JP5429736B2 - タイトジャンクション調節剤 - Google Patents
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Description
1.LSRを含むトリセルリン誘導因子。
2.LSRと相互作用する物質からなるタイトジャンクション調節因子。
3.LSRと相互作用する物質が、LSR遺伝子の発現抑制物質またはLSRの機能阻害物質である前項2に記載のタイトジャンクション調節因子。
4.LSRと相互作用する物質が、LSR遺伝子に対するsiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはLSRに対する抗体、阻害ペプチド、ドミナントネガティブ変異体からなる群より選択される前項3に記載のタイトジャンクション調節因子。
5.LSR遺伝子に対するsiRNAが、配列表の配列番号1に示す塩基配列を有するsiRNA、またはそれと同等の機能を有する相同体RNAである前項4に記載のタイトジャンクション調節因子。
6.前項2〜5のいずれか1に記載のタイトジャンクション調節因子を含むタイトジャンクション調節剤。
7.前項6に記載のタイトジャンクション調節剤を含む薬剤デリバリー系。
8.前項6に記載のタイトジャンクション調節剤を含む医薬組成物。
LSR遺伝子に対するsiRNA:AGAAGAGGCUUUAAAGAAA(配列番号1)
LSRを培養上皮細胞(マウスEpH4細胞)に過剰発現させて、培養上皮細胞でのLSRの細胞内局在を確認した。
市販のLSRクローニングベクター(Accession No.AK146807, RIKEN FANTOM(R), ダナフォーム社)を購入し、開始コドン直前および終止コドンにEcoR1認識配列を組み込んだプライマーを用いてPCRを行った。該PCR産物をEcoR1で消化し、同じくEcoR1で消化したpCAGGS-neo-GFP発現ベクターに導入し、発現ベクターpCAG-LSRを調製し、マウスEpH4細胞に導入し、過剰発現させた。
上記マウスEpH4細胞を10%ホルマリンで固定し、界面活性剤(0.2%tritonX-100)にて透過処理を行ったものに、LSR検出用一次抗体として抗GFP抗体(自製)およびクローディン4検出用一次抗体として抗クローディン4抗体(インビトロジェン製)を付加し、各々二次抗体として抗ラットAlexa488抗体および抗マウスCy3抗体を付加して免疫組織染色を行なった。
上皮培養細胞(マウスEpH4細胞)並びにマウスの小腸および顎下腺におけるLSRおよびトリセルリンの発現と分布を、免疫組織染色にて確認した。上記マウスEpH4細胞について、10%ホルマリンで固定し、界面活性剤(0.2%tritonX-100)にて透過処理を行った。また、マウスの小腸組織および顎下腺組織については99.5%エタノールで固定し、100%アセトン処理後に凍結した組織から薄切切片を作製した。各細胞または組織に、LSR検出用一次抗体として抗LSRポリクローナル抗体(自製)を、トリセルリン検出用一次抗体としてトリセルリンモノクローナル抗体(J. Cell Biol. 171: 939-945, 2005)を付加し、各々二次抗体として抗ラビットCy3抗体および抗ラットAlexa488抗体を付加して免疫組織染色を行なった。
shRNA法によりLSR発現を抑制したマウスEph4細胞株でのトリセルリンの細胞内局在と、該細胞株に全長LSRを入れ戻したときのトリセルリンの細胞内局在を調べた。使用したsiRNAは、以下の配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
LSR遺伝子に対するsiRNA:AGAAGAGGCUUUAAAGAAA(配列番号1)
参考例3に記載の方法により、マウスEph4細胞株内でsiRNAによりLSR発現を抑制させ、その後該細胞株に全長LSRを入れ戻した。この場合の細胞間隙における透過性変化を、TJの機能的な定量法の1つであるTER(trans-epithelial electrical resistance)法を用いて定量的に測定した。TER法による定量は、上皮細胞であるマウスEph4細胞をダブルチャンバー(two-chamber)の培養ディッシュ(12穴)1ウェルあたりに1×105個を播種し、DMEM培地中で5日間培養し、上皮細胞シートの上下に発生する電気抵抗値(TER)を電極Millicell-ERS(MILLIPORE社)を用いて測定し、上皮細胞の間の溶質の透過しやすさを測定することにより行なった。
参考例3に記載の方法により、マウスEph4細胞株内でsiRNAによりLSR発現を抑制し、その後該細胞株に全長LSRを入れ戻した。この場合の細胞間隙における透過性変化を、TJの機能的な定量法の1つであるトレーサー法を用いて定量的に測定した。
トレーサー法による定量は、上皮細胞であるマウスEph4細胞をダブルチャンバーの培養ディッシュ(12穴)1ウェルあたりに1×105個を播種し、HBSS培地中で5日間培養し、上皮細胞の上部チャンバーにトレーサー(FITC-dextran 250KDおよび4KD)を加えて2時間培養したとき、下部チャンバーに移動するトレーサー量を定量し、上皮細胞の間のトレーサーの透過しやすさを測定することにより行なった。上部チャンバーに加えたトレーサー量を100としたときの下部チャンバーに移動したトレーサー量の割合で、透過性を評価した。
Claims (5)
- LSRを含むトリセルリン誘導剤。
- LSR遺伝子に対するsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドより選択される、LSR遺伝子の発現抑制物質若しくはLSRの機能阻害物質を含むタイトジャンクション調節剤。
- LSR遺伝子に対するsiRNAが、配列表の配列番号1に示す塩基配列を有するsiRNAである請求項2に記載のタイトジャンクション調節剤。
- 請求項2または3に記載のタイトジャンクション調節剤を含む薬剤デリバリー系。
- 請求項2または3に記載のタイトジャンクション調節剤を含む医薬組成物。
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