CN114525279A - C/EBP α SARNA组合物和使用方法 - Google Patents

C/EBP α SARNA组合物和使用方法 Download PDF

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M·霍斯巴赫
M·卡兰波特
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Abstract

本发明涉及靶向C/EBPα转录物的saRNA和包含所述saRNA的治疗性组合物。还提供使用治疗性组合物的方法。

Description

C/EBP α SARNA组合物和使用方法
本申请是申请日为2016年4月21日、申请号为2016800342241、发明名称为“C/EBPα SARNA组合物和使用方法”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月22日提交的美国临时申请号62/150,889、2015年10月1日提交的美国临时申请号62/235,778和2016年3月15日提交的美国临时申请号62/308,521的优先权，所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
序列表的引用
本申请随电子格式的序列表一起提交。电子格式的序列表中的信息通过引用的方式完整并入本文。
技术领域
本发明涉及用于调节C/EBPα和C/EBPα途径的多核苷酸(尤其saRNA)、组合物，并且涉及在治疗性应用如治疗代谢疾病、过度增生性疾病和调节干细胞系中使用该组合物的方法。
背景技术
CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα、C/EBPα、C/EBPA或CEBPA)是一种在人类和大鼠之间保守的亮氨酸拉链蛋白。这种核转录因子富含于肝细胞、骨髓单核细胞、脂肪细胞以及其他类型的乳腺上皮细胞中[Lekstrom-Himes等人,J.Bio.Chem,vol.273,28545-28548(1998)]。它由N端部分中的两个反式激活结构域和介导与其他C/EBP家族成员二聚化的亮氨酸拉链区域和在C端部分的DNA结合结构域组成。C/EBP转录因子家族的结合位点存在于参与维持正常肝细胞功能和损伤反应的多种基因的启动子区中。C/EBPα对参与免疫反应和炎症反应、发育、细胞增殖、抗凋亡和几条代谢途径的几种肝特异性基因的转录具有多效性影响[Darlington等人,Current Opinion of Genetic Development,vol.5(5),565-570(1995)]。它对维持肝细胞分化状态至关重要。它激活白蛋白转录并协调编码多种参与脲产生的鸟氨酸循环酶的基因的表达，因此在正常肝功能中发挥重要作用。
在成年肝脏中，C/EBPα定义为在终末分化的肝细胞中发挥作用，而快速增殖的肝瘤细胞仅表达C/EBPα的一部分[Umek等人,Science,vol.251,288-292(1991)]。已知C/EBPα通过上调视网膜母细胞瘤并抑制Cdk2和Cdk4，而上调细胞增殖强力抑制剂p21[Timchenko等人,Genes&Development,vol.10,804-815(1996)；Wang等人,Molecular Cell,vol.8,817-828(2001)]。在肝细胞癌(HCC)中，C/EBPα作为具有抗增殖性特性的肿瘤抑制物发挥作用[Iakova等人,Seminars in Cancer Biology,vol.21(1),28-34(2011)]。
实施了不同方法以研究C/EBPαmRNA或蛋白的调节作用。已知C/EBPα蛋白通过翻译后磷酸化和SUMO化而受到调节。例如，FLT3酪氨酸激酶抑制剂和胞外信号调节的激酶1和/或2(ERK1/2)阻断C/EBPα的丝氨酸-21磷酸化，这增加了C/EBPα蛋白的粒细胞分化潜能[Radomska等人,Journal of Experimental Medicine,vol.203(2),371-381(2006)和Ross等人,Molecular and Cellular Biology,vol.24(2),675-686(2004)]。此外，C/EBPα翻译可以由2-氰基-3,12-二氧齐墩果烷-1,9-二烯-28-酸(CDDO)高效诱导，这改变了C/EBPα蛋白同工型的比率，对全长p42形式有利性超过p30形式，从而诱导粒细胞分化[Koschmieder等人,Blood,vol.110(10),3695-3705(2007)]。
C/EBPα基因是位于染色体19q13.1上的无内含子基因。大部分真核细胞使用RNA-互补性作为调节基因表达的机制。一个例子是使用双链短干扰性RNA借助RNA诱导性沉默复合体(RISC)敲减基因表达的RNA干扰(RNAi)途径。现已确立，短双链体RNA寡核苷酸还具有靶向基因的启动子区并介导这些基因的转录激活的能力，并且已经将它们称作RNA活化(RNAa)、抗基因RNA(agRNA)或短活化性RNA(saRNA)[Li等人,PNAS,vol.103,17337-17342(2006)]。saRNA诱导的基因激活在其他哺乳动物物种(包括小鼠、大鼠和非人灵长类)中保守并且正迅速成为一种研究基因内源上调的影响的流行方法。
因此，需要用saRNA出于治疗目的定向调节C/EBPα。
发明内容
本发明提供了设计、制备、制造、配制和/或使用出于治疗目的(包括诊断和预后)而调节C/EBPα基因表达和/或功能的短活化性RNA(saRNA)分子的组合物、方法和试剂盒。
本发明的一个方面提供一种包含靶向C/EBPα转录物的saRNA和至少一种可药用载体的药物组合物。本发明的又一个方面提供一种调节干细胞分化和多能性的方法，所述方法包括使所述干细胞与靶向C/EBPα转录物的saRNA接触。
在下文描述中叙述了本发明的多种实施方案的详细内容。本发明的其他特征、目的和优点将从本描述及附图并且从权利要求书中显而易见。
附图说明
前述目的和其他目的、特征和优点将从以下对如附图中所示的本发明具体实施方案的描述显而易见，其中相同参考字符在不同视图间始终指相同的部分。附图不必然符合比例，反而重点在于说明本发明各种实施方案的原理。
图1显示C/EBPα对肝脏的主要影响。
图2显示C/EBPα对脂肪组织的次要影响。
图3是说明参与本发明saRNA的功能的各核酸部分之间关系的示意图。
图4A-4D显示CEBPA-saRNA上调一组HCC细胞中的CEBPA。
图5A-5D显示CEBPA-saRNA上调一组HCC细胞中的白蛋白。
图6A显示用修饰的saRNA转染的DU145细胞中对GAPDH归一化的CEBPA mRNA水平。图6B显示DU145细胞中的GAPDH mRNA水平。图6C显示作为转染对照的Aha1 mRNA水平。
图7A-7B显示用CEBPA-siRNA或Fluc转染的DU145细胞中对GAPDH归一化的CEBPAmRNA水平。图7C显示用AhA-1-siRNA转染的DU145细胞中对GAPDH归一化的AhA-1mRNA水平。
图8A-8C显示用三种saRNA转染的DU145细胞中对GAPDH归一化的CEBPA mRNA水平。其中x轴为浓度(nM)，y轴为剩余的mRNA。
图9包含显示表达水平的图9A和图9B。图9A显示非增殖培养基中肝细胞的AhA1、白蛋白和CEBPA相对表达水平。图9B显示增殖培养基中肝细胞的AhA1、白蛋白和CEBPA相对表达水平。
图10A显示代表性蛋白质印迹，其显示CEBPA-51转染后HepG2、Hep3B和PLCPRF5细胞中C/EBP-α蛋白水平。图10B显示HepG2、Hep3B和PLCPRF5细胞中经CEBPA-51转染后的相对CEBPA mRNA表达(***p＝0.0002；**p＝0.0012)。
图11A-11C显示HEP3B、HEPG2和PLCPRF5细胞系中AW51的WST-1细胞增殖分析结果。图11D-11F显示HEP3B、HEPG2和PLCPRF5细胞系中AW51的磺酰罗丹明B(SRB)细胞数目分析结果。
图12A-12B显示在HuH7细胞(图12A)和Panc-1细胞(图12B)中测量的AW51脱靶。
图13A-13B显示细胞中的CEBPA mRNA水平和白蛋白mRNA水平，所述细胞用非特异性对照(NC-500000)、未修饰的AW1-51序列、具有内部序列突变的AW1-51(CEBPA-AW01-510500)、在SS上修饰的AW1-51(CEBPA-AW01-510012)和在AS上修饰的AW1-51(CEBPA-AW01-510013)或在两条链上均修饰的AW1-51(CEBPA-AW01-510014)转染。
图14A展示CEBPA51上调人原代肝细胞中的CEBPA。图14B展示CEBPA51增加人原代肝细胞中的白蛋白分泌。图14C显示Aha1水平。使用Aha1 siRNA作为阳性对照以确定原代细胞中的转染效率。全部统计显著性均遵循非参数Mann Whitney U检验，在95％置信区间。
图15显示来自CEBPA51转染的培养人原代肝细胞的培养基中的白蛋白ELISA结果。
图16A-16F显示在CEBPA-51转染的人原代肝细胞中检测到的(A)丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(AGXT)；(B)白蛋白；(C)细胞色素P450 3A4(CYP3A4)；(D)鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)；(E)肝细胞核因子4-α(HNF4A)和(F)CEBPA转录物水平的相对表达。
图17显示食蟹猴(CYNOM-K1)成纤维细胞中第二次CEBPA-51转染后24小时的CEBPAmRNA表达。
图18A-18C显示CEBPA-51在大鼠血浆、人血浆和食蟹猴血浆中的稳定性。
图19A-19C显示MTL-CEBPA在大鼠血浆、人血浆和食蟹猴血浆中的稳定性。
图20A显示大鼠血浆中静脉内施用1.5mg/kg CEBPA51后CEBPA51和代谢物/杂质的平均浓度。
图20B显示静脉内施用1.5mg/kg CEBPA51后大鼠血浆中完整CEBPA51的平均浓度。施用后0.5小时，完整CEBPA51的浓度低于检测限。
图21A显示大鼠血浆中静脉内施用2.175mg/kg MTL-CEBPA后CEBPA51平均浓度。CEBPA51的完整母体化合物与代谢物的比较显示了MTL-CEBPA在血浆中的高稳定性。
图21B显示静脉内施用2.175mg/kg MTL-CEBPA后大鼠血浆中完整CEBPA51的平均浓度。施用后48小时，CEBPA51仍存在于血浆中。
图22A-22K显示在施用不同剂量的MTL-CEBPA后CCL4-处理的大鼠中体重、ALT水平、AST水平、ALP水平、GGT水平、胆红素水平、总蛋白水平、白蛋白水平、凝血酶原时间、氨水平和羟脯氨酸水平的变化。其中，图22A-J中，数据表示为均数±SEM；相对于假性对照，#p＜0.001，$p＜0.01和δp小于0.05；相对于NOV34O/siFLUC，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。在图22K中，#与假性对照相比时，#p＜0.001；***与NOV34G/siFLUC相比时，***p＜0.001；单因素方差分析，随后是Dunnett多重比较检验。
图23是健康肝和用CCL4和对照、CCL4和0.3mg/kg MTL-CEBPA以及CCL4和3.0mg/kgMTL-CEBPA治疗的肝的总病理学。对于未用过药的动物，健康，偏棕粉色并且光滑、边缘清晰。对于CCI4+对照，更加苍白，更坚实，表面遍布多个肝硬化结节。对于CCI4+MTL-CEBPA(0.3mpk)，苍白，更坚实，表面遍布小结节。对于CCI4+MTL-CEBPA(3.0mpk)，正常，表面不均匀且结节化非常轻。
图24A-24C显示组织学染色，包括对未处理的大鼠、经CCL4和对照处理的大鼠和经CCL4和MTL-CEBPA处理的大鼠的肝的H&E染色、Mason三色染色和天狼猩红染色。图24A是假性对照。图24B是接受NOV340/siFluc治疗的CCL4处理的大鼠(阴性对照)。图24C是接受MTL-CEBPA治疗的CCL4处理的大鼠。
图25A-25H显示TAA注射对肝功能参数如ALT、AST、ALP、GGT、胆红素以及其他参数如总蛋白、白蛋白和氨的影响。
图26显示经CEBPA-saRNA治疗的糖尿病大鼠的血清参数和身体参数。图26A：甘油三酯水平。图26B：总胆固醇水平。图26C：肝脏胆固醇水平。图26D：HDL-c水平。图26E：LDL-c水平。图26F：HDL-c/LDL-c比。图26G：AST水平。图26H：ALT水平。图26I：TG/HDL-c比。图26J：空腹葡萄糖水平。图26K：胰岛素水平。图26L：体重变化。图26M：肝重量变化。图26N：肝重量/体重比。其中，与对照动物相比，统计显著性：*p＜0.05，**p＜0.01。
图27A-27B显示MCD诱导的NASH研究中的体重变化和饲料消耗量变化，其中与正常膳食组比较时，*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.01，单因素方差分析，随后是Tukey多重比较检验；与MCD膳食对照组相比，治疗组显示体重和采食量无显著变化。图27C-27H显示该研究中ALT、AST、ALP、胆红素、白蛋白和肝TG水平的变化。在27C-G中，#与正常膳食组比较时，#p＜0.05，##p＜0.01，单因素方差分析，随后是Turkey多重比较检验；*与MCD膳食对照组相比时，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。在27H中，###与正常膳食组比较时，###p＜0.01，单因素方差分析，随后是Turkey多重比较检验(第6周)；***与MCD膳食对照组相比时，***p＜0.001(第6周)；$$$与正常膳食对照组相比时，$$$p＜0.001(第4周)。
图28显示肝组织中的CEBPA mRNA和白蛋白mRNA的表达。表达值相对于处理前对照(DEN诱导的HCC)，对NOV340/siFLUC的**p<0.01。
图29A-29I显示MTL-CEBPA治疗的DEN-大鼠中的身体参数和血清参数。值作为均数±SEM显示；显示MTL-CEBPA的p-值：#p<0.1，*p<0.05(对NOV340/siFLUC)；$p<0.05(对处理前对照)。
图30A显示用CEBPA51的生物素酰化链与Argonaute蛋白的免疫共沉淀结果。
图30B显示经CEBPA-saRNA转染的野生型细胞和Ago2敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的CEBPA水平。
图30C显示经CEBPA-saRNA转染的野生型细胞和Ago2敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的p21水平。
图31是MTL-CEBPA生产工艺的概述。
图32A和图32B显示在huPBMC中用CEBPA-51和对照寡聚物转染后的TNF-α和IFN-α分泌
图33是剂量递增流程图。
图34显示就API溶液的两个不同pH值而言，相对于注射缓冲液中的API浓度，CEBPA-51包封入脂质体的效率。
图35显示相对于注射缓冲液中的API浓度，CEBPA-51包封入脂质体的效率。
图36显示在第8周或第11周MTL-CEBPA治疗后的氨水平。其中，上图中，与假性对照相比时，*p＜0.05；**p＜0.01，学生t检验。
图37A和图37B显示在第8周或第11周MTL-CEBPA治疗后的腹水评分。统计学分析：kruskal wallis ANOVA，随后是多重比较检验。
图38A和图38B显示在第8周或第11周MTL-CEBPA治疗后的存活曲线。卡方检验，*与路径对照-2相比，*p＜0.05。
具体实施方式
本发明提供了出于治疗目的而调节C/EBPα基因表达和/或功能的组合物、方法和试剂盒。这些组合物、方法和试剂盒包含靶向C/EBPα转录物的核酸构建体。
C/EBPα蛋白称作代谢过程和细胞增殖的关键调节物。调节C/EBPα基因具有用于治疗目的的巨大潜力。本发明通过提供靶向C/EBPα转录物的核酸构建体而满足这种需求，其中所述核酸构建体可以包括具有或没有修饰的单链或双链DNA或RNA。
如本文所用的C/EBPα基因是包含编码链和模板链的双链DNA。它也可以指本申请中的靶基因。
术语“C/EBPα转录物”、“C/EBPα靶转录物”或“靶转录物”在上下文中可以是编码C/EBPα蛋白的C/EBPαmRNA。C/EBPαmRNA从C/EBPα基因的模板链转录并且可以存在于线粒体中。
从C/EBPα基因的编码链转录的C/EBPα基因反义RNA下文称作靶反义RNA转录物。靶反义RNA转录物可以是长的非编码反义RNA转录物。
术语“活化性小RNA”、“活化性短RNA”或“saRNA”在本发明的上下文中意指上调特定基因的表达或对其表达具有正向影响的单链或双链RNA。saRNA可以是14至30个核苷酸的单链。saRNA也可以为双链，每条链包含14至30个核苷酸。该基因称作saRNA的靶基因。上调C/EBPα基因表达的saRNA称作“C/EBPα-saRNA”并且C/EBPα基因是C/EBPα-saRNA的靶基因。
在一个实施方案中，靶向C/EBPα靶反义RNA转录物的C/EBPα-saRNA上调C/EBPα基因表达和/或功能。
术语“靶”或“靶向”在上下文中意指对C/EBPα基因产生影响。该影响可以是直接或间接的。直接影响可以由与C/EBPα靶反义RNA转录物完全或部分杂交引起。间接影响可以是上游或下游的。
C/EBPα-saRNA可以对生物学过程或活性具有下游影响。在这类实施方案中，C/EBPα-saRNA可以对第二非靶转录物具有影响(上调或下调)。
术语“基因表达”在上下文中可以包括从C/EBPα基因产生C/EBPαmRNA的转录步骤或从C/EBPαmRNA产生C/EBPα蛋白的翻译步骤。C/EBPαmRNA的增加和C/EBPα蛋白的增加均显示C/EBPα基因表达的增加或正向影响。
基因的“上调”或“活化”意指观察到基因表达水平或由基因编码的多肽的水平或其活性水平、或从基因的模板链转录的RNA转录物的水平增加，高于在缺少本发明saRNA时的水平。本发明的saRNA可以对靶基因的表达具有直接或间接上调影响。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以在正在增殖的细胞中显示功效。如本文就细胞而言所用，“增殖”意指正在快速生长和/或繁殖的细胞。
I.本发明的组合物
本发明的一个方面提供了包含上调CEBPA基因的saRNA和至少一种可药用载体的药物组合物。这种saRNA下文称作“C/EBPα-saRNA”或“本发明的saRNA”，它们在本申请中互换地使用。
saRNA设计
C/EBPα-saRNA上调C/EBPα基因。在一个实施方案中，它设计成与C/EBPα基因的靶反义RNA转录物互补，并且它可以对C/EBPα基因表达产生影响和/或通过下调靶反义RNA转录物发挥作用。
术语“与……互补”在上下文中意指能够在严格条件下与靶反义RNA转录物杂交。
当用来在本发明的上下文中描述核酸序列时，术语“有义”意指序列与基因编码链上的序列具有同一性。当用来在本发明的上下文中描述核酸序列时，术语“反义”意指序列与基因编码链上的序列互补。
应当理解，DNA的胸苷由RNA中的尿苷替换并且这种差异不改变对术语“反义”或“互补性”的理解。
靶反义RNA转录物可以由编码链上在所述靶基因转录起始位点(TSS)对应位置上游达100、80、60、40、20或10kb和所述靶基因转录终止位点对应位置下游达100、80、60、40、20或10kb之间的基因座转录。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物可以从编码链上位于靶基因转录起始位点+/-1kb范围内的基因座转录。
在另一个实施方案中，靶反义RNA转录物可以从编码链上位于靶基因转录起始位点+/-500、+/-250或+/-100bp范围内的基因座转录。
在另一个实施方案中，靶反义RNA转录物可以从编码链上位于靶基因转录起始位点+/-2000个核苷酸范围内的基因座转录。
在另一个实施方案中，编码链上的基因座距对应于靶基因转录起始位点的位置上游或下游不多于1000个核苷酸。
在另一个实施方案中，编码链上的基因座距对应于靶基因转录起始位点的位置上游或下游不多于500个核苷酸。
如本文所用的术语“转录起始位点”(TSS)意指在基因的模板链上对应于或标志转录起点位置的核苷酸。TSS可以位于基因的模板链上的启动子区内部。
如本文所用的术语“转录终止位点”意指基因的模板链上这样的区域，其可以是一个或多个核苷酸，所述区域具有至少一个特征，如但不限于此：编码靶转录物的至少一个终止密码子的区域、编码靶转录物3’UTR前的序列的区域，RNA聚合酶在此释放基因的区域、编码剪接位点的区域或在剪接位点之前的区域和在模板链上靶转录物的转录终止的区域。
术语“从特定基因座转录”在本发明的靶反义RNA转录物的背景下意指靶反义RNA转录物的转录始于特定基因座处。
靶反义RNA转录物与靶基因的基因组序列的编码链互补，并且本文任何时候提及“基因组序列”均是“基因组序列的编码链”的简记形式。
基因的“编码链”具有与所产生的mRNA相同的碱基序列，例外是mRNA中T由U替换。基因的“模板链”因此互补于并反平行于产生的mRNA。
因此，靶反义RNA转录物可以包含与位于靶基因转录起始位点上游100、80、60、40、20或10kb至靶基因转录终止位点下游100、80、60、40、20或10kb之间的基因组序列互补的序列。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物包含与位于靶基因转录起始位点上游1kb至靶基因转录终止位点下游1kb之间的基因组序列互补的序列。
在另一个实施方案中，靶反义RNA转录物包含与位于靶基因转录起始位点上游500、250或100个核苷酸至靶基因转录终止位点下游500、250或100个核苷酸之间的基因组序列互补的序列。
靶反义RNA转录物可以包含与包含CEBPA基因编码区的基因组序列互补的序列。靶反义RNA转录物可以包含与模板链上靶基因的启动子区对齐的基因组序列互补的序列。基因可以拥有多个启动子区，在这种情况下，靶反义RNA转录物可以与一个、两个或更多个启动子区对齐。一个注释基因座位的在线数据库可以用来鉴定基因的启动子区。在一对核苷酸序列的背景下使用时，术语‘对齐’意指该核苷酸序列对彼此互补或彼此具有序列同一性。
在靶反义RNA转录物和靶基因启动子区之间的对齐区域可以是部分的并且可以在长度上短至单个核苷酸，不过，它可以是至少15或至少20个核苷酸长度、或至少25个核苷酸长度、或至少30、35、40、45或50个核苷酸长度、或至少55、60、65、70或75个核苷酸长度、或至少100个核苷酸长度。每种以下特定排列均意在落于术语“对齐”的范围内：
a)靶反义RNA转录物和靶基因启动子区在长度上相同并且它们对齐(即它们在其整个长度范围内对齐)。
b)靶反义RNA转录物短于靶基因启动子区并且在其整个长度范围内与靶基因启动子区对齐(即它在其整个长度范围内与靶基因启动子区内部的序列对齐)。
c)靶反义RNA转录物长于靶基因启动子区并且靶基因启动子区与其完全对齐(即靶基因启动子区在其整个长度范围内与靶反义RNA转录物内部的序列对齐)。
d)靶反义RNA转录物和靶基因启动子区具有相同或不同的长度并且对齐区域短于靶反义RNA转录物的长度和靶基因启动子区的长度。
已作必要的修正情况下，上述的“对齐”定义适用于本说明书通篇范围内描述其他重叠(例如，对齐)的序列。显然，如果将靶反义RNA转录物描述为与靶基因除启动子区之外的区域对齐，则靶反义RNA转录物的序列与所指区域内部而非靶基因启动子区内部的序列对齐。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物长至少1kb、或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10kb、例如，20、25、30、35或40kb。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物包含沿其全长与靶基因编码链上的序列至少75％、或至少85％、或至少90％、或至少95％互补的序列。
本发明提供了靶向靶反义RNA转录物的saRNA并且可以有效及特异性下调这类靶反义RNA转录物。这可以通过与靶反义RNA转录物内部的区域具有高程度互补性的saRNA实现。所述saRNA将与靶反义RNA转录物内部待靶向的区域具有不多于5个、或不多于4或3个、或不多于2个、或不多于1个错配或与之无错配。
参考图3，由于靶反义RNA转录物与靶基因的模板链的区域具有序列同一性，靶反义RNA转录物将部分地与靶基因的模板链内部这样的区域相同，所述区域允许参考基因的模板链或参考靶反义RNA转录物。saRNA与靶反义RNA转录物(并且因此与模板链上的相同位置)杂交或结合的位置称作“靶向的序列”或“靶部位”。
saRNA(无论是否为单链或双链)的反义链可以与靶向的序列的反向互补物至少80％、90％、95％、98％、99％或100％相同。因此，saRNA的反义链的反向互补物与所靶向的序列具有高程度的序列同一性。所靶向的序列可以具有与saRNA和/或saRNA的反向互补物相同的长度，即，相同数目的核苷酸。
在一些实施方案中，靶向的序列包含至少14个且小于30个核苷酸。
在一些实施方案中，靶向的序列具有19、20、21、22或23个核苷酸。
在一些实施方案中，靶向的序列的位置位于模板链的启动子区域内部。
在一些实施方案中，靶向的序列位于模板链的TSS(转录起始位点)核心内部。如本文所用，“TSS核心”或“TSS核心序列”指在TSS(转录起始位点)上游2000个核苷酸及其下游2000个核苷酸之间的区域。因此，TSS核心包含4001个核苷酸并且TSS位于距TSS核心序列5'末端的位置2001处。下表中显示CEBPA TSS核心序列：
Figure BDA0003506633680000121
在一些实施方案中，靶向序列位于TSS上游1000个核苷酸及其下游1000个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶向序列位于TSS上游500个核苷酸及其下游500个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶向序列位于TSS上游250个核苷酸及其下游250个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶向序列位于TSS上游100个核苷酸及其下游100个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶向序列位于TSS核心内TSS的上游。靶向的序列可以在TSS上游小于2000、小于1000、小于500、小于250、或少于100个核苷酸。
在一些实施方案中，靶向序列位于TSS核心中TSS的下游。靶向的序列可以在TSS的下游小于2000、小于1000、小于500、小于250、或少于100个核苷酸。
在一些实施方案中，靶向序列位于TSS核心的TSS周围+/-50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列基本上重叠TSS核心的TSS。在一些实施方案中，靶向序列重叠始于或止于TSS核心的TSS。在一些实施方案中，靶向的序列与TSS核心的TSS在上游或下游方向重叠1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。
模板链上的靶向序列的位置由靶向序列的5'末端的位置限定。靶向序列的5'末端可以在TSS核心的任何位置并且靶向序列可以始于选自TSS核心的位置1至位置4001中的任何位置。为了在本文中参照，当靶向序列的5’最末端是从TSS核心的位置1至位置2000时，认为靶向序列在TSS上游，当靶向的序列的5’最末端是从位置2002至4001时，认为靶向的序列在TSS下游。当靶向的序列的5’最末端在核苷酸2001时，认为靶向的序列是TSS中央序列并且既不在TSS上游，也不在其下游。
为了进一步参照，例如，当靶向的序列的5'末端在TSS核心的位置1600时，即，它是TSS核心的第1600核苷酸，则靶向的序列始于TSS核心的位置1600处并且认为其在TSS上游。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以具有形成双链体的两条链，一条链为引导链。saRNA双链体也称作双链saRNA。如本文所用，双链saRNA或saRNA双链体，是包含多于一条并且优选地两条链的saRNA，其中链间杂交可以形成双链体结构的区域。双链saRNA的两条链称作反义链或引导链以及有义链或载客链。
saRNA双链体的反义链(与反义链saRNA或反义saRNA互换使用)与靶反义RNA转录物内部的区域具有高程度互补性。反义链可以与靶反义RNA转录物或靶向的序列内部的区域具有不多于5个、或不多于4或3个、或不多于2个、或不多于1个错配或与之无错配。因此，反义链与模板链上的靶向序列具有高程度的互补性。saRNA双链体的有义链(与有义链saRNA或有义saRNA互换使用)与模板链上的靶向序列具有高程度的序列同一性。在一些实施方案中，靶向的序列位于模板链的启动子区域内部。在一些实施方案中，靶向的序列位于模板链的TSS核心内部。
相对于靶向的序列，通过参照TSS核心序列，确定saRNA双链体的反义链和/或有义链的位置。例如，当靶向的序列在TSS下游时，反义saRNA和有义saRNA始于TSS的下游。在另一个例子中，当靶向的序列始于TSS核心的位置200时，反义saRNA和有义saRNA始于TSS的上游。
图3中显示saRNA、靶基因、靶基因的编码链、靶基因的模板链、靶反义RNA转录物、靶转录物、靶向的序列/靶部位和TSS之间的关系。
在本发明的上下文中“链”意指连续的核苷酸(包括非天然存在的或修饰的核苷酸)序列。两条或更多条链可以是独立的分子或分别形成独立分子的部分，或它们可以共价连接，例如，通过接头如聚乙二醇接头共价连接。saRNA的至少一条链可以包含与靶反义RNA互补的区域。这种链称作saRNA双链体的反义链或引导链。包含与saRNA的反义链互补的区域的saRNA的第二链称作有义链或载客链。
saRNA双链体也可以从单个分子形成，所述单个分子至少部分地自身互补，形成发夹结构，包括双链体区。在这种情况下，术语“链”指saRNA区域中与saRNA的另一个内部区互补的区域之一。saRNA的引导链将与靶反义RNA转录物内部的序列具有不多于5个、或不多于4或3个、或不多于2个、或不多于1个错配或与之无错配。
在一些实施方案中，saRNA的载客链可以包含与引导链上相应的核苷酸不互补的至少一个核苷酸，称作与引导链错配。与引导链的错配可以激励偏好载入引导链(Wu等人,PLoS ONE,vol.6(12):e28580(2011)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在一个实施方案中，与引导链的至少一个错配可以在载客链的3’末端。在一个实施方案中，载客链的3’末端可以包含1-5个与引导链的错配。在一个实施方案中，载客链的3’末端可以包含2-3个与引导链的错配。在一个实施方案中，载客链的3’末端可以包含6-10个与引导链的错配。
在一个实施方案中，saRNA双链体可以显示在增殖的细胞中的功效。
saRNA双链体可以与靶反义RNA转录物的区域具有siRNA样互补性；即在RNA双链体中距引导链5'末端的核苷酸2-6与靶反义RNA转录物的区域之间100％互补性。另外，saRNA的其他核苷酸可以与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％互补性。例如，saRNA的核苷酸7(从5'末端计数)直至3’末端可以与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％互补性。
术语“小干扰性RNA”或“siRNA”在上下文中意指一般长20-25个核苷酸的参与RNA干扰(RNAi)途径并干扰或抑制特定基因表达的双链RNA。该基因是siRNA的靶基因。例如，干扰APOA1基因表达的siRNA称作“APOA1-siRNA”并且APOA1基因是靶基因。siRNA通常长约21个核苷酸，在两条链的每个末端具有3'突出端(例如，2个核苷酸)。
siRNA通过以下方式抑制靶基因表达：与靶基因的一种或多种RNA转录物在特定序列处结合并且促进切割转录物。一般，在RNAi中，RNA转录物是mRNA，从而切割mRNA导致基因表达下调。在本发明中，不意在受任何理论约束，可能机制之一是，本发明的saRNA可以通过切割靶反义RNA转录物，调节靶基因表达。
双链saRNA可以包含一个或多个单链核苷酸突出端。在双链saRNA和siRNA的语境下，术语“突出端”或“尾”指从saRNA或siRNA的双链体结构突出的至少一个非配对核苷酸。例如，当saRNA的一条链的3'-端延伸超过另一条链的5'-端时或反之亦然，存在核苷酸突出端。saRNA可以包含至少一个核苷酸的突出端；或者，该突出端可以包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个或更多个核苷酸。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。突出端可以在有义链、反义链或其任意组合上。另外，突出端的核苷酸可以存在于saRNA的反义链或有义链的5'末端、3'末端或两个末端上。在两个寡核苷酸设计成一旦杂交就形成一个或多个单链突出端的情况下，就互补性的确定而言，这类突出端不应当视作错配。例如，出于本文所述的目的，仍可以将包含长19个核苷酸的一个寡核苷酸和长21个核苷酸的另一个寡核苷酸的saRNA(其中较长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的19个核苷酸的序列)称作“完全互补的”。
在一个实施方案中，双链saRNA的反义链在3'末端和/或5'末端具有含1-10个核苷酸的突出端。在一个实施方案中，双链saRNA的反义链在其3'末端具有1-4个核苷酸的突出端或在其3'末端具有1-2个核苷酸的突出端。在一个实施方案中，双链saRNA的有义链在3'末端和/或5'末端具有1-10个核苷酸的突出端。在一个实施方案中，双链saRNA的有义链在其3'末端具有1-4个核苷酸的突出端或在其3'末端具有1-2个核苷酸的突出端。在一个实施方案中，双链saRNA的有义链和反义链均具有3’突出端。3’突出端可以包含一个或多个尿嘧啶，例如，序列UU或UUU。在一个实施方案中，突出端中的一个或多个核苷酸由硫代磷酸核苷替换，其中核苷间键是硫代磷酸连接。在一个实施方案中，突出端包含一个或多个脱氧核糖核苷，例如，序列dTdT或dTdTdT。在一个实施方案中，突出端包含序列dT*dT，其中*是硫代磷酸连接核苷间键。
技术人员将理解，便利的是通过参照靶反义RNA转录物或靶向的序列，定义本发明的saRNA，无论saRNA调靶基因表达的机制是什么。然而，本发明的saRNA或者可以通过参照靶基因来定义。靶反义RNA转录物与靶基因编码链上的基因组区互补，并且本发明的saRNA转而与靶反义RNA转录物的区域互补，从而本发明的saRNA可以定义为与靶基因编码链上的区域具有序列同一性。本文中通过参照靶反义RNA转录物而就本发明的saRNA定义所讨论的全部特征在已作必要的修正情况下，适用于通过参照靶基因而对本发明saRNA的定义，从而任何与靶反义RNA转录物互补性的讨论应当理解包括与靶基因的基因组序列的同一性。因此，本发明的saRNA优选地与靶基因上的基因组序列具有高同一性百分数，例如，至少80％、90％、95％、98％或99％或者100％同一性。基因组序列可以是靶基因转录起始位点上游或下游的达2000、1000、500、250或100个核苷酸。它可以与靶基因的启动子区对齐。因此，saRNA可以与这样的序列具有序列同一性，所述序列与靶基因的启动子区对齐。
在一个实施方案中，不需要确定靶反义RNA转录物的存在以设计本发明的saRNA。换而言之，saRNA的设计不需要鉴定靶反义RNA转录物。例如，可以通过靶基因的编码链的基因组序列、通过测序或通过数据库中检索获得TSS核心的核苷酸序列，即，在靶基因转录起始位点上游2000个核苷酸至靶基因转录起点下游2000个核苷酸的区域中的序列。可以选择TSS核心内部始于模板链上从TSS核心位置1至位置4001的任何位置的靶向序列，并且其随后可以用来设计saRNA序列。如上文讨论，saRNA与靶向的序列的反向互补物具有高程度的序列同一性。
随后确定全基因组中saRNA序列的脱靶命中数、0错配(0mm)命中数和1错配(1mm)命中数。术语“脱靶命中数”指与靶基因的模板链上saRNA的靶向序列相同的全基因组中其他位点的数目。术语“0mm命中数”指除saRNA的靶转录物之外已知的saRNA可以以0错配与其的互补物杂交或结合的蛋白质编码转录物的数目。换而言之，“0mm命中数”计数的是除saRNA的靶转录物之外已知的包含与saRNA序列完全相同的区域的蛋白质编码性转录物的数目。术语“1mm命中数”指除saRNA的靶转录物之外已知的，可以以1个错配与所述其的互补物杂交或结合的蛋白质编码性转录物的数目。换而言之，“1mm命中数”计数的是除saRNA的靶转录物之外已知的，包含仅具有1个错配的与saRNA序列相同的区域的蛋白质编码性转录物的数目。在一个实施方案中，仅选择没有脱靶命中、没有0mm命中和没有1mm命中的saRNA序列。对于本申请中公开的那些saRNA序列，每者均具有无脱靶命中、无0mm命中并且无1mm命中。
在2011年6月23日提交的US2013/0164846中公开的方法(saRNA算法)(所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)也可以用来设计saRNA。saRNA的设计还公开于以下文献中：Corey等人的美国专利号8,324,181和美国专利号7,709,566、Li等人的美国专利申请号2010/0210707和Voutila等人,Mol Ther Nucleic Acids,vol.1,e35(2012)，所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
“确定存在(或测定存在)”意指在靶基因的基因座周围检索EST和/或反义RNA转录物的数据库以鉴定合适的靶反义RNA转录物，或使用RT PCR或任何其他已知技术来证实细胞中靶反义RNA转录物的物理存在。
在一些实施方案中，本发明的saRNA可以是单链或双链的。双链分子包含第一链和第二链。如果为双链，则双链体的每条链可以长至少14个、或至少18个，例如19、20、21或22个核苷酸。双链体可以在至少12个、或至少15个、或至少17个、或至少19个核苷酸的长度上杂交。每条链可以正好是19个核苷酸长度。优选地，saRNA的长度小于30个核苷酸，因为超过这个长度的寡核苷酸双链体可能具有增加的诱导干扰素反应的风险。在一个实施方案中，saRNA的长度是19至25个核苷酸。形成saRNA双链体的链可以长度相等或不等。
在一个实施方案中，本发明的saRNA包含至少14个核苷酸和小于30个核苷酸的序列，所述序列与靶向的序列具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％互补性。在一个实施方案中，与靶向的序列具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％互补性的序列长至少15、16、17、18或19个核苷酸、或18-22个或19个至21个、或正好19个核苷酸。
本发明的saRNA可以包含不与靶反义RNA转录物互补的短3'或5'序列。在一个实施方案中，这种序列在链的3’末端。该序列可以长1-5个核苷酸、或2个或3个核苷酸。该序列可以包含尿嘧啶，从而它可以是2或3个尿嘧啶的3'序列段。该序列可以包含一个或多个脱氧核糖核苷，如dT。在一个实施方案中，序列中的一个或多个核苷酸由硫代磷酸核苷替换，其中核苷间键是硫代磷酸连接。作为一个非限制性例子，该序列包含序列dT*dT，其中*是硫代磷酸核苷间键。这种非互补序列可以称作“尾”。如果存在3'尾，则链可以较长，例如，19个核苷酸外加3'尾，其可以是UU或UUU。在确定saRNA和靶反义RNA转录物之间的互补性时，这种3’尾不应当视作错配。
因此，本发明的saRNA可以由以下组成：(i)与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％互补性的序列；和(ii)1-5个核苷酸的3'尾，所述尾可以包含尿嘧啶残基或由其组成。saRNA因此一般在其整个长度与靶反义RNA转录物的区域具有互补性，3'尾除外(如果存在)。本申请中公开的任一saRNA序列可以任选地包含这种3'尾。因此，在saRNA表和序列表中公开的任一saRNA序列可以任选地包含这种3'尾。本发明的saRNA还可以包含Dicer或Drosha底物序列。
本发明的saRNA可以含有侧翼序列。侧翼序列可以插入本发明saRNA的3’末端或5'末端中。在一个实施方案中，侧翼序列是miRNA的序列，从而使得saRNA具有miRNA构型并且可以用Drosha和Dicer加工。在非限制性例子中，本发明的saRNA具有两条链并且被克隆入微RNA前体，例如，amiR-30主链侧翼序列中。
本发明的saRNA可以包含一个限制性酶底物或识别序列。限制性酶识别序列可以在本发明saRNA的3’末端或5'末端。限制性酶的非限制性例子包括NotI和AscI。
在一个实施方案中，本发明的saRNA由稳定碱基配对在一起的两条链组成。在一些实施方案中，载客链可以包含至少一个与引导链上相应的核苷酸不互补的核苷酸，称作与引导链错配。在一个实施方案中，与引导链的至少一个错配可以在载客链的3’末端。在一个实施方案中，载客链的3’末端可以包含1-5个与引导链的错配。在一个实施方案中，载客链的3’末端可以包含2-3个与引导链的错配。在一个实施方案中，载客链的3’末端可以包含6-10个与引导链的错配。
在一些实施方案中，双链saRNA可以在每条链的3'末端包含形成3'突出端的多个未配对核苷酸。形成每条链的3'突出端的未配对核苷酸的数目可以在1至5个核苷酸或1至3个核苷酸范围内，或是2个核苷酸。3'突出端可以在上文提到的3'尾上形成，从而3'尾可以是双链saRNA的3'突出端。
因此，本发明的saRNA可以为单链并且由以下组成：(i)与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％互补性的序列；和(ii)1-5个核苷酸的3'尾，所述尾可以包含尿嘧啶残基。本发明的saRNA可以在其整个长度上与靶反义RNA转录物的区域具有互补性，3'尾除外(如果存在)。如上文提到，取代“与靶反义RNA转录物互补”，本发明的saRNA也可以定义为与靶基因的编码链具有“同一性”。本发明的saRNA可以为双链并且由第一链和第二链组成，所述第一链包含(i)与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％互补性的第一序列和(ii)1-5个核苷酸的3'突出端；所述第二链包含(i)与第一序列形成双链体的第二序列和(ii)1-5个核苷酸的3’突出端。
如本文所述，C/EBPα基因的序列用来设计C/EBPα-saRNA。CEBPA基因的靶反义RNA转录物的序列可以根据用于设计C/EBPα-saRNA的C/EBPα基因的序列确定。然而，不需要确定这种靶反义RNA转录物的存在。表1中提供了本发明的合适C/EBPα-saRNA的序列。因此，提供了具有第一链的C/EBPα-saRNA，所述第一链包含选自SEQ ID No:2、4、6、8、10和12的序列。任选地，C/EBPα-saRNA可以包含在这些序列的3'末端的3’尾。
单链C/EBPα-saRNA仅由第一链组成，而双链C/EBPα-saRNA还具有第二链。单链CEBPA-saRNA包含了选自表1和表1A中反义链的序列。双链C/EBPα-saRNA包含第一链和第二链，其中第一链包含选自表1和表1A中反义链的序列，其中第二链包含作为表1和表1A中相应有义链的序列。反义链和/或有义链可以包含3’突出端。
表1 saRNA序列
Figure BDA0003506633680000191
Figure BDA0003506633680000201
表1A额外的saRNA序列
Figure BDA0003506633680000202
双功能或双重功能的寡核苷酸还设计成上调C/EBPα基因表达和下调C/EBPβ基因表达。双重功能寡核苷酸的一条链激活C/EBPα基因表达并且另一条链抑制C/EBPβ基因表达。表2A中显示了优选的双重功能寡核苷酸序列。每条链可能进一步包含如表2B中所示的Dicer底物序列。
表2A双功能寡核苷酸序列
Figure BDA0003506633680000203
表2B双功能寡核苷酸序列的Dice底物序列
Figure BDA0003506633680000211
本发明的saRNA可以通过任何合适方法产生，例如使用所属领域技术人员熟知的标准分子生物学技术以合成方式或通过在细胞中表达来产生。例如，可以使用本领域已知的方法，化学合成或重组产生本发明的saRNA。
saRNA的化学修饰
本文中，在saRNA中，术语“修饰”或(如果适宜)“被修饰的(经修饰的)”指相对于A、G、U或C核糖核苷酸的结构性和/或化学性修饰。在本发明saRNA中的核苷酸可以包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。本发明的saRNA可以包括任何有用的修饰，如对糖、核碱基或核苷间键(例如对连接性磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。嘧啶核碱基的一种或多种原子可以用任选取代的氨基、任选取代的巯基、任选取代的烷基(例如，曱基或乙基)或卤素(例如，氯或氟)替换或取代。在某些实施方案中，修饰(例如，一个或多个修饰)是存在于每个糖和核苷间键中。本发明的修饰可以是核糖核酸(RNA)至脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交分子的修饰。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以包含本文所述的至少一个修饰。
在另一个实施方案中，saRNA是saRNA双链体并且有义链和反义序列可以独立地包含至少一个修饰。作为一个非限制性例子，有义序列可以包含修饰并且反义链可以未经修饰。作为另一个非限制性例子，反义序列可以包含修饰并且有义链可以未经修饰。作为又一个非限制性例子，有义序列可以包含多于一个修饰并且反义链可以包含一个修饰。作为一个非限制性例子，反义序列可以包含多于一个修饰并且有义链可以包含一个修饰。
本发明的saRNA可以包括对糖、核碱基和/或核苷间键修饰的组合。这些组合可以包括本文所述的或在2012年10月3日提交的国际申请公开WO2013/052523中的任一种或多种修饰，尤其式(Ia)-(Ia-5)、(Ib)-(If)、(IIa)-(IIp)、(IIb-1)、(IIb-2)、(IIc-1)-(IIc-2)、(IIn-1)、(IIn-2)、(IVa)-(IVl)和(IXa)-(IXr))，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本发明的saRNA可以沿整个分子长度均匀地或不均匀地被修饰。例如，在本发明的saRNA中，一个或多个或全部类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或任一种或多种或全部的A、G、U、C)可以均匀地被修饰或可以不被均匀地修饰。在一些实施方案中，在本发明saRNA中的全部核苷酸X均被修饰，其中X可以是核苷酸A、G、U、C的任一种，或A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C组合的任一种。
不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键(例如，骨架结构)可以存在于saRNA中的各个位置。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他修饰可以位于saRNA的任何位置处而基本不降低saRNA的功能。本发明的saRNA可以含有约1％至约100％的修饰核苷酸(相对于核苷酸总含量，或相对于一个或多个类型的核苷酸，即A、G、U或C的任一者或多者)或居间的任何百分数(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％以及95％至100％)。
在一些实施方案中，修饰可以在核糖环上。可以取代核糖上的2’-OH基团以保护saRNA免受核糖核酸酶。例如，2’-OH基团可以用2'-O-甲基(2’-OMe)、2'-氟(2’-F)、2’-O-甲氧乙基(2’-O-MOE)、2’-O-烯丙基(2’-O-烯丙基)等取代。
在一些实施方案中，修饰包括核苷酸的双环衍生物(LNA、ENA、CLNA、CENA、AENA等)、无环核苷酸(UNA、PNA等)或含有吡喃环而非核糖的核苷酸(ANA、HNA)。
在一些实施方案中，修饰可以在主链(骨架)上以增加saRNA的核酸酶抗性。非限制性例子包括将磷酸基团(PO)替换为硫代磷酸基团(PS)或硼代磷酸(PB)基团，将3’,5’-磷酸二酯键替换为2',5'-键或酰胺键而非酯键等。
在一些实施方案中，修饰可以在核碱基上。例如，可以将尿苷(U)替换为假尿苷(ψ)、2-硫代尿苷(s2U)、二氢尿苷(D)、5-溴-U、5-碘-U等。可以将嘌呤替换为2,6-二氨基嘌呤。
在一些实施方案中，修饰可以是在saRNA的末端。任何末端修饰都可以用来增加核酸酶抗性，用来促进非对称RISC装配，用来帮助saRNA在细胞中堆积并用来实现saRNA检测。例如，荧光标记物和生物素可以接合至saRNA的末端。在另一个例子中，可以在saRNA的末端使用反向的脱氧核糖。
在一些实施方案中，可以将本发明的saRNA修饰成球状核酸(SNA)或环状核酸。本发明saRNA的末端可以借助化学试剂或酶连接，产生无自由末端的球状saRNA。预计球状saRNA比其线型对应物更稳定并抵抗RNase R核酸外切酶的消化。球状saRNA还可以包含针对A、G、U或C核糖核苷酸的其他结构性和/或化学性修饰。
在一些实施方案中，本发明的saRNA可以包含反向的dT修饰。反向的修饰可以在5'末端或3’末端。在一些实施方案中，将核苷酸的2’-OH用–OMe取代，称作2’-OMe。在一些实施方案中，将核苷酸的2’-OH用–F取代，称作2’-F。在一些实施方案中，核苷酸间存在硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，本发明的saRNA可以包含脱碱基修饰。
本发明的saRNA可以包含修饰的组合。saRNA可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个修饰。例如，saRNA可以包含交替的2’-F修饰和2’-OMe修饰。在一些实施方案中，saRNA可以在其整个长度受到修饰。
可以使用不干扰引导链活性的任何令有义链无活性和/或减少脱靶的合适修饰。
表3包括修饰的CEBPA-saRNA序列和未修饰CEBPA-saRNA序列的非限制性例子。在表3中，小写字母指2’-OMe修饰。‘(invdT)’指在3’和/或5'末端包含反向的dT。‘f’意指位居其前的核苷酸具有2’-F修饰。‘s’意指核苷酸之间存在硫代磷酸酯键。‘dT’指脱氧胸腺嘧啶。‘dG’指脱氧鸟苷。‘dA’指脱氧腺苷。
表3-1修饰的saRNA序列–有义序列
Figure BDA0003506633680000241
表3-2修饰的saRNA序列–反义序列
Figure BDA0003506633680000242
saRNA缀合和组合
缀合可以导致稳定性和/或半寿期增加，并且可以特别用于导引本发明的saRNA至细胞、组织或生物中的特定位点。本发明的saRNA可以设计成缀合至其他多核苷酸、染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、烷基化剂、磷酸化、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶、蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如，对共配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如与指定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体、激素和激素受体，非肽种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子或药物。在2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开了核酸分子的合适缀合物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
根据本发明的，C/EBPα-saRNA可以随以下一者或多者一起施用或进一步编码以下一者或多者：RNAi剂、小干扰性RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、非编码性长RNA(lncRNA)、增强子RNA、增强子衍生的RNA或增强子驱动的RNA(eRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA结合位点、反义RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适配体或载体等，以实现不同功能。一种或多种RNAi剂、小干扰性RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、非编码性长RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA结合位点、反义RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适配体或载体可以包含至少一个修饰或置换。在一些实施方案中，修饰选自核酸在糖位置处的化学取代、在磷酸酯位置处的化学取代和在碱基位置处的化学取代。在其他实施方案中，化学修饰选自掺入修饰的核苷酸；3’帽结构；缀合于高分子量的非免疫原性化合物；缀合于亲脂化合物；以及硫代磷酸掺入磷酸骨架中。在一个优选实施方案中，高分子量非免疫原性化合物是聚二醇，并且更优选地是聚乙二醇(PEG)。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA可以连接至转基因，从而它可以从RNA聚合酶II启动子共表达。在非限制性例子中，C/EBPα-saRNA连接至绿色荧光蛋白基因(GFP)。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA可以连接至DNA或RNA适配体，因而产生C/EBPα-saRNA-适配体缀合物。适配体是具有高度选择性、亲和力和稳定性的寡核苷酸或肽。它们采取特定和稳定的立体形状，因而产生高度特异的牢固的靶分子结合作用。适配体可以是这样的核酸种类，其已经通过反复轮次的体外选择或同等地通过SELEX(通过指数富集的配体系统进化)工程化，从而结合至各种分子靶如小分子、蛋白质、核酸以及甚至细胞、组织和生物。核酸适配体通过相互作用而非经典的Watson-Crick碱基配对而对分子具有特异性结合亲和力。核酸适配体，如通过噬菌体展示或单克隆抗体(mAb)产生的肽，能够与选定的靶特异性结合，并且能够通过结合作用阻断其靶发挥作用。在一些情况下，适配体也可以是肽适配体。对于任何特定分子靶，可以根据核酸的组合文库鉴定核酸适配体，例如通过SELEX鉴定。肽适配体可以使用酵母双杂交系统鉴定。技术人员因此能够设计用于递送本发明的saRNA或细胞至靶细胞如肝脏细胞的合适适配体。本发明包括DNA适配体、RNA适配体和肽适配体。特别优选使用肝特异性适配体，将本发明的saRNA施用至肝脏。
如本文所用，常见的核酸适配体大小大约10-15kDa(20-45个核苷酸)，以至少纳摩尔亲和力结合其靶并且排斥密切相关的靶。核酸适配体可以是核糖核酸、脱氧脱氧核糖核酸，或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。适配体可以是单链核糖核酸，脱氧核糖核酸或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。适配体可以包含至少一个化学修饰。
适配体的合适核苷酸长度是约15个至约100个核苷酸(nt)，并且在各种其他的优选实施方案中，是15-30个nt、20-25个nt、30-100个nt、30-60个nt、25-70个nt、25-60个nt、40-60个nt、25-40个nt、30-40个nt长度、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个nt或者40-70个nt之任一长度。但是，序列可以设计具有足够的柔性，从而它可以兼容适配体与在本文所述的距离的两种靶的相互作用。可以进一步修饰适配体，以提供免受核酸酶和其他酶活性影响的保护作用。适配体序列可以通过本领域已知的任何合适方法修饰。
可以使用任何已知用于连接两个部分的方法，如形成化学键直接、经接头(如链霉亲和素)连接等，形成C/EBPα-saRNA-适配体缀合物。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA可以与抗体连接。产生针对靶细胞表面受体的抗体的方法是熟知的。本发明的saRNA分子可以用已知方法与这类抗体连接，例如使用RNA载体蛋白连接。所产生的复合物随后可以施用至受试者并借助受体介导的内吞作用被靶细胞摄入。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA可以缀合至脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556)、胆酸(Manoharan等人,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060)、硫醚例如beryl-5-tritylthiol(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309；Manoharan等人,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770)、巯基胆固醇(thiocholesterol)(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.,1992,20:533-538)、脂族链，例如，十二醇或十一基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J,1991,10:1111-1118；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259:327-330；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75:49-54)、磷脂，例如，二-鲸蜡基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-鲸蜡基-外消旋-甘油-3-H膦酸酯(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654))、棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237)、或十八烷基胺或己基氨基-羰酰氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937)，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA缀合至Manoharan等人的US20130184328中公开的配体，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。缀合物具有下式：配体-[接头]任选-[系索]任选l-寡核苷酸剂。寡核苷酸剂可以包含亚单位，所述亚单位具有Manoharan等人的US20130184328公开的式(I)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
教授制备这种核酸/脂质缀合物的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，saRNA缀合至碳水化合物配体，如Manoharan等人的美国专利号8106022和8828956(Alnylam Pharmaceuticals)中公开的任何碳水化合物配体，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。例如，碳水化合物配体可以是单糖、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖。这些碳水化合物缀合的RNA剂可以靶向肝脏的实质细胞。在一个实施方案中，saRNA缀合于多于一个、优选地两个或三个碳水化合物配体。在一个实施方案中，saRNA缀合于一个或多个半乳糖部分。在另一个实施方案中，saRNA缀合于至少一个(例如，两个或三个或更多个)乳糖分子(乳糖是与半乳糖偶联的葡萄糖)。在另一个实施方案中，saRNA缀合于至少一个(例如，两个或三个或更多个)N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、N-Ac-氨基葡萄糖(GluNAc)或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸)。在一个实施方案中，saRNA缀合于至少一个甘露糖配体，并且缀合的saRNA靶向巨噬细胞。
本发明的saRNA可以与已知在正在考虑的特定方法中产生作用的其他活性成分联合提供。其他活性成分可以与本发明的saRNA同时、分别或依次施用。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA随调节不同靶基因的saRNA一起施用。非限制性例子包括调节白蛋白基因、胰岛素基因或HNF4A基因的saRNA。可以使用单独saRNA或两种或更多种不同saRNA的组合，实现调节任何基因。可以与本发明的C/EBPα-saRNA一起施用的saRNA的非限制性例子包括2012年6月20日提交的国际公开WO 2012/175958中公开的调节白蛋白或HNF4A的saRNA，2011年10月10日同时提交的国际公开WO 2012/046084和WO 2012/046085中公开的调节胰岛素的saRNA、2006年11月13日提交的美国专利号7,709,456和2010年4月23日提交的美国专利公开US 2010/0273863中公开的调节人孕酮受体、人穹窿主体蛋白(hMVP)、E-钙黏着蛋白基因、p53基因或PTEN基因的saRNA和在2006年4月11日提交的国际公开WO2006/113246中公开的靶向p21基因的saRNA，所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA与抑制C/EBPβ基因表达的小干扰性RNA或siRNA(即，C/EBPβ-siRNA)一起施用。表4中提供了本发明的合适siRNA的优选序列。
表4 siRNA序列
Figure BDA0003506633680000291
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA与一种或多种调节代谢、尤其调节肝功能的药物一起施用。在非限制性例子中，本发明的C/EBPα-saRNA与降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平的药物如他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、依折麦布(ezetimibe)、烟酸、PCSK9抑制剂、CETP抑制剂、氯贝丁酯、非诺贝酸、生育三烯酚、植物甾醇类、胆汁酸螯合剂、普罗布考或其组合一起施用。C/EBPα-saRNA也可以与Orvig等人的US 6287586中公开的钒双胍复合物一起施用。在另一个例子中，C/EBPα-saRNA可以与Rhodes的WO201102838中公开的组合物一起施用以降低血清胆固醇，所述文献的内容通过引用方式完整并入。组合物包含一种选择性结合至并抑制PCSK9蛋白的抗原结合蛋白；和抑制细胞中PCSK9基因表达的RNA效应剂。在又一个例子中，C/EBPα-saRNA可以与具有ABC1生物学活性的ABC1多肽或编码具有ABC1活性的ABC1多肽的核酸一起施用，以如Brooks-Wilson等人的EP1854880中所述那样调节胆固醇水平，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA与增加胰岛素敏感性或治疗II型糖尿病的药物一起施用，如二甲双胍、磺酰脲、非磺酰脲促分泌物、α葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮、吡格列酮、罗格列酮、胰高血糖素样肽-1类似物和二肽基肽酶-4抑制剂或其组合。可以与本发明saRNA组合施用的其他护肝药在Adams等人,Postgraduate Medical Journal,vol.82,315-322(2006)中公开，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
Gankyrin和FXR蛋白
肝细胞癌(HCC)形成是一个涉及基因表达进行性变化的多步骤过程，导致肝过度增生并导致肝癌。在肝癌的癌发生期间，肿瘤抑制蛋白Rb、p53、肝细胞核因子4α(HNF4α)和C/EBP-α变无效。这些蛋白质的消除由癌激活的26S蛋白酶体的小亚基gankyrin介导。Wang等人公开了gankyrin与C/EBPα的S193-ph同工型相互作用并导引它进行泛素-蛋白酶体系统(UPS)介导的降解。Gankyrin水平在肝癌发展的早期阶段期间升高(Wang等人,J.Clin.Invest,vol.120(7):2549-2562(2010)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。抑制gankyrin(例如，使用gankyrin基因(也称作PSMD10基因)的siRNA和/或gankyrin抑制剂抑制)可以预防和/或治疗HCC。
Jiang等人发现类法尼醇X受体(Farnesoid X receptor，FXR)，也称作胆汁酸受体(BAR)或NR1H4，通过借助HDAC1-C/EBPβ复合物沉默gankyrin启动子，而抑制gankyrin在静息肝脏中的表达(Jiang等人,Hepatology,vol.57(3):1098-1106(2013)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。小鼠中FXR信号传导的删除导致gankyrin启动子的去阻遏并导致在12月龄时肝癌自发形成。野生型小鼠中二乙基亚硝基胺(DEN)介导的肝癌还涉及FXR的减少和gankyrin的激活。检验老龄小鼠中的肝癌和人类患者中的肝癌揭示在肝癌自发形成期间，FXR减少，而gankyrin升高。Jiang等人得出结论，FXR通过借助C/EBPβ-HDAC1复合物抑制gankyrin启动子，导致后续保护肿瘤抑制蛋白免于降解而阻止肝癌。FXR的稳定作用和核转位抑制了gankyrin。激活FXR，例如，使用FXR激动剂或激活物或NR1H4基因激活物激活，可以预防和/或治疗HCC。
本发明的C/EBPα-saRNA可以与一个或多个下调gankyrin或上调FXR的治疗剂组合使用。该组合可以对预防和/或治疗HCC具有协同效应。在一些实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA可以与gankyrin-siRNA组合使用。可以使用Higashitsuji等人在‘通过RNAi抑制内源性基因表达’部分中公开的方法产生双链gankyrin-siRNA(Higashitsuji等人,CancerCell,vol.8:75-87(2005)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在一些实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA可以与FXR激动剂组合使用。FXR激动剂或激活物的非限制性例子包括牛磺胆酸、奥贝胆酸(OCA)、INT-767(Intercept Pharmaceuticals)、INT-777(Intercept Pharmaceuticals)和以下文献中公开的任何FXR激动剂或激活物：美国专利申请号20140057886、美国专利号8546365、美国专利号7932244、美国专利申请号20140100209、美国专利号8445472、美国专利号8114862、美国专利申请号20140094443、美国专利号8410083、美国专利号8796249、美国专利申请号20140024631、美国专利号8377916、美国专利号8258267、美国专利号7786102、美国专利号7138390、美国专利号7994352、美国专利号7858608、美国专利号7812011、美国专利申请号20140148428和美国专利申请号20060252670(所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
配制、递送、施用和定剂量
药物制剂可以另外包含可药用赋形剂，如本文所用，所述的可药用赋形剂包括，但不限于任何和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，其合适于所需的具体剂型。用于配制药物组合物的多种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；所述文献通过引用方式完整并入本文)。除了任何常规赋形剂介质可能与某物质或其衍生物不相容的情况下(如因产生任何不想要的生物学效应或另外以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用)，否则可以在本公开的范围内包含使用常规赋形剂介质。
在一些实施方案中，将组合物施用至人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常指如本文所述那样递送的C/EBPα-saRNA。
虽然本文提供的药物组合物描述主要涉及适于施用至人类的药物组合物，技术人员将理解这类组合物通常适于施用至任何其他动物，例如，施用至非人类动物，例如非人类哺乳动物。本领域熟知对适于施用至人类的药物组合物改造以使得该组合物适于施用至多种动物，并且普通技术的兽医药理学家可以仅用普通(如果有的话)实验即可设计和/或开展这类改造。所述药物组合物的施用受试者包括但不限于人类和/或其他灵长类；哺乳类，包括有商业意义的哺乳动物如牛、猪、马、羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括有商业意义的鸟类如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一个实施方案中，可以在正在增殖的细胞中确定本文所述的配制的saRNA的功效。
本文所述药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知或此后开发的任何方法制备。通常而言，这类制备方法包括步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且随后，如果需要和/或合乎需要，将产品分割、成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单元。
可以将本发明的药物组合物作为单独单位剂量和/或作为多个单独单位剂量的量级制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是独立量的药物组合物，其包含预定量的活性成分。活性成分的量通常等于将施用至受试者的活性成分的剂量和/或这种剂量的便利分数，如，例如，一半或三分之一的这种剂量。
本发明药物组合物中活性成分、可药用赋形剂和/或任何额外成分的相对量将根据受到治疗的受试者的身份、体格大小和/或状况变动并且进一步取决于组合物待施用的途径。以举例方式，组合物可以包含0.1％和100％之间、例如0.5％和50％之间、1-30％之间、5-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可以含有至少一种saRNA。作为一个非限制性例子，制剂可以含有1、2、3、4或5种具有不同序列的saRNA。在一个实施方案中，制剂含有至少3种具有不同序列的saRNA。在一个实施方案中，制剂含有至少5种具有不同序列的saRNA。
可以使用一种或多种赋形剂配制本发明的saRNA，从而(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许缓释或延迟释放(例如，从saRNA的贮库制剂释放)；(4)改变生物分布(例如，指引saRNA至特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变所编码蛋白质的体内释放谱。除传统赋形剂如任何和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本发明的赋形剂可以包括而不限于类脂质(lipidoids)、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质-核酸复合物(lipoplexe)、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、用saRNA转染的细胞(例如，用于移植入受试者)、透明质酸酶、纳米粒子模拟物及其组合。因此，本发明的制剂可以包含一种或多种各自处于以下量的赋形剂，所述量共同增加saRNA的稳定性和/或增加saRNA对细胞的转染。另外，可以使用自装配核酸纳米粒子配制本发明的saRNA。在2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开了可以随本发明saRNA一起配制的用于核酸的可药用载体、赋形剂和递送剂，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA包含各自长21个核苷酸且复性形成作为活性成分的双链C/EBPα-saRNA的两条单RNA链。组合物还包含由50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mMNaCl和5mM EDTA组成的盐缓冲液。
在另一个实施方案中，本发明的saRNA可以用树状物递送。树状物是高度分枝的大分子。在一个优选实施方案中，本发明的saRNA与结构上柔性的聚(酰氨基胺))(PAMAM)树状物复合，用于体内定向递送。该复合物称作C/EBPα-saRNA-树状物。树状物具有高程度的分子均一性、窄分子量分布、特定大小和形状的特征，并且具有高度官能化的末端表面。生产工艺是一系列始于中心引发芯部的重复步骤。每种后续生长步骤都代表具有比前代更大分子直径和分子量以及反应性更高的表面位点的新一代聚合物。PAMAM树状物是在其表面上携带伯胺基并且结构的内部还携带叔胺基的核苷酸高效递送系统。伯胺基参与核苷酸结合并促进细胞摄取，而埋入的叔胺基在内体中充当质子海绵并且增强核酸向细胞质中释放。这些树状物保护其所携带的saRNA免于核酶降解并且借助内吞实现saRNA在延长的时间段内大幅度释放，用于高效基因打靶。先前已经评价了这些纳米粒子的体内效力，其中生物分布研究显示树状物偏好地积累在外周血单核细胞并以无可察觉的毒性存活(参见Zhou等人,Molecular Ther.2011Vol.19,2228-2238，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。PAMAM树状物可以包含三乙醇胺(TEA)芯部、二氨基丁烷(DAB)芯部、胱胺芯部、二氨基己烷(HEX)芯部、二氨基十二烷(DODE)芯部或乙二胺(EDA)芯部。优选地，PAMAM树状物包含TEA芯部或DAB芯部。
类脂质
类脂质的合成已有广泛描述并且含有这些化合物的制剂特别适用于递送寡核苷酸或核酸(参见Mahon等人,Bioconjug Chem.2010 21:1448-1454；Schroeder等人,JIntern Med.2010 267:9-21；Akinc等人,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Love等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Siegwart等人,Proc Natl Acad Sci US A.2011 108:12996-3001；所述文献全部完整并入本文)。
尽管这些类脂质已经用来在啮齿类和非人灵长类中有效递送双链小干扰RNA分子(参见Akinc等人,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Frank-Kamenetsky等人,Proc NatlAcad Sci U S A.2008 105:11915-11920；Akinc等人,Mol Ther.2009 17:872-879；Love等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Leuschner等人,NatBiotechnol.2011 29:1005-1010；所述文献全部完整并入本文)，本公开描述了它们的配制(制剂)和在递送saRNA中的用途。可以制备含有这些类脂质的复合物、胶束、脂质体或粒子，并且因此，借助局限化和/或全身性施用途径注射类脂质制剂之后，它们可以导致saRNA的有效递送。saRNA的类脂质复合物可以通过各种手段施用，包括但不限于静脉内、肌内或皮下途径。
体内递送核酸可能受许多参数影响，包括但不限于制剂组成、粒子PEG化的性质、装载程度、寡核苷酸对脂质比和生物物理参数如，但不限于粒度(Akinc等人,MolTher.2009 17:872-879；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。作为一个例子，聚(乙二醇))(PEG)脂质的锚定链长度的微小变化可能显著影响体内效力。可以对具有不同类脂质的制剂测试体内活性，所述类脂质包括但不限于五[3-(1-月桂基氨基丙酰基)]-三乙烯四胺盐酸盐(TETA–5LAP；aka 98N12-5，参见Murugaiah等人,AnalyticalBiochemistry,401:61(2010)；所述文献的内容通过引用方式完整并入本文)、C12-200(包括衍生物和变体)和MD1。
本文中称作“98N12-5”的类脂质由Akinc等人,Mol Ther.2009 17:872-879公开并且其内容通过引用的方式完整并入。(参见图2)
本文中称作“C12-200”的类脂质由Love等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2010107:1864-1869(参见图2)及Liu和Huang,Molecular Therapy.2010 669-670(参见图2)公开；所述两篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。类脂质制剂可以包含粒子，除saRNA之外，所述粒子还包含3或4种或更多种组分。作为一个例子，具有某些类脂质的制剂包含但不限于98N12-5并且可以含有42％脂质、48％胆固醇和10％PEG(C14烷基链长度)。作为另一个例子，具有某些类脂质的制剂包括但不限于C12-200并且可以含有50％类脂质、10％二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％胆固醇及1.5％PEG-DMG。
在一个实施方案中，用类脂质配制以全身性静脉内施用的saRNA可以靶向肝脏。例如，一种使用saRNA并且所含脂质摩尔组成为42％98N12-5、48％胆固醇和10％PEG-脂质，最终重量比为约7.5比1的总脂质对saRNA和在PEG脂质上的C14烷基链长度，平均粒度为大约50–60nm的最终优化型静脉内制剂，可以导致该制剂分布至肝脏超过90％(参见，Akinc等人,Mol Ther.2009 17:872-879；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在另一个例子中，一种使用C12-200(参见美国临时申请61/175,770和公开的国际申请WO2010129709，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文)类脂质的静脉内制剂可以具有50/10/38.5/1.5的C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG摩尔比，总脂质对核酸重量比为7:1且平均粒度80nm，可以有效递送saRNA(参见，Love等人,Proc NatlAcad Sci U S A.2010 107:1864-1869，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在另一个实施方案中，含有MD1类脂质的制剂可以用来在体内有效递送saRNA至肝细胞。用于肌内或皮下途径的优化类脂质制剂的特征可以根据靶细胞类型和制剂穿过胞外基质扩散进入血液的能力显著地变动。尽管小于150nm的粒度可以因内皮窗孔的大小而是有效肝细胞递送所需的(参见，Akinc等人,Mol Ther.2009 17:872-879，所述文献的内容通过引用方式并入本文)，但是类脂质配制的saRNA将制剂递送至其他细胞类型(包括但不限于内皮细胞、髓样细胞和肌肉细胞)的用途可能类似地不受大小限制。已经报道使用类脂质制剂在体内递送siRNA至其他非肝细胞如髓样细胞和内皮(参见Akinc等人,Nat Biotechnol.200826:561-569；Leuschner等人,Nat Biotechnol.2011 29:1005-1010；Cho等人Adv.Funct.Mater.200919:3112-3118；8th International Judah Folkman Conference,Cambridge,MA October 8-9,2010；所述文献每篇的内容通过引用方式并入完整并入本文)。有效递送至髓样细胞如单核细胞，类脂质制剂可以具有相似的组分摩尔比。类脂质和其他组分(包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG)的不同比率可以用来优化saRNA的制剂以递送至不同的细胞类型，包括但不限于肝细胞、髓样细胞、肌肉细胞等。例如，组分摩尔比可以包括，但不限于50％C12-200、10％二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％胆固醇和1.5％PEG-DMG(参见Leuschner等人,Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。脂质制剂通过皮下或肌内递送用于局部递送核酸至细胞(如，但不限于脂肪细胞和肌肉细胞)的用途可能不需要全身性递送所需的全部制剂组分，并且本身可以仅包含类脂质和saRNA。
脂质体(liposome)、脂质-核酸复合物(lipoplex)和脂质纳米粒子
可以使用一种或多种脂质体、脂质-核酸复合物或脂质纳米粒子，配制本发明的saRNA。在一个实施方案中，saRNA的药物组合物包含脂质体。脂质体是人工制备的小泡，所述小泡可以基本由脂质双层组成并且可以用作递送载具以用于养分和药物制剂的施用。脂质体可以具有不同规格，如但不限于其直径可以是数百纳米并且可以含有一系列由狭窄水质区室分隔的同心双层的多层小泡(MLV)；其直径可以小于50nm的小单膜小泡(SUV)，和其直径可以在50和500nm之间的大单层小泡(LUV)。脂质体设计可以包含但不限于调理素(opsonin)或配体，以改善脂质体与不健康组织结合或以激活诸如但不限于内吞的事件。脂质体可以含有低pH或高pH，以改善药物制剂递送。
脂质体的形成可以取决于多种物理化学特征，如，但不限于包埋的药物制剂和脂质体成分，其中分散有脂质小泡的介质的性质，所包埋物质的有效浓度和其潜在毒性，在施加和/或递送小泡期间涉及的任何额外过程，优化规格，用于预期应用的小泡的多分散性和保质期，以及批次间重现性和大规模生产安全和高效脂质体产品的可能性。
在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以包含而不限于多种脂质体，如从1,2-二油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)脂质体、来自Marina Biotech(Bothell,WA)的DiLa2脂质体、1,2-二亚油氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)和MC3(US20100324120；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)形成的那些脂质体，以及可以递送小分子药物的脂质体，如，但不限于来自Janssen Biotech,Inc.(Horsham,PA)的
Figure BDA0003506633680000361
在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以包含而不限于多种脂质体，如从合成先前已经描述并显示适用于体外和体内递送寡核苷酸的稳定化质粒-脂质粒子(SPLP)或稳定化核酸脂质粒子(SNALP)中形成的那些脂质体(参见Wheeler等人,GeneTherapy.1999 6:271-281；Zhang等人,Gene Therapy.19996:1438-1447；Jeffs等人,PharmRes.2005 22:362-372；Morrissey等人,Nat Biotechnol.2005 2:1002-1007；Zimmermann等人,Nature.2006 441:111-114；Heyes等人,J Contr Rel.2005 107:276-287；Semple等人,Nature Biotech.201028:172-176；Judge等人,J Clin Invest.2009 119:661-673；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132；所述文献每篇的内容完整并入本文)。Wheeler等人的原始制造方法是去垢剂透析法，所述方法稍后由Jeffs等人改进，并且称作自发性小泡形成法。脂质体制剂可以由除saRNA之外的3至4种脂质组分组成。作为一个例子，脂质体可以含有但不限于55％胆固醇、20％二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、10％PEG-S-DSG和15％1,2-二油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)，如Jeffs等人所描述。在另一个例子中，某些脂质体制剂可以含有但不限于48％胆固醇、20％DSPC、2％PEG-c-DMA和30％阳离子脂质，其中阳离子脂质可以是1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亚麻基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLenDMA)，如Heyes等人所描述。在另一个例子中，核酸-脂质粒子可以包含阳离子脂质，其占粒子中存在的总脂质约50mol％至约85mol％的；非阳离子脂质，其占粒子中存在的总脂质约13mol％至约49.5mol％；和抑制粒子聚集的共轭脂质，其占粒子中存在的总脂质约0.5mol％至约2mol％，如Maclachlan等人的WO 2009127060中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个例子中，核酸-脂质粒子可以是在Maclachlan等人的US2006008910中公开的任何核酸-脂质粒子，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，核酸-脂质粒子可以包含式I的阳离子脂质、非阳离子脂质和抑制粒子聚集的共轭脂质。
在一个实施方案中，saRNA可以在脂质小泡中配制，所述脂质小泡可以在官能化脂质双层之间具有交联。
在一个实施方案中，脂质体可以含有在Bally等人的US 5595756中公开的糖修饰的脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。脂质可以是量约10mol％的神经节苷脂和脑苷脂。
在一个实施方案中，saRNA可以在包含阳离子脂质的脂质体中配制。脂质体可以具有阳离子脂质中氮原子对saRN中磷酸酯的1:1和20:1之间的摩尔比(N:P比率)，如国际公开号WO 2013006825中所述，所述文献的内容通过引用方式完整并入本文。在另一个实施方案中，脂质体可以具有大于20:1或小于1:1的N:P比率。
在一个实施方案中，saRNA可以配制在脂质-聚阳离子复合物中。脂质-聚阳离子复合物的形成可以通过本领域已知的方法和/或如美国公开号20120178702中所述那样实现，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，聚阳离子可以包括阳离子肽或多肽如，但不限于，在国际公开号WO2012013326(所述文通过引用的方式完整并入本文)中描述的聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸以及阳离子肽。在一个实施方案中，saRNA可以在脂质-聚阳离子复合物中配制，所述脂质-聚阳离子复合物还可以包含中性脂质，如，但不限于胆固醇或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
可以通过但不限于阳离子脂质组分的选择、阳离子脂质饱和度、PEG化的性质、全部组分的比率和生物物理参数如大小，影响脂质体制剂。在Semple等人(Semple等人,Nature Biotech.2010 28:172-176；所述文献的内容通过引用方式完整并入本文)的一个例子中，脂质体制剂由57.1％阳离子脂质、7.1％二棕榈酰磷脂酰胆碱、34.3％胆固醇和1.4％PEG-c-DMA组成。
在一些实施方案中，可以增加或减少脂质纳米粒子(LNP)制剂中PEG的比率和/或可以调整PEG脂质的碳链长度从C14至C18，以改变LNP制剂的药代动力学和/或生物分布。作为一个非限制性例子，LNP制剂可以含有与阳离子脂质相比1-5％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG、DSPC和胆固醇。在另一个实施方案中，可以将PEG-c-DOMG替换为PEG脂质，例如但不限于PEG-DSG(1,2-二硬脂酰-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)或PEG-DPG(1,2二棕榈酰-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)。阳离子脂质可以选自本领域已知的任何脂质，如，但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一个实施方案中，saRNA可以在脂质纳米粒子(如在国际公开号WO 2012170930中描述的脂质纳米粒子)中配制，所述文献的内容通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，可以在本发明制剂中使用的阳离子脂质可以选自，但不限于在以下文献中描述的阳离子脂质：国际公开号WO 2012040184、WO 2011153120、WO2011149733、WO 2011090965、WO 2011043913、WO 2011022460、WO 2012061259、WO2012054365、WO 2012044638、WO 2010080724、WO 201021865和WO 2008103276，美国专利号7,893,302、7,404,969和8,283,333和美国专利公开号US20100036115和US20120202871；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于在国际公开号WO 2012040184、WO 2011153120、WO 2011149733、WO2011090965、WO 2011043913、WO 2011022460、WO 2012061259、WO 2012054365and WO2012044638中描述的式A；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。在又一个实施方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于国际公开号WO2008103276的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,893,302的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,404,969的式CLI-CLXXXXII和美国专利公开号US20100036115的式I-VI；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。在又一个实施方案中，阳离子脂质可以是多价阳离子脂质如在Gaucheron等人的美国专利号7223887中公开的阳离子脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。阳离子脂质可以具有包含两个季胺基团的带正电荷的头基团和包含四条烃链的疏水性部分，如Gaucheron等人的美国专利号7223887中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在又一个实施方案中，阳离子脂质可以是生物可降解，如在Maier等人的US20130195920中公开的生物可降解脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。阳离子脂质可以具有位于阳离子脂质的脂质部分的一个或多个生物可降解基团，如Maier等人的US 20130195920的式I-IV中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，阳离子脂质可以选自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺、(15Z,18Z)-Ν,Ν-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十七碳-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十六碳-22-烯-10-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七碳-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六碳-8-胺、Ν,Ν-二甲基H-[(1R,2S)-2-十一基环丙基]十四碳-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二碳-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-Ν,Ν-二甲基十八碳-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五碳-6-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五碳-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧]丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吖丁啶、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺；(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八碳-6,9,12-三烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-Ν,Ν-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二碳-l3,16-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六碳-9-烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧]-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}氧)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧}-3-(辛氧基)丙-2-胺和(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,2-三烯-10-胺或其可药用盐或立体异构体。
在一个实施方案中，脂质可以是可切割脂质，如国际公开号WO 2012170889中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的纳米粒子可以包含本文所述的和/或本领域已知的至少一种阳离子聚合物。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以通过本领域已知和/或如国际公开号WO2012040184、WO 2011153120、WO 2011149733、WO 2011090965、WO 2011043913、WO2011022460、WO 2012061259、WO 2012054365、WO 2012044638、WO 2010080724和WO201021865中所述的方法合成；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，saRNA的LNP制剂可以按3％脂质摩尔比含有PEG-c-DOMG。在另一个实施方案中，saRNA的LNP制剂可以按1.5％脂质摩尔比含有PEG-c-DOMG。
在一个实施方案中，saRNA的药物组合物可以包含至少一种在国际公开号2012099755中描述的聚乙二醇化脂质，所述文献的内容通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油酰-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。在一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、本领域已知的一种阳离子脂质和至少一个其他组分。在另一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、本领域已知的一种阳离子脂质、DSPC和胆固醇。作为一个非限制性例子，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇。作为另一个非限制性例子，LNP制剂可以含有摩尔比2:40:10:48的PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇(参见例如Geall等人,Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines,PNAS2012；PMID:22908294；所述文献通过引用方式完整并入本文)。作为另一个非限制性例子，本文所述的saRNA可以在纳米粒子中配制以通过肠胃外途径递送，如美国公开号20120207845中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。阳离子脂质也可以是在Manoharan等人的US20130156845和Manoharan等人的US20130129785、Wasan等人的WO2012047656、Chen等人的WO 2010144740、Ansell等人的WO 2013086322或Manoharan等人的WO 2012016184中公开的阳离子脂质，所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用多个阳离子脂质配制，如Hope等人的US20130017223中所述的第一和第二阳离子脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。第一阳离子脂质可以基于第一特性选择，第二阳离子脂质可以基于第二特性选择，其中可以如US20130017223中所概述那样确定所述特性，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在一个实施方案中，第一和第二特性是互补的。
在另一个实施方案中，saRNA可以用包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种第二脂质的脂质粒子以及一种或多种核酸配制，其中脂质粒子包含实心，如Cullis等人的美国专利公开号US 20120276209中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以在水包油(o/w)乳液中与阳离子性两亲分子复合，如Satishchandran等人的EP2298358中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。阳离子性两亲分子可以是阳离子脂质、修饰或未修饰的精胺、布比卡因或苯扎氯铵，并且油可以是植物油或动物油。作为一个非限制性例子，至少10％的核酸-阳离子性两亲分子复合物处于水包油乳液的油相(参见例如，在Satishchandran等人的欧洲公开号EP2298358中描述的复合物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用包含阳离子性化合物和中性脂质的混合物的组合物配制。作为一个非限制性例子，阳离子性化合物可以是在Ansell等人的WO1999010390中公开的式(I)，所述文献的内容通过应用的方式在本文中完整公开，并且中性脂质可以选自二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺和鞘磷脂。
在一个实施方案中，LNP制剂可以由国际公开号WO 2011127255或WO 2008103276中描述的方法配制，所述文献的每篇通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，本发明的saRNA可以包封于如WO 2011127255和/或WO 2008103276中所述的任意脂质纳米粒子(LNP)制剂中；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整地并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂可以包含聚阳离子组合物。作为一个非限制性例子，聚阳离子组合物可以选自美国专利公开号US20050222064的式1-60；所述文献的内容通过引用的方式完整地并入本文。在另一个实施方案中，包含聚阳离子组合物的LNP制剂可以用于体内和/或体外递送本文所述的saRNA。
在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂可以另外包含渗透促进分子。非限制的渗透促进分子在美国专利公开号US20050222064中描述；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，药物组合物可以配制在脂质体中，所述脂质体例如是但不限于DiLa2脂质体(Marina Biotech,Bothell,WA)、
Figure BDA0003506633680000431
/NOV340(MarinaBiotech,Bothell,WA)、基于中性DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如，用于卵巢癌的siRNA递送(Landen等人,Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)；所述文献通过引用方式完整并入本文)和透明质糖包覆的脂质体(Quiet Therapeutics,Israel)。在一些实施方案中，药物组合物可以用Panzner等人的WO 2008/043575和Essler等人的US8580297中公开的任何两性脂质体配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。两性脂质体可以包含脂质混合物，所述的脂质包含阳离子性两亲分子、阴离子性两亲分子和任选一种或多种中性两亲分子。两性脂质体可以包含基于两性分子的两性化合物，其头基团置换为一个或多个两性基团。在一些实施方案中，药物组合物可以用包含等电点在具有4和9之间的一个或多个两性基团的两性脂质配制，如Essler等人的US20140227345中公开，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
纳米粒子制剂可以是包含碳水化合物载体和核酸分子(例如，saRNA)的碳水化合物纳米粒子。作为一个非限制性例子，碳水化合物载体可以包括，但不限于酐修饰的植物糖原或糖原型材料、植物糖原琥珀酸辛烯酯、植物糖原β-糊精、酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如，国际公开号WO 2012109121；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
可以通过将阳离子脂质替换为称作快速消除性脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解阳离子脂质，改进脂质纳米粒子制剂。可电离阳离子脂质，如，但不限于DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA，已经显示随时间推移蓄积在血浆和组织中，并且可能是毒性的潜在来源。快速消除性脂质的快速代谢可以改善脂质纳米粒子在大鼠中的耐受性和治疗指数从1mg/kg剂量至10mg/kg剂量的数量级。纳入酶促降级的酯键可以改善阳离子组分的降解和代谢特征，同时仍然维持reLNP制剂的活性。酯键可以内在地位于脂质链内部或它可以末端地位于脂质链的终末端处。内部酯键可以替换脂质链中的任何碳。
在一个实施方案中，将saRNA配制为脂质-核酸复合物，如，而不限于，来自SilenceTherapeutics(伦敦，英国)的ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和其他siRNA-脂质体DNA复合物技术，来自
Figure BDA0003506633680000441
(Cambridge,MA)的STEMFECTTM和基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白的定向和非定向核酸递送(Aleku等人,Cancer Res.2008 68:9788-9798；Strumberg等人,Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78；Santel等人,Gene Ther2006 13:1222-1234；Santel等人,Gene Ther 2006 13:1360-1370；Gutbier等人,PulmPharmacol.Ther.2010 23:334-344；Kaufmann等人,Microvasc Res 2010 80:286-293Weide等人,J Immunother.2009 32:498-507；Weide等人,J Immunother.2008 31:180-188；Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4:1285-1294；Fotin-Mleczek等人,2011J.Immunother.34:1-15；Song等人,Nature Biotechnol.2005,23:709-717；Peer等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 6；104:4095-4100；deFougerolles Hum GeneTher.2008 19:125-132；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，也可以构建这类制剂或改变组合物，从而它们被动或主动地在体内指向不同细胞类型，包括但不限于肝细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、抗原呈递细胞和白细胞(Akinc等人,Mol Ther.2010 18:1357-1364；Song等人,NatBiotechnol.2005 23:709-717；Judge等人,J Clin Invest.2009 119:661-673；Kaufmann等人,Microvasc Res 2010 80:286-293；Santel等人,Gene Ther 2006 13:1222-1234；Santel等人,Gene Ther 2006 13:1360-1370；Gutbier等人,Pulm Pharmacol.Ther.201023:334-344；Basha等人,Mol.Ther.2011 19:2186-2200；Fenske和Cullis,Expert OpinDrug Deliv.2008 5:25-44；Peer等人,Science.2008 319:627-630；Peer和Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133；所述文献每篇的内容通过引的用方式完整并入本文)。向肝脏细胞被动靶向制剂的一个例子包括基于DLin-DMA，DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA-的脂质纳米粒子制剂，其中已经显示所述制剂与载脂蛋白E结合并在体内促进这些制剂的结合及其摄入肝细胞(Akinc等人,Mol Ther.2010 18:1357-1364；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。制剂也可以通过在其表面上表达不同配体被选择性地靶向，如叶酸靶向、转铁蛋白靶向、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和抗体靶向方案所例举，但不限于此(Kolhatkar等人,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197-206；Musacchio和Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388-1412；Yu等人,Mol Membr Biol.2010 27:286-298；Patil等人,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1-61；Benoit等人,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714；Zhao等人,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309-319；Akinc等人,Mol Ther.201018:1357-1364；Srinivasan等人,Methods MolBiol.2012 820:105-116；Ben-Arie等人,Methods Mol Biol.2012 757:497-507；Peer2010J Control Release.20:63-68；Peer等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:4095-4100；Kim等人,Methods Mol Biol.2011 721:339-353；Subramanya等人,MolTher.2010 18:2028-2037；Song等人,Nat Biotechnol.2005 23:709-717；Peer等人,Science.2008319:627-630；Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，将saRNA配制为固态脂质纳米粒子。固态脂质纳米粒子(SLN)可以为球状，平均直径在10至1000nm之间。SLN拥有可以溶解亲脂分子并可以用表面活性剂和/或乳化剂稳定化的固态脂质核心基质。在又一个实施方案中，脂质纳米粒子可以是自装配脂质-聚合物纳米粒子(参见Zhang等人,ACS Nano,2008,2(8),第1696–1702页；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，可以配制本发明的saRNA用于控释和/或定向递送。如本文所用，“控释”指符合特定释放模式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放特征。在一个实施方案中，saRNA可以包封入本文所述和/或本领域已知的递送剂中以便控释和/或定向递送。如本文所用，术语“包封”意指围绕、包围或包裹。在它涉及本发明化合物的制剂时，包封可以是基本上的、完整的或部分的。术语“基本上包封”意指至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.9％或大于99.999％的本发明药物组合物或化合物可以封闭、包围或包裹在递送剂内部。“部分包封”意指小于10％、10％、20％、30％、40％、50％或更少的本发明药物组合物或化合物可以封闭、包围或包裹在递送剂内部。有利地，可以通过使用荧光和/或电子显微照片测量本发明药物组合物或化合物的逃逸或活性，测定包封。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大99.99％的本发明药物组合物或化合物被包封在递送剂中。
在另一个实施方案中，saRNA可以包封入脂质纳米粒子或快速消除的脂质纳米粒子中，并且脂质纳米粒子或快速消除的脂质纳米粒子随后可以包封入本文所述的和/或本领域已知的聚合物、水凝胶和/或手术密封剂中。作为一个非限制性例子，聚合物、水凝胶或外科密封剂(surgical sealant)可以是PLGA、乙烯醋酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、
Figure BDA0003506633680000461
(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、
Figure BDA0003506633680000463
(HalozymeTherapeutics,San Diego CA)、外科密封剂如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、
Figure BDA0003506633680000462
(Baxter International,Inc Deerfield,IL)、基于PEG的密封剂和
Figure BDA0003506633680000471
(Baxter International,Inc Deerfield,IL)。
在另一个实施方案中，脂质纳米粒子可以包封到本领域已知的可以在注入受试者时形成凝胶的任何聚合物中。作为另一个非限制性例子，脂质纳米粒子可以包封入可以呈生物可降解的聚合物基质中。
在一个实施方案中，用于控释和/或定向递送的saRNA制剂还可以包含至少一种控释涂覆剂。控释涂覆剂包括但不限于
Figure BDA0003506633680000472
聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物，聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、EUDRAGIT
Figure BDA0003506633680000474
EUDRAGIT
Figure BDA0003506633680000473
和纤维素衍生物如乙基纤维素含水分散体(
Figure BDA0003506633680000476
和
Figure BDA0003506633680000475
)。
在一个实施方案中，控释和/或靶向递送制剂可以包含至少一种可以含有聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)及其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可以包含PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用具有导引(靶向)部分如Manoharan等人的US20130202652中公开的导引部分的导引脂质配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，可以选择Manoharan等人的US20130202652的式I导引部分，旨在有利于脂质定位于所需的器官、组织、细胞、细胞类型或亚型或细胞器。本发明中包括的非限制性导引部分包括转铁蛋白、茴香酰胺、RGD肽、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、岩藻糖、抗体或适配体。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以包封在治疗性纳米粒子中。治疗性纳米粒子可以通过本文所述的和本领域已知的方法配制，如，但不限于国际公开号WO2010005740、WO 2010030763、WO 2010005721、WO 2010005723、WO 2012054923、美国公开号US20110262491、US20100104645、US20100087337、US20100068285、US20110274759，US20100068286和US20120288541和美国专利号8,206,747、8,293,276，8,318,208和8,318,211；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，治疗性聚合物纳米粒子可以通过美国公开号US20120140790中描述的方法鉴定，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，可以配制治疗性纳米粒子用于缓释。如本文所用，“缓释”指在特定时间段范围内符合释放速率的药物组合物或化合物。时间段可以包括，但不限于数小时、数天、数周、数月和数年。作为一个非限制性例子，缓释纳米粒子可以包含聚合物和治疗药，如，但不限于本发明的saRNA(参见国际公开号2010075072和美国公开号US20100216804、US20110217377和US20120201859，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，可以配制治疗性纳米粒子以具有靶特异性。作为一个非限制性例子，治疗性纳米粒子可以包含皮质类固醇(参见国际公开号WO 2011084518；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在一个实施方案中，可以配制治疗性纳米粒子以具有癌特异性。作为一个非限制性例子，治疗性纳米粒子可以配制在国际公开号WO2008121949、WO 2010005726、WO 2010005725，WO 2011084521和美国公开号US20100069426、US20120004293和US20100104655中描述的纳米粒子中，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的纳米粒子可以包含聚合物基质。作为非限制性例子，纳米粒子可以包含两种或更多种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、多胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)或其组合。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子包含双嵌段共聚物。在一个实施方案中，双嵌段共聚物可以包含与以下聚合物组合的PEG，如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、多胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)或其组合。
作为一个非限制性例子，治疗性纳米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公开号US20120004293和美国专利号8,236,330，所述文献每篇通过引用的方式完整并入本文)。在另一个非限制性例子中，治疗性纳米粒子是包含PEG和PLA或PEG和PLGA的双嵌段共聚物的隐形纳米粒子(参见美国专利号8,246,968和国际公开号WO 2012166923，所述文献每篇的内容通过引用方式并入完整并入本文)。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含多嵌段共聚物如，但不限于美国专利号8,263,665和8,287,910中描述的多嵌段共聚物；所述文献每篇的内容通过引用方式并入完整并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的嵌段共聚物可以包含于包含非聚合物胶束和嵌段共聚物的多价离子复合物中。(参见例如，美国公开号20120076836；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含至少一种丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其组合。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含至少一种含胺聚合物如，但不限于聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，聚(酰氨基胺)树状物，聚(β-氨基酯)(参见例如，美国专利号8,287,849；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)及其组合。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含至少一种可以含有聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)及其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可以包含PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。
在另一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包括至少一种导引配体的缀合。导引配体可以是本领域已知的任何配体，如，但不限于，单克隆抗体。(Kirpotin等人,CancerRes.2006 66:6732-6740；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以配制在可以用来靶向癌的水溶液中(参见国际公开号WO2011084513和美国公开号US20110294717，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，saRNA可以包封于合成性纳米载体中、与之连接和/或缔合。合成性纳米载体包括但不限于以下文献中描述的那些：国际公开号WO 2010005740、WO2010030763、WO 201213501、WO 2012149252、WO 2012149255、WO 2012149259、WO2012149265、WO 2012149268、WO 2012149282、WO 2012149301、WO 2012149393、WO2012149405、WO 2012149411、WO 2012149454和WO 2013019669以及美国公开号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US20120244222，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。可以使用本领域已知的和/或本文所述的方法配制合成性纳米载体。作为一个非限制性例子，合成性纳米载体可以通过国际公开号WO 2010005740、WO2010030763和WO 201213501以及美国公开号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US2012024422中描述的方法配制，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，合成性纳米载体制剂可以通过国际公开号WO2011072218和美国专利号8,211,473中描述的方法冻干；所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，合成性纳米载体可以含有反应基团以释放本文所述的saRNA(参见国际公开号WO 20120952552和美国公开号US20120171229，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，可以配制合成性纳米载体用于定向释放。在一个实施方案中，可以配制合成性纳米载体以在指定的pH和/或在所需的时间区间后释放saRNA。作为一个非限制性例子，可以配制合成性纳米粒子以在24小时后和/或在pH 4.5释放saRNA(参见国际公开号WO 2010138193和WO 2010138194和美国公开号US20110020388和US20110027217，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，可以配制合成性纳米载体用于控释和/或缓释本文所述的saRNA。作为一个非限制性例子，用于缓释的合成性纳米载体可以通过本领域已知、本文所述和/或如国际公开号WO 2010138192和美国公开号20100303850中所述的方法配制，所述文献每篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，纳米粒子可以经优化用于口服施用。纳米粒子可以包含至少一种阳离子生物聚合物，如，但不限于壳聚糖或其衍生物。作为一个非限制性例子，纳米粒子可以通过美国公开号20120282343中描述的方法配制；所述文献的内容通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以配制在如Manoharan等人的US8575123中描述的模块组合物(modular composition)中，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，模块组合物可以包含核酸(例如，本发明的saRNA)，至少一种内体裂解组分(endosomolytic component)和至少一种导引配体。模块组合物可以具有某种式，如Manoharan等人的US8575123中描述的任何式，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以包封在脂质制剂中，以形成如Fougerolles等人的US8546554中描述的稳定核酸-脂质粒子(SNALP)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。脂质可以是阳离子的或非阳离子的。在一个非限制性例子中，脂质对核酸比率(质量/质量比)(例如，脂质对saRNA比率)将处于约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1、或5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或11:1的范围内。在另一个例子中，SNALP包含40％的2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(脂质A)、10％的二油酰磷脂酰胆碱(DSPC)、40％的胆固醇、10％聚乙二醇(PEG)-C-DOMG(mol％)，粒度为63.0±20nm并且核酸/脂质比为0.027。在另一个实施方案中，本发明的saRNA可以用包含如Lam等人的US7189705中公开的内体膜去稳定化物的核酸-脂质粒子配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，内体膜去稳定化物可以是Ca2+离子。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用如Akine等人的US8148344中公开的脂质粒子(FLiP)配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。Akine等人教授到，FLiP可以包含已经与亲油物缀合的至少一种单链或双链寡核苷酸，和已经与缀合的寡核苷酸聚集、混合或结合的至少一种乳液或脂质体。这些粒子已经令人惊讶地显示有效地递送寡核苷酸至心脏、肺和肌肉，如Akine等人的US8148344中公开，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，可以使用脂质制剂中包含表达载体的组合物，递送本发明的saRNA至细胞，如Tam等人的US6086913中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。Tam公开的组合物是血清稳定的并且包含表达载体，所述表达载体包含来自腺联病毒(AAV)的第一和第二反向重复序列、来自AAV的rep基因和核酸片段。Tam中的表达载体与脂质复合。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用de Fougerolles等人的US20120270921中公开的脂质制剂配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在一个非限制性例子中，脂质制剂可以包括具有在US20120270921中所述的式A的阳离子脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个非限制性例子中，US20120270921的表A中公开的示例性核酸-脂质粒子的组合物可以随本发明的saRNA一起使用，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以完全包封在Maurer等人的US20120276207中公开的脂质粒子中，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。这些粒子可以包含具有预先形成的脂质小泡的脂质组合物、带电荷的治疗剂和去稳定剂，以形成预先形成的小泡和治疗剂在去稳定化溶剂中的混合物，其中所述去稳定化溶剂在不破坏小泡的情况下有效地使预先形成的脂质小泡的膜去稳定化。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用共轭(conjugated)脂质配制。在非限制性例子中，共轭脂质可以具有如Lin等人的US20120264810中描述的式，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。共轭脂质可以形成脂质粒子，其还包含阳离子脂质、中性脂质和能够减少聚集的脂质的。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以在Fitzgerald等人的US 20120244207中公开的中性脂质体制剂中配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。短语“中性脂质体制剂”指在生理pH具有近中性或中性表面电荷的脂质体制剂。生理pH可以例如是约7.0至约7.5，或例如是约7.5，或例如是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，或例如是7.3，或例如是7.4。中性脂质体制剂的例子是可解离的脂质纳米粒子(iLNP)。中性脂质体制剂可以包含可电离的阳离子脂质，例如，DLin-KC2-DMA。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用带电荷的脂质或氨基脂质配制。如本文所用，术语“带电荷的脂质”意在包括那些具有一个或两个脂酰基或脂肪烷基链和一个季铵头基的脂质。季胺携带永久性正电荷。头基团可以任选地包括可电离基团，如可以在生理pH质子化的伯胺、仲胺或叔胺。季胺的存在可以相对于缺少季胺的结构相似的化合物中基团的pKa而改变可电离基团的pKa(例如，用叔胺替换季胺)。在一些实施方案中，带电荷的脂质称作“氨基脂质”。在非限制性例子中，氨基脂质可以是Hope等人的US20110256175中描述的氨基脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。例如，氨基脂质可以具有在Hope等人的US20110256175中公开的作为结构(II)、DLin-K-C2-DMA、DLin-K2-DMA、DLin-K6-DMA公开的结构，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个例子中，氨基脂质可以具有如Muthiah等人的WO 2009132131中所述的结构(I)、(II)、(III)或(IV)或4-(R)-DUn-K-DMA(VI)、4-(S)-DUn-K-DMA(V)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个例子中，在本文所述的任何制剂中使用的带电荷脂质可以是Manoharan等人的EP2509636中描述的任何带电荷脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明saRNA可以用含有脂质、脂质体或脂质-核酸复合物(lipoplexe)的缔合复合物配制。在非限制性例子中，缔合复合物包含一种或多种各自具有式(I)限定的结构的化合物、具有式(XV)限定的结构的PEG-脂质、Manoharan等人的US8034376中公开的类固醇和核酸，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。saRNA可以用US8034376中描述的任何缔合复合物配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以用反向头基脂质配制。作为一个非限制性例子，saRNA可以用包含头基的两性离子脂质配制，其中正电荷是位于酰基链区域附近并且负电荷位于头基的远端，如具有Leung等人的WO2011056682中描述的结构(A)或结构(I)的脂质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以配制在脂质双层载体中。作为一个非限制性例子，saRNA可以与脂质-去垢剂混合物组合，所述脂质-去垢剂混合物包含量为约5mol％至约20mol％的防聚集剂、量为约0.5mol％至约50mol％的阳离子脂质和融合脂质和去垢剂的脂质混合物，以提供核酸-脂质-去垢剂混合物；并且随后用缓冲的盐溶液透析所述核酸-脂质-去垢剂混合物以移除所述去垢剂，并在脂质双层载体中包封所述核酸，以及提供脂质双层-核酸组合物，其中所述缓冲的盐溶液具有足以包封约40％至约80％的所述核酸的离子强度，如Cullis等人的WO 1999018933中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可以配制在能够选择性导引saRNA至心脏、肝脏或肿瘤组织部位的核酸-脂质粒子中。例如，核酸-脂质粒子可以包含(a)核酸；(b)1.0mol％至45mol％的阳离子脂质；(c)0.0mol％至90mol％的另一种脂质；(d)1.0mol％至10mol％的双层稳定组分；(e)0.0mol％至60mol％的胆固醇；和(f)0.0mol％至10mol％的阳离子聚合物脂质，如Cullis等人的EP1328254中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。Cullis教授，变动所述阳离子脂质、双层稳定组分、另一种脂质、胆固醇和阳离子聚合物脂质中每一种的量可以赋予针对心脏、肝脏或肿瘤组织部位的组织选择性，从而鉴别能够选择性导引核酸至心脏、肝脏或肿瘤组织部位的核酸-脂质粒子。
递送
考虑到药物递送科学的可能进展，本公开涵盖了用于治疗、药物、诊断或成像用途的通过任何适宜途径的saRNA递送。递送可以是裸的或经配制的。
可以将本发明的saRNA裸输送至细胞。如本文所用在中，“裸”指不含促进转染的物质情况下递送saRNA。例如，递送至细胞的saRNA可以不含有修饰。可以使用本领域已知的和本文所述的施用途径，递送裸saRNA至细胞。
可以使用本文所述的方法，配制本发明的saRNA。制剂可以含有可以经修饰的和/或未经修饰的saRNA。制剂还可以包括但不限于细胞渗透剂、可药用载体、递送剂、生物溶蚀性或生物相容性聚合物、溶剂和缓释递送储库。可以使用本领域已知的和本文所述的施用途径，递送配制的saRNA至细胞。
也可以配制组合物制以按照本领域几种方式中任一方式，直接递送至器官或组织，所述方式包括但不限于直接浸泡或浸浴、通过导管、通过凝胶剂、散剂、软膏、霜、凝胶剂、洗剂和/或滴剂、通过使用以该组合物涂覆或浸渍的基质如织物或生物可降解材料等。也可以将本发明的saRNA克隆入逆转录病毒复制型载体(RRV)并转导至细胞。
施用
本发明的saRNA可以通过产生治疗有效结果的任何途径施用。这些途径包括但不限于肠内、胃肠、硬膜外、经口、经皮、硬膜外(epidural，peridural)、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮的(施加到皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、经鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射进入腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵体内注射(进入阴茎基部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、经皮(扩散穿过完整皮肤以便全身性分布)、经粘膜(扩散穿过粘膜)、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(滴到结膜上)或在滴耳剂中。在具体实施方案中，组合物可以按照允许它们跨越血-脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。在2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开的施用途径可以用来施用本发明的saRNA，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
剂型
本文所述的药物组合物可以配制成本文所述的剂型，如局部用(topical)、鼻内、气管内或可注射用(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、心内、腹膜内、皮下)。在2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中描述的液态剂型、可注射制品、肺用形式和固态剂型可以作为用于本发明的saRNA的剂型，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
II.使用方法
本发明的一个方面提供了使用C/EBPα-saRNA和包含所述C/EBPα-saRNA及至少一种可药用载体的药物组合物的方法。C/EBPα-saRNA调节C/EBPα基因表达。在一个实施方案中，与不存在本发明的saRNA情况下C/EBPα基因表达相比，C/EBPα基因的表达在本发明的saRNA存在下增加至少20％、30％、40％，更优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％，甚至更优选地至少80％。在又一个优选的实施方案中，与不存在本发明的saRNA情况下C/EBPα基因表达相比，C/EBPα基因的表达在本发明的saRNA存在下增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、更优选地增加至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍，甚至更优选地增加至少60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。
在一个实施方案中，本文描述的saRNA的基因表达增加显示在正在增殖的细胞中。
代谢调节
通常认为肝细胞对维持几种重要功能重至关要。例如，它们可以调节碳水化合物和脂质代谢及外源和内源化合物的脱毒。C/EBPα在多种组织中表达，在这些组织，它在许多细胞类型(包括脂肪细胞、II型肺泡细胞和肝细胞)的分化中发挥重要作用。在小鼠中，C/EBPα最丰富地存在于脂肪组织、肝组织和肺组织中。C/EBPα的功能角色包括，但不限于，调节α-1-抗胰蛋白酶、转甲状腺素蛋白和白蛋白。另外，C/EBPα基因在肝细胞系(HepG2)中的表达导致细胞色素P450(CYP)(参与内源底物代谢并在关键生物异源物质的脱毒和代谢性活化中发挥关键作用的单加氧酶超家族)的水平升高[Jover等人,FEBS Letters,vol.431(2),227-230(1998)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文]。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是全球重大健康问题并且影响美国三分之一人口。NAFLD是不因过度饮酒引起的额外脂肪(脂质)在肝脏细胞中堆积。如果超过5％-10％的肝重量是脂肪，则将它称作脂肪肝(脂肪变性)。NAFLD可以进展成脂肪肝炎、肝硬化和肝癌。它与多种代谢疾病相关如代谢综合征、胰岛素抵抗、II型糖尿病、高脂血症、高血压、肥胖症等。治疗方法包括降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平、改善胰岛素敏感性、治疗代谢风险因素、减轻体重等[Adams等人,Postgraduate Medical Journal,vol.82,315-322(2006)；Musso等人,Curr.Opin.Lipidol.,vol.22(6),489-496(2011)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文]
C/EBPα蛋白在调节肝功能和代谢中发挥重要作用。图1中显示C/EBPα对肝脏的主要影响，包括通过降低CD36蛋白水平减少脂肪酸摄取，通过减少固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、碳水化合物应答元件结合蛋白(ChREBP)和脂肪酸合酶(FAS)蛋白水平而减少从头生成脂肪，通过增加过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活蛋白1-α和-β(PGC-1α和β)蛋白水平而增加β-氧化，通过降低载脂蛋白C-III(APOC3)和低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白质水平而减少肝脂质负载，通过增加PGC-1β蛋白水平而减少进展成纤维化，和通过增加过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)蛋白水平而减少胰岛素抵抗。另外，如图2中所显示，C/EBPα对脂肪组织具有次级影响。白色脂肪组织(WAT)不仅是生脂和脂肪储存组织，还是调节能量稳态、脂质代谢、食欲、生育力和免疫反应及应激反应的重要内分泌器官。与WAT相比，褐色脂肪组织(BAT)含有多个较小的脂质小滴和数目高得多的含铁线粒体。它在营养性能量学、能量平衡和体重中发挥显著作用。有证据证明，BAT萎缩与肥胖症有关。尤其，研究已经表明，BAT中受损的生热作用在啮齿类的肥胖症病因学中是重要的[Trayhurn P.,J.Biosci.,vol.18(2),161-173(1993)]。C/EBPα减少肝脂肪变性及胰岛素抵抗并且增加PGC-1α蛋白水平，这可以转而引起WAT褐变，使WAT变成BAT，并且随后激活BAT，因而减少身体脂肪和重量。因此，本发明的C/EBPα-saRNA可以用来调节肝功能、减少脂肪变性、减少血脂、治疗NAFLD、治疗胰岛素抵抗、增加能量支出及治疗肥胖症。
在一个实施方案中，提供一种通过本发明C/EBPα-saRNA治疗而在体外和在体内调节肝代谢基因的方法。还提供一种通过本发明C/EBPα-saRNA治疗而在体外和在体内调节涉及NAFLD的肝基因的方法。这些基因包括但不限于固醇调节元件结合因子1(SREBF-1或SREBF)、分化抗原簇36(CD36)、乙酰-CoA羧化酶2(ACACB)、载脂蛋白C-III(APOC3)、微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活蛋白1α(PPARγ-CoA1α或PPARGC1A)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活蛋白1β(PPARγ-CoA1β或PERC)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、乙酰-CoA羧化酶1(ACACA)、糖应答元件结合蛋白(ChREBP或MLX1PL)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα或PPARA)、FASN(脂肪酸合酶)、甘油二酯酰基转移酶-2(DGAT2)和雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中SREBF-1基因的表达至少20％、30％，优选地至少40％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中CD36基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中ACACB基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、100％、125％、150％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中APOC3基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中MTP基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中PPARγ-CoA1α基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、100％、125％、150％，更优选地至少175％、200％、250％、300％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中PPARγ基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、100％、125％、150％，更优选地至少175％、200％、250％、300％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中PPARα基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、100％、125％、150％，更优选地至少175％、200％、250％、300％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中MLXIPL基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中FASN基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中DGAT2基因的表达少10％、20％，优选地至少30％、40％、50％。
C/EBPα-saRNA还调节BAT细胞中上文公开的肝代谢基因的表达。在另一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中SREBP基因的表达至少20％、30％，优选地至少40％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中CD36基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中LDLR基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加BAT细胞中PPARGC1A基因的表达至少20％、30％，优选地至少40％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中APOC基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％，更优选地至少95％、99％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中ACACB基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中PERC基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加BAT细胞中ACACA基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、100％、125％、150％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中MLXP1基因的表达至少20％、30％、40％，优选地至少50％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少BAT细胞中MTOR基因的表达至少20％、30％、40％，优选地至少50％、75％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中PPARA基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、100％、125％、150％，更优选地至少200％、250％、300％、350％、400％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加BAT细胞中FASN基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中DGAT基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、100％、125％、150％，更优选地至少200％、250％、300％。
C/EBPα-saRNA还调节WAT细胞中上文公开的肝代谢基因的表达。在另一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中SREBP基因的表达至少20％、30％，优选地至少40％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中CD36基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中LDLR基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加WAT细胞中PPARGC1A基因的表达至少20％、30％，优选地至少40％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加WAT胞中MTP基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％，更优选地至少95％、更优选地至少1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍，更优选地至少5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA增加WAT细胞中APOC基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％，更优选地至少95％、99％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中ACACB基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中PERC基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中ACACA基因的表达至少20％、30％、40％、50％，优选地至少75％、90％、95％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中MLX1PL基因的表达至少20％、30％、40％，优选地至少50％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中MTOR基因的表达至少20％、30％、40％，优选地至少50％、75％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中FASN基因的表达至少5％、10％，优选地至少15％、20％。在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少WAT细胞中DGAT基因的表达至少10％、20％、30％、更优选地40％、50％。
在另一个实施方案中，提供一种通过向有需要的患者施用本发明的C/EBPα-saRNA，减少胰岛素抵抗(IR)或增加胰岛素敏感性的方法。还提供一种通过向有需要的患者施用本发明的C/EBPα-saRNA，治疗II型糖尿病、高胰岛素血症和脂肪变性的方法。如果肝脏细胞对胰岛素抵抗并且不能有效地使用胰岛素，则形成高血糖症。随后，胰中的β细胞增加其胰岛素产量，导致高胰岛素血症和II型糖尿病。许多调节物影响肝脏细胞的胰岛素抵抗。例如，固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1或SREBP)是胆固醇的主导调节物并且与增加的胰岛素抵抗相关。胆固醇酯转移蛋白(CETP)的上调与增加的胰岛素抵抗相关。肝脂肪酸转移酶/分化抗原簇36(FAT/CD36)的上调与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中的胰岛素抵抗、高胰岛素血症、增加的脂肪变性相关。脂蛋白脂肪酶基因(LPL)的肝特异性过量表达造成肝特异性胰岛素抵抗。肝X受体基因(LXR)在肝中胰岛素介导激活的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c诱导的脂肪酸合成中具有核心职能。其他因素包括调节甘油三酯合成的甘油二酯酰基转移酶-2(DGAT2)和调节脂肪酸生物合成的脂肪酸合酶(FASN)。在一个实施方案中，与没有处理的肝脏细胞相比，C/EBPα-saRNA减少肝脏细胞中FAT/CD36基因的表达至少25％、优选地至少50％，更优选地至少75％，甚至更优选地90％。在另一个实施方案中，与没有处理的肝脏细胞相比，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中LPL基因的表达至少20％、30％、40％，优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，更优选地至少100％、150％、200％、250％、300％、350％和400％。在另一个实施方案中，与没有处理的肝脏细胞相比，C/EBPα-saRNA增加肝脏细胞中LXR基因的表达至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，更优选地至少100％、150％、200％、250％、300％、350％和400％，甚至更优选地至少450％、500％、550％、600％。在另一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少SREBP1基因表达。在另一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少DGAT2基因表达。在另一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少CETP基因表达。在又一个实施方案中，C/EBPα-saRNA减少FASN基因表达。
表5中显示可以用C/EBPα-saRNA调节的NAFLD基因和IR基因的总结。表5中的缩写：NAFLD：非酒精性脂肪肝病；IR：胰岛素抵抗(胰岛素抗性)；DNL：从头生成脂肪；FA：脂肪酸；TG：甘油三酯；LPL：脂蛋白脂肪酶；HP：肝脂肪酶；CHOL：胆固醇。
表5可以用C/EBPα-saRNA调节的NAFLD基因和IR基因
Figure BDA0003506633680000611
Figure BDA0003506633680000621
表5可以用C/EBPα-saRNA调节的NAFLD基因和IR基因(续)
Figure BDA0003506633680000622
Figure BDA0003506633680000631
在本发明的一个实施方案中，提供一种通过本发明C/EBPα-saRNA治疗，体外降低血清胆固醇水平的方法。与无治疗时的血清胆固醇水平相比，采用C/EBPα-saRNA时血清胆固醇水平降低至少25％、优选地50％、更优选地75％。还提供一种通过施用本发明的C/EBPα-saRNA，在体内降低肝细胞中的LDL水平和甘油三酯水平并增加LDL循环水平的方法。与不存在C/EBPα-saRNA情况下LDL循环水平相比，LDL循环水平可以增加至少2倍，优选地3倍，优选地4倍，优选地5倍，优选地10倍和优选地15倍。与不存在C/EBPα-saRNA情况下肝脏甘油三酯水平相比，肝脏甘油三酯水平可以降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。与不存在C/EBPα-saRNA情况下肝脏LDL水平相比，肝脏LDL水平可以降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
在本发明的一个实施方案中，提供一种通过向有需要的患者施用本发明的C/EBPα-saRNA，治疗NAFLD和缩减脂肪肝大小的方法。与不治疗情况下的患者相比，用C/EBPα-saRNA治疗的患者的脂肪肝的大小缩减至少10％、20％、30％、40％或50％。还提供一种通过向有需要的患者施用本发明的C/EBPα-saRNA，减少体重和治疗肥胖症的方法。用C/EBPα-saRNA治疗的患者的体重比不用C/EBPα-saRNA治疗的患者的体重低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。本发明的C/EBPα-saRNA可以按1次剂量、2次剂量、3次剂量或更多次剂量施用。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，减少肝摄取游离脂肪酸的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，减少白色脂肪组织(WAT)炎症的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，减少从头生成脂肪的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，增加肝脏中β-氧化的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，增加肝脏中褐色脂肪组织(BAT)的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，减少肝摄取脂质的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，减少WAT中脂肪生成的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，减少肝脏中脂质储存的方法。还提供一种通过用本发明C/EBPα-saRNA治疗，减少肝脏中脂质过载的方法。
在另一个实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA用来增加肝功能。在一个非限制性例子中，C/EBPα-saRNA增加白蛋白基因表达并因而增加血清白蛋白水平和非结合型胆红素水平。与不存在本发明的saRNA情况下白蛋白基因表达相比，在本发明的saRNA存在下白蛋白基因的表达可以增加至少20％、30％、40％，更优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％，甚至更优选地至少80％。在又一个优选的实施方案中，与不存在本发明的saRNA情况下白蛋白基因表达相比，白蛋白基因的表达在本发明的saRNA存在下增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，更优选地增加至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍，甚至更优选地增加至少60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。在另一个非限制性例子中，C/EBPα-saRNA减少丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ谷氨酰转肽酶(GGT)、甲胎蛋白(AFP)和肝细胞生长因子(HGF)的量。与不存在本发明saRNA的情况下ALT、AST、GGT、AFP或HGF任一者的量相比，在本发明的saRNA存在下ALT、AST、GGT、AFP或HGF的量可以降低至少20％、30％、40％，更优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％，甚至更优选地至少80％。
在另一个实施方案中，施用本发明的C/EBPα-saRNA以调节C/EBP家族其他成员的水平。C/EBPα-saRNA增加C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ和C/EBPζ的表达，这依赖于C/EBPα-saRNA的剂量。在又一个实施方案中，通过使细胞与本发明的C/EBPα-saRNA接触，调节所述细胞中C/EBPα或C/EBPβ蛋白同工型的比率。在一个实施方案中，C/EBPα的42KDa同工型增加。在一个实施方案中，C/EBPβ的30k Da同工型增加。
ecCEBPA
通过与DNA甲基转移酶(DNMT1)相互作用并由此阻止CEBPA基因甲基化，额外编码性CEBPA(ecCEBPA)(从CEBPA基因座转录的功能性ncRNA)调节CEBPA甲基化。已经发现ecCEBPA敲减导致CEBPA mRNA表达下降并且导致DNA甲基化明显增加(Ruscio等人,Nature,vol.503:371-376(2013)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在另一个实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA用来上调ecCEBPA水平。
手术护理
肝切除术，即手术切除肝脏或肝组织，可能造成肝衰竭，白蛋白和凝血因子产量减少。肝切除术后需要恰当的手术护理。在一些实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA用于肝切除术后手术护理以促进肝再生并增加存活率。
过度增殖性疾病
在本发明的一个实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA用来减少过度增殖性细胞的细胞增殖。过度增殖性细胞的例子包括癌性细胞，例如，癌(carcinomas)、肉瘤、淋巴瘤和胚细胞瘤。这类癌性细胞可以是良性或恶性的。过度增殖性细胞可以因自身免疫病症如类风湿性关节炎、炎性肠病或银屑病所致。过度增殖性细胞还可以在免疫系统过度敏感的接触致敏原的患者内部产生。涉及过度敏感性免疫系统的这类病状包括但不限于哮喘、过敏性鼻炎、湿疹和过敏反应，如变应性过敏反应。在一个实施方案中，抑制肿瘤细胞发育和/或生长。在一个优选实施方案中，抑制实体瘤细胞增殖。在另一个优选实施方案中，防止肿瘤细胞转移。在另一个优选的例子中，抑制未分化的肿瘤细胞增殖。
抑制细胞增殖或减少增殖意指增殖减少或完全停止。因此，“减少增殖”是“抑制增殖”的实施方案。与用本发明saRNA处理之前所述细胞的增殖相比，或与等同的未处理细胞的增殖相比，细胞的增殖在本发明的saRNA存在下减少至少20％、30％或40％、或优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，甚至更优选地至少80％、90％或95％。在过度增殖性细胞中抑制细胞增殖的实施方案中，“等同”细胞也是过度增殖性细胞。在优选的实施方案中，减少增殖至与等同的健康(非过度增殖性)细胞的增殖速率相当的速率。或者，根据观察，“抑制细胞增殖”的优选实施方案是抑制过度增殖或调节细胞增殖以达到正常的健康的增殖水平。
在一个非限制性例子中，C/EBPα-saRNA用来减少白血病细胞和淋巴瘤细胞的增殖。优选地，细胞包括Jurkat细胞(急性T细胞淋巴瘤细胞系)、K562细胞(红细胞白血病细胞系)、U373细胞(胶质母细胞瘤细胞系)和32Dp210细胞(髓样白血病细胞系)。
在另一个非限制性例子中，C/EBPα-saRNA用来减少卵巢癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、大鼠肝癌细胞和胰岛素瘤细胞的增殖。优选地，细胞包括PEO1和PEO4(卵巢癌细胞系)、HepG2(肝细胞癌细胞系)、Panc1(人胰腺癌细胞系)、MCF7(人乳腺腺癌细胞系)、DU145(人转移性前列腺癌细胞系)、大鼠肝癌细胞和MIN6(大鼠胰岛素瘤细胞系)。
在另一个非限制性例子中，C/EBPα-saRNA与靶向C/EBPβ基因的siRNA组合使用，以减少肿瘤细胞增殖。肿瘤细胞可以包括肝细胞癌细胞，如HepG2细胞和乳腺癌细胞如MCF7细胞。
在一个实施方案中，本发明的saRNA用来治疗过度增殖性疾病。肿瘤和癌症代表一种具有特定意义的过度增殖性疾病，并且包括全部类型的肿瘤和癌，例如实体瘤和血液学癌。癌症的例子包括，但不限于：宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠道癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病和慢性髓性白血病)、脑癌(例如，星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤)、神经母细胞瘤、肉瘤、结肠癌、直肠癌症、胃癌、直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、Wilm's肿瘤、Ewing肉瘤、黑素瘤和其他皮肤癌。肝癌可以包括，但不限于胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤或肝细胞癌(HCC)。HCC具有特定意义。
原发性肝癌是全球第五大发病最频繁的癌症以及癌相关死亡的第三大最常见原因。HCC代表绝大部分的原发性肝癌[El-Serag等人,Gastroenterology,vol.132(7),2557-2576(2007)，所述文献的内容在本文完整公开]。HCC受涉及癌细胞生物学、免疫系统和不同病因学(病毒、毒素和遗传)的几种因素的相互作用影响。大部分HCC患者从肝硬化背景形成恶性肿瘤。目前，大部分患者在晚期确诊斌，并且因此大部分HCC患者的5年生存期仍不良。手术切、局部区域消融和肝移植目前是具有治愈HCC潜力的仅有治疗选项。但是，基于个体肝功能和肿瘤负荷评价，仅约5-15％的患者符合手术介入条件。C/EBP转录因子家族的结合位点存在于参与正常肝细胞功能的维持和损伤反应的多种基因的启动子区中(包括白蛋白、白介素6反应、能量稳态、鸟氨酸循环调节和血清淀粉样蛋白A表达)。本发明利用C/EBPα-saRNA以调节C/EBPα基因的表达并治疗肝硬化和HCC。
本发明的方法可以缩减肿瘤体积至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。优选地，抑制一个或多个新肿瘤的形成，例如，根据本发明治疗的受试者形成更少和/或更小的肿瘤。更少的肿瘤意指他在设定的时间段内形成数目较等同受试者更少的肿瘤。例如，他形成比等同对照(未治疗的)受试者少至少1、2、3，4或5个肿瘤。更小的肿瘤意指肿瘤的重量和/或体积比等同受试者的肿瘤小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本发明的方法减少肿瘤负荷至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
设定的时间段可以是任何合适的时间段，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个月或年。
在一个非限制性例子中，提供一种治疗未分化肿瘤的方法，包括使细胞、组织、器官或受试者与本发明的C/EBPα-saRNA接触。与分化的肿瘤相比，未分化的肿瘤通常具有较差的预后。由于肿瘤中的分化程度对预后具有影响，所以假设使用有分化作用的生物药物可能是有益的抗增殖药物。已知C/EBPα在急性髓样白血病中恢复髓样分化并阻止造血细胞过度增殖。优选地，可以用C/EBPα-saRNA治疗的未分化的肿瘤包括未分化的小细胞肺癌、未分化的胰腺腺癌、未分化的人胰腺癌、未分化的人转移性前列腺癌，和未分化的人乳腺癌。
在一个非限制性例子中，将C/EBPα-saRNA复合成PAMAM树状物，称作C/EBPα-saRNA-树状物，用于体内定向递送。如实施例1中所示，在有临床意义的大鼠肝肿瘤模型中，证明了静脉内注射的C/EBPα-saRNA-树状物的治疗作用。通过以48小时间隔尾静脉内注射三个剂量后，治疗的肝硬化症大鼠在1周内显示血清白蛋白水平显著增加。C/EBPα-saRNA树状物治疗组中肝脏肿瘤负荷显著减少。这项研究首次说明，可以通过全身性静脉内施用使用借助活化性小RNA分子的基因打靶，以在患有HCC的肝硬化症大鼠中同时改善肝功能和减少肿瘤负荷。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA用来调节癌基因和肿瘤抑制基因。优选地，可以是下调癌基因的表达。与不存在本发明的C/EBPα-saRNA情况下的表达相比，在本发明的C/EBPα-saRNA存在下癌基因的表达减少至少20％、30％、40％，更优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。在又一个优选的实施方案中，与不存在本发明C/EBPα-saRNA情况下的表达相比，在本发明的C/EBPα-saRNA存在下癌基因的表达减少至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，更优选地减少至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍，甚至更优选地减少至少60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。优选地，可以抑制肿瘤抑制基因的表达。与不存在本发明C/EBPα-saRNA情况下的表达相比，在本发明的C/EBPα-saRNA存在下肿瘤抑制基因的表达增加至少20％、30％、40％，更优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，甚至更优选地至少100％。在又一个优选的实施方案中，与不存在本发明C/EBPα-saRNA情况下的表达相比，肿瘤抑制基因的表达在本发明的C/EBPα-saRNA存在下增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，更优选地增加至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍，甚至更优选地增加至少60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。癌基因和肿瘤抑制基因的非限制性例子包括Bcl-2相关的X蛋白(BAX)、BH3互作结构域死亡激动物(BID)、胱天蛋白酶8(CASP8)、失能同系物2相互作用蛋白(DAB21P)、肝癌中缺失1(DLC1)、Fas表面死亡受体(FAS)、脆性组氨酸三联体(FHIT)、生长停滞和DNA损伤诱导型β(GADD45B)、刺猬因子相互作用蛋白(HHIP)、胰岛素样生长因子2(IGF2)、淋巴样增强子结合因子1(LEF1)、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、蛋白质酪氨酸激酶2(PTK2)、视网膜母细胞瘤1(RB1)、成骨相关转录因子3(RUNX3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、细胞因子信号传导阻抑蛋白(3SOCS3)、转化生长因子β受体II(TGFBR2)、肿瘤坏死因子(配体)超家族成员10(TNFSF10)、P53、含有解整联蛋白和金属蛋白酶结构域的蛋白质17(ADAM17)、v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1(AKT1)、血管生成素2(ANGPT2)、B-细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)、BCL2样1(BCL2L1)、含有杆状病毒IAP重复序列2(BIRC2)、含有杆状病毒IAP重复序列5(BIRC5)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、细胞周期蛋白D2(CCND2)、钙黏着蛋白1(CDH1)、钙黏着蛋白13(CDH13)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白1A(CDKN1A)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白1B(CDKN1B)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A)、CASP8和FADD样凋亡调节物(CFLAR)、联蛋白(钙黏着蛋白相关的蛋白质)β1(CTNNB1)、趋化因子受体4(CXCR4)、E2F转录因子1(E2F1)、表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、E1A结合蛋白p300(EP300)、Fas(TNFRSF6)经死亡结构域(FADD)相关、fms相关的酪氨酸激酶1(FLT1)、卷曲家族受体7(FZD7)、谷胱甘肽S-转移酶pi1(GSTP1)、肝细胞生长因子(HGF)、Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、胰岛素受体底物1(IRS1)、整联蛋白β1(ITGB1)、激酶插入物结构域受体(KDR)、髓样细胞白血病序列1(MCL1)、met原癌基因(MET)、mutS同源物2(MSH2)、mutS同源物3(MSH3)、异粘蛋白(MTDH)、v-myc鸟类髓细胞增多症病毒癌基因同源物(MYC)、B细胞中κ轻链多肽基因增强子的核因子1(NFKB1)、神经母细胞瘤RAS病毒(v-ras)癌基因同源物(NRAS)、阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样(OPCML)、血小板衍生生长因子受体、α多肽(PDGFRA)、肽酰基脯氨酰顺/反式异构体、NIMA相互作用1(PIN1)、前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2)、含有PYD和CARD结构域(PYCARD)、Ras相关的C3肉毒毒素底物1(RAC1)、Ras缔合(RalGDS/AF-6)结构域家族成员1(RASSF1)、reelin(RELN)、ras同源物家族成员A(RHOA)、分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)、SMAD家族成员7(SMAD7)、细胞因子信号传导阻抑蛋白1(SOCS1)、信号传导者和转录激活物3(STAT3)、转录因子4(TCF4)、端粒酶逆转录酶(TERT)、转化生长因子α(TGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)、toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、Wilm肿瘤1(WT1)、凋亡的X连锁抑制剂(XIAP)和Yes相关蛋白1(YAP1)。
在一个实施方案中，提供一种通过向有需要的患者施用本发明的C/EBPα-saRNA，增加白细胞计数的方法。还提供是一种通过向患者施用本发明的C/EBPα-saRNA治疗败血症或慢性炎症疾病(例如，肝炎和肝硬化)患者以及免疫受损患者(例如，接受化疗的患者)的白细胞减少症的方法。还提供一种通过向有需要的患者施用本发明的C/EBPα-saRNA，治疗前B细胞恶性肿瘤和B细胞恶性肿瘤(包括白血病和淋巴瘤)的方法。还提供一种通过向有需要的患者施用本发明的C/EBPα-saRNA，动员白细胞、造血干细胞或间充质干细胞的方法。在一个实施方案中，与无C/EBPα-saRNA治疗相比，用C/EBPα-saRNA治疗的患者中的白细胞计数增加至少50％、75％、100％，更优选地增加至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍，更优选地增加至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA在治疗肝细胞癌时用来调节微RNA(miRNA或miR)。微RNA是调节基因表达的非编码性小RNA。它们涉及重要的生理功能并且它们可以参与癌发生的每个步骤。它们一般具有21个核苷酸并且通过阻断mRNA翻译或通过结合至所述mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)诱导mRNA降解，而在转录后水平调节基因表达。
在肿瘤中，调节miRNA表达影响肿瘤形成。在HCC中，如其他癌症中那样，miRNA作为癌基因或肿瘤抑制基因发挥作用，影响细胞生长和增殖、细胞代谢和分化、凋亡、血管生成、转移并最终影响预后。[Lin等人,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,vol.375,315-320(2008)；Kutay等人,J.Cell.Biochem.,vol.99,671-678(2006)；Meng等人,Gastroenterology,vol.133(2),647-658(2007)，所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文]。本发明的C/EBPα-saRNA在HCC细胞中调节C/EBPα基因表达和/或功能并且还调节miRNA水平。可以受本发明C/EBPα-saRNA调节的miRNA的非限制性例子包括hsa-let-7a-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-184、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-134、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7c、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-206、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-150-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-128、hsa-miR-215、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-203a、hsa-miR-30c-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-210、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-372、hsa-miR-149-5p和hsa-miR-32-5p。
在一个非限制性例子中，miRNAs是致瘤性miRNA并且与不存在C/EBPα-saRNA的情况下相比，在本发明的C/EBPα-saRNA存在时下调至少0.01倍、0.02倍、0.05倍、0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍和3倍。在另一个非限制性例子中，miRNAs是肿瘤抑制性miRNA并且与不存在C/EBPα-saRNA的情况下相比，在本发明的C/EBPα-saRNA存在下上调至少0.01倍、0.02倍、0.05倍、0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.5倍、1倍、更优选地至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、更优选地至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50、甚至更优选地至少60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。
干细胞调节作用
在本发明的一些实施方案中，C/EBPα-saRNA用来调节自我更新性多能因子并影响干细胞分化。改变细胞表型以表达目的蛋白或将某种细胞变成不同细胞表型已经用在不同临床环境、治疗环境和研究环境中。目前通过从DNA或病毒载体表达蛋白质实现细胞表型的改变。目前正在进行研究以评价人胚胎干细胞作为治疗选项用于多种疾病如帕金森病和糖尿病和损伤如脊髓损伤的用途。胚胎干细胞具有无限生长，同时维持多能性以产生任何分化细胞类型的能力。
许多因子如多能性因子、细胞表型改变因子、转分化因子、分化因子和去分化因子，用来改变细胞表型，这可用于以下领域：个人再生医学、细胞疗法和其他疾病的疗法。例如，干细胞的自我更新特性和多能性特性在包含OCT4、SOX2、NANOG和KLF基因的核心调节回路中受一系列基因(如转录因子和染色质重塑酶)调节[Bourillot等人,BMC Biology,8:125(2010)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文]。用于自我调节网络的这种调节回路还影响下游基因。寡核苷酸已经用来调节核心调节回路。Xu等人公开了miRNA-145靶向OCT4、SOX2和KLF4的3’-UTR。减少miRNA-145损害了分化并升高OCT4、SOX2和KLF4[Xu等人,Cell,vol.137,1-12(2009)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文]。
在一个实施方案中，本发明的C/EBPα-saRNA用来调节自我更新性多能性基因。多能性基因的非限制性例子包括SOX2、OCT4、cKit、KLF4、KLF2、KLF5、NANOG、CDX2和SALL4。在一个实施方案中，与不存在C/EBPα-saRNA的情况下相比，多能性基因的表达在本发明的C/EBPα-saRNA存在下减少至少20％、30％或40％、或优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，甚至更优选地至少80％、90％或95％。在另一个实施方案中，与不存在C/EBPα-saRNA的情况下相比，多能性基因的表达在本发明的C/EBPα-saRNA存在下增加至少20％、30％、40％，更优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％，甚至更优选地至少80％。在一个优选的实施方案中，与不存在C/EBPα-saRNA情况下的表达相比，多能性基因的表达在本发明的C/EBPα-saRNA存在下增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，更优选地增加至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍，甚至更优选地增加至少60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。
在一个实施方案中，C/EBPα-saRNA用来调节细胞上皮-间充质转变(EMT)。一些肿瘤含有可以自我更新并通过分化成不同的癌细胞谱系维持肿瘤启动能力的癌干细胞或癌干细胞样细胞。已经证明EMT与癌干细胞样细胞、肿瘤侵入性与转移以及肿瘤复发相关[Kong等人,Cancers,vol.3(1),716-729(2011)]。存在多种调节EMT的因子，包括miRNA如miR-200和miR-134、生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)，以及如Notch-1和Wnt信号传导途径的因子。在一个非限制性例子中，C/EBPα-saRNA通过调节miR-134的表达而调节EMT。在另一个非限制性例子中，C/EBPα-saRNA通过调节RUNX3、CTNB1、HGF、SMAD7或TGFB1基因的表达而调节EMT。
III.试剂盒和装置
试剂盒
本发明提供用于便利和/或有效实施本发明方法的多种试剂盒。一般试剂盒将包含足够量和/或数目的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗和/或以进行多次实验。
在一个实施方案中，包含本文所述saRNA的试剂盒可以与正在增殖的细胞一起使用以显示功效。
在一个实施方案中，本发明提供在体外或在体内调节基因表达的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的C/EBPα-saRNA或C/EBPα-saRNA、调节其他基因的saRNA、siRNA或miRNA的组合。试剂盒还可以包含包装和说明书和/或递送剂，以形成制剂组合物。递送剂可以包括本文公开的盐水、缓冲溶液、类脂质(lipidoid)、树状物或任何递送剂。基因的非限制性例子包括C/EBPα、C/EBP家族的其他成员、白蛋白基因、甲胎蛋白基因、肝特异性因子基因、生长因子、核因子基因、肿瘤抑制基因、多能性因子基因。
在一个非限制性例子中，缓冲溶液可以包括氯化钠、氯化钙、磷酸盐和/或EDTA。在另一个非限制性例子中，缓冲溶液可以包括，但不限于盐水、含2mM钙的盐水、5％蔗糖、含2mM钙的5％蔗糖、5％甘露醇、含2mM钙的5％甘露醇、Ringer乳酸盐、氯化钠、含2mM钙的氯化钠和甘露糖(参见例如，美国公开号20120258046；所述文献通过引用方式完整并入本文)。在又一个非限制性例子中，可以将缓冲溶液沉淀或可以将它冻干。每种组分的量可以变动以实现一致、可重复的较高浓度盐水或简单缓冲液制剂。也可以变动组分以增加saRNA在缓冲溶液中一段时间和/或多种条件下的稳定性。
在另一个实施方案中，本发明提供调节细胞增殖的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的C/EBPα-saRNA，其以引入细胞时有效抑制所述细胞增殖的量提供；任选地包含siRNAs和miRNA以进一步调节靶细胞的增殖；和包装物与说明书和/或形成制剂组合物的递送剂。
在另一个实施方案中，本发明提供降低细胞中LDL水平的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的saRNA分子；任选地包含减少LDL的药物；和包装物与说明书和/或递送剂，以形成制剂组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供调节细胞中miRNA表达水平的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的C/EBPα-saRNA；任选地包含siRNA、eRNA和lncRNA；和包装物与说明书和/或递送剂，以形成制剂组合物。
装置
本发明提供可以并入本发明C/EBPα-saRNA的装置。这些装置含有可用于立即递送至有需求的受试者(如人类患者)的稳定制剂。这种受试者的非限制性例子包括患有过度增殖性疾病如癌症、肿瘤或肝硬化的受试者；和代谢疾病如NAFLD、肥胖症、高LDL胆固醇、或II型糖尿病的受试者。
装置的非限制性例子包括泵、导管、针头、透皮贴剂、加压嗅用输送装置、离子导入装置、多层微流体装置。装置可以用来根据单次、多次或分割给药方案递送本发明的C/EBPα-saRNA。装置可以用来跨生物组织、真皮内、皮下或肌内递送本发明的C/EBPα-saRNA。在2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开了适于递送寡核苷酸的装置的更多例子，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
定义
出于便利，下文提供在本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。如果本说明书的其他部分中某术语的使用和这个部分中所提供的其定义之间存在明显的不一致性，则这个部分中的定义应当占优。
约：如本文所用，术语“约”意指所述值的+/-10％。
组合施用：如本文所用，术语“组合施用”或“联合施用”意指将两种或更多种药物(例如saRNA)在相同时间或在如此间隔时间内施用至受试者，从而每种药物在该患者上的作用可存在重叠。在一些实施方案中，将它们在彼此约60、30、15、10、5或1分钟范围内施用。在一些实施方案中，药物的施用足够紧密地如此间隔，从而实现联合(例如，协同)效应。
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”和“氨基酸类”指天然出现的全部L-α-氨基酸。氨基酸借助如下的单字母或三字母名称识别：天冬氨酸(Asp：D)、异亮氨酸(Ile：I)、苏氨酸(Thr：T)、亮氨酸(Leu：L)、丝氨酸(Ser：S)、酪氨酸(Tyr：Y)、谷氨酸(Glu：E)、苯丙氨酸(Phe：F)、脯氨酸(Pro：P)、组氨酸(His：H)、甘氨酸(Gly：G)、赖氨酸(Lys：K)、丙氨酸(Ala：A)、精氨酸(Arg：R)、半胱氨酸(Cys：C)、色氨酸(Trp：W)、缬氨酸(Val：V)、谷氨酰胺(Gln：Q)、甲硫氨酸(Met：M)、天冬酰胺(Asn：N)，其中首先列出氨基酸，随后在括号内分别列出三字母代码和单字母代码。
动物：如本文所用，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿类、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、羊、牛、灵长类或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行类、两栖类、鱼类和蠕虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物、基因修饰动物或克隆。
大约：如本文所用，术语“大约”或“约”如适用于一个或多个目的值，指与所述参比值相似的值。在某些实施方案中，除非另外声明或否则从上下文显而易见(除外情形是其中这类数目将超过100％的可能值)，术语“大约”或“约”指以任一方向(大于或更小)落于所述参比值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的一系列值。
与缔合：如本文所用，术语“与缔合”、“缀合”、“连接”、“接合”和“系留”，当相对于两个或更多个部分使用时，意指所述部分在物理上彼此直接或通过一个或多个充当连接剂的额外部分缔合或连接，以形成这样的结构，所述结构足够地稳定，从而各部分在使用该结构的条件(例如，生理条件)下保持物理缔合。“缔合”不必要严格地通过直接共价化学键进行。它还可以表示足够稳定的离子键合作用或氢键合作用或基于杂交的连接，从而使“结合的”实体保持物理缔合。
双官能的：如本文所用，术语“双官能的”指能够执行或维持至少两种功能的任何物质、分子或部分。所述功能可以影响相同的结果或不同的结果。产生功能的结构可以是相同或不同的。
生物相容：如本文所用，术语“生物相容”意指与活细胞、组织、器官或系统相容，带来微小损伤至没有损伤、毒性或免疫系统排异的风险。
生物可降解：如本文所用，术语“生物可降解的”意指能够通过活生命的作用分解成无害产物。
生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”指在生物系统和/或生物中具有活性的任何物质特征。例如，施用某物质至生物时，该物质对该生物具有生物学效应，则认为该物质是生物活性的。在具体的实施方案中，如果甚至saRNA的一部有生物活性或模拟视为有生物学意义的活性，则本发明的saRNA可以视为有生物活性。
癌症：如本文所用，术语“癌症”在个体中指存在这样的细胞，所述细胞具有为造成癌症的细胞常见的特征，如增殖失控、永生性、转移潜力、快速生长和增殖速率，和某些特征性形态学特征。经常，癌细胞将会处于肿瘤形式，但是这类细胞可以在个体内部独立存在，或可以在血流中作为独立细胞循环，如白血病细胞。
细胞生长：如本文所用，术语“细胞生长”主要与细胞数目增长相关，所述增长借助细胞复制速率大于细胞死亡速率(例如凋亡或坏死)时的细胞复制(即增殖)发生，从而导致细胞群体的大小增长，虽然在某些情况下这种生长的小部分可能是由于单个细胞的细胞尺寸或胞质体积增加所致。抑制细胞生长的物质因此可以通过抑制增殖或刺激细胞死亡或同时发挥这两种作用做到这点，从而改变两种相反过程之间的平衡。
细胞类型：如本文所用，术语“细胞类型”指来自给定来源(例如，组织、器官)的细胞或处于给定分化状态的细胞，或与给定病变或遗传构成相关的细胞。
染色体：如本文所用，术语“染色体”指存在于细胞中的DNA和蛋白质的组织化结构。
互补的：如本文所用，术语“互补的”在它涉及核酸时，指在核苷酸或核酸之间例如双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸探针和靶之间的杂交或碱基配对是互补的。
病状：如本文所用，术语“病状”指任何细胞、器官、器官系统或生物的状态。病状可以反映实体的疾病状态或简单地生理表现或情况。病状可以表征为表型病状如疾病或遗传病的宏观表现，如与该病状相关的基础性基因或蛋白质表达图谱。病状可以是良性或恶性的。
控释：如本文所用，术语“控释”指符合特定释放模式以产生治疗结果的药物组合物或化合物释放特征。
抑制细胞的(cytostatic)：如本文所用，“抑制细胞的”指抑制、减少、阻抑细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合的生长、分裂或增殖。
细胞毒的：如本文所用，“细胞毒的”指杀死细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或对其造成有害、有毒或致死效果。
递送：如本文所用，“递送”指递送化合物、物质、实体、部分、载货或酬载的行为或方式。
递送剂：如本文所用，“递送剂”指促进(至少部分地)本发明的saRNA体内递送至所靶向细胞的任何物质。
递送剂：如本文所用，术语“去稳定的”、“去稳定化”或“去稳定化区域”意指与相同区域或分子的起始形式、野生型形式或天然形式相比较不稳定的区域或分子。
可检测标记物：如本文所用，“可检测标记物”指与另一种实体连接、合并或缔合的一种或多种标记、信号或部分，其中通过本领域已知的方法轻易检测到所述另一种实体，所述方法包括放射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记物包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、配体如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素和半抗原、量子点等。可检测标记物可以位于本文公开的肽、蛋白质或多核苷酸(例如saRNA)中的任何位置处。它们可以位于N末端或C末端或5’末端或3’末端处存在的氨基酸、肽、蛋白质或多核苷酸的内部，根据具体情况而定。
包封：如本文所用，术语“包封”意指围绕、包围或包裹。
工程化：如本文所用，当本发明的实施方案设计成具有与起始、野生型或天然分子不同的(结构性或化学性)特征或性能时，本发明的实施方案是被“工程化”的。
等同受试者：如本文所用，“等同受试者”可以是例如具有相似年龄、性别和健康如肝健康或癌症分期的受试者，或本发明治疗之前的同一受试者。未治疗的：如果等同受试者未接受本发明saRNA治疗，则他是“未治疗的”。但是，他可以接受常规抗癌疗法，前提是用本发明saRNA治疗的受试者接受相同或等效的常规抗癌疗法。
外来体：如本文所用，“外来体”是哺乳动物细胞分泌的小泡。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”指以下一个或多个事件：(1)从DNA序列(例如，通过转录)产生RNA模板；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3’端加工)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
特征：如本文所用，“特征”指性质、特性或不同要素。
制剂：如本文所用，“制剂”至少包含本发明saRNA和递送剂。
片段：如本文所用，“片段”指部分。例如，蛋白质的片段可以包括通过消化从培养细胞分离的全长蛋白质获得的多肽。
有功能的：如本文所用，“有功能的”生物分子是指所处形式时其表现出作为其特征的特性和/或活性的生物分子。
基因：如本文所用，术语“基因”指包含产生多肽或前体所需要的控制序列并且最经常的编码性序列的核酸序列。然而，基因可以不翻译并且反而编码调节性或结构性RNA分子。
基因可以完整地或部分地衍生自本领域已知的任何来源，包括植物、真菌、动物、细菌基因组或附加体、真核DNA、核DNA或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成性DNA。基因可以在编码区或非翻译区中含有一个或多个修饰，所述修饰可能影响表达产物的生物学活性或化学结构、表达速率或表达控制方式。这类修饰包括但不限于突变、插入、缺失和置换一个或多个核苷酸。基因可以构成如不间断的编码序列，或它可以包含一个或多个由适宜剪接交界界定的内含子。
基因表达：如本文所用，术语“基因表达”指核酸序列发生成功转录和在大部分情况下翻译以产生蛋白质或肽的过程。为清晰起见，当提到测量“基因表达”时，这应当理解成意指可以测量核酸转录产物，例如，RNA或mRNA，或翻译的氨基酸产物，例如，多肽或肽。测量RNA、mRNA、多肽和肽的数量或水平的方法是本领域熟知的。
基因组：术语“基因组”意在包括生物的完整DNA互补物，包括核DNA组分、染色体或染色体外DNA以及胞质域(例如，线粒体DNA)。
同源性：如本文所用，术语“同源性”指聚合物分子之间例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％相同或相似的，则认为它们彼此“同源”。术语“同源的”必然地指至少两个序列(多核苷酸序列或多肽序列)之间的比较。根据本发明，如果两个多核苷酸序列编码的多肽就至少约20个氨基酸的至少一个片段而言至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％相同，则认为这两个多核苷酸序列同源。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列以编码至少4–5个唯一指定氨基酸的片段的能力为特征。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，通过编码至少4–5个唯一指定氨基酸的片段的能力确定同源性。根据本发明，如果两种蛋白质就至少一个至少约20个氨基酸的片段而言至少约50％、60％、70％、80％或90％相同，则认为这两个蛋白质序列同源。
术语“过度增殖性细胞”可以指与等同的健康细胞(可以称作“对照”)的增殖速率相比以异常高的速率增殖的任何细胞。“等同的健康”细胞是细胞的正常、健康对应物。因此，它是执行与对比细胞相同的功能的相同类型细胞，例如来自相同的器官。例如，过度增生性肝细胞的增殖应当通过参照健康的肝细胞评定，而过度增生性前列腺细胞的增殖应当参照健康的前列腺细胞评定。
“异常高”的增殖速率意指过度增殖性细胞的增殖速率如与等同的健康(非过度增殖性)细胞的增殖速率相比，增加至少20％、30％、40％、或至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。“异常高”的增殖速率意还可以指与等同的健康细胞的增殖速率相比增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍，或至少60倍、70倍、80倍、90倍、100倍的速率。
如本文所用的术语“过度增殖性细胞”不指与大部分细胞相比天然以较高速率增殖，但是为健康细胞的细胞。已知终生持续分裂的细胞的例子是皮肤细胞、胃肠道细胞、血细胞和骨髓细胞。然而，当这类细胞按照比其健康对应物更高的速率增殖时，则它们是过度增殖的。
过度增殖性疾病：如本文所用，“过度增殖性疾病”可以是涉及如上文定义的过度增殖性细胞的任何疾病。过度增殖性疾病的例子包括肿瘤性疾病如癌症、银屑病关节炎、类风湿性关节炎，胃过度增殖性疾病如炎性肠病、皮肤病(包括银屑病)、Reiter综合征、毛发红糠疹和角质化诸病症的过度增殖性变体。
技术人员完全知晓如何鉴定过度增殖性细胞。过度增殖性细胞在动物内部的存在是可以通过使用扫描如X射线、MRI或CT扫描而可鉴定的。通过在体外培养样品，使用细胞增殖分析如MTT、XTT、MTS或WST-1分析，也可以鉴定过度增殖性细胞，或可以测定细胞的增殖。也可以使用流式细胞术测定细胞体外增殖。
同一性：如本文所用，术语“同一性”指聚合物分子之间例如寡核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。例如，可以通过以下方式计算两个多核苷酸序列的同一性百分数：将两个序列为最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对结果而在第一和第二核酸序列之一或二者中引入空位并且可以为比较目的而抛弃不相同的序列)。在某些实施方案中，为比对目的所比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。随后比较相应核苷酸位置处的核苷酸。在第一序列中的位置由与第二序列中在对应位置处相同的核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置数的函数。可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，可以使用多种方法如以下文献中描述的那些方法，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编著,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编著,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,Humana Press,New Jersey,1994；以及SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,M Stockton Press,New York,1991；所述每篇文献通过引用的方式并入本文。例如，可以利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller算法(CABIOS,1989,4:11-17)，使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。备选地，可以使用GCG软件包中的GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩阵，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。常用来确定序列之间同一性百分数的方法包括但不限于在Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J AppliedMath.,48:1073(1988)中公开的那些；所述文献通过引用方式并入本文。另外，确定同一性的技术编纂于公众可获得的计算机程序中。确定两个序列之间同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序组(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Res 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215,403(1990)))。
抑制基因的表达：如本文所用，短语“抑制基因的表达”意指造成基因表达产物量减少。表达产物可以是从基因转录的RNA(例如，mRNA)或从转录自基因的mRNA翻译的多肽。一般，mRNA水平降低导致从其翻译的多肽的水平降低。可以使用测量mRNA或蛋白质的标准技术确定表达的水平。
体外：如本文所用，术语“体外”指在人工环境下例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在皮式培养皿中等发生，而不是在生物(例如，动物、植物或微生物)内部发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”指在生物(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内部发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”指已经从与同它们结合的至少一些组分分离(无论是否在自然界中或在实验性环境中)的物质或实体。分离的物质可以相对于同它们结合的物质具有不同的纯度水平。分离的物质和/或实体可以与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多起初同它们结合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的物质纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。如本文所用，如果某物质基本上不含其他组分，则它是“纯的”。基本上分离的：“基本上分离的”意指化合物基本上与其中形成或检测到它的环境分离。部分的分离可以例如包括富含本公开化合物的组合物。基本上分离可以包括含有以重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％本公开化合物或其盐的组合物。用于分离化合物及其盐的方法是本领域常规的。
标记物：术语“标记物(标签)”指物质或化合物，所述物质或化合物如此并入某对象，从而该物质、化合物或对象可以是可检测的。
接头：如本文所用，接头指一组原子，例如，10-1,000个原子，并且可以由原子或基团如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰、羰基和亚胺组成。接头可以在第一末端连接至核碱基或糖部分上的修饰的核苷或核苷酸，和在第二末端连接至酬载，例如，可检测物质或治疗剂。接头可以具有足够长度，从而不干扰向核酸序列中并入。接头可以用于任何可用目的，如用来形成saRNA缀合物，以及用来施用酬载，如本文所述。可以并入接头中的化学基团的例子包括但不限于烷基、链烯基、炔基、酰氨基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，每种基团可以是任选取代的，如本文所述。接头的例子包括但不限于不饱和链烷、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单位，例如，二甘醇、双丙甘醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物及其衍生物。其他例子包括但不限于接头内部可以利用还原剂或光解作用切割的可切割部分，如，例如，二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)。可选择性切割键的非限制性例子包括可以例如通过使用三(2-羧乙基)膦)(TCEP)或其他还原剂，和/或光解作用切割的酰氨基键以及可以例如通过酸性或碱性水解切割的酯键。
转移：如本文所用，术语“转移”意指癌借以从它作为原发肿瘤首先出现的位置扩散至身体内远端位置的过程。转移还指因原发肿瘤扩散产生的癌。例如，患有乳腺癌的某些人可以在其淋巴系统、肝、骨或肺中显示转移灶。
修饰的：如本文所用“修饰的”指本发明分子的改变的状态或结构。分子可以按多种方式修饰，包括以化学、结构和功能方式修饰。在一个实施方案中，通过引入非天然核苷和/或核苷酸修饰本发明的saRNA分子。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”意指在自然界中无人工辅助情况下存在。
核酸：如本文所用，术语“核酸”指由一个或多个核苷酸，即核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或这两者组成的分子。本术语包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单体和聚合物，在聚合物的情况下核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸借助5'至3'键结合在一起。核糖核苷酸聚合物和脱氧核糖核苷酸聚合物可以是单链或双链的。然而，键可以包括本领域已知的任何键，例如包括，包含5'至3'键的核酸。核苷酸可以是天然存在的或可以是合成产生的类似物，所述类似物能够与天然存在的碱基对形成碱基配对关系。能够形成碱基配对关系的非天然存在碱基的例子包括但不限于氮杂和去氮杂嘧啶类似物、氮杂和去氮杂嘌呤类似物和其他杂环碱基类似物，其中嘧啶环的一个或多个碳原子和氮原子已经由杂原子例如氧、硫、硒、磷等取代。
患者：如本文所用，“患者”指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将会接受治疗的受试者，或因特定疾病或病状而在训练有素的专业人员护理下的受试者。
肽：如本文所用，“肽”长度小于或等于50个氨基酸，例如，长度约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
可药用的：短语“可药用的”在本文中用来指这些化合物、材料、组合物和/或剂型，其中它们在健全医学判断力范围内，适用于接触人和动物的组织而没有过多毒性、刺激性、变态反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称。
可药用赋形剂：如本文所用，短语“可药用赋形剂”指除本文所述的化合物之外(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的溶媒)并具有在患者中基本上无毒和非炎性特性的任何成分。赋形剂可以包括例如抗粘附剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压制助剂、崩解剂、染料(色料)、软化剂、乳化剂、填料(稀释剂)、成膜物质或包衣、风味剂、香精、助流剂(流动增进剂)、润滑剂、防腐剂、印刷墨、吸附剂、助悬剂或分散剂、甜味剂和水化水。示例性赋形剂包括但不限于：丁化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸(氢二)钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、尼泊金甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预糊化淀粉、尼泊金丙酯、视黄醇棕榈酸酯、紫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟乙酸钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
可药用盐：本公开还包括本文所述化合物的可药用盐。如本文所用，“可药用盐”指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸部分或碱部分转化成其盐形式(例如，通过游离碱基团与合适的有机酸反应)，对母体化合物进行修饰。可药用盐的例子包括但不限于碱性残基如胺的无机盐和有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱式盐或有机盐等。代表性酸加成盐包含乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙基、乙胺等。本公开的可药用盐包括形成的母体化合物的常规无毒盐，例如，从无毒无机酸或有机酸形成。本公开的可药用盐可以通过常规化学方法从含有碱性部分或酸性部分的母体化合物合成。简而言之，这类盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量数量的适宜碱或酸在水中或在有机溶剂中或在这二者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐的清单存在以下文献中：Pharmaceutical Sciences,第17版,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编著),Wiley-VCH,2008以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，所述每篇文献通过引用方式完整地并入本文。
可药用溶剂化物：如本文所用，术语“可药用溶剂化物”意指其中合适溶剂分子掺入晶体晶格中的本发明化合物。合适的溶剂在施用的剂量上是生理可耐受的。例如，可以通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液结晶、再结晶或沉淀，制备溶剂化物。合适溶剂的例子是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯烷酮、苄基苯甲酸盐等。当水是溶剂时，溶剂化物称作“水合物。”
药理学作用：如本文所用，“药理学作用”是生物或系统中在生物或系统已经接触或暴露于外源物质后出现的可测量的生物学现象。药理学作用可以产生治疗有效的结果如治疗、改善一种或多种症状、诊断、预防和延迟疾病、病症、病状或感染的发生。这种生物学现象的测量可以是定量的、定性或相对于另一个生物学现象。定量性测量可以是统计学上显著的。定性测量可以按程度或种类并且可以至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的不同。它们可以观察为存在或不存在、更好或更差、更大或更小。当指药理学作用时，外源物质是相对于生物或系统为完全或部分外来的那些物质。例如，修饰野生型生物分子，无论结构性或化学性修饰，均将产生外源物质。同样地，野生型分子掺入生物或系统中不存在的化合物、分子或物质或与之组合也会产生外源物质。本发明的saRNA包含外源物质。药理学作用的例子包括但不限于细胞计数改变如嗜中性粒细胞、网织红细胞、粒细胞、红细胞(血液红细胞)、巨核细胞、血小板、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞、树突细胞、小胶质细胞细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、细胞毒T细胞、天然杀伤T细胞、B细胞、天然杀伤细胞或网织红细胞的增加或减少。药理学作用还包括血液化学、pH、血红蛋白、血细胞比容的改变，酶(如但不限于肝酶AST和ALT)水平的变化，脂质谱、电解质、代谢标志物、激素或其他标志物或本领域技术人员已知图谱的变化。
物理化学：如本文所用，“物理化学”意指或涉及物理和/或化学特性。
预防：如本文所用，术语“预防”指部分地或完全地延迟感染、疾病、病症和/或病状发作；部分地或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现发作；部分地或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现发作；部分地或完全地延迟来自感染、特定疾病、病症和/或病状进展；和/或降低形成与感染、疾病、病症和/或病状相关的病变的风险。
前药：本公开还包括本文所述化合物的前药。如本文所用，“前药”指任何物质、分子或实体，其处于据预测该物质、分子或实体在化学或物理改变后充当治疗药的形式。前药可以按某种方式共价地结合或掩蔽并且在施用至哺乳动物受试者之前、之时或其后释放或转化成活性药物部分。前药可以通过以下方式制备：修饰化合物中存在的官能团的方式使得相对于母体化合物，以例行操作或在体内切去所述修饰。前药包含这样的化合物，其中羟基、氨基、硫氢基或羧基与施用至哺乳动物受试者时遭受切割以分别形成游离羟基、氨基、硫氢基或羧基的任何基团结合。在T.Higuchi和V.Stella,“Pro-drugs as Novel DeliverySystems,”A.C.S.Symposium Series第14卷以及Bioreversible Carriers in DrugDesign,编者Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and PergamonPress,1987中讨论了前药的制备和施用，所述两篇文献因而通过引用的方式完整并入。
预后：如本文所用，术语“预后”意指特定生物事件将在未来发生或或很有可能发生的声明或宣称。
进展：如本文所用，术语“进展”或“癌进展”意指朝向疾病或病状的推进或加重。
增殖：如本文所用，术语“增殖”意指生长、扩大或增加或造成快速地生长、扩大或增加。“增殖性”意指具有增殖能力。“抗增殖性”意指具有与增殖性特性相反或相对的特性。
蛋白质：“蛋白质”意指通过肽键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。如本文所用，该术语指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。然而，蛋白质一般将长至少50个氨基酸。在一些情况下，编码的蛋白质小于约50个氨基酸。在这种情况下，多肽称作肽。如果蛋白质是短肽，它将长至少约10个氨基酸残基。蛋白质可以是天然存在的、重组的或合成的或前者的任意组合。蛋白质还可以包含天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质可以是单个分子或可以是多分子复合体。术语“蛋白质”也可以适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物。
蛋白质表达：术语“蛋白质表达”指这样的过程，其中核酸序列借助所述过程发生翻译，从而表达可检测水平的氨基酸序列或蛋白质。
纯化的：如本文所用，“经纯化”、“纯化的”、“纯化”意指使得基本上纯的或不含不想要的组分、污秽材料、混合物或杂质。
消退：如本文所用，术语“消退”或“消退程度”指癌进展在表型上或在基因型上的逆转。延缓或阻止癌进展可以视为消退。
样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”指其组织、细胞或组分部分的子集(例如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液)。样品还可以包括从完整生物或其组织、细胞或组分部分的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，或其级分或部分，包括但不限于例如，血浆、血清、脊液、淋巴液、皮肤的外部分、呼吸道、肠道和生殖泌尿道、泪、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官。样品还涉及培养基，如营养肉汤或凝胶，其可以含有细胞组分，如蛋白质或核酸分子。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”指可以指导蛋白质转运或定位的序列。
单个单位剂量：如本文所用，“单个单位剂量”是以一个剂量/在一个时间/单个途径/单个接触点(即，单个施用事件)施用的任何治疗药的剂量。
相似性：如本文所用，术语“相似性”指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。可以按照与计算同一性百分数相同的方式计算聚合物分子彼此间的相似性百分数，不同之处在于相似性百分数的计算考虑保守性置换，这是本领域理解的。
分割剂量：如本文所用，“分割剂量”是单个单位剂量或每日总剂量分成两个或更多个剂量。
稳定的：如本文所用“稳定的”指充分稳健以承受从反应混合物分离至可用纯度并且优选地能够配制成有效治疗剂的化合物。
稳定化：如本文所用，术语“稳定化”、“稳定化的”、“稳定化区域”意指使得或变得稳定。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”指可以例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的而向其施用本发明组合物的任何生物。常见的受试者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类和人)和/或植物。
基本上：如本文所用，术语“基本上”指显示完全或近完全程度或度的目的特征或特性的定性条件。普通生物技术人员将理解，生物学现象和化学现象很少(就算有的话)达到完整和/或很少推进到完整或者很少实现或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用来涵盖可能缺少多种生物学现象和化学现象内在的完整性。
基本上相等的：如本文所用，在它涉及剂量之间的倍数差时，该术语意指加/减2％。
基本上同时：如本文所用并且在它涉及多个剂量时，该术语意指2秒范围内。
患有：正在“患有”疾病、病症和/或病状的个体已经诊断患有或显示疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
易患：“易患”某疾病、病症和/或病状的个体尚未诊断患有该疾病、病症和/或病状和/或可能不显示出该疾病、病症和/或病状的症状，但是存在形成疾病或其症状的倾向性。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或病状(例如，癌症)的个体可以由以下一项或多项表征：(1)与形成该疾病、病症和/或病状相关的基因突变；(2)与形成该疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；(3)与该疾病、病症和/或病状相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或减少；(4)与形成该疾病、病症和/或病状相关的习惯和/或生活方式；(5)该疾病、病症和/或病状的家族史；和(6)暴露于与形成该疾病、病症和/或病状相关的微生物和/或被其感染。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或病状的个体将形成该疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或病状的个体将不形成该疾病、病症和/或病状。
缓释：如本文所用，术语“缓释”指在特定时间段范围内符合释放速率的药物组合物或化合物释放谱。
合成的：术语“合成的”意指借助人手产生、制备和/或制造。本发明多核苷酸或多肽或其他分子的合成可以是化学或酶促的。
靶向的细胞：如本文所用，“靶向的细胞”指任一种或多种感兴趣的(目的)细胞。所述细胞可以在体外、在体内、原位存在或在生物的组织或器官中存在。生物可以是动物，优选地是哺乳动物，更优选地是人和并且最优选地是患者。
治疗剂：术语“治疗剂”指当施用至受试者时具有治疗、诊断和/或预防效果和/或激发所需生物学和/或药理学作用的任何物质。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送物质(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，在施用至患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者时，所述量足够治疗该感染、疾病、病症和/或病状，改善其症状，诊断、预防该感染、疾病、病症和/或病状，和/或延迟其发作。
治疗有效的结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以治疗该感染、疾病、病症和/或病状，改善其症状，诊断、预防该感染、疾病、病症和/或病状，和/或延迟其发作的结果。
每日总剂量：如本文所用，“每日总剂量”是在24小时时间给予或开具的量。它可以作为单个单位剂量施用。
转录因子：如本文所用，术语“转录因子”指(例如，通过激活或阻遏转录)调节DNA转录成RNA的DNA结合蛋白。一些转录因子单独实现转录的调节作用，而其他与其他蛋白质一起发挥作用。一些转录因子可以在某些条件下同时激活及阻抑转录。通常而言，转录因子结合与靶基因调节区中的特定共有序列高度相似的特定靶序列或序列。转录因子可以单独或在具有其他分子的复合物中调节靶基因的转录。
治疗：如本文所用，术语“治疗”指部分地或完全地缓和、改善、改进、减轻特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率。例如，“治疗”癌症可以指抑制肿瘤存活、生长和/或扩散。可以将治疗施用至不显示疾病、病症和/或病状迹象的受试者和/或施用至仅显示疾病、病症和/或病状早期迹象的受试者，目的在于降低形成与该疾病、病症和/或病状相关的病变的风险。
当适用于例如癌症时，短语“治疗方法”或其等同物指作用的期间或过程，其中将所述程序或过程设计成减少、消除或阻止个体中的癌细胞数目，或设计成减轻癌症的症状。“治疗癌症或另一种增殖性疾病的方法”并不必然地意指事实上将彻底地消除癌细胞或其他疾病，事实上将减少细胞或疾病的数目，或将减轻癌症或其他疾病的症状。通常，治疗癌症的方法将甚至在成功可能性低的情况下进行，但是鉴于个体的具体医疗史和估计的存活期望，所述方法仍视为总体有益的作用过程。
肿瘤生长：如本文所用，除非另外说明，否则术语“肿瘤生长”或“肿瘤转移灶生长”如肿瘤学中常见方式使用，其中该术语主要与肿瘤或肿瘤转移灶的质量或体积增加相关，主要因肿瘤细胞生长所致。
肿瘤负荷：如本文所用，术语“肿瘤负荷”指受试者携带的直径超过3mm的全部肿瘤结节的肿瘤总体积。
肿瘤体积：如本文所用，术语“肿瘤体积”指肿瘤的大小。按mm3计的肿瘤体积由下式计算：体积＝(宽度)2x长度/2。
未修饰的：如本文所用，“未修饰的”指以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未修饰可以指生物分子的野生型或天然形式，但并非总是如此。分子可以经历一系列修饰，从而每种修饰的分子可以充当用于后续修饰的“未修饰的”起始分子。
实施方案1-98
1.上调C/EBPα基因表达的分离的合成性saRNA，其中saRNA至少80％互补于SEQ IDNo.77上的区域，并且其中saRNA具有14-30个核苷酸。
2.根据实施方案1所述的saRNA，其中saRNA为单链。
3.根据实施方案2所述的saRNA，其中saRNA包含3’突出端。
4.根据实施方案2所述的saRNA，其中saRNA是经修饰的。
5.根据实施方案4所述的saRNA，其中saRNA包含至少2个修饰。
6.根据实施方案4所述的saRNA，其中所述修饰包括2’-F、2’-OMe、反转脱氧核糖或核苷酸间硫代磷酸酯键的任一种。
7.根据实施方案2所述的saRNA，其中所述saRNA包含选自SEQ ID No.35、37、39、41、43、45、47、49、93(AW51)和109(CEBPA51)的序列。
8.根据实施方案1所述的saRNA，其中所述saRNA为双链并且包含反义链和有义链。
9.根据实施方案5所述的saRNA，其中所述反义链包含选自SEQ ID No.35、37、39、41、43、45、47、49、93(AW51)和109(CEBPA51)的序列。
10.根据实施方案6所述的saRNA，其中所述有义链包含选自SEQ ID No.34、36、38、40、42、44、48、94和110的序列。
11.根据实施方案8所述的saRNA，其中所述saRNA是经修饰的。
12.根据实施方案11所述的saRNA，其中所述saRNA包含至少2个修饰。
13.根据实施方案11所述的saRNA，其中所述修饰可以包括2’-F、2’-OMe、反转脱氧核糖或核苷酸间硫代磷酸酯键的任一种。
14.根据实施方案11所述的saRNA，其中所述修饰在有义链上。
15.根据实施方案11所述的saRNA，其中所述修饰在有义链和反义链两者上。
16.根据实施方案1所述的saRNA，其中所述saRNA是缀合的。
17.根据实施方案16所述的saRNA，其中所述saRNA与糖配体缀合。
18.上调细胞中C/EBPα基因的方法，包括向所述细胞施用实施方案1-15中任一项所述的saRNA。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述细胞是正在增殖的细胞。
20.根据实施方案19所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述细胞是肝细胞癌(HCC)细胞。
22.根据实施方案18所述的方法，其中C/EBPαmRNA上调的EC50高于1.0。
23.根据实施方案18所述的方法，其中C/EBPα基因上调至少20％。
24.根据实施方案22所述的方法，其中C/EBPα基因上调至少2倍。
25.上调细胞中的基因表达的方法，所述基因选自丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(AGXT)、细胞色素P450 3A4(CYP3A4)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)或肝细胞核因子4-α(HNF4a)，所述方法包括施用上调C/EBPα基因表达的分离的合成性saRNA或其药物组合物，其中所述saRNA至少80％互补于SEQ ID No.77上的区域，并且其中所述saRNA具有14-30个核苷酸。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述细胞是正在过度增殖的细胞。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述细胞是肝细胞癌(HCC)细胞。
29.根据实施方案25所述的方法，其中所述细胞不是正在过度增殖的细胞。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述细胞是人原代肝细胞。
31.根据实施方案25所述的方法，其中从C/EBPα基因的编码链转录的反义RNA转录物未被切割。
32.根据实施方案25所述的方法，其中所述saRNA与Ago2蛋白结合。
33.根据实施方案25所述的方法，其中所述基因表达上调至少20％。
34.根据实施方案26所述的方法，其中所述基因表达上调至少2倍。
35.治疗有需求的受试者的肝纤维化、肝衰竭或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括施用上调C/EBPα基因表达的分离的合成性saRNA或其药物组合物，其中所述saRNA至少80％互补于SEQ ID No.77上的区域，并且其中所述saRNA具有14-30个核苷酸。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述肝衰竭是急性肝衰竭。
37.根据实施方案35所述的方法，其中所述受试者的总胆红素(TBIL)水平、循环丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，碱性磷酸酶(ALP)水平、γ-谷氨酰基-转肽酶(GGT)水平、肝羟脯氨酸水平、凝血酶原时间、氨或肝甘油三酯(肝TG)的水平降低。
38.根据实施方案35所述的方法，其中所述受试者的血清白蛋白水平、总蛋白水平增加。
39.根据实施方案35所述的方法，其中所述受试者的纤维组织或假小叶形成减少。
40.治疗有需求的受试者的II型糖尿病或胰岛素抵抗的方法，包括施用上调C/EBPα基因表达的分离的合成性saRNA或其药物组合物，其中所述saRNA至少80％互补于SEQ IDNo.77上的区域，并且其中所述saRNA具有14-30个核苷酸。
41.根据实施方案40所述的方法，其中所述受试者的肝脏胆固醇水平、血清AST水平、空腹葡萄糖水平、甘油三酯与HDL-C的比率或肝与身体的比率降低。
42.根据实施方案40所述的方法，其中所述受试者的胰岛素水平升高。
43.根据实施方案25、35或40所述的方法，其中所述saRNA为双链并且包含反义链和有义链。
44.根据实施方案43所述的方法，其中所述saRNA的反义链和/或有义链包含3’突出端。
45.根据实施方案43所述的saRNA，其中所述saRNA是经修饰的。
46.根据实施方案45所述的saRNA，其中所述saRNA包含至少2个修饰。
47.根据实施方案45所述的saRNA，其中所述修饰可以包括2’-F、2’-OMe、反转脱氧核糖或核苷酸间硫代磷酸酯键的任一种。
48.根据实施方案45所述的saRNA，其中所述修饰在有义链上。
49.根据实施方案45所述的saRNA，其中所述修饰在有义链和反义链两者上。
50.根据实施方案43所述的方法，其中所述反义链包含选自SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、35、37、39、41、43、45、47、49、93(AW51)和109(CEBPA51)的序列。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述有义链包含选自SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、34、36、38、40、42、44、48、94(AW51)和110(CEBPA51)的序列。
52.药物组合物，包含包封在脂质体中的分离的合成性saRNA，其中所述saRNA或其药物组合物上调C/EBPα基因表达，其中saRNA至少80％互补于SEQ ID No.77上的区域，并且其中所述saRNA具有14-30个核苷酸。
53.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述脂质体包含1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆甾烯基-半琥珀酸酯(CHEMS)和4-(2-氨基乙基)-吗啉代-胆固醇半琥珀酸酯(MOCHOL)。
54.根据实施方案53所述的药物组合物，其中POPC:DOPE:CHEMS:MOCHOL的摩尔比是约6:24:23:47。
55.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述脂质体的大小在约50nm至约150nm之间。
56.根据实施方案55所述的药物组合物，其中所述脂质体的大小在100nm至约120nm之间。
57.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述saRNA为双链并且包含反义链和有义链。
58.根据实施方案57所述的药物组合物，其中所述saRNA的反义链和/或有义链包含3’突出端。
59.根据实施方案57所述的药物组合物，其中所述saRNA是经修饰的。
60.根据实施方案59所述的药物组合物，其中所述saRNA包含至少2个修饰。
61.根据实施方案59所述的药物组合物，其中所述修饰可以包括2’-F、2’-OMe、反转脱氧核糖或核苷酸间硫代磷酸酯键的任一种。
62.根据实施方案59所述的药物组合物，其中所述修饰在有义链上。
63.根据实施方案59所述的药物组合物，其中所述修饰在有义链和反义链两者上。
64.根据实施方案57所述的药物组合物，其中所述saRNA的反义链包含选自SEQ IDNo.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、35、37、39、41、43、45、47、49、93(AW51)和109(CEBPA51)的序列。
65.根据实施方案57所述的药物组合物，其中所述saRNA的有义链包含选自SEQ IDNo.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、34、36、38、40、42、44、48、94(AW51)和110(CEBPA51)的序列。
66.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述saRNA具有SEQ ID No.109的反义链和SEQ ID No.110的有义链。
67.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述saRNA具有约2mg/mL至约5mg/mL的浓度。
68.根据实施方案67所述的药物组合物，其中所述saRNA具有约2.5mg/mL的浓度。
69.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约7.2至约7.8之间的pH。
70.根据实施方案69所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约7.5的pH。
71.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有磷酸盐缓冲剂。
72.根据实施方案71所述的药物组合物，其中所述磷酸盐缓冲剂包含磷酸氢二钠二水合物和磷酸二氢钾。
73.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含低温保护剂。
74.根据实施方案73所述的药物组合物，其中所述低温保护剂是蔗糖。
75.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含离子强度调节剂。
76.根据实施方案75所述的药物组合物，其中所述离子强度调节剂是氯化钾。
77.根据实施方案52所述的药物组合物，其中对所述药物组合物经保护免受光。
78.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述药物组合物储存在带瓶塞的玻璃小瓶中。
79.根据实施方案52所述的药物组合物，其中所述药物组合物冷冻储存在-20℃±5℃。
80.根据实施方案79所述的药物组合物，其中包封在所述脂质体中的所述分离的合成性saRNA保持稳定至少6个月。
81.根据实施方案52所述的药物组合物，其中将所述药物组合物用静脉内用0.9％生理盐水稀释。
82.治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用实施方案52的药物组合物。
83.根据实施方案82所述的方法，其中所述受试者患有肝细胞癌(HCC)。
84.根据实施方案83所述的方法，其中所述HCC是晚期HCC。
85.根据实施方案82所述的方法，其中所述受试者患有继发性肝肿瘤。
86.根据实施方案82所述的方法，其中所述药物组合物的剂量在约20至约160mg/m2之间。
87.根据实施方案82所述的方法，其中将所述药物组合物一周一次在第1日、第8日和第15日通过静脉输注施用3周。
88.在脂质体中包封分离的合成性saRNA的方法，包括：
在第一缓冲液中溶解saRNA以获得saRNA溶液，
经0.2μm滤器过滤所述saRNA溶液，
在注射模块中将过滤的saRNA溶液与脂质溶液混合以形成脂质体制剂，
向所述脂质体制剂添加第二缓冲液，
其中所述saRNA或其药物组合物上调C/EBPα基因表达，其中所述saRNA至少80％互补于SEQ ID No.77上的区域，并且其中所述saRNA具有14-30个核苷酸。
89.根据实施方案88所述的方法，其中第一缓冲液是乙酸Na/蔗糖。
90.根据实施方案88所述的方法，其中所述saRNA溶液的pH是约4.0。
91.根据实施方案88所述的方法，其中所述saRNA溶液中saRNA的浓度是约2.38mg/mL。
92.根据实施方案88所述的方法，其中所述脂质溶液包含1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆甾烯基-半琥珀酸酯(CHEMS)和4-(2-氨基乙基)-吗啉代-胆固醇半琥珀酸酯(MOCHOL)。
93.根据实施方案92所述的方法，其中POPC:DOPE:CHEMS:MOCHOL的摩尔比是约6:24:23:47。
94.根据实施方案88所述的方法，其中第二缓冲液具有约9的pH。
95.根据实施方案94所述的方法，其中第二缓冲液是NaCl/Na2HPO4。
96.根据实施方案88所述的方法，其中所述saRNA为双链并且包含反义链和有义链。
97.根据实施方案96所述的方法，其中所述saRNA的反义链包含选自SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、64(AW51)和78(CEBPA51)的序列。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述saRNA的有义链包含选自SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、50(AW51)和79(CEBPA51)的序列。
等同物和范围
本领域那些普通技术人员会认识到或将能够利用不超出常规的实验，确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同物。本发明的范围不意在限于以上说明书，而是如所附权利要求书所述。
在权利要求书中，除非指出相反或另外从上下文显而易见，否则冠词如“a”、“an”和“the”可以表示一个或多于一个。除非相反地指示或从上下文显而易见，否则，如果某群组成员的一个、多于一个或全部均存在于给定的产物或过程中、用于其中或否则与之相关，则该群组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或说明视为满足。本发明包括其中该群组的一个成员完全存在于给定的产物或过程中、用于其中或否则与之相关的实施方式。本发明包括其中该群组的一个、多于一个或全部成员均存在于给定的产物或过程中、用于其中或否则与之相关的实施方案。
还应当指出，术语“包含”是开放式的并且允许包含额外的组成成分或步骤。
在给出范围的情况下，包括端值。另外，应当理解，除非另外说明或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则，作为范围表述的值可以在本发明的不同实施方案中采取所述范围内部的任何特定值或子范围，至该范围下限的十分之一单位，除非上下文另外清楚地说明。
此外，应当理解，落在现有技术范围内的本发明的任何具体实施方案可以从任一项或多项权利要求中明确地排除。由于这类实施方案视为本领域普通技术人员已知，所以可以排除它们，即使这种排除并未在本文中明确地阐明。本发明组合物的任何具体实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；任何产生方法；任何使用方法等)可以因任何原因从任一项或多项权利要求排除，无论是否与现有技术的存在相关。
全部援引的来源，例如，本文中援引的参考文献、出版物、数据库，数据库条目和论文，均通过参考并入本申请，即便没有在引文中明确地描述。在援引的来源和本申请的描述发生冲突的情况下，本申请中的描述应当占主导地位。
本发明由以下非限制性实施例进一步说明：
实施例
材料和程序已经公开在PCT申请号PCT/IB2014/003054中。
实施例1.C/EBPα-saRNA体外研究
在一组HCC细胞系如Hep3B、HepG2、PLC/PRF/5、SNU475细胞中，转染AW51(akaCEBPA-AW1-510000)。将细胞在接种时用50nM AW51反向转染，24小时后正向转染并且在72小时收获。测量CEBPA mRNA水平和白蛋白(ALB)mRNA水平。如图4A-4D和图5A-5D中所显示，观察到CEBPA和ALB的mRNA上调。
Figure BDA0003506633680000981
实施例2.修饰的CEBPA-saRNA上调CEBPA
在DU145细胞中转染表3中的修饰的CEBPA-saRNA。将细胞在接种时用2.5nM和10nM修饰的CEBPA-saRNA反向转染，24小时后正向转染并且在72小时收获。测量CEBPA mRNA水平和GAPDH mRNA水平。在表6、图6A中的结果表明，CEPBA-saRNA可以耐受重度修饰。
表6-1 DU145细胞中的CEBPA mRNA水平
Figure BDA0003506633680000982
表6-2 DU145细胞中的GAPDH mRNA水平
双链体ID gapdh 2.5nM SD gapdh 10nM SD
XD-03287 0.30012213 0.04872709 0.15487859 0.021476125
XD-04353 0.38430764 0.05893013 0.21179771 0.023662437
XD-04354 0.278508 0.0151083 0.21589058 0.025144858
XD-04355 0.33891401 0.03684563 0.23096784 0.039633795
XD-04356 0.66440667 0.09665852 0.34165265 0.068757809
XD-03302 0.48401386 0.0938301 0.15074631 0.023836647
XD-04358 0.99270067 0.10679351 0.60215746 0.076308233
XD-04359 0.93338175 0.08896079 0.55308903 0.050195732
XD-04360 1.14035319 0.05727254 0.47614574 0.040400001
XD-04361 1.19595973 0.10526669 0.46229043 0.060483173
XD-03317 0.59089619 0.10261665 0.15368292 0.02885901
XD-04363 1.42967486 0.10493026 0.93230015 0.188124401
XD-04364 1.51612477 0.20993157 1.02248778 0.070857079
XD-04365 1.31858062 0.12189526 1.07045908 0.136617289
XD-04366 1.02824228 0.13557063 0.58889998 0.03921991
乱序 0.9596105 0.1991626 0.88815236 0.227402132
F-Luc 0.95681136 0.1749612 1.06219451 0.229513678
MeF 0.81949497 0.03521342 0.71848557 0.094709517
Aha-1 0.94853936 0.10607439 0.72142219 0.134524626
下表包括该实施例中使用的对照。使用Aha1 siRNA作为转染对照并且按2.5nM和10nM的浓度转染。
表7-1对照–有义序列
Figure BDA0003506633680000991
表7-2对照–反义序列
Figure BDA0003506633680000992
Figure BDA0003506633680001001
将CEBPA-saRNA与GalNac簇缀合(称作GalNac-CEBPA-saRNA)并在DU145细胞中转染。将细胞在接种时用2.5nM、10nM或50nM GalNac-CEBPA-saRNA反向转染，24小时后正向转染并且在72小时收获。测量CEBPA mRNA水平和白蛋白mRNA水平。
将AW51(aka CEBPA-AW1-510000)与GalNac簇缀合并在DU145细胞中转染。将细胞在接种时用2.5nM、10nM或50nM GalNac-CEBPA-saRNA反向转染，24小时后正向转染并且在72小时收获。测量CEBPA mRNA水平和白蛋白mRNA水平。
实施例3.saRNA和siRNA的体外剂量反应和效力比较
DU145细胞中三种未修饰的CEBPA-saRNA(XD-03287、XD-03302、XD-03317)的EC50与DU145细胞中针对AHA1和CEBPA的siRNA的IC50比较。
对于saRNA的EC50试验，将DU145细胞(p15，8000个细胞/孔)用CEBPA-saRNA反向在0小时转染(脂质转染胺2000，0.4μl/孔)，在24小时正向转染并在72小时收获。将XD-03287、XD-03302、XD-03317从100nM按2x稀释系列给予。CEBPA mRNA水平用GAPDH归一化。
对于siRNA的IC50试验，DU145细胞(p15、8000个细胞/孔)接受在0小时单次转染，在24小时收获。将Life Technologies CEBPA-siRNA和Axo unmod AHA1从50nM按5x稀释系列给予。
表8 saRNA、siRNA和对照的序列：
Figure BDA0003506633680001002
Figure BDA0003506633680001011
表9以nM计的saRNA浓度和siRNA浓度：
siRNA 50 10 2 0.4 0.08 0.016 0.0032 0.00064 0.000128 0.0000256
saRNA 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.5625 0.78125 0.390625 0.1953125
表10和图7A-7C中显示siRNA的IC50值。表11和图8A-8C中显示saRNA的EC50值。saRNA/siRNA斜率比是约5，提示不同的机制。为了计算斜率平均数和比率，斜率对100％的Y-轴范围归一化。这产生siRNA的约0.5的平均斜率(CEBPA-siRNA和Aha-1-siRNA)和saRNAs(XD-03287、XD-03302和XD-03317)的约2.7的平均斜率。EC50和IC50是拐点(IP)，最大半数活性的量值。因此，CEBPA-saRNA高度强力，具有低nM范围的IC50。
表10 siRNA和对照的IC50值：
Figure BDA0003506633680001012
表11 saRNA的EC50值
saRNA双链体ID XD-03287 XD-03302 XD-03317
EC<sub>50</sub>(nM) 2.50 5.83 4.66
IP(nM) 5.42 6.24 5.58
斜率 1.91 1.82 2.19
实施例4.人肝细胞中CEBPA-saRNA的体外研究
人原代肝细胞(LifeTechnologies，HMCPTS)置于非增殖培养基中。在接种当日，对细胞进行反向转染步骤，其中在细胞单层贴壁之前，将saRNA转染复合物添加至细胞。在24小时后，更换培养基并进行正向转染。次日，更换培养基并将细胞温育另外24小时，之后收获细胞供分析。将肝细胞用AW51转染。在48小时和72小时测量CEBPA mRNA水平和白蛋白mRNA水平。使用Aha-1-siRNA和Fluc作为对照。表12和图9A中显示Aha1、白蛋白、CEBPA的相对表达。
材料
原代肝细胞解冻培养基：冷冻的肝细胞恢复培养基(CHRM)，50mL(LifeTechnologies目录号CM7000)
原代肝细胞铺种培养基：胎牛血清，热灭活–50mL(Life Technologies目录号16140-071)
胰岛素-转铁蛋白-硒(100X)–5mL(Life Technologies目录号41400-045)
HEPES(1M)–5mL(Life Technologies目录号15630-056)
L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液–5mL(Sigma目录号G1146)
地塞米松–至40ng/mL终浓度(Sigma目录号D8893)
Williams E培养基，无酚红–总计至500mL(Life Technologies目录号A12176-01)
原代肝细胞维持培养基：原代肝细胞维持补充物(Life Technologies目录号CM4000)
Williams E培养基，无酚红–总计至500mL(Life Technologies目录号A12176-01)
原代肝细胞培养板：胶原蛋白I，包被平板，24孔(Life Technologies目录号A11428-02)
转染试剂：HiPerFect转染试剂(Qiagen目录号301704)
Opti-MEM I还原型血清培养基，无酚红(Life Technologies目录号11058-021)
试验方法
saRNA复性：
将冻干的每种saRNA链在无RNA酶10mM Tris-HCl，20mM NaCl，1mM EDTA中重悬至1mM。将它们充分混合至完全重悬。通过温和涡旋混合，将等体积的有义链和反义链混合在一起。含合并链的管置于具有加热到95℃水的烧杯中。覆盖烧杯并且允许其冷却至室温。使用无RNA酶的水进行后续稀释。通常对于24孔样式，稀释母液至10μM。复性的saRNA等分试样等分并储存在-20℃。
原代肝细胞解冻和铺种：
在水浴中加温CHRM和铺种培养基至37℃。将冷冻的肝细胞在37℃水浴中解冻直至无冰晶体留下。小瓶用70％乙醇消毒。在无菌的组织培养通风橱中，将解冻的肝细胞直接转移入CHRM。肝细胞以100xg(Thermo F-G1定角转子中，900转/分钟)在室温离心10分钟。将上清液小心地倾入废物瓶。将沉淀物按1x106个冷冻的细胞重悬于1mL铺种培养基中。使用NucleoCounter NC-200聚集式细胞测定法计数细胞，以确定细胞生存力。将2.0x105个活细胞在24孔平板中每孔500μL铺种培养基中铺种。
反向转染(接种后立即进行)：
对每个待转染孔，将12μL 10μM saRNA稀释于85μL Opti-MEM中。对每个待转染孔，添加3μLHiPerFect并通过涡旋混合充分混合。将转染物在室温温育15分钟。将100μL转染复合物添加至每个孔，以便saRNA终浓度为200nM。将平板在增湿培养箱中于37℃5％CO2温育。5小时后，将培养基更换成500μL预温的维持培养基。
正向转染(接种后24小时进行)：
对每个待转染孔，将12μL 10μM saRNA稀释于85μL Opti-MEM中。对每个待转染孔，添加3μL HiPerFect并通过涡旋混合充分混合。将转染物在室温温育15分钟。在温育期间，将培养基更换成每孔500μL预温的新鲜维持培养基。将100μL转染复合物添加至每个孔，以便saRNA终浓度为200nM。将平板放回培养箱。24小时后，将培养基更换成500μL预温的新鲜维持培养基。最高的基因活化出现在细胞接种后72小时。此时收集细胞和/或上清液供下游分析。
表12-1在aha1-siRNA、Fluc和AW51转染后48小时的Aha1基因、白蛋白基因和CEBPA基因的相对表达
Figure BDA0003506633680001031
Figure BDA0003506633680001041
表12-2在aha1-siRNA、Fluc和AW51转染后72小时的Aha1基因、白蛋白基因和CEBPA基因的相对表达
Aha1表达 白蛋白表达 CEBPA表达
未处理 1 1 1
Aha1 0.1 0.6 1.0
Flu 0.8 0.7 1.4
AW51 0.9 0.65 1.6
正在增殖的人原代肝细胞中saRNA转染方案
人原代肝细胞(LifeTechnologies，HMCPTS)置于增殖培养基中。在接种当日，对细胞进行反向转染步骤，其中在细胞单层贴壁之前，将saRNA转染复合物添加至细胞。在24小时后，更换培养基并进行正向转染。次日，更换培养基并将细胞温育另外24小时，之后收获细胞供分析。将肝细胞用AW51转染。在48小时和72小时测量CEBPA mRNA水平和白蛋白mRNA水平。使用Aha-1-siRNA和Fluc作为对照。表13和图9B中显示Aha1、白蛋白、CEBPA的相对表达。
材料
原代肝细胞解冻培养基：
冷冻的肝细胞恢复培养基(CHRM)，50mL(Life Technologies目录号CM7000)
原代肝细胞铺种培养基：
胎牛血清，热灭活–50mL(Life Technologies目录号16140-071)
胰岛素-转铁蛋白-硒(100X)–5mL(Life Technologies目录号41400-045)
HEPES(1M)–5mL(Life Technologies目录号15630-056)
L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液–5mL(Sigma目录号G1146)
地塞米松–至40ng/mL终浓度(Sigma目录号D8893)
Williams E培养基，无酚红–总计至500mL(Life Technologies目录号A12176-01)
原代肝细胞维持培养基：
原代肝细胞维持补充物(Life Technologies目录号CM4000)
人肝细胞生长因子–至40ng/mL终浓度(Sigma目录号H5791)
人表皮生长因子–至20ng/mL终浓度(Sigma目录号E9644)
烟酰胺–至2.5μg/mL终浓度(Sigma目录号N0636)
Williams E培养基，无酚红–总计至500mL(Life Technologies目录号A12176-01)
原代肝细胞培养板：
胶原蛋白I，包被平板，24孔(Life Technologies目录号A11428-02)
转染试剂：
HiPerFect转染试剂(Qiagen目录号301704)
Opti-MEM I还原型血清培养基，无酚红(Life Technologies目录号11058-021)
试验方法
saRNA复性：
将冻干的每种saRNA链在无RNA酶10mM Tris-HCl，20mM NaCl，1mM EDTA中重悬至1mM。将它们充分混合至完全重悬。通过温和涡旋混合，将等体积的有义链和反义链混合在一起。将连同合并的链的管置于具有加热到95℃水的烧杯中。覆盖烧杯并且允许其冷却至室温。使用无RNA酶的水进行后续稀释。通常对于24孔样式，稀释母液至10μM。复性的saRNA等分并储存在-20℃。
原代肝细胞解冻和铺种：
在水浴中加温CHRM和铺种培养基至37℃。将冷冻的肝细胞在37℃水浴中解冻直至无冰晶体留下。小瓶用70％乙醇消毒。在无菌的组织培养通风橱中，将解冻的肝细胞直接转移入CHRM。肝细胞以100xg(Thermo F-G1定角转子中，900转/分钟)在室温离心10分钟。将上清液小心地倾入废物瓶。在1mL铺种培养基中按1x106个冷冻的细胞重悬沉淀物。使用NucleoCounter NC-200聚集式细胞测定法计数细胞，以确定细胞生存力。将1.0x105个活细胞以每孔500μL铺种培养基在24孔平板中铺种。
反向转染(接种后立即进行)：
对每个待转染孔，将3μL 10μM saRNA稀释于94μL Opti-MEM中。对每个待转染孔，添加3μLHiPerFect并通过涡旋混合充分混合。将转染物在室温温育15分钟。将100μL转染复合物添加至每个孔，以使saRNA终浓度为50nM。
将平板在增湿培养箱中于37℃5％CO2温育。5小时后，将培养基更换成500μL预温的维持培养基。
正向转染(接种后24小时进行)：
对每个待转染孔，将3μL 10μM saRNA稀释于94μL Opti-MEM中。对每个待转染孔，添加3μLHiPerFect并通过涡旋混合充分混合。
将转染物在室温温育15分钟。在温育期间，将培养基更换成每孔500μL预温的新鲜维持培养基。将100μL转染复合物添加至每个孔，以便saRNA终浓度为50nM。将平板放回培养箱。24小时后，将培养基更换成500μL预温的新鲜维持培养基。最高的基因活化出现在细胞接种后72小时。此时收集细胞和/或上清液供下游分析。
表13-1在aha1-siRNA、Fluc和AW51转染后48小时的Aha1基因、白蛋白基因和CEBPA基因的相对表达
Aha1表达 白蛋白表达 CEBPA表达
未处理 1 1 1
Aha1 0.1 0.8 1.1
Flu 1.6 0.7 2.0
AW51 2.2 0.9 3.2
表13-2在aha1-siRNA、Fluc和AW51转染后在72小时的Aha1基因、白蛋白基因和CEBPA基因的相对表达
Figure BDA0003506633680001061
Figure BDA0003506633680001071
表12-13和图9A/9B显示当肝细胞暴露于增殖培养基时，CEBPA-saRNA上调肝细胞中的CEBPA和白蛋白。因此，CEBPA-saRNA在正在增殖的细胞中显示功效。siRNA在正在增殖的细胞和并未正在增殖的细胞中均显示功效。
实施例5.CEBPA-saRNA的体外研究
CEBPA-51在肝细胞系中的生物学效应：
研究目的：这项研究的目的是测量代表高度分化的HCC的HCC细胞系(HepG2，Hep3B)或代表不良分化的HCC的HCC细胞系(PLCPRF5)中的内源CEBPA转录物水平，并且确定在CEBPA-51转染后CEBPA mRNA和C/EBP-α蛋白质表达的相对增加。此外，评估C/EBP-α上调对细胞增殖的影响。
用CEBPA-51转染一组包括HEP3B、HEPG和PLCPRF5的肝细胞系。通过蛋白质印迹法在距转染后72小时的细胞裂解物中检测C/EBP-α蛋白(定量：RC-DC Bradford测定法，参比蛋白：微管蛋白)。与PLCPRF5细胞相比，Hep3B细胞和HepG2细胞中CEBPA的内源转录物水平显著较高。与未转染的对照和非特异性RNA双链体(siFLUC)处理相比(图10A和图10B)，用CEBPA-51处理导致全部3个测试的HCC细胞系中CEBPA mRNA转录物水平明显增加和C/EBP-α蛋白质水平增加。
用WST-1增殖测定法和SRB比色测定法测量细胞增殖。图11A-11F中显示结果。与HEP3B和HEPG2细胞系的对照相比，CEBPA-51减少细胞增殖，但在PLCPRF5细胞中并非如此。因此，在HepG2和Hep3B细胞中证实了CEBPA-51抑制细胞增殖的能力。相比之下，PLCPRF5细胞不受CEBPA-51处理影响。
AW51的脱靶分析：
从预测的脱靶位点证实AW51的特异性。实施脱靶生物信息学分析。AW51与任何其他人转录物具有至少2个反义链的错配。仅预测出4个脱靶，具有2个反义链错配。在24小时温育情况下在HuH7细胞和Panc-1细胞中体外测量靶。mRNA水平对gapdh归一化并且结果在图12A(HuH7细胞)-图12B(Panc-1细胞)中显示。AW51转染后潜在脱靶的表达模式显示没有一个基因显著地受AW51影响。
实施例6.CEBPA-saRNA的机制研究
链选择/鉴定和切割分析
已经显示在5'末端反向脱碱基修饰阻止了装载至Ago2复合物中的引导位置内。C/EBPA-saRNA的反义链(AS)和有义链(SS)用在5'末端的反向脱碱基修饰阻断(b)，并且测量C/EBPA mRNA表达以及确定阻断AS链和/或SS链对C/EBPA mRNA表达的影响。
RNAi涉及靶mRNA的切割。检测中心三碱基对突变的非切割性序列(CEBPA-AW01-510500)，以确定CEBPA-saRNA是否切割靶EST(AW665812)。中心三碱基对突变产生不可切割性saRNA，无论哪条链充当引导链。
全部saRNA均在水中合成和复性。RP-HPLC具有90％纯度。下表中显示寡核苷酸样品的序列。
Figure BDA0003506633680001081
关键试剂
转染 将细胞以100,000个细胞/孔在24孔培养皿中按寡核苷酸终浓度10nM用1μL脂质转染胺2000(Life Technologies，Carlsbad，加利福尼亚州)转染。相同条件用于正向转染和反向转染。
RNA分离 根据制造商的方案(Qiagen，Venlo，荷兰)以RNeasy微量试剂盒分离总RNA。
互补性DNA(cDNA)合成使用Quantitect逆转录试剂盒，根据生产商的操作方案用20μL反应中用500ng RNA(Qiagen)，合成cDNA。
定量PCR用QuantiFast SYBR Green PCR主混合物(Qiagen)在AppliedBiosystems 7900HT实时PCR系统(Life Technologies)上根据生产商的操作方案进行定量PCR。在每个反应中反应以12.5ng cDNA按三个重复孔进行。
细胞系
将HepG2肝细胞癌细胞在维持于37℃5％CO2的培养箱中补充有10％胎牛血清和1XL-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液的RPMI培养基(Sigma-Aldrich,St.Louis,密苏里州)中。
实验设计
实验按三个重复孔进行。将HepG2细胞在24孔培养皿中按100,000个细胞/孔接种并使用Lipofectamine 2000，用10nM(终浓度)每种供试品反向转染。在24小时温育时间后，使用Lipofectamine 2000，用10nM(终浓度)每种供试品实施额外的正向转染步骤。初步实验确定在第二次转染后观察到最大saRNA活性。在第二次转染后48小时，将细胞裂解并收集以通过定量性逆转录-PCR(qRT-PCR)测定CEBPA mRNA水平和白蛋白mRNA水平。
数据评价
使用ΔΔCt方法分析实时PCR结果。使用SDS软件(Life Technologies)确定Ct值并且通过对未转染的细胞归一化计算相对量。另外，持家基因GAPDH充当内对照。用三次重复实施转染实验；一式三份进行qPCR测定。使用t检验联合Welch校正确定统计显著性
结果和讨论
与未转染的细胞相比，在经未修饰的AW1-51序列、SS上修饰的AW1-51(CEBPA-AW01-510012)和具有内部序列突变的AW1-51(CEBPA-AW01-510500)转染的细胞中观察到CEBPA mRNA上调2-2.5倍(图13A)，在p<0.01均具有统计学显著性。用非特异性对照(NC-500000)、AS上修饰的AW1-51(CEBPA-AW01-510013)或在两条链上均修饰的AW1-51(CEBPA-AW01-510014)转染后未观察到CEBPA mRNA上调。与这个激活模式一致的是白蛋白(CEBPA转录激活的下游靶)表达上调，也具有统计学显著性，P<0.05(图13B)。
由于5’反向脱碱基修饰已知阻断Ago2装载该链，预计在两条链上具有这个修饰的寡聚物CEBPA-AW01-510014无活性。这可以在实验中证实。观察到在SS上具有反向脱碱基修饰但在AS上没有这种修饰的CEBPA激活，这表明表示AS是引导链，其载入Ago2以触发CEBPAmRNA表达。
通过引导链和靶序列(源自基因的基因组DNA或反义RNA转录物)之间序列中的中央错配抑制了Ago2对靶的切割。与未突变的寡聚物相比，含有中央突变的CEBPA-saRNA序列(CEBPA-AW01-510500)未显示CEBPA活化的差异，这表明对于saRNA活性，对CEBPA序列的切割并非必要。
结论
已经证明，反义链AW1-51是负责saRNA活性的引导链。另外，还证明有义链上的5’反向脱碱基修饰对CEBPA基因激活没有任何影响。此外，Ago2切割靶反义RNA不是触发saRNA活性必需的。
实施例7.人原代肝细胞中的CEBPA-51saRNA活性
如前所显示，CEBPA-saRNA上调正在增殖而非静息的肝细胞中的CEBPA mRNA和白蛋白mRNA(图9A和图9B)。在这项研究中，再次评价了CEBPA-saRNA对正在增殖的肝细胞的影响(图14)，并且还研究了对白蛋白分泌(图15)和下游标志物(图16A-图16F)的影响。
评价了CEBPA-51在正常人原代人肝细胞中的影响。由于培养下的原代肝细胞不增殖，这项研究表明CEBPA-51在生长因子和细胞因子诱导增殖的原代肝细胞中上调CEBPA转录物和白蛋白。另外，这项研究显示CEBPA-51引起调节对高效肝功能至关重要的因子；这些因子包括肝丙氨酸乙醛酸氨基转移酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、白蛋白、CYP3A4和HNF4A。
这项研究的目标是确立正常人原代肝细胞中CEBPA-51对CEBPA和白蛋白表达的功效。另外，还筛选对肝功能重要的因子以评估CEBPA-51是否引起有利影响。这些因子包括：
-丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(AGXT)。AGXT表达是肝特异的并且是肝细胞代谢功能需要的。
-白蛋白血清白蛋白是主要的人血浆蛋白质并且完全由肝脏合成。其主要功能是调节血液的胶体渗透压以及作为脂溶性激素、胆盐、非结合型胆红、载脂蛋白、钙和某些药物(华法林、氯贝丁酯等)的载体分子发挥作用。
-细胞色素P4503A4(CYP3A4)CYP3A4是参与药物代谢的细胞色素P450氧化酶家族的成员。CYP3A4优势地存在于肝脏中。这个细胞色素P450家族存在几种其他成员，然而CYP3A4是最常见和多功能的成员。
-鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)OTC是作为尿素循环的一部分在线粒体中催化氨甲酰基磷酸盐和鸟氨酸之间反应以形成瓜氨酸和磷酸盐的酶。
-肝细胞核因子4-α(HNF4A)HNF4A是肝特异性转录因子，其为参与脂质转运和药物和葡萄糖代谢的基因的肝特异性基因表达的主调节物。
为了证实CEBPA-51的靶接合作用，也用肝功能探针证实了CEBPA和白蛋白转录物水平。另外，用白蛋白特异性抗体实施ELISA，以测量CEBPA-51转染后细胞培养基中的白蛋白分泌。
材料与方法
这个实验的供试品是CEBPA-51，其是MTL-CEBPA的API。此外，还使用非靶向性双链体siFLUC作为阴性对照并且使用Aha-1siRNA作为转染效率对照。将这些RNA寡核苷酸(参见下表)商业合成(ST Pharm，首尔，韩国，分析证书见附件)，复性并且按10μM等分试样在无RNase H2O中储存在-20℃。
Figure BDA0003506633680001111
Figure BDA0003506633680001121
b：5’反向脱碱基糖帽
m：2'-O-甲基修饰的碱基
d：脱氧核糖核苷酸
ps：硫代磷酸酯
关键试剂
原代肝细胞解冻培养基 冷冻的肝细胞复苏培养基(CHRM)用于每个小瓶的解冻(Life Technologies，CM7000)。
原代肝细胞铺种培养基 热灭活胎牛血清-50ml(Life Technologies，16140-071)；胰岛素-转铁蛋白-硒(100x)-5ml(Life Technologies，41400-045)；HEPES(1M)-5ml(Life Technologies，15630-056)；L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液-5ml(Sigma，G1146)；地塞米松-40ng/ml终浓度(Sigma，D8893)；无酚红William’s E培养基(LifeTechnologies，A12176-01)。
原代肝细胞维持培养基 原代肝细胞维持补充物(Life Technologies，CM4000)；人肝细胞生长因子-40ng/ml终浓度(Sigma，H5791)；表皮生长因子-20ng/ml终浓度(Sigma，E9644)，烟酰胺-2.5ug/ml终浓度(SigmaN0636)；无酚红William’s E培养基-500ml(LifeTechnologies，A12176-01)。
转染 将细胞以100,000个细胞/孔在胶原蛋白包覆的24孔培养皿中按寡核苷酸终浓度50nM用3μL HiPerFect转染试剂(Qiagen，301704)转染。将细胞在铺种培养基中温育5小时以允许单层形成，之后替换为维持培养基。对于第二次(正向)转染，使用与反向转染相同的条件。维持培养基用于剩余的实验时间。
RNA分离根据制造商的方案(Qiagen，Venlo，荷兰)以RNeasy微量试剂盒分离总RNA。
互补性DNA(cDNA)合成使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)，根据生产商的操作方案，在20μL反应中以500ng RNA合成cDNA。
定量PCR用Quantitect SYBR主混合物(Qiagen)在Applied Biosystems 7900HT实时PCR系统(Life Technologies)上根据生产商的操作方案进行定量PCR。反应按三个重复孔进行。
白蛋白酶联免疫吸附测定(ELISA)使用人白蛋白ELISA定量套装(BethylLaboratories Inc，美国)遵循生产商的说明，对来自每个实验组内所温育的原代细胞的培养基测量白蛋白含量。将针对白蛋白的人特异性抗体固定到Costar-3596-96孔平板(平底，TC处理，无热原，聚苯乙烯，无菌平板(Corning，美国)的每个孔上。自行制备的试剂包括：
ELISA平板包被缓冲液0.05M碳酸盐-重碳酸盐(Sigma，C-3041)pH 9.6。
ELISA洗涤缓冲液50mM Tris；0.14M NaCl；0.05％Tween 20(Sigma，P1379)pH8.0)。
ELISA封闭缓冲液50mM Tris；0.14M NaCl；1％BSA(Sigma，A-4503)，pH8.0)。
样品/结合物缓冲液50nM Tris；0.14M NaCl；1％BSA(Sigma，A-4503)；0.05％Tween 20(Sigma，P1379)。
酶底物缓冲液3,3',5,5'-四甲基联苯胺(Sigma,T0440)。ELISA终止溶液。(Sigma，S5814)。
细胞系
人正常原代肝细胞购自Life Technologies(HMCPTS)。全部重复均源自相同批次(HU8200-A)。
实验设计
相对基因表达
为了靶转录物的相对定量，实验一式三份进行。人原代肝细胞在24孔胶原蛋白包被的培养皿(Life technologies，A11428-02)中以密度100,000个细胞/孔接种在原代肝细胞铺种培养基中，随后用50nM(终浓度)CEBPA-51在细胞仍处于悬浮时初始转染(反向转染)。随后使细胞形成单层，5小时后将铺种培养基更换为维持培养基。在反向转染后24小时，用50nM CEBPA-51实施第二次(正向)转染。每24小时更换新鲜的维持培养基直至反向转染后72小时的收获点为止，对细胞提取的总RNA筛选靶基因表达。
ELISA
在这项研究的72小时时间点收集培养基用于ELISA，所述ELISA使用固定到96孔平板各孔上的人特异性抗白蛋白(Bethyl Laboratories，A80-129A)。将白蛋白量已知的标准曲线(Bethyl Laboratories，RS10-110-4)按10μg/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml和6.25ng/ml添加。将样品和已知的对照量留在转动平板上之上的ELISA平板上，在室温(20-25℃)温育3小时。如生产商方案中详述，在适宜次数洗涤后，将HRP检测抗体(Bethyl Laboratories，A80-129P)以1:150,000的浓度添加并且在转动的平板上在室温(20-25℃)温育1小时。在5次洗涤后，添加TMB底物并且允许在室温温育直至酶促颜色反应显色。通过添加ELISA终止溶液终止反应，其中在平板读数仪上测量在450nm光密度的吸光度。
数据评价
相对表达
使用Livak方法(2–ΔΔCT)(Livak K和Schmittgen TD，2001)分析实时PCR结果。使用SDS软件(Life Technologies)确定Ct值并且通过对未转染的细胞归一化计算相对量。持家基因GAPDH充当内对照。一式三份实施转染实验；一式三份进行qPCR测定。使用非参数t检验联合Welch校正确定统计显著性。
ELISA
使用曲线拟合软件(Excel)，垂直(Y)轴上是每个标准浓度的平均吸光度值减去空白值，水平(X)轴上是相应的人白蛋白浓度，来制备标准曲线，从而确定未知样品中人白蛋白量的量。使用与针对未知样品获得的吸光度值(Y轴)相关联的人白蛋白浓度(X轴)，计算未知样品中人白蛋白的量。
结果和讨论
转染CEBPA-51至人原代肝细胞诱导了CEBPA转录物水平以及白蛋白明显增加2.5倍，图14A和图14B。为了证实高效的转染效率，使用Aha1-siRNA用作对照，并且其证明靶转录物减少7倍，图14C。
CEBPA-51在正常人原代肝细胞中的生物学效应
在证实CEBPA-51转染后CEBPA转录物内源表达水平增加后，测量来自细胞的培养基中分泌型白蛋白水平。使用人特异性抗-白蛋白抗体的ELISA测定证实，来自肝细胞的白蛋白分泌显著增加1.3倍(图15)。
为了评估增加的CEBPA转录物水平和白蛋白转录物水平是否也反映对肝功能重要的各因子的正向调节作用；评估CEBPA-51转染的原代肝细胞中以下转录物的表达水平：图16A丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(AGXT)增加1.4倍；图16B白蛋白增加1.5倍；图16C细胞色素P450 3A4(CYP3A4)增加1.5倍；图16D鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)增加2.3倍；图16E肝细胞核因子4-α(HNF4A)增加1.5倍；并且图16F CEBPA增加1.6倍。
结论
认为CEBPA是重要的肝富集型转录因子。其生物学功能在敲除和敲入转基因动物研究中变得更明显。这项研究证明了，CEBPA-51的转录应答引起对正常人原代肝细胞中肝细胞功能非常相关的CEBPA和其下游效应子上调。发现正常原代肝细胞有利地对CEBPA-51转染做出反应，白蛋白分泌明显增加且脱毒酶显著上调。
实施例8.食蟹猴成纤维细胞中的CEBPA-saRNA saRNA
细胞系
原代食蟹猴肝细胞从Primacyt Cell Culture Technology(Schwerin，德国)获得。将CYNOM-K1食蟹猴胚胎成纤维细胞细胞(英格兰公共卫生署，Salisbury，UK)维持在37℃5％CO2的培养箱中的补充有10％胎牛血清、1％非必需氨基酸(Life Technologies)和1XL-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液的MEM培养基(Sigma-Aldrich,St.Louis,密苏里州)中。评估CEBPA-51上调食蟹猴细胞中CEBPA mRNA的能力以证实交叉反应性。首先，验证在CEBPA-51靶位点的食蟹猴基因组序列。该序列从公开可获得的数据库取得并且通过对gDNA衍生的PCR产物直接测序来验证。使用BLAST，将CEBPA51靶序列用作食蟹猴(Macacafascicularis，cynomolgus monkey)基因组上的查询检索。查询定位于CEBPA的基因组位置并且在CEBPA-51序列和基因组靶位点之间不存在错配。为了验证这个序列信息，从食蟹猴原代肝细胞分离gDNA并且生成靶位点的PCR产物供直接测序。比对所得到的序列与公开的食蟹猴基因组序列和CEBPA-51靶位点，没有错配。
在证实食蟹猴基因组靶序列后，将CEBPA-51转染入食蟹猴成纤维细胞以确定CEBPA-51是否有交叉反应性并能够上调肝细胞之外其他细胞中的CEBPA mRNA。测量未转染的细胞、siFLUC转染的细胞和CEBPA51转染的细胞中的mRNA水平。实验一式三份进行。将CYNOM-K1细胞在24孔培养皿中按100,000个细胞/孔接种，并使用Lipofectamine 2000，用20nM(终浓度)每种供试品反向转染。在24小时温育时间后，使用Lipofectamine 2000，用20nM(终浓度)每种供试品实施额外的正向转染步骤。初步实验确定，在第二次转染后观察到最大saRNA活性。在第二次转染后24小时，将细胞裂解并收集以通过定量性逆转录-PCR(qRT-PCR)测定CEBPA mRNA水平。如图17中所示，与未转染的细胞相比，在细胞经CEBPA-51第二次转染后24小时观察到CEBPA mRNA上调2倍，而利用siFLUC未见上调。这种上调具有统计学显著性，p<0.05。
因此，在食蟹猴细胞系中证实了CEBPA-saRNA的交叉反应性。已经证明，根据BLAST数据库，食蟹猴的基因组序列不含与CEBPA-51靶序列的错配。通过对原代食蟹猴gDNA测序进一步验证这一点。随后通过在食蟹猴成纤维细胞中转染和观察到CEBPA基因活化，证实了CEBPA-51的交叉反应性。
实施例9.在大鼠、食蟹猴和人血清中的体外稳定性分析
这项研究是研究CEBPA-51和脂质体配制的MTL-CEBPA在EDTA-K2抗凝的大鼠、食蟹猴和人血浆中37℃、120分钟范围的体外稳定性分析。
3μL在PBS中的50uM CEBPA-51溶液或3μL MTL-CEBPA溶液与30μL血浆混合并在37℃在血浆中温育0、5、10、20、30、60和120分钟。温育3μL在PBS中的CEBPA-51溶液或3μL在30μL PBS中的MTL-CEBPA溶液充当非特异性降解的对照。温育在Eppendorf Mastercycler中的密封的96孔PCR平板内进行。在指示的时间点通过蛋白酶K处理以消化血浆样品中存在的全部核酸酶，停止温育。在蛋白酶K处理后，CEBPA-51在样品中稳定并且在含有SDS CEBPA-51的裂解缓冲液中从MTL-CEBPA中的LNP制剂释放。
随后通过一般性AEX-HPLC方法在变性条件下升高的pH(11)和40℃在ThermoFisher DNA Pac PA 200柱(4x250mm)上，分析样品。将以1mL/分钟流速在18分钟中从250至620mM的溴化钠梯度用来分离并从HPLC柱洗脱RNA链。用UV检测器在260nm实施检测。
在这些条件下，单独CEBPA-51或从MTL-CEBPA释放的CEBPA-51这两条单链相互分离并与降解产物分离，并且可以作为不同的峰评价。由于没有参比单链并且AEX-HPLC不能与质谱法组合，不可能进行两条单链的分配(assignment)。因此根据梯度洗脱期间的保留时间，将两条链标记为第一链和第二链。为了评价数据，仅评价单独CEBPA-51或MTL-CEBPA中CEBPA-51这两条单链的峰面积。对每个物种的血浆，在T＝0的峰面积设定为100％并且全部其他时间点相对在T＝0的峰面积归一化。数据随后报告为对T＝0归一化的完整链％。
结果
无配制的CEBPA-51：
CEBPA-51在EDTA抗凝的大鼠血浆中相对地稳定并且观察到第一峰降解15％和第二峰降解8％(参见图18A)。在人血浆中CEBPA-51经2小时降解约50％(参见图18B)。CEBPA-51在食蟹猴血浆中最不稳定，两条链的约85％在2小时以内降解(参见图18C)。
数据显示，单独的CEBPA-51在人血浆和食蟹猴血浆中较不稳定，但在大鼠血浆中经两小时相对地稳定。不希望受任何理论约束，在大鼠血浆中，RNA降解主要由依赖于二价阳离子的3’-核酸外切酶引起。因此，使用EDTA作为抗凝血剂高效地阻断了这个降解途径并且CEBPA-51相对稳定。与之相反，人血浆和食蟹猴血浆中的主要降解途径依赖于RNase A。这种核酸内切酶的活性与二价阳离子无关，因此未受脂质体制剂保护的CEBPA-51在这些物种的血浆中降解。
脂质体配制的CEBPA-51：
MTL-CEBPA中的CEBPA-51在全部物种的血浆中经2小时仍稳定并且没有观察到明显降解(参见图19A、图19B和图19C)。这表明，MTL-CEBPA中的LNP制剂经2小时稳定并且彻底地保护CEBPA-51在血浆中免遭降解。
从这些结果，可以得出结论，MTL-CEBPA制剂在血浆中历经至少2小时完好无损。
实施例10.大鼠中的体内药代动力学研究
这项研究是一项PK研究，其研究在组1中和组2中分别单次IV施加2.175mg/kgMTL-CEBPA和1.5mg/kg CEBPA-51后大鼠血浆样品中CEBPA-51和脂质体配制的MTL-CEBPA。每个组3只雄性大鼠。两个组均在0.25、0.5、1、2、3、6、12、24和48小时后采集血液。
在含有SDS的缓冲体系中通过蛋白酶K处理，将等分试样的血浆均化。在蛋白酶K消化后，将SDS用3M KCl沉淀并通过离心移除。将上清液在互补性15mer荧光标记肽核酸(PNA)探针存在下加热，以在PNA和单独CEBPA-51的反义链或从脂质体配制的MTL-CEBPA释放的CEBPA-51的反义链之间特异性形成稳定双链体。PNA与CEBPA-51(这个实施例中称作母体化合物)之间形成双链体，还与来自代谢物或合成的杂质形成双链体。随后通过与荧光检测器偶联的非变性阴离子交换-高效液相色谱法(AEX-HPLC)，分析形成的双链体。通过AEX-HPLC，将代谢物或合成性杂质与主要化合物分离。
使用由掺入未处理的血浆裂解物的已知浓度母体化合物产生的外部校准曲线，计算CEBPA-51的浓度。通过从总峰面积扣减母体化合物的峰面积，计算每份样品的总代谢物/合成性杂质水平。所得到的峰面积随后针对外部校准曲线定量。
结果
无配制的CEBPA-51：
从CEBPA-51处理的大鼠获得的血浆中观察到母体化合物高度降解。母体化合物仅在第一采样时间点(施用后15分钟，参见图20A和图20B)检出。直至60分钟检出代谢物，但施用后2小时其低于检测限(BDL)。
脂质体配制的CEBPA-51：
MTL-CEBPA制剂在血浆中显示高稳定性。母体化合物发现于从MTL-CEBPA处理的大鼠获得的全部血浆裂解物中。母体化合物和代谢物之间的比率是约9:1，即脂质体配制的组中接近88％的母体化合物完好。在更晚的时间点，母体化合物的相对含量增加超过“代谢物/杂质”，因为色谱图中大部分的微小位点峰的信号低于检测限(参见图21A)。施用后48小时，仍在大鼠血浆中可检出CEBPA-51(参见图21A和图21B)。
这项研究表明，静脉内施用MTL-CEBPA后观察到的代谢物(其占据所检测RNA的约10％)可能源自RNA合成过程而非来自强烈的代谢。然而，由于与未封装化合物(CEBPA-51)的比较因未配制CEBPA-51的血浆不稳定性和极端快速的清除而不可行，故不能排除dsRNA的代谢性转化。
实施例11.采用CEBPA-saRNA的CCL4所致肝衰竭/纤维化体内研究
肝纤维化是慢性炎性肝脏疾病如慢性病毒性肝炎(例如，乙型肝炎和丙型肝炎)、酒精滥用、药物使用过量/毒性、胆汁阻塞性肝损伤、先天性异常或自身免疫性攻击肝细胞的病理学结果。它的特征是肝星状细胞(HSC)增殖及分化成肌成纤维细胞样细胞，导致胞外基质(ECM)和胶原蛋白沉积。四氯化碳(CCL4)所致肝纤维化是啮齿类中用于研究肝纤维化和肝硬化的明确确定和广泛接受的实验模型。向大鼠长期施用四氯化碳诱导肝功能重度紊乱连同组织学上可观察的肝纤维化。
用两性脂质体(Marina Biotech提供的NOV340 Smarticle脂质体)配制的CEBPA51(称作MTL-CEBPA)实施一项10周长的研究。CEBPA51(XD-03934)具有与AW51相同的序列，但在有义链上存在2’O-Me和5’反向脱碱基修饰。NOV340中的脂质包括Mochol、Chems、DOPE和POPC。通过每周二次腹内注射四氯化碳(CCL4)在Sprague Dawley大鼠中引起肝衰竭。使用起始体重120–150g的雄性Sprague Dawley大鼠。向动物按2ml/kg一周2次腹膜内(腹内注射CCL4:橄榄油(1:1比率)施2周，随后1ml/kg腹膜内每周二次施8周。将动物每周二次称重并维持在温度22±3℃、湿度50±20％、昼/夜循环各12小时和每小时更换15-20次新鲜空气的受控环境中。在研究阶段期间，动物按组圈养(3只动物/笼)，使用高压灭菌的玉米芯作为垫料，并且以经认证的照射的实验室啮齿类日粮(Nutrilab牌,Tetragon Chemie Pvt.Ltd,Bangalore)自由饲喂。
Figure BDA0003506633680001191
大鼠基于胆红素、体重和AST随机分配。将它们分入组1：假性对照；组2：路径对照-1；组3：路径对照-2；组4：测试化合物-0.3mg/kg；组5：测试化合物-1mg/kg；组6：测试化合物-3mg/kg。测试化合物＝MTL-CEBPA。将组4-6中的大鼠从第周8开始用测试化合物通过尾静脉注射达3mg/kg处理2周，伴以持续注射CCL4。向组3中的大鼠按3mg/kg施用NOV340/siFLUC。测试化合物静脉内注射在第8周、第8.5周、第9周和第9.5周进行。
Figure BDA0003506633680001201
在路径对照-1组中进行肝功能检验、羟脯氨酸水平和组织病理学以评估施用8周CCL4后的纤维化状态。在路径对照-2组中进行肝功能检验、羟脯氨酸水平和组织病理学以评估施用10周CCL4后的纤维化状态。测试化合物的功效依据其限制病情进展或逆转纤维化的能力评定。评估的参数是体重(每三天一次)、肝功能检验(第0日、第42日(第6周)、第56日(第8周)、第63日(第9周)和第70日(第10周))、研究结束时的组织病理学和研究结束时的羟基脯氨酸含量(路径对照-1为第8周，其余组为第10周)。组织病理学包括研究结束时对全部动物进行的H&E染色、Mason三色染色和天狼猩红染色。肝功能检验包括在第0、第4、第6、第8、第9和第10周测量的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白、球蛋白和白蛋白/球蛋白比。图22A-22K中所示的第8周、第9周和第10周时参数证明了有临床意义的参数的逆转和近似正常化，这些参数包括胆红素(下降75％，图22F)、循环型丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶(下降60％，图22B和图22C)和凝血酶原时间(下降20％，图22I)。此外，血清白蛋白(图22H)和总蛋白(图22G)存在明显增加，并且碱性磷酸酶(ALP)(图22D)和γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)(图22E)显著降低。肝羟脯氨酸以剂量依赖性方式显著降低(图22K)。观察到体重明显增加，无相关的毒性(图22A)。
图23中显示病理学结果。未用过药(naive)的动物具有呈偏棕粉色并且光滑、边缘清晰的健康肝脏。用CCL4和溶媒对照处理的动物的肝脏更苍白更坚实，表面遍布多个肝硬化结节。用CCL4和MTL-CEBPA(0.3mg/kg)处理的动物的肝脏苍白、更坚实，表面遍布小结节。肝脏颜色比CCL4和溶媒对照组的肝脏颜色深。用CCL4和MTL-CEBPA(3mg/kg)处理的动物的肝脏具有正常偏棕的颜色，表面不均匀和结节化非常轻。
图24A-24C中显示组织学染色结果。图24A是假性对照。图24B是接受NOV340/siFluc治疗的CCL4处理的大鼠(阴性对照)。图24C是接受MTL-CEBPA治疗的CCL4处理的大鼠。MTL-CEBPA治疗的动物与对照组中动物相比纤维组织和假性结节形成减少。
上文讨论的数据证明，CEBPA-saRNA在全部有临床意义的参数上逆转了肝衰竭。许多参数被逆转至正常。血清白蛋白水平甚至比正常更好。
实施例12.治疗急性肝衰竭的体内研究
急性肝脏衰竭(ALF)是具有高死亡率的临床病状。急性肝脏衰竭(ALF)病况的特征是，在无已知既往肝脏疾病的患者中肝细胞功能快速和重度恶化。在这项研究中肝毒性药物硫代乙酰胺(TAA)用来诱导ALF。为了在SD大鼠中建立硫代乙酰胺(TAA)所致的急性肝衰竭模型，测量以下参数：a)存活率；b)肝功能检验(LFT)和生物化学参数。
检验系统
测试物种：褐家鼠(Rattus norvegicus)。
品系：Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)。
性别：雄性。
体重/年龄：150-200g/7-8周。
组数：4。动物数/组：8。
来源：Harlan Laboratories。
研究时间：7天。
雄性SD大鼠，6-7周龄购自Harlan。将动物在温度22±3℃、湿度50±20％、昼/夜循环各12小时和每小时更换15-20次新鲜空气的受控环境中维持。动物按组圈养(3只动物/笼)，并使用高压灭菌的玉米芯作为垫料。一旦收到，将动物保持隔离1周。使用不褪色标记笔，在尾根除赋予动物一个临时编号。在隔离后，将动物转移至实验房间并保育以在启动实验之前适应1周。
设备：EM-360临床化学分析仪(Erba Mannheim，德国)。
疾病诱导
考虑基础参数的组间变异小于10％，将全部动物基于第–2日时的基础体重、胆红素和AST随机分配至四个组。通过笼卡识别各笼，所述笼卡显示研究编号、研究代码、组数、性别、剂量、笼号、动物数和动物编号详情。组1-4：全部研究动物均在第0日按剂量350mg/kg(mpk)、体积5ml/kg给予单次腹膜内(i.p)注射盐水中的TAA。组1不接受任何处理并且充当病理学对照。TAA注射后，将MTL-CEBPA在-24小时静脉内注射至组2，在0小时静脉内注射至组2，并且在24小时静脉内注射至组4。在第1、第2、第3、第4和第5日评估动物的LFT及生物化学参数，如丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和氨。在研究结束时，通过CO2窒息法使全部可获得的动物安乐死并收集血浆储存在-80℃。
实验组：
Figure BDA0003506633680001221
Figure BDA0003506633680001231
MTL-CEBPA的施用
通过尾静脉，用适宜的一次性注射器和针头静脉内施用供试品MTL-CEBPA。组2、3和4中的动物施以MTL-CEBPA。全部剂量均按剂量体积1ml/kg动物体重施用。
观察
体重和动物死亡率
单独记录全部动物的初始体重并且此后每天记录持续整个研究时间7天。以每日为基础在当天的相同时间观察总体健康状况。这包括警觉度、毛发质地、笼内运动和存在来自鼻、眼、口和耳的任何排泄物。对全部组的动物每日均监测因施用TAA所致的死亡率。
生物化学分析-LFT(供随机分组)
在第-2日，在异氟烷浅麻醉下通过眶后穿刺方法采集血液样品并分离血浆，通过全自动随机存取临床化学分析仪(EM-360，Make：Erba Mannheim，德国)测定ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、TP、ALB和氨。随后基于总胆红素、体重和AST随机分配动物。
TAA注射后评估生物化学参数、LFT
在异氟烷浅麻醉下通过眶后穿刺方法从全部动物采集血液样品(从注射TAA后第1日至研究结束)并分离血浆以评估ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、TP、ALB和氨。
统计分析
使用单因素或两因素差分析(ANOVA)，随后Dunnett多重比较检验(若适用)进行统计分析。p<0.05视为统计显著。数据表述为均数±SEM。
结果
肝功能参数和体重
在第-2日，将全部动物基于总胆红素(TB)、体重和AST水平随机分配至四个组供注射TAA以诱导ALF并用于MTL-CEBPA预防性、同步和阻止性治疗。
基于胆红素、体重和AST对组的随机化：
Figure BDA0003506633680001241
数据表述为均数±SEM
与其基础体重相比，病理学对照(TAA对照组)显示体重在第2日、第3日、第4日(p<0.01)及第5日(p<0.05)明显降低。与不同日数的TAA对照组比时，组2、组3和组4中在不同时间间隔的静脉内施用MTL-CEBPA显示体重从第1日至第5日无显著变化。
在整个研究持续时间(7天)期间在TAA治疗组和供试品治疗组中未观察到死亡。常规监测动物的局部(注射部位)和总体临床体征。发现全部动物在TAA注射后第1日嗜眠，并且在后续日恢复至正常。
动物每日平均体重：
Figure BDA0003506633680001242
生物化学分析
单个腹内注射TAA导致大部分的肝功能参数如第1日(p<0.05)和第2日(p<0.001)ALT、第1日和第2日AST(p<0.001)、第3日(p<0.05)GGT、第3日胆红素(p<0.05)没有显著增加，其他参数如第1日(p<0.01)、第2日(p<0.001)，第3日(p<0.05)白蛋白和第1日和第2日(p<0.001)氨与其基础读数相比时显著降低。
预防性、同步而非阻止性MTL-CEBPA注射显示，与治疗后不同天的TAA对照相比，肝脏功能参数明显改善，如ALT(p<0.05)、AST(p<0.05)、ALP(p<0.001)、GGT(p<0.05)、胆红素(p<0.05)和其他参数如总蛋白(p<0.01)、白蛋白(p<0.01)和氨(p<0.01)(图25A-25H)。
讨论和结论
在这项研究中，通过实施腹腔内TAA注射在SD大鼠中建立急性肝衰竭模型。在TAA注射后任何组未观察到死亡。与在病理学对照(TAA对照)动物中观察到的其基础水平相比时，TAA注射导致肝脏生物化学参数显著变化，如AST、ALT、胆红素、GGT、总蛋白、白蛋白和氨。还在TAA对照动物中观察到体重显著降低。当预防性注射(-24小时)和与TAA注射同步注射(0小时)时，MTL-CEBPA治疗显示LFT参数和氨明显改善。
实施例13.治疗糖尿病的体内研究
鉴于CEBPA在调节葡萄糖代谢中的作用，在大鼠糖尿病模型中实施研究以确定CEBPA激活是否可能改善有临床意义的血液参数。在六只wistar大鼠中通过高脂膳食诱导II型糖尿病。随后用配制在NOV340脂质体中的总计4.35mg/kgCEBPA-saRNA(AW1-50)或非靶向性FLUC siRNA治疗大鼠。在最后治疗后6天，抽取血液并处死动物以评估血清化学和体重的变。实验组和剂量：
Figure BDA0003506633680001251
如图26A-26N中所示，与对照相比，NOV340-CEBPA治疗的大鼠显示肝脏胆固醇、血清AST、空腹葡萄糖和甘油三酯对HDL-C比率显著降低。它们在体重以及肝对体重比率方面也具有显著的降低(图26L和图26N)。胰岛素水平随CEBPA-saRNA治疗增加(图26K)。结果表明，用CEBPA-saRNA上调CEBPA可能有益于管理糖尿病。CEBPA-saRNA也可以用于治疗脂肪肝病和胰岛素抗性。
实施例14.治疗NASH的体内研究
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是可以由肝脏中脂肪堆积引起的肝脏炎症和损伤。它是一组称作非酒精性脂肪肝病的病状的一部分。NASH可以引起肝脏瘢痕化，后者可以导致肝硬化。使用饲以缺乏甲硫氨酸胆碱的(MCD)膳食的动物，研究MTL-CEBPA在治疗NASH中的作用。与NASH相似，MCD膳食导致肝损伤。
在这项研究中，CEBPA-saRNA用来治疗C57BL/6小鼠中MCD诱导的NASH。研究时长是6周。雄性7-8周龄C57B/L6小鼠在第0日基于体重随机分配。组1获得正常膳食4周，并且组2获得正常膳食6周。组3获得MCD膳食4周，并且组4-8获得MCD膳食6周。在第4周，治疗组(组4-8)基于胆红素、体重和ALT水平随机分配。通过每周二次静脉内注射(第4周、第4.5周、第5周和第5.5周)，组4-8接受PBS治疗或治疗性疗法。
在第4周，组1和组3终止。在第6周，组2和组4-8终止。实施肝功能测试(LFT)(ALT、AST、ALP、白蛋白、总胆红和肝甘油三酯(TG))以及肝的组织病理学(H&E染色、油红O染色和Masson三色)。测量血清细胞因子/标志物(IL1β、IL6和TNF-α)和α2巨球蛋白。
下文总结研究组和治疗描述：
Figure BDA0003506633680001261
Figure BDA0003506633680001271
图27A-27B显示体重和饲料消耗量变化。如预期，MCD膳食治疗显示在整个研究期间体重和饲料消耗量显著降低。与MCD膳食对照相比，治疗组(G5-G8)显示体重和采食量无显著变化。因此，MTL-CEBPA治疗未改变体重和饲料消耗量。图27C-27G显示LFT结果，包括ALT、AST、ALP、胆红素和白蛋白水平变化。与正常膳食对照相比时，饲以MCD膳食的动物显示LFT参数如ALT、AST、胆红素明显增加及蛋白质水平减少。MTL-CEBPA治疗显示ALT水平和AST水平显著降低。还观察到ALP及胆红素随MTL-CEBPA治疗降低。图27H显示肝甘油三酯(TG)水平变化。MCD膳食对照组中肝TG显著地增加。MTL-CEBPA治疗显示肝TG水平显著降低，逆转肝TG至正常水平。
因此，CEBPA-saRNA治疗可以用来治疗NASH。
实施例15.采用CEBPA-saRNA其他体内研究--在DEN所致HCC的大鼠模型中评价 MTL-CEBPA功效
这项研究的目的是研究通过MTL-CEBPA治疗而激活CEBPA是否将改善大鼠HCC模型中的临床参数。
实验设计：用DEN处理雄性Wistar大鼠以诱导HCC。简而言之，将动物用DEN处理9周，随后不做处理3周。随后根据体重，将动物随机分配至三个组(6至7只雄性/组)。在第1日处死组1动物以充当治疗前对照，并且将组2和组3动物用配制在NOV340(siFLUC)或MTL-CEBPA中的非靶向性dsRNA按剂量4mg/kg静脉内处理3次(第1、第3、第和第5日)。在第12日，抽取血液并处死全部动物。测量肿瘤重量和肝重量并且将肝组织切片立即快速冷冻供mRNA分析。通过qRT-PCR(持家基因：GAPDH；测量一式三份)测定CEBPA mRNA水平和白蛋白mRNA水平
结果：如图28中所示，与NOV340/siFLUC(非靶向性脂质体对照，溶媒对照)相比，经MTL-CEBPA治疗的动物显示肝脏中CEBPA mRNA表达明显增加。观察到白蛋白mRNA表达增加的趋势，这种增加无统计显著性。
如图29A-29I中所示，与NOV340/siFLUC对照相比，经MTL-CEBPA治疗的大鼠显示血清氨显著降低(p<0.05)以及趋向于统计显著的体重(bw)、肿瘤体积、胆固醇和血红蛋白的变化(bw：p＝0.063；肿瘤体积：p＝0.10；胆固醇：p＝0.08；血红蛋白：p＝0.05)。与治疗前对照相比，经MTL-CEBPA治疗的大鼠显示AST、ALT和胆红素显著降低(p<0.05)。
结论：在DEN所致大鼠HCC模型中，与NOV340/siFLUC对照相比，MTL-CEBPA治疗导致靶参与(target engagement)(肝脏中CEBPA mRNA上调)和几种疾病标志物(包括血红蛋白、氨和胆固醇)改善。虽然由于动物数少而统计不显著，但经MTL-CEBPA治疗的组显示出肿瘤生长得到抑制的趋势，肿瘤平均大小比NOV340/siFLUC对照小大约80％。如相比治疗前病情对照时所见，MTL-CEBPA不仅使疾病症状稳定，还逆转某些肝毒性血清标记，包括AST、ALT和胆红素，与CCL4纤维化模型中所见的这些标志物方面的益处一致。总之，这些结果表明，MTL-CEBPA可以在广泛使用的DEN所致肝纤维化和HCC的大鼠模型中改善肝功能并减少肿瘤生长。
实施例16.研究CEBPA-saRNA与Ago蛋白的相互作用
将HepG2细胞用生物素酰化的反义链(AS)和有义链(ss)-CEBPA51转染并且与未转染的或乱序生物素对照比较。在收获时点(72小时)，将生物素酰化的缀合物用1％甲醛交联，随后固定在链霉亲和素琼脂糖珠上。随后用抗Ago1、抗Ago2、抗Ago3和抗Ago4进行免疫共沉淀法(Co-IP)。使用同种型IgG作为阴性对照。免疫共沉淀的缀合物随后用Dynabead-蛋白质-G固定。洗涤拉下的免疫复合物并在磁柱上洗脱。随后将样品在SDS-PAGE上分离并转移到PVDF上供使用相应Argonaute抗体的蛋白质印迹。
如图30A中所示，与SS-生物素链相比，Ago2强烈地出现在AS-生物素链上。Ago1、3和4似乎不存在于任一链上。这提示，CEBPA-saRNA的反义链与Ago2结合并且不与其他Argonaute结合。
在又一项研究中，敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞中的Ago2。将野生型和Ago2敲除细胞按每孔9.8x105接种在24孔平板中。将20nM CEBPA51和Fluc如先前描述转染(正向+反向)。在48小时时间点收获RNA以确定saRNA的活性。如图30B中所示，CEBPA转录物水平在CEBPA51转染野生型细胞中相对于Fluc增加2倍。图30C显示p21转录物水平在CEBPA51转染野生型细胞中相对于Fluc增加4倍。然而，在Ago2敲除细胞中未测量到CEBPA或p21诱导作用。这证明通过saRNA激活基因需要Ago2。
实施例17.CEBPA-saRNA的配制
将CEBPA-51saRNA包封入脂质体。使用的递送技术是Marina Biotech拥有的NOV340
Figure BDA0003506633680001293
技术。这些纳米粒子的脂质组分由1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆甾烯基-半琥珀酸酯(CHEMS)和4-(2-氨基乙基)-吗啉代-胆固醇半琥珀酸酯(MOCHOL)组成。NOV340由POPC、DOPE、CHEMS和MOCHOL以摩尔比6:24:23:47组成。这些纳米粒子在生理pH为阴离子，并且它们的具体脂质比率赋予“pH可调节”特征并且向脂质体赋予其变化取决于周围pH微环境的电荷，以促进跨生理膜运动。确定
Figure BDA0003506633680001294
纳米粒子的大小以避免广泛的即刻肝阻隔作用，其中平均直径大致为约50–约150nm或约100–约120nm，这促进静脉内注射后更为延长的全身性分布并改善血清稳定性，从而导致报告更宽的组织分布连同肝、脾和骨髓中的高水平。
CEBPA-51的序列，有义和反义：
Figure BDA0003506633680001291
双链体：
Figure BDA0003506633680001292
通过依次偶联磷酰亚胺单体，在固相支持物上合成CEBPA-51的每条链。在自动合成仪如Akta Oligopilot 100(GE Healthcare)和Technikrom合成仪(Asahi Kasei Bio)进行合成，所述的合成仪递送规定体积的试剂和溶剂至并且离开装填有固相支持物的合成反应器(柱型)。该过程始于充填试剂至与反应器连接的指定储器并用适宜的固相支持物装填反应器容器。试剂和溶剂的流动受计算机控制的一系列阀门和泵调节，自动记录流量和压力。固相方案能够在合成中的每个步骤，通过用溶剂洗涤固相支持物，实现作为与固相偶联的反应产物与溶液相中的试剂高效分离。
CEBPA-51合成的总体概述如下：
Figure BDA0003506633680001301
CEBPA-51合成的详细流程图如下：
Figure BDA0003506633680001311
Figure BDA0003506633680001321
通过大小排阻色谱(SE-HPLC)测定溶液中存在的CEBPA-51的总体尺寸和纯度，主要旨在区分双链和单链形式。CEBPA-51双链的熔点是序列特异性的，其计算为在双链体的热诱导‘解链’(去杂交化)期间产生的UV(在260nm)对T[℃)曲线中的拐点。确定这个Tm值为81.3℃，与260nm处增加的吸收相关(增色效应)。基于≥90％含量的寡核苷酸为钠盐，已经在260nm和25℃在PBS中测定消光系数。在制造过程期间通过LC-MS确定了两种单链的分子质量。对于放行检验，将双链体分离成单链并且通过MS分析每个峰，所述MS通过IPRP-HPLC与ESI-MS组合来进行。
杂质
产物相关杂质：
潜在的产物相关杂质是多聚体、聚集物以及延长或截短/降解的形式。通过SE-HPLC控制这些杂质。
另外和作为不完全或无效合成的结果，可能出现因缺少例如n-1或n-2个核苷酸而不同的聚合性副产物(其中对于有义链和反义链的完整链长度，“n＝21”，即20聚物或19聚物，而非21聚物)。另外，可能出现序列延长1或2个核苷酸，产生n+1或n+2寡核苷酸(22聚物或23聚物)。然而，后者的概率较低。这些变体不能通过SE-HPLC鉴定，这归因于分辨率有限，但可以通过IPRP-HPLC确定。
另外，还可能出现核糖核苷酸的错误掺入或修饰，也导致产物相关杂质。后者通过离子对反相高压色谱(IPRP-HPLC)MS或MS/MS-测序检出。
工艺相关杂质
潜在的工艺相关杂质包括来自化学合成的残余试剂、反应物和溶剂。基于给出的固相上RNA合成法和生产工艺中使用的试剂，可以预期以下工艺相关杂质(表14)：
表14 CEBPA-51生产中的工艺相关杂质
Figure BDA0003506633680001331
*n.d.＝“未检出”(低于LoQ)
制剂
将需要量的CEBPA-51在环境温度溶解于乙酸钠/蔗糖缓冲液pH 4.0中，并且将需要量的脂质在55℃溶解于无水乙醇中。通过错流乙醇注射技术制备脂质体。在脂质体形成后旋即用氯化钠/磷酸盐缓冲液pH 9.0在线稀释悬液。将收集的中间产物经孔径0.2μm的聚碳酸酯膜挤出。通过超滤实现saRNA目标浓度。通过用蔗糖/磷酸盐缓冲液pH 7.5后续渗滤，移除未包封的原料药和残余乙醇。此后，将浓缩的脂质体悬液进行0.2μm过滤并储存在5±3℃。最后，配制散装产品，进行0.2μm过滤并灌装在20ml小瓶中。
将MTL-CEBPA作为输注用浓缩液提供。每个小瓶含有在20ml蔗糖/磷酸盐缓冲液(pH约7.5)中的50mg CEBPA-51(saRNA)。
下表15中提供MTL-CEBPA的组成。
表15 MTL-CEBPA(2.5mg/ml)的定性和定量组成
Figure BDA0003506633680001332
Figure BDA0003506633680001341
MTL-CEBPA按悬液形式供应并且将包装在带瓶塞的20mL玻璃小瓶中。为了确保可以通过注射器从初级容器抽出20ml，过量灌装20.6m(等同于21.4g)。不存在生产性过量加入。配制为：
量/mL 量/小瓶
MTL-CEBPA 2.5 mg 50mg
赋形剂
MTL-CEBPA中的赋形剂可以划分成两个组：形成脂质体的脂质赋形剂(MarinaBiotech拥有的
Figure BDA0003506633680001343
技术)和形成缓冲液的赋形剂蔗糖和磷酸盐(还参见表15)。脂质体的开发及其组成由Andreakos E.等人,Arthritis Rheum,vol.60(4):994-1005(2009)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。使用的蔗糖-磷酸盐缓冲液(pH 7.5)已知与赋形剂和原料药具有良好相容性。
如下表16中所示，形成脂质体的赋形剂由1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆甾烯基-半琥珀酸酯(CHEMS)和4-(2-氨基乙基)吗啉代-胆固醇半琥珀酸酯(MOCHOL)按摩尔比6:24:23:47组成。
表16 NOV340的脂质组分
Figure BDA0003506633680001342
图31中显示MTL-CEBPA生产工艺的概述。下表17是详细工艺。
表17 MTL-CEBPA生产流程图(步骤1-9)
Figure BDA0003506633680001351
通过首先在乙醇中溶解脂质并在pH 4.0的乙酸钠/蔗糖缓冲液中单独溶解CEBPA-51(步骤1a和步骤1b)，制备MTL-CEBPA。
两个溶液随后通过注射工艺合并以形成初级小泡，此后通过添加pH调整缓冲液(氯化钠/磷酸盐缓冲液pH 9.0)快速降低乙醇浓度并且快速增加pH(步骤2)。
随后通过聚碳酸酯膜挤出中间体脂质体混合物，以降低大粒子和聚集物的尺寸(步骤3)。
随后通过超滤浓缩散装混合物，并且针对至少7个体积的蔗糖/磷酸盐缓冲液pH7.5交换缓冲液，以降低乙醇和盐的浓度(步骤4)。随后使这种散装产品穿过0.2μm滤器以降低生物负荷(步骤5)。调节产品至最终目标浓度并且通过0.2μm无菌过滤除菌(步骤6)。随后，将散装产品灌装入无菌小瓶(步骤7)。检验灌装的小瓶以最终放行(步骤8)。以下的相应图中描述了现行的在制工艺控制。根据本文件中确定的质量标准对药品执行药品的最终放行。
在该过程(包括最终灌瓶和放行)完成后，整个DP小瓶储存在或低于-20℃(步骤9)。
在脂质体形成时的脂质对药物比率对脂质体内部RNA包封效率具有主导重要性，原因是溶解于pH 4.0缓冲液中的CEBPA-51与这个环境下带正电荷的MOCHOL相互作用。为了优化包封产率，EtOH溶液中的脂质浓度保持恒定并且改变该溶液中的CEBPA-51浓度，范围从1.06直至3.44mg/ml。获得结果明确地显示这样的一个趋势，该趋势表明通过降低溶液中的CEBPA-51浓度使包封效率轻微增加。
容器密封系统
选择用于MTL-CEBPA的容器封口系统是具有20mm封闭的标准20ml血清小瓶配置。玻璃小瓶由透明USP I型硼硅酸盐玻璃制成，这提供良好产品保护同时潜在溶出最小。这种类型的玻璃还具有良好的热稳定性，这对贮藏冷冻的产品至关重要。瓶塞由标准氯丁橡胶化合物制成，并且接触产品的表面用氟聚合物涂布，这最大限度减少了潜在产物吸附。最后，铝质钳口盖向小瓶提供牢固的瓶塞密封并保护橡胶隔膜的外界面在使用前免遭潜在污染。
微生物属性
将MTL-CEBPA作为无菌、一次性使用小瓶提供。不添加抑制微生物生长的防腐剂。带橡胶瓶塞和铝质钳口盖的标准玻璃血清小瓶提供了经明确证明的防止微生物污染的屏障。
通过0.2μm滤器过滤降低MTL-CEBPA的生物负荷。紧邻灌装入无菌小瓶之前，通过流经灭菌级0.2μm滤器，对产品除菌(步骤6，DP)。提供无菌“即用型”的全部包装组件。在ISO5级环境中无菌条件下操作它们，无额外处理。
将MTL-CEBPA冷冻储存在-20℃±5℃并遮光。运送/运输在装填有干冰的冷藏箱中进行。当储存在-20℃时MTL-CEBPA稳定至6个月，显示无轻微下降或变化趋势(在分析变异性范围内)。因为认定冷冻条件下物料的质量不太可能快速下降，所以认为储存在-20℃的物料的保质期为12个月。
MTL-CEBPA通过静脉内输注施用(250mL)。MTL-CEBPA以2.5mg/mLsaRNA的浓度在室温解冻，之后稀释悬液于0.9％静脉用生理盐水中，以获得250mL体积，无论浓度为多大。
通过手动颠倒输液袋(以避免起泡)，将供试品和稀释剂混合在一起。
使用输注泵，将MTL-CEBPA按恒定速率经60分钟施用入静脉(外周或中央静脉)。
已配制溶液的储存：室温(15至25℃)，最长预期在用保质期为至少6小时。
表18-1和表18-2中显示CEBPA-51saRNA和MTL-CEBPA的特性：总体上，MTL-CEBPA为乳白色悬液。通过荧光检测法测量的saRNA包封率≥75％。通过动态光散射法测量的粒度在约50nm至约150nm或约100至约140nm之间。通过动态光散射法测量的多分散性指数是≤0.200。通过动态光散射法测量的ζ电位在pH 7.2–7.8是≤-30.0mV。通过电位分析法测量的pH值在约7.2至约7.8之间。通过凝点降低法测量的重量摩尔渗透压浓度在约280至约400mOsmol/kg之间。通过RP-HPLC测量的saRNA杂质是≤15％。
saRNA包封：通过测量来自RiboGreen和saRNA复合作用测量的荧光强度，对总saRNA含量和“外部”游离saRNA含量定量以确定％包封。在两个不同条件下分析药品的样品溶液：未处理的样品用于外部saRNA，Triton X-100处理的样品用于总saRNA。使用从浓度已知的标准品产生的校准曲线测定RNA含量。
计算包封的saRNA的含量百分数：
Figure BDA0003506633680001371
E(％)％ 包封的saRNA
CT saRNA总含量
CF 游离(外部)saRNA含量
粒度和多分散性指数：使用Zetasizer Nano ZS仪(Malvern)，通过光子相关性光谱法(PCS)测定脂质体和PDI的尺寸。
ζ电位：使用Zetasizer Nano ZS仪(Malvern)，通过激光多普勒速度/激光多普勒测速技术(LDV/LDA)测定表面电位。
pH：使用玻璃电极在20–25℃测量脂质体药品的pH。
重量摩尔渗透压浓度：使用Osmomat 030(Gonotec)，基于与纯水相比凝点降低的原理测定重量摩尔渗透压浓度。
残余乙醇：使用火焰离子化检测器(GC/FID)，通过顶空气相色谱法定量脂质体姜黄素药品中的残余乙醇。
杂质saRNA：使用Waters XBridge C18柱(4.6x100mm,3.5μm粒度)通过离子对反相(IPRP)HPLC，定量saRNA杂质的含量(面积％)。将纳米粒子用2％Triton X-100缓冲液破碎并且使用水中100mM六氟异丙醇(HFIP)/7mM三乙胺(TEA)和100甲醇％的梯度，在HPLC柱分离释放的saRNA。在260nm检测RNA。通过从总峰面积(100％面积)扣减主要链(反义链、有义链)的峰面积(％)，确定杂质含量(面积％)。
表18-1 CEBPA-51的特性
Figure BDA0003506633680001381
Figure BDA0003506633680001391
表18-2 MTL-CEBPA的特性
Figure BDA0003506633680001392
实施例18.人原代PBMC中CEBPA-51的免疫安全性研究
研究目的：这项研究的目标是评估CEBPA-51的免疫安全性，通过离体激活人血细胞中的TLR通路所测量。
实验设计：用分离自两名人供体(huPBMC)的外周血单核细胞检验CEBPA-51对细胞因子的诱导。
TNF-α：使用Dotap作为转染试剂，用133nM CEBPA-51或对照序列RD-01010(阳性对照)和RD-01011(阴性对照)一式三份转染huPBMC。单独使用转染试剂作为模拟对照。此外，以500nM浓度直接添加对照ODN2216(CpG-寡核苷酸)和RD-01002(胆固醇缀合的siRNA)而无转染。在20小时温育后，汇集来自三次重复转染的上清液，并且使用商业人TNF-αELISA测定法，测量分泌的TNF-α(一式两份测量样品)。
IFN-α：使用Geneporter-2作为转染试剂，用133nM CEBPA-51或对照序列RD-01010(阳性对照)和RD-01011(阴性对照)一式三份转染HuPBMC。单独使用转染试剂作为模拟对照。此外，以500nM浓度直接添加对照ODN2216(CpG-寡核苷酸)和RD-01002(胆固醇缀合的siRNA)而无转染。在20小时温育后，汇集来自三次重复转染的上清液并且使用商业人TNF-αELISA测定法，测量分泌的IFN-α(一式两份测量样品)。
结果：用CEBPA-51或对照寡聚物转染后测量人PBMC分泌的细胞因子TNF-α和IFN-α。在温育20小时后CEBPA-51没有激发任一种细胞因子明显分泌入细胞培养基，而阳性对照触发预期的细胞因子释放(参见32A和图32B)。
结论：CEBPA-51未触发人PBMC中的TLR-8或TLR7/9通路激活，如CEBPA-51转染后缺少细胞因子TNF-α和IFN-α释放所示。这些结果表明，化学修饰的saRNA没有免疫刺激活性。
实施例19.I期研究和安全起始剂量的选择
拟议的人类首次临床试验
FIH研究将是一项采用RNA寡核苷酸MTL-CEBPA研究其在晚期肝癌患者中安全性和耐受性的多中心、开放标签的I期临床研究。
适应症
治疗患有特征如下的组织学晚期癌症的患者：肝细胞癌或呈现从肝外原发癌类型衍生的继发性肝肿瘤的晚期癌症，其中认为所述患者不适合任何疗法或手术或在局部区域治疗和索拉非尼后恶化。
研究目的
主要目的：
确定对于患有特征如下的组织学晚期癌症的参与者每周施用MTL-CEBPA持续3周的安全性和耐受性：肝细胞癌或呈现从肝外原发癌类型衍生的继发性肝肿瘤的晚期癌症。
次要目的：
确定MTL-CEBPA的II期试验推荐剂量(RP2D)；表征MTL-CEBPA的药代动力学(PK)参数；评估MTL-CEBPA的药效动力学(PD)过程，特别是表征MTL-CEBPA对血清白蛋白和胆红素的影响；评估施用MTL-CEBPA后HCC患者中健康相关生活质量的变化。
生物标记物
生物标记物策略
预测性生物标记物
纳入/排除生物标记物
迄今，尚未鉴定到MTL-CEBPA的预测性生物标记物或基因特征标识。因此，用于该研究的患者合规标准不包括这类生物标记物。
探索性预测性生物标记物
CEBPA-51和工具化合物的临床前数据和科学文献提示了HCC对CEBPA saRNA应答的多个生物标记物假设。例如，响应于CEBPA saRNA的肿瘤细胞生长停滞可能取决于基础水平的CEBPA表达。使C/EBP-α蛋白失活的某些调节机制可以导致针对CEBPA saRNA的抗性，这包括例如因PI3K-AKT途径激活致使Ser193去磷酸化或过量表达显性阴性形式的C/EBP-β。
本研究不包括肿瘤反应的前瞻性探索性生物标记物。然而，可以基于归档的活检样品实施肿瘤敏感性/抗性的生物标记物的回顾性分析。
迄今尚未针对肝纤维化或硬化对MTL-CEBPA的应答性形成最后的生物标记物假设，不过已知某些内分泌环调节CEBPA活性，例如，借助胰岛素和TNF-α。目前尚未构想出预测性生物标记物的前瞻性分析；然而，可以对归档的组织实施回顾性分析。
生物标记物反应
靶参与作用
CEBPA-51saRNA的分子靶是CEBPA启动子。可以通过CEBPA mRNA的qRT-PCR或通过C/EBP-α蛋白的免疫染色测量在组织样品中CEBPA转录的上调。
将寻求几种探索性方案以测量CEBPA表达的变化并建立验证机制(proof-of-mechanism)。在扩充阶段期间，将在治疗前/后收集循环肿瘤细胞(CTC)，供C/EBP-α蛋白水平的免疫染色。如果我们从任何匹配的治疗前/后活检样品获得足够的组织，我们将旨在通过临床前模型中所用的qRT-PCR方法以及通过免疫染色在C/EBP-α蛋白水平审视CEBPAmRNA水平。迄今尚未验证代用组织如WBC的用途，但是将探索其作为证明一旦确立MTD就可以引入的靶参与作用的另一种潜在选项。
PD生物标记物
PD生物标记物包括肝特异性基因及其处于C/EBP-α直接转录性控制下的相应蛋白质产物(近端生物标记物)以及作为C/EBP-α-依赖性分化或增殖程序之标志的下游基因靶和蛋白质(远端生物标记物)。C/EBP-α的几种近端生物标记物是可以血清中监测的分泌型蛋白，例如包括白蛋白、AFP、转铁蛋白和凝血因子。
选择血清白蛋白作为主要的肝特异性PD生物标记物，原因在于采样容易和可获得经验证的临床测定法。作为额外的探索性PD生物标记物，研究了其他基于血清的生物标记物。
取决于治疗前/后肿瘤活检样品的可获得性，将通过IHC评估肿瘤切片中细胞周期调节蛋白p21的变化，作为肿瘤细胞生长停滞的标志物。
代用品功效的生物标记物
血清白蛋白水平和总胆红素水平是这项研究中的次要终点。白蛋白和胆红素是经验证的肝功能总体状态的生物标记物。此外，已经证实白蛋白水平和胆红素血清水平(ALBI等级)的联合测量与晚期HCC和肝脏疾病患者的生存相关。在肝脏疾病的临床前模型中已经证实血清白蛋白和胆红素均响应于MTL-CEBPA治疗，与对照组和胆红素水平的近似归一化相比白蛋白得到改善。
在扩充阶段期间将收集CTC和循环性DNA作为肿瘤反应的探索性生物标记物。血清甲胎蛋白(AFP)是经验证的HCC负荷标志物。然而，正常肝中AFP基因也处于C/EBP-α控制下，预期MTL-CEBPA治疗增加AFP血清水平。因为肝和肿瘤中这种相反的反应，所以将需要谨慎解读AFP水平。
功效生物标记物
肝功能状态将依据包括白蛋白、总蛋白、胆红素、ALP、GGT、ALT、AST和氨水平的血清化学评定。肿瘤对MTL-CEBPA治疗的反应将通过CT或MRI监测，并使用标准规范(RECIST)评估。
药物PK和生物分布
MTL-CEBPA的ADME监测将限于血浆中总API水平的测定。因为游离dsRNA的代谢及清除迅速，所以总API水平将主要代表包封的CEBPA-51。将不单独监测纳米粒子和其脂质组分。假定循环中完整纳米粒子的水平与总API水平成正比。将不测量CEBPA-51的组织生物分布和代谢物。
生物标记物测定法
全部血清生物标记物将由本地认证的实验室评定。将通过验证的免疫组织化学(IHC)测定法测量活检样品中的基因表达。
开发了一项程序特异性PK测定法以测量参与者血浆中的总API。该测定法基于使CEBPA-51热变性以分离两条RNA链，随后反义链与固定的互补PNA探针杂交。从而，该测定法测量反义链(和能够与PNA探针杂交的任何其代谢物)的浓度，而非RNA双链体本身。该测定法由德国Axolabs GmbH针对非临床和临床用途开发并验证。
研究结局(outcome)指标
初级结局指标
将采集生命体征(包括血压、脉搏、体温、呼吸频率)、ECG(12导联)的连续量值和实验室安全性数据(包括血液学、凝集、临床化学、补体因子B和补体组分3a(C3a)的凝血和激活片段(Bb))以及参与者和研究者评估耐受性的描述。
首次MTL-CEBPA输注后记录的全部不良事件将就严重度、预期性和与研究药物关系评定为‘不相关’、'可能'、'潜在'或'确定'。
将从根据毒性标准(NCI CTCAE v4.03)分级并依据身体系统和诊断分类的不良事件的频率方面，评价MTL-CEBPA的安全性和耐受性。
次要结局指标
将在限定的时间点使用基于杂交的HPLC测定法分析MTL-CEBPA的血浆浓度，旨在确定静脉内施用后血浆中MTL-CEBPA的药代动力学(PK)特性。
这份研究方案计划采集代用PD生物标记物的量值，包含白蛋白、胆红素、肝酶水平、趋化因子和肿瘤标记物。肿瘤组织中基因和蛋白质的表达水平也支持了静脉内施用后肝肿瘤参与者中MTL-CEBPA的药效动力学特征的测定结果。
将在第1日、第15日、第8周和在第1b部分EOS时使用自我执行的FACT-Hep问卷调查，采集健康相关的生活质量问卷调查数据。
研究设计
这项研究是一项按两个部分：剂量递增随后剂量扩大进行的多中心、开放标签的首次人体内I期临床研究。
第1a部分-剂量递增
本研究的剂量递增部分遵循标准的3+3设计。剂量在约20至约160mg/m2之间。符合合规标准的晚期HCC参与者或继发性肝肿瘤参与者将按剂量28、47、70、98、130、160mg/m2被招募入各自含3名参与者的6个队列，直至已经如上文定义观察到出现药物相关的3级毒性(NCI-CTCAE版本4.03)或血清白蛋白最大改善。上文描述了剂量递增程序。剂量和时间安排可能根据所述研究的数据而调整。
在第一给药队列中，第一位参与者按研究起始剂量接受MTL-CEBPA治疗。通过静脉内输注经60分钟施用MTL-CEBPA，一周一次持续3周，随后是1周休息期；这确定了一个4周周期。MTL-CEBPA起始剂量的确定基于啮齿类和食蟹猴中的GLP毒性研究。基于这些数据，认定MTL-CEBPA起始剂量28mg/m2是人类中安全的起始剂量。
将向本研究第1a部分中获得临床获益的参与者提供进一步的周期。参与者还可以基于体恤继续接受MTL-CEBPA；在参与者可以继续接受治疗之前研究者必须与申办方逐案讨论。
可以在完成第1a部分后和在启动第1b部分之前增加一个仅三位HCC参与者的附加队列，以确认这组患者中的RP2D。只有由PI和申办方的安全性委员会在评审临床数据和再招募HCC参与者进入本研究第1a部分后认定为适宜时，才会考虑该队列。
RP2D将由安全性评审委员(SRC)确定为最适宜剂量，以令本研究的剂量扩大部分中参与者群体的有利风险/获益回报最大化。
第1b部分–剂量扩大
一旦获得RP2D，将随后招募一个含12–15个晚期HCC的合格参与者的附加组。每位参与者将入选用于2个周期并按RP2D施用MTL-CEBPA直至参与者退出本研究。
将向本研究第1b部分中获得临床获益的参与者提供其他周期。参与者还可以基于体恤继续接受MTL-CEBPA。在参与者可以继续接受治疗之前，研究者必须与申办方逐案讨论这点。
研究终点
主要终点
在第1a部分中，主要终点将是剂量限制毒性(DLT)，其定义为：根据不良事件通用术语标准(CTCAE)v4.03，等级大于或等于3的任何药物相关毒性，包括：尽管充分治疗超过3天，≥3级恶心、呕吐和腹泻；与基线相比参与者体能状态下降≥2点；≥3级疲乏超过7天；≥3级血红蛋白、血小板或中性粒细胞实验室值异常、骨髓抑制超过5天；≥3级胆红素实验室值异常(>3.0xULN)；4级AST和/或AST异常实验室值(>20.0xULN)。
将在前28天期间(即第一周期)评价任何潜在的DLT。队列中的全部患者均应当在可以进行任何剂量递增之前清除DLT阶段；为此目的，强制在本研究第1a部分期间第三剂施用至先前队列中最后参与者后的间隔不少于7天以评估可能的治疗相关副作用。
在第1b部分中，将从根据毒性标准(NCI CTCAE v4.03)分级并依据身体系统和诊断分类的不良事件的频率方面，评价MTL-CEBPA的安全性和耐受性。
次要终点
PK参数将由静脉内施用后MTL-CEBPA的最大血浆浓度(Cmax)、至最大血浆浓度的时间(Tmax)、血浆浓度曲线下面积(AUC)和半寿期(t1/2)限定。
这份研究方案计划使用从代用生物标记物基线的变化的描述性分析，评价MTL-CEBPA在晚期HCC参与者其中或表现出继发性肝肿瘤的参与者中的临床疗效(PD)，所述的代用生物标记物包括白蛋白、胆红素、肝酶水平、趋化因子、CTC、肿瘤标记物以及肿瘤组织中基因和蛋白质表达水平。将使用从FACT-Hep评分的基线的变化的描述性分析，在晚期HCC参与者中评估健康相关的生活质量。
入选和退出研究
在筛查阶段期间，在参与者已经签署ICF后，将评估以下标准；每位参与者应当符合这项研究的全部纳入标准并且不符合所有排除标准。在任何情况下，不可以存在此原则的例外，并且如认定不适宜且不符合GCP，申办方将不批准弃权声明。
参与者将会随后以参与者唯一试验ID按其招募顺序分配(例如，001、002等)
入选标准
参与者应当符合全部以下纳入标准以具有参与本研究的资格。
剂量递增(第1a部分)的入选标准
本研究的剂量递增部分将集中于招募患有晚期HCC或患有继发性肝肿瘤的患者。招募充将取决于观察到的毒性。然而，研究方案旨在第1a部分招募最多30位参与者。
晚期HCC患者的入选标准：经组织学证实的晚期HCC；认定不符合手术或任何其他治疗资格、在局部区域疗法和/或索拉非尼后恶化(从未用过索拉非尼的患者有资格)的患者；至少一个可度量病灶，且MRI或CT所测量的目标病灶大小≥1.0cm；Child-Pugh A或B7类疾病；血小板≥75x109/L；血清白蛋白>28g/L且<35g/L；ALT和AST≤5xULN。
继发性肝癌患者的纳入标准：经组织学证实的晚期肝外实体瘤和耐受既往标准疗法的不可治愈性肝肿瘤，或对该患者而言不存在标准疗法；位于肝脏内的至少一个可度量病灶，经MRI或CT测量目标病灶大小≥1.0cm；血小板≥100x109/L；血清白蛋白>25g/L；ALT和AST≤3xULN。
其他纳入标准：在任何试验专用程序之前获得书面知情同意书；男性或女性年龄≥16岁；ECOG体能状态0和1；可获得的可存档肿瘤组织或进行治疗前肿瘤活组织检查的能力和意愿；实验室参数可接受，如下所证明：胆红素≤50μmol/L、WBC≥2.0x109/L、中性粒细胞绝对计数≥1.5x109/L、血红蛋白≥9.0g/dL或凝血酶原时间(PT)<20秒；肾功能可接受，如下证明：血清肌酐≤1.5xULN或计算的肌酐清除率≥60mL/分钟/1.73m2(使用CKD-EPI公式估计)；育龄女性的血妊娠试验阴性；整个研究期间育龄女性中安全避孕、在筛查开始之前使用确立的激素处理避孕措施至少2个月：对于育龄女性(在筛查开始之前至少2个月未使用激素避孕措施)，在整个研究期间要求符合有效生殖控制方法之标准的双重避孕方法，即必须使用至少两种有效生殖控制方法如避孕套、阴道隔膜或宫内节育器；在试验期间和末剂后3月除让其配偶使用另一种方法避孕之外，要求男性参与者偕同育龄配偶使用屏障式避孕。还将建议男性参与者禁绝与怀孕或授乳女性性交或使用避孕套；有能力和意愿遵守全部研究方案要求包括计划访视、治疗计划、实验室检验和其他研究程序。
剂量扩大(第1b部分)的纳入标准
这个研究方案旨在招募12至15位晚期HCC参与者：
经组织学证实的晚期HCC；认定不符合手术或任何其他治疗资格、在局部区域疗法和/或索拉非尼后恶化(从未用过索拉非尼的患者有资格)的患者；至少一个可度量病灶，通过MRI或CT测量目标病灶大小≥1.0cm；Child-Pugh A或B7类疾病；血小板≥75x109/L；肝功能障碍伴血清白蛋白>28g/L且<35g/L；ALT和AST≤5倍正常范围上限；胆红素≤50μmol/L；在任何试验专用程序之前获得书面知情同意书；男性或女性年龄≥16岁；ECOG体能状态0和1；可获得的可存档肿瘤组织或进行治疗前肿瘤活组织检查的能力和意愿；实验室参数可接受，如下所证明：WBC≥2.0x109/L、中性粒细胞绝对计数≥1.5x109/L、血红蛋白≥9.0g/dL或凝血酶原时间(PT)<20秒；肾功能可接受，如以下证明：血清肌酐≤1.5xULN，计算的肌酐清除率≥60mL/分钟/1.73m2(CKD-EPI公式)，或育龄女性的血妊娠试验阴性；整个研究期间育龄女性中安全避孕、在筛查开始之前使用确立的激素处理避孕措施至少2个月：对于育龄女性(在筛查开始之前至少2个月未使用激素避孕措施)，在整个研究期间要求符合有效生殖控制方法之标准的双重避孕方法，即必须使用至少两种有效生殖控制方法如避孕套、阴道隔膜或宫内节育器。在试验期间和末剂后3月除让其配偶使用另一种方法避孕之外，要求男性参与者偕同育龄配偶使用屏障式避孕。还将建议男性参与者禁绝与怀孕或授乳女性性交或使用避孕套；有能力和意愿遵守全部研究方案要求包括计划访视、治疗计划、实验室检验和其他研究程序。
参与者排除标准
如果满足以下排除标准的任一项，则患者不应当加入本研究。
晚期HCC患者的排除标准：Child-Pugh B8、B9或C类；
已经在最近28天内用TACE、索拉非尼或化疗治疗的患者
其他排除标准：在15天内既往全身性癌症定向治疗或在最近30天内研究用药物；筛选时1级治疗相关毒性(不包括脱发)；有临床意义的癌症腹水患者；最近3个月内来自食管血管曲张的任何出血事件或其他未控制的出血；在首次MTL-CEBPA注射之前最近7天内施用过血清白蛋白的患者；已知感染人类免疫缺陷病毒(HIV)；具有中枢神经系统(CNS)转移灶的患者；特征为大于纽约心脏学会(NYHA)I类的心力衰竭的体征和症状；使用Fridericia法修正公式时表现出定义为≥450ms(男性)和≥460ms(雌性)的延长的修正QT(QTc)间期患者；或其他有临床意义的心脏异常；在最近30天大手术；败血症、阻塞性黄疸或脑病患者；自发性细菌腹膜炎或肾衰竭或药物或赋形剂过敏反应的证据；妊娠或授乳妇女；根据研究者判断可以影响参与者遵循研究方案特有程序之能力的任何其他状况(例如，已知或疑似的依从性不良等)。
治疗分组程序
第1a部分-剂量递增
参与者将入选用于2个周期。研究的剂量递增阶段将遵循如图33中所示的标准的3+3设计。按以下剂量计划六个由3位合格参与者组成的队列：28、47、70、98、130、160mg/m2。个体剂量将基于使用DuBois&DuBois(133)体表面积(BSA)计算法时参与者的最新身高和体重。
在每个剂量，第一位参与者按研究起始剂量接受MTL-CEBPA治疗。将MTL-CEBPA一周一次在第1天、第8日和第15日通过静脉输注60分钟，施用3周，随后休息一周。这确定为一个周期。
后续的参与者将在第一位参与者首剂后不少于7天按顺序招募，以允许评估治疗相关的副作用。
将在前28天期间(即第一周期)评价如上文定义的任何潜在DLT。
在先前队列中最后一位参与者的末剂之间应当有一个不少于7天的间隔期，以允许不良事件或毒性变得显而易见。推进至下一个队列的决定将需要通过SRC评审全部参与者的先前队列安全性和临床数据。在评审后，可以启动下一个队列。该决定将书面记录，并且记录将留存在试验主文件(TMF)中。
如果给药队列的3位参与者中未出现定性为DLT的毒性，则剂量可以递增至下一个剂量水平。如果给药队列的3位参与者之一中出现DLT，则将按这个剂量入选另外3位参与者。如果这些附加的3参与者中未出现进一步的DLT，则可以递增至下一个剂量水平。然而，如果这6位参与者(3+3)中2位或更多位出现DLT，将不会存在进一步的剂量递增步骤并且该剂量水平将认定为最大耐受剂量(MTD)。另外，如果单个队列中2位参与者出现DLT，将不会存在进一步的剂量递增步骤并且该剂量水平将认定为MTD。全部剂量递增决定将基于SRC的判定。
可以在完成第1a部分后和在启动第1b部分之前增加一个仅三位HCC参与者的附加队列，并且可以与第1a部分相同给药方案，对该队列施用中间剂量的MTL-CEBPA。只有在PI和申办方的安全性委员会在评审临床数据和再招募HCC参与者进入本研究第1a部分后认定为适宜，才会考虑该队列。
RP2D将由SRC确定为最适宜剂量，以令本研究的剂量扩大部分中参与者群体的有利风险/获益回报最大化。图33是剂量递增的流程图。
第1b部分-剂量扩大
在完成研究的递增部分后，12-15位表现出晚期HCC的合格参与者将随后入选用于2个周期进入研究的剂量扩大部分，并且将按RP2D施用MTL-CEBPA。
退出的原因
参与者可以因以下原因退出研究：
患者决定：参与者可随时自由退出参与本研究，而无影响；如所述用预防性程序未控制的≥3级输注相关的研究用药过敏反应)；任何临床不良事件(AE)、实验结果异常、间发疾病或其他医学疾病或状况出现或恶化，从而继续参与研究将不符合参与者的最佳利益；确认病情进展，除非按照研究者的观点，参与者正在收到临床获益；如研究者所判定，严重不遵守本研究方案；参与者怀孕；参与者死亡。
研究特有的停用标准：存在获益，血清白蛋白增加≥45mg/L；如果停用研究药物符合参与者的最佳利益或如果参与者的反应积极并允许接受在研究伊始不适宜的另一个常规疗法(即分期迁移)如手术、RFA、TACE或索拉非尼，则研究者可以建议参与者停用研究药物。
研究终止
患者可随时自由退出本研究(IP和评估)，不影响其他治疗(撤回同意)。总是向这类参与者询问原因及任何AE的存在情况。如果可能，他们将由研究者接见并评定。将跟踪AE。
可以基于可公开获得的来源或联系参与者的医疗护理，在计划的研究结束时和在参与者已经撤回同意的情况下研究生存率。将在eCRF中采集这些数据。
为了防止参与者失访，他们的详细联系方式，包括直系亲属联系人，应当一开始就收集并且由研究机构工作人员或代表定期更新。
给药方案
MTL-CEBPA的施用将是一周一次持续3周，随后是1周休息期[3周加1周＝4周＝一个周期]。可以根据正在进行的临床前实验的结果或本研究的数据，探索其他方案和剂量
按以下剂量计划六个由3位合格参与者组成的队列：28、47、70、98、130、160mg/m2。
对于不存在其他已批准治疗选项供其所用的原发性或继发性肝肿瘤患者中从规划的FIH I期研究中的治疗获得临床上收益的那些患者，允许延长的治疗，即，只要临床获益续存，治疗就可以延续。
计算人起始剂量的考虑事项
MTL-CEBPA在两种肝脏疾病模型中有效。在CCL4模型中，一周两次(biweekly)低至0.3mg/kg的剂量显示减少或逆转一小组疾病症状。然而，要求最高剂量3mg/kg以最大限度影响某些认为疾病相关的生物标记物，包括血清白蛋白和肝羟脯氨酸。因此，对于2周一周两次方案，这个模型中的最大有效剂量或许是3mg/kg或更高。DEN模型中仅评价单一剂量水平(3剂4mg/kg)。因此不明确较低剂量将是否具有活性或更高剂量将是否进一步改善对肿瘤和其他疾病指标观察到的影响。因此估计单周治疗的有效剂量按4mg/kg。
基于MTL-CEBPA的大鼠PK数据，CCL4模型和DEN模型中的biw方案和tiw方案不应当导致药物在循环中蓄积，因此允许基于单次给药估计人剂量。总之并且考虑到DEN模型中治疗阶段非常短，3-4mg/kg重复给药可足以获得有意义的抗肿瘤功效并且剂量0.3至3mg/kg足以改善肝功能。
非临床毒性程序包括在大鼠和食蟹猴中的重复剂量毒性检验，包括毒代动力学剖析和局部耐受性评价。
通过静脉内途径向食蟹猴连续3天按7.5mg/kg每日给予(1小时输注)持续4周(总计12次施用)的MTL-CEBPA，这在临床上耐受良好并且仅诱导体重、食物消耗量、临床实验室参数的短暂非不良变化以及血小板计数和补体旁路途径与共同途径激活的下降。为期1个月研究的持续期间每周3次施用7.5mg/kg被定义为食蟹猴的NOAEL。通过静脉内途径连续3天按7.5mg/kg每日给予(1小时输注)持续4周(总计12次施用)施用至大鼠的MTL-CEBPA引起较低的体重增加和食物摄入量、在少数动物中引起临床体征、血液学参数、凝集参数和血清临床化学参数的各种变化以及输注部位处局部反应。因为其小幅度和可逆性，这些临床病理学变化未认定为不良。组织学上，主要观察结果是几种器官或组织中的巨噬细胞空泡化，这可能反映颗粒状供试品的清除并且这未认定为不良。为期1个月研究的持续期间每周3次施用7.5mg/kg被定义为大鼠中的HNSTD。
在治疗阶段结束时猴或大鼠中不存在MTL-CEBPA相关的眼科或心血管观察结果。
利用CEBPA-51转染的人原代外周血单核细胞(PBMC)进行一项体外免疫原性测定法。对TNF-α和IFN-α的评估显示无诱导作用并且因此在toll样受体(TLR)途径诱导方面无免疫刺激性活性。
如上，为期1个月研究的持续期间每周3次施用7.5mg/kg定义为大鼠中的HNSTD及猴中MTL-CEBPA的NOAEL。虽然从动物外推至人类的剂量传统上基于体表面积(BSA)相关的放大或相似的数学范式，但这些传统衍生自采用小分子抗癌剂进行的研究，并且对于由脂质体粒子或其他脂质粒子递送系统中RNA组成的产品(如MTL-CEBPA)的剂量外推很可能没有意义。基于BSA跨物种放大的原始动力源自这样的报道：从体重相关性MTD直接外推低估了人对细胞毒性抗癌药的敏感性，并且当剂量表述为每体表面积时，获得了跨物种MTD的更好相关性。较小物种如啮齿类相对于较大物种对小分子抗癌药的敏感性更低的主要原因是，较小的物种倾向于通过肝细胞色素P450系统比高等物种更快地代谢这类分子和/或显示出从血液区室更快清除，这总体上有助于比高等物种(包括人)中更迅速或更广泛地脱毒。
对于许多通过非临床开发推进的脂质配制的寡核苷酸，啮齿类中MTD倾向于类似或低于猴或其他非啮齿类物种中的MTD，MTL-CEBPA也是如此。这种模式与基于BSA的放大过程的基础性原理不一致，后者预测在啮齿类中相对于较大物种如猴具有更高的MTD。配制的寡核苷酸产品表现方式不同于小分子抗癌药物这并不意外，因为已经证实(或预计)核酸酬载和赋形剂均未与肝细胞色素P450系统显著地相互作用，并且制剂以颗粒形式通过血流，从而显示出不同于小分子药物的独特药代动力学和清除途径。
虽然在相似的剂量水平，大鼠中活性saRNA成分(CEBPA-51)的血浆AUC大幅度低于猴中，但是MTL-CEBPA产生的毒性与循环中药物的量不相关，因为这些毒性均不源自与血液组分相互作用，并且预期观察到的主要效应(即，各种组织中巨噬细胞的空泡化)与组织而非血药浓度相关。实际上，大鼠中MTL-CEBPA(CEBPA-51)从循环清除更快很可能反映更快速的巨噬细胞摄取，这可能导致这些细胞的活化更多和由这种活化产生的下游结果更明显，这解释了毒性的严重程度在大鼠中大于猴中。因此，虽然大鼠中相对于猴在相同的mg/kg剂量水平的血浆暴露量较低可能似乎与常规基于BSA的放大过程一致，但是这种差异当然与大鼠中较小的毒性程度无关，并且大鼠中颗粒从血液区室中清除更快实际上可能构成更大毒性的基础。换句话说，对于这种类型的药品，当比较跨物种暴露量时，较低AUC值反映的更快清除不应当解释为暗示敏感性较低(如细胞毒性抗癌药中所见)。
因此，基于BSA的放大不适用于从食蟹猴NOAEL和大鼠HNSTD计算人体等效剂量(HED)。还观察到，猴可能是MTL-CEBPA的人体敏感性的更好预测者，但此时尚不能证明这点。因此，为了尽力确定用于初始临床试验的实现足够安全余量的适宜起始剂量水平，尽管没有如此保守地下降而使药理活性和临床疗效逐渐受损，认为10倍低于大鼠中HNSTD7.5mg/kg/给药(每周给药三次，4周)和猴中NOAEL的剂量水平,即0.75mg/kg,是适宜选择。当考虑在4周的大鼠研究和猴研究中的HNSTD，与意在用于初始试验的每周一次给药相反，每周连续3天给予剂量时，这个拟定的起始剂量水平甚至更保守。因此得出结论，预期MTL-CEBPA安全和良好耐受，没有妨碍在作为每周一次60分钟静脉内(i.v)输注施用的预期初始剂量0.75mg/kg(28mg/m2)在人体中使用的异常或警告性毒性迹象。基于药理学，我们可能预期从0.3-3.0mg/kg看到肝功能获益并且在大约4mg/kg看到肿瘤获益。因此，以剂量0.75mg/kg起始给予初始患者从肝脏改善获益的潜在机会，尽管可能要求剂量递增实现直接的抗肿瘤活性。
研究性产品的剂量、配制和施用
在剂量递增和剂量扩大期间，给药将遵循该方案。剂量将基于使用DuBois&DuBois(133)体表面积(BSA)计算法时参与者的最新身高和体重。
BSA(m2)＝0.007184x身高(cm)0.725x体重(kg)0.425
MTL-CEBPA在室温解冻，之后稀释药品悬液于0.9％静脉用生理盐水中。配妥的输液袋的容积应当是250mL，无论浓度是多少，并且使用无滤器的输注泵，按恒定速率历经60分钟施用入静脉(外周或中央静脉)(关于操作IMP的说明的更多详情，参阅药剂手册)。
配制物应当保存在室温(25℃)，最长在用保质期为6小时。
预期IMP和稀释剂和/或输注装置之间无相容性问题。
改变参与者的研究性产品给药
可以根据正在进行的研临床前实验的结果或从源自本研究的数据探索其他方案和剂量
在≥3级输注反应(例如，血压下降、面部潮红、胸闷、背痛或腹痛、心率升高、出汗)的情况下，应当立即停止输注直至症状消散；随后可以重启输注。如果症状复现，研究者应当停止输注。在此时点施用的输注的容积将记录在CRF中。研究者应当在实施前与医学监查员讨论任何剂量改变计划。这可以导致在随后两天等分剩余的每周剂量。以下施用将遵循如所述的3日施用计划。
如果尽管改变给药但症状延续，则治疗应当停止并建议参与者退出本研究。
伴同用药/治疗
将在eCRF中记录关于启动研究治疗之前4周内的任何治疗和研究期间给予的全部伴同治疗连同治疗原因的信息。
禁用药物和程序
以下药物在参与者参与试验期间禁用：其他研究性药物；抗肿瘤药。
预防用药和程序
全部参与者均将在给予MTL-CEBPA之前进行前驱用药(除非禁忌症)以减少输注反应的可能性。前驱用药应当在开始输注前30至60分钟如下进行：类固醇单次给药(即，地塞米松口服8mg或静脉内10mg)；口服H2阻滞剂单次给药(即，雷尼替丁150mg或法莫替丁20mg或等效的其他H2阻滞剂剂量)；口服H1阻滞剂单次给药、10mg西替利嗪(如果参与者不耐受西替立嗪，则可以更换为安泰乐25mg或非索非那定)。
研究性医药产品的过量用药
MTL-CEBPA是研究性药物并且禁用于本研究方案中所提到那些病状之外的全部病状。
一旦出现过量用药，则不存在已知的解毒剂。应当对症治疗过量用药导致的症状和体征。应当密切监测、采用适宜支持疗法管理无意间接受较预期更高剂量的任何参与者直至康复并且期待追踪之。
这类过量用药应当记录如下：将伴有相关AE/SAE的过量用药在eCRF的相关AE/SAE模块上和在过量用药eCRF模块上记录为AE诊断/症状；仅在过量用药eCRF模块上报告未伴随相关症状的过量用药。
如果在研究过程期间出现过量用药，研究机构人员必须在一天内(即立即)告知PI，但不晚于他或她知晓该情况时的下一个工作日结束。过量用药将由PI报告给申办方。
对于与SAE相关的过量用药，采用标准报告时间表。对于其他过量用药，应当在30天内进行报告。
妊娠和母源暴露
由于MTL-CEBPA是研究性药物，因此它禁用于孕妇，并且因而本身排除她们参与这项研究。对于全部育龄女性，应当使用屏障式避孕措施并应当在MTL-CEBPA治疗结束后续用至少三个月。然而，若参与者在参与研究时即便作为强制而使用屏障式避孕措施，却仍怀孕，则要求立即中止研究。
研究药物是否将影响精子或精液并不知晓，因此建议男性在治疗阶段期间和末次治疗后至少三个月使用可靠的屏障形式避孕措施。
研究方案
研究方案适用于研究的第1a部分和第1b部分。每种治疗周期由3周在第1日、第8日和第15日治疗随后休息1周组成。
筛查访视(第-21日–第-1日)：以下数据将在入选时采集并记录于适宜的CRF部分中：签署ICF的日期；人口统计数据、完整医学史、体格检查、生命体征记录、体能评分、体重(kg)、身高(cm)和腰围量值(cm)。针对纳入和排除标准的评价。记录基线症状和因果关系。既往和伴随用药。育龄女性的血妊娠试验。6小时空腹血液采样以评估血液学、凝血功能、临床生物化学(包括LFT、肾谱)、脂质谱、适宜的肿瘤标记物、细胞因子谱和补体激活因子Bb和C3a。12导联ECG。X光胸片肝。腹部的MRI或CT扫描连同RECIST报告。(注意：如果先前扫描在启动研究治疗之前1个月内可获得，则不应当重复扫描)。将仅在HCC参与者中进行肝纤维化扫描。FDG-PET扫描(仅第1b部分)。在不能获得其归档材料的参与者中进行肿瘤组织的影像学指导肝活检。肿瘤组织将是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的样品。
因血清白蛋白水平超出纳入范围而未进行首次筛查访视的参与者可以在14天后接受复筛。不接受第三次筛选。
第1、第8日和第15日访视(+\-2日)：除非另外说明，否则应当在给药前进行程序和评估。标准体格检查、体重和腰围量值。记录自先前访视以来的新症状和新药物、体能评分、12导联ECG。在第1日给药前和第15日给药后、第8周和在研究访视结束时进行FACT-Hep生活质量问卷调查(仅第1b部分中的参与者)。将套管置入静脉(外周静脉或中央静脉)。6小时空腹血液采样以评估血液学、凝血功能和临床生物化学(包括LFT和和肾功能检验)及补体激活因子Bb和C3a。仅第8日和第15日：用于适宜肿瘤标记物和细胞因子谱的血液采样。如果需要，MTL-CEBPA输注前30分钟通过导管插入术施用前驱用药。通过插管历经60分钟按照给药方案，静脉内施用MTL-CEBPA。记录给药前和在施用后15分钟、30分钟、1小时和2小时时间点的生命体征(体重和腰围量值除外)。(第1a部分参与者仅在第1日和第8日)在以下时间点的输注前和输注后PK样品：给药前、输注后立即、从输注完成起计时的0.25小时、1小时、3小时和6小时时间。FDG-PET扫描在给药后第15日(仅第1b部分中的参与者)(注意：可以在当日施用MTL-CEBPA之前取得并分析全部治疗前血液样品，PK例外)。
第2日、第9日和第16日访视：记录新症状和药物、生命体征和体能评分。6小时空腹血液采样以评估血液学、凝血功能和临床生物化学(包括LFT和肾功能检验)及补体激活因子Bb和C3a。(第1a部分参与者仅在第2日和第9日)在输注完成后24小时的PK。
第3日和第10日访视：仅第1a部分中的参与者的48小时PK采样
第4日和第11日访视：仅第1a部分中的参与者的72小时PK采样
第22日访视(+\-2天)：标准体格检查。记录新症状和药物、生命体征和体能评分。育龄女性的血妊娠试验。6小时空腹血液采样以评估血液学、凝血功能、临床生物化学(包括LFT、肾谱)、脂质谱、适宜的肿瘤标记物、细胞因子谱和补体激活因子Bb和C3a。FACT-Hep生活质量问卷调查(仅第1b部分)。X光胸片。
第2循环第8周–第22日访视(+\-2天)：除第22日上文所列的研究和程序之外，应当实施以下成像程序：进行MRI/CT扫描并且此后每8周进行一次；FDG-PET扫描仅在第8周对第1b部分中的参与者进行并且此后不会重复。
研究结束访视(末剂后第29日或第14日+/-7天)：标准体格检查、体重和腰围量值。记录自先前访视以来的新症状和新药物、生命体征和体能评分。FACT-Hep生活质量问卷调查(仅第1b部分)。育龄女性的血妊娠试验。6小时空腹血液采样以评估血液学、凝血功能和临床生物化学(包括LFT和肾功能检验)及补体激活因子Bb和C3a。仅对于提前撤退的参与者(即，如果在第22日未进行)，血液采样用于空腹脂质谱、适宜的肿瘤标记物和细胞因子谱。肝纤维化扫描(仅在HCC参与者中)。肿瘤活检；迫切需要治疗后活检并且将依据研究者的判断进行。
提前终止访视：若参与者退出本研究，应当进行上文描述的评估。
计划外访视：可以进行计划外访视或电话联系以跟踪不良事件。
妊娠访视：在参与者于研究期间怀孕的情况下，应当建议参与者立即停止研究治疗。将在eCRF中记录退出的原因并且参与者将由研究者查看和评估，以完成用于结束研究访视的全部评估从而评估如上文所述的研究药物的安全性。
反应者的治疗计划：第1a部分和第1b部分的参与者起初入选用于2个周期。在第一个循环结束时，若参与者显示出临床获益(例如，肝功能改善)并且同意继续参与本研究，则参与者可以基于相同的治疗方案(不包括PK采样)接受额外的MTL-CEBPA循环。在第二个循环结束时，评估肿瘤反应；向未显示肿瘤进展的参与者提供另外的2个额外治疗循环。
此时，如果退出研究符合参与者的最佳利益或如果参与者的反应积极，这允许参与者接受在研究伊始(即分期迁移)不适宜的另一个常规疗法如手术、RFA、TACE或索拉非尼，则研究者可以建议退出研究。
只要治疗的反应持续，将给予参与者机会接受另外的MTL-CEBPA循环。
研究程序/评价–患者报告结局
癌症治疗功能评价-肝胆(FACT-Hep)第4版问卷调查将会在第1日和第15日和第8周用来评估按RP2D水平(第1b部分)施用MTL-CEBPA后参与者的健康相关生活质量的变化。
FACT-Hep问卷调查
癌症治疗功能评价-肝胆(FACT-Hep)是一项经验证的健康相关生活质量问卷调查并且是FACT-总体和专门设计成测量与肝胆癌相关的症状和治疗副作用的18项模块的组合。FACT-G是四个生活质量维度(包括身体、社会/家庭、情绪和功能康乐)的多维度27项工具。FACT-Hep还包括一个评估肝胆癌症状和治疗副作用的18项模块(额外关注)。
评估方法
FACTHep将在计划的访视时使用纸版调查问卷自我执行。将在第1日给药前和在第15日给药后并且随后在第22日(第8周)评估问卷调查。
PRO问卷调查的执行
设计FACIT量表供参与者自我执行，但它也可以通过访谈模式执行。对于自我执行，应当教授参与者阅读页面上端的简要指导。在已经确认参与者正确理解后，应当鼓励他/她按顺序完成每一项，不遗漏任一项。应当鼓励患者圈选最适用的回复。例如，如果参与者目前没有接受任何治疗，参与者应当对问题“我遭受治疗副作用烦扰”圈选“完全没有”。鉴于访谈员培训充分，访谈执行被认为是恰当的，从而激发无偏见的参与者响应。
评分
FACT-Hep包括5个维度：“身体康乐”、“社会/家庭康乐”、“情感康乐”、“功能康乐”和“附加关注”。每维度具有5个水平：“一点也不”、“有一点”、“或多或少”、“相当大地”和“非常大的”。参与者在FACT-Hep上通过以下方式评定其当前健康状态：每行圈选或标记一个数字以显示他/她的答复，该数字适用于过去7日FACT-Hep上的描述。这是FACT-Hep评分。
实验室安全性评价
研究事件计划中包括样品采集时间。方法学和参考文献的详情将储存在TMF中。已经距基线显著变化并认定为有临床意义的实验室值必须记录为不良事件并且如果适宜，加以追踪。
下文展示1个循环期间从每位参与者待采集的估计血液容积：
Figure BDA0003506633680001591
[a]将评估总蛋白、白蛋白、总胆红素、ALT、AST、血浆氨、肿瘤标记物、总胆固醇、HDL-C和甘油三酯以允许评审PD生物标记物。[b]针对育龄女性。
将在每次访视时从每位参与者取得不足50mL并且每个4周循环总计小于300mL。
当地实验室检验
用于评估实验室安全性的全部样品将在每个研究机构根据当地惯例采集并且在当地实验室，使用例行检验的标准方法分析。全部血液样品应当在筛选时和在第1日、第2日、第8日、第9日、第15日、第16日、第22日和EOS在MTL-CEBPA输注前采集(脂质谱例外)。
将测量临床生物化学参数和血液学参数。应当在空腹状态(血液样品之前6小时)采集临床生物化学样品，包括肝功能、氨和葡萄糖以及脂质谱。
Figure BDA0003506633680001601
[a]将评估总蛋白、白蛋白、总胆红素、ALT、AST和血浆氨以允许筛选时评审合格性并允许评审PD生物标记物。[b]将在筛选时、在每个循环结束时(第22日)和EOS(针对提前退出的参与者)评估总胆固醇、HDL-C和甘油三酯，以允许评审探索性PD生物标记物。
Figure BDA0003506633680001602
Figure BDA0003506633680001603
Figure BDA0003506633680001604
妊娠试验(血液)
将在筛查时、第22日和此后每8周测量育龄女性的人绒毛膜促性腺激素(hCG)(如果参与者正在接受其他的治疗周期)。
肿瘤标记物
基于癌症史选择以下清单当中的最合适标志物并且在筛选时并在第8日、第15日、第22日和EOS(提前退出参的与者)进行。
Figure BDA0003506633680001611
成像
X光胸片：X光胸片拍摄将在筛选期间和第4周进行。如果参与者正在接受其他的MTL-CEBPA循环，进一步X光拍摄将在第12周并且此后根据医护标准进行。
MRI或CT扫描：胸部和腹部的MRI或CT扫描将在筛选期间(首剂研究药物之前1个月内)和在第8周进行。MRI是优选的方法，但允许CT扫描；无论使用MRI或CT扫描，重要的是维持用于每位参与者的评估方法的一致性。
将随后每8周进行MRI/CT扫描。
肝纤维化扫描：仅在HCC参与者中在筛选时和在研究结束时进行肝纤维化扫描，旨在评估MTL-CEBPA治疗之前和之后肝脏的纤维化特征。
FDG-PET扫描：使用FDG-PET扫描仅在入选第1b部分的参与者中评估肝脏和肿瘤的代谢。在筛选期间、在MTL-CEBPA输注后第15日和在再分期CT(即第8周)时进行FDG-PET扫描。
不允许患者在开始PET研究之前至少6小时(即相对于注射FDG的时间)消费任何食物或糖。在实践中，这意味着经安排在早晨接受PET研究的患者不应当在午夜后摄食并且优选地在PET研究之前的晚上期间吃清淡餐(不饮酒)。安排中午进行PET研究的那些患者可以在早8点之前吃清淡早餐(即至多两块三明治、无糖或含糖的三明治馅料)。药物可以如规定那样服用。
肝活检
如果适用，对每位参与者采集以福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤块形式的归档组织样品。如果不能获得肿瘤块或它不存在，参与者必须同意在筛选时进行活检作为知情同意流程的组成部分。
归档肿瘤组织应当由研究团队索取并且应当如所述那样发送。归档肿瘤块将在研究结束时返回或当要求时(如需要)更早返还至来源地。
在EOS访视迫切需要治疗后肝肿瘤活检样品。
如需要，应当执行冷冻的新鲜血浆和血小板管理以纠正任何凝集异常。
药物代谢动力学(PK)
在第一循环第1日、第2日、第3日和4日、第8日、第9日、第10日、第11和在以下时间点：研究药物给药前、输注完成后立即、随后在距完成输注的0.25小时、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时和72小时时间点，从研究的剂量递增部分的全部6个队列的每位参与者采集在EDTA管中PK血液样品(5mL全血)。
鼓励临床员工在安排的时间点取得PK分析用血液样品。然而，偏离安排的采样时间不视为研究方案偏离。抽取血液的确切时间和日期必须使用毫无疑义的格式记录。
MTL-CEBPA的血浆浓度将在限定的时间点使用基于杂交的HPLC-测定法集中分析。
以下是描述标本制备、处置和储存的说明。
药效动力学(PD)
已经确定肝功能检验、AFP肿瘤标记物(对于HCC参与者)、细胞因子谱和CEBPA基因表达为MTL-CEBPA药理学效应的代用生物标记物。
肝功能检验：将在第1日(给药前)、第2日、第8日(给药前)、第15日(给药前)、第22日和在EOS访视获得丙氨酸转氨酶(ALT)、血清白蛋白、血浆氨、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素样品。将在本地实验室分析这些样品。
AFP肿瘤标记物：将在第1日(给药前)、第8日(给药前)、第15日(给药前)、第22日和在EOS访视(针对提前退出的参与者)检验AFP。将在本地实验室分析这些样品。
脂质谱：将在每个循环的第1日、第8日、第15日、第22日和EOS(针对提前退出的参与者)评估总胆固醇、HDL-C和甘油三酯以允许评审探索性PD生物标记物
细胞因子谱：将在筛选时、第8日(给药前)、第15日(给药前)、第22日访视和在EOS访视(针对提前退出的参与者)检验IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-g、IL-4、IL-17a、IL-10。样品将在中心实验室分析。
基因表达：将使用CEBPA和p21蛋白质表达，利用免疫化学染色测定法在福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)肿瘤活检样品上研究CEBPA基因表达，所述样品从归档肿瘤组织和/或从筛选访视和EOS访视时的新活检组织获得。
标本制品、处置和运送
标本制备、处置和储存的说明
全部样品(PK样品和细胞因子谱样品例外)将由各研究机构根据当地惯例采集并且在当地实验室使用例行检验的标准方法分析。
给出详细说明的研究者实验室手册将在启动研究之前提供给每个研究机构。研究者和委派的研究机构人员应当遵循实验室手册中确定的程序。
对于PK样品，将5mL全血采集入EDTA处理的管。在采样后立即处理EDTA管并使用冷冻离心机(4℃)离心以产生血浆。一旦获得，血浆将在冰上分成至少两个100μL等分试样。等分试样将遵循上文提到的相同研究方案离心并使用液氮或干冰急冻，之后储存在-80℃。从血液采集至血浆储存的推荐时间是30分钟。
对于细胞因子图谱，将3mL血液采集入EDTA处理的管。管离心以产生血浆。样品将现场冷冻储存在-80℃，之后发送至中心实验室(参见以下部分)。
如果可获得，归档肿瘤块应当从有关的病理科索取。新获得的肿瘤组织样品应当进行福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)。组织快(优选地)或切片将发送至订立合同以进行IHC染色检验的中心实验室(参见以下部分)。
不良事件(AE)
不良事件(AE)定义为施用过药物产品的参与者或临床研究参与者中的任何不利医学事件(包括先前存在的医学状况变坏)，无论其与研究治疗的因果关系如何。因此，AE可以是时间上与使用研究性医药产品(IMP)相关的任何不利和非预期体征，包括异常的研究结果(例如，实验室结果、心电图)，症状(例如，恶心、胸痛)，体征(例如，心动过速、肝脏肿大)或疾病。
将在这项研究期间从知情同意直至研究访视结束，收集AE。全部AE，包括不符合“严重不良事件”标准的局部和全身性反应，应当记录在适宜的eCRF上。
将由参与者自发报告的或响应来自研究人员的开放问题而报告或依据观察结果揭示的全部AE收集并记录于CRF中。当收集AE时，记录某个诊断优选(当可能时)记录一系列体征和症状。然而，如果诊断是已知的并且存在通常不是该诊断的组成部分的其他体征或症状，则该诊断和每种体征或症状将分别记录。
在签署知情同意书时存在的任何医学状况应当认定为医学史并且不作为AE报告。然而，如果它在签署ICF后的任何时间恶化，则它应当记录为AE。
AE变量
将采集每个AE的以下变量：诊断/症状(verbatim)。当AE开始(发作日期)和停止(消散日期)时的日期。NCI-CTCAE最高严重度。无论AE是否严重(严重性)。研究者针对研究性产品评定因果关系。就IMP采取的措施。无论AE是否造成参与者从IP撤出。结果。
此外，将采集SAE的以下变量：AE符合严重AE标准的日期。研究人员知晓严重AE的日期。划分为严重的原因。住院日期。出院日期。住院原因。可能的死因。死亡日期。进行的死后措施。与研究程序有关的因果关系评估。与其他药物有关的因果关系评估。与额外研究药物有关的因果关系评估。AE描述。
参与研究时出现的全部AE必须适当地记录，无论关系是什么样的。根据当地惯例追踪全部AE直至事件已经稳定或充分解决。
全部AE必须针对严重程度和与研究药物的关系定级。
改变参与者的MTL-CEBPA施用
根据源自研究的临床数据，可能需要备选或中间剂量和方案。这可能包括再安排、分割、减少或递减所要求的剂量。
参与者的方案改变
给药访视应当在这个研究方案指定的可允许时间窗口范围内规划。然而，在参与者不能够参与安排的给药日(例如，参与者感觉不好)情况下，给药可以再安排并且后续研究访视的时序应当因此变更。
MTL-CEBPA的施用可以延迟多达1周。若参与者不能够参与下一个给药日期，参与者应当退出研究并且应当安排EOS研究访视。
参与者的剂量改变和方案改变
在≥3级输注反应的情况下，应当遵循上文提到的程序。在这个程序后，可以将初始剂量在3个连续日上分割。
下文显示分割剂量方案的例子。
Figure BDA0003506633680001651
在三天分割给药的情况下，PK样品应当如计划那样在第1日和第8日取得并且随后在第2日、第3日及第9日、第10日给药前取得。
在任何情况下，应当在实施前与医学监查员讨论剂量和方案改变。
参与者的剂量改变
SRC建议决定递减(例如，如果特定方案的起始剂量导致毒性，从而超过MTD)或减少剂量。
实施例20.制剂优化研究
NOV340是用于包封寡核苷酸的明确确定的脂质体制剂。表19以摩尔比显示制剂的脂质组成。
表19.NOV340的组成
Figure BDA0003506633680001652
进行本优化研究以改善CEBPA-51进入脂质体的包封效率。基于工艺开发和优化NOV340脂质体中所配制寡核苷酸方面的内部经验，CEBPA-51的待优化的最关键参数是包封效率。包封效率(％)是脂质体缔合的寡核苷酸(包封和膜结合)的量除以溶解于API溶液中旨在包封的总量(不包括水含量以及杂质)。计算包封效率时还应当考虑小规模制备时的工艺损耗高。那些损耗归因于采样和滤器单元和管路中的死体积。当生产规模增加时工艺损耗将降低。因此，还计算基于脂质回收率的包封效率。为了改善包封效率，寻求的最合理方向是令RNA和脂质之间的相互作用最大化。为了实现这个目标，变动并评价两个不同参数。第一个参数是在脂质体形成时脂质对药物比率，第二个参数是用来溶解CEBPA-51的缓冲液的pH。RNA和脂质制剂之间的相互作用主要出现在MoChol和寡核苷酸之间。MoChol是在酸性介质中带正电荷的pKa为6.5的两性脂质。带正电荷的MoChol与带负电荷的RNA之间的相互作用导致RNA向脂质体中包封增加。因此，我们的假设是降低API缓冲液的pH将导致MoChol电荷增加，因此导致MoChol和CEBPA-51之间的相互作用增加和包封效率增加。第二选项是鉴定最佳的脂质对药物比率，或更简单‘’饱和点”(可以与MoChol相互作用的CEBPA-51最大量)。因此，在脂质体制备实验过程中测试了多种脂质对药物比率。通过降低API溶液中CEBPA-51的浓度，改变脂质对药物比率。测试了七个不同的CEBPA-51浓度。
方法
脂质体制备
通过错流乙醇注射方法制备脂质体。简言之，将脂质(POPC、Chems和DOPE)在55℃溶解于无水EtOH中。在完全溶解后，将溶液定量地转移入含有预称重MoChol的另一个瓶。已经证明按两个步骤选择无水EtOH和溶解脂质是最大限度减少MoChol降解成Chol必需的。在完全溶解脂质后，将乙醇脂质溶液通过0.2μm滤器过滤并定量转移到在加热炉中55℃调节的注射器中。与此同时，将寡核苷酸在室温溶解于乙酸钠/蔗糖缓冲液中并通过0.2μm滤器过滤入API缓冲液瓶。NOV340制剂的API缓冲液的标准pH是在pH 4，但是在本优化研究中，使用pH 3.5和pH 4.0的缓冲液。当脂质溶液与API缓冲液在注射模块中混合时，脂质体形成。在脂质体形成后立即用稀释缓冲液(室温NaCl/Na2HPO4，pH 9.0)进行在线稀释步骤，以中和脂质体制剂的pH。将脂质体配制的寡核苷酸收集在IV瓶中并在室温搅拌30分钟，之后挤出。随后将这种中间体悬液经0.2μm聚碳酸酯膜挤出以细化脂质体的大小和PdI。在挤出后，将游离的RNA和EtOH通过渗滤移除并且通过超滤浓缩成saRNA目标浓度。在灌装入小瓶之前，将脂质体产品经0.2μm滤器无菌过滤。
脂质体的大小测量
使用Malvern Nano ZS(224/SOP/002)，通过动态激光光散射法(DLS)进行用于确定脂质体大小的测量。这个系统配备633nm波长的4mW氦/氖激光并且使用非侵入式背向散射技术在检测角173°测量脂质体样品。将脂质体在水相中稀释以达到最佳脂质体浓度并且实验在25℃实施。结果以脂质体悬液的平均直径(z-平均中值)表示，连同多分散性指数来确定脂质体均匀性。
脂质体的ζ电位测量
使用Malvern Nano ZS，根据224/SOP/012从散装成品测量脂质体的ζ电位。
RNA-消光系数的定量
根据221/SOP/012，在OD 260nm通过分光光度计定量RNA。定量API溶液中和散装成品中的RNA。在CEBPA-51配方开发的很早阶段，测量saRNA的每条单链的消光系数。因此，使用每条单链的平均消光系数值进行saRNA的定量。由于增色效应，使用平均消光系数定量saRNA导致包封效率值降低，低30％范围内。在开发阶段期间，STPharm测定的正确消光系数值导致准确的saRNA定量和优化的包封效率。用于定量CEBPA-51的第一消光系数是：30.17(L/(摩尔·cm))并且更新值是：20.68(L/(摩尔cm))。
脂质定量
根据222/SOP/004使用HPLC从散装容积测量样品中的脂质浓度。
结果和讨论
旧消光系数和新消光系数之间的比较
表20列出了如通过开始制剂优化过程之前制备的样品的两个消光系数值所计算的导出的包封效率。从导出值显而易见，更新的消光系数明显地改善CEBPA-51进入脂质体的包封效率。然而，实施其他优化研究以令成品制剂中saRNA的产率最大化。实际上，从几乎30％的初始包封效率中，优化的配制产生几乎60％的包封效率。
表20：通过旧消光系数值和新消光系数值计算的CEBPA-51进入脂质体的包封效率
Figure BDA0003506633680001681
采用溶解在pH 3.5缓冲液中的API制备脂质体
为了研究API溶液的pH对包封效率的影响，将API溶液的pH从pH4.0降至pH 3.5。此外，API溶液中的三个不同CEBPA-51浓度用来研究脂质对药物比率对包封效率的影响。表21列出了用pH 3.5的API溶液制备的全部制剂及其特征。表22、表23和表24显示与用pH 4.0的API溶液制备的其相应制剂制备比较，用pH 3.5的API溶液制备的制剂。图34展示了表22、表23和表24中显示结果的为曲线图。从获得的结果中显而易见，改变API缓冲液的pH仅导致在API溶液中低RNA浓度(1.85mg/mL)时的包封效率略微增加。就其他的两个测试浓度(2.25和2.65mg/mL)而言，不能观察到这个方向的明显趋势。另外，降低pH导致形成的脂质体的大小和PdI增加。大小和PdI的这种增加将需要额外的挤出循环，不推荐这么做，因为它将增加RNA损耗和工艺持续时间。因此，不选择注射缓冲液pH从4.0降至3.5。就脂质对药物比率的改变而言，注意到通过降低API缓冲液中的RNA浓度，包封效率增加。这种趋势对API溶液的两个pH值而言均相似。
表21：使用pH 3.5的缓冲液制备的脂质体样品
Figure BDA0003506633680001682
Figure BDA0003506633680001691
表22：用pH 3.5缓冲液和pH 4.0缓冲液制备的样品之间的比较。注射缓冲液中的CEBPA-51浓度在2.65mg/mL。
Figure BDA0003506633680001692
Figure BDA0003506633680001701
表23：用pH 3.5缓冲液和pH 4.0缓冲液制备的样品之间的比较。注射缓冲液中的CEBPA-51浓度在2.25mg/mL。
Figure BDA0003506633680001702
表24：用pH 3.5缓冲液和pH 4.0缓冲液制备的样品之间的比较。注射缓冲液中的CEBPA-51浓度在1.85mg/mL。
Figure BDA0003506633680001703
脂质对药物比的优化。
在脂质体形成时的脂质对药物比率对脂质体内部RNA包封效率具有主导重要性。为了优化这点，EtOH溶液中的脂质浓度保持相同并且改变API溶液中的CEBPA-51浓度，范围从1.06直至3.44mg/mL。全部其他工艺参数保持恒定并且API溶液的pH维持在pH 4.0。表25列出了制备的全部制剂及其特征。在图35中，将相同的结果作为曲线作图。从获得的结果显而易见，存在一个轻微趋势，其表明通过降低API溶液中的CEBPA-51浓度，包封效率轻微增加。此时，重要的是指出，成品中的脂质浓度是尽力实现saRNA最大产率时应当考虑的关键结果。在另一方面，成品中脂质浓度增加可能在最终0.2μm过滤变得关键，因为在某种程度上，滤膜可能拦截暴露于滤膜区域的过多脂质。因此，目标不仅仅是令RNA损耗最小化，还旨在实现将允许成品中CEBPA-51浓度增加的最佳脂质浓度。
表25：使用pH 4.0的缓冲液制备的脂质体样品。
Figure BDA0003506633680001711
优化研究的确认。
在实施全部意在优化saRNA进入脂质体的包封效率的实验后，制备更大体积的两个最终批次以确认结果。表26显示了推导的数据，所述数据还以图形方式与全部其他已制备批次的结果一并展示在图35。获得数据明确地证实设定注射缓冲液中CEBPA-51浓度为2.38mg/mL所做的决定，因为它既产生更高的saRNA包封效率，又在脂质体成品中产生更高的CEBPA-51浓度。
表26：为确认推导结果制备的脂质体样品。
Figure BDA0003506633680001721
结论
这项研究优化了CEBPA-51进入脂质体的包封效率。推导的结果显示，脂质体的产生应当用pH 4.0的API缓冲液进行，并且应当设定API溶液中的CEBPA-51浓度为大约2.38mg/mL。这些条件应当产生产率在50％较高区域的脂质体制剂，所述产率是用NOV340配制寡核苷酸时常见的产率。
实施例21.在用稳定性研究
将51.80至296.00mgMTL-CEBPA稀释成总输注体积250ml，在输液袋中产生0.21至1.18mg/ml的终浓度。使用一个类型的输液袋(Baxter VIAFLO，250ml氯化钠，0.9％静脉内输注BP)并且选择2种代表性space管路(PVC和无PVC)供评价。选择最低剂量0.21mg/ml(对应于临床剂量的水平为28mg/m2)，作为最差情况用于这项在用研究。
材料
5小瓶MTL-CEBPA药品，批号MIT1215-A，saRNA含量：2.5mg/ml；标称体积20ml；输液袋：4xBaxter VIAFLO 250ml氯化钠0.9％静脉内输注BP(ref：FE1322)；输注space管路：1).2x Braun
Figure BDA0003506633680001722
space管路–Neutrapur(聚氨酯)无PVC(参考号：8700110SP)；2).2xBraun
Figure BDA0003506633680001723
space管路–PVC(无DEHP)(参考号：8700036SP)；针头：例如，BDMirolance(ref：301300)；注射器：例如，BD注射器(参考号：309658)；培养箱QC-GTBS01MM(23–27℃)。
给药溶液的配制、采样和储存
在输液袋中通过取出大约21ml 0.9％生理盐水并替换为大约21ml药品，稀释MIT1215-A(2.5mg/ml)。为每根space管路配制重复的输液袋，产生总计4个输液袋。将输液袋在取出盐水之前和之后以及添加药品后称重。1.04g/ml的密度用于计算药品的添加量。两个输液袋(#1和#2)用无PVC的space管路连接，剩余两个输液袋(#3和#4)用PVC space管路连接。输液袋在25±2℃储存24小时。
表27：给药溶液的配制
Figure BDA0003506633680001731
1)密度盐水：1.00g/ml
2)密度DP：1.04g/ml
将样品(4x0.5ml，每个时间点和输液袋)在输液袋配制后立即(时间点0小时)、8小时和24小时后经space管路采集并且储存在-20±5℃。在时间点8和24小时，将管路在采样前用大约30ml盐水吹扫，以确保这份样品材料采集自输液袋而非在space管路中温育的材料。在SEC-HPLC(含量)和RP-HPLC(脂质)的单个分析轮次内部进行全部样品的分析。
检验和验收标准
概况
Figure BDA0003506633680001732
Figure BDA0003506633680001741
考虑配制输注用悬液时约12倍的相应稀释倍数(即saRNA含量从2.5±0.5mg/ml稀释至0.21±0.04mg/ml))，基于药品(DP)质量标准应用验收标准。
结果
saRNA含量
根据222/SOP/013，通过RP-HPLC连同UV检测，测量总saRNA含量。全部样品均按相同的HPLC顺序分析。表28中列出结果。在整个观察期间，全部输液袋均含有接近于目标值的saRNA浓度并且符合验收标准0.21±0.04mg/ml。
表28：输液袋中的saRNA含量(mg/ml)
Figure BDA0003506633680001742
POPC含量
根据222/SOP/018，通过RP-HPLC连同CAD检测，测量总POPC含量。全部样品均按相同的HPLC顺序分析。表29中列出结果。在整个观察期间，全部输液袋均含有接近于目标值的POPC浓度并且符合验收标准0.29–0.49mg/ml。
表29：输液袋中的POPC含量(mg/ml)
Figure BDA0003506633680001751
DOPE含量
根据222/SOP/018，通过RP-HPLC连同CAD检测，测量总DOPE含量。全部样品均按相同的HPLC顺序分析。表30中列出结果。在整个观察期间，全部输液袋均含有接近于目标值的DOPE浓度并且符合验收标准1.13–1.90mg/ml。
表30：输液袋中的DOPE含量(mg/ml)
Figure BDA0003506633680001752
CHEMS含量
根据222/SOP/018，通过RP-HPLC连同CAD检测，测量总CHEMS含量。全部样品均按相同的HPLC顺序分析。表31中列出结果。
表31：输液袋中的CHEMS含量(mg/ml)
Figure BDA0003506633680001761
MoChol含量
根据222/SOP/018，通过RP-HPLC连同CAD检测，测量总MoChol含量。全部样品均按相同的HPLC顺序分析。表32中列出结果。在整个观察期间，全部输液袋均含有接近于目标值的MoChol浓度并且符合验收标准1.71–2.84mg/ml。
表32：输液袋中的MoChol含量(mg/ml)
Figure BDA0003506633680001762
胆固醇含量
根据222/SOP/018，通过RP-HPLC连同CAD检测，测量总胆固醇含量。全部样品均按相同的HPLC顺序分析。表33中列出结果。在整个观察期间，全部输液袋均含有低于最大允许限值的胆固醇浓度并且符合验收标准≤0.17mg/ml。
表33：输液袋中的胆固醇含量(mg/ml)
Figure BDA0003506633680001771
结论
实施在用研究以证实MTL-CEBPA在输液袋中在室温历经24小时时间的稳定性及与预期输注管路的相容性。
结果证实，药品在在最低预期临床剂量0.21mg/ml时稳定并相容至少8小时。
因此可以得出结论，选择的材料(输液袋和space管路)与药品相容并且可以在MTL-CEBPA的临床研究中在至少8小时的时间段范围内使用。
实施例22.MTL-CEBPA的稳定性研究
在-20±5℃进行长期储存。在2–8℃研究加速条件下的稳定性。通过在25±2℃和40±2℃储存，进行了用于确定稳定性标示参数的影响因素试验研究。表34提供了对这些稳定性研究中受验的各批次的概述，包括持续时间、条件和目前可用数据。
稳定性项目中所用分析方法包括检验外观、pH、测试、纯度、脂质含量和颗粒物特征。
表34：MTL-CEBPA药品的稳定性研究
Figure BDA0003506633680001772
稳定性总结
可获得在长期储存条件(-20±5℃)储存的一个批次MTL-CEBPA(MIT0615-A)的稳定性数据。可获得储存在25±2℃和40±2℃的相同批次的影响因素试验数据。
未观察到MIT0615-A储存在-20±5℃长达6个月的的变化。储存在应力条件下(25±2℃和40±2℃)的样品显示因储存时MOCHOL降解和转化成胆固醇，MOCHOL减少。与25±2℃相比，这降解在40±2℃更明显。
在25℃三天(72小时)影响因素试验下，关键脂质-吗啉代乙胺胆固醇(MOCHOL)的含量从33.2mg/ml降低至27.8mg/ml(下降16％)，而在40℃三天后，MOCHOL的含量从30.1mg/ml降低至22.5mg/ml(下降25％)。MOCHOL的这种降低对应于形成降解产物胆固醇，其在25℃三天后从1.1mg/ml增加至2.2mg/ml并且在40℃三天后从1.0mg/ml增加至8.2mg/ml。其他脂质赋形剂在加速条件下没有显示明显的变化。未观察到其他脂质、总saRNA含量和其杂质的显著变化。表35-38显示MTL-CEBPA在不同条件的稳定性和影响因素试验结果。
表35：批次MIT1215-A在-20±5℃的长期稳定性(长期，-20±5℃)
Figure BDA0003506633680001791
表36：批次MIT1215-A在5±3℃的加速稳定性
Figure BDA0003506633680001792
Figure BDA0003506633680001801
表37：批次MIT0615-A在25±2℃的影响因素试验数据
Figure BDA0003506633680001802
表38：批次MIT0615-A在40±2℃的影响因素试验数据
Figure BDA0003506633680001803
当在长期储存条件(-20±5℃)储存时，MTL-CEBPA稳定至少6个月，显示除由于分析变异性之外没有下降或变化趋势。它在2-8℃(5±3℃)加速条件下稳定至少1个月。
实施例23.CEBPA-saRNA对CCL4所致肝肝硬化体内研究
这项研究是实施例11的重复，伴有腹水和生存探索延迟管理。四氯化碳(CCL4)所致肝纤维化是啮齿类中用于研究肝纤维化和肝硬化的明确建立且广泛接受的实验模型。向大鼠长期施用四氯化碳诱导肝功能重度紊乱连同组织学上可观察的肝纤维化。
通过腹内注射四CCL4，在Sprague Dawley大鼠中诱导肝硬化。使用起始体重120–150g的雄性Sprague Dawley大鼠。CCL4处理的动物显示在整个研究期间体重显著降低。CCL4处理的动物显示肝功能检验(LFT)参数如天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、凝血酶原时间(PT)和胆红素明显升高达8周，但是GGT则不是如此(第一次随机化)。路径对照动物中氨明显增加并且总蛋白显著降低达8周。
在第8周用MTL-CEBPA(1mpk)治疗显示动物的体重显著改善。显著逆转LFT水平和氨水平直至13周。总蛋白水平显著地升高。在第11周用MTL-CEBPA(1mpk)治疗也显示LFT水平和氨水平明显逆转直至第13周。图36显示从第8周起MTL-CEBPA治疗逆转了高血氨症。
图37A和图37B显示MTL-CEBPA治疗减少腹水。基于目视/体格检查按0至3的量表评估腹水。不存在腹水记录为0；腹水几乎不可触及记录为1；大量腹水伴腹部膨胀记录为2并且腹水紧绷记录为3。腹水从第9周往后显而易见并且在第13周达到高评分。
MTL-CEBPA治疗导致存活明显改善，如图38A和图38B的生存曲线中所示。
实施例24.小鼠和大鼠中的CEBPA-51交叉反应性
研究目的：这项研究的目的是研究对于临床前肝脏疾病模型及采用MTL-CEBPA/CEBPA-51的非临床毒理学研究而言，大鼠和小鼠是否为适宜的啮齿类物种。
实验设计：该研究含有3个部分：1)来自数据库检索的序列匹配，2)对大鼠和小鼠基因组DNA(gDNA)测序和3)证实大鼠细胞系和小鼠细胞系中CEBPA上调。
首先，用公开可获得的数据库评估CEBPA的序列同源性(BLAST检索)。使用BLAST，将CEBPA51靶序列用作褐家鼠(Rattus norvegicus)(Wistar品系)和小家鼠(Musmusculus)(C57BL/6J品系)基因组上的查询检索。
另外，从大鼠肝叶和小鼠肝叶分离基因组DNA并且生成靶位点的PCR产物供直接测序。随后借助BLAST，将所产生的序列与公开的大鼠和小鼠基因组序列比较。
随后通过将CEBPA-51转染入大鼠肝克隆-9细胞和小鼠肝AML12细胞并测量CEBPAmRNA的上调，评定功能交叉反应性。将细胞使用Lipofectamine 2000，以20nM(终浓度)每种供试品(CEBPA-51或siFLUC(非靶向的siRNA))反向转染，随后使用Lipofectamine 2000，进行每种供试品的额外正向转染步骤(20nM终浓度)。第二次转染后24小时，通过qRT-PCR，测定CEBPA mRNA水平(持家基因：GAPDH；测量一式三份)。
结果：BLAST检索证实在CEBPA-51的序列和大鼠和小鼠靶位点(CEBPA基因的基因组位置)之间不存在错配。此外，比较CEBPA-51和从大鼠肝和小鼠肝的gDNA衍生的扩增序列，未找到错配。
将CEBPA-51转染入大鼠克隆-9细胞和小鼠AML12细胞分别导致CEBPA mRNA上调2倍(n＝1)和1.7倍(n＝2)，而非靶向的对照RNA双链体(siFLUC)未观察到上调。
结论：根据BLAST数据库，大鼠和小鼠CEBPA的基因组序列与CEBPA-51靶序列相同。对大鼠和小鼠肝gDNA测序进一步验证这一点。通过在初始研究在大鼠和小鼠肝细胞系中显示CEBPA基因上调，验证了CEBPA-51的功能交叉反应性。因此认定大鼠和小鼠肝癌和疾病模型适用于临床前评估MTL-CEBPA活性，并且认定大鼠是MTL-CEBPA非临床毒理学试验的适宜啮齿类物种。
应当理解尽管已经将本公开结合其发明详述加以描述，但前述说明书意在例示而非意在限制本公开的范围，所述范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改处于以下权利要求的范围。
序列表
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<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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acgacgaguu ccuggccgac cuguucc 27
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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ucuuuaagcg auuacucagu u 21
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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gaaacuuuag cgagucagau u 21
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 32
ucugacucgc uaaaguuucu u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 33
acuacugagu gacaguagau u 21
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<223> 在SEQ ID NO: 67的第17位开始的正义链
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<223>在SEQ ID NO: 67的第46位开始的正义链
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cuagcuuucu ggugugacu 19
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> SEQ ID NO: 36的反义链
<400> 37
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
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<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<221>
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> SEQ ID NO: 40的反义链
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<211> 19
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
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<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 在SEQ ID NO: 67的第487位开始的正义链
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gcacaagguu auccuaaau 19
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<212> RNA
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<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> SEQ ID NO: 44的反义链
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auuuaggaua accuugugc 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
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cggucauugu cacugguca 19
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
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ugaccaguga caaugaccg 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
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ccaggaacuc gucguugaa 19
<210> 49
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
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<220>
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<222> (18)..(18)
<223> 2'F修饰的核苷酸
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<222> (13)..(13)
<223> 脱氧-核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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tccctctccc accaggggta tacatcctca gagctgaccc acgacctagc tttctggtgt 60
gactcggggt gggggctccc actggtcacc tggtgacccc catcgcagtg agttccgccc 120
caaggggaag cccagcctat agcaggctgg ggtggggtgt gtgcggaggg aggtgggaga 180
ggcgtggaac tagagaccct ccaccttcat gtagaactag gggaacaacc ttaggttcca 240
agccccaagt ccctatgttt ccaccccttt ctaaggacag gcgtggagga gcggctgggg 300
ctggcgggct tgtcgggatc tcagctccct gagccctcct cctgccacgg gcctgctccc 360
ctccttctct catgggggtc tgctgtagcc tcgggaagga ggcaggaaac ctccaaataa 420
aatgacaagg cacgatttgc tccccctact cagtaggcat tggagcggtg agtttgcatt 480
tccaaggcac aaggttatcc taaatactag agttgccggg ctcccagctc agccccaaga 540
attctcccct cctcgcaggg agaagccacc gcctggcccc ctcatcttag acgcaccaag 600
tccggcgcag aggaagggag gggacacgcg gagcaggcca ggctttcagg aggcaccgga 660
atctcctagt cctggctcgc acggctcggg caagcctcga gatccggcga ccccaaacca 720
ctccctgggt ccccgccgga ggctggccca gggcggtccc acagccgcgc gcctcacgcg 780
cagttgccca tggccttgac caaggagctc tctggcagct ggcggaagat gccccgcagc 840
gtgtccagtt cgcggctcag ctgttccacc cgcttgcgca ggcggtcatt gtcactggtc 900
agctccagca ccttctgctg cgtctccacg ttgcgctgct tggccttgtc gcggctcttg 960
cgcaccgcga tgttgttgcg ctcgcgccgc acccggtact cgttgctgtt cttgtccacc 1020
gacttcttgg ccttgcccgc gccgctgccg ccactcgcgc ggaggtcggg gtgcgcggcg 1080
cccagcccct tgagcgcgct gccagggccc ggcaggccgg cggcaccgag cgcgggcgcg 1140
gggtgcgggc tgggcacggg cgtgggcggc ggcgtggggt gaccgggctg caggtgcatg 1200
gtggtctggc cgcagtgcgc gatctggaac tgcaggtgcg gggcggccag gtgcgcgggc 1260
ggcgggtgcg ggtgcgggtg cgagggcggc ggcggcggcg gcggctggta agggaagagg 1320
ccggccagcg ccagctgctt ggcttcatcc tcctcgcggg gctcctgctt gatcaccagc 1380
ggccgcagcg ccggcgcccc gacgcgctcg tacaggggct ccagcctgcc gtccaggtag 1440
ccggcggccg cgcagccgta gccgggcggg ggcccgtgcg ctcccccggg catgacggcg 1500
ccgccggggc ccgcgggcgc gcccgggtag tcaaagtcgc cgccgccgcc gccgcccgtg 1560
gggcccacgg ccgccttggc cttctcctgc tgccggctgt gctggaacag gtcggccagg 1620
aactcgtcgt tgaaggcggc cgggtcgatg taggcgctga tgtcgatgga cgtctcgtgc 1680
tcgcagatgc cgcccagcgg ctccggggcg gcaggtgggg cgggaggctg cgcggggccc 1740
gcgccccggg gaaagccgaa ggcggcgctg ctgggcgcgt gcggggggct ctgcaggtgg 1800
ctgctcatcg ggggccgcgg ctccgcctcg tagaagtcgg ccgactccat gggggagtta 1860
gagttctccc ggcatggcga gcctcggcgg cctccagcct gcgcggggcg tcgccgccgc 1920
ccacccggag accctgctcg cccgcgcccg cgcacctccg ggtcgcgaat ggcccggccc 1980
gcgccggccc agcttttata cccggcaggc cgcgtcgccc cctagagtcc gaggcggcct 2040
ctgtccccgg gctgcggcgg cgcggcgcct gctgggtcct agcgcgcggc cggcatgggg 2100
cggcgaacca gcgcggcaca gcgccgcgct ccccaggcag gccgcggcgc aacgcccacc 2160
gcctccagcg cgcccagcag agccgcggcg ctcgctccaa gctccgcccc cggcccggcc 2220
gtcgcccccg cgcccacgtg gtcggtagcg ggggccccct cctcctgcct gccctaggcg 2280
cccgtatcca gccacggccg ggagcccagg agtatcccga ggctgcacgg ggtaggggtg 2340
gggggcggag ggcgagtctt ggtcttgagc tgctggggcg cggattctct ttcaaagcca 2400
gaaccaggcc tgtcccggac ccgcgtcccg gggaggctgc agcgcagagc agcggggctg 2460
gggccggtgg ggggccgttt gggacgcgcg gagaggtcct gagcgcggtg gctctgcgtc 2520
tcctagctct gatctccagg ctacccctgt gattccgcgc agaggtacct ctcggaggac 2580
gccggggtcc catgggcggc gccgcgcagg gcgctaggac cccgcgggga gcggaggcgg 2640
cctcggcccg ggagcctgga ggacctggcc ggtcgatccg cccgggctgg aaaactttct 2700
ttataattac ttctccaggt cggagcgcgc ggcttgctag gcgcgcgggg ccggcgctgt 2760
tacccggcgt ggagtcgccg attttttttc ctgcgggacc gcggggcccc ccagactagc 2820
ggagctggac gccggggcga gcacggggag gggcgcaccg agggaggaga caaacttaac 2880
tctggggccg ggattccgag gcgggggccg cagccctcga ggcccgaagc caccgcttcc 2940
tcccccgcct ccccattcag gtgggcgcca acggcgggag cgagggtgtc caggccgccg 3000
ggctgccagg tccgagcacg cacagggaga actctgccca gtggttcgcc gggcgctgta 3060
gtccccggga tcctagggac cgaggcggcc aggccctggg gccccttgag tgcggcagct 3120
aatgctctca ccgcggcggg ggaaggagct tgccaccgag acccccagcc acgtgcgtcc 3180
ctcgcattct ttaccggggc cggggtggcg gctacggacc gtcagctggg cccagatgga 3240
gtcttgggag ccctcaagtg tctcctgtcc ttgcccgcgc cgcccctcgc cactggcgct 3300
gaggcctgac gccgcctgcg tcccggctag aggcgcgctt gcctacaggt gagggaagac 3360
ccccttcacc gacagtggcc ttaggcctgg caaggcgcca cgacccgccc aggagccccg 3420
gagggggcac agctaaaaac accgctggag agccccgagc ttccacgacg atcgcagtaa 3480
agaagcagtt tcatctgggc aacgcacact gcgctttaat caagttccta ttcaacatag 3540
tcccagtgat taatagccca actgcttcgt tttcggtcca gagctcataa acaagatatt 3600
tttagcttga cgcttttgga cgggagggag taaaaaccag atacgttaaa taaatatccc 3660
gatgtgagcc ggagagctgc ttgctgagcc aaatgcagga cccattcata tagcattcac 3720
ctgtggaggg agacctggac ggaaatcaaa aagcaccaag agcgatttgc gtttttttct 3780
gcggtgctaa aactaatggc ttttcctacc taggaacaaa gaaacgccac tgtacatgca 3840
cggttcccgg cctgtggagt tgtgggagga aggcgatgtc tggccttttt tgcacagctg 3900
ctgttgcctg cccagagatc gggaactctg ccccgtagga ctggaagaaa cctcagtaat 3960
gggaataaga ctttgtccaa tagggggctg atgaatgtgt g 4001
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 78
cuuacgcuga guacuucgau u 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(16)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 79
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(5)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(10)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 80
ggaucaucuc aagucuuact t 21
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 81
ucuacuguca cucaguaguu u 21
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 82
ucgaaguacu cagcguaagu u 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 83
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(9)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (17)..(19)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 84
guaagacuug agaugaucct t 21
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 85
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 86
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 87
ugaaaggauu cauccuccuu u 21
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 88
aggaggauga auccuuucau u 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 89
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 90
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(8)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 91
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (11)..(11)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 92
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 93
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 94
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 95
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 95
acuacugagu gacaguagau u 21
<210> 96
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 96
ucuacuguca cucaguaguu u 21
<210> 97
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 97
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 98
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 99
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基修饰
<400> 99
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基修饰
<400> 100
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 101
gcggucauac acacuggucu u 21
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 102
gaccagugug uaugaccgcu u 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(8)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 103
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 104
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(16)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 105
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 106
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基修饰
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(2)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
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gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 108
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 109
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 109
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基修饰
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(2)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 110
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 111
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(23)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
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cuuacgcuga guacuucgas usu 23
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(16)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 112
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (5)..(6)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (8)..(11)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(18)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 113
ggaucaucuc aagucuuact t 21
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 114
ucuacuguca cucaguaguu u 21
<210> 115
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(23)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 115
ucgaaguacu cagcguaags usu 23
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 116
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (8)..(10)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (18)..(19)
<223> 2'F修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 117
guaagacuug agaugaucct t 21
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 118
cggucauugu cacuggucau u 21
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 119
ugaccaguga caaugaccgu u 21
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 120
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 121
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 122
ugaaaggauu cauccuccuu u 21
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 123
aggaggauga auccuuucau u 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 124
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: Synthetic
oligonucleotide
<400> 125
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(8)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 126
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>
<222>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (11)..(11)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸键
<400> 127
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<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基修饰
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(2)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 128
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe修饰的核苷酸
<400> 129
gaccagugac aaugaccgcu u 21

Claims (10)

1.上调C/EBPα基因表达的分离的合成性saRNA，其中saRNA至少80％互补于SEQ IDNo.77上的区域，并且其中saRNA具有14-30个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的saRNA，其中saRNA为单链。
3.根据权利要求2所述的saRNA，其中saRNA包含3’突出端。
4.根据权利要求2所述的saRNA，其中saRNA是经修饰的。
5.根据权利要求4所述的saRNA，其中saRNA包含至少2个修饰。
6.根据权利要求4所述的saRNA，其中所述修饰包括2’-F、2’-OMe、反转脱氧核糖或核苷酸间硫代磷酸酯键的任一种。
7.根据权利要求2所述的saRNA，其中所述saRNA包含选自SEQ ID No.35、37、39、41、43、45、47、49、93(AW51)和109(CEBPA51)的序列。
8.根据权利要求1所述的saRNA，其中所述saRNA为双链并且包含反义链和有义链。
9.根据权利要求5所述的saRNA，其中所述反义链包含选自SEQ ID No.35、37、39、41、43、45、47、49、93(AW51)和109(CEBPA51)的序列。
10.根据权利要求6所述的saRNA，其中所述有义链包含选自SEQ ID No.34、36、38、40、42、44、48、94和110的序列。
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