PT1003783E

PT1003783E - Medicamentos reguladores de lipoproteínas

Info

Publication number: PT1003783E
Application number: PT98936610T
Authority: PT
Inventors: Lydie Bougueleret; Bernard Bihain; Frances Yen-Potin
Original assignee: Serono Genetics Inst Sa
Priority date: 1997-08-06
Filing date: 1998-08-06
Publication date: 2007-12-06
Also published as: JP3726969B2; EP1375516A2; EP1903057A2; CA2274302A1; EP1375516A3; FR2767135A1; EP0964870A2; ATE378354T1; US7220722B2; WO1999007737A2; DK1003783T3; PT964870E; EP1903057B1; US20080249009A1; CA2298849A1; JP2005143508A; JP2001512746A; WO1999007736A3; US20110165166A1; US6635431B1

Description

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DESCRIÇÃO "MEDICAMENTOS REGULADORES DE LIPOPROTEÍNAS" Área da Invenção A presente invenção refere-se a medicamentos que são úteis para modular níveis de lipoproteínas in vivo. Mais particularmente, a invenção refere-se a medicamentos que modificam a actividade do Receptor Estimulado pela Lipólise (LSR) e que podem ser utilizados para influenciar a partição de lípidos dietéticos entre o fígado e tecidos periféricos, incluindo tecido adiposo.

Contexto da Invenção A obesidade é um problema de saúde pública grave e disseminado. Um terço da população de países industrializados tem um excesso de peso de pelo menos 20% relativamente ao peso ideal. O fenómeno continua a piorar, particularmente em regiões do globo onde as economias se estão a modernizar. Nos Estados Unidos, o número de pessoas obesas aumentou em escalada desde 25% no final da década de 1970 até 33% no início da década de 1990. A obesidade aumenta consideravelmente o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares ou metabólicas. Estima-se que, se toda a população tivesse o peso ideal, o risco de insuficiência coronária diminuiria em 25% e o de insuficiência cardíaca e de acidentes vasculares cerebrais em 35%. Insuficiência coronária, doença ateromatosa e insuficiência cardíaca são as principais complicações cardiovasculares induzidas por obesidade. Para um excesso de peso superior a 30%, a incidência de doenças coronárias duplica em sujeitos com menos de 50 anos de idade. Estudos 2 realizados para outras doenças são igualmente eloquentes. Para um excesso de peso de 20%, o risco de pressão sanguínea elevada duplica. Para um excesso de peso de 30%, o risco de desenvolvimento de diabetes não dependente de insulina triplica. O de hiperlipidemias sextuplica. É longa a lista de doenças cujo aparecimento é promovido pela obesidade: hiperuricemia (11,4% em sujeitos obesos contra 3,4% na população geral), patologias digestivas, anormalidades em funções hepáticas e mesmo certos cancros.

Quer as alterações fisiológicas em obesidade sejam caracterizadas por um aumento do número de células adiposas ou por um aumento da quantidade de triglicéridos armazenados em cada célula adiposa, ou por ambos, este excesso de peso resulta maioritariamente de um desequilíbrio entre a quantidade de calorias consumidas e a quantidade de calorias utilizadas pelo corpo. Estudos das causas deste desequilíbrio têm decorrido em várias direcções. Alguns centraram-se no estudo do mecanismo da absorção de alimentos e, em consequência, das moléculas que controlam a ingestão de alimentos e a sensação de saciedade. Outros estudos caracterizaram as vias pelas quais o corpo utiliza as suas calorias.

Os tratamentos propostos para obesidade são de quatro tipos. A restrição de alimentos é o mais frequentemente utilizado. Os indivíduos obesos são aconselhados a alterar os seus hábitos dietéticos de modo a consumirem menos calorias. Este tipo de tratamento é eficaz a curto prazo. No entanto, a taxa de recidiva é muito elevada. Também é proposto o aumento do gasto de calorias através de 3 exercício físico. Este tratamento é ineficaz quando aplicado isoladamente; todavia, aumenta a perda de peso em sujeitos submetidos a uma dieta pobre em calorias. A cirurgia gastrointestinal, que reduz a absorção das calorias ingeridas, é eficaz, mas foi virtualmente abandonada devido aos efeitos secundários que provoca. A abordagem medicinal utiliza a acção anorexigénica de moléculas envolvidas ao nível do sistema nervoso central ou o efeito de moléculas que aumentam o gasto de energia ao aumentar a produção de calor. Os protótipos deste tipo de moléculas são as hormonas da tiróide, que desacoplam fosforilações oxidativas da cadeia respiratória mitocondrial. Os efeitos secundários e a toxicidade deste tipo de tratamento tornam perigosa a sua utilização. Também é contemplada uma abordagem que pretende reduzir a absorção de lípidos dietéticos ao sequestrá-los no lúmen do tubo digestivo. No entanto, induz desequilíbrios fisiológicos difíceis de tolerar: deficiência da absorção de vitaminas solúveis em gorduras, flatulência e esteatorreia. Qualquer que seja a abordagem terapêutica considerada, todos os tratamentos de obesidade são caracterizados por uma taxa de recidiva extremamente elevada.

Os mecanismos moleculares responsáveis por obesidade no homem são complexos e envolvem factores genéticos e ambientais. Devido à baixa eficiência dos tratamentos conhecidos até à data, é urgente definir os mecanismos genéticos que determinam a obesidade de modo a ser possível desenvolver medicamentos melhor dirigidos.

Foram estudados mais de 20 genes como possíveis candidatos, quer porque foram implicados em doenças nas quais a obesidade é uma das manifestações clínicas quer 4 porque são homólogos de genes envolvidos em obesidade em modelos animais. Situado na região do cromossoma 7q31, o gene OB é um dos mais amplamente estudados. 0 seu produto, leptina, está envolvido nos mecanismos da saciedade. A leptina é uma proteína do plasma de 16 kDa produzida pelos adipócitos sob acção de vários estímulos. Ratinhos obesos do tipo ob/ob exibem uma deficiência no gene da leptina; esta proteína não é detectável no plasma destes animais. A administração de leptina, obtida por manipulação genética, a ratinhos ob/ob corrige a sua hiperfagia relativa e permite a normalização do seu peso. Este efeito anorexigénico da leptina faz entrar em acção um receptor do sistema nervoso central: o receptor ob, que pertence à família dos receptores de citoquinas de classe 1. Ratinhos obesos da estirpe db/db são deficientes no receptor ob. A administração de leptina a estes ratinhos não tem nenhum efeito na sua ingestão de alimentos e não permite reduzir substancialmente o seu peso. Não se conhecem de forma precisa os mecanismos pelos quais os receptores ob transmitem o sinal de saciedade. É possível que o neuropéptido Y esteja envolvido nesta via de sinalização. Nesta fase é importante especificar que os receptores ob não são os únicos reguladores do apetite. 0 receptor da Melanocortina 4 também está envolvido, uma vez que ratinhos tornados deficientes neste receptor são obesos (Gura, Science 275: 751 (1997)) . A descoberta da leptina e a caracterização do receptor da leptina ao nível do sistema nervoso central abriram uma nova via para a pesquisa de medicamentos contra a obesidade. Contudo, este modelo tornou-se rapidamente numa desilusão. De facto, apenas com uma excepção (Montague et al., Nature 387: 903 (1997)), foi mostrado que os genes que 5 codificam a leptina ou o seu receptor ob estão normais em sujeitos humanos obesos. Além disso e de forma paradoxal, as concentrações no plasma da leptina, a hormona da saciedade, são anormalmente elevadas na maior parte dos sujeitos humanos obesos.

Relativamente à presente invenção também podem citar-se os seguintes documentos. 0 documento Mann et al. (Circulation R4 (8), suplemento, 1-698, 1996), que revela a proteína denominada ApoClll e a sua propriedade de inibir a ligação de lipoproteínas ricas em triglicéridos ao LSR. - 0 documento Troussard et al. (Journal of Biological Chemistry 270 (29), 17068-17071, 1995), que se refere a um estudo que mostra que a proteína associada a receptores (RAP) é capaz de exercer um efeito inibidor importante no LSR. - O documento da candidatura de patente publicado com o número WO 99/04000, que revela o polipéptido denominado zsig37 e respectivo polipéptido homólogo, como Clq, sendo citado que exerce um papel nas defesas do hospedeiro contra infecções. O documento Ghebrehiwet et al. (Journal of Experimental Medicine 179, 1809-1821, 1994), que revela ensaios de ligação envolvendo Clq e o seu receptor. - O documento da candidatura de patente publicado com o número WO 96/39429, que se refere a DNA que codifica Acrp30 e à utilização de inibidor ou intensificador de Acrp30 para 6 a regulação do equilíbrio de energia de um mamífero, ou à utilização de Acrp30 para modular a produção de insulina num mamífero.

Claramente, continuam a ser necessários novos medicamentos que sejam úteis para reduzir o peso do corpo em humanos. Tal composição farmacêutica ajudará vantajosamente a controlar a obesidade e, desse modo, atenuará muitas das consequências cardiovasculares associadas a este estado. A presente invenção revela um agente que influencia a partição de lípidos dietéticos entre o fígado e tecidos periféricos para utilização como medicamento. Este agente pode ser utilizado para tratar um estado em que seja desejável aumentar a partição de lípidos dietéticos para o fígado, reduzindo a ingestão de alimentos em indivíduos obesos, reduzindo os níveis de ácidos gordos livres em indivíduos obesos, diminuindo o peso do corpo de indivíduos obesos ou tratando um estado relacionado com obesidade seleccionado do grupo que consiste em aterosclerose relacionada com obesidade, resistência à insulina relacionada com obesidade, hipertensão relacionada com obesidade, lesões microangiopáticas resultantes de diabetes de Tipo II relacionada com obesidade, lesões oculares causadas por microangiopatia em indivíduos obesos com diabetes de Tipo II e lesões renais causadas por microangiopatia em indivíduos obesos com diabetes de Tipo II. 0 agente que influencia a partição de lípidos dietéticos entre o fígado e tecidos periféricos é qualquer um de entre: análogos de AdipoQ, homólogos de AdipoQ, derivados de AdipoQ ou fragmentos de qualquer um dos 7 agentes precedentes, ou inclui um antagonista do LSR ou um agonista do LSR. A invenção refere-se a um composto que activa o LSR para o fabrico de um medicamento destinado a tratar ou prevenir uma doença ou perturbação relacionada com obesidade, em que o referido composto compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com uma das sequências das ID SEQ NOs: 7-10 e 14.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com a presente invenção no fabrico de um medicamento para tratar um estado em que a partição de lipidos para o figado é anormal. Numa especificação, este medicamento pode ser utilizado para reduzir a ingestão de alimentos em indivíduos obesos, reduzir os níveis de ácidos gordos livres em indivíduos obesos, diminuir o peso do corpo de indivíduos obesos ou tratar ou prevenir uma doença ou perturbação relacionada com obesidade seleccionada do grupo que consiste em aterosclerose relacionada com obesidade, resistência à insulina relacionada com obesidade, hipertensão relacionada com obesidade, lesões microangiopáticas resultantes de diabetes de Tipo II relacionada com obesidade, lesões oculares causadas por microangiopatia em indivíduos obesos com diabetes de Tipo II e lesões renais causadas por microangiopatia em indivíduos obesos com diabetes de Tipo II. Numa especificação preferida, a invenção é dirigida à utilização de acordo com a invenção em que o referido composto inclui um polipéptido que pode ser Clq, cerebelina ou multimerina. 8

Ainda outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica que também compreende um transportador farmaceuticamente aceitável.

Noutro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de identificação de um composto candidato para modular uma actividade do Receptor Estimulado pela Lipólise, que compreende: a) contactar o referido Receptor Estimulado pela Lipólise com uma ou mais moléculas de teste na presença de um composto que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência seleccionada do grupo que consiste na ID SEQ NO: 7, ID SEQ NO: 8, ID SEQ NO: 9, ID SEQ NO: 10, ID SEQ NO: 11, ID SEQ NO: 12, ID SEQ NO: 13 e ID SEQ NO: 14, e b) determinar se a referida uma ou mais moléculas de teste modulam a interacção do referido composto com o referido Receptor Estimulado pela Lipólise, em que a modulação dessa interacção identifica um referido composto candidato.

Numa especificação preferida, o método de identificação de um composto candidato de acordo com a presente invenção é caracterizado por a referida uma ou mais moléculas de teste serem seleccionadas do grupo que consiste em péptidos, fármacos e moléculas pequenas.

Descrição Breve das Figuras A Figura 1 é um gráfico que mostra o efeito inibidor de anticorpos dirigidos contra péptidos sintéticos que representam as regiões do terminal amino e terminal carboxi da proteína gClq-R. Mediu-se a ligação induzida por oleato 125 9 de I-LDL a membranas do plasma de hepatócitos de rato na presença de concentrações crescentes de anticorpos dirigidos contra um péptido amino-terminal de gClq-R (), anticorpos dirigidos contra um péptido carboxi-terminal de gClq-R (o) ou um anticorpo de controlo negativo (□).

As Figuras 2A-2C mostram gráficos que representam diferentes aspectos da actividade do LSR. Os gráficos mostram resultados de (A) ligação, (B) interiorização e (C) degradação de LDL etiquetada, uma lipoproteina modelo, na presença e ausência de oleato para concentrações crescentes de Clq. Os valores do eixo vertical estão apresentados em ng de I-LDL por mg de proteína celular ligada, interiorizada e degradada por placa na presença () ou ausência (□) de oleato. A Figura 3 mostra um alinhamento de várias proteínas que são análogas à Clq. Os domínios globulares de proteínas pertencentes à família do complemento Clq foram alinhados utilizando ClustalW. As várias sequências alinhadas são as seguintes.

Clqa-117: Sequência proteica do complemento Clq A (referência da Swiss Prot: P02745) desde o aminoácido na posição 117 (ID SEQ NO: 7).

Clqb-122: Sequência proteica do complemento Clq B (referência da Swiss Prot: P02746) desde o aminoácido na posição 122 (ID SEQ NO: 8) .

Clqc-121: Sequência proteica do complemento Clq C (referência da Swiss Prot: P02747) desde o aminoácido na posição 121 (ID SEQ NO: 9). mul-1160: Sequência proteica traduzida da sequência nucleica da multimerina (GenBank, Acesso: U27109) desde o aminoácido 1160 (ID SEQ NO: 14). 10 cer-64: Sequência proteica traduzida da sequência nucleica da cerebelina (GenBank, Acesso: M58583) desde o aminoácido 64 (ID SEQ NO: 10) . apml-115: Sequência proteica traduzida da sequência nucleica da ApMl (GenBank, Acesso: D45371) desde o aminoácido 115 (ID SEQ NO: 11) . adQ-118: Sequência proteica traduzida da sequência nucleica da AdipoQ (GenBank, Acesso: U49915) desde o aminoácido 118 (ID SEQ NO: 12) . acrp-118: Sequência proteica traduzida da sequência nucleica da acrp30 (GenBank, Acesso: U37222) desde o aminoácido 118 (ID SEQ NO: 13) .

As sequências contidas em caixas mostram as duas porções do alinhamento correspondentes à assinatura de Clq, a primeira correspondente ao consenso depositado na base de dados Prosite (PDOC00857) : F-x (5)-[N/D]-x(4)-[F/Y/W/L]-x(6)-F-x (5)-G-x-Y-x-F-x-[F/Y] (ID SEQ NO: 1), a segunda na extremidade COOH das proteínas é: [S/T]-x-F-[S/T]-G-[F/Y]-L-[L/V]-[F/Y] (ID SEQ NO: 2). Nestas sequências, os parênteses rectos ([]) encerram aminoácidos alternativos que podem ocupar uma posição e os números indicam o número de iterações de um aminoácido não especificado. As setas (V) acima dos alinhamentos marcam as posições dos resíduos cisteína conservados nas três formas de Clq mas não nas outras proteínas alinhadas. Os símbolos (*) colocados sob os alinhamentos indicam os aminoácidos conservados, os símbolos (.) indicam as substituições conservativas de aminoácidos.

As Figuras 4A-4C mostram gráficos de barras que representam diferentes aspectos da actividade do LSR. Os gráficos mostram resultados de (A) ligação, (B) captação ou mteriorização e (C) degradação de I-LDL por hepatócitos 11 cultivados. As barras a branco representam a diferença entre os valores obtidos após incubação com e sem oleato 0,6 mM na ausência de AdipoQ. As barras a preto mostram os mesmos parâmetros em amostras incubadas com 25 ng de AdipoQ. A Figura 5 é um gráfico que mostra a resposta lipémica pós-prandial em ratos injectados com AdipoQ.

As Figuras 6A-6B são gráficos de barras que representam resultados obtidos após infusão de AdipoQ em ratos. Os gráficos mostram resultados de (A) perda de peso e (B) niveis de triglicéridos no plasma.

As Figuras 7A-7B são gráficos de barras que representam a ingestão diária de alimentos para (A) ratinhos ob/ob e (B) ratinhos db/db que consistiram em controlos ou aos quais foi administrado AdipoQ.

Resumo

Aqui revelamos composições e métodos úteis para modular a actividade do "Receptor Estimulado pela Lipólise" (LSR). Como pormenorizado abaixo, a capacidade para modular a actividade do LSR proporciona um meio para intervir em patologias que envolvam anormalidades no metabolismo de lipidos. Mais particularmente, descobrimos uma familia de compostos que podem ser incorporados em medicamentos que, quando administrados in vitro ou in vivo, aumentam vantajosamente a actividade do LSR. Em consequência, as lipoproteinas são eficientemente ligadas, interiorizadas e degradadas por hepatócitos. 12

Quando utilizados desta forma, compostos que aumentam a actividade do LSR, particularmente aqueles que aumentam a actividade do receptor, podem promover perda de peso. Em contraste com compostos activadores do LSR, agentes que inibem a actividade do LSR podem ser utilizados para promover o armazenamento de lipidos em tecido adiposo, porque a degradação de lipoproteínas pelo fígado será reduzida. As composições e métodos inventados são úteis para tratar estados que incluem: obesidade e anorexia, hiperlipidemias, aterosclerose, diabetes, hipertensão e, mais geralmente, as várias patologias associadas a anormalidades do metabolismo de citoquinas.

Introdução A presente invenção revela métodos e composições que são úteis para regular a actividade de um receptor de múltiplas subunidades denominado LSR. 0 LSR é expresso na superfície de células hepáticas e liga-se a lipoproteínas na presença de ácidos gordos livres. Na ausência de ácidos gordos livres, o LSR pode ligar-se a uma citoquina, preferivelmente leptina. É importante notar que o LSR também é capaz de se ligar à gClq-R (Ghebrehiwet et al. J. Exp. Med. 179: 1809 (1994)) ou a um receptor do tipo gClq-R. Os habitualmente experimentados na área compreenderão que o gClq-R é um receptor de Clq, uma proteína que é um componente-chave do sistema do complemento e que também se sabe que activa a fagocitose por macrófagos.

Em resumo, o LSR inclui pelo menos uma subunidade α e uma β, preferivelmente uma subunidade α e três β. Ambas as subunidades α e β são os produtos de tradução de duas espécies de mRNA que resultam do processamento alternativo 13 de um RNA precursor comum. Crê-se que uma subunidade a' (alfa pelica), que é uma proteína membranar integral tal como a subunidade α e é codificada por um terceiro mRNA processado de forma alternativa, é um constituinte do LSR em alternativa à subunidade α. A inclusão suplementar de uma subunidade γ, que pode ser gClq-R ou uma proteína receptora do tipo gClq-R, no LSR forma o "complexo de LSR". Postulamos que gClq-R ou a proteína do tipo gClq-R é um "chaperon" molecular que se associa ao LSR.

Cremos que agentes que modificam a estrutura do complexo de LSR ao perturbar a interacção da subunidade γ no LSR activam eficazmente o LSR na ausência de ácidos gordos livres. Pode medir-se o efeito desta perturbação na forma de ligação, interiorização e degradação acrescidas de lipoproteínas por hepatócitos. Quando lípidos são degradados em células do fígado, ficam disponíveis menos lípidos para captação e armazenamento por tecido adiposo.

Definições

Tal como são aqui utilizados, os termos "LSR" e "receptor LSR" referem-se à combinação das subunidades α ou a' e β que constituem um receptor maioritariamente expresso na superfície de hepatócitos e que pode ligar-se e facilitar a interiorização e degradação de lipoproteínas por hepatócitos.

Tal como é aqui utilizado, "complexo de LSR" refere-se a um receptor LSR que também inclui uma subunidade γ.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo polipéptido designa uma proteína ou péptido. 14

Entender-se-á que polipéptido equivalente designa um polipéptido que tem pelo menos uma das actividades de um polipéptido em questão. Assim, por exemplo, se um polipéptido em questão for capaz de inibir a ligação de uma subunidade γ ao LSR para formar um complexo de LSR, então, neste contexto, um polipéptido equivalente será um polipéptido que consegue inibir, de modo semelhante, a ligação da subunidade γ ao LSR.

Entender-se-á que polipéptidos homólogos significam polipéptidos que exibem certas modificações quando comparados com o polipéptido natural. Estas modificações incluem uma deleção, truncamento, extensão, fusão quimérica e/ou mutação, em particular uma mutação pontual. Entre os polipéptidos homólogos são preferidos aqueles em que a sequência de aminoácidos exibe pelo menos 80%, preferivelmente 90% de homologia com as sequências de aminoácidos dos polipéptidos de acordo com a invenção.

Entender-se-á que polipéptido derivado (ou proteína derivada) designa todos os polipéptidos mutados que possam existir, incluindo truncamentos, deleções e/ou adições de resíduos de aminoácidos (incluindo aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos modificados e invulgares, como os listados na Tabela 4 de WIPO Standard ST.25 (1998), e aminoácidos de ocorrência não natural), substituições ou mutações, em particular mutações pontuais, independentemente de ocorrerem naturalmente ou de terem sido produzidas artificialmente. Podem criar-se derivados gerados artificialmente utilizando uma variedade de técnicas, incluindo mutagénese de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos, síntese química ou modificação química. 15

Tal como são aqui utilizados, os termos "obesidade" e "relacionado com obesidade" referem-se a indivíduos com uma massa corporal mensuravelmente superior ao ideal para a sua altura e estatura. Preferivelmente, estes termos referem-se a indivíduos cujos valores do índice de massa corporal são superiores a 10, mais preferivelmente com valores do índice de massa corporal superiores a 20 e muito preferivelmente com valores do índice de massa corporal superiores a 35.

Entende-se que fragmento polipeptídico designa um polipéptido ou um péptido que compreende pelo menos 5, pelo menos 7, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 30 ou mais de 30 aminoácidos consecutivos do polipéptido de onde deriva. Entender-se-á que um fragmento polipeptídico pode ser obtido de um polipéptido derivado.

Entender-se-á que fragmentos biologicamente activos de um polipéptido designam uma porção de um polipéptido maior cuja porção retém uma actividade característica do polipéptido maior e em que a actividade é mensurável em qualquer sistema biológico. Por exemplo, um fragmento polipeptídico é considerado "biologicamente activo" se exibir uma alteração da actividade estatisticamente significativa em qualquer um dos ensaios descritos nos Exemplos 1, 2, 6, 7, 8, 9 ou 10. Assim, por exemplo, se uma proteína modificar de modo característico a interacção entre a subunidade γ e o receptor LSR, então um fragmento biologicamente activo dessa proteína será uma porção da proteína que retém a capacidade para modificar essa interacção.

Entende-se que um polinucleótido, sequência nucleica ou ácido nucleico designa uma molécula de DNA e/ou RNA natural 16 ou sintética e isolada que pode incluir nucleótidos não naturais.

Entende-se que sequências polinucleotídicas equivalentes designam sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos de acordo com a invenção, tomando em consideração a degenerescência do código genético, as sequências de DNA complementares e as correspondentes sequências de RNA, bem como sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos equivalentes.

Entende-se que sequências nucleicas homólogas designam as sequências nucleicas que codificam os polipéptidos homólogos e/ou as sequências nucleicas que exibem um nível de homologia de pelo menos 80%, preferivelmente 90%. De acordo com a invenção, a homologia é somente do tipo estatístico, significa que as sequências têm um mínimo de 80%, preferivelmente 90% de nucleótidos em comum.

Entender-se-á que variantes de alelos ou alélicas designam as sequências mutadas naturais correspondentes a polimorfismos presentes em seres humanos e, em particular, a polimorfismos que podem conduzir ao aparecimento e/ou ao desenvolvimento de obesidade ou anorexia. Estes polimorfismos também podem conduzir ao início e/ou ao desenvolvimento de riscos ou complicações associadas a obesidade, em particular ao nível cardiovascular, e/ou de patologias associadas a anormalidades do metabolismo de citoquinas.

Entende-se que sequências nucleicas mutadas designam as sequências nucleicas que compreendem pelo menos uma mutação pontual em comparação com a sequência normal. 17

Se bem que as sequências de acordo com a invenção sejam, em geral, sequências de tipo selvagem, também são sequências mutadas, pois compreendem pelo menos uma mutação pontual e, preferivelmente, no máximo 10% de mutações em comparação com a sequência de tipo selvagem.

Tal como foi referido aqui, métodos e medicamentos da invenção podem ser utilizados para tratar animais, incluindo pássaros, peixes e mamíferos. Deve entender-se que a categoria de mamíferos inclui mamíferos tais como ratinhos, ratos, coelhos, mamíferos domesticados e seres humanos. Apesar dos métodos de tratamento poderem ser aplicados a mamíferos não humanos, claramente prevemos que humanos também poderão ser tratados utilizando os métodos e medicamentos aqui revelados.

Compostos Moduladores da Actividade do LSR

Utilizando os métodos revelados aqui identificaram-se compostos que modulam selectivamente a actividade do LSR in vitro e in vivo. Os compostos identificados incluem, por exemplo, anticorpos com especificidade de ligação para a proteína gClq-R, Clq e AdipoQ. Uma vez que é razoável esperar que a ApMl represente o homólogo humano da AdipoQ murina, como descrito abaixo, A ApMl será útil para modular a actividade do LSR e o metabolismo de lipoproteínas em humanos. Mais geralmente, espera-se que homólogos da Clq sejam úteis para modular a actividade do LSR e o metabolismo de lipoproteínas. No entanto, estes compostos não se limitam a qualquer estrutura química particular, sendo apenas definidos pela cascata de ensaios que permite, pela primeira vez, a identificação sistemática e racional de moduladores altamente potentes e selectivos do LSR específico de hepatócitos ao nível molecular. 18

Indicações Não pretendendo ficar restringido por nenhuma teoria de operação particular, crê-se que os compostos identificados pelos métodos revelados aqui se ligam à subunidade γ do complexo de LSR, onde o composto irá aumentar ou inibir a actividade do LSR. Assim, composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto identificado por este processo serão úteis para o tratamento de doenças caracterizadas por níveis elevados de triglicéridos em circulação ou por uma tendência indesejavelmente forte para a deposição de lípidos em tecido adiposo. Alternativamente, compostos que inibem a actividade do LSR serão úteis para favorecer a deposição de lípidos no tecido adiposo e/ou para diminuir a degradação de lípidos dietéticos pelo fígado.

Assim, em geral, as perturbações que podem ser tratadas com os compostos, composições, medicamentos e formulações farmacêuticas identificados por este processo da invenção referem-se genericamente a perturbações envolvendo o metabolismo de lípidos.

Formulações Farmacêuticas e Vias de Administração

Os compostos identificados podem ser administrados a um mamífero, incluindo um paciente humano, isoladamente ou em composições farmacêuticas, onde são misturados com transportador(es) ou excipiente(s) adequado(s) em doses terapeuticamente eficazes para tratar ou melhorar uma variedade de perturbações associadas ao metabolismo de lípidos. Uma dose terapeuticamente eficaz também se refere àquela quantidade do composto suficiente para melhorar os sintomas, como determinado pelos métodos descritos aqui. Assim, uma dosagem terapeuticamente eficaz de AdipoQ ou 19

ApMl será aquela dosagem do composto que é adequada para promover níveis reduzidos de triglicéridos após uma refeição rica em gorduras e que irá promover perda de peso por utilização ou administração periódica continuada. Técnicas de formulação e administração dos compostos da presente candidatura podem encontrar-se em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição.

Vias de Administração

Vias de administração adequadas incluem administração oral, rectal, transmucosa ou intestinal, distribuição parentérica, incluindo injecções intramusculares, subcutâneas, intramedulares, bem como injecções intratecais, intraventicular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal ou intra-ocular. Um método particularmente útil de administração dos compostos para promover perda de peso envolve implantação cirúrgica, por exemplo, na cavidade abdominal do receptor, de um dispositivo para distribuir o composto durante um período de tempo prolongado. São particularmente contempladas formulações de libertação prolongada dos medicamentos inventados.

Composição/Formulação

Composições farmacêuticas e medicamentos para utilização de acordo com a presente invenção podem ser formulados de modo convencional utilizando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares. A formulação apropriada depende da via de administração escolhida. 20

Alguns dos medicamentos descritos aqui incluirão um transportador farmaceuticamente aceitável e pelo menos um polipéptido que é homólogo à proteína Clq ou respectivo fragmento. Para além de medicamentos que incluem componentes proteicos homólogos aos homólogos da proteína Clq, também contemplamos que compostos não proteicos que interajam com a subunidade γ do complexo de LSR também sejam úteis como moduladores da actividade do LSR, in vitro e in vivo. Entre exemplos de homólogos da proteína Clq que serão úteis na modulação da actividade do LSR e/ou na estimulação de uma redução de lipoproteínas no plasma e/ou na promoção de perda de peso estão incluídas: as proteínas Clq (Clq A, Clq B e Clq C) , AdipoQ, ApMl, acrp 30, cerebelina e multimerina.

Para injecção, os agentes da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de soro fisiológico, como tampão de fosfato ou bicarbonato. Para administração transmucosa, utilizam-se na formulação penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na área.

Preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas duras feitas de gelatina, bem como cápsulas moles seladas feitas de gelatina e um plastificante, como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter os ingredientes activos em mistura com agentes de enchimento, como lactose, aglutinantes, como amidos, e/ou lubrificantes, como talco ou estearato de magnésio, e, opcionalmente, estabilizadores. Nas cápsulas moles, os compostos activos podem estar dissolvidos ou suspensos em 21 líquidos adequados, como óleos gordos, parafina líquida ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, podem adicionar-se estabilizadores. Todas as formulações destinadas para administração oral devem ser apresentadas em dosagens adequadas para essa administração.

Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de pastilhas ou rebuçados formulados de modo convencional.

Para administração por inalação, os compostos a serem utilizados de acordo com a presente invenção são convenientemente distribuídos na forma de uma apresentação de pulverização de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, utilizando um impulsor gasoso adequado, por exemplo, dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, pode determinar-se a unidade de dosagem fornecendo uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Podem formular-se cápsulas e cartuxos, por exemplo, de gelatina, para utilização num inalador ou insuflador, contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, como lactose ou amido.

Os compostos podem ser formulados para administração parentérica por injecção, por exemplo, por injecção de bolus ou infusão contínua. Formulações para injecção podem ser apresentadas em forma galénica unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes com múltiplas doses, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos aquosos e podem conter agentes de formulação, como agentes de suspensão, estabilizadores e/ou dispersantes. 22

Formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos em forma solúvel em água. Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose sódica, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos, para permitir preparar soluções altamente concentradas.

Alternativamente, o ingrediente activo pode estar em forma de pó ou liofilizada para constituição com um veiculo adequado, como água esterilizada sem pirogénios, antes da utilização.

Para além das formulações descritas previamente, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Essas formulações de actuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo, na forma de uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica, ou como derivados escassamente solúveis, por exemplo, como um sal escassamente solúvel.

Adicionalmente, os compostos podem ser distribuídos utilizando um sistema de libertação prolongada, como matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o agente terapêutico. Foram determinados vários materiais de libertação prolongada, que são bem conhecidos dos experimentados na área. Dependendo da sua natureza 23 química, cápsulas de libertação prolongada podem libertar os compostos desde um período de algumas semanas até mais de 100 dias.

Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, podem empregar-se estratégias adicionais para a estabilização de proteínas.

As composições farmacêuticas também podem compreender transportadores ou excipientes adequados sólidos ou em fase de gel. Exemplos desses transportadores ou excipientes incluem, mas não se limitam a estes, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros, como polietilenoglicóis.

Dosagem Eficaz

Composições farmacêuticas adequadas para utilização na presente invenção incluem composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade eficaz para atingir a sua finalidade pretendida. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade eficaz para prevenir o desenvolvimento ou para atenuar os sintomas existentes do sujeito a ser tratado. A determinação de quantidades eficazes pertence ao âmbito dos experimentados na área, especialmente à luz da revelação pormenorizada fornecida aqui.

Para qualquer composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura de células. Por exemplo, pode formular-se uma dose em modelos animais para obter uma gama de concentrações em circulação que inclua ou 24 abranja um valor ou gama de concentrações que se verificou aumentar ou inibir a actividade do LSR num sistema in vitro. Essa informação pode ser utilizada para determinar de modo mais rigoroso doses úteis em humanos.

Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquela quantidade do composto que melhora os sintomas de um paciente. Pode determinar-se a toxicidade e eficácia terapêutica desses compostos por procedimentos farmacêuticos comuns em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população de teste) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a razão entre LD50 e ED50. São preferidos compostos que exibam índices terapêuticos elevados.

Os dados obtidos destes ensaios de culturas de células e estudos em animais podem ser utilizados para formular uma gama de dosagens para utilização em humanos. A dosagem desses compostos situa-se preferivelmente numa gama de concentrações em circulação que inclui a ED50, com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar nesta gama, dependendo da forma galénica empregue e da via de administração utilizada. A formulação, via de administração e dosagem exactas podem ser escolhidas pelo médico individual considerando o estado do paciente (ver, por exemplo, Fingi et al.f 1975, em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Capítulo 1). A quantidade e o intervalo das dosagens podem ser ajustados individualmente para dar origem a níveis no 25 plasma do composto activo suficientes para manter os efeitos moduladores do LSR. As dosagens necessárias para obter os efeitos moduladores do LSR dependerão de características individuais e da via de administração.

Os intervalos de dosagem também podem ser determinados utilizando o valor da concentração mínima eficaz. Os compostos devem ser administrados utilizando um regime que mantenha os níveis no plasma acima da concentração mínima eficaz durante 10-90% do tempo, preferivelmente entre 30-90% e muito preferivelmente entre 50-90%. Nos casos de administração local ou captação selectiva, a concentração local eficaz do fármaco poderá não estar relacionada com a concentração no plasma.

Obviamente, a quantidade da composição administrada dependerá do sujeito a ser tratado, do peso do sujeito, da gravidade da perturbação, do modo de administração e da avaliação do médico que prescreve o tratamento.

Uma gama de dosagens preferida para a quantidade do polipéptido homólogo a Clq, como AdipoQ ou ApMl, que pode ser administrada diária ou regularmente para obter resultados desejados, incluindo uma redução dos níveis de triglicéridos e/ou lipoproteínas no plasma em circulação, varia entre 0,1 - 50 mg/kg de massa corporal. Uma gama de dosagens mais preferida situa-se entre 0,2 - 25 mg/kg. Uma gama de dosagens ainda mais preferida situa-se entre 1,0 -20 mg/kg, em que a gama de dosagens mais preferida se situa entre 2,0 - 10 mg/kg. Obviamente, estas dosagens diárias podem ser distribuídas ou administradas em pequenas quantidades periodicamente ao longo do dia. 26

Homologias de Proteínas

Deve entender-se que um polipéptido com um dado nível de homologia relativamente a uma proteína ou polipéptido em questão pode ser identificado utilizando programas de alinhamento e comparação de sequências facilmente disponíveis, como blastp, fasta e/ou ClustalW, e métodos que serão familiares aos habitualmente experimentados na área. Uma abordagem para identificar uma proteína que é homóloga a uma proteína em questão envolve correr um algoritmo padrão de comparação de sequências "blastp" (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Nesta abordagem, pode utilizar-se uma pontuação relativamente baixa no algoritmo de blastp para isolar um grande número de sequências potencialmente homólogas de diferentes comprimentos. Por exemplo, uma pontuação baixa pode ser da ordem de um valor entre cerca de 80 e cerca de 100 e pode resultar em alvos com níveis de homologia de cerca de 20%.

Se forem desejados níveis de homologia mais elevados podem realizar-se passos adicionais. Por exemplo, depois de identificada uma primeira série de sequências homólogas candidatas, seguidamente podem seleccionar-se sequências que sejam mais homólogas à proteína em questão. Nessa fase podem variar-se dois parâmetros. Em primeiro lugar, é possível "cortar" a proteína em questão em subsequências de interesse e depois efectuar pesquisas de homologia que refinem os resultados obtidos no passo inicial. Por exemplo, os fragmentos que estão listados como ID SEQ NO: 7-14 ou as sequências de consenso nas duas regiões encerradas em caixas apresentadas na Figura 3 podem ser seleccionadas com subsequências de interesse que podem ser utilizadas para efectuar pesquisas de homologia. Em segundo lugar, pode aumentar-se a pontuação utilizada ao correr o 27 algoritmo blastp. Por exemplo, ao aumentar a pontuação até um nível de cerca de 300, podem obter-se frequentemente níveis de homologia de cerca de 80%. Estes procedimentos podem ser efectuados utilizando programas computacionais facilmente acessíveis, tais como, por exemplo, "blastp" ou "fasta" (Altschul et ai., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Pearson, W. R., Genomics 11_: 635-650 (1991)).

Os habitualmente experimentados na área apreciarão que a pontuação acima referida que pode ser inserida no programa de comparação de sequências pode ser calculada com base no grau de homologia que se pretende. Fórmulas apresentadas nos pacotes citados de algoritmos computacionais permitem esta possibilidade. Em geral, uma pontuação crescente permite identificar alinhamentos de proteínas cada vez mais específicas caracterizadas por níveis elevados de homologia. Alinhamentos candidatos podem ser suplementarmente refinados utilizando alinhamentos de pares (fasta) ou múltiplos alinhamentos (ClustalW) (Higgins et ai., Computer Applications in the Biosciences (CABIOS) _8: 189-191 (1992), e Thompson et ai., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994)).

Apresenta-se na Tabela 1 uma ilustração da extensão da homologia de proteínas. Os resultados apresentados na tabela mostram vários níveis de homologia entre a ApMl e várias proteínas completas ou fragmentos dessas proteínas. Assim, por exemplo, a sequência da proteína completa Acrp 30 exibiu 81,8% de homologia relativamente à proteína ApMl, ao passo que o segmento da Acrp 30 identificado pela ID SEQ NO: 13 exibiu 91,5% de homologia relativamente à proteína ApMl. 28 TABELA 1

Homoloqias entre ApMl e Várias Proteínas

Proteína/ID SEQ NO: Proteína ID SEQ completa NOs: 7-14 Acrp 30/ID SEQ NO:13 81,8% 91,5% AdipoQ/ID SEQ NO:12 80,6% 90% Clqa/ID SEQ NO:7 81,8% 91,5% Clqb/ID SEQ NO:8 31,8% 36,7% Clqc/ID SEQ NO:9 38,8% 38% Multimerina/ID SEQ NO: 14 27,7% 28,8% Cerebelina/ID SEQ NO: 10 24,6% 28,3%

Para identificar uma proteína com um dado nível de homologia, como pelo menos 25% de homologia, pelo menos 50% de homologia ou pelo menos 80% de homologia relativamente a outra proteína, como AdipoQ, ApMl ou Clq, pode utilizar-se uma análise blastp padrão em que se dão instruções ao programa para recuperar proteínas com uma pontuação correspondente ao nível de homologia desejado. Por exemplo, para identificar proteínas com um nível de homologia de 20-30%, podem dar-se instruções ao programa para recuperar proteínas com uma pontuação entre cerca de 80 e cerca de 100. Para recuperar uma proteína com um nível de homologia de 80%, podem dar-se instruções ao programa para incluir proteínas com uma pontuação de cerca de 300. Será apreciado que estas pontuações podem ser calculadas ao longo de todo o comprimento da proteína em questão ou ao longo de uma porção da proteína, como as ID SEQ NOs: 7-14. Também será apreciado que se podem obter níveis de homologia diferentes dos aqui explicitamente enumerados utilizando as instruções fornecidas como parte do programa. Assim, a descrição anterior é adequada para permitir ao habitualmente experimentado na área identificar polipéptidos homólogos a uma proteína em questão, como a proteína ApMl humana, a 29 vários níveis de homologia. Nalguns casos poderão utilizar-se os parâmetros por defeito. LSR de Múltiplas Subunidades 0 LSR específico de hepatócitos é um receptor de múltiplas subunidades que tem actividade dual. Quando activado por ácidos gordos livres, o LSR permite a endocitose de lipoproteínas e, assim, é um componente da via metabólica para a eliminação de lipoproteínas. Esta via serve maioritariamente, mas não exclusivamente, para promover a eliminação de partículas com teor elevado de triglicéridos de origem intestinal (Mann et al., Biochemistry 3^4: 10421 (1995)). Esta actividade, muito particularmente expressa ao nível hepático, depende da presença de ácidos gordos livres que se ligam ao receptor, induzem uma alteração reversível da conformação deste complexo e permitem que se ligue, com afinidade elevada, a várias classes de lipoproteínas, como as que contêm apoproteína B ou apoproteína E. No seu outro papel, e na ausência de ácidos gordos livres, o LSR não se liga a lipoproteínas, mas é capaz de se ligar a uma citoquina, em particular leptina. Em seguida, a leptina ligada ao receptor é interiorizada pelos hepatócitos, onde é degradada.

Como descrito acima, as subunidades do LSR podem ligar-se a gClq-R, o receptor da Clq, um dos componentes do complexo Cl da via convencional para activação do complemento. Proteínas análogas a gClq-R também podem ligar-se ao sítio do LSR para ligação de gClq-R. Entende-se que proteínas análogas a gClq-R designam, em particular, as proteínas homólogas, preferivelmente exibindo um nível de homologia da sequência de aminoácidos de pelo menos 80%, em 30 que as proteínas exibem pelo menos um dos motivos de um sítio de ligação da proteína gClq-R no receptor LSR e/ou proteínas capazes de interagirem com o receptor LSR.

Outra característica do LSR refere-se ao destino das lipoproteínas ou citoquinas ligadas. Mais particularmente, é característico do LSR que as proteínas ligadas ou citoquinas ligadas sejam incorporadas na célula e depois degradadas. As lipoproteínas ligadas podem conter, particularmente, apoproteína B ou E.

Como descrito mais pormenorizadamente abaixo, a actividade do complexo de LSR pode ser modulada por uma família de compostos que inclui Clq ou um dos seus compostos análogos, como AdipoQ (Hu et al., J. Biol. Chem. 271: 10697 (1996)), ApMl (Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 286 (1996)) e cerebelina. Em particular, o composto Clq ou um dos seus compostos análogos possibilita, na ausência de ácidos gordos livres, aumentar a actividade do LSR e, desse modo, aumentar a quantidade de lipoproteínas ligadas, interiorizadas e degradadas pelas células que expressam o receptor LSR. A invenção descreve polipéptidos ou outros compostos que são capazes de modular, ao imitar, promover, inibir ou alterar de qualquer outra forma a interacção da subunidade γ do complexo de LSR com as subunidades α ou a' e β do receptor LSR.

Estes polipéptidos podem ser obtidos por purificação ou isolamento de fontes naturais ou, alternativamente, podem ser obtidos por recombinação genética ou síntese química. 31

No caso dos polipéptidos serem polipéptidos sintéticos, podem conter aminoácidos não naturais.

Pode definir-se a invenção de forma mais completa descrevendo primeiramente a estrutura do LSR e os métodos que foram utilizados para elucidar as suas propriedades farmacológicas.

Definição da Estrutura e Função do LSR

As subunidades do LSR foram identificadas por procedimentos que empregaram anticorpos policlonais específicos para o receptor. Obtiveram-se estes anticorpos imunizando coelhos com uma espécie de 240 kDa purificada em gel que se ligou a uma sonda de LDL etiquetada num ensaio de coloração de ligandos (Mann et al., Biochemistry 34: 10421 (1995)) conduzido na presença de oleato 0,8 mM. Nos procedimentos descritos aqui, o oleato é empregue como ácido gordo livre modelo utilizado para activar a actividade de ligação de lipoproteínas do LSR. Os resultados deste ensaio de coloração de ligandos também indicaram que proteínas membranares com pesos moleculares estimados de 115 kDa e 90 kDa também se ligaram à LDL. Notavelmente, os anticorpos de coelho reconheceram as três espécies que se ligaram à LDL num procedimento de coloração "Western" e inibiram a ligação de LDLs a LSRs dispostos em hepatócitos de rato num ensaio de ligação de ligandos. Isto indicou que os anticorpos policlonais dirigidos contra a espécie de ligação a LDL de 240 kDa foram úteis como reagentes específicos para o LSR. A análise electroforética de proteínas que foram imunoprecipitadas utilizando os anticorpos anti-LSR e depois separadas em condições redutoras indicou que apenas 32 um número muito pequeno de proteínas individuais foi reconhecido pelo reagente de anticorpo. Mais particularmente, verificou-se que proteínas de 68 kDa, 56 kDa e 35 kDa estavam presentes no imunoprecipitado. Isto demonstrou que o complexo de LSR era um multímero composto por subunidades com pesos moleculares de 68 kDa (subunidade a), 56 kDa (subunidade β) e 35 kDa (subunidade γ) . Estes pesos moleculares são estimativas e foram obtidos do rato. Como pormenorizado abaixo, crê-se que a subunidade γ corresponde a uma proteína previamente conhecida. Determinaram-se as estruturas das subunidades α e β por um procedimento de clonagem e expressão utilizando como sonda os anticorpos policlonais anti-LSR.

De facto, uma biblioteca de cDNA de fígado de rato Xgtll foi rastreada com os anticorpos específicos para o LSR para identificar clones que expressam proteínas correspondentes às subunidades do LSR. A análise pormenorizada de um dos clones fágicos isolados, utilizando um protocolo de PCR com base na sequência clonada identificada, conduziu à identificação de três espécies diferentes de mRNA. 0 exame cuidadoso das sequências destes mRNAs, juntamente com procedimentos subsequentes de PCR e clonagem, confirmou que as três espécies representavam variantes de processamento alternativo de um único transcrito precursor. Os três cDNAs completos tinham comprimentos de 2097 pares de bases, 2040 pares de bases e 1893 pares de bases. Os pesos moleculares das proteínas previstas codificadas pelas fases de leitura aberta das três sequências de cDNA foram 66 kDa, 64 kDa e 58 kDa, respectivamente. 33

Procedimentos de coloração "Northern" utilizando RNA isolado de diferentes tecidos de rato indicaram que o polinucleótido clonado hibridizou para transcritos expressos no figado de rato na forma de mRNAs de 1,9 milhares de bases e 2,1 milhares de bases e também indicaram que esta expressão estava substancialmente restringida ao figado.

Utilizaram-se cinco técnicas diferentes para demonstrar que as sequências de 2097 pares de bases e 1893 pares de bases eram componentes essenciais do receptor LSR. Em primeiro lugar, dirigiram-se anticorpos policlonais contra dois péptidos sintéticos com sequências correspondentes aos resíduos 169-186 e aos resíduos 556-570, respectivamente, codificadas pelo cDNA de 2097 pares de bases. Estas sequências peptídicas eram comuns a todas as proteínas previstas codificadas pelas três variantes de processamento de mRNA descritas acima. Verificou-se que estes anticorpos anti-péptidos, mas não anticorpos de controlo irrelevantes, inibiram a ligação de LDLs ao LSR presente em membranas do plasma de ratos. Em segundo lugar, os procedimentos de coloração "Western" e coloração de ligandos mostraram que as subunidades α e β parcialmente purificadas: (1) se ligaram aos anticorpos policlonais de coelho anti-LSR; (2) se ligaram aos anticorpos anti-péptidos, e (3) se ligaram a LDLs após incubação com oleatos. Em terceiro lugar, a tradução e etiquetagem in vitro para produzir proteínas sintéticas correspondentes aos polipéptidos codificados pelos cDNAs de 2097 pares de bases e 1893 pares de bases deram origem a produtos que se ligaram a LDLs num ensaio de ultracentrifugação, em que a ligação de LDLs produziu um complexo com uma densidade inferior à densidade da proteína isolada. Esta ligação aumentou na presença de oleato em 34 duas vezes para a subunidade α ou em cinco vezes para a subunidade β. Em quarto lugar, verificou-se que células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas de forma transitória com um plasmideo que continha a subunidade α do LSR exibiram ligação acrescida de LDLs após incubações na presença de oleato, ao passo que a ligação de LDLs medida na ausência de oleato permaneceu inalterada. A co-transfecção de plasmideos que continham a subunidade β do LSR juntamente com a subunidade α do LSR aumentou suplementarmente a ligação de LDLs observada após incubações com oleato. É muito importante notar que se observou um aumento da degradação de LDLs após incubação com oleato apenas em placas que continham células co-transfectadas com as subunidades α e β do LSR. Em consequência, a co-transfecção de ambas as subunidades α e β do LSR é uma condição suficiente para aumentar a actividade do LSR em células CHO. A afinidade das várias classes de lipoproteinas para o LSR em células co-transfectadas com as subunidades α e β foi muito semelhante à originalmente descrita para o LSR expresso em hepatócitos de rato ou em fibroblastos humanos isolados de sujeitos com hipercolesterolemia familiar (Bihain et ai., Biochemistry 31: 4628 (1992); Yen et al., Biochemistry 33: 1172 (1994)).

Obteve-se uma quinta linha de evidências que demonstra que o gene identificado era responsável pela função do LSR e que este receptor participa na eliminação de triglicéridos dietéticos utilizando ratinhos geneticamente obesos. Verificou-se que ratinhos ob/ob (com um gene de leptina deficiente) e ratinhos db/db (com um defeito no gene que codifica o receptor da leptina) exibem uma resposta lipémica pós-prandial aumentada depois de terem 35 sido forçados a alimentarem-se com a refeição padrão de teste descrita acima. 0 número aparente de LSRs disponíveis na membrana do plasma de hepatócitos destes ratinhos obesos foi inferior ao dos controlos magros. Além disso, a análise de coloração "Northern" revelou que o nível de mRNA de LSRs foi significativamente reduzido em ratinhos obesos. 0 tratamento da obesidade de ratinhos ob/ob por administração diária de leptina recombinante durante um período de trinta dias conduziu a uma redução de mais de 30% do peso do corpo do animal, a um decréscimo maciço da resposta lipémica pós-prandial, a um aumento significativo do número aparente de LSRs expressos na superfície de células do fígado e a um número acrescido de mRNA de LSR.

Em consequência, com base nestes dados, determinou-se que o gene do LSR identificado era responsável pela função deste receptor, que o LSR representa um passo limitador da velocidade da eliminação de triglicéridos dietéticos e que a expressão deste gene está desregulada em ratinhos obesos. Além disso, as subunidades de 56 e 68 kDa do LSR ligam-se substancialmente a LDLs só após incubação com oleato. A análise estequiométrica dos produtos da imunoprecipitação indicou ser muito provável que o complexo que se liga a LDLs de 240 kDa que foi observado no ensaio de coloração de ligandos representasse um complexo multimérico formado por uma única subunidade α e três β. Crê-se que o cDNA de 2040 pares de bases acima descrito, que representa o terceiro produto de processamento de RNA alternativo, codifica uma subunidade que pode substituir α no complexo multimérico. Esta última proteína é referida como a' (alfa pelica). 36 Não obstante as subunidades α e β do LSR terem sido codificadas por mRNAs processados de forma alternativa gerados a partir de uma única molécula precursora, o procedimento de clonagem e expressão descrito acima não esclareceu a identidade da subunidade de 35 kDa que foi detectada juntamente com as proteínas de 68 kDa e 56 kDa no imunoprecipitado anti-LSR. De facto, a subunidade γ do LSR foi identificada por sequenciação directa da proteína purificada.

Mais particularmente, utilizou-se sequenciação N-terminal de material purificado por imunoafinidade para determinar a identidade provável do componente final do complexo de LSR. Neste procedimento utilizaram-se anticorpos policlonais de coelho anti-LSR imobilizados numa coluna para capturar proteínas membranares do fígado de rato. Depois de verificar a presença da espécie de 35 kDa no eluato da coluna, sequenciou-se uma amostra que continha a proteína de 35 kDa utilizando um protocolo padrão de degradação de Edman. Os resultados deste procedimento deram origem a uma sequência polipeptídica com 19 aminoácidos de comprimento que foi utilizada para pesquisar uma base de dados de proteínas. Esta pesquisa revelou que a subunidade γ do receptor LSR incluía uma sequência polipeptídica que aparecia de forma idêntica em gClq-R (Ghebrehiwet et al. J. Exp. Med. 179, 1809 (1994)), um receptor conhecido da superfície celular que se liga às cabeças globulares de Clq. Uma vez que não se determinou a sequência completa da proteína de 35 kDa purificada por imunoafinidade, permitimos a possibilidade da subunidade γ do complexo de LSR estar relacionada, mas não ser idêntica à proteína gClq-R. 37 A análise das sequências proteicas das subunidades α e β do LSR revelou várias caracteristicas estruturais interessantes. Por exemplo, a presença de vários sítios de fosforilação na extremidade N-terminal da proteína da subunidade α sugeriu que o terminal amino desta proteína estava orientado para o interior da célula e também sugeriu um possível papel na transdução do sinal. A porção N-terminal da proteína da subunidade α também possuía uma sequência de aminoácidos hidrófoba que estava separada por dois resíduos prolina contíguos, uma disposição que provavelmente induz uma estrutura em grampo. É provável que esta disposição de dois braços hidrófobos constitua um domínio putativo de ligação de ácidos gordos do LSR. A subunidade α também possuía uma sequência de aminoácidos hidrófoba consistente com um domínio transmembranar potencial (Brendel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 2002 (1992)). A proteína da subunidade β não possui um domínio transmembranar e provavelmente está posicionada fora da célula, onde está ligada, por pontes dissulfureto, a outros componentes do complexo de LSR.

Composições e Métodos para Modular a Actividade do LSR

Uma característica estrutural adicional das proteínas das subunidades α e β está relacionada com a presença de segmentos repetidos ricos em resíduos serina e arginina. Isto é importante, pois o receptor da lamina e o "factor de processamento 2" também têm em comum uma sequência repetida de resíduos serina e arginina (RSRS), e também é conhecido que estas proteínas se combinam com a proteína gClqR (Honoré et al., Gene 134: 283 (1993)). Tendo em vista esta coincidência de motivos estruturais relacionados e interaeções com gClq-R, especulamos que os segmentos ricos 38 em serina e arginina das subunidades α e β do LSR foram importantes, de algum modo, para o contacto com gClq-R, ou com a proteína do tipo gClq-R que era a subunidade γ do complexo de LSR.

Como descrito no Exemplo seguinte, utilizaram-se anticorpos policlonais dirigidos contra péptidos sintéticos derivados da sequência de aminoácidos primária de gClq-R para demonstrar que esta proteína, ou uma proteína proximamente relacionada com gClq-R, era um componente do complexo de LSR. No procedimento descrito abaixo, os anticorpos anti-péptidos inibiram a ligação de LDLs etiquetadas ao LSR expresso na superfície de hepatócitos de rato. A utilização do substrato modelo LDL nestes procedimentos proporcionou um meio conveniente e altamente sensível para monitorizar aspectos do metabolismo de lipoproteínas em células do fígado. O Exemplo 1 descreve os procedimentos utilizados para demonstrar que a gClq-R, ou um homólogo proximamente relacionado desta proteína, era um constituinte do complexo de LSR.

Exemplo 1 A gClq-R ou uma Proteína do Tipo gClq-R é um Componente do LSR de Múltiplas Subunidades

Prepararam-se anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra dois péptidos sintéticos com sequências localizadas nas extremidades dos terminais carboxi e amino da proteína gClq-R de acordo com procedimentos laboratoriais comuns. 0 péptido sintético que representa a região N-terminal da proteína tinha a sequência LRCVPRVLGSSVAGY* (ID SEQ NO: 3) e correspondia aos resíduos 39 5-19 da sequência polipeptídica gClq-R. 0 péptido sintético C-terminal tinha a sequência C*YITFLEDLKSFVKSQ (ID SEQ NO: 4) e correspondia aos resíduos 268-282 de gClq-R. As posições de aminoácidos marcadas com indicam resíduos que diferiram da sequência proteica de tipo selvagem para aumentar a antigenicidade dos péptidos. Os péptidos foram acoplados a um transportador de hemocianina de lapa californiana (KLH) antes da injecção em coelhos. Estes procedimentos deram origem a duas amostras de soro, cada uma com uma especificidade de ligação para uma região diferente da proteína gClq-R. A imunoglobulina G (IgG) destes soros foi suplementarmente purificada utilizando uma coluna de Proteína A (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante.

Combinaram-se quantidades crescentes destes anticorpos anti-péptidos ou de um anticorpo IgG irrelevante com 125I-LDL num ensaio padrão para medir a ligação de LDL induzida por oleato a membranas do plasma de hepatócitos de rato (Bihain et al., Biochemistry 31: 4628 (1992); Mann et al., J. Biol. Chem. 272 : 31348 (1997)). Determinou-se a ligação induzida pelo oleato na forma da diferença entre incubações com e sem oleato 0,5 mM. Analisaram-se as medições numéricas feitas nesta experiência como a percentagem do total da 125I-LDL ligada a membranas na ausência de anticorpos adicionados.

Os resultados apresentados na Figura 1 indicaram que anticorpos dirigidos para qualquer uma de duas regiões da proteína gClq-R inibiram a actividade do LSR, medido pela ligação de LDL. A IgG de controlo negativo não inibiu a actividade do LSR neste ensaio. Isto demonstrou que os efeitos inibidores observados nos nossos procedimentos 40 resultaram de interacções específicas anticorpo-receptor. Estes resultados confirmaram que a gClq-R, ou uma proteína proximamente relacionada com a gClq-R, era um componente do complexo de LSR.

Aparentemente, os resultados anteriores sugeriram que agentes que se ligam a gClq-R, ou à subunidade γ do complexo de LSR, exerceram um efeito negativo ou inibidor na actividade do LSR. Assim, identificámos agentes que conseguiram modular a actividade do LSR de um modo negativo.

Em vista destas descobertas, foi interessante avaliar também os efeitos de compostos que se ligaram à gClq-R, ou que poderiam alterar interacções entre a subunidade γ e o LSR. Uma vez que era conhecido que a proteína do complemento Clq era um substrato de ligação para a gClq-R, investigámos se a Clq modularia a actividade do LSR do mesmo modo que anticorpos anti-péptidos inibiram a actividade do LSR no Exemplo precedente. De notar que a experiência descrita no Exemplo seguinte foi conduzida na presença e ausência de oleato, um ácido gordo livre que desmascara o sítio de ligação de lipoproteínas no LSR. O Exemplo 2 descreve os procedimentos utilizados para demonstrar que foi possível modular a actividade do LSR de um modo positivo. Inesperadamente, ocorreu aumento da actividade do LSR na presença e na ausência de ácidos gordos livres.

Exemplo 2

Regulação da Actividade do LSR por Clq e seus Homólogos 41

Culturas primárias de hepatócitos de rato foram incubadas com 20 ng de leptina/cavidade, utilizando placas de 6 cavidades, durante 30 minutos a 37°C, para estimular a mobilização de proteínas LSR para a superfície celular e para aumentar o número de receptores LSR expressos. Em seguida, adicionaram-se concentrações crescentes de Clq (Sigma) e 20 pg/ml de 125I-LDL a culturas celulares paralelas na presença ou ausência de oleato 0,5 mM. Incubaram-se as misturas durante 4 horas a 37°C e analisou-se a ligação, interiorização e degradação das LDLs etiquetadas utilizando técnicas comuns (Bihain et al., Biochemistry 3^: 4628 (1992); Mann et al., J. Biol. Chem. 272 : 31348 (1997)) .

Os resultados apresentados nas Figuras 2A-C indicaram inesperadamente que a Clq aumentou a actividade do LSR na presença e na ausência de ácidos gordos livres. De facto, foi surpreendente que a ligação, interiorização e degradação de lipoproteínas tivesse ocorrido na ausência de oleato adicionado, pois previamente pensava-se que estes aspectos da actividade do LSR requeriam a presença de ácidos gordos livres. Na presença de oleato também se observaram aumentos pequenos, mas significativos, dos três parâmetros medidos. A importância destes últimos aumentos foi menos substancial porque os valores de fundo medidos na ausência de Clq adicionada foram mais elevados na presença de oleato em comparação com os valores medidos na ausência deste ácido gordo livre.

Os resultados descritos no Exemplo precedente mostraram que a incubação de hepatócitos de rato com Clq, uma proteína capaz de se ligar a gClq-R e, assim, potencialmente capaz de deslocá-la do complexo de LSR, 42 conduziu a uma activação espontânea do LSR na ausência de ácidos gordos livres. Não pretendendo ficar restringidos por qualquer teoria particular subjacente ao mecanismo desta modulação do receptor, o que se apresenta a seguir é uma explicação possível para o fenómeno. É possível que a proteína gClq-R, ou mais geralmente a subunidade y, funcione como proteína "chaperon" para o LSR. Também é possível que a subunidade γ exerça, de algum modo, um efeito inibidor no LSR. É então concebível que agentes que perturbem ou alterem a ligação da subunidade γ ao LSR possam ser utilizados para modular a actividade do LSR, que pode ser medida in vitro na forma da ligação, interiorização e degradação de LDLs. 0 caso exemplificativo apresentado acima sugeriu que a Clq serviu de agente que perturbou a ligação da subunidade y no complexo de LSR. No entanto, contemplamos que qualquer agente homólogo ou análogo à Clq que consiga ligar-se à gClq-R ou a uma proteína do tipo gClq-R também tenha o efeito de modular a actividade do receptor LSR. 0 efeito acima descrito da Clq na actividade do LSR levou-nos a investigar se efeitos semelhantes no LSR seriam promovidos por proteínas partilhando homologia estrutural com a Clq. Apresentam-se na Figura 3 alinhamentos de alguns destes homólogos, em que as regiões encerradas em caixas representam regiões conservadas de homologia estrutural. As proteínas murinas AdipoQ (Hu et al., J. Biol. Chem. 271: 10697 (1996)) e Acrp30 (Scherer et al., J. Biol. Chem. 270: 26746 (1995)) e a proteína ApMl humana (Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 286 (1996)) exibiram claramente homologias acentuadas. Estas três proteínas, tal 43 como os componentes do complemento Clq (Clq A, B e C), são proteínas segregadas com extremidades N-terminais que se assemelham ao colagénio (repetição de motivos Gly-X-Y) e extremidades C-terminais correspondentes ao domínio globular do complemento Clq. É importante notar que estas três proteínas são preferencialmente expressas em tecido adiposo. Outras proteínas homólogas exibem domínios globulares que se assemelham ao domínio de Clq. Mais especificamente, cerebelina e multimerina (isoladas no homem) são duas proteínas que não têm um domínio que se assemelhe ao colagénio. É interessante notar que resíduos cisteína conservados nas posições 172, 179, 178 e 190, 196, 192 respectivamente em Clq A, Clq B e Clq C, não estão conservados nos outros homólogos de Clq apresentados no alinhamento. Estes resíduos cisteína estão substituídos em ApMl, AdipoQ e Acrp 30 por um resíduo lisina e um resíduo aspartato. Os habitualmente experimentados na área apreciarão que os aminoácidos lisina e aspartato podem, em condições apropriadas, formar pontes de sal intra-cadeias que podem contribuir para a estrutura proteica. Os aminoácidos nas posições correspondentes em cerebelina e multimerina não permitem a formação de pontes de sal. Em consequência, é possível caracterizar o domínio Clq das proteínas produzidas pelos adipócitos pela ausência de cisteínas na região correspondente aos aminoácidos 170-200 das moléculas de Clq e pelo consenso no domínio de Clq.

Ao considerar a relação estrutural dos homólogos apresentados na Figura 3, vale a pena notar que a proteína ApMl, que é codificada por um mRNA caracterizado como sendo fortemente expresso em adipócitos, exibe 79,7% de 44 identidade de ácidos nucleicos e 80,6% de identidade de aminoácidos com AdipoQ. Dado este nivel de relação entre sequências, a proteína ApMl é quase certamente o homólogo humano da AdipoQ murina. Assim, é razoável esperar que as actividades da AdipoQ murina, reveladas abaixo, também caracterizem a ApMl num sistema humano.

Uma vez que a Clq tem um espectro largo de efeitos biológicos, incluindo iniciação da cascata do complemento, pareceu improvável que a activação altamente especializada do LSR representasse uma função fisiologicamente significativa desta proteína. Em conformidade, investigámos se homólogos da Clq poderiam modular a actividade do LSR. Como indicado nos Exemplos que se seguem, demonstrámos agora que a AdipoQ, uma proteína do plasma abundante com função desconhecida até à data, também aumenta a actividade do LSR. A AdipoQ é um homólogo da Clq que se sabe ser segregada por adipócitos com cinética muito próxima da cinética da secreção de Adipsina. A Adipsina é uma hormona do sistema do complemento, e foi mostrado que corresponde ao fragmento purificado do terceiro componente do complemento, C3a-desArg (Baldo et al., J. Clin. Invest. 92: 1543 (1993)). A Adipsina estimula a síntese de triglicéridos por adipócitos e regula a lipemia pós-prandial (Sniderman et al., Proc. Nutr. Soc. 56: 703 (1997) ) . Além disso, a secreção de AdipoQ e Adipsina é estimulada em resposta à insulina.

Como corroborado pelos resultados experimentais apresentados abaixo, provámos que a AdipoQ pode estimular a actividade do LSR in vitro e pode diminuir o peso do corpo de um animal. Uma vez que a Clq e AdipoQ partilham 45 homologia estrutural sem partilharem extensas semelhanças funcionais, a nossa demonstração de que a AdipoQ activa a actividade do LSR estabelece a utilidade geral de homólogos da Clq como compostos úteis para modificar a actividade do LSR. 0 Exemplo 3 descreve os métodos utilizados para preparar um vector de expressão que codifica a AdipoQ murina.

Exemplo 3

Construção de um Vector de Expressão que Codifica a AdipoQ Murina

Utilizaram-se procedimentos laboratoriais comuns para isolar mRNA de tecido adiposo que tinha sido obtido de ratinhos C57BL/6J. Capturou-se mRNA poli(A)+ utilizando esférulas magnéticas revestidas com oligo-dT de acordo com as instruções do fabricante (Dynal, França). 0 mRNA foi transcrito de forma reversa em cDNA utilizando transcriptase reversa SUPERSCRIPT e reagentes que foram adquiridos na forma de um estojo (Life Technologies, França). 0 cDNA que codifica a AdipoQ foi amplificado num protocolo padrão de PCR utilizando "primers" oligonucleotidicos com as sequências seguintes: CTACATGGATCCAGTCATGCCGAAGAT (ID SEQ NO: 5) e CGACAACTCGAGTCAGTTGGTATCATGG (ID SEQ NO: 6).

Este procedimento amplificou selectivamente sequências polinucleotidicas a jusante da sequência de sinal putativa localizada na extremidade 5' da região codificadora de AdipoQ. 0 cDNA amplificado foi digerido com as endonucleases de restrição BamHI e Xhol e os produtos da digestão foram ligados nos sítios correspondentes do vector 46 de expressão pTRC His B (Invitrogen, França). Este vector foi manipulado para permitir a expressão de sequências heterólogas a jusante de um dominio polipeptidico que inclui um motivo peptidico de hexa-histidina, um sitio de clivagem de enteroquinases e um epitopo que é reconhecido por um anticorpo Anti-Xpress™. Após transformação de E. coli DH5-a competentes, seleccionaram-se clones bacterianos que albergam o polinucleótido que codifica a AdipoQ por crescimento na presença de ampicilina. Isolou-se o DNA plasmidico de um dos clones bacterianos e determinou-se a sequência da inserção do DNA heterólogo. Verificou-se que a sequência da inserção corresponde às bases 57 - 762 de AdipoQ (n° de acesso do GeneBank U49915) . A sequência polinucleotidica clonada também correspondeu às bases 86-791 da sequência que codifica a Acrp30 (n° de acesso do GeneBank U37222), exceptuando a posição do nucleótido 382. A sequência polinucleotidica que codifica a Acrp 30 tem um resíduo adenosina nesta posição, ao passo que o polinucleótido AdipoQ tem um resíduo guanina na posição correspondente. Esta substituição de nucleótidos conduz a uma alteração de aminoácidos de uma metionina em Acrp30 para uma valina em AdipoQ.

Com a disponibilidade do vector de expressão acima descrito tornou-se possível produzir a proteína AdipoQ recombinante que pode ser utilizada para conduzir experiências in vitro e in vivo. O Exemplo 4 descreve os procedimentos que foram utilizados para preparar uma forma recombinante da proteína AdipoQ. 47

Exemplo 4

Produção e Purificação da Proteína AdipoQ Recombinante

Bactérias que continham o vector de expressão de AdipoQ foram cultivadas a 37°C em meio LB com selecção de antibióticos até a Οϋεοο ter atingido 0,2. Em seguida, induziu-se a produção da proteína recombinante adicionando isopropil-p-D-tiogalactopiranosido para uma concentração final de 1 mM. O crescimento bacteriano prosseguiu durante 16 horas adicionais a 37°C; após esse período de tempo, as bactérias cultivadas foram recolhidas por centrifugação. As bactérias foram submetidas a lise de acordo com procedimentos laboratoriais comuns utilizando lisozima num tampão que incluía Tris HC1 (pH 7,4), NaCl, PMSF e desoxicolato de sódio. O DNA presente no lisato em bruto foi degradado por sonicação. Após centrifugação, para remover os detritos celulares, a proteína recombinante foi isolada do sobrenadante límpido utilizando uma coluna PROBOND (Invitrogen, França). A resina carregada com níquel da coluna tem afinidade para o motivo peptídico de hexa-histidina acima descrito da proteína de fusão recombinante. Efectuou-se a eluição na presença de imidazolo. Após diálise do eluato, mediu-se a concentração da proteína pelo método padrão de Lowry. Verificou-se a pureza da proteína recombinante por electroforese em gel de poliacrilamida com SDS. No gel da proteína observou-se uma única banda de massa molecular aparente de cerca de 33 kDa. De notar que, nesta altura, a proteína recombinante retinha o domínio proteico de hexa-histidina.

Em seguida empregámos um ensaio in vitro para investigar se a AdipoQ recombinante, como a Clq, estimulava a actividade do LSR. A utilização do ensaio in vitro permitiu-nos estudar particularmente diferentes aspectos da 48 actividade mediada pelo LSR, incluindo ligação, interiorização e degradação de um substrato modelo de lipoproteinas. 0 Exemplo 5 descreve os métodos que foram utilizados para provar que a AdipoQ estimulava a actividade do LSR in vitro.

Exemplo 5

AdipoQ Recombinante Estimula a Actividade do LSR em Hepatócitos Cultivados Prepararam-se culturas primárias de hepatócitos de rato, tendo sido plaqueadas em placas de 6 cavidades a 900 000 células/cavidade. Após 48 horas, as células foram lavadas uma vez com 2 ml/cavidade de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois foram incubadas durante 30 minutos a 37°C com 20 ng/ml de leptina murina recombinante. Em seguida, as células foram suplementarmente incubadas 4 horas a 37 °C com 25 pg/ml de AdipoQ recombinante e 20 pg/ml de I-LDL na presença ou ausência de oleato 0,6 mM. Determinou-se a ligação, interiorização e degradação das LDLs etiquetadas de acordo com os métodos comuns referidos acima.

Os resultados apresentados nas Figuras 4A-C mostram que a AdipoQ aumentou significativamente a quantidade de LDLs ligadas, interiorizadas e degradadas por hepatócitos. De facto, os resultados indicaram particularmente que a degradação de LDLs aumentou dramaticamente por tratamento dos hepatócitos com AdipoQ. Vale a pena notar que, neste cenário, o aumento de actividade do LSR devido à AdipoQ foi medido na presença de leptina. Estes resultados confirmaram 49 que a AdipoQ foi capaz de aumentar a actividade do LSR em culturas primárias de hepatócitos de rato.

Dada a descoberta da AdipoQ ter aumentado dramaticamente a actividade do LSR in vitro, teve interesse determinar se o mesmo padrão de actividade se repetiria in vivo. Testou-se esta possibilidade alimentando ratos com uma refeição rica em gorduras, administrando aos ratos AdipoQ recombinante, medindo os triglicéridos no plasma e comparando os resultados com medições feitas em ratos que não receberam AdipoQ. Como descrito abaixo, as nossas descobertas indicaram que a administração de AdipoQ reduziu dramaticamente o nivel de triglicéridos no plasma após a refeição de teste rica em gorduras. 0 Exemplo 6 descreve os procedimentos que foram utilizados para demonstrar que os niveis de triglicéridos no plasma após uma refeição rica em gorduras foram reduzidos em animais aos quais tinha sido injectada AdipoQ.

Exemplo 6

AdipoQ Reduz Níveis Pós-Prandiais de Lípidos no Sangue in vivo

Ratos Sprague-Dawley machos (400-450 g) que tinham jejuado durante a noite foram submetidos a gavagem com uma refeição de teste rica em gorduras (tempo = 0) e administrou-se-lhes imediatamente, por injecção intravenosa na veia femoral, 300 μΐ de PBS isoladamente ou contendo 1 mg de AdipoQ murina recombinante. A refeição de teste consistiu em 60% de gorduras (37% saturadas, 27% ácidos gordos mono-insaturados e 36% poli-insaturados), 20% de proteínas e 20% de hidratos de carbono, que forneceu 56 kcal de energia/kg de peso do corpo. Uma segunda injecção 50 de AdipoQ foi administrada 2 horas após a refeição de teste. Recolheram-se amostras de sangue em intervalos de duas horas e determinaram-se os níveis de triglicéridos no plasma através de um ensaio enzimático comum utilizando reagentes que tinham sido adquiridos na forma de um estojo (Boehringer Mannheim).

Os resultados apresentados na Figura 5 mostram que a AdipoQ reduziu substancialmente a magnitude da resposta pós-prandial de triglicéridos. Os valores quantitativos apresentados na Figura representam a média ± desvio padrão (n=3). Se bem que o nível de triglicéridos em circulação tenha permanecido substancialmente constante nos animais aos quais se administrou AdipoQ, o nível aumentou nos animais de controlo até atingir um máximo cerca das 4 horas. Estes resultados in vivo foram consistentes com o aumento acentuado dependente de AdipoQ da actividade do LSR que tínhamos observado in vitro. O Exemplo 7 descreve os procedimentos utilizados para demonstrar que a administração de AdipoQ promoveu perda de peso e redução dos níveis de triglicéridos no plasma em animais normais. Isto verificou-se mesmo quando os animais foram submetidos a uma dieta rica em gorduras. De notar que, neste caso, a AdipoQ foi administrada por um protocolo de infusão lenta em vez de injecção.

Exemplo 7

Administração de AdipoQ por Infusão Estimula a Perda de Peso e Redução dos Triglicéridos no Plasma

Bombas osmóticas (Alzet) foram cirurgicamente inseridas nas cavidades abdominais de 12 ratos Sprague-Dawley machos de 400-450 g. As bombas continham 2 ml de PBS (pH 7,4) 51 (controlo, n=6) ou 2 ml de AdipoQ recombinante de ratinho (5 mg/ml de PBS, n=6). As bombas utilizadas neste procedimento foram concebidas para distribuir 10 μΐ/hora (50 pg AdipoQ/hora). Os animais foram pesados e depois foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas. Três animais de cada grupo foram submetidos a uma dieta de ração regular ou a uma dieta rica em gorduras ad libitum (dia 0). A dieta rica em gorduras consistiu em ração regular suplementada com 2% (p/v) de colesterol, 10% (p/v) de gorduras saturadas na forma de vegetalina, 10% (p/v) de óleo de girassol e 15% (p/v) de sucrose. No dia 3, os animais foram pesados e recolheram-se amostras de sangue da veia da cauda. Mediram-se os triglicéridos no plasma utilizando um estojo enzimático.

Os resultados apresentados nas Figuras 6A-B mostram que a AdipoQ reduziu significativamente os níveis de triglicéridos no plasma em animais de teste alimentados com uma dieta regular ou uma dieta rica em gorduras. Além disso, a administração de AdipoQ reduziu o peso do corpo, que foi mais pronunciado em animais alimentados com a dieta rica em gorduras. O Exemplo 8 descreve os procedimentos que definiram ainda outro efeito da AdipoQ in vivo. Mais especificamente, os resultados apresentados abaixo demonstram que animais de teste aos quais se administrou AdipoQ reduziram inesperadamente a ingestão de alimentos.

Exemplo 8

Administração de AdipoQ Promove a Redução da Ingestão de

Alimentos em Ratinhos Geneticamente Obesos 52

Ratinhos ob/ob e db/db alojados em gaiolas metabólicas foram injectados diariamente, durante 5 dias nas veias da cauda, com PBS isoladamente ou AdipoQ murina recombinante (100 pg) dispersa num transportador de PBS. Monitorizou-se a quantidade de alimentos consumida diariamente por cada animal durante o período da experiência.

Os resultados apresentados nas Figuras 7A-B mostram que a ingestão média diária de alimentos de ratinhos obesos foi significativamente reduzida após administração de AdipoQ. Os dados representados nos gráficos reflectem a ingestão média de alimentos e o desvio padrão para 4 ratinhos em cada grupo, exceptuando para o grupo de controlo db/db (n=3), em que um animal morreu antes do final da experiência. De modo significativo, a redução dependente de AdipoQ da ingestão de alimentos foi observada para os grupos de ratinhos ob/ob e db/db. Deste modo determinou-se que a AdipoQ foi útil para controlar a ingestão de alimentos na ausência de leptina (ratinhos ob/ob) e que a AdipoQ conseguiu ultrapassar a resistência à leptina que é característica de ratinhos db/db. O Exemplo 9 descreve um método que pode ser utilizado para reduzir os triglicéridos no plasma e massa corporal em humanos. Não obstante este caso exemplificativo descrever um tratamento de humanos obesos, deve entender-se que também se pode administrar o medicamento descrito abaixo a humanos não obesos. Para os procedimentos descritos nos dois Exemplos seguintes, uma população de indivíduos com índice de massa corporal > 35 é recrutada e testada quanto a diabetes (níveis de glucose no plasma em jejum > 120 mg/dl) e hipertrigliceridemia ou "HTG" (níveis de triglicéridos em jejum > 150 mg/dl). Depois constituem-se 53 quatro grupos de sujeitos obesos. Estes grupos incluem: (1) sujeitos com obesidade e sem diabetes nem HTG; (2) sujeitos com diabetes mas sem HTG; (3) sujeitos com HTG mas sem diabetes, e (4) sujeitos com diabetes e HTG.

Exemplo 9

Administração de um Medicamento que Inclui AdipoQ

Uma população de indivíduos humanos obesos é primeiramente identificada e depois é separada em dois grupos aleatórios. 0 grupo de controlo recebe uma injecção diária intravenosa de um placebo durante um período desde uma semana, duas semanas, um mês ou mais do que um mês. 0 placebo compreende um volume de 1,0 ml de PBS esterilizado. Os indivíduos do grupo de tratamento recebem uma injecção intravenosa duas vezes por dia de um medicamento que compreende 1,0 ml de PBS esterilizado que contém AdipoQ recombinante num nível de dosagem correspondente a 2,5 mg de AdipoQ/kg de massa corporal. A AdipoQ recombinante é produzida de acordo com bons procedimento de fabrico (GMP) num sistema de expressão procariótico essencialmente de acordo com os procedimentos descritos nos Exemplos 3 e 4. Os indivíduos de ambos os grupos consomem refeições ricas em gorduras; os níveis de triglicéridos no soro e massa corporal são monitorizados regularmente durante o procedimento.

No final do período de tratamento fica claro que indivíduos aos quais foi administrado o medicamento que incluía AdipoQ exibiram níveis de triglicéridos no plasma substancialmente reduzidos relativamente ao grupo de controlo. Além disso, há evidências de que estes indivíduos sofreram uma redução mensurável de peso. 54 0 Exemplo 10 descreve o modo como a ApMl pode ser utilizada para estimular a redução dos níveis de triglicéridos no plasma e da massa corporal.

Exemplo 10

Administração de ApMl Reduz Triglicéridos no Plasma e Massa Corporal

Uma população de indivíduos humanos obesos é primeiramente identificada e depois é separada em dois grupos aleatórios. O grupo de controlo recebe uma injecção diária intravenosa de um placebo durante um período desde uma semana, duas semanas, um mês ou mais do que um mês. O placebo compreende um volume de 1,0 ml de PBS esterilizado. Os indivíduos do grupo de tratamento recebem uma injecção intravenosa duas vezes por dia de um medicamento que compreende 1,0 ml de PBS esterilizado que contém ApMl humana num nível de dosagem correspondente a 2,5 mg de ApMl/kg de massa corporal. A ApMl humana é um material recombinante produzido de acordo com padrões de GMP. Para este fim utiliza-se um sistema de expressão procariótico essencialmente de acordo com os procedimentos descritos nos Exemplos 3 e 4, com a excepção do cDNA de ApMl humana substituir o cDNA de AdipoQ murina descrito nos Exemplos. Os indivíduos de ambos os grupos consomem refeições ricas em gorduras. Os níveis de triglicéridos no soro e massa corporal são monitorizados para ambos os grupos de indivíduos.

No final do período de tratamento, indivíduos do grupo ao qual foi administrado o medicamento que incluía ApMl exibiram níveis de triglicéridos no plasma substancialmente reduzidos relativamente ao grupo de controlo. Além disso, estes indivíduos sofreram uma redução mensurável de peso. 55 A presente invenção descreve a preparação de um medicamento para influenciar a partição de lipidos dietéticos entre os tecidos adiposos e o fígado num indivíduo. Por exemplo, os medicamentos podem aumentar ou diminuir o nível de lipólise que ocorre no fígado. Em particular, os medicamentos podem aumentar ou diminuir o nível de lipólise que ocorre no fígado aumentando ou diminuindo a actividade do LSR.

Esses medicamentos podem ser utilizados em procedimentos para reduzir a quantidade de lipidos dietéticos armazenados no tecido adiposo ou em procedimentos para aumentar a quantidade de lipidos dietéticos armazenados no tecido adiposo, dependendo da natureza do estado a ser tratado. Em particular, esses medicamentos aumentam ou diminuem as actividades de compostos (incluindo AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) que aumentam a quantidade de lipidos dietéticos submetidos a partição para o fígado.

Medicamentos que aumentam a actividade destes compostos num indivíduo podem ser utilizados para reduzir a ingestão de alimentos em indivíduos obesos, para reduzir os níveis de ácidos gordos livres em indivíduos obesos, para diminuir o peso do corpo de indivíduos obesos ou para tratar uma variedade de estados relacionados com obesidade. Esses estados relacionados com obesidade incluem aterosclerose 56 (que pode resultar de níveis elevados de ácidos gordos livres e remanescentes de quilomícrones no plasma), resistência à insulina relacionada com obesidade, resultante de ácidos gordos no plasma ou ácidos gordos produzidos por lipólise extracelular (Walker, M., Metabolism 44: 18- 20 (1995); Lonnroth, P ., Intern. Med. Suppl. 735: 23-29 (1991); Hannes, Μ. M., et al., Int . J. Obes. 14: 831-841 (1990)), hipertensão relacionada com obesidade, resultante de ácidos gordos no plasma ou ácidos gordos produzidos por lipólise extracelular (Goodfriend e Egan, J. Med. 344: 1649-1654 (1996)), lesões microangiopáticas resultantes de diabetes de Tipo II relacionada com obesidade e lesões oculares e renais causadas por microangiopatia em sujeitos obesos com diabetes de Tipo II.

Medicamentos que diminuem a actividade de compostos que aumentam a partição de lípidos dietéticos para o fígado (incluindo AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) podem ser utilizados para tratar estados tais como caquexia em sujeitos com síndroma neoplástica ou para-neoplástica ou perturbações de alimentação.

Pode utilizar-se uma variedade de técnicas para aumentar a actividade de compostos que aumentam a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Em particular, pode aumentar-se a actividade destes compostos administrando 57 directamente estes compostos (incluindo AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) ao indivíduo em qualquer uma das formulações farmaceuticamente aceitáveis descritas acima. Vias de administração destes compostos, bem como doses apropriadas destes agentes, também foram apresentadas acima.

Noutra abordagem, os genes (ou respectivas porções) que codificam compostos que aumentam a partição de lípidos dietéticos para o fígado (incluindo AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) podem ser submetidos a mutagénese para criar proteínas ou péptidos derivados com maior capacidade para aumentar a partição de lípidos dietéticos para o fígado do que as proteínas de tipo selvagem. Os experimentados na área conhecem uma variedade de procedimentos de mutagénese, incluindo mutagénese dirigida a sítios e mutagénese química aleatória. Por exemplo, pode utilizar-se qualquer um dos procedimentos de mutagénese revelados em Ausebel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons (1998). 58

As proteínas ou péptidos codificados pelos genes submetidos a mutagénese são inseridos em vectores de expressão, são isolados utilizando técnicas familiares aos experimentados na área e são testados para determinar se têm maior actividade do que as proteínas de tipo selvagem utilizando os procedimentos descritos abaixo.

Alternativamente, em vez de preparar derivados utilizando os procedimentos de mutagénese descritos acima, podem utilizar-se técnicas de química combinatorial que permitem gerar um grande número de péptidos derivados in vitro.

Podem identificar-se proteínas ou péptidos derivados com actividade aumentada relativamente ao tipo selvagem comparando a sua actividade com a actividade das proteínas ou péptidos de tipo selvagem no ensaio de hepatócitos de rato do Exemplo 5. Em seguida, as proteínas ou péptidos derivados com actividade aumentada relativamente às proteínas de tipo selvagem podem ser suplementarmente analisados no ensaio de resposta lipémica pós-prandial do Exemplo 6, no ensaio de triglicéridos no plasma do Exemplo 7, no ensaio de ingestão de alimentos do Exemplo 8 ou no ensaio de perda de peso do Exemplo 7.

As proteínas ou péptidos derivados com actividade aumentada relativamente às proteínas de tipo selvagem podem ser utilizados em medicamentos para aumentar a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Nesses medicamentos, a proteína ou péptido derivado pode ser administrado ao indivíduo num transportador farmaceuticamente aceitável, como os descritos acima. A proteína ou péptido derivado 59 pode ser administrado por qualquer uma das vias e em qualquer uma das dosagens descritas acima.

Adicionalmente, como discutido acima, podem obter-se moléculas pequenas, fármacos ou outros compostos que aumentem a actividade de um composto que aumente a partição de lipidos dietéticos para o fígado utilizando uma variedade de abordagens de síntese familiares aos experimentados na área, incluindo técnicas à base de química combinatorial. Podem avaliar-se moléculas pequenas, fármacos ou outros compostos candidatos determinando a sua capacidade para aumentar a actividade de um composto que aumente a partição de lipidos dietéticos para o fígado no ensaio de hepatócitos de rato do Exemplo 5. Os compostos que aumentam a actividade de um composto que aumente a partição de lipidos dietéticos para o fígado no ensaio de hepatócitos de rato podem ser suplementarmente avaliados no ensaio de resposta lipémica pós-prandial do Exemplo 6, no ensaio de triglicéridos no plasma do Exemplo 7, no ensaio de ingestão de alimentos do Exemplo 8 ou no ensaio de perda de peso do Exemplo 7.

Como descrito acima, a presente invenção também revela medicamentos para reduzir a actividade de compostos que aumentam a partição de lipidos dietéticos para o fígado. Esses medicamentos podem ser utilizados para tratar estados, como os descritos acima, em que seja desejável diminuir a partição de lipidos dietéticos para o fígado (isto é, para aumentar a partição de lipidos dietéticos para o tecido adiposo) . A actividade de compostos que aumentam a partição de lipidos dietéticos para o fígado (incluindo AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq ou compostos possuindo pelo 60 menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) pode ser reduzida utilizando uma variedade de métodos, incluindo os métodos descritos abaixo. A partição de lipidos dietéticos para o fígado também pode ser aumentada preparando um anticorpo que se ligue à subunidade γ, ao receptor da Clq (gClq-R) ou a uma proteína relacionada com estes, bem como fragmentos destas proteínas. Esses anticorpos podem modular a interacção entre o LSR e a subunidade γ, o receptor da Clq (gClq-R) ou uma proteína relacionada com estes de um modo que aumente a partição de lipidos dietéticos para o fígado. Os anticorpos podem ser qualquer um dos anticorpos descritos abaixo.

Num procedimento para reduzir a actividade de um composto que aumente a partição de lipidos dietéticos para o fígado, administra-se a um indivíduo um anticorpo que iniba a actividade do composto. O anticorpo pode ser policlonal ou monoclonal.

Podem obter-se anticorpos policlonais capazes de se ligarem especificamente a um composto que aumente a partição de lipidos dietéticos para o fígado utilizando o composto (ou respectivo fragmento) como imunogene nos procedimentos descritos no Exemplo 1 acima. Alternativamente, podem gerar-se anticorpos policlonais contra a subunidade γ, receptor da Clq (gClq-R) ou uma 61 proteína relacionada com estes, bem como fragmentos destas proteínas.

Podem preparar-se anticorpos monoclonais para compostos que aumentem a partição de lípidos dietéticos para o fígado a partir de hibridomas murinos de acordo com o método clássico de Kohler, G., e Milstein, C., Nature 256: 495 (1975) ou métodos derivados deste. Em resumo, um ratinho é repetidamente inoculado com alguns microgramas do composto ou respectivo fragmento (como AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq ou compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) durante um período de algumas semanas. Alternativamente, podem gerar-se anticorpos monoclonais contra a subunidade γ, receptor da Clq (gClq-R) ou uma proteína relacionada com estes, bem como fragmentos destas proteínas.

Em seguida, o ratinho é sacrificado e isolam-se as células do baço produtoras de anticorpos. As células do baço são fundidas, empregando polietilenoglicol, a células de mieloma de ratinho e o excesso de células não fundidas é destruído por crescimento do sistema em meio selectivo compreendendo aminopterina (meio HAT). As células fundidas com êxito são diluídas e colocam-se alíquotas da diluição em cavidades de uma placa de microtítulo, onde se continua o crescimento da cultura. Identificam-se clones produtores de anticorpos por detecçâo de anticorpos no fluido sobrenadante das cavidades através de procedimentos de imunoensaio, como Elisa, como originalmente descrito por 62

Engvall, E., Meth. Enzymol. 7_0; 419 (1980), e métodos derivados deste. Os clones positivos seleccionados podem ser expandidos e o seu produto de anticorpos monoclonais pode ser recolhido para ser utilizado. Procedimentos pormenorizados de produção de anticorpos monoclonais são descritos em Davis, L., et al., "Basic Methods in Molecular Biology" Elsevier, Nova Iorque, Secção 21-2.

Podem identificar-se anticorpos capazes de inibir a actividade de compostos que aumentem a partição de lipidos dietéticos para o fígado (incluindo AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) contactando o composto com quantidades crescentes dos anticorpos monoclonais ou policlonais antes de conduzir ou durante a realização do ensaio descrito no Exemplo 5 com o composto. Os anticorpos que reduzem a ligação, interiorização e/ou degradação no ensaio de hepatócitos de rato podem ser testados quanto à actividade in vivo administrando a ratinhos quantidades crescentes dos anticorpos e determinando a capacidade dos anticorpos para inibirem a redução mediada pelo composto na resposta de triglicéridos pós-prandial no ensaio descrito no Exemplo 6 acima, a capacidade dos anticorpos para inibirem a redução mediada pelo composto nos triglicéridos no plasma no ensaio descrito no Exemplo 7 acima, a capacidade dos anticorpos para inibirem a redução mediada pelo composto de ingestão de alimentos em ratinhos obesos no ensaio descrito no Exemplo 8 acima ou a capacidade dos anticorpos para 63 inibirem a perda de peso mediada pelo composto no ensaio descrito no Exemplo 7. A partição de lípidos dietéticos para o figado também pode ser reduzida preparando um anticorpo que se ligue à subunidade γ, ao receptor da Clq (gClq-R) ou a uma proteína relacionada com estes, bem como fragmentos destas proteínas. Esses anticorpos podem modular a interacção entre AdipoQ, ApMl ou proteínas análogas e a subunidade γ, o receptor da Clq (gClq-R) ou uma proteína relacionada com estes de um modo que reduza a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Os anticorpos podem ser quaisquer dos anticorpos descritos acima.

Alternativamente, a partição de lípidos dietéticos para 0 fígado também pode ser reduzida utilizando fragmentos de anticorpos que retenham a capacidade para se ligarem especificamente à AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14, subunidade γ, o receptor da Clq (gClq-R) ou uma proteína relacionada com estes. Por exemplo, os fragmentos podem ser fragmentos Fab, que podem ser preparados utilizando métodos familiares aos experimentados na área.

Alternativamente, os anticorpos podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos de cadeia única. Uma variedade de métodos para preparar anticorpos humanizados 64 ou anticorpos de cadeia única é familiar aos experimentados na área, incluindo as técnicas descritas nas Patentes U.S. N°s 5 705 154, 5 565 332 e 5 608 039.

Em seguida, os anticorpos que inibem os efeitos mediados pelo composto em um ou mais dos ensaios descritos acima podem ser utilizados em medicamentos para reduzir a actividade de compostos que aumentem a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Os anticorpos podem ser administrados a indivíduos num transportador farmaceuticamente aceitável, como os descritos acima.

Alternativamente, a actividade de um composto que aumente a partição de lípidos dietéticos para o fígado pode ser reduzida utilizando derivados do composto que inibem a sua actividade. Por exemplo, podem preparar-se derivados de compostos que aumentam a partição de lípidos dietéticos para o fígado (como derivados de AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq ou compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) utilizando os procedimentos de mutagénese ou química combinatorial descritos acima em conjunção com a preparação de derivados possuindo actividade aumentada relativamente ao tipo selvagem.

Proteínas ou péptidos derivados produzidos utilizando os procedimentos acima podem ser utilizados em medicamentos para reduzir a actividade de compostos que aumentam a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Essas 65 proteínas ou péptidos mutantes podem reduzir a actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado (incluindo AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq ou compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14) por uma variedade de mecanismos, que incluem actuação como antagonistas da ligação das proteínas de tipo selvagem aos seus ligandos. Por exemplo, os antagonistas podem ter actividade reduzida e, assim, podem reduzir a actividade do composto competindo com ele.

Podem identificar-se proteínas ou péptidos derivados capazes de inibirem a actividade da proteína de tipo selvagem determinando a sua capacidade para bloquear a actividade das proteínas de tipo selvagem em ensaios tais como o ensaio de hepatócitos de rato do Exemplo 5, o ensaio de resposta lipémica pós-prandial do Exemplo 6, o ensaio de triglicéridos no plasma do Exemplo 7, o ensaio de ingestão de alimentos do Exemplo 8 ou o ensaio de perda de peso do Exemplo 7. Alternativamente, podem avaliar-se as proteínas ou péptidos derivados determinando a sua capacidade para aumentar a ingestão de alimentos ou originar ganho de peso quando administrados nos ensaios dos Exemplos 7 e 8.

As proteínas ou péptidos derivados que inibem a actividade das proteínas de tipo selvagem podem ser utilizados em medicamentos para reduzir a actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Nesses medicamentos, a proteína ou péptido 66 derivado pode ser administrado ao indivíduo num transportador farmaceuticamente aceitável, como os descritos acima. A proteína ou péptido derivado pode ser administrado por qualquer uma das vias e em qualquer uma das dosagens descritas acima.

Adicionalmente, como discutido acima, podem obter-se moléculas pequenas, fármacos ou outros compostos que reduzam a actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado utilizando uma variedade de abordagens de síntese familiares aos experimentados na área, incluindo técnicas à base de química combinatorial. Podem avaliar-se moléculas pequenas, fármacos ou outros compostos candidatos determinando a sua capacidade para inibir a actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado no ensaio de hepatócitos de rato do Exemplo 5. Os compostos que inibem a actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado no ensaio de hepatócitos de rato podem ser suplementarmente avaliados no ensaio de resposta lipémica pós-prandial do Exemplo 6, no ensaio de triglicéridos no plasma do Exemplo 7, no ensaio de ingestão de alimentos do Exemplo 8 ou no ensaio de perda de peso do Exemplo 8.

Assim, a presente invenção revela um agente que aumenta a actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado para utilização como agente farmacêutico. Em particular, o agente pode ser utilizado para tratar um estado seleccionado do grupo que consiste em obesidade, aterosclerose relacionada com obesidade, resistência à insulina relacionada com obesidade, hipertensão relacionada com obesidade, lesões 67 microangiopáticas relacionadas com obesidade, lesões oculares relacionadas com obesidade, lesões renais relacionadas com obesidade e outros estados em que seja desejável aumentar a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Em particular, os estados precedentes podem ser tratados administrando a um indivíduo que sofra dos estados precedentes uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado num transportador farmaceuticamente aceitável. Nalgumas especificações, o medicamento pode ser administrado a um indivíduo para o qual se tenha determinado que tem uma nível inferior ao normal de actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Em particular, o medicamento pode compreender AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq ou compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, ou compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14. Alternativamente, o medicamento pode compreender um derivado dos compostos precedentes que exiba maior actividade do que o composto de tipo selvagem ou um ácido nucleico que aumente o nivel de expressão dos compostos precedentes no indivíduo.

Noutro aspecto, a presente invenção revela um agente que inibe a actividade de um composto que aumenta a partição de lípidos dietéticos para o fígado para utilização como agente farmacêutico. O agente farmacêutico pode ser utilizado para tratar um estado seleccionado do grupo que consiste caquexia em sujeitos com síndroma neoplástica ou para-neoplástica, perturbações de 68 alimentação e outros estados em que seja desejável reduzir a partição de lipidos dietéticos para o fígado. Em particular, os estados precedentes podem ser tratados administrando a um indivíduo que sofra dos estados precedentes uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que inibe a actividade de um composto que aumenta partição de lipidos dietéticos para o fígado num transportador farmaceuticamente aceitável. Nalgumas especificações, o medicamento pode ser administrado a um indivíduo para o qual se tenha determinado que tem um nível superior ao normal de actividade de um composto que aumenta a partição de lipidos dietéticos para o fígado. Em particular, o medicamento pode compreender um agente que inibe a actividade de AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, um composto possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, ou um composto compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14. Por exemplo, o medicamento pode compreender um anticorpo que inibe a actividade de AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, um composto possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, ou um composto compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia com uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14. O medicamento também pode compreender um derivado de AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, compostos possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, e compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo 69 menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14. Alternativamente, o medicamento pode compreender um ácido nucleico, como um ácido nucleico anti-sentido ou um ácido nucleico que forme uma hélice tripla, que altere a expressão ou diminua o nivel da expressão de AdipoQ, ApMl, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, um composto possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, ou um composto compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14 no indivíduo.

Indivíduos obesos expressam níveis inferiores ao normal de AdipoQ ou compostos relacionados com AdipoQ (Hu et al., J. Biol. Chem. 271: 10697-10703 (1996)). Indivíduos obesos com actividade decrescida de AdipoQ, ApMl ou compostos análogos no seu plasma, fluidos corporais ou tecidos corporais podem estar em risco de desenvolver uma variedade de estados associados a partição de níveis inferiores ao normal de lípidos dietéticos para o fígado (isto é, partição de níveis superiores ao normal de lípidos dietéticos para os tecidos adiposos). Em particular, esses indivíduos podem sofrer de aterosclerose relacionada com obesidade, resistência à insulina relacionada com obesidade, hipertensão relacionada com obesidade, lesões microangiopáticas relacionadas com obesidade, lesões oculares relacionadas com obesidade e lesões renais relacionadas com obesidade.

Noutro aspecto, a presente invenção revela métodos para identificar moléculas que se ligam à subunidade γ. Como 70 discutido acima, a subunidade γ pode ser o receptor da Clq (gClq-R) ou uma proteína relacionada com aquele. Em conformidade, como utilizado abaixo, a terminologia "subunidade γ" referir-se-á a gClq-R ou à proteína relacionada que constitui a subunidade γ do complexo de LSR.

Moléculas que se ligam à subunidade γ podem ser utilizadas nos medicamentos e métodos da presente invenção para aumentar ou diminuir a partição de lípidos dietéticos para o fígado. Por exemplo, essas moléculas podem actuar como agonistas ou antagonistas para estimular ou diminuir a actividade do LSR. Há numerosos métodos disponíveis para identificar ligandos da subunidade γ. Um desses métodos é descrito na Patente U.S. N° 5 270 170, cuja revelação é aqui incorporada por referência. Em resumo, neste método constrói-se uma biblioteca de péptidos aleatórios. A biblioteca de péptidos aleatórios compreende uma pluralidade de vectores que codificam fusões entre péptidos a serem testados quanto à actividade de ligação da subunidade γ e uma proteína de ligação a DNA, como o repressor lac codificado pelo gene lacl. Os vectores presentes na biblioteca de péptidos aleatórios também contêm sítios de ligação para a proteína de ligação a DNA, como o sítio lacO no caso da proteína de ligação a DNA ser o repressor lac. A biblioteca de péptidos aleatórios é introduzida numa célula-hospedeiro, onde a proteína de fusão é expressa. Em seguida, as células-hospedeiro são submetidas a lise em condições que permitem que a porção de 71 ligação a DNA da proteína de fusão se ligue aos sítios de ligação de DNA do vector.

Os vectores com as proteínas de fusão ligadas entram em contacto com a subunidade γ imobilizada, ou um fragmento imobilizado da subunidade γ, em condições que permitem que os péptidos se liguem especificamente. Por exemplo, a subunidade γ ou respectivo fragmento pode ser imobilizado fixando-o a uma superfície, como uma placa de plástico ou uma partícula. Em particular, o fragmento imobilizado da subunidade γ pode compreender o sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl.

Os vectores que codificam péptidos aleatórios capazes de se ligarem à subunidade γ imobilizada, ou respectivo fragmento, ou ao respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, ficarão especificamente retidos na superfície via a interacção entre o péptido e a subunidade γ, um fragmento da subunidade γ ou respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl.

Alternativamente, podem identificar-se moléculas capazes de se ligarem à subunidade γ utilizando sistemas de dois híbridos, como o Sistema de Dois Híbridos Matchmaker 2 (N° do Catálogo K1604-1, Clontech). Como descrito no manual que acompanha o Sistema de Dois Híbridos Matchmaker 2 (N° do Catálogo K1604-1, Clontech), ácidos nucleicos que codificam a subunidade γ, respectivo fragmento ou fragmento compreendendo o sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, são inseridos num vector de expressão de modo a ficarem na estrutura com DNA que codifica o domínio de ligação de DNA do activador de transcrição de levedura GAL4. Ácidos 72 nucleicos presentes numa biblioteca que codifica proteínas ou péptidos que poderão interagir com a subunidade γ, um fragmento da subunidade γ ou o sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, são inseridos num segundo vector de expressão de modo a ficarem na estrutura com DNA que codifica o domínio de activação de GAL4 . Os dois plasmídeos de expressão são transformados em levedura e a levedura é plaqueada em meio de selecção que selecciona quanto à expressão de marcadores seleccionáveis em cada um dos vectores de expressão, bem como expressão dependente de GAL4 do gene HIS3. Os transformantes capazes de crescer em meio sem histidina são rastreados quanto à expressão de lacZ dependente de GAL4. As células que são positivas na selecção por histidina e no ensaio de lacZ contêm plasmídeos que codificam proteínas ou péptidos que interagem com a subunidade γ, respectivo fragmento ou sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl.

Alternativamente, para estudar a interacção da subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl com fármacos ou moléculas pequenas, como moléculas geradas por abordagens de química combinatorial, pode utilizar-se o método de microdiálise acoplada a HPLC descrito por Wang et al., Chromatographia, 4_4, 205-208 (1997) ou o método de electroforese capilar de afinidade descrito por Busch et ai., J. Chromatogr. 111: 311-328 (1997), cujas revelações são aqui incorporadas por referência.

Noutros métodos, podem identificar-se proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequenas ou outros compostos 73 que interajam com a subunidade γ, respectivo fragmento ou fragmento compreendendo o respectivo sitio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, utilizando ensaios tais como o seguinte. A molécula a ser testada quanto à ligação é etiquetada com uma etiqueta detectável, como um marcador fluorescente, radioactivo ou enzimático, e é contactada com subunidade γ imobilizada, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sitio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, em condições que permitam a ocorrência de ligação especifica. Após a remoção de moléculas ligadas de forma inespecifica, as moléculas ligadas são detectadas utilizando meios apropriados.

Alternativamente, podem identificar-se proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequenas ou outros compostos que se liguem à subunidade γ, respectivo fragmento ou fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, utilizando experiências de competição. Nesses ensaios, a subunidade γ, respectivo fragmento ou fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, é imobilizado numa superfície, como uma placa de plástico. Quantidades crescentes das proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequenas ou outros compostos são contactadas com a subunidade γ imobilizada, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, na presença de um ligando conhecido da subunidade γ etiquetado de forma detectável, como AdipoQ, Clq, qualquer um dos compostos descritos acima análogos a Clq, um composto possuindo pelo menos a sequência de consenso da ID SEQ NO: 1 e, opcionalmente, ID SEQ NO: 2, ou um composto compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo 74 menos 80% de homologia relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste nas ID SEQ NOs: 7-14. Por exemplo, o ligando da subunidade γ pode ser etiquetado de forma detectável com um marcador fluorescente, radioactivo ou enzimático. Determina-se a capacidade da molécula de teste para se ligar à subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sitio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, medindo a quantidade do ligando conhecido etiquetado de forma detectável ligado na presença da molécula de teste. Um decréscimo da quantidade do ligando conhecido ligado à subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sitio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, quando a molécula de teste está presente indica que a molécula de teste é capaz de se ligar à subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sitio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl. Este método pode ser utilizado para identificar compostos que se ligam à subunidade γ e que, em consequência, representam agonistas ou antagonistas potenciais da actividade do LSR que podem ser explorados nos medicamentos descritos acima.

Proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequenas ou outros compostos que interagem com a subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, também podem ser rastreados utilizando um Biossensor Óptico, como descrito em Edwards e Leatherbarrow, Analytical Biochemistry, 246, 1-6 (1997). A principal vantagem do método é o facto de permitir determinar a taxa de associação entre a subunidade γ e outras moléculas que interagem. Assim, é possível seleccionar especificamente 75 moléculas que interagem com uma taxa de associação elevada ou baixa. Tipicamente, uma molécula-alvo é ligada à superfície do sensor (por intermédio de uma matriz de carboximetildextrano) e uma amostra de moléculas de teste é contactada com as moléculas-alvo. A ligação de uma molécula de teste à molécula-alvo altera o índice de refracção e/ou a espessura. Esta alteração é detectada pelo Biossensor desde que ocorra no campo evanescente (que se prolonga por algumas centenas de nanómetros desde a superfície do sensor). Nestes ensaios de rastreio, a molécula-alvo pode ser a subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, e a amostra de teste pode ser uma colecção de proteínas extraídas de tecidos ou células, uma reunião de proteínas expressas, bibliotecas combinatoriais de péptidos e/ou químicas, péptidos de expressão em fagos, fármacos, moléculas pequenas ou outros compostos. Os tecidos ou células de onde são extraídas as proteínas de teste podem ser originários de qualquer espécie.

Proteínas ou outras moléculas que interagem com a subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, também podem ser encontradas utilizando colunas de afinidade que contenham a subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl. A subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, pode ser ligado à coluna utilizando técnicas convencionais, incluindo acoplamento químico a uma matriz de coluna adequada, como agarose, Affi Gel ou outras matrizes 76 familiares aos experimentados na área. Nalgumas versões deste método, a coluna de afinidade contém proteínas quiméricas nas quais a subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sitio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, está fundido a glutationa-S-transferase. Aplica-se na coluna de afinidade uma mistura de proteínas celulares ou reunião de proteínas expressas como descrito acima. Em seguida, proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequenas ou outras moléculas que interagem com a subunidade γ, respectivo fragmento ou um fragmento compreendendo o respectivo sítio de ligação de Clq, AdipoQ ou ApMl, ligados à coluna, podem ser isolados e analisados em gel de electroforese 2-D como descrito em Ramunsen et al., Electrophoresis, .18, 588-598 (1997). Alternativamente, as proteínas ou outras moléculas retidas na coluna de afinidade podem ser purificadas por métodos baseados em electroforese e ser sequenciadas. Pode utilizar-se o mesmo método para isolar anticorpos, para rastrear produtos de expressão em fagos ou para rastrear anticorpos humanos de expressão em fagos.

Os compostos identificados utilizando os métodos acima podem ser rastreados para determinar, do modo seguinte, se actuam como agonistas ou antagonistas da actividade do LSR. Os compostos que são agonistas aumentarão a actividade do LSR em um ou mais ensaios seleccionados do grupo que consiste no ensaio de hepatócitos de rato do Exemplo 5, o ensaio de resposta lipémica pós-prandial do Exemplo 6, o ensaio de triglicéridos no plasma do Exemplo 7, o ensaio de ingestão de alimentos do Exemplo 8 ou o ensaio de peso do corpo do Exemplo 7. Esses compostos são úteis nos medicamentos discutidos acima para tratar estados em que 77 seja desejável aumentar a partição de lípidos dietéticos para o figado.

Alternativamente, os compostos que são antagonistas da actividade do LSR inibirão a actividade de AdipoQ em um ou mais ensaios seleccionados do grupo que consiste no ensaio de hepatócitos de rato do Exemplo 5, o ensaio de resposta lipémica pós-prandial do Exemplo 6, o ensaio de triglicéridos no plasma do Exemplo 7, o ensaio de ingestão de alimentos do Exemplo 8 ou o ensaio de peso do corpo do Exemplo 7. Esses compostos são úteis nos medicamentos discutidos acima para tratar estados em que seja desejável reduzir a partição de lípidos dietéticos para o fígado. 78

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) CANDIDATO: (A) NOME: GeiiSêt Èh (B) RUA: 24, Rue Royale

(C) CIDADE: PARIS (E) PAÍS: França (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75008 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Medicamentos reguladores de lipoproteínas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 14 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: Win95 (D) "SOFTWARE": Word (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens 79 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 1 PheXÍ5HAsnAsp3XÍ4i [FheTyrTrpLeuJXfSi PheX(5)GlyXTyr}tPhi2 XtPheTyr] 31 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 2 {SerThr3 XPhe [SerTh3 Gly íPheTyr] Leu [ LéttVal ] I FheTyr3 9 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 3 80

Lh&u Arg Cys Vai Pr o Arg Vai Leu Gly Ser Ser Vai Ala Gly Tyr' 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 4

Cys Tyr II® Thr Phe Leu Giu Asp Leu Lys Ser Fhe Vai Lys Ser Gin 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Idêntico a 58 .. 73 na ref. U49915 (B) LOCALIZAÇÃO: 12 .. 27 81 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 5 CTACATGGAT CCAGTCATGC CGAAGAT 27 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Idêntico a 745 .. 762 na ref. U49915 (B) LOCALIZAÇÃO: 11 .. 28 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 6 CGACM.CTCG AGTCAGTTGG TATCATGG 28 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 129 aminoácidos

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO 82 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 117-245 da ref. P02745 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1... (B) LOCALIZAÇÃO: 17-47 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1... (B) LOCALIZAÇÃO: 118-126 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 7

Phe Ser .Ala ile Arg Arg Asn Prct Pr o Met Gly Gly Asa Vai Vai Ile 1 5 10 15

Phe Asp Thr Vai Ile Thr Asn Gin Glu Glu Pro Tyr Gin Asn His Ser 20 25· 30

Gly Arg Phé Vai Cys Thr Vai Pro Gly Tyr Tyr Tyr Phe Thr Phe Gin 35 40 45

Vai Leu Ser Gin Trp Glu Ile Cys Leu Ser lie Vai Ser Ser Ser Arg 50 55 60

Gly Gin Vai Arg Arg Ser Leu Gly Phe Cys Asp Thr Thr Asn L.ys Gly 83 65 70 75 80

Leu Phe Gin Vai Vai Ser Gly Gly Vai Leu Gin Leu Gin Gin Gly 85 §0 95

Asp Gin Vai Trp Vai Glu Lys Asp Pro Lys Lys Gly Kis Ile Tyr Gin 10D 105 110

Gly Ser Glu Ala Asp Ser Vai Phe Ser Gly Phe Leu Ile Phe Pro Ser 115 120 125

Ala (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 130 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 122-251 da ref. P02745. (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1... (B) LOCALIZAÇÃO: 19-49 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 2. 84 (B) LOCALIZAÇÃO: 117-125 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 8 phe Ser Ala Thr Arg Thr lie Asn Vai Pro Leu Arg Arg Asp Gin Thr 1 5 10 15

Ile Arg Phe Asp Kis vai ile Thr Asn Mel Asn Asn Asn Tyr Giu Pro 20 25 30

Arg Ser Gly Lys Phe Thr Cys Lys Vai Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Thr 35 40 45

Tyr His Ala Ser Ser Arg Gly Asn Leu Cys VaX Asn Leu Met Arg Gly 50 55 60

Arg Glu Arg Ala Gin. Lys Vai Vai Thr Phe cys Asp Tyr Ala Tyr Asn 65 7Ό 75 80

Thr Phe Gin Vai Thr Thr Gly Gly Met Vai Leu Lys LêU Glu Gin Gly 85 90 95

Glu Asn Vai Phe Leu Gin Ala Thr ASp Lys Asn Ser Leu Leu Gly Met 100 105 110

Glu Gly Ala Asn Ser lie Phe Ser Gly Phe Leu Leu Phe Pro Asp Met 115 120 125

Glu Ala 130 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 124 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR 85

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 121-244 da ref. P02745 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1. (B) LOCALIZAÇÃO: 19-49 (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 2. (B) LOCALIZAÇÃO: 114-122 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 9

Thr Vai Thr Arg Gin Thr Bis Gin Pro Pro Ala Pro Asn Ser Leu 1 5 10 15

Xle Arg Phe Asn Ala Vai Leu Thr Asn Pro Gin Gly Asp Tyr Asp Thr ao 25 30

Ser Thr Gly Lys Phe Thr Cys Lys vai Pro Gly Leu Tyr Tyr Pbe vai 35 40 45

Tyr Bis Ala Ser His Thr Ala Asn Leu Cys Vai Leu Leu Tyr Arg Ser 50 55 60

Gly Vai Lys Vai Vai Thr Phe Cys Gly His Thr Ser Lys Thr Asn GXn

65 70 75 SO

Vai Asn Ser Gly Gly Vai Leu Leu Arg Leu Gin Vai Gly Glu Glu Vai B5 90 95

Trp Leu Ala Vai Asn Asp Tyr Tyr Asp Met Vai Gly Ile Gin Gly Ser 86 100 .105 110

Asp Ser Vai Phe Ser Gly Phe Leu Leu Phe Pro Asp 115 120 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 130 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapíens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 64-193 da tradução da ref. M58583 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1 (B) LOCALIZAÇÃO: 23-53 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 2 (B) LOCALIZAÇÃO: 120-128 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 10 10 1$

Phe Set Ala Lie Arg Set Thr Agn His Glu Prq Ser Glu Mefc Ser Asm 1 5 87

Arg Thr ífet Ile Ile Tyr Phe Asp Gin Vai Leu Vai Asn Ile Gly Asn 20 25 30

Asn Phe Asp Ser 61« Arg Ser Thr Phe Ile Ala Pro Arg Ly$ Qly Ile 35 40 45

Tyr Ser Phe Asa Phe His Vai Vai Lys Vai Tyr Asn Arg Gin Thr lie 59 55 60

Gin Vai Ser Leu Mêt Leu Asn Gly Trp Pro Vai Ile Ser Ala Phe Ala 65 70 75 80

Gly Asp Gin Asp Vai Thr Arg Glu Ala Ala Ser Asn Gly Vai Leu Ile 85 . 90 95

Gin Mefc Glu Lys Gly Asp Arg Ala Tyr Leu Lys Leu Glu Arg Gly Asn 100 105 110

Leu Met Gly Gly Trp Lys Tyr Ser Thr Phe Ser Gly Phe Leu Vai Phe 115 120 125

Pro Leu 130 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 130 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 115-244 da tradução da ref. D45371 (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1 (B) LOCALIZAÇÃO: 18-48 (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 2 (B) LOCALIZAÇÃO: 118-126 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 11

Ph« Ser Vai Gly Leu Glu Thr Tyr 1 5

Arg Phe Thr Lys .1.1 e Phe Tyr Asn 20

Thr Gly Lys phe Mis Cys A$n 11$ 35 40

Eis lie Thr Vai Tyr Mat Lys Asp 50 55

Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr 85 70

Asp Gin Ala Ser Gly Ser Vai Leu 85

Vai Trp Leu Gin Vai Tyr Gly Glu 100

Asp Asn Asp Asa Asp Ser Thr The 115 120

Thr Asn 130

Vai Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile 10 15

Gin Gin Asn His Tyr Asp Gly Ser 25 30

Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr 45

Vai Lys Vai Ser Leu Phe Lys Lys 60

Asp Gin Tyr Gin Glu Asn Asn Vai 75 80

Leu Híe Leu Glu Vai Gly Asp Gin 90 95

Gly Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala 105 110

Thr Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp

12 S (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 12: 89 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 130 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: músculo Mus (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 118-247 da tradução da ref. U49915 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1 (B) LOCALIZAÇÃO: 18-48 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 2 (B) LOCALIZAÇÃO: 118-126 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 12

Phe Ser Vai Gly Leu Glu Thr Arg Vai Thr Vai Pro Asn Vai Pro Ile 1 S 10 15

Arg Phe Thr iye Ile Phe fyr Asn Gin Gin Asn His Tyr Asp Asn Ser 20 25 30

Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Asn. ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ser Tyr 90 35 40 45

His Ué Thr Vai Tyr Ket Lys Asp Vai Lys Vai Ser Leu Phe Lys Lys 50 55 60

Asp Lys Ala Vai Leu Phe Thr Tyr Asp Gin Tyr Gin Glu Lys Asn Vai 65 70 75 80

Asp Gin Ala Ser Gly Ser Vai Leu Leu His Leu Glu Vai Gly Asp Gin 85 90 95

Vai Trp Leu Gin Vai Tyr Gly Asp Gly Asp His Asn Gly Leu Tyr Ma 100 105 no

Asp Asn Vai Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Fhe His Asp 115 120 125

Thr Asn 130 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 130 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: músculo Mus (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 118-267 da tradução da ref. U37222 (ix) CARACTERÍSTICA: 91 (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1 (B) LOCALIZAÇÃO: 18-48 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 2 (B) LOCALIZAÇÃO: 118-126 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 13

Phe Ser Vál Gly Leu Glu Thr Arg Vai Thr Vai Pro Asm Vai Pro Xle 1 5 .10 15

Arg Phe Thr Lys IIe Phe Tyr Asn Gin Gin Asn His Tyr Asp Gly Ser 20 25 30

Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr phe Ser Tyr 35 40 45

His Xle Thr Vai Tyr Met Lys Asp Vai Lys Vai Ser Leu Phe Lys Lys 50 55 60

Asp Lys Ala Vai Leu Phe Thr Tyr Asp Gin Tyr Gin Glu Lys Asn Vai 6$ 70 75 80

Asp Gin Ala Ser Gly Ser Vai Leu Leu His Leu Glu Vai Gly Asp Gin 85 90 95

Vai Trp Leu Gin Vai Tyr Gly Asp Gly Asp His Asn Gly Leu Tyr Ala 100 105 110

Asp Asn Vál Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp 115 120 125

Thr Asn 130 92 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 126 aminoácidos

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) FILAMENTAÇÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: fragmento 1161-1286 da tradução da ref. U27109 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 1 (B) LOCALIZAÇÃO: 17-47 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Caixa de consenso correspondente a ID SEQ 2 (B) LOCALIZAÇÃO: 116-124 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 14

Fhe Phe Ais Ser Eis Thr Tyr Gly Met Thr Ile Pro Gly Pro Ile Leu 1 S 10 15

Phe As» Asm, Leu Asp Vai Asm Tyr Gly Ala Ser Tyr Thr Pro Arg Thr 20 25 30

Gly Lys Phe Arg Ile pro Tyr Lôíí Gly Vai Tyr Vai Phe Lys Tyr Thr 35 40 45

Ile Glu Ser Phe Ser Ala His He Ser Gly Phe Leu Vai Vai Asp Gly 93 50 55 - 60

Ile Asp Lys Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ãsb Xle Asn Ser Glu Ile His 65 70 75 80

Cys Asp Arg Vai Leu Thr Gly Asp Ala Leu Leu Glu Leu Asn Tyr Gly

85 90 9S

Gin Glu Vai Trp Leu Arg Leu Ala Lys Gly Thr Ile Pro Ala Lys Phe 100 105 lio

Pro Pro Vai Thr Thr Phe Ser Gly Tyr Leu Leu Tyr Arg Thr 115 120 125

Lisboa, 26 de Novembro de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto que activa o Receptor Estimulado pela Lipólise, que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste na ID SEQ NO: 7, ID SEQ NO: 8, ID SEQ NO: 9, ID SEQ NO: 10 e ID SEQ NO: 14, no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença ou perturbação relacionada com obesidade.

2. Utilização da Reivindicação 1, em que a referida sequência de aminoácidos consiste numa sequência seleccionada do grupo que consiste na ID SEQ NO: 7, ID SEQ NO: 8, ID SEQ NO: 9, ID SEQ NO: 10 e ID SEQ NO: 14.

3. Utilização das Reivindicações 1 e 2 para o fabrico de uma composição farmacêutica, em que a referida composição farmacêutica também compreende um transportador farmaceuticamente aceitável.

4. Utilização das Reivindicações 1 até 3, em que a referida doença ou perturbação relacionada com obesidade é seleccionada do grupo que consiste em aterosclerose relacionada com obesidade, resistência à insulina relacionada com obesidade, hipertensão relacionada com obesidade, lesões microangiopáticas resultantes de diabetes de Tipo II relacionada com obesidade, lesões oculares causadas por microangiopatia em sujeitos obesos com diabetes de Tipo II e lesões renais causadas por microangiopatia em sujeitos obesos com diabetes de Tipo II. 2

5. Utilização das Reivindicações 1 até 3 no fabrico de um medicamento para tratar um estado em que a partição de lipidos para o figado é anormal.

6. Utilização das Reivindicações 1 até 3 no fabrico de um medicamento para reduzir a ingestão de alimentos em indivíduos obesos, reduzir os níveis de ácidos gordos livres em indivíduos obesos ou diminuir o peso do corpo de indivíduos obesos.

7. Utilização das Reivindicações 1 até 6, em que o referido composto compreende um polipéptido seleccionado do grupo que consiste em Clq, cerebelina e multimerina no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença ou perturbação relacionada com obesidade.

8. Método de identificação de um composto candidato para modular uma actividade do Receptor Estimulado pela Lipólise, que compreende: a) contactar o referido Receptor Estimulado pela Lipólise com uma ou mais moléculas de teste na presença de um composto que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade relativamente a uma sequência seleccionada do grupo que consiste na ID SEQ NO: 7, ID SEQ NO: 8, ID SEQ NO: 9, ID SEQ NO: 10, ID SEQ NO: 11, ID SEQ NO: 12, ID SEQ NO: 13 e ID SEQ NO: 14, e b) determinar se as referidas uma ou mais moléculas de teste modulam a interacção do referido composto com o referido Receptor Estimulado pela Lipólise, em que a modulação da referida interacção identifica um referido composto candidato. 3 3 ou que

9. Método da Reivindicação 8, em que as referidas uma mais moléculas de teste são seleccionadas do grupo consiste em péptidos, fármacos e moléculas pequenas. Lisboa, 26 de Novembro de 2007