PT1701978E

PT1701978E - Utilização de caderina-t solúvel no tratamento de distúrbios metabólicos

Info

Publication number: PT1701978E
Application number: PT04812804T
Authority: PT
Inventors: Christopher Hug; Harvey F Lodish
Original assignee: Whitehead Biomedical Inst
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2009-03-03
Also published as: NO20062975L; WO2005057222A2; DK1701978T3; ES2320139T3; ATE422506T1; CA2546126A1; JP2007519894A; DE602004019451D1; IL175862A; CY1109014T1; EP1701978B1; WO2005057222A3; AU2004297914A1; SI1701978T1; EP1701978A2; RS50754B; IL175862A0; US20070212686A1; PL1701978T3; HRP20090119T3

Description

1

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE CADERINA—T SOLÚVEL NO TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS METABÓLICOS"

Area da Invenção

Esta invenção relaciona-se com a utilização de polipéptidos de caderina-T para tratar um distúrbio metabólico. Os distúrbios metabólicos que podem ser tratados utilizando um modulador de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia, sindrome X, anorexia e caquexia.

Antecedentes da Invenção

1. Caderina-T

As caderinas constituem uma grande família de proteínas da superfície celular envolvidas nas interacções e sinalização célula-célula mediadas por cálcio. As caderinas exibem especificidade em relação ao tipo de célula e desenvolvimento no que se refere à expressão e estão reguladas de modo aberrante em várias doenças malignas humanas (ver, por exemplo, Conacci-Sorrell et al. , 2002). A caderina-T, também conhecida como caderina-H ou caderina-13, está ligada à membrana através de uma âncora GPI na extremidade C (Tanihara et al., 1994). Em comparação com outros membros da família de caderinas, a caderina-T não tem o domínio transmembranar e é libertada da superfície da célula pelo tratamento das células com fosfatidilinositol 2 fosfolipase-C. A caderina-T foi inicialmente detectada no sistema nervoso, mas a sua distribuição no tecido é mais disseminada, com uma expressão mais elevada no sistema cardiovascular e niveis mais baixos no músculo. Na vasculatura, está localizada na intima e média e é expressada nas células endoteliais e do músculo liso (Ivanov et al., 2001).

Existem duas formas de caderina-T na superfície celular. Uma delas, um polipéptido de 135 kDa, sofre dissociação na proximidade da extremidade N para gerar uma segunda forma de 105 kDa (Tkachuk et ai., 1998) . Ambas as formas da proteína encontram-se na superfície celular, onde são capazes de se ligar a partículas de LDL através da associação da âncora GPI com as lipoproteínas (Niermann et al., 2000) .

Embora não se conheçam quaisquer percursos de sinalização que envolvam a caderina-T foi sugerido que a caderina-T pode participar na sinalização através da sua associação com outras proteínas da membrana e incorporação em domínios lipídicos específicos da membrana celular (Doyle et al., 1998). Foi demonstrado que a caderina-T pode regular o crescimento de células no sistema nervoso (Takeuchi et al., 2000). Além do mais, a caderina-T suprime o crescimento de astrócitos e encontra-se reduzida numa linha de células de glioblastoma (Huang et al., 2003). Foi também sugerido que a caderina-T pode estar envolvida no controlo da arquitectura vascular normal e na sua remodelação durante a aterogénese (Ivanov et al., 2001). A US 6358920 descreve um grande número de péptidos curtos derivados de mais de 20 caderinas diferentes. Ela apenas se 3 refere vagamente ao tratamento dos distúrbios metabólicos diabetes e obesidade por agentes de modulação que compreendem um octapéptido que representa uma sequência de aminoácidos de reconhecimento da adesão celular. A W099/19477 ensina que os péptidos, que se dissociam das Pró-caderinas quando estas estão a ser processadas nas correspondentes caderinas, representam as chamadas "regiões de factor de crescimento de caderina" (CGFRs) e que as actividades destas CGFRs podem ser terapeuticamente exploradas. Neste contexto, aquela descreve a CGFR da caderina-T para o tratamento de um distúrbio metabólico. Esta CGFR consiste dos aminoácidos 23-138 da SEQ ID NO: 1. A W02004/096272 descreve formas solúveis de caderina-T, em que as referidas formas solúveis são polipéptidos consistindo de fragmentos de até 118 aminoácidos de um polipéptido consistindo dos aminoácidos 23 até 692 da SEQ ID NO: 1. Esta também descreve utilizações clinicas destas formas solúveis para distúrbios metabólicos. 2. Obesidade 2.1. Sintomas A obesidade é a acumulação de gordura corporal excessiva. A gravidade da obesidade é determinada medindo a altura e o peso. Frequentemente, estas medições são convertidas em indice de massa corporal (BMI): o peso em quilogramas dividido pelo quadrado da altura em metros. Um valor de 25 até 29,9 indica excesso de peso ou obesidade ligeira, e um valor de 30 ou mais indica obesidade e uma necessidade de tratamento. Nos Estados Unidos, o excesso de peso e a 4 obesidade afectam presentemente mais de 50% dos adultos, reflectindo um aumento rápido da prevalência. A obesidade resulta da ingestão de mais calorias do que as que o organismo utiliza. Factores genéticos e ambientais influenciam o peso corporal, mas continua por esclarecer o modo exacto como eles interagem para determinar o peso de uma pessoa. Investigação recente sugere que em média, a influência genética contribui para cerca de 33 por cento do peso corporal. Um aumento no tamanho ou número de células adiposas ou ambos contribui para a quantidade de gordura acumulada no organismo. As pessoas obesas, em particular aquelas que se tornam obesas durante a infância, podem ter até cinco vezes mais de células adiposas do que as pessoas com peso normal. Uma vez que o número de células não pode ser reduzido, a perda de peso só pode ocorrer através da redução da quantidade de gordura em cada célula. A acumulação de excesso de gordura por baixo do diafragma e na parede do peito pode colocar pressão sobre os pulmões, provocando dificuldades na respiração e respiração ofegante, mesmo no caso de um esforço físico mínimo. A dificuldade na respiração pode interferir gravemente com o sono, provocando paragem momentânea de respiração (apneia do sono), originando sonolência diurna e outras complicações. A obesidade também pode provocar vários problemas ortopédicos, distúrbios cutâneos e dilatação dos pés e tornozelos. As complicações graves da obesidade incluem um risco muito mais elevado de distúrbio da artéria coronária e dos seus factores principais de risco diabetes de tipo II, hiperlipidemia e hipertensão. Muita da morbilidade associada à obesidade está ligada à diabetes de tipo II, já que a diabetes mal controlada e a obesidade 5 levam a uma constelação de sintomas que são conhecidos no seu conjunto como sindrome X, ou sindrome metabólica (ver, por exemplo, Roth et ai., 2002). 2.2. Tratamento A maior parte dos programas de gestão de peso baseiam-se na modificação do comportamento. A realização de uma dieta é geralmente considerada menos importante do que fazer alterações permanentes nos hábitos alimentares e de exercício físico. Cada vez mais, os médicos prescrevem fármacos como o orlistat ou sibutramina para reduzir o peso corporal. Um fármaco deste tipo pode reduzir o peso em cerca de 10 por cento num prazo de 6 meses e mantém a perda enquanto o fármaco for continuado. No entanto, quando este é descontinuado, o peso é rapidamente reposto, e os efeitos a longo prazo dos tratamentos actuais para a obesidade são frustrantes. Apesar de terem sido feitos progressos consideráveis para ajudar as pessoas a perderem peso, elas geralmente voltam a ganhá-lo num período de 3 anos. As muitas complicações graves da obesidade tornam o tratamento importante, e o tratamento por cirurgia está a tornar-se cada vez mais comum no caso de obesidade grave. 3. Diabetes 3.1. Sintomas A diabetes é um distúrbio em que os níveis de glucose no sangue são anormalmente elevados porque o organismo não liberta ou utiliza adequadamente a insulina. A diabetes surge quando o organismo não produz insulina suficiente 6 para manter os níveis normais de açúcar no sangue ou quando as células não respondem adequadamente à insulina.

As pessoas com diabetes de tipo I (diabetes insulinodependente) produzem pouca ou nenhuma insulina. Embora cerca de 6 por cento da população dos Estados Unidos tenha alguma forma de diabetes, apenas cerca de 10 por cento de todos os diabéticos têm um distúrbio de tipo I. A maioria das pessoas que têm diabetes de tipo I desenvolveram a doença antes dos 30 anos. Na diabetes de tipo I mais de 90 por cento das células produtoras de insulina (células beta) do pâncreas estão permanentemente destruídas. A deficiência de insulina resultante é grave e uma pessoa com diabetes de tipo I tem de injectar regularmente insulina para sobreviver.

Na diabetes de tipo II (diabetes não insulinodependente), o pâncreas continua a fabricar insulina, por vezes a níveis mais elevados do que os níveis normais. No entanto, o organismo desenvolve resistência aos seus efeitos, resultando numa deficiência relativa de insulina. A diabetes de tipo II pode ocorrer em crianças e adolescentes, mas geralmente surge depois dos 30 anos e torna-se progressivamente mais comum com a idade: Cerca de 15 por cento das pessoas com mais de 70 têm diabetes de tipo II. A obesidade é um factor de risco para a diabetes de tipo II, e 80 a 90 por cento das pessoas com este distúrbio são obesas.

Outras causas menos comuns de diabetes são níveis anormalmente elevados de corticosteróides, gravidez (diabetes gestacional), fármacos e venenos que interferem 7 com a produção ou efeitos da insulina, que resultam em níveis elevados de açúcar no sangue.

As pessoas com diabetes de tipo II podem não ter quaisquer sintomas durante anos ou décadas. Quando a deficiência de insulina progride podem desenvolver-se os sintomas. Os aumentos da micção e sede são inicialmente ligeiros e pioram gradualmente ao longo de semanas ou meses. Se o nível de açúcar no sangue se tornar muito elevado (frequentemente superior a 1 000 mg/dL), a pessoa pode desenvolver desidratação grave, a qual pode levar a confusão mental, entorpecimento mental, convulsões e coma hiperglicémico-hiperosmolar não cetótico.

Ao longo do tempo, os níveis elevados de açúcar no sangue danificam os vasos sanguíneos, células nervosas e outras estruturas internas. Substâncias complexas à base de açúcar acumulam-se nas paredes de vasos sanguíneos pequenos, provocando o seu espessamento e ruptura. À medida que ficam mais espessos, fornecem cada vez menos sangue, especialmente à pele e células nervosas. Níveis de açúcar no sangue mal controlados tendem também a provocar o aumento dos níveis de substâncias gordas no sangue, resultando em aterosclerose acelerada (a acumulação de placa nos vasos sanguíneos). A aterosclerose é entre duas e seis vezes mais comum em diabéticos do que em não diabéticos e ocorre tanto nos homens como nas mulheres. Uma má circulação através dos vasos sanguíneos grandes e pequenos pode prejudicar o coração, cérebro, pernas, olhos, rins, nervos e pele e torna a cicatrização de feridas lenta.

Por todas estas razões, as pessoas com diabetes podem experimentar muitas complicações graves no longo prazo. Os ataques cardíacos e acidentes vasculares cerebrais são mais comuns. A danificação dos vasos sanguíneos do olho pode provocar perda de visão (retinopatia diabética). Os rins podem funcionar de modo deficiente, originando insuficiência renal que requer diálise. A danificação das células nervosas pode manifestar-se de vários modos. Se um único nervo funcionar de modo deficiente (mononeuropatia), um braço ou uma perna pode ficar de repente fraco. Se forem danificados os nervos das mãos, pernas e pés (polineuropatia diabética), a sensação pode tornar-se anormal e pode desenvolver-se um formigueiro ou dor de queimadura e fraqueza nos braços e pernas. A danificação dos nervos da pele aumenta a probabilidade de lesões repetidas porque a pessoa não consegue sentir alterações na pressão ou temperatura. Um fornecimento fraco de sangue à pele também pode conduzir a úlceras, e todas as feridas curam lentamente. As úlceras no pé podem tornar-se tão profundas e infectadas e curar de tal forma mal que parte da perna pode ter de ser amputada. 3.2. Tratamento 0 objectivo principal do tratamento da diabetes é manter, tanto quanto possível, os níveis de sangue dentro da gama normal. Níveis completamente normais são difíceis de manter, mas quanto mais próximos eles forem mantidos da gama normal, menor é a probabilidade de se desenvolverem complicações temporárias ou no longo prazo. 0 problema principal com a tentativa de controlar apertadamente os níveis de açúcar no sangue é o aumento da probabilidade de 9 sobredosagem, que resulta em níveis baixos de açúcar no sangue (hipoglicemia). 0 tratamento da diabetes requer atenção ao controlo de peso, exercício físico e dieta. Muitas pessoas obesas com diabetes de tipo II não necessitarão de tratamento se elas perderam peso e praticarem exercício regularmente. No entanto, como discutido acima, a redução de peso é difícil. Por conseguinte é frequentemente necessária terapia de substituição de insulina ou uma medicação hipoglicémica oral.

Os fármacos hipoglicémicos orais tais como glipizida, gliburida, tolbutamida e clorpropamida podem reduzir adequadamente os níveis de açúcar no sangue em pessoas com diabetes de tipo II através da estimulação do pâncreas para libertar insulina e aumentar a sua eficácia. Um outro tipo de fármaco oral, metformina, aumenta a resposta do organismo à sua própria insulina. Ainda um outro fármaco, acarbose, funciona retardando a absorção de glucose no intestino. Se estes fármacos hipoglicémicos orais não conseguirem controlar suficientemente bem o açúcar no sangue é necessária uma terapia de substituição de insulina.

Uma terapia de substituição de insulina pode ser apenas conseguida através de injecções diárias, sendo deste modo um tratamento pesado. Estão a ser testadas novas formas de insulina, tal como uma formulação para pulverização nasal. Até à data, estas novas formas não funcionaram bem porque a variabilidade na taxa de absorção leva a problemas na determinação da dose. 10 4. Acrp30 O tecido adiposo, apesar de ser há muito tempo conhecido pela sua capacidade para armazenar gordura, tem um papel importante como fonte de um certo número de hormonas e mediadores parácrinos, incluindo resistina, adipsina, leptina e TNF-α. Colectivamente, estas moléculas são designadas adipocinas, para acentuar o seu papel como hormonas e o sitio de síntese. A Acrp30, também referida como adiponectina ou ApM-1, é uma de tais adipocinas e é produzida exclusivamente pelo tecido adiposo. A Acrp30 de rato foi identificada pela primeira vez em 1995 (Scherer et al., 1995) e foi demonstrado que estava regulado positivamente mais de 100 vezes durante a diferenciação de adipócitos. O homólogo humano foi identificado em 1996 (Maeda et al., 1996). A Acrp30 contém uma sequência sinal amino-terminal, seguida de uma região central compreendendo repetições de colagénio e um domínio carboxi-terminal com homologia em relação ao factor de complemento globular Clq. Como aqui utilizado, o termo "Acrp30" refere-se tanto à proteína humana como à proteína murídea, e aos seus homólogos em qualquer outra espécie.

4.1. O papel de Acrp30 na obesidade e diabetes de tipo II

Diversos estudos demonstraram que a Acrp30 está ligada à obesidade e diabetes de tipo II. Dados genéticos demonstraram essa ligação da diabetes de tipo II com Polimorfismos de Nucleótidos Simples (SNPs) não codificadores localizados dentro do gene da Acrp30 numa coorte de doentes Japoneses (Hara et al., 2002). Foi ainda demonstrado que as mutações de sentido invertido que 11 afectem a cabeça globular estão correlacionadas com os níveis de Acrp30 no soro (Kondo et ai., 2002).

Além disso, os níveis de Acrp30 no soro encontram-se diminuídos em vários modelos da obesidade, incluindo nos modelos de ratos deficientes em leptina, ratos deficientes no receptor de leptina e modelos em macacos (ver, por exemplo, Hu et al., 1996; Yamauchi et al., 2001). Em estudos humanos, os níveis de Acrp30 correlacionam inversamente com as diabetes e obesidade, e encontram-se ainda mais reduzidos em doentes com distúrbio da artéria coronária (Arita et al., 1999). Evidência adicional para uma relação causa-efeito entre os níveis reduzidos de Acrp30 e o desenvolvimento de resistência à insulina e diabetes de tipo II foi obtida por Lindsay et ai. (2002), os quais mostraram que indivíduos da população Indiana de Pima que tinham níveis inferiores de Acrp30 no soro possuíam uma maior probabilidade de desenvolver diabetes de tipo II do que os com níveis mais elevados.

Experiências de disrupção de genes produziram evidência de suporte para o envolvimento de Acrp30 na obesidade e diabetes de tipo II. Maeda et al. (2002) constataram que ratos homozigóticos deficientes em Acrp30 não eram hiperglicémicos quando mantidos numa dieta normal, mas que apresentavam uma eliminação reduzida dos ácidos gordos livres presentes no soro. Quando mudados para uma dieta rica em gordura, rica em sacarose, eles apresentaram uma resistência à insulina grave e mostraram um maior ganho de peso em relação aos animais de controlo.

Além do seu papel essencial na obesidade e diabetes foi demonstrado que a Acrp30 desempenha um papel noutros 12 distúrbios tais como, por exemplo, síndrome poliquística do ovário (Panidis et al., 2003), cancro do endométrio (Petridou et al., 2003), pré-eclampsia (Ramsay et al., 2003), fígado gordo (Xu et al., 2003) e síndrome nefrótica (Zoccali et al., 2003) . Foi também demonstrado que a Acrp30 apresenta propriedades anti-inflamatórias (Yokota et al., 2000) .

Tendo em consideração os estudos anteriores, a Acrp30 exógena é uma terapêutica promissora para tratar vários distúrbios incluindo distúrbios metabólicos tais como obesidade e diabetes de tipo II, distúrbio ginecológicos, distúrbios hepáticos e distúrbios inflamatórios crónicos. 4.2. As várias espécies de Acrp30 A Acrp30 está presente no soro em concentração elevada (5-10 μρ/ηϋΐ.) e existe como vários grupos de massa molecular aparente diferente (Scherer et al., 1995). A estrutura destas espécies de massa molecular aparente diferente foi investigada por Tsao et al. (2002, 2003) . Quando expressadas em bactérias como uma proteína de fusão de comprimento total e separadas por cromatografia de filtração de gel foram identificadas três espécies de Acrp30: hexâmeros e duas espécies de trímeros. Estudos de expressão em células eucariotas geraram três espécies Acrp30: uma espécie de massa molecular elevada (HMW), a qual não é observada na proteína produzida em bactérias, e espécies correspondentes aos hexâmeros e uma espécie de trímeros. 13 Vários estudos centraram-se em polipéptidos compreendendo a cabeça globular da Acrp30, doravante referida como gAcrp30. Existem diferenças entre as actividades das Acrp30 e gAcrp30 in vivo, embora os dois polipéptidos partilhem de várias semelhanças. Após tratamento a longo prazo com proteína recombinante, existe uma maior redução de peso com a injecção de gAcrp30 do que com Acrp30, apesar de uma ausência de diferença na ingestão de alimentos (Fruebis et ai., 2001). Por outro lado, a Acrp30 reduziu a produção de glucose de modo sinérgico com a insulina, enquanto a gAcrp30 não teve actividade neste ensaio (Berg et ai., 2001) . A fim de determinar a actividade potencial destas várias espécies foi analisado um número de elementos de resposta transcricional que conduzem a expressão de um gene relator de luciferase em miócitos C2C12, células que respondem a Acrp30 (Tsao et ai., 2003). O promotor selectina-E que responde ao NF-κΒ demonstrou uma maior actividade em resposta à adição de Acrp30. Apenas o hexâmero fraccionado e as espécies HMW foram activas, enquanto tanto a gAcrp30 como o trímero foram inactivos neste ensaio. A IL-6, cuja expressão é aumentada pelo NF-κΒ em miotubos C2C12, é produzida em níveis elevados pelo músculo-esquelético durante o exercício físico, e julga-se que desencadeia uma maior produção de ácidos gordos e glucose a partir do tecido adiposo e fígado, proporcionando assim um aumento no combustível em circulação para ser utilizado pelo músculo (Febbraio et al., 2002; Kosmidou et ai., 2002). Deste modo, as espécies hexamérica e HMW da Acpr30 podem estimular indirectamente a lipólise do tecido adiposo através da 14 libertação de IL-6 induzida pelo NF-κΒ a partir do músculo-esquelético (Tsao et al. , 2003).

Estando a Acrp30 envolvida na obesidade e diabetes de tipo II, a modulação de proteínas do percurso de sinalização da Acrp30 é uma opção de tratamento para distúrbios metabólicos tais como obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia, sindrome X, anorexia e caquexia. No entanto, o isolamento de receptores de Acrp30 demonstrou ser elusiva. A ligação da Acrp30 aos colagénios e às células endoteliais aórticas humanas (HAECs) foi descrita in vitro (Okamoto et al., 2000). Recentemente foram descritos dois receptores para a Acrp30 globular e de comprimento total de função desconhecida, designados

AdipoRl e AdipoR2, (Yamauchi et al., 2003). Foi previsto que estes dois receptores de Acrp30 continham sete domínios transmembranares, mas que eram estrutural e funcionalmente distintos dos receptores acoplados à proteína G. No entanto, os receptores para as espécies hexamérica e HMW da Acrp30 não foram descritos na literatura científica.

Breve Sumário da Invenção A presente invenção resulta da descoberta de um novo receptor de Acrp30. Especificamente, foi mostrado no contexto da presente invenção que a caderina-T é um receptor para as espécies hexamérica e de elevada massa molecular (HMW) da Acrp30.

Por conseguinte, um primeiro aspecto da especificação relaciona-se com a utilização de um polipéptido de caderina-T como um alvo para seleccionar moduladores 15 candidatos para fármacos candidatos para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de um distúrbio metabólico, um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico e um distúrbio hepático ou renal, em que o referido fármaco candidato é um modulador de caderina-T.

Um segundo aspecto relaciona-se com a utilização de um modulador de um polipéptido de caderina-T para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de um distúrbio metabólico, um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico e um distúrbio hepático ou renal.

Um terceiro aspecto relaciona-se com a utilização de um polipéptido de caderina-T como um alvo para seleccionar parceiros de ligação naturais, em que o referido parceiro de ligação natural é um fármaco candidato para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de um distúrbio metabólico, um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico e um distúrbio hepático ou renal.

Um quarto aspecto relaciona-se com a utilização de uma forma solúvel de caderina-T como medicamento.

Um quinto aspecto, o qual representa a presente invenção, relaciona-se com a utilização de uma forma solúvel de caderina-T para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio metabólico.

Um sexto aspecto relaciona-se com um método de avaliação da eficiência de um modulador de um polipéptido de caderina-T 16 para o tratamento de obesidade, em que o referido método compreende administrar o referido modulador a um modelo animal para a obesidade, em que uma determinação que mostre que o referido modulador melhora uma caracteristica representativa da obesidade no referido modelo animal indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento da obesidade.

Um sétimo aspecto relaciona-se com um método de avaliação da eficiência de um modulador de um polipéptido de caderina-T para o tratamento de diabetes de tipo II, em que o referido método compreende administrar o referido modulador a um modelo animal para a diabetes de tipo II, em que uma determinação que mostre que o referido modulador melhora uma caracteristica representativa da diabetes de tipo II no referido modelo animal indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento da diabetes de tipo II.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra o resultado de Ensaios de ligação de triagem de células activada por fluorescência de células C2C12, CHO e Ba/F3, como se explica no Exemplo 2. A Figura 2 mostra o resultado de Ensaios de ligação de triagem de células activada por fluorescência de células Ba/F3 de controlo e de células Ba/F3 que expressam caderina-T, como se explica no Exemplo 4.2. A Figura 3A mostra a análise por ELISA da ligação de diferentes espécies de Acrp30 a células CHO-GFP, como se explica no Exemplo 4.3. 17 A Figura 3B mostra a análise por ELISA da ligação de diferentes espécies de Acrp30 a células CHO que expressam caderina-T, como se explica no Exemplo 4.3. A Figura 4 mostra a activação de NF-κΒ em células C2C12, como se explica no Exemplo 5.

Breve Descrição das Sequências SEQ ID NO: 1 corresponde ao precursor de comprimento total da caderina-T humana. SEQ ID NO: 2 corresponde ao precursor de comprimento total da Acrp30 humana. SEQ ID NO: 3 corresponde ao precursor de comprimento total da Acrp30 murina. SEQ ID NO: 4 corresponde ao precursor de comprimento total da caderina-T murina. SEQ ID NO: 5-18 correspondem a sequências de iniciadores. Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção resulta da descoberta de um novo receptor da Acrp30. Especificamente, foi mostrado no contexto da presente invenção que a caderina-T é um receptor para as espécies hexamérica e de elevada massa molecular (HMW) da Acrp30. São ainda proporcionados dados que mostram que a sobre-expressão da caderina-T suprime a 18 transcrição mediada pelo NF-κΒ induzida pela Acrp30. Por consequência, a presente especificação proporciona meios para identificar compostos úteis no tratamento de distúrbios metabólicos tais como, por exemplo, obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia, sindrome X, anorexia e caquexia. Especificamente, a especificação relaciona-se com a utilização de polipéptidos de caderina-T como alvos para seleccionar moduladores daquela. A utilização dos referidos moduladores para tratar distúrbios metabólicos é um outro aspecto da presente especificação.

Um primeiro aspecto da presente especificação é direccionado para a utilização de um polipéptido de caderina-T como um alvo para seleccionar moduladores candidatos para fármacos candidatos para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de um distúrbio metabólico, um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico e um distúrbio hepático ou renal, em que o referido fármaco candidato é um modulador de caderina-T.

Como utilizado ao longo da presente especificação, o termo "polipéptido de caderina-T" refere-se tanto a proteínas caderina-T de comprimento total como aos fragmentos biologicamente activos desta. Os polipéptidos de caderina-T podem ser de origem humana ou animal. Preferencialmente, os polipéptidos de caderina-T são de origem humana.

Muito preferencialmente, o polipéptido de caderina-T humano é seleccionado do grupo consistindo de: a) um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 1; 19 b) um polipéptido compreendendo os aminoácidos 23 até 713 da SEQ ID NO: 1; c) um polipéptido compreendendo os aminoácidos 23 até 693 da SEQ ID NO: 1; d) um polipéptido compreendendo os aminoácidos 140 até 713 da SEQ ID NO: 1; e) um polipéptido compreendendo os aminoácidos 140 até 693 da SEQ ID NO: 1; f) uma proteína mutada de qualquer um de (a) até (e) , em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das sequências em (a) até (e); g) uma proteína mutada de qualquer um de (a) até (e) a qual é codificada por um ácido nucleico que hibridiza com o complemento de uma sequência de ADN que codifica qualquer um de (a) até (e) em condições extremamente rigorosas; e h) uma proteína mutada de qualquer um de (a) até (e) em que quaisquer alterações na sequência de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos das sequências de aminoácidos em (a) até (e) . O termo "polipéptido de caderina-T" abrange polipéptidos naturais, recombinantes, quiméricos, sintéticos e sintetizados quimicamente. O termo "polipéptido de caderina-T" abrange ainda fragmentos de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ou 650 aminoácidos da caderina-T. O termo "polipéptido de caderina-T" abrange ainda proteínas mutadas da caderina-T. Como aqui utilizado, o termo "proteínas mutadas" refere-se a análogos da caderina-T, nos quais um ou mais dos resíduos de aminoácidos de uma caderina-T natural estão substituídos 20 por resíduos de aminoácidos diferentes, ou são eliminados, ou são adicionados um ou mais resíduos de aminoácidos à sequência natural da caderina-T, sem reduzir consideravelmente a actividade dos produtos resultantes por comparação com a caderina-T de tipo selvagem. Estas proteínas mutadas são preparadas por técnicas de síntese e/ou por técnicas de mutagénese dirigida conhecidas, ou quaisquer outras técnicas conhecidas adequadas para esse fim.

As proteínas mutadas de caderina-T que podem ser utilizadas de acordo com a presente especificação incluem um conjunto finito de sequências essencialmente correspondentes como péptidos ou polinucleótidos de substituição os quais podem ser rotineiramente obtidos por um técnico médio na arte, sem experimentação excessiva, com base nos ensinamentos e orientação aqui apresentados e conhecidos na técnica.

Os polipéptidos de caderina-T de acordo com a presente especificação incluem proteínas codificada por um ácido nucleico, tal como ADN ou ARN, o qual hibridiza com ADN ou ARN, que codifica a caderina-T, de acordo com a presente invenção, em condições moderada ou extremamente rigorosas. O termo “condições rigorosas" refere-se às condições de hibridização e lavagem subsequente, que os técnicos médios na arte referem convencionalmente como "rigorosas" (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989) .

Sem restrição, exemplos de condições rigorosas incluem condições de lavagem 12-20 °C abaixo do Tm calculado para o híbrido em estudo em, por exemplo, 2 x SSC e 0,5% de SDS durante 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% de SDS durante 15 21 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 37 °C durante 30-60 minutos e em seguida uma 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 68 °C durante 30-60 minutos. Os técnicos médios nesta arte compreendem que as condições rigorosas também dependem do comprimento das sequências de ADN, sondas de oligonucleótidos (tal como 10-40 bases) ou sondas mistas de oligonucleótidos. Se forem utilizadas sondas mistas, é preferível utilizar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC.

Os polipéptidos de caderina-T que podem ser utilizados de acordo com a presente especificação incluem proteínas mutadas possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 50% idêntica, mais preferencialmente pelo menos 60% idêntica e ainda mais preferencialmente 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma caderina-T de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4 ou a um seu fragmento. Por um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de pesquisa de aminoácidos da presente invenção, pretende-se dizer que a sequência de aminoácidos do polipéptido objecto é idêntica à sequência de pesquisa excepto que a sequência do polipéptido objecto pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de pesquisa de aminoácidos. Por outras palavras, para se obter um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à sequência de pesquisa de aminoácidos, até 5% (5 de 100) dos resíduos de aminoácidos na sequência objecto podem ser inseridos, eliminados ou substituídos por outros aminoácidos.

Para sequências em que não existe uma correspondência exacta pode determinar-se uma "% de identidade". Duma 22 maneira geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de "lacunas" em qualquer uma ou em ambas as sequências, para melhorar o grau de alinhamento. A % de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento de cada uma das sequências a serem comparadas (o chamado alinhamento global), que é particularmente adequada para sequências com o mesmo comprimento ou com comprimentos muito semelhantes, ou ao longo de comprimentos definidos, mais curtos (o chamado alinhamento local), que é mais adequada para sequências com comprimentos desiguais.

As alterações preferidas para as proteínas mutadas que podem ser utilizadas de acordo com a presente especificação são as que são conhecidas como substituições "conservadoras". As substituições conservadoras de aminoácidos dos polipéptidos de caderina-T podem incluir aminoácidos sinónimos dentro de um grupo os quais têm propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes para que a substituição entre membros do grupo conserve a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É evidente que também podem ser feitas inserções e delecções de aminoácidos nas sequências definidas acima sem alterar a sua função, em particular se as inserções ou delecções envolverem apenas alguns aminoácidos, por exemplo inferior a trinta, e preferencialmente inferior a dez, e não eliminarem ou substituírem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo resíduos de cisteína. As proteínas e proteínas mutadas produzidas por tais delecções e/ou inserções estão dentro do alcance da presente especificação. 23

Preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro I. Mais preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro II; e muito preferencialmente os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro III.

QUADRO I

Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

Aminoácido Grupo Sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Vai Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Vai Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Vai, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Asn Gin, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Vai, Leu, Met Trp Trp

QUADRO II

Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

Aminoácido Grupo Sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, Ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Vai Vai, Met, Ile Gly Gly Ile Ile, Met, Phe, Vai, Leu Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gin, Arg Gin Glu, Gin, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gin Met Met, Phe, Ile, Vai, Leu Trp Trp

QUADRO III

Grupos Muito Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

Aminoácido Grupo Sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Met Pro Pro Thr Thr 25

Ala Ala Vai Vai Gly Gly Ile Ile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gin Gin Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Trp

Exemplos de produção de substituições de aminoácidos em proteínas que podem ser utilizados para obter proteínas mutadas de caderina-T, polipéptidos para utilização na presente invenção incluem quaisquer passos de métodos conhecidos, tais como apresentados nas patentes US 4 959 314, 4 588 585 e 4 737 462, de Mark et al.; 5 116 943 de Koths et al., 4 965 195 de Namen et al.; 4 879 111 de Chong et al. ; e 5 017 691 de Lee et al.; e as proteínas substituídas com lisina apresentadas na patente US N° 4 904 584 (Shaw et al.).

Preferencialmente, as proteínas mutadas da presente especificação apresentam essencialmente a mesma actividade biológica que o polipéptido de caderina-T à qual ela corresponde. Muito preferencialmente, as proteínas mutadas da presente invenção apresentam uma actividade biológica 26 melhorada em comparaçao com o polipéptido de caderina-T à qual elas correspondem.

Como aqui utilizado, o termo "modulador" refere-se a um composto que aumenta ou diminui a actividade de um polipéptido de caderina-T. Como aqui utilizado, um "modulador de caderina-T" refere-se a um composto que aumenta ou diminui a actividade de um polipéptido de caderina-T e/ou a um composto que aumenta ou diminui o nível de transcrição do ARNm da caderina-T. 0 termo "modulador" abrange ambos, agonistas e antagonistas.

Como aqui utilizado, um "agonista de caderina-T" refere-se a um composto que tem um efeito na mesma direcção na actividade da caderina-T que a Acrp30. Um composto possuindo "um efeito na mesma direcção" na actividade caderina-T que a Acrp30 refere-se a um composto que (i) quando testado num ensaio em que a Acrp30 aumenta a actividade da caderina-T, o referido composto aumenta a actividade da caderina-T; e/ou (i) quando testado num ensaio em que a Acrp30 diminui a actividade da caderina-T, o referido composto diminui a actividade da caderina-T. Os termos "agonista" e "activador" são considerados como sendo sinónimos e podem ser utilizados intermutavelmente ao longo da presente divulgação.

Como aqui utilizado, um "antagonista de caderina-T" refere-se a um composto que tem um efeito oposto na actividade da caderina-T em comparação com a Acrp30. Um composto que possui "um efeito oposto" na actividade da caderina-T em comparação com a Acrp30 refere-se a um composto que (i) quando testado num ensaio em que a Acrp30 aumenta a actividade da caderina-T, o referido composto diminui a 27 actividade da caderina-T; e/ou (i) quando testado num ensaio em que a Acrp30 diminui a actividade da caderina-T, o referido composto aumenta a actividade da caderina-T. Os termos “antagonista" e "inibidores" são considerados como sendo sinónimos e podem ser utilizados intermutavelmente ao longo da presente divulgação.

Os métodos para determinar se um modulador tem um efeito na mesma direcção ou um efeito oposto na actividade da caderina-T em comparação com a Acrp30 são mais pormenorizados abaixo.

Os métodos que podem ser utilizados para testar moduladores em relação à sua capacidade para aumentar ou diminuir a actividade de um polipéptido de caderina-T ou para aumentar ou diminuir a expressão de um ARNm da caderina-T são bem conhecidos na técnica e mais pormenorizados abaixo. Estes ensaios podem ser realizados in vitro ou in vivo.

Os moduladores candidatos de acordo com a presente invenção incluem compostos naturais e sintéticos. Estes compostos incluem, por exemplo, ligandos naturais, moléculas pequenas, aptâmeros, ARNm antimensageiros, ARN interferentes pequenos, formas solúveis de caderina-T e anticorpos. Estes compostos são referidos como "compostos candidatos" ou como "moduladores candidatos" na presente especificação. Os agonistas candidatos preferidos incluem ligandos naturais, moléculas pequenas e aptâmeros. Os antagonistas candidatos preferidos incluem ligandos naturais, moléculas pequenas, aptâmeros, ARNm antimensageiros, ARN interferentes pequenos, formas solúveis de caderina-T e anticorpos. Os antagonistas 28 candidatos muito preferidos são as formas solúveis da caderina-T.

Como aqui utilizado, o termo "ligando natural" refere-se a qualquer molécula de sinalização que se liga a uma caderina-T in vivo e inclui moléculas tais como, por exemplo, lípidos, nucleótidos, polinucleótidos, aminoácidos, péptidos, polipéptidos, proteínas, hidratos de carbono e moléculas inorgânicas.

Como aqui utilizado, o termo "molécula pequena" refere-se a uma molécula orgânica de massa relativamente baixa. Preferencialmente, uma molécula pequena compreende menos do que 200 átomos. Muito preferencialmente, uma molécula pequena compreende entre cerca de 50 átomos e 80 átomos.

Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a uma proteína produzida pelas células do sistema imunológico ou a um seu fragmento que se liga a um antigénio. Os anticorpos de acordo com a especificação podem ser policlonais ou monoclonais, quiméricos, humanizados ou até mesmo totalmente humanos. Os anticorpos recombinantes e seus fragmentos caracterizam-se por uma afinidade de ligação elevada aos polipéptidos de caderina-T in vivo e toxicidade baixa. Os anticorpos que podem ser utilizados na especificação caracterizam-se pela sua capacidade para tratar doentes durante um período suficiente para ter uma regressão ou alívio bom a excelente da condição patogénica ou de qualquer sintoma ou grupo de sintomas associados a uma condição patogénica, e uma toxicidade baixa. Os anticorpos neutralizantes são facilmente gerados em animais tais como coelhos, cabras ou ratos por imunização com polipéptidos de caderina-T. Os ratos imunizados são 29 particularmente úteis para proporcionar fontes de células B para o fabrico de hibridomas, os quais são por sua vez cultivados para produzir grandes quantidades de anticorpos monoclonais anti-caderina-T. Os anticorpos quiméricos são moléculas de imunoglobulina caracterizadas por dois ou mais segmentos ou porções provenientes de espécies animais diferentes. Duma maneira geral, a região variável do anticorpo quimérico é proveniente de um anticorpo de mamifero não humano, tal como anticorpo monoclonal murino, e a região constante da imunoglobulina é proveniente de uma molécula de imunoglobulina humana. Preferencialmente, ambas as regiões e a combinação têm uma imunogenicidade baixa como determinada de modo rotineiro (Elliott et al., 1994). OS anticorpos humanizados são moléculas de imunoglobulina geradas por técnicas de manipulação genética nas quais as regiões constantes murinas são substituídas por homólogos humanos ao mesmo tempo que se retém as regiões de ligação ao antigénio murino. 0 anticorpo quimérico de rato-humano resultante tem preferencialmente imunogenicidade reduzida e uma melhor farmacocinética em humanos (Knight et al., 1993). 0 anticorpo pode ser totalmente humano. A tecnologia para produzir anticorpos humanos é descrita em pormenor, por exemplo, nas WO 00/76310, WO 99/53049, US 6 162 963 e AU 5 336 100. Um método de preparação de anticorpos totalmente humanos consiste na "humanização" do sistema imunológico humoral do rato, isto é, produção de estirpes de ratos capazes de produzir Ig humana (Xeno-ratos), através da introdução de pontos de imunoglobulina (Ig) humana em ratos em que os genes da Ig endógena foram inactivados. Os pontos de Ig são complexos em termos da sua estrutura física e dos processos de rearranjos de genes e expressão necessários para produzir por fim uma resposta imunológica lata. A diversidade de anticorpo é 30 principalmente gerada por rearranjo combinatório entre genes V, D e J diferentes presentes nos pontos de Ig. Estes pontos também contêm os elementos reguladores dispersos, os quais controlam a expressão do anticorpo, exclusão alélica, troca de classe e maturação da afinidade. A introdução de transgenes de ig humana não rearranjados em ratos demonstrou que a maquinaria de recombinação do rato é compatível com os genes humanos. Além disso podem ser obtidos hibridomas que segregam hu-mAbs específicos para o antigénio de vários isotipos por imunização de Xeno-ratos com antigénio. Os anticorpos totalmente humanos e os métodos para a sua produção são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, WO 98/24893).

Como aqui utilizado, o termo "ARNm antimensageiro" refere-se a uma molécula de ARN complementar à cadeia normalmente processada em ARNm e traduzida, ou a uma molécula de ARN complementar a uma região desta.

Como aqui utilizado, o termo "aptâmero" refere-se a um ligando de ácido nucleico artificial (ver, por exemplo, Ellington e Szostak, 1990).

Como aqui utilizado, o termo "ARN interferente pequeno" refere-se a um ARN de cadeia dupla que induz silenciamento pós-transcricional de genes específicos em relação à sequência (ver, por exemplo, Elbashir et al., 2001) .

Como aqui utilizado, o termo "forma solúvel de caderina-T" refere-se a um polipéptido de caderina-T que não está ligado à membrana. Os polipéptidos de caderina-T que não estão ligados à membrana podem ser facilmente gerados pelos especialistas na técnica através de mutação do sítio âncora 31 GPI de um polipéptido de caderina-T. Por exemplo, a glicina na posição 693 da SEQ ID NO: 1 pode ser alterada para outro aminoácido. Alternativamente, a forma solúvel pode ser um fragmento de caderina-T que carece do sitio âncora GPI. A forma solúvel de caderina-T de acordo com a presente invenção, é seleccionada do grupo consistindo de: a) um polipéptido consistindo dos aminoácidos 23 até 692 da SEQ ID NO: 1; b) um polipéptido consistindo de um fragmento de pelo menos 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ou 650 aminoácidos de (a); c) uma proteína mutada de qualquer um de (a) ou (b) , em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das sequências em (a) ou (b); d) uma proteína mutada de qualquer um de (a) ou (b) a qual é codificada por um ácido nucleico que hibridiza com o complemento de uma sequência de ADN que codifica qualquer um de (a) ou (b) em condições extremamente rigorosas; e e) uma proteína mutada de qualquer um de (a) ou (b) em que quaisquer alterações na sequência de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos das sequências de aminoácidos em (a) ou (b) .

Preferencialmente, a referida forma solúvel de caderina-T liga a Acrp30. Preferencialmente, a referida forma solúvel de caderina-T liga as espécies hexamérica e/ou HMW da Acrp30.

Como aqui utilizado, o termo "espécie HMW da Acrp30" refere-se a um complexo de polipéptidos de Acrp30 32 compreendendo mais do que seis polipéptidos de Acrp30. A massa molecular aparente da espécie HMW da Acrp30 murina é de cerca de 630 kDa. Como aqui utilizado, o termo "espécie hexamérica da Acrp30" refere-se a um complexo de seis polipéptidos de Acrp30. A massa molecular aparente da espécie hexamérica murina é de cerca de 410 kDa. Estes complexos multiméricos ou hexamérico podem ser purificados e/ou separados, por exemplo, por filtração de gel como descrito em Tsao et ai. (2002) .

As formas solúveis de caderina-T de acordo com a presente especificação incluem ainda polipéptidos de caderina-T quiméricos compreendendo caderina-T ou um seu fragmento fundido com um polipéptido heterólogo.

De acordo com a presente especificação, a referida forma solúvel de caderina-T compreende caderina-T ou um seu fragmento fundido com a totalidade ou uma parte de uma imunoglobulina. Os métodos para preparar proteínas de fusão de imunoglobulina são bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, os descritos em WO 01/03737. O especialista na técnica compreenderá que a proteína de fusão resultante da invenção retém a actividade biológica da caderina-T, em particular a ligação às espécies hexamérica e/ou HMW da Acrp30. A fusão pode ser directa ou via um péptido de ligação curto o qual pode ser tão curto quanto 1 até 3 resíduos de aminoácidos de comprimento ou mais compridos, por exemplo, 13 resíduos de aminoácidos de comprimento. O referido grupo de ligação pode ser, por exemplo, um tripéptido da sequência E-F-M (Glu-Phe-Met) ou uma sequência de ligação com 13 aminoácidos compreendendo Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introduzida entre a sequência de caderina-T e a sequência de 33 imunoglobulina. A proteína de fusão resultante possui propriedades melhoradas, tais como um tempo de residência prolongado nos fluidos do organismo (semivida), maior actividade específica, maior nível de expressão ou a purificação da proteína de fusão está facilitada. Preferencialmente, a caderina-T ou um seu fragmento é fundido com a região constante de uma molécula de Ig. Preferencialmente, é fundido, for exemplo, a regiões da cadeia pesada, como os domínios CH2 e CH3 da IgGl humana. Outras isoformas de moléculas de Ig também são adequadas para a geração de proteínas de fusão de acordo com a presente especificação, tais como as isoformas IgG2 ou IgG4, ou outras classes de Ig como, por exemplo, a IgM ou IgA. As proteínas de fusão podem ser monoméricas ou multiméricas, hetero- ou homomultiméricas. A forma solúvel de caderina-T pode ser uma molécula quimérica que liga uma região solúvel de caderina-T e a totalidade ou uma parte da Acrp30. Este tipo de quimeras foi descrito para a IL-6 e o seu receptor IL-6R (Chebath et ai., 1997, WO 99/02552 e WO 97/32891). A quimera IL-6R/IL-6 liga-se com uma maior eficiência ao seu receptor celular in vitro do que o faz a mistura de IL-6 com um IL-6R solúvel (Kollet et ai., 1999). A caderina-T pode ser, por exemplo, fundida com a Acrp30 de comprimento total. Alternativamente, a caderina-T pode ser fundida com a região central da Acrp30 que compreende repetições de colagénio. Espera-se que tais quimeras formem moléculas quiméricas solúveis hexamérica e HMW.

Os fármacos candidatos podem ser obtidos utilizando qualquer uma das abordagens numerosas dos métodos de bibliotecas combinatórias conhecidos na técnica, incluindo, 34 por exemplo, métodos de bibliotecas biológicas, bibliotecas paralelas de fase sólida ou em solução espacialmente endereçáveis e bibliotecas sintéticas utilizando selecção por cromatografia de afinidade. A abordagem de biblioteca biológica é geralmente utilizada com bibliotecas de péptidos, enquanto as outras quatro abordagens são aplicáveis a bibliotecas de compostos de péptidos, oligómeros não peptídicos, aptâmeros ou moléculas pequenas.

Um exemplo de um método que pode ser utilizado para seleccionar compostos candidatos para um modulador é um método que compreende os passos de: a) colocar em contacto um polipéptido de caderina-T com o composto candidato; e b) testar a actividade do referido polipéptido de caderina-T na presença do referido composto candidato; em que uma diferença ou alteração na actividade do referido polipéptido de caderina-T na presença do referido composto indica que o composto é um modulador do referido polipéptido de caderina-T. Preferencialmente, um tal método compreende adicionalmente o passo de comparação da actividade do referido polipéptido de caderina-T na presença do referido composto com a actividade do referido polipéptido de caderina-T na ausência do referido composto. Também preferencialmente, um tal método também compreende o passo de avaliação da actividade do referido polipéptido de caderina-T na ausência do referido composto candidato.

Alternativamente, o ensaio pode ser um ensaio baseado em células compreendendo os passos de: 35 a) colocar em contacto uma célula que expressa um polipéptido de caderina-T com o composto candidato; e b) testar a actividade do referido polipéptido de caderina-T na presença do referido composto candidato; em que uma diferença ou uma alteração na actividade do referido polipéptido de caderina-T na presença do referido composto indica que o composto é um modulador do referido polipéptido de caderina-T. Preferencialmente, um tal método compreende adicionalmente o passo de comparação da actividade do referido polipéptido de caderina-T na presença do referido composto com a actividade do referido polipéptido de caderina-T na ausência do referido composto. Também preferencialmente, um tal método também compreende o passo de avaliação da actividade do referido polipéptido de caderina-T na ausência do referido composto candidato. 0 modulador pode ser um inibidor ou um activador. Um inibidor pode diminuir a actividade da caderina-T em, por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em relação à actividade da caderina-T na ausência do referido inibidor. Um activador pode aumentar a actividade da caderina-T em, por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em relação à actividade da caderina-T na ausência do referido activador. O modulador pode modular qualquer actividade do referido polipéptido de caderina-T. 0 modulador pode, por exemplo, modular a expressão do ARNm de caderina-T dentro de uma célula, modular a ligação do polipéptido de caderina-T a um parceiro de ligação natural tal como, por exemplo, Acrp30, ou modular o crescimento celular. 36 A actividade de um polipéptido de caderina-T pode ser avaliada medindo a ligação do referido polipéptido de caderina-T à Acrp30. Os ensaios para medir a ligação de um polipéptido de caderina-T à Acrp30 são conhecidos dos especialistas na técnica. Pode utilizar-se, por exemplo, o ensaio FACS descrito no Exemplo 4.2. ou o ensaio ELISA descrito no Exemplo 4.3. da presente especificação. Um tal ensaio compreende, por exemplo, os passos de: a) colocar em contacto uma célula que expressa um polipéptido de caderina-T com o composto candidato e com a Acrp30; e b) testar a ligação do referido polipéptido de caderina-T à Acrp30 na presença do referido composto candidato; em que uma diferença ou alteração na ligação do referido polipéptido de caderina-T à Acrp30 na presença do referido composto indica que o composto é um modulador do referido polipéptido de caderina-T. Preferencialmente, um tal método compreende adicionalmente o passo de comparação da ligação do referido polipéptido de caderina-T à Acrp30 na presença do referido composto com a ligação do referido polipéptido de caderina-T à Acrp30 na ausência do referido composto. Também preferencialmente, um tal método também compreende os passos de: c) colocar em contacto uma célula que expressa um polipéptido de caderina-T com a Acrp30; e d) testar a ligação do referido polipéptido de caderina-T à Acrp30 na ausência do referido composto candidato. 37 A Acrp30 pode ser uma espécie hexamérica da Acrp30. Alternativamente, a Acrp30 é uma espécie HMW da Acrp30. A actividade de um polipéptido de caderina-T pode ser avaliada medindo os níveis de ARNm de caderina-T dentro de uma célula. A actividade pode ser, por exemplo, medida utilizando transferências de Northern, RT-PCR, RT-PCR quantitativa com iniciadores e sondas específicas para os ARNm de caderina-T. Alternativamente, mede-se a expressão do ARNm de caderina-T ao nível do polipéptido, utilizando anticorpos marcados que se ligam especificamente ao polipéptido de caderina-T em imunoensaios tais como ensaios ELISA ou ensaios RIA, transferências de Western ou ensaios imuno-histoquímicos.

Alternativamente, a actividade de um polipéptido de caderina-T pode ser avaliada medindo a regulação do crescimento celular. As células preferidas são células do sistema nervoso tais como os astrócitos. Outras células preferidas são os miotubos C2C12. Estes ensaios podem ser, por exemplo, realizados como descrito em Takeuchi et al. (2000) ou em Huang et al. (2003).

Como utilizado ao longo da presente especificação, o termo "distúrbio metabólico" inclui obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia, síndrome X, aterosclerose, anorexia e caquexia. Os termos "obesidade", "diabetes de tipo II", "resistência à insulina", "hipercolesterolemia", "hiperlipidemia", "dislipidemia" e "aterosclerose" referem-se às condições definidas no "The Merck Manual- Second Home Edition" (Publisher: Merck & Co). O termo "síndrome X" refere-se a uma constelação de factores de risco 38 aterosclerótico, incluindo a resistência à insulina, hiperinsulinemia, dislipidemia, hipertensão e obesidade (ver, por exemplo, Roth et al., 2002). O termo "caquexia" refere-se a uma condição que se caracteriza pela perda de gordura. Como aqui utilizado, o termo "caquexia" inclui o emagrecimento associado à SIDA e cancro. O termo "anorexia" refere-se a uma condição que se caracteriza por uma imagem distorcida do corpo, medo da obesidade e incapacidade para manter um peso corporal minimamente normal.

Como utilizado ao longo da presente especificação, o termo "distúrbio ginecológico" refere-se a distúrbios que afectam o sistema reprodutivo feminino e/ou distúrbios ligados à gravidez. Estes distúrbios incluem, por exemplo, sindrome poliquistica do ovário, cancro do endométrio, cancro da mama, pré-eclampsia e eclampsia. Como utilizado ao longo da presente especificação, o termo "distúrbio hepático ou renal" inclui, por exemplo, fígado gordo, sindrome nefrótica e sindrome renal crónica. Como utilizado ao longo da presente especificação, o termo "distúrbio inflamatório crónico" refere-se a uma inflamação patológica crónica de um tecido ou um órgão de um indivíduo. As doenças inflamatórias crónicas incluem, por exemplo, psoríase, artrite psoriática, artrite reumatóide, asma, doença inflamatória do intestino e esclerose múltipla. Todos os distúrbios mencionados acima referem-se a distúrbios definidos no "The Merck Manual-Second Home Edition" (Publisher: Merck & Co) . Outros distúrbios que podem ser tratados utilizando os moduladores e as formas solúveis de caderina-T da presente invenção incluem qualquer cancro associado à obesidade e/ou resistência à insulina tal como, por exemplo, cancro do endométrio. 39

De acordo com a presente invenção, o distúrbio é um distúrbio metabólico.

Numa outra forma de realização preferida, o distúrbio é um distúrbio metabólico seleccionado do grupo consistindo de obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia e sindrome X. Um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado como um alvo para seleccionar moduladores candidatos para fármacos candidatos para o tratamento de obesidade, em que o referido fármaco candidato é um modulador de caderina-T. Alternativamente um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado como um alvo para seleccionar moduladores candidatos para fármacos candidatos para o tratamento de diabetes de tipo II, em que o referido fármaco candidato é um modulador de caderina-T. Além disso, um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado como um alvo para seleccionar moduladores candidatos para fármacos candidatos para o tratamento de sindrome X, em que o referido fármaco candidato é um modulador de caderina-T.

Os fármacos candidatos preferidos para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia e sindrome X são agonistas de caderina-T. Assim, um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado como um alvo para seleccionar compostos candidatos para fármacos candidatos para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia e sindrome X, em que o referido fármaco candidato é um agonista de caderina-T. 40

Preferencialmente, os referidos compostos candidatos são seleccionados do grupo consistindo de ligandos naturais, moléculas pequenas e aptâmeros. A determinação se um modulador de caderina-T é um agonista de caderina-T ou um antagonista de caderina-T pode ser, por exemplo, efectuada utilizando o ensaio descrito no Exemplo 5. Um tal ensaio pode compreender, por exemplo, os passos de: a) colocar em contacto uma célula que expressa um polipéptido de caderina-T com um modulador; e b) testar a transcrição mediada por NF-κΒ na presença do referido modulador; em que uma determinação que mostre que o referido modulador tem um efeito na mesma direcção na transcrição mediada por NF-κΒ que a Acrp30 indica que o composto é um agonista do referido polipéptido de caderina-T, e em que uma determinação que mostre que o referido modulador tem um efeito oposto na transcrição mediada por NF-κΒ em comparação com a Acrp30 indica que o composto é um antagonista do referido polipéptido de caderina-T. Preferencialmente, um tal método compreende adicionalmente os passos de: c) colocar em contacto uma célula que expressa um polipéptido de caderina-T com Acrp30; e d) testar a transcrição mediada por NF-κΒ- na presença de Acrp30 e na ausência do referido modulador. 41

Num tal ensaio, a Acrp30 é preferencialmente uma espécie hexamérica ou uma espécie HMW da Acrp30. Num tal ensaio, a célula que expressa um polipéptido de caderina-T pode ser, por exemplo, uma linha de células C2C12 ou uma célula C2C12 que sobre-expressa a caderina-T. Um tal ensaio também pode ser realizado com compostos candidatos para seleccionar agonistas de caderina-T ou antagonistas de caderina-T. A IL-6, a qual é produzida em niveis elevados pelo músculo-esquelético durante o exercício físico, desencadeia uma maior produção de ácidos gordos e glucose a partir do tecido adiposo. Julga-se que a Acrp30 desempenha um papel na libertação de IL-6 a partir do músculo-esquelético através da activação pelo NF-κΒ (ver, por exemplo, Tsao et al. , 2003). Por conseguinte, a determinação se um modulador de caderina-T é um agonista de caderina-T ou um antagonista de caderina-T pode ser efectuada medindo a expressão do gene de IL-6 e/ou a libertação de IL-6 a partir de células do músculo-esquelético. Um tal ensaio pode compreender, por exemplo, os passos de: a) colocar em contacto uma célula que expressa um polipéptido de caderina-T com um modulador; e b) testar a expressão do gene de IL-6 e/ou libertação de IL-6 a partir das células do músculo-esquelético na presença do referido modulador; em que uma determinação que mostre que o referido modulador tem um efeito na mesma direcção na expressão do gene de IL-6 e/ou na libertação de IL-6 a partir das células do músculo-esquelético que a Acrp30 indica que o composto é um agonista do referido polipéptido de caderina-T, e em que uma determinação que mostre que o referido modulador tem um 42 efeito oposto na expressão do gene de IL-6 e/ou na libertação de IL-6 a partir das células do músculo-esquelético em comparação com a Acrp30 indica que o composto é um antagonista do referido polipéptido de caderina-T. Preferencialmente, um tal método compreende adicionalmente os passos de: c) colocar em contacto uma célula que expressa um polipéptido de caderina-T com a Acrp30; e d) testar a expressão do gene de IL-6 e/ou a libertação de IL-6 a partir das células do músculo-esquelético na presença de Acrp30 e na ausência do referido modulador.

Num tal ensaio, a Acrp30 é preferencialmente uma espécie hexamérica ou uma espécie HMW da Acrp30.

Alternativamente, a determinação se um modulador de caderina-T é um agonista de caderina-T ou um antagonista de caderina-T pode ser efectuada por qualquer um dos ensaios in vivo conhecidos para avaliar a actividade da Acrp30. 0 distúrbio pode ser anorexia ou caquexia. Assim, um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado como um alvo para seleccionar moduladores candidatos para fármacos candidatos para o tratamento de anorexia ou caquexia, em que o referido fármaco candidato é um modulador de caderina-T. Os fármacos candidatos preferidos para o tratamento de caquexia ou anorexia são antagonistas de caderina-T.

Alternativamente, o distúrbio pode ser um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico ou um 43 distúrbio hepático ou renal. Os fármacos candidatos preferidos para o tratamento de caquexia ou anorexia são agonistas de caderina-T.

Um outro aspecto da presente especificação é direccionado para a utilização de um modulador de um polipéptido de caderina-T para preparar um medicamento para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de um distúrbio metabólico, um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico e um distúrbio hepático ou renal. Preferencialmente, o referido distúrbio é um distúrbio metabólico. Um tal medicamento compreende o referido modulador de um polipéptido de caderina-T em combinação com qualquer veiculo fisiologicamente aceitável. Os veículos fisiologicamente aceitáveis podem ser preparados por qualquer método conhecido pelos especialistas na técnica. Os veículos fisiologicamente aceitáveis incluem mas não se restringem aos descritos no Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985) . As composições farmacêuticas compreendendo um modulador de um polipéptido de caderina-T e um veículo fisiologicamente aceitável podem ser, por exemplo, para utilização intravenosa, tópica, rectal, local, inalante, subcutânea, intradérmica, intramuscular, oral, intracerebral e intratecal. As composições podem estar na forma líquida (por exemplo, soluções, suspensões), sólida (por exemplo, pílulas, comprimidos, supositórios) ou semi-sólida (por exemplo, cremes, geles). As dosagens a serem administradas dependem das necessidades individuais, do efeito desejado e da via de administração escolhida.

Um tal medicamento compreendendo um modulador de caderina-T pode ser utilizado em associação com qualquer outro fármaco 44 conhecido para o tratamento do referido distúrbio. Por exemplo, quando se trata a obesidade, o modulador pode ser administrado em associação com Orlistat, Sibutramina, Rimonabant, Axokine, Fluasterona e/ou Famoxin. Quando se trata a diabetes de tipo II, o modulador pode ser, por exemplo, administrado em associação com Acarbose, Acetohexamida, Clorpropamida, Glimepirida, Glipizida, Gliburida, Metformina, Tolazamida, Tolbutamida, Nateglinida, Insulina, Aspartato de Insulina, Insulina glargina, Miglitol, V-411, Repaglinida, Rosiglitazona e/ou Pioglitazona. Os medicamentos compreendendo um modulador de caderina-T também podem ser administrados no contexto de uma dieta.

Um modulador de um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado para preparar um medicamento para o tratamento de um distúrbio metabólico seleccionado do grupo consistindo de obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia e sindrome X. 0 referido modulador é preferencialmente um agonista.

Alternativamente, um modulador de um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado para preparar um medicamento para o tratamento de caquexia ou anorexia. 0 referido modulador é preferencialmente um antagonista.

Além disso, um modulador de um polipéptido de caderina-T pode ser utilizado para preparar um medicamento para o tratamento de um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico ou um distúrbio hepático ou renal. 0 referido modulador é preferencialmente um agonista. 45

Um outro aspecto da presente especificação é direccionado para a utilização de um polipéptido de caderina-T como um alvo para seleccionar parceiros de ligação naturais, em que o referido parceiro de ligação é um fármaco candidato para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de um distúrbio metabólico, um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico e um distúrbio hepático ou renal. 0 referido distúrbio é preferencialmente um distúrbio metabólico. 0 referido distúrbio metabólico é preferencialmente seleccionado do grupo consistindo de obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia, sindrome X, anorexia e caquexia. A utilização de um polipéptido de caderina-T como um alvo tem uma grande utilidade para a identificação de proteínas envolvidas num distúrbio metabólico e para proporcionar novos pontos de intervenção no tratamento de um tal distúrbio. Tais métodos para seleccionar parceiros de ligação naturais de um polipéptido de caderina-T são bem conhecidos na técnica.

Um método para a selecção de um polipéptido candidato que interage com um polipéptido de caderina-T da presente invenção compreende os passos seguintes: a) proporcionar um polipéptido consistindo dos um polipéptido de caderina-T; b) obter um polipéptido candidato; c) pôr em contacto o referido polipéptido com o referido polipéptido candidato; e d) detectar os complexos formados entre o referido polipéptido e o referido polipéptido candidato. 46

No método de selecção definido acima, os complexos produzidos entre o polipéptido e o polipéptido candidato podem ser ainda incubados na presença de um anticorpo policlonal ou monoclonal que se liga especificamente ao polipéptido de caderina-T. Alternativamente, os complexos produzidos entre o polipéptido e o polipéptido candidato são detectados realizando um ensaio de ligação FACS.

No método de selecção, o candidato pode ser o produto de expressão de uma inserção de ADN contida num vector. Por exemplo, um tal método de selecção pode ser realizado como se descreve nos Exemplos 1 e 2 da presente especificação.

No método de selecção, os parceiros de ligação podem ser identificados através de um ensaio de rastreio de duplo híbrido. 0 sistema de duplo híbrido de levedura é concebido para estudar interacções proteína-proteína in vivo (Fields e Song, 1989) e assenta na fusão de uma proteína isco ao domínio de ligação de ADN da proteína Gal4 de levedura. Esta técnica também é descrita nas Patentes US N° 5 667 973 e 5 283 173. 0 procedimento geral de rastreio de uma biblioteca pelo ensaio de duplo híbrido pode ser, por exemplo, realizado como descrito por Fromont-Racine et al. (1997), em que o polipéptido de isco consiste de um polipéptido de caderina-T. Mais precisamente, um polinucleótido de caderina-T é fundido na grelha com um polinucleótido que codifica o domínio de ligação de ADN da proteína GAL4, em que a sequência de nucleótidos fundida é inserida num vector de expressão adequado, por exemplo pAS2 ou pM3.

No método de selecção, os parceiros de ligação podem ser identificados através de cromatografia de afinidade. 0 47 polipéptido de caderina-T pode ser ligado à coluna utilizando técnicas convencionais incluindo condensação química a uma matriz de coluna adequada (por exemplo agarose, AFFI GEL, etc.)· Nalgumas formas de realização deste método, a coluna de afinidade contém proteínas quiméricas nas quais o polipéptido de caderina-T, ou um seu fragmento, está fundido com glutationa S-transferase (GST). Uma mistura de proteínas celulares ou grupo de proteínas expressadas como se descreveu acima é aplicado à coluna de afinidade. Os polipéptidos que interagem com o polipéptido de caderina-T ligado à coluna podem ser depois isolados e analisados, por exemplo, em electroforese de gel 2-D como descrito em Rasmunsen et al. (1997) . Alternativamente, as proteínas retidas na coluna de afinidade podem ser purificadas por métodos à base de electroforese e sequenciadas.

No método de selecção, os parceiros de ligação são identificados através de métodos de biossensores ópticos (ver, por exemplo, Edwards e Leatherbarrow, 1997) . Esta técnica permite a detecção de interacções entre moléculas em tempo real, sem a necessidade de moléculas marcadas.

Preferencialmente, todos os ensaios que compreendem o passo de avaliação da ligação de um polipéptido de caderina-T a um composto candidato, um modulador candidato ou um parceiro de ligação natural candidato são realizados na presença de um catião divalente. Muito preferencialmente, esses ensaios são realizados na presença de Ca2+. A presente invenção é direccionada para a utilização de uma forma solúvel de caderina-T para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio metabólico. 48

As formas solúveis de caderina-T podem ser facilmente geradas como se indicou acima. A forma solúvel de caderina-T pode actuar como um agonista de caderina-T.

Um outro aspecto da presente especificação é direccionado para um método de avaliação da eficiência de um modulador de um polipéptido de caderina-T para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo de um distúrbio metabólico, um distúrbio ginecológico, um distúrbio inflamatório crónico e um distúrbio hepático ou renal, em que o referido método compreende administrar o referido modulador a um modelo animal para o referido distúrbio, em que uma determinação que mostre que o referido modulador melhora uma característica representativa do referido distúrbio no referido modelo animal indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento do referido distúrbio. 0 referido distúrbio é preferencialmente um distúrbio metabólico. 0 referido distúrbio metabólico é preferencialmente seleccionado do grupo consistindo de obesidade, diabetes de tipo II, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, dislipidemia, síndrome X, anorexia e caquexia.

Preferencialmente, o distúrbio é a obesidade. Um exemplo de um método que pode ser utilizado para seleccionar fármacos para o tratamento de obesidade e/ou para avaliar a eficácia de um modulador de um polipéptido de caderina-T para o tratamento de obesidade é um método que compreende o passo de administrar o referido modulador a um modelo animal para a obesidade, em que uma determinação que mostre que o referido modulador melhora uma característica representativa da obesidade no referido modelo animal 49 indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento de obesidade.

Os modelos animais para a obesidade e os ensaios para determinar se um composto melhora uma caracteristica representativa da obesidade nesses modelos animais são conhecidos dos especialistas na técnica. 0 modelo animal preferido para a obesidade inclui ratazanas fa/fa, ratos ob/ob, ratos db/db, ratos deficientes em leptina e ratos deficientes no receptor de leptina (ver, por exemplo, Pelleymounter et al., 1995; Ogawa et al., 1995; Hu et al., 1996; Piercy et al., 2000; Yamauchi et al., 2001).

Ao estudar a obesidade, a caracteristica representativa pode ser, por exemplo, o índice de Massa Corporal (BMI), o peso corporal e/ou a percentagem de gordura corporal. Preferencialmente, a caracteristica representativa é o índice de Massa Corporal. Os métodos de medição destas características são bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Uma determinação que mostre que um modulador de um polipéptido de caderina-T reduz o peso corporal de um modelo animal para a obesidade pode indicar que o referido modulador é um fármaco para o tratamento de obesidade. Preferencialmente, uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou superior do peso corporal indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento de psoriase. Muito preferencialmente, uma redução de 10% ou mais do peso corporal indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento de obesidade. 50

Preferencialmente, o distúrbio é a diabetes de tipo II. Um exemplo de um método que pode ser utilizado para seleccionar fármacos para o tratamento de diabetes de tipo II e/ou para avaliar a eficácia de um modulador de um polipéptido de caderina-T para o tratamento da diabetes de tipo II é um método que compreende o passo de administrar o referido modulador a um modelo animal para a diabetes de tipo II, em que uma determinação que mostre que o referido modulador melhora uma caracteristica representativa da diabetes de tipo II no referido modelo animal indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento de diabetes de tipo II.

Os modelos animais para a diabetes de tipo II e os ensaios para determinar se um composto melhora uma caracteristica representativa da diabetes de tipo II em tais modelos animais são conhecidos dos especialistas na técnica. Os modelos animais preferidos para a diabetes de tipo II incluem o rato diabético C57/BLKsJ, o rato KKA(y), o rato Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY) e o rato (db/db) obeso diabético (ver, por exemplo, Castle et al., 1993; Piercy et al., 1998; Piercy et al., 2000; Ueda et al., 2000). A determinação se o modulador melhora uma caracteristica representativa da diabetes pode ser realizada utilizando vários métodos disponíveis na técnica. Por exemplo, a caracteristica representativa pode ser os níveis de glucose no plasma, soro ou sangue. Numa forma de realização, a caracteristica representativa é o nível de glucose no plasma em jejum (FPG). Alternativamente, a caracteristica representativa é o nível de glucose pós-prandial. A caracteristica representativa também pode ser o nível de frutosamina e hemoglobina glicosilada (HbAlc). Tanto os 51 níveis de HbAlc como os níveis de FPG são medições geralmente utilizadas em ensaios clínicos para tratamentos da diabetes de tipo II (ver, por exemplo, Holman et al., 1999). Alternativamente, a característica representativa pode ser o nível de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL e/ou triglicéridos (ver, por exemplo, Feinglos et al., 1997). Os métodos de determinação das características representativas anteriores são bem conhecidos na técnica.

Uma determinação que mostre que um modulador de um polipéptido de caderina-T reduz os níveis de HbAlc em pelo menos 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20% ou mais em relação ao placebo indica que o referido modulador é um fármaco para o tratamento da diabetes de tipo II. Como aqui utilizado, o termo "placebo" refere-se a um modelo animal ao qual não foi administrado o referido modulador de um polipéptido de caderina-T. A referência a passos de métodos conhecidos, passos de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é, de modo algum, um reconhecimento de que qualquer aspecto, descrição ou forma de realização da presente invenção é descrito, ensinado ou sugerido na técnica relevante.

Exemplos

Exemplo 1: Construção e expressão de Acrp30 marcada A sequência de codificação completa para a Acrp30 murina (SEQ ID NO: 3) foi inserida num vector pCDNA3.1. O vector pcDNA3.1 foi obtido de Invitrogen (Carlsbad, CA). O vector 52 pCDNA3.1 inclui o promotor de CMV que regula a expressão do gene clonado. A sequência de codificação do epítopo Flag (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) foi inserida através de mutagénese por PCR entre o sítio de dissociação previsto da sequência sinal da Acrp30 (aminoácido na posição 17 da SEQ ID NO: 3) e a região amino-terminal. Esta construção é designada 5'FlagAcrp30. A mutagénese por PCR foi realizada utilizando iniciadores das SEQ ID NOs: 5 até 8. Os iniciadores das SEQ ID NOs: 6 e 7 contêm a sequência que codifica o epítopo Flag e as sequências Acrp30, e foram utilizados em PCR de sobreposição para introduzir a marcação após a sequência sinal. As SEQ ID Nos. 5 e 8 contêm sequências de Acrp30 nas extremidades 5' e 3' do gene, respectivamente, e também contêm um sítio EcoRI utilizado para subclonagem em pCDNA3.1.

Uma segunda construção, designada 3'Flag-Acrp30, foi também construída inserindo, através de mutagénese por PCR, a sequência de codificação para o epítopo Flag imediatamente antes do codão de paragem do ADNc da Acrp30 para gerar a proteína marcada na extremidade carboxi. A mutagénese por PCR foi realizada utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 9, que contém as sequências Acrp30-5' precedidas por um sítio EcoRI, e da SEQ ID NO: 10, o qual contém as sequências Acrp30-3' que carecem o codão de paragem, estando o codão de paragem substituído por uma sequência que codifica o epítopo Flag seguido imediatamente por um codão de paragem e um sítio EcoRI. 53

Estas duas construções Flag-Acrp30 foram sequenciadas para confirmar que não tinham ocorrido nenhuns erros introduzidos por PCR. A fim de gerar proteínas Flag-Acrp30 recombinantes, células HEK foram transfectadas transitoriamente com estas construções. Depois de se transferir as células para meio sem soro, recolheu-se os sobrenadantes. Determinou-se a concentração de proteína por comparação com quantidades conhecidas de proteína de fusão de Acrp30 marcada com Flag expressada em bactérias, purificada através do ensaio de transferência de Western. Os sobrenadantes continham aproximadamente 5 μρ/ηιΐΐ, de Acrp30 marcada, segregada.

Estes sobrenadantes foram ainda purificados por precipitação com sulfato de amónio seguida de FPLC de cromatografia de troca aniónica (HiQ, Bio-Rad) das proteínas ressuspendidas. Após cromatografia aniónica, a electroforese de gel nativa e a imunotransferência para o epítopo Flag mostraram resolução da proteína expressada em duas espécies: a primeira continha predominantemente a 5'Flag-Acrp30 trimérica, enquanto a segunda continha a 5'Flag-Acrp30 hexamérica e de massa molecular mais elevada. A pureza destas preparações foi avaliada como sendo de aproximadamente 50 por cento através de SDS-PAGE e revelação com Coomassie.

Exemplo 2: Ligação de polipéptidos de Flaq-Acrp30 a miócitos C2C12, células CHO e células Ba/F3 A capacidade dos polipéptidos de Flag-Acrp30 compreendidos nos sobrenadantes anteriores para se ligar a miócitos C2C12 não diferenciados, a células CHO e a células Ba/F3 foi 54 avaliada através de ensaios de ligaçao de triagem de células activada por fluorescência (FACS).

Transferiu-se células aderentes (C2C12 e CHO) ou células em suspensão (Ba/F3) para meios sem soro durante duas horas e incubou-se em seguida a 4 °C durante trinta minutos para bloquear a endocitose. As células foram incubadas em BSA a 1% em PBS contendo CaCl2 0,9 mM e MgCl2 0,5 mM (PBS + +) a 4 °C durante trinta minutos para bloquear sítios de ligação não específicos. Todos os passos subsequentes foram efectuados a 4 °C. As células foram incubadas numa solução 1:1 de meios condicionados de células HEK e solução de bloqueio durante duas horas, lavadas duas vezes em PBS++ e incubadas durante uma hora com um anticorpo monoclonal que reconhece o epítopo Flag conjugado com o corante fluorescente APC (Phyco Link). Os anticorpos que reconhecem o epítopo Flag foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). Depois de lavar duas vezes em PBS++, as células aderentes foram raspadas e ressuspendidas em PBS contendo 10% de FBS e 0,5 μρ/ιτΛ de iodeto de propídio (PI), um marcador da permeabilidade celular, e analisadas por FACS. Determinou-se a fluorescência mediana de células PI-negativas vivas. A Figura 1 mostra o resultado do ensaio de ligação FACS. Apresenta-se a fluorescência mediana das células para cada tipo de célula. As pistas 1-3 correspondem a um ensaio de ligação realizado com controlos de tampão. As pistas 4-6 correspondem a um ensaio de ligação realizado com meios condicionados de células HEK transfectadas com o vector pCDNA3.1 sozinho, que carecem de qualquer inserção de ADNc (células de controlo) . As pistas 7-9 correspondem a um ensaio de ligação realizado com meios condicionados de células HEK transfectadas com 5'Flag-Acrp30. As pistas 10- 55 12 correspondem a um ensaio de ligação realizado com meios condicionados de células HEK transfectadas com 3'Flag-Acrp30. Foram realizadas duas experiências independentes. Meios condicionados refere-se aos sobrenadantes não purificados gerados como se descreveu no Exemplo 1.

Como se mostra na Figura 1, as células Ba/F3 não se ligaram consideravelmente à 5'FlagAcrp30 (pista 9) ou à 3'FlagAcrp30 (pista 12). 0 sinal obtido foi semelhante ao obtido com os sobrenadantes transfectados de controlo (pista 6) ou quando se adicionou apenas a solução de bloqueio (pista 3). As células CHO produziram um sinal ligeiramente maior quando incubadas em meios condicionados contendo Acrp30 marcada 5'-Flag (pista 8) ou Acrp30 marcada 3'-Flag (pista 11) por comparação com o controlo contendo apenas a proteína de bloqueio (pista 3) ou o sobrenadante transfectado de controlo (pista 5). No entanto, as células C2C12 demonstraram uma duplicação do sinal quando as células foram incubadas em meios condicionados contendo 5'Flag-Acrp30 (pista 7) ou 3'Flag-Acrp30 (pista 10), em comparação com a solução de bloqueio (pista 1) ou sobrenadante transfectado de controlo (pista 4).

Estes resultados indicam que as células C2C12, mas não as células Ba/F3, ligam especificamente a Acrp30.

Exemplo 3: Clonagem de um novo receptor de Acrp30 3.1. Construção da biblioteca de ADNc de C2C12

Escolheu-se a linha celular C2C12 para construção de uma biblioteca de expressão de ADNc uma vez que se liga a polipéptidos de Flag-Acrp30 não purificados e uma vez que, 56 como foi anteriormente demonstrado, aumenta a oxidação de ácidos gordos em resposta a Acrp30 (Fruebis et al., 2001).

Preparou-se uma biblioteca de expressão de ADNc de C2C12 não diferenciadas num vector retroviral bicistrónico pBI-GFP. Este vector contém uma sequência de codificação de proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo de um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) (Bogan et al., 2001). A expressão do gene clonado ou da inserção de ADNc é proporcional à expressão de GFP nas células individuais. A qualidade do ARNm foi verificada através de análise por transferência de Northern do gene β-actina. Após ligação do ADNc transcrito de modo inverso no vector retroviral, a caracterização da biblioteca amplificada revelou aproximadamente 0,5-lxl07 transformantes independentes. Através da digestão por restrição de plasmídeos preparados a partir de clones individuais da biblioteca primária, 95 por cento continha inserções com um tamanho médio de 1,5 kb. Produziu-se partículas virais de ADNc infecciosas por transfecção do plasmídeo numa linha celular de embalagem (Naviaux et al., 1996) . O sobrenadante contendo vírus resultante foi utilizado para infectar aproximadamente 5 por cento de uma população de 2xl08 células Ba/F3 naive. 3.2. Preparação de esferas magnéticas

Esferas magnéticas contendo grupos reactivos tosilo (M280 Dynalbeads, Dynal) foram incubadas com anticorpo anti-Flag (M2, Sigma) para acoplar o anticorpo às esferas. Após acoplamento, as esferas foram bloqueadas numa solução de PBS++ contendo 1% de BSA durante uma hora, adicionadas a 40 mL de meios condicionados de células HEK transfectadas com 57 5 'Flag-Acrp30 e incubadas dum dia para o outro a 4 °C. Esferas de controlo foram incubadas com os sobrenadantes de células HEK transfectadas com o vector vazio pCDNA3.1. Após ligação aos sobrenadantes, as esferas foram lavadas duas vezes em PBS + + contendo 0,1% de BSA e conservadas sob condições estéreis no mesmo tampão. 3.3. Prospecção das esferas magnéticas

As células Ba/F3 infectadas pela biblioteca de expressão de ADNc de C2C12 foram expandidas durante dois dias antes de serem submetidas a ligação às esferas magnéticas. As células foram preparadas e bloqueadas como se descreveu no Exemplo 2, excepto que foi incluído 0,1 mg/mL de IgG de rato (Sigma) no passo de bloqueio. Todos os passos subsequentes foram realizados a 4 °C para impedir a internalização das esferas.

As células foram pré-limpas para eliminar células ligadas não especificamente incubando 30 mL de células (2,4xl07/mL) com 30 μΕ de esferas magnéticas de controlo durante uma hora. As células ligadas foram separadas através da utilização de um magnete, e as células não aderentes foram novamente submetidas a mais dois ciclos de ligação a esferas de controlo. As células não aderentes foram incubadas com 75 μΕ de esferas de 5'Flag-Acrp30 durante uma hora, após o que as células aderentes foram separadas com um magnete e lavadas três vezes (cinco minutos em 10 mL de PBS++ com 0,1% de BSA.) As células ligadas foram expandidas em cultura; em ciclos subsequentes de ligação, a pré-limpeza foi realizada duas vezes com 15 μΕ de esferas de controlo antes de se adicionar 30 μμ de esferas de 5'Flag- 58

Acrp30. Após cada ciclo de ligação e expansão, analisou-se aliquotas das células por FACS quanto à expressão de GFP para seguir o enriquecimento de células que contêm integrado um retrovirus.

Uma vez que a expressão de GFP a partir da IRES do vector retroviral integrado é proporcional à expressão da inserção de ADNc clonada em células individuais (Liu et al., 2000), o enriquecimento na expressão de GFP numa população de células após ligação à 5'Flag-Acrp30 está ligada ao enriquecimento de um ADNc clonado que confere ligação. 3.4. Análise por FACS de grupos de células enriquecidas

Após um ciclo de ligação às esferas, 2,4% das células purificadas nas esferas de controlo e 1,6% das células purificadas nas esferas de 5'Flag-Acrp30 eram positivas em termos de GFP relativamente às células não infectadas.

Após o segundo ciclo de ligação, 1,7% das células purificadas nas esferas de controlo e 7,8% das células purificadas nas esferas de 5'Flag-Acrp30 eram positivas em termos de GFP.

No terceiro ciclo, as células que se ligavam às esferas de controlo não tinham sofrido enriquecimento por comparação com o primeiro ciclo, já que 2,3% eram positivas em termos de GFP. Por outro lado, 73% das células que se ligavam às esferas de 5'Flag-Acrp30 eram positivas em termos de GFP, indicando que a população tinha sofrido enriquecimento no que se refere às células que continham um clone de ADNc retroviral integrado. 59

Uma vez que as células ligadas à esfera de controlo não sofreram enriquecimento em termos de GFP durante o terceiro ciclo são excluídos efeitos epigenéticos devido ao enriquecimento de células ligas às esferas de 5'Flag-Acrp30. Assim, a população de células enriquecida contém provavelmente um ADNc que codifica um receptor para a Acrp3 0 . 3.5. Amplificação da inserção de ADNc enriquecida

Preparou-se ADN genómico dos diferentes grupos de células obtidos após o terceiro ciclo e submeteu-se a amplificação por PCR utilizando iniciadores específicos retrovirais a flanquear o sítio de clonagem de ADNc do vector retroviral pBI-GFP. Estes grupos diferentes de células correspondiam a células Ba/F3 naive ou a células Ba/F3 infectadas com a biblioteca de ADNc e ligaram-se a esferas magnéticas que tinham sido incubadas com o sobrenadante de (i) células HEK transfectadas com o vector pcDNA3.1 sozinho; (ii) células HEK que expressam a 5'FlagAcrp30; ou (ii) células HEK que expressam a 5'FlagAcrp30. Nas células incubadas com as esferas contendo 5'Flag-Acrp30, mas não nas células de controlo ou nas células Ba/F3 naive, observou-se uma única banda específica de 2,5 kb.

Esta banda foi subclonada no vector pCRII-Topo e as extremidades sequenciadas utilizando iniciadores específicos do vector. A sequência foi idêntica à caderina-T murina (número de admissão no GenBank BC021628). A fim de obter a sequência completa da inserção, concebeu-se os iniciadores das SEQ ID NOs: 11 até 18 a partir da sequência conhecida de caderina-T para permitir a sequenciação da 60 inserção completa. Esta confirmou a identidade do clone enriquecido como caderina-T de comprimento total.

Consequentemente, a caderina-T é um receptor potencial de Acrp30. O facto de a caderina-T ser um receptor de Acrp30 foi confirmado como se pormenoriza abaixo.

Exemplo 4: Ligação de Acrp30 à caderina-T 4.1. Sobre-expressão de caderina-T em células

Obteve-se ADNc de caderina-T murina de comprimento total como uma etiqueta de sequência expressada (IMAGE clone ID 3987627) e clonou-se no vector pCDNA3.1 para gerar uma construção pCDNA-Tcad. Foram geradas três linhas de células que sobre-expressam caderina-T. Células CHO foram transfectadas transitoriamente com pCDNA-Tcad. Estas células CHO transfectadas transitoriamente demonstraram uma maior ligação à 5'Flag-Acrp30 em comparação com os sobrenadantes de cultura de tecido de controlo utilizando o ensaio de ligação FACS anteriormente descrito. A sequência de codificação completa da caderina-T foi clonada no vector retroviral pBI-GFP para gerar a construção pBI-GFP-Tcad. Células Ba/F3 naive e CHO-ER foram transfectadas com pBI-GFP-Tcad. A linha de células CHO-ER expressa de modo estável o receptor do vector retroviral e pode ser infectada por vírus ecotrópicos (oferta do Dr. M. Krieger, MIT).

4.2. Análise da ligação da Acrp30 à caderina-T por FACS 61

As linhas celulares anteriores foram subsequentemente utilizadas para ensaios de ligação FACS, como se mostra na Figura 2. Os painéis 1 até 3 correspondem ao ensaio de ligação FACS de células Ba/F3 de controlo. Os painéis 4 até 9 correspondem ao ensaio de ligação FACS de células Ba/F3 que expressam caderina-T infectadas com retrovirus (pBI-GFP-Tcad). A ligação foi estudada para:

- hexâmero de 5'Flag-Acrp300 nM (painéis 1 e 4), 6 nM (painéis 2 e 5, 7-9) ou 60 nM (painéis 3 e 6); - hexâmero de Acrp30 60 nM (painel 7); - EDTA 10 mM (painel 8); e - 10 pg/mL de Clq (painel 9) .

As células Ba/F3 não infectadas, de controlo exibiram uma ligação fraca ao hexâmero de 5'Flag-Acrp30 6 nM (painel 2) ou 60 nM (painel 3), enquanto as células Ba/F3 que expressam caderina-T demonstraram uma ligação crescente ao hexâmero de 5'Flag-Acrp30 6 nM (painel 5 e painéis 7-9) ou 60 nM (painel 6) (concentração exprimida como equivalentes de trímero). A ligação de fundo na ausência de ligando foi fraca (painel 4). A inclusão de 60 nM de hexâmero de Acrp30 não marcado, produzido em eucariotas inibiu a ligação de 5'FlagAcrp30 6 nM (painel 7), que indica uma ligação específica entre a Acrp30 e a caderina-T. A fim de examinar os requisitos de catião divalente para a ligação, adicionou-se EDTA 10 mM à reacção de ligação. Isto bloqueou completamente a ligação (painel 8), o que indica que são necessários catiões divalentes para ligação. A Clq, uma molécula que partilha homologia com a Acrp30, não afectou a ligação num excesso de 20 vezes (em peso) quando co-incubada com hexâmero de 5'Flag-Acrp30 6 nM (painel 9), o 62 que indica que a Clq provavelmente não se liga ao mesmo receptor que a Acrp30.

Em experiências paralelas não se observou qualquer ligação significativa de gAcrp30 expressada por bactérias a linhas celulares que expressam caderina-T ou a uma preparação de 5 'Flag-Acrp30 trimérica produzida em células de mamíferos.

Esta experiência confirma que a caderina-T não se liga ao epítopo Flag, excluindo assim uma explicação trivial para a ligação à 5'Flag-Acrp30. Além disso, este resultado sugere que a caderina-T é um receptor específico para as espécies hexamérica e HMW da Acrp30 de comprimento total mas não se liga às espécies globular ou trimérica da Acrp30.

4.3. Análise da ligação da Acrp30 à caderina-T por ELISA

Foram ainda realizados ensaios ELISA para mostrar a ligação directa da Acrp30 a células que expressam caderina-T.

Linhas celulares CHO-ER infectadas com a construção retroviral bicistrónica pBI-GFP-Tcad (referida como CHO-caderina-T) e células de controlo infectadas com pBI-GFP (referidas como CHO-GFP) foram, cada uma, multiplicada em placas de 96 poços. Um dia após a aplicação (1,5xl04/poço) , as células foram incubadas em meios sem soro durante uma hora, colocadas a 4 °C durante trinta minutos e bloqueadas em PBS++ contendo 4% de leite seco durante trinta minutos. Acrp30 globular marcado com Flag expressada em bactérias, completa marcada com Flag expressada em bactérias ou 5'Flag-Acrp30 trimérica ou hexamérica e HMW purificadas produzidas em células HEK foram incubadas com as células durante uma hora em tampão de bloqueio às concentrações 63 indicadas. Produziu-se polipéptidos expressados em HEK e purificou-se por precipitação com sulfato de amónio e por cromatografia de troca aniónica. Grupos contendo a 5'Flag-Acrp30 trimérica ou uma combinação do hexâmero e HMW foram identificados por electroforese de gel nativa e imunotransferência com um anticorpo anti-Flag. A pureza destas preparações foi avaliada como sendo de aproximadamente 50% através de análise por PAGE Coomassie. A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA (Pierce). A concentração de proteínas expressadas em bactérias, purificadas foi determinada pela absorvância a 280 nm e o coeficiente de extinção calculado derivado da sequência primária de aminoácidos (Protean; DNAStar). Depois de lavar duas vezes em PBS++, adicionou-se um anticorpo monoclonal ao epítopo Flag (M2; 4 μρ/ιτΛ) durante uma hora; a lavagem foi repetida, seguida de uma incubação em anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano-silvestre (anti-rato de burro; Jackson), e desenvolvido com substrato TMB colorimétrico (Pierce). Mediu-se a absorvância a 450 nm com um leitor de placas.

Os resultados são apresentados nas Figuras 3A e 3B. A Figura 3A mostra a análise por ELISA da ligação de várias preparações de Acrp30 ao controlo de CHO-GFP. A Figura 3B mostra as linhas celulares que expressam a CHO-caderina-T. gAcrp refere-se a 3'Flag-gAcrp30 expressada em bactérias. Acrp de comprimento total refere-se a 3'Flag-Acrp30 expressada em bactérias. TRI refere-se a 5'FlagAcrp30 trimérica produzida em HEK. HEX e HMW referem-se a 5'FlagAcrp30 hexamérica e de massa molecular elevada produzidas em HEK. Foram realizados quatro experiências independentes. 64

Como se observa na Figura 3A, as células de controlo não ligaram qualquer uma das proteínas testadas. Como se observa na Figura 3B, as células CHO que expressam caderina-T demonstraram ligação apenas para os oligómeros hexamérico e HMW, mas não trimérico, da 5'FlagAcrp30. A concentração de ligação semi-máxima estimada é de 25-50 nM (concentração expressada como equivalentes de trímero). Não houve qualquer ligação de proteína globular ou de comprimento total produzida em bactérias às células CHO que expressam caderina-T, o que implica que o reconhecimento da Acrp30 pela caderina-T pode requerer modificações pós-tradução da Acrp30 e não envolve provavelmente do domínio globular.

Assim sendo, a caderina-T pode ligar-se às espécies hexamérica e HMW da Acrp30 mas não às espécies globular ou trimérica.

Exemplo 5: Efeito da caderina-T na transcrição mediada por NF-kB

Para determinar se as células que sobre-expressam caderina-T têm uma resposta NF-κΒ alterada à estimulação pela Acrp30, examinou-se a transcrição mediada por NF-κΒ em células transfectadas transitoriamente com o plasmídeo pCDNA3.1 de controlo ou com o plasmídeo pCDNA-caderina-T (pCDNA-Tcad) como descrito em Tsao et al. (2002).

Para analisar a actividade de NF-κΒ, pCDNA-Tcad foi co-transfectado com um plasmídeo contendo a sequência de codificação da luciferase sob o controlo de um promotor de selectina-E que codifica um elemento de resposta ao NF-kB. 65 A construção selectina-E luciferase foi gerada inserindo o promotor de selectina-E no vector pGL2-Basic contendo o gene da luciferase (Promega) como descrito por Schindler e Baichwal (1994). Um terceiro plasmideo que expressa β-galactosidase sob o controlo do promotor do CMV também foi co-transfectado e foi utilizado para normalizar os níveis de expressão. Os plasmídeos foram transfectados nas células em placas de 24 poços. No dia seguinte, as células foram incubadas durante seis horas em meios contendo os compostos indicados. A actividade enzimática da luciferase e da β-galactosidase dos lisados celulares foi determinada com um ensaio baseado num luminómetro (Promega). 0 sinal da luciferase foi normalizado à actividade da β-galactosidase e representado como número de vezes de estimulação em relação a células não estimuladas transfectadas com as construções idênticas. A Figura 4 mostra o número de vezes de estimulação da transcrição mediada pelo NF-κΒ em miócitos C2C12 não diferenciados. Mediu-se a actividade da luciferase. A coluna 1 mostra o número de vezes de estimulação após tratamento de 6 h com meio sozinho. A coluna 2 mostra o número de vezes de estimulação com a adição de 2 ug/mL de Acrp30 hexamérica. A coluna 3 mostra o número de vezes de estimulação com a adição de 300 ng/mL de LPS. A coluna 4 mostra o número de vezes de estimulação com a adição de 50 ng/mL de TNF-α. Foram realizadas três experiências independentes.

A coluna 1 mostra que a expressão da caderina-T suprime a transcrição de base mediada pelo NF-κΒ até 3 7% da transcrição mediada pelo NF-κΒ em células de controlo. O 66

hexâmero de Acrp30 (coluna 2) a uma concentração de 2 ug/mL estimula 1,8 vezes a transcrição mediada pelo NF-κΒ. Nas células que expressam caderina-T, esta estimulação é completamente suprimida, uma vez que a transcrição mediada pelo NF-κΒ tem o mesmo nivel que em células que expressam caderina-T não tratadas. As colunas 3 e 4 mostram células C2C12 tratadas com 300 ng/mL de LPS (coluna 3) ou 50 ng/mL de TNF-a (coluna 4) . Em ambos os casos, existe uma estimulação semelhante de quatro vezes em células de controlo transfectadas, e em ambos os casos, a estimulação foi reduzida pela expressão da caderina-T. No entanto, a caderina-T reduz apenas a estimulação até ao nivel de base de células de controlo transfectadas. Não houve mais supressão como foi o caso com células tratadas com Acrp30 hexamérica. A expressão de β-galactosidase permaneceu inalterada entre as linhas celulares transfectadas com pCDNA e caderina-T, o que indica que a sobre-expressão de caderina-T não conduz a supressão transcricional não especifica.

Concluindo, a sobre-expressão de caderina-T suprime a transcrição mediada pelo NF-κΒ iniciada por vários estímulos diferentes, incluindo a transcrição mediada pelo NF-κΒ, iniciada pela Acrp30. 67

Referências 1. Arita, Kihara et al. (1999) "Paradoxical decrease of an adipose-specific protein, adiponectin, in obesity" Biochem Biophys Res Commun 257(1): 79-83 2. Berg, Combs et al. (2001) "The adipocyte-secreted protein Acrp30 enhances hepatic insulin action" Nat Med 7(8): 947-53 3. Bogan, McKee et al. (2001) "Insulin-responsive compartments containing GLUT4 in 3T3-L1 and CHO cells: regulation by amino acid concentrations" Mol Cell Biol 21(14): 4785-806 4. Castle, Colca et al. (1993) "Lipoprotein profile characterization of the KKA(y) mouse, a rodent model of type II diabetes, before and after treatment with the insulin-sensitizing agent pioglitazone"

Arterioscler Thromb 13(2):302-9 5. Chebath J, Fischer et al. (1997) "Interleukin-6 receptor-interleukin-6 fusion proteins with enhanced interleukin-6 type pleiotropic Cytokine Netw. 8(4):359-65. activities" Eur 6. Conacci-Sorrell, Zhurinsky et cadherin-catenin adhesion system al. (2002) in signaling "The and câncer" J Clin Invest 109(8): 987-91 7. Doyle, Goings et al. (1998) "T-cadherin is a major glycophosphoinositol-anchored protein associated with noncaveolar detergent-insoluble domains of the cardiac sarcolemma" J Biol Chem 273(12): 6937-43 8. Edwards and Leatherbarrow "Determination of association rate constants by an optical biosensor using initial rate analysis" Anal Biochem, 1997 Mar. 1; 246(1):1-6 68 9. Elbashir, Harborth et al. (2001) Duplexes of 21- nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells Nature, 2001 May 24; 411(6836):494-8 10. Ellington and Szostak (1990) "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands" Nature 346 (6287) :818-22 11. Elliott and Pestronk (1994) "Progression of multifocal motor neuropathy during apparently successful treatment with human immunoglobulin" Neurology. 44 (5) : 967-8. 12. Febbraio and Pedersen (2002) "Muscle-derived interleukin-6: mechanisms for activation and possible biological roles" FASEB J 16(11):1335-47 13. Feinglos, Thacker et al. (1997) "Modification of postprandial hyperglycemia with insulin lispro improves glucose control in patients with type 2 diabetes" Diabetes Care, 20(10):1539-42 14. Fields and Song (1989) "A novel genetic System to detect protein-protein interactions" Nature 340(6230):245-6 Nature 340:245-6 15. Fromont-Racine, Rain et al. (1997) Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive two-hybrid screens Nat Genet 16(3):277-82 16. Fruebis, Tsao et al. (2001) "Proteolytic cleavage product of 30-kDa adipocyte complement-related protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weight loss in mice" Proc Natl Acad Sei USA 98(4): 2005-10 17. Grantham R (1974) "Amino acid difference formula to help explain protein evolution" Science 185(4154):862-4

Hara, Boutin et al. (2002) "Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an 18. 69 increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population" Diabetes 51(2): 536-40 19. Holman, Cull et al. (1999) "A randomized double-blind trial of acarbose in type 2 diabetes shows improved glycemic control over 3 years" Diabetes Care 22(6):960-4 20. Hu, Liang et al. (1996) "AdipoQ is a novel adipose-specific gene dysregulated in obesity" J Biol Chem 271 (18) : 10697-10703 21. Huang, Wu et al. (2003) "T-cadherin-mediated cell growth regulation involves G2 phase arrest and requires p21(CIP1/WAF1) expression" Mol Cell Biol 23 (2) : 566-78 22. Ivanov, Philippova et al. (2001) “Expression of cell adhesion molecule T-cadherin in the human vasculature" Histochem Cell Biol 115(3): 231-42 23. Knight, Trinh et al. (1993) "Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody" Mol Immnunol. 30(16):1443-53. 24. Kollet O, Aviram et al. (1999) "The soluble interleukin-6 (IL-6) receptor/IL-6 fusion protein enhances in vitro maintenance and proliferation of human CD34(+)CD38(-/low) cells capable of repopulating severe combined immunodeficiency mice" Blood. 94(3):923-31. 25. Kondo, Shimomura et al. (2002) "Association of adiponectin mutation with type 2 diabetes: a candidate gene for the insulin resistance syndrome" Diabetes 51(7): 2325-8 26. Kosmidou, Vassilakopoulos et al. (2002) "Production of interleukin-6 by skeletal myotubes: role of reactive oxygen species" Am J Respir Cell Mol Biol 26(5):587-93 70 27. Lindsay, Funahashi et al. (2002) "Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population" Lancet 360(9326): 57-8 28. Liu, Constantinescu et al. (2000 ) "Generation of mammalian cells stably expressing multiple genes at predetermined leveis" Anal Biochem 280(1): 20-8 29. Maeda, Okubo et al. (1996) "cDNA cloning and expression of a novel adipose specific collagen-like factor, apMl (AdiPose Most abundant Gene transcript 1)" Biochem Biophys Res Commun 221(2): 286-9 30. Maeda, Shimomura et al. (2002) "Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30" Nat Med 8(7): 731-7 31. Naviaux, Costanzi et al. (1996) "The pCL vector System: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses" J Virol 70(8): 5701-5 32. Niermann, Kern et ai. (2000) "The glycosyl phosphatidylinositol anchor of human T-cadherin binds lipoproteins" Biochem Biophys Res Commun 276(3): 1240-7 33. Ogawa, Masuzaki et al. (1995) "Molecular cloning of rat obese cDNA and augmented gene expression in genetically obese Zucker fatty (fa/fa) rats" J Clin Invest 96(3): 1647-52 34. Okamoto, Arita et al. (2000) "An adipocyte-derived plasma protein, adiponectin, adheres to injured vascular walls" Horm Metab Res 32(2): 47-50 35. Panidis, Kourtis et al. (2003) "Serum adiponectin leveis in women with polycystic ovary syndrome" Hum Reprod. 18(9):1790-6. 36. Pelleymounter, Cullen et al. (1995) "Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice Science 269 (5223) :540-3" 71 37. Petridou, Mantzoros et al. (2003) "Plasma adiponectin concentrations in relation to endometrial câncer: a case-control study in Greece" J Clin Endocrinol Metab. 88 (3) :993-7. 38. Piercy, Toseland et al. (1998) "Potential benefit of inhibitors of advanced glycation end products in the progression of type II diabetes: a study with aminoguanidine in C57/BLKsJ diabetic mice" Metabolism 47(12): 1477-80 39. Piercy, Toseland et al. (2000)<< Acceleration of the development of diabetes in obese diabetic (db/db) mice by nicotinamide: a comparison with its antidiabetic effects in non-obese diabetic mice" Metabolism, 2000 December; 49(12):1548-54 40. Ramsay, Jamieson et al. (2003) "Paradoxical elevation in adiponectin concentrations in women with preeclampsia." Hypertension. 42(5):891-4. 41. Rasmussen, Ji et al. (1997) "Two-dimensional electrophoretic analysis of human breast carcinoma proteins: mapping of proteins that bind to the SH3 domain of mixed lineage kinase MLK2" Electrophoresis, 1997 March-April;18(3-4):588-98 42. Roth, Mobarhan et al. (2002) "Syndrome X: where are we and where do we go?" Nutr Rev 60:335-7 Review

43. Sambrook, Fritsch et al. (1989) "Molecular Cloning: A

Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 44. Scherer, Williams et al. (1995) "A novel serum protein similar to Clq, produced exclusively in adipocytes" J Biol Chem 270(45): 26746-9

Schindler and Baichwal (1994) Three NF-kappa B binding sites in the human E-selectin gene required for 45. 72 maximal tumor necrosis factor alpha-induced expression. Mol Cell Biol. 14(9):5820-31.

46. Takeuchi, Misaki et al. (2000; ) "Expression of T- cadherin (CDH13, Η-Cadherin) in human brain and it s characteristics as a negative growth regulator of epidermal growth factor in neuroblastoma cells " J

Neurochem 74(4): 1489-97 47. Tanihara, Sano et al. (1994) "Cloning of five human cadherins clarifies characteristic features of cadherin extracellular domain and provides further evidence for two structurally different types of cadherin" Cell Adhes Commun 2(1): 15-26 48. Tkachuk, Bochkov et al. (1998) "Identification of an atypical lipoprotein-binding protein from human aortic smooth muscle as T-cadherin" FEBS Left 421(3): 208-12 49. Tsao, Murrey et al. (2002) "Oligomerization state- dependent activation of NF-kappa B signaling pathway by adipocyte complement-related protein of 30 kDa (Acrp30)" J Biol Chem 277 (33): 29359-62 50. Tsao, Tomas et al. (2003) "Role of Disulfide Bonds in

Acrp30/Adiponectin Structure and Signaling

Specificity: Different Oligomers Activate Different Signal Transduction Pathways" J Biol Chem In the press 51. Ueda, Ikegami et al. (2000) "Age-dependent changes in phenotypes and candidate gene analysis in a polygenic animal model of Type II diabetes mellitus; NSY mouse" Diabetologia 43(7):932-8 52. Xu, Wang et al. (2003) "The fat-derived hormone adiponectin alleviates alcoholic and nonalcoholic fatty liver diseases in mice" J Clin Invest. 2003

July; 112 (1) :91-100. 73 53. Yamauchi, Kamon et al. (2003) "Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects" Nature 423(6941): 762-9 54. Yamauchi, Kamon et al. (2001) "The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity" Nat Med 7(8): 941-6 55. Yokota, Oritani et al. (2000) "Adiponectin, a new member of the family of soluble defense collagens, negatively regulates the growth of myelomonocytic progenitors and the functions of macrophages" Blood. 96 (5) :1723-32 56. Zoccali, Mallamaci et al. (2003) "Adiponectin is markedly increased in patients with nephrotic syndrome and is related to metabolic risk factors" Kidney Int Suppl. 84 : S98-102. 74

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Whitehead Institute for Biomedical Research Hug, Christopher Lodish, Harvey F.

<120> UTILIZAÇÃO DE CADERINA-T SOLÚVEL NO TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS METABÓLICOS

<130> SER-100X <150> US 60/526 956 <151> 2003-12-03 <160> 18 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 713 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SINAL <222> <223> (D · · (22) <220> <221> LÍPIDO <222> (693)..(693

<223> ANCORA GPI <220> 75 <221> PROPEP <222> (23)..(139) <223> <220> <221> PROPEP <222> (694)..(713) <223> <440> 1

Met Gin Pro Arg *rhr Pro Leu Vai Leu Cys Vai Leu Leu Ser Gin Vai 1 5 10 15 Leu Leu Leu Thr Ser Ala Glu Asp Leu Asp Cys Thr Pro Gly Phe Gin 20 25 30 Gin Lys Vai Phe His Ile Asn Gin Pro Ala Glu Phe Ile Glu Asp Gin 35 40 45 Ser Ile Leu Asn Leu Thr Phe Ser Asp Cys Lys Gly Asn Asp Lys Leu 50 55 60 Arg Tyr Glu Vai Ser Ser Pro Tyr Phe Lys Vai Asn Ser Asp Gly Gly 65 70 75 80 Leu Vai Âlct Leu Arg Asn Ile Thr Ala Vai Gly Lys Thr Leu Phe Vai 85 90 95 His Ala Arg Thr Pro His Ala Glu Asp Meu Ala Glu Leu Vai Ile Vai 100 105 110 Gly 61y Lys Asp Ile Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Phe Lys Phe Ala 115 120 125 Arg Thr Ser Pro Vai Pro Arg Gin Lys Arg Ser lie Vai Vai Ser Pro 130 135 140 Ile Leu Ile Pro Glu Asn Gin Arg Gin Pro Phe Pro Arg Asp Vai Gly 145 ISO 155 160 Lys Vai Vai Asp Ser Asp Arg Pro Glu Arg Ser Lys Phe Arg Leu Thr 165 170 175 Gly Lys Gly Vai Asp Gin Glu Pro Lys Gly Ile Phe Arg Ile Asn Glu 180 185 100 76

Asn Thr Gly Ser Vai Ser Vai Thr Arg Thr Leu Asp Arg Glu Vai Ile 195 200 205 Ala Vai Tyr Gin Leu Phe Vai Glu Thr Thr Asp Vai Asn Gly Lys Thr 210 215 220 Leu Glu Gly Pro Vai Pro Leu Glu Vai Ile Vai Ile Asp Gin Asn Asp 225 230 235 240 Asn Arg Pro Ile Phe Arg Glu Gly Pro Tyr Ile Gly His Vai Met Glu 245 250 255 Gly Ser Pro Thr Gly Thr Thr Vai Met Arg Met Thr Ala Phe Asp Ala 260 265 270 Asp Asp Pro Ala Thr Asp Asn Ala Leu Leu Arg Tyr Asn Ile Arg Gin 275 280 285 Gin Thr Pro Asp Lys Pro Ser Pro Asn Met Phe Tyr Ile Asp Pro Glu 290 295 300 Lys Gly Asp Ile Vai Thr Vai Vai Ser Pro Ala Leu Leu Asp Arg Glu 305 310 315 320 Thr Leu Glu Asn Pro Lys Tyr Glu Leu Ile Ile Glu Ala Gin Asp Met 325 330 335 Ala Gly Leu Asp Vai Gly Leu Thr Gly Thr Ala Thr Ala Thr Ile Met 340 345 350 Ile Asp Asp Lys Asn Asp His Ser Pro Lys Phe Thr Lys Lys Glu Phe 355 360 365 Gin Ala Thr Vai Glu Glu Gly Ala Vai Gly Vai Ile Vai Asn Leu Thr 370 375 380 Vai Glu Asp Lys Asp Asp Pro Thr Thr Gly Ala Trp Arg Ala Ala Tyr 385 390 395 400 Thr Ile Ile Asn Gly Asn Pro Gly Gin Ser Phe Glu Ile His Thr Asn 405 410 415 Pro Gin Thr Asn Glu Gly Met Leu Ser Vai Vai Lys Pro Leu Asp Tyr 420 425 430 Glu Ile Ser Ala Phe His Thr Leu Leu Ile Lys Vai Glu Asn Glu Asp 435 440 445 Pro Leu Vai Pro Asp Vai Ser Tyr Gly Pro Ser Ser Thr Ala Thr Vai 450 455 460 His Ile Thr Vai Leu Asp Vai Asn Glu Gly Pro Vai Phe Tyr Pro Asp 465 470 475 480 77

Pro Met Met Vai Thr Arg Gin Glu Asp Leu Ser Vai Gly Ser Vai Leu 485 490 495 Leu Thr Vai Asn Ala Thr Asp Pro Asp Ser Leu Gin His Gin Thr Ile 500 505 510 Arg Tyr Ser Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Gly Trp Leu Asn Ile Asn Pro 515 520 525 Ile Asn Gly Thr Vai Asp Thr Thr Ala Vai Leu Asp Arg Glu Ser Pro 530 535 540 Phe Vai Asp Asn Ser Vai Tyr Thr Ala Leu Phe Leu Ala Ile Asp Ser 545 550 555 560 Gly Asn Pro Pro Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Ile Thr Leu Glu 565 570 575 Asp Vai Asn Asp Asn Ala Pro Phe Ile Tyr Pro Thr Vai Ala Glu Vai 580 585 590 Cys Asp Asp Ala Lys Asn Leu Ser Vai Vai Ile Leu Gly Ala Ser Asp 595 600 605 Lys Asp Leu His Pro Asn Thr Asp Pro Phe Lys Phe Glu Ile His Lys 610 615 620 Gin Ala Vai Pro Asp Lys Vai Trp Lys Ile Ser Lys Ile Asn Asn Thr 625 630 635 640 His Ala Leu Vai Ser Leu Leu Gin Asn Leu Asn Lys Ala Asn Tyr Asn 645 650 655 Leu Pro Ile Met Vai Thr Asp Ser Gly Lys Pro Pro Met Thr Asn Ile 660 665 670 Thr Asp Leu Arg Vai Gin Vai Cys Ser Cys Arg Asn Ser Lys Vai Asp 675 680 685 Cys Asn Ala Ala i 31y Ala Leu Arg Phe Ser Leu Pro Ser Vai Leu Leu 690 695 700 Leu Ser Leu Phe : Ser Leu Ala Cys Leu 705 710

<210> 2 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 78 <221> SINAL <222> (1)..(14) <223> <220> <221> DOMÍNIO <222> (42)..(107) <223> Domínio tipo colagénio <22 0> <221> DOMÍNIO <222> (108)..(244) <223> domínio Clq <440> 2

Met 1 Leu Leu Leu Gly Ala Vai 5 Leu Leu Leu 10 Leu Ala Leu Pro Gly 15 His Asp Gin Glu Thr 20 Thr Thr Gin Gly Pro Gly 25 Vai Leu Leu Pro 30 Leu Pro Lys Gly Ala 35 Cys Thr Gly Trp Met 40 Ala Gly Ile Pro Gly 45 His Pro Gly His Asn Gly 50 Ala Pro Gly Arg 55 Asp Gly Arg Asp Gly 60 Thr Pro Gly Glu Lys 65 Gly Glu Lys Gly Asp Pro 70 Gly Leu Ile Gly 75 Pro Lys Gly Asp Ile 80 Gly Glu Thr Gly Vai Pro Gly 85 Ala Glu Gly 90 Pro Arg Gly Phe Pro 95 Gly Ile Gin Gly Arg Lys Gly Glu 100 Pro Gly Glu 105 Gly Ala Tyr Vai 110 Tyr Arg Ser Ala Phe 115 Ser Vai Gly Leu Glu 120 Thr Tyr Vai Thr Ile 125 Pro Asn Met Pro Ile Arg 130 Phe Thr Lys Ile 135 Phe Tyr Asn Gin Gin 140 Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe 79 145 150 155 160 Ala Tyr His Ile Thr 165 Vai Tyr Met Lys Asp 170 Vai Lys Vai Ser Leu 175 Phe Lys Lys Asp Lys 180 Ala Met Leu Phe Thr 185 Tyr Asp Gin Tyr Gin 190 Glu Asn Asn Vai Asp 195 Gin Ala Ser Gly Ser 200 Vai Leu Leu His Leu 205 Glu Vai Gly Asp Gin 210 Vai Trp Leu Gin Vai 215 Tyr Gly Glu Gly Glu 220 Arg Asn Gly Leu Tyr 225 Ala Asp Asn Asp Asn 230 Asp Ser Thr Phe Thr Gly 235 Phe Leu Leu Tyr 240 His Asp Thr Asn <210> 3 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SINAL <222> <223> (D · · (17) <220> <221> DOMÍNIO <222> (45)..(110) <223> Domínio tipo <220> <221> DOMÍNIO <222> (111)..(247) <223> domínio Clq colagénio <440> 3 80

Met Leu Leu Leu Gin Ala Leu Leu Phe Leu Leu Ile Leu Pro Ser His 1 5 10 15 Ala Glu Asp Asp Vai Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Vai 20 25 30 Pro Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly 35 40 45 His Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr 50 55 60 Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys 65 70 75 80 Gly Glu Thr Gly Asp Vai Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly 85 90 95 Phe Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Ala Tyr 100 105 110 Met Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Vai Gly Leu Glu Thr Arg Vai Thr Vai 115 120 125 Pro Asn Vai Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gin Gin Asn 130 135 140 His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Asn Ile Pro Gly Leu 145 150 155 160 Tyr Tyr Phe Ser Tyr His Ile Thr Vai Tyr Met Lys Asp Vai Lys Vai 165 170 175 Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Vai Leu Phe Thr Tyr Asp Gin Tyr 180 185 190 Gin Glu Lys Asn Vai Asp Gin Ala Ser Gly Ser Vai Leu Leu His Leu 195 200 205 Glu Vai Gly Asp Gin Vai Trp Leu Gin Vai Tyr Gly Asp Gly Asp His 210 215 220 Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Vai Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe 225 230 235 240 Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn 245 <210> 4 <211> 714

<212> PRT <213> Mus musculus <220> 81 <221> SINAL <222> (1)..(22) <223> <220>

<221> LÍPIDO <222> (693)..(693) <223> ÂNCORA GPI <220> <221> PROPEP <222> (23)..(139) <223> <220> <221> PROPEP <222> (694)..(714) <223> <440> 4

Met Gin Pro Arg Thr Pro Leu Thr Leu Cys Vai Leu Leu Ser Gin Vai 1 5 10 15 Leu Leu Vai Thr Ser Ala Asp Asp Leu Glu Cys Thr Pro Gly Phe Gin 20 25 30 Arg Lys Vai Leu His Ile His Gin Pro Ala Glu Phe Ile Glu Asp Gin 35 40 45 Pro Vai Leu Asn Leu Thr Phe Asn Asp Cys Lys Gly Asn Glu Lys Leu 50 55 60 His Tyr Glu Vai Ser Ser Pro His Phe Lys Vai Asn Ser Asp Gly Thr 65 70 75 80 Leu Vai Ala Leu Arg Asn Ile Thr Ala Vai Gly Arg Thr Leu Phe Vai 85 90 95 82

His Ala Arg Thr Pro His Ala Glu Asp Met Ala Glu Leu Vai Ile Vai 100 105 110 Gly Gly Lys Asp Ile Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Phe Lys Phe Ala 115 120 125 Arg Thr Ser Pro Vai Pro Arg Gin Lys Arg Ser Ile Vai Vai Ser Pro 130 135 140 Ile Leu Ile Pro Glu Asn Gin Arg Gin Pro Phe Pro Arg Asp Vai Gly 145 150 155 160 Lys Vai Vai Asp Ser Asp Arg Pro Glu Gly Ser Lys Phe Arg Leu Thr 165 170 175 Gly Lys Gly Vai Asp Gin Asp Pro Lys Gly Thr Phe Arg Ile Asn Glu 180 185 190 Asn Thr Gly Ser Vai Ser Vai Thr Arg Thr Leu Asp Arg Glu Thr Ile 195 200 205 Ala Thr Tyr Gin Leu Tyr Vai Glu Thr Thr Asp Ala Ser Gly Lys Thr 210 215 220 Leu Glu Gly Pro Vai Pro Leu Glu Vai Ile Vai Ile Asp Gin Asn Asp 225 230 235 240 Asn Arg Pro Ile Phe Arg Glu Gly Pro Tyr Ile Gly His Vai Met Glu 245 250 255 Gly Ser Pro Thr Gly Thr Thr Vai Met Arg Met Thr Ala Phe Asp Ala 260 265 270 Asp Asp Pro Ala Thr Asp Asn Ala Leu Trp Arg Tyr Asn Ile Arg Gin 275 280 285 Gin Thr Pro Asp Lys Pro Ser Pro Asn Met Phe Tyr Ile Asp Pro Glu 290 295 300 Lys Gly Asp Ile Vai Thr Vai Vai Ser Pro Ala Leu Leu Asp Arg Glu 305 310 315 320 Thr Leu Glu Asn Pro Lys Tyr Glu Leu Ile Ile Glu Ala Gin Asp Met 325 330 335 Ala Gly Leu Asp Vai Gly Leu Thr Gly Thr Ala Thr Ala Thr Ile Vai 340 345 350 Ile Asp Asp Lys Asn Asp His Ser Pro Lys Phe Thr Lys Lys Glu Phe 355 360 365

Gin Ala Arg Vai Glu Glu Gly Ala Vai Gly Vai Ile Vai Asn Leu Thr 370 375 380 83

Vai Glu Asp Lys Asp Asp Pro Thr Thr Gly Ala Trp Arg Ala Ala Tyr 385 390 395 400 Thr Ile Ile Asn Gly Asn Pro Gly Gin Ser Phe Glu Ile His Thr Asn 405 410 415 Pro Gin Thr Asn Glu Gly Met Leu Ser Val Val Lys Pro Leu Asp Tyr 420 425 430 Glu Ile Ser Ala Phe His Thr Leu Leu Ile Lys Val Glu Asn Glu Asp 435 440 445 Pro Leu Vai Pro Asp Val Ser Tyr Gly Pro Ser Ser Thr Ala Thr Val 450 455 460 His Ile Thr Val Leu Asp Val Asn Glu Gly Pro Val Phe Tyr Pro Asp 465 470 475 480 Pro Met Met Vai Thr Lys Gin Glu Asn Ile Ser Val Gly Ser Val Leu 485 490 495 Leu Thr Vai Asn Ala Thr Asp Pro Asp Ser Leu Gin His Gin Thr Ile 500 505 510 Arg Tyr Ser Ile Tyr Lys Asp Pro Ala Gly Trp Leu Ser Ile Asn Pro 515 520 525 Ile Asn Gly Thr Val Asp Thr Thr Ala Val Leu Asp Arg Glu Ser Pro 530 535 540 Phe Vai His Asn Ser Val Tyr Thr Ala Leu Phe Leu Ala Ile Asp Ser 545 550 555 560 Gly Asn Pro Pro Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Ile Thr Leu Glu 565 570 575 Asp Ile Asn Asp Asn Ala Pro Val Ile Tyr Pro Thr Val Ala Glu Val 580 585 590 Cys Asp Asp Ala Arg Asn Leu Ser Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asp 595 600 605 Lys Asp Leu His Pro Asn Thr Asp Pro Phe Lys Phe Glu Ile His Lys 610 615 620 Gin Thr Vai Pro Asp Lys Val Trp Lys Ile Ser Lys Ile Asn Asn Thr 625 630 635 640 His Ala Leu Val ! Ser Leu Leu Gin Asn Leu Asn Lys Ala Asn Tyr Asn 645 650 655 Leu Pro Ile Met Val Thr Asp Ser Gly Lys Pro Pro Met Thr Asn Ile 660 665 670 84

Thr Asp Leu Lys Vai Gin Vai Cys Ser Cys Lys Asn Ser Lys Vai Asp 675 680 685

Cys Asn Gly Ala Gly Ala Leu His Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu 690 695 700

Phe Ser Leu Leu Ser Leu Leu Ser Gly Leu 705 710 <210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 5 aagaattccg ccaccatgct actgttgcaa gctctc 36 <210> 6 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 6 gactacaagg acgacgatga caaggaagat gacgttacta caact 45 <210> 7 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> 85 <223> iniciador <440> 7 cttgtcatcg tcgtccttgt agtcggcatg actgggcagg attaa 45 <210> 8 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 8 tttgaattct cagttggtat catggtagag 30 <210> 9 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 9 aagaattccg ccaccatgct actgttgcaa gctctc 36 <210> 10 <211> 60 <212> ADN <213> Artificial <220> 86 <223> iniciador <440> 10 tttgaattct cacttgtcgt catcgtcttt gtagtctgca cttgcatcgt tggtatcatg 60 <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 11 gacatctcct gtcccaag 18 <210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 12 ctaacatgtt ctacatcg 18 <210> 13 <211> 18

<212> ADN 87 <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 13 ctgtccacat cacagtcc 18 <210> 14 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 14 cagacagtcc ctgataaag 19 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 15 ctcgttgccc ttgcagtcac 20 <210> 16 <211> 19

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 16 gacttccaga ggcactggc <210> 17 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 17 ggctcctgtg gtggggtcg <210> 18 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <440> 18 ggttgccact gtcgatgg

Lisboa, 20 de Fevereiro de 2009

Claims

REIVINDICAÇÕES Forma solúvel de caderina-T para o tratamento de um distúrbio metabólico, em que a referida forma solúvel é seleccionada do grupo consistindo de: a) um polipéptido consistindo dos aminoácidos 23 até 692 da SEQ ID NO: 1; b) um polipéptido consistindo de um fragmento de pelo menos 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ou 650 aminoácidos de (a); c) uma proteína mutada de (a) ou (b) , em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das sequências em (a) ou (b); d) uma proteína mutada de (a) ou (b) a qual é codificada por um ácido nucleico que hibridiza com o complemento de uma sequência de ADN que codifica (a) ou (b) em condições extremamente rigorosas; e e) uma proteína mutada de (a) ou (b) em que quaisquer alterações na sequência de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos das sequências de aminoácidos em (a) ou (b). Utilização da reivindicação 1, em que o referido distúrbio é um distúrbio metabólico seleccionado do grupo consistindo de obesidade, diabetes de tipo II, resistência hiperlipidemia, caquexia. à insulina, hipercolesterolemia dislipidemia, sindrome X, anorexia Lisboa, 20 de Fevereiro de 2009