ES2320139T3 - Uso de t-cadherina soluble para el tratamiento de trastornos metabolicos. - Google Patents
Uso de t-cadherina soluble para el tratamiento de trastornos metabolicos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2320139T3 ES2320139T3 ES04812804T ES04812804T ES2320139T3 ES 2320139 T3 ES2320139 T3 ES 2320139T3 ES 04812804 T ES04812804 T ES 04812804T ES 04812804 T ES04812804 T ES 04812804T ES 2320139 T3 ES2320139 T3 ES 2320139T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cadherin
- baselineskip
- acrp30
- cells
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Abstract
Forma soluble de T-cadherina para el tratamiento de un trastorno metabólico, en la que dicha forma soluble se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 23 a 692 de la SEQ ID NO: 1; b) un polipéptido que consiste en un fragmento de al menos 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ó 650 aminoácidos de (a); c) una muteína de (a) o (b), en la que la secuencia de aminoácidos tiene al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad con al menos una de las secuencias en (a) o (b); d) una muteína de (a) o (b) la cual es codificada por un ácido nucleico que se hibrida con el complemento de una secuencia de DNA que codifica a (a) o (b) en condiciones muy rigurosas; y e) una muteína de (a) o (b) en la que cualquiera de los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos en (a) o (b).
Description
Uso de T-cadherina soluble para
el tratamiento de trastornos metabólicos.
Esta invención se refiere al uso de polipéptidos
de T-cadherina para tratar un trastorno metabólico.
Los trastornos metabólicos que pueden tratarse usando un agente
modulador según la presente invención incluyen, por ejemplo, la
obesidad, la diabetes del tipo II, la resistencia a la insulina, la
hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la dislipidemia, el
síndrome X, la anorexia y la caquexia.
Las cadherinas comprenden una gran familia de
proteínas de la superficie celular involucradas en interacciones
célula-célula y en la transmisión de señales
mediadas por el calcio. Las cadherinas exhiben especificidad
evolucionista y frente al tipo de célula en la expresión y están
anormalmente reguladas en varias enfermedades del ser humano
(véase, por ejemplo, Conacci-Sorrell et al,
2002).
La T-cadherina, también conocida
como H-cadherina o cadherina-13,
está unida a la membrana vía un anclaje GPI en el terminal C
(Tanihara et al, 1994). Comparada con otros miembros de la
familia de las cadherinas, la T-cadherina carece
del dominio transmembrana y se libera de la superficie celular tras
el tratamiento de las células con fosfatidilinositol
fosfolipasa-C. La T-cadherina fue
inicialmente descrita en el sistema nervioso, pero su distribución
en los tejidos está más extendida, con la mayor expresión en el
sistema cardiovascular y las concentraciones más bajas en el
músculo. En el sistema vascular, está localizada en las capas íntima
y media y es expresada en las células del músculo endotelial y liso
(Ivanov et al, 2001).
En la superficie celular se encuentran dos
formas de T-cadherina. Una de ellas, un polipéptido
de 135 kDa, se escinde cerca del terminal N para generar una
segunda forma de 105 kDa (Tkachuk et al, 1998). Ambas formas
de la proteína se encuentran en la superficie celular, en la que son
capaces de enlazarse a partículas de LDL por medio de la asociación
del anclaje GPI con lipoproteínas (Niermann et al, 2000).
Aunque no se conoce ninguna ruta de transmisión
de señales que implique a la T-cadherina, se ha
sugerido que la T-cadherina puede participar en la
transmisión de señales por medio de su asociación con otras
proteínas de la membrana y su incorporación en dominios lipídicos
específicos de la membrana celular (Doyle et al, 1998). Se
ha mostrado que la T-cadherina puede regular el
crecimiento de células en el sistema nervioso (Takeuchi et
al, 2000). Además, la T-cadherina suprime el
crecimiento de astrocitos y es reducida en una línea de células de
glioblastoma (Huang et al, 2003). También se ha sugerido que
la T-cadherina puede estar implicada en el control
de la arquitectura vascular normal y en su remodelación durante la
aterogénesis (Ivanov et al, 2001).
El documento US 6358920 describe un enorme
número de péptidos cortos derivados de más de 20 cadherinas
diferentes. Sólo se refiere vagamente al tratamiento de los
trastornos metabólicos, de la diabetes y de la obesidad modulando
agentes que comprenden un octapéptido que representa una secuencia
de aminoácidos de reconocimiento de la adhesión celular.
El documento WO99/19477 enseña que los péptidos,
que son escindidos de las Pro-cadherinas aunque son
procesados por las correspondientes cadherinas, representan las
denominadas "regiones del factor de crecimiento derivado de las
cadherinas" (CGFRs) y que las actividades de estas CGFRs pueden
explotarse terapéuticamente. En este contexto, describe la CGFR de
T-cadherina para el tratamiento de un trastorno
metabólico. Esta CGFR consiste en los aminoácidos
23-138 de la SEQ ID NO: 1.
El documento WO2004/096272 describe formas
solubles de T-cadherina, en el que dichas formas
solubles son polipéptidos que consisten en fragmentos de hasta 118
aminoácidos de un polipéptido que consiste en los aminoácidos 23 a
692 de la SEQ ID NO: 1. También describe usos médicos para los
trastornos metabólicos de estas formas solubles.
La obesidad es la acumulación de grasa corporal
excesiva. La gravedad de la obesidad se determina midiendo la
altura y el peso. Con frecuencia, estas medidas se convierten en el
índice de masa corporal (IMC): el peso en kilogramos dividido entre
la altura en metros elevada al cuadrado. Un valor de 25 a 29,9
indica sobrepeso u obesidad suave, y un valor de 30 ó mayor indica
obesidad y la necesidad de tratamiento. En los Estados Unidos, el
sobrepeso y la obesidad afectan ahora a más del 50% de los adultos,
reflejando un aumento rápido en su extensión.
La obesidad se produce consumiendo más calorías
que las que usa el cuerpo. En el peso corporal influyen factores
genéticos y medioambientales, pero precisamente todavía no está
claro cómo interaccionan para determinar el peso de una persona.
Una investigación reciente sugiere que, en promedio, la influencia
genética contribuye en aproximadamente un 33 por ciento al peso
corporal. Un incremento del tamaño o del número de células grasas o
de ambos aumenta la cantidad de grasa almacenada en el cuerpo. Las
personas obesas, particularmente las que llegan a ser obesas
durante la infancia, pueden tener hasta cinco veces más de células
grasas que las personas de peso normal. Debido a que no puede
reducirse el número de células, sólo puede perderse peso reduciendo
la cantidad de grasa en cada
célula.
célula.
La acumulación de grasa en exceso debajo del
diafragma y en la pared del pecho puede ejercer presión sobre los
pulmones, provocando dificultad en respirar y brevedad de la
respiración, incluso con un mínimo esfuerzo. La dificultad en
respirar puede interferir seriamente con el sueño, provocando el
cese momentáneo de la respiración (apnea del sueño), lo que conduce
a somnolencia durante el día y otras complicaciones. La obesidad
también puede provocar problemas ortopédicos, trastornos de la piel
e hinchamiento de pies y tobillos. Las complicaciones graves de la
obesidad incluyen un riesgo mucho mayor de trastorno de la arteria
coronaria y de sus factores principales de riesgo diabetes tipo II,
hiperlipidemia e hipertensión. Gran parte de la morbilidad asociada
con la obesidad está asociada con la diabetes del tipo II, ya que la
diabetes y la obesidad malamente controladas conducen a una
constelación de síntomas que son conjuntamente conocidos como
síndrome X, o síndrome metabólico (véase, por ejemplo, Roth et
al, 2002).
La mayoría de los programas de gestión del peso
están basados en una modificación del comportamiento. Hacer dieta
se considera usualmente menos importante que realizar cambios
permanentes en los hábitos alimentarios y de ejercicio. Los médicos
están crecientemente prescribiendo fármacos tales como orlistat o
sibutramina para reducir el peso corporal. Tal fármaco puede
reducir el peso en aproximadamente 10 por ciento antes de 6 meses y
mantiene la pérdida en tanto y cuanto se continúe con el fármaco.
Sin embargo, cuando se cesa, el peso se recupera rápidamente, y los
efectos a largo plazo de los tratamientos actuales de la obesidad
son decepcionantes. Aunque se ha hecho un considerable progreso
para ayudar a las personas a perder peso, usualmente lo recuperan
antes de 3 años. Las muchas complicaciones serias de la obesidad
hacen importante el tratamiento, y el tratamiento quirúrgico está
llegando a ser más y más común en el caso de obesidad grave.
La diabetes es un trastorno en el que las
concentraciones de glucosa en sangre son anormalmente altas porque
el cuerpo no libera o usa insulina adecuadamente. La diabetes se
produce cuando el cuerpo no produce suficiente insulina para
mantener normales las concentraciones de azúcar en sangre o cuando
las células no responden apropiadamente a la insulina.
Las personas con diabetes del tipo I (diabetes
dependiente de la insulina) producen poca o ninguna insulina en
absoluto. Aunque aproximadamente el 6 por ciento de la población de
los Estados Unidos tiene alguna forma de diabetes, sólo
aproximadamente el 10 por ciento de todos los diabéticos tienen el
trastorno del tipo I. La mayoría de las personas que tienen
diabetes tipo I desarrollan el trastorno antes de los 30 años de
edad. En la diabetes del tipo I más del 90 por ciento de las
células que producen insulina (células beta) del páncreas están
permanentemente destruidas. La deficiencia resultante de insulina es
grave, y para sobrevivir, una persona con diabetes del tipo I tiene
que inyectarse regularmente insulina.
En la diabetes del tipo II (diabetes no
dependiente de la insulina), el páncreas continúa fabricando
insulina, algunas veces incluso en concentraciones mayores que las
normales. Sin embargo, el cuerpo desarrolla resistencia a sus
efectos, dando lugar a una deficiencia relativa de insulina. La
diabetes del tipo II puede ocurrir en niños y adolescentes pero
usualmente comienza después de los 30 años de edad y llega a ser
progresivamente más común con la edad: aproximadamente el 15 por
ciento de las personas con una edad superior a 70 años tienen la
diabetes del tipo II. La obesidad es un factor de riesgo para la
diabetes del tipo II, y de 80 a 90 por ciento de las personas con
este trastorno son obesas.
Otras causas menos comunes de la diabetes son
concentraciones anormalmente altas de corticosteroides, embarazo
(diabetes gestacional), fármacos, y venenos que interfieren con la
producción o los efectos de la insulina, dando lugar a altas
concentraciones de azúcar en la sangre.
Las personas con la diabetes del tipo II puede
que no tengan ningún síntoma durante años o décadas. Cuando la
deficiencia de insulina progresa pueden desarrollarse síntomas. Las
ganas de orinar y la sed crecientes son suaves al principio y
empeoran gradualmente durante semanas o meses. Si la concentración
de azúcar en la sangre llega a ser muy alta (superando con
frecuencia 1.000 mg/dL), la persona puede desarrollar una
deshidratación grave, la cual puede conducir a confusión mental,
somnolencia, ataques y coma
hiperglucémico-hiperosmolar no cetósico.
Con el tiempo, las concentraciones elevadas de
azúcar en la sangre dañan los vasos sanguíneos, los nervios y otras
estructuras internas. Las sustancias complejas basadas en azúcares
se acumulan en las paredes de los vasos sanguíneos provocando que
engrosen y tengan pérdidas. Cuando engrosan, suministran menos y
menos sangre, especialmente a la piel y los nervios. Las
concentraciones de azúcar en la sangre malamente controladas también
tienden a provocar que aumenten las concentraciones en la sangre de
las sustancias grasas, dando lugar a aterosclerosis acelerada (la
acumulación de placa en los vasos sanguíneos). La aterosclerosis es
entre dos y seis veces más común en los diabéticos que en los no
diabéticos y se produce tanto en hombres como en mujeres. La mala
circulación a través tanto de los vasos sanguíneos grandes como
pequeños daña el corazón, el cerebro, las piernas, los ojos, los
riñones, los nervios y la piel y hace que la cicatrización de las
lesiones sea lenta.
Por todas estas razones, las personas con
diabetes pueden experimentar muchas complicaciones graves a largo
plazo. Los ataques al corazón y las apoplejías son más comunes. El
daño a los vasos sanguíneos del ojo puede provocar pérdida de
visión (retinopatía diabética). Los riñones pueden funcionar mal,
dando lugar al fallo renal que requiere diálisis. El daño de los
nervios puede manifestarse de varias maneras. Si un sólo nervio
funciona mal (mononeuropatía), un brazo o una pierna puede
debilitarse de repente. Si los nervios de las manos, piernas y pies
llegar a ser dañados (polineuropatía diabética), la sensación puede
llegar a ser anormal y puede desarrollarse una sensación de
hormigueo o dolor ardiente en los brazos y en las piernas. El daño a
los nervios de la piel provoca lesiones repetidas más probablemente
debido a que la persona no puede sentir los cambios de la presión o
de la temperatura. El mal suministro de sangre a la piel también
puede conducir a úlceras, y todas las heridas cicatrizan
lentamente. Las úlceras de los pies pueden llegar a ser por tanto
profundas e infectarse y cicatrizar tan malamente que puede ser
necesario amputar parte de la pierna.
El fin principal del tratamiento de la diabetes
es mantener las concentraciones de azúcar en la sangre dentro del
intervalo normal tanto como sea posible. Las concentraciones
completamente normales son difíciles de mantener, pero cuanto más
próximamente puedan mantenerse dentro del intervalo normal, menos
probablemente se desarrollarán complicaciones temporales o a largo
plazo. El principal problema con tratar de controlar estrechamente
las concentraciones de azúcar en la sangre es un riesgo acrecentado
de excederse, dando lugar a bajas concentraciones de azúcar en la
sangre (hipoglucemia).
El tratamiento de la diabetes requiere atención
para controlar el peso, hacer ejercicio y llevar una dieta. Muchas
personas obesas con diabetes del tipo II no necesitarían medicación
si perdieran peso y realizaran ejercicio regularmente. Sin embargo,
como se discutió anteriormente, la reducción de peso es difícil. Por
lo tanto, con frecuencia es necesaria una terapia de
reemplazamiento de la insulina o una medicación hipoglucémica
oral.
Los fármacos hipoglucémicos orales tales como
glipizida, gliburida, tolbutamida, y clorpropamida pueden disminuir
las concentraciones de azúcar en la sangre adecuadamente en personas
con diabetes del tipo II estimulando al páncreas a liberar insulina
y aumentando su efectividad. Otro tipo de fármaco oral, la
metformina, aumenta la respuesta del cuerpo a su propia insulina.
Aún otro fármaco, la acarbosa, funciona retrasando la absorción de
glucosa en el intestino. Si estos fármacos hipoglucémicos orales no
pueden controlar el azúcar en la sangre bastante bien, se necesita
una terapia de reemplazamiento de la insulina.
Una terapia de reemplazamiento de la insulina
puede conseguirse sólo mediante inyecciones diarias, siendo así un
tratamiento pesado. Se están ensayando nuevas formas de insulina,
tales como una pulverización nasal. Hasta la fecha, estas nuevas
formas no han funcionado bien debido a que la variabilidad en la
tasa de absorción conduce a problemas para la determinación de la
dosis.
El tejido adiposo, aunque largamente conocido
por su capacidad para almacenar grasa, tiene un papel importante
como fuente de varias hormonas y agentes mediadores paracrinos, que
incluyen la resistina, la adipsina, la leptina, y el
TNF-\alpha. Colectivamente, estas moléculas se
denominan adipoquinas, para enfatizar su papel como hormonas y
sitio de síntesis. La Acrp30, también denominada adiponectina o
ApM-1, es una de tales adipoquinas y es
exclusivamente producida por el tejido adiposo.
La Acrp30 de ratón se identificó en primer lugar
en 1995 (Scherer et al, 1995), y se mostró que era regulada
por encima de 100 veces durante la diferenciación de los adipocitos.
El homólogo en ser humano se identificó en 1996 (Maeda et
al, 1996). La Acrp30 contiene una secuencia señal amino
terminal, seguida por una región central que comprende repeticiones
de colágeno, y un dominio carboxi-terminal con
homología con el factor globular C1q del complemento. Cuando se usa
en la presente memoria, el término "Acrp30" se refiere tanto a
proteínas de ser humano como murina, y a sus homólogos en cualquier
otra especie.
Varios estudios han demostrado que Acrp30 está
unida a la obesidad y a la diabetes del tipo II. Los datos
genéticos han demostrado el encadenamiento de la diabetes del tipo
II con polimorfismos no codificantes de un único nucleótido (SNPs)
localizados dentro del gen de Acrp30 en una cohorte japonesa de
pacientes (Hara et al., 2002). Además, se demostró que las
mutaciones de sentido erróneo que afectan a la cabeza globular
están correlacionadas con la concentración de Acrp30 en el suero
(Kondo et al, 2002).
Además, la concentración en el suero de Acrp30
disminuye en varios modelos de obesidad, que incluyen ratones
deficientes en leptina, ratones deficientes en el receptor de la
leptina, y modelos de monos (véase, por ejemplo, Hu et al.,
1996; Yamauchi et al, 2001). En estudios en seres humanos, la
concentración de Acrp30 está inversamente correlacionada tanto con
la diabetes como con la obesidad, y además se reduce en pacientes
con trastorno de la arteria coronaria (Arita et al, 1999).
Más evidencia de una relación causal entre las concentraciones
reducidas de Acrp30 y el desarrollo de resistencia a la insulina y
de diabetes del tipo II fue obtenida por Lindsay et al.
(2002), quienes demostraron que los individuos de la población India
de Pima que tenían menores concentraciones de Acrp30 en el suero
tenían mayor probabilidad de desarrollar la diabetes del tipo II que
aquellos con mayores
concentraciones.
concentraciones.
Los experimentos de disrupción de genes dieron
una evidencia que soportaba la implicación de Acrp30 en la obesidad
y en la diabetes del tipo II. Maeda et al. (2002) encontraron
que los ratones homocigotos deficientes en Acrp30 no fueron
hiperglucémicos cuando se mantuvieron con una dieta normal, pero que
exhibieron un aclaramiento reducido de ácidos grasos libres en el
suero. Cuando se cambiaron a una dieta rica en grasas y en sacarosa,
exhibieron una grave resistencia a la insulina y demostraron una
ganancia de peso acrecentada con relación a animales
testigo.
testigo.
Además de su papel pivotal en la obesidad y en
la diabetes, se ha mostrado que Acrp30 juega un papel en otros
trastornos tales como, por ejemplo, el síndrome de los ovarios
poliquísticos (Panidis et al, 2003), el cáncer endometrial
(Petridou et al, 2003), la preeclampsia (Ramsay et al,
2003), el hígado graso (Xu et al, 2003) y síndrome nefrótico
(Zoccali et al, 2003). También se ha mostrado que Acrp30
exhibe propiedades anti-inflamatorias (Yolcota
et al, 2000).
A la vista de los estudios anteriores, la Acrp30
exógena es un factor terapéutico prometedor para tratar varios
trastornos que incluyen trastornos metabólicos tales como la
obesidad y la diabetes del tipo II, trastornos ginecológicos,
trastornos del hígado y trastornos inflamatorios crónicos.
La Acrp30 está presente en el suero en alta
concentración (5-10 \mug/mL) y existe como
múltiples asociaciones de diferentes pesos moleculares aparentes
(Scherer et al, 1995).
La estructura de estas especies de diferente
peso molecular aparente fue investigada por Tsao et al.
(2002, 2003). Cuando se expresó en bacterias como una proteína de
fusión de longitud completa y se separó por cromatografía de
exclusión molecular, se identificaron tres especies de Acrp30:
hexámeros y dos especies de trímeros. Los estudios de expresión en
células eucariotas generaron tres especies de Acrp30: una especie de
alto peso molecular (HMW), que no se ve en la proteína producida en
bacterias, y especies que corresponden a hexámeros y a una especie
de trímeros.
Varios estudios se han centrado en polipéptidos
que comprenden la cabeza globular de Acrp30, de aquí en adelante
denominada gAcrp30. Hay diferencias entre las actividades in
vivo de Acrp30 y gAcrp30, aunque los dos polipéptidos comparten
varias similitudes. Tras un tratamiento a largo plazo con proteína
recombinante, hay una mayor reducción en el peso con la inyección
de gAcrp30 en comparación con Acrp30, a pesar de una falta de
diferencia en la ingesta de comida (Fruebis et al, 2001).
Por otra parte, Acrp30 redujo la producción de glucosa
sinérgicamente con la insulina, mientras que gAcrp30 no tuvo
ninguna actividad en este ensayo (Berg et al, 2001).
Para determinar la actividad potencial de estas
especies diferentes, se ensayaron varios elementos de respuestas
transcripcionales que impulsan la expresión de un gen reportero de
luciferasa en miocitos C2C12, células que se sabe responden a
Acrp30 (Tsao et al, 2003). El promotor de la
E-selectiva que responde al factor de transcripción
NF-\kappaB demostró una actividad acrecentada en
respuesta a la adición de Acrp30. Sólo las especies de hexámero
fraccionado y de HMW fueron activas, mientras que tanto gAcrp30 como
el trímero fueron inactivos en este ensayo. IL-6,
cuya expresión es acrecentada por NF-\kappaB en
miotubos C2C12, es producida en altas concentraciones por el
músculo esqueletal durante el ejercicio, y se piensa que activa la
producción acrecentada de ácidos grasos y de glucosa en el tejido
adiposo y en el hígado, proporcionando así un aumento del
combustible circulante para el uso por el músculo (Febbraio et
al, 2002; Kosmidou et al, 2002). Por tanto, las especies
de hexámeros y de HMW de Acrp30 pueden estimular indirectamente la
lipólisis del tejido graso por medio de la liberación de
IL-6 inducida por el factor de transcripción
NF-\kappaB en el músculo esqueletal (Tsao et
al, 2003).
Estando Acrp30 implicada en la obesidad y en la
diabetes del tipo II, la modulación de proteínas de la ruta de
transmisión de señales de Acrp30 es una opción para el tratamiento
de trastornos metabólicos tales como la obesidad, la diabetes del
tipo II, la resistencia a la insulina, la hipercolesterolemia, la
hiperlipidemia, la dislipidemia, el síndrome X, la anorexia y la
caquexia. Sin embargo, el aislamiento de los receptores de Acrp30
se ha mostrado esquivo. Se ha descrito in vitro el enlace de
Acrp30 a colágenos y a células endoteliales aórticas de ser humano
(HAECs) (Okamoto et al, 2000). Recientemente, se han descrito
dos receptores de Acrp30 globular y de longitud completa,
denominados AdipoR1 y AdipoR2, de función desconocida (Yamauchi
et al, 2003). Se predice que estos dos receptores de Acrp30
contienen siete dominios transmembrana, pero que son estructural y
funcionalmente distintos de los receptores acoplados a proteínas G.
Sin embargo, los receptores de las especies de hexámeros y de HMW
de Acrp30 no han sido descritos en la bibliografía científica.
La presente invención es consecuencia del
hallazgo de un nuevo receptor de Acrp30. Específicamente, se ha
mostrado en el marco de la presente invención que la
T-cadherina es un receptor de las especies de
hexámeros y de alto peso molecular (HMW) de Acrp30.
Por lo tanto, un primer aspecto de la memoria
descriptiva se refiere al uso de un polipéptido de
T-cadherina como una diana para seleccionar agentes
moduladores candidatos para fármacos candidatos para el tratamiento
de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno
metabólico, un trastorno ginecológico, un trastorno inflamatorio
crónico y un trastorno hepático o renal, en el que dicho fármaco
candidato es un agente modulador de la
T-cadherina.
Un segundo aspecto se refiere al uso de un
agente modulador de un polipéptido de T-cadherina
para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un
trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno
metabólico, un trastorno ginecológico, un trastorno inflamatorio
crónico y un trastorno hepático o renal.
Un tercer aspecto se refiere al uso de un
polipéptido de T-cadherina como diana para la
selección de socios de enlace naturales, en el que dicho socio de
enlace natural es un fármaco candidato para el tratamiento de un
trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno
metabólico, un trastorno ginecológico, un trastorno inflamatorio
crónico y un trastorno hepático o renal.
Un cuarto aspecto se refiere al uso como
medicamento de una forma soluble de T-cadherina.
Un quinto aspecto, el cual representa la
presente invención, se refiere al uso de una forma soluble de
T-cadherina para la preparación de un trastorno
metabólico.
Un sexto aspecto se refiere a un método para
evaluar la eficiencia de un agente modulador de un polipéptido de
T-cadherina para el tratamiento de la obesidad,
comprendiendo dicho método administrar dicho agente modulador a un
modelo animal para la obesidad, en el que una determinación de que
dicho agente modulador mejora una característica representativa de
la obesidad en dicho modelo animal indica que dicho agente modulador
es un fármaco para el tratamiento de la obesidad.
Un séptimo aspecto se refiere a un método para
evaluar la eficiencia de un agente modulador de un polipéptido de
T-cadherina para el tratamiento de la diabetes del
tipo II, comprendiendo dicho método administrar dicho agente
modulador a un modelo animal para la diabetes del tipo II, en el que
una determinación de que dicho agente modulador mejora una
característica representativa de la diabetes del tipo II en dicho
modelo animal indica que dicho agente modulador es un fármaco para
el tratamiento de la diabetes del tipo II.
La figura 1 muestra el resultado de los ensayos
de enlace clasificadores de células activados por fluorescencia de
células C2C12, CHO y Ba/F3, como se explica en el ejemplo 2.
La figura 2 muestra el resultado del ensayo de
enlace clasificador de células activado por fluorescencia de
células testigo Ba/F3 y de células Ba/F3 que expresan
T-cadherina, como se explica en el ejemplo 4.2.
La figura 3A muestra el análisis ELISA de enlace
de diferentes especies de Acrp30 a células CHO-GFP,
como se explica en el ejemplo 4.3.
La figura 3B muestra el análisis ELISA de enlace
de diferentes especies de Acrp30 a células CHO que expresan
T-cadherina, como se explica en el ejemplo 4.3.
La figura 4 muestra la activación de
NF-\kappaB en células C2C12, como se explica en el
ejemplo 5.
SEQ ID NO: 1 corresponde al precursor de
longitud completa de T-cadherina de ser humano.
SEQ ID NO: 2 corresponde al precursor de
longitud completa de Acrp30 de ser humano.
SEQ ID NO: 3 corresponde al precursor de
longitud completa de Acrp30 murina.
SEQ ID NO: 4 corresponde al precursor de
longitud completa de T-cadherina murina.
SEQ ID NOs: 5-18 corresponden a
las secuencias cebadoras.
La presente invención es consecuencia del
hallazgo de un nuevo receptor de Acrp30. Específicamente, se ha
mostrado en el marco de la presente invención que la
T-cadherina es un receptor de las especies de
hexámeros y de alto peso molecular (HMW) de Acrp30. Se proporcionan
datos adicionales que muestran que la sobreexpresión de
T-cadherina suprime la transcripción mediada por
NF-\kappaB inducida por Acrp30. Por consiguiente,
la presente memoria descriptiva proporciona medios para identificar
compuestos útiles en el tratamiento de trastornos metabólicos tales
como, por ejemplo, la obesidad, la diabetes del tipo II, la
resistencia a la insulina, la hipercolesterolemia, la
hiperlipidemia, la dislipidemia, el síndrome X, la anorexia y la
caquexia. Específicamente, la memoria descriptiva se refiere al uso
de polipéptidos de T-cadherina como dianas para la
selección de sus agentes moduladores. El uso de dichos agentes
moduladores para tratar trastornos metabólicos es otro aspecto de
la presente memoria descriptiva.
Un primer aspecto de la presente memoria
descriptiva se dirige al uso de un polipéptido de
T-cadherina como una diana para seleccionar agentes
moduladores candidatos para fármacos candidatos para el tratamiento
de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno
metabólico, un trastorno ginecológico, un trastorno inflamatorio
crónico y un trastorno hepático o renal, en el que dicho fármaco
candidato es un agente modulador de la
T-cadherina.
Cuando se usa a lo largo de la presente memoria
descriptiva, la expresión "polipéptido de
T-cadherina" se refiere tanto a proteínas de
T-cadherina de longitud completa como a sus
fragmentos biológicamente activos. Los polipéptidos de
T-cadherina pueden ser de origen humano o animal.
Preferiblemente, los polipéptidos de T-cadherina
son de origen humano.
Mucho más preferiblemente, los polipéptidos de
T-cadherina de origen humano se seleccionan del
grupo que consiste en:
- a)
- un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 1;
- b)
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 713 de la SEQ ID NO: 1;
- c)
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 23 a 693 de la SEQ ID NO: 1;
- d)
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 140 a 713 de la SEQ ID NO: 1;
- e)
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 140 a 693 de la SEQ ID NO: 1;
- f)
- una muteína de cualquiera de (a) a (e), en la que la secuencia de aminoácidos tiene al menos una identidad de 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con al menos una de las secuencias en (a) a (e);
- g)
- una muteína de cualquiera de (a) a (e) la cual es codificada por un ácido nucleico que se hibrida con el complemento de una secuencia de DNA que codifica a cualquiera de (a) a (e) en condiciones muy rigurosas; y
- h)
- una muteína de cualquiera de (a) a (e) en la que cualquiera de los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos en (a) a (e).
La expresión "polipéptido de
T-cadherina" abarca polipéptidos naturales,
recombinantes, quimera, sintéticos y químicamente sintetizados. La
expresión "polipéptido de T-cadherina" abarca
además fragmentos de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350,
400, 450, 500, 550, 600 ó 650 aminoácidos de
T-cadherina. La expresión "polipéptido de
T-cadherina" abarca además muteínas de
T-cadherina. Cuando se usa en la presente memoria,
el término "muteínas" se refiere un compuestos análogos de
T-cadherina, en los cuales uno o más de los residuos
aminoácidos de una T-cadherina natural son
reemplazados por residuos aminoácidos diferentes, o se eliminan, o
se añaden uno o más residuos aminoácidos a la secuencia natural de
T-cadherina, sin disminuir considerablemente la
actividad de los productos resultantes en comparación con la
T-cadherina del tipo silvestre. Estas muteínas se
preparan por técnicas de síntesis y/o de mutagénesis dirigidas al
sitio conocidas, o, por lo tanto, por cualquier otra técnica
conocida adecuada.
Las muteínas de T-cadherina que
pueden usarse según la presente memoria descriptiva incluyen una
serie finita de secuencias sustancialmente correspondientes como
péptidos o polinucleótidos de sustitución que un experto en la
técnica puede obtener rutinariamente, sin experimentación indebida,
sobre la base de las enseñanzas y la guía presentada en la presente
memoria y conocida en la técnica.
Los polipéptidos de T-cadherina
según la presente memoria descriptiva incluyen proteínas codificadas
por un ácido nucleico, tal como DNA o RNA, las cuales hibridan un
DNA o RNA, el cual codifica T-cadherina, según la
presente invención, en condiciones moderada o altamente rigurosas.
La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a las
condiciones de hibridación y de lavado subsiguiente, a las que los
expertos en la técnica se refieren convencionalmente como
"rigurosas" (véase, por ejemplo, Sambrook et al,
1989).
Sin limitación, ejemplos de condiciones
rigurosas incluyen condiciones de lavado 12-20ºC por
debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio en, por ejemplo,
2 x SSC y SDS al 0,5% durante 5 minutos, 2 x SSC y SDS al 0,1%
durante 15 minutos; 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 37ºC durante
30-60 minutos y a continuación, 0,1 x SSC y SDS al
0,5% a 68ºC durante 30-60 minutos. Los expertos en
esta técnica entenderán que las condiciones rigurosas también
dependen de la longitud de las secuencias de DNA, las sondas de
oligonucleótidos (tales como 10-40 bases) o las
sondas mixtas de oligonucleótidos. Si se usan sondas mixtas, es
preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de
SSC.
Los polipéptidos de T-cadherina
que pueden usarse según la presente memoria descriptiva incluyen
muteínas que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 50%
idéntica, más preferiblemente al menos 60% idéntica, y aún más
preferiblemente 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a
una T-cadherina de la SEQ ID NO: 1 o de la SEC ID
Nº: 2 4 o a uno de sus fragmentos. Mediante un polipéptido que tenga
una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95%
"idéntica" a una secuencia de aminoácidos interrogante de la
presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del
polipéptido objeto sea idéntica a la secuencia interrogante
excepto que la secuencia del polipéptido objeto puede incluir hasta
cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos interrogante. En otras palabras, para
obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al
menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos interrogante,
pueden insertarse, eliminarse o sustituirse con otro aminoácido
hasta el 5% (5 de 100) de los residuos aminoácidos de la secuencia
objeto.
Para las secuencias en las que no hay una
correspondencia exacta puede determinarse un "% de identidad".
En general, las dos secuencias a comparar se alinean para dar una
correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir
insertar "huecos" en una o en ambas secuencias, para aumentar
el grado de alineación. Puede determinarse un % de identidad
respecto a la longitud completa de cada una de las secuencias que se
comparan (denominada alineación global), que es particularmente
adecuado para las secuencias de la misma o muy similar longitud, o
sobre longitudes definidas más cortas (denominada alineación local),
que es más adecuado para secuencias de diferente longitud.
Los cambios preferidos para las muteínas que
pueden usarse según la presente memoria descriptiva son los que son
conocidos como sustituciones "conservadoras". Las
sustituciones conservadoras de aminoácidos de polipéptidos de
T-cadherina pueden incluir aminoácidos sinónimos
dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas
suficientemente similares que la sustitución entre miembros del
grupo preservará la función biológica de la molécula (Grantham,
1974). Esta claro que las inserciones y eliminaciones de aminoácidos
también pueden hacerse en las secuencias anteriormente definidas
sin alterar su función, particularmente si las inserciones o
eliminaciones sólo implican a unos pocos aminoácidos, por ejemplo
por debajo de treinta, y preferiblemente por debajo de diez, y no
eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para una
conformación funcional, por ejemplo los residuos de cisteína. Las
proteínas y muteínas producidas por tales eliminaciones y/o
inserciones entran dentro de la mira de la presente memoria
descriptiva.
Preferiblemente, los grupos de aminoácidos
sinónimos son los definidos en la Tabla I. Más preferiblemente, los
grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla II; y
mucho más preferiblemente los grupos de aminoácidos sinónimos son
los definidos en la Tabla III.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de producción de sustituciones de
aminoácidos en proteínas que pueden usarse para obtener muteínas de
T-cadherina, polipéptidos para usar en la presente
invención incluyen cualquiera de las etapas de los métodos
conocidos, tales como se presentan en las patentes de EE.UU.
4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, de Mark et al; 5.116.943
de Koths et al, 4.965.195 de Namen et al; 4.879.111 de
Chong et al; y 5.017.691 de Lee et al.; y las
proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de EE.UU.
No. 4.904.584 (Shaw et al.).
Preferiblemente, las muteínas de la presente
memoria descriptiva exhiben sustancialmente la misma actividad
biológica que el polipéptido de T-cadherina al que
corresponden. Mucho más preferiblemente, las muteínas de la
presente invención exhiben una actividad biológica acrecentada que
el polipéptido de T-cadherina al que
corresponden.
Cuando se usa en la presente memoria, la
expresión "agente modulador" se refiere a un compuesto
que aumenta o disminuye la actividad de un polipéptido de
T-cadherina. Cuando se usa en la presente memoria,
un "agente modulador de T-cadherina" se
refiere a un compuesto que aumenta o disminuye la actividad de un
polipéptido de T-cadherina y/o a un compuesto que
aumenta o disminuye el nivel de transcripción del mRNA de
T-cadherina. La expresión "agente modulador"
engloba tanto a los agentes agonistas como a los agentes
antagonistas.
Cuando se usa en la presente memoria, un
"agente agonista de T-cadherina" se
refiere a un compuesto que tiene un efecto en la misma dirección
sobre actividad de T-cadherina que Acrp30. Un
compuesto que tiene "un efecto en la misma dirección"
sobre la actividad de T-cadherina que Acrp30 se
refiere a un compuesto que: (i) cuando se ensaya en un ensayo en el
que Acrp30 aumenta la actividad de T-cadherina,
dicho compuesto aumenta la actividad de
T-cadherina; y/o (i) cuando se ensaya en un ensayo
en el que Acrp30 disminuye la actividad de
T-cadherina, dicho compuesto disminuye la actividad
de T-cadherina. Se considera que las expresiones
"agente agonista" y "agente activante" son sinónimas y
pueden usarse intercambiablemente a lo largo de la presente
descrip-
ción.
ción.
Cuando se usa en la presente memoria, un
"agente antagonista de T-cadherina" se
refiere a un compuesto que tiene un efecto opuesto sobre la
actividad de T-cadherina en comparación con Acrp30.
Un compuesto que tiene "un efecto opuesto" sobre la
actividad de T-cadherina que Acrp30 se refiere a un
compuesto que: (i) cuando se ensaya en un ensayo en el que Acrp30
aumenta la actividad de T-cadherina, dicho compuesto
disminuye la actividad de T-cadherina; y/o (i)
cuando se ensaya en un ensayo en el que Acrp30 disminuye la
actividad de T-cadherina, dicho compuesto aumenta
la actividad de T-cadherina. Se considera que las
expresiones "agente antagonista" y "agente inhibidor" son
sinónimas y pueden usarse intercambiablemente a lo largo de la
descripción.
Más adelante se detallan adicionalmente los
métodos para determinar si un agente modulador tiene un efecto en
la misma dirección o un efecto opuesto sobre la actividad de
T-cadherina que Acrp30.
Los métodos que pueden usarse para ensayar la
capacidad de los agentes moduladores para aumentar o disminuir la
actividad de un polipéptido de T-cadherina o para
aumentar o disminuir la expresión de un mRNA de
T-cadherina son bien conocidos en la técnica y se
detallan adicionalmente más adelante. Estos ensayos pueden
realizarse in vitro o in vivo.
Agentes moduladores candidatos según la presente
memoria descriptiva incluyen compuestos naturales y sintéticos.
Tales compuestos incluyen, por ejemplo, ligandos naturales, pequeñas
moléculas, aptámeros, mRNAs antisentido, pequeños RNAs de
interferencia, formas solubles de T-cadherina y
anticuerpos. En la presente memoria descriptiva, tales compuestos
se denominan "compuestos candidatos" o "agentes
moduladores candidatos". Los agentes agonistas candidatos
preferidos incluyen ligandos naturales, pequeñas moléculas y
aptámeros. Los agentes antagonistas candidatos preferidos incluyen
ligandos naturales, pequeñas moléculas, aptámeros, mRNAs
antisentido, pequeños RNAs de interferencia, formas solubles de
T-cadherina y anticuerpos. Los agentes antagonistas
candidatos más preferidos son formas solubles de
T-cadherina.
Cuando se usa en la presente memoria, La
expresión "ligando natural" se refiere a cualquier
molécula de transmisión de señales que se enlaza a una
T-cadherina in vivo e incluye moléculas tales
como, por ejemplo, lípidos, nucleótidos, polinucleótidos,
aminoácidos, péptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos y
moléculas inorgánicas.
Cuando se usa en la presente memoria, la
expresión "pequeña molécula" se refiere a un molécula
orgánica de peso molecular relativamente bajo. Preferiblemente, una
pequeña molécula comprende menos que 200 átomos. Mucho más
preferiblemente, una pequeña molécula comprende entre
aproximadamente 50 átomos y 80 átomos.
Cuando se usa en la presente memoria, La
expresión "anticuerpo" se refiere a una proteína producida por
células del sistema inmune o a uno de sus fragmentos que se enlaza
a un antígeno. Los anticuerpos según la memoria descriptiva pueden
ser policlonales o monoclonales, quimera, humanizados, o incluso
completamente de ser humano. Los anticuerpos recombinantes y sus
fragmentos se caracterizan por una alta afinidad de enlace a
polipéptidos de T-cadherina in vivo y por
una baja toxicidad. Los anticuerpos que pueden usarse en la memoria
descriptiva se caracterizan por su capacidad para tratar pacientes
durante un período suficiente para tener una regresión o alivio de
buena a excelente de la enfermedad patógena, o de cualquier síntoma
o grupo de síntomas relacionados con una enfermedad patógena, y por
una baja toxicidad. Los anticuerpos neutralizantes se cultivan
fácilmente en animales tales como conejos, cabras o ratones por
inmunización con polipéptidos de T-cadherina. Los
ratones inmunizados son particularmente útiles para proporcionar
fuentes de células B para la fabricación de hibridomas, los cuales
a su vez se cultivan para producir grandes cantidades de anticuerpos
monoclonales anti-T-cadherina. Los
anticuerpos quimera son moléculas de inmunoglobulinas caracterizadas
por dos o más segmentos o porciones derivadas de especies animales
diferentes. Generalmente, la región variable del anticuerpo quimera
se obtiene a partir de un anticuerpo de mamífero no humano, tal
como un anticuerpo monoclonal murina y la región constante de la
inmunoglobulina se obtiene a partir de una molécula de
inmunoglobulina humana. Preferiblemente, ambas regiones y la
combinación tienen una inmunogenicidad baja que se determina
rutinariamente (Elliott et al, 1994). Los anticuerpos
humanizados son moléculas de inmunoglobulinas creadas por técnicas
de ingeniería genética en las que las regiones constantes murina
son reemplazadas por contrapartidas de ser humano mientras que
retienen las regiones murina de enlace a los antígenos. El
anticuerpo quimera resultante de ratón-humano tiene
preferiblemente una inmunogenicidad reducida y una farmacocinética
mejorada en seres humanos (Knight et al 1993). El anticuerpo
puede ser completamente de ser humano. La tecnología para producir
anticuerpos de ser humano se describe en detalle por ejemplo en los
documentos WO 00/76310, WO 99/53049, US 6.162.963 y AU 5.336.100. Un
método para la preparación de anticuerpos completamente de ser
humano consiste en la "humanización" del sistema inmune
humoral del ratón, es decir en la producción de cepas de ratón
capaces de producir Ig de ser humano (Xenorratones), mediante la
introducción de lugares de inmunoglobulina (Ig) de ser humano en
ratones en los cuales se han inactivado los genes Ig endógenos. Los
lugares de Ig son complejos en términos tanto de su estructura
física como de los procesos de expresión y reordenamiento de genes
requeridos para producir finalmente una amplia respuesta inmune. La
diversidad de anticuerpos es principalmente generada por un
reordenamiento combinatorial entre genes V, D, y J diferentes
presentes en los lugares de Ig. Estos lugares también contienen los
elementos reguladores interespaciados, los cuales controlan la
expresión de los anticuerpos, la exclusión alélica, el cambio de
clases y la maduración de afinidad. La introducción de transgenes de
Ig de ser humano no reordenados en ratones ha demostrado que la
maquinaria de recombinación en ratones es compatible con genes de
ser humano. Además, pueden obtenerse hibridomas que secretan
hu-mAbs de antígenos específicos de varios isotipos
por inmunización de Xenorratones con un antígeno. Los anticuerpos
completamente de ser humano y los métodos para su producción son
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO
98/24893).
Cuando se usa en la presente memoria, la
expresión "mRNA antisentido" se refiere a una molécula
de RNA complementaria a la hebra normalmente procesada en mRNA y
trasladada, o a una molécula de RNA complementaria de una de sus
regiones.
Cuando se usa en la presente memoria, el término
"aptámero" se refiere a un ligando artificial de un ácido
nucleico (véase, por ejemplo, Ellington y Szostak, 1990).
Cuando se usa en la presente memoria, la
expresión "pequeño RNA de interferencia" se refiere a un
RNA de doble hebra que induce un gen silencioso
post-transcripcional específico de la secuencia
(véase, por ejemplo, Elbashir et al 2001).
Cuando se usa en la presente memoria, La
expresión "forma soluble de T-cadherina"
se refiere a un polipéptido de T-cadherina que no
está unido a la membrana. Los polipéptidos de
T-cadherina que no están unidos a la membrana
pueden ser generados fácilmente por los expertos en la técnica
mutando el sitio de anclaje de GPI de un polipéptido de
T-cadherina. Por ejemplo, la glicina en la posición
693 de la SEQ ID NO: 1 puede cambiarse por otro aminoácido.
Alternativamente, la forma soluble puede ser un fragmento de
T-cadherina que carece del sitio de anclaje de GPI.
La forma soluble de T-cadherina según la
presente invención se selecciona del grupo que consiste en:
- a)
- un polipéptido que consiste en los aminoácidos 23 a 692 de la SEQ ID NO: 1;
- b)
- un polipéptido que consiste en un fragmento de al menos 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550,600 ó 650 aminoácidos de (a);
- c)
- una muteína de cualquiera de (a) o (b), en la que la secuencia de aminoácidos tiene al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad con al menos una de las secuencias en (a) o (b);
- d)
- una muteína de cualquiera de (a) o (b) la cual es codificada por un ácido nucleico que se hibrida al complemento de una secuencia de DNA que codifica a cualquiera de (a) o (b) en condiciones muy rigurosas; y
- e)
- una muteína de cualquiera de (a) o (b) en la que cualquiera de los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos en (a) o (b).
Preferiblemente, dicha forma soluble de
T-cadherina en enlaza a Acrp30. Preferiblemente,
dicha forma soluble de T-cadherina se enlaza a
especies de hexámeros y/o de HMW de Acrp30.
Cuando se usa en la presente memoria, la
expresión "especie de HMW de Acrp30" se refiere a un
complejo de polipéptidos de Acrp30 que comprende más de seis
polipéptidos de Acrp30. La masa molecular aparente de especies
murina de HMW de Acrp30 es de aproximadamente 630 kDa. Cuando se usa
en la presente memoria, la expresión "especie de hexámeros de
Acrp30" se refiere a un complejo de seis polipéptidos de
Acrp30. La masa molecular aparente de la especie de hexámeros
murina es de aproximadamente 410 kDa. Tales complejos de multímeros
o de hexámeros pueden purificarse y/o separase por, por ejemplo,
exclusión molecular como es descrito por Tsao et al.
(2002).
Las formas solubles de
T-cadherina según la presente memoria descriptiva
incluyen además un polipéptido quimera de
T-cadherina que comprende
T-cadherina o uno de sus fragmentos fusionado con un
polipéptido heterólogo.
Según la presente memoria descriptiva, dicha
forma soluble de T-cadherina comprende
T-cadherina o uno de sus fragmentos fusionados con
todos o una porción de una inmunoglobulina. Los métodos para
fabricar proteínas de fusión con inmunoglobulinas son bien
conocidos en la técnica, tales como los descritos en el documento
WO 01/03737, por ejemplo. El experto en la técnica comprenderá que
la proteína de fusión resultante de la invención retiene la
actividad biológica de T-cadherina, en particular el
enlace a especies de hexámeros y/o de HMW de Acrp30. La fusión
puede ser directa o a través de un péptido corto que actúa como
agente de enlace, que puede tener una longitud tan corta como 1 a 3
residuos de aminoácidos o más larga, por ejemplo, 13 residuos de
aminoácidos de longitud. Dicho agente de enlace puede ser un
tripéptido de la secuencia E-F-M
(Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una
secuencia enlazante de 13 aminoácidos que comprende
Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met
introducida entre la secuencia de T-cadherina y la
secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante
tiene unas propiedades mejoradas, tales como un tiempo de residencia
más largo en los fluidos corporales (semi-vida),
una actividad específica incrementada, un nivel de expresión
acrecentado o se facilita la purificación de la proteína de fusión.
Preferiblemente, la T-cadherina o uno de sus
fragmentos se fusionan a la región constante de una molécula de Ig.
Preferiblemente, se fusiona a regiones de cadena pesada, como los
dominios CH2 y CH3 de IgG1 de ser humano, por ejemplo. Otras
isoformas de moléculas de Ig también son adecuadas para la
generación de proteínas de fusión según la presente memoria
descriptiva, tales como isoformas de IgG2 o IgG4, u otras clases de
Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser
monómeras o multímeras, hetero u homomultímeras.
La forma soluble de T-cadherina
puede ser una molécula quimera que une una región soluble de
T-cadherina y toda o una porción de Acrp30. Tales
moléculas quimera se han descrito para IL-6 y su
receptor IL-6R (Chebath et al, 1997,
documento WO 99/02552 y documento WO 97/32891). La quimera
IL-6R/IL-6 se enlaza con una mayor
eficiencia a su receptor celular in vitro que la mezcla de
IL-6 con un IL-6R soluble (Kollet
et al, 1999). La T-cadherina puede, por
ejemplo, fundirse con una Acrp30 de longitud completa.
Alternativamente, la T-cadherina puede fundirse con
la región central de Acrp30 que comprende unidades repetidas de
colágeno. Se espera que tales quimeras formen moléculas quimera
solubles de hexámeros y de HMW.
Los fármacos candidatos pueden obtenerse usando
cualquiera de los numerosos enfoques en métodos combinatoriales de
bibliotecas conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo,
métodos de bibliotecas biológicas, de bibliotecas espacialmente
direccionables en paralelo en fase sólida o en disolución, y de
bibliotecas sintéticas usando selección por cromatografía de
afinidad. En general, el enfoque de biblioteca biológica se usa con
bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son
aplicables a bibliotecas de compuestos tipo péptidos, oligómeros no
péptidos, aptámeros o pequeñas moléculas.
Un ejemplo de un método que puede usarse para la
selección de compuestos candidatos para un agente modulador es un
método que comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto un polipéptido de T-cadherina con el compuesto candidato; y
- b)
- ensayar la actividad de dicho polipéptido de T-cadherina en presencia de dicho compuesto candidato;
en el que una diferencia o cambio
en la actividad de dicho polipéptido de T-cadherina
en presencia de dicho compuesto indica que el compuesto es un
agente modulador de dicho polipéptido de
T-cadherina. Preferiblemente, tal método comprende
adicionalmente la etapa de comparar la actividad de dicho
polipéptido de T-cadherina en presencia de dicho
compuesto con la actividad de dicho polipéptido de
T-cadherina en ausencia de dicho compuesto. También
preferiblemente, tal método también comprende la etapa de ensayar la
actividad de dicho polipéptido de T-cadherina en
ausencia de dicho compuesto
candidato.
Alternativamente, el ensayo puede ser un ensayo
basado en células que comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de T-cadherina con el compuesto candidato; y
- b)
- ensayar la actividad de dicho polipéptido de T-cadherina en presencia de dicho compuesto candidato;
en el que una diferencia o un
cambio en la actividad de dicho polipéptido de
T-cadherina en presencia de dicho compuesto indica
que el compuesto es un agente modulador de dicho polipéptido de
T-cadherina. Preferiblemente, tal método comprende
adicionalmente la etapa de comparar la actividad de dicho
polipéptido de T-cadherina en presencia de dicho
compuesto con la actividad de dicho polipéptido de
T-cadherina en ausencia de dicho compuesto. También
preferiblemente, tal método también comprende la etapa de ensayar la
actividad de dicho polipéptido de T-cadherina en
ausencia de dicho compuesto
candidato.
El agente modulador puede ser un agente
inhibidor o un agente activante. Un agente inhibidor puede disminuir
la actividad de T-cadherina en, por ejemplo, 10%,
20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 100% comparada con la
actividad de T-cadherina en ausencia de dicho agente
inhibidor. Un agente activante puede aumentar la actividad de
T-cadherina en, por ejemplo, 10%, 20%, 30%, 40%,
50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 100% comparada con la actividad de
T-cadherina en ausencia de dicho agente
activante.
El agente modulador puede modular cualquier
actividad de dicho polipéptido de T-cadherina. El
agente modulador puede, por ejemplo, modular la expresión del mRNA
de T-cadherina dentro de una célula, modular el
enlace del polipéptido de T-cadherina a un socio de
enlace natural tal como, por ejemplo, Acrp30, o modular el
crecimiento celular.
La actividad de un polipéptido de
T-cadherina puede evaluarse midiendo en enlace de
dicho polipéptido de T-cadherina a Acrp30. Los
expertos en la técnica conocen los ensayos para medir el enlace de
un polipéptido de T-cadherina a Acrp30. Por
ejemplo, pueden usarse el ensayo FACS descrito en el ejemplo 4.2. o
el ensayo ELISA descrito en el ejemplo 4.3. de la presente memoria
descriptiva. Tal ensayo puede comprender por ejemplo las etapas
de:
- a)
- poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de T-cadherina con el compuesto candidato y con Acrp30; y
- b)
- ensayar el enlace de dicho polipéptido de T-cadherina a Acrp30 en presencia de dicho compuesto candidato;
en el que una diferencia o cambio
en el enlace de dicho polipéptido de T-cadherina a
Acrp30 en presencia de dicho compuesto indica que el compuesto es
un agente modulador de dicho polipéptido de
T-cadherina. Preferiblemente, tal método comprende
adicionalmente la etapa de comparar el enlace de dicho polipéptido
de T-cadherina a Acrp30 en presencia de dicho
compuesto con el enlace de dicho polipéptido de
T-cadherina a Acrp30 en ausencia de dicho
compuesto. También preferiblemente, tal método también comprende las
etapas
de:
- a)
- poner en contacto una célula que expresa una polipéptido de T-cadherina con Acrp30; y
- b)
- ensayar el enlace de dicho polipéptido de T-cadherina a Acrp30 en ausencia de dicho compuesto candidato.
Acrp30 puede ser una especie de hexámero de
Acrp30. Alternativamente, Acrp30 puede ser una especie de HMW de
Acrp30.
La actividad de un polipéptido de
T-cadherina también puede evaluarse midiendo las
concentraciones de mRNA de T-cadherina dentro de
una célula. Por ejemplo, la actividad puede medirse usando manchas
de Northern, RT-PCR, RT-PCR
cuantitativo con cebadores y sondas específicas para mRNAs de
T-cadherina. Alternativamente, la expresión del
mRNA de T-cadherina se mide al nivel de
polipéptidos, usando anticuerpos marcados que se enlacen
específicamente al polipéptido de T-cadherina en
inmunoensayos tales como ensayos ELISA, o ensayos RIA, ensayos de
manchas Western o ensayos inmunohistoquímicos.
Alternativamente, la actividad de un polipéptido
de T-cadherina puede evaluarse midiendo la
regulación del crecimiento celular. Las células preferidas son
células del sistema nervioso tales como astrocitos. Otras células
preferidas son miotubos C2C12. Tales ensayos pueden realizarse, por
ejemplo, como se describe en Takeuchi et al. (2000) o en
Huang et al. (2003).
Cuando se usa a lo largo de la presente memoria
descriptiva, la expresión "trastorno metabólico" incluye
la obesidad, diabetes del tipo II, la resistencia a la insulina, la
hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la dislipidemia, el
síndrome X, la aterosclerosis, la anorexia y la caquexia. Los
términos "obesidad", "diabetes del tipo
II", "resistencia a la insulina",
"hipercolesterolemia", "hiperlipidemia",
"dislipidemia" y "aterosclerosis" se
refieren a enfermedades definidas en "The Merck
Manual-Second Home Edition" (Publisher: Merck
& Co). La expresión "síndrome X" se refiere a una
constelación de factores de riesgo ateroscleróticos, que incluyen
la resistencia a la insulina, la hiperinsulinemia, la dislipidemia,
la hipertensión y la obesidad (véase, por ejemplo, Roth et
al, 2002). El término "caquexia" se refiere a una
enfermedad caracterizada por pérdida de grasa. Cuando se usa en la
presente memoria, el término "caquexia" incluye el desgaste
relacionado con el SIDA y el cáncer. El término
"anorexia" se refiere a una enfermedad caracterizada por
una imagen distorsionada del cuerpo, miedo de obesidad e
incapacidad para mantener un peso corporal mínimamente normal.
Cuando se usa a lo largo de la presente memoria
descriptiva, la expresión "trastorno ginecológico" se
refiere a trastornos que afectan al sistema reproductor femenino
y/o a trastornos ligados al embarazo. Tales trastornos incluyen,
por ejemplo, síndrome de los ovarios poliquísticos, cáncer de
endometrio, cáncer de mama, preeclampsia y eclampsia. Cuando se usa
a lo largo de la presente memoria descriptiva, la expresión
"trastorno hepático o renal" incluye, por ejemplo,
hígado graso, síndrome nefrótico y síndrome renal crónico. Cuando se
usa a lo largo de la presente memoria descriptiva, la expresión
"trastorno inflamatorio crónico" se refiere a una
inflamación patológica crónica de un tejido o de un órgano de un
individuo. Las enfermedades inflamatorias crónicas incluyen, por
ejemplo, la psoriasis, la artritis psoriática, la artritis
reumatoide, el asma, el trastorno inflamatorio de los intestinos y
la esclerosis múltiple. Todos los trastornos mencionados
anteriormente se refieren a trastornos definidos en "The Merck
Manual-Second Home Edition" (Publisher; Merck
& Co). Otros trastornos que pueden tratarse usando los agentes
moduladores y las formas solubles de T-cadherina de
la presente memoria descriptiva incluyen cualquier cáncer asociado
con la obesidad y/o la resistencia a la insulina tal como, por
ejemplo, el cáncer de endometrio.
Según la presente invención, el trastorno es un
trastorno metabólico.
En una realización preferida, el trastorno es un
trastorno metabólico seleccionado del grupo que consiste en la
obesidad, la diabetes del tipo II, la resistencia a la insulina, la
hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la dislipidemia y el
síndrome X. Un polipéptido de T-cadherina puede
usarse como diana para la selección de agentes moduladores
candidatos para fármacos candidatos para el tratamiento de la
obesidad, en el que dicho fármaco candidato es un agente modulador
de la T-cadherina. Alternativamente, un polipéptido
de T-cadherina puede usarse como diana para la
selección de agentes moduladores candidatos para fármacos candidatos
para el tratamiento de la diabetes del tipo II, en el que dicho
fármaco candidato es un agente modulador de la
T-cadherina. Además, un polipéptido de
T-cadherina puede usarse como diana para la
selección de agentes moduladores candidatos para fármacos
candidatos para el tratamiento del síndrome X, en el que dicho
fármaco candidato es un agente modulador de la
T-cadherina.
Los fármacos candidatos preferidos para el
tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en
la obesidad, la diabetes del tipo II, la resistencia a la insulina,
la hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la dislipidemia y el
síndrome X son agentes agonistas de T-cadherina.
Así, un polipéptido de T-cadherina puede usarse
como diana para la selección de compuestos candidatos para fármacos
candidatos para el tratamiento de un trastorno seleccionado del
grupo que consiste en la obesidad, la diabetes del tipo II, la
resistencia a la insulina, la hipercolesterolemia, la
hiperlipidemia, la dislipidemia y el síndrome X, en el que dicho
fármaco candidato es un agente agonista de
T-cadherina. Preferiblemente, dichos compuestos
candidatos se seleccionan del grupo que consiste en ligandos
naturales, pequeñas moléculas y aptámeros.
La determinación de si un agente modulador de la
T-cadherina es un agente agonista de la
T-cadherina o un agente antagonista de la
T-cadherina puede, por ejemplo, evaluarse usando el
ensayo descrito en el ejemplo 5. Tal ensayo puede comprender por
ejemplo las etapas de:
- a)
- poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de T-cadherina con un agente modulador; y
- b)
- ensayar la transcripción mediada por NF-\kappaB en presencia de dicho agente modulador;
en el que una determinación de que
dicho agente modulador tiene un efecto en la misma dirección sobre
la transcripción mediada por NF-\kappaB que
Acrp30 indica que el compuesto es un agente agonista de dicho
polipéptido de T-cadherina, y en el que una
determinación de que dicho agente modulador has un efecto opuesto
sobre la transcripción mediada por NF-\kappaB
comparado con Acrp30 indica que el compuesto es un agente
antagonista de dicho polipéptido de T-cadherina.
Preferiblemente, tal método comprende adicionalmente las etapas
de:
- a)
- poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de T-cadherina con Acrp30; y
- b)
- ensayar la transcripción mediada por NF-\kappaB en presencia de Acrp30 y en ausencia de dicho agente modulador.
En tal ensayo, Acrp30 es preferiblemente una
especie de hexámero o una especie de HMW de Acrp30. En tal ensayo,
la célula que expresa un polipéptido de T-cadherina
puede ser, por ejemplo, una línea de células C2C12 o una célula
C2C12 que sobreexpresa T-cadherina. Tal ensayo
también puede realizarse con compuestos candidatos con el fin de
seleccionar agentes agonistas de T-cadherina o
agentes antagonistas de T-cadherina.
IL-6, que es producida en altas
concentraciones por el músculo esqueletal durante el ejercicio,
activa la producción acrecentada de ácidos grasos y de glucosa en
el tejido adiposo. Se piensa que Acrp30 juega un papel en la
liberación de IL-6 en el músculo esqueletal a través
de la activación de NF-\kappaB (véase, por
ejemplo, Tsao et al, 2003). Por consiguiente, la
determinación de si un agente modulador de la
T-cadherina es un agente agonista de la
T-cadherina o un agente antagonista de la
T-cadherina puede evaluarse midiendo la expresión
del gen de IL-6 y/o la liberación de
IL-6 en las células del músculo esqueletal. Tal
ensayo puede comprender por ejemplo las etapas de:
- a)
- poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de T-cadherina con un agente modulador; y
- b)
- ensayar la expresión del gen de IL-6 y/o la liberación de IL-6 en las células del músculo esqueletal en presencia de dicho agente modulador;
en el que una determinación de que
dicho agente modulador tiene un efecto en la misma dirección que
Acrp30 sobre la expresión del gen de IL-6 gene y/o
la liberación de IL-6 en células del músculo
esqueletal indica que el compuesto es un agente agonista de dicho
polipéptido de T-cadherina, y en el que una
determinación de que dicho agente modulador tiene un efecto opuesto
sobre la expresión del gen IL-6 y/o la liberación de
IL-6 en células del músculo esqueletal comparado
con Acrp30 indica que el compuesto es un agente antagonista de
dicho polipéptido de T-cadherina. Preferiblemente,
tal método comprende adicionalmente las etapas
de:
- a)
- poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de T-cadherina con Acrp30; y
- b)
- ensayar la expresión del gen de IL-6 y/o la liberación de IL-6 en células de músculo esqueletal en presencia de Acrp30 y en ausencia de dicho agente modulador.
En tal ensayo, Acrp30 es preferiblemente una
especie de hexámero o una especie de HMW de Acrp30.
Alternativamente, la determinación de si un
agente modulador de la T-cadherina es un agente
agonista de la T-cadherina o un agente antagonista
de la T-cadherina puede evaluarse por cualquiera de
los ensayos in vivo conocidos para evaluar la actividad de
Acrp30.
El trastorno puede ser anorexia o caquexia. Así,
un polipéptido de T-cadherina puede usarse como
diana para la selección de agentes moduladores candidatos para
fármacos candidatos para el tratamiento de la anorexia o la
caquexia, en el que dicho fármaco candidato es un agente modulador
de la T-cadherina. Los fármacos candidatos
preferidos para el tratamiento de la caquexia o la anorexia son
agentes antagonistas de la T-cadherina.
Alternativamente, el trastorno puede ser un
trastorno ginecológico, un trastorno inflamatorio crónico o un
trastorno hepático o renal. Los fármacos candidatos preferidos para
el tratamiento de la caquexia o la anorexia son agentes agonistas
de la T-cadherina.
Otro aspecto de la presente memoria descriptiva
se dirige al uso de un agente modulador de un polipéptido de
T-cadherina para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que
consiste en un trastorno metabólico, un trastorno ginecológico, un
trastorno inflamatorio crónico y un trastorno hepático o renal.
Preferiblemente, dicho trastorno es un trastorno metabólico. Tal
medicamento comprende dicho agente modulador de un polipéptido de
la T-cadherina en combinación con cualquier vehículo
fisiológicamente aceptable. Vehículos fisiológicamente aceptables
pueden prepararse por cualquier método conocido por los expertos en
la técnica. Los vehículos fisiológicamente aceptables incluyen, pero
no se limitan a, los descritos en Remington's Pharmaceutical
Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985). Las
composiciones farmacéuticas que comprenden un agente modulador de
un polipéptido de T-cadherina y un vehículo
fisiológicamente aceptable pueden, por ejemplo, ser de uso
intravenoso, tópico, rectal, local, inhalante, subcutáneo,
intradérmico, intramuscular, oral, intracerebral e intratecal. Las
composiciones pueden estar en forma líquida (por ejemplo,
soluciones, suspensiones), sólida (por ejemplo, píldoras,
comprimidos, supositorios) o semisólida (por ejemplo, cremas,
geles). Las dosificaciones a administrar dependen de las necesidades
individuales, del efecto deseado y de la ruta de administración
escogida.
Tal medicamento que comprende un agente
modulador de la T-cadherina puede usarse en
combinación con cualquier fármaco conocido para el tratamiento de
dicho trastorno. Por ejemplo, cuando se trata la obesidad, el agente
modulador puede administrarse en combinación con Orlistat,
Sibutramina, Rimonabant, Axoquina, Fluasterona y/o Famoxin. Cuando
se trata la diabetes del tipo II, el agente modulador puede, por
ejemplo, administrarse en combinación con Acarbosa, Acetohexamida,
Clorpropamida, Glimepirida, Glipizida, Gliburida, Metformina,
Tolazamida, Tolbutamida, Nateglinida, Insulina, Insulina Asparto,
Insulina glargina, Miglitol, V-411, Repaglinida,
Rosiglitazona y/o Pioglitazona. Los medicamentos que comprenden un
agente modulador de la T-cadherina también pueden
administrarse en el marco de una dieta.
Un agente modulador de un polipéptido de
T-cadherina puede usarse para preparar un
medicamento para el tratamiento de un trastorno metabólico
seleccionado del grupo que consiste en la obesidad, la diabetes del
tipo II, la resistencia a la insulina, la hipercolesterolemia, la
hiperlipidemia, la dislipidemia y el síndrome X. Dicho agente
modulador es preferiblemente un agente agonista.
Alternativamente, un agente modulador de un
polipéptido de T-cadherina puede usarse para
preparar un medicamento para el tratamiento de la caquexia o la
anorexia. Dicho agente modulador es preferiblemente un agente
antagonista.
Además, un agente modulador de un polipéptido de
T-cadherina puede usarse para preparar un
medicamento para el tratamiento de un trastorno ginecológico, un
trastorno inflamatorio crónico o un trastorno hepático o renal.
Dicho agente modulador es preferiblemente un agente agonista.
Otro aspecto de la presente memoria descriptiva
se dirige al uso de un polipéptido de T-cadherina
como diana para la selección de socios de enlace naturales, en el
que dicho socio de enlace natural es un fármaco candidato para el
tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en
un trastorno metabólico, un trastorno ginecológico, un trastorno
inflamatorio crónico y un trastorno hepático o renal.
Preferiblemente, dicho trastorno es un trastorno metabólico. Dicho
trastorno metabólico se selecciona preferiblemente del grupo que
consiste en la obesidad, la diabetes del tipo II, la resistencia a
la insulina, la hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la
dislipidemia, el síndrome X, la anorexia y la caquexia. El uso de un
polipéptido de T-cadherina como diana tiene una
gran utilidad para la identificación de proteínas implicadas en un
trastorno metabólico, y para proporcionar nuevos puntos de
intervención en el tratamiento de tal trastorno. Tales métodos para
la selección de socios de enlace naturales de un polipéptido de
T-cadherina son bien conocidos en la técnica.
Un método para la selección de un polipéptido
candidato que interacciona con un polipéptido de
T-cadherina comprende las siguientes etapas:
- a)
- proporcionar un polipéptido que consiste en un polipéptido de T-cadherina;
- b)
- obtener un polipéptido candidato;
- c)
- poner en contacto dicho polipéptido con dicho polipéptido candidato; y
- d)
- detectar los complejos formados entre dicho polipéptido y dicho polipéptido candidato.
En el método de selección anteriormente
definido, los complejos formados entre el polipéptido y el
polipéptido candidato pueden además incubarse en presencia de un
anticuerpo poli o monoclonal que se enlace específicamente al
polipéptido de T-cadherina. Alternativamente, los
complejos formados entre el polipéptido y el polipéptido candidato
se detectan realizando un ensayo de enlace FACS.
En el método de selección, el candidato puede
ser el producto de expresión de un inserto de DNA contenido en un
vector. Por ejemplo, tal método de selección puede realizarse como
se describe en los ejemplos 1 y 2 de la presente memoria
descriptiva.
En el método de selección, los socios de enlace
pueden identificarse a través de un ensayo de selección doble
híbrido. El sistema de levaduras doble híbrido está diseñado para
estudiar las interacciones proteína-proteína in
vivo (Fields y Song, 1989), y se atiene a la fusión de una
proteína cebo al dominio enlazante del DNA de la proteína Gal4 de
levadura. Esta técnica también se describe en las patentes de EE.UU.
Nos. 5.667.973 y 5.283.173. El procedimiento de selección por
biblioteca mediante el ensayo doble híbrido puede realizarse, por
ejemplo, como describen Fromont-Racine et al
(1997), consistiendo el polipéptido cebo en un polipéptido de
T-cadherina. Más precisamente, un polinucleótido de
T-cadherina se fusiona en UN marco a UN
polinucleótido que codifica el dominio enlazante del DNA de la
proteína GAL4, insertándose la secuencia fusionada de nucleótidos
en un vector de expresión adecuado, por ejemplo pAS2 o pM3.
En el método de selección, los socios de enlace
también pueden identificarse por medio de cromatografía de
afinidad. El polipéptido de T-cadherina puede unirse
a La columna usando técnicas convencionales que incluyen el
acoplamiento químico a una matriz de La columna adecuada (por
ejemplo agarosa, AFFI GEL, etc.). En algunas realizaciones de este
método, La columna de afinidad contiene proteínas quimera en las
cuales el polipéptido de T-cadherina, o uno de sus
fragmentos, está fusionado con glutatión S transferasa (GST). Una
mezcla de proteínas celulares o una agrupación de proteínas
expresadas como se describió anteriormente se aplica a La columna
de afinidad. Los polipéptidos que interaccionan con el polipéptido
de T-cadherina unido a La columna pueden aislarse y
analizarse a continuación, por ejemplo, en un gel de electroforesis
2-D como se describe en Rasmunsen et al.
(1997). Alternativamente, las proteínas retenidas en La columna de
afinidad pueden purificarse por métodos basados en electroforesis y
secuenciarse.
En el método de selección, los socios de enlace
también pueden identificarse por medio de métodos basados en
biosensores ópticos (véase, por ejemplo, Edwards y Leatherbarrow,
1997). Esta técnica permite la detección de interacciones entre
moléculas en tiempo real, sin necesidad de moléculas marcadas.
Preferiblemente, todos ensayos que comprenden la
etapa de ensayar el enlace de un polipéptido de
T-cadherina a un compuesto candidato, un agente
modulador candidato o un socio natural de enlace candidato se
realizan en presencia de un catión divalente. Mucho más
preferiblemente, tales ensayos se realizan en presencia de
Ca^{2+}.
La presente invención se dirige al uso de una
forma soluble de T-cadherina para la preparación de
un medicamento para el tratamiento de un trastorno metabólico. Las
formas solubles de T-cadherina pueden generarse
fácilmente como se indicó anteriormente. La forma soluble de
T-cadherina puede actuar como un agente agonista de
T-cadherina.
Otro aspecto de la presente memoria descriptiva
se dirige a un método para evaluar la eficiencia de un agente
modulador de un polipéptido de T-cadherina para el
tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en
un trastorno metabólico, un trastorno ginecológico, un trastorno
inflamatorio crónico y un trastorno hepático o renal, comprendiendo
dicho método administrar dicho agente modulador a un modelo animal
de dicho trastorno, en el que una determinación de que dicho agente
modulador mejora una característica representativa de dicho
trastorno en dicho modelo animal indica que dicho agente modulador
es un fármaco para el tratamiento de dicho trastorno.
Preferiblemente, dicho trastorno es un trastorno metabólico. Dicho
trastorno metabólico se selecciona preferiblemente del grupo que
consiste en la obesidad, la diabetes del tipo II, la resistencia a
la insulina, la hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la
dislipidemia, el síndrome X, la anorexia y la caquexia.
Preferiblemente, el trastorno es la obesidad. Un
ejemplo de un método que puede usarse para la selección de fármacos
para el tratamiento de la obesidad y/o para evaluar la eficiencia de
un agente modulador de un polipéptido de
T-cadherina para el tratamiento de la obesidad es un
método que comprende la etapa de administrar dicho agente modulador
a un modelo animal para la obesidad, en el que una determinación de
que dicho agente modulador mejora una característica representativa
de la obesidad en dicho modelo animal indica que dicho agente
modulador es un fármaco para el tratamiento de la obesidad.
Los modelos animales para la obesidad y los
ensayos para la determinación de si un compuesto mejora una
característica representativa de la obesidad in tales modelos
animales son conocidos por los expertos en la técnica. Los modelos
animales preferidos para la obesidad incluyen ratas fa/fa, ratones
ob/ob, ratones db/db, ratones deficientes en leptinas y ratones
deficientes en receptores de las leptinas (véase, por ejemplo,
Pelleymounter et al, 1995; Ogawa et al, 1995; Hu
et al, 1996; Piercy et al, 2000; Yamauchi et
al, 2001).
Cuando se estudia la obesidad, la característica
representativa puede ser, por ejemplo, el índice de masa corporal
(IMC), el peso corporal, y/o el porcentaje de grasa corporal.
Preferiblemente, la característica representativa es el índice de
masa corporal. Los métodos para medir estas características son bien
conocidos por los expertos en la técnica.
Una determinación de que un agente modulador de
un polipéptido de T-cadherina reduce el peso
corporal de un modelo animal para la obesidad puede indicar que
dicho agente modulador es un fármaco para el tratamiento de la
obesidad. Preferiblemente, una reducción del peso corporal de 5%,
10%, 15% 20%, 25%, 30%, 40%, 50% o mayor indica que dicho agente
modulador es un fármaco para el tratamiento de la psoriasis. Mucho
más preferiblemente, una reducción de 10% o más del peso corporal
indica que dicho agente modulador es un fármaco para el tratamiento
de la obesidad.
Preferiblemente, el trastorno es la diabetes del
tipo II. Un ejemplo de un método que puede usarse para la selección
de fármacos para el tratamiento de la diabetes del tipo II y/o para
evaluar la eficiencia de un agente modulador de un polipéptido de
T-cadherina para el tratamiento de la diabetes del
tipo II es un método que comprende la etapa de administrar dicho
agente modulador a un modelo animal de la diabetes del tipo II, en
el que una determinación de que dicho agente modulador mejora una
característica representativa de la diabetes del tipo II en dicho
modelo animal indica que dicho agente modulador es un fármaco para
el tratamiento de la diabetes del tipo II.
Los modelos animales para la diabetes del tipo
II y los ensayos para la determinación de si un compuesto mejora
una característica representativa de la diabetes del tipo II in
tales modelos animales son conocidos por los expertos en la
técnica. Los modelos animales preferidos para la diabetes del tipo
II incluyen el ratón diabético C57/BLKsJ, el ratón KKA(y),
el ratón Nagoya-Shibata-Yasuda
(NSY), y el ratón diabético obeso (db/db) (véase, por ejemplo,
Castle et al, 1993; Piercy et al, 1998; Piercy et
al, 2000; Ueda et al, 2000).
La determinación de si el agente modulador
mejora una característica representativa de la diabetes puede
realizarse usando varios métodos disponibles en la técnica. Por
ejemplo, la característica representativa puede ser las
concentraciones de glucosa en el plasma, el suero o la sangre. En
una realización, la característica representativa es la
concentración de glucosa en plasma en ayunas (FPG).
Alternativamente, la característica representativa es la
concentración de glucosa postprandial. La característica
representativa también puede ser la concentración de fructosamina y
hemoglobina glicada (HbA1c), Tanto las concentraciones de HbA1c como
de FPG son una medida comúnmente usada en ensayos clínicos de
tratamientos para la diabetes del tipo II (véase, por ejemplo,
Holman et al 1999). Alternativamente, la característica
representativa puede ser la concentración de colesterol total,
colesterol HDL, colesterol LDL y/o triglicéridos (véase, por
ejemplo, Feinglos et al, 1997). Los métodos para medir la
característica representativa anterior son bien conocidos en la
técnica.
Una determinación de que un agente modulador de
un polipéptido de T-cadherina reduce las
concentraciones de HbAlc en al menos 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%,
1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20% o más con relación a un placebo puede
indicar que dicho agente modulador es un fármaco para el tratamiento
de la diabetes del tipo II. Cuando se usa en la presente memoria,
el término "placebo" se refiere a un modelo animal al
cual no se ha administrado dicho agente modulador de un polipéptido
de T-cadherina.
La referencia a etapas conocidas de métodos, a
etapas convencionales de métodos, a métodos o métodos convencionales
conocidos no es de ninguna manera una admisión de que cualquier
aspecto, descripción o realización de la presente invención se
describe, enseña o sugiere en la técnica relevante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La secuencia codificante entera de Acrp30 murina
(SEQ ID NO: 3) se insertó en el vector pCDNA3.1. El vector pcDNA3.1
se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA). El vector pcDNA3.1 incluye
el agente promotor CMV que regula la expresión del gen clonado.
La secuencia codificante del epítope Flag
(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)
se insertó mediante mutagénesis dirigida por PCR entre el sitio de
escisión predicho de la secuencia señal de Acrp30 (aminoácido en la
posición 17 de la SEQ ID NO: 3) y la región amino terminal. Esta
construcción se denota 5'FlagAcrp30. La mutagénesis dirigida por
PCR se realizó usando cebadores de las SEQ ID NOs: 5 a 8. Los
cebadores de las SEQ ID NOs: 6 y 7 contienen la secuencia que
codifica las secuencias del epítope Flag y de Acrp30, y se usaron en
PCR de extensión por solapamiento para introducir la etiqueta
después de la secuencia señal. Las SEQ ID Nos. 5 y 8 contienen
secuencias de Acrp30 en los extremos 5' y 3' del gen,
respectivamente, y también contienen un sitio EcoRI usado para
subclonar en pCDNA3.1.
También se construyó una segunda construcción,
denotada 3'Flag-Acrp30, insertando por mutagénesis
PCR la secuencia codificante del epítope Flag inmediatamente antes
del codón de parada del cDNA de Acrp30 para generar una proteína
etiquetada en el terminal carboxilo. La mutagénesis dirigida por PCR
se realizó usando cebadores de la SEQ ID NO: 9, la cual contiene
secuencias Acrp30-5' precedidas por un sitio EcoRI,
y de la SEQ ID NO: 10, la cual contiene las secuencias
Acrp30-3' que carecen del codón de parada, siendo el
codón de parada reemplazado por una secuencia que codifica al
epítope Flag inmediatamente seguida por un codón de parada y un
sitio EcoRI.
Estas dos construcciones
Flag-Acrp30 se secuenciaron para confirmar que no se
había producido ningún error introducido por PCR.
Para generar proteínas recombinantes
Flag-Acrp30, se transfectaron transitoriamente
células HEK con estas construcciones. Después de transferir las
células a un medio exento de suero se recogieron los sobrenadantes.
La concentración de proteína se determinó por comparación con
cantidades conocidas de proteína de fusión de Acrp30 etiquetada con
Flag y expresada en bacterias mediante el ensayo de manchas Western.
Los sobrenadantes contenían aproximadamente 5 \mug/ml de Acrp30
etiquetada secretada.
Estos sobrenadantes se purificaron
adicionalmente por precipitación en sulfato de amonio seguido por
cromatografía de intercambio de aniones FPLC (HiQ,
Bio-Rad) de las proteínas resuspendidas. Después de
la cromatografía de aniones, los ensayos de electroforesis en gel
nativo y de inmunomanchas para el epítope Flag mostraron la
resolución de la proteína expresada en dos especies: la primera
contenía predominantemente 5'Flag-Acrp30 trímero,
mientras que la segunda contenía 5'Flag-Acrp30
hexámero y de mayor peso molecular. Se juzgó que la pureza de estas
preparaciones era aproximadamente 50 por ciento por
SDS-PAGE y tinción Coomassie.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La capacidad de los polipéptidos de
Flag-Acrp30 comprendidos en los sobrenadantes
anteriores para enlazarse a miocitos C2C12 no diferenciados, a
células CHO y a células Ba/F3 se ensayó mediante ensayos de enlace
para clasificar células, activados por fluorescencia (FACS).
Se transfirieron a medios exentos de suero
células adherentes (C2C12 y CHO) o células en suspensión (Ba/F3)
durante dos horas y a continuación se incubaron a 4ºC durante
treinta minutos para bloquear la endocitosis. Las células se
incubaron en BSA al 1% en PBS que contenía CaCl_{2} 0,9 mM y
MgCl_{2} 0,5mM (PBS++) a 4ºC durante treinta minutos para
bloquear sitios de enlace no específicos. Todas las etapas
subsiguientes se hicieron a 4ºC. Las células se incubaron en una
disolución 1:1 de medio acondicionado de células HEK y disolución
bloqueante durante dos horas, se lavaron dos veces en PBS++, y se
incubaron durante una hora con un anticuerpo monoclonal que
reconocía el epítope Flag conjugado al colorante APC fluorescente
(Phico Link). Los anticuerpos que reconocían el epítope Flag se
compraron a Sigma (St. Louis, MO). Después de lavar dos veces in
PBS++, las células adherentes se extrajeron por raspado y se
resuspendieron en PBS que contenía FBS al 10% y 0,5 \mug/mL de
yoduro de propidio (PI), un marcador de la permeabilidad celular, y
se analizaron por FACS. SE determinó la fluorescencia media de
células vivas
PI-negativas.
PI-negativas.
La figura 1 muestra el resultado del ensayo de
enlace FACS. Se muestra la fluorescencia celular media de cada tipo
de célula. Las calles 1-3 corresponden a un ensayo
de enlace realizado con testigos tampón. Las calles
4-6 corresponden a un ensayo de enlace realizado con
medios acondicionados en células HEK transfectadas con el vector
pcDNA3.1 solo, que carecían de cualquier inserto de cDNA (células
testigo). Las calles 7-9 corresponden a un ensayo
de enlace realizado con medios acondicionados en células HEK
transfectadas con 5'Flag-Acrp30. Las calles
10-12 corresponden a un ensayo de enlace realizado
con medios acondicionados en células HEK transfectadas con
3'Flag-Acrp30. Se realizaron dos experimentos
independientes. Medios acondicionados se refiere a sobrenadantes
sin purificar generados como se describe en el ejemplo 1.
Como se muestra en la figura 1, las células
Ba/F3 no se enlazaron sustancialmente a 5'FlagAcrp30 (calle 9) ó
3'FlagAcrp30 (calle12). La señal obtenida fue similar a la obtenida
con sobrenadantes testigo transfectados (calle 6) o cuando sólo se
añadió disolución bloqueante (calle 3). Las células CHO dieron una
señal ligeramente mayor cuando se incubaron en medios
acondicionados que contenían Acrp30 etiquetado con 5'Flag (calle 8)
o con medios que contenían Acrp30 etiquetado con 3'Flag (calle 11),
en comparación con el testigo de sólo proteína bloqueante (calle 3)
o sobrenadante testigo transfectado (calle 5). Sin embargo, las
células C2C12 demostraron un aumento de la señal dos veces cuando
las células se incubaron en medios acondicionados que contenían
5'Flag-Acrp30 (calle 7) ó
3'Flag-Acrp30 (calle 10), en comparación con la
disolución bloqueante (calle 1) o el sobrenadante testigo
transfectado (calle 4).
Estos resultados indican que las células C2C12,
pero no las células Ba/F3, se enlazan específicamente a Acrp30.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Para la construcción de una biblioteca de
expresión de cDNA de C2C12 se escogió la línea de células C2C12 ya
que se enlaza a polipéptidos de Flag-Acrp30 sin
purificar y como se ha mostrado previamente aumenta la oxidación de
ácidos grasos en respuesta a Acrp30 (Fruebis et al,
2001).
Se hizo una biblioteca de expresión de cDNA de
C2C12 no diferenciada en un vector retrovírico bicistrónico
pBI-GFP. Este vector contiene la secuencia
codificante de la proteína fluorescente verde (GFP) bajo en testigo
de un sitio interno de entrada a los ribosomas (IRES) (Bogan et
al., 2001). La expresión del gen clonado o del inserto de cDNA
es proporcional a la expresión de GFP en células individuales.
La calidad del mRNA se verificó mediante
análisis de manchas Northern para el gen de
beta-actina. Después del ligamento del cDNA inverso
transcrito en el vector retrovírico, la caracterización de la
biblioteca sin amplificar reveló aproximadamente
0,5-1x10^{7} transformantes independientes. Por
digestión de restricción de plásmidos preparados a partir de clones
individuales de la biblioteca primaria, el 95 por ciento contenía
insertos con un tamaño medio de 1,5 kb. Se produjeron partículas
infecciosas de cDNA vírico por transfección del plásmido en una
línea de células envase (Naviaux et al, 1996). El
sobrenadante resultante que contenía el virus se usó para infectar
aproximadamente el 5 por ciento de una población de 2 x 10^{8}
células Ba/F3.^{1} ingenuas
Se incubaron bolas magnéticas que contenían
grupos reactivos con el grupo tosilo (M280 Dynalbolas, Dynal) con
anticuerpo anti-Flag (M2, Sigma) para acoplar el
anticuerpo a las bolas. Después del acoplamiento, las bolas se
bloquearon en una disolución de PBS++ que contenía BSA al 1% durante
una hora, se añadieron a 40 mL de medios acondicionados en células
HEK transfectadas con 5'Flag-Acrp30, y se incubaron
durante toda la noche a 4ºC. Se incubaron bolas testigo con los
sobrenadantes de células HEK transfectadas con el vector pCDNA3.1
vacío. Después del enlace a los sobrenadantes, las bolas se lavaron
dos veces en PBS++ que contenía BSA al 0,11% y se almacenaron en
condiciones estériles en el mismo tampón.
Las células Ba/F3 infectadas mediante la
biblioteca de expresión de cDNA de C2C12 se expandieron durante dos
días antes de someterse al enlace sobre las bolas magnéticas. Las
células se prepararon y bloquearon como se describe en el ejemplo
2, excepto que en la etapa de bloqueo se incluyeron 0,1 mg/mL de IgG
de ratón (Sigma). Todas las etapas subsiguientes se realizaron a
4ºC para impedir la internalización de las bolas.
Las células se prelimpiaron para separar las
células no específicamente enlazadas incubando 30 mL de células
(2,4 x 10^{7}/mL) con 30 \muL de bolas magnéticas testigo
durante una hora. Las células enlazadas se separaron mediante el
uso de un imán, y las células no adherentes se sometieron de nuevo a
dos rondas adicionales de enlace a las bolas testigo. Las células
no adherentes se incubaron con 75 \muL de bolas
5'Flag-Acrp30 durante una hora, después de los cual
las células adherentes se separaron con un imán y se lavaron tres
veces (cinco minutos en 10 mL de PBS++ con BSA al 0,1%.) Las
células enlazadas se expandieron en un cultivo; en rondas
subsiguientes de enlace se realizó una prelimpieza dos veces con 15
\muL de bolas testigo antes de añadir 30 \muL de bolas de
5'Flag-Acrp30. Después de cada ronda de enlace y
expansión, se analizaron partes alícuotas de células por FACS
respecto a la expresión de GFP para seguir el enriquecimiento de
células que contenían un retrovirus integrado.
Puesto que la expresión de GFP a partir del IRES
del vector retrovírico integrado es proporcional a la expresión del
inserto de cDNA clonado en células individuales (Liu et al.,
2000), tel enriquecimiento de la expresión de GFP en una población
celular después del enlace a 5'Flag-Acrp30 está
ligado al enriquecimiento de un cDNA clonado que confiere capacidad
enlazante.
Después de una ronda de enlace a las bolas, el
2,4% de las células purificadas sobre las bolas testigo, y el 1,6%
de las células purificadas sobre bolas de
5'Flag-Acrp30 fueron GFP-positivas
con relación a las células no infectadas.
Después de una segunda ronda de enlace, el 1,7%
de las células purificadas sobre las bolas testigo y el 7,8% de las
células purificadas sobre bolas de 5'Flag-Acrp30
fueron GFP-positivas.
Mediante la tercera clasificación, las células
que se enlazaron a bolas testigo no se habían enriquecido en
comparación con la primera clasificación, ya que el 2,3% fueron
GFP-positivas. Por otra parte, el 73% de las
células que se enlazaron a bolas de 5'Flag-Acrp30
fueron GFP-positivas, indicando que la población se
había enriquecido en células que contenían un clon integrado de cDNA
retrovírico.
Las células enlazadas a las bolas testigo no se
enriquecieron en GFP durante la tercera clasificación, se excluyen
los efectos epigenéticos debidos al enriquecimiento de células
enlazadas a las bolas de 5'Flag-Acrp30. Así, la
población de célula enriquecidas probablemente contiene un cDNA que
codifica a un receptor de Acrp30.
Se preparó DNA genómico a partir de diferentes
agrupaciones de células obtenidas después de una tercera
clasificación y sometidas a amplificación por PCR usando cebadores
retrovíricos específicos que flanquean el sitio de clonación de
cDNA del vector retrovírico pBI-GFP. Estas
diferentes agrupaciones celulares correspondieron a células Ba/F3
ingenuas o a células Ba/F3 infectadas con la biblioteca de cDNA y
enlazadas a bolas magnéticas que habían sido incubadas con el
sobrenadante de (i) células HEK transfectadas con el vector pcDNA3.1
solo; (ii) células HEIC que expresan 5'FlagAcrp30; o (ii) células
HEK que expresan 5'FlagAcrp30. En células incubadas con las bolas
que contenían 5'Flag-Acrp30 se vio una única banda
específica de 2,5 kb, pero no en células testigo o en células Ba/F3
ingenuas.
Esta banda se subclonó en el vector
pCRII-Topo y los extremos se secuenciaron usando
cebadores específicos del vector. La secuencia fue idéntica a la
T-cadherina murina (número de acceso al GenBank
BC021628). Con el fin de obtener la secuencia completa del inserto,
se diseñaron cebadores de las SEQ ID NOs: 11 a 18 de la secuencia
de T-cadherina conocida para permitir la
secuenciación del inserto completo. Esto confirmó la identidad del
clon enriquecido como T-cadherina de longitud
completa.
Por consiguiente, la T-cadherina
es un receptor potencial de Acrp30. El hecho de que la
T-cadherina es un receptor de Acrp30 se confirmó
como se detalla más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se obtuvo cDNA de T-cadherina
murina de longitud completa como una etiqueta secuencia expresada
(clon IMAGE ID 3987627) y se clonó en el vector pcDNA3.1 par
generar la construcción pCDNA-Tcad. Se generaron
tres líneas de células que sobreexpresaban
T-cadherina
Se transfectaron transitoriamente con
pCDNA-Tcad células CHO. Estas células CHO
transfectadas transitoriamente demostraron una capacidad enlazante
acrecentada con 5'Flag-Acrp30 en comparación con
sobrenadantes testigo de cultivos tisulares usando el ensayo de
enlace FACS previamente descrito.
La secuencia completa que codifica la
T-cadherina se clonó en el vector retrovírico
pBI-GFP para generar la construcción
pBI-GFP-Tcad. Tanto las células
Ba/F3 ingenuas como las CHO-ER se transfectaron con
pBI-GFP-Tcad. La línea de células
CHO-ER expresa establemente el receptor del vector
retrovírico y puede ser infectada por virus ecotrópicos (regalo del
Dr. M. Krieger, MIT).
Como se muestra en la figura 2, las líneas de
células anteriores se usaron subsiguientemente en los ensayos de
enlace FACS. Los paneles 1 a 3 corresponden al ensayo de enlace FACS
de células Ba/F3 testigo. Los paneles 4 a 9 corresponden al ensayo
de enlace FACS de células Ba/F3 infectadas con retrovirus que
expresan T-cadherina
(pBI-GFP-Tcad). El enlace se estudió
para:
- -
- hexámero de 5'Flag-Acrp30 0 nM (paneles 1 y 4), 6 nM (paneles 2 y 5, 7-9), ó 60 nM (paneles 3 y 6);
- -
- hexámero de Acrp30 60 nM (panel 7);
- -
- EDTA 10 mM (panel 8); y
- -
- Clq 10 \mug/mL (panel 9).
Las células Ba/F3 testigo no infectadas
exhibieron una baja capacidad de enlace al hexámero de
5'Flag-Acrp30 6 nM (panel 2) o 60 nM (panel 3),
mientras que las células Ba/F3 que expresan
T-cadherina demostraron una capacidad enlazante
creciente con el hexámero de 5'Flag-Acrp30 6 nM
(panel 5, y paneles 7-9) o 60 nM (panel 6)
(concentración expresada como equivalentes de trímeros). La
capacidad enlazante del fondo en ausencia de ligando fue baja
(panel 4). Las inclusión de 60 nM del hexámero de Acrp30 sin
etiquetar producido por eucariotas inhibió la capacidad enlazante
de 5'FlagAcrp30 6 nM (panel 7), indicando enlace específico entre
Acrp30 y T-cadherina. Para examinar los
requerimientos de cationes divalentes para el enlace, se añadió una
disolución 10 mM de EDTA a la reacción de enlace. Esto bloqueó
completamente la capacidad enlazante (panel 8), indicando que para
que se produzca el enlace se requieren cationes divalentes. Clq, una
molécula que comparte homología con Acrp30, no afectó a la
capacidad enlazante en un exceso de 20 veces (en peso) cuando se
incubó con el hexámero de 5'Flag-Acrp30 6 nM (panel
9), indicando que probablemente Clq no se enlaza al mismo receptor
que Acrp30.
En experimentos paralelos, no se vio ningún
enlace significativo de gAcrp30 expresada por bacterias ni a líneas
de células que expresaban T-cadherina ni a una
preparación de 5'Flag-Acrp30 trímero producida por
células de mamíferos.
Este experimento confirma que
T-cadherina no se enlaza al epítope Flag, excluyendo
así una explicación trivial del enlace a
5'Flag-Acrp30. Adicionalmente, este resultado
sugiere que T-cadherina es un receptor específico
de las especies de hexámeros y de HMW de longitud completa de
Acrp30, pero no se enlaza a las especies globular o de trímeros de
Acrp30.
Se realizaron además ensayos ELISA para mostrar
el enlace directo de Acrp30 a células que expresan
T-cadherina.
Se hicieron crecer, cada una, en placas de 96
pocillos líneas de células CHO-ER infectadas con la
construcción retrovírica bicistrónica
pBI-GFP-Tcad (denominadas
CHO-T-cadherina) y células testigo
infectadas con pBI-GFP (denominadas
CHO-GFP). Un día después de la extensión en el plazo
(1,5 x10^{4}/pocillo), las células se incubaron en medios exentos
de suero durante una hora, se colocaron a 4ºC durante treinta
minutos, y se bloquearon durante treinta minutos en PBS++ que
contenía leche en polvo al 4%. Acrp30 globular etiquetada con Flag
expresada en bacterias, 5'Flag-Acrp30 de longitud
completa etiquetada con Flag expresada en bacterias o las especies
de trímeros o de hexámeros y de HMW de 5'Flag-Acrp30
producidas en células HEK se incubaron con las células durante una
hora en tampón bloqueante a las concentraciones indicadas. Los
polipéptidos expresados en HEK se produjeron y purificaron por
precipitación en sulfato de amonio y cromatografía de intercambio de
aniones. Se identificaron agrupaciones que contenían la especie de
trímeros de 5'Flag-Acrp30 o una combinación de las
especies de hexámeros y de HMW por electroforesis en gel nativo y
ensayo de inmunomanchas con un anticuerpo Flag. Se juzgó que La
pureza de estas preparaciones era aproximadamente 50% por análisis
Coomassie PAGE. La concentración de proteínas se determinó por
ensayo BCA (Pierce). La concentración de proteínas bacterianas
purificadas expresadas se determinó por la absorbancia a 280 nm y el
coeficiente de extinción calculado derivado de la secuencia de
aminoácidos primaria (Protean; DNAStar). Después de lavar dos veces
en PBS ++, se añadió un anticuerpo monoclonal al epítope Flag (M2;
4 \mug/ml) durante una hora; se repitió el lavado, seguido por
una incubación en el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de
rábano (anti-ratón de burro; Jackson), y se
desarrolló con sustrato TMB colorimétrico (Pierce). Se midió la
absorbancia a 450 nm con un lector de placas.
Los resultados se muestran en la figuras 3A y
3B. La figura 3A muestra el análisis ELISA de enlace de varias
preparaciones de Acrp30 a CHO-GFP testigo. La figura
3B muestra las líneas de células que expresan
CHO-T-cadherina. gAcrp se refiere a
3'Flag-gAcrp30 expresada en bacterias. Acrp de
longitud completa se refiere a Flag-Acrp30
expresada en bacterias 3. TRI se refiere a 5'FlagAcrp30 trímero
producido por células HEK. HEX & HMW se refiere a 5'FlagAcrp30
hexámero y de alto peso molecular producidos por células HEK. Se
realizaron cuatro experimentos independientes.
Como se ve en la figura 3A, las células testigo
no se enlazaron a ninguna de las proteínas ensayadas. Como se ve en
la figura 3B, las células CHO que expresan
T-cadherina sólo demostraron capacidad enlazante a
oligómeros de 5'FlagAcrp30 hexámeros y de HMW, pero no a trímeros.
La concentración semi-máxima de enlace estimada es
de 25-50 nM (concentración expresada como
equivalentes de trímeros). No hubo ningún enlace a células CHO que
expresan T-cadherina de proteína globular o de
longitud completa producidas por bacterias, lo que implica que el
reconocimiento de Acrp30 por T-cadherina puede
requerir modificaciones post-translacionales de
Acrp30 y que probablemente no implica al dominio globular. Por
consiguiente, la T-cadherina puede enlazarse a las
especies de hexámeros y de HMW de Acrp30, pero no a las especies
globular o de trímeros.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para determinar si las células que sobreexpresan
T-cadherina tienen una respuesta a la estimulación
de Acrp30 alterada por NF-\kappaB, se examinó la
transcripción mediada por NF-\kappaB en células
transitoriamente transfectadas con el plásmido testigo pCDNA3.1 o
con el plásmido pCDNA-T-cadherina
(pCDNA-Tcad) como se describe en Tsao et al
(2002).
Para ensayar la actividad de
NF-\kappaB, se cotransfectó
pCDNA-Tcad con un plásmido que contenía la secuencia
que codifica la luciferasa bajo el control de un agente promotor
E-selectina que codificaba un elemento respuesta a
NF-\kappaB. La construcción
E-selectina luciferasa se generó insertando el
agente promotor E-seleccionado en el gen de
luciferasa que contenía el vector pGL2-básico
(Promega) como describieron Schindler y Baichwal (1994). Se
cotransfectó un tercer plásmido que expresa
beta-galactosidasa también bajo el control del
agente promotor CMV y se usó para normalizar las concentraciones de
expresión. Los plásmidos se transfectaron en células en placas de
24 pocillos. El día siguiente, las células se incubaron durante seis
horas en medios que contenían los compuestos idénticos. La
actividad enzimática de la luciferasa y de la
p-galactosidasa de los lisados de células se
determinaron con un ensayo basado en un luminómetro (Promega). La
señal de la luciferasa se normalizó a la actividad de la
beta-galactosidasa y se representó como el número de
veces de estimulación con relación a las células no estimuladas
transfectadas con las construcciones idénticas.
La figura 4 muestra el número de veces de
estimulación de la transcripción mediada por
NF-\kappaB en miocitos C2C12 no diferenciados. Se
midió la actividad de la luciferasa. La columna 1 muestra el número
de veces de estimulación que sigue al tratamiento de 6 h con medios
solos. La columna 2 muestra el número de veces de estimulación con
adición de 2 ug/mL de la especie de hexámeros de Acrp30. La columna
3 muestra el número de veces de estimulación con adición de 300
ng/mL de LPS. La columna 4 muestra el número de veces de
estimulación con adición de 50 ng/mL de
TNF-\alpha. Se realizaron tres experimentos
independientes.
La columna 1 muestra que la expresión de
T-cadherina suprime la transcripción basal mediada
por NF-\kappaB al 37% de la transcripción mediada
por NF-\kappaB en células testigo. La especie de
hexámeros de Acrp30 (columna 2) a una concentración de 2 ug/ml
estimula 1,8 veces la transcripción mediada por
NF-\kappaB. En células que expresan
T-cadherina, esta estimulación está completamente
suprimida ya que la transcripción mediada por
NF-\kappaB tiene el mismo nivel que en células no
tratadas que expresan T-cadherina. Las columnas 3 y
4 muestran células C2C12 tratadas con 300 ng/mL de LPS (columna 3)
ó 50 ng/mL de TNF-\alpha (columna 4). En ambos
casos hay una estimulación similar de cuatro veces en células
testigo transfectadas, y en ambos casos la estimulación fue
reducida mediante la expresión de T-cadherina. Sin
embargo, la T-cadherina sólo redujo la estimulación
al nivel base de células testigo transfectadas. No hubo más
expresión como fue el caso en células tratadas con la especie de
hexámeros de Acrp30. La expresión de
beta-galactosidasa permaneció inalterable entre
líneas de células de pCDNA y transfectadas con
T-cadherina, indicando que la sobreexpresión de
T-cadherina no condujo a la supresión
transcripcional no específica.
En conclusión, la sobreexpresión de
T-cadherina suprime la transcripción mediada por
NF-\kappaB iniciada por varios estímulos
diferentes, incluyendo la transcripción mediada por
NF-\kappaB iniciada por Acrp30.
1. Arita, Kihara et al.
(1999) "Paradoxical decrease of an
adipose-specific protein, adiponectin, in
obesity" Biochem Biophys Res Commun 257(1):
79-83
2. Berg, Combs et al.
(2001) "The adipocyte-secreted protein
Acrp30 enhances hepatic insulin action" Nat Med
7(8): 947-53
3. Bogan, McKee et al.
(2001) "Insulin-responsive compartments
containing GLUT4 in 3T3-Ll and CHO cells:
regulation by amino acid concentrations" Mol Cell Biol
21(14): 4785-806
4. Castle, Colca et al.
(1993) "Lipoprotein profile characterization of the
KKA(y) mouse, a rodent model of type II diabetes, before and
after treatment with the insulin- sensitizing agent pioglitazone"
Arterioscler Thromb 13(2):302-9
5. Chebath J, Fischer et
al. (1997) "Interleukin-6
receptor-interleukin-6 fusion
proteins with enhanced interleukin-6 type
pleiotropic activities" Eur Cytokine Netw.
8(4):359- 65.
6. Conacci-Sorrell,
Zhurinsky et al. (2002) "The
cadherin-catenin adhesion system in signaling and
cancer" J Clin Invest 109(8):
987-91
7. Doyle, Goings et al.
(1998) "T-cadherin is a major
glycophosphoinositol-anchored protein associated
with noncaveolar detergent-insoluble domains of. the
cardiac sarcolemma" J Biol Chem 273(12):
6937-43
8. Edwards and Leatherbarrow
"Determination of association rate constants by an optical
biosensor. using initial rate analysis" Anal Biochem, 1997
Mar 1;246(1):1-6
9. Elbashir, Harborth et
al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs
mediate RNA interference in cultured mammalian cells Nature,
2001 May 24;411(6836):494-8
10. Ellington and Szostak
(1990) "In vitro selection of RNA molecules that
bind specific ligands" Nature
346(6287):818-22
11. Elliott and Pestronk
(1994) "Progression of multifocal motor neuropathy during
apparently successful treatment with human immunoglobulin"
Neurology. 44(5):967-8.
12. Febbraio and Pedersen
(2002) "Muscle-derived
interleukin-6: mechanisms for activation and
possible biological roles" FASEB J
16(11):1335-47
13. Feinglos, Thacker et
al. (1997) "Modification of postprandial hyperglycemia
with insulin lispro improves glucose control in patients with type
2 diabetes" Diabetes Care,
20(10):1539-42
14. Fields and Song (1989)
"A novel genetic system to detect protein-protein
interactions" Nature
340(6230):245-6 Nature
340:245-6
15. Fromont-Racine,
Rain et al. (1997) Toward a functional analysis
of the yeast genome through exhaustive two-hybrid
screens Nat Genet 16(3):277-82
16. Fruebis, Tsao et al.
(2001) "Proteolytic cleavage product of
30-kDa adipocyte complement-related
protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weight
loss in mice" Proc Natl Mad Sci U S A 98(4):,
2005-10
17. Grantham R (1974) "Amino
acid difference formula to help explain protein evolution"
Science 185(4154):862-4
18. Hara, Boutin et al.
(2002) "Genetic variation in the gene encoding adiponectin
is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the
Japanese population" Diabetes 51(2):
536-40
19. Holman, Cull et al.
(1999) "A randomized double-blind trial of
acarbose in type 2 diabetes shows improved glycemic control over 3
years" Diabetes Care
22(6):960-4
20. Hu, Liang et al.
(1996) "AdipoQ is a novel adipose-specific
gene dysregulated in obesity" J Biol Chem 271(18):
10697-10703
21. Huang, Wu et al.
(2003) "T-cadherin-mediated
cell growth regulation involves G2 phase arrest and requires
p21(CIP1/WAF1) expression" Mol Cell Biol
23(2): 566-78
22. Ivanov, Philippova et
al. (2001) "Expression of cell adhesion molecule
T-cadherin in the human vasculature" Histochem
Cell Biol 115(3): 231-42
23. Knight, Trinh et al.
(1993) "Construction and initial characterization of a
mouse-human chimeric anti-TNF
antibody" Mol Immunol.
30(16):1443-53.
24. Kollet O, Aviram et al.
(1999) "The soluble interleulcin-6
(IL-6) receptor/IL-6 fusion protein
enhances in vitro maintenance and proliferation of human
CD34(+)CD38(-/low) cells capable of repopulating severe combined
immunodeficiency mice" Blood.
94(3):923-31.
25. Kondo, Shimomura et al.
(2002) "Association of adiponectin mutation with type 2
diabetes: a candidate gene for the insulin resistance syndrome"
Diabetes 51(7): 2325-8
26. Kosmidou, Vassilakopoulos
et al. (2002) "Production of
interleukin-6 by skeletal myotubes: role of reactive
oxygen species" Am J Respir Cell Mol Biol
26(5):587-93
27. Lindsay, Funahashi et
al. (2002) "Adiponectin and development of type 2
diabetes in the Pima Indian population" Lancet
360(9326): 57-8
28. Liu, Constantinescu et
al. (2000) "Generation of mammalian cells stably
expressing multiple genes at predetermined levels" Anal
Biochem 280(1):, 20-8
29. Maeda, Okubo et al.
(1996) "cDNA cloning and expression of a novel adipose
specific collagen-like factor, apMl (AdiPose Most
abundant Gene transcript 1)" Biochem Biophys Res Commun
221(2): 286-9
30. Maeda, Shimomura et al.
(2002) "Diet-induced insulin resistance in
mice lacking adiponectin/ACRP30" Nat Med 8(7):
731-7
31. Naviaux, Costanzi et
al. (1996) "The pCL vector system: rapid production of
helper-free, high-titer, recombinant
retroviruses" J Virol 70(8):
5701-5.
32. Niermann, Kern et al.
(2000) "The glycosyl phosphatidylinositol anchor of human
T-cadherin binds lipoproteins" Biochem Biophys
Res Commun 276(3): 1240-7
33. Ogawa, Masuzalci et al.
(1995) "Molecular cloning of rat obese cDNA and augmented
gene expression in genetically obese Zucker fatty (falfa) rats"
J Clin Invest 96(3):1647-52
34. Okamoto, Arita et al.
(2000) "An adipocyte-derived plasma
protein, adiponectin, adheres to injured vascular walls" Horm
Metab Res 32(2): 47-50
35. Panidis, Kourtis et al.
(2003) "Serum adiponectin levels in women with polycystic
ovary syndrome" Hum Reprod.
18(9):1790-6.
36. Pelleymounter, Cullen et
al. (1995) "Effects of the obese gene product on body
weight regulation in ob/ob mice Science
269(5223):540-3"
37. Petridou, Mantzoros et
al. (2003) "Plasma adiponectin concentrations in
relation to endometrial cancer: a case-control
study in Greece" J Clin Endocrinol Metab.
88(3):993-7.
38. Piercy, Toseland et al.
(1998) "Potential benefit of inhibitors of advanced
glycation end products in the progression of type II diabetes: a
study with aminoguanidine in C57BLKsJ diabetic mice"
Metabolism 47(12):1477-80
39. Piercy, Toseland et al.
(2000) "Acceleration of the development of diabetes in
obese diabetic (db/db) mice by nicotinamide: a comparison with its
antidiabetic effects in non-obese diabetic mice"
Metabolism, 2000
Dec;49(12):1548-54
40. Ramsay, Jamieson et al.
(2003) "Paradoxical elevation in adiponectin concentrations
in women with preeclampsia". Hypertension.
42(5):891-4.
41. Rasmussen, Ji et al.
(1997) "Two-dimensional electrophoretic
analysis of human breast carcinoma proteins: mapping of proteins
that bind to the SH3 domain of mixed lineage lcinase MLK2"
Electrophoresis, 1997
Mar-Apr;18(3-4):588-98
\newpage
42. Roth, Mobarhan et al.
(2002) "Syndrome X: where are we and where do we go?"
Nutr Rev 60:335-7 Review
43. Sambrook, Fritsch et
al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY
44. Scherer, Williams et
al. (1995) "A novel serum protein similar to Clq,
produced exclusively in adipocytes" J Biol Chem
270(45): 26746-9
45. Schindler and Baichwal
(1994) Three NF-kappa B binding sites in the
human E-selectin gene required for maximal tumor
necrosis factor alpha-induced expression. Mol
Cell Biol. 14(9):5820-31.
46. Takeuchi, Misaki et al.
(2000) "Expression of T-cadherin (CDH13,
H-Cadherin) in human brain and its characteristics
as a negative growth regulator of epidermal growth factor in
neuroblastoma cells" J Neurochem 74(4):
1489-97
47. Tanihara, Sano et al.
(1994) "Cloning of five human cadherins clarifies
characteristic features of cadherin extracellular domain and
provides further evidence for two structurally different types of
cadherin" Cell Adhes Commun 2(1):
15-26
48. Tkachuk, Bochkov et al.
(1998) "Identification of an atypical
lipoprotein-binding protein from human aortic
smooth muscle as T-cadherin" FEBS Left
421(3):, 208-12
49. Tsao, Murrey et al.
(2002) "Oligomerization state-dependent
activation of NF-kappa B signaling pathway by
adipocyte complement-related protein of 30 kDa
(Acrp30)" J Biol Chem 277(33):
29359-62
50. Tsao, Tomas et al.
(2003) "Role of Disulfide Bonds in Acrp30/Adiponectin
Structure and Signaling Specificity: Different Oligorners Activate
Different Signal Transduction Pathways" J Biol Chem In the
press
51. Ueda, Ikegami et al.
(2000) "Age-dependent changes in phenotypes
and candidate gene analysis in a polygenic animal model of Type II
diabetes mellitus; NSY mouse" Diabetologia
43(7):932-8
52. Xu, Wang et al.
(2003) "The fat-derived hormone adiponectin
alleviates alcoholic and nonalcoholic fatty liver diseases in
mice" J Clin Invest. 2003 Jul;
112(1):91-100.
53. Yamauchi, Kamon et al.
(2003) "Cloning of adiponectin receptors that mediate
antidiabetic metabolic effects" Nature 423(6941):
762-9
54. Yamauchi, Kamon et al.
(2001) "The fat-derived hormone adiponectin
reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and
obesity" Nat Med 7(8): 941-6
55. Yokota, Oritani et al.
(2000) "Adiponectin, a new member of the family of soluble
defense collagens, negatively regulates the growth of myelomonocytic
progenitors and the functions of macrophages" Blood.
96(5):1723-32
56. Zoccali, Mallamaci et
al. (2003) "Adiponectin is markedly increased in
patients with nephrotic syndrome and is related to metabolic risk
factors" Kidney Int Suppl.
84:S98-102.
<110> Whitehead Institute for Biomedical
Research
\hskip1cmHug, Christopher
\hskip1cmodish, Harvey F.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE T-CADHERINA
COMO DIANA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SER-100X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/526.956
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-12-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de la patente 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 713
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> LÍPIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (693).. (693)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ANCLAJE A GPI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PROPEP
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(139)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PROPEP
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (694).. (713)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42).. (107)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio semejante al colágeno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (108)..(244)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio Clq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45).. (110)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio semejante al colágeno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (111)..(247)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio Clq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 714
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> LÍPIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (693).. (693)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ANCLAJE a GPI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PROPEP
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23).. (139)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PROPEP
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (694).. (714)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
Claims (2)
1. Forma soluble de T-cadherina
para el tratamiento de un trastorno metabólico, en la que dicha
forma soluble se selecciona del grupo que consiste en:
- a)
- un polipéptido que consiste en los aminoácidos 23 a 692 de la SEQ ID NO: 1;
- b)
- un polipéptido que consiste en un fragmento de al menos 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ó 650 aminoácidos de (a);
- c)
- una muteína de (a) o (b), en la que la secuencia de aminoácidos tiene al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad con al menos una de las secuencias en (a) o (b);
- d)
- una muteína de (a) o (b) la cual es codificada por un ácido nucleico que se hibrida con el complemento de una secuencia de DNA que codifica a (a) o (b) en condiciones muy rigurosas; y
- e)
- una muteína de (a) o (b) en la que cualquiera de los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos en (a) o (b).
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicho trastorno es un trastorno metabólico seleccionado del grupo
que consiste en la obesidad, la diabetes del tipo II, la resistencia
a la insulina, la hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la
dislipidemia, el síndrome X, la anorexia y la caquexia.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US52695603P | 2003-12-03 | 2003-12-03 | |
US526956P | 2003-12-03 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2320139T3 true ES2320139T3 (es) | 2009-05-19 |
Family
ID=34676687
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04812804T Active ES2320139T3 (es) | 2003-12-03 | 2004-12-02 | Uso de t-cadherina soluble para el tratamiento de trastornos metabolicos. |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070212686A1 (es) |
EP (1) | EP1701978B1 (es) |
JP (1) | JP2007519894A (es) |
AT (1) | ATE422506T1 (es) |
AU (1) | AU2004297914A1 (es) |
CA (1) | CA2546126A1 (es) |
CY (1) | CY1109014T1 (es) |
DE (1) | DE602004019451D1 (es) |
DK (1) | DK1701978T3 (es) |
ES (1) | ES2320139T3 (es) |
HR (1) | HRP20090119T3 (es) |
IL (1) | IL175862A (es) |
NO (1) | NO20062975L (es) |
PL (1) | PL1701978T3 (es) |
PT (1) | PT1701978E (es) |
RS (1) | RS50754B (es) |
SI (1) | SI1701978T1 (es) |
WO (1) | WO2005057222A2 (es) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007082181A2 (en) * | 2006-01-10 | 2007-07-19 | Colgate-Palmolive Company | Methods of modulating cell surface receptors to prevent or reduce inflammation |
AR076041A1 (es) | 2009-04-01 | 2011-05-11 | Colgate Palmolive Co | Biomarcadores de proteina para el diagnostico de enfermedades de tejido blando y como objetivos terapeuticos para intervenciones de cuidado oral |
MX2011009859A (es) | 2009-04-01 | 2011-09-29 | Colgate Palmolive Co | Compuestos derivados de mentol y uso de los mismos como agentes activos orales y sistemicos. |
CA2753658C (en) | 2009-04-01 | 2014-10-28 | Colgate-Palmolive Company | Anti-biofilm carbonate compounds for use in oral care compositions |
TWI405565B (zh) | 2009-04-01 | 2013-08-21 | Colgate Palmolive Co | 口腔用組成物之抗-骨質流失及抗-牙周附連喪失之功效 |
GB201312010D0 (en) * | 2013-07-04 | 2013-08-21 | Univ Birmingham | Receptor Agonists |
WO2016100301A1 (en) * | 2014-12-15 | 2016-06-23 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Use of cadherin-11 antagonists to treat obesity-associated conditions and other metabolic disorders |
CN115485554A (zh) * | 2020-03-03 | 2022-12-16 | 国立大学法人信州大学 | 脂联素的定量方法以及用于该定量方法的分析用试剂 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1023445B1 (de) * | 1997-10-15 | 2005-08-17 | Pharis Biotec GmbH | Cadherin derived growth factor und seine verwendung |
US6472367B1 (en) * | 1998-05-05 | 2002-10-29 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating OB-cadherin mediated cell adhesion |
US6433149B1 (en) * | 1998-05-05 | 2002-08-13 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for inhibiting cancer metastasis |
US6680175B2 (en) * | 1998-05-05 | 2004-01-20 | Adherex Technologies, Inc. | Methods for diagnosing and evaluating cancer |
AU3259901A (en) * | 2000-02-18 | 2001-08-27 | Pharmacia Ab | Transgenic animal model for obesity expressing foxc2 |
US6689938B2 (en) * | 2000-09-13 | 2004-02-10 | Oklajoma Medical Research Foundation | Method for treatment of insulin resistance in obesity and diabetes |
WO2002053726A2 (en) * | 2001-01-02 | 2002-07-11 | Hybrigenics | Protein-protein interactions in adipocyte cells |
EP1627229A2 (en) * | 2003-04-29 | 2006-02-22 | Cytos Biotechnology AG | Methods and compositions for modulating the interaction between adiponectin and its receptor |
JP2007531512A (ja) * | 2003-11-10 | 2007-11-08 | エピゲノミクス アーゲー | 婦人科細胞増殖障害の分析方法 |
-
2004
- 2004-12-02 RS RSP-2009/0221A patent/RS50754B/sr unknown
- 2004-12-02 WO PCT/US2004/040363 patent/WO2005057222A2/en active Application Filing
- 2004-12-02 DK DK04812804T patent/DK1701978T3/da active
- 2004-12-02 SI SI200431083T patent/SI1701978T1/sl unknown
- 2004-12-02 PT PT04812804T patent/PT1701978E/pt unknown
- 2004-12-02 AU AU2004297914A patent/AU2004297914A1/en not_active Abandoned
- 2004-12-02 DE DE602004019451T patent/DE602004019451D1/de active Active
- 2004-12-02 PL PL04812804T patent/PL1701978T3/pl unknown
- 2004-12-02 EP EP04812804A patent/EP1701978B1/en active Active
- 2004-12-02 ES ES04812804T patent/ES2320139T3/es active Active
- 2004-12-02 CA CA002546126A patent/CA2546126A1/en not_active Abandoned
- 2004-12-02 US US10/553,430 patent/US20070212686A1/en not_active Abandoned
- 2004-12-02 JP JP2006542743A patent/JP2007519894A/ja active Pending
- 2004-12-02 AT AT04812804T patent/ATE422506T1/de not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-05-23 IL IL175862A patent/IL175862A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-06-26 NO NO20062975A patent/NO20062975L/no not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-02-24 HR HR20090119T patent/HRP20090119T3/xx unknown
- 2009-04-23 CY CY20091100456T patent/CY1109014T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HRP20090119T3 (en) | 2009-04-30 |
WO2005057222A3 (en) | 2006-02-23 |
EP1701978B1 (en) | 2009-02-11 |
WO2005057222A2 (en) | 2005-06-23 |
IL175862A0 (en) | 2006-10-05 |
EP1701978A2 (en) | 2006-09-20 |
IL175862A (en) | 2010-11-30 |
US20070212686A1 (en) | 2007-09-13 |
RS50754B (sr) | 2010-08-31 |
PL1701978T3 (pl) | 2009-07-31 |
SI1701978T1 (sl) | 2009-08-31 |
NO20062975L (no) | 2006-06-26 |
AU2004297914A1 (en) | 2005-06-23 |
DE602004019451D1 (de) | 2009-03-26 |
DK1701978T3 (da) | 2009-04-06 |
ATE422506T1 (de) | 2009-02-15 |
CY1109014T1 (el) | 2014-07-02 |
CA2546126A1 (en) | 2005-06-23 |
JP2007519894A (ja) | 2007-07-19 |
PT1701978E (pt) | 2009-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lockhart et al. | GDF15: a hormone conveying somatic distress to the brain | |
Verma et al. | Resistin promotes endothelial cell activation: further evidence of adipokine-endothelial interaction | |
BR112013033175A2 (pt) | sequência de peptídeo, subsequência, composição, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, vetor, célula transformada ou hospedeira, método de tratamento de um indivíduo, método para melhorar o metabolismo da glicose em um indivíduo e método para identificar uma sequência peptédica | |
US20090038022A1 (en) | IGF-1 Novel peptides | |
US9878010B2 (en) | Methods of treating metabolic disorders | |
US9072777B2 (en) | Method for screening substance having proangiogenic effect | |
ES2595579T3 (es) | Agente tipo SorCS1 para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina y enfermedades relacionadas con la misma | |
ES2320139T3 (es) | Uso de t-cadherina soluble para el tratamiento de trastornos metabolicos. | |
CN108367018A (zh) | 用于治疗淀粉样变性病的方法和组合物 | |
US20090203610A1 (en) | Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5 | |
TWI359271B (en) | Pharmaceutical composition for insulin resistance | |
EP1359938B1 (en) | Method for treating psoriasis by using an il-17d antagonist | |
KR102240763B1 (ko) | Taz의 pdx1 활성 조절을 통한 혈당 조절 용도 | |
ES2402096T3 (es) | Uso de proteínas relacionadas con saposina para prevenir y tratar la obesidad, diabetes y/o síndrome metabólico | |
ES2392430T3 (es) | Uso de productos de proteínas segregadas DG153 para prevenir y tratar enfermedades pancreáticas y/u obesidad y/o síndrome metabólico | |
US20040115191A1 (en) | Method for treating psoriasis | |
CN108144060A (zh) | 一类通过调控yb-1磷酸化治疗单核细胞趋化蛋白-1参与的疾病的药物及其筛选方法 | |
JP2015514726A (ja) | 肥満及び過体重の処置に用いるSorCS1 | |
CN111944035B (zh) | Fgf4及其应用 | |
CA2694222A1 (en) | Insulin secretion inducer, and accelerator for increasing the number of pancreatic .beta.-cells | |
US8383580B2 (en) | Methods of administering lipocalins to treat metabolic disorders and cardiovascular diseases | |
Zhao | Inflammation requires an anti-inflammatory/regenerating protein REG3 [beta] to induce insulin resistance | |
WO2024036044A1 (en) | Compositions and methods for treating and preventing metabolic disorders | |
JP2005537794A (ja) | エネルギー恒常性の調節に関与するミニブレイン相同タンパク質 | |
ES2396073B1 (es) | Método para inhibir el apetito. |