ES2595579T3

ES2595579T3 - Agente tipo SorCS1 para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina y enfermedades relacionadas con la misma

Info

Publication number: ES2595579T3
Application number: ES10785771.6T
Authority: ES
Inventors: Karen-Marie Pedersen; Anders Nykjaer
Original assignee: Aarhus Universitet
Current assignee: Aarhus Universitet
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2017-01-02
Anticipated expiration: 2030-06-10
Also published as: US20160015778A1; US20170014476A1; CN102647995A; HK1168283A1; EP2440233B1; EP2440233A1; CA2764385A1; AU2010257887A1; CA2764385C; US20120156183A1; US9931374B2; WO2010142296A1; DK2440233T3; US20120207721A1; EP2440233A4; US9387232B2; CN102647995B; US9101117B2; AU2010257887B2; US10172918B2

Abstract

Un agente tipo SorCS1 para su uso en el tratamiento de resistencia a la insulina y/o una enfermedad relacionada con la resistencia a la insulina en un individuo, donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido SorCS1 soluble aislado seleccionado del grupo que consiste en i) una secuencia aminoacídica que consiste en las SEQ ID NO: 5, 10, 15, 21, 27 y 33; ii) una variante de secuencia biológicamente activa o una variante alélica de origen natural de la secuencia aminoacídica de i) donde la variante tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con respecto a dicha SEQ ID NO. 5, 10, 15, 21, 27 o 33; o iii) un fragmento biológicamente activo que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 aa 103-124, SEQ ID NO: 1 aa 125-143, SEQ ID NO: 1 aa 144-162, SEQ ID NO: 1 aa 197-218, SEQ ID NO: 1 aa 391-409, SEQ ID NO: 1 aa 661-684, y la SEQ ID NO: 1 aa 763-783, SEQ ID NO: 1 aa 859-876, o una variante de dicho fragmento, donde la variante tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 aa 103-124, SEQ ID NO: 1 aa 125-143, SEQ ID NO: 1 aa 144-162, SEQ ID NO: 1 aa 197-218, 20 SEQ ID NO: 1 aa 391-409, SEQ ID NO: 1 aa 661-684, y la SEQ ID NO: 1 aa 763-783, SEQ ID NO: 1 aa 859-876; donde dicho polipéptido SorCS1 soluble aislado es capaz de unirse al receptor de insulina en un sitio de unión a SorCS1 y que es capaz de sensibilizar un receptor de insulina, y donde la actividad biológica es la sensibilización de un receptor de insulina, b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en a); c) un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico como se define en b), d) una célula huésped aislada transformada o transducida con el ácido nucleico de b) o el vector de c).

Description

DESCRIPCIÓN

Agente tipo SorCS1 para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina y enfermedades relacionadas con la misma.

5

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de agentes tipo SorCS1, tal como SorCS1 y fragmentos y variantes del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento, reducción o retraso de la resistencia a la insulina en los pacientes. La invención se refiere además al uso de agentes tipo SorCS1, tal como SorCS1 y fragmentos y 10 variantes del mismo, para sensibilizar los receptores de insulina. La invención también se refiere al uso del ratón genomanipulado SorCS1 como un modelo animal de resistencia a la insulina.

Antecedentes de la invención

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El síndrome de resistencia a la insulina.

La prevalencia de la alteración metabólica, comúnmente conocida como síndrome metabólico o síndrome de resistencia a la insulina, ha alcanzado una proporción epidémica en los países industrializados. El síndrome de resistencia a la insulina se refiere a una constelación de hallazgos, incluyendo intolerancia a la glucosa, obesidad, un 20 perfil lipídico alterado (dislipidemia) e hipertensión, que promuevan el desarrollo de diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedad de ovario poliquístico y otros trastornos. En todos estos trastornos, un componente central de la patofisiología es la resistencia a la insulina. Las causas subyacentes de este síndrome son el sobrepeso/obesidad, la inactividad física y una serie de polimorfismos genéticos que actualmente no están todavía bien definidos (revisado en 1+2). Las intervenciones del estilo de vida y el tratamiento farmacológico de las 25 patologías del síndrome son sólo parcialmente eficaces y se necesitan urgentemente nuevos enfoques terapéuticos.

Insulina y resistencia a la insulina.

La insulina es una hormona producida por las células β en los islotes de Langerhans en el páncreas. La liberación de 30 insulina se estimula según aumentan los niveles de glucosa en sangre la y glucosa se elimina de la sangre por la estimulación dependiente de la insulina de los transportadores de la glucosa situados en las membranas celulares del tejido diana, en particular en el tejido adiposo, el músculo esquelético y el hígado. La insulina ejerce sus efectos biológicos uniéndose a y activando el receptor de insulina unido a membrana (IR), iniciando así una cascada de eventos de señalización intracelulares, que regula múltiples procesos biológicos, tales como el metabolismo de la 35 glucosa y lipídico, la expresión génica, la síntesis de proteínas y procesos no metabólicos, tales como el crecimiento celular y la diferenciación. Los diversos efectos de la activación del IR están mediados a través de un complejo de señalización multicomponente que se ensambla tras la unión de la insulina. Así, la actividad de la tirosina cinasa de la proteína intrínseca del IR da como resultado la autofosforilación de varios residuos de tirosina, seguido de la captación y fosforilación de varios sustratos de proteína intracelulares incluyendo las proteínas de sustrato del IR 40 (IRS) y las proteínas que contienen homología-2 con Scr (Shc). Esto inicia la activación de dos vías principales de señalización: la vía fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K)-AKT/proteína cinasa B (PKB), que es responsable de la mayor parte de las acciones metabólicas, incluyendo la translocación del transportador de glucosa GLUT4 a la membrana celular y la estimulación de la síntesis de glucógeno, y la vía de proteína cinasa activada por Ras-mitógeno (MAPK), que regula la expresión de algunos genes y coopera con la vía (PI3K)-AKT para controlar el crecimiento celular y la 45 diferenciación (revisado en 3-8).

La capacidad de la insulina para estimular la eliminación de glucosa varía continuamente a lo largo de una población de personas aparentemente sanas, y existe una diferencia de ≥ 600 % entre los más sensibles a la insulina y las personas con más resistencia a la insulina. Sin embargo, la tercera parte de la población que es más resistente a la 50 insulina presenta un riesgo mucho mayor de desarrollar varias anomalías y síndromes clínicos, incluyendo diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, ictus, hígado graso no alcohólico, enfermedad de ovario poliquístico, y ciertas formas de cáncer (revisado en 9)

Se dice que los individuos son "resistentes a la insulina" debido a que sus tejidos se comportan como si no hubiera suficiente insulina en el torrente sanguíneo como se refleja en la disminución de la respuesta a la insulina y la 55 captación de glucosa en el hígado, el tejido adiposo y el esquelético músculo. La primera respuesta a la resistencia a la insulina es una producción de compensación y la secreción de insulina para compensar la sensibilidad disminuida del cuerpo, lo que conduce a la hiperinsulinemia. Por lo tanto, los niveles altos de insulina y una respuesta disminuida del tejido a la eliminación de la glucosa del torrente sanguíneo caracterizan la resistencia a la insulina. La resistencia a la insulina es el evento principal que conduce a una serie de cambios metabólicos que incluyen hiperinsulinemia compensatoria, dislipidemia, descompensación de las células beta pancreáticas e hiperglucemia (revisado en 6-8).

Diabetes tipo 2 y resistencia a la insulina. 5

La diabetes tipo 2 (diabetes no dependiente de insulina) es un trastorno complejo y heterogéneo asociado a un mayor riesgo de mortalidad, así como de morbilidad. La incidencia es cada vez mayor y la enfermedad afecta actualmente a más de 150 millones de personas en todo el mundo, por lo que es una preocupación pública importante. El trastorno es una enfermedad poligénica compleja prototípica con un fuerte componente hereditario, 10 pero también está fuertemente influenciado por factores ambientales tales como, por ejemplo, la obesidad. La patogénesis de la diabetes tipo 2 implica el desarrollo progresivo de la resistencia a la insulina en el hígado y el tejido periférico acompañado de la secreción de insulina defectuosa desde las células beta pancreáticas que conduce a una hiperglucemia manifiesta (una cantidad anormalmente alta de los niveles de glucosa en sangre). La primera respuesta a la resistencia a la insulina es una producción compensatoria y la secreción de insulina para 15 compensar la disminución de la sensibilidad del cuerpo, lo que conduce a hiperinsulinemia y a convertir prediabético al individuo. Sin embargo, cuando el páncreas de un individuo resistente a la insulina no es capaz de producir hormona suficiente para compensar el aumento de la demanda, en última instancia, la masa de las células β se agotará y se degenerará conduciendo a hiperglucemia y diabetes tipo 2 manifiesta (revisado en 4 y 5). Por lo tanto, la diabetes tipo 2 sólo se desarrolla en individuos que son incapaces de mantener la respuesta a la insulina 20 compensatoria de células β. Estos sujetos tienen islotes "susceptible", a diferencia de "robustos", una afección determinada por factores genéticos y/o factores adquiridos, ex obesidad (figura 4).

La identificación de un péptido/proteína que pueda restablecer el metabolismo de la glucosa y tratar la resistencia a la insulina presenta una perspectiva muy alentadora como nuevas dianas terapéuticas en el tratamiento 25 potencialmente combinado de diabetes tipo 2, síndrome metabólico y otras enfermedades caracterizadas por resistencia a la insulina.

El receptor SorCS1.

30

SorCS1 es uno de los cinco miembros de la familia de receptores del dominio Vps10p mamífero (Vps10p-D), que también comprende Sortilina, SorLA, SorCS2 y SorCS3. Son todos receptores transmembrana de tipo 1 que comparten la función estructural característica de un Vps10p-D N-terminal con alta homología a Vps10p, una proteína de clasificación en la levadura (10). En la actualidad la función o funciones fisiológicas de la familia de receptores no está clara, pero los recientes hallazgos indican que tanto la Sortilina como SorLA tienen una función 35 crucial como reguladores de la supervivencia y la muerte neuronal (11, 12). De forma interesante, la Sortilina también se ha asociado a la captación de glucosa regulada por la insulina, ya que puede facilitar la traslocación del transportador de glucosa GLUT4 desde un compartimento intracelular a la membrana plasmática (13,14).

SorCS1 es único entre los receptores Vps10p-D, ya que existe en varias variantes de splicing distintas, 40 representadas SorCS1- a, b, c, c+ y d, que codifican las partes extracelulares y transmembrana idénticas, y los dominios citoplasmáticos que difieren en longitud y secuencia (10, 11). Los presentes inventores, y otros han descubierto que SorCS1, además de en el sistema nervioso, se expresa en el tejido adiposo, el músculo esquelético y las células β del páncreas; todos los tejidos implicados en el metabolismo de la glucosa. Además, cada variante de splicing muestra una distribución tisular distinta, así como un patrón de expresión subcelular que sugiere que las 45 variantes de cola pueden estar implicadas en diferentes actividades biológicas (15-17).

Resumen de la invención

Los presentes inventores han estudiado el efecto de SorCS1 y sus diferentes variantes de splicing en el tratamiento 50 de la resistencia a la insulina en ratones, y el efecto de SorCS1 y las diferentes variantes de splicing en la expresión del receptor de insulina usando estudios celulares y, en consecuencia, en un aspecto principal, la presente invención se refiere a un agente tipo SorCS1 para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina y/o una enfermedad relacionada con la resistencia a la insulina en un individuo, donde dicho agente es capaz de unirse al receptor de insulina (IR) en un sitio de unión a SorCS1 y que es capaz de sensibilizar un receptor de insulina. 55

SorCS1 es uno de cinco miembros de la familia de receptores del dominio Vps10p mamífero (Vps10p-D), que también comprende Sortilina, SorLA, SorCS2 y SorCS3 (figura 1). SorCS1 murino es único entre los receptores Vps10p-D ya que existe en varias variantes de splicing distintas, representadas como mSorCS1- a, b, c, c+ y d (figura 2)

En resumen, los inventores han demostrado que en los ratones genomanipulados que carecen de todas las variantes de splicing de mSorCS1, los ratones macho ancianos son hiperinsulinémicos pero prediabéticos, mientras que los ratones hembra genomanipulados SorCS1 ancianos son hiperglucémicos e hiperinsulinémicos, volviéndose 5 de este modo ambos diabéticos con la edad, como consecuencia de la resistencia a la insulina en los ratones transgénicos. Además, los inventores han demostrado que el SorCS1 murino se une al receptor de insulina y que mSorCS1 regula la expresión del receptor de insulina.

Además, la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se ha definido 10 anteriormente, para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina en un individuo, así como un vector, una célula huésped y una línea celular de empaquetamiento que comprende el ácido nucleico con fines de tratamiento.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más del 15 agente como se ha definido anteriormente; o la secuencia de ácido nucleico aislada como se ha definido anteriormente; o el vector de expresión como se ha definido anteriormente; o una composición de células huésped como se ha definido anteriormente; o una línea celular de empaquetamiento como se ha definido anteriormente, o una combinación de los mismos.

20

Además, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina, comprendiendo dicho método administrar a un individuo que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del agente como se ha definido anteriormente; o la secuencia de ácido nucleico aislada como se ha definido anteriormente; o el vector de expresión como se ha definido anteriormente; o una composición de células huésped como se ha definido anteriormente; o una línea 25 celular de empaquetamiento como se ha definido anteriormente, o una combinación de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de regulación ascendente de un receptor de insulina o un fragmento o variante del mismo, en un paciente que necesita el mismo, comprendiendo dicho método administrar a un individuo que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del agente como se ha definido 30 anteriormente; o la secuencia de ácido nucleico aislada como se ha definido anteriormente; o el vector de expresión como se ha definido anteriormente; o una composición de células huésped como se ha definido anteriormente; o una línea celular de empaquetamiento como se ha definido anteriormente, o una combinación de los mismos.

Se desvela un método que comprende administrar un receptor del dominio Vps10p seleccionado del grupo que 35 consiste en:

a) SorCS1

b) SorCS2

c) SorCS3 40

d) Sortilina y

e) SorLA,

siendo así útil en un método de tratamiento de resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina. 45

Las enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina se seleccionan, en particular, del grupo que consiste en síndrome de resistencia a la insulina, diabetes mellitus tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, síndrome metabólico, hiperglucemia, hiperinsulinemia, arteriosclerosis, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, dislipidemia, obesidad, obesidad central, síndrome del ovario poliquístico, hipercoagulabilidad, hipertensión, 50 microalbuminuria, síndrome de resistencia a la insulina (SRI), diabetes mellitus tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, el síndrome metabólico, hiperglucemia, e hiperinsulinemia.

Se desvela un kit en partes que comprende:

55

- una composición farmacéutica como se define en el presente documento,

- un instrumento médico u otro medio para administrar dicha composición farmacéutica,

- instrucciones sobre cómo usar el kit en partes.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de detección que emplea un ratón genomanipulado transgénico en el que los genes SorCS1 del receptor del dominio Vps10p endógeno se han alterado para suprimir la expresión de un receptor SorCS1 funcional, y donde dicho ratón muestra una respuesta reducida a la insulina con respecto a un ratón de control no transgénico. En un aspecto importante adicional, la invención se refiere a un método para detectar la capacidad del agente tipo SorCS1 para reducir los niveles de 5 glucosa en sangre, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un primer y un segundo ratón transgénico;

b) administrar a dicho primer ratón transgénico un agente candidato, y

c) administrar a dicho segundo ratón transgénico una solución fisiológica, y 10

d) tomar muestras de sangre del ratón de b) y c) respectivamente, en intervalos de tiempo predeterminados, tal como en 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 y 4 horas, posteriores a la administración de dicho agente, y

e) comparar los niveles de glucosa en sangre en las muestras de d); donde una reducción en el nivel de glucosa en sangre de dicho primer ratón transgénico al que se administró dicho agente candidato con respecto a dicho segundo ratón transgénico al que no se administró dicho agente candidato indica que el agente candidato reduce los niveles 15 de glucosa en sangre.

En un aspecto importante adicional, la invención se refiere a un método para detectar la capacidad del agente tipo SorCS1 para reducir los niveles de glucosa en sangre, comprendiendo dicho método las etapas de:

20

a) proporcionar un primer y un segundo ratón de tipo silvestre; y

b) administrar a dicho primer ratón el agente de la reivindicación 1, y

c) administrar a dicho segundo ratón una solución fisiológica, y

d) tomar muestras de sangre de los dos ratones de b) y c) respectivamente, en intervalos de tiempo predeterminados, tal como en 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 y 4 horas, posteriores a la administración de 25 dicho agente, y

e) comparar los niveles de glucosa en plasma en las muestras de d); donde una reducción en el nivel de glucosa en sangre de dicho primer ratón de tipo silvestre al que se administró dicho agente con respecto a dicho segundo ratón de tipo silvestre al que no se administró dicho agente candidato, indica que el agente reduces los niveles de glucosa en sangre. 30

Se desvela un ratón transgénico capaz de codificar SorCS1 soluble y/o de longitud completa de una manera específica de los tejidos, tras la activación de la expresión.

Se desvela el uso de un agente capaz de mejorar la actividad de unión entre SorCS1 o un fragmento o variante del 35 mismo, y un receptor de insulina para el tratamiento de la resistencia a la insulina y/o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina.

Breve descripción de los dibujos

40

Figura 1. La familia de receptores del dominio Vps10p. Se indica su organización estructural.

Figura 2. Variantes de splicing de mSorCS1. A) Organización del gen SorCS1 murino que conduce a la generación de diferentes colas citoplasmáticas. B) Secuencias aminoacídicas de los dominios citoplasmáticos mSorCS1.

Figura 3. Expresión de las diferentes variantes de splicing mSorCS1. Los fragmentos obtenidos por RT-PCR en ARNm de diferente tejido con pares de cebadores específicos usados para identificar la parte extracelular de 45 SorCS1 (extra) o cada una de las cinco variantes de cola (a, b, c, c+ y d).

Figura 4. Generación del ratón genomanipulado mSorCS1. A) Estrategia usada para generar ratones genomanipulados mSorCS1 por recombinación homóloga en células madre embrionarias. B) Análisis de la expresión de ARNm en mSorCS1, que carece de transcripción de todas las variantes de splicing mSorCS1. C) Análisis de Western blot del córtex que muestra la falta de proteína mSorCS1 en los ratones genomanipulados (KO) mSorCS1. 50

Figura 5. Glucosa en sangre promedio en ratones A) macho y B) hembra a diferente edad. Los animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h). Se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y la glucosa plasmática se midió inmediatamente en un monitor automático.

Figura 6. Niveles de insulina en plasma en ratones genomanipulados hembra de tipo silvestre y SorCS1 de 10 a 50 semanas de edad. Los animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h). Se obtuvieron muestras de 55 sangre por sangrado retroorbital y los niveles de insulina en plasma se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina de ratón ultrasensible.

Figura 7. Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones genomanipulados SorCS1 y crías de la misma camada de tipo silvestre. Ratones de 59 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h) y se les inyectó por vía intraperitoneal un bolo de glucosa (2 mg/g de peso corporal) en una solución salina estéril. Se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital en los tiempos 0, 15, 30, 60 y 120 min después de la inyección, y se midieron los niveles de A) glucosa y B) insulina en plasma. Los datos son medias ± SEM para cuatro ratones en cada grupo.

Figura 8. Niveles elevados de glucosa e insulina en plasma en ayunas en ratones de tipo silvestre en dieta de tipo 5 occidental. Ratones hembra A) + C) y macho B) + D) de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 se alimentaron con una dieta de occidental hipercalórica (WD) de 10 semanas de edad a 50 semanas de edad. A las 50 semanas de edad, los animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h), se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y se midieron los niveles de glucosa plasmática A) + B) e insulina plasmática C) + D). Los datos son medias ± SEM para 4 a 10 ratones en cada grupo. 10

Figura 9. Tejido adiposo abdominal en ratones de tipo silvestre y genomanipulados alimentados con una dieta de tipo occidental.

Ratones hembra A) y macho B) de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 se alimentaron con una dieta de occidental hipercalórica (WD) de 10 semanas de edad a 50 semanas de edad. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y la grasa abdominal (tejido adiposo) se separó y se pesó. Los datos son medias ± SEM para 4 a 10 15 ratones en cada grupo.

Figura 10. Expresión de IR, IR fosforilado (pY-IR) y Glut4 en tejido muscular y adiposo. Ratones hembra genomanipulados SorCS1 (-/-) y ratones de control de tipo silvestre (+/+) de 50 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía intraperitoneal insulina (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. Se analizó el tejido A) adiposo y el B) tejido muscular 20 (100 µg) por western blotting con anti-IR, anti-IR-pY, anti-Glut y anti-actina como control de carga.

Figura 11. Interacción física entre el receptor SorCS1 y de insulina. A) Las células CHO transfectadas con los receptores indicados (únicamente transitorios transfectados con IRA e IRB) se estimularon con insulina y se inmunoprecipitaron con IR, y se analizaron por western blotting usando α-SorCS1-leu y α-IR, respectivamente. B) Experimento de resonancia de plasmones superficiales (BIAcore) que muestra la interacción directa de la parte 25 extracelular soluble de longitud completa de SorCS1 con el receptor de insulina soluble inmovilizado (IR). La Kd se estima de aproximadamente 5 nM.

Figura 12. Expresión del receptor de insulina en células CHO transfectadas con SorCS1. Los lisados celulares de células CHO y células CHO que expresan de forma estable mSorCS1-A, mSorCS1-B, mSorCS1-C, mSorCS1-D y msol.SorCS1 (la parte extracelular de SorCS1) se sometieron a SDS-PAGE y análisis Western blot usando anti-IR, 30 anti-SorCS1-leu y anti-actina como un control de carga.

Figura 13: Expresión de IR y SorCS1 en la membrana celular. Las células CHO y las células CHO que expresan de forma estable mSorCS1-B y mSorCS1-C se sometieron a biotinilación superficial seguida de SDS-PAGE y análisis Western blot usando anti-IR, anti-SorCS1-leu y anti-actina como un control de carga. Los carriles Bio contienen proteínas superficiales biotiniladas, los carriles Intra contienen proteínas intracelulares, y los lisados 35 celulares (lysat) se usaron como control de entrada.

Figura 14: Fases de desarrollo hacia diabetes tipo 2 en el ser humano. Se ilustran en el gráfico (línea de color negro) aumentos de la concentración de glucosa en sangre durante el desarrollo de T2D, mostrando el cambio de normal a prediabético, antes del inicio de una diabetes evidente. Además, el nivel de insulina durante el desarrollo de T2D se revela en el mismo gráfico (línea discontinua), que muestra un aumento de la insulina durante el estado 40 prediabético como compensación a la resistencia a la insulina y un grave descenso de la liberación de insulina al inicio de una diabetes evidente como consecuencia de fallo en las células β.

Figura 15: Inmunotinción de insulina de los islotes pancreáticos en ratones de tipo silvestre y genomanipulados de 20 días de edad. Los páncreas se extrajeron, se fijaron en paraformaldehído, se crioseccionaron y se inmunotiñeron con anticuerpo anti-insulina. Se muestran imágenes representativas. 45

Figura 16: Alineamiento de SorCS1

Alineamiento de secuencia de SorCS1 de origen humano (homo sapiens), de chimpancé (Pan troglodytes), vaca (Bos Taurus), ratón (Mus musculus), rata (Rattus norvegicus), perro (Canis lupus familiaris) y pollo (Gallus gallus). La identidad de secuencia es como se demuestra en la tabla 2.

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Tabla 2: Identidad de secuencia con respecto a SorCS1 humano

Especie: Proteína (% de identidad) ADN (% de identidad)

Ser Humano: 100 100

Chimpancé: 99,6 99,4

Perro: 97,6 92,5

Vaca: 92,9 89,8

Ratón: 93,2 87,7

Rata: 93,2 88,0

Pollo: 85,3 79,7

Figura 17: Descenso de los niveles de glucosa en plasma en ratones hembra de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 después de la sobreexpresión hepática de SorCS1 soluble.

A ratones hembra genomanipulados SorCS1 o de tipo silvestre se les inyectó un adenovirus para la expresión hepática de SorCS1 humano soluble o un virus de control que codifica LacZ. El día de la inyección (0 d), así como 5 7 días después de la administración del virus (7 d), se determinó la glucosa en plasma en ratones en ayunas 16 h. La figura muestra la glucosa en plasma relativa después de la normalización con respecto a los valores obtenidos el día 0. (n = 4). La figura muestra que la sobreexpresión de SorCS1 soluble (el dominio extracelular) reduce la glucosa en plasma tanto en ratones de tipo silvestre como en ratones genomanipulados SorCS1.

Figura 18: Expresión de IR, IR fosforilado, y Glut4 en tejido muscular y adiposo de ratones hembra 10 genomanipulados SorCS1 que sobreexpresan SorCS1 soluble.

A ratones hembra genomanipulados SorCS1 (-/-) de 40 semanas de edad se les inyectó un vector adenoviral que expresaba SorCS1 soluble humano o LacZ como control. Doce días después de la inyección del virus, los ratones se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía intraperitoneal insulina (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. Se analizaron 50 µg de lisados de tejido 15 muscular (A) y adiposo (B) por western blotting con anti-IR, anti-IR-pY y anti-Glut4. La figura muestra que el tratamiento con un virus que codifica SorCS1 aumenta la expresión de IR, la fosforilación de IR, así como la expresión de Glut4.

Figura 19: Descenso de los niveles en plasma de glucosa e insulina en ratones hembra diabéticos db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble. 20

A ratones hembra obesos con diabetes tipo 2 hembra db/db de 10 semanas de edad se les inyectó un adenovirus que expresaba SorCS1 soluble humano o LacZ como control. El día 0 (d 0) antes de la infección con el virus y 7 días después (d 7), se obtuvieron muestras de sangre de ratones en ayunas durante una noche (16 h) por sangrado retroorbital y se midieron los niveles de glucosa en sangre (A) y de insulina en plasma (B). Los datos son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo y se presentan como valores relativos en comparación con el día 0. Los ratones 25 tratados con el virus SorCS1, pero no con el virus LacZ, muestran un aumento de la sensibilidad a la insulina como se refleja por la reducción de los niveles en plasma de glucosa e insulina. El aumento tanto de glucosa como de insulina en plasma del día 0 al 7 en el grupo LacZ refleja que los animales están en proceso de desarrollar diabetes.

Figura 20: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones hembra diabéticos db/db con sobreexpresión de SorCS1 soluble. 30

A ratones en ayunas hembra db/db se les inyectó 3 días después de la infección adenovirus que expresaban SorCS1 soluble o LacZ por vía intraperitoneal un bolo de glucosa (2 mg/g de peso corporal) en una solución salina estéril. Se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital en los tiempos 0, 15, 30, 90 y 150 min después de la inyección, y se midieron los niveles de glucosa en sangre. Los valores son media ± SEM para 5 ratones en cada grupo. El experimento muestra que la glucosa en sangre inicial se restaura en 150 min en ratones que 35 recibieron el virus sol-SorCS1, mientras que se mantiene la hiperglucemia en ratones tratados con el virus LacZ.

Figura 21: Niveles en plasma de glucosa e insulina en ratones macho diabéticos db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble.

A ratones macho obesos db/db de 6 semanas de edad se les inyectó adenovirus que expresaba SorCS1 soluble humano o LacZ como control. El día 0 y 7, los ratones se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h), se 40 obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y se midieron los niveles de glucosa en sangre (A) y de insulina en plasma (B). Los datos son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo y se presentan como cambio relativo con respecto al día 0. La figura muestra que el tratamiento con el virus SorCS1 aumenta la sensibilidad a la glucosa según desciende la glucosa en plasma, mientras que los niveles de insulina son similares a los de ratones que recibieron el virus LacZ. El aumento de la insulina en plasma del día 0 al 7 en ambos grupos refleja que los 45 animales están en proceso de desarrollar diabetes. Durante el transcurso del experimento, aún pueden compensar una reducción de la sensibilidad a la insulina aumentando la producción de insulina.

Figura 22: Localización subcelular de Glut4 en el tejido muscular de ratones macho db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble.

Los microsomas ligeros aislados por fraccionamiento subcelular del tejido muscular de cinco ratones macho db/db 50 después de la sobreexpresión de SorCS1 soluble o lacZ se fraccionaron en un gradiente de velocidad de sacarosa de 0,8 M a 1,6 M. Las fracciones de gradiente se sometieron a electroforesis en gel y se inmunotransfirieron con un anticuerpo Glut4, identificando así la localización de Glut4 en las diferentes fracciones. El experimento muestra que la expresión de SorCS1 cambia la localización subcelular de Glut4, en línea con una función importante de SorCS1 en la regulación de la captación de glucosa. 55

Figura 23: Análisis de secuencias de contacto SorCS1/IR por análisis SPOT.

A) Péptidos aminoacídicos 16-mer consecutivos solapados por tres residuos del receptor de insulina humano se descubrieron sobre los filtros. Posteriormente, los filtros se incubaron con los dominios extracelulares radiomarcados de SorCS1 murino, y la unión se detectó por auto-radiografía. Se indican posibles sitios de unión a SorCS1 en el receptor de insulina.

B) Péptidos aminoacídicos 16-mer consecutivos solapados por tres residuos de SorCS1-a humano se descubrieron sobre los filtros y se sondaron para la unión al receptor de insulina usando un receptor soluble marcado con his. Los 5 péptidos capaces de unirse a SorCS1-a se visualizaron por Western blotting usando un anticuerpo contra la etiqueta de histidina. Se indican posibles secuencias de unión en SorCS1-a.

Figura 24: Perfil de expresión génica del tejido adiposo de ratones genomanipulados SorCS1 por matrices de PCR. 10

La expresión génica en tejido adiposo genomanipulado SorCS1 en comparación con el tejido adiposo de tipo silvestre se examinó para A) 84 genes relacionados con la ruta de señalización de insulina de ratón y B) 84 genes relacionados con la señalización de lipoproteína de ratón y metabolismo de colesterol. Los genes en los genomanipulados SorCS1 que son 3 veces superiores o inferiores que en los ratones de tipo silvestre se enumeran y se indican sus supuestas funciones. 15

Descripción detallada de la invención

Definiciones

20

A menos que se indique específicamente otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Para los fines de la presente invención, se definen los siguientes términos.

Adyuvante: Cualquier sustancia cuya mezcla con un determinante inmunogénico/antígeno administrado aumenta o 25 modifica de otro modo la respuesta inmune a dicho determinante.

Afinidad: La interacción de la mayoría de los ligandos con sus sitios de unión puede caracterizarse en cuando a una afinidad de unión. En general, la unión de los ligandos de alta afinidad resultante de una mayor fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor mientras que la unión del ligando de baja afinidad implica menos fuerza intermolecular 30 entre el ligando y su receptor. En general, la unión de alta afinidad implica un tiempo de residencia más largo para el ligando en su sitio de unión al receptor que en el caso de la unión de baja afinidad. La unión de alta afinidad de ligandos a los receptores es a menudo fisiológicamente importante cuando algo de la energía de unión se puede utilizar para provocar un cambio conformacional en el receptor, dando como resultado un comportamiento alterado de un canal de iones asociado o enzima. 35

Un ligando que puede unirse a un receptor, alterar la función del receptor y desencadenar una respuesta fisiológica se denomina un agonista para ese receptor. La unión agonista a un receptor puede caracterizarse tanto en cuanto a cuánto se puede activar la respuesta fisiológica como en cuanto a la concentración del agonista que se requiere para producir la respuesta fisiológica. La unión al ligando de alta afinidad implica que una concentración relativamente 40 baja de un ligando es adecuada para ocupar al máximo un sitio de unión a ligando y desencadenar una respuesta fisiológica. La unión de baja afinidad implica que se requiere una concentración relativamente alta de un ligando antes de que el sitio de unión esté ocupado al máximo y se consigue la máxima respuesta fisiológica al ligando. La unión del ligando a menudo se caracteriza en cuando a la concentración de ligando a la que la mitad de los sitios de unión a receptores están ocupados, conocida como la constante de disociación (kd). La afinidad también es la 45 resistencia de la unión entre los receptores y sus ligandos, por ejemplo entre un anticuerpo y su antígeno.

Alcohol: Una clase de compuestos orgánicos que contienen uno o más grupos hidroxilo (OH). En este contexto, un grupo hidrocarburo saturado o insaturado, ramificado o no ramificado que está situado como un sustituyente en una molécula más grande. 50

Grupo alicíclico: La expresión "grupo alicíclico" se refiere a un grupo hidrocarburo cíclico que tiene propiedades parecidas a las de los grupos alifáticos.

Grupo alifático: En el contexto de la presente invención, la expresión "grupo alifático" se refiere a un grupo 55 hidrocarburo saturado o insaturado y lineal o ramificado. Esta expresión se usa para incluir grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, por ejemplo.

Grupo alquilo: La expresión "grupo alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o lineal saturado que incluye, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, t-butilo, heptilo, dodecilo, octadecilo, amilo, 2-etilhexilo, y similares.

Grupo alquenilo: La expresión "grupo alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o lineal insaturado con uno o más dobles enlaces carbono-carbono, tal como un grupo vinilo.

5

Grupo alquinilo: La expresión "grupo alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o lineal insaturado con uno o más triples enlaces carbono-carbono.

Anfífilo: Sustancia que contiene tanto grupos polares, solubles en agua como no polares insolubles en agua.

10

Agonista: Un agonista es un compuesto capaz de aumentar o efectuar la actividad de un receptor. Especialmente, un agonista del receptor del dominio Vps10p es un compuesto capaz de unirse a uno o más de los sitios de unión de un receptor de dominio Vps10p, induciendo así la misma respuesta fisiológica que un compuesto ligando de agonista endógeno dado.

15

Antagonista: Un antagonista es en este caso sinónimo de un inhibidor. Un antagonista es un compuesto capaz de disminuir la actividad de un efector tal como un receptor. En concreto, un antagonista del receptor de dominio Vps10p es un compuesto capaz de unirse a uno o más de los sitios de unión del receptor de dominio Vps10p inhibiendo así la unión de otro ligando, inhibiendo de esta manera una respuesta fisiológica.

20

Anticuerpo: El término "anticuerpo", como se hace referencia en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadena sencilla del mismo. Anticuerpo policlonal: Los anticuerpos policlonales son una mezcla de moléculas de anticuerpo que reconocen un antígeno dado específico, por lo tanto, los anticuerpos policlonales pueden reconocer diferentes epítopos en dicho antígeno. 25

Grupo aromático: El término "grupo aromático" o "grupo arilo" se refiere a un grupo hidrocarburo aromático mono o policíclico.

Unión: El término "unión" se refiere a una condición de proximidad entre entidades químicas o compuestos, o 30 porciones de los mismos. La asociación puede ser no covalente - donde la yuxtaposición está energéticamente favorecida por enlaces de hidrógeno o de van der Waals o interacciones electrostáticas - o puede ser covalente. Los agentes de acuerdo con la invención son capaces de unirse al receptor de insulina. Un ensayo para la unión puede ser el ensayo Biocore analizado en relación con la figura 11B, así como el ensayo co.IP analizado en relación con la figura 11A. 35

Sitio de unión: El término "sitio de unión" o "bolsillo de unión", como se usa en el presente documento, se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado de su forma, se asocia favorablemente con otra molécula, complejo molecular, entidad química o compuesto. Como se usa en el presente documento, el bolsillo comprende al menos una cavidad profunda y, opcionalmente, una cavidad superficial. 40

Agente bioreactivo o biológicamente activo o actividad biológica: Los términos, como se usan en el presente documento, se refieren al efecto de cualquier sustancia que puede usarse junto con una aplicación que es terapéutica, o de otro modo útil, de acuerdo con esta invención. La actividad biológica se refiere al efecto biológico in vitro y/o in vivo. En el presente contexto, la actividad biológica de un agente es la capacidad de unirse al receptor de 45 insulina y/o mejorar la unión de un agente tipo SorCS1 al receptor de insulina, y la actividad biológica incluye la sensibilización del receptor de insulina. Los agentes bioactivos pueden neutros, con carga positiva o carga negativa. Los agentes bioactivos adecuados incluye, por ejemplo, profármacos, agentes de diagnóstico, agentes terapéuticos, agentes farmacéuticos, fármacos, agentes de suministro de oxígeno, sustitutos de la sangre, moléculas orgánicas sintéticas, polipéptidos, péptidos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides y determinantes genéticos, 50 incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.

Grupo catiónico: Un grupo químico capaz de funcionar como un donante de protones cuando un compuesto que comprende el grupo químico se disuelve en un disolvente, preferiblemente cuando se disuelve en agua.

55

Complejo: Como se usa en el presente documento, el término "complejo" se refiere a la combinación de una molécula o una proteína, análogos de conservantes o truncamientos del mismo asociados a una entidad química.

Grupo cíclico: La expresión "grupo cíclico" se refiere a un grupo hidrocarburo de anillo cerrado que se clasifica como un grupo alicíclico, grupo aromático o grupo heterocíclico.

Cicloalquenilo: Se refiere a un radical carbocíclico insaturado monovalente que consiste en uno, dos o tres anillos, de tres a ocho carbonos por anillo, que puede opcionalmente estar sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquenilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, 5 alqueniltio, halo, haloalquenilo, hidroxialquenilo, nitro, alcoxicarbonenilo, amino, alquenilamino, alquenilsulfonilo, arilsulfonilo, alquenilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquenilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquenilcarbonilamino y arilcarbonilamino.

Cicloalquilo: Se refiere a un radical carbocíclico saturado monovalente que consiste en uno, dos o tres anillos, de 10 tres a ocho carbonos por anillo, que puede opcionalmente estar sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alquiltio, halo, haloalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino y arilcarbonilamino. 15

Interacción electrostática: La expresión "interacción electrostática", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier interacción que ocurre entre componentes cargados, moléculas o iones, debido a las fuerzas de atracción cuando componentes de carga eléctrica opuesta se atraen entre sí. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: interacciones iónicas, interacciones covalentes, interacciones entre un ión y un dipolo (ión y molécula 20 polar), interacciones entre dos dipolos (cargas parciales de moléculas polares), enlaces de hidrógeno y enlaces de dispersión de London (dipolos inducidos de moléculas polarizables). Por lo tanto, por ejemplo, "interacción iónica" o "interacción electrostática" se refiere a la atracción entre una primera molécula con carga positiva y una segunda molécula con carga negativa. Las interacciones iónicas o electrostáticas incluyen, por ejemplo, la atracción de entre un agente bioactivo con carga negativa. 25

Formar un anillo: Significa que los átomos mencionados se conectan a través de un enlace cuando se forma la estructura anular.

Fragmentos: Los fragmentos polipeptídicos, incluyendo cualquier equivalente funcional de los mismos, pueden 30 comprender menos de 500 residuos aminoacídicos, tal como menos de 450 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 400 residuos aminoacídicos, tal como menos de 350 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 300 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 250 residuos aminoacídicos, tal como menos de 240 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 225 residuos aminoacídicos, tal como menos de 200 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 180 residuos aminoacídicos, tal como menos de 160 residuos aminoacídicos, por ejemplo, 35 menos de 150 residuos aminoacídicos, tal como menos de 140 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 130 residuos aminoacídicos, tal como menos de 120 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 110 residuos aminoacídicos, tal como menos de 100 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 90 residuos aminoacídicos, tal como menos de 85 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 80 residuos aminoacídicos, tal como menos de 75 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 70 residuos aminoacídicos, tal como menos de 65 residuos 40 aminoacídicos, por ejemplo, menos de 60 residuos aminoacídicos, tal como menos de 55 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 50 residuos aminoacídicos, tal como menos de 45 residuos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 40 residuos aminoacídicos, tal como 35 residuos aminoacídicos, por ejemplo 30 residuos aminoacídicos, tal como 25 residuos aminoacídicos, tal como 20 residuos aminoacídicos, por ejemplo 15 residuos aminoacídicos, tal como 10 residuos aminoacídicos, por ejemplo 5 residuos aminoacídicos contiguos de una secuencia aminoacídica 45 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51, o una variante de la misma, que es al menos un 70 % idéntica a dichas secuencias. Además, los fragmentos polipeptídicos, incluyendo cualquier equivalente funcional de los mismos, pueden comprender más de 5 residuos aminoacídicos, tal como más de 10 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 15 residuos aminoacídicos, tal 50 como más de 20 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 25 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 50 residuos aminoacídicos, tal como más de 75 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 100 residuos aminoacídicos, tal como más de 125 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 150 residuos aminoacídicos, tal como más de 175 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 200 residuos aminoacídicos, tal como más de 225 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 250 residuos aminoacídicos, tal como más de 275 residuos 55 aminoacídicos, por ejemplo más de 300 residuos aminoacídicos, tal como más de 325 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 350 residuos aminoacídicos, tal como más de 375 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 400 residuos aminoacídicos, tal como más de 425 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 450 residuos aminoacídicos, tal como más de 475 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 500 residuos aminoacídicos, tal como más de 525 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 550 residuos aminoacídicos, tal como más de 575 residuos aminoacídicos, por ejemplo más de 600 residuos aminoacídicos, tal como 625 residuos aminoacídicos, por ejemplo 650 residuos aminoacídicos, tal como 675 residuos aminoacídicos, tal como 700 residuos aminoacídicos de una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 5 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51, o una variante de la misma, que es al menos un 70 % idéntica a dichas secuencias.

Equivalencia funcional: La "equivalencia funcional" se establece por medio de la referencia a la funcionalidad correspondiente de un fragmento predeterminado de la secuencia. 10

Los equivalentes funcionales o variantes de un polipéptido SorCS1, o un fragmento del mismo, se entenderá que muestran secuencias aminoacídicas que difieren gradualmente del polipéptido SorCS1 predeterminado preferido o la secuencia del fragmento SorCS1 respectivamente, como el número y alcance de las inserciones, deleciones y sustituciones, incluyendo el aumento de las sustituciones conservativas, conservando al mismo tiempo la actividad 15 biológica de un polipéptido SorCS1 en este contexto. Esta diferencia se mide como una reducción de homología entre la secuencia predeterminada preferida y el fragmento o equivalente funcional.

Una variante funcional obtenida por la sustitución, así puede exhibir alguna forma o grado de actividad de SorCS1 nativo, y sin embargo, ser menos homóloga, si se sustituyen los residuos que contienen cadenas laterales de 20 aminoácidos funcionalmente similares. Funcionalmente similar en este sentido se refiere a características dominantes de las cadenas laterales tal como hidrófobo, básico, neutro o ácido, o la presencia o ausencia de volumen estérico. Por consiguiente, en una realización de la Invención, el grado de identidad no es una medida principal de un fragmento que es una variante o equivalente funcional de un fragmento predeterminado preferido de acuerdo con la presente invención. 25

"Silenciamiento" génico: Un proceso que conduce a la reducción de la expresión de genes endógenos. El silenciamiento génico es preferiblemente el resultado de la reducción post-transcripcional de la expresión génica.

Grupo: (Resto/sustitución) como se entiende bien en esta área técnica, un gran grado de sustitución no sólo es 30 tolerado, sino que a menudo es recomendable. La sustitución se prevé en los materiales de la presente invención Como un medio para simplificar el análisis y la mención de cierta terminología usada a lo largo de toda esta solicitud, los términos "grupo" y "resto" se usan para diferenciar entre especies químicas que permiten la sustitución o que pueden sustituirse y los que no permiten o no puede ser así sustituidos. Por lo tanto, cuando el término "grupo" se usa para describir un sustituyente químico, el material químico descrito incluye el grupo no sustituido y ese grupo 35 con átomos de O, N o S, por ejemplo, en la cadena, así como grupos carbonilo u otra sustitución convencional. Cuando se usa el término "resto" para describir un compuesto químico o sustituyente, sólo tiene la intención de ser incluido un material químico no sustituido. Por ejemplo, la expresión "grupo alquilo" pretende incluir no sólo sustituyentes alquilo de hidrocarburo saturado de cadena abierta puros, tal como metilo, etilo, propilo, t-butilo, y similares, sino también sustituyentes alquilo que llevan otros sustituyentes conocidos en la técnica, tal como hidroxi, 40 alcoxi, alquilsulfonilo, átomos de halógeno, ciano, nitro, amino, carboxilo, etc. Por lo tanto, "grupo alquilo" incluye grupos éter, haloalquilos, nitroalquilos, carboxialquilos, hidroxialquilos, sulfoalquilos, etc. Por otra parte, la frase "resto alquilo" se limita a la inclusión de solamente sustituyentes alquilo de de hidrocarburos saturados de cadena abierta puros, tal como metilo, etilo, propilo, t-butilo, y similares. Las mismas definiciones se aplican a "grupo alquenilo" y "resto alquenilo"; a "grupo alquinilo" y "resto alquinilo"; a "grupo cíclico" y "resto cíclico"; a "grupo 45 alicíclico" y "resto alicíclico"; a "grupo aromático" o "grupo arilo" y a "resto aromático" o "resto arilo", así como a "grupo heterocíclico" y "resto heterocíclico".

Grupo heterocíclico: La expresión "grupo heterocíclico" se refiere a un hidrocarburo de anillo cerrado en el que uno o más de los átomos en el anillo es un elemento distinto de carbono (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.). 50

Heterociclilo se refiere a un radical cíclico saturado monovalente, que consiste en uno a dos anillos, de tres a ocho átomos por anillo, incorporando uno o dos heteroátomos anulares (elegidos entre N, O o S(O)0-2, y que puede opcionalmente estar sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, oxo, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alquiltio, halo, haloalquilo, hidroxialquilo, nitro, 55 alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminofarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino o arilcarbonilamino.

Heteroarilo se refiere a un radical cíclico aromático monovalente que tiene de uno a tres anillos, de cuatro a ocho átomos por anillo, incorporando uno o dos heteroátomos (elegidos entre nitrógeno, oxígeno o azufre) dentro del anillo, que puede opcionalmente estar sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alquiltio, halo, haloalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, 5 alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino y arilcarbonilamino.

Homología: La homología entre secuencias de aminoácidos puede calcularse utilizando matrices de puntuación bien conocidas tal como una cualquiera de BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, 10 BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 y BLOSUM 90.

Los fragmentos que comparten homología con fragmentos de las SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51, respectivamente, son preferiblemente al menos aproximadamente un 15 60 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 65 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 70 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 75 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 80 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 85 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 90 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 92 por ciento homólogos, tal como al menos un 94 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 95 por ciento homólogos, tal como al menos un 96 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 97 por ciento 20 homólogos, tal como al menos un 98 por ciento homólogos, por ejemplo al menos un 99 por ciento homólogos con dichas secuencias de fragmentos predeterminadas, respectivamente. De acuerdo con una realización de la invención, los porcentajes de homología se refieren a los porcentajes de identidad.

Un procedimiento más adecuado para determinar las relaciones de estructura y función de los fragmentos de 25 péptidos se describe en el documento US 6.013.478. Además, los procedimientos de ensayo de la unión de una secuencia de aminoácidos a un resto del receptor se conocen por el experto en la técnica.

Además de las sustituciones conservadoras introducidas en cualquier posición de un polipéptido SorCS1 predeterminado preferido, o un fragmento del mismo, también puede ser deseable introducir sustituciones no 30 conservativas en una cualquiera o más posiciones de tal polipéptido SorCS1, o un fragmento del mismo.

Una sustitución no conservativa que conduce a la formación de un fragmento funcionalmente equivalente de un polipéptido SorCS1, o un fragmento del mismo, por ejemplo i) diferirá sustancialmente en la polaridad, por ejemplo un residuo con una cadena lateral no polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe o Met) sustituido por un residuo con 35 una cadena lateral polar tal como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, o Gln o un aminoácido cargado tal como Asp, Glu, Arg, o Lys, o sustituyendo un residuo polar o cargado por uno no polar; y/o ii) diferirá sustancialmente en su efecto sobre la orientación de la estructura polipeptídica, tal como la sustitución de o por Pro o Gly por otro resto; y/o iii) diferirá sustancialmente en la carga eléctrica, por ejemplo, la sustitución de un residuo con carga negativa tal como Glu o Asp por un residuo con carga positiva tal como Lys, His o Arg (y viceversa ); y/o iv) diferirá sustancialmente en 40 volumen estérico, por ejemplo la sustitución de un residuo voluminoso tal como His, Trp, Phe o Tyr por uno que tenga una cadena lateral menor, por ejemplo, Ala, Gly o Ser (y viceversa).

Las variantes obtenidas por sustitución de aminoácidos pueden fabricarse en una realización preferida en base a los valores de hidrofilicidad y hidrofobicidad y la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, 45 incluyendo carga, tamaño, y similares. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares que toman varias de las características anteriores en consideración se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Además de las variantes descritas en el presente documento, se pueden formular variantes estéricamente similares 50 para imitar las partes clave de la estructura variante y que tales compuestos también se pueden utilizar de la misma manera que las variantes de la invención. Esto se puede conseguir mediante técnicas de modelado y diseño químico conocidas por los expertos en la técnica.

Se desvelan variantes funcionales que comprenden aminoácidos sustituidos que tienen valores hidrófilos o índices 55 hidropáticos que están dentro de +/-4,9, por ejemplo dentro de +/-4,7, tal como dentro de +/-4,5, por ejemplo dentro de +/-4,3, tal como dentro de +/-4,1, por ejemplo dentro de +/-3,9, tal como dentro de +/-3,7, por ejemplo dentro de +/- 3,5, tal como dentro de +/-3,3, por ejemplo dentro de +/- 3,1, tal como dentro de +/- 2,9, por ejemplo dentro de +/- 2,7, tal como dentro de +/-2,5, por ejemplo dentro de +/-2,3, tal como dentro de +/- 2,1, por ejemplo dentro de +/- 2,0, tal como dentro de +/- 1,8, por ejemplo dentro de +/- 1,6, tal como dentro de +/- 1,5, por ejemplo dentro de +/- 1,4, tal como dentro de +/- 1,3 por ejemplo dentro de +/- 1,2, tal como dentro de +/- 1,1, por ejemplo dentro de +/-1,0, tal como dentro de +/- 0,9, por ejemplo dentro de +/- 0,8, tal como dentro de +/- 0,7, por ejemplo dentro de +/- 0,6, tal como dentro de +/- 0,5, por ejemplo dentro de +/- 0,4, tal como dentro de +/- 0,3, por ejemplo dentro de +/- 0,25, tal como dentro de +/- 0,2 del valor del aminoácido que ha sustituido. 5

La importancia de los índices de aminoácidos hidropáticos e hidrófilos en la transmisión de la función biológica interactiva en una proteína se entiende bien en la técnica (Kyte & Doo-little, 1982 y Hopp, Pat. de Estados Unidos n.º 4.554.101.

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Los valores del índice hidropático aminoacídico como se usan en el presente documento son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7 ); serina (-0,8 ); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5) (Kyte & Doolittle, 1982).

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Los valores de hidrofilicidad aminoacídica son: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0,+-,1); glutamato (+3,0,+-,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5,+-,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4) (documento U.S. 4.554.101).

20

Además de los compuestos peptídicos descritos en el presente documento, se pueden formular compuestos estéricamente similares para imitar las partes clave de la estructura peptídica y que tales compuestos también se pueden usar de la misma manera que los péptidos de la invención. Esto se puede conseguir mediante técnicas de modelado y diseño químico conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la esterificación y otras alquilaciones pueden emplearse para modificar el extremo terminal amino de, por ejemplo, una estructura peptídica 25 di-arginina, para imitar una estructura tetra peptídica.

También se desvelan péptidos con alquilaciones del extremo terminal N y esterificaciones del extremo terminal C. Los equivalentes funcionales comprenden también conjugados agregados o covalentes y glicosilados formados con los mismos u otros polipéptidos SorCS1, o fragmentos de los mismos, incluyendo dímeros o restos químicos no 30 relacionados. Tales equivalentes funcionales se preparan mediante unión de funcionalidades a grupos que se encuentran en el fragmento incluyendo en uno cualquiera o ambos de los extremos terminales N y C por procedimientos conocidos en la técnica.

Por lo tanto, los equivalentes funcionales pueden comprender fragmentos conjugados con ésteres alifáticos o de 35 acilo o amidas del extremo terminal carboxilo, alquilaminas o residuos que contengan cadenas laterales de carboxilo, por ejemplo, conjugados con alquilaminas en los residuos de ácido aspártico; derivados O-acilo de residuos que contienen grupo hidroxilo y derivados N-acilo del aminoácido terminal amino o residuos que contienen grupo amino, por ejemplo, conjugados con fMet-Leu-Phe o proteínas inmunogénicas. Los derivados de los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo (incluyendo cicloalquilo normal de C3 a C10), formando así especies 40 alcanoílo, compuestos carbocíclicos o heterocíclicos, formando de así aroílo. Los grupos reactivos preferiblemente son compuestos disfuncionales conocidos per se por su uso en la reticulación de proteínas para generar matrices insolubles a través de grupos laterales reactivos.

Los equivalentes funcionales covalentes o de agregación y derivados de los mismos son útiles como reactivos en 45 inmunoensayos o para procedimientos de purificación por afinidad. Por ejemplo, un fragmento de un polipéptido SorCS1 de acuerdo con la presente invención puede insolubilizarse por unión covalente con Sefarosa activada con bromuro de cianógeno por procedimientos conocidos per se o adsorberse a superficies de poliolefina, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para su uso en un ensayo o purificación de anticuerpos moduladores de la actividad de anti-SorCS1 o receptores de superficie celular. Los fragmentos también pueden etiquetarse con un 50 grupo detectable, por ejemplo, radioyodado mediante el procedimiento de cloramina T, unido covalentemente a quelatos de tierras raras o conjugado con otro resto fluorescente para su uso, por ejemplo, en ensayos de diagnóstico

La mutagénesis de un polipéptido SorCS1 predeterminado preferido, o un fragmento del mismo, puede realizarse 55 haciendo inserciones de aminoácidos, usualmente en el orden de aproximadamente de 1 a 10 residuos aminoacídicos, preferiblemente de aproximadamente 1 a 5 residuos aminoacídicos, o supresiones de aproximadamente 1 a 10 residuos, tal como de aproximadamente 2 a 5 residuos.

En una realización el ligando del sitio de unión 1, 2 o 3 es un oligopéptido sintetizado por síntesis automatizada. Pueden emplearse cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles en el mercado, tal como el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento (véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963).

5

El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible en el mercado en proveedores tal como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, CA, y generalmente pueden operarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La síntesis en fase sólida permitirá la incorporación de sustituciones de aminoácidos deseables en cualquier fragmento de SorCS1 de acuerdo con la presente invención. Se entenderá que pueden combinarse sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier subcombinación de las mismas para llegar a una secuencia de 10 final de un equivalente funcional. Se entenderá que las inserciones incluyen fusiones del extremo terminal carboxilo y/o extremo terminal amino, por ejemplo, con una proteína hidrófoba o inmunógena o un vehículo, tal como cualquier estructura polipeptídica o andamiada capaz de servir como un vehículo.

También se proporcionan oligómeros, incluyendo los dímeros que incluyen homodímeros y heterodímeros de 15 fragmentos de inhibidores de sortilina.

Los polipéptidos y fragmentos SorCS1, equivalentes funcionales y variantes de los mismos se pueden producir como homodímeros o heterodímeros con otras secuencias aminoacídicas o con inhibidores de secuencias inhibidoras de sortilina nativas. Los heterodímeros incluyen dímeros que contienen fragmentos inhibidores de la sortilina 20 inmunorreactiva, así como fragmentos inhibidores de la sortilina que no necesitan tener o ejercer ninguna actividad biológica. Los polipéptidos SorCS1, o fragmentos y variantes de los mismos, pueden sintetizarse tanto in vitro como in vivo. Se conocen bien métodos para la síntesis in vitro, también se describen métodos que son adecuados o convenientemente adaptables a la síntesis in vivo de inhibidores de sortilina. Cuando se sintetiza in vivo, una célula huésped se transforma con vectores que contienen ADN codificando un inhibidor peptídico de sortilina o un 25 fragmento del mismo. Un vector se define como una construcción de ácido nucleico replicable. Los vectores se usan para mediar la expresión de los polipéptidos SorCS1, y/o fragmentos y variantes. Un vector de expresión es una construcción de ADN replicable en la que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el fragmento de inhibidor de sortilina predeterminado, o cualquier equivalente funcional del mismo que se puede expresar in vivo, está unido operativamente a secuencias de control adecuadas capaces efectuar la expresión del fragmento o equivalente en un 30 huésped adecuado. Tales secuencias de control se conocen bien en la técnica. Tanto las células eucariotas como las procariotas pueden usarse para la síntesis de ligandos.

Sin embargo, los cultivos de células obtenidas a partir de organismos multicelulares representan células huésped preferidas. En principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores es factible, ya sea cultivo de vertebrados o 35 de invertebrados. Los ejemplos de líneas celulares huésped útiles son células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), y WI38, BHK, COS-7, 293 y líneas celulares MDCK. Las células huésped preferidas son células eucariotas conocidas para sintetizar inhibidores de sortilina endógenos. Los cultivos de tales células huésped pueden aislarse y usarse como fuente del fragmento, o se usan en los métodos terapéuticos de tratamiento, incluyendo los métodos terapéuticos destinados a promover o inhibir un estado de crecimiento, o 40 métodos de diagnóstico realizados en el cuerpo humano o animal.

Enlace hidrófobo: El término "enlace de hidrógeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una fuerza de atracción, o puente, que puede ocurrir entre un átomo de hidrógeno que está unido covalentemente a un átomo electronegativo, por ejemplo, oxígeno, azufre, o nitrógeno, y otro átomo electronegativo. El enlace de hidrógeno se 45 puede producir entre un átomo de hidrógeno en una primera molécula y un átomo electronegativo en una segunda molécula (enlace de hidrógeno intermolecular). Además, el enlace de hidrógeno puede producirse entre un átomo de hidrógeno y un átomo electronegativo que están contenidos ambos en una sola molécula (enlace de hidrógeno intramolecular).

50

Interacción hidrófoba: La expresión "interacción hidrófoba", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier interacción que ocurre entre componentes básicamente no polares (hidrófobos) ubicados dentro del intervalo de atracción entre sí en un entorno polar (como el agua). Como se usa en el presente documento, el intervalo de atracción se encuentra en la escala de 0,1 hasta 2 nm. Un tipo particular de interacción hidrófoba es la ejercida por las "fuerzas de Van der Waals", es decir, las fuerzas atractivas entre moléculas no polares explicadas 55 por mecánica cuántica. Las fuerzas de Van der Waals en general están asociadas a momentos dipolares momentáneos que son inducidos por moléculas vecinas y que implican cambios en la distribución de electrones.

Insulina: La insulina es una hormona que se produce por las células beta del páncreas. La insulina producida se libera en el torrente sanguíneo y se transporta por todo el cuerpo. La insulina es una hormona importante que tiene muchas acciones en el cuerpo. La mayor parte de las acciones de la insulina se dirigen al metabolismo (control) de carbohidratos (azúcares y almidones), lípidos (grasas), y proteínas. La insulina también es importante en la regulación de las células del cuerpo, incluyendo su crecimiento.

5

Resistencia a la insulina: La resistencia a la insulina (IR) es una afección en la que las células del cuerpo se vuelven resistentes a los efectos de la insulina, es decir, la respuesta normal a una cantidad determinada de insulina se reduce. Como resultado, son necesarios mayores niveles de insulina para que la insulina tenga sus efectos. La resistencia a la insulina precede al desarrollo de diabetes tipo 2, a menudos en varios años. En individuos que desarrollarán en última instancia diabetes tipo 2, se cree que los niveles de glucosa e insulina en sangre son 10 normales durante muchos años; después, en algún momento en el tiempo, se desarrolla resistencia a la insulina. Por consiguiente, se prefiere el tratamiento de la causa de la resistencia a la insulina sobre el tratamiento de los síntomas de la diabetes. La presente invención tiene el objetivo principalmente de proporcionar un medicamento para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina.

15

In vitro/in vivo: Los términos se usan con su significado normal.

Ligando: Una sustancia, compuesto o biomolécula tal como una proteína que incluye receptores, que es capaz de unirse a y formar un complejo con (una segunda) biomolécula para servir a un propósito biológico. En un sentido más estricto, es una unión de una molécula que produce señales a un sitio en una proteína diana, por fuerzas 20 intermoleculares tal como enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals. El acoplamiento (asociación) es generalmente reversible (disociación). La unión covalente irreversible real entre un ligando y su molécula diana es rara en los sistemas biológicos. A diferencia del significado en la química inorgánica y metalorgánica, es irrelevante si el ligando realmente se une a un sitio de metal o no, como es el caso de la hemoglobina. La unión del ligando a los receptores puede alterar la conformación química, es decir, la forma 25 tridimensional de la proteína del receptor. El estado conformacional de una proteína del receptor determina el estado funcional de un receptor. La tendencia o la fuerza de unión se denomina afinidad. Los ligandos incluyen sustratos, inhibidores, activadores, no auto receptores, co-receptores y neurotransmisores.

Agente farmacéutico: Los términos "agente farmacéutico" o "fármaco" o "medicamento" se refieren a cualquier uso 30 terapéutico o profiláctico de un agente de acuerdo con la invención, cuyo agente puede usarse en el tratamiento (incluyendo la prevención, diagnóstico, alivio o curación) de un trastorno, aflicción, afección, enfermedad o lesión en un paciente. Los determinantes genéticos terapéuticamente útiles, péptidos, polipéptidos y polinucleótidos pueden incluirse dentro del significado del término farmacéutico o fármaco. Como se define en el presente documento, un "agente terapéutico", "agente farmacéutico" o "fármaco" o "medicamento" es un tipo de agente bioactivo. 35

Composición farmacéutica: o fármaco, medicamento o agente se refiere a cualquier material químico o biológico, compuesto, o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Algunos medicamentos se venden en una forma inactiva que se convierte in vivo en un metabolito con actividad farmacéutica. Para los fines de la presente invención, las expresiones "composición farmacéutica" y 40 "medicamento" incluyen preferiblemente un agente activo tal cual o un fármaco inactivo y el metabolito activo.

Polipéptido: El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende al menos dos aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos. Los "oligopéptidos" se definen en el presente documento como polipéptidos de longitud no superior a 100 aminoácidos. El término 45 "polipéptido" también pretende incluir proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, estos pueden formar complejos, estar unidos covalentemente o pueden no estar unidos covalentemente. Los polipéptidos en una proteína pueden glicosilarse y/o lipidarse y/o pueden comprender grupos protésicos.

50

Polinucleótido: "Polinucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende al menos dos ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden ser de origen natural o modificados, tal como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o ácidos nucleicos peptídicos (PNA). El polinucleótido, como se usa en el presente documento, en general se aplica a

55

i) un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación predeterminada, o

ii) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos predeterminada, o

iii) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por los polinucleótidos (i) o (ii) , donde dicho fragmento tiene al menos una actividad predeterminada como se especifica en el presente documento; y

iv) un polinucleótido cuya hebra complementaria se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los puntos (i), (ii) y (iii), y codifica un polipéptido, o un fragmento del mismo, que tiene al menos una actividad predeterminada como se especifica en el presente documento; y

v) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se degenera convirtiéndose en la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos (iii) o (iv); 5

o la hebra complementaria de tal polinucleótido.

Prediabetes: Prediabetes se refiere a los estados metabólicos intermedios entre la homeostasis de la glucosa normal y diabética. Comprende dos estados distintos, los de la glucosa en ayunas alterada (IFG) y la tolerancia a la glucosa alterada (IGT), o una combinación de ambos, pero por sí misma no es diabetes. Por lo tanto, es una afección en la 10 que el nivel de glucosa en sangre es superior al normal, pero no lo suficientemente alto para clasificarse como diabetes tipo 2.

Anticuerpo purificado: La expresión un "anticuerpo purificado" es un anticuerpo al menos el 60 por ciento en peso del cual está libre de los polipéptidos y moléculas orgánicas de origen natural con las que naturalmente se asocia. 15 Preferiblemente, la preparación de anticuerpo comprende anticuerpo en una cantidad de al menos el 75 por ciento en peso, más preferiblemente al menos el 90 por ciento en peso, y mucho más preferiblemente al menos el 99 por ciento en peso.

Desviación media cuadrática: La expresión "desviación media cuadrática" (rmsd) se usa como medio de 20 comparación de dos estructuras estrechamente relacionadas, y se refiere a una desviación en la distancia entre átomos relacionados de las dos estructuras después de minimizar estructuralmente esta distancia en un alineamiento. Las proteínas relacionadas con estructuras estrechamente relacionadas se caracterizarán por valores de RMSD relativamente bajos, mientras que mayores diferencias darán como resultado un aumento del valor de la RMSD. 25

Sensibilización del receptor de insulina: La expresión "sensibilización del receptor de insulina" se usa para explicar que se prefiere que los agentes de acuerdo con la invención sean capaces de estabilizar el receptor de insulina, y preferiblemente, también aumentar la cantidad de receptores de insulina. La sensibilización del receptor de insulina puede medirse administrando un agente de acuerdo con la invención y después realizando una prueba de tolerancia 30 a la glucosa, como se analiza en relación con la figura 20. Además, la sensibilización puede evaluarse evaluando la cantidad de receptores de insulina antes y después de la administración del agente de acuerdo con la invención, por lo que un aumento es indicativo de la sensibilización del receptor de insulina. Además, la sensibilización puede evaluarse evaluando la cantidad de receptores de insulina activados, es decir, los receptores de insulina fosforilados. Además, la sensibilización también puede evaluarse midiendo la afinidad entre la insulina y el receptor de insulina, 35 ya que un aumento de la afinidad es una indicación de sensibilización.

Identidad de secuencia: La identidad de secuencia se determina en una utilizando fragmentos de polipéptidos SorCS1 que comprenden al menos 25 aminoácidos contiguos y que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, tal como un 85 %, por ejemplo un 90 %, tal como un 95 %, por ejemplo un 99 % idéntica a la 40 secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51 respectivamente, donde identidad porcentual se determina con el algoritmo GAP, BESTFIT o FASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, usando pesos de espacios por defecto.

45

Las siguientes expresiones se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia predeterminada", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial".

El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo por el 50 algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, por la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, 55 el que produce el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado por diversos métodos.

Aplicado a los polipéptidos, un grado de identidad de secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos idénticos en posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos. Un grado de homología o similitud de secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos, es decir, estructuralmente relacionados, en posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos.

Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte una identidad menor del 40 %, pero preferiblemente una 5 identidad menor del 25 %, con una de las secuencias de polipéptido SorCS1 de la presente invención. La expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineadas de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT que usan los pesos de huecos por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento o más (por ejemplo, una identidad de 10 secuencia del 99 por ciento). Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticos difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la intercambiabilidad de restos que tiene cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, 15 valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos 20 conservativas preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina.

Adicionalmente, las variantes también se determinan basándose en un número predeterminado de sustituciones de aminoácidos conservativas como se define en el presente documento más adelante. La sustitución de aminoácidos 25 conservativa como se usa en el presente documento, se refiere a la sustitución de un aminoácido (dentro de un grupo predeterminado de aminoácidos) por otro aminoácido (dentro del mismo grupo), donde los aminoácidos presentan características similares o sustancialmente similares.

Dentro del significado de la expresión "sustitución de aminoácido conservativa" como se aplica en el presente 30 documento, un aminoácido se puede sustituir por otro dentro de los grupos de aminoácidos indicados en el presente documento a continuación:

i) Aminoácidos que tienen cadenas laterales polares (Asp, GIu, Lys, Arg, His, Asn, GIn, Ser, Thr, Tyr y Cys) , 35

ii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares (Gly, Ala, Val, Leu, lle, Phe, Trp, Pro y Met)

iii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (Gly, Ala Val, Leu, Ile)

iv) Aminoácidos que tienen cadenas laterales cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro)

v) Aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (Phe, Tyr, Trp)

vi) Aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (Asp, GIu) 40

vii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (Lys, Arg, His)

viii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida (Asn, GIn)

ix) Aminoácidos que tienen cadenas laterales con hidroxi (Ser, Thr)

x) Aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre (Cys, Met) ,

xi) Aminoácidos neutros, débilmente hidrófobos (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr) 45

xii) Aminoácidos ácidos, hidrófilos (GIn, Asn, GIu, Asp) , y

xiii) Aminoácidos hidrófobos (Leu, Ile, Val)

Por consiguiente, una variante o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención, puede comprender, dentro de la misma variante de la secuencia o fragmentos de la misma, o entre diferentes variantes de la secuencia o 50 fragmentos de la misma, al menos una sustitución, tal como una pluralidad de sustituciones introducidas independientemente entre sí.

Se desprende de la descripción anterior que la misma variante o fragmento de la misma puede comprender más de una sustitución de aminoácido conservativa de más de un grupo de aminoácidos conservativos como se define en el 55 presente documento anteriormente.

La adición o eliminación de al menos un aminoácido puede ser una adición o eliminación preferiblemente de 2 a 250 aminoácidos, tal como de 10 a 20 aminoácidos, por ejemplo de 20 a 30 aminoácidos, tal como de 40 a 50 aminoácidos. Sin embargo, también se desvelan adiciones o eliminaciones de más de 50 aminoácidos, tal como adiciones de 50 a 100 aminoácidos, adición de 100 a 150 aminoácidos, adición de 150-250 aminoácidos.

La eliminación y/o la adición puede ser, independientemente entre sí, una eliminación y/o una adición dentro de una secuencia y/o en el extremo de una secuencia. 5

Agente tipo SorCS1: La expresión "un agente tipo SorCS1", como se usa en el presente documento se refiere a cualquier agente capaz de imitar estructuralmente el receptor del dominio Vps10p SorCS1, teniendo así el mismo o similar efecto biológico sobre el receptor de insulina, como el efecto demostrado en el presente documento por los presentes inventores. Por consiguiente, como el agente tipo SorCS1 puede ser un péptido, un polipéptido, una 10 molécula orgánica pequeña, siRNA, siDNA, moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido. En una realización preferida, el agente tipo SorCS1 es un fragmento SorCS1, preferiblemente SorCS1 soluble humano (SEQ ID NO: 15), o un precursor del mismo.

Alquilo inferior sustituido se refiere a un alquilo inferior que tiene de uno a tres sustituyentes seleccionados del grupo 15 que consiste en hidroxilo, alcoxi, amino, amido, carboxilo, acilo, halógeno, ciano, nitro y tiol.

Tratamiento: El término "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a un método que implica terapia, incluyendo cirugía de una afección clínica en un individuo, incluyendo un cuerpo humano o animal. La terapia puede ser de mejora, curativa o profiláctica, es decir, que reduce los síntomas mentales y conductuales. 20

Variantes: El término "variantes", como se usa en el presente documento, se refiere a variantes de secuencia aminoacídica, teniendo dichas variantes preferiblemente al menos un 60 % de identidad, por ejemplo al menos un 63 % de identidad, tal como al menos un 66% de identidad, por ejemplo al menos un 70 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 72 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 75 % de identidad de 25 secuencia, por ejemplo al menos un 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 85 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 90 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 91 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 91 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 92 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 93 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 94 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 95 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 96 % de identidad de 30 secuencia, por ejemplo al menos un 97 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 98 % de identidad de secuencia, por ejemplo un 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias predeterminadas.

Las variantes incluyen preferiblemente los fragmentos mostrados para unirse al receptor de insulina, véase, por ejemplo, la figura 23B y/o partes de la secuencia SorCS1 conservada de una especie a otra, véase, por ejemplo, la 35 figura 13.

Regulación por aumento de la expresión: Un proceso que conduce a un aumento de la expresión de genes, preferiblemente de genes endógenos.

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Resistencia a la insulina

La resistencia a la insulina (IR) es una afección en la que las células del cuerpo se vuelven resistentes a los efectos de la insulina, es decir, la respuesta normal a una cantidad determinada de insulina se reduce. Como resultado, son necesarios mayores niveles de insulina para que la insulina tenga sus efectos. La resistencia se observa con la 45 insulina del propio cuerpo (endógena) y si la insulina se administra mediante inyección (exógena).

Existen probablemente varias causas de la resistencia a la insulina, y como se ha descrito en el presente documento anteriormente, hay un fuerte factor genético. La IR inducida por fármacos puede ser una causa adicional. Además, la resistencia a la insulina a menudo se observa en las siguientes condiciones: el síndrome metabólico, obesidad, 50 embarazo, infección o enfermedad grave y estrés durante el uso de esteroides. Los tratamientos de resistencia a la insulina en estas condiciones son aspectos de la presente invención.

La relación entre la resistencia a la insulina y la diabetes es como se indica a continuación. La diabetes tipo 2, es el tipo de diabetes que se produce normalmente más adelante en la vida. La resistencia a la insulina precede al 55 desarrollo de diabetes tipo 2, a veces varios años. En individuos que desarrollarán finalmente diabetes tipo 2, se cree que los niveles de glucosa e insulina en sangre son normales durante muchos años; entonces, en al algún punto en el tiempo, se desarrolla la resistencia a la insulina más probablemente causada por el sobrepeso/obesidad, inactividad física y/o una serie de polimorfismos genéticos aún no definidos actualmente. Por consiguiente, se prefiere el tratamiento de la causa de la resistencia a la insulina sobre el tratamiento de los síntomas de la diabetes. La presente invención tiene el objeto principal de proporcionar un medicamento para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina.

Como se conoce bien por los expertos en la técnica, una de las acciones de la insulina es hacer que las células del 5 cuerpo, particularmente los hepatocitos y otras células del hígado, las células musculares y de grasa, eliminen y usen la glucosa de la sangre. De esta manera, la insulina controla el nivel de glucosa en sangre. La insulina tiene este efecto sobre las células mediante la unión a receptores de insulina sobre la superficie celular y para permitir que el flujo de glucosa a las células se use como energía por la célula. Con la resistencia a la insulina, las células no reaccionan apropiadamente a la insulina (son resistentes), y se envía una señal al páncreas de que es necesario 10 producir más insulina, que a su vez da como resultado un aumento del nivel de insulina en sangre dando como resultado una señal incluso más fuerte a través de los receptores de insulina. De esta manera, la resistencia a la insulina de las células aumenta con el tiempo. Mientras que el páncreas sea capaz de producir suficiente insulina para superar esta resistencia, los niveles de glucosa en sangre permanecen normales. Cuando el páncreas ya no puede producir insulina suficiente, los niveles de glucosa en sangre comienzan a elevarse, inicialmente después de 15 las comidas, cuando los niveles de glucosa están en su punto más alto y es necesaria más insulina, pero eventualmente también en el estado en ayunas. En este punto, la resistencia a la insulina ha dado como resultado varias afecciones médicas, incluyendo diabetes tipo 2, hígado graso, aterosclerosis donde ésta última a su vez puede dar como resultado una arteriopatía coronaria (angina de pecho e insuficiencia cardiaca), ictus y enfermedad vascular periférica. Una afección médica adicional asociada a la resistencia a la insulina incluye lesiones cutáneas, 20 acanthosis nigricans (una afección cosmética que implica el oscurecimiento de la piel en áreas donde hay arrugas, tal como el cuello y las axilas). Afecciones adicionales asociadas al IR son papiloma cutáneo, anomalías reproductoras en mujeres, enfermedad de ovario poliquístico, hiperandrogenismo, altos niveles de hormonas masculinas y anomalías del crecimiento.

25

Las anomalías del crecimiento como resultado de la resistencia a la insulina están causadas por los altos niveles de insulina circulante que pueden estar presentes en la sangre. Aunque los efectos de la insulina sobre el metabolismo de glucosa pueden alterarse, sus efectos sobre otros mecanismos pueden estar intacto (o al menos, menos alterados). La insulina, que es un anabólico, puede ejercer efectos sobre el crecimiento, a través de un medicador conocido como factor de crecimiento tipo insulina-1. Los pacientes pueden tener un crecimiento lineal real y un 30 endurecimiento apropiado de las características. La incidencia en aumento de los papilomas cutáneos que se ha mencionado anteriormente puede ser a través de este mecanismo también.

La capacidad de la insulina para estimular el consumo de glucosa varía continuamente en toda una población de personas aparentemente sanas, y existe una diferencia de ≥600 % entre las personas más sensibles a la insulina y 35 las personas más resistentes a la insulina. Aproximadamente el 50 % de esta variabilidad puede atribuirse a la adiposidad (25 %) y la forma física (25 %), siendo el 50 % restante probablemente de origen genético. Un tercio de la población que es más resistente a la insulina está en un riesgo mucho mayor de desarrollar graves anomalías y síndromes clínicos, incluyendo diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, ictus, hígado graso no alcohólico, enfermedad de ovario poliquístico, y ciertas formas de cáncer. 40

La resistencia a la insulina puede diagnosticarse por un médico que puede identificar individuos que tienen más probabilidad de tener resistencia a la insulina con un historial de paciente detallado, examen físico del paciente, y pruebas de laboratorio utilizando los factores de riesgo. Las pruebas para diagnosticar IR incluyen, pero sin limitación, clamp hiperinsulínico-euglucémico y una prueba de tolerancia a la glucosa. Sin embargo, son costosas y no son necesarias para la gestión de los pacientes. 45

En la práctica clínica general, los niveles de glucosa junto con los niveles de glucosa en ayunas pueden dar al médico una pista de si la resistencia a la insulina está presente o no en pacientes sin diabetes.

La resistencia a la insulina puede tratarse intentando reducir la necesidad de insulina, en combinación con un 50 aumento de la sensibilidad de las células a la acción de la insulina que puede aumentarse.

Para disminuir la necesidad de insulina, el individuo que padece resistencia a la insulina puede alterar su dieta, y particularmente la ingesta de carbohidratos en la dieta.

55

Como se describe en el presente documento, la presente invención aborda métodos para sensibilizar las células (receptores de insulina) para aumentar la acción de la insulina.

En un aspecto, el agente de acuerdo con la presente invención puede usarse para tratar enfermedades y trastornos asociados a la resistencia a la insulina, donde dichas enfermedades y trastornos se seleccionan del grupo que consiste en síndrome de resistencia a la insulina, diabetes mellitus tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, el síndrome metabólico, hiperglucemia, hiperinsulinemia, arteriosclerosis, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, dislipidemia, obesidad, obesidad central, síndrome del ovario poliquístico, hipercoagulabilidad, hipertensión, microalbuminuria, y cualquier combinación de las mismas. 5

Otras afecciones que pueden tratarse por la presente invención incluyen, pero sin limitación, síndrome de resistencia a la insulina (SRI), diabetes mellitus tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, el síndrome metabólico, hiperglucemia e hiperinsulinemia.

10

Agente de la invención

Los presente inventores han descubierto que SorCS1 interactúa físicamente con el receptor de insulina (figura 11), y han demostrado además, mediante experimentos biológicos celulares, que la expresión del receptor de insulina se eleva en las células que sobreexpresan de forma estable SorCS1 soluble o las diferentes variantes de splicing 15 SorCS1 (figura 12), y la cantidad elevada del receptor de insulina aún se sitúa sobre la superficie celular (figura 13).

Además, los inventores han descubierto que la sobreexpresión de SorCS1 soluble en ratones genomanipulados SorCS1, así como la administración de SorCS1 disminuye el nivel de glucosa en plasma (figura 17) y aumenta la expresión y fosforilación del receptor de la insulina, así como de la proteína transportadora de glucosa tipo 4 (Glut4) 20 (figura 18). Además, la sobreexpresión de SorCS1 soluble en ratones hembra diabéticas de tipo 2 disminuye los niveles en plasma de glucosa e insulina (figura 19), y cambia la localización subcelular de Glut4, que puede regular en consecuencia la captación de glucosa.

Por lo tanto, en un aspecto principal, la presente invención se refiere a un agente tipo SorCS1 para su uso en el 25 tratamiento de resistencia a la insulina y/o una enfermedad relacionada con la resistencia a la insulina en un individuo, donde dicho agente es capaz de unirse al receptor de insulina (IR) en un sitio de unión a SorCS1 y que es capaz de sensibilizar un receptor de insulina. El receptor de insulina puede ser cualquier receptor de insulina, pero preferiblemente el receptor de insulina es un receptor de insulina humano que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 56. 30

Los presentes inventores han descubierto que SorCS1 se une al receptor de insulina a través de al menos un sitio de unión, y que una o más de las siguientes partes de SorCS1 participa en la unión:

SEQ ID NO: 1 aa 103-124 35

SEQ ID NO: 1 aa 125-143

SEQ ID NO: 1 aa 144-162

SEQ ID NO: 1 aa 197-218

SEQ ID NO: 1 aa 391-409

SEQ ID NO: 1 aa 661-684 40

SEQ ID NO: 1 aa 763-783

SEQ ID NO: 1 aa 859-876

Por consiguiente, el agente tipo SorCS1 se une preferiblemente a un sitio de unión en el receptor de insulina, cuyo sitio de unión está caracterizado por que una o más de las partes mostradas de SorCS1 se unen a dicho sitio de 45 unión.

En una realización preferida, el sitio de unión en el receptor de insulina comprende una o más de las secuencias definidas como se indica a continuación:

50

SEQ ID NO: 56 aa 100-120

SEQ ID NO: 56 aa 127-150

SEQ ID NO: 56 aa 284-310

SEQ ID NO: 56 aa 362-379

SEQ ID NO: 56 aa 593-610 55

SEQ ID NO: 56 aa 629-652

SEQ ID NO: 56 aa 749-772.

En una realización preferida, el agente como se ha definido en el presente documento anteriormente se selecciona del grupo que consiste en

a) un polipéptido SorCS1 aislado seleccionado del grupo que consiste en

i) una secuencia aminoacídica que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 5 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51;

ii) una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia aminoacídica de a) donde la variante tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con respecto a dicha SEQ ID NO: 1; o

iii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de i o ii, donde dicho fragmento comprende al menos 5 10 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b), y que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 1 en un rango de solapamiento de al menos 5 aminoácidos donde la actividad biológica es la sensibilización de un receptor de insulina,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

15

En un ejemplo, el polipéptido es una variante alélica de origen natural de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51, y preferiblemente, el polipéptido comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 5, 10, 15, 21, 27, 33, 37, 39, 43 y 47. 20

En un ejemplo adicional, el polipéptido es un polipéptido de variante descrito en la presente, donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia seleccionada se altera para proporcionar una sustitución conservativa como se ha definido anteriormente. Por consiguiente, el polipéptido tiene preferiblemente al menos un 70 %, por ejemplo 75 %, tal como 80 %, por ejemplo 85 %, tal como 90 %, por ejemplo 95 %, tal como 98 %, por ejemplo un 25 99 % de identidad de secuencia con respecto a una proteína que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51.

En un ejemplo, el polipéptido está glicosilado, tal como un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en 30 las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, donde el polipéptido puede glicosilarse en una o más de las siguientes posiciones de residuos aminoacídicos 184, 352, 433, 765, 776, 816, 847, 908 y 929, y/o donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 22, 26, 28, 29, 30, 31 y 32, donde el polipéptido puede glicosilarse en una o más de las siguientes posiciones de residuos aminoácidos 184, 352, 433, 765, 776, 816, 847, 908 y 929, y en otra realización, el fragmento glicosilado tiene la secuencia 35 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, 10 y 15, o el fragmento polipeptídico glicosilado tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, 27 y 33.

En algunas realizaciones, sin embargo, se prefiere que el polipéptido no esté glicosilado.

El agente tipo SorCS1 puede comprender un fragmento soluble de un polipéptido como se define en el presente 40 documento, o un fragmento de una variante y, por consiguiente, en una realización, el polipéptido es un polipéptido soluble que es un fragmento de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, o el polipéptido es un polipéptido soluble que es un fragmento de las secuencias de la reivindicación 15.

45

Se prefiere que el polipéptido sea capaz de formar al menos un puente de cistina intramolecular, y más preferiblemente, que el polipéptido como se ha definido en el presente documento anteriormente, comprenda un dímero de dicho polipéptido unido a través de al menos un puente de cistina intermolecular.

En una realización, el polipéptido de acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente un marcador de 50 afinidad, tal como una etiqueta polyhis, una etiqueta GST, una etiqueta HA, una etiqueta Flag, una etiqueta C-myc, una etiqueta HSV, una etiqueta V5, una etiqueta de proteína de unión a maltosa, una etiqueta del dominio de unión a celulosa.

Ácido nucleico, vectores y células huésped 55

Se desvela una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar el polinucleótido como se ha definido en el presente documento anteriormente, donde el polipéptido codificado tiene al menos un 70 %%, por ejemplo 75 %, tal como 80 %, por ejemplo 85 %, tal como 90 %, por ejemplo 95 %, tal como 98 %, por ejemplo un 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51, o un fragmento de las mismas.

Se desvela un vector, comprendiendo dicho vector al menos una molécula de ácido nucleico como se ha definido en 5 el presente documento anteriormente, para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina en un individuo.

El vector de la invención puede comprender adicionalmente un promotor que puede vincularse operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención. 10

El promotor puede ser, pero sin limitación, el grupo que consiste en: CMV, UbiC humano, RSV, promotor Tet-regulable, Mo-MLV-LTR, Mx1, EF-1alfa, PDGF beta y CaMK II.

El vector de la invención puede seleccionarse del grupo que consiste en vectores obtenidos a partir de la familia 15 Retroviridae, incluyendo lentivirus, VIH, SIV, FIV, EAIV, CIV. Otros vectores de la invención se seleccionan del grupo que consiste en alfavirus, adenovirus, virus adeno asociados, baculovirus, HSV, coronavirus, virus del papiloma bovino, Mo-MLV, preferiblemente virus adeno asociados.

En otra realización preferida, la invención también se refiere a una célula huésped que comprende el ácido nucleico 20 como se ha descrito anteriormente, e incluso más preferida, una célula huésped aislada de la invención se transforma o se transduce con al menos un vector como se ha definido en el presente documento anteriormente, para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina en un individuo.

25

El huésped aislado puede seleccionarse del grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, E. coli, Aspergillus y células de insecto Sf9 y en células mamíferas seleccionadas del grupo que consiste en células humanas, de felino, porcinas, de simio, caninas, murinas y de rata, donde las células de mamífero pueden seleccionarse, pero sin limitación, del grupo que consiste en células musculares, hepatocitos, adipocitos y células del páncreas tales como célula α, células β y células δ. 30

En una realización, la célula huésped aislada se selecciona del grupo que consiste en células CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b y BHK.

Se desvela una línea celular de empaquetamiento como se ha definido en el presente documento anteriormente, 35 donde dicha línea celular de empaquetamiento es capaz de producir una partícula de virus infecciosa para su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina en un individuo, comprendiendo dicha partícula vírica un genoma derivado de Retroviridae que comprende un LTR 5' retrovírico, un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor unido operativamente a una secuencia polinucleótida que codifica el péptido como se ha definido en el presente documento anteriormente, un origen de la 40 segunda síntesis de hebra de ADN, y una LTR 3' retrovírico.

En un ejemplo, el genoma de la línea celular de empaquetamiento se obtiene por lentivirus y las LTR son lentivíricas.

Como se ha analizado anteriormente, el agente tipo SorCS1 es cualquier agente que tenga la actividad biológica de 45 SorCS1 en relación con el receptor de insulina, es decir, un agente que es capaz de unirse al receptor de insulina, y más preferiblemente el agente también es capaz de sintetizar el receptor de insulina, por lo que es posible reducir la concentración de glucosa en sangre en el individuo al que se administra el agente tipo SorCS1 por tratamiento con resistencia a la insulina y enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina. El agente puede ser cualquier tipo de compuesto, tal como polipéptidos, anticuerpos, así como pequeñas moléculas orgánicas, donde el anticuerpo 50 puede seleccionarse del grupo que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos recombinantes dirigidos hacia el receptor de insulina.

Además, como se analiza en el presente documento, la administración de ácidos nucleicos, ya sea desnudos, o en células huésped o células de empaquetamiento, donde el ácido nucleico es capaz de codificar el polipéptido como 55 se analiza en el presente documento, para el tratamiento de la resistencia a la insulina y enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina también un aspecto de la invención.

Anticuerpos

Como se ha mencionado anteriormente, el agente puede ser un anticuerpo, en particular, un anticuerpo dirigido contra el receptor de insulina, o más preferido contra uno o más de los sitios de unión en el receptor de insulina mostrado en la figura 23A.

5

Los anticuerpos pueden usarse además como herramientas de investigación para explorar diversos aspectos de la invención. Dichos métodos se conocen bien por los expertos en la técnica pero, no obstante, se describen en más detalle a continuación. Los anticuerpos para su uso para herramientas de investigación son ambos anticuerpos dirigidos hacia el receptor de insulina, así como hacia el receptor del dominio de Vps10p, incluyendo SorCS1.

10

Es un aspecto proporcionar anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos, que reconozcan específicamente y se unan a los epítopos de los receptores del dominio Vps10p y los receptores de insulina.

El anticuerpo o equivalente funcional del mismo puede ser cualquier anticuerpo conocido en la técnica, por ejemplo un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal derivado de un mamífero o un anticuerpo sintético tal como un 15 anticuerpo de cadena sencilla o híbridos que comprenden fragmentos de anticuerpos. Además, el anticuerpo puede ser mezclas de anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales artificiales. Además, los equivalentes funcionales de anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, en particular, fragmentos de unión a epítopos. Además, los anticuerpos o equivalente funcional de los mismos pueden ser una molécula pequeña que imita un anticuerpo. Los anticuerpos de origen natural son moléculas de inmunoglobulina que consisten en cadenas pesadas 20 y livianas. En los ejemplos preferidos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos recombinantes. Los anticuerpos recombinantes son anticuerpos o fragmentos de los mismos o equivalentes funcionales de los mismos producidos utilizando tecnología recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes pueden producirse utilizando una biblioteca sintética o mediante 25 presentación de fagos. Los anticuerpos recombinantes se pueden producir de acuerdo con cualquier método convencional, por ejemplo los procedimientos descritos en "Recombinant Antibodies", Frank Breitling, Stefan Dübel, Jossey-Bass, septiembre de 1999.

Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos biespecíficos, es decir, anticuerpos que reconocen específicamente 30 dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos en general pueden prepararse a partir de anticuerpos monoclonales, o a partir de anticuerpos recombinantes, por ejemplo fusionando dos hibridomas con el fin de combinar su especificidad, por reticulación química o utilizando tecnologías recombinantes. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también pueden ser anticuerpos triespecíficos.

35

Los equivalentes funcionales de anticuerpos pueden ser un fragmento de un anticuerpo, preferiblemente un fragmento de unión al antígeno o una región variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos útiles con la presente invención incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, denominado el fragmento Fab, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento residual "Fc", denominado así por su capacidad de cristalizar fácilmente. El 40 tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos de unión a antígeno que son capaces de reticular el antígeno, y otro fragmento residual (que se denomina pFc'). Los fragmentos adicionales pueden incluir diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena única, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Como se usa en el presente documento, "fragmento funcional" con respecto a los anticuerpos, se refiere a los fragmentos Fv, F(ab) y F(ab')2. 45

Los fragmentos de anticuerpos preferidos conservan parte o esencialmente toda la capacidad de un anticuerpo para unirse selectivamente con su antígeno o receptor. Algunos fragmentos preferidos se definen como se indica a continuación:

50

(1) Fab es el fragmento que contiene un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo. Un fragmento Fab puede producirse mediante la digestión del anticuerpo entero con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada.

(2) Fab' es el fragmento de una molécula de anticuerpo y se puede obtener tratando el anticuerpo entero con 55 pepsina, seguido de reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.

(3) (Fab')2 es el fragmento de un anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo entero con la enzima pepsina sin reducción posterior. F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' retenidos unidos por dos enlaces disulfuro.

(4) Fv es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento y sitio de unión de antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno pesado en una estrecha 5 asociación, no covalente (dímero VH-VL). Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque en una afinidad inferior que el sitio de unión completo. 10

En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla ("SCA"), definido como una molécula manipulada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula de cadena sencilla fusionada genéticamente. Dichos anticuerpos de cadena sencilla también se denominan como fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o 15 "scFv". En general, el polipéptido Fv comprende adicionalmente un enlazador polipeptídico entre los dominios VL y VH Y, que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno.

Procedimientos para elaborar anticuerpos

20

Los anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos contra un antígeno específico, o epítopo de un antígeno, se pueden producir de acuerdo con procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Antibodies - A laboratory Manual de Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory 1998, ISBN 0-87969-314-2). El procedimiento para la posterior generación de anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos también se ha descrito (por ejemplo, A. M. Scott y col., Cancer Research 60: 3254-3261, 2000; A. Nissim y Y. Chernajovsky, Handb. Exp. 25 Pharmacol. 181: 3-18, 2008; A. Mountain y J. R. Adair, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1-142, 1992).

Marco de anticuerpo humanizado

No siempre es deseable utilizar anticuerpos no humanos para la terapia humana, puesto que los epítopos "foráneos" 30 no humanos pueden provocar una respuesta inmune en el individuo a tratar. Para eliminar o minimizar los problemas asociados a los anticuerpos no humanos, es deseable diseñar derivados de anticuerpos quiméricos, es decir, moléculas de anticuerpo "humanizadas" que combinen determinantes de unión a la región variable de Fab no humana con una región constante humana (Fc). Dichos anticuerpos se caracterizan por especificidad de antígeno equivalente y afinidad de los anticuerpos monoclonales y policlonales que se han descrito anteriormente, y son 35 menos inmunógenos cuando se administran a seres humanos, y por lo tanto, más propensos a ser tolerados por el individuo a tratar.

Por consiguiente, en un ejemplo, el polipéptido de unión tiene un dominio de unión transportado en un marco de anticuerpo humanizado, también denominado un anticuerpo humanizado. 40

Anticuerpos humanos

Los anticuerpos monoclonales humanos pueden producirse por una diversidad de técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas 45 convencional de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpo monoclonal, por ejemplo, transformación vírica u oncogénica de linfocitos B o técnicas de presentación en fagos utilizando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos

50

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos contra los epítopos de interés para la presente invención, los ratones transgénicos o transcromosomales que contienen genes de inmunoglobulina humana (por ejemplo, ratones HCo12, HCo7 o KM) pueden inmunizarse con una preparación enriquecida del antígeno y/o células que expresan los epítopos de receptores diana de la presente invención, como se describe, por ejemplo, por Lonberg y col. (1994), anteriormente; Fishwild y col. (1996), anteriormente, y el documento WO 98/24884. Como 55 alternativa, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica el epítopo CAOU-1. Preferiblemente, los ratones tendrán de 6-16 semanas de edad en la primera infusión.

Anticuerpos monovalentes

El polipéptido de unión monoespecífico puede ser monovalente, es decir, que tiene sólo un dominio de unión.

Para un anticuerpo monovalente, las secuencias de residuos de aminoácidos de dominio constante de 5 inmunoglobulina comprenden las partes estructurales de una molécula de anticuerpo conocidas en la técnica como CH1, CH2, CH3 y CH4. Se prefieren los polipéptidos de unión que se conocen en la técnica como CL. Los polipéptidos CL preferidos se seleccionan del grupo que consiste Ckappa y Clambda.

Además, en la medida en que el dominio constante puede ser un dominio constante de cadena pesada o ligera (CH 10 o CL, respectivamente), una diversidad de composiciones de polipéptidos de unión monovalentes se contempla por la presente invención. Por ejemplo, los dominios constantes de cadena ligera son capaces de formar un puente de disulfuro a cualquier otro dominio constante de cadena ligera o a un dominio constante de cadena pesada. Por el contrario, un dominio constante de cadena pesada puede formar dos puentes disulfuro independientes, lo que permite la posibilidad de formar un puente tanto a otra cadena pesada como a una cadena ligera, o formar polímeros 15 de cadenas pesadas.

La memoria descriptiva contempla un polipéptido de unión monovalente aislado donde el dominio de cadena constante C tiene un residuo cisteína capaz de formar al menos un puente disulfuro, y donde al menos dos polipéptidos monovalentes están unidos covalentemente por dicho puente disulfuro. 20

El dominio de cadena constante C puede ser CL o CH. Cuando C es CL, el polipéptido CL se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en Ckappa y Clambda.

La memoria descriptiva contempla una composición de polipéptidos de unión que comprende un polipéptido 25 monovalente como anteriormente, excepto que cuando C es CL que tiene un residuo de cisteína capaz de formar un puente disulfuro, de tal forma que la composición contiene dos polipéptidos monovalentes unidos covalentemente por dicho puente disulfuro.

Multiespecificidad, incluyendo biespecificidad 30

Se desvelan polipéptidos de unión multiespecíficos, que tienen afinidad para y son capaces de unirse al menos a dos entidades diferentes. Los polipéptidos de unión multiespecíficos pueden incluir polipéptidos de unión biespecíficos.

35

En un ejemplo, la molécula multiespecífica es un anticuerpo biespecífico (BsAb), que realiza al menos dos dominios de unión diferentes, donde preferiblemente al menos uno de los cuales es de origen anticuerpo.

Una molécula biespecífica también puede ser una molécula biespecífica de cadena sencilla, tal como un anticuerpo biespecífico de cadena simple, una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de 40 cadena sencilla y un dominio de unión, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos dominios de unión. Las moléculas multiespecíficas también pueden ser moléculas de cadena sencilla o pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla.

Los anticuerpos multiespecíficos incluyendo los biespecíficos, pueden producirse mediante cualquier manera 45 adecuada conocida por el experto en la técnica.

El enfoque tradicional para generar anticuerpos completos biespecíficos era fusionar dos líneas celulares de hibridoma produciendo cada una un anticuerpo con la especificidad deseada. Debido a la asociación aleatoria de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, estos hibridomas híbridos producen una mezcla de hasta 10 combinaciones diferentes de cadena ligera y pesada, sólo una de las cuales es el anticuerpo biespecífico. Por lo 50 tanto, estos anticuerpos biespecíficos tienen que purificarse con procedimientos engorrosos, que disminuyen considerablemente el rendimiento del producto deseado.

Utilizando un polipéptido de unión biespecífico o multiespecífico de acuerdo con la invención, la invención ofrece varias ventajas en comparación con los polipéptidos de unión monoespecíficos/monovalentes. 55

Si bien se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la invención son anticuerpos murinos, quiméricos y humanizados monoclonales. Tales anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica.

Los inventores de esta solicitud han planteado anticuerpos contra varias partes del receptor del dominio Vps10ps. La presente divulgación se refiere a anticuerpos contra la característica de unificación de esta familia de receptores - el dominio Vps10p. El alineamiento de secuencias a continuación del dominio Vps10p demuestra la conservación en 5 esta familia de receptores.

Tabla 1: Anticuerpos contra receptores del dominio Vps10p

Receptor: Nombre Antígeno Especie Western IH/IC Ref.

SorLA: SORLA cabra dominio extracelular cabra X X Schmidt y col., J.Biol.Chem. 282:32956-67, 2007

: Hale SORLA Dominio citoplasmático conejo X

: SORLA LA Repetir tipo complemento t conejo X

: Sol SORLA dominio extracelular conejo X X Andersen y col., PNAS 103: 13461-6, 2005

: SORLA cola Dominio citoplasmático conejo X

: SORLA VPS Dominio VPS10p conejo X

: #606870 Sec. peptídica en dominio Vps10p conejo X

: #642739 C-terminal conejo X

: #643739 Cola citoplasmática conejo X

: 20C11 Dominio extracelular ratón X X

: AG4 Dominio extracelular ratón X

Sortilina: #5264 Dominio extracelular conejo X X Munck Petersen y col., EMBO J. 18: 595-604, 1999

: #5448 Dominio citoplasmático conejo X X Jansen y col., Nature Neurosci. 10: 1449-1457,2007

: #5287 Dominio citoplasmático conejo X

: CP 96 334 SR 96 204 propéptido conejo X Munck Petersen y col., EMBO J. 18: 595-604, 1999

: #5438 Vps10p conejo X

: Sortilina cabra/Laika Dominio extracelular cabra X

: F9 Dominio extracelular ratón X X

: F11 Dominio extracelular ratón X X

: AF2934 Dominio extracelular cabra X X R&D Systems, Jansen y col., Nature Neurosci. 10: 1449-1457,2007

: AF3154 Dominio extracelular cabra X X R&D Systems; Jansen y col., Nature Neurosci. 10: 1449-1457,2007

: anti-NTR3 Dominio extracelular ratón X X BD Transduction Laboratories,

: ANT-009 Dominio extracelular ratón X X Alomone Labs; Nykjaer y col., Nature 427: 8 43-848, 2004

SorCS1: AF3457 Dominio extracelular cabra X X BD Transduction Laboratories

: SorCS1 cabra Dominio extracelular cabra X

: L-SorCS1 Dominio extracelular conejo X X Hermey y col., J.Biol.Chem. 279: 50221-50229, 2003

: Leu-SorCS1 Dominio rico en leucina conejo X X Hermey y col., J.Biol.Chem. 279: 50221-50229, 2003

: #5466 Dominio extracelular conejo X X

: 1D Dominio extracelular ratón X

: 4H Dominio extracelular ratón X

: 6B Dominio extracelular ratón X

: 4A Dominio extracelular ratón X

SorCS2: AF4237 Dominio extracelular oveja X BD Transduction Laboratories

: SorCS2 cabra Dominio extracelular cabra X X

: #5422 Dominio extracelular conejo X X Hermey y col., Biochem. J., 395: 285-93, 2006

: #5431 28 aminoácidos C-terminales conejo X X

: SorCS2-prp propéptido conejo X Schousboe Sjoegaard, Dissertation, Aarhus University, 2005

: M1 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M3 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M4 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M7 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M9 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M10 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M13 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M15 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M18 Dominio extracelular ratón X X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: M19 Dominio extracelular ratón X X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: S21 Dominio extracelular ratón X Roland Holst, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

: SorCS2-GST-73aa Dominio extracelular conejo X

: SorCS2-GST-100aa Dominio extracelular conejo X

: SorCS2-GST-172aa Dominio extracelular conejo X

SorCS3: SorCS3-N dominio extracelular conejo X

: SorCS3-C 15 aa C-terminal conejo X

: Sort3 N Term #5389 Dominio N-terminal conejo X X Westergaard y col., FEBS Lett. 579: 1172-6, 2005

: #5432 Dominio extracelular conejo X X

: MAB3067 Dominio extracelular ratón X BD Transduction Laboratories

: MAB30671 Dominio extracelular ratón X BD Transduction Laboratories

: AF3326 Dominio extracelular cabra X BD Transduction Laboratories

: SorCS3 cabra Dominio extracelular cabra X

Uso clínico satisfactorio de anticuerpos

Hay una serie de anticuerpos terapéuticos que tienen uso clínico. Los ejemplos incluyen Rituxan de Genentech, un anticuerpo dirigido contra el receptor de CD20 (usado en la artritis reumatoide), Remicade de Johnson & Johnson, 5 un anticuerpo dirigido contra el receptor del TNF alfa (en psoriasis), Avastin de Roche, un anticuerpo anti-VEGF usado para el tratamiento del cáncer colorrectal y pulmonar, así como Herceptin, un anticuerpo contra el receptor HRE2 usando en la terapia del cáncer de mama.

La evaluación de la unión a un receptor es un trabajo rutinario para el experto en el campo de la biotecnología. A 10 este respecto, debe mencionarse que la familia de receptores del dominio Vps10p, eran conocidos en la fecha de prioridad de esta invención y los ensayos de unión que implican.

En un ejemplo, el receptor anti-Insulina es un anticuerpo policlonal o monoclonal.

5

Ratones SorCS1 transgénicos

Los presentes inventores han descubierto que SorCS1 se expresa en el tejido adiposo, el músculo esquelético y las células β del páncreas; todos los tejidos implicados en el metabolismo de glucosa (figura 3). Para examinar la función de SorCS1 y sus diferentes variantes de splicing, los inventores generaron un ratón genomanipulado 10 condicional usando una nueva estrategia de direccionamiento desarrollada en base a la recombinación FLP y una técnica de inserción denominada "intercambio de casete mediado por recombinasa". El modelo se usó para generar un ratón genomanipulado "completo" que carece de todas las formas de splicing de SorCS1, por lo que la expresión de todas las variantes de splicing se ha interrumpido (figura 4). Los ratones SorCS1 deficientes en todas las variantes de splicing (genomanipulados "completos") no mostraron graves anomalías o signos de conducta 15 cambiada, son fértiles y muestran una esperanza de vida normal (no publicado). Sin embargo, el ratón genomanipulado SorCS1 se caracterizó fenotípicamente con respecto al metabolismo de glucosa y el desarrollo de la diabetes tipo 2, y los resultados preliminares sostienen una función importante del receptor en el desarrollo de la diabetes. Mientras que los niveles de glucosa en sangre en ratones macho en ayunas a las 17 y 50 semanas de edad fueron similares a los de las crías de la misma camada de control, los ratones hembra a la edad de 20 50 semanas mostraron una elevación dramática de la glucosa en sangre en comparación con los ratones de control correspondientes en edad (figura 5). Sin embargo, ambos géneros mostraron niveles elevados de insulina a las 50 semanas de edad (figura 6, hembras únicamente). En consonancia, sus islotes pancreáticos se ampliaron hasta 3 veces como se determinó por inmunotinción para un marcador de células β (figura 15). Los resultados indican que los ratones macho genomanipulados SorCS1 ancianos son hiperinsulinémicos pero prediabéticos, mientras que los 25 ratones hembra genomanipulados SorCS1 ancianos son hiperglucémicos e hiperinsulinémicos, convirtiéndose así en diabéticos.

Además, los inventores también han descubierto que tanto los ratones macho como los ratones hembra genomanipulados SorCS1 tienen un peso corporal normal. La ausencia de obesidad en los ratones 30 genomanipulados hace posible disociar el efecto de la obesidad sobre el fenotipo prediabético o diabético, que complica el análisis en varios modelos animales existentes de diabetes. Sin embargo, puesto que la obesidad es un factor de riesgo significativo para la diabetes tipo 2, los animales deficientes en SorCS1 también se alimentaron con una dieta de occidental hipercalórica para estudiar el impacto de la obesidad sobre el avance de la enfermedad. Las mediciones fisiológicas revelaron aumentos en los niveles de glucosa e insulina en plasma y en la grasa abdominal 35 para los ratones de tipo silvestre en una dieta hipercalórica en comparación con ratones de tipo silvestre con una dieta normal (figura 8+9). Por el contrario, los ratones genomanipulados SorCS1 no mostraron cambios significativos en la dieta de tipo occidental en comparación con la dieta normal, no mostrando de este modo ningún empeoramiento del estado diabético. La cantidad inferior de grasa abdominal en los ratones genomanipulados en una dieta occidental en comparación con los ratones de tipo silvestre confirma la resistencia a la insulina de los 40 ratones genomanipulados, ya que esto conduce a una reducción de la captación de glucosa en el tejido adiposo, y así menos producción de grasa abdominal.

Por consiguiente, los presentes inventores han demostrado que el ratón genomanipulado SorCS1 es un modelo animal único para estudiar la resistencia a la insulina y enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina, 45 en particular la diabetes, dado que el ratón genomanipulado SorCS1 desarrolla los síntomas normalmente relacionados con la resistencia a la insulina y la diabetes, incluyendo los síntomas tardíos de la diabetes, tales como síntomas neuropáticos.

Además, los inventores han mostrado que los ratones de 50 semanas de edad macho y hembra SorCS1-/- muestran 50 una cantidad elevada de IR fosforilado en comparación con los controles de edad correspondiente (figura 10) lo que sugiere que SorCS1 pueden particular en la señalización de la insulina en los tejidos periféricos. Como alternativa, una señal obtenida partir de SorCS1 que se convierte en las rutas de señalización de la insulina puede perderse, dando como resultado una regulación ascendente compensatoria de IR fosforilado. Dado que el SorCS1 también se acopla en la clasificación celular, el receptor también puede regular la distribución subcelular de IR. 55

Por lo tanto, un aspecto importante de la presente invención se refiere a un ratón genomanipulado transgénico en el que los genes SorCS1 del receptor del dominio Vps10p endógeno se han alterado para suprimir la expresión de un receptor SorCS1 funcional, y donde dicho ratón muestra una respuesta reducida a la insulina con respecto a un ratón de control no transgénico.

En una realización más, la invención se refiere al ratón transgénico como se ha definido en el presente documento anteriormente, donde dicha alteración comprende una deleción de las secuencias nucleotídicas del gen del receptor SorCS1 que codifica el codón de inicio o una región del receptor SorCS1 de ratón del dominio extracelular, el 5 dominio transmembrana, o el dominio citoplasmático.

En un aspecto, la invención se refiere a un ratón transgénico capaz de codificar SorCS1 soluble y/o de longitud completa de una manera específica de los tejidos, tras la activación de la expresión. El procedimiento para preparar dicho ratón se describe en el ejemplo 12. El tejido a activar específicamente puede seleccionarse, pero sin limitación, 10 del grupo que consiste en hígado, músculo, páncreas y tejido adiposo.

Métodos de detección de agentes de la invención

La presente invención proporciona dianas específicas y métodos para detectar y evaluar agentes candidatos como 15 se reivindica, incluyendo el péptido SorCS1 y fragmentos polipeptídicos y mutantes y variantes del mismo.

Si bien la detección de un gran número de péptidos para una cierta actividad fisiológica puede ser una tarea laboriosa, las divulgaciones exactas del ensayo en el presente documento que han de realizarse permiten al experto reproducir la presente invención sin carga indebida de experimentación y sin necesidad de habilidad inventiva. 20

Con este fin, las bibliotecas de detección de agentes candidatos fuera del alcance de protección están disponibles para su compra en el mercado. Una biblioteca es una biblioteca de péptidos o una biblioteca química no tiene ningún impacto en la situación actual ya que la detección de bibliotecas químicas es también el trabajo de rutina. De hecho, la detección de bibliotecas químicas es un servicio ofrecido por las empresas comerciales, y es evidente a partir de 25 su material de presentación (véase, por ejemplo http://www.analyticon.com/) que no tienen en cuenta el trabajo de detección como inventivo.

Inicialmente, en el proceso de detección de agentes tipo SorCs1, es relevante realizar estudios de unión como se analiza en el presente documento, en particular, en relación con las figuras y los Ejemplos para verificar que el 30 agente se une al receptor de insulina. Además, puede ser relevante mostrar que el agente, de hecho, también sensibiliza al receptor de insulina. Como se ha analizado anteriormente, esto puede hacerse indirectamente mostrado que la administración del agente tipo SorCS1 de hecho reduce la concentración de glucosa en sangre realizando, por ejemplo, una prueba de tolerancia a la glucosa (GTT), y también mostrando preferiblemente que la concentración de insulina se reduce, si se aumentó inicialmente. Además, la sensibilización del receptor de insulina 35 también puede medirse midiendo la cantidad de receptor de insulina, ya que la administración de perlas solubles de SorCS1 conduce a un aumento de los receptores de insulina.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a un método para detectar la capacidad del agente tipo SorCS1 como se ha definido en el presente documento anteriormente para reducir los niveles de glucosa 40 en sangre, comprendiendo dicho método las etapas de

a) proporcionar un primer y un segundo ratón transgénico;

b) administrar a dicho primer ratón transgénico un agente candidato, y

c) administrar a dicho segundo ratón transgénico una solución fisiológica, y 45

e) comparar los niveles de glucosa en sangre en las muestras de d); donde una reducción en el nivel de glucosa en sangre de dicho primer ratón transgénico al que se administró dicho agente candidato con respecto a dicho segundo ratón transgénico al que no se administró dicho agente candidato indica que el agente candidato reduce los niveles 50 de glucosa en sangre.

En otra realización, la invención se refiere a un método para detectar la capacidad del agente tipo SorCS1 de la invención para reducir los niveles de glucosa en sangre, comprendiendo dicho método las etapas de

55

a) proporcionar un primer y un segundo ratón de tipo silvestre; y

f) administrar a dicho primer ratón el agente de la reivindicación 1, y

g) administrar a dicho segundo ratón una solución fisiológica, y

h) tomar muestras de sangre de los dos ratones de b) y c) respectivamente, en intervalos de tiempo predeterminados, tal como en 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 y 4 horas, posteriores a la administración de dicho agente, y

i) comparar los niveles de glucosa en plasma en las muestras de d); donde una reducción en el nivel de glucosa en sangre de dicho primer ratón de tipo silvestre al que se administró dicho agente con respecto a dicho segundo ratón de tipo silvestre al que no se administró dicho agente candidato, indica que el agente reduces los niveles de glucosa 5 en sangre.

Composición farmacéutica y formas de administración

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden el agente como se define en 10 el presente documento. En el presente contexto, los términos agente y compuesto se consideran sinónimos al analizar la composición farmacéutica.

Las principales vías de administración de fármacos de acuerdo con esta invención son parenteral, oral o enteral, y tópica para introducir el agente en el torrente sanguíneo para dirigirse por último a los sitios de los receptores de 15 insulina.

El agente puede administrarse para cruzar cualquier membrana mucosa de un animal al que se va a administrar la sustancia biológicamente activa, por ejemplo, en la nariz, la vagina, el ojo, la boca, el tracto genital, los pulmones, el tracto gastrointestinal, o el recto, preferiblemente, la mucosa de la nariz, o la boca. 20

Los agentes pueden administrarse por vía oral o enteral.

Los compuestos de la invención también se pueden administrar por vía parenteral, es decir, por administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, intrarrectal, intravaginal o intraperitoneal. Las formas de la 25 administración parenteral intramusculares y subcutáneas se prefieren generalmente. Las formas de dosificación apropiadas para tal administración se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Los compuestos también se pueden administrar por inhalación, que es por administración intranasal e inhalación oral. Las formas de dosificación apropiadas para tal administración, tal como una formulación en aerosol o un inhalador de dosis medida, se pueden preparar mediante técnicas convencionales. 30

Los compuestos de acuerdo con la invención se pueden administrar con al menos otro compuesto, tal como, por ejemplo insulina. Los compuestos se pueden administrar simultáneamente, ya sea como formulaciones separadas o combinadas en una forma de dosificación unitaria, o se pueden administrar secuencialmente.

35

En una realización de la presente invención, la dosificación del principio activo de la composición farmacéutica como se ha definido en el presente documento anteriormente, está entre 10 µg a 500 mg por kg de masa corporal, tal como entre 20 µg y 400 mg, por ejemplo entre 30 µg y 300 mg, tal como entre 40 µg y 200 mg, por ejemplo entre 50 µg y 100 mg, tal como entre 60 µg y 90 µg, por ejemplo entre 70 µg y 80 µg.

40

Además, la dosificación puede administrarse en forma de administración en bolo o como una administración continua. En relación con la administración en bolo, la composición farmacéutica puede administrarse en intervalos de 30 minutos a 24 horas, tal como en intervalos de 1 a 6 horas. Cuando la administración es continua, se administra durante un intervalo de tiempo que normalmente es de 6 horas a 7 días. Sin embargo, normalmente, la dosificación se administra como un bolo 1-3 veces al día. 45

En un aspecto importante, la duración del tratamiento es para toda la vida.

Formulaciones

50

Si bien es posible que los compuestos o sales de la presente invención se administren como producto químico en bruto, es preferible presentarlos en forma de una formulación farmacéutica. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva proporciona adicionalmente una formulación farmacéutica, para aplicación medicinal, que comprende un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para ello. 55

Los agentes de la presente invención se pueden formular en una amplia variedad de formas de dosificación, adecuadas para las diversas formas de administración que se han analizado anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación pueden comprender los compuestos de la invención o su sal farmacéuticamente aceptable o una forma cristalina del mismo como el componente activo.

Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprende vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser sólidos o líquidos. 5

Las preparaciones en forma sólida se proporcionan normalmente para administración oral o enteral, tal como polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios, y gránulos dispersables. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que pueden actuar como diluyentes, agentes saporíferos, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes humectantes, agentes disgregantes de comprimidos, o un material 10 encapsulante.

Preferiblemente, la composición será de aproximadamente el 0,5 % al 75 % en peso de un compuesto o compuestos de la invención, consistiendo el resto en excipientes farmacéuticos adecuados. Para la administración oral, dichos excipientes incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, 15 talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares.

En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que es una mezcla con el componente activo finamente dividido. En los comprimidos, el componente activo se mezcla con el vehículo que tiene la capacidad de unión necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos 20 preferiblemente contienen de uno a aproximadamente el setenta por ciento del compuesto activo. Los vehículos adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao, y similares. El término "preparación" pretende incluir la formulación del compuesto activo con material de encapsulación como vehículo proporcionando una cápsula en la que el componente activo, con o sin vehículos, está 25 rodeado por un vehículo, que está en asociación con el mismo. De manera similar, se incluyen sellos y pastillas. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, sellos y pastillas pueden ser formas sólidas adecuadas para administración oral.

Las gotas pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas o en aceite no estériles o estériles, y pueden 30 prepararse disolviendo el principio activo en una solución acuosa adecuada, incluyendo opcionalmente un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, y opcionalmente incluyendo un agente activo superficial. La solución resultante puede clarificarse después por filtración, transferirse a un recipiente adecuado que después se sella y se esteriliza mediante autoclave o manteniéndolo a 98-100 ºC durante media hora. Como alternativa, la solución puede esterilizarse por filtración y transferirse al recipiente de forma aséptica. Los ejemplos 35 de agentes fungicidas y bactericidas adecuados para la inclusión en las gotas son nitrato o acetato fenilmercúrico (0,002 %), cloruro de benzalconio (0,01 %) y acetato de clorhexidina (0,01 %). Los disolventes adecuados para la preparación de una solución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.

También se incluyen preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse, poco antes del uso, en 40 preparaciones en forma líquida para la administración oral. Tales formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo, colorantes, sabores, estabilizantes, tampones, edulcorantes naturales y artificiales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes, y similares.

45

Otras formas adecuadas para la administración oral incluyen preparaciones de forma líquida que incluyen emulsiones, jarabes, elixires, soluciones acuosas, suspensiones acuosas, pasta de dientes, dentífrico de gel, goma de mascar, o preparaciones en forma sólida que están destinadas a ser convertidas poco antes del uso en preparaciones en forma líquida. Las emulsiones pueden prepararse en soluciones en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes tal como lecitina, monooleato de sorbitán, o acacia. Las 50 soluciones acuosas pueden prepararse disolviendo el componente activo en agua y añadiendo colorantes adecuados, aromatizantes, estabilizantes y agentes espesantes. Las suspensiones acuosas pueden prepararse dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, gomas naturales o sintéticas tal como, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y otros agentes de suspensión bien conocidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, y pueden contener, además del 55 componente activo, colorantes, sabores, estabilizantes, tampones, edulcorantes naturales y artificiales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes, y similares.

Los compuestos de la presente invención pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, por inyección, por ejemplo inyección de bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en recipientes de dosis múltiples con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, soluciones, por ejemplo, en polietilenglicol acuoso. Los ejemplos de vehículos oleosos o no acuosos, diluyentes, disolventes o vehículos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales 5 (por ejemplo, aceite de oliva) , y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y pueden contener agentes de formulación tal como conservantes, humectantes, agentes emulsionantes o de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de sólido estéril o por liofilización a partir de solución para la constitución antes del uso con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos. 10

Los aceites útiles en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animal, vegetal, o aceites sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites útiles en dichas formulaciones incluyen cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina, y mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico, y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y miristato de isopropilo son ejemplos 15 de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones apropiados para su uso en formulaciones parenterales incluyen metal alcalino graso, amonio, y sales de trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tal como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio, haluros de alquil piridinio; (b) detergentes aniónicos tal como, por ejemplo, alquilo, arilo, y 20 sulfonatos de olefina, alquilo, olefina, éter, sulfatos de monoglicéridos y, sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tal como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos, y copolímeros de polioxietileno-polipropileno, (d) detergentes anfóteros tal como, por ejemplo, alquil-.beta-aminopropionatos, y sales de 2-alquilimidazolina amonio cuaternario, y (e) mezclas de los mismos.

25

Las formulaciones parenterales contendrán típicamente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente el 25 % en peso del principio activo en solución. Pueden usarse conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de la inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un balance hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones variará típicamente de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 15 % en peso. Los 30 tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilen sorbitán, tal como monooleato de sorbitán y aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en dosis unitarias o recipientes cerrados de múltiples dosis, tal como ampollas y viales, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere sólo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para 35 inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones de inyección extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos, y comprimidos del tipo que se ha descrito previamente.

Los compuestos de la invención también se pueden administrar por vía tópica para administración transdérmica o transmucosa. Las regiones para la administración tópica incluyen la superficie de la piel y también los tejidos de 40 membranas mucosas de la vagina, recto, nariz, boca y garganta. Las composiciones para la administración tópica a través de las membranas mucosas y piel no deberían dar lugar a signos de irritación, tal como hinchazón o enrojecimiento. La administración transdérmica típicamente implica la administración de un agente farmacéutico para el paso percutáneo del fármaco a la circulación sistémica del paciente. Los sitios de la piel incluyen regiones anatómicas para administrar por vía transdérmica el fármaco, e incluyen el antebrazo, el abdomen, el pecho, la 45 espalda, glúteo, el área mastoidea, y similares.

La composición tópica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable adaptado para la administración tópica. Por lo tanto, la composición puede tomar la forma de una suspensión, solución, pomada, loción, lubricante sexual, crema, espuma, aerosol, supositorio, implante, inhalante, comprimido, tal como un comprimido sublingual, 50 cápsula, polvo seco, jarabe, bálsamo o pastilla, por ejemplo. Los métodos para preparar tales composiciones se conocen bien en la industria farmacéutica.

Los compuestos de la presente invención se pueden formular para la administración tópica a la epidermis como ungüentos, cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Los ungüentos y cremas pueden, por ejemplo, 55 formularse con una base acuosa u oleosa con la adición de adecuados agentes espesantes y/o agentes gelificantes. Las lociones pueden formularse con una base acuosa u oleosa y, en general, también contienen uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, o agentes colorantes. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden agentes activos en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el principio activo en un vehículo líquido adecuado.

Las cremas, pomadas o pastas de acuerdo con la presente invención son formulaciones semisólidas del principio 5 activo para aplicación externa. Pueden hacerse mezclando el principio activo en forma finamente dividida o en polvo, en solitario o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de maquinaria adecuada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tal como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abejas, jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural, tal como aceite de almendras, maíz, cacahuete, ricino u oliva; grasa de lana o sus derivados o un ácido graso tal como ácido estérico u oleico junto 10 con un alcohol tal como propilenglicol o un macrogel. La formulación puede incorporar cualquier agente activo superficial adecuado tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tal como éster de sorbitán o un derivado de polioxietileno del mismo. Los agentes de suspensión, tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tal como sílices silíceas, y otros ingredientes tal como lanolina también pueden ser incluidos.

15

Las lociones incluyen aquellas adecuadas para la aplicación a la piel o el ojo. Una loción ocular puede comprender una solución acuosa estéril que opcionalmente contiene un bactericida y se puede preparar por métodos similares a aquellos para la preparación de gotas. Las lociones o linimentos para aplicación a la piel también pueden incluir un agente para acelerar el secado y enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un humectante tal como glicerol o un aceite, tal como aceite de ricino o aceite de cacahuete. 20

La administración transdérmica puede realizarse mediante la exposición de una fuente del complejo a la piel de un paciente durante un período prolongado de tiempo. Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar la administración controlada de un complejo modificador químico-agente farmacéutico al cuerpo. Véase Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft y Guy (eds.), Marcel Dekker, 25 Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson y Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); y Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987). Tales formas de dosificación se pueden preparar por disolución, dispersión, o de otra manera incorporando el complejo modificador químico-agente farmacéutico en un medio adecuado, de tal como un material de matriz elastomérica. Los potenciadores de la absorción también pueden usarse para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. 30 La velocidad de tal flujo puede controlarse proporcionando una velocidad de control de membrana o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o gel.

Por ejemplo, puede prepararse un parche adhesivo sencillo a partir de un material de soporte y un adhesivo de acrilato. El complejo modificador químico-agente farmacéutico y cualquier potenciador se formulan generando la 35 solución de colada adhesiva y se deja mezclar bien. La solución se cuela directamente sobre el material de soporte y el disolvente de colada se evapora en un horno, dejando una película adhesiva. El forro de liberación puede estar unido para completar el sistema.

Los parches de matriz de espuma son similares en diseño y los componentes para el sistema de depósito de líquido, 40 excepto que la solución del modificador químico-agente farmacéutico gelificado está limitada en una capa de espuma delgada, típicamente un poliuretano. Esta capa de espuma se encuentra entre el soporte y la membrana que han sido sellados con calor en la periferia del parche.

Para los sistemas de administración pasivos, la velocidad de liberación se controla típicamente por una membrana 45 colocada entre el depósito y la piel, por difusión desde un dispositivo monolítico, o por la propia piel que sirve como una barrera que controla la velocidad en el sistema de administración. Véanse las Pat. de Estados Unidos n.º 4.816.258; 4.927.408; 4.904.475; 4.588.580, 4.788.062; y similares. La velocidad de suministro de fármaco dependerá, en parte, de la naturaleza de la membrana. Por ejemplo, la velocidad de administración de fármacos a través de membranas dentro del cuerpo es generalmente más alta que a través de barreras dérmicas. La velocidad 50 a la que el complejo se administra desde el dispositivo a la membrana se controla más ventajosamente mediante el uso de membranas limitantes de velocidad que se colocan entre el depósito y la piel. Suponiendo que la piel es suficientemente permeable para el complejo (es decir, la absorción a través de la piel es mayor que la velocidad de paso a través de la membrana), la membrana servirá para controlar la velocidad de dosificación experimentada por el paciente. 55

Los materiales de membrana permeables adecuados pueden seleccionarse basándose en el grado deseado de permeabilidad, la naturaleza del complejo, y las consideraciones mecánicas relacionadas con la construcción del dispositivo. Los materiales de membrana permeables ejemplares incluyen una amplia diversidad de polímeros naturales y sintéticos, tales como polidimetilsiloxanos (cauchos de silicona) , copolímero de acetato de etilenvinilo (EVA), poliuretanos, copolímeros de poliuretano-poliéter, polietilenos, poliamidas, cloruros de polivinilo (PVC), polipropilenos, policarbonatos, politetrafluoroetilenos (PTFE), materiales celulósicos, por ejemplo, triacetato de celulosa y nitrato/acetato de celulosa, e hidrogeles, por ejemplo, 2-hidroxietilo (HEMA).

5

Los compuestos de la presente invención también pueden formularse para la administración como supositorios. Una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao primero se funde y el componente activo se dispersa homogéneamente, por ejemplo, por agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte entonces en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y solidificar.

10

El compuesto activo se puede formular en un supositorio que comprende, por ejemplo, de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 50 % de un compuesto de la invención, dispuesto en un vehículo de glicol de polietileno (PEG) (por ejemplo, PEG 1000 [96 %] y PEG 4000 [4 %].

Los compuestos de la presente invención pueden formularse para la administración vaginal. Pesarios, tampones, 15 cremas, geles, pastas, espumas o pulverizaciones que contienen además del principio activo dichos vehículos tal como se conocen en la técnica por ser apropiados.

Los compuestos de la presente invención pueden formularse para su administración nasal. Las soluciones o suspensiones se aplican directamente a la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo con un gotero, 20 pipeta o pulverización. Las formulaciones se pueden proporcionar en forma individual o multidosis. En el último caso de un gotero o pipeta, esto puede conseguirse por el paciente administrando un volumen predeterminado apropiado de la solución o suspensión. En el caso de un pulverizador esto se puede conseguir por ejemplo por medio de una bomba de pulverización de atomización dosificadora.

25

Los compuestos de la presente invención pueden formularse para la administración en aerosol, particularmente al tracto respiratorio e incluyendo la administración intranasal. El compuesto tendrá generalmente un pequeño tamaño de partícula por ejemplo del orden de 5 micrómetros o menos. Tal tamaño de partícula puede obtenerse por medios conocidos en la técnica, por ejemplo por micronización. El principio activo se proporciona en un envase presurizado con un propulsor adecuado tal como un clorofluorocarbono (CFC) por ejemplo diclorodifluorometano, 30 triclorofluorometano, o diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol también puede contener convenientemente un tensioactivo tal como lecitina. La dosis de fármaco puede controlarse mediante una válvula calibrada. Como alternativa, los principios activos pueden proporcionarse en una forma de polvo seco, por ejemplo una mezcla de polvo del compuesto en una base en polvo apropiada tal como lactosa, almidón, derivados de almidón tal como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona (PVP). El vehículo en polvo formará un gel en la 35 cavidad nasal. La composición en polvo puede presentarse en forma de dosis unitarias por ejemplo en cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina o en envases tipo blíster a partir del cual el polvo se puede administrar por medio de un inhalador.

Cuando se desee, las formulaciones pueden prepararse con recubrimientos entéricos adaptados para la 40 administración de liberación sostenida o controlada del principio activo.

Las preparaciones farmacéuticas están preferiblemente en formas de dosificación unitarias. En tal forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de la 45 preparación, comprimidos envasados tal como, cápsulas, y polvos en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, sello o pastilla, o puede ser el número apropiado de cualquiera de éstos en forma envasada.

Sales farmacéuticamente aceptables 50

También se desvelan sales farmacéuticamente aceptables de los presente compuestos, donde pueden prepararse.

Estas sales serán aquellas que son aceptables en su aplicación para un uso farmacéutico. Mediante esto se quiere decir que la sal retendrá la actividad biológica del compuesto precursor y la sal no tendrá efectos adversos o 55 perjudiciales en su aplicación y uso en el tratamiento de enfermedades.

Las sales farmacéuticamente aceptables se preparan de una manera estándar. Si el compuesto precursor es una base, se trata con un exceso de un ácido orgánico o inorgánico en un disolvente adecuado. Si el compuesto precursor es un ácido, se trata con una base inorgánica u orgánica en un disolvente adecuado.

Los compuestos de la invención se pueden administrar en forma de un metal alcalino o sal de metal alcalinotérreo del mismo, concurrentemente, simultáneamente, o junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, especialmente y preferiblemente en la forma de una composición farmacéutica del mismo, ya sea por vía oral, rectal, 5 o parenteral (incluyendo la subcutánea) , en una cantidad eficaz.

Los ejemplos de sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables para su uso en la composición farmacéutica incluyen aquellas obtenidas a partir de ácidos minerales, tal como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tal como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, 10 láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico, p-toluenosulfónico, y arilsulfónico, por ejemplo.

En una realización, la composición farmacéutica como se ha definido en el presente documento anteriormente comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15

En una realización de la presente invención, el pH de la composición farmacéutica como se ha definido en el presente documento anteriormente, está entre pH 4 y pH 9.

Kit de partes

20

En un aspecto, la presente memoria descriptiva se refiere a un kit en partes que comprende:

- una composición farmacéutica como se ha definido en el presente documento anteriormente

- un instrumento médico u otros medios para administrar el medicamento

- instrucciones sobre cómo usar el kit en partes. 25

- opcionalmente, un segundo principio activo como se ha definido en el presente documento anteriormente.

El instrumento, como se ha definido en el presente documento anteriormente, también se denomina lápiz de insulina descrito en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.462.535, US 5.999.323 y US 5.984.906. El segundo ingrediente puede ser cualquier principio activo adecuado administrado normalmente a individuos que padecen resistencia a la 30 insulina y enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina, tal como insulina. Mediante la sensibilización del receptor de insulina debido a la administración de una composición farmacéutica como se define en el presente documento, se cree que se reduce la necesidad de insulina.

Tratamientos 35

Como se ha analizado anteriormente, la presente memoria descriptiva también se refiere al tratamiento de resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina, comprendiendo dicho método administrar a un individuo que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del agente como se ha definido anteriormente; o la secuencia de ácido nucleico aislada como se ha definido anteriormente; o el vector de 40 expresión como se ha definido anteriormente; o una composición de células huésped como se ha definido anteriormente; o una línea celular de empaquetamiento como se ha definido anteriormente, o una combinación de los mismos.

Las enfermedades asociadas a la resistencia a la insulina se seleccionan, en particular, del grupo que consiste en 45 síndrome de resistencia a la insulina, diabetes mellitus tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, el síndrome metabólico, hiperglucemia, hiperinsulinemia, arteriosclerosis, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, dislipidemia, obesidad, obesidad central, síndrome del ovario poliquístico, hipercoagulabilidad, hipertensión, microalbuminuria, síndrome de resistencia a la insulina (SRI), diabetes mellitus tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, el síndrome metabólico, hiperglucemia e hiperinsulinemia. 50

Los presentes inventores han descubierto que la administración de un agente tipo SorCS1 sensibiliza el receptor de insulina, ya que estabiliza el receptor de insulina, aumenta la cantidad de receptores de insulina, y/o aumenta la cantidad de receptores de insulina activados (se miden los receptores de insulina fosforilados). Por lo tanto, en otro aspecto, la presente memoria descriptiva se refiere a un método de sensibilización de un receptor de insulina, 55 comprendiendo dicho método administrar un receptor del dominio Vps10p seleccionado del grupo que consiste en:

f) SorCS1

g) SorCS2

h) SorCS3

i) Sortilina y

j) SorLA,

siendo así útil en un método de tratamiento de la resistencia a la insulina o enfermedades asociadas a la resistencia 5 a la insulina.

Además, los inventores han descubierto que, al administrar un agente tipo SorCS1, entonces los receptores de insulina pueden regularse por aumento y, por consiguiente, la presente memoria descriptiva se refiere a un método para la regulación por ascenso de un receptor de insulina o un fragmento o variante del mismo, en un paciente que 10 necesita el mismo, comprendiendo dicho método administrar a un individuo que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del agente como se ha definido anteriormente; o la secuencia de ácido nucleico aislada como se ha definido anteriormente; o el vector de expresión como se ha definido anteriormente; o una composición de células huésped como se ha definido anteriormente; o una línea celular de empaquetamiento como se ha definido anteriormente, o una combinación de los mismos. 15

Además, se ha descubierto que un agente tipo SorCS1 aumenta la sensibilidad a la insulina y, por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método para aumentar la sensibilidad a la insulina que comprende administrar a un individuo que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del agente como se ha definido anteriormente; o la secuencia de ácido nucleico aislada como se ha definido anteriormente; o el vector de 20 expresión como se ha definido anteriormente; o una composición de células huésped como se ha definido anteriormente; o una línea celular de empaquetamiento como se ha definido anteriormente, o una combinación de los mismos. Este individuo es típicamente un individuo que padece cualquiera de las enfermedades que se han mencionado anteriormente, más probablemente un individuo que padece diabetes tipo 1 o tipo 2.

25

Descripción detallada de los dibujos

Figura 1: La familia de receptores del dominio Vps10p. Se indica su organización estructural.

Figura 2: Variantes de splicing de mSorCS1. A) Organización del gen SorCS1 murino que conduce a la generación de diferentes colas citoplasmáticas. Los cuadros de color negro representan el exón 23 y 24 con sitios de 30 splicing típicos. En el exón compuesto interno/terminal 25 (gris) y 26 (blanco), la línea discontinua indica un sitio de splicing potencial. Los exones terminales usados alternativos 25, 26, 27 y 28 se muestran en color blanco. B) Secuencias aminoacídicas de los dominios citoplasmáticos mSorCS1. Los motivos de dileucina están subrayados, los motivos de unión al dominio SH3 tienen líneas superpuestas, los motivos de unión al dominio SH2 están subrayados por líneas discontinuas, y los motivos YXX∅ tienen líneas discontinuas superpuestas. 35

Figura 3: Expresión de las diferentes variantes de splicing mSorCS1. Expresión de la parte extracelular de SorCS1 (SorCS1.ex) y las cinco variantes de splicing de cola SorCS1-a, -b, -c, c+ y -d se determinaron en el tejido de ratones adultos por PCR de transcripción inversa (RT-PCR) con pares de cebadores específicos. Los cebadores específicos de SorCS1.ex abarcan las uniones del exón 21 a 24 dando un producto de 390 pb. Los cebadores específicos de SorCS1-a abarcan las uniones del exón 21 a 25 dando un producto de 586 pb. Los cebadores 40 específicos de SorCS1-b abarcan las uniones del exón 21 a 25 y las uniones del exón 25 a 27 dando un producto de 621 pb. Los cebadores específicos de SorCS1-c abarcan las uniones del exón 21 a 26 dando un producto de 626 pb. Los cebadores específicos de SorCS1-d abarcan las uniones del exón 21 a 25 y la unión del exón 25 a 28 dando un producto de 636 pb. Las preparaciones de ARN total se hicieron a partir de hipocampo, hígado, tejido adiposo (grasa), músculo, páncreas y testículos aislados de ratones de tipo silvestre e hipocampo e hígado de 45 ratones KO SorCS1 de aproximadamente 8 semanas de edad usando el kit de purificación de ARN total Versagene (Gentra Systems). En resumen, los tejidos se extrajeron quirúrgicamente y se congelaron en hielo seco. Las muestras de tejido congelado se alteraron y se homogeneizaron durante hasta 60 s usando un estator de rotor (Ultra-Turrax, IKA-Werke) en 800 µl de tampón de lisis que contenía Tris (2-carboxietil) fosfina 5 mM (TCEP) y el ARN total se purificó de acuerdo con el protocolo de los fabricantes para el kit. Se realizaron RT-PCR con 0,75 µg a 50 1 µg de ARN total de cada muestra usando el kit RT-PCR de una etapa TITANIUM (Clontech). Todas las reacciones se realizaron en 50 µl de volumen que contenía 1 x tampón de una etapa (tricina 40 mM, KCI 20 mM, MgCl2 3 mM, 3,75 µg/µl de BSA), 0,2 mM de cada dNTP, 25 µl de agente termoestabilizante, 10 µl fusión por GC, cebador Oligo(dT) 20 µM, 20 unidades de inhibidor de RNasa recombinante, 1 x mezcla de enzima RT-TITANIUM™ (todo suministrado con el kit) y 45 µM de cada cebador. Las condiciones de PCR fueron: 50 ºC durante 1 hora, 94 ºC 55 durante 5 min, 35 ciclos a 94 ºC durante 30 s, 64 ºC durante 30 s, 68 ºC durante 1 min, y 68 ºC durante 2 min.

Figura 4: Generación del ratón genomanipulado mSorCS1. A) Estrategia usada para generar ratones genomanipulados mSorCS1 por recombinación homóloga en células madre embrionarias. Se muestra una representación esquemática del locus SorCS1 murino de tipo silvestre (superior), el vector de direccionamiento (centro), y el genoma recombinante homólogo (inferior). B) Análisis de la expresión de ARNm en mSorCS1, que carece de transcripción de todas las variantes de splicing mSorCS1. Los fragmentos se obtienen por RT-PCR en ARNm del hipocampo de ratones de tipo silvestre (WT) y genomanipulados SorCS1 (KO) usando pares de cebadores específicos para identificar la parte extracelular de SorCS1 (ext) o cada una de las cinco variantes de cola (a, b, c, c(centro), y el genoma recombinante homólogo (inferior). B) Análisis de la expresión de ARNm en mSorCS1, que carece de transcripción de todas las variantes de splicing mSorCS1. Los fragmentos se obtienen por RT-PCR en ARNm del hipocampo de ratones de tipo silvestre (WT) y genomanipulados SorCS1 (KO) usando pares de cebadores específicos para identificar la parte extracelular de SorCS1 (ext) o cada una de las cinco variantes de cola (a, b, c, c(centro), y el genoma recombinante homólogo (inferior). B) Análisis de la expresión de ARNm en mSorCS1, que carece de transcripción de todas las variantes de splicing mSorCS1. Los fragmentos se obtienen por RT-PCR en ARNm del hipocampo de ratones de tipo silvestre (WT) y genomanipulados SorCS1 (KO) usando pares de cebadores específicos para identificar la parte extracelular de SorCS1 (ext) o cada una de las cinco variantes de cola (a, b, c, c

Figura 5: Glucosa en sangre promedio en ratones A) macho y B) hembra a diferente edad. Los animales se 15 mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h). Los ratones de tipo silvestre (wt) y genomanipulados SorCS1 (KO) se anestesiaron con éter dietílico, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y la glucosa plasmática se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascensia Contour de Bayer). Los aumentos estadísticamente significativos de los niveles de glucosa en sangre de ratones genomanipulados con respecto a ratones de tipo silvestre se indican con estrellas. Las barras de error indican SEM. 20

Figura 6: Niveles de insulina en plasma en ratones hembra de tipo salvaje y genomanipulados SorCS1 de 10 a 50 semanas de edad. Los animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h). Los ratones se anestesiaron con éter dietílico, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y los niveles de insulina en plasma se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics, Marburg, Alemania). Los datos son medias ± SEM para 4 a 10 ratones en cada 25 grupo. Los aumentos estadísticamente significativos de los niveles de glucosa en sangre de ratones genomanipulados con respecto a ratones de tipo silvestre se indican con estrellas.

Figura 7: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones genomanipulados SorCS1 y crías de la misma camada de tipo silvestre. Ratones hembra de tipo silvestre (wt) y genomanipulados SorCS1 (KO) de 59 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h) y se les inyectó por vía intraperitoneal un bolo de D-glucosa 30 (Sigma) (2 mg/g de peso corporal) en una solución salina estéril. Los ratones se anestesiaron con éter dietílico, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital en los tiempos 0, 15, 30, 60 y 120 min después de la inyección, y se midieron los niveles de A) glucosa y B) insulina en plasma. La glucosa en plasma se midió inmediatamente después del muestreo en un monitor automático (Ascensia Contour de Bayer). Los niveles de insulina se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina de ratón 35 ultrasensible (DRG Diagnostics, Marburg, Alemania). Los datos son medias ± SEM para cuatro ratones en cada grupo.

Figura 8: Niveles elevados de glucosa e insulina en plasma en ratones de tipo silvestre en dieta de tipo occidental. Ratones hembra A) + C) y macho B) + D) de tipo silvestre (wt) y genomanipulados SorCS1 (KO) se alimentaron con una dieta de occidental hipercalórica (WD) (24 % de proteínas, 41 % de carbohidratos, 24 % de 40 grasas) (Research Diets. D12451) de 10 semanas de edad a 50 semanas de edad. A las 50 semanas de edad, los animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h), se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras sanguíneas por sangrado retroorbital. Los niveles de glucosa en plasma A) + b) se midieron inmediatamente después del muestreo en un monitor automático (Ascensia Contour de Bayer), mientras que los niveles de insulina en plasma C) + D) se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas 45 de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics, Marburg, Alemania). Los datos son medias ± SEM para 4 a 10 ratones en cada grupo.

Figura 9: Tejido adiposo abdominal en ratones de tipo silvestre y genomanipulados con dieta de tipo occidental.

Ratones hembra A) y macho B) de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 se alimentaron con una dieta de occidental hipercalórica (WD) (24 % de proteínas, 41 % de carbohidratos, 24 % de grasas) (Research Diets. 50 D12451) de 10 semanas de edad a 50 semanas de edad. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y la grasa abdominal (tejido adiposo) se separó y se pesó. Los datos son medias ± SEM para 4 a 10 ratones en cada grupo.

Figura 10: Expresión de IR, IR fosforilado (pY-IR) y Glut4 en tejido muscular y adiposo. Ratones hembra genomanipulados SorCS1 (-/-) y ratones de control de tipo silvestre (+/+) de 50 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía intraperitoneal insulina (Novorapid, Novo Nordisk A/S) 55 (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. Se extrajo tejido A) adiposo y B) muscular y se homogeneizó en tampón de lisis tampón TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, nonidet P-40 al 1 % (Sigma Aldrich) pH 8) que contenía inhibidores de proteasa (CompleteMini). Los lisados se aclararon por centrifugación durante 10 min a 1000 x g, y las concentraciones de proteínas se determinaron por un ensayo de proteínas Bio-Rad. Se separaron cantidades iguales de proteína total para diferentes muestras (100 µg) en un gel SDS-PAGE al 4-16 % y se transfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia). La membrana se analizó por western blotting con anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711), anti-IR-pY (R&D systems, AF2507), anti-Glut4 (Abcam, ab654), y anti-β-actina (Sigma, AF5441) como un control de carga. Se desarrollaron anticuerpos unidos por reactivo SuperSignal West Pico (Pierce) y un Fuji film 5 LAS3000.

Figura 11: Interacción física entre el receptor SorCS1 y de insulina. A) Las células CHO transfectadas con los receptores indicados (únicamente transitorios transfectados con IRA e IRB) se estimularon con insulina durante 30 min seguido de reticulación con DSP 5 nM (Pierce) y posteriormente se lisaron. Los lisados celulares se incubaron con anticuerpo contra IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711) unido a perlas de Gammabind (GE 10 Healthcare). Los complejos precipitados se eluyeron en las perlas lavadas con tampón de carga SDS. El eluato se sometió a SDS-PAGE y análisis Western blot usando α-SorCS1-leu y α-IR para revelar la presencia de un complejo SorCS1:IR. Los lisados en bruto sometidos a análisis Western blot usando α-SorCS1-leu y α-IR se incluyeron para evaluar la eficiencia de transfección. B) Experimento de resonancia de plasmones superficiales (BIAcore) que muestra la interacción directa de la parte extracelular soluble de longitud completa de SorCS1 con el receptor de 15 insulina soluble inmovilizado (IR) (R&D systems). Las concentraciones de SorCS1 soluble usadas fueron 50 nM, 75 nM y 150 nM. La Kd se estima de aproximadamente 5 nM.

Figura 12: Expresión del receptor de insulina en células CHO transfectadas con SorCS1. Las células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas de forma estable con las cuatro variantes de splicing SorCS1 murino (SorCS1-a,-b,-c,-d) y msol.SorCS1 (la parte extracelular de SorCS1) se cultivaron hasta confluencia en medio CHO 20 HyQ-CCM5 libre de suero (HyClone) complementado con antibióticos (50 U/ml de penicilina/50 µg/ml de estreptomicina). Las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón de lisis (Triton X-100 al 1 %, Tris-HCl 20 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0), complementado con inhibidores de proteinasa (CompleteMini, Roche Molecular Biochemicals). Las alícuotas de los lisados, correspondientes a 10 µg de proteína, se disolvieron en tampón de muestra SDS y se sometieron a reducción por SDS-PAGE usando geles de acrilamida al 4-16 %. Para la 25 inmunotransferencia, las proteínas se transfirieron electroforéticamente sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia) y se sondaron con anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711), anti-SorCS1-leu y anti-β-actina (Sigma, AF5441) como un control de carga. Se desarrollaron anticuerpos unidos por reactivo SuperSignal West Pico (Pierce) y un Fuji film LAS3000.

Figura 13: Expresión de IR y SorCS1 en la membrana celular. La expresión de la superficie celular del receptor 30 de insulina y SorCS1 se determinó por biotinilación de la superficie celular. Las células CHO y las células CHO que expresan de forma estable mSorCS1-B y mSorCS1-C se sometieron a biotinilación superficial usando el reactivo de biotinilación impermeable a membrana NHS-SS-biotina (Pierce). Las células se cultivaron hasta confluencia, después de lo cual las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La biotinilación se realizó usando 0,5 mg/ml de NHS-SS-biotina en PBS durante 90 min a 4 ºC con agitación suave. Después del 35 marcado, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo para eliminar la NHS-SS-biotina residual. Posteriormente, las células se solubilizaron en tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, nonidet P-40 al 1 % (Sigma Aldrich) pH 8) que contenía inhibidores de proteasa (CompleteMini) mediante agitación suave sobre hielo durante aproximadamente 10 min. Los lisados se aclararon por centrifugación a 14,000xg durante 5 min a 4 ºC, se guardaron 20 µl del lisado aclarado (fracción de lisado) y el resto del lisado se incubó durante una noche 40 con 100 µl de perlas de estreptavidina-agarosa (Sigma) a 4 ºC con agitación suave. Después de la incubación, la mezcla lisado/perlas se separó por centrifugación a 14,000xg durante 5 min a 4 ºC. La fracción de lisado contiene las proteínas intracelulares de las células (Intra). Las perlas se lavaron dos veces con PBS y las proteínas biotiniladas capturadas (Bio) se eluyeron en las perlas con 150 µl de tampón de muestra SDS. Finalmente, una porción de los lisados biotinilados (Bio) (30 µl), los intracelulares (Intra) (25 µl), y los lisados en bruto (lisado) se sometió a SDS-45 PAGE y análisis Western blot usando anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711), anti-IR-pY (R&D systems, AF2507), anti-Glut4 (Abcam, ab654), y anti-β-actina (Sigma, AF5441) como un control de carga. Se desarrollaron anticuerpos unidos por reactivo SuperSignal West Pico (Pierce) y un Fuji film LAS3000.

Figura 14: Fases de desarrollo hacia diabetes tipo 2 en el ser humano. La diabetes tipo 2 (T2D) se desarrolla en respuesta a la obesidad en sujetos que tienen predisposición genética y adquirida subyacente tanto a la resistencia a 50 la insulina como a la disfunción de las células β. Con el tiempo, la compensación de células β de islotes para la resistencia a la insulina falla, dando como resultado un descenso progresivo de la función de las células β. En consecuencia, el sujeto pasa de una tolerancia a la glucosa normal a una tolerancia a la glucosa alterada (prediabetes) y finalmente a T2D establecida. Se ilustran en el gráfico (línea de color negro) aumentos de la concentración de glucosa en sangre durante el desarrollo de T2D, mostrando el cambio de normal a prediabético, 55 antes del inicio de una diabetes evidente. Además, el nivel de insulina durante el desarrollo de T2D se revela en el mismo gráfico (línea discontinua), que muestra un aumento de la insulina durante el estado prediabético como compensación a la resistencia a la insulina y un grave descenso de la liberación de insulina al inicio de una diabetes evidente como consecuencia de fallo en las células β.

Figura 15: Inmunotinción de insulina de los islotes pancreáticos en ratones de tipo silvestre y genomanipulados de 20 días de edad. Los páncreas se extrajeron y se fijaron con paraformaldehído al 4 %, recientemente preparado en PBS. Las muestras se embebieron en Tissue-Tek (Sakura). Se obtuvieron criosecciones (10 µm) de varias posiciones por todo el páncreas, y se almacenaron a -80 ºC. Para la inmunotinción, los portaobjetos se pusieron en PBS durante 2 x 5 min, se bloquearon en peróxido ácido al 0,2 % (H2O2) en metanol 5 durante 15 min a -20 ºC, se lavaron con PBS (1 x 5 min) y PBS + Triton X-100 al 0,1 % (2 x 10 min) antes de la preincubación con suero fetal de ternero al 10 % (FCS) en PBS durante 30 min. Los portaobjetos se aclararon posteriormente en PBS (3 x 2 min) y se incubaron durante una noche a 4 ºC en anticuerpo primario de cobaya anti-insulina (I-8510, Sigma) diluido en PBS + FCS 10 % (1:500). Los portaobjetos se lavaron con PBS (3 x 15 min), se incubaron con anticuerpo secundario anti-cobaya conjugado con Cy3 (706-165-148, Jackson ImmunoResearch) 10 diluido en PBS + FCS (1:500) en la oscuridad durante 1 h a TA, y posteriormente se lavaron en PBS (3 x 15 min) y se dejaron secar al aire. Finalmente, los portaobjetos se montaron con Vectashield con DAPI (H-1200, Vector Labs) y se analizaron mediante microscopía de láser confocal de barrido (LMS 510, Carl Zeiss).

Figura 16: Alineamiento de SorCS1

Alineamiento de secuencia de SorCS1 de origen humano (homo sapiens), de chimpancé (Pan troglodytes), vaca 15 (Bos Taurus), ratón (Mus musculus), rata (Rattus norvegicus), perro (Canis lupus familiaris) y pollo (Gallus gallus). La identidad de secuencia es como se demuestra en la tabla 2.

Tabla 2: Identidad de secuencia con respecto a SorCS1 humano

Especie: Proteína (% de identidad) ADN (% de identidad)

Humano: 100 100

Chimpancé: 99,6 99,4

Perro: 97,6 92,5

Vaca: 92,9 89,8

Ratón: 93,2 87,7

Rata: 93,2 88,0

Pollo: 85,3 79,7

Figura 17: Descenso de los niveles de glucosa en plasma en ratones hembra de tipo silvestre y 20 genomanipulados SorCS1 después de la sobreexpresión hepática de SorCS1 soluble.

A ratones hembra de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 se les inyectó un adenovirus que sobreexpresaba SorCS1 soluble. El adenovirus recombinante para la expresión de SorCS1 soluble humano (hsol.SorCS1) se generó como se indica a continuación:

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pcDNA3.1/Zeo(-)/hsol.SorCS1 que codificaba el ADNc de SorCS1 soluble humano (aminoácidos 1-1100) se digirió con Pme1 y Apa1 y el fragmento que codificaba hsol.SorCS1 se insertó en el plásmido lanzadera pVQpacAd5CMVK-NpA (ViraQuest Inc, North Liberty, IA). ViraQuest Inc, North Liberty, IA, usó entonces este plásmido lanzadera para la generación y propagación de adenovirus que sobreexpresan hsol.

SorCS1. Ratones hembra genomanipulados SorCS1 y de tipo silvestre de 40 semanas de edad se mantuvieron en 30 ayuno durante una noche. Por la mañana, el día 0, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y la glucosa plasmática se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer). Después, a los ratones se les inyectó en la vena de la cola 2E9 pfu de un vector adenoviral con hsol.SorCS1 o LacZ como control negativo (de ViraQuest Inc, North Liberty, IA). El día 7, las mediciones de la glucosa en plasma se repitieron en los ratones en ayunas durante una noche para evaluar el efecto de la proteína SorCS1 y 35

LacZ. Los datos son medias ± SEM para 3 ratones en cada grupo. Los ratones con sobreexpresión de SorCS1 soluble mostraron un descenso significativo de la glucosa en plasma (≈40 %) tanto en ratones genomanipulados SorCS1 como en ratones de tipo silvestre. Este aumento no se observó en los ratones que recibieron el virus de control LacZ.

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Figura 18: Expresión de IR, IR fosforilado y Glut4 en tejido muscular y adiposo de ratones hembra genomanipulados SorCS1 que sobreexpresan SorCS1 soluble.

A ratones hembra genomanipulados SorCS1 (-/-) de 40 semanas de edad se les inyectó un vector adenoviral que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control negativo (véase el protocolo detallado en la figura 17). El día 12 después de la inyección del virus, los ratones se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía 45 intraperitoneal insulina (Novorapid, Novo Nordisk A/S) (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. Se extrajo tejido A) muscular y B) adiposo y se homogeneizó en tampón de lisis tampón TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, nonidet P-40 al 1 %, pH 8) que contenía inhibidores de proteasa (Complete Mini, Roche) e inhibidores de fosfatasa (cóctel 1, Sigma Aldrich). Los lisados se aclararon por centrifugación durante 10 min a 10.000 x g, y la concentración de proteína se determinó por ensayo de 50 proteínas Bio-Rad. Se separó una cantidad igual de proteína total (50 µg) para diferentes muestras en un gel Bis-tris al 4-12 % (Nupage, Invitrogen) y se transfirió sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia). Las membranas se analizaron por western blotting con anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711), anti-IR-pY (R&D systems, AF2507) y anti-Glut4 (Abcam, ab654). Se desarrollaron anticuerpos unidos por Super-Signal West Pico reagent (Pierce) y un Fuji film LAS3000. Tanto el tejido A) muscular como el B) adiposo de ratones 5 genomanipulados SorCS1 que sobreexpresan SorCS1 soluble ha cantidades elevadas de IR, IR fosforilado (IR-pY) y glut4 en comparación con los ratones que expresan la proteína de control LacZ, lo que sugiere un aumento de la sensibilidad a la insulina en los ratones que recibieron el virus hsol.SorCS1.

Figura 19: Descenso de los niveles en plasma de glucosa e insulina en ratones hembra diabéticos db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble. 10

Para evaluar el efecto del SorCS1 soluble en un modelo de ratón obeso que desarrolla espontáneamente diabetes tipo 2, se usó la cepa de ratón db/db (BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac de Taconic). Estos ratones carecen del receptor de leptina, en consecuencia los ratones se vuelven obesos y desarrollan resistencia a la insulina y finalmente diabetes graves a la edad de 6-8 semanas. Se inyectó adenovirus que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control (como se describe en la figura 17), para examinar el efecto sobre los niveles en plasma de glucosa e insulina. En 15 detalle, los ratones hembra db/db de 10 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche. Por la mañana, el día 0, los ratones se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital. A) La glucosa en sangre se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer), mientras que B) los niveles de insulina en plasma se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics). Después, a los ratones se 20 les inyectó en la vena de la cola 2E9 pfu de un vector adenoviral con hsol.SorCS1 o LacZ (de ViraQuest Inc, North Liberty, IA) como virus de control negativo. El día 7, las mediciones de la glucosa en plasma e insulina en plasma se repitieron en los ratones en ayunas durante una noche para evaluar el efecto de la proteína SorCS1 y LacZ. Los datos son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo. El día 7, los ratones hembra db/db con sobreexpresión de SorCS1 soluble mostraron un descenso significativo de la glucosa en sangre (≈35 %) en comparación con los 25 ratones que recibieron el virus de control LacZ. Además, el día 7 hubo también un descenso significativo de los niveles en plasma de insulina en los ratones hembra db/db que sobreexpresaban SorCS1 soluble en comparación con los ratones que expresan el virus de control. Por lo tanto, la sobreexpresión de SorCS1 soluble mejora el estatus diabético en este tipo de modelo de ratón diabético de tipo 2.

Figura 20: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones hembra diabéticos db/db con sobreexpresión de 30 SorCS1 soluble.

A ratones hembra db/db se les inyectó adenovirus que expresaban SorCS1 soluble o LacZ (véase la figura 17), donde el día 3 ayunaron durante una noche (16 h). El día 4, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal un bolo de glucosa (2 mg/g de peso corporal) en una solución salina estéril. Los animales se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital en los tiempos 0, 15, 30, 90 y 150 min 35 después de la inyección. Los niveles de glucosa en sangre se midieron inmediatamente después del muestreo en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer). Los datos son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo. Los resultados muestran que la sobreexpresión de SorCS1 soluble hace a los ratones más sensibles a la insulina según el nivel de glucosa en sangre regresa al valor inicial después de 150 min. Por el contrario, la glucosa en sangre en ratones que expresan LacZ permanece elevada durante el transcurso de los experimentos. En conclusión, los 40 ratones hembra db/db con sobreexpresión de SorCS1 soluble son menos resistentes a la insulina.

Para evaluar el efecto del SorCS1 soluble en un modelo de ratón obeso que desarrolla espontáneamente diabetes tipo 2, se usó la cepa de ratón db/db (BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac de Taconic). Estos ratones carecen del receptor 45 de leptina, en consecuencia los ratones se vuelven obesos y desarrollan resistencia a la insulina y finalmente diabetes graves a la edad de 6-8 semanas. Se inyectó adenovirus que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control (como se describe en la figura 17), para examinar el efecto sobre los niveles en plasma de glucosa e insulina. En detalle, los ratones macho db/db de 6 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche. Por la mañana, el día 0, los ratones se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras de sangre por sangrado 50 retroorbital. A) La glucosa en sangre se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer), mientras que B) los niveles de insulina en plasma se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics). Después, a los ratones se les inyectó en la vena de la cola 2E9 pfu de un vector adenoviral con hsol.SorCS1 o LacZ (de ViraQuest Inc, North Liberty, IA) como virus de control negativo. El día 7, las mediciones de la glucosa en plasma e insulina en plasma se 55 repitieron en los ratones en ayunas durante una noche para evaluar el efecto de la proteína SorCS1 y LacZ. Los datos son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo. El día 7, los ratones macho db/db con sobreexpresión de SorCS1 soluble mostraron un descenso significativo de la glucosa en sangre (≈35 %) en comparación con los ratones que recibieron el virus de control LacZ. Puesto que el descenso en los niveles de glucosa no se contabilizó por un aumento de la concentración de insulina en comparación con los animales tratados con LacZ, se concluye que la sobreexpresión de SorCS1 soluble mejora el estatus diabético en los ratones macho db/db diabéticos de tipo 2.

Figura 22: Localización subcelular de Glut4 en el tejido muscular de ratones macho db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble. 5

Para evaluar si la sobreexpresión de SorCS1 soluble puede cambiar la distribución de Glut4, se realizó un fraccionamiento subcelular en tejido muscular de ratones macho db/db que sobreexpresaban SorCS1 soluble. En detalle, a los ratones macho db/db de 6 semanas de edad se les inyectó en la vena de la cola un vector adenoviral que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control, como se describe en la figura 17. El día 7 después de la inyección del virus, los ratones se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía intraperitoneal insulina 10 (Novorapid, Novo Nordisk A/S) (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. El tejido muscular de 5 ratones a los que se les inyectó el mismo virus se extrajo, se agrupó y se transfirió a 5 ml de sacarosa tamponada con HEPES (sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM, HEPES-KOH 20 mM, pH 7,4), se homogeneizó mediante 10 golpes arriba y abajo usando un mortero de Teflon, y se centrifugó a 1000 x g durante 10 min. Por lo tanto, se obtuvieron fracciones mitocondriales pesadas, mitocondriales ligeras y microsomales 15 mediante varias vueltas de centrifugación. En primer lugar, el sobrenadante se centrifugó a 3.000 x g durante 10 min, después el sobrenadante resultante se centrifugó a 16.000 x g durante 10 min, y finalmente, el sobrenadante resultante se centrifugó a 100.000 x g durante 45 min dando un gránulo que contenía la fracción microsomal. Las fracciones microsomales se suspendieron de nuevo en 0,5 ml de una solución tamponada con HEPES y se sometieron a centrifugación de gradiente de sacarosa (velocidad). Los 0,5 ml de muestras microsomales se cargaron 20 sobre un gradiente de sacarosa de 12 ml lineal de 0,8 M a 1,6 M en HEPES 1 M, pH 7,2, y se centrifugaron durante 18 h en un rotor basculante (SW41 Ti) a 84.000 x g. Cada gradiente se separó en 24 fracciones partiendo de la parte superior del tubo. Finalmente, la electroforesis en gel y el análisis Western blotting analizaron la expresión de Glut4 en las diferentes fracciones. El resultado muestra que la distribución de sedimentación de Glut4 en el tejido muscular que sobreexpresa SorCS1 es diferente del tejido muscular que expresa la proteína de control lacZ. Por lo tanto, la 25 acumulación de glut4 se desvía de las fracciones 2 - 4 después del tratamiento con LacZ a las fracciones 8-12 en el grupo SorCS1. Esto indica que la sobreexpresión de SorCS1 soluble puede cambiar la distribución de Glut4 y modular así la captación de glucosa.

Figura 23 A+B: Análisis de secuencias de contacto SorCS1/IR por análisis SPOT.

La co-inmunoprecipitación y los experimentos BIAcore (resonancia de plasmones superficiales) mostró que SorCS1 30 puede asociarse físicamente al receptor de insulina. Aquí, se usó el análisis de síntesis SPOT para identificar secuencias aminoacídicas lineales en cualquiera de los dos receptores que pueden participar en la interacción proteína-proteína. En la práctica, los filtros se descubrieron con péptidos 15-mer consecutivos solapados por tres aminoácidos del extremo N a C de SorCS1 (B) e IR (A), y los filtros se sondaron posteriormente con (A) SorCS1 humano soluble marcado con 125I o (B) receptor de insulina marcado con histidina (R&D systems, n.º 1544-IR/CF). 35 Después, los filtros se lavaron y las proteínas unidas se visualizaron. El ensayo de unión se realizó directamente en la membrana peptídica a través de inmunodetección o radiografía de la proteína unida. En detalle, la membrana se lavó 1 x 10 min en etanol al 96 % seguido de 3 x 10 min de lavado con 1 x TBS (Tris-HCl 500 mM, NaCl 1500 mM), pH 8,0 y durante 3 h de incubación en tampón de bloqueo de membrana (BB; 1 x tampón de bloqueo (B6429, Sigma), 1 x TBS, sacarosa al 5 %). La membrana de IR bloqueada se incubó durante una noche con 125I-sol.SorCS1 40 (400.000 cpm/ml de BB) y la membrana de SorCS1 con his-IR (10 µg/ml de BB). Ambas membranas se lavaron 3 x 10 min con 1 x TBS. A) his-IR unido en la membrana SorCS1 se detectó por inmunodetección usando un anticuerpo primario contra la etiqueta de histidina, α-histidina (Invitrogen) (monoclonal de ratón) seguido de un anticuerpo anti-ratón secundario marcado con HRP (Sigma). El anticuerpo unido se visualizó usando el reactivo de detección por Western blotting de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Amersham biosciences) y un Fuji film LAS1000). El 45 SorCS1 radiomarcado unido a la membrana de IR se detectó por radiografía usando una placa de imagen Fuji, y después de 12 h de exposición, se desarrolló posteriormente usando un Fujifilm FLA3000. Una señal (SPOT) indica que el ligando se une a un péptido. Los epítopos de unión lineal solapantes se representan por señales de manchas adyacentes. Las SPOT se enmarcan en las figuras de membrana y las secuencias clave correspondientes a las SPOT se indican por debajo de la membrana. 50

Figura 24 A+B: Perfil de expresión génica del tejido adiposo de ratones genomanipulados SorCS1 por matrices de PCR.

Usando un análisis de matriz génica del tejido adiposo para ratones adiposos genomanipulados SorCS1 y de tipo silvestre, se ensayó la expresión de A) 84 genes relacionados con la ruta de señalización de la insulina de ratón y B) 84 genes relacionados con la señalización de lipoproteína de ratón y el metabolismo del colesterol. En la práctica, la 55 primera hebra de ADNc se sintetizó a partir de ARN total (Applied Biosystems) de tejido adiposo genomanipulado SorCS1 (-/-) y de tipo silvestre (+/+) de ratones hembra de 50 semanas de edad (n = 3). Después, la supermatriz de la A) ruta de señalización de insulina de ratón (matrices PCR del perfilador PAMM-030A RT2) o B) la señalización de lipoproteína de tipo ratón y el metabolismo del colesterol (matrices de PCR del perfilador PAMM-080-A RT2) se procesaron usando una plataforma ABI7900 (Applied Biosystems) y PCR SYBR Green/Rox (SABiosciences). AROS Applied Biotechnology, Aarhus, Dinamarca, hizo los análisis de expresión. Los genes que muestran una expresión más de 3 veces regulada en ascenso o descenso en los ratones genomanipulados SorCS1 en comparación con los ratones de tipo silvestre, se enumeran en las tablas superiores y sus funciones conocidas se indican en la tabla a continuación. Varios genes en A y B muestran una expresión cambiada en los ratones genomanipulados SorCS1 en 5 comparación con los ratones de tipo silvestre, lo que indica que las rutas de señalización de la insulina y el colesterol y el metabolismo se alteran en los ratones genomanipulados SorCS1.

Ejemplos

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Ejemplo 1: Expresión de variantes de splicing mSorCS1 en tejidos de ratones

La expresión de la parte extracelular de SorCS1 (SorCS1.ex) y las cinco variantes de splicing de cola SorCS1-a, -b, -c, c+ y -d se determinan en diversos tejidos de ratones adultos (véase la figura 3). La organización del gen SorCS1 y las secuencias aminoacídicas de los dominios citoplasmáticos de las variantes de splicing se muestran en la figura 15 2A y 2B, respectivamente.

La expresión de la parte extracelular de SorCS1 (SorCS1.ex) y las variantes de splicing se determinaron por PCR de transcripción inversa (RT-PCR) con pares de cebadores específicos. Los cebadores específicos de SorCS1.ex (SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58) abarcan las uniones del exón 21 a 24 dando un producto de 390 pb. Los cebadores 20 específicos de SorCS1-a (SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60) abarcan las uniones del exón 21 a 25 dando un producto de 586 pb. Los cebadores específicos de SorCS1-b (SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62) abarcan las uniones del exón 21 a 25 y las uniones del exón 25 a 27 dando un producto de 621 pb. Los cebadores específicos de SorCS1-c (SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64) abarcan las uniones del exón 21 a 26 dando un producto de 626 pb. Los cebadores específicos de SorCS1-d (SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66) abarcan las uniones del exón 21 a 25 y 25 la unión del exón 25 a 28 dando un producto de 636 pb. Las preparaciones de ARN total se hicieron a partir de hipocampo, hígado, tejido adiposo (grasa), músculo, páncreas y testículos aislados de ratones de tipo silvestre e hipocampo e hígado de ratones KO SorCS1 de aproximadamente 8 semanas de edad usando el kit de purificación de ARN total Versagene (Gentra Systems). En resumen, los tejidos se extrajeron quirúrgicamente y se congelaron en hielo seco. Las muestras de tejido congelado se alteraron y se homogeneizaron durante hasta 60 s usando un 30 estator de rotor (Ultra-Turrax, IKA-Werke) en 800 µl de tampón de lisis que contenía Tris (2-carboxietil) fosfina 5 mM (TCEP) y el ARN total se purificó de acuerdo con el protocolo de los fabricantes para el kit. Se realizaron RT-PCR con 0,75 µg a 1 µg de ARN total de cada muestra usando el kit RT-PCR de una etapa TITANIUM (Clontech). Todas las reacciones se realizaron en 50 µl de volumen que contenía 1 x tampón de una etapa (tricina 40 mM, KCI 20 mM, MgCl2 3 mM, 3,75 µg/µl de BSA), 0,2 mM de cada dNTP, 25 µl de agente termoestabilizante, 10 µl fusión por GC, 35 cebador Oligo(dT) 20 µM, 20 unidades de inhibidor de RNasa recombinante, 1 x mezcla de enzimas Taq RT-TITANIUM™ (todos suministrados con el kit) y 45 µM de cada cebador. Las condiciones de PCR fueron: 50 ºC durante 1 hora, 94 ºC durante 5 min, 35 ciclos a 94 ºC durante 30 s, 64 ºC durante 30 s, 68 ºC durante 1 min, y 68 ºC durante 2 min.

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Ejemplo 2: Generación del ratón genomanipulado mSorCS1

Para investigar la función de SorCS1 y sus diferentes variantes de splicing, se generó un ratón genomanipulado condicional por recombinación homóloga en células madre embrionarias. La recombinación homóloga se inició por la FLP recombinasa de sitio específico en un sitio FRT, que da como resultado un "intercambio de casete mediado por 45 recombinasa". El evento de recombinación se ilustra en la figura 4A, donde el gen SorCS1 se "intercambia" con el gen Neo, generando así un ratón genomanipulado completo donde todas se variantes de splicing SorCS1 se alteran.

La expresión de SorCS1 se ensayó en ratones de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 por RT-PCR en ARNm del hipocampo de ratones de tipo silvestre (WT) y genomanipulados SorCS1 (KO) usando pares de cebadores 50 específicos para identificar la parte extracelular de SorCS1 (ext) o cada una de las cinco variantes de cola (a, b, c, c+ y d). Los resultados mostrados en la figura 4B revelan que la transcripción de todas las variantes de splicing mSorCS1 se alteran en el ratón genomanipulado SorCS1.

El análisis Western blot del córtex reveló la falta de proteína mSorCS1 en los ratones genomanipulados (KO) 55 mSorCS1 (figura 4C). Las proteínas se extrajeron como lisados del córtex obtenido en E14.5. El tejido se disolvió en 100 µl de tampón TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, nonidet P-40 al 1 % (Sigma Aldrich) pH 8) que contenía inhibidores de proteasa (CompleteMini) mediante agitación vorticial vigorosa. Después de la congelación durante una noche a 20 ºC, los lisados se agitaron vorticialmente y se centrifugaron durante 10 min a 1000 x g. Los lisados (sobrenadante) se transfirieron a un nuevo tubo y el ensayo de proteínas Bio-Rad midió la concentración de proteínas. Los lisados (200 µg) se resolvieron en SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Después, la inmunotransferencia se sondeó con un anticuerpo policlonal de conejo contra la parte rica en leucina de SorCS1 (α-hSorCS1-leu).

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Ejemplo 3: Niveles de glucosa en plasma en ratones genomanipulados SorCS1

La diabetes tipo 2 (T2D) se desarrolla en respuesta a la obesidad en sujetos que tienen predisposición genética y adquirida subyacente tanto a la resistencia a la insulina como a la disfunción de las células β. Con el tiempo, la compensación de células β de islotes para la resistencia a la insulina falla, dando como resultado un descenso 10 progresivo de la función de las células β. En consecuencia, el sujeto pasa de una tolerancia a la glucosa normal a una tolerancia a la glucosa alterada (prediabetes) y finalmente a T2D establecida. Se ilustran en el gráfico (línea de color negro) aumentos de la concentración de glucosa en sangre durante el desarrollo de T2D, mostrando el cambio de normal a prediabético, antes del inicio de una diabetes evidente. Además, el nivel de insulina durante el desarrollo de T2D se revela en el mismo gráfico (línea discontinua), que muestra un aumento de la insulina durante el estado 15 prediabético como compensación a la resistencia a la insulina y un grave descenso de la liberación de insulina al inicio de una diabetes evidente como consecuencia de fallo en las células β (figura 14).

Para examinar el ratón genomanipulado SorCS1 con respecto al metabolismo de la glucosa, los niveles de glucosa en plasma se determinaron en ratones machos (figura 5A) y ratones hembra (figura 5B) a diferente edad. Los 20 animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h). Los ratones se anestesiaron con éter dietílico, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y la glucosa plasmática se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascensia Contour de Bayer). Los resultados en la figura 5B muestran un descenso estadísticamente significativo de los niveles de glucosa en plasma de ratones hembra genomanipulados SorCS1 a una edad de 23 y 50 semanas con respecto a los ratones de tipo silvestre. 25

Ejemplo 4: Niveles de insulina en plasma en ratones hembra genomanipulados SorCS1

Para examinar adicionalmente el ratón genomanipulado SorCS1 con respecto al metabolismo de la glucosa, los niveles de insulina en plasma se determinaron en ratones hembra genomanipulados SorCS1 de 10 a 20 semanas de 30 edad (figura 6). Los animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h). Los ratones se anestesiaron con éter dietílico, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y los niveles de insulina en plasma se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics, Marburg, Alemania). Los datos son medias ± SEM para 4 a 10 ratones en cada grupo. De acuerdo con los resultados mostrados en la figura 5B, los resultados de la figura 6 muestran un aumento estadísticamente 35 significativo de los niveles de insulina en plasma de ratones hembra genomanipulados SorCS1 a una edad de 23 y 50 semanas con respecto ratones de tipo silvestre.

Los niveles de insulina se investigaron adicionalmente por inmunotinción de tejidos de ratones de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 de 20 días de edad. 40

Los páncreas se extrajeron y se fijaron con paraformaldehído al 4 %, recientemente preparado en PBS. Las muestras se embebieron en Tissue-Tek (Sakura). Se obtuvieron criosecciones (10 µm) de varias posiciones por todo el páncreas, y se almacenaron a -80 ºC. Para la inmunotinción, los portaobjetos se pusieron en PBS durante 2 x 5 min, se bloquearon en peróxido ácido al 0,2 % (H2O2) en metanol durante 15 min a -20 ºC, se lavaron con PBS (1 45 x 5 min) y PBS + TritonX-100 al 0,1 % (2 x 10 min) antes de la preincubación con suero fetal de ternero al 10 % (FCS) en PBS durante 30 min. Posteriormente, se aclararon en PBS (3 x 2 min) y se incubaron durante una noche a 4 ºC en anticuerpo primario de cobaya anti-insulina (I-8510, Sigma) diluido en PBS + FCS 10 % (1:500). Los portaobjetos se lavaron con PBS (3 x 15 min), se incubaron con anticuerpo secundario anti-cobaya conjugado con Cy3 (706-165-148, Jackson ImmunoResearch) diluido en PBS + FCS (1:500) en la oscuridad durante 1 h a TA, y 50 posteriormente se lavaron en PBS (3 x 15 min) y se dejaron secar al aire. Finalmente, los portaobjetos se montaron con Vectashield con DAPI (H-1200, Vector Labs) y se analizaron mediante microscopía de láser confocal de barrido (LMS 510, Carl Zeiss). Estos datos sugieren que el páncreas lucha para compensar el descenso de sensibilidad a la insulina aumentando el tamaño de los islotes de células beta y la producción de insulina.

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Ejemplo 5: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones hembra genomanipulados SorCS1

La tolerancia a la glucosa de los ratones hembra genomanipulados SorCS1 se ensayó midiendo los niveles de glucosa e insulina en diferentes puntos temporales después de una inyección con glucosa (figura 8). Los ratones hembra de 59 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h) y se les inyectó por vía intraperitoneal un bolo de D-glucosa (Sigma) (2 mg/g de peso corporal) en una solución salina estéril. Los ratones se anestesiaron con éter dietílico, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital en los tiempos 0, 15, 30, 60 y 120 min después de la inyección, y los niveles de glucosa en plasma (figura 8A) y los niveles de insulina (figura 8B) se midieron. Los niveles de glucosa en plasma se midieron inmediatamente después del muestreo en un monitor 5 automático (Ascensia Contour de Bayer). Los niveles de insulina se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics, Marburg, Alemania). Los resultados de la figura 7B muestran un aumento de los niveles de insulina en ratones hembra genomanipulados SorCS1 en todos los puntos temporales (0-120 min) después de la inyección.

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Ejemplo 6: Niveles elevados de glucosa e insulina en plasma en ratones de tipo silvestre en dieta de tipo occidental

Ratones hembra (figura 8A+8C) y macho (figura 8B+8D) de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1 se alimentaron con una dieta de occidental hipercalórica (WD) (24 % de proteínas, 41 % de carbohidratos, 24 % de grasas) 15 (Research Diets. D12451) de 10 semanas de edad a 50 semanas de edad. A las 50 semanas de edad, los animales se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h), se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras sanguíneas por sangrado retroorbital. Los niveles de glucosa en plasma (figura 8A+8B) se midieron inmediatamente después del muestreo en un monitor automático (Ascensia Contour de Bayer), mientras que los niveles de insulina en plasma (figura 8C+8D) se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina 20 de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics, Marburg, Alemania). Los resultados representados en la figura 6 muestran que los niveles en plasma de glucosa e insulina son elevados en ratones de tipo silvestre en dieta de tipo occidental.

Ejemplo 7: Demostración del aumento de la fosforilación del receptor de insulina en ratones genomanipulados SorCS1. 25

Ratones hembra de control genomanipulados SorCS1 (-/-) y de tipo silvestre (+/+) de 40 y 50 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía intraperitoneal insulina (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. El músculo tisular se extrajo y se homogeneizó en tampón de lisis tampón TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, nonidet P-40 al 1 % 30 (Sigma Aldrich), pH = 8,0 que contenía inhibidores de proteasa (CompleteMini, Roche) y de fosfatasa (Cóctel 1, Sigma Aldrich). Los lisados se aclararon por centrifugación durante 10 min a 1000 x g, y la concentración de proteína se determinó por ensayo de proteínas Bio-Rad. Se separaron cantidades iguales de proteína total de diferentes muestras (100 µg) en un gel SDS-PAGE al 4-16 % y se transfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia). La membrana se sometió a Western blotting con anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, 35 sc-711), anti-IR-pY (R&D, AF 2507) y anti-β-actina (Sigma Aldrich, AF5441) como un control de carga. Además, la fosforilación de tirosina de IR también se analizó por inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10). La inmunoprecipitación se realizó como se indica a continuación. Se incubaron 100 µg de proteína de tejido muscular con perlas de Gammabind G-Sepharose (Amersham Bioscience) recubiertas con anti-fosfotirosina (4G10, Upstate/Millipore) durante una noche a 4 ºC. Las perlas se lavaron posteriormente 4 x 5 min, y finalmente se 40 suspendieron de nuevo en tampón de muestra reductor (DTE 20 mM, SDS al 2,5 %) y se hirvieron. El sobrenadante de las muestras hervidas, que contenía proteínas precipitadas, se analizó por Western blotting usando anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711). Todos los anticuerpos unidos se desarrollaron por reactivo Super Signal West Pico (Pierce) y un Fuji film LAS3000. La figura 10 muestra un aumento de la expresión del receptor de insulina y un descenso de la fosforilación del receptor de insulina en ratones genomanipulados SorCS1 de 50 semanas de edad, 45 lo que sugiere que el IR se acumula en un compartimento en los ratones genomanipulados SorCS1, impidiendo así la fosforilación y activación del receptor. Los resultados sugieren que SorCS1 tiene una función en la señalización de la insulina y la activación del receptor de insulina.

Ejemplo 8: Interacción física entre el receptor SorCS1 y de insulina 50

Para examinar la interacción entre SorCS1 y el receptor de insulina (IR), las células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas de forma estable con las cuatro variantes de splicing SorCS1 murino (SorCS1-a,-b,-c,-d) y msol.SorCS1 (la parte extracelular de SorCS1) se cultivaron hasta confluencia en medio CHO HyQ-CCM5 libre de suero (HyClone) complementado con antibióticos (50 U/ml de penicilina/50 µg/ml de estreptomicina). Las células se 55 lavaron con PBS y se lisaron en tampón de lisis (Triton X-100 al 1 %, Tris-HCl 20 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0), complementado con inhibidores de proteinasa (CompleteMini, Roche Molecular Biochemicals). Las alícuotas de los lisados, correspondientes a 10 µg de proteína, se disolvieron en tampón de muestra SDS y se sometieron a reducción por SDS-PAGE usando geles de acrilamida al 4-16 %. Para la inmunotransferencia, las proteínas se transfirieron electroforéticamente sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia) y se sondaron con anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711), anti-SorCS1-leu y anti-β-actina (Sigma, AF5441) como un control de carga. Se desarrollaron anticuerpos unidos por reactivo SuperSignal West Pico (Pierce) y Fuji film LAS3000. Las líneas celulares transfectadas de forma estable con las diferentes variantes de splicing de SorCS1 mostraron una expresión elevada del IR en comparación con las células CHO sin expresión de SorCS1 (figura 12). 5 Para identificar la localización celular de la cantidad elevada de IR en las células transfectadas con SorCS1 se realizó una biotinilación superficial. Las células CHO y las células CHO que expresan de forma estable mSorCS1-B y mSorCS1-C se sometieron a biotinilación superficial usando el reactivo de biotinilación impermeable a membrana NHS-SS-biotina (Pierce). Las monocapas celulares confluentes se lavaron en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y la biotinilación se realizó usando 0,5 mg/ml de NHS-SS-biotina en PBS durante 90 min a 4 ºC con 10 agitación suave. Después del marcado, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo para eliminar la NHS-SS-biotina residual. Posteriormente, las células se solubilizaron en tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, nonidet P-40 al 1 % (Sigma Aldrich) pH 8) que contenía inhibidores de proteasa (CompleteMini) mediante agitación suave sobre hielo durante aproximadamente 10 min. Los lisados se aclararon por centrifugación a 14,000xg durante 5 min a 4 ºC, se guardaron 20 µl del lisado aclarado (fracción de lisado) y el resto 15 del lisado se incubó durante una noche con 100 µl de perlas de estreptavidina-agarosa (Sigma) a 4 ºC con agitación suave. Después de la incubación, la mezcla lisado/perlas se separó por centrifugación a 14,000xg durante 5 min a 4 ºC. La fracción de lisado contiene las proteínas intracelulares de las células (Intra). Las perlas se lavaron dos veces con PBS y las proteínas biotiniladas capturadas (Bio) se eluyeron en las perlas con 150 µl de tampón de muestra SDS. Finalmente, una porción de los lisados biotinilados (Bio) (30 µl), los intracelulares (Intra) (25 µl), y los 20 lisados en bruto (lisado) se sometió a SDS-PAGE y análisis Western blot usando anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711), anti-IR-pY (R&D systems, AF2507), anti-Glut4 (Abcam, ab654), y anti-β-actina (Sigma, AF5441) como un control de carga. La cantidad elevada del receptor de insulina en las células SorCS1-B y SorCS1-C se localizó sobre la superficie celular (en la fracción Bio), en localización conjunta con una porción de las proteínas SorCS1 (figura 13), lo que indica que SorCS1 regula la expresión de IR mediante interacción física y/o reduciendo el movimiento de 25 la proteína IR.

Ejemplo 9: Demostración de la formación del complejo SorCS1:IR.

Para examinar la interacción física potencial entre SorCS1 e IR, se usaron células CHO transfectadas de forma 30 estable con plásmidos que codifican SorCS1-B y -C y posteriormente transfectadas de forma transitoria con IRA e IRB para la inmunoprecipitación. Las células se transfectaron con plásmidos que codifican IRAe IRB usando el kit HiFect (Amaxa) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Después de dos días de crecimiento y una confluencia al 80 %, las células se entrecruzaron con DSP (Peirce) y posteriormente se lisaron. Los lisados celulares se incubaron con anticuerpo contra IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711) unido a perlas de Gammabind (GE Healthcare). Los 35 complejos precipitados se eluyeron en las perlas lavadas con tampón de carga SDS y se sometieron a SDS-PAGE y análisis Western blot usando anti-SorCS1-leu y anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711). El análisis Western blot reveló la presencia de un complejo SorCS1:IR (figura 11A). La interacción directa de los dominios extracelulares de SorCS1 e IR también se demostró usando resonancia de plasmones superficiales (Biacore, Suecia) usando CaHBS como tampón de realización convencional (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2 mM, EGTA 1 mM, tween-40 20 al 0,005 %). Un chip biosensor de Biacore (CM5, cat. n.º BR-1000-14) se activó usando el método NHS/EDC como se describe por el proveedor seguido de revestimiento con IR soluble (R&D systems, 28-956). El SorCS1 soluble mostró una fuerte unión al receptor de insulina soluble con una Kd estimada de aproximadamente 5 nM (figura 11B).

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Ejemplo 10: Análisis de sitios de contacto de SorCS1/IR en base a la síntesis SPOT.

La co-inmunoprecipitación y los experimentos Biacore mostraron una interacción de proteínas a nivel molecular completo. Sin embargo, el método de síntesis SPOT se usa para identificar la interacción de la proteína a nivel aminoacídico usando un barrido derivado de proteínas de péptidos solapantes de SorCS1 o IR, identificando así 50 pequeños agonistas peptídicos SorCS1. La síntesis SPOT mapea epítopos lineales (cadena de proteína implicada en la interacción) usando péptidos de solapamiento obtenidos a partir de toda la secuencia primaria de SorCS1-a humano (figura 23A) o IR-B humano (figura 23B). En detalle, la secuencia SorCS1 e IR se fragmenta y se sintetiza sobre celulosa con péptidos de solapamiento cortos (15 aminoácidos de longitud y se cambiaron por 3 aminoácidos) del extremo C o extremo N, que posteriormente se sonda para la unión a la proteína compañera respectiva, proteína 55 IR (marcada con histidina) (R&D systems, n.º 1544-IR/CF) y proteína SorCS1 soluble de ratón (marcada con I125). El ensayo de unión se realiza directamente en la membrana peptídica a través de inmunodetección o radiografía de la proteína unida. En detalle, la membrana se lava 1 x 10 min en etanol al 96 % seguido de 3 x 10 min de lavado con 1 x TBS (Tris-HCl 500 mM, NaCl 1500 mM), pH 8,0 y durante 3 h de incubación en tampón de bloqueo de membrana (BB; 1 x tampón de bloqueo (B6429, Sigma), 1 x TBS, sacarosa al 5 %). La membrana de IR bloqueada se incuba durante una noche con I(BB; 1 x tampón de bloqueo (B6429, Sigma), 1 x TBS, sacarosa al 5 %). La membrana de IR bloqueada se incuba durante una noche con I(BB; 1 x tampón de bloqueo (B6429, Sigma), 1 x TBS, sacarosa al 5 %). La membrana de IR bloqueada se incuba durante una noche con I

Ejemplo 11: Unión de péptidos específicos a SorCS1 o IR

El análisis SPOT identificó la unión de los péptidos candidatos sintéticos SorCS1 o IR a su proteína ligando (IR y 15 SorCS1). La unión se confirmó adicionalmente por análisis de resonancia de plasmones superficiales (Biacore, Suecia) (figura 11 B) usando CaHBS como tampón de realización estándar (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2 mM, EGTA 1 mM, tween-20 al 0,005 %). Un chip biosensor de Biacore (CM5, cat. n.º BR-1000-14) se activó usando el método NHS/EDC como se describe por el proveedor seguido de revestimiento con IR soluble (R&D systems, 28-956). Se ensayó SorCS1 de longitud completa para la unión a IR por paso sobre el chip biosensor, 20 mostrando una curva de unión sigmoidea positiva, indicando una interacción directa de la parte extracelular de longitud completa soluble de SorCS1 con el receptor de insulina soluble inmovilizado (IR)

Ejemplo 6: Estudios de competición. Los péptidos SorCS1 e IR sintéticos que se unen a las proteínas de ligando se usan en estudios de competición para establecer su influencia en la interacción entre SorCS1 e IR en el complejo 25 SorCS1:IR. Un chip biosensor de Biacore (CM5, cat. n.º BR-1000-14) se activó usando el método NHS/EDC como se describe por el proveedor seguido de revestimiento con IR soluble (R&D systems, 28-956) o SorCS1 soluble. Los chips se incubaron con muestras de SorCS1 soluble o IR soluble puros (R&D systems, 28-956) (300 nM, 40 µl) en ausencia de péptido de competición para determinar la capacidad de unión máximo ajustada para representar el 100 % de unión (véase el ejemplo 5). En experimentos posteriores, se inyecta una cantidad similar de SorCS1 30 soluble o IR al chip de ligando, pero en presencia de péptidos de competición a diferentes concentraciones para determinar su capacidad de disminuir o destruir la interacción entre SorCS1 e IR.

Ejemplo 7: Estudios de competición

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Los péptidos SorCS1 e IR sintéticos que se unen a las proteínas de ligando se usan en estudios de competición en células para establecer su influencia en la interacción entre SorCS1 e IR en el complejo SorCS1:IR. Se usaron A) células CHO transfectadas de forma estable con plásmidos que codifican las diferentes variantes de splicing de SorCS1 y posteriormente transfectadas de forma transitoria con IRA e IRB para la inmunoprecipitación. Las células se transfectan con plásmidos que codifican IR usando el kit HiFect (Amaxa) de acuerdo con el protocolo del 40 proveedor. Las células se cultivaron durante dos días en medio sin o con péptido SorCS1 o IR sintético de competición en diferentes concentraciones y en confluencia al 80 %, las células se entrecruzan con DSP y posteriormente se lisan. Los lisados celulares se incubaron con anticuerpo contra IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711) unido a perlas de Gammabind (GE Healthcare). Los complejos precipitados se eluyen en las perlas lavadas con tampón de carga SDS y se someten a SDS-PAGE y análisis Western blot usando anti-SorCS1-leu y anti-IR (Santa 45 Cruz Biotechnology, sc-711). Se usan análisis Western blot para revelar la presencia o ausencia de un complejo SorCS1:IR, y establecer así la capacidad del péptido sintético para disminuir o destruir la interacción entre SorCS1 e IR. B) La expresión de IR endógeno en ausencia o presencia de uno o más péptidos SorCS1 sintéticos se examina en células CHO y células CHO transfectadas de forma estable con las cuatro variantes de splicing SorCS1 murino (SorCS1-a,-b,-c,-d) y msol.SorCS1 (la parte extracelular de SorCS1). Las células se cultivan hasta una confluencia al 50 80 % en medio CHO HyQ-CCM5 libre de suero (HyClone) y en medio CHO HyQ-CCM5 libre de suero complementado con diferentes concentraciones de péptido SorCC1 sintético. Las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón de lisis y las alícuotas de los lisados se someten a reducción por SDS-PAGE y análisis Western blot usando anti-SorCS1-leu y anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711). Se usaron análisis Western blot para revelar la influencia del péptido SorCS1 sintético sobre la expresión de IR en las células sin o con la expresión 55 estable de SorCS1, y establecer así la capacidad del péptido sintético para disminuir o destruir la regulación ascendente del IR en células que expresan SorCS1.

Ejemplo 8: Administración de péptidos SorCS1 solubles o SorCS1 para el tratamiento de resistencia a la insulina.

El dominio soluble de uno o más péptidos SorCS1 de ratón capaces de unirse a IR (véase el ejemplo 5) se expresa de forma recombinante a una gran escala en un cultivo celular mamífero y posteriormente se purifica por cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo. La proteína/péptido se administra por vía peritoneal, intravenosa, 5 intramuscular o subcutánea a, por ejemplo, a ratones genomanipulados SorCS1 u otro modelo animal diabético que muestre resistencia a la insulina (1 mg a 1 g/kg de peso corporal cada día o cada semana) en paralelo con un ratón de referencia de tipo silvestre. Se obtiene un buen efecto, y se aplican los mismos métodos usando SorCS1 humano para un paciente con resistencia a la insulina.

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Ejemplo 9: La aplicación de ADN que codifica péptidos SorCS1 solubles o SorCS1 para el tratamiento de resistencia a la insulina.

Terapia génica en un entorno clínico

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La terapia génica se define por la introducción de material genético exógeno a las células o tejido para curar una enfermedad o evitar los síntomas asociados, en este caso resistencia a la insulina. El material genético puede introducirse en las células vivas/pacientes usando diferentes métodos/compuestos de administración: a) como moléculas genéticas terapéuticas desnudas (ADN), donde el propio material genético se introduce directamente en el tejido/paciente (ejemplo 9), b) como vehículos de administración génica especializados, donde el gen se inserta en 20 diferentes entidades biológicas adaptadas para la administración génica antes de la introducción en el paciente (ejemplo 10), y c) como virus, donde el gen se inserta en un vector vírico antes de la introducción en el paciente. Las proteínas pueden tener una semivida corta al introducirse en el ratón o paciente, por lo que se aplica un tratamiento adicional donde se administran péptidos SorCS1 solubles o SorCS1 que codifican ADN plasmídico al ratón genomanipulado SorCS1 por inyección peritoneal, administración oral o inyección directamente en el tejido muscular 25 o adiposo. Los fragmentos SorCS1 solubles o SorCS1 específicos que codifican ADN se transcriben en la proteína en el organismo restaurando el nivel de SorCS1, y tratando así la resistencia a la insulina. El mismo método se usa en seres humanos que carecen de SorCS1 o que muestran resistencia a la insulina tratando los síntomas del paciente.

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Ejemplo 10: La aplicación de vehículos de administración génica que contienen fragmentos SorCS1 solubles o SorCS1 específicos para el tratamiento de resistencia a la insulina.

Para superar cualquier limitación de uso de ADN plasmídico o adenovirus para la expresión de SorCS1 (fragmentos solubles o específicos) se usan vehículos de administración génica especializados (GDV) que mejoran la eficiencia 35 de administración y la especificidad celular, protegido al mismo tiempo frente al reconocimiento inmune. Se producirán varios GDV diferentes: A) Las cepas de bacterias con propiedades deseables se transforman con carga plasmídica que contiene SorCS1 y se aplican para generar GDV. B) el fagémido, un plásmido bacteriano modificado con secuencia de fagos, se usa como la carga de SorCS1 y se transforma en bacterias. La bacteria se infecta con un fago auxiliar de replicación defectuosa que produce un gen esencial para el empaquetamiento del vector fagémido 40 en GDV bacteriófagos. C) Se producen proteínas de superficie vírica en cultivo celular y se purifican como monómeros de cápside. Después, la carga genética que contiene SorCS1 se empaqueta en un virión según los monómeros se transfectan en un tampón que promueve el ensamblaje del virión. D) Los eritrocitos se recolectan del paciente y se lisan para producir fantasmas de eritrocitos. Los fantasmas se cargan, a través de presión osmótica, con la carga genética que contiene SorCS1 antes de introducirse en los pacientes. E) Las células primarias 45 obtenidas de los pacientes se recolectan y se estimulan para producir exosomas, que después se purifican y se cargan, por electroporación, con la carga genética que contiene SorCS1 antes de introducirse de nuevo en el paciente.

Ejemplo 12: La aplicación de adenovirus que expresan fragmentos SorCS1 soluble o SorCS1 específico para 50 el tratamiento de la resistencia a la insulina.

El material genético que expresa péptidos SorCS1 solubles o específicos de SorCS1 se inserta en un vector vírico adeno asociado. El vector vírico adeno asociado se escoge porque, a diferencia de los adenovirus de primera generación que contienen un complemento completo de proteínas víricas, este vector no codifica ninguna proteína 55 vírica y tiene una toxicidad inapreciable. Además, este virus proporciona una expresión prolongada y estable del transgen (SorCS1), lo que reduce la necesidad de una inyección repetida de virus al paciente. En detalle, una construcción de ADN que codifica SorCS1 soluble o fragmentos de SorCS1, se inserta en un vector vírico adeno asociado. El virus adeno asociado se introduce, junto con un plásmido auxiliar, en un cultivo celular y se produce una gran cantidad de virus adeno asociado. Finalmente, 1 x 10gran cantidad de virus adeno asociado. Finalmente, 1 x 10gran cantidad de virus adeno asociado. Finalmente, 1 x 10

Ejemplo 13: Generación de ratón que sobreexpresa SorCS1 5

Para la inducción específica de tejido de la expresión de SorCS1 en el ratón, una construcción de expresión que contiene un promotor CAAG (pollo beta-actina/CMV mínimo) aguas arriba de un casete lox-STOP-lox, seguido del ADNc de SorCS1 de longitud completa (todas las variantes de splicing) o SorCS1 soluble se introduce por recombinación homóloga en el locus del gen ROSA. Para conducir la expresión, el casete de detención se extrae por 10 el cruce con ratones transgénicos que expresan Cre-recombinasa de una manera específica de los tejidos. Como alternativa, el virus recombinante que expresa Cre puede someterse a los ratones que contienen el promotor CAAG (pollo beta-actina/CMV mínimo), casete lox-STOP-lox seguido del ADNc de SorCS1 de longitud completa (todas las variantes de splicing) o SorCS1 soluble para inducir la expresión de SorCS1 de longitud completa o soluble, respectivamente. Por lo tanto, la expresión del hígado se consigue inyectando adenovirus que expresa Cre, por 15 ejemplo, en la vena de la cola.

Este ratón puede usarse, pero sin limitación, con fines de detección para medir los niveles de glucosa e insulina, así como la expresión del receptor de insulina y la fosforilación (por ejemplo, tolerancia a la glucosa y cepa de insulina) antes y después de la inducción. Además, el ratón puede cruzarse con un ratón genomanipulado SorCS1, para 20 estudiar si la expresión de SorCS1 puede normalizar o mejorar el fenotipo.

Ejemplo 13: Descenso de los niveles de glucosa en plasma en ratones que sobreexpresan SorCS1 soluble.

Para examinar el uso de SorCS1 para el tratamiento de resistencia a la insulina, a ratones hembra de tipo silvestre y 25 genomanipulados SorCS1 se les inyectó un adenovirus que expresaba SorCS1 soluble. El adenovirus recombinante para la expresión de SorCs1 soluble humano (hsol.SorCs1) se generó como se indica a continuación: pcDNA3.1/Zeo(-)/hsol.SorCS1 que codificaba el ADNc de SorCS1 soluble humano (aminoácidos 1-1100) se digirió con Pme1 y Apa1 y el fragmento que codificaba hsol.SorCS1 se insertó en el plásmido lanzadera pVQpacAd5CMVK-NpA (ViraQuest Inc, North Liberty, IA). ViraQuest Inc, North Liberty, IA, usó entonces este 30 plásmido lanzadera para la generación y propagación de adenovirus que sobreexpresan hsol. SorCS1. Ratones hembra genomanipulados SorCS1 y de tipo silvestre de 40 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche. Por la mañana, el día 0, se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital y la glucosa plasmática se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer). Posteriormente, a los ratones se les inyectó en la vena de la cola 2E9 pfu de un vector adenoviral con hsol.SorCS1 o LacZ como control negativo (de 35 ViraQuest Inc, North Liberty, IA). El día 7, las mediciones de la glucosa en plasma se repitieron en los ratones en ayunas durante una noche para evaluar el efecto de la proteína SorCS1 y LacZ. Como se muestra en la figura 17, los ratones de tipo silvestre y genomanipulados SorCS1, que sobreexpresaron proteína SorCS1 soluble, mostraron un descenso significativo de los niveles en plasma de glucosa (≈40 %) en ambos. Como se esperaba, no se observó un descenso significativo de los niveles de glucosa en los ratones que recibieron el virus de control LacZ. 40

Ejemplo 14: Expresión y fosforilación de IR y expresión de Glut4 en ratones genomanipulados SorCS1 que sobreexpresan SorCS1 soluble.

Para examinar adicionalmente el efecto de SorCS1 sobre la resistencia a la insulina, la expresión del receptor de 45 insulina (IR), la fosforilación de IR y la expresión del transportador de glucosa de tipo 4 (Glut4) se determinó en ratones que sobreexpresaban SorCS1. A ratones hembra genomanipulados SorCS1 (-/-) de 40 semanas de edad se les inyectó un vector adenoviral que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control negativo (véase el ejemplo 13). El día 12 después de la inyección del virus, los ratones se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía intraperitoneal insulina (Novorapid, Novo Nordisk A/S) (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina 50 estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. Se extrajo tejido muscular y adiposo y se homogeneizó en tampón de lisis tampón TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, nonidet P-40 al 1 %, pH 8) que contenía inhibidores de proteasa (Complete Mini, Roche) e inhibidores de fosfatasa (cóctel 1, Sigma Aldrich). Los lisados se aclararon por centrifugación durante 10 min a 10,000 x g, y la concentración de proteína se determinó por ensayo de proteínas Bio-Rad. Se separó una cantidad igual de proteína total (50 µg) para diferentes muestras en un gel Bis-tris al 4-12 % 55 (Nupage, Invitrogen) y se transfirió sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia). Las membranas se analizaron por western blotting con anti-IR (Santa Cruz Biotechnology, sc-711), anti-IR-pY (R&D systems, AF2507) y anti-Glut4 (Abcam, ab654). Se desarrollaron anticuerpos unidos por Super-Signal West Pico reagent (Pierce) y un Fuji film LAS3000. Se observaron elevadas cantidades de IR, IR fosforilado (IR-pY) y glut4 tanto en tejido muscular (figura 18A) como en el tejido adiposo (figura 18B) de ratones genomanipulados SorCS1 que expresaban SorCS1 soluble en comparación con ratones que expresaban la proteína de control LacZ, lo que sugería un aumento de la sensibilidad a la insulina en los ratones que sobreexpresan SorCS1.

Ejemplo 15: Descenso de los niveles en plasma de glucosa e insulina en ratones hembra diabéticos db/db 5 que sobreexpresan SorCS1 soluble.

Para evaluar el efecto del SorCS1 soluble en un modelo de ratón obeso que desarrolla espontáneamente diabetes tipo 2, se usó la cepa de ratón db/db (BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac de Taconic). Estos ratones carecen del receptor de leptina, en consecuencia los ratones se vuelven obesos y desarrollan resistencia a la insulina y finalmente 10 diabetes graves a la edad de 6-8 semanas. Para examinar el efecto sobre los niveles de glucosa e insulina en plasma, a los ratones se les inyectó adenovirus que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control (véase el ejemplo 13). En detalle, los ratones hembra db/db de 10 semanas de edad se mantuvieron en ayuno durante una noche. Por la mañana, el día 0, los ratones se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital. La glucosa en sangre se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer), 15 mientras que los niveles de insulina en plasma se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligando a enzimas de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics). Después, a los ratones se les inyectó en la vena de la cola 2E9 pfu de un vector adenoviral con hsol.SorCS1 o LacZ (de ViraQuest Inc, North Liberty, IA) como virus de control negativo. El día 7, las mediciones de la glucosa en plasma e insulina en plasma se repitieron en los ratones en ayunas durante una noche para evaluar el efecto de la proteína SorCS1 y LacZ. Los datos mostrados en la figura 20 19 son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo. El día 7, los ratones hembra db/db con sobreexpresión de SorCS1 soluble mostraron un descenso significativo de la glucosa en sangre (≈35 %) en comparación con los ratones que recibieron el virus de control LacZ (figura 19A). Además, el día 7 hubo también un descenso significativo de los niveles en plasma de insulina en los ratones hembra db/db que sobreexpresaban SorCS1 soluble en comparación con los ratones que expresan el virus de control (figura 19B). Por lo tanto, la sobreexpresión de 25 SorCS1 soluble mejora el estatus diabético en el modelo de ratón diabético de tipo 2 (db/db).

Ejemplo 16: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones hembra diabéticos db/db con sobreexpresión de SorCS1 soluble.

30

Para examinar el efecto de SorCS1 en la tolerancia a la glucosa, a ratones hembra db/db se les inyectó adenovirus que expresaban SorCS1 soluble o LacZ (véase el ejemplo 13), donde el día 3 se mantuvieron en ayuno durante una noche (16 h). El día 4, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal un bolo de glucosa (2 mg/g de peso corporal) en una solución salina estéril. Los animales se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital en los tiempos 0, 15, 30, 90 y 150 minutos después de la inyección. Los niveles de 35 glucosa en sangre se midieron inmediatamente después del muestreo en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer). Los datos mostrados en la figura 20 son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo. Los resultados de la figura 20 muestran que la sobreexpresión de SorCS1 soluble hace a los ratones más sensibles a la insulina según el nivel de glucosa en sangre vuelve a la normalidad (es decir, igual que antes de la inyección de glucosa) después de 150 min. Por el contrario, el nivel de glucosa en sangre en ratones que expresan la proteína de control LacZ 40 permanece elevado durante los 150 minutos. En conclusión, estos resultados muestran que los ratones hembra db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble son menos resistentes a la insulina.

Ejemplo 17: Niveles en plasma de glucosa e insulina en ratones macho diabéticos db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble. 45

Para evaluar el efecto del SorCS1 soluble en un modelo de ratón obeso que desarrolla espontáneamente diabetes tipo 2, se usó la cepa de ratón db/db (BKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac de Taconic). A los ratones se les inyectó adenovirus que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control (véase el ejemplo 13), para examinar los efectos sobre los niveles de glucosa e insulina en plasma. En detalle, los ratones macho db/db de 6 semanas de edad se 50 mantuvieron en ayuno durante una noche. Por la mañana, el día 0, los ratones se anestesiaron con éter dietílico y se obtuvieron muestras de sangre por sangrado retroorbital. La glucosa en sangre se midió inmediatamente en un monitor automático (Ascentia Contour de Bayer), mientras que los niveles de insulina en plasma se determinaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligando a enzimas de insulina de ratón ultrasensible (DRG Diagnostics). Después, a los ratones se les inyectó en la vena de la cola 2E9 pfu de un vector adenoviral con hsol.SorCS1 o LacZ 55 (de ViraQuest Inc, North Liberty, IA) como virus de control negativo. El día 7, las mediciones de la glucosa en plasma e insulina en plasma se repitieron en los ratones en ayunas durante una noche para evaluar el efecto de la proteína SorCS1 y LacZ. Los datos mostrados en la figura 21 son medias ± SEM para 5 ratones en cada grupo. El día 7, los ratones macho db/db con sobreexpresión de SorCS1 soluble mostraron un descenso significativo de la glucosa en sangre (≈35 %) en comparación con los ratones que recibieron el virus de control LacZ (figura 21A). Puesto que el descenso en los niveles de glucosa no se contabilizó por un aumento de la concentración de insulina en los ratones que sobreexpresaban SorCS1 (figura 21B), se concluye que la sobreexpresión de SorCS1 soluble mejora el estatus diabético en los ratones macho db/db diabéticos de tipo 2.

5

Ejemplo 18: Localización subcelular de Glut4 en el tejido muscular de ratones macho db/db que sobreexpresan SorCS1 soluble.

Para evaluar si la sobreexpresión de SorCS1 soluble puede cambiar la distribución de Glut4, se realizó un fraccionamiento subcelular en tejido muscular de ratones macho db/db que sobreexpresaban SorCS1 soluble. En 10 detalle, a los ratones macho db/db de 6 semanas de edad se les inyectó en la vena de la cola un vector adenoviral que expresaba hsol.SorCS1 o LacZ como control (véase el ejemplo 13). El día 7 después de la inyección del virus, los ratones se mantuvieron en ayuno durante una noche, se les inyectó por vía intraperitoneal insulina (Novorapid, Novo Nordisk A/S) (10 unidades/kg de peso corporal) en una solución salina estéril, y se sacrificaron 15 min más tarde. El tejido muscular de 5 ratones a los que se les inyectó el mismo virus se extrajo, se agrupó y se transfirió a 15 5 ml de sacarosa tamponada con HEPES (sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM, HEPES-KOH 20 mM, pH 7,4), se homogeneizó mediante 10 golpes arriba y abajo usando un mortero de Teflon, y se centrifugó a 1000 x g durante 10 min. Por lo tanto, se obtuvieron fracciones mitocondriales pesadas, mitocondriales ligeras y microsomales mediante varias vueltas de centrifugación. En primer lugar, el sobrenadante se centrifugó a 3.000 x g durante 10 min, después el sobrenadante resultante se centrifugó a 16.000 x g durante 10 min, y finalmente, el sobrenadante 20 resultante se centrifugó a 100.000 x g durante 45 min dando un gránulo que contenía la fracción microsomal. Las fracciones microsomales se suspendieron de nuevo en 0,5 ml de una solución tamponada con HEPES y se sometieron a centrifugación de gradiente de sacarosa (velocidad). Los 0,5 ml de muestras microsomales se cargaron sobre un gradiente de sacarosa de 12 ml lineal de 0,8 M a 1,6 M en HEPES 1 M, pH 7,2, y se centrifugaron durante 18 h en un rotor basculante (SW41 Ti) a 84.000 x g. Cada gradiente se separó en 24 fracciones partiendo de la parte 25 superior del tubo. Finalmente, la electroforesis en gel y el análisis Western blotting analizaron la expresión de Glut4 en las diferentes fracciones. Los resultados de la figura 22 muestran que la distribución de sedimentación de Glut4 en el tejido muscular que sobreexpresa SorCS1 (panel inferior) es diferente del tejido muscular que expresa la proteína de control lacZ (panel superior). Por lo tanto, la sobreexpresión de SorCS1 soluble en ratones macho db/db puede cambiar la distribución de Glut4 y modular así la captación de glucosa. 30

Ejemplo 19: Perfil de expresión génica del tejido adiposo de ratones genomanipulados SorCS1 por matrices de PCR.

Para examinar el perfil de expresión génica de ratones genomanipulados SorCS1, la expresión de 84 genes 35 relacionados con la ruta de señalización de la insulina de ratón y 84 genes relacionados con la señalización de lipoproteína de ratón y el metabolismo del colesterol, se determinó usando análisis de micromatriz. El análisis de micromatriz se realizó usando ARN del tejido adiposo de ratones adiposos genomanipulados SorCS1 y de tipo silvestre. En la práctica, la primera hebra de ADNc se sintetizó a partir de ARN total (Applied Biosystems) de tejido adiposo genomanipulado SorCS1 (-/-) y de tipo silvestre (+/+) de ratones hembra de 50 semanas de edad (n = 3). 40 Después, la supermatriz de la ruta de señalización de insulina de ratón (matrices PCR del perfilador PAMM-030A RT2) o B) la señalización de lipoproteína de tipo ratón y el metabolismo del colesterol (matrices de PCR del perfilador PAMM-080-A RT2) se procesaron usando una plataforma ABI7900 (Applied Biosystems) y PCR SYBR Green/Rox (SABiosciences). AROS Applied Biotechnology, Aarhus, Dinamarca, hizo los análisis de expresión. Los genes que muestran una expresión más de 3 veces regulada en ascenso o descenso en los ratones 45 genomanipulados SorCS1 en comparación con los ratones de tipo silvestre, se enumeran en las tablas superiores y sus funciones conocidas se indican en la tabla a continuación. Los datos de la figura 24 muestran que la expresión de varios genes se cambia en los ratones genomanipulados SorCS1 en comparación con los ratones de tipo silvestre, lo que indica que las rutas de señalización de la insulina y el colesterol y el metabolismo se alteran en los ratones genomanipulados SorCS1. 50

Referencias

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3. L. Plum et al. (2004) Transgenic and knockout mice in diabetes research: Novel insights into pathophysiology, limitations, and perspectives. Physiology 20 pp.152-61

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8. T.E. Graham and B.B. Kahn (2007) Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39 pp 717-721

9. C. Guerra et al. (2001) Brown adipose tissue-specific insulin receptor knockout shows diabetic phenotype without 10 insulin resistance. J. Clin. Invest. 108(8) pp 1205-1213

10. G. Hermey et al. (1999) Identification and characterization of SorCS, a third member of a novel receptor family. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266(2) pp.347-51

11. A. Nykjaer et al. (2004) Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal death. Nature 427(6977) pp. 843-8

12. O.M. Andersen et al. (2005) Neuronal sorting protein-related receptor SorLA/LR11 regulates processing of the 15 amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(38) pp. 13461-13466

13. N.J. Morris et al. (1998) Sortilin is the major 110-kDa protein in GLUT4 vesicles from adipocytes. J.Biol.Chem. 273(6) pp. 3582-7

14. J. Shi and V. Kandror (2005) Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4 storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev. Cell 9 pp 99-108 20

15. G. Hermey and H.C. Schaller (2000) Alternative splicing of murine SorCS leads to two forms of the receptor that differ completely in their cytoplasmic tails. Biochim. Biophys. Acta. 1491(1-3) pp. 350-54

16. G. Hermey et al. (2003) Characterization of SorCS1, an alternatively spliced receptor with completely different cytoplasmic domains that mediate different trafficking in cells. J. Biol.Chem. 278 pp. 7390-96

17. M.S. Nielsen et al. (2008) Different motifs regulate trafficking of SorCS1 isoforms. Traffic 9 pp. 980-94 25

18. S.M. Clee et al. (2006) Positional of SorCS1, a type 2 diabetes quantitative trait locus. Nature genetics 6 pp. 688-93

19. M.O.Goodarzi et al. (2007) SorCS1: A novel human type 2 diabetes susceptibility gene suggested by the mouse. Diabetes 56(7) pp. 1922-9

20. WO 2004/022719 (Attie et al.) 30

Resumen de las secuencias

SEQ ID NO 1: preproSorCS1b de Homo sapiens (Isoforma 1)

SEQ ID NO 2: preproSorCS1 de Homo sapiens (Isoforma 2) 35

SEQ ID NO 3: preproSorCS1c de Homo sapiens (Isoforma 3)

SEQ ID NO 4: preproSorCS1a de Homo sapiens (Isoforma 4)

SEQ ID NO 5: preproSorCS1 soluble de Homo sapiens

SEQ ID NO 6: proSorCS1b de Homo sapiens (Isoforma 1)

SEQ ID NO 7: proSorCS1 de Homo sapiens (Isoforma 2) 40

SEQ ID NO 8: proSorCS1c de Homo sapiens (Isoforma 3)

SEQ ID NO 9: proSorCS1a de Homo sapiens (Isoforma 4)

SEQ ID NO 10: proSorCS1 soluble de Homo sapiens

SEQ ID NO 11: SorCS1b maduro de Homo sapiens (Isoforma 1)

SEQ ID NO 12: SorCS1 maduro de Homo sapiens (Isoforma 2) 45

SEQ ID NO 13: SorCS1c maduro de Homo sapiens (Isoforma 3)

SEQ ID NO 14: SorCS1a maduro de Homo sapiens (Isoforma 4)

SEQ ID NO 15: SorCS1 maduro soluble de Homo sapiens

SEQ ID NO 16: preproSorCS1b de ratón (isoforma 1)

SEQ ID NO 17: preproSorCS1a de ratón (isoforma 2) 50

SEQ ID NO 18: preproSorCS1c de ratón (isoforma 3)

SEQ ID NO 19: preproSorCS1c+ de ratón (isoforma 4)

SEQ ID NO 20: preproSorCS1d de ratón

SEQ ID NO 21: preproSorCS1 soluble de ratón

SEQ ID NO 22: proSorCS1b de ratón (isoforma 1) 55

SEQ ID NO 23: proSorCS1a de ratón (isoforma 2)

SEQ ID NO 24: proSorCS1c de ratón (isoforma 3)

SEQ ID NO 25: proSorCS1c+ de ratón (isoforma 4)

SEQ ID NO 26: proSorCS1d de ratón

SEQ ID NO 27: proSorCS1 soluble de ratón

SEQ ID NO 28: SorCS1b maduro de ratón (isoforma 1)

SEQ ID NO 29: SorCS1a maduro de ratón (isoforma 2)

SEQ ID NO 30: SorCS1c maduro de ratón (isoforma 3)

SEQ ID NO 31: SorCS1c+ maduro de ratón (isoforma 4) 5

SEQ ID NO 32: SorCS1d maduro de ratón

SEQ ID NO 33: SorCS1 maduro soluble de ratón

SEQ ID NO 34: preproSorCS1 de chimpancé

SEQ ID NO 35: proSorCS1 de chimpancé

SEQ ID NO 36: SorCS1 maduro de chimpancé 10

SEQ ID NO 37: SorCS1 soluble de chimpancé

SEQ ID NO 38: SorCS1 maduro de perro

SEQ ID NO 39: SorCS1 soluble de perro

SEQ ID NO 40: preproSorCS1 de vaca

SEQ ID NO 41: proSorCS1 de vaca 15

SEQ ID NO 42: SorCS1 maduro de vaca

SEQ ID NO 43: SorCS1 soluble de vaca

SEQ ID NO 44: preproSorSC1 de rata

SEQ ID NO 45: proSorCS1 de rata

SEQ ID NO 46: SorCS1 maduro de rata 20

SEQ ID NO 47: SorCS1 soluble de rata

SEQ ID NO 48: preproSorCS1 de pollo

SEQ ID NO 49: proSorCS1 de pollo

SEQ ID NO 50: SorCS1 maduro de pollo

SEQ ID NO 51: SorCS1 soluble de pollo 25

SEQ ID NO 52: Sortilina de Homo sapiens

SEQ ID NO 53: SorLA de Homo sapiens

SEQ ID NO 54: SorCS2 de Homo sapiens

SEQ ID NO 55: SorCS3 de Homo sapiens

SEQ ID NO 56: Receptor de Insulina Humano (IR) de Homo sapiens 30

SEQ ID NO: 57

SorCS1 (ex24), cebador directo

5'-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3

SEQ ID NO: 58

SorCS1 (ex24), cebador inverso 35

5'-GTGGACAAGAACTTGGACGCCAGGCTTCAG-3

SEQ ID NO: 59

SorCS1-a (ex25), cebador directo

5'-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3

SEQ ID NO: 60 40

SorCS1-a (ex25), cebador inverso

5'-TATTGCTTCTGAACCTGGCAGAAAGAGGAG-3'

SEQ ID NO: 61

SorCS1-b (ex27), cebador directo

5'-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3 45

SEQ ID NO: 62

SorCS1-b (ex27), cebador inverso

5'-GCTTTGGCGATGAAGGTGGAGTTGCTGGCT-3'

SEQ ID NO: 63

SorCS1-c (ex26), cebador directo 50

5'-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3

SEQ ID NO: 64

SorCS1-c (ex26), cebador inverso

5'-CAGGGTGAGGGACACTGGGCCTGCTTTCAG-3

SEQ ID NO: 65 55

SorCS1-d (ex28), cebador directo

5'-AAGTCTCTGCTGGGAACGCCATACTGCAAG-3

SEQ ID NO: 66

SorCS1-d (ex28), cebador inverso

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente tipo SorCS1 para su uso en el tratamiento de resistencia a la insulina y/o una enfermedad relacionada con la resistencia a la insulina en un individuo, donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en: 5

a) un polipéptido SorCS1 soluble aislado seleccionado del grupo que consiste en

i) una secuencia aminoacídica que consiste en las SEQ ID NO: 5, 10, 15, 21, 27 y 33;

ii) una variante de secuencia biológicamente activa o una variante alélica de origen natural de la secuencia 10 aminoacídica de

i) donde la variante tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con respecto a dicha SEQ ID NO. 5, 10, 15, 21, 27 o 33; o

iii) un fragmento biológicamente activo que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en: 15

SEQ ID NO: 1 aa 103-124, SEQ ID NO: 1 aa 125-143, SEQ ID NO: 1 aa 144-162, SEQ ID NO: 1 aa 197-218, SEQ ID NO: 1 aa 391-409, SEQ ID NO: 1 aa 661-684, y la SEQ ID NO: 1 aa 763-783, SEQ ID NO: 1 aa 859-876, o una variante de dicho fragmento, donde la variante tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 aa 103-124, SEQ ID NO: 1 aa 125-143, SEQ ID NO: 1 aa 144-162, SEQ ID NO: 1 aa 197-218, 20 SEQ ID NO: 1 aa 391-409, SEQ ID NO: 1 aa 661-684, y la SEQ ID NO: 1 aa 763-783, SEQ ID NO: 1 aa 859-876;

donde dicho polipéptido SorCS1 soluble aislado es capaz de unirse al receptor de insulina en un sitio de unión a SorCS1 y que es capaz de sensibilizar un receptor de insulina, y

donde la actividad biológica es la sensibilización de un receptor de insulina, 25

b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en a);

c) un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico como se define en b),

d) una célula huésped aislada transformada o transducida con el ácido nucleico de b) o el vector de c).
2. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho agente es un polipéptido, donde 30 el polipéptido es capaz de formar un dímero de dicho polipéptido unido a través de al menos un puente de cistina intermolecular.
3. El agente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia seleccionada se altera para proporcionar una sustitución conservativa. 35
4. El agente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente es un polipéptido, donde el polipéptido tiene al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 %, mucho más preferiblemente al menos el 99 % de identidad de secuencia con 40 respecto a una proteína que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 10, 15, 21, 27 y 33.
5. El agente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente es un polipéptido, donde el polipéptido está glicosilado. 45
6. El agente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente es un polipéptido que comprende adicionalmente una etiqueta de afinidad, tal como una etiqueta polyhis, una etiqueta GST, una etiqueta HA, una etiqueta Flag, una etiqueta C-myc, una etiqueta HSV, una etiqueta V5, una etiqueta de proteína de unión a maltosa, una etiqueta del dominio de unión a celulosa. 50
7. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el vector comprende un promotor unido operativamente a la molécula de ácido nucleico, donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en: CMV, UbiC humano, RSV, promotor Tet regulable, Mo-MLV-LTR, Mx1, EF-1alfa, PDGF beta y CaMK II.

55
8. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 y 7, donde el vector se selecciona del grupo que consiste en vectores obtenidos a partir de la familia Retroviridae, incluyendo lentivirus, HIV, SIV, FIV, EAIV, CIV; alfavirus, adenovirus, virus adeno asociados, baculovirus, HSV, coronavirus, virus del papiloma bovino, Mo-MLV, preferiblemente virus adeno asociados.
9. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la célula se selecciona entre:

Saccharomyces cerevisiae, E. coli, Aspergillus y células de insecto Sf9, y células mamíferas, tales como células humana, felinas, porcinas, de simio, caninas, murinas y de rata, incluyendo células musculares, hepatocitos, 5 adipocitos y células del páncreas, tales como células α, células β, células δ; células CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, HiB5, RN33b y BHK.
10. El agente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enfermedad asociada a la resistencia a la insulina selecciona del grupo que consiste en síndrome de resistencia a la 10 insulina, diabetes mellitus tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, el síndrome metabólico, hiperglucemia, hiperinsulinemia, arteriosclerosis, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, dislipidemia, obesidad, obesidad central, síndrome del ovario poliquístico, microalbuminuria, hipercoagulabilidad e hipertensión, y cualquier combinación de las mismas.

15
11. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente es capaz de unirse al receptor de insulina en un sitio de unión a SorCS1 y que es capaz de sensibilizar el receptor de insulina.
12. Un método para detectar la capacidad del agente SorCS1 de la reivindicación 1 de reducir los niveles 20 de glucosa en sangre, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un primer y un segundo ratón transgénico en el que los genes SorCS1 del receptor del dominio Vps10p endógeno se han alterado para suprimir la expresión de un receptor SorCS1 funcional, y donde dicho ratón muestra una respuesta reducida a la insulina con respecto a un ratón de control no transgénico; 25

b) administrar a dicho primer ratón transgénico el agente candidato, y

c) administrar a dicho segundo ratón transgénico una solución fisiológica, y

d) tomar muestras de sangre del ratón de b) y c) respectivamente, en intervalos de tiempo predeterminados, tal como en 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 y 4 horas, posteriores a la administración de dicho agente, y

e) comparar los niveles de glucosa en sangre en las muestras de d); donde una reducción en el nivel de glucosa en 30 sangre de dicho primer ratón transgénico al que se administró dicho agente candidato con respecto a dicho segundo ratón transgénico al que no se administró dicho agente candidato indica que el agente candidato reduce los niveles de glucosa en sangre.