ES2337890T3 - Polipeptidos de fusion actriib y usos de los mismos. - Google Patents

Polipeptidos de fusion actriib y usos de los mismos. Download PDF

Info

Publication number
ES2337890T3
ES2337890T3 ES03773145T ES03773145T ES2337890T3 ES 2337890 T3 ES2337890 T3 ES 2337890T3 ES 03773145 T ES03773145 T ES 03773145T ES 03773145 T ES03773145 T ES 03773145T ES 2337890 T3 ES2337890 T3 ES 2337890T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
actriib
gdf
fusion polypeptide
seq
baselineskip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03773145T
Other languages
English (en)
Inventor
Neil M. Wolfman
Mary L. Bouxsein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth LLC
Original Assignee
Wyeth LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth LLC filed Critical Wyeth LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2337890T3 publication Critical patent/ES2337890T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1796—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

Uso de un polipéptido de fusión del receptor de Activina tipo IIB (ActRIIB) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno degenerativo óseo en un mamífero, en donde el polipéptido de fusión ActRIIB comprende (a) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a los aminoácidos 23 a 138 de la SEQ ID NO:3 y es capaz de unirse a un factor-8 de crecimiento y de diferenciación (GDF-8) y (b) la región constante de un anticuerpo IgG, IgA, IgE, o IgM.

Description

Polipéptidos de fusión ActRIIB y usos de los mismos.
Campo técnico
Este campo técnico se relaciona con inhibidores del factor-8 de crecimiento y de diferenciación (GDF-8), incluyendo formas solubles de los receptores de activina tipo II, y fragmentos de estos, especialmente aquellos que inhiben la actividad de GDF-8 in vivo. El campo además se relaciona con métodos para prevenir, o tratar trastornos degenerativos de los huesos.
\vskip1.000000\baselineskip
Antecedentes
La familia TGF-\beta es un número de factores de crecimiento relacionados estructuralmente, de los cuales todos poseen propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento importantes fisiológicamente (Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8:133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228:235-272). Estos factores incluyen proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), activina, inhibina, sustancia inhibidora de müller, factor neurotrófico derivado de las células gliales, e incluso un número creciente de factores de diferenciación y de crecimiento (GDF), tales como GDF-8. Muchas de estas proteínas son altamente homólogas. Por ejemplo, BMP-11 humano, también conocido como GDF-11, es 90% idéntica a GDF-8 en el nivel de aminoácido (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232; http://www.ronmyrick.com Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80:185-189).
La mayoría de los miembros de la familia TGF-\beta se conocen por transducir sus señales a través de la formación de complejos heteroméricos de dos diferentes tipos de receptores quinasa serina/treonina expresados en la superficie celular, i.e., receptores tipo I de aproximadamente 50-55 kDa y receptores tipo II de más de 70 kDa. Los receptores tipo I no unen los ligandos directamente; más bien, participan en la transducción de la señal por asociación con los receptores tipo II, que unen moléculas ligando. El sistema TGF-\beta se conserva altamente en todo el reino animal. (Para una revisión del sistema TGF-\beta, ver Massague (2000) Nature Rev. Mol. Cell Biol. 1:16-178; and Moustakas et al. (2001) J. Cell Sci. 114:4359-4369).
El receptor de activina tipo II se ha descrito previamente en U.S. Patent No. 5,885,794. La activina originalmente se purificó a partir de fluido folicular de los ovarios como una proteína que tiene un efecto estimulatorio en la producción de hormonas que estimulan el folículo en la glándula pituitaria. Cinco isoformas del receptor de activina tipo II han sido identificadas en las células sensibles a la activina. Basándose en estudios in vitro, estos receptores pueden ser compartidos por miembros de la familia TGF-\beta (Attisano et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:1066-1073). La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el receptor de activina tipo II, denominado ActRIIB, se puede unir al factor-8 de crecimiento y de diferenciación (GDF-8) además a la activina.
GDF-8 está implicado en la regulación de procesos biológicos críticos en el músculo esquelético y la osteogénesis. GDF-8 se expresa altamente en el músculo esquelético en adultos y en el desarrollo. Los ratones transgénicos carentes de GDF-8 se caracterizan por una marcada hipertrofia e hiperplasia del músculo esquelético (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90) y una estructura del hueso cortical alterada (Hamrick et al. (2000) Bone 27 (3):343-349). Incrementos similares en la masa del músculo esquelético son evidentes en mutaciones de GDF-8 que ocurren naturalmente en ganado (Ashmore et al. (1974) Growth 38:501-507; Swatland et al. (1994) J. Anim. Sci. 38:752-757; McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461; and Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-915). Los estudios han indicado que la atrofia muscular asociada con la infección por HIV se acompaña por un aumento en la expresión de GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14938-14943). GDF-8 también ha sido implicado en la producción de enzimas musculares específicas (por ejemplo, la creatina quinasa) y la proliferación de células mioblásticas (WO 00/43781). Además de sus propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas, GDF-8 también puede estar implicado en un número de otros procesos fisiológicos, incluyendo homeostasis de la glucosa en el desarrollo de diabetes tipo II, tolerancia a la glucosa deteriorada, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma tales como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno, y trastornos del tejido adiposo, tales como obesidad (Kim et al. (2001) BBRC 281:902-906).
Un número de trastornos humanos y animales se asocian con tejido muscular deteriorado funcionalmente, por ejemplo, distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular, atrofia orgánica, fragilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, y síndrome de atrofia muscular causados por otras enfermedades y condiciones. A la fecha, muy pocas terapias confiables o efectivas han sido desarrolladas para tratar estos trastornos.
También hay un número de condiciones asociadas con una pérdida de hueso, que incluyen osteoporosis y osteoartritis, especialmente en las mujeres mayores y/o posmenopáusicas. Además, las enfermedades de hueso metabólicas y trastornos incluyen, masa ósea baja debido a terapia crónica con glucocorticoides, insuficiencia gonodal prematura, supresión androgénica, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa. En la actualidad las terapias disponibles para estas condiciones funcionan inhibiendo la resorción ósea. Una terapia que promueve la formación de hueso nuevo, sería una alternativa deseable para estas terapias.
Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevas terapias que contribuyan a un aumento global de masa muscular y/o densidad ósea, especialmente, en humanos. Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos terapéuticos seguros y efectivos para trastornos asociados con los huesos. Es otro objeto de la invención proporcionar métodos para aumentar la densidad ósea en mamíferos. Incluso otro objeto de la invención es proporcionar inhibidores de GDF-8 que sean seguros y efectivos in vivo.
Incluso otro objeto de la invención es proporcionar formas solubles del receptor de activina tipo II ActRIIB y/o fragmentos funcionales de estos que son estables in vivo y se unen a GDF-8 con alta especificidad y afinidad. WO 02/10214 describe un receptor del factor de diferenciación de crecimiento (GDF) sustancialmente purificado, incluyendo un receptor GDF-8 para el tratamiento de condiciones patológicas relacionadas con tejido muscular o adiposo.
Los objetos adicionales de la invención serán establecidos en parte en la descripción que sigue, y en parte será evidente de la descripción o pueden ser adquiridos por la práctica de la invención.
Varios objetos, aspectos y ventajas de la invención serán realizados y logrados por medio de los elementos y combinaciones particularmente señaladas en las reivindicaciones anexas.
Resumen
En consecuencia, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de fusión del receptor de Activina tipo IIB (ActRIIB) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno degenerativo óseo en un mamífero, en donde el polipéptido de fusión ActRIIB comprende (a) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a los aminoácidos 23 a 138 de SEQ ID NO:3 y es capaz de unirse al factor-8 de crecimiento y de diferenciación (GDF-8) y (b) la región constante de un anticuerpo IgG, IgA, IgE, o IgM.
La invención también proporciona una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.
La invención además proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de fusión de la invención, un vector de expresión, que comprende el ácido nucleico de la invención y una célula huésped que comprende el vector de la invención.
La invención adicionalmente proporciona un método para identificar los inhibidores de GDF 8, que comprende:
(a) la preparación de una primera mezcla de enlace que comprende el polipéptido de fusión ActRIIB de la invención y GDF-8;
(b) la medición de la cantidad de enlace entre el polipéptido de fusión ActRIIB y GDF-8 en la primera mezcla;
(c) la preparación de una segunda mezcla de enlace que comprende el polipéptido de fusión ActRIIB, GDF-8 y un compuesto de prueba; y
(d) la medición de la cantidad de enlace entre el polipéptido de fusión ActRIIB y GDF-8 en la segunda mezcla.
Además se proporciona por la invención el uso de un polipéptido de fusión ActRIIB en la fabricación de un medicamento para aumentar la densidad ósea trabecular, en donde el polipéptido de fusión ActRIIB comprende (a) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a los aminoácidos 23 a 138 de SEQ ID NO:3 y es capaz de unirse al factor-8 de crecimiento y de diferenciación (GDF-8) y (b) la región constante de un anticuerpo IgG, IgA, IgE, o IgM.
Los métodos para tratar trastornos degenerativos óseos se describen aquí. Los métodos también son útiles para aumentar la densidad ósea en animales normales.
También se describen los métodos para inhibir la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de densidad ósea.
Se proporcionan las formas de ActRIIB solubles estabilizadas y los fragmentos de estas que se unen e inhiben GDF-8 in vitro e in vivo. En la actualidad las formas de ActRIIB solubles reveladas poseen propiedades farmacocinéticas que las hacen apropiadas como agentes terapéuticos.
Otros aspectos proporcionan composiciones que contienen los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en la actualidad y su uso en métodos para inhibir o neutralizar GDF-8, incluyendo métodos de tratamiento de los seres humanos o animales. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados pueden ser utilizados para tratar o prevenir condiciones en las cuales un aumento en la densidad ósea es deseable. Enfermedades y trastornos ejemplares incluyen enfermedad degenerativa ósea tales como osteoartritis y osteoporosis. Las formas de ActRIIB modificadas utilizadas en los métodos de la invención, por lo tanto, son polipéptidos de fusión de ActRIIB que comprenden (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la región constante de un anticuerpo.
La primera secuencia puede comprender toda o una porción de un dominio extracelular de humano ActRIIB, o puede ser una mutación de dicha secuencia. La segunda secuencia puede ser derivada de la porción Fc de un anticuerpo, o puede ser una mutación de dicha secuencia.
La segunda secuencia se puede unir al C-terminal o al N-terminal de la primera secuencia de aminoácidos, con o sin estar unida por una secuencia ligadora.
Los métodos terapéuticos para tratar trastornos degenerativos óseos también se describen. Enfermedades y trastornos ejemplares incluyen enfermedad degenerativa ósea tal como osteoporosis.
Además, los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad, pueden ser utilizados como una herramienta de diagnóstico para detectar cuantitativa o cualitativamente GDF-8 o fragmentos de este, en una muestra biológica. La presencia o cantidad de GDF-8 detectada puede ser correlacionada con uno o más de las condiciones médicas enumeradas anteriormente.
Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión ActRIIB utilizado en los métodos de la invención también se proporciona. Además se proporcionan vectores de expresión que comprenden el ácido nucleico; las células huésped que comprenden los vectores de expresión; y los métodos para producir el ácido nucleico.
Incluso otro aspecto, proporciona un método para identificar agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de trastornos musculares y óseos.
Se debe entender que ambas la descripción general anterior y la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas solamente y no son limitantes de la invención, según se reivindica.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 muestra el enlace de GDF-8 biotinilado y BMP-11 con ActRIIB-Fc.
Figura 2 muestra los resultados de ensayos de gen indicador en los cuales ActRIIB-Fc ha sido probado.
Figura 3 muestra los resultados de un estudio farmacocinético en el cual ratones C57B6/SCID que utilizan una única administración intravenosa (IV) o intraperitoneal (IP) de ActRIIB-Fc.
Breve descripción de las secuencias
La siguiente tabla se proporciona como una referencia para las secuencias referidas en esta aplicación.
1
Descripción detallada 1. Definiciones
El término "ActRIIB" se refiere a cualquier isoforma del receptor de activina tipo II o un fragmento de este que es capaz de unirse específicamente a GDF-8. El término no se limita a cualquier especie particular de origen, método de producción, y otras características de ActRIIB. El término incluye ActRIIB producido recombinantemente o sus fragmentos, y particularmente, el dominio de enlace de GDF-8 de ActRIIB humano. El término también abarca variantes de empalme y alélicas de ActRIIB, sus homólogos, y ortólogos y secuencias de estos que contienen mutaciones introducidas (sustituciones, adiciones, o deleciones), por ejemplo, aquellos introducidos por técnicas recombinantes.
El término "trastorno degenerativo de músculos, huesos, o homeostasis de la glucosa" se refiere a un número de trastornos y enfermedades asociadas con GDF-8 y/o otros miembros de la superfamilia TGF-\beta, por ejemplo, BMP-11. Ejemplo de tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, trastornos metabólicos tales como diabetes tipo II, tolerancia a la glucosa deteriorada, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), y resistencia a la insulina inducida por trauma (por ejemplo, quemaduras o desequilibrio de nitrógeno); trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad); trastornos musculares y neuromusculares tales como distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrófica (ALS); atrofia muscular; atrofia orgánica; fragilidad; síndrome del canal carpiano; enfermedad pulmonar obstructiva congestiva; y sarcopenia, caquexia y otros síndromes de atrofia muscular. Otros ejemplos incluyen osteoporosis, especialmente en las mujeres mayores y/o posmenopáusicas; osteoporosis inducida por los glucocorticoides; osteopenia; osteoartritis; y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Incluso otros ejemplos incluyen masa ósea baja debido a terapia crónica con glucocorticoides, insuficiencia gonodal prematura, supresión androgénica, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa.
El término "cantidad efectiva" se refiere a aquella cantidad del compuesto que se traduce en mejoría de los síntomas en un paciente o un resultado biológico deseado (por ejemplo, aumento de la masa del músculo esquelético y/o densidad ósea). Tal cantidad debería ser suficiente para reducir la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de masa del músculo esquelético y la densidad ósea. La cantidad efectiva se puede determinar como se describe en las posteriores secciones.
El término "dominio de enlace de GDF-8" cuando se utiliza en relación con ActRIIB, se refiere al dominio extracelular de ActRIIB o una parte de estos necesaria para unirse a GDF-8, i.e., una porción del dominio extracelular ActRIIB responsable para el enlace específico con GDF-8.
El término "superfamilia TGF-\beta" se refiere a una familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados. Esta familia de factores de crecimiento relacionados es bien conocida en el oficio (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). La superfamilia TGF-\beta incluye proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), activina, inhibina, sustancia inhibidora de müller, factor neurotrófico derivado de gliales, e incluso un número creciente de factores de diferenciación y de crecimiento (GDF), tales como GDF-8 (miostatina). Muchas de dichas proteínas son estructuralmente y/o funcionalmente relacionadas con GDF-8. Por ejemplo, BMP-11 humano, también conocido como GDF-11, es 90% idéntica a GDF-8 en el nivel de aminoácido (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232; Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80:185-189).
El término "GDF-8" se refiere a un factor-8 específico de crecimiento y de diferenciación. El término se refiere a la forma de GDF-8 precursora sin procesar de longitud completa, así como los polipéptidos maduros y propéptido resultantes de la división postraduccional. El término también se refiere a cualquiera de los fragmentos y las variantes de GDF-8 que retienen una o más actividades biológicas asociadas con GDF-8 como se discute aquí. La secuencia de aminoácidos de GDF-8 humano maduro se proporciona en SEQ ID NO:2. La presente invención se relaciona con GDF-8 de todas las especies de vertebrados, incluyendo, pero no limitando a, humano, bovino, pollos, murino, rata, porcino, ovino, pavo, babuino, y peces (para información de la secuencia, ver, por ejemplo, McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461).
El término "GDF-8 maduro" se refiere a la proteína que se divide del dominio carboxi-terminal de la proteína precursora de GDF-8. El GDF-8 maduro puede estar presente como un monómero, homodímero, o en un complejo latente de GDF-8. Dependiendo de las condiciones, GDF-8 maduro puede establecer el equilibrio entre cualquiera o todos de estos polipéptidos diferentes. En su forma biológicamente activa, el GDF-8 maduro también se refiere como "GDF-8 activo".
El término "propéptido de GDF-8" se refiere al polipéptido que se divide del dominio amino-terminal de la proteína precursora de GDF-8. El propéptido GDF-8 es capaz de unirse al dominio de enlace del propéptido en el GDF-8 maduro.
El término "complejo latente de GDF-8" se refiere al complejo de proteínas formado entre el homodímero de GDF-8 maduro y el propéptido de GDF-8. Se cree que dos propéptidos de GDF-8 asociados con las dos moléculas de GDF-8 maduro en el homodímero para formar un complejo tetramérico inactivo. El complejo latente puede incluir otros inhibidores de GDF-8 en lugar de o además de uno o ambos de los propéptidos de GDF-8.
El término "actividad de GDF-8" se refiere a una o más de actividades morfogenéticas o del crecimiento fisiológicamente reguladoras, asociadas con la proteína del GDF-8 activo. Por ejemplo, GDF-8 activo es un regulador negativo del músculo esquelético. El GDF-8 activo también puede modular la producción de enzimas musculares específicas (por ejemplo, creatina quinasa), estimular la proliferación de mioblastos, y modular la diferenciación de preadipocitos con los adipocitos. Los procedimientos para evaluar la actividad de GDF-8 in vivo e in vitro incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ensayos de gen indicador (ver Ejemplo 6) o pruebas in vivo que involucran mediciones de parámetros de músculo y/o hueso (ver Ejemplos 8, 9, y 10).
El término "porción Fc" se refiere al fragmento C-terminal de una inmunoglobulina generada por la proteólisis con papaina, o un equivalente funcional derivado de esta. El término "porción Fc" se debería entender que abarca los fragmentos Fc producidos recombinantemente, incluyendo aquellos derivados de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM, y cualquiera de las subclases del isotipo. El término "región constante de un anticuerpo" se refiere a una porción C-terminal de una inmunoglobulina, que comprende la porción Fc y las secuencias adyacentes en la medida que estas secuencias no incluyan regiones variables del anticuerpo, tales como regiones determinantes de la complementariedad (CDRs). La región constante de un anticuerpo es la misma en todos los anticuerpos de un isotipo particular.
Como se utiliza en este documento, el término "hibridación bajo condiciones estrictas" tiene la intención de describir las condiciones para la hibridación y lavados en los que las secuencias de nucleótidos que son significantemente idénticas u homólogas entre sí, permanecen unidas complementariamente entre sí. Las condiciones son tales que las secuencias al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85-90% idénticas sigan unidas entre sí. El porcentaje de identidad se determina como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
Condiciones estrictas se conocen en el oficio y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (eds. Ausubel et al. 1995), sections 2, 4, and 6. Adicionalmente, condiciones estrictas se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, chapters 7, 9, and 11. Un ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es hibridación en 4X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 65-70ºC o hibridación en 4X SSC más 50% de formamida a aproximadamente 42-50ºC, seguido por uno o más lavados en 1X SSC, a aproximadamente 65-70ºC. Cuando se utiliza membranas de nylon, por ejemplo, un ejemplo adicional no-limitante de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en NaH_{2}PO_{4} 0.25-0.5 M, 7% de SDS a aproximadamente 65ºC, seguido por uno o más lavados en NaH_{2}PO_{4} 0.02 M, 1% de SDS a 65ºC. Ver, por ejemplo, Church et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:1991-1995. Será entendido que se pueden adicionar reactivos adicionales a la hibridación y/o soluciones reguladoras de lavado, por ejemplo, agentes de bloqueo (BSA o ADN de esperma de salmón), detergentes (SDS), agentes quelantes (EDTA), Ficoll, PVP, etc.
El término "inhibidor", cuando se utiliza en relación con GDF-8 o su actividad, incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procedimiento, o secreción de GDF-8. Tales inhibidores incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos anti-sentido, ARN bicatenario, y otras moléculas pequeñas, que inhiben GDF-8. Se dice que tales inhibidores "inhiben", "neutralizan", o "reducen" la actividad biológica de la proteína de GDF-8.
Los términos "neutralizar", "neutralización", "inhibitorio", y sus afines se refieren a una reducción en la actividad de GDF-8 por un inhibidor de GDF-8, relativa a la actividad de GDF-8 en la ausencia del mismo inhibidor. La reducción en actividad es preferiblemente al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más.
El término "aislado" se refiere a una molécula que es sustancialmente libre de su ambiente natural. Por ejemplo, una proteína aislada es sustancialmente libre de material celular u otras proteínas de la fuente de célula o tejido del cual se deriva. El término se refiere a preparaciones donde la proteína aislada es suficientemente pura que se administra como una composición terapéutica o al menos 70% a 80% (peso/peso) pura, al menos 80%-90% pura, 90-95% pura; o al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% pura.
El término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como tal, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, animales de zoológico, deportivos, o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc.
El término "interacción específica", o "unido específicamente", o similares, significa que dos moléculas forman un complejo que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. El término es también aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de enlace-antígeno es específico por un epitope particular, que se lleva por un número de antígenos, en cuyo caso el anticuerpo que lleva el dominio de enlace-antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que llevan el epitope. Por lo tanto, un anticuerpo se puede unir específicamente, por ejemplo, BMP-11 y GDF-8 siempre que se una al epitope, que se lleva por ambos.
El enlace específico se caracteriza por una alta afinidad y una baja a moderada capacidad. El enlace no-específico usualmente tiene una baja afinidad con una moderada a alta capacidad. Por lo general, el enlace se considera específico cuando la afinidad constante K_{a} es superior de 10^{6} M^{-1}, o preferiblemente más alta de 10^{8} M^{-1}. Si es necesario, el enlace no-específico se puede reducir sin afectar sustancialmente el enlace específico variando las condiciones de enlace. Tales condiciones se conocen en el oficio, y un experto utilizando técnicas rutinarias puede seleccionar las condiciones apropiadas. Las condiciones usualmente se definen en términos de concentración del polipéptido de fusión ActRIIB, fuerza iónica de la solución, temperatura, tiempo permitido para unir, concentración de moléculas no-relacionadas (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de leche), etc. Condiciones ejemplares se establecen en los Ejemplos 5 y 6.
La frase "sustancialmente según se presenta" significa que una secuencia de aminoácidos pertinente es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia dada. A modo de ejemplo, tales secuencias pueden ser variantes derivadas de diversas especies, o pueden ser derivadas de la secuencia dada por truncamiento, deleción, sustitución o adición de aminoácidos. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina por algoritmos de alineación estándar tales como, por ejemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrito en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, el algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol 48:444-453, o el algoritmo de Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17.
El término "tratamiento" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como un tratamiento profiláctico/preventivo. Aquellos con necesidad de tratamiento pueden incluir a individuos que ya tienen un trastorno médico particular así como aquellos que pueden adquirir en última instancia el trastorno (i.e., aquellos que necesitan medidas preventivas, tales como, por ejemplo, mujeres posmenopáusicas con una historia familiar de osteoporosis, o pacientes obesos con una historia familiar de diabetes tipo II o algunas lecturas elevadas de azúcar en sangre).
\vskip1.000000\baselineskip
II. Polipéptidos de Fusión ActRIIB
Se describe aquí un receptor de activina tipo II ActRIIB modificado que se une a GDF-8 e inhibe su actividad in vitro y/o in vivo. En particular, los polipéptidos de fusión ActRIIB, revelados en la actualidad inhiben la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de masa del músculo esquelético y la densidad ósea. Los polipéptidos de fusión ActRIIB descritos en este documento son solubles y poseen propiedades farmacocinéticas, que los hacen apropiados para uso terapéutico, por ejemplo, vida media circulatoria extendida y/o protección mejorada a partir de la degradación proteolítica.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento comprenden (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la región constante de un anticuerpo. El aminoácido completo y las secuencias de ADN de una modalidad ilustrativa particular de la proteína de fusión de ActRIIB se establecen en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente.
La primera secuencia de aminoácidos se deriva de toda o una porción del dominio extracelular de ActRIIB y es capaz de unirse a GDF-8 específicamente. Dicha porción del dominio extracelular de ActRIIB también se puede unir a BMP-11 y/o activina, u otros factores de crecimiento. La primera secuencia de aminoácidos puede ser idéntica a o sustancialmente según se presenta en SEQ ID NO:3 del aminoácido (aa) 23 al aa 138 o de aa 19 al aa 134 en SEQ ID NO:1. La diferencia entre SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 es que aa 64 de SEQ ID NO:1 es Ala, mientras que el correspondiente aa 68 en SEQ ID NO:3 es Arg. Adicionalmente, otras variaciones en la secuencia de ActRIIB son posibles, por ejemplo, aa 16 y aa 17 en SEQ ID NO:1 pueden ser sustituidos con Cys y Ala, respectivamente. La primera secuencia de aminoácidos puede comprender al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, o 120 aminoácidos continuos de aa 23 y aa 138 de SEQ ID NO:3 o aa 19 y aa 134 de SEQ ID NO:1. Dicha secuencia se puede truncar en la medida que la secuencia truncada sea capaz de unirse específicamente a GDF-8. El enlace con GDF-8 se puede probar utilizando métodos conocido en el oficio o como se describe en los Ejemplos 5 y 6.
La segunda secuencia de aminoácidos se deriva de la región constante de un anticuerpo, particularmente la porción Fc, o es una mutación de dicha secuencia. La segunda secuencia de aminoácidos puede ser derivada de la porción Fc de una IgG. La porción Fc puede ser derivada de la IgG que es IgG_{1}, IgG_{4}, u otro isotipo de IgG. En una modalidad particular, la segunda secuencia de aminoácidos comprende la porción Fc de IgG_{1} humana según se establece en SEQ ID NO:3 (aminoácidos 148 a 378), en donde la porción Fc de IgG_{1} humana ha sido modificada para minimizar la función efectora de la porción Fc. Tales modificaciones incluyen el cambio de residuos de aminoácidos específicos que pueden alterar una función efectora tal como enlace receptor Fc (Lund et al. (1991) J. Immun. 147:2657-2662 and Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-324), o el cambio de la especie a partir de la cual la región constante se deriva. Los anticuerpos pueden tener mutaciones en la región C_{H}2 de la cadena pesada que reduce la función efectora, i.e., enlace receptor Fc y activación complementaria. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener mutaciones tales como aquellas descritas en U.S. Patent Nos. 5,624,821 y 5,648,260. En la cadena pesada de IgG_{1} o IgG_{2}, por ejemplo, tales mutaciones se pueden hacer en los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 234 y 237 en la secuencia de longitud completa de IgG_{1} o IgG_{2}. Los anticuerpos también pueden tener mutaciones que estabilizan el enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas de una inmunoglobulina, tales como mutaciones en la región bisagra de IgG4, como se revela en Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108.
La segunda secuencia de aminoácidos se puede unir al C-terminal o al N-terminal de la primera secuencia de aminoácidos, con o sin estar unida por una secuencia ligadora. La longitud exacta y la secuencia del ligador y su orientación relativa a las secuencias ligadas, puede variar. El ligador puede ser, por ejemplo, (Gly-Ser)2 (SEQ ID NO:5). El ligador puede comprender 2, 10, 20, 30, o más aminoácidos y se selecciona basándose en las propiedades deseadas tales como solubilidad, longitud y separación estérica, inmunogenecidad, etc. El ligador puede comprender una secuencia de un sitio de corte proteolítico, tal como la sitio de corte de la enteroquinasa Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:6), u otras secuencias funcionales útiles, por ejemplo, para purificación, detección, o modificación de la proteína de fusión.
Será entendido por alguien de habilidad en el oficio que ciertos aminoácidos en una secuencia de cualquier proteína pueden ser sustituidos por otros aminoácidos sin afectar adversamente la actividad de la proteína. Por lo tanto, se contempla que diversos cambios se pueden hacer en las secuencias de aminoácidos de la secuencia de los polipéptidos de fusión ActRIIB descritos en este documento, o secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica o utilidad. La actividad biológica de ActRIIB se puede medir como se describe en los Ejemplos 6-10. Tales cambios pueden incluir, pero no se limitan a, deleciones, inserciones, truncaciones, y sustituciones.
Las fusiones adicionales de cualquiera de los polipéptidos de fusión ActRIIB descritos en este documento con las secuencias de aminoácidos derivadas de otras proteínas se pueden construir. Las secuencias de fusión deseables pueden ser derivadas de proteínas que tienen actividad biológica diferente de aquellas de ActRIIB, por ejemplo, citoquinas, factores de diferenciación y de crecimiento, enzimas, hormonas, otros componentes receptores, etc. También, los polipéptidos de fusión de ActRIIB, pueden ser acoplados químicamente, o conjugados, con otras proteínas y agentes farmacéuticos. Tal modificación se puede diseñar para alterar la farmacocinética y/o biodistribución de la composición resultante.
Los polipéptidos de fusión ActRIIB descritos en este documento pueden ser glicosilados, pegilados, o unidos a otro polímero no proteináceo. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad, se pueden unir a uno de una variedad de polímeros no-proteináceos, por ejemplo, polietileno-glicol, polipropileno glicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en U.S. Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; o 4,179,337. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB se modifican químicamente por conjugación covalente con un polímero para aumentar su vida media en circulación, por ejemplo. Polímeros ejemplares, y métodos que los unen a los péptidos, también se muestran en U.S. Patent Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; y 4,609,546.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento, pueden ser modificados para tener un patrón de glicosilación alterado (i.e., alterado a partir del patrón de glicosilación original o nativo). Como se utiliza en este documento, "alterado" significa que tiene una o más fracciones carbohidrato suprimidas, y/o que tienen uno o más sitios de glicosilación adicionados a la secuencia original. La adición de sitios de glicosilación al ActRIIB modificado revelado en la actualidad, se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos que contiene secuencias de consenso del sitio de glicosilación bien conocidos en el oficio. Otro medio para aumentar el número de fracciones carbohidrato es por acoplamiento químico o enzimático de los glucósidos con los residuos de aminoácidos. Estos métodos se describen en WO 87/05330, y en Aplin et al. (1981) Crit. Rev. Biochem. 22:259-306. La eliminación de cualquiera de las fracciones carbohidrato presentes en ActRIIB se puede lograr química o enzimáticamente como se describe por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131 y por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento también se pueden etiquetar con una etiqueta detectable o funcional. Las etiquetas detectables incluyen radiomarcadores tales como ^{131}I o ^{99}Tc, que se pueden unir a los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento utilizando química convencional conocida en el oficio. Las etiquetas también incluyen etiquetas de enzimas tales como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Las etiquetas además incluyen fracciones químicas tales como biotina, que pueden ser detectadas vía un enlace con una fracción detectable cognada específica, por ejemplo, avidina marcada.
Alguien de habilidad en el oficio reconocerá que los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento pueden ser utilizados para detectar, medir, e inhibir proteínas diferentes de GDF-8, BMP-11, y activina. Ejemplos no limitantes de tales proteínas, por ejemplo, las secuencias de GDF-8 derivadas de diversas especies (ortólogos), se describen en la presente especificación.
\vskip1.000000\baselineskip
III. Ácidos Nucleicos, Clonación y Sistemas de Expresión
La presente divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un ActRIIB soluble, que puede ser utilizado en los métodos de la presente invención. El ácido nucleico comprende una secuencia codificante por al menos un polipéptido de fusión ActRIIB como se describe en este documento. En una modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia, establecido en SEQ ID NO:4. La secuencia de ácido nucleico puede codificar las secuencias de aminoácidos de aa 23 y aa 138 de SEQ ID NO:3 o de aa 19 y aa 134 de SEQ ID NO:1.
La divulgación también proporciona las construcciones en la forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención como anteriormente.
La divulgación también proporciona una célula huésped, que comprende una o más construcciones como anteriormente. Un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.3 es en sí misma un aspecto de la presente invención. La producción de los polipéptidos de fusión codificados de ActRIIB se puede lograr por la expresión recombinante de células huésped que contienen el ácido nucleico bajo condiciones de cultivo apropiado. Después de la expresión, un polipéptido de fusión ActRIIB se aísla y/o purifica utilizando cualquier técnica apropiada, a continuación se utiliza, según proceda. Procedimientos ejemplares para la expresión y purificación se presentan en los Ejemplos 3 y 4.
Los polipéptidos de fusión específicos de ActRIIB y que codifican moléculas de ácido nucleico y vectores descritos en este documento se pueden obtener, aislar y/o purificar, por ejemplo, de su ambiente natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o en el caso de ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de origen diferente de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. Los ácidos nucleicos, de acuerdo con la presente invención, pueden comprender ADN o ARN y pueden ser completa o parcialmente sintéticos. La referencia a una secuencia de nucleótido según se presenta aquí abarca una molécula de ADN con la secuencia determinada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia determinada en la cual U es sustituido por T, a menos que el contexto lo requiera de otra manera.
Se describen aquí las secuencias que tienen al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 nucleótidos de largo e hibridizan bajo condiciones estrictas de hibridación al ácido nucleico establecido en SEQ ID NO:4.
Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped son bien conocidos. Apropiadas células huésped incluyen bacterias, células de mamífero, y levadura y sistemas de baculovirus. Líneas celulares de mamíferos disponibles en el oficio para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster Chino, células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un huésped de bacterias común es E. coli. Para otras células apropiadas para producir polipéptidos de fusión de ActRIIB, ver Gene Expression Systems, Academic Press (Fernandez et al. eds. 1999). Cualquier línea celular compatible con la presente invención, puede ser utilizada para producir los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento.
Apropiados vectores se pueden seleccionar o construir, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotor, secuencias terminador, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según proceda. Los vectores pueden ser plásmidos o virus, por ejemplo, fago, o fagómido, según proceda. Para otros detalles ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley & Sons (Ausubel et al eds. 1992).
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es una célula huésped que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3. Tal ácido nucleico se puede introducir en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica apropiada. Para las células eucariotas, técnicas apropiadas pueden incluir transfección de fosfato de calcio, DEAE-Dextran, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción utilizando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas apropiadas pueden incluir transformación de cloruro de calcio, electroporación y transfección utilizando bacteriófagos.
La introducción puede ser seguida causando o permitiendo la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, por el cultivo de células huésped bajo condiciones apropiadas para la expresión del ácido nucleico.
IV. Métodos para Identificar Inhibidores
Incluso otro aspecto de la invención proporciona un método para identificar los inhibidores de GDF 8. Ensayos de detección aprobados, por ejemplo, ensayos basados en ELISA, se conocen en el oficio. En tal ensayo de detección, una primera mezcla de enlace se forma combinando un polipéptido de fusión ActRIIB y un ligando, por ejemplo, GDF-8, BMP-11, activina; y la cantidad de enlace en la primera mezcla de enlace (M_{0}) se determina. Una segunda mezcla de enlace también se forma combinando un polipéptido de fusión ActRIIB, el ligando, y el compuesto o agente que se detecta, y la cantidad de enlace en la segunda mezcla de enlace (M_{1}) se determina. Las cantidades de enlace en la primera y segunda mezclas de enlace luego se comparan, por ejemplo, calculando la relación M_{1}/M_{0}. El compuesto o agente se considera que es capaz de inhibir la señalización de la célula mediada por ActRIIB, sí se observa una disminución en enlace en la segunda mezcla de enlace en comparación con la primera mezcla de enlace. La formulación y optimización de mezclas de enlace está dentro del nivel de habilidad en el oficio, tales mezclas de enlace también pueden contener las soluciones reguladoras y las sales necesarias para mejorar u optimizar el enlace, y ensayos control adicionales se pueden incluir en el ensayo de detección de la invención.
Los compuestos encontrados para reducir el polipéptido de fusión del enlace ActRIIB-ligando por al menos aproximadamente 10% (i.e., M_{1}/M_{0}<0.9), preferiblemente mayor de aproximadamente 30%, además se puede identificar y luego, si se desea, en segundo lugar detectar la capacidad para inhibir la actividad de GDF-8 en otros ensayos, tales co-
mo el ensayo de enlace de ActRIIB, y otros ensayos basados en células e in vivo como se describe en los Ejemplos 
\hbox{5-12.}
V. Métodos de Tratamiento de Enfermedades y Otros Usos
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad, son solubles y poseen propiedades farmacocinéticas que las hacen apropiadas como agentes terapéuticos, i.e., útiles para prevenir, diagnosticar, o tratar diversos trastornos médicos en animales, y especialmente, humanos. En ciertas modalidades, la vida media en circulación del polipéptido de fusión ActRIIB excede 5, 7, 10, o 14 días.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB pueden ser utilizados para inhibir una o más actividades de GDF-8 asociados con trastornos musculares y/o de huesos. La inhibición de la actividad de GDF-8 se puede medir en ensayos de gen indicador (RGA) de pGL3(CAGA)12 como se describe en Thies et al. (Growth Factors (2001) 18:251-259) o como se ilustra en el Ejemplo 6.
El trastorno médico que se diagnostica, se trata, o previene por los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad, es un trastorno muscular o neuromuscular; un trastorno de tejido adiposo tal como obesidad; diabetes tipo II; tolerancia a la glucosa deteriorada; síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X); resistencia a la insulina inducida por trauma tales como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno; o enfermedades degenerativas óseas tales como osteoporosis.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB en la actualidad revelados, también se pueden utilizar en terapias para reparar músculos dañados, por ejemplo, miocardio, diafragma, etc. Enfermedades y trastornos ejemplares además incluyen trastornos musculares y neuromusculares tales como distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular; atrofia orgánica; fragilidad; síndrome del canal carpiano; enfermedad pulmonar obstructiva congestiva; y sarcopenia, caquexia y otro síndrome de atrofias musculares.
Otros trastornos médicos que se diagnostican, se tratan, o previenen por los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad son trastornos asociados con una pérdida de hueso, que incluyen osteoporosis, especialmente en las mujeres mayores y/o posmenopáusicas; osteoporosis inducida por los glucocorticoides; osteopenia; osteoartritis; y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Otras enfermedades de hueso metabólicas y trastornos objetivo incluyen baja masa ósea debido a la terapia crónica con glucocorticoides, insuficiencia gonodal prematura, supresión androgénica, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB preferiblemente se utilizan para prevenir; diagnosticar, o tratar dichos trastornos médicos en mamíferos, especialmente, en humanos.
Las composiciones que comprenden los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. En general, una cantidad efectiva terapéuticamente puede variar con la edad, condición, y sexo del sujeto, así como la severidad de la condición médica en el sujeto. La dosificación se puede determinar por un médico y ajustar, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Por lo general, las composiciones se administran de manera que los polipéptidos se administran a una dosis de 1 \mug/kg a 20 mg/kg, 1 \mug/kg a 10 mg/kg, 1 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 100 \mug/kg, 100 \mug a 1 mg/kg, y 500 \mug/kg a 1 mg/kg, o como se describe en los Ejemplos 10 y 11. Las composiciones se pueden administrar como una dosis en bolo, para maximizar los niveles en circulación por el mayor periodo de tiempo después de la dosis. La infusión continua también se puede utilizar después la dosis en bolo.
La especificación para la unidad de dosificación de los polipéptidos descritos en este documento se estipulan por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se logra, y las limitaciones inherentes en el oficio de la composición como un compuesto activo para el tratamiento de individuos.
La toxicidad y eficacia terapéutica se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales por ejemplo, para determinar la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos o terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD_{50}/ED_{50}. Las composiciones que muestran grandes índices terapéuticos, se prefieren.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden ser utilizados en la formulación de un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones en circulación que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada.
La dosis efectiva terapéuticamente, se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos de animales para lograr un rango de concentración de plasma en circulación que incluye la IC_{50} (i.e., la concentración del terapéutico que logra una inhibición media máxima de síntomas) según se determina en cultivo celular. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosificación particular se pueden monitorear por un bioensayo apropiado. Ejemplos de bioensayos apropiados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en la transcripción, ensayos de enlace de GDF-8, ensayos de creatina quinasa, ensayos basándose en la diferenciación de pre-adipocitos, ensayos basados en la absorción de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunológicos.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento pueden ser utilizados para detectar la presencia de proteínas que pertenecen a la superfamilia TGF-\beta, tales como BMP-11 y GDF-8, in vivo o in vitro. Correlacionando la presencia o nivel de estas proteínas con una condición médica, alguien de habilidad en el oficio puede diagnosticar la condición médica asociada. Las condiciones médicas que se pueden diagnosticar por los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad, se establecen anteriormente.
Tales métodos de detección son bien conocidas en el oficio e incluyen ELISA, radioinmunoensayo, inmunotransferencia, Western blot, inmunofluorescencia, immunoprecipitación, y otras técnicas comparables. Los polipéptidos además se pueden proporcionar en un kit de diagnóstico que incorpora una o más de estas técnicas para detectar una proteína (por ejemplo, GDF-8). El citado kit puede contener otros componentes, embalaje, instrucciones, u otro material de ayuda para la detección de la proteína y uso del kit.
Cuando los polipéptidos de fusión de ActRIIB están destinados para propósitos de diagnóstico, puede ser deseable modificarlos, por ejemplo, con un grupo ligando (tal como biotina) o un grupo marcador detectable (tal como un grupo fluorescente, un radioisotopo o una enzima). Si se desea, los polipéptidos de fusión de ActRIIB se pueden marcar utilizando técnicas convencionales. Apropiadas etiquetas incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos, reactivos electrón-denso, enzimas, y ligandos que tienen socios de enlace específicos. Las enzimas usualmente se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante se puede detectar por su capacidad para convertir la tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Otros socios de enlace apropiados incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas receptor-ligando conocidas en el oficio.
\vskip1.000000\baselineskip
VI. Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Administración
Se describen aquí las composiciones apropiadas para la administración a pacientes. Las composiciones usualmente comprenden uno o más polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en este documento, la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, cubiertas, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes de las sustancias farmacéuticamente activas, es bien conocido en el oficio. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones suplementarias, terapéuticas adicionales, o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también se pueden incluir en un recipiente, envase, o dispensador junto con las instrucciones para su administración.
Se formula una composición farmacéutica de la invención, que es compatible con su ruta prevista de administración. Los métodos que logran la administración se conocen por aquellos de ordinaria habilidad en el oficio. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcuatánea o transdérmica. También puede ser posible obtener composiciones que se pueden administrar vía oral o tópica.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación intradérmica o subcuatánea usualmente incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos y grasas, polietileno-glicoles, glicerina, propileno glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilenodiaminatetraacético; soluciones reguladoras tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Tales preparaciones se pueden incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas para la inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, apropiados portadores incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor^{TM} EL (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina reguladora de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida en la medida que exista fácilmente jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propileno glicol, y polietileno glicol líquido, y similares), y mezclas apropiadas de estos. La apropiada fluidez se puede mantener, por ejemplo, por el uso de una cubierta tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones y por el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse más o menos incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluente inerte o un portador comestible. Se pueden incluir en cápsulas de gelatina o comprimidos en forma de tabletas. Para el propósito de administración terapéutica oral, los polipéptidos de fusión de ActRIIB se pueden incorporar con excipientes y utilizar en la forma de tabletas, comprimidos medicinales, o cápsulas. Los agentes de enlace farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, comprimidos medicinales, y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel^{TM}, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes^{TM}; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o sabor naranja.
Para la administración por inhalación, los polipéptidos de fusión de ActRIIB se entregan en la forma de un atomizador de aerosol de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor apropiado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medio transdérmico o transmucosa. Por ejemplo, en el caso de ActRIIB-Fc, las composiciones pueden ser capaces de transmisión a través de las membranas mucosas (por ejemplo, intestino, boca, o pulmones) vía la ruta mediada del receptor FcRn (U.S. Patent No. 6,030,613). La administración transmucosa se puede lograr, por ejemplo, a través del uso de pastillas para chupar, atomizadores nasales, inhaladores, o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles, o cremas como generalmente se conoce en el oficio. Para la administración transmucosal o transdérmica, penetrantes apropiados a la barrera que se penetra se utilizan en la formulación. Tales penetrantes generalmente se conocen en el oficio, e incluyen, por ejemplo, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad se pueden preparar con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de entrega microencapsulados. Los polímeros biodegradables, biocompatibles se pueden utilizar, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán aparentes para aquellos de habilidad en el oficio. Las suspensiones liposomales que contienen los polipéptidos de fusión de ActRIIB revelados en la actualidad, también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estas se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por aquellos de habilidad en el oficio, por ejemplo, como se describe en U.S. Patent No. 4,522,811.
Puede ser ventajoso formar composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación como se utiliza aquí, se refiere a unidades discretas, físicamente apropiadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se trata; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del compuesto activo, calculada para producir el deseado efecto terapéutico en asociación con el portador farmacéutico requerido.
Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de fusión de ActRIIB, tales como los ácidos nucleicos descritos anteriormente, se pueden introducir a una célula dentro del tejido, un órgano, o un organismo de manera que los polipéptidos codificados luego se pueden expresar. Esta metodología puede ser útil, por ejemplo, en la evaluación de los efectos de polipéptidos de fusión de ActRIIB sobre tejidos y órganos individuales. El ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión ActRIIB se puede unir a una secuencia de control de expresión tejido-específico, por ejemplo, secuencia promotor músculo-específico tales como el promotor de miosina o el promotor de la desmina, los elementos potenciadores de músculo específico tales como el potenciador de la creatina quinasa del músculo. Aquellos de habilidad en el oficio reconocerán que las secuencias de polinucleótidos específicas se pueden insertar en los vectores virales o de plásmidos, que se pueden inyectar a un mamífero sistemática, o localmente. Las células huésped también se pueden cosechar, y un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión ActRIIB se puede transfectar en dichas células ex vivo para la posterior reimplantación utilizando métodos conocidos en el oficio. Los ácidos nucleicos también se pueden transfectar en un embrión de célula única para crear un animal transgénico como se describe en Gene Expression Systems, Academic Press (Fernandez et al. eds. 1999).
Los siguientes ejemplos ilustran algunas modalidades y aspectos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de GDF-8
Los medios acondicionados a partir de una línea celular seleccionada que expresa la proteína recombinante humana de GDF-8 (GDF-8 maduro y propéptido de GDF-8) se acidificó a pH 6.5 y se aplico a una columna de intercambio aniónico de 80 x 50 mm POROS^{TM} HQ en tándem a una columna de intercambio catiónico de 80 x 50 mm POROS^{TM} SP (PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). El flujo a través se ajustó a pH 5.0 y se aplico a una columna de intercambio catiónico de 75 x 20 mm POROS^{TM} SP (PerSeptive Biosystems) y se eluyó con un gradiente TFA/acetonitrilo. Las fracciones que contienen el complejo latente de GDF-8, según se confirmó por SDS-PAGE, se mezclaron, acidificaron con ácido trifluoroacético (TFA) a pH 2-3, luego se lleva hasta 200 ml con 0.1% de TFA para bajar la viscosidad. A continuación la mezcla se aplicó a una columna C5 de 250 x 21.2 mm (Phenomenex, Torrance, CA) precedida por un guarda columna de 60 x 21.2 mm (Phenomenex) y se eluyó con un gradiente TFA/acetonitrilo, para separar el GDF-8 maduro del propéptido de GDF-8. Las fracciones mezcladas que contienen GDF-8 maduro se concentraron por liofilización para eliminar el acetonitrilo y se adicionaron 20 ml de TFA al 0.1%. A continuación la muestra se aplicó a una columna C5 de 250 x 10 mm (Phenomenex) se calentó a 60ºC para ayudar en la separación. Esto se repitió hasta que no se puede lograr más otra separación. Las fracciones que contienen GDF-8 maduro luego se mezclaron y se llevan hasta 40% de acetonitrilo y se aplico a una columna de exclusión de tamaño 600 x 21.2 BioSep^{TM} S-3000 (Phenomenex) precedida por un guarda columna de 60 x 21.2. Las fracciones que contienen el GDF-8 maduro purificado y el propéptido de GDF-8 se mezclaron por separado y se concentraron para utilizar en posteriores experimentos.
En SDS-PAGE, el GDF-8 maduro purificado migró como una banda amplia a 25 kDa bajo condiciones no-reductoras y 13 kDa bajo condiciones reductoras. Bajo condiciones no-reductoras y reductoras, propéptido de BMP-11 migró alrededor de 35 kDa. Un perfil similar de SDS-PAGE ha sido reportado para murino GDF-8 por McPherron et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997) 94:12457-12461) y refleja la naturaleza dimérica de la proteína madura. El propéptido de GDF-8 migró a aproximadamente 35 kDa en SDS-PAGE reductor. El dímero BMP-11 maduro activo se purificó a partir de medio acondicionado de una línea celular que expresa BMP-11 humano recombinante de la misma manera. El medio acondicionado se cargó dentro de una columna TALON^{TM} de10 ml (Clonetech, Palo Alto, CA). La proteína unida se eluyó con Tris 50 mM pH 8.0/NaCl 1 M/imidazol 500 mM. Las fracciones que contienen el complejo de BMP-11 se mezclaron y acidificaron con 10% de ácido trifluoroacético a un pH de 3. La mezcla del complejo BMP-11 se aplicó a una columna C4 Jupiter de 250 x 4.6 mm (Phenomenex), la cual se calentó a 60ºC para una mejor separación del BMP-11 maduro y el propéptido de BMP-11. BMP-11 se eluyó con un gradiente TFA/acetonitrilo. Las fracciones que contienen BMP-11 se concentraron por liofilización para eliminar el acetonitrilo.
Ejemplo 2 Características de GDF-8 Humano Recombinante Purificado
50 \mug de cada GDF-8 maduro purificado y propéptido de GDF-8 purificado se mezclaron y dializaron en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.0, y se sometieron a cromatografía en una columna de exclusión de tamaño BioSep^{TM} S-3000 de 300 x 7.8 mm (Phenomenex). El peso molecular del complejo GDF-8 maduro/propéptido se determinó del tiempo de elución, utilizando estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que se sometieron a cromatografía en la misma columna.
Cuando el propéptido de GDF-8 purificado se incubó con GDF-8 maduro purificado a pH neutro, las dos proteínas surgieron al complejo, como se indica por el perfil de exclusión de tamaño. El pico de proteína primaria que eluyó a 12.7 minutos tuvo un peso molecular estimado de 78 kDa a partir de estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories) que se sometieron a cromatografía en la misma columna. El tamaño del complejo fue más consistente con un dímero del GDF-8 maduro asociado con dos monómeros de propéptido.
Para confirmar esta observación, una preparación que contiene ambos GDF-8 maduro y el propéptido de GDF-8 se incubó con o sin 1-Etil 3-(3-dimetilaminopropil)carbodiamida clorhidrato 100 mM (EDC, Pierce Chemical, Rockford, IL) por 1 hora a temperatura ambiente, se acidificaron con HCl a pH 2-3, y se concentraron con un concentrador Amicon Micron-10 (Millipore, Bedford, MA) por SDS-PAGE, utilizando un gel de acrilamida al 10% estandarizado con tricina. Las proteínas se visualizaron por tinción de azul Coomassie^{TM} de SDS-PAGE.
Ejemplo 3 Expresión de ActRIIB-Fc en Células CHO
Un cADN de ActRIIB humano de longitud completa se utilizó para clonar-PCR el dominio extracelular (excluyendo la secuencia que codifica el péptido señal). Los cebadores utilizados se flanquearon por los sitios SpeI (5') y NotI (3'). Después de la amplificación PCR, este fragmento PCR se clonó en los sitios SpeI/NotI del plásmido de expresión pHTop-HBML/EKFc. El marco de lectura abierto codifica: líder de la melitina de abejas de la miel (aminoácidos 1 a-21 de SEQ ID NO:3); dominio extracelular ActRIIB humano (aminoácidos 23 a 138 de SEQ ID NO:3); sitio de corte de la enteroquinasa (DDDK, SEQ ID NO:6); y fragmento Fc de IgG1 humana (aminoácidos 148 a 378 de SEQ ID NO:3). Como un resultado de la inserción del sitio SpeI, hubo una adición de Thr-22 en la secuencia.
Una línea celular estable CHO transfectada establemente para expresar el ActRIIB-Fc anterior se obtuvo por transfección de la lipofectina del vector pHTop-HBML que contiene la construcción ActRIIB-Fc en las células CHO/A2. Las células transfectadas se seleccionaron en metotrexato 0.1 \muM. El análisis Western blot del medio acondicionado se utilizó para identificar los clones de expresión más altos.
El vector pHTop se derivó de pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) eliminando la mayoría del promotor principal tardío del adeno y la inserción de seis repeticiones del operador tet como se describe en Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551.
La línea celular CHO/A2 se derivó de las células CHO DUKX B11 (Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216-4220) por integración establemente de un activador transcripcional, una proteína de fusión entre el represor tet fusionado al dominio transcripcional VP 16 del virus herpes (Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551).
Ejemplo 4 Purificación de ActRIIB-Fc
El material crudo concentrado a partir del medio acondicionado se purificó por rProtein A Sephadex Fast Flow^{TM} (XK26/4.5 cm, 23.8 ml; Pharmacia, Piscataway, NJ) a una pureza del 99%, según se determina por cromatografía de tamaño de exclusión de la siguiente manera. El medio acondicionado congelado se descongeló en un baño de agua a 37ºC y se filtró a través de filtros de 0.22 \mum. Cuatro partes de la solución filtrada se mezcló con una parte de la solución reguladora de carga de la Proteína A (Na_{2}SO_{4} 0.65 M, citrato de sodio 20 mM, ácido bórico 20 mM, Na_{2}HPO_{4} 20 mM, pH 9.0) y se corre sobre la columna de proteína A a temperatura ambiente. ActRIIB-Fc se eluyó completamente de la columna utilizando solución reguladora de elución de la proteína A (NaCl 0.15 M, ácido cítrico 20 mM, pH 2.5) con gradiente o elevando a un pH cercano de 4-5, y el pico se recolectó y neutralizó a pH 7.0, adicionando solución reguladora de neutralización al 25% (Na_{2}HPO_{4} 0.05 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2). Las fracciones se evaluaron por cromatografía de tamaño de exclusión y SDS-PAGE, y luego se mezclaron y almacenaron a 4ºC. La proteína purificada se formuló en PBS por columna Sephadex^{TM} G-25 desalinizada (XK50/13.4 cm, 236 ml, Pharmacia), y luego se filtró a través de un filtro de 0.22 \mum y se almacenó a 4ºC.
Ejemplo 5 Propiedades de enlace de GDF-8 y BMP-11 Purificado en el ensayo de enlace ActRIIB-Fc
El complejo latente de GDF-8 fue biotinilado en una relación de 20 moles de EZ-link^{TM} Sulfo-NHS-Biotin (Pierce Chemical, Cat. No. 21217) por 1 mol del complejo GDF-8 por 2 horas en hielo, inactivado con 0.5% de TFA, y sometido a cromatografía en una columna C4 Jupiter de 250 x 4.6 mm (Phenomenex) para separar el GDF-8 maduro a partir del propéptido de GDF-8. Las fracciones de GDF-8 biotinilado eluidas con un gradiente TFA/acetonitrilo se mezclaron, se concentraron y cuantificaron mediante MicroBCA^{TM} protein Assay Reagent Kit (Pierce Chemical, Cat. No. 23235).
BMP-11 maduro biotinilado se preparó a partir del complejo BMP-11 latente de la misma manera como se describe anteriormente. ActRIIB-Fc recombinante, se preparó como se describe en los Ejemplos 3 y 4, se recubrió en placas de ensayo de fondo plano de 96-pozos (Costar, NY, Cat. No. 3590) a 1 \mug/ml en solución reguladora de carbonato de sodio 0.2 M (pH 10) durante la noche a 4ºC. Las placas luego se bloquearon con 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino y se lavaron siguiendo el protocolo estándar de ELISA. 100 \mul de alícuotas de GDF-8 o BMP-11 biotinilado a diversas concentraciones se adicionaron a la placa de ELISA bloqueada, incubada por 1 hr y se lavaron. La cantidad de GDF-8 o BMP-11 unida se detectó por peroxidasa de rábano picante-Estreptavidina (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, Cat. No.13047E) seguido por la adición de TMB (KPL, Gaithersburg, MD, Cat. No. 50-76-04). Se hicieron mediciones colorimétricas a 450 nM en un lector de microplaca Molecular Devices.
Como se muestra en la Figura 1, GDF-8 y BMP-11 biotinilado unido a ActRIIB-Fc, con una ED_{50} de 15 ng/ml y 40 ng/ml, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Actividad inhibidora de ActRIIB-Fc en Ensayo de Gen Indicador
Para demostrar la actividad de ActRIIB-Fc, un ensayo de gen indicador (RGA) se desarrolló utilizando una secuencia PGL3(CAGA)_{12} del vector indicador acoplado a la luciferasa. Se reportó previamente que la secuencia CAGA era una secuencia sensible a TGF-\beta dentro del promotor del gen PAI-1 inducido por TGF-\beta (Denner et al. (1998) EMBO J. 17:3091-3100).
Un vector indicador que contiene 12 cajas CAGA, se hizo utilizando el plásmido indicador básico PGL3 (Promega, Madison, WI). La caja TATA y el sitio de iniciación de transcripción del promotor posterior principal del adenovirus (-35/+10) se insertó entre los sitios Bglll y Hindlll. Los oligonucleótidos que contienen 12 repeticiones de las cajas CAGA, AGCCAGACA, se hibridaron y clonaron en el sitio Xhol. La línea celular rabdomiosarcoma humano A204 (ATCC HTB-82) fue transfectada temporalmente con pGL3(CAGA)_{12} utilizando el reactivo de transfección FuGENE^{TM} 6 (Boehringer Manheim, Germany). Después de la transfección, las células se cultivaron sobre placas de 48 pozos en medio de McCoy 5A suplementado con glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, 1000 \mug/ml de penicilina y 10% suero de fetal bovino por 16 hrs. Las células luego se trataron con o sin 10 ng/ml de GDF-8 y diversas concentraciones de ActRIIB-Fc en medio de McCoy 5A con glutamina, estreptomicina, penicilina, y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino por 6 hrs a 37ºC. La luciferasa se cuantificó en las células tratadas utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega).
Dos lotes de ActRIIB purificados independientemente mostraron una IC_{50} de 0.07 a 0.1 nM en el anterior ensayo de gen indicador (Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Farmacocinética
La farmacocinética (PK) de ActRIIB-Fc se evaluó en ratones C57B6/SCID (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a una dosis de 1 mg/kg como una administración intravenosa única (IV) o intraperitoneal (IP). ActRIIB-Fc, producido y purificado como se describe en los Ejemplos 3 y 4, fue radiomarcado utilizando el método iodogen (Protein Pharmacokinetics and Metabolism, Plenum Press, New York, NY (Ferraiolo et al. eds. 1992)). Los animales recibieron una mezcla de ActRIIB-Fc sin marcar y ^{125}I marcado en las dosis enumeradas anteriormente y las concentraciones en suero se determinaron basándose en la radioactividad ^{125}I en el suero y la actividad específica de la dosis inyectada. La Figura 3 muestra la concentración en suero basándose en conteos precipitados de TCA versus el tiempo para ActRIIB-Fc administrado ya sea IV o IP. La absorción de la inyección IP se completó, y la biodisponibilidad fue cercana al 100% dentro de las primeras 180 hr después de la inyección; la distribución del volumen inicial correspondió al volumen en plasma de ratón (50 ml/kg); la concentración pico en suero fue 11 \mug/ml (IP, a 6 hr después de la inyección) y 19.4 \mug/ml (IV); la vida media durante la fase de eliminación terminal fue aproximadamente 5 días.
Ejemplo 8 Efecto in vivo de ActRIIB-Fc
Con el fin de determinar si el ActRIIB aumenta la masa muscular en ratones adultos, un estudio in vivo se realizó con hembras C57B6/SCID de siete-semanas de edad (The Jackson Laboratory). Los ratones se pesaron y se distribuyeron con igualdad en relación con el peso corporal en grupos de ocho. Durante un estudio de cuatro semanas, cada grupo recibió una inyección intraperitoneal semanal de los siguientes: ActRIIB-Fc (60 mg/kg, 3 mg/kg, o 60 \mug/kg), anticuerpo anti-GDF-8 monoclonal de ratón JA16 (60 mg/kg), o solución reguladora de PBS (vehículo control). JA16 fue elegido debido a que este anticuerpo es específico para GDF-8, y se mostró que inhibe la actividad de regulación reductora del músculo de GDF-8 in vivo, en un estudio separado (U.S. Patent App. Pub. No. 20030138422). Los animales se evaluaron por ganancia en masa corporal magra, sometiéndolos a un análisis de dexa-scan antes y después del periodo de tratamiento. La masa muscular se evalúo mediante la disección y el peso de los gemelos y cuadriceps. La almohadilla grasa peri-uterina también se retiró y se pesó. Los pesos del bazo y el timo también se
midieron.
Los resultados de este estudio indicaron que ActRIIB-Fc inhibió significantemente la actividad de GDF-8 in vivo lo que da lugar al aumento de la masa muscular. Como se preveía, los ratones administrados con JA16 mostraron pesos del músculo esquelético y corporales ligeramente más altos y tuvieron un aumento estadísticamente significante (p=0.05) en pesos de los cuadríceps (Tabla 4). Los tratamientos con 60 y 3 mg/kg de ActRIIB-Fc fueron sorprendentemente mucho más efectivos en comparación con el anticuerpo JA16. Los grupos administrados con 60 mg/kg de ActRIIB-Fc y 3 mg/kg de ActRIIB-Fc tuvieron aproximadamente 3 y 2 veces de aumentos de pesos corporales respectivamente en comparación con los controles (Tabla 1). Estos aumentos primero se observaron después de una dosis. Los pesos del músculo de cuadriceps, como pesos absolutos, se incrementaron en los ratones administrados con 60 y 3 mg/kg de ActRIIB-Fc - (Tabla 3). Los músculos de gemelos, como pesos absolutos, se incrementaron en ratones administrados con 60 mg/kg de JA16 y 60 o 3 mg/kg de ActRIIB-Fc (Tabla 3). Como un porcentaje de peso corporal, pesos del músculo de cuadriceps se incrementaron en los mismos tres grupos de tratamiento en comparación con los controles (Tabla 4). También, como un porcentaje de peso corporal, los pesos de músculos de gemelos se incrementaron en los ratones tratados con 60 mg/kg de ActRIIB-Fc (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Pesos Corporales Terminales
2 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Ganancia de Peso Absoluto
3
TABLA 3 Pesos (g) de Órgano Absoluto
4 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Pesos del Órgano como Porcentaje de Peso Corporal
5
Ejemplo 9 Efecto Dosis-Dependiente de ActRIIB-Fc en la Masa Muscular
Además para investigar el efecto de ActRIIB-Fc en la masa muscular en ratones adultos, un estudio se realizó con hembras C57B6/SCID de siete-semanas de edad (The Jackson Laboratory). Los ratones se pesaron y con igualdad se distribuyeron en relación con el peso corporal en cuatro grupos de seis (6 SCID, 6 ratones C57, y dos grupos control de 6 ratones cada uno). Cada grupo recibió una inyección intraperitoneal semanal de 60 mg/kg de ActRIIB-Fc o solución reguladora de PBS (vehículo control) por una a cuatro semanas. En el día 29 del estudio, los animales se evaluaron para masa muscular por disección y el peso de los músculos gemelos y cuadriceps. Los resultados de este estudio indicaron que ActRIIB-Fc inhibió significantemente la actividad de GDF-8 in vivo lo que da lugar a un aumento de masa muscular incluso después una única administración de ActRIIB en comparación con el vehículo control. Los pesos del músculo de cuadríceps, como pesos absolutos, se incrementaron en ambos ratones C57 y SCID por 21% a 60% (Tabla 5). Así mismo, la masa muscular de los músculos gemelos, como pesos absolutos, se aumentó por 31 a 51% (Tabla 5).
TABLA 5 Aumento en Masa Muscular Después de Una o Más Dosis de ActRIIB-Fc
7
Ejemplo 10 Papel In vivo de GDF-8 en Hueso Trabecular
La inhibición de GDF-8 aumenta la masa muscular. Incrementa la carga mecánica, ya sea debido al aumento de la actividad muscular o aumento del peso corporal, se asocia con aumento de la masa del hueso y la densidad ósea. Por consiguiente, los ratones transgénicos (KO) GDF-8, se evaluaron para la alteración de la masa del hueso y la microarquitectura: Una evaluación inicial de ratones adultos mostró que la densidad ósea en la espina dorsal de los ratones KO fue casi dos-veces más alta que la de sus compañeros de camada de tipo salvaje. Este aumento superó con creces lo que podría haberse esperado que fuera solamente debido al aumento de masa muscular en los ratones KO GDF-8.
Imágenes microtomográficas de alta resolución (\muCT40, Scanco Medical, Switzerland) se utilizaron para evaluar la fracción y microarquitectura del volumen del hueso trabecular en la 5^{a} vertebral lumbar y distal femoral y geometría del hueso cortical en la diáfisis femoral media de ratones adultos KO y de tipo salvaje (WT) GDF-8. Las muestras se tomaron de KO GDF-8 de 9-10 meses de edad y controles de la misma camada (cuatro ratones de cada genotipo y sexo). El cuerpo vertebral total y fémur se escanearon utilizando tomografía microcomputarizada a una resolución de 12 \mum. Las regiones de interés que abarcan el hueso trabecular del cuerpo vertebral o el hueso trabecular de la metáfisis distal femoral (i.e., espongiosa secundaria) se identificaron utilizando un algoritmo de contorno, semi-automatizado. Los siguientes parámetros se calcularon utilizando evaluaciones de 3D directas: fracción de volumen del hueso (%), espesor trabecular (\mum), separación (\mum) y número (1/mm). Además, la densidad de conectividad, un indicador de que tan bien la red trabecular se conecta, se evalúo, así como los parámetros del hueso cortical en la región diafisaria media en el fémur, incluyendo zona total, zona del hueso, y espesor cortical.
Ambos ratones KO machos y hembras han aumentado dramáticamente la densidad ósea trabecular en el cuerpo vertebral en comparación con los compañeros de camada WT (n=4, +93% y +70%, respectivamente, p<0.0001). Este aumento de densidad ósea trabecular se acompañó por un aumento del 14% en el espesor trabecular (p=0.03), un aumento del 38% en número trabecular (p=0.0002), y una disminución del 10% en separación trabecular (p=0.009). El efecto combinado de estos cambios en arquitectura y densidad dio lugar a un aumento de 3.4- y 1.7-veces en conectividad en machos y hembras KO, respectivamente, en comparación con los de sus compañeros de camada WT (p<0.0001). Además, una medida desigual del nivel de mineralización del hueso trabecular indicó que el contenido mineral promedio de las trabeculas fue el 8% superior en los ratones KO relativos a los controles (p<0.0001). Existe un indicio de que el efecto es mayor en ratones machos que en ratones hembras, pero el tamaño de muestra es muy pequeño para hacer conclusiones definitivas. Las características del hueso trabecular vertebral evaluadas mediante la tomografía microcomputarizada de alta-resolución se muestran en la Tabla 6.
En contraste con las observaciones en la espina dorsal, los ratones KO machos y hembras tuvieron densidad ósea trabecular más pequeña en el fémur distal que los compañeros de camada WT (n=4, p=0:05 para el efecto del fenotipo completo) (Tabla 7). Este decremento en densidad ósea fue más pronunciado en los ratones hembras KO, que en los ratones machos KO. Los ratones GDF-8 KO tuvieron un espesor trabecular similar como sus compañeros de camada WT, pero tuvieron más pocas trabeculas y aumento de la separación trabecular en comparación con los controles de la misma camada. Sin embargo, aunque el espesor cortical en la columna media femoral fue similar en machos GDF-8 KO y sus controles de la misma camada, fue aproximadamente 10% mayor en los ratones hembras GDF-8 KO que en sus compañeros de camada WT (n=4, p=0.04) (ver Tabla 8). No hubo diferencias en la zona cortical del hueso o fracción de la zona del hueso entre los dos genotipos.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Características del Hueso Trabecular Vertebral (Promedio \pm SEM)
8
TABLA 7 Características del Hueso Trabecular en Metafisis Femoral Distal (Promedio \pm SEM)
9 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 8 Características del Hueso Cortical en la Diafisis-Media Femoral (Promedio \pm SEM)
11
Ejemplo 11 Tratamiento de Desórdenes degenerativos del hueso y del músculo
Los inhibidores de GDF-8 tales como, por ejemplo, polipéptidos de fusión de ActRIIB son útiles para los tratamientos dirigidos al aumento de masa muscular, y también para la prevención y el tratamiento de osteoporosis. Además, la inhibición de GDF-8 puede ser útil en otros casos donde un efecto anabólico en el hueso se desea, tales como el aumento de curación del hueso (i.e., reparación de fracturas, fusión de la espina dorsal, etc.). Los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos en este documento se utilizan para tratar un sujeto en el inicio de la enfermedad o que tienen una enfermedad degenerativa ósea o muscular establecida.
La eficacia de ActRIIB-Fc para el tratamiento de trastornos óseos, por ejemplo, osteoporosis, se confirma utilizando modelos bien establecidos de osteoporosis. Por ejemplo, han sido utilizados ratones ovariectomizados para probar la eficacia de nuevo tratamiento con fármacos para la osteoporosis (Alexander et al. (2001) J. Bone Miri. Res. 16:1665-1673; and Anderson et al. (2001) J. Endocrinol. 170:529-537). Similares a los humanos, estos roedores muestran una rápida pérdida de hueso de la cavidad de la ovariectomía, especialmente en hueso esponjoso. Las evaluaciones finales se basan en la densidad mineral del hueso, marcadores bioquímicos de volumen del hueso en suero y orina, fuerza del hueso, e histología/histomorfometría.
En un estudio, ratones hembras normales y/o inmunes comprometidos se someten a ovariectomía a las 12-16 semanas de edad y permitido que pierdan hueso por cuatro a seis semanas. Después de este periodo de pérdida de hueso, el tratamiento con ActRIIB-Fc (inyección IP) o vehículo se lleva a cabo por uno a seis meses. El protocolo del tratamiento puede variar, con las pruebas de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, inyecciones diarias, semanales, o bi-semanales). Se prevé que los ratones ovariectomizados (o ratas) sin tratar, deberían perder aproximadamente 10-30% de densidad ósea relativa a los intactos (i.e., no-ovariectomizados), ratones correspondientes en edad. Se prevé que los ratones tratados con ActRIIB-Fc tendrían 10 a 50% más de masa del hueso y densidad ósea que aquellos ratones que reciben el tratamiento con vehículo, y adicionalmente que este aumento en densidad ósea sería asociado con el aumento de fuerza del hueso, particularmente en regiones con una proporción mayor de hueso esponjoso en comparación con el hueso cortical.
El objetivo de otro estudio es demostrar que ActRIIB-Fc es efectivo en la prevención de la disminución de la masa del hueso, microarquitectura y fuerza asociada con la deficiencia del estrógeno. Por lo tanto, el estudio tiene un diseño similar a los descritos anteriormente, excepto que el tratamiento con anticuerpos de ActRIIB-Fc se inició inmediatamente después de la ovariectomía, en lugar de después del periodo de pérdida de hueso. Se prevé que los ratones tratados con ActRIIB-Fc deberían perder significantemente menos masa del hueso después de la ovariectomía que los ratones tratados con el vehículo.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB también se utilizan para prevenir y/o para reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se prevé que los polipéptidos de fusión de ActRIIB serían administrados como una inyección subcutánea con tanta frecuencia como una vez por día y con tan poca frecuencia como una vez al mes. La duración del tratamiento podría oscilar entre un mes y varios años.
Para probar la eficacia clínica de ActRIIB-Fc en humanos, mujeres postmenopaúsicas con baja masa ósea se identificaron mediante la prueba de densidad ósea y se asignaron al azar en un grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluyen un grupo de placebo y uno a tres grupos que recibieron el anticuerpo (diferentes dosis). Los individuos se siguieron prospectivamente por uno a tres años para evaluar cambios en los marcadores bioquímicos de volumen óseo, cambios en la densidad mineral del hueso, y la ocurrencia de fracturas por fragilidad. Se prevé que los individuos que reciben tratamiento deberían mostrar un aumento en la densidad mineral del hueso en el fémur proximal y la espina dorsal lumbar de 2-30% respecto al valor basal, y habría una menor incidencia de fracturas por fragilidad. Se prevé que los marcadores bioquímicos de formación de hueso aumentarían.
Los polipéptidos se administran como el compuesto activo solo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administra como el compuesto activo solo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosificación es preferiblemente de aproximadamente 1 \mug/kg y 20 mg/kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y la progresión de la enfermedad. La dosis efectiva apropiada se selecciona por el médico tratante a partir de los siguientes rangos: 1 \mug/kg a 20 mg/kg, 1 \mug/kg a 10 mg/kg, 1 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 100 \mug/kg, 100 \mug a 1 mg/kg, y 500 \mug/kg a 1 mg/kg. Los regímenes de tratamiento ejemplares y los resultados se resumen en la Tabla 9. Los regímenes alternativos incluyen: (1) 1 x IC_{50}, o 40 \mug/kg dosis inicial y 0.5 x IC_{50}, o 20 \mug/kg, 2 semanas más tarde; (2) 10 x IC_{50} dosis inicial y 5 x IC_{50} 2 semanas más tarde, o 100 x IC_{50} y 50 x IC_{50} 2 semanas después.
TABLA 9 Ejemplos de Casos Clínicos
12
Ejemplo 12 Tratamiento de Desórdenes Metabólicos
Los inhibidores de GDF-8, tales como, por ejemplo, polipéptidos de fusión de ActRIIB, son útiles para el tratamiento de trastornos metabólicos tales como diabetes tipo II, tolerancia a la glucosa deteriorada, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma (por ejemplo, quemaduras o desequilibrio de nitrógeno), y trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad). Los anticuerpos de los polipéptidos de fusión de ActRIIB se pueden utilizar para tratar un sujeto en el inicio de la enfermedad o que tiene una enfermedad metabólica establecida.
La eficacia de los polipéptidos de fusión de ActRIIB para el tratamiento de trastornos metabólicos, por ejemplo, diabetes tipo II y/o obesidad, se confirma utilizando modelos murino de obesidad bien establecidos, resistencia a la insulina y diabetes tipo II, incluyendo ob/ob, db/db, y cepas que llevan la mutación de color amarillo letal. La resistencia a la insulina también puede ser inducida por alimentación de grasa alta o calórica alta de ciertas cepas de ratones, incluyendo C57BL/6J. De manera similar a los humanos, estos roedores desarrollan resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, dislipidemia, y deterioro de la homeostasis de glucosa lo que da lugar a la hiperglicemia. Las evaluaciones de los resultados se basan en mediciones en suero de glucosa, insulina y lípidos. Las mediciones de sensibilidad a la insulina mejorada se pueden determinar por pruebas de tolerancia a la insulina y pruebas de tolerancia a la glucosa. Técnicas más sensibles incluirían el uso de pinzamiento euglucémico-hiperinsulinémico para evaluar las mejoras es el control glicémico y la sensibilidad a la glicemia. Además, las técnicas de pinzamiento permitirían una evaluación cuantitativa del papel principal de los tejidos que disponen de la glucosa (músculo, tejido adiposo, y el hígado) en control glicémico mejorado.
En un estudio, el tratamiento con un polipéptido de fusión ActRIIB tal como se presenta en la SEQ ID NO:3 (inyección IP) o vehículo se lleva a cabo por una semana a seis meses. El protocolo de tratamiento podría variar, con la prueba de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, inyecciones diarias, semanales, o bi-semanales). Se prevé que los ratones tratados con el polipéptido de fusión tendrían mayor absorción de glucosa, aumento de la glucólisis y síntesis del glucógeno, ácidos grasos libres inferiores y triglicéridos en el suero en comparación con ratones que reciben tratamiento con placebo.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB también se utilizan para prevenir y/o para reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se prevé que los polipéptidos de fusión de ActRIIB serían administrados como una inyección subcutánea tan frecuentemente como una vez por día y tan poco frecuente como una vez por mes. La duración del tratamiento podría oscilar entre un mes y varios años.
Para probar la eficacia clínica de los polipéptidos de fusión de ActRIIB en humanos, sujetos que padecen de o en riesgo de diabetes tipo II se identificaron y se asignaron al azar a un grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluyen un grupo de placebo y uno a tres grupos que reciben los polipéptidos de fusión de ActRIIB (dosis diferentes). Los individuos se siguieron prospectivamente por un mes a tres años para evaluar los cambios en el metabolismo de la glucosa. Se prevé que los individuos que reciben tratamiento deberían mostrar una mejora.
Los polipéptidos de fusión de ActRIIB se administran como el compuesto activo solo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administra como el compuesto activo solo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosificación puede ser de aproximadamente 1 \mug/kg a 20 mg/kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y la progresión de la enfermedad. La dosis efectiva apropiada se selecciona por el médico tratante a partir de los siguientes rangos: 1 \mug/kg a 20 mg/kg, 1 \mug/kg a 10 mg/kg, 1 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 100 \mug/kg, 100 \mug a 1 mg/kg, y 500 \mug/kg a 1 mg/kg. Los regímenes de tratamiento ejemplares y resultados se resumen en la Tabla 7.
TABLA 7 Ejemplos de Casos Clínicos
14 
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. 
\vskip1.000000\baselineskip
Documentos de patentes citadas en la descripción
\bullet US 5885794 A [0004]
\bullet WO 0043781 A [0005]
\bullet WO 0210214 A [0009]
\bullet US 5624821 A [0056]
\bullet US 5648260 A [0056]
\bullet US 4640835 A [0060]
\bullet US 4496689 A [0060]
\bullet US 4301144 A [0060]
\bullet US 4670417 A [0060]
\bullet US 4791192 A [0060]
\bullet US 4179337 A [0060]
\bullet US 4766106 A [0060]
\bullet US 4495285 A [0060]
\bullet US 4609546 A [0060]
\bullet WO 8705330 A [0061]
\bullet US 6030613 A [0094]
\bullet US 4522811 A [0095]
\bullet US 20030138422 A [0116]
\vskip1.000000\baselineskip
Literatura no-patente citada en la descripción
\bulletKingsley et al. Genes Dev., 1994, vol. 8, 133-146 [0002] [0036]
\bulletHoodless et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol., vol. 228, 235-272 [0002]
\bulletGamer et al. Dev. Biol., 1999, vol. 208, 222-232, http://www.ronmyrick.com [0002]
\bulletNakashima et al. Mech. Dev., 1999, vol. 80, 185-189 [0002] [0036]
\bulletMassague. Nature Rev. Mol. Cell Biol., 2000, vol. 1, 16-178 [0003]
\bulletMoustakas et al. J. Cell Sci., 2001, vol. 114, 4359-4369 [0003]
\bulletAttisano et al. Mol. Cell. Biol., 1996, vol. 16, 1066-1073 [0004]
\bulletMcPherron et al. Nature, 1997, vol. 387, 83-90 [0005]
\bulletHamrick et al. Bone, 2000, vol. 27 (3), 343-349 [0005]
\bulletAshmore et al. Growth, 1974, vol. 38, 501-507 [0005]
\bulletSwatland et al. J. Anim. Sci., 1994, vol. 38, 752-757 [0005]
\bulletMcPherron et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, vol. 94, 12457-12461 [0005] [0037] [0100]
\bulletKambadur et al. Genome Res., 1997, vol. 7, 910-915 [0005]
\bulletGonzalez-Cadavid et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, vol. 95, 14938-14943 [0005]
\bulletKim et al. BBRC, 2001, vol. 281, 902-906 [0005]
\bulletHoodless et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol., 1998, vol. 228, 235-72 [0036]
\bulletGamer et al. Dev. Biol., 1999, vol. 208, 222-232 [0036]
\bulletAltschul et al. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 25, 3389-3402 [0043]
\bullet Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc, 1995 [0044]
\bulletChurch et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1984, vol. 81, 1991-1995 [0044]
\bulletAltschul et al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0051]
\bulletNeedleman et al. J. Mol. Biol, 1970, vol. 48, 444-453 [0051]
\bulletMeyers et al. Comput. Appl. Biosci., 1988, vol. 4, 11-17 [0051]
\bulletLund et al. J. Immun., 1991, vol. 147, 2657-2662 [0056]
\bulletMorgan et al. Immunology, 1995, vol. 86, 319-324 [0056]
\bulletAngal et al. Mol. Immunol., 1993, vol. 30, 105-108 [0056]
\bulletAplin et al. Crit. Rev. Biochem., 1981, vol. 22, 259-306 [0061]
\bulletHakimuddin et al. Arch. Biochem. Biophys., 1987, vol. 259, 52 [0061]
\bulletEdge et al. Anal. Biochem., 1981, vol. 118, 131 [0061]
\bulletThotakura et al. Meth. Enzymol., 1987, vol. 138, 350 [0061]
\bullet Gene Expression Systems. Academic Press, 1999 [0069] [0097]
\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0070]
\bullet Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1992 [0070]
\bulletThies et al. Growth Factors, 2001, vol. 18, 251-259 [0076]
\bulletKaufman et al. Nucleic Acids Res., 1991, vol. 19, 4485-4490 [0106]
\bulletGossen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, vol. 89, 5547-5551 [0106] [0107]
\bulletUrlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1980, vol. 77, 4216-4220 [0107]
\bulletDenner et al. EMBO J., 1998, vol. 17, 3091-3100 [0112]
\bullet Protein Pharmacokinetics and Metabolism. Plenum Press, 1992 [0115]
\bulletAlexander et al. J. Bone Miri. Res., 2001, vol. 16, 1665-1673 [0124]
\bulletAnderson et al. J. Endocrinol., 2001, vol. 170, 529-537 [0124]
<110> Wyeth
\hskip1cm Wolfman, Neil
\hskip1cm Bouxsein, Mary
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptidos de Fusión de ActRIIB y Uses Therefor
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 8702.093-304
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
15
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
21
22 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Wyeth
\hskip1cm Wolfman, Neil
\hskip1cm Bouxsein, Mary
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptidos de Fusión de ActRIIB y Usos De estos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 8702.093-304
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
27
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
30
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
33
34
35 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
36 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm38

Claims (23)

1. Uso de un polipéptido de fusión del receptor de Activina tipo IIB (ActRIIB) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno degenerativo óseo en un mamífero, en donde el polipéptido de fusión ActRIIB comprende (a) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a los aminoácidos 23 a 138 de la SEQ ID NO:3 y es capaz de unirse a un factor-8 de crecimiento y de diferenciación (GDF-8) y (b) la región constante de un anticuerpo IgG, IgA, IgE, o IgM.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el mamífero es humano.
3. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento es para ser administrado a un mamífero con necesidad del tratamiento o prevención de un trastorno seleccionado de al menos uno de osteoartritis y osteoporosis.
4. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de fusión ActRIIB es para ser administrado en la cantidad efectiva seleccionada de 1 \mug/kg a 20 mg/kg, 1 \mug/kg a 10 mg/kg, 1 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 100 \mug/kg, 100 \mug a 1 mg/kg, y 500 \mug/kg a 1 mg/kg.
5. El uso de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de fusión ActRIIB comprende los aminoácidos 23 a 138 de la SEQ ID NO:3.
6. El uso de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de fusión ActRIIB comprende los aminoácidos 19 a 134 de la SEQ ID NO:1.
7. El uso de la reivindicación 1, en donde la segunda secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de fusión ActRIIB comprende una secuencia seleccionada de (a) el fragmento Fc de IgG, (b) el fragmento Fc de IgG1, (c) el fragmento Fc de IgG4, y (d) los aminoácidos 148 a 378 de la SEQ ID NO:3.
8. El uso de la reivindicación 1, en donde la secuencia del polipéptido de fusión ActRIIB se define en SEQ ID NO:3.
9. El uso de la reivindicación 1, en donde la vida media en circulación del polipéptido de fusión ActRIIB excede 5 días.
10. El uso de la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión se codifica por un ácido nucleico que hibridiza a la secuencia de SEQ ID NO:4 bajo condiciones estrictas de hibridación, y en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que es capaz de unirse a GDF-8.
11. Una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.
12. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 11.
13. El ácido nucleico de la reivindicación 12, en donde dicho ácido nucleico se define en SEQ ID NO:4.
14. Un vector de expresión, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12.
15. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 14.
16. Un método para identificar los inhibidores de GDF 8, que comprende:
(a) la preparación de una primera mezcla de enlace que comprende el polipéptido de fusión ActRIIB de la reivindicación 11 y GDF 8;
(b) la medición de la cantidad de enlace entre el polipéptido de fusión ActRIIB y GDF 8 en la primera mezcla;
(c) la preparación de una segunda mezcla de enlace que comprende el polipéptido de fusión ActRIIB, GDF 8 y un compuesto de prueba;
y
(d) la medición de la cantidad de enlace entre el polipéptido de fusión ActRIIB y GDF 8 en la segunda mezcla.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Uso de un polipéptido de fusión ActRIIB en la fabricación de un medicamento para aumentar la densidad ósea trabecular, en donde el polipéptido de fusión ActRIIB comprende (a) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a los aminoácidos 23 a 138 de la SEQ ID NO:3 y es capaz de unirse al factor-8 de crecimiento y de diferenciación (GDF-8) y (b) la región constante de un anticuerpo IgG, IgA, IgE, o IgM.
18. El uso de la reivindicación 17, en donde el polipéptido de fusión ActRIIB es para ser administrado al mamífero en una dosis efectiva de 1 \mug/kg a 20 mg/kg, 1 \mug/kg a 10 mg/kg, 1 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 1 mg/kg, 10 \mug/kg a 100 \mug/kg, 100 \mug a 1 mg/kg, o 500 \mug/kg a 1 mg/kg.
19. El uso de la reivindicación 17, en donde la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión ActRIIB comprende los aminoácidos 23 a 138 de SEQ ID NO:3.
20. El uso de la reivindicación 17, en donde la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión ActRIIB comprende los aminoácidos 19 a 134 de SEQ ID NO:1.
21. El uso de la reivindicación 17, en donde la segunda secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión ActRIIB comprende (a) el fragmento Fc de IgG, (b) el fragmento Fc de IgG1, (c) el fragmento Fc de IgG4, o (d) aminoácidos 148 a 378 de SEQ ID NO:3.
22. El uso de la reivindicación 17, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión ActRIIB (a) se presenta en la SEQ ID NO:3 o (b) se codifica por un ácido nucleico que hibridiza a la secuencia de SEQ ID NO:4 bajo condiciones estrictas de hibridación, en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que es capaz de unirse a GDF-8.
23. El uso de la reivindicación 17, en donde la vida media en circulación del polipéptido de fusión ActRIIB excede 5 días.
ES03773145T 2002-10-25 2003-10-24 Polipeptidos de fusion actriib y usos de los mismos. Expired - Lifetime ES2337890T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42104102P 2002-10-25 2002-10-25
US421041P 2002-10-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2337890T3 true ES2337890T3 (es) 2010-04-30

Family

ID=32230212

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03773145T Expired - Lifetime ES2337890T3 (es) 2002-10-25 2003-10-24 Polipeptidos de fusion actriib y usos de los mismos.

Country Status (11)

Country Link
US (5) US20040223966A1 (es)
EP (1) EP1572961B1 (es)
JP (2) JP4685452B2 (es)
AT (1) ATE448686T1 (es)
AU (1) AU2003279817A1 (es)
BR (1) BR0315645A (es)
CA (1) CA2501180A1 (es)
DE (1) DE60330181D1 (es)
ES (1) ES2337890T3 (es)
MX (1) MXPA05004224A (es)
WO (1) WO2004039948A2 (es)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200526779A (en) * 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US7320789B2 (en) * 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US7572763B2 (en) * 2002-02-21 2009-08-11 Wyeth Follistatin domain containing proteins
EP1572909A4 (en) * 2002-02-21 2007-06-06 Wyeth Corp PROTEIN CONTAINING A DOMAINE OF FOLLISTATIN
US20030219846A1 (en) * 2002-02-28 2003-11-27 Pfizer Inc. Assay for activity of the ActRIIB kinase
DE60331778D1 (de) * 2002-09-16 2010-04-29 Univ Johns Hopkins Metalloproteaseaktivierung von myostatin und verfahren zur modulation der myostatinaktivität
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
UA85055C2 (ru) 2003-06-02 2008-12-25 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
AU2005219441A1 (en) 2004-03-02 2005-09-15 Acceleron Pharma Inc. ALK7 and myostatin inhibitors and uses thereof
CA2574777C (en) 2004-07-23 2015-09-01 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
AU2012244215B2 (en) * 2004-07-23 2014-11-27 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
AU2015200950B2 (en) * 2004-07-23 2017-04-27 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
BRPI0514253A (pt) * 2004-08-12 2008-06-03 Wyeth Corp terapia de combinação para diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares usando composições contendo inibidores de gdf-8
US7300773B2 (en) 2004-08-27 2007-11-27 Wyeth Research Ireland Limited Production of TNFR-Ig
TWI374935B (en) 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
NZ538097A (en) * 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
JP2008537488A (ja) * 2005-03-23 2008-09-18 ワイス Ｇｄｆ−８モジュレート物質の検出
MX2007011405A (es) * 2005-03-23 2007-10-11 Wyeth Corp Deteccion de una respuesta inmune para agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8).
PT2407486T (pt) 2005-08-19 2018-02-21 Univ Pennsylvania Anticorpos antagonistas contra gdf-8 e utilizações no tratamento de ela e outros distúrbios associados a gdf-8
US8067562B2 (en) * 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
AU2011237541B2 (en) * 2005-11-01 2014-05-15 Amgen Inc. Novel activin receptor and uses thereof
US8128933B2 (en) * 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CN103432568A (zh) 2005-11-23 2013-12-11 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
AU2016250354B2 (en) * 2006-12-18 2019-01-17 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
CA2672758C (en) * 2006-12-18 2019-07-30 Acceleron Pharma Inc. Activin-actrii antagonists and uses for increasing red blood cell levels
AU2013221910B2 (en) * 2006-12-18 2016-11-17 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) * 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
MX2009008222A (es) * 2007-02-01 2009-10-12 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de activina-actriia y usos para tratar o prevenir cancer de mama.
AU2013203266B2 (en) * 2007-02-02 2016-04-28 Acceleron Pharma Inc. Variants derived from ActRIIB and uses therefor
TW202021980A (zh) * 2007-02-02 2020-06-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
KR20200054317A (ko) 2007-02-09 2020-05-19 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ＡｃｔＲⅡＡ 길항제 및 암 환자에서 골 생장을 촉진시키기 위한 이의 용도
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
AR068332A1 (es) 2007-08-03 2009-11-11 Summit Corp Plc Combinaciones de drogas para el tratamiento de la distrofia muscular de duchenne
CN103877564A (zh) 2007-09-18 2014-06-25 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
CA2729054C (en) * 2008-06-26 2019-09-03 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
EP2315602A4 (en) * 2008-06-26 2011-11-02 Acceleron Pharma Inc METHOD OF DOSING AN ACTRIIB ANTAGONIST AND MONITORING TREATED PATIENTS
US20100061976A1 (en) * 2008-07-24 2010-03-11 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Method for treating or preventing osteoporosis by reducing follicle stimulating hormone to cyclic physiological levels in a mammalian subject
TW201919685A (zh) 2008-08-14 2019-06-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 使用ｇｄｆ阱以增加紅血球水平
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
BRPI0920962A2 (pt) 2008-11-26 2016-07-12 Amgen Inc variantes de polipeptídeos receptores de activina iib e usos dos mesmos
CA2749544A1 (en) * 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
CA2764890A1 (en) * 2009-06-08 2010-12-16 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
AU2010263182B2 (en) 2009-06-12 2016-05-12 Acceleron Pharma Inc. Truncated ActRIIB-Fc fusion proteins
WO2011031901A1 (en) * 2009-09-09 2011-03-17 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof
EP3260130B1 (en) 2009-11-03 2021-03-10 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US20110268736A1 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 Children's Medical Center Corporation Method for treating congenital myopathy
JP2013535981A (ja) 2010-08-20 2013-09-19 ワイス・エルエルシー 成長因子不含適合細胞の細胞培養
WO2012064771A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma, Inc. Actriia binding agents and uses thereof
RU2600067C2 (ru) * 2011-05-06 2016-10-20 Дзе Гавермент Оф Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари Оф Дзе Депармент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин
US20140322758A1 (en) 2011-10-21 2014-10-30 Pfizer Inc. Addition of iron to improve cell culture
EP2793925B1 (en) * 2011-12-19 2019-03-20 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
SA113340642B1 (ar) 2012-06-15 2015-09-15 فايزر إنك أجسام مضادة معارضة محسنة ضد gdf-8 واستخداماتها
PL2880053T3 (pl) 2012-08-01 2021-01-11 Ikaika Therapeutics, Llc Łagodzenie uszkodzenia tkanek i włóknienia przez przeciwciało przeciwko ltbp4
JP6214537B2 (ja) * 2012-08-21 2017-10-25 国立大学法人九州大学 貧血患者の貧血の要因を検出するためのバイオマーカー
KR102279522B1 (ko) 2012-11-02 2021-07-19 셀진 코포레이션 골 및 다른 장애를 치료하기 위한 액티빈-actrii 길항제 및 용도
SG11201505960VA (en) 2013-02-01 2015-08-28 Santa Maria Biotherapeutics Inc Administration of an anti-activin-a compound to a subject
RS61778B1 (sr) 2013-05-06 2021-06-30 Scholar Rock Inc Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta
TN2016000553A1 (en) 2014-06-13 2018-04-04 Acceleron Pharma Inc Methods and compositions for treating ulcers
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
RS64214B1 (sr) 2014-12-03 2023-06-30 Celgene Corp Antagonisti aktivin-actrii i njihova primena u lečenju mijelodisplastičnog sindroma
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
BR112017021510A2 (pt) 2015-04-06 2018-07-03 Acceleron Pharma Inc heteromultímeros do receptor tipo i e tipo ii da superfamília tgf-beta e sua utilização
MA53883A (fr) 2015-04-06 2021-08-18 Acceleron Pharma Inc Protéines de fusion de récepteur type i et type ii à bras unique et leurs utilisations
KR20180006386A (ko) 2015-04-22 2018-01-17 얼라이브젠 유에스에이 인코포레이티드 신규한 근육 소모 질환 치료용 하이브리드 ａｃｔｒｉｉｂ 리간드 트랩 단백질
EP3522913A4 (en) 2016-10-05 2020-10-28 Acceleron Pharma Inc. ALK4: ACTRIIB HETEROMULTIMERS AND USES THEREOF
CN110461349A (zh) 2016-11-10 2019-11-15 科乐斯疗法公司 激活素受体iia型变体及其使用方法
GB201620119D0 (en) * 2016-11-29 2017-01-11 Pharmafox Therapeutics Ag Compounds
KR20200085832A (ko) 2017-11-09 2020-07-15 케로스 테라퓨틱스, 인크. 액티빈 수용체 유형 iia 변이체 및 그의 사용 방법
AU2019206634B2 (en) 2018-01-12 2024-06-27 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIB variants and methods of use thereof
AU2019406214A1 (en) 2018-12-21 2021-08-05 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
US20220062299A1 (en) 2018-12-26 2022-03-03 Northwestern University Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
JP2807287B2 (ja) * 1989-10-13 1998-10-08 株式会社医学生物学研究所 ペプチドおよびその用途
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
EP1400536A1 (en) * 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5573924A (en) * 1992-09-08 1996-11-12 Immunex Corporation CD27 ligand
US20030074680A1 (en) * 1993-03-19 2003-04-17 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US5994618A (en) * 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
US6607884B1 (en) * 1993-03-19 2003-08-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-8
US6673534B1 (en) * 1995-10-26 2004-01-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods for detection of mutations in myostatin variants
CA2157577C (en) * 1993-03-19 2009-11-17 Se-Jin Lee Growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6465239B1 (en) * 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
EP1378572B1 (en) * 1993-05-12 2006-10-25 Genetics Institute, LLC Bmp-11 compositions
US5831050A (en) * 1993-06-07 1998-11-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor
DE69434739T2 (de) * 1993-08-26 2007-05-10 Genetics Institute, LLC, Cambridge Menschliche Knochen-morphogenetische Proteine zur Verwendung bei neuronaler Rehgeneration
US7332575B2 (en) * 1994-03-18 2008-02-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species
US5914234A (en) * 1994-07-08 1999-06-22 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-11
US5545616A (en) * 1994-09-22 1996-08-13 Genentech, Inc. Method for predicting and/or preventing preterm labor
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6121415A (en) * 1997-07-09 2000-09-19 Genentech, Inc. ErbB4 receptor-specific neuregolin related ligands and uses therefor
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) * 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6369201B1 (en) * 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers
US6004937A (en) * 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]
WO1999056768A1 (en) * 1998-05-06 1999-11-11 Metamorphix, Inc. Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8
US6472179B2 (en) * 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US7037501B2 (en) * 2001-01-04 2006-05-02 Regents Of The University Of Minnesota Myostatin immnoconjugate
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
TW200526779A (en) * 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US7320789B2 (en) * 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US7572763B2 (en) * 2002-02-21 2009-08-11 Wyeth Follistatin domain containing proteins
EP1572909A4 (en) * 2002-02-21 2007-06-06 Wyeth Corp PROTEIN CONTAINING A DOMAINE OF FOLLISTATIN
DE60331778D1 (de) * 2002-09-16 2010-04-29 Univ Johns Hopkins Metalloproteaseaktivierung von myostatin und verfahren zur modulation der myostatinaktivität
AR047392A1 (es) * 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
KR101304718B1 (ko) * 2002-12-20 2013-09-05 암겐 인코포레이티드 미오스타틴을 저해하는 결합제
WO2005028517A2 (en) * 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
UA85055C2 (ru) * 2003-06-02 2008-12-25 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
US20050157125A1 (en) * 2004-01-21 2005-07-21 Silverbrook Research Pty Ltd Inkjet printer cartridge with integral shield
MX2007011405A (es) * 2005-03-23 2007-10-11 Wyeth Corp Deteccion de una respuesta inmune para agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8).
JP2008537488A (ja) * 2005-03-23 2008-09-18 ワイス Ｇｄｆ−８モジュレート物質の検出

Also Published As

Publication number Publication date
US20080089897A1 (en) 2008-04-17
BR0315645A (pt) 2005-08-30
JP2006516886A (ja) 2006-07-13
US20110250198A1 (en) 2011-10-13
EP1572961A4 (en) 2007-05-23
ATE448686T1 (de) 2009-12-15
US20090087433A1 (en) 2009-04-02
US20040223966A1 (en) 2004-11-11
WO2004039948A3 (en) 2006-07-27
JP2010138179A (ja) 2010-06-24
JP4685452B2 (ja) 2011-05-18
EP1572961A2 (en) 2005-09-14
WO2004039948A2 (en) 2004-05-13
MXPA05004224A (es) 2005-09-20
CA2501180A1 (en) 2004-05-13
AU2003279817A1 (en) 2004-05-25
DE60330181D1 (de) 2009-12-31
US20090087375A1 (en) 2009-04-02
EP1572961B1 (en) 2009-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2337890T3 (es) Polipeptidos de fusion actriib y usos de los mismos.
JP2020158546A (ja) 筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するａｃｔｒｉｉｂタンパク質およびその改変体およびその使用
ES2649983T3 (es) Antagonistas de activina-ActRIIa en su uso para promover el crecimiento óseo
ES2340662T3 (es) Factor de crecimiento de fibroblastos (fgf23) nuevo procedimiento para el uso.
ES2284828T3 (es) Propeptidos de gdf modificados y estabilizados y usos de los mismos.
JP2021036916A (ja) Ｂｍｐ−ａｌｋ３アンタゴニストおよび骨成長促進のためのその使用
ES2561048T3 (es) Polipéptidos del receptor ActRII
JP2021143207A (ja) 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
US7465706B2 (en) GDF3 propeptides and related methods
EA025891B1 (ru) ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
BRPI0807506B1 (pt) Uso de uma proteína de fusão actriia-fc para a fabricação de um medicamento para tratar ou previnir mieloma múltiplo
KR20150111347A (ko) 듀켄씨 근이영양증의 치료에서의 폴리스타틴
US20170014476A1 (en) SorCS1 for the Treatment of Obesity