EA025891B1 - ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA025891B1
EA025891B1 EA201300713A EA201300713A EA025891B1 EA 025891 B1 EA025891 B1 EA 025891B1 EA 201300713 A EA201300713 A EA 201300713A EA 201300713 A EA201300713 A EA 201300713A EA 025891 B1 EA025891 B1 EA 025891B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
mice
polypeptide
sequence
muscle
Prior art date
Application number
EA201300713A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300713A1 (ru
Inventor
Джон Нопф
Равиндра Кумар
Джасбир Сихра
Original Assignee
Акселерон Фарма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акселерон Фарма Инк. filed Critical Акселерон Фарма Инк.
Publication of EA201300713A1 publication Critical patent/EA201300713A1/ru
Publication of EA025891B1 publication Critical patent/EA025891B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Abstract

В некоторых своих аспектах изобретение относится к композициям и к способам, применяемым для модуляции (стимуляции или ингибирования) роста ткани, такой как костная ткань, хрящевая ткань, мышечная ткань, жировая ткань и/или нервная ткань. Изобретение также относится к способам скрининга соединений, модулирующих активность белка ActRIIB и/или лиганда ActRIIB. Описанные здесь композиции и способы могут быть применены для лечения заболеваний, ассоциированных с аномальной активностью белка ActRIIB и/или лиганда ActRIIB.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки рег. № 60/899304, поданной 2 февраля 2007 г., предварительной заявки рег. № 60/927088, поданной 1 мая 2007 г., и предварительной заявки рег. № 60/931880, поданной 25 мая 2007 г. Все описания вышеуказанных заявок вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
Суперсемейство трансформирующего фактора роста-бета (ТСР-бета) содержит ряд факторов роста, которые имеют общие элементы и структурные мотивы последовательностей. Известно, что эти белки оказывают биологическое действие на клетки широкого ряда позвоночных и беспозвоночных различных типов. Члены этого суперсемейства белков играют важную роль в образовании структуры и формировании ткани в процессе эмбрионального развития и могут оказывать влияние на различные процессы дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кардиогенез, гемопоэз, нейрогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. Это семейство подразделяется на две основных ветви: ΒΜΡ/ΟΌΡ и ТСР-бета/активин/ВМР10, члены которых обладают различными, а часто дополнительными функциями. При изменении активности члена семейства ТСР-бета в организме часто могут происходить значительные физиологические изменения. Так, например, у крупного рогатого скота пьемонтской породы и породы бельгийская голубая имеется мутация в гене СЭР8 (также называемом миостатином), приводящая к потере его функции, что вызывает значительное увеличение мышечной массы (СтоЬс! с1 а1., ΝαΙ СспсЕ 1997, 17(1):71-4). Кроме того, у человека неактивные аллели СЭР8 ассоциируются с увеличением мышечной массы и, как сообщалось, с исключительно высокой мышечной силой (§сйис1кс е1 а1., Ν. Епд1. 1. Мсб. 2004, 350:2682-8).
Изменения в мышцах, костях, хрящах и в других тканях могут быть достигнуты путем активации или подавления передачи сигнала, опосредуемого соответствующим членом семейства ТСР-бета. А поэтому в настоящее время необходимо разработать средства, которые будут служить сильными регуляторами передачи сигнала ТСР-бета.
Описание сущности изобретения
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам АсЕКПВ, в частности, к вариантам АсЕКЛВ, включая амино- и карбоксиконцевые усечения и альтерации последовательностей. Такие полипептиды АсЕКЛВ могут быть использованы для лечения различных расстройств или состояний, в частности мышечных и нейромышечных расстройств (например, мышечной дистрофии, амиотрофического бокового склероза (АБС) и атрофии мышц); расстройств, ассоциированных с отложением жира в ткани (например, ожирения); метаболических расстройств (например, диабета типа 2); нейродегенеративных расстройств и гипотрофии мышц, ассоциированной со старением (саркопении); рака предстательной железы и кахексии при раке. В конкретных вариантах изобретения полипептиды АсЕКЛВ (например, растворимые полипептиды АсЕКПВ) могут служить антагонистами рецептора АсЕКПВ в любом процессе, ассоциированном с активностью АсЕКПВ. Могут быть сконструированы, но необязательно, полипептиды АсЕКЛВ согласно изобретению, которые будут преимущественно антагонистами одного или нескольких лигандов рецепторов АсЕКЛВ, таких как СЭР8 (также называемый миостатином), СЭР11, активин А, активин В, активин АВ, Νοάαΐ и ВМР7 (также называемый ОР-1), а поэтому могут быть использованы для лечения других расстройств. Примерами полипептидов АсЖИВ являются природные полипептиды АсЕКЛВ, а также их функциональные варианты. Настоящее изобретение также относится к ряду вариантов, происходящих от АсЕКЛВ, которые вызывают значительное снижение аффинности к активину, но при этом сохраняют способность связываться с СЭР11. Такие варианты оказывают желаемое воздействие на мышцы, но оказывают более слабое воздействие на другие ткани.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, включающим растворимый полипептид АсЕКЛВ, который связывается с лигандом АсЕКИВ, таким как СЭР8, СЭР11, активин, ВМР7 или Νοάαΐ. и фармацевтически приемлемый носитель. Растворимый полипептид АсЕКЛВ связывается, но необязательно, с лигандом АсЕКПВ с Кб, составляющим менее чем 10 мкМ или менее чем 1 мкМ, 100, 10 или 1 нМ. Растворимый полипептид АсЕКПВ ингибирует, но необязательно, передачу сигнала АсЖИВ, такую как передача внутриклеточного сигнала, запускаемая лигандом АсЕКЛВ. Растворимый полипептид АсЕКЛВ, который может быть использован в таком препарате, может представлять собой любой из полипептидов, описанных в настоящей заявке, такой как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕС ГО №№: 1, 2, 5, 6 и 12, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕС ГО №№: 1, 2, 5, 6 и 12. Растворимый полипептид Ас1К11В может включать функциональный фрагмент природного полипептида Ас1КПВ, например фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 20 или 30 аминокислот последовательности, выбранной из 8ЕС ГО №№: 1, 2, 5, 6 и 12 или последовательности 8ЕС ГО N0:1, в которой отсутствуют 1, 2, 3, 4, 5 или 10-15 С-концевых аминокислот и 1, 2, 3, 4 или 5 Ν-концевых аминокислот. Предпочтительный полипептид в отличие от 8ЕС ГО N0:1 может иметь усечение в 2-5 аминокислот у Ν-конца и не более чем в 3 аминокислоты у С-конца. Другим предпочтительным полипептидом является полипептид, представленный в 8ЕС ГО N0:12. Растворимый полипептид Ас1К11В в отличие от природного полипептида Ас1К11В может
- 1 025891 включать одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности (например, в лигандсвязывающем домене). Модификация в аминокислотной последовательности в отличие от природного полипептида АсЖПВ может вызывать, например, изменение характера гликозилирования полипептида, продуцируемого у млекопитающих, насекомых или в других эукариотических клетках, или изменение уровня протеолитического расщепления полипептида. Растворимым полипептидом АеЖИВ может быть слитый белок, который в качестве одного домена имеет полипептид АеЖИВ (например, лигандсвязывающий домен АсЖПВ или его вариант) и один или несколько дополнительных доменов, которые сообщают нужные свойства, такие как улучшенные фармакокинетические свойства, способность к более легкой очистке, способность к нацеливанию на конкретные ткани и т. п. Так, например, домен слитого белка может усиливать одно или несколько свойств, таких как ίη νίνο стабильность, время полужизни ίη νίνο, способность к поглощению/внедрению, локализация или распределение в ткани, образование белковых комплексов, мультимеризация слитого белка и/или очистка. Растворимый слитый белок АсίΚΙΙΒ может включать Рс-домен иммуноглобулина (дикого типа или мутантный) или сывороточный альбумин. В некоторых вариантах изобретения гибрид АсЖЛВ-Рс включает относительно неструктурированный линкер, расположенный между Рс-доменом и внеклеточным доменом АсЖПВ. Этот неструктурированный линкер может соответствовать неструктурированной области, состоящей приблизительно из 15 аминокислот и находящейся у С-конца внеклеточного домена АсЖПВ (хвоста), либо он может представлять собой искусственную последовательность, состоящую из 5-15, 20, 30, 50 или более аминокислот и в основном не содержащую вторичной структуры. Линкер может быть обогащен глициновыми и пролиновыми остатками и может, например, содержать повторяющиеся последовательности треонина/серина и глицинов (например, повторы ТО4 или δθ4). Слитый белок может включать подпоследовательность для очистки, такую как эпитопная метка, метка РЬАС, полигистидиновая последовательность и С8Т-гибрид. Растворимый полипептид АсЖПВ включает, но необязательно, один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из гликозилированной аминокислоты, ПЭГ илированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной молекулой, и аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизирующим агентом. Фармацевтический препарат может также включать одно или несколько дополнительных соединений, таких как соединение, которое может быть использовано для лечения АсЖЛВ-ассоциированного расстройства. Предпочтительно фармацевтический препарат является, по существу, апирогенным. Вообще говоря, предпочтительно, чтобы белок АсЕКЛВ экспрессировался в клеточной линии млекопитающих, которая опосредует соответствующее природное гликозилирование белка АсЖПВ, что позволило бы снизить вероятность возникновения нежелательного иммунного ответа у пациента. В настоящее время с успехом используются человеческие клеточные линии и клеточные линии СНО, но при этом предполагается, что могут быть использованы и другие стандартные экспрессионные векторы млекопитающих.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам в упаковках, содержащих описанный здесь фармацевтический препарат и этикетку, в которой указывается на возможность применения этого препарата для стимуляции роста ткани либо снижения или предотвращения потери ткани у человека. Репрезентативными тканями являются ткани костей, хряща, мышц, жировые ткани и нервные ткани.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к растворимым полипептидам АсЖИВ, содержащим модифицированный лигандсвязывающий (например, ОЭР8-связывающий) домен. Такие модифицированные лигандсвязывающие домены рецептора АсЕКЛВ имеют одну или несколько мутаций в аминокислотных остатках, таких как Е37, Е39, К.40, К55, К56, Υ60, А64, К74, \У78. Ь79, Ό80, Р82 и Р101 человеческого АсЖПВ (нумерация сделана по отношению к 8ΕΟ ΕΌ N0:2). Модифицированный лигандсвязывающий домен в отличие от лигандсвязывающего домена рецептора АсЖПВ дикого типа может иметь, но необязательно, повышенную селективность по отношению к лиганду, такому как ΟΌΡ8/ΟΌΡ11. Для иллюстрации мутациями, представленными в настоящей заявке, являются мутации Κ74Υ, К74Р, Κ74Ι и Ό80Ι, повышающие селективность модифицированного лигандсвязывающего домена к СЭР11 (а следовательно, предположительно, к ΟΌΡ8), но не к активину (данные приводятся для АсЖНВ). Нижеследующие мутации, а именно Э54А, К55А, Ь79А и Р82А, дают обратный эффект, то есть приводят к увеличению отношения связывания активина по отношению к ΟΌΡ11. Общая активность связывания (с ΟΌΡ11 и активином) может быть повышена путем включения области хвоста или предположительно неструктурированной линкерной области, а также путем введения мутации К74А. Другими мутациями, которые приводят к общему снижению аффинности связывания с лигандом, являются К40А, Е37А, К56А, №78А, О80К, Ό80Κ, Э80А, Ό80Ο, Ό80Ρ, Ό80Μ и Ό80Ν. Мутации могут быть объединены для достижения желаемых эффектов. Так, например, многие мутации, которые влияют на отношение связывания ОПР11:активин, в целом, оказывают негативное влияние на связывание с лигандом, а поэтому они могут быть объединены с мутациями, которые в основном повышают уровень связывания с лигандом, что будет приводить к повышению селективности связывания белка с лигандом.
Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение К,| для связывания с активином к К,| для связывания с ΟΌΡ8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз
- 2 025891 превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение Σθ5ο для ингибирования активина к Σθ5ο для ингибирования ΟΌΡ8/ΟΌΡ11, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Указанный модифицированный лигандсвязывающий домен ингибирует, но необязательно, ΟΌΡ8/ΟΌΡ11 с 1С50, которая по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз ниже, чем 1С50 для ингибирования активина. Такими растворимыми полипептидами ΆοίΚΙΙΒ могут быть слитые белки, включающие Ре-домен иммуноглобулина (дикого типа или мутантный). В некоторых случаях рассматриваемыми растворимыми полипептидами ΆείΚΙΙΒ являются антагонисты (ингибиторы) ΟΌΡ8/ΟΌΡ11.
Рассматриваются и другие варианты ΛαίΡΙΙΒ. например варианты, описанные ниже. Вариант слитого белка ΛαίΡΙΙΒ содержит часть, происходящую из последовательности ΛοίΡΙΙΒ δΕΟ ΙΌ N0:2, и вторую полипептидную часть, где часть, происходящая от ΆείΚΙΙΒ, соответствует последовательности, начинающейся в положениях любой из аминокислот 21-29 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2 (необязательно начинающейся в положениях 22-25 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2) и заканчивающейся в положениях любой из аминокислот 109-134 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2, и где слитый белок ΛοίΡΙΙΒ ингибирует передачу сигнала под действием активина, миостатина и/или ΟΌΡ11, как показал клеточный анализ. Описанный выше вариант слитого белка ΛοίΡΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΆείΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-29 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2 (начинающейся, но необязательно, в положениях 22-25 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2) и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 109-133 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2. Описанный выше вариант слитого белка ΆοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΆείΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-24 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2 (начинающейся, но необязательно, в положениях 22-25 последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2) и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 109-133 δΕΟ Ш N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΛοίΡΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΆοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 21-24 δΕΟ ΙΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 109-134 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΆοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΆοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-24 δΕΟ ΙΌ N0:2, и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-133 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΆοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΆοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 21-24 δΕΟ ΙΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-134 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΆοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящая от ΆοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот
20- 24 δΕΟ ΙΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-133 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΆοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΆοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-24 δΕΟ ΙΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-133 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΑοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΆοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 21-29 δΕΟ ΙΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-134 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΑοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΑοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-29 δΕΟ ΙΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-133 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΑοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΑοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот
21- 29 δΕΟ ΙΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-134 δΕΟ ΙΌ N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка ΑοίΚΙΙΒ имеет часть, происходящую от ΑοίΚΙΙΒ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-29 δΕΟ ΒΌ N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-133 δΕΟ ΙΌ N0:2. Неожиданно было обнаружено, что конструкции, начинающиеся в положениях 22-25 δΕΟ ΙΌ N0:2, обладают активностью, уровень которой превышает уровень активности белков, имеющих полноразмерный внеклеточный домен человеческого ΑοίΚΙΙΒ. Любой из вышеописанных вариантов слитого белка ΑοίΚΙΙΒ может быть продуцирован в виде гомодимера. Любой из вышеуказанных слитых белков ΑοίΚΙΙΒ может иметь гетерологичную часть, которая содержит константную область тяжелой цепи Ι§0, такую как Рс-домен.
Рассматриваются и другие варианты белков ΑΛΚΙΙΒ, например варианты, описанные ниже. Вариант белка ΑΛΚΙΙΒ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот 29-109 δΕΟ ΙΌ N0:2, где в положении, соответствующем аминокислоте 64 δΕΟ ΙΌ N0:2, присутствуют Κ или К, и где вариант белка ΑΛΚΙΙΒ ингибирует передачу сигнала под действием активина, миостатина и/или 0ΌΡ11 в клеточном анализе. Описанный выше вариант белка ΑсίΚIIΒ по отношению к последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2 имеет по меньшей мере одну модификацию, которая находится за пределами лигандсвязывающего кармана. Описанный выше вариант белка ΑсίΚIIΒ по отношению к последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2 имеет
- 3 025891 по меньшей мере одну консервативную модификацию, расположенную в лигандсвязывающем кармане. Описанный выше вариант белка АсЖЛВ по отношению к последовательности ЗЕО ГО N0:2 имеет по меньшей мере одну модификацию в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из К74, К.40, 053, К55, Р82 и Ь79. Описанный выше вариант белка АсЖИВ содержит по меньшей мере одну последовательность Ν-Χ-8/Τ в положении, отличающемся от положения эндогенной последовательности Ν-Χ-8/Τ Ас1КПВ. и в положении, находящемся за пределами лигандсвязывающего кармана.
Рассматриваются и другие варианты белков АсЖИВ, например варианты, описанные ниже. Вариант белка АсЖИВ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот 29-109 ЗЕО ГО N0:2, где указанный белок содержит по меньшей мере одну последовательность Ν-Χ-3/Τ в положении, отличающемся от положения эндогенной последовательности Ν-Χ-3/Τ АсЖЛВ, и в положении, находящемся за пределами лигандсвязывающего кармана. Описанный выше вариант белка Ас1К11В содержит N в положении, соответствующем положению 24 ЗЕО ГО N0:2, и З или Т в положении, соответствующем положению 26 ЗЕО ГО N0:2, где указанный вариант белка АсЖИВ ингибирует передачу сигнала под действием активина, миостатина и/или 0ΌΡ11 в клеточном анализе. Описанный выше вариант белка АсЖПВ содержит К или К в положении, соответствующем положению 64 ЗЕО ГО N0:2. Описанный выше вариант белка АсЖИВ по отношению к последовательности ЗЕО ГО N0:2 имеет по меньшей мере одну консервативную модификацию, расположенную в лигандсвязывающем кармане. Описанный выше вариант белка АсЖИВ по отношению к последовательности ЗЕО ГО N0:2 имеет по меньшей мере одну модификацию в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из К74, К40, 053, К55, Р82 и Ь79. Описанный выше вариант белка Ас1КПВ представляет собой слитый белок, который дополнительно содержит гетерологичную часть. Любой из вышеописанных вариантов слитого белка АсЖИВ может быть продуцирован в виде гомодимера. Любой из вышеуказанных слитых белков АсЖЛВ может иметь гетерологичную часть, которая содержит константную область тяжелой цепи 1§0, такую как Рс-домен.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют растворимый полипептид АсЖЛВ, но не кодируют полноразмерный полипептид Ас1КПВ. Выделенный полинуклеотид может содержать последовательность, кодирующую растворимый полипептид АсЖЛВ, такой как полипептид, описанный выше. Так, например, выделенная нуклеиновая кислота может включать последовательность, кодирующую внеклеточный домен (например, лигандсвязывающий домен) АсЖЛВ, и последовательность, кодирующую полноразмерный трансмембранный домен Ас1КПВ или его часть и/или полноразмерный цитоплазматический домен Ас1К11В или его часть, а также стопкодон, расположенный в трансмембранном домене или в цитоплазматическом домене или расположенный между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом или цитоплазматическим доменом. Так, например, выделенный полинуклеотид может содержать полноразмерную полинуклеотидную последовательность АсЖЛВ, такую как последовательность ЗЕО ГО N0:4, или ее частично усеченный вариант, где указанный выделенный полинуклеотид также содержит кодоны терминации транскрипции, состоящие по меньшей мере из 600 нуклеотидов, расположенных перед З'-концом или в каком-либо другом участке таким образом, чтобы трансляция полинуклеотида приводила к образованию внеклеточного домена, присоединенного, но необязательно, к усеченной части полноразмерного АсЖЛВ. Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящей заявке, могут быть функционально присоединены к промотору, регулирующему экспрессию, и настоящее изобретение также относится к клеткам, трансформированным такими рекомбинантными полинуклеотидами. Предпочтительными клетками являются клетки млекопитающих, такие как клетки СНО.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам получения растворимого полипептида АсЖЛВ. Этот способ может включать экспрессию любой из нуклеиновых кислот (например, ЗЕО ГО N0:3), описанных в настоящей заявке, в подходящей клетке, такой как клетки яичника китайского хомячка (СНО). Указанный способ может включать а) культивирование клеток в условиях, подходящих для экспрессии растворимого полипептида АсЖИВ, где указанные клетки трансформируются конструкцией для экспрессии растворимого АсЖЛВ; и Ь) выделение экспрессируемого таким образом растворимого полипептида АсЖИВ. Растворимые полипептиды Ас1К11В могут быть выделены в виде неочищенных, частично очищенных или в высокой степени очищенных фракций с применением хорошо известных методов получения белка из клеточных культур.
В некоторых аспектах изобретения описанный здесь растворимый полипептид Ас1КПВ может быть использован в способе лечения индивидуума, страдающего расстройством, ассоциированным с потерей мышечной массы или с недостаточным ростом мышечной массы. Такими расстройствами являются атрофия мышц, мышечная дистрофия, амиотрофический боковой склероз (АБС) и гипотрофия мышц (например, кахексия, анорексия, синдром мышечной дистрофии Дюшенна (МДД), синдром мышечной дистрофии Беккера, истощение при СПИДе, мышечная дистрофия, нейромышечные заболевания, заболевание двигательных нейронов, заболевания нервно-мышечных соединений и воспалительные миопатии). Такой способ может включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества растворимого полипептида Ас1КПВ.
В некоторых аспектах изобретения описанный здесь растворимый полипептид Ас1КПВ может быть
- 4 025891 использован в способе снижения содержания жира в организме или снижения скорости увеличения содержания жира в организме, а также для лечения расстройства, ассоциированного с нежелательным увеличением массы тела, такого как ожирение, инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНЗСД), сердечнососудистое заболевание, рак, гипертензия, остеоартрит, инсульт, заболевания дыхательных путей и заболевание желчного пузыря. Такие способы могут включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества растворимого полипептида АсЖПВ.
В некоторых конкретных аспектах изобретения описанный здесь растворимый полипептид ЛсЖНВ может быть использован в способе лечения расстройства, ассоциированного с аномальной активностью 0ΌΡ8. Такими расстройствами являются метаболические расстройства, такие как диабет типа 2, непереносимость глюкозы, метаболический синдром (например, синдром X) и инсулинорезистентность, вызываемая травмами (например, ожогами или нарушением баланса азота); расстройства, ассоциированные с отложением жира в ткани (например, ожирение), мышечная дистрофия (включая мышечную дистрофию Дюшенна); амиотрофический боковой склероз (АБС); атрофия мышц; атрофия органов; общее недомогание; синдром канала запястья, хроническая обструктивная болезнь легких, саркопения, кахексия и другие синдромы гипотрофии мышц; остеопороз; остеопороз, индуцированный глюкокортикоидами; остеопения; остеоартрит; переломы, ассоциированные с остеопорозом; разрежение кости, вызываемое длительной терапией глюкокортикоидами; преждевременное угасание половой функции; подавление функции андрогенов; дефицит витамина Ό; вторичный гиперпаратиреоидит; дефицит питательных веществ и нервная анорексия. Такой способ может включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества растворимого полипептида АсЖПВ.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способу идентификации агента, стимулирующего рост ткани, такой как костная, хрящевая, мышечная и жировая ткань. Указанный способ включает а) идентификацию тестируемого агента, который конкурирует с растворимым полипептидом АсЖЛВ за связывание с лигандсвязывающим доменом полипептида Ас1К11В; и Ь) оценку влияния данного агента на рост массы ткани.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам подавления активности полипептида Ас1КПВ или лиганда Ас1КПВ (например, 0ΌΡ8, 0ΌΡ11, активина, ВМР7 и Νοάαΐ) в клетке. Эти способы включают контактирование клеток с растворимым полипептидом АсЖНВ. Мониторинг активности полипептида или лиганда АсЖНВ проводят, но необязательно, путем оценки передачи сигнала, опосредуемой комплексом АсЖНВ/лиганд Ас1Ы1В. например путем оценки пролиферации клеток. Клетками, используемыми в данных способах, являются остеобласты, хондроциты, миоциты, адипоциты и мышечные клетки.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к применению растворимого полипептида АсЖПВ для производства лекарственного препарата для лечения описанного здесь расстройства или состояния.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 представлена последовательность человеческого растворимого полипептида АсЖПВ (внеклеточного) (8ЕО ГО N0:1). С-концевой хвост подчеркнут.
На фиг. 2 представлена последовательность человеческого белка-предшественника АсЖЛВ (8ЕЦ ГО N0:2). Сигнальный пептид подчеркнут; внеклеточный домен (также называемый 8Е0 ГО N0:1) показан жирным шрифтом, а предполагаемые сайты Ν-связанного гликозилирования показаны в рамке.
На фиг. 3 представлена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий растворимый полипептид АсЖПВ (внеклеточный), представленный как 8Е0 ГО N0:3.
На фиг. 4 представлена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок-предшественник АсЖИВ, представленный как 8Е0 ГО N0:4.
На фиг. 5 проиллюстрировано увеличение массы тела у мышей, обработанных носителем (ромбы), полипептидом Ас1КПВ(К64 20-134)-тРс (квадраты) или его формой с длительным временем полужизни, Ас1КПВ(К64 А24N 20-134) (треугольники).
На фиг. 6 представлены массы мышц, иссеченных в конце исследования. Носитель: левый столбец (слабое затенение) для каждой группы; Ас1КПВ(К64 20-134)-шРс: средний столбец (умеренное затенение) для каждой группы; Ас1КПВ(К64 А24N 20-134): правый столбец (сильное затенение) для каждой группы.
На фиг. 7 проиллюстрировано измерение силы спазмов у мышей 80Ό, обработанных РВ8 и мышиным Ас1В11В (К.64 К74А 20-134)-тРс (или хвост К74А+15) (белые и черные столбцы соответственно). На этой фигуре проиллюстрировано увеличение мышечной силы у мышей Ас1КПВ (К64 К74А 20-134)тРс-группы по сравнению с мышами РВ8-группы на ранней стадии (на день 117) и на поздней стадии (на день 149) развития заболевания. *Р<0,05, двухсторонний т-критерий Стьюдента.
На фиг. 8 проиллюстрировано сравнение выживаемости мышей 80Ό, обработанных РВ8 и АсЖПВ (К64 К74А 20-134)-тРс (белые и черные линии соответственно) в соответствии с критерием КапланаМейера. У АсЖИВ (К64 К74А 20-134)-тРс-обработанной группы по сравнению с РВ8-обработанной группой выживаемость была в среднем на несколько дней выше.
На фиг. 9 проиллюстрировано процентное изменение состава веществ в организме у мышей, кото- 5 025891 рым давали корм с высоким содержанием жира, включающий РВ§ и АсЖПВ (К64 20-134)-тРс (белые и черные столбцы соответственно). Обработка мышей мышиным белком Ас1КПВ(К64 20-134)-Рс приводит к значительному снижению массы жира и увеличению безжировой ткани.
На фиг. 10 показано поперечное сечение мышц бедра (с 4-кратным увеличением) у старых мышей (А) или у старых мышей, обработанных белком АсЖПВ(К64 20-134)-тРс (В).
На фиг. 11 представлены средние массы тела мышей в эксперименте на мышах с раковой кахексией, проводимом с использованием клеток рака толстой кишки СТ26. Ромбы: животные, не имеющие опухолей и обработанные физиологическим раствором; квадраты: АсЖПВ(Р64 20-134)-тРсобработанные мыши, не имеющие опухолей; треугольники: мыши с опухолями, обработанные физиологическим раствором; х: АсЖПВ(Р64 20-134)-тРс-обработанные мыши с опухолями (10 мг/кг); *: АсЖПВ(Р64 20-134)-тРс-обработанные мыши с опухолями (30 мг/кг); кружки: АсЖПВ(К64 20-134)тРс-обработанные мыши с опухолями, (10 мг/кг), для проведения профилактического лечения обработку начинали во время имплантации опухоли.
На фиг. 12 проиллюстрировано сопоставление путем выравнивания остатков человеческих АсЖПА и АсЖПВ с остатками, выведенными здесь исходя из анализа состава множества кристаллических структур АсЖПВ и АсЖПА, и непосредственно контактирующих с лигандом (лигандсвязывающего кармана), показанных в рамках.
На фиг. 13 проиллюстрировано сопоставление путем выравнивания множества последовательностей различных белков АсЖПВ позвоночных и человеческого АсЖПА.
Подробное описание изобретения
1. Общий обзор.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам АсЖПВ. Используемый здесь термин АсЖПВ означает семейство белков-рецепторов активина типа 11В (АсЖПВ) и АсЖНВ-родственных белков, происходящих от любых видов. Членами семейства АсЖПВ в основном являются все трансмембранные белки, состоящие из лигандсвязывающего внеклеточного домена с богатой цистеином областью, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной серин/треонин-киназной специфичностью.
Аминокислотные последовательности белка-предшественника человеческого АсЖПА (показаны для сравнения) и белка-предшественника АсЖПВ проиллюстрированы на фиг. 1 (δΕΟ ГО N0:1) и фиг. 2 (8Е0 ГО N0:2) соответственно.
Используемый здесь термин полипептид АсЖПВ означает полипептиды, содержащие любой природный полипептид, являющийся членом семейства АсЖПВ, а также любые их варианты (включая мутанты, фрагменты, гибриды и пептидомиметики), которые сохраняют нужную активность. Так, например, полипептидами АсЖПВ являются полипептиды, происходящие от последовательности любого известного АсЖПВ и имеющие последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, а предпочтительно по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 99% или более идентична последовательности полипептида АсЖПВ.
В своем конкретном варианте настоящее изобретение относится к растворимым полипептидам АсЖИВ. Используемый здесь термин растворимый полипептид АсЖПВ, в общих чертах, означает полипептиды, содержащие внеклеточный домен белка АсЖПВ. Используемый здесь термин растворимый полипептид АсЖПВ включает любой природный внеклеточный домен белка АсЖПВ, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты и пептидомиметики), которые сохраняют нужную активность. Так, например, внеклеточный домен белка АсЖПВ связывается с лигандом и, по существу, является растворимым. Примерами растворимых полипептидов АсЖПВ являются растворимые полипептиды АсЖПВ, проиллюстрированные на фиг. 1 (δΕΟ ΕΌ N0:1). Другие примеры растворимых полипептидов АсЖПВ, помимо внеклеточного домена белка АсЖПВ, содержат сигнальную последовательность, см. пример 1. Сигнальной последовательностью может быть нативная сигнальная последовательность АсЖИВ или сигнальная последовательность другого белка, такая как сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) или сигнальная последовательность мелатина пчелиного меда (НВМ).
ΤΟΡ-β-сигналы опосредуются гетеромерными комплексами серин/треонин-киназных рецепторов типа I и типа II, которые фосфорилируют и активируют расположенные ниже белки §таб после стимуляции лиганда (Маккадие, 2000, Ναι. Кеу. Мо1. Се11 Вю1. 1:169-178). Все эти рецепторы типа I и типа II представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лигандсвязывающего внеклеточного домена с богатой цистеином областью, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной специфичностью к серину/треонину. Рецепторы типа I играют важную роль в передаче сигнала, а рецепторы типа II необходимы для связывания с лигандами и для экспрессии рецепторов типа I. Рецепторы активина типа I и II после связывания с лигандом образуют стабильный комплекс, что приводит к фосфорилированию рецепторов типа I под действие рецепторов типа II.
Два родственных рецептора типа II, АсЖПА и АсЖПВ, были идентифицированы как рецепторы активинов типа II (Ма1Не\У5 и Уа1е, 1991, Се11 65:973-982; АЖкаио е! а1., 1992, Се11 68: 97-108). Помимо активинов, АсЖПА и АсЖПВ могут биохимически взаимодействовать с несколькими другими белками
- 6 025891 семейства ΤΟΡ-β, включая ВМР7, Ыойа1, ΟΌΡ8 и ΟΌΡ11 (УатакЬйа е! а1., 1995, 1. Се11 ΒίοΙ. 130:217-226; Ьсе и МсРЬеггоп, 2001, Ргос. ЫаИ. Асай. δα. 98:9306-9311; Уео и \У1Шшап. 2001, Мо1. Се11 7: 949-957; ОЬ е! а1., 2002, Оепек Эеу. 16:2749-54). Заявителями было обнаружено, что растворимые слитые белки АсίΚΙΙΑ-Рс и слитые белки Ас1К11В-Рс оказывают в основном различное действие ίη У1уо, причем Ас1РПАРс влияет, главным образом, на кости, а АсЖИВ-Тс влияет, главным образом, на скелетную мышцу.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к подавлению функции лиганда для рецепторов АсЖНВ (также называемого лигандом Ас!КЛВ) под действием рассматриваемого полипептида Ас!КЛВ (например, растворимого полипептида Ас!КЛВ). Таким образом, композиции и способы согласно изобретению могут быть применены для лечения расстройств, ассоциированных с аномальной активностью одного или нескольких лигандов для рецепторов АсЖИВ.
Репрезентативными лигандами для рецепторов АсЖЛВ являются некоторые члены семейства ΤΟΡβ, такие как активин, Ыоба1, ΟΌΡ8, ΟΌΡ11 и ВМР7.
Активины представляют собой димерные полипептидные факторы роста и принадлежат к суперсемейству ΤΟΡ-бета. Существует три активина (А, В и АВ), которые представляют собой гомо/гетеродимеры, состоящие из двух близкородственных β-субъединиц (вАвА, βιΥ; и βАвВ). В суперсемействе ΤΟΡ-бета активины являются уникальными и многофункциональными факторами, которые могут стимулировать продуцирование гормонов в клетках яичника и плаценты, поддерживать выживаемость нервных клеток, положительно или отрицательно влиять на прохождение клеточного цикла в зависимости от типа клетки и индуцировать дифференцировку мезодермы, по меньшей мере, в эмбрионах амфибий (ЭеРао1о е! а1., 1991, Ргос 8осЕр Вю1 Мей. 198:500-512; Эукоп е! а1., 1997, Сигг Вю1. 7:81-84; ХУоойгиГГ 1998, ВюсЬет РЬагтасо1. 55:953-963). Кроме того, было обнаружено, что эритроидный фактор дифференцировки (ΕΌΡ), выделенный из стимулированных человеческих клеток моноцитарного лейкоза, идентичен активину А (Мита1а е! а1., 1988, РЫА§, 85:2434). Было высказано предположение, что активин А действует как природный регулятор эритропоэза в костном мозге. В некоторых тканях передача активинового сигнала подавляется под действием родственного ему гетеродимера, ингибина. Так, например, в процессе высвобождения фолликулостимулирующего гормона (ΡδΗ) из гипофиза активин стимулирует секрецию и синтез ΡδΗ, а ингибин способствует предупреждению секреции и синтеза ΡδΗ. Другими белками, которые могут регулировать биологическую активность активина и/или связываться с активином, являются фоллистатин (Ρδ), белок, родственный фоллистатину ^δ^), а2-макроглобулин, белок СегЬегик и эндоглин, описанные ниже.
Белки Ыойа1 функционируют в мезодерме и участвуют в индуцировании и образовании эндодермы, а также в последующей организации аксиальных структур, например, на ранней стадии эмбриогенеза в сердце и в желудке. Было продемонстрировано, что дорсальная ткань на стадии развития эмбрионов позвоночных преимущественно участвует в образовании аксиальных структур спинной хорды и прехордальной пластины, но в то же время она участвует в рекрутинге окружающих клеток с образованием неаксиальных эмбрионных структур. Белок Ыойа1 очевидно передает сигнал посредством рецепторов типа I и типа II и внутриклеточных эффекторов, известных как белки δтай. Недавно проведенные исследования лишь подтвердили идею о том, что АсЖЛА и АсЖИВ служат в качестве рецепторов типа II для Ыойа1 ракита е! а1., Сепек Се11к. 2002, 7:401-12). Было высказано предположение, что лиганды Ыойа1 взаимодействуют со своими кофакторами (например, крипто-белок), что приводит к активации рецепторов активина типа I и типа II, которые фосфорилируют δтай2. Белки Ыойа1 участвуют во многих событиях, играющих важную роль в развитии эмбриона позвоночного на ранней стадии, включая образование мезодермы, образование структуры передней пластины и формирование левой-правой оси. Экспериментальные исследования показали, что передача сигнала Ыойа1 активирует рАКЗ-Ьих, то есть репортерную молекулу люциферазы, которая, как сообщалось ранее, является специфической по отношению к активину и ΤΟΡ-бета. Однако Ыойа1 не обладает способностью индуцировать ρΤ1χ2-Ρυχ, то есть репортер, который является специфическим по отношению к белкам морфогенеза кости. Недавно полученные результаты биохимического анализа со всей очевидностью показали, что передача сигнала Ыойа1 опосредуется путями активина-ΤΟΡ-бета, δтайк, δтай2 и δтай3. Последующие результаты показали, что внеклеточный крипто-белок необходим для передачи сигнала Ыойа1, а не активина или ΤΟΡ-бета.
Фактор роста и дифференцировки-8 (ΟΌΡ8) также известен как миостатин. ΟΌΡ8 является негативным регулятором массы скелетной мышцы. ΟΌΡ8 в высокой степени экспрессируется в скелетной мышце развивающегося организма и в скелетной мышце взрослого индивидуума. Нуль-мутация ΟΌΡ8 у трансгенных мышей характеризуется заметной гипертрофией и гиперплазией скелетной мышцы (МсРЬеггоп е! а1., №!ите, 1997, 387:83-90). Аналогичное увеличение массы скелетной мышцы наблюдается в случае природных мутаций ΟΌΡ8 у крупного рогатого скота (АкЬтоге е! а1., 1974, СгслуОт 38:501507; δινη^-ΗΗ и К1е£Гег, 1. Атт. δΑ 1994, 38:752-757; МсРЬеггоп и Рее, Ргос. Ыа!1. Асай. δ^. ^А, 1997, 94:12457-12461; и КатЬайиг е! а1., Οеηοте Кек., 1997, 7:910-915), и что удивительно, у человека (Ъс1ше1ке е! а1., N Епд1 1 Мей 2004; 350:2682-8). Исследования также показали, что гипотрофия мышц, ассоциированная с ВИЧ-инфекцией у человека, сопровождается повышением уровня экспрессии белка ΟΌΡ8 (Сопга^-СайауШ е! а1., РNΑδ, 1998, 95:14938-43). Кроме того, ΟΌΡ8 может модулировать продуцирова- 7 025891 ние мышцеспецифических ферментов (например, креатинкиназы) и пролиферацию миобластов (νθ 00/43781). Пропептид ΟΌΡ8 может нековалентно связываться со зрелым димером домена ΟΌΡ8, что приводит к инактивации его биологической активности (Μίναζοηο е! а1. (1988) 1. ΒίοΙ. СЬет., 263: 64076415; е! а1. (1988) 1. Βΐο1. СЬет., 263; 7646-7654 и Βιο\\ιι е! а1. (1990) СюМЬ РасЮге, 3: 35-43).
Другими белками, которые связываются с СЭР8 или со структурно родственными белками и ингибируют их биологическую активность, являются фоллистатин, а возможно и белки, родственные фоллистатину (Сатег е! а1. (1999) Эе\. Βΐο1., 208:222-232).
Фактор роста и дифференцировки-11 (СЭР11), также известный как ВМР11, представляет собой секретируемый белок (МсРЬеггоп е! а1., 1999, ΝηΙ. Сенек 22:260-264). СЭР11 экспрессируется в хвостовой почке, в почке конечностей, в верхнечелюстной и в челюстной дуге и в спинно-мозговых узлах в процессе развития организма у мышей ^акакЫта е! а1., 1999, МесЬ. Эеу. 80:185-189). СЭР11 играет уникальную роль в образовании структуры тканей мезодермы и нервных тканей (Сатег е! а1., 1999, Эе\' Βίο1., 208:222-32). Было показано, что СЭР11 является негативным регулятором хондрогенеза и миогенеза на стадии развития конечностей кур (Сатег е! а1., 2001, Эе\' Βίο1. 229:407-20). Экспрессия СЭР11 в мышце также указывает на то, что СЭР11, также как и СЭР8, играет определенную роль в регуляции роста мышц. Кроме того, экспрессия СЭР11 в головном мозге указывает на то, что СЭР 11 может также обладать активностями, ассоциированными с функцией нервной системы. Интересно отметить, что СЭР11, как было обнаружено, ингибирует нейрогенез обонятельного эпителия (νυ е! а1., 2003, №игоп. 37:197-207). Следовательно, СЭР11 может быть использован ίη νί!το и ίη νίνο для лечения таких заболеваний, как заболевания мышц и нейродегенеративные заболевания (например, амиотрофический боковой склероз).
Хорошо известно, что белок морфогенеза кости (ВМР7), также называемый остеогенным белком-1 (ОР-1), индуцирует образование хряща и костей. Кроме того, ВМР7 регулирует широкий ряд физиологических процессов. Так, например, ВМР7 может представлять собой остеоиндуцирующий фактор, ответственный за остеогенез эпителия. Было также обнаружено, что ВМР7 играет определенную роль в регуляции уровня кальция и в гомеостазе кости. ВМР7 подобно активину связывается с рецепторами типа II, ЛсРКПЛ и ΙΙΒ. Однако ВМР7 и активин осуществляют рекрутинг различных рецепторов типа I с образованием гетеромерных рецепторных комплексов. Как показали наблюдения, основной рецептор ВМР7 типа I, представляет собой АЬК2, а активин связывается исключительно с ЛЬК4 (ЛсРКПВ). ВМР7 и активин вырабатывают определенные биологические ответы и активируют различные пути 8таб (Мааак8Жа е! а1., 1998, ί Βίοι СЬет. 273:25628-36).
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к использованию некоторых полипептидов Α^ΡΠΒ (например, растворимых полипептидов ΑοίΚΠΒ) для подавления сигнала, передаваемого лигандами ΑοίΚΠΒ, по существу, в любом процессе, ассоциированном с активностью ЛсРШИ. Полипептиды ΑοίΚΠΒ согласно изобретению могут, но необязательно, подавлять активность одного или нескольких лигандов рецепторов ΑΛΚΙ^, таких как активин, №4а1, СЭР8, СЭР11 и ВМР7, а поэтому они могут быть использованы для лечения других расстройств.
Поэтому в настоящем изобретении рассматривается использование полипептидов ЛсРШИ для лечения или предупреждения заболеваний или состояний, ассоциированных с аномальной активностью ΑсίΚΠΒ или лиганда АсВДШ. ΑсίΚΠΒ или лиганды ΑсίΚΠΒ участвуют в регуляции многих важных биологических процессов. Благодаря ключевым функциям, которые они играют в этих процессах, они могут быть желательными мишенями для терапевтического лечения. Так, например, полипептиды Αс!ΚΠΒ (например, растворимые полипептиды ЛсРШИ) могут быть использованы для лечения расстройств или состояний у человека или животного. Примерами таких расстройств или состояний являются, но не ограничиваются ими, метаболические расстройства, такие как диабет типа 2, непереносимость глюкозы, метаболический синдром (например, синдром X), и инсулинорезистентность, вызываемая травмами (например, ожогами или нарушением баланса азота); расстройства, ассоциированные с отложением жира в ткани (например, ожирение), мышечные и нейромышечные заболевания, такие как мышечная дистрофия (включая мышечную дистрофию Дюшенна); амиотрофический боковой склероз (АБС); атрофия мышц; атрофия органов; общее недомогание; синдром канала запястья, хроническая обструктивная болезнь легких, саркопения, кахексия и другие синдромы гипотрофии мышц. Другими примерами является остеопороз, в частности, у пожилых женщин и/или у женщин после менопаузы; остеопороз, индуцированный глюкокортикоидами; остеопения; остеоартрит и переломы, ассоциированные с остеопорозом. Другими примерами являются разрежение кости, вызываемое длительной терапией глюкокортикоидами; преждевременное угасание половой функции; подавление функции андрогенов; дефицит витамина Ό; вторичный гиперпаратиреоидит; дефицит питательных веществ и нервная анорексия. Такие расстройства и состояния обсуждаются ниже в разделе Репрезентативное терапевтическое применение.
Термины, используемые в описании настоящей заявки, обычно употребляются в своем общепринятом смысле в соответствии с контекстом настоящего изобретения и в соответствии с контекстом, в котором употребляется каждый из этих терминов. Для представления специалисту дополнительной информации о композициях и способах согласно изобретению и информации об осуществлении и применении таких способов, некоторые термины обсуждаются ниже или в каком-либо разделе описания настоящей
- 8 025891 заявки. Объем употребления или значение любого используемого здесь термина будут очевидны специалистам из конкретного контекста, в котором используется данный термин.
Термины примерно и приблизительно, в общих чертах, означают допустимую степень ошибки при определении количественной величины, вычисленной с учетом способа или точности измерений. Обычно допустимые степени ошибок составляют в пределах 20, предпочтительно 10, а более предпочтительно 5% от данной величины или интервала величин.
Альтернативно, в частности, в биологических системах термины примерно и приблизительно могут означать величины, которые входят в пределы величин, предпочтительно порядка величин, которые в 5 раз, а более предпочтительно в 2 раза превышают данную величину. Если это не оговорено особо, то представленные здесь численные значения являются приблизительными, а это означает, что, если эти значения не указаны точно, то могут быть использованы термины примерно или приблизительно.
Способы согласно изобретению могут включать стадии сравнения последовательностей друг с другом, включая сравнение последовательности дикого типа с последовательностями одного или нескольких мутантов (вариантов последовательностей). Такие сравнения обычно включают выравнивание полимерных последовательностей, например, с использованием программ и/или алгоритмов выравнивания последовательностей, хорошо известных специалистам (например, ВЬАБТ, ΡΑ8ΤΑ и ΜΕΟΑΕΙΟΝ и т. п.). Специалисту в данной области хорошо известно, что при осуществлении таких выравниваний, в том случае, если мутация представляет собой инсерцию или делецию остатка, в сравниваемую полимерную последовательность, не содержащую введенного или делетированного остатка, будет вводиться пробел (обычно обозначаемый штрихом или А).
Термин гомологичный во всех его грамматических формах и орфографических вариантах относится к взаимосвязи между двумя белками, которые имеют общее эволюционное происхождение, включая белки, происходящие от суперсемейств белков организмов одного и того же вида, а также гомологичные белки, происходящие от организмов других видов. Такие белки (и кодирующие их нуклеиновые кислоты) имеют гомологичные последовательности, на что указывает их сходство, независимо от процента идентичности, или присутствия конкретных остатков или мотивов и наличия консервативных положений.
Термин сходство последовательностей во всех его грамматических формах означает степень идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновых кислот или между аминокислотными последовательностями, которые могут иметь, а могут и не иметь общее эволюционное происхождение.
Однако термин гомологичный, употребляемый в своем общепринятом смысле и в контексте описания настоящей заявки, в том случае, если он употребляется вместе с наречием в высокой степени, может относиться к сходству последовательностей, которые могут иметь, а могут и не иметь общее эволюционное происхождение.
2. Полипептиды ΑείΚΙΙΒ.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к вариантам полипептидов ΑείΚΙΙΒ (например, к растворимым полипептидам ΑείΚΙΙΒ). Их фрагменты, функциональные варианты и модифицированные формы могут, но необязательно, обладать биологическими активностями, которые сходны с биологическими активностями их соответствующих полипептидов ΑείΚΙΙΒ дикого типа, или являются такими же, как биологические активности данных полипептидов дикого типа. Так, например, вариант ΑεΐΚΙΙΒ согласно изобретению может связываться с лигандом ΑείΚΙΙΒ (например, с активином А, активином АВ, активином В, Νοάαΐ. 0ΌΡ8, ΟΌΡ11 или ВМР7) и ингибировать функцию этого лиганда. Полипептид ΑείΚΙΙΒ модулирует, но необязательно, рост тканей, таких как ткани костей, хряща, мышц или жировых тканей. Примерами полипептидов ΑείΚΙΙΒ являются человеческий полипептидпредшественник ΑείΚΙΙΒ (5>ΕΟ ΙΌ N0:2) и растворимые человеческие полипептиды ΑείΚΙΙΒ (например, 8ΕΟ ΙΌ №№ 1, 5, 6 и 12).
В настоящем изобретении идентифицированы функционально активные части и варианты ΑεΐΚΙΙΒ. Заявителями было установлено, что Ре-слитый белок, имеющий последовательность, описанную в публикации Нйбеи с1 а1. (Βίοοά. 1994 Αρτ 15; 83(8):2163-70), где аланин присутствует в положении, соответствующем аминокислоте 64 8Ε0 ΙΌ N0:2 (А64), обладает относительно низкой аффинностью по отношению к активину и 0ΌΡ-11. В противоположность этому тот же самый Рс-слитый белок с аргинином в положении 64 (К64) обладает аффинностью по отношению к активину и 0ΌΡ-11 в интервалах от низких наномолярных значений до высоких пикомолярных значений. Поэтому в описании настоящей заявки последовательность с К64 используется как эталонная последовательность человеческого ΑсίΚIIΒ дикого типа.
ΑπΦαηο и др. (Се11. 1992 1аи 10; 68 (1) :97-108) показали, что делеция пролинового узла у С-конца внеклеточного домена ΑсίΚIIΒ приводит к снижению аффинности рецептора по отношению к активину. Представленные здесь данные показали, что слитый белок ΑсίΚIIΒ-Рс, содержащий аминокислоты 20119 8Ε0 ΙΌ N0:2, ΑΛΡΙΙΒ(20-119)-Ρε, обладает пониженной способностью связываться с 0ΌΡ-11 и с активином по сравнению с ΑсίΚIIΒ(20-134)-Рс, который включает область пролинового узла и полноразмерный пограничный мембранный домен. Однако белок ΑΛΚΙΙΒ(20-129)-Ρε сохраняет аналогичную,
- 9 025891 но несколько меньшую активность по сравнению с активностью белка дикого типа, даже если область пролинового узла отсутствует в результате дизрупции. Таким образом, предполагается, что все внеклеточные домены АсЖЛВ, которые заканчиваются в положениях аминокислот 134, 133, 132, 131, 130 и 129, являются активными, однако конструкции, заканчивающиеся в положении 134 или 133, могут быть наиболее активными. Аналогичным образом, предполагается, что мутации в любом из остатков 129-134 не будут оказывать влияние на аффинность связывания с лигандом в крупных концевых областях. В подтверждение этому следует отметить, что мутации Р129 и Р130 не приводят к значительному снижению уровня связывания с лигандом. Поэтому слитый белок АсЕКЛВ-Рс может заканчиваться уже в положении аминокислоты 109 (конечный цистеин), однако при этом предполагается, что формы полипептидов, заканчивающиеся в положениях 109 и 119 или между этими положениями, обладают пониженной способностью связываться с лигандом. Аминокислота 119 является слабоконсервативной, а поэтому она может быть легко модифицирована или удалена. Формы, заканчивающиеся в положении 128 или далее, сохраняют активность связывания с лигандом. Формы, заканчивающиеся в положениях 119 и 127 или между этими положениями, обладают умеренной способностью к связыванию. Любая из этих форм может оказаться желательной для применения в зависимости от клинических или экспериментальных условий.
Предполагается, что у Ν-конца АсЖЛВ белок, начинающийся в положении аминокислоты 29 или ранее, будет сохранять активность связывания с лигандом. Аминокислотой 29 является исходный цистеин. Замена аланина на аспарагин, вводимая в положение 24 последовательности Ν-связанного гликозилирования, не оказывает какого-либо значительного влияния на связывание с лигандом. Это подтверждает тот факт, что мутации в области, расположенной между сигнальным отщепляемым пептидом и перекрестно-связанной цистеиновой областью, соответствующей аминокислотам 20-29, являются в достаточной степени толерантными. В частности, конструкции, начинающиеся в положениях 20, 21, 22, 23 и 24, сохраняют свою активность, а также предполагается, что такую активность также сохраняют конструкции, начинающиеся в положениях 25, 26, 27, 28 и 29. Данные, представленные в примерах, указывают на то, что, как было неожиданно обнаружено, конструкция, начинающаяся в положениях 22, 23, 24 или 25, обладает наибольшей активностью.
В целом, активная часть АсЖЛВ содержит аминокислоты 29-109 8ЕО ГО N0:2, и конструкции могут, например, начинаться в положении остатка, соответствующего аминокислотам 20-29, и заканчиваться в положении, соответствующем аминокислотам 109-134. Другими примерами могут служить конструкции, которые начинаются в положениях 20-29 или 21-29 и заканчиваются в положениях 119-134, 119133 или 129-134, 129-133. Другими примерами являются конструкции, которые начинаются в положениях 20-24 (или 21-24, или 22-25) и заканчиваются в положениях 109-134 (или 109-133), 119-134 (или 119133) или 129-134 (или 129-133). Также рассматриваются варианты с этими интервалами, в частности варианты, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 99% идентичны соответствующей части 8ЕО ГО Ν0:4.
Настоящее изобретение включает результаты анализа состава структур АсЖЛВ, представленные на фиг. 22, где указанные результаты указывают на то, что лигандсвязывающий карман определяется остатками Υ31, N33, N35, Б38-Т41, Е47, Е50, Р53-К55, Ь57, Н58, Υ60, 862, К74, Α78-Ν83, Υ85, К87, А92 и Е94-Р101. Предполагается, что в этих положениях консервативные мутации являются толерантными, хотя мутация К74А также является достаточно толерантной, как и мутации К40А, К55А, Р82А и мутации в положении Ь79. У Хепорик К40 представляет собой К, что указывает на то, что основные аминокислоты в этом положении являются толерантными. В АсЖИВ коров 053 представляет собой К, а в АсЖИВ Хепорик 053 представляет собой К, а поэтому аминокислоты, включая К, К, О. N и Н, являются толерантными в этом положении. Таким образом, активный вариант белка АсЖИВ имеет общую структурную формулу, которая содержит аминокислоты 29-109, но необязательно, начинается в положениях 2024 или 22-25 и заканчивается в положениях 129-134, и которая также содержит не более чем 1, 2, 5, 10 или 15 консервативных аминокислотных замен в лигандсвязывающем кармане, и 0, 1 или более неконсервативных модификаций в положениях 40, 53, 55, 74, 79 и/или 82 в лигандсвязывающем кармане. Такой белок может сохранять последовательность, которая более чем на 80, 90, 95 или 99% идентична последовательности аминокислот 29-109 8ЕО ГО N0:4. Сайты, находящиеся за пределами связывающего кармана, вариабельность которых может быть, в частности, достаточно толерантной, включают амино- и карбоксиконцы внеклеточного домена (указанного выше) и положения 42-46 и 65-73. Замена аспарагина аланином в положении 65 (Ж5А) фактически может приводить к повышению уровня связывания с лигандом в эталонном А64, и, таким образом, предполагается, что такая замена не будет оказывать негативного влияния на уровень связывания с лигандом в эталонном К64. Такая замена, вероятно, будет приводить к элиминации сайта гликозилирования в положении N65 в эталонном А64, что указывает на то, что значительные изменения, сделанные в этой области, являются, очевидно, толерантными. Замена К64 является слабо толерантной, К64К является достаточно толерантной, и, таким образом, другой основный остаток, такой как Н, может быть толерантным в положении 64.
АсЖИВ является в высокой степени консервативным почти у всех позвоночных, при этом крупные фрагменты внеклеточного домена такого белка являются полностью консервативными. Многие из этих лигандов, которые связываются с АсЖЛВ, также являются в высокой степени консервативными. В соот- 10 025891 ветствии с этим сравнение последовательностей ЛеЖЛВ различных позвоночных позволяет идентифицировать остатки, которые могут быть модифицированными. Следовательно, активный человеческий вариант ЛеЖИВ может включать одну или несколько аминокислот в соответствующих положениях последовательности ЛеЖИВ другого позвоночного, либо он может включать остаток, аналогичный остатку, присутствующему в последовательности человека или другого позвоночного. Такой способ определения активного варианта ЛеЖЛВ проиллюстрирован в нижеследующих примерах. В ΑείΚΙΙΒ Хепориз Ь46 представляет собой валин, и в этом положении такой остаток может быть модифицирован, и он может быть заменен, но необязательно, другим гидрофобным остатком, таким как V, I или Р, или неполярным остатком, таким как А. У Хепориз Е52 представляет собой К, что указывает на то, что этот сайт может быть толерантным к модификациям широкого ряда, включая замены полярными остатками, такими как Е, Ό, К, К, Н, δ, Т, Р, С, Υ, и вероятно, А. У Хепориз Т93 представляет собой К, что указывает на то, что в этом положении широкие структурные изменения могут оставаться толерантными, при этом предпочтение следует отдать полярным остаткам, таким как δ, К, К, Е, Ό, Н, С, Р, С и Υ. У Хепориз Р108 представляет собой Υ, а поэтому Υ или другая гидрофобная группа, такая как I, V или Ь, должны быть толерантными. У Хепориз Е111 представляет собой К, что указывает на то, что в этом положении заряженные остатки, включая Ό, К, К и Н, а также О и Ν, могут быть толерантными. У Хепориз К112 представляет собой К, что указывает на то, что в этом положении, включая К и Н, основные остатки являются толерантными. В положении 119 остаток А и, очевидно, Р у грызунов и V у Хепориз являются относительно слабоконсервативными, а поэтому, по существу, любая аминокислота в этом положении должна быть толерантной.
В описании настоящей заявки продемонстрировано, что присоединение дополнительного сайта Νсвязанного гликозилирования (Ν-Х^/Т) приводит к увеличению времени полужизни слитого белка АсЖПВ-Рс в сыворотке по сравнению со временем полужизни Ас!К11В(К64)-Рс-формы. При введении аспарагина в положение 24 (А24ГСконструкции) образуется последовательность ΝΥΤ. которая сообщает более длительное время полужизни. Другие последовательности NX(Τ/δ) присутствуют в положениях 42-44 (ΝΟδ) и 65-67 (Νδδ), хотя последняя последовательность не может быть эффективно гликозилирована остатком К в положении 64. Последовательности Ν-Х^/Т могут быть в основном введены в положениях, находящихся за пределами лигандсвязывающего кармана, определенного на фиг. 12. Особенно подходящими сайтами для введения неэндогенных последовательностей Ν-Х^/Т являются аминокислоты 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 или 129-134. Последовательности Ν-Х^/Т могут быть также введены в линкер между последовательностью АсЖТЕВ и Рс или другим компонентом гибрида. Такой сайт может быть легко встроен путем введения Ν в правильное положение по отношению к уже существующему δ или Т или путем введения δ или Т в положение, соответствующее уже существующему Ν. Таким образом, желательными модификациями, которые могут приводить к образованию сайта Νсвязанного гликозилирования, являются Α24Ν, Ρ64Ν, δ67Ν (возможно объединенные с модификациями Ν65Α), Е106ГС Β.112Ν, Ο120Ν, Ξ123Ν, Ρ129Ν, Α132Ν, К1128 и К112Т. Благодаря защите, сообщаемой гликозилированием, любой δ, который, как было предсказано, является гликозилированным, может быть заменен на Т без создания иммуногенного сайта. Аналогичным образом, любой Т, который, как было предсказано, является гликозилированным, может быть заменен на δ. Рассматриваются также модификации δ67Τ и δ44Κ Аналогичным образом, в вариант Α24Ν может быть введена модификация δ26Κ В соответствии с этим вариант Α^ΡΙΚ может включать одну или несколько дополнительных неэндогенных консенсусных последовательностей Ν-связанного гликозилирования.
Положение Ь79 может быть модифицировано в целях изменения связывающих свойств активинамиостатина (СОР-11). Ρ79Α или Ь79Р снижают уровень связывания СОР-11 в гораздо большей степени, чем уровень связывания активина. Ь79Е или Ь79О сохраняют способность связываться с СОР-11. Интересно отметить, что варианты Ь79Е и Ь79О обладают значительно меньшей способностью связываться с активином. 1п νί\Ό эксперименты показали, что такие неактивиновые рецепторы в значительной степени сохраняют способность увеличивать мышечную массу, но обладают значительно меньшим действием на другие ткани. Полученные данные продемонстрировали необходимость и целесообразность получения полипептидов, обладающих более слабым действием на активин.
Описанные модификации могут быть объединены различными методами. Кроме того, описанные здесь результаты применения программы мутагенеза показали, что в ΑсίКIIΒ имеются положения аминокислот, которые часто и предпочтительно являются консервативными. Такими положениями являются положение 64 (основная аминокислота), положение 80 (кислотная или гидрофобная аминокислота), положение 78 (гидрофобная аминокислота, в частности, триптофан), положение 37 (кислотная аминокислота, в частности, аспарагиновая или глутаминовая аминокислота), положение 56 (основная аминокислота), положение 60 (гидрофобная аминокислота, в частности, фенилаланин или тирозин). Таким образом, в каждом из описанных здесь вариантов настоящее изобретение относится к каркасной области аминокислот, которые могут быть консервативными. Другими положениями, которые могут быть, что предпочтительно, консервативными, являются следующие положения: положение 52 (кислотная аминокислота), положение 55 (основная аминокислота), положение 81 (кислотная аминокислота), положение 98 (полярная или заряженная аминокислота, в частности, Е, О, К или К).
- 11 025891
В некоторых вариантах изобретения выделенные фрагменты полипептидов ЛеЖИВ могут быть получены путем скрининга полипептидов, рекомбинантно продуцированных из соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Ас1КЛВ (например, §ЕЦ ГО №№ 3 и 4). Кроме того, фрагменты могут быть химически синтезированы методами, известными специалистам, такими как стандартный метод химического твердофазного синтеза Меррифилда с использованием ί-Мос или 1-Вое. Такие фрагменты могут быть получены (рекомбинантными методами или методами химического синтеза) и протестированы для идентификации тех пептидильных фрагментов, которые могут действовать, например, как антагонисты (ингибиторы) или агонисты (активаторы) белка Ас1КИВ или лиганда Ас1КПВ.
В некоторых вариантах изобретения функциональный вариант полипептида Ас1КИВ имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: 3, 4 и 10. В некоторых случаях функциональный вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: 3, 4 и 10.
В некоторых вариантах изобретения рассматривается получение функциональных вариантов путем модификации структуры полипептида Ас1КЛВ для таких целей, как повышение терапевтической эффективности или стабильности (например, срока хранения ех νίνο и резистентности к протеолитическому расщеплению ίη νίνο). Модифицированные полипептиды Ас1КЛВ могут быть также получены, например, путем замены, делеции или добавления аминокислот. Так, например, имеются основания предположить, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или аналогичная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой (например, консервативные мутации) не будет оказывать значительного влияния на биологическую активность полученной молекулы. Консервативными заменами являются замены, осуществляемые в пределах семейства аминокислот, которые являются родственными по их боковым цепям. Для того чтобы определить, может ли замена в аминокислотной последовательности полипептида Ас1КЛВ приводить к образованию функционального гомолога, вариант полипептида Ас1КИВ может быть легко оценен на его способность вырабатывать клеточный ответ методом, аналогичным методу определения такой способности полипептида Ас1КИВ дикого типа, либо он может быть оценен на его способность связываться с одним или несколькими лигандами, такими как активин, ΟΌΡ-11 или миостатин, методом, аналогичным методу определения такой способности полипептида дикого типа.
В некоторых конкретных вариантах изобретения рассматривается введение мутаций во внеклеточный домен (также называемый лигандсвязывающим доменом) полипептида Ас1КИВ так, чтобы такой вариант (или мутант) полипептида Ас1КИВ обладал измененной активностью связывания с лигандом (например, аффинностью связывания или специфичностью связывания). В некоторых случаях такие варианты полипептидов Ас1КИВ обладают измененной (повышенной или пониженной) аффинностью связывания с конкретным лигандом. В других случаях варианты полипептидов Ас1КИВ обладают измененной специфичностью связывания с их лигандами.
Так, например, настоящее изобретение относится к вариантам полипептидов Ас1КИВ, которые преимущественно связываются с ΟΌΡ8/ΟΌΡ11, а не с активинами. В настоящем изобретении преимущественными также являются такие полипептиды, которые обеспечивают уменьшение побочных эффектов, хотя такие селективные варианты могут оказаться менее желательными для лечения тяжелых заболеваний, при которых для достижения терапевтического эффекта может оказаться необходимым очень высокий прирост мышечной массы, и где некоторый определенный уровень побочных эффектов является допустимым. Так, например, аминокислотные остатки белка Ас1КЛВ, такие как Е39, К55, Υ60, К74, \У78. Ό80 и Р101, присутствуют в лигандсвязывающем кармане и опосредуют связывание с его лигандами, такими как активин и ΟΌΡ8. Таким образом, настоящее изобретение относится к модифицированному лигандсвязывающему домену (например, СОР8-связывающему домену) рецептора Ас1КЛВ, который содержит одну или несколько мутаций в этих аминокислотных остатках. Модифицированный лигандсвязывающий домен по сравнению с лигандсвязывающим доменом рецептора Ас1КИВ дикого типа может, но необязательно, обладать повышенной селективностью к лиганду, такому как ΟΌΡ8. Для иллюстрации можно сказать, что эти мутации повышают селективность модифицированного лигандсвязывающего домена по отношению к ΟΌΡ8, а не к активину. Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение Кз для связывания с активином к Кз для связывания с ΟΌΡ8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение 1С50 для ингибирования активина к 1С50 для ингибирования ΟΌΡ8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Такой модифицированный лигандсвязывающий домен ингибирует ΟΌΡ8, но необязательно, с ингибирующей концентрацией 1С50, которая по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз ниже ингибирующей концентрации 1С50 для ингибирования активина.
В конкретном примере положительно заряженный аминокислотный остаток Акр (Ό80) лигандсвязывающего домена Ас1КИВ может быть заменен другим аминокислотным остатком так, чтобы вари- 12 025891 ант полипептида ЛеЖИВ предпочтительно связывался с ΟΌΡ8, а не с активином. Предпочтительно остаток Ό80 заменяют аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из незаряженного аминокислотного остатка, отрицательно заряженного аминокислотного остатка и гидрофобного аминокислотного остатка. В другом конкретном примере для значительного снижения уровня связывания с активином, но сохранения способности связываться с ΟΌΡ11, гидрофобный остаток Ь79 может быть заменен кислотными аминокислотами, такими как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. Для специалистов в данной области очевидно, что большинство описанных мутаций, вариантов или модификаций может быть сделано на уровне нуклеиновых кислот или в некоторых случаях с помощью посттрансляционной модификации или химического синтеза. Такие методы хорошо известны специалистам.
В некоторых вариантах изобретения рассматриваются специфические мутации, вводимые в полипептиды ЛеЖИВ в целях изменения характера гликозилирования данного полипептида. Репрезентативные сайты гликозилирования в полипептидах ЛеЖИВ проиллюстрированы на фиг. 2. Такие мутации могут быть выбраны для введения или элиминации одного или нескольких сайтов гликозилиролвания, таких как сайты О-связанного или Ν-связанного гликозилирования. Сайты распознавания аспарагинсвязанного гликозилирования обычно содержат последовательность из трех пептидов, аспарагин-Хтреонин (где X представляет собой любую аминокислоту), которая специфически распознается соответствующими клеточными гликозилирующими ферментами. Такая модификация может быть также введена путем добавления одного или нескольких сериновых или треониновых остатков в последовательность полипептида ЛеЖИВ дикого типа либо замены на эти остатки в данной последовательности (для сайтов О-связанного гликозилирования). Различные аминокислотные замены или делеции в первом или третьем положениях или в обоих этих положениях аминокислот распознаваемого сайта гликозилирования (и/или аминокислотная делеция во втором положении) приводят к предотвращению гликозилирования в модифицированной последовательности из трех пептидов. Другим методом увеличения числа углеводных молекул в полипептиде Ас1КПВ является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду ЛсЖИВ. В зависимости от применяемого метода присоединения сахар (сахара) может (могут) быть присоединен(ы) к (а) аргинину и гистидину; (Ь) свободным карбоксильным группам; (с) свободным сульфгидрильным группами, таким как сульфгидрильные группы цистеина; (б) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина; (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана; или (ί) к амидной группе глутамина. Эти методы описаны в \УО 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и в публикации Ар1ίη & \Уп5Юп (1981) СКС Сгй. Кеу. ВюсЬеш., рр. 259-306, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Удаление одной или нескольких углеводных групп, присутствующих на полипептиде АсЕКПВ, может быть осуществлено химически и/или ферментативно. Химическое дегликозилирование может включать, например, обработку полипептида АсЖЛВ соединением трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентным соединением. Такая обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением линкерного сахара (Ν-ацетилглюкозамина или Ν-ацетилгалактозамина), при этом аминокислотная последовательность остается интактной. Химическое дегликозилирование более подробно описано в публикации Накшиббш е1 а1. (1987) АгсЬ. ВюсЬеш. ВюрЬук. 259:52 и Ебде е1 а1. (1981) Апа1. ВюсЬеш. 118:131. Ферментативное расщепление углеводных групп на полипептидах Ас1КПВ может быть достигнуто с использованием различных эндо- и экзогликозидаз как описано ТЬо1акига е1 а1. (1987) Мебг Еп/ушо1. 138:350. Последовательность полипептида Ас1К11В может быть скорректирована, если это необходимо, в зависимости от типа используемой экспрессионной системы, поскольку все клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых и растений могут иметь различные типы гликозилирования, на которые может влиять аминокислотная последовательность пептида. В общих чертах, белки Ас1К11В. которые присутствуют у человека, могут быть экспрессированы в клеточных линиях млекопитающих, таких как клеточные линии НЕК293 или СНО, которые имеют свой собственный тип гликозилирования, хотя предполагается, что могут быть также использованы и другие экспрессионные клеточные линии млекопитающих.
Настоящее изобретение также относится к способу получения вариантов, в частности серий комбинаторных вариантов полипептидов АсЖИВ, включая, но необязательно, усеченные варианты; и пулов комбинаторных мутантов, которые являются особенно подходящими для идентификации функциональных вариантов последовательности. Целью скрининга таких комбинаторых библиотек может быть, например, получение вариантов полипептида АсЖИВ, обладающих измененными свойствами, такими как измененные фармакокинетические свойства или измененный характер связывания с лигандом. Ниже описаны различные скрининг-анализы, и такие анализы могут быть проведены для оценки вариантов. Так, например, вариант полипептида Ас1.К11В может быть скринирован на его способность связываться с полипептидом АсЖЛВ и на предотвращение связывания лиганда Ас1К11В с полипептидом Ас1КПВ.
Активность полипептида АсЖИВ или его вариантов может быть также протестирована в клеточном анализе или в анализе ίη νίνο. Так, например, может быть оценено влияние варианта полипептида Ас1КПВ на экспрессию генов, участвующих в формировании кости и в образовании остеобластов или их предшественников. При необходимости, это может быть осуществлено в присутствии одного или нескольких рекомбинантных белков-лигандов АсЖЛВ (например, ВМР7), а клетки могут быть трансфици- 13 025891 рованы так, чтобы они продуцировали полипептид АсЖНВ и/или его варианты, и, необязательно, лиганд АсЖПВ. Аналогичным образом, полипептид ΛαίΒΙΙΒ может быть введен мышам или другим животным, а затем могут быть оценены одно или несколько свойств кости, таких как плотность или объем. Может быть также оценена скорость срастания костей после их перелома. Аналогичным образом, активность полипептида АсЖНВ или его вариантов может быть протестирована в клетках мышц, в адипоцитах и в нервных клетках на любое ее влияние на рост этих клеток, например, с помощью анализов, описанных ниже. Такие анализы являются хорошо известными и могут быть осуществлены рутинными методами. Для мониторинга влияния на последующую передачу сигнала в таких клеточных линиях может быть использован δΜΆΌ-чувствительный ген-репортер.
Могут быть получены комбинаторные варианты, которые по сравнению с природным полипептидом АсЖНВ обладают селективной способностью. Такие варианты белков при их экспрессии из рекомбинантных ДНК-конструкций могут быть использованы в протоколах генотерапии. Аналогичным образом, путем мутагенеза могут быть получены варианты, которые имеют внутриклеточное время полужизни, значительно отличающееся от времени полужизни соответствующего полипептида АсЖНВ дикого типа. Так, например, модифицированный белок может сообщать нативному полипептиду АсЖНВ большую или меньшую стабильность к протеолитическому расщеплению или к другим процессам, которые приводят к деструкции или к какой-либо другой инактивации нативного полипептида АсЖЛВ. Такие варианты и кодирующие их гены могут быть использованы в целях изменения уровней полипептида Ас1КНВ посредством модуляции времени полужизни полипептидов АсЖПВ. Так, например, короткое время полужизни может давать более кратковременные биологические эффекты, а в случае использования части индуцибельно экспрессионной системы, оно может более жестко регулировать уровни рекомбинантных полипептидов АсЖНВ в клетках.
В некоторых вариантах изобретения полипептиды Ас1КЛВ согласно изобретению могут также содержать пострансляционные модификации, помимо любых модификаций, которые обычно присутствуют в полипептидах АсЖЛВ. Такими модификациями являются, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизация и ацилирование. В результате этого модифицированные полипептиды АсЖЛВ могут содержать неаминокислотные элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахариды и фосфаты. Влияние таких неаминокислотных элементов на функциональные свойства полипептида АсЖЛВ может быть протестировано как описано в настоящей заявке для других вариантов полипептидов АсЖНВ. Если полипептид Ас1КЛВ продуцируется в клетках путем отщепления растущей формы полипептида АсЖЛВ, то для регулирования укладки и/или функции белка важную роль может также играть посттрансляционный процессинг. Различные клетки (такие как СНО, НеЬа, МИСК, 293, ^Ι38, ΝΙΗ-3Τ3 или НЕК293) имеют конкретные клеточные механизмы и характерные механизмы такой посттрансляционной активности и могут быть выбраны для гарантии соответствующей модификации и процессинга полипептидов АсЖНВ.
В некоторых аспектах изобретения функциональными вариантами или модифицированными формами полипептидов АсЖНВ являются слитые белки, имеющие по меньшей мере часть полипептидов АсЖЛВ и один или несколько слитых доменов. Хорошо известными примерами таких слитых доменов являются, но не ограничиваются ими, полигистидин, С1и-С1и, глутатион-Мтрансфераза (Ο8Τ), тиоредоксин, белок А, О-белок, константная область тяжелой цепи иммуноглобулина (например, Рс), белок, связывающийся с мальтозой (МВР), или альбумин человеческой сыворотки. Слитый домен может быть выбран так, чтобы он сообщал нужные свойства. Так, например, некоторые слитые домены являются особенно подходящими для выделения слитых белков с помощью аффинной хроматографии. Для проведения аффинной очистки используются соответствующие матрицы для аффинной хроматографии, такие как смолы, конъюгированные с глутатионом, амилазой и никелем или кобальтом. Многие такие матрицы поставляются в виде набора, такого как система очистки РЬагташа О8Т и система О1Ае\рге55™ (ОДадеи), в которой используются партнеры по связыванию (ΗΙδ6). В другом примере слитый домен может быть выбран так, чтобы он облегчал детектирование полипептидов АсЖНВ. Примерами таких доменов для детектирования являются различные флуоресцентные белки (например, ОРР), а также эпитопные метки, обычно представляющие собой короткие пептидные последовательности, для которых имеются специфические антитела. Хорошо известными эпитопными метками, которые легко доступны для специфических моноклональных антител, являются метки РЬАО, гемаглютинин вируса гриппа (НА) и с-тус. В некоторых случаях слитые домены имеют сайт расщепления протеазой, такой как фактор Ха или тромбин, что позволяет релевантной протеазе частично расщеплять слитые белки и тем самым высвобождать из них рекомбинантные белки. Высвобождаемые белки могут быть затем выделены из слитого домена путем проведения хроматографического разделения. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения полипептид АсЖНВ присоединяют к домену, который стабилизирует полипептид АсЖНВ ίη νίνο (домен-стабилизатор). Термин стабилизация означает увеличение времени полужизни в сыворотке, независимо от того, происходит ли это вследствие снижения уровня деструкции, снижения уровня выведения из почек или других фармакокинетических эффектов. Известно, что гибриды Рс-части иммуноглобулина сообщают белкам широкого ряда желательные фармакокинетические свойства. Аналогичным образом, желательные свойства могут также сообщать гибриды с альбумином человеческой сыворотки.
- 14 025891
Слитыми доменами других типов, которые могут быть отобраны, являются мультимеризующие (например, димеризующие, тетрамеризующие) домены и функциональные домены (которые сообщают дополнительную биологическую функцию, такую как дополнительная стимуляция роста мышечной массы).
В своем конкретном примере настоящее изобретение относится к слитому белку, который используется в качестве антагониста ΟΌΡ8 и содержит внеклеточный (например, ООР8-связывающий) домен, присоединенный к Ре-домену (например, 8ЕЦ ГО N0:13).
ТНТСРРСРАРЕЬЪС6Р5УРЪЕРРКРКРТ1.М15КТРЕУТСУУУР (А)
УЗНЕОРЕУКЕЫИУУОСУЕУНбАКТКРКЕЕОУРЗТУКУУЗУЬТУЬНОРИЬККЗКЕУКСК (А)
УЗЫКАЬРУР1ЕКТ13КАКСОРКЕРОУ¥ТЪРРЗКЕЕМТК№У5ЪТСЬУКСЕУРЗО1АУЕИЕЗМС ОРЕЫЫУКТТРРУЬОЗОСРЕЕЬУЗКЕТУОКЗРИСОбЫУЕЗСЗУМНЕАЬНН (А)
НУТСКЗЬЗЬЗРСК*
Рс-домен предпочтительно имеет одну или несколько мутаций в таких остатках, как Азр-265, Ьуз322 и Азп-434. В некоторых случаях мутантный Рс-домен, имеющий одну или несколько таких мутаций (например, мутацию в Азр-265), обладает пониженной способностью связываться с Рсу-рецептором по сравнению с Рс-доменом дикого типа. В других случаях мутантный Рс-домен, имеющий одну или несколько таких мутаций (например, мутацию в Азп-434), по сравнению с Рс-доменом дикого типа обладает повышенной способностью связываться с Рс-рецептором, родственным МНС класса I (РсРЦ).
Следует отметить, что различные элементы слитых белков могут быть расположены в любом порядке, который позволяет сохранять их желательные функции. Так, например, полипептид АсЖЛВ может быть расположен у С-конца по отношению к гетерологичному домену, либо, альтернативно, гетерологичный домен может быть расположен у С-конца по отношению к полипептиду Ас1Р11В. Домен полипептида АсЖЛВ и гетерологичный домен необязательно должны находиться рядом друг с другом в слитом белке, а дополнительные домены или аминокислотные последовательности могут быть включены со стороны С- или Ν-концов по отношению к любому домену или между этими доменами.
В некоторых вариантах изобретения полипептиды АсЖЛВ согласно изобретению содержат одну или несколько модификаций, обладающих способностью стабилизировать полипептиды АсЖНВ.
Так, например, такие модификации увеличивают время полужизни полипептидов АйРПВ ίη νίίτο, увеличивают время полужизни полипептидов АсЖНВ в кровотоке или снижают уровень протеолитического расщепления полипептидов АсЖЛВ. Такими стабилизирующими модификациями являются, но не ограничиваются ими, слитые белки (включая, например, слитые белки, содержащие полипептид АсЖНВ и домен-стабилизатор), модификации сайта гликозилирования (включая, например, присоединение сайта гликозилирования к полипептиду АсЖНВ) и модификации углеводной молекулы (включая, например, удаление углеводных групп из полипептида АсЖНВ). В случае слитых белков полипептид Ас1Р11В присоединяют к домену-стабилизатору, такому как молекула 1дО (например, Рс-домену). Используемый здесь термин домен-стабилизатор означает не только слитый домен (например, Рс), как в случае слитых белков, но также включает небелковые модификации, такие как углеводная молекула или небелковый полимер, такой как полиэтиленгликоль.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к получению подходящих выделенных и/или очищенных форм полипептидов АйРПВ, которые были отделены или как-либо иначе очищены от других белков.
В некоторых вариантах изобретения полипептиды АсЖЛВ (немодифицированные или модифицированные) согласно изобретению могут быть получены различными методами, известными специалистам. Так, например, такие полипептиды АсЖЛВ могут быть синтезированы стандартными методами химического синтеза белков, такими как методы, описанные в публикациях Вобапзку, М. Ртшщркз οί Рерббе 8уЩйс515. §рттдег Усг1ад. Вегйп (1993) и Стай О. А. (еб.), 8уйбебс Рерббез: А Изет'з Ошбе, Н. Ргеетап & Сотрапу, №ν Уогк (1992). Кроме того, автоматические синтезаторы пептидов являются коммерчески доступными (например, Абνаηсеб СНетТесй Мобе1 396; МННдеп/Вюхеагсй 9600). Альтернативно, полипептиды Ас1РПВ, их фрагменты или варианты могут быть рекомбинантно продуцированы с использованием различных экспрессионных систем (например, Е.соб, клеток яичника китайского хомячка, клеток СО8, бакуловируса), хорошо известных специалистам (также см. ниже). В другом варианте изобретения модифицированные или немодифицированные полипептиды Ас1Р11В могут быть получены путем гидролиза природных или рекомбинантно продуцированных полноразмерных полипептидов Ас1РПВ с использованием, например, протеазы, например трипсина, термолизина, химотрипсина, пепсина или комплексного фермента, конвертирующего основную аминокислоту (РАСЕ). Для идентификации сайтов протеолитического расщепления может быть проведен компьютерный анализ (с использованием коммерчески доступной программы, например, МасУесЮг Отеда, РСОепе, Мо1еси1аг §1ти1абоп, 1пс.). Альтернативно, такие полипептиды Ас1Р11В могут быть получены из природных или рекомбинантно продуцированных полноразмерных полипептидов АйРПВ известными стандартными методами, такими как метод химического расщепления (например, бромцианом, гидроксиламином).
3. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды Ас1РНВ.
- 15 025891
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим любой из полипептидов АсЖПВ (например, растворимые полипептиды АсЖПВ), включая любые описанные здесь варианты. Так, например, §ЕЦ ГО N0:4 кодирует природный полипептид-предшественник АсЖПВ, а 8ЕЦ ГО N0:3 кодирует растворимый полипептид АсЖЛВ. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Такими нуклеиновыми кислотами могут быть молекулы ДНК или РНК. Указанные нуклеиновые кислоты могут быть использованы, например, в методах получения полипептидов АсЖПВ или в качестве самих терапевтических средств (например, в методе генотерапии).
Из некоторых аспектов изобретения также очевидно, что рассматриваемые нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды АсЖПВ, включают нуклеиновые кислоты, которые являются вариантами 8Е0 ГО N0:3. Вариантами нуклеотидных последовательностей являются последовательности, которые отличаются одной или несколькими нуклеотидными заменами, добавлениями или делециями, такие как аллельные варианты, а поэтому такими последовательностями являются кодирующие последовательности, которые отличаются от нуклеотидной кодирующей последовательности, представленной в §ЕЦ ГО N0:4.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным последовательностям нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичны §ЕЦ ГО N0:3. Для среднего специалиста в данной области совершенно очевидно, что последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарные §ЕЦ ГО N0:3, и варианты §ЕЦ ГО N0:3 также входят в объем настоящего изобретения. В других вариантах изобретения последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть выделенными, рекомбинантными и/или присоединенными к гетерологичной нуклеотидной последовательности, либо они могут присутствовать в библиотеке ДНК.
В других вариантах изобретения нуклеиновыми кислотами согласно изобретению также являются нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, представленной в §ЕЦ ГО N0:3, с комплементарной последовательностью 8Е0 ГО N0:3 или с их фрагментами. Как обсуждалось выше, для среднего специалиста в данной области совершенно очевидно, что соответствующие условия жесткости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, могут варьироваться. Так, например, может быть осуществлена гибридизация в присутствии 6,0ххлорида натрия/цитрата натрия (§§С) примерно при 45°С с последующей промывкой 2,0х§§С при 50°С. Так, например, концентрация соли на стадии промывки может быть выбрана из интервала концентраций, соответствующих условиям низкой жесткости примерно при 2,0х§§С при 50°С, и концентраций, соответствующих условиям высокой жесткости примерно при 0,2х§§С при 50°С. Кроме того, температура в стадии промывки может быть увеличена, начиная от комнатной температуры, соответствующей условиям низкой жесткости примерно 22°С, до температуры, соответствующей условиям высокой жесткости примерно 65°С. Температура и концентрация соли могут варьироваться, при этом один из параметров может оставаться постоянным, например температура или концентрация соли, а другой параметр может изменяться. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в условиях низкой жесткости при 6х§§С и при комнатной температуре с последующей промывкой 2х§§С при комнатной температуре.
Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, представленных в 8Е0 ГО N0:3, вырожденностью генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Так, например, ряд аминокислот кодируется более чем одним триплетом. Кодоны, которые соответствуют одной и той же аминокислоте, или синонимичные кодоны (например, САИ и САС являются синонимичными кодонами для гистидина) могут давать молчащие мутации, которые не влияют на аминокислотную последовательность белка. Однако предполагается, что в клетках млекопитающих имеется полиморфизм последовательностей ДНК, который приводит к изменениям в аминокислотных последовательностях рассматриваемых белков. Для специалистов в данной области очевидно, что такие изменения в одном или нескольких нуклеотидах (примерно до 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, могут присутствовать у индивидуумов данного вида вследствие природной аллельной вариабельности. Любые и все указанные нуклеотидные модификации и полиморфизмы аминокислот входят в объем настоящего изобретения.
В некоторых вариантах изобретения рекомбинантные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть функционально присоединены к одной или нескольким регуляторным нуклеотидным последовательностям в экспрессионной конструкции. Регуляторные нуклеотидные последовательности обычно присутствуют в клетке-хозяине, используемой для экспрессии. Специалистам известно много типов соответствующих экспрессионных векторов и подходящих регуляторных последовательностей для различных клеток-хозяев. Обычно указанными одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями могут быть, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания с рибосомой, последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции и последова- 16 025891 тельности энхансеров или активаторов. В настоящем изобретении рассматриваются конститутивные или индуцибельные промоторы, известные специалистам. Промоторами могут быть природные промоторы или слитые промоторы, которые объединяют элементы, содержащие более чем один промотор. Экспрессионная конструкция может присутствовать в клетке на эписоме, такой как плазмида, либо такая экспрессионная конструкция может быть встроена в хромосому. В предпочтительном варианте изобретения экспрессионный вектор содержит селективный маркерный ген, что позволяет осуществлять отбор трансформированных клеток-хозяев. Селективные маркерные гены хорошо известны специалистам и могут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к рассматриваемой нуклеиновой кислоте, присутствующей в экспрессионном векторе, включающем нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ΑίΚΙΙΒ и функционально присоединенную по меньшей мере к одной регуляторной последовательности. Регуляторные последовательности известны специалистам и могут быть выбраны так, чтобы они позволяли осуществлять прямую экспрессию полипептида ΑсίΚIIΒ. В соответствии с этим термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии. Репрезентативные регуляторные последовательности описаны в публикации Соеййе1; Сеие ΕχρίΌδδίοη ТесЬио1оду: Мейойк ίη БихутоЕду, Шайепис Ргекк, δαη П1едо, СΑ (1990). Так, например, любая из последовательностей регуляции экспрессии широкого ряда, регулирующих экспрессию последовательности ДНК, при ее функциональном присоединении к данной последовательности, может быть использована в данных векторах для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид ΑсίΚΠΒ. Такими подходящими последовательностями регуляции экспрессии являются, например, ранний и поздний промотор δν40, промотор ίβί, предранний промотор аденовируса или цитомегаловируса, промоторы Κδν, система 1ас, система 1гр, система ТАС или ТОС, промотор Т7, экспрессия которого регулируется РНК-полимеразой Т7, главные операторные и промоторные области фага лямбда, регуляторные области оболочечного белка £й, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислотной фосфатазы, например Р1ю5, промоторы дрожжевых факторов скрещивания α, полиэдроновый промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, которые, как известно, регулируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов и различные их комбинации. Следует отметить, что конструирование экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина и/или типа белка, предназначенного для экспрессии. Кроме того, необходимо также учитывать число копий векторов, способность регулировать число таких копий и уровень экспрессии любого другого белка, кодируемого вектором, такого как антибиотики-маркеры.
Рекомбинантная нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть продуцирована путем лигирования клонируемого гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии в любых прокариотических клетках, эукариотических клетках (дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих) или в обеих этих клетках. Экспрессионными носителями для продуцирования рекомбинантного полипептида ШίΚΙΙΒ являются плазмиды и другие векторы. Так, например, подходящими векторами являются плазмиды следующих типов: плазмиды, происходящие от ρΒΚ322; плазмиды, происходящие от ρΕΜΒΕ; плазмиды, происходящие от рЕХ; плазмиды, происходящие от рВТас; и плазмиды, происходящие от рИС, которые могут быть использованы для экспрессии в прокариотических клетках, таких как В.соН.
Некоторые экспрессионные векторы млекопитающих содержат прокариотические последовательности, облегчающие размножение векторов в бактериях, и одну или несколько эукариотических транскрипционных единиц, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Примерами экспрессионных векторов млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток, являются векторы, происходящие от рсОХМ/атр, рсОиМ/иео, ρΚ^Μν, ρδV2дρ1, ρδV2ηеο, ρδν2-ά1ιΙϊ, рТк2, рЕ^иео, ρΜδΠ ρδνΤ7, рко-иео и рНуд. Для облегчения репликации и отбора на резистентность к лекарственному средству в прокариотических и эукариотических клетках некоторые из этих векторов модифицируют последовательностями, происходящими от бактериальных плазмид, таких как ρΒΚ322. Альтернативно, для временной экспрессии белков в эукариотических клетках могут быть использованы производные вирусов, таких как вирус бычьей папилломы (ΒΡν-1) или вирус Эпштейна-Барра (ρНВΒο, ρΚΕΡпроизводное и р205). Примеры других вирусных экспрессионных систем (включая ретровирусные системы) можно найти ниже в разделе Системы доставки методами генотерапии. Различные методы, применяемые для получения плазмид и трансформации организмов-хозяев, хорошо известны специалистам. Описание других подходящих экспрессионных систем для прокариотических и эукариотических клеток, а также описание общих процедур рекомбинации можно найти в руководстве Мо1еси1аг С1отид Α ЬаЬогайгу Маииа1, 2ηά Εά., ей. δатЬ^οοк, Ргйксй & Матайк (Со1й δρτί^ НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге88, 1989) Οιαρ1ег8 16 апй 17. В некоторых случаях может оказаться желательным экспрессировать рекомбинантные полипептиды с использованием бакуловирусной экспрессионной системы. Примерами таких бакуловирусных экспрессионных систем являются векторы, происходящие от ρΛΕ (такие как ρνΕ1392, ρνΕ1393 и ρνΕ941), векторы, происходящие от ρΑ^ν (такие как ρΑ^ν1), и векторы, происходящие от ρΒ1иеΒас (такие как в-да1-содержащий вектор ρΒ1иеΒас ΙΙΙ).
- 17 025891
В предпочтительном варианте изобретения для продуцирования рассматриваемых полипептидов Лс1КПВ в клетках СНО могут быть сконструированы такие векторы, как вектор Рсту-8спр1 (81га1адеие, Ьа 1о11а, СаПГ.), векторы рс^NА4 (1п\кгодеп, СагкЬак, СаНГ.) и векторы рС1-пео (Рготеда, МаФвои, \Уке). Следует отметить, что рассматриваемые генные конструкции могут быть использованы для индуцирования экспрессии рассматриваемых полипептидов Ас£КПВ в клетках, размножаемых в культуре, например для продуцирования белков, включая слитые белки или варианты белков, и для их очистки.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансфицированной рекомбинантным геном, включая последовательность (например, 8ЕЦ ГО N0:4), кодирующую один или несколько рассматриваемых полипептидов Ас!К11В. Клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Так, например, полипептид АсЖИВ согласно изобретению может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как Е.соП, клетки насекомых (например, с использованием бакуловирусной экспрессионной системы), клетки дрожжей или клетки млекопитающих. Специалистам известны и другие подходящие клетки-хозяева.
В соответствии с этим настоящее изобретение также относится к способам продуцирования рассматриваемых полипептидов Ас£КПВ. Так, например, клетки-хозяева, трансфицированные экспрессионным вектором, кодирующим полипептид Ас£КПВ, могут быть культивированы в условиях, подходящих для экспрессии полипептида Ас£КПВ. Полипептид Ас£КПВ может быть секретирован и выделен из смеси клеток и среды, содержащей полипептид Ас£КПВ. Альтернативно, полипептид Ас£КПВ может сохраняться в цитоплазме или в мембранной фракции, после чего клетки собирают, подвергают лизису и выделяют белок. Клеточная культура включает клетки-хозяева, среду и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток хорошо известны специалистам. Рассматриваемые полипептиды АсЖНВ могут быть выделены из среды для культивирования клеток, клеток-хозяев или того и другого известными методами, применяемыми для очистки белков, включая ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, ультрафильтрацию, электрофорез и иммуноаффинную очистку с использованием антител, специфичных к конкретным эпитопам полипептидов Ас£КПВ. В предпочтительном варианте изобретения полипептидом Ас£КЛВ является слитый белок, содержащий домен, который облегчает его очистку.
В другом варианте изобретения слитый ген, кодирующий лидерную последовательность для очистки, такую как последовательность сайта расщепления поли-(Н18)/энтерокиназой, расположенную у N конца нужной части рекомбинантного полипептида Ас£КПВ, может обеспечивать очистку экспрессируемого слитого белка с помощью аффинной хроматографии, проводимой с использованием смолы, связанной с металлом №2+. Для очистки лидерная последовательность может быть затем удалена путем обработки энтерокиназой с получением очищенного полипептида АсЖНВ (например, см. Ноский е1 а1., (1987) 1. Скгота!одгарку 411:177 и 1апкиеск! е! а1., РNА8 И8А 88:8972).
Методы получения слитых генов хорошо известны специалистам. По существу, присоединение различных ДНК-фрагментов, кодирующих различные полипептидные последовательности, осуществляют в соответствии со стандартными методами с применением затупленных концов или липких концов со ступенчатыми разрывами для лигирования; гидролиза рестриктирующими ферментами для образования соответствующих концов; достраивания липких концов, если это необходимо; обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного присоединения, и ферментативного лигирования. В другом варианте изобретения слитый ген может быть синтезирован стандартными методами, включая использование автоматизированных синтезаторов ДНК. Альтернативно, ПЦР-амплификация генных фрагментов может быть осуществлена с использованием заякоривающих праймеров, которые образуют комплементарные выступающие концы между двумя расположенными друг за другом генными фрагментами, которые затем могут быть подвергнуты отжигу с получением химерной генной последовательности (см., например, Сиггеи! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, еФ. Аи8иЬе1 е! а1., 1оки Укеу & 8оив: 1992).
4. Антитела.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителам. Антитело, которое специфически реагирует с полипептидом АсЖЛВ (например, с растворимым полипептидом АсЖЛВ) и которое конкурентно связывается с полипептидом АсЖНВ, может быть использовано в качестве антагониста активности полипептида АсЖЛВ. Так, например, с использованием иммуногенов, происходящих от полипептида АсЖИВ, могут быть получены антисыворотка или моноклональные антитела против белков/пептидов в соответствии со стандартными протоколами (см., например, АикЬоФев: А ЬаЬога!огу Маииа1 ек. Наг1оте & Ьаие (Со1к 8ргш§ НагЬог Рге88: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомячок или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой полипептида Ас£КПВ, антигенным фрагментом, обладающим способностью вырабатывать ответ типа продуцирования антител, или слитым белком. Методы сообщения иммуногенности белку или пептиду включают конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные специалистам. Иммуногенная часть полипептида АсЖЛВ может быть введена в присутствии адъюванта. Мониторинг процесса иммунизации может быть проведен путем детектирования титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут быть проведены стандартный ЕЫ8А или другие иммуноанализы с использованием иммуногена в качестве антигена.
- 18 025891
После иммунизации животного антигенным препаратом полипептида АсЖИВ может быть получена антисыворотка, и если это необходимо, из такой сыворотки могут быть выделены поликлональные антитела. Для продуцирования моноклональных антител у иммунизованного животного могут быть собраны антитело-продуцирующие клетки (лимфоциты), а затем в соответствии со стандартными процедурами слияния соматических клеток эти клетки могут быть подвергнуты слиянию с иммортализованными клетками, такими как клетки миеломы, в результате чего могут быть получены гибридомные клетки. Такие методы хорошо известны специалистам и включают, например, гибридомный метод (впервые разработанный КоЫег и МП51е1п, (1975) Шине, 256: 495-497), гибридомный метод с использованием человеческих В-клеток (Ко/Ъаг е1 а1., (1983) 1штипо1оду Тойау, 4: 72), и ЕВУ-гибридомный метод для продуцирования человеческих моноклональных антител (Со1е е1 а1., (1985) Мопос1опа1 АпйЬоШек апй Сапсег Ткегару, А1ап К. Ыкк, 1пс. рр. 77-96). Гибридомные клетки могут быть скринированы иммунохимическим методом на продуцирование антител, специфически реагирующих с полипептидом АсЖЛВ, и моноклональных антител, выделенных из культуры, содержащей такие гибридомные клетки.
Используемый здесь термин антитело включает фрагменты антитела, которые также специфически реагируют с рассматриваемым полипептидом Ас1КНВ. Антитела могут быть фрагментированы стандартными методами, и полученные фрагменты могут быть скринированы на возможность их использования в описанных выше способах, применяемых для целых антител. Так, например, Р (аЪ')2-фрагменты могут быть получены путем обработки антитела пепсином. Так, например, Р(аЪ')2-фрагмент может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков в целях продуцирования РаЪ-фрагментов. Термин антитело согласно изобретению также включает биспецифические, одноцепочечные, химерные и гуманизированные молекулы, обладающие аффинностью по отношению к полипептиду Ас1К11В, сообщаемой по меньшей мере одной областью СОК данного антитела. В предпочтительных вариантах изобретения указанное антитело также содержит присоединенную к нему метку, которая может быть детектирована (например, такой меткой может быть радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент и кофактор фермента).
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения антителом согласно изобретению является моноклональное антитело, а в некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способу разработки подходящих методов получения новых антител. Так, например, метод получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с полипептидом Ас£КИВ, может включать введение мышам иммуногенной композиции, содержащей полипептид АсЖЛВ, в количестве, эффективном для стимуляции детектируемого иммунного ответа; получение антитело-продуцирующих клеток (например, клеток селезенки) у этих мышей; слияние указанных антитело-продуцирующих клеток с миеломными клетками для получения антитело-продуцирующих гибридом и тестирование антителопродуцирующих гибридом для идентификации гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом АсЖЛВ. Гибридома после ее получения может быть размножена в клеточной культуре, необязательно в условиях культивирования, при которых гибридомные клетки продуцируют моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом Ас£КЛВ. Моноклональное антитело может быть выделено из клеточной культуры.
Используемое здесь определение специфически реагирующий с если оно относится к антителу, означает, как в общих чертах известно специалистам, что данное антитело является достаточно селективным по отношению к представляющему интерес антигену (например, к полипептиду Ас£КИВ), но не к другим не представляющим интерес антигенам, и что данное антитело может быть использовано как минимум для детектирования присутствия представляющего интерес антигена в биологическом образце конкретного типа. В некоторых способах, в которых используется данное антитело, таких как терапевтические методы, может оказаться желательной более высокая степень специфичности связывания. Моноклональные антитела обычно имеют более высокую тенденцию (по сравнению с поликлональными антителами) к эффективному распознаванию нужных антигенов, но не перекрестно реагирующих полипептидов. Одним из факторов, который влияет на специфичность взаимодействия антитело:антиген, является аффинность антитела к антигену. Хотя нужная специфичность может достигаться в интервале различных аффинностей, однако в основном предпочтительные антитела должны обладать аффинностью (должны иметь константу диссоциации), составляющей примерно 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или менее.
Кроме того, выбор методов, используемых для скрининга антител в целях идентификации нужного антитела, может зависеть от свойств полученного антитела. Так, например, если антитело используется для связывания с антигеном в растворе, то может оказаться желательным проведение теста на связывание в растворе. Для тестирования взаимодействия между антителами и антигенами в целях идентификации особенно подходящих антител применяется ряд различных методов. Такими методами являются ЕЬ1§А, анализы на связывание методом поверхностного плазмонного резонанса (например, анализ на связывание В1асоте, В1а-соге АВ, иррка1а, 8\уейеп), сэндвич-анализы (например, система парамагнитных сфер IΟЕN 1п1егпа1юпа1, 1пс., ОайЬеткЪигд, Магу1апй), вестерн-блот-анализы, анализы методом иммунопреципитации и иммуногистохимический анализ.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с растворимым полипептидом АсЖНВ. Такие антитела могут быть получены в основном, как описано
- 19 025891 выше, с использованием растворимого полипептида АсЕКЛВ или его фрагмента в качестве антигена. Антитела этого типа могут быть использованы, например, для детектирования полипептидов АсЕКЛВ в биологических образцах и/или для мониторинга уровней растворимых полипептидов Ас1КИВ у индивидуума. В некоторых случаях антитело, которое специфически связывается с растворимым полипептидом АсЕКПВ, может быть использовано для модуляции активности полипептида Ас1КИВ и/или лиганда АсЕКЛВ и, тем самым, регуляции (стимуляции или ингибирования) роста тканей, таких как ткани костей, хрящей и мышц; жировые ткани и нервные ткани.
5. Скрининг-анализы.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к применению рассматриваемых полипептидов АсЕКЛВ (например, растворимых полипептидов АсЕКЛВ) для идентификации соединений (агентов), которые являются агонистами или антагонистами полипептидов АсЕКЛВ. Соединения, идентифицированные с помощью такого скрининга, могут быть протестированы в таких тканях, как ткани костей, хрящей и мышц; жировые ткани и/или нервные ткани, для оценки способности этих соединений модулировать рост ткани ίη νίίτο. Данные соединения могут быть также, но необязательно, протестированы на животных-моделях для оценки способности этих соединений модулировать рост ткани ίη νίνο.
Существует множество методов скрининга терапевтических средств, модулирующих рост ткани, путем нацеливания на полипептиды АсЕКЛВ. В некоторых вариантах изобретения может быть осуществлен крупномасштабный скрининг соединений для идентификации агентов, которые устраняют влияние АсЕКЛВ-опосредуемых эффектов на рост кости, хряща, мышц, жировой ткани и/или нейронов. В некоторых вариантах изобретения осуществляют анализ для скрининга и идентификации соединений, которые специфически ингибируют или подавляют связывание полипептида АсЕКЛВ с его партнером по связыванию, таким как лиганд АсЕКЛВ (например, активин, Νοάαΐ, СЭР8, СЭР11 или ВМР7).
Альтернативно, может быть осуществлен анализ для идентификации соединений, которые повышают уровень связывания полипептида АсЕКЛВ с белком-партнером по связыванию, таким как лиганд АсЕКЛВ. В другом варианте изобретения такие соединения могут быть идентифицированы на их способность взаимодействовать с полипептидом АсЕКЛВ.
Существует достаточное число форматов анализов, которые точно не описаны в настоящем изобретении, но тем не менее они известны среднему специалисту в данной области. Как описано в настоящей заявке, тестируемые соединения (агенты) согласно изобретению могут быть получены любым комбинаторным химическим методам. Альтернативно, рассматриваемые соединения могут быть ίη νίνο или ίη уйго синтезированы естественным образом как биомолекулы. Такие соединения (агенты), тестируемые на их способность действовать как модуляторы роста ткани, могут быть продуцированы, например, бактериями, дрожжами, растениями или другими организмами (например, природные продукты), химическими методами (например, в виде небольших молекул, включая пептидомиметики) или рекомбинантными методами. Тестируемыми соединениями, рассматриваемыми в настоящей заявке, являются непептидильные органические молекулы, пептиды, полипептиды, пептидомиметики, сахара, гормоны и молекулы нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте изобретения тестируемым агентом является небольшая органическая молекула, молекулярная масса которой составляет примерно менее чем 2000 Да.
Тестируемые соединения согласно изобретению могут быть получены в виде одной дискретной молекулы или в виде более сложных библиотек, таких как библиотеки, полученные химическим комбинаторным методом. Такие библиотеки могут включать, например, спирты, алкилгалогениды, амины, амиды, сложные эфиры, альдегиды, простые эфиры и органические соединения других классов. Тестируемые соединения могут быть презентированы тест-системе в выделенной форме или в виде смеси соединений, в частности, в начальных стадиях скрининга. Такие соединения могут быть, но необязательно, дериватизированы другими соединениями и могут иметь дериватизирующие группы, облегчающие выделение данных соединений. Неограничивающими примерами дериватизирующих групп являются биотин, флуоресцеин, дигоксигенин, белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра, изотопы, полигистидин, магнитные сферы, глутатион-8-трансфераза (С8Т), фотоактивируемые сшивающие агенты или любые их комбинации.
Во многих программах скрининга лекарственных средств, в которых тестируют библиотеки соединений и природных экстрактов, для максимизации числа соединений, наблюдаемых в данный период времени, может оказаться желательным проведение анализов в крупномасштабном формате. Анализы, осуществляемые в бесклеточных системах, например системах, которые могут быть модифицированы очищенными или наполовину очищенными белками, часто и предпочтительно используются в качестве предварительного скрининга, то есть такие анализы могут быть разработаны для быстрого выявления и относительно легкого детектирования модификации в молекулярной мишени, опосредуемой тестируемым соединением. Кроме того, токсическое воздействие на клетку или биологическая доступность тестируемого соединения могут, вообще говоря, не учитываться в ίη νίΙΐΌ системе, а вместо этого все внимание в этом анализе может быть сфокусировано, главным образом, на влиянии лекарственного средства на молекулярную мишень, которое может проявляться в модификации аффинности связывания полипептида АсЕКЛВ со связывающимся с ним белком (например, лигандом АсЕКЛВ).
В репрезентативном скрининг-анализе согласно изобретению, который описан здесь лишь для ил- 20 025891 люстрации, представляющее интерес соединение подвергают контактированию с выделенным и очищенным полипептидом ΑсίКIIΒ, обычно способным связываться с лигандом ΑсίКIIΒ, если это необходимо для проведения данного анализа. Затем к смеси соединения и полипептида ΑсίКIIΒ добавляют композицию, содержащую лиганд ΑсίКIIΒ. Детектирование и количественная оценка комплексов Α^ ЖПВ/лиганд Α^ΕΙΕ представляют собой методы определения эффективности соединений в ингибировании (или потенцировании) образования комплексов между полипептидом ΑсίКIIΒ и связывающимся с ним белком. Эффективность данного соединения может быть оценена путем построения кривой дозаответ на основании данных, полученных с использованием различных концентраций тестируемого соединения. Кроме того, может быть также осуществлен анализ с контролем, в котором для сравнения используется фоновый уровень. Так, например, в анализе с контролем выделенный и очищенный лиганд Αс!КIIΒ добавляют к композиции, содержащей полипептид ΑсίКIIΒ, и образование комплекса Αс!КIIΒ/лиганд ΑΛΜΕ количественно оценивают в отсутствие тестируемого соединения. При этом следует отметить, что, по существу, порядок смешивания реагентов может варьироваться, и такие реагенты могут быть смешаны одновременно. Кроме того, для разработки подходящей бесклеточной аналитической системы вместо очищенных белков могут быть использованы клеточные экстракты и лизаты.
Образование комплексов между полипептидом ΑΛ^Κ и связывающимся с ним белком может быть детектировано различными методами. Так, например, модуляция образования комплексов может быть количественно оценена с использованием, например, детектируемо меченых белков, таких как радиоактивно меченые (например, Р, δ, С или Н), флуоресцентно меченые (например, ФИТЦ) или ферментативно меченые полипептид ΑΛΜΕ или связывающийся с ним белок, с помощью иммуноанализа или хроматографического детектирования.
В некоторых вариантах настоящего изобретения рассматривается применение анализов с поляризацией флуоресценции и анализов с переносом флуоресцентной резонансной энергии (РКЕТ) для прямого или непосредственного измерения степени взаимодействия между полипептидом ΑсίКIIΒ и связывающимся с ним белком. Кроме того, во многих вариантах изобретения могут применяться и другие способы детектирования, например, с использованием оптических волноводов (публикация РСТ ГСО 96/26432 и патент США № 5677196), поверхностного плазмонного резонанса ^РК), датчиков поверхностных зарядов и датчиков поверхностного натяжения.
Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается применение анализа, проводимого посредством взаимодействия по типу захвата, также известного как анализ с использованием двухкомпонентного гибрида, который осуществляют в целях идентификации агентов, ингибирующих или потенцирующих взаимодействие между полипептидом Αс!КIIΒ и связывающимся с ним белком (см., например, патент США № 5283317; 2етуоз е! а1. (1993) Се11 72:223-232; Мабига е! а1. (1993) 1. Вю1. СЬет 268:12046-12054; Ваг!е1 е! а1. (1993) ВюЮсЬпкщез 14:920-924 и 1\уаЪис1й е! а1. (1993) Опсодепе 8:16931696). В конкретном варианте изобретения рассматривается использование обратимых двухкомпонентных слитых систем для идентификации соединений (например, небольших молекул или пептидов), которые нарушают взаимодействие между полипептидом ΑсίКIIΒ и связывающимся с ним белком (см., например, νί6;·ι1 & Ьедтат, (1999) ШсГСс Αс^бз Кез 27:919-29; νί6η1 & Ьедташ, (1999) Тгепбз Вю!есЬпо1 17:374-81 и патенты США №№ 5525490, 5955280 и 5965368.
В некоторых вариантах изобретения рассматриваемые соединения идентифицируют по их способности взаимодействовать с полипептидом ΑсίКIIΒ согласно изобретению. Взаимодействие между указанным соединением и полипептидом ΑсίКIIΒ может быть ковалентным или нековалентным. Так, например, такое взаимодействие может быть идентифицировано на уровне белка с применением биохимических методов ш У11то, включая перекрестное сшивание под действием оптически активных агентов, связывание с радиоактивно меченым лигандом и аффинную хроматографию (1акоЪу ГСВ е! а1., 1974, Ме!Ьобз ш Еп/уто1оду 46:1). В некоторых случаях соединения могут быть скринированы в анализе на основе механизма их действия, таком как анализ на соединения, которые связываются с полипептидом ΑсίКIIΒ. Таким анализом может быть твердофазный анализ на связывание или анализ на связывание в растворе. Альтернативно, ген, кодирующий полипептид ΑсίКIIΒ, вместе с репортерной системой (например, β-галактозидазой, люциферазой или белком, флуоресцирующим в зеленом диапазоне спектра), может быть трансфицирован в клетку, а затем библиотеку скринируют предпочтительно путем высокопроизводительного скрининга или с использованием отдельных членов библиотеки. Могут быть использованы и другие анализы на связывание, проводимые на основе определенного механизма, например анализы на связывание, которые позволяют детектировать изменение свободной энергии. Анализы на связывание могут быть проведены с использованием мишени, фиксированной на лунке, на сферах или на чипах, или захваченной иммобилизованным антителом, или выделенной путем капиллярного электрофореза. Связанные соединения могут быть в основном детектированы с помощью колориметрического или флуоресцентного анализа или методом поверхностного плазмонного резонанса.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам и агентам для стимуляции роста мышц и увеличения мышечной массы, например, путем подавления функций полипептида ΑсίКIIΒ и/или лиганда ΑсίКIIΒ. Поэтому любое идентифицированное соединение может быть протестировано в целых клетках или тканях, ш уЬто или ш у1уо, для подтверждения его способности модулиро- 21 025891 вать рост мышечной массы. Для осуществления этих целей могут быть применены различные методы, известные специалистам. Так, например, могут быть осуществлены такие способы согласно изобретению, которые позволяют подавлять или ингибировать передачу сигнала посредством белка Ас1К11В, активированного путем связывания с лигандом АсЖЛВ (например, СЭР8). Следует отметить, что рост мышечной ткани в организме приводит к увеличению мышечной массы в организме по сравнению с мышечной массой соответствующего организма (или популяции организмов), в котором не происходит передачи сигнала посредством белка АсЖИВ.
Так, например, влияние полипептидов АсЖИВ или тестируемых соединений на рост/пролиферацию мышечных клеток может быть определено путем измерения уровней экспрессии генов Рах-3 и Му£-5, которые ассоциированы с пролиферацией миогенных клеток, и уровней экспрессии гена МуоО, которая ассоциируется с дифференциацией мышц (например, Атбюг с) а1., Осу Вю1. 2002, 251:241-57). Известно, что СЭР8 ингибирует экспрессию генов Рах-3 и Му£-5 и предупреждает экспрессию генов МуоО. Предполагается, что полипептиды АсЖЛВ или тестируемые соединения подавляют такую активность СЭР8. Другой пример клеточных анализов включает измерение уровня пролиферации миобластов, таких как миобласты С(2)С(12) в присутствии полипептидов АсЖИВ или тестируемых соединений (например, ТЬотак е1 а1., 1 Бю1 СЬет. 2000, 275:40235-43).
В настоящем изобретении также рассматриваются анализы ίη νίνο, проводимые для измерения мышечной массы и силы. Так, например, в публикации \У1йиетоге е1 а1. (ВюсЬет ВюрЬук Кек Соттип. 2003, 300:965-71) описан метод измерения уровня увеличения массы скелетной мышцы и силы сокращения мышцы у мышей. Этот метод может быть использован, но необязательно, для определения терапевтического влияния тестируемых соединений (например, полипептидов АсЖПВ) на мышечные заболевания и патологии, например, на такие состояния, которые ассоциируются с ограничением мышечной массы.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам и агентам для модуляции (стимуляции или ингибирования) образования кости и увеличения массы кости. Поэтому любое идентифицированное соединение может быть протестировано в целых клетках или тканях ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό для подтверждения его способности модулировать рост костей или хрящей. Для этой цели могут быть применены различные методы, известные специалистам.
Так, например, влияние полипептидов АсЖПВ или тестируемых соединений на рост костей или хряща может быть определено путем измерения уровня индуцирования Мкх2 или дифференцировки преостеобластов (мезенхимных клеток) в остеобласты в клеточных анализах (см., например, Оа1шкк1 е1 а1., N1. ОепеР 2001, 27(1):84-8; Ншо е1 а1., Ртой Вюкск 2004, 9:1520-9). Другим примером клеточных анализов является анализ остеогенной активности рассматриваемых полипептидов АсЖПВ и тестируемых соединений в преостеобластах и остеобластах. Для иллюстрации следует отметить, что для инфицирования плюрипотентных мезенхимных преостеобластов С3Н10Т1/2, преостеобластов С2С12 и остеобластов ТЕ-85 были сконструированы рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие АсЖПВ. Затем определяют остеогенную активность путем измерения уровня индуцирования щелочной фосфатазы, остеокальцина и минерализации матрикса (см., например, СЬепд е1 а1., ί. Ьопе Ло1п1 Зигд. Ат. 2003, 85-А(8): 154452).
В настоящем изобретении также рассматривается анализы ίη νί\Ό, проводимые для измерения уровня роста костей или хряща. Так, например, в публикации Наткимд-МаШий е1 а1., Воне, 28:80-86 (2001) описаны крысы с моделью остеопороза, на которых проводили исследования по репарации кости через короткий период времени после перелома. В публикации КиЬо е1 а1., З1егси6 ВюсЬетхкйу & Мо1еси1аг Вю^ду, 68:197-202 (1999) также описаны крысы с моделью остеопороза, на которых проводили исследования по репарации кости через более длительный период времени после перелома. Работы, в которых приводится описание крысиной модели для исследования перелома костей при остеопорозе, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к анализам на срастание костей при переломах, известным специалистам. Такими анализами являются анализ, в котором провоцируют переломы, и гистологический и биохимический анализы, описанные, например, в патенте США № 6521750, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки и в котором описаны экспериментальные протоколы провоцирования переломов, а также измерения степени переломов и процессов их репарации.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам и агентам для регуляции увеличения массы тела и ожирения. На клеточном уровне в развитии ожирения важную роль играет пролиферация и дифференцировка адипоцитов, что приводит к образованию дополнительных жировых клеток (адипоцитов). Поэтому любое идентифицированное соединение может быть протестировано в целых клетках или тканях ίη νίίΐΌ или ίη νί\Ό для подтверждения способности этих соединений модулировать адипогенез путем измерения уровня пролиферации или дифференцировки адипоцитов. Для этой цели могут быть применены различные методы, известные специалистам. Так, например, влияние полипептида АсРКИВ (например, растворимого полипептида АйКПВ) или тестируемых соединений на адипогенез может быть определено путем измерения уровня дифференцировки преадипоцитов 3Т3-Ь1 в зрелые адипоциты в клеточных анализах, например путем наблюдения аккумуляции триацилглицерина в везикулах,
- 22 025891 окрашенных масляным красным О, и выявления некоторых маркеров адипоцитов, таких как ΡΑΒΡ (аР2/422) и ΡΡΑΚγ2 (см., например, КеиксЬ е! а1., 2000, Мο1 Се11 Βίο1. 20:1008-20; Эенд е! а1., 2000, Εηάοс^^нο1οду. 141:2370-6; Βе11 е! а1., 2000, 0Ьек Кек. 8:249-54). Другим примером клеточных анализов является анализ роли полипептидов ΑсίΚIIΒ и тестируемых соединений в пролиферации адипоцитов или клеток-предшественников адипоцитов (например, клеток 3Т3-Ь1), например, путем монитринга бромдезоксиуридин ЩМ^-позитивных клеток (см., например, Ρκο е! а1., 1998, Мο1. Се11. Β^οсЬет. 189:1-7; Маыню е! а1., 2003, Τοχκο1 8ск 75:314-20.
Следует отметить, что скрининг-анализы согласно изобретению применяются не только для рассматриваемых полипептидов ΑсίΚIIΒ и вариантов полипептидов ΑсίΚIIΒ, но также и для любых тестируемых соединений, включая агонисты и антагонисты полипептидов ΑсίΚIIΒ. Кроме того, эти скрининганализы могут быть проведены для подтверждения эффективности нужных лекарственных средств и для контроля их качества.
6. Репрезентативное терапевтическое применение.
В некоторых вариантах изобретения композиции (например, полипептидов ΑсίΚIIΒ) согласно изобретению могут быть использованы для лечения или предупреждения заболевания или состояния, которые ассоциируются с аномальной активностью полипептида ΑсίΚIIΒ и/или лиганда ΑсίΚIIΒ (например, СЭР8). Такие заболевания, расстройства или состояния называются здесь общим термином ΑсίΚIIΒассоциированные состояния. В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения заболевания у индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения указанному индивидууму терапевтически эффективного количества полипептида ΑсίΚIIΒ, описанного выше. Такие способы являются особенно подходящими для терапевтического или профилактического лечения животных, а более предпочтительно человека.
Используемый здесь термин терапевтическое соединение, которое предупреждает развитие расстройства или состояния, означает соединение, которое в статистическом образце подавляет развитие расстройства или состояния в обработанном образце по сравнению с необработанным контрольным образцом или замедляет начало развития или ослабляет тяжесть одного или нескольких симптомов такого расстройства или состояния по сравнению с необработанным контрольным образцом. Используемый здесь термин лечение включает профилактику указанного состояния, ослабление или предотвращение его развития после диагностики такого состояния.
Комплексы ΑсίΚIIΒ/лиганд ΑσίΚΠΒ играют важную роль в росте ткани, а также на ранних процессах развития, таких как регуляция образования различных структур, или в одной или нескольких постэволюционных функциях, включая развитие половой функции, продуцирование гормонов гипофиза и образование костей и хряща. Таким образом, ΑсίΚIIΒ-ассоциированными состояниями являются аномальный рост ткани и дефекты развития. Кроме того, ΑсίΚIIΒ-ассоциированными состояниями являются, но не ограничиваются ими, состояния, ассоциированные с нарушением роста и дифференцировки клеток, такие как воспаление, аллергия, аутоиммунные заболевания, инфекционные заболевания и опухоли.
Репрезентативными ΑсίΚIIΒ-ассоциированными состояниями являются нейромышечные расстройства (например, мышечная дистрофия и атрофия мышц), хроническая обструктивная болезнь легких (и гипотрофия мышц, ассоциированная с ХОБЛ), синдром гипотрофии мышц, саркопения, кахексия, расстройства, ассоциированные с отложением жира в ткани (например, ожирение), диабет типа 2 и дегенеративное заболевание кости (например, остеопороз). Другими репрезентативными ΑсίΚIIΒассоциированными состояниями являются мышечно-дегенеративные и нейромышечные расстройства, репарация ткани (например, при заживлении ран), нейродегенеративные заболевания (например, амиотрофический боковой склероз), иммунные расстройства (например, расстройства, ассоциированные с аномальной пролиферацией или функцией лимфоцитов), и ожирение или расстройства, ассоциированные с аномальной пролиферацией адипоцитов.
В некоторых вариантах изобретения композиции (например, растворимых полипептидов ΑΛΚΊΒ) согласно изобретению используются для лечения мышечной дистрофии. Термин мышечная дистрофия означает группу дегенеративных мышечных заболеваний, характеризующихся постепенным ослаблением и разрушением скелетных мышц, а иногда мышц сердца и дыхательных путей. Мышечные дистрофии представляют собой генетические заболевания, характеризующиеся прогрессирующей гипотрофией мышц и слабостью мышц, которые начинаются с микроскопических изменений в мышцах. По мере ослабления мышц в течение определенного периода времени мышечная сила у человека снижается. Репрезентативными мышечными дистрофиями, которые могут быть подвергнуты лечению по схеме, предусматривающей использование рассматриваемых полипептидов ΑсίΚIIΒ, являются мышечная дистрофия Дюшенна (МДД), мышечная дистрофия Беккера (МДБ), мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (МДЭД), мышечная дистрофия тазового и плечевого поясов (МДТПП), плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия (ППЛ или ППЛД) (также известная как болезнь Ландузи-Дежерина), миотоническая дистрофия (МТД) (также известная как болезнь Штейнерта), мышечная дистрофия глаза и носоглотки (МДГН), дистальная мышечная дистрофия (ДМД) и наследственная мышечная дистрофия (НМД).
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) впервые была описана французским неврологом Гийомом Бенджамин Аманд Дюшенном в 1860-х годах. Мышечная дистрофия Беккера (МДБ) была названа по
- 23 025891 имени немецкого врача Петера Эмиля Беккера, который впервые описал этот тип МДД в 1950-х годах. МДД является одной из наиболее часто встречающихся наследственных заболеваний у мужчин, которой страдает один из 3500 мужчин. МДД развивается в случае разрушения гена дистрофина, локализованного на коротком плече хромасомы X. Поскольку у мужчин имеется только одна копия хромосомы X, то у них присутствует только одна копия гена дистрофина. В отсутствие белка дистрофина мышца легко разрушается при прохождении циклов сокращения и релаксации. Хотя на ранней стадии заболевания мышца компенсируется посредством регенерации, однако на более поздних стадиях мышечные клеткипредшественники больше не могут претерпевать имеющееся повреждение, в результате чего здоровая мышца заменяется нефункциональной фиброжировой тканью.
МДБ возникает в результате различных мутаций в гене дистрофина. У пациентов с МДБ присутствует некоторое количество дистрофина, но либо это количество является недостаточным, либо этот дистрофин имеет недостаточную функцию. При этом следует принять во внимание тот факт, что определенное количество дистрофина так же сильно или быстро защищает мышцы пациентов с МДБ от дегенерации, как и мышцы людей с МДД.
Так, например, недавно проведенные исследования продемонстрировали, что блокирование или элиминация функции СЭР8 (лиганда ΑΛΚΙΙΒ) ίη νίνο может способствовать эффективному лечению, по меньшей мере, некоторых симптомов у пациентов с МДД и МДБ. Таким образом, рассматриваемые полипептиды ΑсίΚIIΒ могут действовать как ингибиторы СЭР8 (антагонисты) и являются альтернативными средствами, блокирующими функции СЭР8 и/или ΑсίΚIIΒ ίη νίνο у пациентов с МДД и с МДБ. Этот результат подтверждается и подкрепляется представленными здесь данными, при этом было показано, что белок ΑсίΚIIΒ-Рс способствует увеличению мышечной массы у мышей с моделью мышечной дистрофии.
Аналогичным образом, рассматриваемые полипептиды ΑсίΚIIΒ представляют собой эффективные средства, увеличивающие мышечную массу при других патологических состояниях, при которых необходимо такое увеличение. Так, например, АБС, также называемый болезнью Луи Герига (заболевание двигательных нейронов), представляет собой хроническое неизлечимое и прогрессирующее расстройство ЦНС, которое поражает двигательные нейроны, то есть компоненты ЦНС, которые соединяют головной мозг со скелетными мышцами. При АБС двигательные нейроны повреждаются и в конечном счете погибают, и хотя головной мозг человека обычно полностью сохраняет свои функции и находится в возбужденном состоянии, однако сигнал, подаваемый мышцам на сокращение, никогда не достигает цели. Большинство людей страдает АБС в возрасте от 40 до 70 лет. Сначала ослабляются те двигательные нейроны, которые воздействуют на руки или ноги. У пациентов с АБС может наблюдаться затрудненная походка, они могут ронять вещи, падать, иметь запинающуюся речь и могут предаваться неконтролируемому смеху или плачу. В конечном счете мышцы конечностей начинают атрофироваться от бездействия. Такая мышечная слабость подрывает силы человека, и он может нуждаться в инвалидной коляске либо он становится вообще неспособным вставать с постели. Большинство пациентов с АБС умирает через 3-5 лет после начала заболевания от недостаточности дыхательных путей или от осложнений, возникающих в результате искусственной вентиляции легких, подобно той, которую обычно проводят при пневмонии. Эти результаты подтверждаются и подкрепляются представленными здесь данными, при этом было показано, что белок ΑΛΚΙΙΒ-Ρά вызывает заметное увеличение мышечной массы и повышает продолжительность жизни у мышей с моделью АБС.
Увеличение мышечной массы, индуцированное полипептидом ΑсίΚIIΒ, может также давать положительный эффект при лечении пациентов, страдающих заболеваниями, ассоциированными с гипотрофией мышц. В публикации Οοηζ;·ιΚζ-ί'.’;·ιά;·ινίά е1 а1. (см. выше) сообщалось, что экспрессия ΟΌΡ8 обратно пропорционально коррелирует с безжировой массой у человека, и что повышенная экспрессия гена ΟΌΡ8 ассоциируется с потерей массы у мужчин, страдающих СПИДом с синдромом истощения. В результате ингибирования функции ΟΌΡ8 у пациентов со СПИДом, по меньшей мере, некоторые симптомы СПИДа могут ослабляться, а могут и вообще исчезнуть, что позволяет значительно повысить качество жизни пациентов со СПИДом.
Поскольку потеря функции ΟΌΡ8 (лиганда ΑΛΚΙΙΒ) также ассоциируется с потерей жира без снижения уровня поглощения питательных веществ (21ттег8 е1 а1., см. выше; МсРйеггои и Бее, см. выше), то рассматриваемые полипептиды ΑсίΚIIΒ могут быть также использованы в качестве терапевтических средств для замедления или предупреждения развития ожирения и диабета типа ΙΙ. Эти результаты подтверждаются и подкрепляются представленными здесь данными, при этом было показано, что белок Α^ ίΚΙΙΒ-Рс улучшает метаблический статус у мышей с ожирением.
Синдром анорексии-кахексии при раке является одним из наиболее неблагоприятных и опасных для жизни факторов при раке. Прогрессирующее снижение массы тела в случае синдрома анорексиикахексии при раке является основным отличительным признаком рака многих типов и приводит не только к ухудшению качества жизни и к неэффективному ответу на химиотерапию, но также и к уменьшению продолжительности жизни по сравнению с пациентами, у которых имеются такие же опухоли, но не наблюдается потеря массы тела. Кахексия, ассоциированная с анорексией, потерей жировой и мышечной ткани, психическим расстройством и снижением качества жизни, является результатом сложного взаи- 24 025891 модействия раковой опухоли с организмом хозяина. Это заболевание является одной из наиболее распространенных причин смертности пациентов, страдающих раком, которая составляет 80%. Данное заболевание представляет собой комплексное нарушение метаболизма белков, углеводов и жиров. Опухоли непосредственно и косвенно приводят к развитию патологий, которые, в свою очередь, вызывают анорексию и потерю массы. В настоящее время не существует какого-либо способа регуляции или предотвращения процессов развития опухолей. Синдром анорексии-кахексии при раке влияет на продуцирование цитокинов и на высвобождение липидмобилизующих и протеолизиндуцирующих факторов и приводит к изменению промежуточного метаболизма. Хотя анорексия является широко распространенным расстройством, однако лишь одно снижение потребления пищи не способно изменить состав веществ в организме, наблюдаемый у пациентов, страдающих раком, а увеличение потребления пищи может привести к реверсии синдрома истощения. Если у пациентов, страдающих раком, в течение шести месяцев наблюдается беспричинная потеря массы, составляющая более чем 5% от преклинической массы, то таких пациентов следует отнести к индивидуумам с подозрением на рак.
Поскольку было обнаружено, что у взрослых мышей системная сверхэкспрессия ΟΌΡ8 индуцирует значительную потерю мышечной и жировой ткани, аналогичную потери, наблюдаемой у человека с синдромами кахексии (21ттегк е! а1., см. выше), то рассматриваемые полипептиды АсЖПВ, полученные в виде фармацевтических композиций, могут быть с успехом использованы для предупреждения, лечения или ослабления симптомов, наблюдаемых при синдроме кахексии, в том случае, где желательным является рост мышечной ткани.
В других своих вариантах настоящее изобретение относится к способам индуцирования образования костей и/или хряща, предупреждения потери костной ткани, повышения уровня минерализации кости или предупреждения деминерализации кости. Так, например, рассматриваемые полипептиды АсЖПВ и соединения, идентифицированные в настоящем изобретении, могут быть применены для лечения остеопороза и сращения костей при переломах и устранения дефектов хряща у человека и других животных. Полипептиды АсЖПВ могут быть использованы для лечения пациентов, у которых субклинически была диагностирована низкая плотность кости, в качестве профилактической меры против развития остеопороза.
В одном из конкретных вариантов изобретения способы и композиции согласно изобретению могут быть применены в терапии для сращивания костей при переломах и для устранения дефектов хряща у человека и животных. Рассматриваемые способы и композиции могут также иметь профилактическое применение для сращивания костей при закрытых и открытых переломах, а также для улучшения фиксации искусственных суставов. Образование костей бе ηονο, индуцированное остеогенным агентом, способствует заживлению врожденных, вызванных травмами или онкологическими операциями черепнолицевых дефектов, а также может оказаться эффективным для применения в косметической пластической хирургии. Кроме того, способы и композиции согласно изобретению могут быть использованы для лечения периодонтоза, а также в других стоматологических операциях. В некоторых случаях рассматриваемые полипептиды АсЖПВ могут обеспечивать условия для миграции остеогенных клеток в данный участок, для стимуляции роста остеогенных клеток или для индуцирования дифференцировки предшественников остеогенных клеток. Полипептиды АсЖПВ согласно изобретению могут быть также использованы для лечения остеопороза. Кроме того, полипептиды АсЖПВ могут быть использованы для устранения дефектов хряща и предупреждения/лечения остеоартрита.
В другом своем конкретном варианте настоящее изобретение относится к терапевтическому способу и к композиции для сращивания переломов и для лечения других состояний, ассоциированных с дефектами хряща и/или костей, или периодонтоза. Настоящее изобретение также относится к терапевтическим способам и композициям для заживления ран и репарации ткани. Типами ран являются, но не ограничиваются ими, ожоги, порезы и язвы (см., например, публикацию РСТ № \У0 84/01106). Такие композиции включают терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного из полипептидов АсЖПВ согласно изобретению в смеси с фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или матрицами.
В другом конкретном варианте изобретения указанные способы и композиции согласно изобретению могут быть применены для лечения состояний, вызывающих потерю костной ткани, таких как остеопороз; гиперпаратиреоидит; болезнь Кушинга; тиротоксикоз; хроническая диарея или малабсорбция; ацидоз почечных канальцев или нервная анорексия. Многим людям известно, что женщин, которые имеют низкий вес и ведут сидячий образ жизни, можно отнести к группе с фактором риска развития остеопороза (потери минеральной плотности кости, которая увеличивает риск перелома). Однако остеопороз может быть также результатом длительного употребления некоторых лекарственных препаратов. Остеопороз, возникающий в результате употребления лекарственных средств или индуцированный другими патологическими состояниями, известен как вторичный остеопороз. При состоянии, известном как болезнь Кушинга, избыточное количество кортизола, продуцируемое организмом, приводит к развитию остеопороза и к переломам. Наиболее распространенными лекарственными препаратами, ассоциированными с развитием вторичного остеопороза, являются кортикостероиды, то есть класс лекарственных средств, которые действуют как кортизол, то есть гормон, обычно продуцируемый надпочечниками. Хо- 25 025891 тя для развития скелета необходимы адекватные уровни тиреотропных гормонов (которые продуцируются щитовидной железой), однако избыток тиреотропных гормонов может приводить к снижению костной массы в течение определенного периода времени. Антациды, содержащие алюминий, при их употреблении в высоких дозах пациентами с почечными заболеваниями, в частности пациентами, подвергаемыми диализу, могут вызывать потерю костной ткани. Другими лекарственными препаратами, которые могут вызывать вторичный остеопороз, являются фенитоин (дилантин) и барбитураты, которые используются для предупреждения эпилептических припадков; метотрексат (КЬеита1тех, 1ттипех, Ро1ех РР8), то есть лекарственное средство, применяемое для лечения некоторых форм артрита, рака и иммунных расстройств; циклоспорин (ЗапФттипе, №ога1), то есть лекарственное средство, применяемое для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и для подавления иммунной системы у пациентов с трансплантированными органами; агонисты лютеинизирующего рилизинг-фактора (Ьиргоп, 2о1абех), применяемые для лечения рака предстательной железы и эндометриоза; гепарин (кальципарин, исщаепип), то есть препарат, препятствующий свертыванию крови; и холестирамин (Циекйап) и колестипол (Со1е511б), применяемые для снижения высокого уровня холестерина. Потеря костной ткани вызывается также заболеваниями десен, поскольку болезнетворные бактерии, присутствующие в ротовой полости, провоцируют организм на вырабатывание защиты против таких бактерий. Эти бактерии продуцируют токсины и ферменты под линией десны, что приводит к развитию хронических инфекций.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способам и терапевтическим средствам, применяемым для лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с аномальным или нежелательным ростом кости. Так, например, у пациентов, страдающих заболеванием, известным как прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия (ПОФ), наблюдается аномальный рост второго скелета, который затрудняет любое движение. Кроме того, аномальный рост костей может наблюдаться после заместительной хирургии на бедрах, что приводит к ухудшению результата хирургической операции. Этот факт является наиболее типичным примером патологического роста костей и ситуации, при которой рассматриваемые способы и композиции могут давать терапевтический эффект. Те же самые способы и композиции могут быть также применены для лечения других форм аномального роста кости (например, патологического роста кости после травм, ожогов или поражения спинного мозга) и для лечения или предупреждения нежелательных состояний, ассоциированных с аномальным ростом кости, наблюдаемым в комбинации с метастазирующим раком предстательной железы или остеосаркомой. Примерами таких терапевтических средств являются, но не ограничиваются ими, полипептиды Ас1КЛВ, которые ингибируют функцию лиганда Ас1КЛВ (например, ВМР7), соединения, которые нарушают взаимодействие между Ас1КЛВ и его лигандом (например, ВМР7), и антитела, которые специфически связываются с рецептором Ас1КПВ, в результате чего лиганд Ас1КПВ (например, ВМР7) не может связываться с рецептором Ас1КПВ.
В других своих вариантах настоящее изобретение относится к композициям и к способам регуляции содержания жира в организме у животного и для лечения или предупреждения состояний, в частности опасных для жизни состояний, ассоциированных с содержанием жира в организме. В соответствии с настоящим изобретением термин регуляция (контролирование) массы тела может означать снижение или увеличение массы тела, либо снижение или увеличение скорости набора веса, либо увеличение или снижение скорости потери веса, и этот термин также включает активное поддержание массы тела или предотвращение значительного ее изменения (например, предотвращение внешних или внутренних воздействий, которые могут каким-либо образом повышать или снижать массу тела). В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к регуляции массы тела путем введения животному (например, человеку), нуждающемуся в этом, полипептида АсЖПВ.
В одном из своих конкретных вариантов настоящее изобретение относится к способам и соединениям, применяемым для снижения массы тела и/или уменьшения прироста массы тела у животного, а более конкретно, для лечения или уменьшения степени ожирения у пациентов с риском развития ожирения или у пациентов, страдающих ожирением. В другом своем конкретном варианте настоящее изобретение относится к способам и соединениям для лечения животного, у которого отсутствует способность к набору или сохранению веса (например, у животного с синдромом истощения). Такие способы являются эффективными для увеличения веса и/или массы тела, или для снижения потери веса и/или массы, или для улучшения состояний, ассоциированных с нежелательно низким весом и/или массой тела или вызываемых таким нежелательно низким весом и/или массой тела (например, у больных).
Другие расстройства, включая высокий уровень холестерина, которые могут быть подвергнуты лечению с использованием белков Ас1КЛВ, описаны в примерах.
7. Фармацевтические композиции.
В некоторых вариантах изобретения соединения (например, полипептиды Ас1КЛВ) согласно изобретению приготавливают вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Так, например, полипептид Ас1КПВ может быть введен отдельно или как компонент фармацевтической композиции (терапевтической композиции). Рассматриваемые композиции могут быть приготовлены для введения в любой форме, подходящей для ее применения в медицине или ветеринарии.
В некоторых вариантах изобретения терапевтический способ согласно изобретению включает вве- 26 025891 дение композиции местно, системно или в определенный участок в виде имплантата или медицинского приспособления. Терапевтическую композицию, вводимую в соответствии с настоящим изобретением, обычно приготавливают в апирогенной физиологически приемлемой форме. Кроме того, указанная композиция может быть, если это необходимо, инкапсулирована или инъецирована в вязкой форме для доставки в нужный участок ткани (например, в кость, хрящ, мышцу, жировую ткань или в нервную ткань), например в участок поражения ткани. Местное введение может быть подходящим для заживления ран и репарации ткани. Терапевтически эффективные средства, которые не являются полипептидами АсйКПВ и которые могут быть также, но необязательно, включены в композицию, описанную выше, альтернативно или дополнительно могут быть введены одновременно или последовательно с рассматриваемыми соединениями (например, с полипептидами АсйКИВ) в способах согласно изобретению.
В некоторых вариантах изобретения композиции согласно изобретению могут включать матрицу, способную доставлять одно или несколько терапевтических соединений (например, полипептидов АсЖИВ) в нужный участок ткани, и образовывать структуру, подходящую для развития ткани и обладающую оптимальной способностью ресорбироваться в организм. Так, например, такая матрица может обеспечивать пролонгированное высвобождение полипептидов АсЖИВ. Такие матрицы могут быть изготовлены из материалов, которые в настоящее время используются в целях приготовления других имплантируемых медицинских препаратов.
Материал для изготовления матрицы выбирают с учетом биологической совместимости, биологической разлагаемости, механических свойств, внешнего вида и межфазных свойств. Соответствующий состав препарата определяется конкретной целью применения рассматриваемых композиций. Потенциальные матрицы для данных композиций могут быть биологически разлагаемыми, и такими матрицами могут быть химические вещества, такие как сульфат кальция, трифосфат кальция, гидроксиапатит, полимолочная кислота и полиангидриды. Другие потенциальные материалы являются биологически разлагаемыми и имеют хорошо определенные биологические свойства, и такими материалами являются костный или кожный коллаген. Другие матрицы состоят из чистых белков или компонентов внеклеточного матрикса. Другие потенциальные матрицы не являются биологически разлагаемыми и имеют определенные химические свойства, и такими матрицами являются спеченный гидроксиапатит, биостекло, алюминаты или другие керамические изделия. Матрицы могут состоять из комбинаций материалов любого из вышеупомянутых типов, таких как полимолочная кислота и гидроксиапатит или коллаген и трифосфат кальция. Биокерамические изделия в композиции, такой как алюминат-фосфат кальция, могут быть модифицированы и обработаны так, чтобы они имели измененные размер пор, размер частиц, форму частиц и биологическую разлагаемость.
В некоторых вариантах изобретения композиции согласно изобретению могут быть введены перорально, например в форме капсул, каше, драже, таблеток, лекарственных лепешек (приготовленных с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и аравийской или трагакантовой камеди), порошков, гранул, или в виде раствора или суспензии в водной или безводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии масло в воде или вода в масле, или в виде эликсира или сиропа, или пастилок (приготовленных с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин, или сахароза и аравийская камедь), и/или в виде растворов для полоскания рта и т.п., содержащих предварительно определенное количество агента, используемого в качестве активного ингредиента. Агент может быть также введен в виде болюса, лекарственной кашки или пасты.
В твердых лекарственных формах для перорального введения (капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т.п.) одно или несколько терапевтических соединений согласно изобретению могут быть смешаны с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дифосфат кальция, и/или с любым из нижеследующих компонентов, таких как (1) наполнители или агенты, придающие объем, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) агенты, замедляющие растворение, такие как парафин; (6) ускорители абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающие агенты, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) замасливатели, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси, и (10) красители. В случае капсул, таблеток и драже фармацевтические композиции могут также содержать забуферивающие агенты. Твердые композиции аналогичного типа могут быть также использованы в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, приготовленных с использованием таких наполнителей, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т. п.
Жидкими лекарственными формами для перорального введения являются фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Жидкие лекарственные формы, помимо активного ингредиента, могут содержать инертные разбавители, обычно используемые специалистами, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, та- 27 025891 кие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, масло из семян хлопчатника, арахисовое масло, кукурузное масло, масло из зародышевых семян, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирной кислоты и сорбитана и их смеси. Композиции для перорального введения, помимо инертных разбавителей, могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, ароматизаторы, красители, отдушки и консерванты.
Суспензии, помимо активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакантовая камедь и их смеси.
Некоторые описанные здесь композиции могут быть введены местно, либо нанесены на кожу, либо на слизистую оболочку. Композиции для местного применения могут также включать один или несколько агентов широкого ряда, которые, как известно, являются эффективными при их использовании в качестве усилителей пенетрации через кожу или роговой слой. Примерами таких агентов являются 2пирролидон, ^метил-2-пирролидон, диметилацетамид, диметилформамид, пропиленгликоль, метиловый или изопропиловый спирт, диметилсульфоксид и азон. Для приготовления приятного на вид препарата в него могут быть также включены и другие агенты. Примерами таких агентов являются жиры, воски, масла, красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В данную композицию могут быть также включены кератолитические агенты, известные специалистам. Примерами являются салициловая кислота и сера.
Лекарственными формами для местного или чрескожного введения являются порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и, при необходимости, с консервантами, буферами или пропеллентами. Мази, пасты, кремы и гели, помимо рассматриваемого соединения согласно изобретению (например, полипептида АсЖЛВ), могут содержать наполнители, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакантовая камедь, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевая кислота, тальк и оксид цинка или их смеси.
Порошки и спреи, помимо рассматриваемого соединения, могут содержать наполнители, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидный порошок или смеси этих веществ. Спреи могут также содержать специально приготовленные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды, и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.
В некоторых вариантах изобретения фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать один или несколько полипептидов АсЖЛВ в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или безводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями или стерильными порошками, которые непосредственно перед их применением могут быть разведены с получением стерильных растворов или дисперсий для инъекций и которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты, растворенные вещества, которые сообщают данному препарату изотоничность с кровью данного реципиента, или суспендирующие агенты или загустители. Примерами подходящих водных и безводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях согласно изобретению, являются вода, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси; растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Соответствующая текучесть может поддерживаться, например, с использованием материалов для покрытий, таких как лецитин, путем сохранения нужного размера частиц в случае дисперсий и с использованием поверхностно-активных веществ.
Композиции согласно изобретению могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т. п. В данные композиции могут быть также включены изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т. п. Кроме того, пролонгированная абсорбция фармацевтической формы для инъекции может быть достигнута путем включения агентов, замедляющих абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Следует отметить, что схема введения доз может быть определена лечащим врачом с учетом различных факторов, которые изменяют действие рассматриваемых соединений согласно изобретению (например, полипептидов АсЖИВ). Различные факторы зависят от типа заболевания, подвергаемого лечению. В случае мышечных заболеваний такими факторами могут быть, но не ограничиваются ими, желаемое количество образуемой мышечной массы, мышцы, наиболее подверженные действию данного заболевания, условия, приводящие к ослаблению мышц, возраст, пол и режим питания пациента, время введения и другие клинические факторы. Доза может также определена с учетом добавления в конечную композицию других известных факторов роста. Мониторинг благоприятного эффекта лечения может
- 28 025891 быть проведен путем периодической оценки роста и/или репарации мышц, например путем измерения мышечной силы, оценки размера мышц с помощью МРИ и анализа мышц с помощью биопсии.
В некоторых вариантах изобретения один или несколько полипептидов АсЕКЛВ могут быть введены вместе (одновременно) или через различные периоды времени (последовательно или с перекрыванием). Кроме того, полипептиды АсЕКЛВ могут быть введены вместе с терапевтическими средствами других типов, например с агентом, индуцирующим рост хряща, с агентом, индуцирующим рост кости, с агентом, индуцирующим рост мышц, с агентом, снижающим уровень жира, или с агентом, индуцирующим рост нейронов. Соединения двух типов могут быть введены одновременно или через различные периоды времени. Предполагается, что полипептиды АсЕКЛВ согласно изобретению могут действовать в сочетании с другим терапевтическим средством либо, вероятно, они могут действовать синергически.
В конкретном примере изобретения описаны различные остеогенные факторы, факторы, индуцирующие рост хряща, и факторы, индуцирующие рост кости, в частности бисфосфонаты (см., например, европейские патентные заявки №№ 148155 и 169016). Так, например, другими факторами, которые могут быть объединены с рассматриваемыми полипептидами АсЕКЛВ, являются различные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕСР), тромбоцитарный фактор роста (РЭСР), трансформирующие факторы роста (ТСР-α и ТСР-β) и инсулиноподобный фактор роста (1СР).
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение также относится к генотерапии для продуцирования полипептидов АсЕКЛВ ίη νίνο. Такая терапия дает терапевтический эффект в результате введения полинуклеотидных последовательностей АсЕКЛВ в клетки или ткани, пораженные заболеваниями, перечисленными выше. Доставка полинуклеотидных последовательностей АсЕКЛВ может быть достигнута с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, такого как химерный вирус или коллоидальная дисперсионная система. Для терапевтической доставки полинуклеотидных последовательностей АсЕКЛВ предпочтительно используются липосомы, доставляемые в нужный участок.
Различными вирусными векторами, которые могут быть использованы в генотерапии, описанной в настоящей заявке, являются векторы на основе аденовируса, вируса герпеса, вируса коровьей оспы или предпочтительно РНК-вируса, такого как ретровирус. Предпочтительным ретровирусным вектором является производное мышиного или птичьего ретровируса. Примерами ретровирусных векторов, в которые может быть встроен один чужеродный ген, являются, но не ограничиваются ими, векторы на основе вируса мышиного лейкоза Молони (ΜοΜπΕν), вируса мышиной саркомы Харви (НаМи8У), вируса мышиной опухоли молочной железы (МиМТ^ и вируса саркомы Рауса (К8^. Ряд других ретровирусных векторов может включать множество генов. Все эти векторы могут переносить или включать ген селективного маркера так, что в результате этого могут быть идентифицированы и получены трансдуцированные клетки. Ретровирусные векторы могут быть сделаны мишень-специфическим путем присоединения, например, сахара, гликолипида или белка. Такую доставку предпочтительно осуществляют с использованием антитела. Специалистам в данной области очевидно, что специфические полинуклеотидные последовательности могут быть встроены в геном ретровируса или присоединены к вирусной оболочке так, чтобы обеспечивалась специфическая доставка ретровирусного вектора, содержащего полинуклеотид АсЕКЛВ, в нужную мишень. В одном из предпочтительных вариантов изобретения вектор доставляют в клетки/ткани кости, хряща, мышц или нейронов.
Альтернативно, клетки тканевой культуры могут быть непосредственно трансфицированы плазмидами, кодирующими ретровирусные структурные гены дад, ροϊ и спу, стандартными методами трансфекции фосфатом кальция. Затем эти клетки трансфицируют плазмидным вектором, содержащим представляющие интерес гены. Полученные клетки высвобождают ретровирусный вектор в культуральную среду.
Другой системой целевой доставки полинуклеотидов АсЕКЛВ является коллоидальная дисперсионная система. Коллоидальными дисперсионными системами являются макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, сферы и липидные системы, включая эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидальной системой согласно изобретению является липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные везикулы, которые могут быть использованы в качестве носителей для доставки ίη νίίΓο и ίη νίνο. РНК, ДНК и интактные вирионы могут быть инкапсулированы во внутреннюю водную среду и доставлены в клетки в биологически активной форме (см., например, Рга1су, сЕ а1., ТгснФ ВюсНст. 8сЕ, 6:77, 1981). Методы эффективного переноса генов с использованием липосомы в качестве носителя известны специалистам (см., например, Маттю, сЕ а1., ВюЕссНтдиск, 6:682, 1988). В состав липосом обычно входит комбинация фосфолипидов в основном вместе со стероидами, в частности с холестерином. Могут быть также использованы и другие фосфолипиды или липиды. Физические свойства липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов.
Примерами липидов, которые могут быть использованы для получения липосом, являются фосфатидильные соединения, такие как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды, цереброзиды и ганглиозиды. Репрезентативными фосфолипидами являются яичный фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Доставка липосом может быть также осуществлена на основе, например, специфичности к органу, к клетке и органелле, и такая доставка известна специалистам в данной области.
- 29 025891
Примеры.
В общих чертах, настоящее изобретение будет более очевидным исходя из описанных ниже примеров, которые приводятся лишь в целях иллюстрации некоторых вариантов и аспектов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Пример 1. Получение слитого белка Ас®ПВ-Рс.
Заявителями был сконструирован растворимый слитый белок АсЖПВ, который имеет внеклеточный домен человеческого АсЖПВ, присоединенный к человеческому или мышиному Рс-домену посредством расположенного между ними линкера минимального размера (из трех аминокислот глицинов). Полученные конструкции обозначены АсЖПВ-НРс и АсЖПВ-тРс соответственно.
АсЖПВ-ЬРс представлен ниже как белок, выделенный из клеточных линий СНО (8ЕЦ ГО N0:5) СКСЕАЕТКЕС1УУЫАЫИЕЬЕКТЫОЗСЕЕРСЕ<ЗЕОРККЬНСУАЗИКНЗЗСТ1Е1,УККСС ИЬРРЕНСУРАОЕСУАТЕЕЫРОУУЕСССЕЗНЕСЫЕРЕТНЬРЕАССРЕУТУЕРРРТАРТЗ СЗТНТСРРСРАРЕЬЬ06Р5УЕЬГРРКРКРТАМ15КТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКГМИУУ
РдУЕУНЦАКТКРКЕЕ0У№ТУКУУ5УЪТУТН0РИЬН6КЕУКСКУ5ЦКАЬРУР1ЕКТ15 КАКС0РЕЕР0УУТЬРР5КЕЕМТК№У5ЬТСЬУКСЕУРЗР1АУЕИЕЗЫ50РЕМНУКТТРР
УЬРЗРбЗЕЕЬУЗКЦТУРКЗКИООСКУЕЗСЗУМНЕАЬНЫНУТОКЗТЗЬЗРСК
Белки АсЖНВ-ЬРс и АсЖПВ-тРс были экспрессированы в клеточных линиях СНО. Рассматривались три различных лидерных последовательности (ί) Последовательность меллитина пчелиного меда (НВМЬ): МКГЬУМУАЬУЕМУУУ13У1УА (ЗЕС Ю N0:7) (ίί) Последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА): МРАМККСЬССУЬЬЬССАУРУЗР (ЗЕО ΙΡΝ0:8) (ίίί) Нативная последовательность: МСАААКЬАГАУРЫЗСЗЗЕА (ЗЕО 10 N0:9).
Выбранная форма имеет лидерную последовательность ТРА и нижеследующую непроцессированную аминокислотную последовательность
МРАМККСЬССУЬЬЬССАУЕУЗРОАЗСКСЕАЕТНЕСЬУУМАННЕЬЕЕТЫОЗСЬЕКСЕС Е0РККЬНСУАЗИКН536Т1ЕЬУККеСИЪРРРЫСУРК0ЕСУАТЕЕЫР0УУРСССЕСНГ 0Ν ЕЕ ЕТ НЬ РЕАЗС РЕУТ Υ Е Ρ Р РТ А РТСОеТНТСРРСРАРЕЬЬБОРЗУЕЬРРРКРКРТЬМЗ КТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКЕЫИУУРбУЕУНМАКТКРКЕЕОУНЗТУКУУЗУЬТУЬНО
РИЬЫСКЕУКСКУЗМКАЬРУР1ЕКТ13КАКООРКЕРОУУТЬРР5КЕЕМТК№УЗЬТСЬУК
ОЕУРЗРТАУЕИЕЗЫСОРЕМНУКТТРРУЬРЗРСЗРЕЬУЗКЬТУРКЗКИООСИУЕЗСЗУМ
НЕАЬНННУТОКЗЬЗЬЗРОК
Указанный полипептид кодируется нижеследующей последовательностью нуклеиновой кислоты (8ЕС) ГО N0:10):
А ТСОАТОСААТ ОААСАОАОСС СТСТОСТОТС ТССТССТССТ СТСТССАССА (ЗТСТТССТТТ сссссеосас стстссосст сосоассстс асасасссса стосатстас тасаасосса АСТСССАССТ ССАССССАСС ААССАСАССО СССТООАССС СТСССААССС САССАССАСА АСССССТССА СТССТАСССС ТССТСОСОСА АСАССТСТСС САССАТССАС СТССТСААСА АССССТССТО ОСТАСАТСАС ТТСААСТССТ АССАТАОССА ССАСТСТСТС СССАСТСАСС АОААСССССА СОТСТАСТТС ТССТССТСТС ААСОСААСТТ СТССААССАС СССТТСАСТС АТТТСССАСА СССТСССССС ССОСААСТСА ССТАССАССС АССССССАСА ССССССАССС СТССТССААС ТСАСАСАТСС ССАСОСТОСС САССАССТСА АСТССТСССС ССАССОТСАС ТСТТССТСТТ ССССССАААА СССААССАСА СССТСАТСАТ СТСССССАСС ССТСАОСТСА САТСССТССТ ССТОСАССТС аоссассаас ассстсасст саасттсаас тсстасстсс АСССССТССА ССТССАТААТ СССААСАСАА АССССССССА ССАССАСТАС ААСАССАССТ дссатотсот сдссстсстс ассстсстос ассаосастс сстсаатссс аассастаса АСТССААССТ СТССААСААА ССССТСССАС ТССССАТССА СААААССАТС ТССАААСССА ААООССАССС СССАСААССА САСОТСТАСА СССТСССССС АТССССССАС САСАТСАССА АСААССАССТ САСССТОАСС ТСССТССТСА ААСССТТСТА ТСССАСССАС АТСССССТСС АОТСССАСАС СААТСОССАС ССССАСААСА АСТАСААСАС САССССТССС СТССТССАСТ СССАССССТС СТТСТТССТС ТАТАССААСС ТСАСССТССА СААОАССАСС ТСССАССАСС
ССААССТСТТ СТСАТССТСС СТСАТССАТС АСССТСТССА СААССАСТАС АСССАСААСА ссстстссст етстсссаст ааатса ^концевое секвенирование вещества, продуцируемого клетками СНО, выявило основную последовательность - ОКОЕАЕ (8Е0 ГО N0:11). Примечательно то, что другие конструкции, описанные в литературе, начинаются с последовательности -8СК.
Очистка может быть проведена с помощью колоночной хроматографии в несколько стадий, включая, например, три или более стадий, осуществляемых в любом порядке, например, с помощью хроматографии на белке А, хроматографии на Ц-сефарозе, хроматографии на фенилсефарозе, эксклюзионной хроматографии и катионообменной хроматографии. Очистка может быть завершена с помощью вирусной фильтрации и буферного обмена.
Слитые белки Ас1К11В-Рс экспрессировали также в клетках НЕК293 и в клетках С08. Хотя материал, выделенный из всех клеточных линий, культивированных в подходящих условиях, обеспечивал при- 30 025891 сутствие белка, обладающего активностью, направленной на формирование структуры мышц ίη νίνο, однако при этом в его активности наблюдалась некоторая вариабельность, вероятно обусловленная условиями отбора и/или культивирования клеточных линий.
Пример 2. Генерирование мутантов Ас£КПВ-Рс.
Заявителями была генерирована серия мутаций внеклеточного домена Ас£КЛВ, и указанные мутантные белки были продуцированы в виде растворимых слитых белков, образованных между внеклеточным Ас£КПВ и Рс-доменом. Контрольный гибрид Ас®ПВ-Рс имеет нижеследующую последовательность (Рс-область подчеркнута) (δΕβ ΙΌ N0:12):
ЗСРОЕАЕТКЕС1УУИАЦИЕЕЕКТМОЗСЬЕКСЕСЕСРКЕЬНСУАЗНРЦ55еТ1ЕЬУККС
СМЪРРГМСУРРОЕСУАТЕЕЫРаУУЕСССЕСНГСИЕКГТНЬРЕАеЗРЕУТУЕРРРТАРТ
55аТНТСРРСРАРЕЦЬ55Р5УЕЕГРРКРКРТЬМ15КТРЕУТСУУУРУ5НЕРРЕУКЕЫМУ
УРСТЕУНЫАКТКРКЕЕОУМЗТУКУУЗУЕТУЬНОРИШбКЕУКСКУЗМКАЬРУРТЕКТ!
£КАКСаРЕЕР0УУТЬРРЗКЕЕМТКЫ2У5ЬТСЬУК2ЕУРЗР1АУЕИЕ5НС0РЕМНУКТТР
РУЪРЗРС£ЕЕ1У£КЬТУРКЗЕИ0С6МУГЗСЗУМНЕАЬНННУТ0К£ЕЗЬЗРСК
В исходный Ас£КЛВ-Рс-белок были введены различные мутации, включая Ν- и С-концевые усечения. На основании данных, представленных в примере 1, было высказано предположение, что эти конструкции, если они экспрессируются с лидерной последовательностью ТРА, не содержат Ν-концевого серина. Мутации были введены во внеклеточный домен АсЖПВ с помощью ПЦР-мутагенеза. После проведения ПЦР фрагменты очищали на колонке 01адеп, гидролизовали ферментами δίοΙ и АдеI и подвергали гель-очистке. Полученные фрагменты лигировали в экспрессионный вектор ρΑΙΌ4 (см. \У0 2006/012627) так, чтобы после лигирования образовывался химерный гибрид с человеческим ΙβΟ1. После трансформации в Е.соП ПН5-альфа колонии собирали и выделяли ДНК. В мышиных конструкциях (тРс) человеческий ΙβΟ1 заменяли мышиным Ι§Ο2α. Затем подтверждали последовательности всех мутантов.
Все мутанты продуцировали в клетках НЕК293Т путем временной трансфекции. Вкратце, во вращающийся 500-мл сосуд высевали клетки НЕК293Т при плотности 6х105 клеток/мл в среде РгееЧу1е (ΙηуПгодеп) в объеме 250 мл и культивировали в течение ночи. На следующий день эти клетки обрабатывали комплексом ДНК:ПЭИ (1:1) при конечной концентрации ДНК, составляющей 0,5 мкг/мл. Через 4 ч добавляли 250 мл среды,ии и клетки культивировали в течение 7 дней. Кондиционированную среду собирали путем центрифугирования клеток, а затем эту среду концентрировали.
Мутанты очищали различными методами, включая, например, очистку на колонке с белком А, которую элюировали глициновым буфером с низким рН (3,0). После нейтрализации мутанты диализовали против РΒδ.
Мутанты были также продуцированы в клетках СНО аналогичным методом.
Мутанты тестировали в анализах и/или в биоанализах на связывание, описанных ниже. В некоторых случаях анализы проводили с использованием кондиционированной среды, а не очищенных белков.
Пример 2. Биоанализ на передачу сигнала, опосредуемую ОПР-11 и активином.
Анализ с использованием репортерного гена А-204 проводили для оценки влияния белков Ас£КЛВРс на передачу сигнала ОПР-11 и активином А. Клеточная линия: человеческая рабдомиосаркома (образованная из мышечной ткани). Репортерный вектор: рОЬ3(САОА)12 (описанный Пепп1ег е1 а1, 1998, ЕМВ0 17: 3091-3100.) См. фиг. 5. Мотив САОА12 присутствует на ТОР-бета-чувствительных генах (гене ΡΑΙ-1), а поэтому такой вектор обычно применяется для передачи сигнала факторов под действием δтаά2 и 3.
День 1. Клетки А-204 распределяли по лункам 48-луночного планшета.
День 2. Клетки А-204 трансфицировали 10 мкг рОЬ3(САОА)12 или рОЬ3(САОА)12(10 мкг)+рКЬСМУ (1 мкг) и реагентом Ридепе.
День 3. Добавляли факторы (разведенные в среде+0,1% ΒδА). Ингибиторы перед их добавлением в клетки должны быть предварительно инкубированы с факторами в течение 1 ч. Через 6 ч клетки промывали ΡΒδ и подвергали лизису.
После этого проводили анализ с использованием люциферазы. В отсутствие любых ингибиторов активин А способствует 10-кратной стимуляции экспрессии репортерного гена с ЕП50 ~2 нг/мл. ОПР-11: 16-кратная стимуляция, ЕП50 ~1,5 нг/мл.
В этом анализе Ас£КЛВ (К64, 20-134) представляет собой сильный ингибитор активности активина, ОПР-8 и ОПР-11. В этом анализе также были протестированы варианты.
Пример 3. Ингибирование ОПР-11 с Ν- и С-концевыми усечениями.
Был получен белок Ас®ПВ-Рс (К64, 20-134), в котором Ас£КПВ-часть имела Ν- и С-концевые усечения, и этот белок тестировали на активность в качестве ингибиторов ОПР-11 и активина. Активности представлены ниже (измеренные в кондиционированных средах).
С-концевые усечения АсЖПВ-ЬРс
- 31 025891
1С50 (нг/мл)
СйГ-11 Активин
АсРВНЬ-ЬГс (В64, 20-134) 45 22
АсрВЫЬ-НГс (В64, 20-132) 87 32
АсГКИЬ-ЬГс (К64, 20-131) 120 4 4 '
АсРКИЬ-ЬГс (В64, 20-128) 130 158 |
Следует отметить, что усечения в три аминокислоты (заканчивающиеся ...РРТ), шесть аминокислот (заканчивающихся ...ΥΕΡ) или более аминокислот у С-конца приводят к трехкратному или к еще более значительному снижению активности данной молекулы. Усечение 15 конечных аминокислот в АсЖПВчасти приводит к значительной потере активности (см. \У0 2006/012627).
Аминоконцевые усечения были сделаны в контрольном белке АсЖПВ-НЕс (К64 20-131). Полученные активности представлены ниже (измеренные в кондиционированных средах).
Ν-концевые усечения АсЖПВ-НЕс
1Сьо (нг/мл)
СОЕ-11 Активин
АсГКИЬ-КЕс (В64, 20-131) (СВС...) 183 201
АсРКШо-НЕс (Р.64, 21-131) (ВСЕ...) 121 325
АсйКИЬ-НЕс (В64, 22-131) (СЕА...) 71 100
АсСВИЬ-НГс (В64, 23-131) (ЕАЕ...) 60 43
АсРКИЬ-ЬЕс (В64, 24-131) (АЕТ...) 69 105
В соответствии с этим усечения в две, три или четыре аминокислоты у Ν-конца приводят к образованию более активного белка, чем варианты, содержащие полноразмерный внеклеточный домен. Дополнительные эксперименты показали, что АсЖПВ-НЕс (К64, 25-131) с усечениями в пять аминокислот обладает активностью, эквивалентной активности неусеченной формы, а дополнительные делеции у Νконца способствуют дальнейшему снижению активности белка. Поэтому оптимальные конструкции имеют у С-конца последовательность, заканчивающуюся в положениях аминокислот 133-134 δΕΟ ГО N0:4, а у Ν-конца - начинающуюся в положениях аминокислот 22-24 δΕΟ ГО N0:4.
Конструкция, в которой Ν-конец, соответствующий аминокислотам 21 или 25, обладает активностью, аналогичной активности конструкции АсЖПВ-НЕс (К64, 20-134).
Пример 4. Варианты АсЖИВ-Ес и их активность в клетках.
Активность белков ЛсЖПВ-Рс тестировали в клеточном анализе, описанном выше. Результаты систематизированы ниже в табл. 1. Некоторые варианты тестировали в различных конструкциях с Сконцевыми усечениями. Как обсуждалось выше, усечения в пять или пятнадцать аминокислот приводили к снижению активности. Интересно отметить, что варианты Ь79О и Ρ79Ε, по существу, не обладали способностью связываться с активином, но почти полностью сохраняли способность ингибировать ΟΌΡ-11 дикого типа.
Связывание растворимого АсЖПВ-Рс с ΟΌΡ11 и активином А
Варианты АсРКИВ-Ес Часть АсРКИВ (соответствует аминокислотам ВЕС 1С N0:4) Активность ингибирования СВЕ-11 Активность ингибирования активина
64В 20-134 +++ (прибл. 10’8 М Κχ) +++ (прибл. 10*8 М Κι)
64А 20-134 + (прибл. 10‘6 М Кх) + (прибл. 10'6 М Κχ)
64В 20-129 +++ +++
64В К74А 20-134 ++++ ++++
64К Α24Ν 20-134 +++ +++
64В Α24Ν 20-119 ++ ++
64В Α24Ν К74А 20-119 + +
К64 Ъ79Р 20-134 + +
К64 Ь79Р К74А 20-134 + +
В64 Σ79ϋ 20-134 +++ +
К64 Ь79Е 20-134 +++ +
В64К 20-134 +++ +++
В64К 20-129 ++ + +++
В64 Р1293 Р130А 20-134 +++ +++
Β64Ν 20-134 + +
+ - низкая активность (приблизительно 1 х 10-6 К);
++ - умеренная активность (приблизительно 1 х 10-7 К;);
+++ - высокая активность (дикого типа) (приблизительно 1 х 10-8 К);
++++ - активность, превышающая активность дикого типа.
Несколько вариантов оценивали на время их полужизни в крысиной сыворотке. Время полужизни ЛсΐКIIВ (К64 20-134)-Рс в сыворотке составляло примерно 70 ч. Время полужизни АсЖПВ (К64 Л24N 20-134)-Рс в сыворотке составляло примерно 100-150 ч. В клеточном анализе (описанном выше) и в анализах ίη νίνο (описанных ниже) вариант А24N обладал активностью, эквивалентной активности молеку- 32 025891 лы дикого типа. Если учесть более длительное время полужизни этого варианта, то это означает, что в течение всего этого времени вариант Α24Κ будет давать лучший эффект на единицу активности белка, чем молекула дикого типа.
Интересно отметить, что введение кислотных аминокислот (аспарагиновой или глутаминовой кислоты) в положение 79 приводит к селективному снижению способности связываться с активином, но сохраняет способность связываться с СОР11/СОР8. Как обсуждается ниже, белки ΥίΚΙΙΒ^ дикого типа, очевидно, действуют на ткани, но не на мышцы, причем некоторые из этих эффектов могут быть нежелательными. Как описано в настоящей заявке, предполагается, что такие эффекты заключаются в том, что различные лиганды связываются с Άс1ΚIIΒ-Рс и ингибируются под действием ΑίΚΙΙΒ-Ρ^ включая, вероятно, связывание с активином и ингибирование активином. Предварительные данные показали, что у мышей варианты Ρ79Ε и Ь79О оказывают меньшее влияние на ткани, чем на мышцы, но при этом они сохраняют свое воздействие на мышцы. Хотя варианты такого типа могут рассматриваться как варианты ΥίΚΙΙΒ, однако следует отметить, что эти белки больше не обладают истинной функцией как рецепторы активина, а поэтому присвоенное обозначение 'ΎίΚΙΙΒ служит только указанием на происхождение этих полипептидов. Хотя кислотные остатки в положении 79 вызывают снижение способности связывания с активином, сохраняя при этом способность связывания с СЭР11, однако другие модификации в этом положении не дают такого эффекта. Замена Ρ79Α приводит к повышению способности связываться с активином, но не с СОР11. Замена Ь79Р приводит к снижению способности связываться с активином и с СОР 11.
Пример 5. Связывание с СОР-11 и с активином А.
Связывание некоторых белков ΑίΚΙΙΒ^ с лигандами тестировали в анализе Β^аСο^е™.
Варианты ΑίΚΙΙΒ^ или белок дикого типа иммобилизовали на системе с использованием анти1Рс антитела. Лиганды инжектировали и пропускали через колонку с иммобилизованными белками рецептора. Результаты систематизированы в нижеследующей таблице.
Специфичность связывания лигандов с вариантами ΙΙΒ
СОРИ
Белок Коп (1/Мз) Ко££(1/5) КБ (М)
АсЛКПВ-ЬГс (Р64 20-134) 1,34е-б 1,13е-4 8,42е-11
АсЛЕИВ-ЬРс (Е64, Α24Ν 20-134) 1,21е-6 б,35е-5 5,19е-11
АсЛЕИВ-ЬРс (Е64, Ъ79Б 20-134) б, 7е-5 4,39е-4 б,55е-10
АсСЕИВ-ЬГс (Е64, 179Е 20-134) 3,8е-5 2,74е-4 7,1бе-10
АсЛКИВ-ЬРс (Е64К 20-134) б,77е-5 2,41е-5 3,56е-11
СБР8
Белок Коп (1/Мз) Ко££ (1/5) КБ (М)
АсЛЕИВ-ЬРс (К64 20-134) 3,б9е-5 3,45е-5 9,35е-11
АсЛЕИВ-НРс (Е64, Α24Ν 20-134)
АсЛЕИВ-ЬРс (Е64, Ъ79Б 20-134) 3,85е-5 8,Зе-4 2,15е-9
АсОЕ11В-ЬРс (Е64, Б79Е 20-134) 3,74е-5 9е-4 2,41е-9
АсйЕНВ-ЬРс (Е64К 20-134) 2,25е-5 4,71е-5 2,1е-10
ΑοίΕΙΙΒ-ЬРс (Е64К 20-129) 9,74е-4 2,09е-4 2,15е-9
АсЛКИВ-ЬРс (Е64, Р1298, Р130Е 20-134) 1,08е-5 1,8е-4 1,б7е-9
АсЛЕИВ-ЬРс (Е64, К74А 20-134) 2,8е-5 2,03е-5 7,18е —11
Активин А
Белок Коп (1/М5) Ко££(1/5) КБ (М)
АсСКИВ-ЬРс (Е64 20-134) 5, 94еб 1,59е-4 2,68е-11
АсЛЕИВ-ЬРс (Е64, Α24Ν 20-134) 3,34еб 3,4бе-4 1,04е-10
Ас£ЕПВ-НРс (Е64, Б79Б 20-134) Низкий уровень связывания
Ас£.Е11В-ЬРс (Е64, Ь79Е 20-134) Низкий уровень связывания
Ас-ЬЕНВ-ЬРс (Е64К 20-134) б, 82еб 3,25е-4 4,7бе-11
АсйКИВ-ЬРс (Е64К 20-129) 7,46еб б,28е-4 8,41е-11
АсЛЕИВ-ЬРс (Е64, Р1298, Р130Е 20-134) 5,02еб 4,17е-4 8,31е-11
Полученные данные подтверждают данные клеточного анализа, и указывают на то, что вариант Α24N сохраняет лигандсвязывающую активность, аналогичную активности молекулы Άс1ΚIIΒ-ЬРс (Κ64 20-134), и что молекулы Ь79О или Ρ79Ε сохраняют способность связываться с миостатином и СОР11, но вызывают значительное снижение уровня (не поддающееся количественной оценке) связывания с активином А.
Другие варианты получали и тестировали, как сообщалось в ν0 2006/012627, с использованием иммобилизованных на данном устройстве лигандов и с последующим пропусканием рецепторов над указанными иммобилизованными лигандами. Ниже приводится таблица данных, относящихся к этим вариантам.
- 33 025891
Связывание растворимых вариантов ΑсίΚΠΒ-Рс с О1')1'11 и с активином А ^а^те-анализ)
— <1/5 от связывания дикого типа (νΤ);
- - ~1/2 от связывания νΤ;
+ - νΤ;
++ - <2-кратное увеличение уровня связывания;
+++ _ ~5-кратное увеличение уровня связывания;
++++ _ ~10-кратное увеличение уровня связывания;
+++++ - ~40-кратное увеличение уровня связывания.
Пример 6. Влияние белков ΑсίΚΠΒ-Рс на мышечную массу у мышей дикого типа.
Заявителями была определена способность белка ΑсίΚΠΒ-Рс увеличивать мышечную массу у мышей дикого типа.
Мышам С57В110 два раза в неделю вводили дозу (10 мг/кг; внутрибрюшинно (ί.ρ.)) человеческого белка ΑсίΚΠΒ (Κ64 20-134) или человеческого ΑсίΚΠΒ (Κ74Α 20-134). Мышей подвергали ЯМРсканированию на день 0 и на день 28 для определения процента изменения безжировой массы ткани всего организма. У мышей, обработанных ΑсίΚΠΒ (Κ64 20-134)-Рс, наблюдалось значимое 31,1% увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой мышей в контрольной группе, обработанной носителем. У мышей, обработанных человеческим белком ΑсίΚΠΒ (Κ74Α 20-134)-Рс, наблюдалось значимое увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой, наблюдаемой у контрольной группы, хотя и в меньшей степени, чем у группы, обработанной человеческим ΑсίΚΠΒ (Κ64 20-134). В аналогичном исследовании мышей внутрибрюшинно два раза в неделю обрабатывали ΡΒ8, 1, 3 или 10 мг/кг мышиного ΑсίΚΠΒ (νΤ, 20-134)-Рс. По окончании исследований мышцы бедра, икроножные мышцы, мышцы грудной клетки и мышцы диафрагмы иссекали и взвешивали. Результаты систематизированы ниже в табл. 3.
Т аблица 3
Массы ткани у мышей дикого типа, обработанных носителем и мышиным ΑсίΚΠΒ (νΤ, 20-134)-Рс
Обработанные носителем Икроножная мышца (Д+В) Бедро (Д+В) Грудная клетка (Д+в) Диафрагма
Среднее (граммы) ± ст.кв.откл. 0,306+0,020 0,187±0,040 0,257+0,020 0,076+0,020
тиАсРВИВ (МТ, 2О-134)-Ес (10 мг/кг) Икроножная мышца (Д+В) Бедро (Д+В) Грудная клетка (Д+в) Диафрагма
Среднее (граммы) ± ст.кв.откл. 0,387±0,010 0,241+0,014 0,360±0,070 0,124±0,040
Величина ρ Ткритерия 0,0001 0,009 0,02 0, 04
Как показано в табл. 3, мышиный слитый белок ΑεΐΚΠΒ (νΤ, 20-134)-Рс способствовал значитель- 34 025891 ному увеличению мышечной массы у мышей дикого типа. У мышей, обработанных мышиным Α^ΜΕ (ГСТ, 20-134)-Рс, масса икроножных мышц увеличивалась на 26,5%, масса мышц бедра увеличивалась на 28,9%, а масса мышц грудной клетки увеличивалась на 40,0%. Авторами настоящего изобретения были также обнаружены изменения массы мышц диафрагмы, которая на 63% превышала массу мышц диафрагмы у контрольных мышей, обработанных носителем. Уменьшение массы мышц диафрагмы ассоциируется с осложнениями, которые обычно наблюдаются при различных мышечных дистрофиях. Поэтому увеличение массы диафрагмы, наблюдаемое после обработки мышиным Αс!КIIΒ (ГСТ, 20-134)-Рс, может иметь клинически важное значение.
Пример 7. Влияние длительного времени полужизни белков ΑсΐКIIΒ-Рс на мышечную массу мышей дикого типа.
Заявителями было определено влияние длительного времени полужизни варианта белка Αс!КIIΒтРс (К64, Α24Ν 20-134) на увеличение мышечной массы у мышей дикого типа.
Мышам С57В110 два раза в неделю вводили дозу (10 мг/кг; внутрибрюшинно (1.р.)) человеческого белка Αс!КIIΒ-тРс (К64 20-134) или человеческого Αс!КIIΒ-тРс (К64, Α24Ν 20-134). Мышей подвергали ЯМР-сканированию в различные периоды времени вплоть до 25-го дня для определения процента изменения массы безжировой ткани всего организма. Обе молекулы способствовали эквивалентному увеличению массы всего организма и мышечной массы, при этом масса икроножных мышц, бедра и грудной клетки увеличивалась на 40-70% (см. фиг. 5 и 6).
Полученные данные показали, что более длительное время полужизни данной молекулы стимулирует рост мышц за короткий период исследований с эффективностью, эквивалентной эффективности молекулы дикого типа.
Пример 8. Влияние белков Α^ΗΙΕ^ с пониженной способностью связываться с активином на мышечную массу мышей дикого типа.
Заявителями была определена способность варианта белка Αс!КIIΒ-тРс (К64, Ь79Б 20-134) с длительным временем полужизни увеличивать мышечную массу у мышей дикого типа.
Мышам С57В110 два раза в неделю вводили дозу (10 мг/кг; внутрибрюшинно (1.р.)) человеческого белка Αс!КIIΒ-тРс (К64 20-134) или человеческого Αс!КIIΒ-тРс (К64, Ь79Б 20-134). Мышей подвергали ЯМР-сканированию в различные периоды времени вплоть до 24-го дня исследований для определения процента изменения массы безжировой ткани всего организма. Данные представлены ниже в таблице.
Масса тела День 0 (г) Масса тела День 24 (г) Икроножная мышца (Ъ+К) Бедро (Д+Н) Грудная клетка (Ъ+К)
Мод. ТВ5 (масс./об.) 24,4±1,51 26,8±1,43 0,29±0,02 0,17+0,02 0,24+0,05
К64, 20-134 (10 мг/кг) 25,0±1,36 31,2*±1,53 0,40*+0,02 0,24*±0,02 0,37*±0,07
К64, Д79О 20-134 (10 мг/кг) 25,3±1,22 28,1+1,64 0,32*±0,02 0,20*±0,02 0,27+0,05
*р<0,05
Эти данные продемонстрировали, что вариант Ь79Б ΑсΐКIIΒ (с пониженной способностью связываться с активином А) обладает активностью ш у1уо, направленной на стимуляцию роста мышц, однако этот вариант дает меньшее количество прироста мышц, чем ΑσΐΜ^ дикого типа. Такое снижение эффекта может быть отчасти вызвано небольшим снижением уровня связывания миостатина или потерей способности связываться с другим еще неизвестным негативным регулятором роста мышц. Способность стимулировать рост мышц в отсутствие влияния на передачу сигнала активина А является особенной желательной, поскольку активин представляет собой широко экспрессируемую регуляторную молекулу, которая, как известно, оказывает влияние на репродуктивную систему, кости, печень и многие другие ткани. У мышей ΑсΐКIIΒ-тРс (К64 20-134) оказывает значительное влияние на репродуктивную систему, а в некоторых случаях способствует увеличению размера селезенки. Молекула Αс!КIIΒ-тРс (К64, Ь79Б 20-134) оказывает значительно более слабое влияние на репродуктивные ткани и селезенку, что указывает на то, что эта молекула является особенно подходящей для стимуляции роста мышц у пациентов с хорошей репродуктивной способностью или у пациентов, у которых желательно минимизировать влияние на репродуктивную систему.
Пример 9. Влияние белка ΑсΐКIIΒ-Рс на мышечную массу и силу мышц у мышей Мбх.
Для определения способности мышиного белка ΑσΐΜ^ (ГСТ, 20-134)-Рс увеличивать мышечную массу при патологических состояниях заявителями была определена способность белка Αс!КIIΒ-Рс увеличивать мышечную массу у мышей тбх с моделью мышечной дистрофии.
Взрослых мышей тбх два раза в неделю обрабатывали мышиным белком ΑσΐΜ^ (ГСТ, 20-134)-Рс (1, 3 или 10 мг/кг; внутрибрюшинно) или РВ8-носителем, используемым в качестве контроля. Для определения сокращения мышц передних конечностей определяли силу, которую мышь прилагает при нажатии датчика мышечной силы. Для сравнения силы сокращения мышц у различных групп мышей была использована средняя сила из 5 испытаний с нажатием датчика. В конце исследований мышцы бедра, икроножные мышцы, мышцы грудной клетки и диафрагмы иссекали и взвешивали.
Измерения силы мышечных сокращений также указывали на значимое увеличение этой силы. Ре- 35 025891 зультаты измерения мышечной массы систематизированы ниже в таблице.
Массы ткани у мышей тйх, обработанных носителем и мышиным Ас!КПВ (^Τ, 20-134)-Гс
Обработанные носителем Икроножная мышца (Ь+К) Бедро (Ь+К) Грудная клетка (Ь+К) Диафрагма
Среднее (граммы)±ст. кв.откл. 0,413±0,040 0,296±0,019 0,437+0,060 0,111±0, 030
шиАсГКИВ (ИТ, 20134)-Гс (10 мг/кг) Икроножная мышца (Ь+К) Бедро (Ь+К) Грудная клетка <1+Ю Диафрагма
Среднее (граммы)±ст. кв.откл. 0,52±0,050 0,39±0,05 0,8 07±0,21 0,149+0,020
Величина р Т-критерия 0,0006 0,0006 0,002 0,05
Как показано в таблице, у групп мышей тйх, обработанных мышиным Ас!КПВ (№Τ, 20-134)-Гс, наблюдается увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой у мышей, обработанных РΒδ. АсЖПВ-Бс-обработка по сравнению с контрольной группой, обработанной носителем, приводила к увеличению размера икроножных мышц на 25,9%, мышц бедра - на 31,8%, а грудной клетки - на 85,4%. Возможный клинический интерес состоит в том, что авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что массы диафрагмы мышей, обработанных мышиным Ас!КПВ (^Τ, 20-134)-Гс, по сравнению с контрольной группой увеличивались на 34,2%. Полученные данные показали, что белок Ас!КПВГс является эффективным для лечения такого патологического состояния, как мышечная дистрофия.
Кроме того, у мышей тйх, обработанных белком АсЖШВ-Бс, по сравнению с контролем, обработанным носителем, наблюдались более сильные мышечные сокращения. Через 16 недель у групп мышей, которым вводили 1, 3 и 10 мг/кг Ас!КПВ, по сравнению с контрольными группами, которым вводили носитель, наблюдалось 31,4%-ное, 32,3%-ное и 64,4%-ное увеличение силы мышечных сокращений соответственно. Увеличение силы мышечных сокращений у групп, обработанных мышиным Ас!КПВ (^Τ, 20-134)-Бс, подтвердило предположение о том, что увеличение мышечной силы, обнаруженное у групп обработки, является физиологически релевантным. Мыши тйх были восприимчивыми к поражениям, индуцированным мышечными сокращениями, и претерпевали значительно большее число циклов дегенерации и регенерации, чем мыши дикого типа. Несмотря на присутствие таких мышечных фенотипов у мышей тйх, обработанных мышиным Ас!КПВ (^Τ, 20-134)-Бс, наблюдались более сильные мышечные сокращения.
Мышечная дистрофия Дюшенна начинает развиваться в раннем детстве, чаще всего в возрасте до пяти лет. В соответствии с этим представленные выше данные, полученные для взрослых мышей, необязательно отражают эффекты, которые дает молекула Ас!КПВ у детей с МДД. Для подтверждения этих данных исследования проводили на молодых мышах тйх.
У молодых мышей (4-недельных) С57ВЛ/10 и у мышей тйх обработка белком Αс!КIIΒ-тΡс (К64, 20-134) приводила к значительному увеличению массы тела. Анализ состава веществ в организме, проводимый с помощью ЯМР-спектроскопии т у1уо, указывал на увеличение массы безжировой ткани, сопровождающееся увеличением массы тела. У мышей С57ВЛ/10, обработанных Αс!КIIΒ-тΡс (К64, 20134), наблюдался 35,2% прирост массы безжировой ткани, а у обработанных групп тйх такой прирост массы безжировой ткани составлял 48,3% по сравнению с соответствующими контрольными группами. Кроме того, было оценено влияние Αс!КIIΒ-тΡс (К64, 20-134)-обработки на мышечную силу. У обработанных носителем мышей тйх показатели силы мышечных сокращений были на 15,7% ниже, чем у групп С57ВЛ/10, обработанных носителем, что указывает на то, что мышечная слабость ассоциируется с дефицитом дистрофина. В противоположность этому у мышей тйх, обработанных Αс!КIIΒ-тΡс (К64, 20-134), сила мышечных сокращений превышала силу, наблюдаемую у группы мышей тйх, обработанных носителем, и величины измерений достигаемой силы мышечных сокращений превышали величины, полученные для мышей С57ВЛ/10, обработанных носителем, и достигали уровня величин силы мышечных сокращений у обработанных мышей С57ВЛ/10 (мыши тйх, обработанные носителем: 0,14 0±0,01 кгС; обработанные мыши тйх: 0,199±0,02 кгС; мыши С57ВЛ/10, обработанные носителем: 0,166±0,03; 0,205±0,02 кгС). Интересно отметить, что такая обработка приводила к восстановлению силы мышечных сокращений у молодых мышей тйх до уровней, наблюдаемых у мышей дикого типа. Поэтому молекула Αс!КIIΒ-тΡс (К64, 20-134), вероятно, играет важную роль в клинической практике лечения мышечной дистрофии Дюшенна, в частности у молодых пациентов в возрасте, близком к возрасту, при котором начинается развитие данного заболевания.
Пример 7. Влияние белка АсЖПВ-Бс на мышечную силу и выживаемость у мышей δΟΌ1.
Для определения способности полипептидов Ас!КПВ увеличивать мышечную силу и выживаемость мышей с моделью АБС заявителями был протестирован белок АсЖПВ-Бс на мышах δΟΌ1.
Мыши Β6.С§-Τ§(δΟ^1-Ο93Α)1Οи^/^ или δΟΏ1 имели большое число копий мутантного аллеля человеческого трансгена супероксид-дисмутазы. Высокие уровни этого белка сообщают мышам фенотип, сравнимый с фенотипом, наблюдаемым у человека с АБС. У мышей δΟΏ1 развивался прогрессирующий
- 36 025891 паралич, а первые признаки заболевания проявлялись на 91-й день. Такое заболевание приводило к преждевременной гибели мышей в возрасте 19-23 недель.
Мышам δθϋ1, начиная с возраста 10 недель, вводили дозу носителя в качестве контроля или АсЖПВ-тРс (К74А 20-134) (ί/р., 5 мг/кг, два раза в неделю). Для определения силы сокращения мышц передних конечностей измеряли силу, которую мышь прилагает при нажатии датчика мышечной силы. Для сравнения силы сокращения мышц у различных групп мышей была использована средняя сила из 5 испытаний с нажатием датчика. Выживаемость определяли как число дней, начиная с рождения мыши и до дня, когда мышь, положенная на один бок, не могла сама встать за 30 с. На фиг. 7 представлены результаты измерения силы сокращения мышц, а на фиг. 8 проиллюстрированы данные по выживаемости.
Мышам на последней стадии заболевания трудно поддерживать чистоту тела, что преимущественно обусловлено прогрессированием паралича, и они становятся неопрятными на вид. Поверхностное наблюдение этих мышей показало, что мыши в группе обработки мышиным АсТРПВ (К74А 20-134)-Рс являются опрятными на вид даже в конечной стадии заболевания по сравнению с РВ5-группой. Это наблюдение дает основание предположить, что обработанные мыши имеют лучшее здоровье и более высокое качество жизни, чем контрольные животные.
Как видно на фиг. 7, у мышей δθϋ1, которых обрабатывали мышиным Ас1РПВ (К74А 20-134)-Рс, по сравнению с контрольной группой, которой вводили РВδ, наблюдались значительно более сильные мышечные сокращения. Это наблюдение отмечалось на день 117, то есть на ранней стадии заболевания, а также после прогрессирования заболевания на день 14 9. На фиг. 8 показано, что Ас1РПВ (К74А 20134)-Рс-обработанные мыши имели большую продолжительность жизни, чем контрольные животные, обработанные носителем. Такое исследование продемонстрировало возможность применения мышиного АсТРПВ(К74А 20-134) у мышей с моделью АБС в целях увеличения мышечной силы и повышения выживаемости.
Аналогичный эксперимент проводили на мышах δθϋ1, однако, для более точной имитации лечения человеческого АБС после появления значимых симптомов заболевания обработку осуществляли более медленно до тех пор, пока не наблюдались едва заметные признаки заболевания (день 130). На день 130 мышей δθϋ1 распределяли на группы, которые обрабатывали либо носителем (модифицированным ТВδ), либо Ас1РПВ (Р64 20-134)-тРс (10 мг/кг). Мышам подкожно вводили дозу один раз в неделю. Затем этих мышей подвергали ЯМР-сканированию на дни исследования -1 и 27 (в возрасте 129 и 157 дней соответственно). Измерения силы мышечных сокращений проводили на дни исследования 0 и 20. По окончании исследования у самцов контрольной группы потеря массы тела со дня исследования 0 составляла 4,3%, а у группы обработки прирост массы тела со дня исследования 0 составлял 7,8%. Потеря массы тела у самок контрольной группы по сравнению с их массой на день исследования 0 составляла 1,5%, тогда как у самок группы обработки наблюдался 15%-ный прирост массы тела.
Измерение силы мышечных сокращений у мышей δθϋ1
День 0 День 20
Самцы, контроль 0,149±0,02 0,097±0,02а
Самцы, обработка ΑοίΚΙΙΒ (К64 20-134)-тГс 0,147±0,02 0, 128±0,02а'ь
Самки, контроль 0,130±0,02 0,091±0,С2а
Самки, обработка ΑοίΚΙΙΒ (К64 20-134)-тГс 0,128±0,01 0,11±0,02ь
У самцов и самок мышей δθϋ1 силу мышечных сокращений измеряли на дни 0 и 20. Верхний индекс а означает значимое различие по сравнению с соответствующим измерением на день 0 (р<0,05). Верхний индекс Ъ означает значимое различие между величинами измерений для групп, которым вводили РВδ (группа 1) и Ас!РПВ (Р64 20-134)-тРс (группа 2) на день 20 (р<0,05).
Мышей подвергали ЯМР-сканированию для определения изменений состава веществ в организме после обработки. На протяжении всего исследования у самок контрольных мышей потеря массы безжировой ткани составляла 6,0% (день 1: 18,2 г±1,28; день 27: 17,1 г±1,10), у самцов обработанных мышей дня исследования 0 прирост массы безжировой ткани составлял 9,1% (день -1: 19,17 г±0,77; день 27: 20,92 г±0,74). У самок контрольных мышей снижение безжировой массы с начала исследования составляло 0,83% (день 1: 13,18 г±0,84; день 27: 13,08 г±0,71), а у самок обработанных мышей прирост массы тела со дня исследования 0 составлял 10,7% (день 1: 13,66 г±0,83; день 27: 15,12 г±1,21). У самцов и самок групп обработки наблюдался значимый прирост массы безжировой ткани по сравнению с массой, наблюдаемой у соответствующих контрольных групп, обработанных РВδ (р<0,001).
- 37 025891
Влияние АсЖПВ (К64 20-134)-тРс на мышечную массу мышей 80Ό1
Икроножная мышца (Ь+К) Бедро (Ь+К) Грудная клетка СЬ+К)
Самцы, контроль 0,18+0,03 0,12+0,03 0,20+0,04
Самцы, обработка АСДК11В (В64 20-134)гаГс 0,22+0,04 0,15+0,02 0,30+0,04
Самки, контроль 0,13+0,02 0,089+0,016 0,11+0,01
Самки, обработка ΑοΐΚΙΙΒ (В.64 20-134)тГс 0,17+0,03 0,01+0,02 0,15±0,05
Полученные данные показали, что АсЖНВ-Рс-обработка может оказывать благоприятный эффект при лечении пациентов с активной формой АБС как в отношении улучшения мышечной функции, так и в отношении повышения качества жизни.
Пример 8. Влияние белка АсЖНВ-Рс на развитие ожирения и диабета у мышей с ожирением.
Для определения способности АсЖНВ-Рс снижать степень ожирения у мышей с моделью ожирения заявителями были протестированы белки АсЖПВ-тРс на мышах, которым давали корм с высоким содержанием жира (ΗΡΌ).
Диабет типа II является серьезным осложнением при ожирении и характеризуется инсулинорезистентностью. Характерными признаками инсулинорезистентности являются повышенные уровни инсулина натощак, и по этим признакам можно определить наличие у животного инсулинорезистентности. Заявителями было определено влияние обработки мышиным АсЖПВ (К64 К74А 20-134)-Рс на нормализацию уровней инсулина натощак у мышей с моделью ожирения.
Мышам С57ВБ/6 давали корм ΗΡΌ, который состоял из 35% жира, при этом считалось, что мыши имеют ожирение, если их масса тела приблизительно на 50% выше массы тела мышей этого же возраста, которым давали стандартный корм (с 4,5% жира). Мышам с ожирением два раза в неделю вводили дозу носителя в качестве контроля или человеческого Ас!КНВ (К64 К74А 20-134)-Рс (10 мг/кг; 1.р.). Мышей с ожирением подвергали ЯМР-сканированию для определения состава веществ в организме сразу после введения дозы и через 3 недели после введения дозы. Изменения состава веществ в организме по сравнению со стандартом систематизированы на фиг. 9.
Мышам давали корм с высоким содержанием жира, при этом считалось, что мыши имеют ожирение, если их масса тела на 50% выше, чем масса тела мышей, которым давали стандартный корм. Мышам, которым давали корм ΗΡΌ, в течение 35 недель вводили либо носитель в качестве контроля, либо мышиный АсЖПВ (К64 К74А 20-134)-Рс (5 мг/кг, два раза в неделю; 1.р.). По окончании исследования мышей поддерживали в условиях голодания в течение ночи. По окончании периода голодания брали кровь и выделяли сыворотку. Затем сыворотку использовали для определения уровней инсулина натощак у мышей обеих групп. Результаты влияния мышиного АсЖНВ (К74А 20-134)-Рс на уровни инсулина натощак у мышей с ожирением систематизированы ниже в таблице.
Уровни инсулина натощак у мышей, обработанных носителем и мышиным Ас!КПВ (К74А 20-134)-Рс
НТО, РВ5 НГО, мышиный Ас-ΟΚΙΙΒ (Κ74Ά 20134)-гаЕс
Среднее (нг/мл) ± ст.кв.откл. 2,27+1,64 0,78+0,40
т-критерий Ν/Α 0, 012
На фиг. 9 проиллюстрировано снижение степени ожирения у группы мышей, которым вводили мышиный АсЖПВ (К64 К74А 20-134)-Рс, по сравнению с контрольной группой, обработанной носителем. Было обнаружено, что жировая масса у обработанных мышей на 25,9% ниже, чем их исходная жировая масса. Кроме того, у мышей этой обработанной группы безжировая масса на 10,1% превышала исходную безжировую массу. Процентное изменение массы жировой ткани и безжировой ткани у мышей, обработанных АсЖПВ (К64 К74А 20-134)-тРс, было значительно выше, чем процентное изменение такой массы у группы, обработанной РВ8.
Мышам этой модели давали корм с высоким содержанием жира до тех пор, пока их масса более чем на 50% не превышала массу таких же мышей, которым давали стандартный корм. Исходя из заметного увеличения массы тела и степени ожирения можно сделать вывод, что эта модель будет соответствовать человеческой модели, которая характеризуется как явно выраженная степень ожирения. Поэтому установление того факта, что обработка мышей с ожирением человеческим белком АсЖНВ (К64 К74А 20134)-Рс приводит к снижению степени ожирения, может оказаться клинически релевантным для лечения человека с явно выраженной степенью ожирения.
Полученные результаты, систематизированные в табл. 5, дают основание предполагать, что обработка мышиным белком АсЖНВ (К74А 20-134)-Рс будет значительно снижать повышенные уровни инсулина в сыворотке натощак, ассоциированные с ожирением. Полученные данные подтверждают возможную клиническую релевантность применения полипептидов АсЖПВ для лечения диабета типа II.
- 38 025891
Последующие эксперименты проводили на ΗΡΌ-мышах с моделью ожирения и диабета, которым вводили ΑсίΚIIΒ-тРс (К64 20-134). 30-недельных мышей ί.’57ΒΡ/6, которым давали корм ΗΡΌ, распределяли на две группы (ΡΒ8 и 10 мг/кг ΑсίΚIIΒ-тРс (К64 20-134)). Затем мышей взвешивали, и два раза в неделю в течение 12 недель внутрибрюшинно вводили нужную дозу. Мышей оценивали с помощью ЯМР на дни исследования 0 и 94.
У обработанных мышей потеря массы тела составляла 1,9% от их массы на день исследования 0, а у ΡΒδ-обработанных мышей прирост массы тела во время исследования составлял 6,7% от их массы на день исследования 0. Во время исследования у обработанных мышей также наблюдалось значительное увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой, наблюдаемой у ΡΒδ-группы (21,1%±6,28 и 3,7%±4,08 соответственно). У обработанных мышей также наблюдалась значительная потеря жировой ткани (-34%±10,95) по сравнению с ΡΒδ-группой (+10,2%±10,18).
Увеличение мышечной массы также наблюдалось у отдельных мышей в группе, обработанной ΑсίΚIIΒ-тРс (К64 20-134)
Икроножная мышца (1+К) Бедро (Ь+К) Грудная клетка (Ь+К)
РВЗ 0/33±0,05 0,18±0,03 0,31±0,05
АсЪРИВ-тГс (Р64 20-134) 0,44±0,08* 0,25+0,02* 0,44±0,13*
*р<0,05
Помимо позитивных эффектов, наблюдаемых в отношении массы жира и мышечной массы, которые ассоциировались с ΑсίΚIIΒ-Рс-обработкой этих мышей, наблюдались также позитивные эффекты в отношении изменения уровней липидов в сыворотке. Уровни холестерина и триглицеридов в сыворотке заметно снижались, что дает основание предположить, что слитые белки ΑсίΚIIΒ-Рс могут быть использованы для снижения уровней этих липидов у пациентов.
Пример 9. Влияние белка ΑΛΚΙΙΒ^ на мышечную массу у мышей с кахексией.
Заявителями была протестирована способность ΑсίΚIIΒ (К64 20-134)-тРс снижать потерю мышечной массы у мышей с моделью гипотрофии мышц, индуцированной глюкокортикоидами.
Мышам ежедневно в течение 13 дней подкожно вводили дозу ΡΒδ или дексаметазона (2 мг/кг) для индуцирования гипотрофии мышц. В течение этих же 13 дней группам, обработанным ΡΒδ или дексаметазоном, вводили носитель или ΑсίΚIIΒ (К64 20-134)-тРс (10 мг/кг; ί.ρ.; два раза в неделю) так, чтобы были представлены все комбинации обработки. Мышей подвергали ЯМР-сканированию на дни 0 и 13 для определения изменений массы безжировой ткани для всех групп. Результаты ЯМР-анализа представлены ниже в табл. 6.
Таблица 6
Масса безжировой ткани у мышей, обработанных носителем и мышиным ΑсίΚIIΒ (К64 20-134)-Рс
Группа (Обработка, ас:ίρ) Средняя безжировая масса на день 13 - Средняя безжировая масса на день 0 (г) ± ст.кв.откл.
РВЗ:РВЗ 0,83+0,94
Дексаметазон:РВЗ 0,47+0,34“
Дексаметазон: АсЬКИВ 2,56±0,37*’ь
РВЗ:АсбР11В 3,63+0,62’
а - значимое различие по сравнению с ΡΒ8:ΡΒ8-группой при р<0,05; ь - значимое различие по сравнению с дексаметазон:ΡΒ8-группой при р<0,05.
ЯМР-сканирование выявило значимое 2,5%-ное снижение массы безжировой ткани у животных группы дексаметазон:ΡΒδ по сравнению с животными ΡΒδ:ΡΒδ-группы. В противоположность этому, у животных группы дексаметазон:ΑсίΚIIΒ (К64 20-134)-тРс наблюдалось 13,5%-ное увеличение массы безжировой ткани, и такое увеличение было значимо более высоким по сравнению с группой ΡΒδ:ΡΒδ и дексаметазон:ΡΒδ. Кахексия представляет собой нежелательный побочный эффект, возникающий при проведении различных терапевтических процедур, включая длительную терапию глюкокортикоидами. Поэтому тот факт, что лечение с использованием человеческого белка ΑсίΚIIΒ (К64 20-134)-тРс может снижать уровень гипотрофии мышц, ассоциированной с кахексией, должен иметь клинически важное значение.
Пример 10. Влияние ΑΛΚΙΙΒ-Ρο на мышечную массу и ожирение у старых мышей или у мышей, подвергнутых овариэктомии.
Саркопения представляет собой одну из форм потери мышечной массы, ассоциированных со старением относительно здоровых людей. Это расстройство ассоциируется с прогрессирующей потерей массы скелетных мышц и снижением мышечной силы и подвижности. Этиология саркопении почти неизвестна. У женщин в период менопаузы потеря мышечной массы ускоряется так же, как и потеря кости. В соответствии с этим ΑΛΚΙΙΒ (К64, 20-134)-тРс тестировали у очень старых (двухлетних) мышей и у мышей с овариэктомией (модели климактерического состояния).
- 39 025891
8-недельных самок мышей С57ВБ/6 подвергали операции овариэктомии (ОУХ) или ложной операции, а затем оставляли в покое на 16 недель до начала исследования. В начале исследования каждую группу мышей, подвергнутых ложной операции, и мышей, подвергнутых овариэктории, разделяли на группу обработки и группу, которой вводили носитель. Мышей всех групп взвешивали, и еженедельно в течение 11 недель вводили дозу либо АсЖПВ (К64, 20-134)-тРс, либо буфера в качестве контроля. Всех исследуемых мышей на дни 0 и 83 подвергали ЯМР-сканированию для определения состава веществ в организме.
По окончании исследования у ложнооперированных РВ§-мышей наблюдалась 4,7%-ная потеря безжировой массы от исходной массы, а у ложнообработанных мышей в течение всего исследования безжировая масса увеличивалась на 21%. По окончании исследования у контрольных ОУХ-мышей наблюдалась 12,1% потеря безжировой массы (значительно большая, чем у ложнооперированных мышей, которым вводили носитель), тогда как у обработанных ОУХ-мышей прирост массы составлял 12,9%.
Полученные данные показали, что слитые белки Ас1КИВ-Рс могут быть использованы для предотвращения потери мышечной массы, которая обычно наблюдается у женщин в климактерическом периоде.
Для оценки эффектов Ас1КПВ-Рс у естественно стареющих животных, самцов мышей С57ВЬ/6 оставляли на 70 недель до начала обработки. Мышей распределяли на 2 группы (РВ§ и 10 мг/кг Ас1КЛВ (К64, 20-134)-тРс). Мышей каждой группы взвешивали и 2 раза в неделю в течение 10 недель вводили нужную дозу. В течение всего исследования прирост массы безжировой ткани у обработанной группы был значительно выше, чем у РВ§-группы.
% изменения безжировой массы РВЗ 10 мг/кг
Среднее (% ст фонового уровня) 101,76 117,27
Ср.кв.откл. 3,83 3, 91
Р-величина для РВЗ <0,001
У животных группы обработки масса отдельных мышц была значительно выше, чем у мышей РВ§группы.
Масса мышц Икроножная мышца (Ь+В) Бедро (Ь+В) Грудная клетка (ь+ю
РВЗ 0,283±0,07 0,156±0,01 0,241±0,07
АсРВИВ (В64 20134)-гаГс 0,371+0,03* 0,192±0,021* 0,330±0,05*
* р<0,05
Было также обнаружено, что целостность мышц у животных группы обработки выше, чем у животных РВ§-группы, на что указывает явное снижение уровня внутримышечного жира и улучшение структуры цитоскелета (см. фиг. 10).
Полученные данные показали, что слитые белки Ас1КЛВ-Рс могут быть использованы для лечения гипотрофии мышц, ассоциированной со старением мужчин и женщин.
Пример 11. Влияние Ас1КПВ-Рс на потерю мышечной массы, ассоциированную с кастрацией.
Рак предстательной железы обычно подвергают лечению методом антиандрогенной терапии. Побочными эффектами такого лечения являются потеря мышечной массы и увеличение степени ожирения. У кастрированных мышей наблюдаются аналогичные изменения, а поэтому такие мыши представляют собой хорошую модель для проведения исследования на возможность применения Ас1КЛВ-Рс в медицине.
8-недельных самцов мышей С57ВБ/6 кастрировали или подвергали ложной кастрации, а затем оставляли на 3 недели до начала исследований. Затем ложнокастрированных и кастрированных мышей подразделяли на группы, которым вводили РВ§ и Ас1КПВ (К64, 20-134)-тРс (10 мг/кг). Мышей взвешивали и один раз в неделю в течение 12 недель подкожно вводили нужную дозу. Мышей подвергали ЯМРсканированию на дни исследования 0 и 83.
Во время исследования у ложнокастрированных РВ§-мышей прирост массы безжировой ткани со дня исследования 0 в среднем составлял 9,72%±3,67, а у ложнокастрированных мышей, которым вводили Ас1КПВ (К64, 20-134)-тРс, прирост составлял 35,79%±3,1. У кастрированных РВ§-обработанных мышей потеря массы безжировой ткани со дня 0 составляла 8,1%±4,22, а у обработанных кастрированных мышей наблюдался прирост массы, составляющий 17,77%±3,86. Кроме того, кастрация приводила к увеличению степени ожирения, а Ас1КПВ (К64, 20-134)-тРс-обработка способствовала уменьшению прироста жировой массы.
Масса икроножных мышц и мышц грудной клетки у кастрированных мышей, обработанных носителем, была меньше, чем масса ложнокастрированных мышей РВ§-группы (масса икроножных мышц у кастрированных мышей 0,275±0,03 г, масса мышц грудной клетки у кастрированных мышей 0,196±0,06 г; масса икроножных мышц у ложнокастрированных мышей 0,313±0,02 г, масса мышц грудной клетки у ложнокастрированных мышей 0,254±0,03 г). Ас1КПВ (К64, 20-134)-тРс-обработка приводила к значительному ослаблению скорости снижения мышечной массы, индуцированного кастрацией (масса икроножных мышц у кастрированных мышей 0,421±0,03 г, масса мышц грудной клетки у кастрированных
- 40 025891 мышей 0,296±0,06 г).
Пример 12. Влияние АсЖИВ-Рс на кахексию при раке.
Многие опухоли ассоциируются с потерей аппетита и со значительной потерей мышечной массы. У пациентов с кахексией прогноз хуже, чем у пациентов, не страдающих кахексией. Клеточная линия рака толстой кишки СТ26 индуцирует развитие тяжелой кахексии у мышей. У этой модели АсιКIIБ(К64 20134) тестировали на его воздействие на кахексию, индуцированную ксенотрансплантацией.
В эксперименте участвовало шесть групп мышей.
Группа Опухоль Обработка Доза Парадигма лечения
1 N 7ЕН Об./об. Терапевтическое
2 N АсПКПВ-Ес 10 мг/кг Терапевтическое
3 Υ УЕН Об./об. Терапевтическое
4 Υ АсРНПВ-Ес 10 мг/кг Терапевтическое
5 Υ АсДППВ-Ес 30 мг/кг Терапевтическое
б Υ АсРКПВ-Гс 10 мг/кг Превентивное
Животным групп 3-6 подкожно вводили 5х106 опухолевых клеток. Группу 6 сразу обрабатывали АсРКПВ-Рс два раза в неделю. Группам 1-5 начинали вводить дозу на 28-й день исследования, когда опухоли достигали размера 300-500 мм3. Как показано на фиг. 11, АсРКПВ-Рс вызывал значительное снижение потери мышечной массы, ассоциированной с опухолями СТ26, как у мышей с диагностированными опухолями, так и у мышей, используемых в качестве превентивной модели до введения им опухолевых клеток.
Пример 13. Влияние вариантов АсРКПВ-Рс на мышечную массу у мышей дикого типа.
Это исследование продемонстрировало влияние нижеследующих АсККПВ-конструкций, конъюгированных с Рс, на мышечную массу и другие ткани у 6-недельных самцов мышей С57ВЬ/6. Мышей взвешивали и этим мышам два раза в неделю внутрибрюшинно инъецировали либо РВЗ, либо АсСКИВконструкции, конъюгированные с Рс (10 мг/кг):
Мышей подвергали ЯМР-сканированию в начале, в середине и в конце исследования. Мышцы бедра, мышцы грудной клетки и икроножные мышцы, а также печень, почки и селезенку взвешивали и хранили в формалине.
Первый анализ данных показал, что АсККПВ (К64 20-134)-Рс вызывал значительное увеличение мышечной массы и безжировой массы тела, а также оказывал более эффективное действие на другие ткани. Варианты Ь79О и Ь79Е способствовали увеличению мышечной массы в меньшей степени, и при этом оказывали незначительное влияние на другие ткани. Конструкции А24N и К64К оказывали промежуточное действие на мышцы и другие ткани. Полученные данные подтвердили, что варианты АсЖИВ, обладающие пониженной способностью связываться с активином, имеют желательные свойства, в частности оказывают селективное действие на мышечную ткань.
Введение путем ссылки.
Все упомянутые здесь публикации и патенты во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и отдельно введены в настоящее описание посредством ссылки.
Хотя в настоящей заявке обсуждаются конкретные варианты рассматриваемых объектов изобретения, однако вышеуказанное описание имеет лишь иллюстративный, а не ограничительный характер. Многие варианты будут очевидны специалистам в данной области исходя из описания изобретения и прилагаемой ниже формулы изобретения. Полный объем изобретения вместе с полным объемом эквивалентов и вместе с указанными вариантами в описании изобретения должен быть определен формулой изобретения.

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Вариант белка Α^ΗΙ^, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности аминокислот 29-109 5ЕО ГО ΝΟ:2, где указанный белок содержит по меньшей мере одну последовательность Ν-Х-З/Т в положении, отличающемся от положения эндогенной последовательности Ν-Х-З/Т Αοί^Ι^, и где указанная по меньшей мере одна последовательность Ν-Х-З/Т находится в положении, находящемся за пределами лигандсвязывающего кармана.
  2. 2. Вариант белка Αс!КIIΒ по п.1, где указанный белок содержит Ν в положении, соответствующем положению 24 5ЕР ГО ΝΟ:2, и δ или Т в положении, соответствующем положению 26 δЕ^ ГО ΝΟ:2, и где указанный белок ингибирует передачу сигнала под действием активина, миостатина и/или СЭР11 в клеточном анализе.
  3. 3. Вариант белка Αс!КIIΒ по п.1, где указанный белок содержит К или К в положении, соответствующем положению 64 δЕ^ ГО ΝΟ:2.
  4. 4. Вариант белка Α^^ΙΚ по п.1, где указанный белок содержит по меньшей мере одну дополнительную модификацию по отношению к последовательности δЕ^ ГО ΝΟ:2 и где указанная по меньшей мере одна дополнительная модификация представляет собой консервативную модификацию, расположенную в лигандсвязывающем кармане.
  5. 5. Вариант белка Α^^ΙΚ по п.1, где указанный белок содержит по меньшей мере одну дополнительную модификацию по отношению к последовательности δЕ^ ГО ΝΟ:2 и где указанная по меньшей мере одна дополнительная модификация представляет собой модификацию в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из К74, К40, 05.3, К55, Р82 и Ь79 δЕ^ ГО ΝΟ:2.
  6. 6. Вариант белка Αс!КIIΒ по п.1, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, начинающуюся в положении аминокислоты, соответствующем любой из аминокислот 22-25 δЕ^ ГО ΝΟ:2, и заканчивающуюся в положении аминокислоты, соответствующем любой из аминокислот 131, 133 или 134 δΚΟ ГО ΝΟ:2.
  7. 7. Вариант белка Αс!КIIΒ по любому из пп.1-6, где указанный белок представляет собой слитый белок, дополнительно содержащий гетерологичную часть.
  8. 8. Вариант слитого белка Αс!КIIΒ по п.7, где указанный белок представляет собой гомодимер.
  9. 9. Вариант слитого белка Αс!КIIΒ по п.7, где указанная гетерологичная часть содержит константную область тяжелой цепи !дС.
    - 49 025891
  10. 10. Вариант белка АсЖИВ по любому из пп.1-9, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности аминокислот 29109 δΙΤ) ГО N0:2.
  11. 11. Вариант белка АсЖИВ по любому из пп.1-9, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности аминокислот 29109 δ КС) ГО N0:2.
  12. 12. Вариант белка АсЖИВ по любому из пп.1-9, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислот 29109 δ КС) ГО N0:2.
    Последовательность человеческого растворимого полипептида АсСКИВ (внеклеточного), представленная как δΕΟ ГО N0: 1 (116 аминокислот)
EA201300713A 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ EA025891B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89930407P 2007-02-02 2007-02-02
US92708807P 2007-05-01 2007-05-01
US93188007P 2007-05-25 2007-05-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300713A1 EA201300713A1 (ru) 2014-03-31
EA025891B1 true EA025891B1 (ru) 2017-02-28

Family

ID=39682306

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300713A EA025891B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA201691260A EA033623B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA200970729A EA018868B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 Варианты, происходящие из actriib, и их применение

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691260A EA033623B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA200970729A EA018868B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 Варианты, происходящие из actriib, и их применение

Country Status (25)

Country Link
US (6) US7842663B2 (ru)
EP (6) EP3293198B1 (ru)
JP (7) JP5554067B2 (ru)
KR (5) KR101801506B1 (ru)
CN (5) CN105906708A (ru)
AR (1) AR065169A1 (ru)
AU (5) AU2008214375B2 (ru)
BR (1) BRPI0808164B8 (ru)
CA (2) CA3038197A1 (ru)
CY (1) CY1115489T1 (ru)
DK (1) DK2607379T3 (ru)
EA (3) EA025891B1 (ru)
ES (4) ES2587934T3 (ru)
HK (2) HK1186477A1 (ru)
HR (1) HRP20140731T1 (ru)
IL (6) IL200171A (ru)
ME (1) ME02234B (ru)
MX (5) MX363943B (ru)
NO (1) NO3053933T3 (ru)
PL (2) PL3053933T3 (ru)
PT (1) PT2607379E (ru)
RS (1) RS53455B (ru)
SI (1) SI2607379T1 (ru)
TW (9) TW201907946A (ru)
WO (1) WO2008097541A2 (ru)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
DK2332977T3 (en) 2004-07-23 2016-02-29 Acceleron Pharma Inc ActRII receptor polypeptides
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
CA3045808C (en) 2005-11-23 2022-08-16 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2484372A1 (en) * 2007-02-09 2012-08-08 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Promoting Bone Growth in Cancer Patients
TWI573802B (zh) * 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
CA2699936A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
KR20110031951A (ko) 2008-06-26 2011-03-29 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
WO2009158025A2 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HRP20230761T1 (hr) * 2008-08-14 2023-10-13 Acceleron Pharma Inc. Gdf zamke
AU2015202035B2 (en) * 2008-08-14 2017-03-23 Acceleron Pharma Inc. Use of GDF traps to increase red blood cell levels
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
EA201791940A3 (ru) 2008-11-26 2018-04-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора iib активина и их использование
US8138142B2 (en) * 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
SI2424895T1 (en) * 2009-04-27 2018-01-31 Novartis Ag Ingredients and procedures for increasing muscle growth
AU2010258931B2 (en) * 2009-06-08 2015-04-23 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
US8293881B2 (en) * 2009-06-12 2012-10-23 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleic acid encoding a truncated ActRIIB fusion protein
AU2015203400A1 (en) * 2009-08-13 2015-07-16 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
IL287990B (en) * 2009-08-13 2022-07-01 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
CN102781518A (zh) 2009-09-09 2012-11-14 阿塞勒隆制药公司 Actriib拮抗剂及其给药和用途
WO2011056896A1 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
ES2658292T3 (es) * 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
US20150359850A1 (en) 2009-11-25 2015-12-17 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an anti-activin-a compound to a subject
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
EP2638065A4 (en) 2010-11-08 2014-04-09 Acceleron Pharma Inc ACTRIIA BINDING AGENTS AND USES THEREOF
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
HUE040276T2 (hu) 2011-07-01 2019-02-28 Novartis Ag Eljárás metabolikus rendellenességek kezelésére
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
CA2852683A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ineffective erythropoiesis
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
SG10201605027XA (en) * 2011-12-19 2016-08-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
GB201206559D0 (en) * 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
ES2753811T3 (es) * 2012-10-24 2020-04-14 Celgene Corp Biomarcador para uso en el tratamiento de anemia
CN112957462A (zh) 2012-10-24 2021-06-15 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
WO2014071158A1 (en) * 2012-11-02 2014-05-08 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US9872906B2 (en) 2013-03-15 2018-01-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Ceftolozane antibiotic compositions
EP3037524B8 (en) 2013-08-23 2020-03-04 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing retinal tissue and retina-related cells
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3808778A1 (en) 2014-04-18 2021-04-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
CA2951926C (en) 2014-06-13 2023-01-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ulcers
US20160075772A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
ES2946160T3 (es) 2014-12-03 2023-07-13 Celgene Corp Antagonistas de activina-ActRII y usos para tratar síndrome mielodisplásico
MX2017007519A (es) * 2014-12-08 2017-08-22 Novartis Ag Antagonistas de miostatina o activina para el tratamiento de sarcopenia.
EP3256148A1 (en) 2015-02-12 2017-12-20 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for predicting the responsiveness of a patient affected with malignant hematological disease to chemotherapy treatment and methods of treatment of such disease
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EA039118B1 (ru) * 2015-04-01 2021-12-07 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способ лечения прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии
ES2863564T3 (es) 2015-04-06 2021-10-11 Acceleron Pharma Inc Heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos
CN107849114B (zh) * 2015-04-06 2021-08-20 阿塞勒隆制药公司 单臂i型和ii型受体融合蛋白和其用途
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
SG11201708351XA (en) 2015-04-22 2017-11-29 Alivegen Usa Inc Novel hybrid actriib ligand trap proteins for treating muscle wasting diseases
CA2986432A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Celgene Corporation In vitro cell culture methods for beta-thalassemia using activin type ii receptor ligand traps
BR112018007066A2 (pt) 2015-10-09 2018-10-23 Sarepta Therapeutics Inc composições e métodos para tratamento da distrofia muscular de duchene e distúrbios relacionados
US11123430B2 (en) 2015-11-04 2021-09-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
EP3380121B1 (en) 2015-11-23 2023-12-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for use in treating eye disorders
WO2017145166A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Composition and method for treating amyotrophic lateral sclerosis
JP6987072B2 (ja) 2016-03-10 2021-12-22 アクセレロン ファーマ インコーポレーテッド アクチビン２型受容体結合タンパク質及びその使用
RS62011B1 (sr) 2016-07-15 2021-07-30 Acceleron Pharma Inc Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije
KR20190040972A (ko) 2016-07-27 2019-04-19 악셀레론 파마 인코포레이티드 골섬유증 치료 방법 및 조성물
WO2018067879A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
JP7280182B2 (ja) 2016-10-05 2023-05-23 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびその使用
AU2017340504A1 (en) 2016-10-05 2019-04-11 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and method for treating kidney disease
US11013785B2 (en) 2016-11-10 2021-05-25 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIA variants and methods of use thereof
WO2018144542A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Acceleron Pharma Inc. TGFβ AND ACTRII ANTAGONISTS FOR USE IN INCREASING IMMUNE ACTIVITY
CN107011430B (zh) * 2017-04-07 2020-09-01 哈尔滨医科大学 一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法
WO2019094751A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
JP2021518745A (ja) 2018-01-12 2021-08-05 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アクチビンｉｉｂ型受容体変異体およびそれらの使用方法
RU2683277C1 (ru) * 2018-03-02 2019-03-27 Наталья Константиновна Осина Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью
BR112022013589A2 (pt) 2020-01-08 2022-09-13 Regeneron Pharma Tratamento da fibrodisplasia ossificante progressiva
EP4121088A1 (en) * 2020-03-20 2023-01-25 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
WO2021189006A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iia variants
WO2023108137A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Biogen Ma Inc. Modified actriib proteins and methods of use thereof
US11945856B2 (en) 2022-01-28 2024-04-02 35Pharma Inc. Activin receptor type IIB variants and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions

Family Cites Families (223)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0105014B1 (en) 1982-09-24 1992-05-20 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Repair of tissue in animals
NZ210699A (en) 1984-01-04 1989-06-28 Int Genetic Eng Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family
ATE128715T1 (de) 1984-07-16 1995-10-15 Celtrix Pharma Polypeptide induzierende faktoren in knochen und knorpel.
JPH0637520B2 (ja) * 1985-07-03 1994-05-18 味の素株式会社 ポリペプチド
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US4973577A (en) * 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5182375A (en) 1987-08-28 1993-01-26 The Salk Institute For Biological Studies DNA encoding follistatin
EP0548276A4 (en) 1990-09-13 1993-12-29 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US5885794A (en) * 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
JPH06500574A (ja) 1991-05-10 1994-01-20 ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ アクチビン／ＴＧＦ―βスーパーファミリーのレセプターのクローニングおよび組換えによる産生
US20050186593A1 (en) 1991-05-10 2005-08-25 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
DK0592562T3 (da) 1991-06-25 1999-08-30 Genetics Inst BMP-9-præparater
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
CA2144081C (en) 1992-09-16 2004-11-30 Filip Roos Protection against liver damage by hgf
US6692925B1 (en) * 1992-11-17 2004-02-17 Ludwig Institute For Cancer Research Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use
EP0679163A4 (en) 1993-01-12 1997-07-16 Univ Johns Hopkins Med FACTOR-3 OF GROWTH AND DIFFERENTIATION.
CA2161807A1 (en) 1993-05-12 1994-11-24 Anthony J. Celeste Bmp-10 compositions
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5831050A (en) * 1993-06-07 1998-11-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor
AU701623B2 (en) 1993-10-14 1999-02-04 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US6686198B1 (en) 1993-10-14 2004-02-03 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5658876A (en) * 1994-04-28 1997-08-19 The General Hospital Corporation Activin antagonists as novel contraceptives
US5545616A (en) 1994-09-22 1996-08-13 Genentech, Inc. Method for predicting and/or preventing preterm labor
US5760010A (en) 1995-01-01 1998-06-02 Klein; Ira Method of treating liver disorders with a macrolide antibiotic
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
DE69636866D1 (en) 1995-04-11 2007-03-15 Gen Hospital Corp Reverse "two-hybrid"-systeme
GB2306481A (en) 1995-10-21 1997-05-07 Univ Manchester Pharmaceutical comprising a stimulator of activin and/or inhibin
EP0771873A3 (en) * 1995-10-27 1998-03-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Neuronal cell-specific receptor protein
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6004780A (en) * 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US20050244867A1 (en) * 1996-03-26 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
CZ130199A3 (cs) 1996-10-25 1999-07-14 G. D. Searle & Co. Cirkulárně permutovaní agonisté receptoru erythropoietinu
US6605699B1 (en) * 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
US6034062A (en) 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US6231880B1 (en) * 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
CA2297489A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Emory University Novel bone mineralization proteins, dna, vectors, expression systems
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
AU8666398A (en) 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6953662B2 (en) * 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
AU8921698A (en) * 1997-08-29 1999-03-16 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
CN1277632A (zh) 1997-10-03 2000-12-20 中外制药株式会社 天然人源化抗体
US6004937A (en) 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]
US6696411B1 (en) * 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
CN1317967A (zh) 1998-09-17 2001-10-17 伊莱利利公司 蛋白质制剂
JP2002526073A (ja) * 1998-09-22 2002-08-20 龍 余 新規のヒト生長分化因子のコード配列、そのｄｎａ配列によりコードされるポリペプチド、およびこれらの製造方法。
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6777205B1 (en) * 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
NZ513642A (en) 1999-01-21 2004-02-27 Metamorphix Inc Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP1174149A1 (en) 1999-04-19 2002-01-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor
US6468543B1 (en) * 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
WO2001009368A1 (en) 1999-07-30 2001-02-08 The General Hospital Corporation Follistatin antagonists
CA2390292A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Maxygen Holdings Ltd. Interferon gamma conjugates
CA2394576A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Research Development Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP4487376B2 (ja) * 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
WO2001087329A1 (en) 2000-05-15 2001-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
US20030162291A1 (en) 2000-06-22 2003-08-28 Seigfried Hekimi Clk-2, cex-7 and coq-4 genes, and uses thereof
US20030215913A1 (en) 2000-07-19 2003-11-20 Enrique Alvarez Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof
US6632180B1 (en) 2000-09-07 2003-10-14 John H. Laragh Method for evaluating and treating hypertension
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
BR0115475A (pt) 2000-11-20 2004-02-10 Univ Illinois Proteìnas de estruturação de membranas
WO2002043759A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Wyeth Method and composition for modulating bone growth
US20030082233A1 (en) 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
MXPA03005406A (es) * 2000-12-20 2003-09-25 Hoffmann La Roche Conjugados de eritropoyetina.
TWI329129B (en) * 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US20040132675A1 (en) * 2002-02-08 2004-07-08 Calvin Kuo Method for treating cancer and increasing hematocrit levels
US7294472B2 (en) 2001-03-14 2007-11-13 Caden Biosciences Method for identifying modulators of G protein coupled receptor signaling
EP1369130A1 (en) 2001-03-16 2003-12-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing sustained release preparation
RS20120253A1 (en) 2001-05-24 2013-02-28 Zymogenetics Inc. TACI-IMUNOGLOBULINSKI PROTEIN FUNCTIONS
IL159015A0 (en) * 2001-05-25 2004-05-12 Genset Sa Polypeptides, their preparation and use
AUPR638101A0 (en) 2001-07-13 2001-08-09 Bioa Pty Limited Composition and method for treatment of disease
US6855344B2 (en) * 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
JP3888998B2 (ja) 2001-07-17 2007-03-07 帝人株式会社 ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする物質の選択方法及び薬剤
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
EP2324834B1 (en) 2001-12-06 2019-05-08 Fibrogen, Inc. Methods of Increasing Endogenous Erythropoietin (EPO)
US20060234918A1 (en) 2001-12-19 2006-10-19 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for treating and preventing cancers that express the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of hormones and receptors
US20030144203A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
US6998118B2 (en) * 2001-12-21 2006-02-14 The Salk Institute For Biological Studies Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection
US20030224397A1 (en) 2002-02-11 2003-12-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
JP4429729B2 (ja) 2002-02-21 2010-03-10 ワイス エルエルシー Ｇａｓｐ１；フォリスタチンドメイン含有タンパク質
WO2003072714A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Wyeth Follistatin domain containing proteins
US20030219846A1 (en) 2002-02-28 2003-11-27 Pfizer Inc. Assay for activity of the ActRIIB kinase
AU2003232485A1 (en) 2002-04-18 2003-10-27 Mtm Laboratories Ag Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
CN1753904A (zh) 2002-08-16 2006-03-29 惠氏公司 骨形态发生蛋白－2的雌激素效应元件及其使用方法
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AU2002953327A0 (en) 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
ZA200506246B (en) 2003-02-07 2006-12-27 Prometic Biosciences Inc Medium-chain length fatty acids, glycerides and analogues as stimulators of erythropoiesis
WO2004073633A2 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
ATE474593T1 (de) 2003-03-21 2010-08-15 Celldex Therapeutics Ltd Behandlung von allergischen erkrankungen unter verwendung eines modulators des notch signaling pathway
US20040197828A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Gaddy Dana P. Method for diagnosis and treatment of bone turnover
WO2005028517A2 (en) 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
EP1635870A2 (en) 2003-06-02 2006-03-22 Wyeth Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
CA2529623A1 (en) 2003-06-16 2005-02-17 Celltech R & D, Inc. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
WO2005009460A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Medexis, S.A. Pharmaceutical composition comprising activin a, alk-4 or derivatives thereof for the treatment of ophthalmic disorders or cancer
US20070135336A1 (en) 2003-09-15 2007-06-14 De Kretser David Follistatin isoforms and uses thereof
WO2005033134A2 (en) 2003-09-30 2005-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Secreted protein therapeutics and uses thereof
JP2007507429A (ja) 2003-10-06 2007-03-29 モナシュ ユニバーシティー 治療方法
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
PL1706428T3 (pl) 2004-01-22 2010-02-26 Merck Patent Gmbh Przeciwciała przeciwnowotworowe o zredukowanym wiązaniu dopełniacza
US20050197292A1 (en) * 2004-01-30 2005-09-08 Glennda Smithson Compositions and methods for treating T-cell mediated pathological conditions
AU2005229072A1 (en) 2004-03-26 2005-10-13 Acceleron Pharma Inc. BMP-3 propeptides and related methods
EP1730186A2 (en) 2004-03-31 2006-12-13 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
JP4688483B2 (ja) 2004-04-15 2011-05-25 株式会社テクノネットワーク四国 フォリスタチン変異体ポリペプチド
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
AU2005258286A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Acceleron Pharma Inc. GDF3 propeptides and related methods
JP5149620B2 (ja) * 2004-07-23 2013-02-20 エンドサイト，インコーポレイテッド ２価リンカーおよびその結合体
EP1794191B1 (en) 2004-08-05 2016-05-18 The Regents of The University of California Molecules with effects on cellular development and function
BRPI0514253A (pt) 2004-08-12 2008-06-03 Wyeth Corp terapia de combinação para diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares usando composições contendo inibidores de gdf-8
EP1804824B1 (en) 2004-09-29 2017-01-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Fsh and fsh receptor modulator compositions and methods for inhibiting osteoclastic bone resorption and bone loss in osteoporosis
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
ES2547866T3 (es) 2005-02-16 2015-10-09 The General Hospital Corporation Uso de proteínas de fusión de hemojuvelina para regular el metabolismo del hierro mediado por hepcidina
JPWO2006115274A1 (ja) 2005-04-26 2008-12-18 味の素株式会社 骨髄赤血球前駆細胞分化促進剤
CN103450359B (zh) 2005-08-19 2018-07-24 惠氏有限责任公司 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途
JP2007099764A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 Ajinomoto Co Inc 血糖低下剤
AU2006294511B2 (en) 2005-09-28 2011-11-17 Zymogenetics, Inc IL-17A and IL-17F antagonists and methods of using the same
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CA3045808C (en) 2005-11-23 2022-08-16 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
EP1968621A2 (en) 2005-12-06 2008-09-17 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
AU2006326815A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Merck Frosst Canada Ltd. Heteroaromatic compounds as inhibitors of stearoyl-coenzyme A delta-9 desaturase
CA2634940A1 (en) 2005-12-21 2007-07-05 Schering Corporation Treatment of nonalcoholic fatty liver disease using cholesterol lowering agents and h3 receptor antagonist/inverse agonist
WO2007076127A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Biogen Idec Ma Inc Condensed imidazoles or pyrazoles and their use as transforming growth factor modulators
WO2007084977A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 Beckman Coulter, Inc. Low hemoglobin concentration cell percentage and method of use in detection of iron deficiency
CA2637375A1 (en) 2006-01-25 2007-08-02 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
JP2009528375A (ja) 2006-02-28 2009-08-06 ウェルスタット セラピューティクス コーポレイション 代謝障害を処置するための化合物
US20080102065A1 (en) * 2006-04-14 2008-05-01 Borges Luis G Erythropoietin receptor extended duration limited agonists
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
CN101489544A (zh) * 2006-05-09 2009-07-22 海玛奎斯特医药公司 治疗血液病的方法
MX2009000722A (es) * 2006-07-21 2009-06-11 Lyne Lab Composiciones liquidas de acetato de calcio.
GB0615129D0 (en) 2006-07-29 2006-09-06 Univ Cardiff Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies
WO2008030367A2 (en) 2006-09-01 2008-03-13 The General Hospital Corporation Selective myostatin inhibitors
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US7547781B2 (en) * 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008060139A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
WO2008073292A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephro parhy (rcn)
AU2007332473B2 (en) 2006-12-14 2012-09-27 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Claudin-3 monoclonal antibody, and treatment and diagnosis of cancer using the same
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) * 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2484372A1 (en) * 2007-02-09 2012-08-08 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Promoting Bone Growth in Cancer Patients
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
JP2010529041A (ja) * 2007-06-01 2010-08-26 ワイス・エルエルシー Ｂｍｐ−１０活性を調整する方法および組成物
WO2009009059A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Biogen Idec Ma Inc. Spiro compounds as antagonists of tgf-beta
LT2170396T (lt) 2007-08-03 2017-03-10 Summit (Oxford) Limited Vaistų deriniai, skirti diušeno raumenų distrofijos gydymui
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
GB0715938D0 (en) 2007-08-15 2007-09-26 Vastox Plc Method of treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009025651A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
WO2009035629A1 (en) 2007-09-13 2009-03-19 Ludwig Institute Of Cancer Research Method for modifying cellular immune response by modulating activin activity
CA2699936A1 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
PE20091163A1 (es) * 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
JP5583591B2 (ja) 2007-11-21 2014-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド Ｗｉｓｅ結合抗体及びエピトープ
EP2265603B1 (en) 2008-03-13 2014-05-07 The General Hospital Corporation Inhibitors of the bmp signaling pathway
WO2009137075A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
CA2725208A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
KR20110031951A (ko) 2008-06-26 2011-03-29 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
WO2009158025A2 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HRP20230761T1 (hr) * 2008-08-14 2023-10-13 Acceleron Pharma Inc. Gdf zamke
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
US20110293526A1 (en) 2008-11-20 2011-12-01 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
EA201791940A3 (ru) 2008-11-26 2018-04-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора iib активина и их использование
US8138142B2 (en) * 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
US8110355B2 (en) 2009-02-20 2012-02-07 GenRemedy, LLC Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
SI2424895T1 (en) 2009-04-27 2018-01-31 Novartis Ag Ingredients and procedures for increasing muscle growth
AU2010258931B2 (en) 2009-06-08 2015-04-23 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
US8293881B2 (en) 2009-06-12 2012-10-23 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleic acid encoding a truncated ActRIIB fusion protein
IL287990B (en) 2009-08-13 2022-07-01 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
CN102781518A (zh) 2009-09-09 2012-11-14 阿塞勒隆制药公司 Actriib拮抗剂及其给药和用途
WO2011056896A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
WO2012027065A2 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
CN103492562B (zh) * 2011-02-03 2017-04-05 佐马技术有限公司 用于增强细菌中功能蛋白表达的方法和材料
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
HUE040276T2 (hu) 2011-07-01 2019-02-28 Novartis Ag Eljárás metabolikus rendellenességek kezelésére
CA2852683A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ineffective erythropoiesis
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
US20140303068A1 (en) 2011-10-28 2014-10-09 Paranta Biosciences Limited Method of treating mucus hypersecretion
SG10201605027XA (en) 2011-12-19 2016-08-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10034920B2 (en) 2012-05-17 2018-07-31 Paranta Biosciences Limited Method of treatment and agents useful for same
US9663569B2 (en) 2012-06-14 2017-05-30 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Use of blocking agents of bone morphogenic protein (BMP) signalling for the treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
CA2874117C (en) 2012-07-02 2021-10-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Pharmaceutical agent comprising anti-bmp9 antibody as active ingredient for treatment of anemia such as renal anemia and cancer anemia
CN112957462A (zh) 2012-10-24 2021-06-15 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
ES2753811T3 (es) 2012-10-24 2020-04-14 Celgene Corp Biomarcador para uso en el tratamiento de anemia
WO2014064292A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) A method for preventing or treating atrial fibrillation
WO2014071158A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
BR112015010566A2 (pt) 2012-11-08 2017-07-11 Clearside Biomedical Inc métodos e dispositivos para o tratamento de doenças oculares em indivíduos humanos
WO2014093531A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin in strategies with stem cells
ES2715710T3 (es) 2013-01-25 2019-06-05 Shire Human Genetic Therapies Folistatina en el tratamiento de la distrofía muscular de Duchenne
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
WO2014187807A1 (en) 2013-05-21 2014-11-27 Arcarios B.V. Follistatin derivatives
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
RU2016108652A (ru) 2013-08-14 2017-09-14 Новартис Аг Способы лечения спорадического миозита с тельцами включений
EP3084000A4 (en) 2013-12-16 2017-09-20 Paranta Biosciences Limited Method of diagnosis and treatment
WO2015108972A1 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
JP2017510622A (ja) 2014-01-27 2017-04-13 ノバルティス アーゲー 筋萎縮を予測するバイオマーカー、方法および使用
JP6601687B2 (ja) 2014-03-31 2019-11-06 大日本住友製薬株式会社 進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤
EP3808778A1 (en) 2014-04-18 2021-04-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
TW201625675A (zh) 2014-06-13 2016-07-16 聖塔瑪麗亞生物治療公司 經調配之受體多肽及相關方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHATIA Prakash K. et al. Protein Glycosylation: Implications for In Vivo Functions and Therapeutic Applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1998, vol. 64, pp. 155-201, реферат, с. 187, 188 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016208313A1 (en) 2016-08-11
KR101801506B1 (ko) 2017-11-24
US7842663B2 (en) 2010-11-30
EP2607379B1 (en) 2014-05-28
IL275608B (en) 2021-10-31
EA018868B1 (ru) 2013-11-29
ES2796347T3 (es) 2020-11-26
KR20160125526A (ko) 2016-10-31
KR102382781B1 (ko) 2022-04-04
PT2607379E (pt) 2014-08-25
WO2008097541A3 (en) 2009-03-05
KR20090114393A (ko) 2009-11-03
IL286494A (en) 2021-10-31
MX2019004066A (es) 2019-08-26
US10259861B2 (en) 2019-04-16
KR20170130620A (ko) 2017-11-28
CA3038197A1 (en) 2008-08-14
TW201940502A (zh) 2019-10-16
EP3293198B1 (en) 2020-04-08
JP2013155180A (ja) 2013-08-15
PL3053933T3 (pl) 2018-03-30
MX2020014234A (es) 2022-06-08
TWI548647B (zh) 2016-09-11
MX363943B (es) 2019-04-08
TW201803890A (zh) 2018-02-01
ES2488854T3 (es) 2014-08-29
TW202021980A (zh) 2020-06-16
KR102317987B1 (ko) 2021-10-28
TWI782836B (zh) 2022-11-01
AR065169A1 (es) 2009-05-20
US20220281951A1 (en) 2022-09-08
TW202104248A (zh) 2021-02-01
CN105906707B (zh) 2021-03-12
IL225045A (en) 2016-04-21
AU2008214375B2 (en) 2013-05-09
IL200171A0 (en) 2010-04-15
ME02234B (me) 2014-12-31
TW201907946A (zh) 2019-03-01
TW200846357A (en) 2008-12-01
BRPI0808164B8 (pt) 2021-05-25
HRP20140731T1 (hr) 2014-08-29
CA2677160C (en) 2019-05-21
KR20190108196A (ko) 2019-09-23
JP2020072750A (ja) 2020-05-14
KR20210132727A (ko) 2021-11-04
US20090005308A1 (en) 2009-01-01
IL240521A0 (en) 2015-10-29
TW201420597A (zh) 2014-06-01
US9399669B2 (en) 2016-07-26
NO3053933T3 (ru) 2018-02-17
MX2009008154A (es) 2009-08-12
EP3053933A1 (en) 2016-08-10
CN101679505B (zh) 2016-05-25
CN105884880A (zh) 2016-08-24
TW201627320A (zh) 2016-08-01
JP5876847B2 (ja) 2016-03-02
EP2805967B1 (en) 2016-04-20
MX350324B (es) 2017-09-04
KR101669278B1 (ko) 2016-10-25
KR102072897B1 (ko) 2020-02-03
US8343933B2 (en) 2013-01-01
AU2016208313B2 (en) 2018-03-01
CA2677160A1 (en) 2008-08-14
EP3293198A1 (en) 2018-03-14
BRPI0808164A2 (pt) 2014-07-08
CN105884880B (zh) 2019-12-10
JP2018108112A (ja) 2018-07-12
CN105906708A (zh) 2016-08-31
HK1203530A1 (zh) 2015-10-30
US20110092670A1 (en) 2011-04-21
HK1186477A1 (en) 2014-03-14
CN105924517A (zh) 2016-09-07
EA200970729A1 (ru) 2010-02-26
EP2125884B1 (en) 2014-07-09
JP6662939B2 (ja) 2020-03-11
JP2022044589A (ja) 2022-03-17
EA201691260A1 (ru) 2017-02-28
ES2652318T3 (es) 2018-02-01
EP3053933B1 (en) 2017-09-20
AU2008214375A1 (en) 2008-08-14
CN105906707A (zh) 2016-08-31
WO2008097541A2 (en) 2008-08-14
BRPI0808164B1 (pt) 2020-05-05
AU2021245102A1 (en) 2021-10-28
IL275608A (en) 2020-08-31
JP6317779B2 (ja) 2018-04-25
SI2607379T1 (sl) 2014-08-29
DK2607379T3 (da) 2014-09-01
TW202214680A (zh) 2022-04-16
EP2125884A2 (en) 2009-12-02
CN101679505A (zh) 2010-03-24
US20170058016A1 (en) 2017-03-02
TWI432449B (zh) 2014-04-01
PL2607379T3 (pl) 2014-11-28
EP3708578A1 (en) 2020-09-16
RS53455B (en) 2014-12-31
AU2019240707A1 (en) 2019-10-24
EA201300713A1 (ru) 2014-03-31
JP2014098028A (ja) 2014-05-29
JP5554067B2 (ja) 2014-07-23
ES2587934T3 (es) 2016-10-27
IL200171A (en) 2015-08-31
EP2607379A1 (en) 2013-06-26
CY1115489T1 (el) 2017-01-04
JP2010518009A (ja) 2010-05-27
AU2018201131A1 (en) 2018-03-08
JP2016135141A (ja) 2016-07-28
IL240522B (en) 2020-07-30
EP2805967A1 (en) 2014-11-26
US20130184210A1 (en) 2013-07-18
US20200071381A1 (en) 2020-03-05
EA033623B1 (ru) 2019-11-11
CN105924517B (zh) 2022-03-01
IL240522A0 (en) 2015-10-29
WO2008097541A4 (en) 2009-05-28
IL240521A (en) 2017-10-31
AU2019240707B2 (en) 2021-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025891B1 (ru) ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
JP2021143207A (ja) 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
JP2020158546A (ja) 筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するａｃｔｒｉｉｂタンパク質およびその改変体およびその使用
JP4685452B2 (ja) Ａｃｔｒｉｉｂ融合ポリペプチドおよびその使用
EA015105B1 (ru) Антагонисты активина - actriia и их применение для стимулирования роста кости
EA018221B1 (ru) АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ