EA015105B1 - Антагонисты активина - actriia и их применение для стимулирования роста кости - Google Patents

Антагонисты активина - actriia и их применение для стимулирования роста кости Download PDF

Info

Publication number
EA015105B1
EA015105B1 EA200801406A EA200801406A EA015105B1 EA 015105 B1 EA015105 B1 EA 015105B1 EA 200801406 A EA200801406 A EA 200801406A EA 200801406 A EA200801406 A EA 200801406A EA 015105 B1 EA015105 B1 EA 015105B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
bone
amino acid
activin
acid sequence
Prior art date
Application number
EA200801406A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801406A1 (ru
Inventor
Джон НОПФ
Джасбир СИХРА
Original Assignee
Акселерон Фарма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акселерон Фарма Инк. filed Critical Акселерон Фарма Инк.
Publication of EA200801406A1 publication Critical patent/EA200801406A1/ru
Publication of EA015105B1 publication Critical patent/EA015105B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Abstract

В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для стимулирования роста кости и увеличения плотности кости.

Description

Родственные заявки
По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет следующих предварительных патентных заявок США № 60/739462, поданной 23 ноября 2005 г., 60/783322, поданной 17 марта 2006 г., и 60/844855, поданной 15 сентября 2006 г., причем указанные заявки включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей их полноте.
Уровень техники изобретения
Костные нарушения от остеопороза до переломов представляют собой ряд патологических состояний, для которых существует немного эффективных фармацевтических средств. Вместо медикаментозной терапии лечение нацелено на физические воздействия и влияние на поведение, включая иммобилизацию, физические упражнения и перемену диеты. Наличие терапевтических средств, которые стимулируют рост кости и увеличение плотности кости, было бы полезным для лечения множества костных нарушений.
Рост кости и минерализация зависят от активности двух типов клеток, остеокластов и остеобластов, но вместе с тем важнейшие аспекты этих процессов также охватывают активность хондроцитов и клеток сосудистой сети. Относительно развития процесс остеогенеза происходит посредством двух механизмов, представляющих собой эндохондральное окостенение и оссификацию в соединительно-тканной мембране, при этом первое отвечает за формирование кости в длину, а второе отвечает за формирование топологически плоских костей, таких как кости черепа. Для эндохондрального окостенения необходимо последовательное образование и разрушение хрящевых структур в ростовых пластинках, которые служат основой для образования остеобластов, остеокластов, сосудистой сети и последующей минерализации. В процессе оссификации в соединительно-тканной мембране образование кости происходит непосредственно в соединительных тканях. Для обоих процессов необходима инфильтрация остеобластов и последующее отложение матрикса.
Излечение переломов и других структурных разрушений кости происходит в ходе процесса, который, по меньшей мере, на первый взгляд, напоминает последовательность событий, развивающихся при остеогенезе, включая образование хрящевой ткани и последующую минерализацию. Процесс заживления перелома может происходить двумя способами. Прямое или первичное заживление кости происходит без образования костной мозоли. При косвенном или вторичном заживлении кости наблюдается предшествующая стадия костной мозоли. Первичное заживление переломов охватывает воссоздание механической непрерывности через область перелома. Клетки, резорбирующие кость, которые окружают область перелома, при подходящих условиях проявляют туннелирующую резорбтивную реакцию и создают проводящие пути для проникновения кровеносных сосудов и последующего заживления. Вторичное заживление кости следует за процессом воспаления, образованием мягкой мозоли, минерализацией мозоли и реконструкцией мозоли. Причиной образования гематомы и геморрагии на стадии воспаления является разрушение периостальных и эндостальных кровеносных сосудов в области повреждения. В эту область проникают воспалительные клетки. На стадии образования мягкой мозоли эти клетки производят новые сосуды, фибробласты, внутриклеточный материал и поддерживающие клетки, образуя грануляционную ткань в пространстве между фрагментами перелома. Клиническое сращение в области перелома создается волокнистой или хрящевой тканью (мягкая мозоль). Происходит образование остеобластов, опосредующих минерализацию мягкой мозоли, которая затем замещается пластинчатой костью и претерпевает нормальные процессы ремоделирования.
В дополнение к переломам и другим физическим разрушениям структуры кости, потерю содержания минеральных веществ в костях и костной массы может вызывать широкий спектр состояний, и это может приводить к серьезным медицинским проблемам. На протяжении жизни человека изменение костной массы происходит относительно прогнозируемым образом. До возраста около 30 лет и у мужчин, и у женщин нарастание костной массы до максимальных показателей происходит посредством линейного роста эндохондральных ростовых пластинок и радиального роста. И у мужчин, и у женщин в возрасте старше примерно 30 лет (в трабекулярных костях, например плоских костях, таких как кости позвоночника и таза) и в возрасте старше примерно 40 лет (в корковых костях, например длинных костях конечностей) наблюдается медленная потеря костной массы. У женщин конечная фаза значительной потери костной массы происходит, по-видимому, также в силу дефицита эстрогенов в постклимактерическом периоде. Во время этой фазы женщины могут потерять дополнительно 10% костной массы в корковых костях и 25% в трабекулярном пространстве. Возникновение патологического состояния в результате прогрессирующей потери костной массы, такого как остеопороз, в значительной степени зависит от исходной костной массы человека и от наличия отягощающих условий.
Потеря костной массы иногда носит характер дисбаланса в нормальном процессе ремоделирования кости. Здоровая кость постоянно подвергается ремоделированию. Ремоделирование начинается с резорбции кости остеокластами. Затем резорбированная кость замещается новой костной тканью, которая характеризуется образованием коллагена остеобластами и последующей кальцификацией. У здоровых людей скорости резорбции и остеогенеза сбалансированы. Остеопороз представляет собой хроническое, прогрессирующее состояние, при котором отмечается сдвиг в сторону резорбции, что приводит к общему уменьшению костной массы и минерализации кости. Остеопорозу у людей предшествует клиническая
- 1 015105 остеопения (значение минеральной плотности костей выше одного стандартного отклонения, но ниже 2,5 стандартных отклонений и ниже среднего значения минеральной плотности костей у молодого взрослого человека). Во всем мире риску развития остеопороза подвержены около 75 миллионов человек.
Таким образом, способы регуляции баланса между активностью остеокластов и остеобластов могут быть полезными для ускорения заживления переломов и других повреждений костей, а также для лечения нарушений, связанных с потерей костной массы и минерализации костей, таких как остеопороз.
Что касается остеопороза, то эстроген, кальцитонин, остеокальцин с витамином К или диеты с большими дозами кальция - все используются в качестве средств для терапевтического воздействия. Другие терапевтические подходы к остеопорозу включают бифосфонаты, паратиреоидный гормон, кальцимиметики, статины, анаболические стероиды, соли лантана и стронция и фторид натрия. Вместе с тем, такое лечение часто связано с нежелательными побочными эффектами.
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении композиций и способов для стимулирования роста и минерализации костей.
Сущность изобретения
Частично в настоящем описании изобретения показано, что молекулы, обладающие активностью антагонистов активина или ЛеЖИа (антагонисты активина и антагонисты ΛοίΒΙΙα). можно использовать для увеличения плотности кости, стимулирования роста кости и/или увеличения прочности кости. В частности, в настоящем описании показано, что растворимая форма ЛеЖИа действует как ингибитор сигнального пути активин-ЛеЖИа и способствует ίη νίνο увеличению плотности кости, роста кости и прочности кости. Тогда как большинство фармацевтических средств, стимулирующих рост кости или ингибирующих потерю костной массы, действуют либо как антикатаболические средства (также обычно называемые катаболическими средствами) (например, бифосфонаты), либо как анаболические средства (например, паратиреоидный гормон (РТН) в подходящей дозе), растворимый белок АеГКИа проявляет двойное действие, обладая как катаболическими, так и анаболическими эффектами. Таким образом, настоящим изобретением установлено, что антагонисты сигнального пути активин-АеГКПа можно использовать для увеличения плотности кости и стимулирования роста кости. Хотя растворимый АеГКИа может действовать на кость посредством механизма, отличного от антагонизма к активину, тем не менее, в настоящем описании показано, что могут быть выбраны желаемые терапевтические средства на основе антагонистической активности активин-АеГКПа. В этой связи в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы использования антагонистов активин-АеГКПа, включающих, например, активин-связывающие полипептиды АеГКИа, антитела к активину, антитела к АеГКИа, нацеленные на активин или АеГКИа малые молекулы и аптамеры, и нуклеиновые кислоты, которые уменьшают экспрессию активина и АеГКИа, для лечения нарушений, ассоциированных с низкой плотностью кости или низкой прочностью кости, таких как остеопороз, или для стимулирования роста кости у нуждающихся в этом пациентов, таких как пациенты, имеющие перелом кости. Дополнительно, растворимый полипептид АеГКИа стимулирует рост кости, не вызывая при этом соизмеримого увеличения мышечной массы.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает полипептиды, содержащие растворимый, активин-связывающий полипептид АеГКИа, который связывается с активином. Полипептиды АеГКИа можно приготовить в виде фармацевтического препарата, содержащего активин-связывающий полипептид АеГКИа и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно активин-связывающий полипептид АеГКИа связывается с активином с константой диссоциации Кс менее 1 мкмоль или менее чем 100, 10 или 1 нмоль. Необязательно, активин-связывающий полипептид АеГКИа селективно связывается с активином в сравнении с ростовыми дифференцировочными факторами ΟΌΡ11 и/или ΟΌΡ8 и предпочтительно имеет Кс, которая по меньшей мере в 10 раз, в 20 раз или в 50 раз ниже в отношении активина, чем в отношении ΟΌΡ11 и/или ΟΌΡ8. Без связи с конкретным механизмом действия, предполагается, что указанная степень селективности для ингибирования активина по сравнению с ингибированием ΟΌΡ11/ΟΌΡ8 является причиной селективного действия на кость без соответствующего заметного действия на мышцы. Во многих вариантах осуществления будут выбирать полипептид АеГКИа, достигающий желаемого действия на кость в дозах, которые вызывают увеличение мышц менее чем на 15%, менее чем на 10% или менее чем на 5%. Предпочтительно композиция имеет по меньшей мере 95% чистоту относительно других полипептидных компонентов, по оценкам с помощью эксклюзионной хроматографии, и более предпочтительно композиция имеет по меньшей мере 98% чистоту. Активинсвязывающий полипептид АеГКИа для использования в таком препарате может быть любым из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов, таким как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 3, 7 или 12, или имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 3, 7, 12 или 13. Активин-связывающий полипептид АеГКИа может включать функциональный фрагмент природного полипептида АеГКИа, такой как фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 20 или 30 аминокислот из последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 1-3 или из последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, в которой отсутствуют 10-15 С-концевых аминокислот (хвост).
- 2 015105
Растворимый активин-связывающий полипептид Ас1КНа может включать одно или несколько изменений аминокислотной последовательности (например, лиганд-связывающего домена) по сравнению с природным полипептидом Ас1КНа. Примеры измененных полипептидов Ас1КНа представлены в АО 2006/012627, р. 59, 60, включенном в качестве ссылки в настоящее описание. Изменение в аминокислотной последовательности может, например, менять гликозилирование полипептида, если оно происходит в клетке млекопитающего, насекомого или в другой эукариотической клетке, или менять протеолитическое расщепление полипептида по сравнению с природным полипептидом Ас1КНа.
Активин-связывающий полипептид Ас1КИа может быть слитым белком, который в качестве одного домена имеет полипептид Ас1КНа (например, лиганд-связывающий участок АсЖНа) и один или несколько дополнительных доменов, которые обеспечивают желаемые свойства, такие как улучшенная фармакокинетика, более легкая очистка, направленность на конкретные ткани и т.д. Например, домен слитого белка может увеличивать одно или несколько из следующего: устойчивость ίη νίνο, период полувыведения ίη νίνο, поглощение/введение, локализацию или распределение в тканях, образование белковых комплексов, мультимеризацию слитого белка и/или очистку. Активин-связывающий слитый белок Ас1КНа может включать домен иммуноглобулина Рс (дикого типа или мутанта) или сывороточного альбумина или другой полипептидный участок, который обеспечивает желаемые свойства, такие как улучшенная фармакокинетика, улучшенная растворимость или улучшенная устойчивость. В предпочтительном варианте осуществления слитый Ас1КНа-Рс содержит относительно неструктурированный линкер, расположенный между доменом Рс и внеклеточным доменом АсЖНа. Такой неструктурированный линкер может соответствовать примерно 15 аминокислотам неструктурированной области на С-терминальном конце внеклеточного домена Ас1КНа (хвост), или он может представлять собой искусственную последовательность из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или иметь длину в диапазоне от 5 до 15, 20, 30, 50 или более аминокислот, которые относительно лишены вторичной структуры, или представлять собой смесь и того, и другого. Линкер может быть обогащен остатками глицина и пролина и может, например, содержать единственную последовательность треонина/серина и глицинов или повторяющиеся последовательности треонина/серина и глицинов (например, синглеты или повторы ТО4 или 8О4). Слитый белок может включать подпоследовательность очистки, такую как метка эпитопа, РЬАО метка, последовательность полигистидина и слияние О8Т (глутатион-8-трансфераза).
Необязательно, растворимый полипептид Ас1КНа включает один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из гликозилированной аминокислоты, пегилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной группой, и аминокислоты, конъюгированной с агентом органического происхождения. Фармацевтический препарат может также включать одно или несколько дополнительных соединений, таких как соединение, применяемое для лечения костных нарушений. Предпочтительно фармацевтический препарат является, по существу, апирогенным. Как правило, предпочтительно, чтобы белок Ас1КНа экспрессировался в клеточной линии млекопитающих, что опосредует соответствующее естественное гликозилирование белка АсЖНа для уменьшения вероятности неблагоприятного иммунного ответа у пациента. Успешно использовались клеточные линии человека и яичника китайского хомячка СНО, предполагается, что другие общепринятые системы экспрессии млекопитающих также будут полезными.
Как описано в настоящем изобретении, белки Ас1КНа, обозначаемые Ас1КНа-Рс (форма с минимальным линкером между участком АсЖНа и участком Рс), имеют желаемые свойства у животных моделей, включая селективное связывание с активином по сравнению с ОИР8 и/или ОИР11, высокоаффинное лигандное связывание и период полувыведения из сыворотки более двух недель. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает полипептиды АсЖНа-Рс и фармацевтические препараты, содержащие такие полипептиды и фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие растворимый активин-связывающий полипептид Ас1КНа. Выделенный полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность для растворимого активин-связывающего полипептида Ас1КНа, такую как описанная выше последовательность. Например, выделенная нуклеиновая кислота может включать последовательность, кодирующую внеклеточный домен (например, лиганд-связывающий домен) Ас1КНа, и последовательность, которая будет кодировать часть или весь трансмембранный домен и/или цитоплазматический домен Ас1КНа, кроме стоп-кодона, расположенного в трансмембранном домене или в цитоплазматическом домене или расположенного между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом или цитоплазматическим доменом. Например, выделенный полинуклеотид может содержать полноразмерную полинуклеотидную последовательность АсЖНа, такую как 8Еф ΙΌ N0: 4 или 5, или частично усеченный вариант, причем указанный выделенный полинуклеотид дополнительно содержит кодон терминации транскрипции по меньшей мере из 600 нуклеотидов перед З'-концом или указанный кодон расположен иным образом, так что трансляция полинуклеотида необязательно обусловливает слияние внеклеточного домена с усеченным участком полноразмерного АсЖНа. Предпочтительной последовательностью нуклеиновой кислоты является 8Еф ΙΌ N0: 14. Нуклеиновые кислоты, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть функционально связаны с промотором экспрессии, и настоящее
- 3 015105 изобретение обеспечивает клетки, трансформированные такими рекомбинантными полинуклеотидами. Предпочтительно клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка СНО.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы получения растворимого активин-связывающего полипептида АсЖИа. Такой способ может включать экспрессию любой из нуклеиновых кислот (например, 8ЕО Ш N0: 4, 5 или 14), раскрытых в настоящем изобретении, в подходящей клетке, такой как клетка яичника китайского хомячка (СНО). Такой способ может включать:
a) культивирование клетки в условиях, подходящих для экспрессии растворимого полипептида Ас®Иа, где указанная клетка трансформирована конструкцией для экспрессии растворимого Ас!КЛа; и
b) выделение растворимого полипептида Ас®Иа, экспрессируемого таким образом.
Растворимые полипептиды Ас!КЛа можно выделять в виде неочищенных, частично очищенных или высокоочищенных фракций. Очистку можно осуществлять сериями последовательных стадий очистки, включающими, например, одну, две или три, или более из следующих стадий в любом порядке: хроматография с белком А, анионообменная хроматография (например, с использованием О-сефарозы). хроматография гидрофобного взаимодействия (например, с использованием фенилсефарозы), эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография.
В некоторых аспектах антагонист акгивина-Ас®Иа, раскрытый в настоящем изобретении, такой как растворимый активин-связывающий полипептид АсЖИа, может быть использован в способе стимулирования роста кости или увеличения плотности кости у субъекта. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы лечения нарушения, ассоциированного с низкой плотностью кости, или способы стимулирования роста кости у нуждающихся в этом пациентов. Способ может включать введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества антагониста активинаАс!КИа. В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает применение антагониста активинаАс!КИа для получения лекарственного средства для лечения нарушения или состояния, описанного в настоящем изобретении.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации вещества, которое стимулирует рост или повышенную минерализацию кости. Способ включает:
a) идентификацию тестового вещества, которое связывается с активином или лиганд-связывающим доменом полипептида АсЖИа; и
b) оценку эффекта вещества на рост или минерализацию кости.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает очистку АсЖИа-ЬРс, экспрессируемого в клетках СНО. Белок очищается в виде единственного, четко определяемого пика.
Фиг. 2 показывает связывание Ас®Иа-№с с активином и ΟΌΡ-11, как измерено с помощью анализа В1аСоге™.
Фиг. 3 показывает схему анализа гена-репортера А-204.
На фигуре показан вектор репортера: рОЬ3(СА6А)12 (описанный Пеии1ег е! а1., 1998, ЕМВО 17: 3091-3100). Мотив САОА12 присутствует в реактивных генах ΤΟΡ-β (ген РА1-1), таким образом, этот вектор имеет общее применение для факторов, передающих сигналы через 8тай 2 и 3.
Фиг. 4 показывает эффекты Ас®Иа-№с (ромбики) и Ас!КИа-тРс (квадратики) на передачу сигналов СЭР-8 в анализе гена-репортера А-204.
Оба белка показывают значительное ингибирование ΟΌΡ-8-опосредованной передачи сигнала в пикомолярных концентрациях.
Фиг. 5 показывает эффекты трех различных препаратов Ас®Иа-ЬРс на передачу сигналов СЭР-11 в анализе гена-репортера А-204.
Фиг. 6 показывает примеры изображений ЭЕХА (двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии) у мышей ВАЬВ/с контрольной группы и леченных Ас!КЛа-тРс, перед (верхние изображения) и после (нижние изображения) 12-недельного периода лечения. Более бледная тень указывает на повышенную плотность кости.
Фиг. 7 показывает количественное определение эффектов Ас!КЛа-таРс на минеральную плотность кости у мышей ВАЬВ/с на протяжении 12-недельного периода.
Проводимое лечение было контролем (ромбики), дозой 2 мг/кг Ас®Иа-тРс (квадратики), дозой 6 мг/кг Ас®Иа-тРс (треугольники) и дозой 10 мг/кг АсЖИа-тРс (кружки).
Фиг. 8 показывает количественное определение эффектов Ас®Иа-тРс на содержание минералов в кости у мышей ВАЬВ/с на протяжении 12-недельного периода.
Проводимое лечение было контролем (ромбики), дозой 2 мг/кг Ас®Иа-тРс (квадратики), дозой 6 мг/кг Ас®Иа-тРс (треугольники) и дозой 10 мг/кг АсЖИа-тРс (кружки).
Фиг. 9 показывает количественное определение эффектов АсЖИа-тРс на минеральную плотность трабекулярной кости у овариэктомированных (ОУХ) или ложнооперированных (8НАМ) мышей С57ВБ6 после 6-недельного периода.
Проводимое лечение было контролем (РВ8) или дозой 10 мг/кг АсЖИа-тРс (Ас®Иа).
- 4 015105
Фиг. 10 показывает количественное определение эффектов Ас1КПа-тЕс на трабекулярную кость у овариэктомированных (ОУХ) мышей С57ВЬб на протяжении 12-недельного периода.
Лечение представляло собой контроль (РВ8; светлые столбики) или дозу 10 мг/кг АсЖПа-шРс (Ас1КНа; светлые столбики).
Фиг. 11 показывает количественное определение эффектов Ас1К11а-тЕс на трабекулярную кость у ложнооперированных мышей С57ВЬб после лечения на протяжении б или 12 недель.
Лечение представляло собой контроль (РВ8; светлые столбики) или дозу 10 мг/кг АсЖПа-тРс (Ас1КНа; темные столбики).
Фиг. 12 показывает результаты плотности кости по анализу рОСТ (периферической количественной компьютерной томографии) у овариэктомированных мышей на протяжении 12 недель лечения. Лечение представляло собой контроль (РВ8; светлые столбики) или Ас1КПа-тЕс (темные столбики), ось у: мг/см3.
Фиг. 13 показывает результаты рОСТ анализа плотности кости у ложнооперированных мышей на протяжении 12 недель лечения.
Лечение представляло собой контроль (РВ8; светлые столбики) или АсЖПа-тРс (темные пластинки), ось у: мг/см3.
Фиг. 14А и В показывают анализ ΏΕΧΛ всего тела после 12 недель лечения (А) и анализ бедренных костей ех νίνο (В). Светлые столбики отображают зоны высокой плотности кости.
Фиг. 15 показывает рОСТ анализ средней части диафиза бедра ех νίνο после 12 недель лечения.
Лечение представляло собой контроль носителя (РВ8, темные столбики) и АсЖПа-тЕс (светлые столбики). Четыре столбика слева показывают общую плотность кости, тогда как четыре столбика справа показывают плотность кортикальной кости. Первая пара столбиков в каждой группе из четырех столбиков представляет данные от овариэктомированных мышей, и вторая пара столбиков представляет данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 1б показывает ех νίνο анализ рОСТ и диафизарную костную массу средней части диафиза бедренной кости после 12 недель лечения.
Лечение представляло собой контроль носителя (РВ8, темные столбики) или АсЖПа-тЕс (светлые столбики). Четыре столбика слева показывают общую костную массу, тогда как четыре столбика справа показывают костную массу кортикального слоя. Первая пара столбиков в каждой группе из четырех столбиков представляет данные от овариэктомированных мышей, и вторая пара столбиков представляет данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 17 показывает ех νίνο рОСТ анализ средней части диафиза бедренной кости и толщину кортикального слоя бедренной кости.
Лечение было контролем (РВ8, темные столбики) и АсЖПа-тЕс (светлые столбики). Четыре столбика слева показывают эндостальную длину окружности, и четыре столбика справа показывают периостальную длину окружности. Первая пара столбиков в каждой группе из четырех столбиков представляет данные от овариэктомированных мышей, и вторая пара столбиков представляет данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 18 показывает результаты механического тестирования бедренных костей после 12 недель лечения.
Лечение представляло собой контроль (РВ8, темные столбики) и Ас1КПа-тЕс (светлые столбики). Два столбика слева представляют данные от овариэктомированных мышей, и последние два столбика представляют данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 19 показывает действие Ас1КНа-тЕс на объем трабекулярной кости.
Фиг. 20 показывает действие Ас1КП-тЕс на трабекулярную архитектуру в дистальной части бедренной кости.
Фиг. 21 показывает действие Ас1КНа-тЕс на кортикальную кость.
Фиг. 22 показывает действие Ас1КНа-тЕс на механическую прочность кости.
Фиг. 23 показывает эффекты различных доз АсЖПа-тЕс на параметры кости в трех разных дозах.
Фиг. 24 показывает гистоморфометрию кости, указывающую на наличие у АсЖПа-тЕс двойного анаболического и антирезорбтивного действия.
- 5 015105
Подробное описание изобретения
1. Краткий обзор.
Суперсемейство трансформирующего бета-фактора роста (ТСР-β) содержит множество факторов роста, которые имеют общие элементы последовательностей и структурные мотивы. Известно, что эти белки проявляют биологические эффекты на множестве типов клеток как у позвоночных, так и у беспозвоночных. В ходе эмбрионального развития члены суперсемейства выполняют важные функции в формировании структуры и тканевой дифференцировке и могут влиять на ряд процессов дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кардиогенез, гематопоэз, нейрогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. Семейство разделяют на две общие ветви: ветвь ВМР/СИР и ветвь ТСР-в/активин/ВМР10, члены которых имеют разнообразные, часто комплементарные эффекты. Часто можно вызвать значительные физиологические изменения в организме путем влияния на активность члена семейства ТСР-β. Например, породы рогатого скота Р1сбтоп!скс и Бельгийская голубая несут мутацию с потерей функции в гене СИР8 (также называемом миостатином), который вызывает заметное увеличение мышечной массы, СгоЬс! с! а1., №11. Сспс!. 1997, 17(1):71-4. Кроме того, у людей неактивные аллели СИР8 ассоциированы с увеличенной мышечной массой и, по сообщениям, с исключительной силой. 8сйис1кс с! а1., N. Епд1. 1. Меб. 2004, 350:2682-8.
Активины представляют собой димерные полипептидные факторы роста, которые принадлежат к суперсемейству ТСР-β. Существуют три принципиальные формы активина (А, В и АВ), которые являются гомо/гетеродимерами двух близкородственных β-субъединиц (βΑβΑ, βι-,βΐ; и βΑβΐ;). В человеческом геноме также кодированы активин С и активин Е, которые экспрессируются в основном в печени. В суперсемействе ТСР-β активины представляют собой уникальные и многофункциональные факторы, которые могут стимулировать продукцию гормонов в клетках яичников и плаценты, поддерживать жизнеспособность нейронов, положительно или отрицательно влиять на развитие клеточного цикла в зависимости от типа клетки и индуцировать мезодермальную дифференцировку, по меньшей мере, у эмбрионов земноводных (ИсРао1о с! а1., 1991, Ргос. 8ос. Ер Вю1. Мсб. 198:500-512; Иукоп с! а1., 1997, Сигг. Вю1. 7:8184; УообгиГГ, 1998, Вюсйст. Рйагтасо1. 55:953-963). Кроме того, было выявлено, что фактор эритроидной дифференцировки (ЕИР), выделенный из стимулированных человеческих моноцитарных лейкозных клеток, идентичен активину (Мига!а с! а1., 1988, РNΑ8, 85:2434). Предполагается, что активин А действует как естественный, положительный регулятор эритропоэза в костном мозге. В некоторых тканях антагонистом передачи сигналов активина является родственный ему гетеродимер ингибин. Например, в процессе высвобождения из гипофиза фолликулостимулирующего гормона (Р8Н) активин способствует секреции и синтезу Р8Н, тогда как ингибин предотвращает секрецию и синтез Р8Н. Другие белки, которые могут регулировать биоактивность активина и/или связываться с активином, включают фоллистатин (Р8), родственный фоллистатину белок (Р8КР), а2-макроглобулин, белок СсгЬсгик и эндоглин.
Передача ТСР-β сигналов опосредована гетеромерными комплексами рецепторов серин/треонинкиназы I типа и II типа, которые фосфорилируют и активируют каскад белков 8шаб после лигандной стимуляции (Маккадис, 2000, N1!. Рсу. Мо1. Сс11. Вю1. 1:169-178). Эти рецепторы I и II типа представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена с участком, обогащенным цистеином, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с прогнозируемой серин/треониновой специфичностью. Рецепторы I типа являются необходимыми для передачи сигнала; рецепторы II типа необходимы для связывающих лигандов и для экспрессии рецепторов I типа. После лигандного связывания рецепторы активина I и II типа образуют устойчивый комплекс, приводя к фосфорилированию рецепторов I типа рецепторами II типа.
Два родственных рецептора II типа, АсЖПа и АсЖНЬ, были идентифицированы как рецепторы II типа для активинов (Ма!йс^к апб Уа1с, 1991, Сс11. 65:973-982; АШкапо с! а1., 1992, Сс11. 68:97-108). Помимо активинов, АсЖПа и АсЖНЬ могут биохимически взаимодействовать с некоторыми другими белками семейства ТСР-β, включающими ВМР7, нодал, СИР8 и СИР11 (Уатакййа с! а1., 1995, I. Сс11. Вю1. 130:217-226; Ьсс апб МсРйсггоп, 2001, Ргос. №!1. Асаб. 8ск 98:9306-9311; Усо апб ^ййтап, 2001, Мо1. Сс11. 7:949-957; Ой с! а1., 2002, Сспск Ису. 16:2749-54). Рецептором I типа для активинов, в первую очередь, является АЬК4, в частности для активина А, и АЬК7 также может служить рецептором для активинов, особенно для активина В.
Как показано в настоящем изобретении, растворимый полипептид Ас1ВПа (кАсЖИа), который проявляет значительную предпочтительность в связывании с активином в отличие от других членов семейства ТСР-β, таких как СИР8 или СИР11, эффективно ускоряет рост кости и увеличивает плотность кости ш у1уо. Без намерения связывать это с каким-либо конкретным механизмом, предполагается, что действие кАсЖПа прежде всего обусловлено эффектом антагониста активина, учитывая очень мощное связывание с активином (пикомолярная константа диссоциации), которое проявляет конкретная конструкция кАсЖПа, используемая в настоящем исследовании. Независимо от механизма, по данным, представленным в настоящем изобретении, очевидно, что антагонисты Ас1ВПа-активина действительно увеличивают плотность кости у здоровых мышей и на моделях мышей с остеопорозом. Необходимо отметить, что кость является динамической тканью, способной к росту или сжатию и к увеличению или уменьшению
- 6 015105 плотности в зависимости от баланса факторов, которые продуцируют кость и стимулируют минерализацию (прежде всего, остеобласты), и факторов, которые вызывают разрушение и деминерализацию кости (прежде всего, остеокласты). Можно усилить рост и минерализацию кости путем увеличения продуцирующих факторов, уменьшения деструктивных факторов или двумя этими путями. Понятия стимулирование роста кости и увеличение минерализации кости относятся к заметным физическим изменениям в кости, и предполагается, что они имеют нейтральное значение по отношению к механизму, посредством которого происходят костные изменения.
Считается, что мышиные модели, используемые в исследованиях остеопороза и роста/плотности кости, которые описаны в настоящем изобретении, имеют высокое прогностическое значение для оценки эффективности у людей, и в этой связи настоящее изобретение обеспечивает способы использования полипептидов ЛеГКПа и других антагонистов активина-ЛеГКПа для стимулирования роста кости и повышения плотности кости у людей. Антагонисты активина-АеГКПа включают, например, активинсвязывающие растворимые полипептиды АеГКПа, антитела, которые связываются с активином (особенно с субъединицами активина А или В, также называемыми βΑ или βΒ) и нарушают связывание АеГКПа, антитела, которые связываются с АеГКПа и нарушают связывание активина, небелковые антитела, выбранные для связывания активина или АеГКПа (см., например, XV О 2002/088171, XVО 2006/055689, иО 2002/032925, иО 2005/037989, И8 2003/0133939 и И8 2005/0238646 для примеров таких белков и способов их конструирования и выбора), рандомизированные пептиды, выбранные для связывания активина или Ас1КПа, часто прикрепляющиеся к Ре домену. Соответственно, для создания бифункциональной связывающей молекулы могут быть связаны два различных белка (или другие функциональные группы) с активностью связывания активина или Ас1КПа, особенно активин-связывающие вещества, которые блокируют сайты связывания I типа (например, растворимого рецептора активина I типа) и II типа (например, растворимого рецептора активина II типа). Аптамеры нуклеиновых кислот, малые молекулы и другие агенты, которые ингибируют ось передачи сигнала активин-АсЖПа. Активностью антагонистов активина-АсЖПа обладает ряд белков, включая ингибин (т.е. альфа-субъединицу ингибина), хотя ингибин не является универсальным антагонистом активина во всех тканях, фоллистатин (например, фоллистатин-288 и фоллистатин-315), белки СсгЬсгнх. Р8КР, эндоглин, активин С, альфа(2)-макроглобулин и мутант активина А М108А (с замещением метионина на аланин в положении 108). В общем, альтернативные формы активина, особенно формы с заменами в связывающем домене рецептора I типа, могут связываться с рецепторами II типа и не обладать способностью к образованию активного третичного комплекса, таким образом действуя в качестве антагонистов. Дополнительно, в качестве антагонистов активина-АсЖПа можно использовать нуклеиновые кислоты, такие как антисмысловые молекулы, малые интерферирующие РНК (кгРНК) или рибозимы, которые ингибируют активин А, В, С или Е, или особенно экспрессию АсЖПа. Предпочтительно используемый антагонист активина-АсЖПа будет проявлять селективность в ингибировании активин-опосредованной передачи сигналов по сравнению с другими членами семейства ТОР-β, особенно по сравнению с ΟΌΡ8 и ΟΌΡ11. Растворимые белки АсЖПЬ связываются с активином, однако белок дикого типа не проявляет значительной селективности в связывании с активином против ΟΌΡ8/11, и по предварительным экспериментам предполагается, что указанный белок не обеспечивает желательного действия на кость, также одновременно вызывая существенный рост мышц. Вместе с тем были идентифицированы измененные формы АсЖПЬ с разными связывающими свойствами (см., например, иО 2006/012627, р. 55-59, включенный путем ссылки в настоящее изобретение), и эти белки могут достигать желаемого действия на кость. Нативный или измененный АсЖПЬ может обладать дополнительной специфичностью к активину путем связывания со вторым, активинселективным связывающим агентом.
Термины, используемые в настоящем описании, обычно имеют свои общепринятые в данной области значения, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, где используется какойлибо термин. Конкретные термины рассмотрены ниже или в другом разделе настоящего описания для обеспечения дополнительных разъяснений практическим специалистам в описании композиций, способов настоящего изобретения и методик их получения и применения. Объем или значение какого-либо используемого термина будут очевидны из конкретного контекста, в котором используется термин.
Термины примерно и приблизительно обычно будут означать, что приемлемая степень ошибки для измеряемого количества обусловлены характером или точностью измерений. Обычно примерные степени ошибки находятся в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% данного значения или диапазона значений.
Альтернативно и особенно в биологических системах термины примерно и приблизительно могут означать показатели, которые находятся в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратного и более предпочтительно в пределах 2-кратного значения от данной величины. Числовые количества, приведенные в настоящем изобретении, являются примерными, если не указано иное, означая, что можно подразумевать термины примерно или приблизительно, если в прямой форме не указано иное.
- 7 015105
Способы настоящего изобретения могут включать стадии сравнения последовательностей друг с другом, включая сравнение последовательности дикого типа с одним или несколькими мутантами (вариантами последовательностей). Такие сравнения обычно содержат выравнивания полимерных последовательностей, например, с использованием программы выравнивания последовательностей и/или алгоритмов, которые известны в данной области (например, ВЬА8Т, ЕА8ТА и МЕСАЫСЫ и некоторые другие). В таких выравниваниях специалист в данной области с легкостью может оценить, что, если мутация содержит вставку или делецию остатка, при выравнивании последовательности в полимерной последовательности, не содержащей вставленный или делетированный остаток, будет вставляться промежуток (обычно представленный прочерком, или А).
Термин гомологичный во всех его грамматических формах и вариантах орфографии относится к отношениям между двумя белками, которые обладают общим эволюционным происхождением, и включает белки из суперсемейств организмов одного вида, а также гомологичные белки от организмов разных видов. Такие белки (и кодирующие их нуклеиновые кислоты) обладают гомологией последовательностей, как отражено по их подобию последовательностей, выраженному процентом идентичности, или по наличию конкретных остатков или мотивов и консервативных положений.
Термин подобие последовательностей во всех его грамматических формах относится к степени идентичности или соответствию между последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот, которые могут иметь или могут не иметь общее эволюционное происхождение.
Однако в общепринятом использовании и в настоящем описании термин гомологичный при варианте его употребления с наречием, например высоко гомологичный, может иметь в виду подобие последовательностей и может относиться или может не относиться к общему эволюционному происхождению.
2. Полипептиды АсЖНа.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам Ас®На. Используемый в настоящем изобретении термин АсЖИа относится к семейству белков-рецепторов активина типа 11а (Ас®Па) от любых видов и вариантов, полученных из таких белков Ас®На мутагенезом или другой модификацией. Предполагается, что ссылка на Ас®Ла в настоящем изобретении является ссылкой на любую из идентифицированных на настоящий момент форм. Члены семейства Ас®Ла в общем представляют собой трансмембранные белки, составленные из лиганд-связывающего внеклеточного домена с участком, обогащенным цистеином, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с прогнозируемой активностью серин/треонинкиназы.
Термин полипептид Ас®Ла включает полипептиды, содержащие любой природный полипептид членов семейства Ас®Иа, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты, слияния и пептидомиметические формы), которые сохраняют полезную активность. Например, полипептиды Ас®Иа включают полипептиды, полученные из последовательности любого известного Ас®Иа, имеющего последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80% идентична последовательности полипептида Ас®Ла и предпочтительно идентична указанной последовательности по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 99% или более. Например, полипептид Ас®Па настоящего изобретения может связываться с белком Ас®Иа и/или активином и ингибировать их действие. Предпочтительно полипептид АсЖНа стимулирует рост кости и минерализацию кости. Примеры полипептидов Ас®Иа включают предшественник человеческого полипептида Ас®Па (8ЕО ΙΌ N0: 1) и растворимые человеческие полипептиды Ас®Иа (например, 8Е0 ΙΌ N0: 2, 3, 7 и 12).
Последовательность предшественника человеческого белка Ас®Па представляет собой:
МСАААКЬАРАУГЫЗСЗЗСАТЬбКЗЕТОЕСЮТЫАМНЕКРММ
ОтетЕРСтетяажквнсЕ’АТИ1^18ез1Е1Укессиьотыс¥ ЦКТОСУЕККО8РЕУУГСССЕСЦМСКЕКЕ8УГРЕМЕУТ<2РТЗКР УТРКРРУУИ1ЬЬ¥ЗЬУРЬМЫАЕ1У1САГИУУКЯНКМА¥РРУЪ УРТООРСРРРРЗРЫСЪКРЪОЬЬЕУКАКСМЧЗСУНКАОЪЬНЕУ νΆνκΐГРΙθυΚ03ΝΩΝΕΥΕνΥ8 ΙιΡΕΜΚΗΕΝΙΙ^ϊΊ САЕККСТ3 УОУОЬИЬХТАГНЕКЕЗЬЗОГЪКАЫУУЗтаЕЬСНТАЕТМАЕбЬА ΥΈΗΕΡΙ ΡΕΕΚϋΕΗΚΡΑΙ 3 ΗΒ,β I КЗ КНУШКМНЪТ АС1ΑΒΕΌΙΑ ΕΚΕΈΑΘΚ5ΑσθΤΗ60νβΤΒΚΥΜΑΡΕνΕΕ6ΑΙΝΡΟΚΟΑΓΕΚΙΟΜ УАМСЦУЬИЕЬАЗВ,СТААОСРУОЕУМГ.₽ГЕЕЕ1СОНРЗЪЕРМОЕ УУУНККККРУЬКРУИОКНАСМАМЬСЕТХВЕСИВНОАЕАКЪЗАБ стсек! томсеый ι ιττ ец ι ντνντκντΝуорр ркез з ь (δΕφΙΟΝΟ: 1)
Сигнальный пептид подчеркнут одной линией; внеклеточный домен выделен жирным шрифтом и потенциальные Ν-связанные участки гликозилирования подчеркнуты двойной линией.
- 8 015105
Последовательность человеческого (внеклеточного) растворимого процессированного полипептида ЛеЖПа представляет собой
ХЬбКЗЕТОЕСЬЕЕИАМИЕКОКТИОТбУЕРСУСОКОКЙКНСРАТ якнгзезιΕΙνκοσοϊαϋΒΐксупнт осуеккбз реуугсссе СЯМСНЕКЕЗУГРЕМЕУТОРТЗКРУТРКРР (8Еф ГО N0: 2)
С-концевой хвост внеклеточного домена подчеркнут. Последовательность с удаленным хвостом (последовательность Δ15) представляет собой
ГЬЕКЗЕТОЕСЬГЕИАЫИЕКОКТЫОТСУЕРСУЕОКОКККНСГАТ
ИКН13031ΕΙУК06СИШ01НС ΥϋΚΤ ЦСУЕККЦЗ РЕУУ ГЕССЕ еымсыекгзυ грим (Ж) ГО N0:3)
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок-предшественник человеческого ЛеЖПа, представлена следующим образом (нуклеотиды 164-1705 из доступа ΝΜ 01616 СепЬаик):
АТБЕЕАЕСТССТЕСААЛБТТБ0СБТТТЕССЕТСТТТСТТАТСТССТ6ТТСТТ САО6ТаСТАТАСТТ6ЕТА6АТСА0АААСТСА0ЕАЕТ0ТСТТТТСТТТААТБС ТААТТЕЕБАААААаАСАСААССААТСАААСТББТБТТСААССЕТЕТТАТББТ БАСАААЕАТАААСБЕСбЕСАТТЕТТТТЕСЗ'АССТБЕААЕААТАТТТСТЕБТТ ССАТТЕАААТАЕТЕАААСААБВТТБТТБЕСТББАТБАТАТСААСТБСТАТБА САЕЕАСТЕАТТеТЕТАСААААААААОАСАЕСССТЕААЕТАТАГТТТТЕТТБС ТЕТБАС6ЕСААТАТЕТ6ТААТ0ААААБТТТТСТТАТТТТССАБАБАТ0БААБ ТСАСАСАБСССАСТТСАААТССАЕТТАСАССТААЕССАСССТАТТАСААСАТ ССТЕСТСТАТТССТТЕбТБССАСТТАТБТТААТТЕСЕЕБЕАТТЕТСАГТТБТ БСАТТТТСБСТЕТАСАбССАТСАСААСАТББССТАСССТССТБТАСТТЕТТС СААСТСААБАСССАЕЕАССАСССССАССТТСТССАТТАСТАЕЕЕТТЕАААСС АСТЕСАЕТТАТТАБААЕТБАААБСААЕЕЕСААбАТТТББТТЕТЕТСТБЕААА БСССАЕТТБСТУААСОААТАТеТЕБСТЕТСААААТАТТТССААТАСАЕЕАСА ААСАЕТСАТЕЕСААААТЕААТАС6ААЕТСТАСА5ТТТЕССТСЕААТБААЕСА ТбАЕААСАТАТТАСАЕТТСАТТЕЕТеСАСАААААСЕАЕЕСАССАБТОТТЕАТ БТ66АТСТТТЕЕСТБАТСАСАБСАТТТСАТ6ААААЕЕБТТСАСТАТСА0АСТ ТТСТТААЕЕСТААТБТББТСТСТТБЕААТЕААСТЕТбТСАТАТТБСАЕАААС САТСеСТАЕАСЕАТТБССАЗАТТТАСАТСАСЕАТАТАССТЕЕССТААААСАТ ЕЕССАСАААССТЕССАТАТСТСАСАЕЕБАСАТСААААЕТАААААТЕТЕСТЕТ ТЕАААААСААССТСАСАБСТТЕСАТТЕСТЕАС(ГТТЕБЕТТ6ЕССТТААААТТ ТБАЕОСТЕБСААЕТСТБСАБЕСбАТАСССАТСБАСАбСТТССТАСССЕЕАБЕ ТАСАТЕЕСТССАбАаЕТАТТАбАЕСЕТЕСТАТАААСТТССАААБЕбАТбСАТ ТТТТСАБЕАТАЕАТАТЕТАТЕССАТЕЕаАТТАОТССТАТЕБСААСТСБСТТС ТСЕСТБТАСТССТССАБАТЕСАССТЕтаЕАТЕААТАСАТСТТБССАТУТОАБ ЕАЕБАААТТЕЕССАЕСАТССАТСТСТТЕААЕАСАТЕСАОЕААЕТТОТТЕТЕС АТААДАААААЕАЕ0ССТЕТТТТААЕАЕАТТАТТЕЕСАЕАААСАТБСТЕЕААТ ЕЕСААТЕСТСТЕТБАААССАТТЕААЕААТЕТТЕЕЕАТСАСбАСЕСАЕААЕСС АБСТТАТСАССТСЕАТБТЕТАБЕТЕАААЕААТТАСССАСАТЕСАБАБАСТАА САААТАТТАТТАССАСАЕАББАСАТТЕТААСАБТБЕТСАСААТББТОАСААА ТОТТВАСТТТССТСССАААЕААТСТАбТСТАТЕА (8Ер ГО N0: 4)
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий растворимый (внеклеточный) полипептид ЛеЖПа, представляет собой
АТАСТТСЕТАБАТСАбАААСТСАЕЕАБТбТСТТТТСТТТААТССТААТТЕБЕ
АЛАААЕАСАОААССААТСАААСТСБТБТ'ГБААССБТСТТАТЕЕТБАСАААСА
ТАААСеЕСЕОСАТТеТТТТБСТАССТеСААЕААТАТТТСТеЕТТССАТТСАА
АТАЕТБАААСААББТТбТТСЕСТвБАТБАТАТСААСТБСТАТЕАСАББАСТБ
ДТТЕТЕТАЕААААААААСАСАССССТБААЕТАТАТа'ТТТбТТЕСТС'ГСАЕЕЕ СААТАТСТЕТААТБААААЕТТТТСТТАТТТТССАбАбАТЕОААЕТСАСАСАЕ СССАСТТСАААТССАБТТАСАССТААЕССАССС (ЗЕф Ш ΝΟ: 5)
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к растворимым полипептидам ЛеЖПа. Используемый в данном описании термин растворимый полипептид ЛеЖПа обычно относится к полипептидам, содержащим внеклеточный домен белка ЛеЖПа. Термин растворимый полипептид ЛеЖПа, используемый в настоящем описании, включает любой природный внеклеточный домен белка ЛеЖПа, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты и пептидомиметиче
- 9 015105 ские формы). Активин-связывающий полипептид Ас®Иа представляет собой полипептид, который сохраняет способность связываться с активином, особенно с активином АА, АВ или ВВ. Предпочтительно активин-связывающий полипептид АсЖИа связывается с активином АА с константой диссоциации 1 нМ или меньше. Аминокислотные последовательности белка-предшественника человеческого АсЖИа представлены ниже. Внеклеточный домен белка Ас®Иа связывается с активином и, как правило, является растворимым, таким образом, его можно называть растворимым активин-связывающим полипептидом Ас®Иа. Примеры растворимых активин-связывающих полипептидов Ас®Иа включают растворимый полипептид, показанный в 8ЕО ГО N0: 2, 3, 7, 12 и 13. Последовательность 8Е0 ГО N0: 7 обозначена как Ас®Иа-йЕс и дополнительно описана в примерах. Другие примеры растворимых активин-связывающих полипептидов Ас®Иа в дополнение к внеклеточному домену белка Ас®Иа содержат сигнальную последовательность, например лидерную последовательность меллитина пчелиного меда (8Е0 ГО N0: 8), лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) (8Е0 ГО N0: 9) или лидерную последовательность нативного Ас®Иа (8Е0 ГО N0: 10). В полипептиде Ас®Иа-йЕс, показанном в 8Е0 ГО N0: 13, использована лидерная последовательность ТРА.
Функционально активные фрагменты полипептидов Ас®Иа могут быть получены путем скрининга полипептидов, полученных по рекомбинантной технологии из соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АсЖИа. Кроме того, фрагменты можно синтезировать химически, используя способы, известные в данной области, такие как общепринятый твердофазный синтез МегпПе1б £-Мос или 1-Вос. Фрагменты могут быть получены (рекомбинантным путем или химическим синтезом) и протестированы для идентификации таких пептидильных фрагментов, которые могут действовать как антагонисты (ингибиторы) белка Ас®Иа или для передачи сигналов, опосредуемых активином.
Функционально активные варианты полипептидов Лс1Е11а могут быть получены путем скрининга библиотек модифицированных полипептидов, полученных по рекомбинантной технологии из соответствующих мутировавших нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид Ас®Па. Можно получать и тестировать варианты для идентификации тех из них, которые способны действовать как антагонисты (ингибиторы) белка АсЖИа или передавать сигналы, опосредуемые активином. В некоторых вариантах осуществления функциональный вариант полипептидов АсЖИа содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ГО N0: 2 или 3. В некоторых случаях функциональный вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ГО N0: 2 или 3.
Функциональные варианты можно получать путем модификации структуры полипептида АсЖИа для таких целей, как усиление терапевтической эффективности, или для повышения стабильности (например, срока годности ех νίνο и устойчивости к протеолитическому разрушению ίη νίνο). Такие модифицированные полипептиды АсЖИа, выбранные для поддержания связывания активина, считаются функциональными эквивалентами природных полипептидов АсЖИа. Модифицированные полипептиды Ас®Иа также можно получать, например, путем аминокислотного замещения, делеции или добавления. Например, обоснованно предполагать, что выделенные замены лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или подобная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту (например, консервативные мутации) не будут обладать большим эффектом на биологическую активность полученной молекулы. Консервативными заменами являются замены, происходящие в пределах семейства аминокислот, которые родственны по боковым цепям. Можно легко определить получение функционального гомолога путем замены аминокислотной последовательности полипептида Ас®Иа, оценивая способность вариантного полипептида АсЖИа вызывать клеточный ответ таким же образом, как и полипептид АсЖИа дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение рассматривает конкретные мутации полипептидов Ас®Ла с целью изменения гликозилирования полипептида. Могут быть выбраны такие мутации, чтобы вставить или удалить один или несколько сайтов гликозилирования, таких как 0- или ^связанный сайты гликозилирования. Аспарагин-связанные сайты узнавания гликозилирования обычно содержат трипептидную последовательность, аспарагин-Х-треонин (или аспарагин-Х-серин) (где X представляет собой любую аминокислоту), которая специфично распознается подходящими клеточными ферментами гликозилирования. Изменение также можно осуществлять путем добавления или замены одного или нескольких сериновых или треониновых остатков последовательности полипептида Ас®Иа дикого типа (для 0-связанных сайтов гликозилирования). Ряд аминокислотных замен или делеций в одной аминокислоте или в обеих аминокислотах из первого или третьего положения сайта узнавания гликозилирования (и/или делеция аминокислоты во втором положении) приводит к отсутствию гликозилирования в модифицированной трипептидной последовательности. Другим способом увеличения числа углеводных групп в полипептиде Ас®Ла является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду Ас®Иа. В зависимости от используемого способа присоединения можно присоединять сахар (сахара) к (а) аргинину и гистидину; (Ь) свободным карбоксильным группам; (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина; (б) свободным гидроксильным
- 10 015105 группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина; (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана; или (1) амидным группам глутамина. Эти способы описаны в \νϋ 87/05330, опубликованном 11 сентября 1987 г., и в публикации Άρΐίη апб ХУпЧоп (1981), СКС СпЕ Реу. Вюсбет., р. 259-306, включенных путем ссылки в настоящее описание. Удаление одной или нескольких углеводных групп, присутствующих в полипептиде Лс1Р11а, можно осуществлять химическим и/или ферментативным способом. Химическое дегликозилирование может включать, например, воздействие на полипептид Ас1Р11а трифторметансульфоновой кислотой или эквивалентным соединением. Такая обработка приводит к расщеплению большей части сахара или всех сахаров, кроме связывающего сахара (Ν-ацетилглюкозамина или Ν-ацетилгалактозамина), при этом не воздействуя на аминокислотную последовательность. Химическое дегликозилирование дополнительно описано Накттиббш е! а1. (1987), Агсб. Вюсбет. Вюрбук. 259:52 и Ебде е! а1. (1981), Апа1. Вюсбет. 118:131. Ферментативное расщепление углеводных групп в полипептидах Ас!Р11а может быть осуществлено с использованием ряда эндо- и экзогликозидаз, как описано Тбо1акига е! а1. (1987), Ме!б. Епхушо1. 138:350. При необходимости, можно подбирать последовательность полипептида Ас!Р11а в зависимости от типа используемой системы экспрессии, поскольку, например, в клетках млекопитающих, дрожжей, насекомых и в растительных клетках могут находиться отличающиеся структуры гликозилирования, на которые может воздействовать аминокислотная последовательность пептида. Как правило, белки Ас!Р11а для использования у людей будут экспрессироваться в клеточной линии млекопитающих, которая обеспечивает надлежащее гликозилирование, например, в клеточной линии НЕК293 или СНО, но вместе с тем предполагается, что также будут полезны другие клеточные линии экспрессии млекопитающих, клеточные линии дрожжей с рекомбинантными ферментами гликозилирования и клетки насекомых.
Настоящее изобретение дополнительно рассматривает способ получения мутантов, особенно наборы комбинаторных мутантов полипептида Ас!Р11а, а также усеченных мутантов; пулы комбинаторных мутантов являются особенно полезными для идентификации функциональных вариантов последовательностей. Целью скрининга таких комбинаторных библиотек может быть получение, например, вариантов полипептида Ас!Р11а, которые могут действовать или как агонисты, или как антагонисты, или альтернативно, что придает новые свойства им всем. Ниже рассматривается ряд скрининговых анализов и такие анализы можно использовать для оценки вариантов. Например, можно проводить скрининг варианта полипептида Ас!Р11а на его способность связываться с лигандом Ас!Р11а, на способность предотвращать связывание лиганда Ас!Р11а с полипептидом Ас!Р11а или нарушать передачу сигналов, вызываемых лигандом Ас!Р11а.
Активность полипептида Ас!Р11а или его вариантов также можно тестировать в анализе на клетке или ίη νίνο. Например, можно оценивать действие варианта полипептида Ас!РПа на экспрессию генов, вовлеченных в продукцию кости или деструкцию кости. При необходимости, это можно осуществлять в присутствии одного или нескольких рекомбинантных лигандных белков Ас!РПа (например, активина) и можно трансфицировать клетки для получения полипептида Ас!РПа и/или его вариантов и, необязательно, лиганда Ас!РПа. Аналогично, полипептид Ас!РПа можно вводить мыши или другому животному, можно проводить оценку одного или нескольких свойств кости, таких как плотность или объем кости. Также можно оценивать скорость излечения переломов кости. Общеизвестной неинвазивной количественной методикой оценки плотности кости у животного является двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (ЭЕХА). У людей для оценки плотности кости в позвоночном столбе и в костях таза могут быть использованы системы центральной ЭЕХА. Они представляют собой наилучшие прогностические показатели общей плотности кости. Системы периферической ЭЕХА можно использовать для оценки плотности кости в периферических костях, включая, например, кости кисти, запястья, лодыжки и стопы. Традиционные рентгеновские системы отображения, включая компьютерную аксиальную томографию САТ, можно применять для оценки роста кости и излечения перелома. Также можно оценивать механическую прочность кости.
Могут быть получены варианты комбинаторного происхождения, которые обладают селективной или в целом увеличенной эффективностью по сравнению с природным полипептидом Ас!РПа. Аналогично, мутагенез может способствовать появлению вариантов, имеющих периоды полувыведения из клеток, резко отличающиеся от соответствующих периодов полипептида Ас1РНа дикого типа. Например, измененный белок может стать или более устойчивым или менее устойчивым к протеолитическому расщеплению или другим клеточным процессам, которые приводят к разрушению, или к инактивации другим путем природного полипептида Ас!РПа. Можно использовать такие варианты и гены, которые кодируют их, для изменения уровней полипептида Ас!РПа путем модулирования периода полувыведения полипептидов Ас!РПа. Например, короткий период полувыведения может способствовать появлению большого числа транзиторных биологических эффектов и может позволить более жесткий контроль уровня рекомбинантного полипептида Ас!РПа в организме пациента. Для изменения периода полувыведения белка можно осуществлять мутации в белке слияния Ес в линкере (при его наличии) и/или в участке Ес.
- 11 015105
Комбинаторную библиотеку можно получить посредством вырожденной библиотеки генов, кодирующих библиотеку полипептидов, каждый из которых включает по меньшей мере часть возможных последовательностей полипептида Ас1КНа. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов можно лигировать ферментным путем в генные последовательности таким образом, что вырожденный набор возможных нуклеотидных последовательностей полипептида Ас1КНа является экспрессируемым в виде отдельных полипептидов или, альтернативно, в виде набора белков слияния большего размера (например, для фагового дисплея).
Существует много путей создания библиотеки потенциальных гомологов из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной генной последовательности можно осуществлять в автоматическом синтезаторе ДНК, а затем лигировать синтетические гены в подходящий вектор для экспрессии. Синтез вырожденных олигонуклеотидов известен в данной области (см., например, публикации Ыагапд, 8.А. (1983), Тс1гаНсбгоп. 39:3; Иакига е! а1. (1981), КесотЬтап! ΌΝΆ, Ргос. 3гб С1ете1апб 8утрок. Масгото1еси1ек, еб. Л.С. ^а1!оп, Атк!егбат: Е1кет1ег, р. 273-289; Иакига е! а1. (1984), Апии. Кет. Вюскет. 53:323; Иакига е! а1. (1984), 8с1епсе, 198:1056; 1ке е! а1. (1983), ШсШс Лаб Кек. 11:477). Такие технологии использовались в направленной эволюции других белков (см., например, публикации 8со!! е! а1. (1990), 8с1епсе, 249:386-390; КоЬеИк е! а1. (1992) , ΡΝΑ8 И8А 89:2429-2433; ЭетИп е! а1. (1990), 8с1епсе, 249:404-406; С\\зг1а е! а1. (1990), ΡΝΑ8 И8А, 87:6378-6382; а также в патентах США № 5223409, 5198346 и 5096815).
Альтернативно, для создания комбинаторной библиотеки можно использовать другие формы мутагенеза. Например, можно получить и выделить варианты полипептида Ас1КИа из библиотеки путем скрининга с использованием, например, мутагенеза аланинового сканирования и т.п. (Кц£ е! а1. (1994), ВюскетйИу 33: 1565-1572; \\апа е! а1. (1994), 1. Вю1. Скет. 269:3095-3099; Ва1ш! е! а1. (1993), Сепе 137:109-118; СгобЬегд е! а1. (1993), Еиг. 1. Вюскет. 218:597-601; Мщаккппа е! а1. (1993), 1. Вю1. Скет. 268:2888-2892; Ьомтап е! а1. (1991), ВюскетщИу 30:10832-10838 апб Сипшпдкат е! а1. (1989), 8с1епсе 244:1081-1085), мутагенеза с использованием сканирования линкером (Сик!ш е! а1. (1993), Уио1о§у 193:653-660; Вгомп е! а1. (1992), Мо1. Се11. Вю1. 12:2644-2652; МсКш§к! е! а1. (1982), 8с1епсе 232:316); путем насыщающего мутагенеза (Меуегк е! а1. (1986), 8с1епсе 232:613); путем ПЦР-мутагенеза (Ееипд е! а1. (1989), Ме!коб. Се11. Мо1. Вю1. 1:11-19) или путем случайного мутагенеза, включая химический мутагенез и т.п. (М111ег е! а1. (1992), А 8коИ Соигке ш Вас!епа1 СепеИск, С8НЬ Ргекк, Со1б 8рпп§ НагЬог, ΝΥ; апб Сгеепег е! а1. (1994), 8!га!ед1ек ш Мо1. Вю1. 7:32-34). Мутагенез с использованием сканирования линкером, особенно в комбинаторной установке, является привлекательным способом идентификации усеченных (биоактивных) форм полипептидов Ас1КНа.
В данной области известен широкий диапазон технологий для скрининга генных продуктов из комбинаторных библиотек, полученных точечными мутациями и усечениями, и, в сущности, для скрининга библиотек кДНК для генных продуктов, имеющих определенное свойство. Такие технологии будут в общем адаптированы для быстрого скрининга генных библиотек, созданных комбинаторным мутагенезом полипептидов АсЖНа. Наиболее широко используемые технологии скрининга больших генных библиотек обычно включают клонирование генной библиотеки в реплицируемые векторы экспрессии, трансформацию подходящих клеток получаемой библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых обнаружение желаемой активности облегчает относительно простое выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был обнаружен. Предпочтительные анализы включают анализы связывания активина и анализы передачи активин-опосредуемого клеточного сигнала.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды Ас1КНа настоящего изобретения могут дополнительно содержать посттрансляционные модификации в дополнение к какой-либо модификации, которые естественным образом присутствуют в полипептидах Ас1КНа. Такие модификации включают, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. В результате модифицированные полипептиды АсЖНа могут содержать неаминокислотные элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахариды и фосфаты. Действие таких неаминокислотных элементов на функциональные возможности полипептида Ас1КНа можно тестировать, как описано в настоящем изобретении, на других вариантах полипептида Ас1КНа. Если полипептид АсЖНа продуцируется в клетках за счет расщепления растущей формы полипептида Ас1КНа, посттрансляционная обработка также может быть важной для правильной укладки и/или функционирования белка. Разные клетки (такие как СНО, НеЬа, МОСК, 293, ^138, ΝΙΗ-3Τ3 или НЕК293) имеют конкретные клеточные структуры и характерные механизмы для таких посттрансляционных действий, и их можно выбирать для гарантии правильной модификации и обработки полипептидов Ас1КНа.
В некоторых аспектах функциональные варианты или модифицированные формы полипептидов Ас1КНа включают слитые белки, имеющие, по меньшей мере, участки полипептидов Ас1КИа и один или несколько доменов слияния. Общеизвестные примеры таких доменов слияния включают, но не ограничиваются ими, полигистидин, С1и-С1и, глутатион-8-трансферазу (С8Т), тиоредоксин, белок А, белок С, константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Ес), мальтоза-связывающий белок (МВР) или человеческий сывороточный альбумин. Домен слияния может быть выбран таким образом, чтобы возникало желаемое свойство. Например, некоторые домены слияния особенно полезны для выделения слитых
- 12 015105 белков методом аффинной хроматографии. С целью аффинной очистки для аффинной хроматографии используют подходящие матрицы, такие как глутатион-, амилаза- и никель- или кобальтконъюгированные смолы. Многие из таких матриц доступны в форме комплекта, такого как система очистки Рйагтааа С8Т и система О1Лсхргс55т™ (01адсп). полезные при использовании с парами слияния Н186. В качестве другого примера домен слияния может быть выбран таким образом, чтобы облегчить обнаружение полипептидов АсГКНа. Примеры таких доменов обнаружения включают различные флуоресцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок СРР), а также метки эпитопа, которые обычно представляют собой короткие пептидные последовательности, для которых существует специфичное антитело. Общеизвестные метки эпитопа, для которых легко доступны специфичные моноклональные антитела, включают РЬАС, гемагглютинин вируса гриппа (НА) и метки с-тус. В некоторых случаях домены слияния имеют сайт расщепления протеазы, такой как для фактора Ха или тромбина, которые позволяют соответствующей протеазе частично расщеплять слитые белки и, таким образом, высвобождать из них рекомбинантные белки. Затем высвобожденные белки могут быть выделены из домена слияния последующим хроматографическим разделением. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления полипептид Лс1В11а сливают с доменом, который стабилизирует полипептид Лс1В11а ίη νίνο (домен-стабилизатор). Под стабилизацией понимают все, что увеличивает период полувыведения из сыворотки, независимо от того, происходит ли это в силу уменьшения разрушения, уменьшенного почечного клиренса или в силу другого фармакокинетического эффекта. Известно, что слияния с участком Рс иммуноглобулина придают желаемые фармакокинетические свойства широкому диапазону белков. Аналогично, желаемые свойства могут придавать слияния с человеческим сывороточным альбумином. Другие типы доменов слияния, которые могут быть выбраны, включают домены мультимеризации (например, димеризации, тетрамеризации) и функциональные домены (которые придают дополнительную биологическую функцию, такую как дополнительная стимуляция роста кости или роста мышцы, если это желательно).
В качестве конкретного примера настоящее изобретение обеспечивает слитый белок, содержащий растворимый внеклеточный домен АсГКНа, слитый с доменом Рс (например, 8ЕО ГО N0: 6).
ТНТСРРСРАРЕЫ>еСРЗУЕЪРРРКРККГЬМ15КТРЕУТСУУуО (А) УЗНЕЦРЕУКГ
ΝΗΥνϋΰ'/Ε7ΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ0Υ№ΤΥ КТУЗ УЬТУЬНОЦНШОКЕΥΚΟΚ (А) УЗИКАЪ РУРГЕКТГЗКАКеСРКЕРОУУТЦРРЗЕЕЕМТКЫОУЗЬТСЬУКСЕУРЗШАУЕНЕЗЦ ООРЕЦНУКТТРРУЪОЗОСРГГЬУЗКЬТУОКЗКадэейУГЗСЗУМНЕАЦНЫ(Α)ΗΥΤ ОКЗЬЗЬЗРСК*
Необязательно, домен Рс имеет одну или несколько мутаций в таких остатках, как Азр-265, лизин 322 и Азп-434. В некоторых случаях мутантный домен Рс, имеющий одну или несколько таких мутаций (например, мутацию Азр-265), обладает пониженной способностью связываться с Рсу-рецептором по сравнению с Рс-доменом дикого типа. В других случаях мутантный домен Рс, имеющий одну или несколько указанных мутаций (например, мутацию Азп-434), обладает повышенной способностью связываться с Рс-рецептором комплекса гистосовместимости (МНС) класса I (РсВЦ) по сравнению с Рс-доменом дикого типа.
Подразумевается, что разные элементы слитых белков могут быть организованы любым образом, который согласуется с желаемыми функциональными возможностями. Например, полипептид АсЖНа может быть расположен С-терминально по отношению к гетерологичному домену или, альтернативно, гетерологичный домен может быть расположен С-терминально по отношению к полипептиду АсЖНа. Домен полипептида АсЖНа и гетерологичный домен не должны быть смежными в слитом белке, и дополнительные домены или аминокислотные последовательности могут быть вставлены на С-конце или на Ν-конце по отношению к любому домену или между доменами.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды АсГКНа настоящего изобретения содержат одну или несколько модификаций, которые способны к стабилизации полипептидов АсЖНа. Например, такие модификации ίη νίίτο увеличивают период полувыведения полипептидов АсЖНа, увеличивают период полувыведения из циркулирующей крови полипептидов АсГКНа или уменьшают протеолитическое разрушение полипептидов АсГКНа. Такие стабилизирущие модификации включают, но не ограничиваются ими, слитые белки (включая, например, слитые белки, содержащие полипептид АсГКНа и стабилизирующий домен), модификации участка гликозилирования (включая, например, добавление участка гликозилирования к полипептиду АсЖНа) и модификации углеводных функциональных групп (включая, например, удаление углеводных групп из полипептида АсГКНа). В случае слитых белков полипептид АсГКНа слит со стабилизирующим доменом, например, как молекула 1дС (например, домен Рс). Используемый в настоящем описании термин стабилизирующий домен относится не только к домену слияния (например, Рс), как в случае слитых белков, но также включает небелковоподобные модификации, такие как углеводные группы, или небелковоподобные полимеры, такие как полиэтиленгликоль.
- 13 015105
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение дает возможность получения выделенных и/или очищенных форм полипептидов ΛοίΡΙΙα. которые являются выделенными, или иным образом, по существу, не содержат других белков. Полипептиды ЛеЖИа обычно получают путем экспрессии из рекомбинантных нуклеиновых кислот.
3. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ЛеЖИа.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает выделенные и/или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из полипептидов ЛеЖИа (например, растворимые полипептиды ЛеЖИа), включая фрагменты, функциональные варианты и слитые белки, раскрытые в настоящем изобретении. Например, ЗЕО ΙΌ N0: 4 кодирует природный предшественник человеческого полипептида ЛеЖИа, тогда как ЗЕО Ш N0: 5 кодирует процессированный внеклеточный домен Ас®На. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или иметь двойную цепь. Такие нуклеиновые кислоты могут быть молекулами ДНК или РНК. Эти нуклеиновые кислоты можно использовать, например, в способах получения полипептидов ЛеЖНа или в качестве прямых терапевтических средств (например, в методиках генной терапии).
В некоторых аспектах дополнительно предполагается, что рассматриваемые нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ЛеЖПа, включают нуклеиновые кислоты, которые являются вариантами последовательностей ЗЕО Ш N0: 4 или 5. Вариантные нуклеотидные последовательности включают последовательности, которые отличаются одной или несколькими нуклеотидными заменами, добавлениями или делециями, такими как аллельные варианты.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенные или рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или на 100% идентичны ЗЕО Ш N0: 4 или 5. Рядовому специалисту в данной области будет понятно, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, комплементарные ЗЕО Ш N0: 4 или 5, и варианты ЗЕО Ш N0: 4 или 5 также входят в объем настоящего изобретения. В дополнительных вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть выделенными, рекомбинантными и/или слитыми с гетерологичной нуклеотидной последовательностью или в библиотеке ДНК.
В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты настоящего изобретения также включают нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются при очень строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, обозначенной ЗЕО Ш N0: 4 или 5, комплементарной последовательностью ЗЕО Ш N0: 4 или 5 или с их фрагментами. Как рассмотрено выше, рядовому специалисту в данной области будет очевидно, что подходящие условия строгости, которые вызывают гибридизацию ДНК, могут быть различными. Рядовому специалисту в данной области будет очевидно, что могут быть различными подходящие условия строгости, которые вызывают гибридизацию ДНК. Например, можно осуществлять гибридизацию в растворе 6,0х хлорид натрия/цитрат натрия (ЗЗС) при температуре около 45°С с последующим промыванием раствором 2,0хЗЗС при 50°С. Например, можно выбрать концентрацию солей на стадии промывки из условий низкой строгости около 2,0хЗЗС при 50°С до концентрации в условиях высокой строгости примерно 0,2хЗЗС при 50°С. Дополнительно, на стадии промывки можно повышать температуру от условий низкой строгости при комнатной температуре примерно 22°С до условий высокой строгости при температуре примерно 65°С. И температура, и концентрация солей могут варьировать или как температуру, так и концентрацию солей можно поддерживать постоянными, в то время как другой показатель варьирует. В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях низкой строгости 6хЗЗС при комнатной температуре с последующим промыванием в 2хЗЗС при комнатной температуре.
Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, обозначенных как ЗЕО Ш N0: 4 или 5, по причине дегенерации генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Например, многие аминокислоты обозначены более чем одним триплетом. Кодоны, которые определяют одну и ту же аминокислоту, или синонимы (например, САИ и САС являются синонимами для гистидина) могут приводить к молчащим мутациям, которые не повреждают аминокислотную последовательность белка. Однако предполагается, что в клетках млекопитающих будут существовать полиморфизмы последовательностей ДНК, которые действительно приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях рассматриваемых белков. Специалист в данной области будет понимать, что у представителей одного вида могут существовать указанные вариации в одном или нескольких нуклеотидах (примерно до 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, в силу природного аллельного разнообразия. Любые и все такие нуклеотидные вариации и полученные полиморфизмы аминокислот входят в объем настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть функционально связаны с одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями в конструкции экспрессии. Регуляторные нуклеотидные последовательности обычно будут подходить для клетки-хозяина, используемой для экспрессии. Многочисленные типы подходящих векторов экспрессии и подходящих регуляторных последовательностей известны в данной области
- 14 015105 для ряда клеток-хозяев. Обычно одна или несколько указанных регуляторных нуклеотидных последовательностей могут включать, без ограничения, промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала и завершения транскрипции, последовательности начала и завершения трансляции и активирующие или усиливающие (энхансерные) последовательности. В настоящем изобретении рассмотрены конститутивные или индуцибельные промоторы, известные в данной области. Промоторы могут представлять собой либо природные промоторы, либо гибридные промоторы, в которых сочетаются элементы более чем одного промотора. Конструкция экспрессии может присутствовать в клетке на эписоме, такой как плазмида, или конструкция экспрессии может быть вставлена в хромосому. В предпочтительном варианте осуществления вектор экспрессии содержит селектируемый маркерный ген, позволяющий выбирать трансформированные клетки-хозяева. Селектируемые маркерные гены известны в данной области и будут варьировать в зависимости от используемой клетки-хозяина.
В некоторых аспектах настоящего изобретения рассматриваемая нуклеиновая кислота представлена в векторе экспрессии, содержащем нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид Ас®Па и функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Регуляторные последовательности известны в данной области и выбираются для направленной экспрессии полипептида Лс®Иа. Соответственно, термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии. Описание примеров регуляторных последовательностей приведено в публикации СоеббеЕ Сепе Ехргекыоп ТесЬпо1оду: Ме!Ьоб§ ίη Епхуто1оду. Асабетк Ргс55. 8ап Окдо, СА (1990). Например, в таких векторах можно использовать любую из широкого разнообразия последовательностей контроля экспрессии, которые регулируют экспрессию последовательности ДНК при функциональном связывании с ней, для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид Ас®Иа. Такие полезные последовательности контроля экспрессии включают, например, ранние и поздние промоторы 8У40, ГеВпромотор, аденовирусный или цитомегаловирусный предранний промотор, промоторы В8У, 1ас систему, 1гр систему, систему ТАС или ТИС, промотор Т7, экспрессия которого направляется Т7 РНК полимеразой, главные операторные и промоторные области лямбда фага, контрольные области для Гб-покрытого белка, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например Р1о5, промоторы α-фактора скрещивания дрожжей, многогранный промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, известные регуляцией экспрессии генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и их различные комбинации. Предполагается, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которая будет трансформирована, и/или типа белка, желаемого для экспрессии. Кроме того, также необходимо учитывать число векторных копий, способность регулировать это число копий и экспрессию любого другого белка, кодируемого вектором, таким как антибиотические маркеры.
Рекомбинантная нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть получена путем лигирования клонированного гена или его участка в вектор, подходящий для экспрессии как в прокариотические клетки, эукариотические клетки (клетки дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих), так и в оба типа клеток. Носители экспрессии для получения рекомбинантного полипептида Ас!КЛа включают плазмиды и другие векторы. Например, для экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е.соЬ, подходящие векторы включают плазмиды следующих типов: рВИ322-производные плазмиды, рЕМВЬ-производные плазмиды, рЕХ-производные плазмиды, рВТас-производные плазмиды и рИС-производные плазмиды.
Некоторые векторы экспрессии млекопитающих содержат как прокариотические последовательности для облегчения размножения вектора в бактериях, так и одну или несколько эукариотических единиц транскрипции, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Векторы, происходящие из рсПЫАГ/атр, рсПыАг/пео, рИс/СМУ, р8У2дрГ, р8У2пео, р8У2-бЪГг, рТк2, рКБУпео, рМ8С, р8УТ7, рко-пео и рНуд, являются примерами векторов экспрессии млекопитающих, подходящих для трансфекции в эукариотическую клетку. Некоторые из этих векторов модифицированы последовательностями из бактериальных плазмид, таких как рВИ322, для облегчения репликации и отбора на лекарственную устойчивость как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. Альтернативно, для транзиторной экспрессии белков в эукариотических клетках могут быть использованы производные вирусов, такие как вирус папилломы быка (ВРУ-Ι) или вирус Эпштейна-Барра (рНЕВо, полученный из рИЕР и р205). Примеры других систем экспрессии вирусов (включая ретровирусы) можно найти ниже в описании систем доставки при генной терапии. Различные способы, используемые в получении плазмид и в трансформации организмов-хозяев, известны в данной области. Примеры других подходящих систем экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, а также примеры обычных рекомбинантных методик см. в руководствах Мо1еси1аг С1ошпд А ЬаЬога!огу Мапиа1, 3гб Еб., еб. Ьу 8атЬгоок, РгбксЬ апб Маша!к (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8, 2001). В некоторых случаях может быть желательно экспрессировать рекомбинантные полипептиды, используя бакуловирусную систему экспрессии. Примеры таких бакуловирусных систем экспрессии включают векторы, происходящие из рУЪ (такие как рУЪ1392, рУЪ1393 и рУЪ941), векторы, происходящие из рАсИ^ (такие как рАсИ^1), и векторы, происходящие
- 15 015105 из рВ1иеВас (такие как β-да! содержащий рВ1иеВас III).
В предпочтительном варианте осуществления вектор будет сконструирован для получения рассматриваемых полипептидов АсЖПа в клетках СНО. например вектор Рсту-8спр1 (81та!адепе. Ьа 1о11а. Сай!.). векторы рсЭХЛ4 (1пуйтодеп. СаткЬай. Сай!.) и векторы рС1-пео (Рготеда. Майкой, ХУйе). Очевидно. что для очистки можно использовать рассматриваемые генные конструкции. чтобы вызвать экспрессию рассматриваемых полипептидов АсГКПа в клетках. размножающихся в культуре. например. для получения белков. включая слитые белки или вариантные белки.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину. трансфицированной рекомбинантным геном. включающим кодирующую последовательность (например. 8ЕО ΙΌ N0: 4 или 5) для одного или нескольких рассматриваемых полипептидов ЛсШПа. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например. полипептид АсГКПа настоящего изобретения может быть экспрессирован в бактериальных клетках. таких как Е.сой. в клетках насекомых (например. с использованием бакуловирусной системы экспрессии). дрожжей или в клетках млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области.
Соответственно. настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения рассматриваемых полипептидов АсГКПа. Например. клетка-хозяин. трансфицированная вектором экспрессии. кодирующим полипептид АсГКПа. может быть культивирована в подходящих условиях. позволяющих проводить экспрессии полипептида АсГКПа. Полипептид АсГКПа можно секретировать и выделять из смеси клеток и питательной среды. содержащей полипептид ЛсЖПа. Альтернативно. полипептид АсГКПа может сохраняться в цитоплазме или в мембранной фракции и собранных клетках в виде лизированного и выделенного белка. Клеточная культура включает клетки-хозяева. питательные среды и другие побочные продукты. Подходящие питательные среды для клеточной культуры известны в данной области. Рассматриваемые полипептиды АсГКПа можно выделить из среды для клеточной культуры. из клеток-хозяев или из того и другого. используя известные в данной области способы очистки белков. включающие ионнообменную хроматографию. гель-фильтрационную хроматографию. ультрафильтрацию. электрофорез. иммуноаффинную очистку с антителами. специфичными для конкретных эпитопов полипептидов АсЖПа. и аффинную очистку агентом. который связывается с доменом. слитым с полипептидом АсГКПа (например. можно использовать колонку белка А для очистки слитого АсЖПа-Ес). В предпочтительном варианте осуществления полипептид АсЖПа представляет собой слитый белок. содержащий домен. который облегчает его очистку. В предпочтительном варианте осуществления очистку осуществляют последовательными стадиями колоночной хроматографии. включающими. например. три или больше из следующих стадий в любом порядке: хроматография с белком А; хроматография с использованием О-сефарозы; хроматография с использованием фенилсефарозы; эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершать вирусной фильтрацией и буферным обменом. Как показано в настоящем описании. белок АсШПа-йЕс очищали до чистоты >98%. как определено эксклюзионной хроматографией. и до чистоты >95%. как определено методом 8Ό8 РАСЕ. Этот уровень чистоты был достаточным для достижения желаемых эффектов на кость у мышей и для приемлемого профиля безопасности у мышей. крыс и приматов. отличных от человека.
В другом варианте осуществления гибридный ген. кодирующий очищающую лидерную последовательность. такую как последовательность сайта расщепления поли-(Нщ)/энтерокиназы на Ν-конце желаемого участка рекомбинантного полипептида АсГКПа. дает возможность очистки экспрессируемого слитого белка методом аффинной хроматографии. используя Ντ'-содержащую смолу. Затем очищающую лидерную последовательность можно последовательно удалять путем обработки энтерокиназой с получением очищенного полипептида Ас1КПа (см.. например. Ноский е! а1. (1987). 1. Сктота!одгарйу. 411:177 апй 1апкпесЫ е! а1.. Р^8 И8А. 88:8972).
Технологии получения гибридных генов общеизвестны. По существу. присоединение разных фрагментов ДНК. кодирующих разные полипептидные последовательности. осуществляют согласно общепринятым технологиям. используя тупоконечные или выступающие концы для лигирования. расщепление ферментами рестрикции для обеспечения подходящих концов. заполнение липких концов в случае необходимости. обработку щелочной фосфатазой для исключения нежелательного присоединения и ферментное лигирование. В другом варианте осуществления может быть синтезирован гибридный ген по общепринятой технологии. включающей автоматические ДНК-синтезаторы. Альтернативно. можно осуществлять ПЦР-амплификацию генных фрагментов. используя якорные праймеры. что приводит к возникновению дополнительных липких концов между двумя последовательными генными фрагментами. которые затем можно отжигать для получения химерной генной последовательности (см.. например. Сштеп! Рто!осок шМо1еси1аг Вю1оду. ей§. Аи8иЬе1 е! а1.. 1ойп \Уйеу & 8оп§. 1992).
- 16 015105
4. Альтернативные антагонисты активина и АсГКПа.
Данные, представленные в настоящем изобретении, показывают, что антагонисты передачи сигналов активин-АсГКПа можно использовать для стимулирования роста кости и минерализации кости. Хотя растворимые полипептиды АсГКПа, и особенно АсГКПа-Ес, являются предпочтительными антагонистами и хотя такие антагонисты могут воздействовать на кость посредством механизма, отличного от антагонизма к активину (например, ингибирование активина может быть индикатором тенденции агента ингибировать активность ряда молекул, включая, возможно, другие члены суперсемейства ΤΟΡ-β, и такое сочетанное ингибирование может приводить к желаемому эффекту на кость), предполагается, что будут полезны другие типы антагонистов активина-АсГКПа, включая антитела против активина (например, А, В, С или Е), анти-АсГКПа-антитела, антисмысловые нуклеиновые кислоты, РНК1 или рибозимы, которые ингибируют продукцию АсГКПа, и другие ингибиторы активина или АсГКПа, особенно те из них, которые нарушают связывание активин-АсГКПа.
Антитело, которое специфично реагирует с полипептидом АсГКПа (например, с растворимым полипептидом АсГКПа) и которое или конкурентно к лиганду связывается с полипептидом АсГКПа, или иным образом ингибирует АсГКПа-опосредованную передачу сигналов, может быть использовано в качестве антагониста действия полипептида АсГКПа. Аналогично, в качестве антагониста можно использовать антитело, которое специфично реагирует с полипептидом активином А и которое нарушает связывание АсГКПа.
Путем использования иммуногенов, полученных из полипептида АсГКПа или полипептида активина, можно получать антибелковую/антипептидную антисыворотку или моноклональные антитела согласно стандартным протоколам (см., например, АпГ1Ьоб1е8: А ЬаЬогаГогу Мапиа1 еб. Ьу Наг1о\\' апб Ьапе (Со1б 8рПпд НагЬог Ргекк: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомяк или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой полипептида АсГКПа, антигенным фрагментом, который способен вызывать реакцию антител, или слитым белком. Технологии придания иммуногенности белку или пептиду включают технологии конъюгации с носителями или другие технологии, известные в данной области. Иммуногенный участок АсГКПа или полипептида активина можно вводить в присутствии адъюванта. Развитие иммунизации можно контролировать выявлением титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровня антител можно использовать стандартный ЕЫ8А или другие иммуноанализы с иммуногеном в качестве антигена.
После иммунизации животного антигенным препаратом полипептида АсГКПа можно получать антисыворотку и, если это желательно, из сыворотки можно выделять поликлональные антитела. Для получения моноклональных антител от иммунизированного животного можно забирать антителопродуцирующие клетки (лимфоциты) и осуществлять слияние согласно стандартным методикам слияния соматических клеток с иммортализованными клетками, такими как миеломные клетки, с получением гибридомных клеток. Такие способы известны в данной области и включают, например, гибридомную технологию (первоначально разработанную КоЫег апб М1кГет (1975), Шипе, 256:495-497), технологию человеческой В-клеточной гибридомы (КохЬаг еГ а1. (1983), 1штипо1оду Тобау, 4:72) и технологию ЕВУ-гибридомы для получения человеческих моноклональных антител (Со1е еГ а1. (1985), Мопос1опа1 АпГ1Ьоб1е8 апб Сапсег Тйегару, А1ап К. Ь188, 1пс. р. 77-96). Можно проводить иммунохимический скрининг клеток гибридомы на продукцию антител, специфично реактивных к полипептиду АсГКПа и к моноклональным антителам, выделенным из культуры, содержащей такие клетки гибридомы.
Предполагается, что термин антитело, используемый в настоящем описании, включает его фрагменты, которые также являются специфично реактивными к рассматриваемому полипептиду. Антитела можно фрагментировать, используя общепринятые технологии, и производить скрининг фрагментов на их применимость таким же образам, как описано выше для целых антител. Например, можно получать фрагмент Р(аЬ)2 обработкой антитела пепсином. Чтобы получить РаЬ фрагменты, полученный фрагмент Р(аЬ)2 можно обработать для уменьшения числа дисульфидных мостиков. Дополнительно предполагается, что антитело настоящего изобретения включает биспецифичные, одноцепочечные, химерные, гуманизированные и полностью человеческие молекулы, обладающие аффинностью к полипептиду АсГКПа или активину, которым принадлежит по меньшей мере одна гипервариабельная СИК-область антитела. Антитело может дополнительно содержать присоединенную к нему метку и быть способным к обнаружению (например, метка может представлять собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента).
В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой рекомбинантное антитело, причем этот термин охватывает любое антитело, частично полученное по технологиям молекулярной биологии, и включает СИК-трансплантированные или химерные антитела, человеческие или другие антитела, собранные от выбранных библиотекой доменов антител, одноцепочечные антитела и антитела с единственным доменом (например, человеческие УН белки или верблюжьи УНН белки). В некоторых вариантах осуществления антитело настоящего изобретения представляет собой моноклональное антитело и в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет доступ к способам получения новых антител. Например, способ получения моноклонального антитела, которое специфично связывается с полипептидом АсГКПа или полипептидом активином, может включать введение мыши такого
- 17 015105 количества иммуногенной композиции, содержащей антигенный полипептид, которое эффективно для того, чтобы индуцировать определяемый иммунный ответ, получение от мыши антителопродуцирующих клеток (например, клеток селезенки) и слияние антителопродуцирующих клеток с миеломными клетками с получением антителопродуцирующих гибридом, тестирование антителопродуцирующих гибридом для идентификации гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, которое специфично связывается с антигеном. После получения гибридомы ее можно размножать в клеточной культуре, необязательно в культуральных условиях, при которых клетки гибридомного происхождения продуцируют моноклональное антитело, которое специфично связывается с антигеном. Моноклональное антитело может быть очищено от клеточной культуры.
Понятие специфично реактивное к, используемое со ссылкой на антитело, означает, как обычно считается в данной области, что антитело является достаточно селективным в отношении представляющего интерес антигена (например, полипептида Ас£КНа) по сравнению с другими, не представляющими интерес антигенами, что антитело полезно, как минимум, для обнаружения присутствия представляющего интерес антигена в конкретном типе биологического образца. В некоторых способах с использованием указанного антитела, таких как терапевтические области применения, может быть желаемой более высокая степень специфичности в связывании. Моноклональные антитела, как правило, имеют более сильную склонность (по сравнению с поликлональными антителами) эффективно выявлять различие между желаемыми антигенами и перекрестно-реагирующими полипептидами. Одним из свойств, которые влияют на специфичность взаимодействия антитело-антиген, является аффинность антитела к антигену. Хотя желаемой специфичности можно достичь с диапазоном разной аффинности, как правило, предпочтительные антитела будут иметь аффинность (константу диссоциации) примерно 10-б, 10-7, 10-8, 10-9 или менее. Учитывая чрезвычайно плотное связывание между активином и Ас£КЛа, предполагается, что нейтрализующее антитело против активина или против Ас£КЛа обычно будет иметь константу диссоциации 10-10 или менее.
Кроме того, технологии, используемые при скрининге антител для идентификации желаемого антитела, могут влиять на свойства полученного антитела. Например, если антитело должно использоваться для связывания антигена в растворе, то может быть желательным тестирование растворов связывания. Ряд различных технологий доступен для тестирования взаимодействия между антителами и антигенами с целью идентификации особенно желаемых антител. Такие технологии включают ЕЬ18А, анализы связывания на основе поверхностного плазмонного резонанса (например, анализ связывания Ρίπ^ΐΌ™.
АВ, Иррка1а, 8^ебеи), сэндвич-анализы (например, система парамагнитных шариков ΙΟΕΝ 1п1егпа1юпа1, 1пс, ОаййегкЬигд, Магу1апб), вестерн-блоттинги, анализы иммунопреципитации и иммуногистохимические исследования.
Примеры категорий соединений нуклеиновых кислот, которыми являются активин или антагонисты Ас£КНа, включают антисмысловые нуклеиновые кислоты, РНК1 конструкции и каталитические конструкции нуклеиновых кислот. Соединение нуклеиновой кислоты может иметь единственную цепь или двойную цепь. Соединение с двойной цепью также может включать липкие или некомплементарные области, в которых одна или другая цепь является одноцепочечной. Соединение с единственной цепью может включать области самокомплементарности, означая, что соединение образует так называемую структуру шпильки или стебля-петли с областью двойной спиральной структуры. Соединение нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную последовательность, которая комплементарна области, состоящей из не более 1000 нуклеотидов, не более 500, не более 250, не более 100 или не более 50, 35, 30, 25, 22, 20 или 18 нуклеотидов полноразмерной последовательности нуклеиновой кислоты Ас£КНа или последовательности нуклеиновой кислоты активина β..\ или активина βΒ. Область комплементарности предпочтительно будет составлять по меньшей мере 8 нуклеотидов, необязательно, по меньшей мере 10 или по меньшей мере 15 нуклеотидов и, необязательно, 15-25 нуклеотидов. Область комплементарности может находиться в пределах интрона, кодирующей последовательности или некодирующей последовательности транскрипта-мишени, такого как участок кодирующей последовательности. Как правило, соединение нуклеиновой кислоты будет иметь длину от примерно 8 до примерно 500 нуклеотидов или пар оснований, и, необязательно, его длина будет составлять от примерно 14 до примерно 50 нуклеотидов. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК (особенно для применения в качестве антисмысловой), РНК или гибрид РНК:ДНК. Любая из цепей может включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые невозможно легко классифицировать как ДНК или как РНК. Аналогично, соединение с двойной цепью может представлять собой ДНК: ДНК, ДНК:РНК или РНК:РНК, и любая из цепей может также включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые невозможно легко классифицировать как ДНК или как РНК. Соединение нуклеиновой кислоты может включать любое множество модификаций, включая одну или несколько модификаций в скелете (сахар-фосфатный участок в природной нуклеиновой кислоте, включающий межнуклеотидные связи) или участок основания (участок пурина или пиримидина в природной нуклеиновой кислоте). Соединение антисмысловой нуклеиновой кислоты будет предпочтительно иметь длину от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов и будет часто содержать одну или несколько модификаций для улучшения таких свойств, как устойчи
- 18 015105 вость в сыворотке, в клетке или в месте вероятной доставки соединения, таком как желудок в случае перорально доставляемых соединений и легкие для ингаляционных соединений. В случае конструкции РНК1, цепью, комплементарной к транскрипту-мишени, обычно будет РНК или ее модификации. Другой цепью может быть РНК, ДНК или любые другие варианты. Сдвоенный участок двойной цепи или одноцепочечной шпильки конструкции РНК1 предпочтительно будет иметь длину от 18 до 40 нуклеотидов и, необязательно, примерно от 21 до 23 нуклеотидов в длину при условии, что он является дайсер субстратом. Каталитические или ферментативные нуклеиновые кислоты могут быть рибозимами или ферментами ДНК и также могут содержать модифицированные формы. Соединения нуклеиновой кислоты могут ингибировать экспрессию мишени примерно на 50, 75, 90% или более в случае контакта с клетками при физиологических условиях и при концентрации, где несмысловой или смысловой контроль имеет небольшой эффект или не имеет эффекта. Предпочтительные концентрации для тестирования действия соединений нуклеиновой кислоты составляют 1, 5 и 10 мкмоль. Также соединения нуклеиновой кислоты можно тестировать на эффекты, например на рост и минерализацию кости.
5. Скрининговые анализы.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к применению полипептидов Ас1КИа (например, растворимых полипептидов АсЖИа) и полипептидов активина для идентификации соединений (веществ), которые являются агонистами или антагонистами сигнального пути активин-АсЖИа. Можно тестировать соединения, идентифицированные посредством такого скрининга, на оценку их способности модулировать рост или минерализацию кости ίη νίίτο. Необязательно, эти соединения можно дополнительно тестировать на моделях животных для оценки их способности модулировать рост тканей ίη νίνο.
Существуют многочисленные подходы к скринингу терапевтических средств для модуляции тканевого роста путем направленного транспорта активина и полипептидов АсЖИа. В некоторых вариантах осуществления может быть проведен высокопроизводительный скрининг соединений для идентификации веществ, которые нарушают действия на кость, опосредуемые активином или АсЖИа. В некоторых вариантах осуществления выполняют анализ для скрининга и идентификации соединений, которые специфично ингибируют или уменьшают связывание полипептида АсШПа с активином. Альтернативно, можно применять анализ для идентификации соединений, которые увеличивают связывание полипептида АсЖИа с активином. В дополнительном варианте осуществления могут быть идентифицированы соединения по их способности взаимодействовать с активином или полипептидом Ас®Иа.
В свете настоящего изобретения несколько видов анализа будет достаточным, и даже не описанные явно в настоящем изобретении анализы будут, вместе с тем, очевидны для рядового специалиста в данной области. Как описано в настоящем изобретении, тестовые соединения (агенты) настоящего изобретения могут быть получены любым комбинаторным химическим способом. Альтернативно, рассматриваемые соединения могут быть природными биомолекулами, синтезируемыми ίη νίνο или ίη νίίτο. Соединения (агенты), которые будут тестироваться на их способность действовать в качестве модуляторов роста тканей, могут продуцироваться, например, бактериями, дрожжами, растениями или другими организмами (например, природными продуктами), могут быть получены химически (например, малые молекулы, включающие пептидомиметики) или получены с помощью рекомбинантной технологии. Тестовые соединения, рассматриваемые согласно настоящему изобретению, включают непептидильные органические молекулы, пептиды, полипептиды, пептидомиметики, сахара, гормоны и молекулы нуклеиновых кислот. В конкретном варианте осуществления тестовым агентом является малая органическая молекула, молекулярная масса которой менее чем примерно 2000 Да.
Тестовые соединения настоящего изобретения могут быть предусмотрены в виде единственной, дискретной единицы или предусмотрены в семействах большего уровня сложности, например, получаемых комбинаторной химией. Эти семейства могут содержать, например, спирты, алкилгалогениды, амины, амиды, сложные эфиры, альдегиды, простые эфиры и другие классы органических соединений. Представление тестовых соединений в тестовую систему может быть или в выделенной форме, или в виде смеси соединений, особенно на начальных стадиях скрининга. Необязательно, соединения могут быть дериватизированы другими соединениями и иметь дериватизационные группы, которые облегчают выделение соединений. Неограничивающие примеры дериватизационных групп включают биотин, флуоресцеин, дигоксигенин, зеленый флуоресцентный белок, изотопы, полигистидин, магнитные ширики, глутатион-8-трансферазу (С8Т), фотоактивируемые сшиватели или их любые комбинации.
Во многих программах скрининга лекарственных средств, которые тестируют семейства соединений и природные экстракты, желаемыми являются высокопроизводительные анализы, чтобы максимизировать количество соединений, обследованных за данный промежуток времени. Анализы, которые проводят в бесклеточных системах, такие как анализы, которые могут быть проведены с очищенными или полуочищенными белками, часто являются предпочтительными в качестве первичного скрининга, который можно осуществлять для возможности быстрого исследования и относительно легкого обнаружения изменения в молекулярной мишени, которое опосредовано тестовым соединением. Кроме того, эффекты клеточной токсичности или биодоступность тестового соединения можно, как правило, игнорировать в системе ίη νίίτο, вместо этого направив анализ, в первую очередь, на действие лекарственного средства на молекулярную мишень, что может проявляться в изменении связывающей аффинности меж
- 19 015105 ду полипептидом АсГКПа и активином.
Просто в качестве примера в скрининговом анализе настоящего изобретения рассматриваемое соединение контактирует с выделенным и очищенным полипептидом АсГКПа, который обычно способен к связыванию с активином. Затем к смеси соединения и полипептида АсГКЛа добавляют композицию, содержащую лиганд АсГКЛа. Обнаружение и количественное определение комплексов АсГКЛа/активин обеспечивают средство для определения эффективности соединения в ингибировании (или потенцировании) образования комплекса между полипептидом АсГКПа и активином. Эффективность соединения может быть оценена путем выведения кривых доза-ответ, используя данные, полученные при разных концентрациях тестового соединения. Кроме того, также можно проводить контрольный анализ, чтобы обеспечить исходный уровень для сравнения. Например, в контрольном анализе выделенный и очищенный активин добавляют к композиции, содержащей полипептид Ас!ВПа, и количественно определяют образование комплекса АсГКЛа/активин в отсутствие тестового соединения.
Подразумевается, что порядок смешивания реагентов, как правило, может варьировать, и они могут быть смешаны одновременно. Кроме того, вместо очищенных белков можно использовать клеточные экстракты и лизаты, чтобы предоставить для анализа подходящую бесклеточную систему.
Образование комплекса между полипептидом АсГКЛа и активином можно обнаружить рядом способов. Например, можно количественно определять модуляцию образования комплексов, используя, на32 35 14 3 пример, определяемые меченые белки, такие как радиоизотопные метки (например, Р, 8, С или Н), флуоресцентные метки (например, МТС) или ферментно-меченый полипептид АсГКПа или активин, путем иммунологического анализа или хроматографическим обнаружением.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение рассматривает применение анализов поляризации флуоресценции и резонансного переноса энергии флуоресценции (РВЕТ) для измерения как прямого, так и опосредованного, степени взаимодействия между полипептидом Ас!ВПа и связывающим его белком. Кроме того, со многими вариантами осуществления настоящего изобретения совместимы другие методики обнаружения, такие как методики на основе оптических волноводов (опубликованная заявка РСТ иО 96/26432 и патент США № 5677196), на основе поверхностного плазмонного резонанса (8РВ), детекторы поверхностного заряда и детекторы поверхностной силы.
Кроме того, настоящее изобретение рассматривает применение анализа взаимодействия с ловушкой, также называемого анализом двойных гибридов, для идентификации агентов, которые нарушают или потенцируют взаимодействие между полипептидом Ас!ВПа и связывающим его белком, см., например, патент США № 5283317; ΖβΓνοδ е! а1. (1993), Се11. 72:223-232; Мабига е! а1. (1993), I. Вю1. Сйет. 268:12046-12054; Ваг)е1 е! а1. (1993), Вю1ес11пк|иек 14:920-924 и ЬуаЬисЫ е! а1. (1993), Опсодепе 8:16931696). В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение рассматривает применение обратных систем двойных гибридов для идентификации соединений (например, малых молекул или пептидов), которые разъединяют взаимодействия между полипептидом Ас!ВПа и связывающим его белком, см., например, У1ба1 апб Ьедгат (1999), Ыис1е1с Ас1бк Век 27:919-29; У1ба1 апб Ьедгат (1999), Тгепбк Вю1ес1то1 17:374-81 и патенты США № 5525490; 5955280 и 5965368.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемые соединения идентифицируют по их способности взаимодействовать с полипептидом Ас!ВПа или активином настоящего изобретения. Взаимодействие между соединением и полипептидом Ас!ВПа или активином может быть ковалентным или нековалентным. Например, такое взаимодействие можно идентифицировать по содержанию белка, используя биохимические способы ш νίίτο, включающие фотосшивание, лигандное связывание с радиоактивным мечением и аффинную хроматографию (.ТакоЬу иВ е! а1., 1974, Мебюбк ш Еп7уто1оду, 46:1). В некоторых случаях можно проводить скрининг соединения на основе анализа механизма, такого как анализ обнаружения соединений, которые связываются с активином или полипептидом Ас!ВПа. Такой анализ может включать случай твердофазного или жидкофазного связывания. Альтернативно, ген, кодирующий активин или полипептид Ас!ВПа, может быть трансфицирован репортерной системой (например, β-галактозидазой, люциферазой или зеленым флуоресцентным белком) в клетку и подвергнут скринингу по сравнению с библиотекой, предпочтительно высокопроизводительному скринингу или скринингу с отдельными членами библиотеки. Можно использовать анализы на основе другого механизма связывания, например анализы связывания, обнаруживающие изменения свободной энергии. Можно проводить анализы связывания с мишенью, фиксированной в лунке, на шарике или чипе, или захваченной иммобилизованным антителом, или с разделением капиллярным электрофорезом. Связанные соединения обычно могут быть выявлены с использованием колориметрии или флуоресценции или поверхностного плазмонного резонанса.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы и средства модуляции (стимуляции или ингибирования) остеогенеза и увеличения костной массы. Поэтому любое идентифицированное соединение можно тестировать на целых клетках или тканях, ш νίίΐΌ или ш νίνΌ, для подтверждения их способности модулировать рост или минерализацию кости. С этой целью можно применять различные способы, известные в данной области.
- 20 015105
Например, можно определять действие полипептидов АсШЛа или активина или тестовых соединений на рост кости или хряща путем измерения индукции Мзх2 или дифференцировки клетокпредшественников остеобластов в остеобласты в анализах на клеточной основе (см., например, Эа1ш8к1. е! а1., №11. Сепе!. 2001, 27(1):84-8; Нто е! а1., Ргоп! ВюзсЕ 2004, 9:1520-9). Другой пример анализов на клеточной основе включает анализ остеогенной активности рассматриваемых полипептидов АсШЛа или активина и тестовых соединений в мезенхимальных клетках-предшественниках и остеобластах. В качестве иллюстрации можно конструировать рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие полипептид АсШЛа или активин, для инфицирования полипотентных мезенхимальных клеток-предшественников С3Н10Т1/2, преостеобластических клеток С2С12 и остеобластических клеток ТЕ-85. Затем определяют остеогенную активность, измеряя индукцию щелочной фосфатазы, остеокальцина и матричную минерализацию (см., например, Сйеид е! а1., I. Вопе Ιοίη! 8игд Ат. 2003, 85-А(8):1544-52).
В настоящем изобретении также рассмотрены исследования ίη у1уо по измерению роста хряща или кости. Например, в публикации №ткипд-Ма!1йа1 е! а1., Вопе, 28:80-86 (2001) приведено описание модели остеопороза крысы, на которой изучали репарацию кости в раннем периоде после перелома. КиЬо е! а1., 8!его1й ВюсНетМгу & Мо1еси1аг Вю1оду, 68:197-202 (1999) также описывают модель остеопороза крысы, на которой изучали репарацию кости в позднем периоде после перелома. Апйегззоп е! а1., I Епйосппо1. 170:529-537 описывают модель остеопороза мыши, в которой мыши овариэктомированы, что вызывает у мышей значительную потерю содержания минералов в костях и снижение минеральной плотности костей, при потере около 50% минеральной плотности в трабекулярной кости. Можно увеличивать плотность костей у овариэктомированных мышей путем введения таких факторов, как паратиреоидный гормон. В некоторых аспектах в настоящем изобретении используются известные в данной области исследования излечения переломов. Эти исследования включают технологию переломов, гистологический анализ и биомеханический анализ, которые описаны, например, в патенте США № 6521750, полностью включенном путем ссылки в отношении раскрытия в нем протоколов экспериментов по выполнению переломов, а также по измерению распространения переломов и процесса репарации.
6. Примеры терапевтического применения.
В некоторых вариантах осуществления антагонисты активина-АсЖЛа (например, полипептиды АсШПа) настоящего изобретения можно использовать для лечения или предотвращения заболевания или состояния, которое ассоциировано с повреждением кости, возникающего, например, по причине перелома, потери или деминерализации. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения повреждения кости у нуждающегося в этом индивидуума посредством введения индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста активинаАсШПа, в частности полипептида АсШЛа. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы стимулирования роста или минерализации кости у нуждающегося в этом индивидуума путем введения индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста активина-АсЖЛа, в частности полипептида АсШЛа. Эти способы предпочтительно направлены на терапевтическое и профилактическое лечение животных, а более предпочтительно людей. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение антагонистов активина-Ас®Иа (особенно растворимых полипептидов АсШПа и нейтрализирующих антител, направленных против активина или АсЖЛа) для лечения нарушений, ассоциированных с низкой плотностью кости или уменьшенной прочностью кости.
Используемое в настоящем изобретении терапевтическое средство, которое предотвращает нарушение или состояние, относится к соединению, которое, в статистической выборке, уменьшает частоту возникновения нарушения или состояния у подвергнутого лечению субъекта по сравнению с не подвергнутым лечению контрольным субъектом или задерживает появление или уменьшает тяжесть одного или нескольких симптомов нарушения или состояния по сравнению с не подвергнутым лечению контрольным субъектом. Термин лечение, используемый в настоящем описании, включает профилактику указанного состояния или улучшение или устранение состояния после его диагностирования. В обоих случаях профилактика или лечение может определяться диагнозом, предоставляемым врачом, и предполагаемым результатом введения терапевтического средства.
Настоящее изобретение обеспечивает способы индуцирования образования кости и/или хряща, предотвращения потери костной массы, увеличения минерализации кости или предотвращения деминерализации кости. Например, рассматриваемые антагонисты активина-АсЖЛа применяют для лечения остеопороза и излечения переломов кости и дефектов хряща у людей и других животных. Плипептиды АсШЛа или активин могут быть полезными для пациентов, у которых диагностировано субклиническое снижение плотности кости, в качестве средства, защищающего от развития остеопороза.
В одном конкретном варианте осуществления можно найти медицинскую применимость способов и композиций настоящего изобретения для заживления переломов кости и дефектов хряща у людей и других животных. Рассматриваемые способы и композиции также могут иметь профилактическое применение для уменьшения как закрытых, так и открытых переломов, а также для улучшения фиксации искусственных суставов. Образование кости йе поуо, вызванное остеогенным средством, способствует репарации при черепно-лицевых дефектах врожденного, травматического происхождения или вызванных онко
- 21 015105 логической резекцией, а также является полезным в косметической пластической хирургии. В некоторых случаях рассматриваемые антагонисты активина-Ас!Р11а могут обеспечить среду для притягивания клеток, образующих кость, стимулировать рост образующих кость клеток или индуцировать дифференцировку клеток-предшественников образующих кость клеток. Антагонисты активина-Ас®Иа настоящего изобретения также могут быть полезны для лечения остеопороза.
Способы и композиции настоящего изобретения можно применять в условиях, характеризуемых или вызванных потерей костной массы, таких как остеопороз (включая вторичный остеопороз), гиперпаратиреоз, болезнь Кушинга, болезнь Педжета, тиреотоксикоз, состояние хронической диареи или малабсорбции, почечный канальцевый ацидоз или нервная анорексия.
Остеопороз может быть вызван различными факторами или ассоциирован с различными факторами. Факторами риска для остеопороза (потеря минеральной плотности костей, приводящая к риску переломов) является женский пол, особенно если женщина находится в постклимактерическом периоде, имеет малую массу тела и ведет сидячий образ жизни, и все из перечисленного являются факторами риска. Люди, имеющие любой из следующих статусов, могут быть кандидатами для лечения антагонистом Ас®Ла: женщина в постклимактерическом периоде, не принимающая эстроген или другую гормонозаместительную терапию; человек, имеющий в личном или семейном анамнезе перелом бедра или курящий; женщина в постклимактерическом периоде с высоким ростом (выше 5 футов 7 дюймов (170,28 см)) или малым весом (меньше 125 фунтов (56,750 кг)); мужчина с клиническими состояниями, ассоциированными с потерей костной массы; человек, принимающий лекарственные средства, известные как вызывающие потерю костной массы, включая кортикостероиды, такие как преднизон™, различные противосудорожные лекарственные средства, такие как дилантин™ и некоторые барбитураты, или высокие дозы лекарственных средств для заместительной терапии тиреоидными гормонами; человек, страдающий диабетом 1 типа, болезнями печени, болезнями почек или имеющий в семейном анамнезе остеопороз; человек, имеющий высокое ремоделирование кости (например, избыток коллагена в анализах мочи); человек с нарушением щитовидной железы, таким как гипертиреоз; человек, перенесший перелом после незначительной травмы; человек, имеющий рентгеновские признаки перелома позвоночника или другие симптомы остеопороза.
Как отмечено выше, к остеопорозу также может приводить состояние, ассоциированное с другим нарушением, или применение некоторых лекарственных препаратов. Остеопороз, вызванный лекарственными средствами или другим клиническим состоянием, известен как вторичный остеопороз. При заболевании, таком как болезнь Кушинга, избыточное количество продуцируемого в организме кортизола приводит к остепорозу и переломам. Наиболее распространенными лекарственными препаратами, ассоциированными с вторичным остеопорозом, являются кортикостероиды, класс лекарственных средств, которые действуют подобно кортизолу, гормону, который естественно вырабатывается надпочечниками. Хотя для развития скелета необходимы адекватные уровни тиреоидных гормонов (которые вырабатываются щитовидной железой), избыток тиреоидного гормона может с течением времени уменьшать костную массу. Прием антацидов, содержащих алюминий, может приводить к потере костной массы, если их применяют в больших дозах люди с нарушениями почек, особенно больные, проходящие диализ. Другие лекарственные препараты, которые могут вызывать вторичный остеопороз, включают фенитоин (дилантин) и барбитураты, которые применяют для предотвращения судорожных приступов; лекарственное средство для некоторых форм артрита, рака и иммунных нарушений метотрексат (ревматрекс, иммунекс, фолекс РЕ8); циклоспорин (сандиммун, неорал), лекарственное средство, применяемое для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и иммуносупрессии у пациентов после трансплантации органов; агонисты лютеинизирующего рилизинг-гормона (лупрон, золадекс), применяемый для лечения рака простаты и эндометриоза; гепарин (кальципарин, Ыдиаетт), лекарственный препарат, препятствующий свертыванию крови; и холестирамин (квестран) и колестипол (колестид), применяемые для лечения высокого уровня холестерина. Потеря костной массы при противораковой терапии является общепризнанной и называется потерей костной массы, вызванной противораковой терапией (СТГВЬ). Костные метастазы могут создавать костные полости, которые можно корригировать лечением антагонистами активина-Ас!Р11а.
В предпочтительном варианте осуществления антагонисты активина-Ас!Р11а, особенно растворимые Ас®Ла, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть использованы для раковых больных. Больные с некоторыми опухолями (например, простаты, молочной железы, с множественной миеломой или с любой опухолью, вызывающей гиперпаратиреоз) являются группой высокого риска по потере костной массы за счет опухолевой индукции потери костной массы, а также метастазов в костях и терапевтических средств. Таких больных можно лечить антагонистами активина-Ас!Р11а даже при отсутствии симптомов потери костной массы или костных метастазов. Больные могут также подвергаться контролю на симптомы потери костной массы или костных метастазов и могут получать лечение антагонистами активина-Ас!Р11а при выявлении признаков, свидетельствующих о повышенном риске. Обычно для оценки изменения плотности кости используют изображения ЭЕХА, тогда как индикаторы ремоделирования кости можно использовать для оценки вероятности костных метастазов. Можно контролировать
- 22 015105 сывороточные маркеры. Костеспецифичная щелочная фосфатаза (ВЗАР) является ферментом, присутствующим в остеобластах. У больных с костными метастазами и другими состояниями, которые приводят к повышенному ремоделированию кости, выявляют увеличенный уровень ВЗАР в крови. Пептиды остеокальцин и проколлаген также ассоциированы с остеогенезом и костными метастазами. Увеличенные уровни ВЗАР выявляют у больных с костными метастазами, вызванными раком простаты, и реже у больных с костными метастазами по причине рака молочной железы. Уровни костного морфогенетического белка 7 (ВМР-7) являются высокими при наличии костных метастазов, обусловленных раком простаты, в отличие от костных метастазов, вызванных раком мочевого пузыря, кожи, печени или рака легкого. Карбокситерминальный телопептид 1 типа (1СТР) является сшитым и обнаруживается в коллагене, который образуется в процессе резорбции кости. Поскольку кость постоянно подвергается разрушению и восстановлению, 1СТР будет выявляться во всем организме. При этом на участке костного метастаза его уровень будет значительно выше, чем в зоне нормальной кости. Высокие уровни 1СТР обнаруживают в костных метастазах при раке простаты, раке легкого и рака молочной железы. Другой сшитый коллаген, ^терминальный телопептид 1 типа (№Гх), наряду с 1СТР вырабатывается в процессе ремоделирования кости. Количество №Гх увеличивается в костных метастазах, обусловленных рядом различных типов рака, включая рак легкого, простаты и рак молочной железы. Также уровни №Гх повышаются при прогрессировании костных метастазов. Следовательно, этот маркер можно использовать как для выявления метастаза, так и для измерения распространенности заболевания. Другие маркеры резорбции включают пиридинолин и дезоксипиридинолин. Любое повышение уровней маркеров резорбции или маркеров костных метастазов указывает на потребность больного в терапии антагонистами активина-Ас®На.
Антагонисты активина-АсЖНа можно вводить совместно с другими фармацевтическими средствами. Можно осуществлять совместное введение путем введения единственной ссовместной рецептуры, путем одновременного введения или введением в разное время. Антагонисты активина-АсЖНа могут обладать особым преимуществом при введении с другими действующими на кость средствами. Пациент может получать пользу от совместного приема антагониста активина-АсЖНа и кальциевых добавок, витамина Ό, применения подходящих физических упражнений и/или в некоторых случаях от другого лечения. Примеры других лекарственных средств включают бифосфонаты (алендронат, ибандронат и ризедронат), кальцитонин, эстрогены, паратгормон и ралоксифен. Бифосфонаты (алендронат, ибандронат и ризедронат), кальцитонин, эстрогены и ралоксифен влияют на цикл ремоделирования кости и относятся к антирезорбтивным лекарственным средствам.
Ремоделирование кости состоит из двух отличающихся стадий: резорбции кости и образования кости. Антирезорбтивные лекарственные средства замедляют или останавливают резорбтивную часть цикла ремоделирования кости, но не замедляют остеогенетическую часть цикла. В результате новый остеогенез происходит с большей скоростью, чем резорбция кости, и с течением времени плотность кости может увеличиваться. Терипаратид, как форма паратиреоидного гормона, увеличивает скорость остеогенеза в цикле ремоделирования кости. Алендронат рекомендован как для профилактики (5 мг в день или 35 мг один раз в неделю), так и для лечения (10 мг в день или 70 мг один раз в неделю) постклимактерического остеопороза. Алендронат уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и уменьшает риск переломов позвоночника, запястья и бедра. Алендронат также рекомендован для лечения глюкокортикоид-индуцированного остеопороза у мужчин и женщин в результате продолжительного применения этих лекарственных средств (т. е. преднизона и кортизона) и для лечения остеопороза у мужчин. Алендронат плюс витамин Ό рекомендован для лечения постклимактерического остеопороза у женщин (70 мг один раз в неделю плюс витамин Ό) и для лечения с целью повышения костной массы у мужчин с остеопорозом. Ибандронат рекомендован для профилактики и лечения постклимактерического остеопороза. Ибандронат в виде пилюли (150 мг) для приема один раз в месяц должен приниматься в один и тот же день каждый месяц. Ибандронат уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и снижает риск переломов позвоночника. Ризедронат рекомендован для профилактики и лечения постклимактерического остеопороза. Ежедневный прием ризедроната (доза 5 мг) или еженедельный прием (доза 35 мг или доза 35 мг с кальцием) замедляет потерю костной массы, увеличивает плотность кости и уменьшает риск переломов позвоночника и других переломов. Ризедронат также рекомендован для применения у мужчин и женщин с целью предотвращения и/или лечения глюкокортикоид-индуцированного остеопороза, который возникает в результате продолжительного применения этих лекарственных средств (то есть преднизона или кортизона). Кальцитонин представляет собой природный гормон, вовлеченный в процесс регуляции кальция и метаболизма кости. У женщин через 5 лет после наступления менопаузы кальцитонин замедляет потерю костной массы, увеличивает плотность позвонков и может уменьшать боль, связанную с переломами костей. Кальцитонин уменьшает риск переломов позвоночника. Кальцитонин доступен в виде раствора для инъекций (50-100 ΐυ ежедневно) или назального спрея (200 ΐυ ежедневно). Терапия эстрогенами (ЕТ, ЭТ)/гормональная терапия (НТ, ГТ) рекомендованы для профилактики остеопороза. Показано, что ЭТ уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и позвоночника и бедра и снижает риск переломов бедра и позвоночника у женщин в постклимактерическом периоде. ЭТ обычно применяется в виде пилюли или пластыря, которые доставляют низкую дозу приблизительно 0,3 мг ежедневно или стандартную дозу приблизительно 0,625 мг ежедневно, и яв
- 23 015105 ляется эффективной, даже если ее начинают в возрасте старше 70 лет. При приеме только одного эстрогена он может увеличивать у женщин риск развития рака серозного покрова матки (рак эндометрия). Для устранения этого риска для женщин, имеющих интактную матку, специалисты здравоохранения назначают гормон прогестин в комбинации с эстрогеном (гормональная заместительная терапия или ГТ). Показано, что применение ЭТ/ГТ уменьшает симптомы менопаузы и имеет благоприятное действие на состояние костей. Побочные эффекты могут включать влагалищное кровотечение, болезненность молочных желез, нарушения настроения и желчно-каменную болезнь. Ралоксифен в дозе 60 мг в день рекомендован для профилактики и лечения постклимактерического остеопороза. Он является представителем класса препаратов под названием селективные модуляторы эстрогенных рецепторов (8ЕВМ), разработанных для обеспечения благоприятных эффектов эстрогенов без их потенциальных недостатков. Ралоксифен увеличивает костную массу и снижает риск переломов позвоночника. В настоящее время недостаточно данных для утверждения, что ралоксифен способен снижать риск переломов бедра и других переломов, кроме переломов позвоночника. Терипаратид, представляющий собой форму паратгормона, рекомендован для лечения остеопороза у женщин в постклимактерическом периоде и у мужчин, имеющих высокий риск переломов. Этот препарат стимулирует образование новой кости и значительно увеличивает минеральную плотность кости. У женщин в постклимактерическом периоде было отмечено уменьшение переломов позвоночника, бедра, лодыжек, ребер и запястья. У мужчин отмечено уменьшение переломов позвоночника, но недостаточно данных для оценки уменьшения переломов других локализаций. Терипаратид применяют самостоятельным введением в виде ежедневной инъекции в течение 24 месяцев.
7. Фармацевтические композиции.
В некоторых вариантах осуществления антагонисты активина-АсЖЛа (например, полипептиды Ас®На) настоящего изобретения составляют композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Например, полипептид Ас®На можно вводить индивидуально или в качестве компонента фармацевтической композиции (терапевтической композиции). Рассматриваемые соединения могут быть составлены в композицию для введения любым удобным способом для применения в лечении человека или ветеринарии.
В некоторых вариантах осуществления терапевтический способ настоящего изобретения включает системное введение композиции или локальное введение в виде имплантата или устройства. Вводимая терапевтическая композиция для использования в настоящем изобретении, безусловно, имеет апирогенную, физиологически приемлемую форму. В состав композиции необязательно также можно включать терапевтически полезные средства, отличные от антагонистов АсЖНа, как описано выше, и их можно вводить одновременно или последовательно с рассматриваемыми соединениями (например, полипептидами Ас®Па) в способах настоящего изобретения.
Обычно антагонисты Ас®На вводят парентерально.
Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать один или несколько полипептидов Ас®На в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями или стерильными порошками, которые можно восстанавливать в стерильные растворы или дисперсии для инъекций непосредственно перед применением, и они могут содержать антиоксиданты, буферные вещества, бактериостаты, растворы, которые делают композицию изотоничной с кровью предполагаемого реципиента, или суспендирующие вещества, или загустители. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях настоящего изобретения, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью веществ для покрытия, таких как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и с помощью поверхностно-активных веществ.
Дополнительно, композицию можно помещать в капсулы или инъецировать в форме для доставки к участку ткани-мишени (например, в кость). В некоторых вариантах осуществления композиции настоящего изобретения могут включать матрицу, способную доставлять одно или несколько терапевтических соединений (например, полипептидов АсЖНа) к участку ткани-мишени (например, в кость), обеспечивая структуру для растущей ткани и оптимально приспособленную для резорбции в организм. Например, матрица может обеспечивать медленное высвобождение полипептидов Ас®На. Такие матрицы могут быть образованы из материалов, используемых в настоящее время для других внедренных медицинских областей применения.
Выбор материала матрицы основан на биосовместимости, биодеградируемости, механических свойствах, косметическом внешнем виде и барьерных свойствах. Подходящая рецептура будет определяться конкретным применением рассматриваемых композиций. Потенциальные матрицы для композиций могут быть биодеградируемыми и с химической точки зрения представлять собой сульфат кальция, трикальцийфосфат, гидроксиапатит, полимолочную кислоту и полиангидриды. Другие потенциальные материалы являются биодеградируемыми и биологически четко определенными, такими как кость или кожный коллаген. Дополнительно матрицы состоят из чистых белков или внеклеточных матриксных
- 24 015105 компонентов. Другие потенциальные матрицы не являются биодеградируемыми и четко определенными химически, такие как спеченный гидроксиапатит, биокерамика, алюминаты или другие керамические материалы. Матрицы могут состоять из комбинаций любого из вышеупомянутых типов материалов, таких как полимолочная кислота и гидроксиапатит или коллаген и трикальцийфосфат. Биокерамику можно изменять в композиции, такой как, например, алюмофосфат кальция, и обрабатывать для изменения размера пор, размера частиц, формы частицы и способности к биодеградации.
В некоторых вариантах методы настоящего изобретения могут представлять собой пероральное введение, например, в виде капсул, саше, пилюль, таблеток, пастилок (с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и камеди или трагаканта), в виде порошков, гранул, или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле, или в виде эликсира или сиропа, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин или сахароза и камедь) и/или в виде жидкости для споласкивания полости рта и т.п., и каждая из лекарственных форм будет содержать заданное количество средства в качестве активного ингредиента. Средство также можно вводить в виде болюса, лекарственной кашки или пасты.
В твердых лекарственных формах для перорального приема (капсулы, таблетки, пилюли, драже, порошки, гранулы и т. п.) одно или несколько терапевтических соединений настоящего изобретения можно смешивать с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или любым из следующего:
(1) наполнители или экстендеры, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремневая кислота;
(2) связывающие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или камедь;
(3) смачивающие вещества, такие как глицерин;
(4) дезинтегрирующие вещества, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия;
(5) вещества, замедляющие растворение, такие как парафин;
(6) катализаторы абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония;
(7) смачивающие вещества, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина;
(8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина;
(9) лубриканты, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) красители.
В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать буферные вещества. Твердые композиции подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягких и прессованных желатиновых капсулах, используя такие наполнители, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Жидкие лекарственные формы для перорального приема включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активному ингредиенту, жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие вещества и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, масло семени хлопчатника, арахисовое, кукурузное, масло зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры сорбитана и жирных кислот и их смеси. Помимо инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать адъюванты, такие как смачивающие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители, отдушки и консерванты.
Суспензии, в дополнение к активным соединениям, могут содержать суспендирующие вещества, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант и их смеси.
Композиции настоящего изобретения могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгирующие и диспергирующие вещества. Предотвращение воздействия микроорганизмов может быть обеспечено включением в состав композиции различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т. п. Также может быть желательным включение в композиции изотонических веществ, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, можно достичь замедленной абсорбции лекарственной формы для инъекций путем включения в нее веществ, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
- 25 015105
Подразумевается, что схему введения будет определять лечащий врач с учетом различных факторов, которые модифицируют действие рассматриваемых соединений настоящего изобретения (например, полипептиды АсГКПа). Эти различные факторы включают, но не ограничиваются ими, количество костной массы, которое желательно образовать, степень потери плотности кости, локализацию костного повреждения, состояние поврежденной кости, возраст больного, пол и пищевой рацион, степень тяжести какого-либо заболевания, которое может обусловливать потерю костной массы, время введения и другие клинические факторы. Необязательно, доза может варьировать в зависимости от типа матрикса, используемого для реконституции, и типов соединений в композиции. Также на дозу может влиять добавление к конечной композиции других известных факторов роста. Можно осуществлять контроль динамики путем периодической оценки роста кости и/или репарации, например путем рентгеновского исследования (включая ЭЕХА), гистоморфометрических определений и мечения тетрациклином.
Эксперименты с мышами показали, что действие АсГКПа-Ес на кость поддается обнаружению, когда соединения дозируют в интервалах и количествах, достаточных для достижения уровней концентраций в сыворотке 0,2 мкг/кг или более, и для достижения значительных эффектов на плотность и прочность кости желательны уровни в сыворотке, составляющие 1, или 2 мкг/кг, или более. Хотя отсутствуют какие-либо указания на то, что более высокие дозы АсГКПа-Ес нежелательны в силу побочных эффектов, можно разработать такие схемы дозирования, чтобы уровни концентраций в сыворотке достигали диапазона от 0,2 до 15 мкг/кг и, необязательно, диапазона от 1 до 5 мкг/кг. Для людей можно достичь уровня в сыворотке 0,2 мкг/кг единственной дозой 0,1 мг/кг или более и уровня в сыворотке, составляющего 1 мкг/кг, можно достичь единственной дозой 0,3 мг/кг или более.
Наблюдаемый период полувыведения молекулы из сыворотки находится в диапазоне примерно от 20 до 30 дней, что значительно дольше, чем большинство слитых Ес-белков, и, таким образом, можно достичь постоянного эффективного уровня в сыворотке, например, введением дозы 0,2-0,4 мг/кг еженедельно или каждые две недели или можно использовать более высокие дозы с более продолжительными интервалами между введением дозы. Например, дозы 1-3 мг/кг можно использовать один раз в месяц или один раз в два месяца, и действие на кость может быть настолько длительным, что введение дозы будет необходимо только однократно каждые 3, 4, 5, 6, 9, 12 или более месяцев.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает генную терапию для продукции полипептидов АсГКПа ш νί\Ό. Такая терапия будет достигать своего терапевтического эффекта путем введения полинуклеотидных последовательностей АсГКПа в имеющие нарушения клетки или ткани, как указано выше. Можно осуществлять доставку полинуклеотидных последовательностей АсГКПа, используя рекомбинантный вектор экспрессии, такой как химерный вирус или коллоидная дисперсная система. Предпочтительным для терапевтической доставки полинуклеотидных последовательностей АсГКПа является использование направленных липосом.
Различные вирусные векторы, которые можно использовать для генной терапии согласно идее настоящего изобретения, включают аденовирус, вирус герпеса, вирус осповакцины или предпочтительно вирус РНК, такой как ретровирус.
Предпочтительно ретровирусный вектор является производным мышиного или птичьего ретровируса. Примеры ретровирусных векторов, в которые может быть вставлен единственный чужеродный ген, включают, но не ограничиваются ими, вирус лейкоза мышей Молони (МоМиЬУ), вирус саркомы мышей Харви (НаМи8У), вирус опухоли молочной железы мышей (МиМТУ) и вирус саркомы Роуса (К8У). Ряд дополнительных ретровирусных векторов может включать множественные гены. Все эти векторы могут переносить или включать ген для выбираемого маркера с тем, чтобы существовала возможность идентифицировать и продуцировать трансдуцированные клетки. Ретровирусные векторы можно делать специфично направленными, например, путем присоединения сахара, гликолипида или белка. Предпочтительного нацеливания достигают использованием антитела. Специалистам в данной области известно, что определенные полинуклеотидные последовательности могут быть вставлены в ретровирусный геном или присоединены к оболочке вируса, чтобы позволить специфично направленный транспорт ретровирусного вектора, содержащего полинуклеотид АсГКПа. В предпочтительном варианте осуществления вектор направлен на кость или хрящ.
Альтернативно, клетки культуры тканей могут быть непосредственно трансфицированы плазмидами, кодирующими ретровирусные структурные гены дад, ро1 и еиу, посредством общепринятой трансфекции фосфатом кальция. Затем эти клетки трансфицируют векторной плазмидой, содержащей рассматриваемые гены. Полученные клетки высвобождают ретровирусный вектор в культуральную среду.
Другая система направленного транспорта для полинуклеотидов АсГКПа представляет собой коллоидную дисперсионную систему. Коллоидные дисперсионные системы включают комплексы макромолекул, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на липидной основе, включающие эмульсии масло-вводе, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой настоящего изобретения является липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные везикулы, которые применимы в качестве носителей для доставки ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό. РНК, ДНК и интактные вирионы могут быть инкапсулированы в водной среде и могут быть доставлены в клетки в биологически активной форме (см., например, Ега1еу, еГ а1., Тгепбк ВюсНет. 8с1, 6:77, 1981). Способы эффективного пе
- 26 015105 реноса генов с использованием липосомного носителя известны в данной области, см., например, в публикации Мапшпо, с1 а1., В1о1ес11тс|1.1е8, 6:682, 1988. Композиция липосомы обычно представляет собой комбинацию фосфолипидов, обычно в комбинации со стероидами, особенно с холестерином. Также можно использовать другие фосфолипиды или другие липиды. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и наличия двухвалентных катионов.
Примеры липидов, пригодных для получения липосом, включают соединения фосфатидила, такие как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды, цереброзиды и ганглиозиды. Примеры фосфолипидов включают яичный фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Направленный транспорт липосом также возможен на основе, например, органной специфичности, клеточной специфичности и специфичности органеллы и является известным в данной области.
Примеры
После общего описания настоящего изобретения далее оно будет легко понято путем ссылки на следующие примеры, которые включены в него просто в целях иллюстрации некоторых вариантов осуществления и вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1. Слитые белки Ас®На-Рс.
Авторы настоящего изобретения сконструировали растворимый слитый белок Ас®Па, который имеет внеклеточный домен человеческого АсЖНа, слитый с человеческим или мышиным Рс-доменом с минимальным линкером между ними. Конструкции названы Ас®Ла-№с и Ас®На-тРс соответственно. Ас®Па-№с показана ниже как очищенная из клеточных линий СН0 (8ЕЦ ГО N0: 7):
1ЬОК8ЕТ0ЕСЬРГМАК?,ЪК1ЖТМ0ТаУЕРС¥СОКОКККНСРА™КМ18С51 ΕίνΚΟΟΟΨΕΡΡΙΝΟΥΡΚΤΡΟνΕΚΚϋδΡΕνΥΕΟΟΟΕΟΝΜΟΝΕΚΕδΥΕΡΕΜΕν ТОРТ5МРУТРКРРТСООТН.ТСРРСРАРЕЬЬСОР8УРЬРРРКРКРТШ)8Г<ТРЕУ ТСУУУРУЗНЕРРЕУКЕМУУУРаУЕУННАКТКРКЕЕОУЫЗТУВУУЯУЬТУЬ НОРУЬЫСКЕУКСКУаМКАЬРУРГЕК-ПЗКАКООРКЕРОУУТЬРРаКЕЕМТК ИОУ8ЕТСЬУКаЕУР8Р1АУЕ\УЕ8НаОРЕМТГУКТТРРУЬР8РС8ЕЕЬ¥8КЕТУ ΡΚ5Κ№ΟΟΟΝνΓ5ϋ5νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚ8Ε8Ε8ΡΟΚ
Белки АсЖПа-ЬРс и Ас®Па-тРс были экспрессированы в клеточных линиях СН0. Были рассмотрены три разные лидерные последовательности:
(1) меллитин пчелиного меда (НВМЬ): МΚР^VNVΛ^VРМVVΥI8ΥIΥА (81Т) ГО N0: 8) (ίί) тканевый активатор плазминогена (ТРА): МПАМКВСЬССУЕЬЬССАУРУЗР (8ЕЦ ГО N0: 9) (ΐϊϊ) нативная последовательность: МСААЛК^ЛРАVР^I8С88СА (8ЕЦ ГО N0: 10).
В выбранной форме использована лидерная ТРА, и она имеет следующую непроцессированную аминокислотную последовательность:
МРАМКВОЕССТЕЬЕСОАУтРОААКО1!8ЕТрЕСЕ1ТМЛШЕ1ШВта(ЗТ ОУЕРСУОРКВКВКНСРАТУ/КМЗСЗШГУКрССтеЬЕОГЫСУОКТРСУЕККО ЗРЕУУЕСССЕОтСМЕКЕЗУЕРЕМЕУТрРТйМРУТРКРРТСаОТНТСРРСРА РЕЕЕССР£УРЪГРРКРКРТЬШ8Е<ТРЕУТСУУУРУ8НЕРРБУКГ№У¥УРСУЕ УНЫАКТИРЙЕЕд¥Ы8Т¥КУУ8УЕТУЕН9РтеЬМаКЕ¥КСКУ8ЫКАЕРУР1Е К'П8КАКСрРКЕР(ЗУ¥ТЕРР8КЕЕМТККдУ8ЕТСЬУКСтЕ¥РЗР1АУЕУ/Е8НО 0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕϋ8ΡΟ8ΓΕΕΥ8ΚΕΊΎΡΚ8Κλνρ0ΟΝνΓ805νΜΗΕΛΕΤΤΝΤ1 ΥΤΟΚ8Ε8Ε8ΡΟΚ(8Ε<3 ГО N0:13)
Указанный полипептид кодируется следующей последовательностью нуклеиновой кислоты:
АТСОАТОСААТСААОАОАССССТСТОСТОТаТОСТОСТОСТОТОТООАО
САОТСТГСОТТТСбСССОбССССОСТАТАСГГООТАОАТСАОАААСТСАО
ОАСТаТСТТТТТТТАЛТОСТААТ'ГОСОАААААОАСАСААССААТСАААС ТОаТОТТОААСССТСТГАТООТОАСАААОАТАААСОССОССАТГОТГП'О СТАССТСОААОААТАТГГСТСОТТССАТТОААТАОТОАААСААООТТОТТ ООСТООАТОАТАТСААСТССТАТОАСАООАСТСАТТОТОТАСААААААА АОАСАОСССТОААОТАТАТТТСТСТГОСТОТОАОаОСААТАТОТСТААТО ААААОТТТТСТТАТТТТССООАОАТООААОТСАСАСАОСССАСТТСАААТ ССАОТТАСАССТААОССАСССАССССТООТСЮААСТСАСАСАТОСССАС СОТССССАаСАССТОААСТССТООООООАССОТСАОТСТТССТСТТСССС
- 27 015105
ССААААСССААССЛСАСССТСАТСАТСТСССООАССССТСАООТСАСАТ ОСОТбСТбаТбСАСОТСАСССАСОААСАСССТОАООТСААСТТСААСТС ОТАССтеОАСбССОТООАОаТОСАТААТаССААаАСАААСССОСббСА ССАССАОТАСААСАОСАСОТАССОТОТООТСАОСОТССТСАССОТССТС САССАСОАСТаОСТСААтаССААССАСТАСААСТаСААССТСТССААСА ААССССТСССАОТССССАТССАСААААССАТСТССАААбССАААОСОСА ОСССС6АаААССАСАСОтеТАСАСССТССССССАТССССООАООА(ЗАТО АССААОААССАСОТСАОССТСАССТОССТООТСАААООСТТСТАТСССА СССЛСАТСаССОТОСгАСТОООАбАОСААТСОССАОССОСАОЛАСЛЛСТ АСААСАССАСОССТСССОТССТСОАСТСССАСООСТССТТСТТССТСТАТ АОСААССТСАСССТООАСААОАССАССТаССАОСАООСОААСбТСТТСТ САТОСТССОТОАТОСАТОАОССТСТОСАСААССАСГАСАСССАСААОАО ССТСТСССГСТСТСС6ССТАААТОАОААТТС (8ЕЦ ГО N0:14)
Как Ас1КПа-№с, так и Ас1ВНа-тЕс были исключительно предрасположены к рекомбинантной экспрессии. Как показано на фиг. 1, белок очищали в виде единственного четкого пика белка. Секвенирование Ν-конца выявило единственную последовательность 1ЕСК8ЕТСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 11). Очистки можно было добиться последовательными стадиями колоночной хроматографии, включающими, например, три или более из следующих стадий, в любом порядке: хроматография с использованием белка А; хроматография с использованием С-сефарозы; хроматография с использованием фенилсефарозы; эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершать вирусной фильтрацией и буферным обменом. Белок АсЖПа-ЬЕс очищали до чистоты >98%, как определено эксклюзионной хроматографией, и до чистоты >95%, как определено методом 8Э8 РАСЕ.
АсЖИа-йЕс и Ас1ВПа-тЕс проявляли высокую аффинность к лигандам, в частности к активину А.
СЭЕ-11 или активин А (Ас!А) были иммобилизованы на чипе В1асоге СМ5 с использованием стандартной методики аминного связывания. Белки АсЖЛа-ЬЕс и Ас1ВПа-тЕс загружали в систему и проводили измерение связывания. АсЖЛа-ЬЕс связывается с активином с константой диссоциации (Кс) 5х10-12, и белок связывается с СЭЕ11 с Кс 9,96х-9, см. фиг. 2. Белок АсЖПа-тЕс вел себя подобным образом.
Для оценки действия белков Ас1ВЛа-ЬЕс на передачу сигналов СЭЕ-11 и активина А использовали анализ гена-репортера А-204.
Клеточная линия: человеческая рабдомиосаркома (полученная из мышцы).
Репортерный вектор: рСЬ3(САСА)12 (описан у Эепп1ег е! а1., 1998, ЕМВ0 17: 3091-3100), см. фиг. 3. Мотив САСА12 присутствует в реактивных генах ТСЕ-β (ген РА1-1), таким образом, этот вектор имеет общее применение для факторов передачи сигнала через 8таб2 и 3.
День 1: суспензия клеток А-204 в 48-луночном планшете.
День 2: клетки А-204, трансфицированные 10 мкг рСЬ3(САСА)12 или рСЬ3(САСА)12 (10 мкг) + рИЬСМУ (1 мкг) и Еидепе.
День 3: добавляли факторы (разведенные в питательной среде + 0,1% В8А (БСА)). Перед добавлением в клетки ингибиторы необходимо предварительно инкубировать с факторами в течение 1 ч. Через 6 ч клетки споласкивали РВ8 и осуществляли лизирование клеток.
После этого проводили исследование с люциферазой. Обычно в этом исследовании в отсутствие каких-либо ингибиторов активин А демонстрирует примерно 10-кратную стимуляцию экспрессии репортерного гена, и ЕЭ50 составляет примерно 2 нг/мл.
СЭЕ-11: 16-кратная стимуляция.
ЕЭ50: примерно 1,5 нг/мл.
СЭЕ-8 проявляет эффект, подобный СЭЕ-11.
Как показано на фиг. 4, Ас1К11а-ЬЕс и АсЖИа-тЕс ингибируют СЭЕ-8-опосредованную передачу сигналов в пикомолярных концентрациях. Как показано на фиг. 5, три разных препарата Ас1ВНа-ЬЕс ингибируют передачу сигналов СЭЕ-11 при 1С50 приблизительно 200 пМ.
В фармакокинетических исследованиях АсЖЛа-ЬЕс проявлял высокую устойчивость. Крысам давали дозы белка Ас1КПа-йЕс 1, 3 или 10 мг/кг и измеряли уровни в плазме на время 24, 48, 72, 144 и 168 ч. В отдельном исследовании крысы получали дозы 1, 10 или 30 мг/кг. У крыс наблюдали период полувыведения из сыворотки АсЖЛа-йЕс от 11 до 14 дней и циркулирующие уровни лекарственного средства были достаточно высокими через 2 недели (11, 110 или 304 мкг/мл для исходного введения 1, 10 или 30 мг/кг соответственно). У обезьян Супото1ди8 период полувыведения из плазмы был существенно больше 14 дней, и циркулирующие уровни лекарственного средства составляли 25, 304 или 1440 мкг/мл для исходного введения 1, 10 или 30 мг/кг соответственно. По предварительным результатам у людей предполагают, что период полувыведения из сыворотки составляет примерно от 20 до 30 дней.
- 28 015105
Пример 2. АсЖНа-тЕс ускоряет рост кости ш νίνο.
Нормальные самки мыши (ВАЬВ/с) получали дозы Ас£КЛа-тЕс на уровне 1, 3 или 10 мг/кг/дозы при введении доз 2 раза в неделю. Минеральную плотность кости и содержание минералов в кости определяли с помощью ВЕХА, см. фиг. б.
У самок мышей ВАЬВ/с в результате лечения изображения ВЕХА показывали значительное увеличение (>20%) минеральной плотности кости и содержания Ас£КЛа-тЕс, см. фиг. 7 и 8.
Таким образом, антагонизм Ас£КЛа вызывает увеличение плотности кости и содержания костной массы у нормальных самок мышей. Как следующая стадия, на мышиной модели остеопороза тестировали действие Ас®На-тЕс на кость.
Апбегебюп е1 а1. (2001) установили, что у овариэктомированных мышей наблюдается значительная потеря костной массы (примерно потеря 50% в трабекулярной кости через б недель после операции) и что потерю костной массы у этих мышей можно корригировать предлагаемыми терапевтическими средствами, такими как паратгормон.
Авторы настоящего изобретения использовали самок мышей С57ВЬб в возрасте 4-5 недель, которые были овариэктомированы (ОУХ) или ложнооперированы (8НАМ). Через 8 недель после операции начинали лечение с АсЖНа-тЕс (10 мг/кг, 2 раза в неделю) или с контролем (РВ8). Плотность кости измеряли СТ (КТ)-сканированием.
Как показано на фиг. 9, у овариэктомированных мышей без лечения через б недель выявляли значительную потерю плотности трабекулярной кости по сравнению с контрольными группами 8НАМ. Лечение АсЖНа-тЕс восстанавливало плотность кости до уровня плотности у ложнооперированных мышей. На б и 12 неделях лечения Ас®На-тЕс вызывал значительное увеличение плотности трабекулярной кости у мышей ОУХ, см. фиг. 10. Через б недель лечения плотность кости увеличивалась на 24% относительно контрольных групп РВ8. Через 12 недель это увеличение составляло 27%.
У ложнооперированных мышей Ас®На-тЕс также вызывал значительное увеличение плотности трабекулярной кости, см. фиг. 11. Через б и 12 недель лечение вызывало увеличение на 35% относительно контрольных групп.
В дополнительной серии экспериментов овариэктомированные (ОУХ) или ложнооперированные мыши, как описано выше, получали лечение Ас®На-тЕс (10 мг/кг, 2 раза в неделю) или контроль (РВ8) в течение 12 недель. Подобно результатам, описанным выше для Ас®На-тЕс, мыши ОУХ, получавшие Ас®На-тЕс, показывали увеличение плотности трабекулярной кости на 15% уже через 4 недели и на 25% через 12 недель лечения (фиг. 12). Ложнооперированные мыши, получавшие АсЖНа-тЕс подобным образом, показывали увеличение плотности трабекулярной кости на 22% уже через 4 недели и на 32% через 12 недель лечения (фиг. 13).
Через 12 недель лечения с Ас®На-тЕс исследование ВЕХА тела полностью и ех νίνο бедренной кости показало, что лечение вызывает увеличение плотности кости и у овариэктомированных, и у ложнооперированных мышей (фиг. 14А и В соответственно). Эти результаты также подтверждены исследованием ех νίνο рОСТ середины диафиза бедренной кости, в котором показано значительное увеличение и общей, и кортикальной плотности кости через 12 недель лечения АсЖНа-тЕс. У контрольных овариэктомированных мышей, леченных носителем, выявлены показатели плотности кости, которые были сопоставимы с показателями контрольных ложнооперированных мышей, получавших лечение носителем (фиг. 15). В дополнение к плотности кости, увеличивалось содержание костной массы после лечения Ас®На-тЕС. Ех νίνο рОСТ исследование средней части диафиза бедренной кости выявило значительное увеличение и общего, и кортикального содержания костной массы через 12 недель лечения Ас®На-тЕс, тогда как контрольные и овариэктомированные, и ложнооперированные мыши, леченные носителем, показывали сопоставимое содержание костной массы (фиг. 1б). Ех νίνο исследование рОСТ средней части диафиза бедренной кости также показало, что у мышей, леченных Ас®На-тЕс, не выявлено изменения периостальной окружности; вместе с тем, лечение АсЖНа-тЕс приводило к уменьшению эндостальной окружности, указывая на увеличение кортикальной толщины за счет роста внутренней поверхности бедренной кости (фиг. 17).
При механическом тестировании бедренных костей было определено, что АсЖНа-тЕс способен повысить внешние характеристики кости (максимальную нагрузку, прочность и усилие для перелома), которые обусловливают значительное повышение внутренних характеристик (предельную прочность) костей. Овариэктомированные мыши, леченные АсЖНа-тЕс, проявляли повышенную прочность кости на уровне, превышающем уровни у ложнооперированных мышей и контрольных групп, леченных носителем, указывая на полное исчезновение остеопорозного фенотипа (фиг. 18).
Эти данные показывают, что антагонист активина-АсЖНа способен увеличивать плотность кости у нормальных самок мышей и, кроме того, на мышиной модели остеопороза корригировать нарушения в плотности кости, содержание костной массы и, в конечном счете, нарушение прочности кости.
В дополнительной серии экспериментов были овариэктомированы или ложнооперированы мыши в возрасте 4 недель, которые начиная с 12 недель получали в течение дополнительного периода 12 недель или плацебо, или АсЖНа-тЕс (2 раза в неделю по 10 мг/кг) (также называемый КАР-11 на фиг. 19-24). Проводили оценку ряда параметров кости. Как показано на фиг. 19, Ас®На-тЕс увеличивал отношение
- 29 015105 объема трабекулярной позвоночной кости к общему объему (ВУ/ТУ) как у мышей ОУХ, так и у ложнооперированных мышей. АсЖНа-тЕс также улучшал трабекулярную архитектуру (фиг. 20), увеличивал кортикальную толщину (фиг. 21) и улучшал прочность кости (фиг. 22). Как показано на фиг. 23, АсЕКНа-тРс оказывал желаемое действие в диапазоне доз от 1 до 10 мг/кг.
У ложнооперированных мышей на 2-й неделе эксперимента проводили гистоморфометрию кости. Эти данные, представленные на фиг. 24, показывают, что АсЕКНа-тРс обладает двойным действием как ингибируя резорбцию кости, так и стимулируя рост кости. Таким образом, АсЖНа-тРс стимулирует рост кости (анаболический эффект) и ингибирует резорбцию кости (антикатаболический эффект). Пример 4. Альтернативные белки АсЖНа-Ес.
Альтернативная конструкция может иметь делецию С-концевого хвоста (последних 15 аминокислот внеклеточного домена АсЖПа. Последовательность для такой конструкции представлена ниже (участок Ес подчеркнут) (8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 12):
1ЬСгКЫЕТЦЕСЬЕЕЫАН%ЪК1>К'1ЙОТОУЕРС¥СВКХ>КККНСРАТУ/КХ15<351
Е^ООСЖлРРтСУРКТРСУЕККРЗРЕУУРСССЕСММСЫЕКГЗУЕРЕМТО
ООТНТСРРСРАРЕЬЕССгРЗУРЕГРРКРКРТЬШВКТРЕУТСУУУРУВНЕРРЕУ
КРМУ/УУРОУЕУНМАКТКРКЕЕОУН8ТУК.УУ8УЕТУЕНОР!УЕКОКЕУКСК νΒΝΚΑΕΡνΡίΕΚΤΙΚΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡΚΚΕΕΜΤΚΝΟνΚΕΤΓΕνΚΟΕΥΡΚ ΡΙΑνΕνΕ8Ν<3ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΡ8Ρ08ΕΡΕΥ8ΚΕΤνΡΚ5Κν/(Χ>0ΝνΕ3€8 νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚ8Ε8Ε8ΡΘΚ
Включение ссылок
Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в него полностью путем ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и отдельно обозначены, как включенные в него путем ссылки.
Поскольку рассмотрены конкретные варианты осуществления объекта изобретения, вышеупомянутое описание является иллюстративным и не ограничивающим. Многие варианты будут очевидными для специалиста в данной области после ознакомления с настоящим описанием и нижеприведенной формулой изобретения. Полный объем настоящего изобретения необходимо определять, учитывая формулу изобретения, наряду с полным объемом эквивалентов, и описание, наряду с указанными вариантами.

Claims (78)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенный активин-связывающий полипептид АсЕКНа, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 7.
  2. 2. Активин-связывающий полипептид АсЖНа по п.1, где полипептид имеет чистоту по меньшей мере 95%, в отношении белковых примесей, как определено эксклюзионной хроматографией.
  3. 3. Активин-связывающий полипептид АсЕКНа по п.1 или 2, где указанный полипептид проявляет селективность к активину по меньшей мере в 10 раз выше по константе диссоциации по сравнению с СЭЕ-11.
  4. 4. Фармацевтический препарат, содержащий активин-связывающий полипептид АсЕКНа по любому из пп.1-3 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
  5. 5. Фармацевтический препарат по п.4, где указанный препарат, по существу, является апирогенным.
  6. 6. Выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую активинсвязывающий полипептид АсЖНа по любому из пп.1-3.
  7. 7. Выделенный полинуклеотид по п.6, где выделенный полинуклеотид содержит аминокислотную последовательность 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 14.
  8. 8. Рекомбинантный полинуклеотид, содержащий промоторную последовательность, функционально связанную с полинуклеотидом по п.6 или 7.
  9. 9. Клетка, трансформированная рекомбинантным полинуклеотидом по любому из пп.6-8.
  10. 10. Клетка по п.9, где указанная клетка является клеткой млекопитающего.
  11. 11. Клетка по п.10, где указанная клетка является клеткой СНО или клеткой человека.
  12. 12. Способ получения активин-связывающего полипептида АсЕКЛа, включающий:
    a) культивирование клетки в условиях, подходящих для экспрессии растворимого полипептида АсЕКЛа, где указанная клетка трансформирована рекомбинантным полинуклеотидом по любому из пп.6-8;
    b) выделение активин-связывающего полипептида АсЕКЛа, экспрессируемого таким образом.
    - 30 015105
  13. 13. Способ стимулирования роста кости, увеличения плотности кости или увеличения прочности кости, включающий введение субъекту эффективного количества полипептида, выбранного из группы, состоящей из:
    a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0:2;
    b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0:3; и
    c) полипептида, содержащего по меньшей мере 50 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2.
  14. 14. Способ по п.13, в котором полипептид имеет один или несколько из следующих признаков:
    ί) связывается с лигандом Ас®Па с Кс по меньшей мере 10-7 М и ίί) ингибирует передачу сигнала АсЖИа в клетке.
  15. 15. Способ по п.13 или 14, в котором указанный полипептид является белком слияния, включающим, в дополнение к домену полипептида АсЖИа, один или несколько полипептидных участков, которые увеличивают одно или несколько из следующего: устойчивость ίη νίνο, период полувыведения ίη νίνο, поглощение/введение, локализацию или распределение в тканях, образование белковых комплексов и/или очистку.
  16. 16. Способ по п.15, в котором указанный белок слияния включает полипептидный участок, выбранный из группы, состоящей из домена Рс иммуноглобулина и сывороточного альбумина.
  17. 17. Способ по любому из пп.13-16, в котором указанный полипептид включает один или несколько остатков модифицированной аминокислоты, выбранных из гликозилированной аминокислоты, пегилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной группой, и аминокислоты, конъюгированной с агентом органического происхождения.
  18. 18. Способ лечения нарушения, связанного с костью, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества активина или антагониста АсЖИа.
  19. 19. Способ по п.18, в котором активин или антагонист Ас®Па представляет собой полипептид активина или антагониста АсЖИа.
  20. 20. Способ по п.19, в котором полипептид активина или антагониста АсЖИа выбран из группы, состоящей из:
    a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2;
    b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0:3; и
    c) полипептида, содержащего по меньшей мере 50 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2.
  21. 21. Способ по п.19 или 20, в котором полипептид активина или антагониста АсЖИа имеет один или несколько из следующих признаков:
    ί) связывается с лигандом Ас®Па с Кс по меньшей мере 10-7 М;
    ίί) ингибирует передачу сигнала АсЖИа в клетке.
  22. 22. Способ по любому из пп.19-21, в котором указанный полипептид активина или антагониста Ас®Иа является белком слияния, включающим, в дополнение к домену полипептида Ас®Иа, один или несколько полипептидных участков, которые увеличивают одно или несколько из следующего: устойчивость ίη νίνο, период полувыведения ίη νίνο, поглощение/введение, локализацию или распределение в тканях, образование белковых комплексов и/или очистку.
  23. 23. Способ по п.22, в котором указанный белок слияния включает полипептидный участок, выбранный из группы, состоящей из домена Рс иммуноглобулина и сывороточного альбумина.
  24. 24. Способ по любому из пп.19-23, в котором указанный полипептид активина или антагониста Ас®Иа включает один или несколько остатков модифицированной аминокислоты, выбранных из гликозилированной аминокислоты, пегилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной группой, и аминокислоты, конъюгированной с агентом органического происхождения.
  25. 25. Способ по любому из пп.18-24, в котором нарушение, связанное с костью, выбрано из группы, состоящей из первичного остеопороза и вторичного остеопороза.
  26. 26. Способ по любому из пп.18-24, в котором связанное с костью нарушение выбрано из группы, состоящей из постклимактерического остеопороза, потери костной массы гипогонадной этиологии, потери костной массы, индуцированной опухолью, потери костной массы, вызванной противораковой терапией, метастазов в костях, множественной миеломы и болезни Педжета.
    - 31 015105
  27. 27. Способ по любому из пп.18-26. дополнительно включающий введение второго действующего на кость средства.
  28. 28. Способ по п.27. в котором действующее на кость средство выбрано из группы. состоящей из бифосфоната. эстрогена. селективного модулятора эстрогенных рецепторов. паратиреоидного гормона. кальцитонина. кальциевой добавки и добавки витамина Ό.
  29. 29. Фармацевтический препарат. содержащий:
    (a) активин или антагонист Ас!КИа и (b) второе действующее на кость средство.
  30. 30. Способ идентификации вещества. которое ускоряет рост кости или увеличивает плотность кости. включающий:
    a) идентификацию тестового вещества. которое связывается с лиганд-связывающим доменом полипептида АсШПа. конкурируя с полипептидом активина или антагониста Ас!КПа; и
    b) оценку действия вещества на рост ткани.
  31. 31. Применение полипептида активина или антагониста Ас!КИа для получения лекарственного средства для лечения связанного с костью нарушения.
  32. 32. Способ профилактики связанного с костью нарушения. включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества активина или антагониста Ас!КИа.
  33. 33. Способ по п.32. в котором у субъекта выявлен рак. связанный с костными метастазами.
  34. 34. Способ по пп.32. 33. в котором субъект имеет положительные признаки потери плотности кости. резорбции кости или костных метастазов.
  35. 35. Способ по любому из пп.32-34. в котором субъект получает схему лечения рака. который связан с потерей костной массы.
  36. 36. Способ по любому из пп.32-34. в котором субъект болен раком. связанным с потерей костной массы.
  37. 37. Активин-связывающий полипептид АсЖЛа по любому из пп.1-3. фармацевтический препарат по любому из пп.4. 5 или 29 или способ по любому из пп.13-28. в котором полипептид является гликозилированным.
  38. 38. Способ стимулирования роста кости и ингибирования резорбции кости у больного. включающий введение больному эффективного количества белка слияния АсЖЛа-Ес. в котором белок слияния Ас!КИа-Ес содержит аминокислотную последовательность. которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 3.
  39. 39. Способ по п.38. в котором белок слияния Ас!КИа-Ес содержит аминокислотную последовательность. которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3.
  40. 40. Способ по п.38 или 39. в котором белок слияния АсЖПа-Ес содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3.
  41. 41. Способ по любому из пп.38-40. в котором белок слияния АсЩПа-Ес содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2.
  42. 42. Способ по любому из пп.38-41. где указанный способ приводит к увеличению массы скелетных мышц больного менее чем на 10%.
  43. 43. Способ по любому из пп.38-41. в котором вводят белок слияния Ас!КИа-Ес. чтобы достигнуть концентрации в сыворотке больного по меньшей мере 0.2 мкг/кг.
  44. 44. Способ по любому из пп.38-43. в котором белок слияния АсЖПа-Ес имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7.
  45. 45. Способ по любому из пп.38-44. в котором период полувыведения из сыворотки белка слияния Ас®Иа-Ес составляет от 15 до 30 дней.
  46. 46. Способ по любому из пп.38-45. в котором белок слияния АсЖПа-Ес вводят больному не чаще чем один раз в неделю.
  47. 47. Способ по любому из пп.38-46. в котором белок слияния АсЖПа-Ес вводят больному не чаще чем один раз в месяц.
  48. 48. Применение полипептида. выбранного из группы. состоящей из:
    (a) полипептида. содержащего аминокислотную последовательность. которая по меньшей мере на 90% идентична. по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    (b) полипептида. содержащего аминокислотную последовательность. которая по меньшей мере на 90% идентична. по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3; и (c) полипептида. содержащего по меньшей мере 50 последовательных аминокислот. выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 2. для получения лекарственного средства для стимулирования роста кости. увеличения плотности кости или увеличения прочности кости.
  49. 49. Применение полипептида активина или антагониста Ас!КИа для получения лекарственного средства для профилактики связанного с костью нарушения.
    - 32 015105
  50. 50. Применение белка слияния Ас®Иа-Ес, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0:3, для получения лекарственного средства для стимулирования роста кости и ингибирования резорбции кости.
  51. 51. Полипептид, выбранный из группы, состоящей из:
    (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2;
    (b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3; и (c) полипептида, содержащего по меньшей мере 50 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2, для применения с целью стимулирования роста кости, увеличения плотности кости или увеличения прочности кости.
  52. 52. Применение полипептида активина или антагониста Ас!КЛа для лечения связанного с костью нарушения.
  53. 53. Применение полипептида активина или антагониста Ас!КЛа для профилактики связанного с костью нарушения.
  54. 54. Применение белка слияния АсЖНа-Ес, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, для стимулирования роста кости и ингибирования резорбции кости.
  55. 55. Выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:7.
  56. 56. Растворимый полипептид по п.55.
  57. 57. Полипептид, который связывается с активином по п.56.
  58. 58. Полипептид по п.57, который связывается с активином с Кс менее 1 мкМ.
  59. 59. Полипептид по п.58, который связывается с активином с К менее чем примерно 100 нМ.
  60. 60. Полипептид по п.59, который связывается с активином с К менее чем примерно 10 нМ.
  61. 61. Полипептид по п.60, который связывается с активином с К менее чем примерно 1 нМ.
  62. 62. Полипептид по п.55, чистота которого составляет по меньшей мере 95%.
  63. 63. Полипептид по п.62, чистота которого составляет по меньшей мере 98%.
  64. 64. Полипептид по п.55, который является ацетилированным.
  65. 65. Полипептид по п.55, который является карбоксилированным.
  66. 66. Полипептид по п.55, который является гликозилированным.
  67. 67. Полипептид по п.55, который является фосфорилированным.
  68. 68. Полипептид по п.55, который является липидизированным.
  69. 69. Полипептид по п.55, который является ацилированным.
  70. 70. Полипептид по п.55, который содержит полиэтиленгликоль.
  71. 71. Полипептид по п.55, который содержит липид.
  72. 72. Полипептид по п.55, который содержит фосфат.
  73. 73. Полипептид по п.55, который содержит полисахарид.
  74. 74. Полипептид по п.55, который содержит моносахарид.
  75. 75. Полипептид по п.55, который пегилирован.
  76. 76. Полипептид по п.55, который фарнезилирован.
  77. 77. Полипептид по п.55, который биотинилирован.
  78. 78. Полипептид по п.55, который конъюгирован с веществом органического происхождения.
    ___к 250^ /1 + ' 150 Λ I А. ί 25 ю ·* .
EA200801406A 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина - actriia и их применение для стимулирования роста кости EA015105B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73946205P 2005-11-23 2005-11-23
US78332206P 2006-03-17 2006-03-17
US84485506P 2006-09-15 2006-09-15
PCT/US2006/045322 WO2007062188A2 (en) 2005-11-23 2006-11-22 Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801406A1 EA200801406A1 (ru) 2009-12-30
EA015105B1 true EA015105B1 (ru) 2011-06-30

Family

ID=38067939

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300330A EA026874B1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина-actriia и их применение для стимулирования роста кости
EA201692543A EA201692543A1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина-actriia и их применение для стимулирования роста кости
EA200801406A EA015105B1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина - actriia и их применение для стимулирования роста кости
EA201100158A EA018450B1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина-actriia и их применение для стимулирования роста кости

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300330A EA026874B1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина-actriia и их применение для стимулирования роста кости
EA201692543A EA201692543A1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина-actriia и их применение для стимулирования роста кости

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100158A EA018450B1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Антагонисты активина-actriia и их применение для стимулирования роста кости

Country Status (25)

Country Link
US (8) US7612041B2 (ru)
EP (5) EP2329837B1 (ru)
JP (9) JP5261187B2 (ru)
KR (8) KR20200041386A (ru)
CN (4) CN105001320A (ru)
AU (1) AU2006318449B2 (ru)
BR (1) BRPI0618947B1 (ru)
CA (2) CA3045808C (ru)
CR (1) CR10008A (ru)
DK (1) DK1973559T3 (ru)
EA (4) EA026874B1 (ru)
EC (1) ECSP088463A (ru)
ES (3) ES2839549T3 (ru)
HK (3) HK1158548A1 (ru)
HR (1) HRP20080377B1 (ru)
IL (5) IL191596A (ru)
IN (1) IN2015DN02553A (ru)
ME (1) ME00380B (ru)
MX (1) MX2008006626A (ru)
NZ (1) NZ568369A (ru)
PL (1) PL1973559T3 (ru)
PT (1) PT1973559E (ru)
RS (1) RS58231B1 (ru)
SG (1) SG10201509620SA (ru)
WO (1) WO2007062188A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2678117C2 (ru) * 2012-11-02 2019-01-23 Селджин Корпорейшн Антагонисты активина-actrii и их применение для лечения нарушений костной ткани и других нарушений

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
JP5261187B2 (ja) 2005-11-23 2013-08-14 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび骨成長を促進するための使用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
EP3156415A1 (en) 2006-11-22 2017-04-19 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
AU2016250354B2 (en) * 2006-12-18 2019-01-17 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
AU2013221910B2 (en) * 2006-12-18 2016-11-17 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) * 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
EA035911B1 (ru) * 2006-12-18 2020-08-31 Акселерон Фарма Инк. Применение полипептида, который ингибирует опосредованный активином сигнальный путь, в качестве лекарственного средства
TWI480048B (zh) * 2007-02-01 2015-04-11 Acceleron Pharma Inc 活化素-ＡｃｔＲＩＩａ拮抗劑及其治療或預防乳癌之用途
TWI548647B (zh) 2007-02-02 2016-09-11 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
AU2013204959B2 (en) * 2007-02-09 2016-05-19 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients
AU2016202691B2 (en) * 2007-02-09 2018-03-15 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients
CN104548056B (zh) * 2007-02-09 2022-09-09 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和促进癌症患者骨骼生长的用途
WO2008113185A1 (en) * 2007-03-19 2008-09-25 National Research Counsil Of Canada Antagonists of ligands and uses thereof
CN107412734A (zh) * 2007-09-18 2017-12-01 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
KR20100128291A (ko) 2008-02-14 2010-12-07 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｅｇｆｒ에 결합하는 조작된 단백질을 기초로 하는 표적화된 치료제
WO2009137075A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
WO2009137880A1 (en) 2008-05-14 2009-11-19 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Use of angiogenin or angiogenin agonists for treating diseases and disorders
JP2011520961A (ja) 2008-05-22 2011-07-21 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 多価フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質
NZ590327A (en) * 2008-06-26 2013-12-20 Acceleron Pharma Inc Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients
NZ602471A (en) * 2008-06-26 2014-10-31 Acceleron Pharma Inc Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
PT3494986T (pt) 2008-08-14 2020-07-14 Acceleron Pharma Inc Armadilhas para gdf
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
CA2749544A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
ES2575695T3 (es) 2009-03-30 2016-06-30 Acceleron Pharma Inc. Antagonistas de BMP-ALK3 y sus usos para estimular el crecimiento óseo
EP2440576A4 (en) 2009-06-08 2013-11-20 Acceleron Pharma Inc PROCESS FOR INCREASING THE NUMBER OF THERMOUS ADIPOCYTES
KR20120028358A (ko) 2009-06-12 2012-03-22 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
KR20120062874A (ko) * 2009-09-09 2012-06-14 악셀레론 파마 인코포레이티드 ＡｃｔＲＩＩｂ 길항제들와 이의 투약 및 용도
AU2010315245B2 (en) * 2009-11-03 2016-11-03 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
EP2501400B1 (en) * 2009-11-17 2017-11-01 Acceleron Pharma, Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
EP2576615B1 (en) 2010-05-26 2016-03-30 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins having improved stability
WO2012027065A2 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
AU2011326586A1 (en) 2010-11-08 2013-05-30 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIA binding agents and uses thereof
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
RU2727452C1 (ru) * 2011-06-28 2020-07-21 Инхибркс, Инк. Слитые серпиновые полипептиды и способы их применения
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
AU2013204740C1 (en) 2012-05-10 2015-10-01 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Methods of treating cancer using angiogenin or an angiogenin agonist
US20140120149A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-01 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Calcium sulphate based composite
US10442851B2 (en) 2014-03-20 2019-10-15 Bristol-Myers Squibb Company Serum albumin-binding fibronectin type III domains
US20150361163A1 (en) 2014-04-18 2015-12-17 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
EP3154566B1 (en) 2014-06-13 2022-08-03 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia
MA41052A (fr) * 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
PT3227675T (pt) 2014-12-03 2023-05-30 Celgene Corp Antagonistas da ativina-actrii e utilizações para tratamento da síndrome mielodisplásica
WO2016164089A2 (en) 2015-04-06 2016-10-13 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta superfamily type i and type ii receptor heteromultimers and uses thereof
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
HUE054180T2 (hu) 2015-04-06 2021-08-30 Acceleron Pharma Inc Egykarú I. típusú és II. típusú receptorral rendelkezõ fúziós fehérjék, illetve ezek alkalmazásai
CN108350057A (zh) 2015-05-20 2018-07-31 细胞基因公司 使用II型活化素受体配体阱的用于β-地中海贫血的体外细胞培养方法
JP6893504B2 (ja) 2015-09-23 2021-06-23 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 速い解離速度を有する血清アルブミン結合フィブロネクチンタイプｉｉｉドメイン
EP3380121B1 (en) 2015-11-23 2023-12-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for use in treating eye disorders
US10722558B2 (en) 2016-07-15 2020-07-28 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
BR112019001615A2 (pt) 2016-07-27 2019-04-30 Acceleron Pharma Inc. métodos e composições para tratar mielofibrose
MA46472A (fr) 2016-10-05 2019-08-14 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
CN116650622A (zh) 2016-10-05 2023-08-29 艾科赛扬制药股份有限公司 用于治疗肾脏疾病的组合物和方法
CN110430890A (zh) 2016-11-10 2019-11-08 科乐斯疗法公司 激活素受体iia型变体及其使用方法
KR102628323B1 (ko) 2017-03-24 2024-01-22 노바르티스 아게 심장질환 예방 및 치료 방법
US11484573B2 (en) 2017-11-09 2022-11-01 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIa variants and methods of use thereof
EP3737406A4 (en) 2018-01-12 2021-11-03 Keros Therapeutics, Inc. ACTIVIN RECEPTOR TYPE IIB VARIANTS AND THEIR METHODS OF USE
CN109320597B (zh) * 2018-10-26 2021-10-26 中国农业科学院特产研究所 狐亚科激活素a蛋白及其制备与应用
CN114594170A (zh) * 2020-12-03 2022-06-07 复旦大学 一种磁固相萃取结合快速原位衍生化的体内药物分析方法
WO2022261437A2 (en) * 2021-06-11 2022-12-15 Acceleron Pharma Inc. Actrii proteins and uses thereof
US11945856B2 (en) 2022-01-28 2024-04-02 35Pharma Inc. Activin receptor type IIB variants and uses thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6093547A (en) * 1993-06-07 2000-07-25 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor and screening for morphogen analogs
WO2004039948A2 (en) * 2002-10-25 2004-05-13 Wyeth Actriib fusion polypeptides and uses therefor
WO2005028517A2 (en) * 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
WO2005094871A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-13 Acceleron Pharma Inc. Bmp-3 propeptides and related methods
WO2005097825A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions

Family Cites Families (211)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0637520B2 (ja) 1985-07-03 1994-05-18 味の素株式会社 ポリペプチド
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US4973577A (en) * 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
AU8761391A (en) 1990-09-13 1992-04-15 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
US5885794A (en) * 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
US20050186593A1 (en) 1991-05-10 2005-08-25 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
JPH06500574A (ja) 1991-05-10 1994-01-20 ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ アクチビン／ＴＧＦ―βスーパーファミリーのレセプターのクローニングおよび組換えによる産生
AU652472B2 (en) 1991-06-25 1994-08-25 Genetics Institute, Llc BMP-9 compositions
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
WO1993020207A1 (en) * 1992-04-02 1993-10-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Use of restriction endonucleases against viruses, including hiv
US6692925B1 (en) 1992-11-17 2004-02-17 Ludwig Institute For Cancer Research Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use
CA2153652A1 (en) 1993-01-12 1994-07-21 Se-Jin Lee Growth differentiation factor-3
WO1994026893A1 (en) 1993-05-12 1994-11-24 Genetics Institute, Inc. Bmp-10 compositions
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
JPH09503673A (ja) 1993-10-14 1997-04-15 プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ ニューロン細胞の誘導および維持法
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5658876A (en) 1994-04-28 1997-08-19 The General Hospital Corporation Activin antagonists as novel contraceptives
US5863738A (en) * 1994-04-29 1999-01-26 Creative Biomolecules, Inc. Methods of antagonizing OP-1 binding to a cell surface receptor utilizing ALK polypeptides
IL114397A0 (en) * 1994-07-01 1995-10-31 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Growth/differentiation factor of the TGF-beta-family
US5760010A (en) 1995-01-01 1998-06-02 Klein; Ira Method of treating liver disorders with a macrolide antibiotic
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
NZ502795A (en) 1995-04-11 2001-09-28 Gen Hospital Corp Method of identifying molecular interactions employing counterselection and at least two hybrid molecules or two hybrid systems
US6132988A (en) * 1995-10-27 2000-10-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA encoding a neuronal cell-specific receptor protein
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US20050244867A1 (en) 1996-03-26 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US6004780A (en) 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
JP2001503266A (ja) 1996-10-25 2001-03-13 ジー．ディー．サール アンド カンパニー 環状に並べ替えたエリスロポイエチン受容体アゴニスト
US6605699B1 (en) * 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
US6034062A (en) 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US6231880B1 (en) 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
WO1999006563A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Emory University Novel bone mineralization proteins, dna, vectors, expression systems
WO1999006559A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
AU8921698A (en) 1997-08-29 1999-03-16 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
US6953662B2 (en) * 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
NZ503489A (en) 1997-10-03 2002-11-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Natural humanized antibody, method of production and pharmaceutical composition
US6696411B1 (en) 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
CA2330939A1 (en) 1998-06-16 1999-12-23 Biogen, Inc. Variant type ii tgf-beta receptor fusion proteins and methods
AU765584B2 (en) * 1998-09-17 2003-09-25 Eli Lilly And Company Protein formulations
AU5502799A (en) 1998-09-22 2000-04-10 Long Yu New human growth differentiation factor encoding sequence and polypeptide encoded by such dna sequence and producing method thereof
US6472179B2 (en) * 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
DE69942782D1 (de) * 1998-11-27 2010-10-28 Ucb Sa Zusammensetzungen und Verfahren zur Erhöhung der Knochenmineralisierung
JP2003517580A (ja) 1999-01-21 2003-05-27 メタモーフイクス・インコーポレーテツド 増殖分化因子インヒビター及びそれらの用途
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU777783B2 (en) 1999-04-19 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor
US6468543B1 (en) 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
CZ20021836A3 (cs) 1999-11-12 2002-08-14 Maxygen Holdings Ltd Konjugáty interferonu gama
IL150198A0 (en) 1999-12-15 2002-12-01 Res Dev Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP4487376B2 (ja) 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
DK1311285T4 (en) 2000-05-15 2017-07-24 Hoffmann La Roche Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
AU2001269709A1 (en) 2000-07-19 2002-02-05 Eli Lilly And Company Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof
US6632180B1 (en) 2000-09-07 2003-10-14 John H. Laragh Method for evaluating and treating hypertension
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
WO2002032925A2 (en) 2000-10-16 2002-04-25 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
BR0115475A (pt) 2000-11-20 2004-02-10 Univ Illinois Proteìnas de estruturação de membranas
US20030082233A1 (en) 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
EP1370287A2 (en) 2000-12-01 2003-12-17 Wyeth Method and composition for modulating bone growth
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
TWI329129B (en) 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US20040132675A1 (en) 2002-02-08 2004-07-08 Calvin Kuo Method for treating cancer and increasing hematocrit levels
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
US7294472B2 (en) * 2001-03-14 2007-11-13 Caden Biosciences Method for identifying modulators of G protein coupled receptor signaling
EP1369130A1 (en) 2001-03-16 2003-12-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing sustained release preparation
US20030082630A1 (en) 2001-04-26 2003-05-01 Maxygen, Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
EP1436003B3 (en) 2001-05-24 2012-03-14 ZymoGenetics, Inc. Taci-immunoglobulin fusion proteins
AU2001286171B2 (en) 2001-05-25 2008-01-10 Serono Genetics Institute S.A. Human CDNAs and proteins and uses thereof
AUPR638101A0 (en) 2001-07-13 2001-08-09 Bioa Pty Limited Composition and method for treatment of disease
US6855344B2 (en) 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
AU2002318743B2 (en) 2001-07-17 2008-02-21 Teijin Limited Method of selecting substance characterized by assaying PPARD activating effect and drug
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
WO2003053997A2 (en) 2001-12-06 2003-07-03 Fibrogen, Inc. Methods of increasing endogenous erythropoietin (epo)
US20030144203A1 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
US20060234918A1 (en) 2001-12-19 2006-10-19 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for treating and preventing cancers that express the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of hormones and receptors
US6998118B2 (en) 2001-12-21 2006-02-14 The Salk Institute For Biological Studies Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection
AU2003216250A1 (en) 2002-02-11 2003-09-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
IL163525A0 (en) 2002-02-21 2005-12-18 Wyeth Corp A follistatin domain containing protein
US20030219846A1 (en) 2002-02-28 2003-11-27 Pfizer Inc. Assay for activity of the ActRIIB kinase
WO2003087162A2 (en) * 2002-04-18 2003-10-23 Mtm Laboratories Ag Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
KR20050083635A (ko) 2002-08-16 2005-08-26 와이어쓰 Ｂｍｐ-2 에스트로겐 반응 요소 및 이의 사용 방법
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
AU2002953327A0 (en) 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
BRPI0407276A (pt) 2003-02-07 2006-01-31 Prometic Biosciences Inc ácidos graxos, glicerìdeos e análogos com comprimento de cadeia médio, como estimulantes de eritropoiese
WO2004086953A2 (en) 2003-03-26 2004-10-14 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method for diagnosis and treatment of bone turnover
BRPI0410927A (pt) 2003-06-02 2006-06-27 Wyeth Corp métodos terapêuticos e profiláticos para distúrbios neuromusculares
EA015166B1 (ru) 2003-06-16 2011-06-30 Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк. Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител
WO2005009460A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Medexis, S.A. Pharmaceutical composition comprising activin a, alk-4 or derivatives thereof for the treatment of ophthalmic disorders or cancer
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
CA2553883C (en) * 2004-01-22 2013-04-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US20050197292A1 (en) * 2004-01-30 2005-09-08 Glennda Smithson Compositions and methods for treating T-cell mediated pathological conditions
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
CA2572330A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Acceleron Pharma Inc. Gdf3 propeptides and related methods
WO2006015368A2 (en) 2004-08-05 2006-02-09 The Regents Of The University Of California Molecules with effects on cellular development and function
BRPI0514253A (pt) 2004-08-12 2008-06-03 Wyeth Corp terapia de combinação para diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares usando composições contendo inibidores de gdf-8
US8435948B2 (en) 2004-09-29 2013-05-07 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Methods for inhibiting osteoclastic bone resorption and bone loss comprising administration of an anti-FSH or anti-FSHR antibody
US20060234299A1 (en) 2004-11-16 2006-10-19 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
NL1027887C2 (nl) 2004-12-24 2006-06-27 Bosch Gmbh Robert Transmissie met gebombeerde poelieschijven en een drijfriem.
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
JP5063366B2 (ja) 2005-02-16 2012-10-31 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ヘプシジンによる鉄代謝を制御するためのＴＧＦ−βスーパーファミリーの化合物の調節因子の使用
AR053067A1 (es) 2005-04-25 2007-04-18 Pfizer Anticuerpos contra miostatina
JPWO2006115274A1 (ja) 2005-04-26 2008-12-18 味の素株式会社 骨髄赤血球前駆細胞分化促進剤
JP2007099764A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 Ajinomoto Co Inc 血糖低下剤
EP1931697B1 (en) 2005-09-28 2010-09-15 ZymoGenetics, Inc. Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
JP5261187B2 (ja) 2005-11-23 2013-08-14 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび骨成長を促進するための使用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
WO2007067616A2 (en) 2005-12-06 2007-06-14 Amgen Inc Uses of myostatin antagonists
EP1966183A4 (en) 2005-12-20 2010-12-29 Merck Frosst Canada Ltd HETEROAROMATIC COMPOUNDS AS INHIBITORS OF STEAROYL-COENZYME A-DELTA-9-DESATURASE
EP1962835A2 (en) 2005-12-21 2008-09-03 Schering Corporation Treatment of nonalcoholic fatty liver disease using cholesterol lowering agents and/or h3 receptor antagonist/inverse agonist
WO2007076127A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Biogen Idec Ma Inc Condensed imidazoles or pyrazoles and their use as transforming growth factor modulators
US7361512B2 (en) 2006-01-20 2008-04-22 Beckman Coulter, Inc. Low hemoglobin concentration cell percentage and method of use in detection of iron deficiency
EP1976377A4 (en) 2006-01-25 2010-06-23 Wellstat Therapeutics Corp COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF METABOLIC DISORDERS
JP2009528375A (ja) 2006-02-28 2009-08-06 ウェルスタット セラピューティクス コーポレイション 代謝障害を処置するための化合物
CA2650131A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Amgen Inc. Agonist erythropoietin receptor antibodies
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
JP2009536659A (ja) * 2006-05-09 2009-10-15 ヘマクエスト・ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 血液疾患の治療法
TW200803123A (en) * 2006-06-02 2008-01-01 Delta Electronics Inc Power converter and magnetic structure thereof
EP2048948B1 (en) * 2006-07-21 2012-02-29 Lyne Laboratories, Inc. Liquid compositions of calcium acetate
GB0615129D0 (en) 2006-07-29 2006-09-06 Univ Cardiff Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US7547781B2 (en) 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008060139A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
WO2008073292A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephro parhy (rcn)
CA2672581A1 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-claudin 3 monoclonal antibody and treatment and diagnosis of cancer using the same
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
EA035911B1 (ru) 2006-12-18 2020-08-31 Акселерон Фарма Инк. Применение полипептида, который ингибирует опосредованный активином сигнальный путь, в качестве лекарственного средства
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
TWI480048B (zh) 2007-02-01 2015-04-11 Acceleron Pharma Inc 活化素-ＡｃｔＲＩＩａ拮抗劑及其治療或預防乳癌之用途
TWI548647B (zh) 2007-02-02 2016-09-11 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
CN104548056B (zh) * 2007-02-09 2022-09-09 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和促进癌症患者骨骼生长的用途
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
MX2009012934A (es) 2007-06-01 2009-12-15 Wyeth Corp Metodos y composiciones para modular la actividad de bmp-10.
WO2009009059A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Biogen Idec Ma Inc. Spiro compounds as antagonists of tgf-beta
US20090025308A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Deans Brian W Seismic support and reinforcement systems
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
PL2170396T3 (pl) 2007-08-03 2017-07-31 Summit (Oxford) Limited Kombinacje leków do leczenia dystrofii mięśniowej Duchenne'a
GB0715938D0 (en) 2007-08-15 2007-09-26 Vastox Plc Method of treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009025651A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
US20100279409A1 (en) 2007-09-13 2010-11-04 Neil Robson Method for modifying celluar immune resonse by modulating activin activity
CN107412734A (zh) 2007-09-18 2017-12-01 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
KR20100099193A (ko) 2007-11-21 2010-09-10 암젠 인크 Ｗｉｓｅ 결합 항체 및 에피토프
JP5638961B2 (ja) 2008-03-13 2014-12-10 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション Ｂｍｐシグナル伝達経路のインヒビター
WO2009137075A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
CA2725208A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
NZ590327A (en) 2008-06-26 2013-12-20 Acceleron Pharma Inc Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients
NZ602471A (en) 2008-06-26 2014-10-31 Acceleron Pharma Inc Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
PT3494986T (pt) 2008-08-14 2020-07-14 Acceleron Pharma Inc Armadilhas para gdf
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
WO2010059861A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
EP2370463B1 (en) 2008-11-26 2016-08-31 Amgen Inc. A stabilized variant of activin iib receptor
CA2749544A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
US8110355B2 (en) 2009-02-20 2012-02-07 GenRemedy, LLC Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
CA2993053A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Antagonistic activin receptor iib (actriib) antibodies for increasing muscle growth
EP2440576A4 (en) 2009-06-08 2013-11-20 Acceleron Pharma Inc PROCESS FOR INCREASING THE NUMBER OF THERMOUS ADIPOCYTES
KR20120028358A (ko) 2009-06-12 2012-03-22 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
NZ598348A (en) 2009-08-13 2014-05-30 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
KR20120062874A (ko) 2009-09-09 2012-06-14 악셀레론 파마 인코포레이티드 ＡｃｔＲＩＩｂ 길항제들와 이의 투약 및 용도
AU2010315245B2 (en) 2009-11-03 2016-11-03 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
EP2501400B1 (en) 2009-11-17 2017-11-01 Acceleron Pharma, Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
WO2012027065A2 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
EP2726099B1 (en) 2011-07-01 2018-07-25 Novartis AG Method for treating metabolic disorders
EP2797620B1 (en) 2011-10-17 2019-04-24 Acceleron Pharma Inc. Compositions for treating iron overload in thalassemia
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
CA2853187A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Paranta Biosciences Limited A method of treating mucus hypersecretion
EA201491231A8 (ru) 2011-12-19 2015-01-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора активина и их применение
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
EP2861620A2 (en) 2012-06-14 2015-04-22 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Use of blocking agents of bone morphogenie protein (bmp) signaling for the treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
EP2868667B1 (en) 2012-07-02 2019-01-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Therapeutic agent for anemia including renal anemia and cancer-induced anemia which contains anti-bmp9 antibody as active ingredient
WO2014066486A2 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Celgene Corporation Biomarker for use in treating anemia
NZ747350A (en) 2012-10-24 2020-07-31 Celgene Corp Methods for treating anemia
WO2014064292A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) A method for preventing or treating atrial fibrillation
WO2014071158A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
BR112015010566A2 (pt) 2012-11-08 2017-07-11 Clearside Biomedical Inc métodos e dispositivos para o tratamento de doenças oculares em indivíduos humanos
WO2014093531A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin in strategies with stem cells
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
EP2970940B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Translate Bio, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
SG10201801063TA (en) 2013-08-14 2018-04-27 Novartis Ag Methods of treating sporadic inclusion body myositis
CA2932463A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Paranta Biosciences Limited Method of diagnosis and treatment
US20160333418A1 (en) 2014-01-14 2016-11-17 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin Inhibitor Response Prediction and Uses for Treatment
WO2015111008A2 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Novartis Ag Biomarkers predictive of muscle atrophy, method and use
WO2015152183A1 (ja) 2014-03-31 2015-10-08 大日本住友製薬株式会社 進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤
US20150361163A1 (en) 2014-04-18 2015-12-17 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
US10023621B2 (en) 2014-06-04 2018-07-17 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins
AP2016009647A0 (en) 2014-06-13 2016-12-31 Santa Maria Biotherapeutics Inc Formulated receptor polypeptides and related methods
EP3294320A4 (en) 2015-05-13 2018-12-26 Celgene Corporation Treatment of beta-thalassemia using actrii ligand traps

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6093547A (en) * 1993-06-07 2000-07-25 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor and screening for morphogen analogs
WO2004039948A2 (en) * 2002-10-25 2004-05-13 Wyeth Actriib fusion polypeptides and uses therefor
WO2005028517A2 (en) * 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
WO2005094871A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-13 Acceleron Pharma Inc. Bmp-3 propeptides and related methods
WO2005097825A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARRISON C.A. ET AL.: "Antagonists of activin signaling: mechanisms and potential biological applications". TRENDS IN ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHING, NEW YORK, NY, US, vol. 16, no. 2, March 2005 (2005-03), pages 73-78, XP004768099, ISSN: 1043-2760 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2678117C2 (ru) * 2012-11-02 2019-01-23 Селджин Корпорейшн Антагонисты активина-actrii и их применение для лечения нарушений костной ткани и других нарушений

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080087092A (ko) 2008-09-30
EP3811965A1 (en) 2021-04-28
EA201692543A1 (ru) 2017-08-31
JP2016041733A (ja) 2016-03-31
EA201100158A1 (ru) 2011-08-30
US8067360B2 (en) 2011-11-29
CA2631013A1 (en) 2007-05-31
KR20190006086A (ko) 2019-01-16
JP2010094129A (ja) 2010-04-30
RS58231B1 (sr) 2019-03-29
US8629109B2 (en) 2014-01-14
US9163075B2 (en) 2015-10-20
JP2016026212A (ja) 2016-02-12
EA201300330A1 (ru) 2013-11-29
JP5261187B2 (ja) 2013-08-14
CN103479994B (zh) 2019-08-30
ES2649983T3 (es) 2018-01-16
IL230645A0 (en) 2014-03-31
DK1973559T3 (da) 2013-03-25
WO2007062188A3 (en) 2007-09-13
US20220211806A1 (en) 2022-07-07
KR20130120557A (ko) 2013-11-04
JP2021151266A (ja) 2021-09-30
HRP20080377A2 (en) 2008-11-30
US10071135B2 (en) 2018-09-11
MEP59208A (en) 2011-05-10
AU2006318449A1 (en) 2007-05-31
EP2329837B1 (en) 2014-04-30
HK1123215A1 (en) 2009-06-12
KR101557375B1 (ko) 2015-10-08
CN103432568A (zh) 2013-12-11
HK1248598A1 (zh) 2018-10-19
IL191596A0 (en) 2008-12-29
US20090099086A1 (en) 2009-04-16
US20140079700A1 (en) 2014-03-20
CA3045808C (en) 2022-08-16
ES2401805T3 (es) 2013-04-24
EP2781222A1 (en) 2014-09-24
JP2018000205A (ja) 2018-01-11
KR20180030264A (ko) 2018-03-21
KR20200041386A (ko) 2020-04-21
CN105001320A (zh) 2015-10-28
EP3269381B1 (en) 2020-10-07
JP5785129B2 (ja) 2015-09-24
PT1973559E (pt) 2013-02-19
US11129873B2 (en) 2021-09-28
CA3045808A1 (en) 2007-05-31
JP2019156848A (ja) 2019-09-19
EP2781222B1 (en) 2017-08-02
IL259893B (en) 2021-03-25
BRPI0618947A2 (pt) 2011-09-13
RS20080336A (en) 2009-07-15
IN2015DN02553A (ru) 2015-09-11
ECSP088463A (es) 2008-07-30
EP1973559A2 (en) 2008-10-01
IL259893A (en) 2018-07-31
CR10008A (es) 2008-10-03
ES2839549T3 (es) 2021-07-05
BRPI0618947B1 (pt) 2022-07-19
US20070249022A1 (en) 2007-10-25
AU2006318449B2 (en) 2012-07-05
IL230646B (en) 2019-10-31
IL191596A (en) 2014-02-27
NZ568369A (en) 2011-10-28
EP1973559B1 (en) 2013-01-09
KR20150115961A (ko) 2015-10-14
CN104844713A (zh) 2015-08-19
JP2012125259A (ja) 2012-07-05
JP6195885B2 (ja) 2017-09-13
PL1973559T3 (pl) 2013-06-28
MX2008006626A (es) 2008-09-24
IL230646A0 (en) 2014-03-31
WO2007062188A2 (en) 2007-05-31
ME00380B (me) 2011-10-10
CA2631013C (en) 2019-06-11
CN103479994A (zh) 2014-01-01
IL230645A (en) 2015-10-29
HK1158548A1 (en) 2012-07-20
US20160120939A1 (en) 2016-05-05
EP2329837A1 (en) 2011-06-08
US20120058115A1 (en) 2012-03-08
CN104844713B (zh) 2021-05-14
EP3269381A1 (en) 2018-01-17
US7612041B2 (en) 2009-11-03
HRP20080377B1 (hr) 2015-03-27
KR20190097310A (ko) 2019-08-20
IL280877A (en) 2021-04-29
EA018450B1 (ru) 2013-08-30
US7951771B2 (en) 2011-05-31
SG10201509620SA (en) 2015-12-30
JP2009517051A (ja) 2009-04-30
KR101585623B1 (ko) 2016-01-19
US20090098113A1 (en) 2009-04-16
JP2013153765A (ja) 2013-08-15
EA200801406A1 (ru) 2009-12-30
KR20160137665A (ko) 2016-11-30
EA026874B1 (ru) 2017-05-31
US20190192625A1 (en) 2019-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015105B1 (ru) Антагонисты активина - actriia и их применение для стимулирования роста кости
JP2020176139A (ja) 癌患者における骨成長を促進するためのアクチビン−ａｃｔｒｉｉａアンタゴニストおよびその使用
EP2414043B1 (en) Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
JP2009517051A5 (ru)
CN101370511A (zh) Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
AU2017203993B2 (en) Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth
AU2019222887A1 (en) Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth