MX2008006626A

MX2008006626A - Antagonistas de activin-actriia y usos para promover el crecimiento de huesos.

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Publication number: MX2008006626A
Application number: MX2008006626A
Authority: MX
Inventors: John Knopf; Jasbir Seehra
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2005-11-23
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2008-09-24
Also published as: ES2401805T3; EP2329837A1; HK1248598A1; US9163075B2; WO2007062188A3; KR20080087092A; JP2021151266A; HRP20080377A2; US8067360B2; HK1123215A1; US8629109B2; EP2781222B1; DK1973559T3; IL230646B; US20090099086A1; JP5261187B2; JP2016026212A; JP2013153765A; KR20180030264A; US20070249022A1

Abstract

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona composiciones y métodos para promover crecimiento de huesos e incrementar la densidad ósea.

Description

ANTAGONISTAS DE ACTIVIN-ACTRIIA Y USOS PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO DE HUESOS Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de las solicitudes Provisionales Norteamericanas Nos. 60/739,462, presentadas el 23 de noviembre del 2005, 60/783,322, presentada el 17 de marzo del 2006, y 60/844,855, presentada el 15 de septiembre del 2006, en donde dichas aplicaciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Antecedentes de la Invención Los trastornos de los huesos, que fluctúan desde osteoporosis hasta fracturas, representan un grupo de estados patológicos para los cuales existen pocos agentes farmacéuticos efectivos. El tratamiento se enfoca más bien en intervenciones físicas y de comportamiento, incluyendo inmovilización, ejercicio y cambios en la dieta. Puede ser benéfico tener agentes terapéuticos que promuevan el crecimiento de huesos e incrementen la densidad ósea con el propósito de tratar una variedad de trastornos de huesos. El crecimiento y mineralización de huesos depende de las actividades de dos tipos de células, osteoclastos y osteoblastos, aunque los condrocitos y células de la vasculatura también participan en aspectos críticos de estos procesos. En forma de desarrollo, la formación de huesos ocurre a través de dos mecanismos, dosificación endocondrial y dosificación intramembrana, siendo la primera responsable de la formación longitudinal de los huesos y siendo la última responsable de la formación de huesos topológicamente planos, tales como huesos del cráneo. La dosificación endocondrial requiere la formación y degradación en secuencias de estructuras de cartílagos en las placas de crecimiento que sirven como plantillas para la formación de osteoblastos, osteoclastos, la vasculatura y mineralización subsecuente. Durante la osificación intramembrana, que forma al hueso directamente en los tejidos conectivos. Ambos procesos requieren la infiltración de osteoblastos y la subsecuente deposición de matriz. Las fracturas y otras interrupciones estructurales de los huesos son curadas a través de un proceso que, al menos superficialmente, se asemeja a la secuencia de eventos de desarrollo de osteogénesis, incluyendo la formación de tejido de cartílago y la mineralización subsecuente. Este proceso par curar fracturas, puede ocurrir en dos formas. La curación de huesos directa o primaria ocurre sin formación de callo. La curación de huesos indirecta o secundarios ocurre con una etapa precursora de callo. La curación primaria de fracturas implica la reformación de continuidad mecánica a través de una interrupción de ajuste estrecho. Bajo condiciones adecuadas, las células de la absorción de huesos que rodea la interrupción muestran una respuesta de re-absorción de tunelización y establecen trayectoria para la penetración de vasos sanguíneos y la subsecuente curación. La curación secundaria de los huesos sigue un proceso de inflamación, formación de callo blando, mineralización de callo y modelado del callo. En la etapa de inflamación, la formación de hematomas y hemorragia resulta de la interrupción de vasos sanguíneos perioestales y endoestales en el sitio de la lesión. Las células inflamatorias invaden el área. En la etapa de formación de callo blando, las células producen nuevos vasos, fibroblastos, material intracelular y células de soporte, formando un tejido de granulación en el espacio entre los fragmentos de fractura. La unión clínica a través de la interrupción se establece mediante tejido fibroso o cartilaginoso (callo blando). Se forman osteoblastos y transmiten la mineralización del callo blando, el cual posteriormente es reemplazado por hueso lamelar y sometido a procesos de remodelado normal. Además de fracturas y otras interrupciones físicas de la estructura ósea, la pérdida de contenido mineral óseo y la masa ósea puede ser originada por una amplia variedad de condiciones y puede dar como resultado problemas médicos significativos. Los cambios a la masa ósea ocurren en una forma relativamente anticipable durante la vida de in individuo. Hasta la edad de aproximadamente 30 años, los huesos tanto de hombres como de mujeres crecen hasta obtener una masa máxima a través del crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondral y crecimiento radial. Después de aproximadamente los 30 años de edad (para huesos trabeculares, por ejemplo, huesos planos tales como vértebras y pelvis) y la edad de 40 años (para huesos corticales, por ejemplo huesos largos encontrados en las extremidades), la pérdida ósea lenta ocurre tanto en hombres como mujeres. En mujeres, la fase final de pérdida ósea sustancial también ocurre, probablemente debido a deficiencias de estrógenos post-menopáusicos. Durante esta fase, las mujeres pueden perder un 10% adicional de la masa ósea del hueso cortical y el 25% del compartimento trabecular. Si la pérdida ósea progresiva da como resultado una condición patológica, tal como osteoporosis dependerá en gran parte de la masa ósea inicial del individuo y si existen condiciones que la exacerben. La pérdida ósea algunas veces es caracterizada por un desequilibrio en el proceso de remodelado de huesos normal. Los huesos saludables constantemente están sometidos a remodelado. El remodelado comienza con la reabsorción de huesos y osteoclastos. El hueso reabsorbido posteriormente es reemplazado por nuevo tejido óseo, lo cual está caracterizado por formación de colágeno mediante osteoblastos, y la subsecuente calcificación. En individuos sanos los rangos de re-absorción y formación están equilibrados. La osteoporosis es una condición crónica, progresiva, marcada por un cambio hacia la re-absorción, que da como resultado una disminución general en la masa ósea y mineralización ósea. La osteoporosis en humanos está precedida por osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor a una desviación estándar, aunque menor a 2.5 desviaciones estándar debajo del valor promedio de los huesos de adultos jóvenes). A nivel mundial, aproximadamente 75 millones de personas están en riesgo de osteoporosis. Por lo tanto, los métodos para controlar el equilibrio entre actividad de osteoclastos y osteoblastos puede ser útil para promover la curación de fracturas y otros daños a los huesos, así como al tratamiento de trastornos, tales como osteoporosis, asociados con pérdida de masa ósea y mineralización ósea. Con respecto a osteoporosis, se utilizan como intervenciones terapéuticas estrógenos, calcitonina, osteocalcina con vitamina K, o altas dosis de calcio en la dieta. Otros métodos terapéuticos para osteoporosis incluyen bifosfonatos, hormona paratiroides, calcimiméticos, estatinas, esteroides anabólicos, sales de lantano y estronio y fluoruro de sodio. Sin embargo, dichos terapéuticos con frecuencia están asociados con efectos secundarios indeseables. Por lo tanto, es un objeto de la presente descripción proporcionar composiciones y método para promover el crecimiento y mineralización ósea.

Breve Descripción de la Invención En parte, la presente invención demuestra que las moléculas que tienen actividad antagonista de activina o ActRlla ("antagonistas de activita" y "antagonistas de ActRlla") se pueden utilizar para incrementar la densidad ósea, promover el crecimiento de huesos y/o incrementar la fuerza ósea. En particular, la descripción demuestra que una forma soluble de ActRlla actúa como un inhibidor de la señalización activina-ActRlla y promueve la densidad ósea incrementada, crecimiento de huesos y resistencia ósea in vivo. Aunque la mayor parte de los agentes farmacéuticos que promueven el crecimiento ósea o inhiben la pérdida de hueso actúan ya sea como agentes anti-catabólicos (también referidos comúnmente como "agentes catabólicos") (por ejemplo bifosfonatos) o agentes anabólicos (por ejemplo hormona de paratiroides, PTH, cuando se dosifica en forma adecuada), la proteína ActRlla soluble exhibe una actividad doble, que tiene efectos tanto catabólicos como anabólicos. Por lo tanto, la presente descripción establece que los antagonistas de la trayectoria de señalización de activita-ActRlla pueden ser utilizados para incrementar la densidad ósea y promover el crecimiento óseo. Aunque ActRlla soluble puede afectar los huesos a través de un mecanismo además del antagonismo de activina, la presente descripción demuestra sin embargo que se pueden seleccionar agentes terapéuticos deseables sobre las bases de una actividad antagonistas de activita-ActRlla. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la descripción proporciona métodos para utilizar antagonistas de activina-ActRI la, incluyendo, por ejemplo, polipéptidos ActRlla que enlazan a activina, anticuerpos anti-activina, anticuerpos anti-ActRlla, moléculas pequeñas dirigidas a activina o ActRlla y aptómeros, y ácidos nucleicos que disminuyen la expresión de activina y ActRlla, para tratar trastornos asociados con baja densidad ósea o baja resistencia ósea, tal como osteoporosis, o promueven el crecimiento de huesos en pacientes que necesita del mismo, tal como en pacientes que tienen fractura de huesos. Además, el polipéptido ActRlla soluble promueve el crecimiento ósea sin originar un incremento consistentemente medible en masa muscular. En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona polipéptidos que comprenden un polipéptido ActRlla de enlace a activina, soluble que enlaza a activina. Los polipéptidos ActRlla pueden ser formulados como una preparación farmacéutica que comprende el polipéptido ActRlla de enlace a activina y un transportador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el polipéptido ActRlla de enlace a activina enlaza a activina con un KD menor a 1 micromolar o menor a 100, 10 o 1 nanomolar. Opcionalmente, el polipéptido ActRlla de enlace a activina, enlaza selectivamente a activina versus GDF11 y/o GDF8, y preferentemente con un KD que es al menos 10 veces, 20 veces o 50 veces menor con respecto a la activina que con respecto a GDF11 y/o GDF8. Aunque no se pretende limitarse a un mecanismo de acción en particular, se espera que este grado de selectividad para la inhibición de activina con respecto a la inhibición GDF11/GDF8, abarque el efecto selectivo en huesos sin un efecto consistentemente medible en los músculos. En muchas modalidades, un polipéptido ActRlla puede ser seleccionado para originar menos del 15%, menos del 10% o menos del 5% en incremento en músculos en dosis que logran efectos deseables en huesos. Preferentemente la composición es al menos el 95% pura, con respecto a otros componentes de polipéptido, tal como se evalúa a través de cromatografía de extrusión por tamaño, y más preferentemente, la composición es al menos el 98% pura. Un polipéptido ActRlla de enlace a activina, para utilizarse en dicha preparación, puede ser cualesquiera de las aquí descritas, tal como un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NOs: 2, 3, 7 ó 12, o que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 ó 13. Un polipéptido ActRlla de enlace a activina puede incluir un fragmento funcional de un polipéptido ActRlla natural, tal como uno que comprende al menos 10, 20 ó 30 aminoácidos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1-3 o una secuencia de SEQ ID NO: 2, que carece de 10 a 15 aminoácidos C-terminal (la "cola").

Un polipéptido ActRlla de enlace a activina puede incluir una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo en el dominio de enlace o ligando) con relación a un polipéptido ActRlla que ocurre naturalmente. Los ejemplos de polipéptidos ActRlla alterados se proporcionan en la Publicación WO 2006/012627, páginas 59 y 60, incorporado a la presente invención como referencia. La alteración en la secuencia de aminoácidos puede, ejemplo, alterar la glucosilación del polipéptido cuando se produce en un mamífero, insecto u otra célula eucariótica o altera la disociación proteolítica del polipéptido con relación al polipéptido ActRlla que ocurre en forma natural. Un polipéptido ActRlla de enlace a activina puede ser una proteína de fusión que tiene, como un dominio, un polipéptido ActRlla (por ejemplo, una parte de enlace a ligandos de un ActRlla) y uno o más dominios adicionales que proporcionan una propiedad deseable, tal como farmacocinéticas mejoradas, purificación más fácil, dirección o tejidos particulares, etc. Por ejemplo, un dominio de una proteína de fusión puede aumentar una o más de la estabilidad in vivo, vida promedio in vivo, captación/administración, localización o distribución de tejido, formación de complejos de proteína, multimerización de proteínas de fusión y/o purificación. Una proteína de fusión ActRlla de enlace a activina puede incluir un dominio Fe de inmunoglobulina (tipo natural o mutante) o una albúmina de suero en otra parte del polipéptido que proporcione propiedades deseables tales como farmacocinéticas mejoradas, solubilidad mejorada o estabilidad mejorada. En una modalidad preferida, una fusión ActRlla-Fc comprende un enlazador relativamente estructurado colocado entre el dominio Fe y el dominio ActRlla extracelular. Este enlazador no estructurado puede corresponder a la región no estructurada de rigurosamente 15 aminoácidos en el extremo C-terminal del dominio extracelular de ActRlla (la "cola"), o puede ser una secuencia artificial de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos o una longitud de entre 5 y 15, 20, 30, 50 o más aminoácidos que están relativamente libres de una estructura secundaria, o una mezcla de ambos. Un enlazador puede tener alto contenido de residuos de glicina y prolina y por ejemplo, puede contener una secuencia simple de treonina/serina y glicinas o secuencias de repetición de treonina/serina y glicinas (por ejemplo singletos o repeticiones TG4 o SG4). Una proteína de fusión puede incluir una sub-secuencia de purificación, tal como una etiqueta de epítope, una etiqueta FLAG, una secuencia de polihistidina y una fusión GST. Opcionalmente, un polipéptido ActRlla soluble incluye uno o más residuos de aminoácido modificados seleccionados de: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a una porción de lípido y un aminoácido conjugado a un agente de derivación orgánica.

Una preparación farmacéutica también puede incluir uno o más compuestos adicionales tales como un compuesto que se utiliza para tratar un trastorno óseo. Preferentemente, una preparación farmacéutica está sustancialmente libre de pirógenos. En general, se prefiere que una proteína ActRlla sea expresada en una línea de célula de mamífero que transmita glucosilación adecuadamente natural de la proteína ActRlla para disminuir de esta forma la probabilidad de una respuesta inmune no favorable en un paciente. Las líneas de células humanas y CHO han sido utilizadas con éxito, y se espera que también sean útiles otros sistemas de expresión de mamíferos comunes. Tal como se describe en la presente invención, las proteínas ActRlla, designadas ActRlla-Fc (una forma con un enlazador mínimo entre la parte ActRlla y la parte Fe) tienen propiedades deseables, incluyendo enlace selectivo a activina versus GDF8 y/o GDF11, alta afinidad de enlace a ligandos y una mayor vida promedio en suero que las que se obtienen en dos semanas en modelos animales. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona polipéptidos ActRlla-Fc y preparaciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido ActRlla de enlace a activina soluble. Un polinucleótido aislado puede comprender una secuencia de codificación de un polipéptido ActRlla de enlace a activina, soluble, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico asilado puede incluir una secuencia que codifica un dominio extracelular (por ejemplo, dominio de enlace a ligando) de un ActRlla y una secuencia que puede codificar parte o todo el dominio de transmembrana y/o el dominio citoplásmico de un ActRlla, aunque para un codón de detención colocado dentro del dominio de transmembrana o el dominio citoplásmico, o colocado entre el dominio extracelular y el dominio de transmembrana o dominio citoplásmico. Por ejemplo, un polinucleótido aislado puede comprender una secuencia de polinucleótido ActRlla de longitud total tal como SEQ ID NO: 4 ó 5, o una versión parcialmente truncada, comprendiendo además el polinucleótido aislado un codón de determinación de transcripción de al menos seiscientos nucleótidos antes del 3'-termino o colocado de otra forma, de modo que la traducción del polinucleótido dé surgimiento a un dominio extracelular fusionado opcionalmente a una parte truncada de un ActRlla de longitud total. Una secuencia de ácido nucleico preferida es SEQ ID NO: 14. Los ácidos nucleicos aquí preferidos pueden enlazar en forma operable a un promotor para la expresión, y la descripción proporciona células transformadas con dichos polinucleótidos recombinantes. Preferentemente la célula es una célula de mamífero, tal como una célula CHO. En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona métodos para elaborar un polipéptido ActRlla de enlace a activina soluble. Dicho método puede incluir expresar cualesquiera de los ácidos nucleicos (por ejemplo, SEQ ID NO: 4, 5 ó 14) aquí descritos en una célula adecuada, tal como célula de ovario de hámster Chino (CHO). Dicho método puede comprender: a) cultivar una célula bajo condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido ActRlla soluble, en donde la célula es transformada con una construcción de expresión ActRlla soluble; y b) el polipéptido ActRlla soluble, así expresado. Los polipéptidos ActRllas solubles pueden ser recuperados como fracciones crudas, parcialmente purificadas o altamente purificadas. La purificación se puede lograr a través de una serie de pasos de purificación, que incluyen, por ejemplo, uno, dos o tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio de aniones (por ejemplo, sefarosa Q), cromatografía de interacción hidrofóbica (por ejemplo, fenilsefarosa), cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de intercambio de cationes. En ciertos aspectos, el antagonista activina-ActRI la, aquí descrito, tal como un polipéptido ActRlla de enlace a activina soluble, puede ser utilizado en un método para promover el crecimiento óseo o incrementar densidad ósea en un sujeto. En ciertas modalidades, la descripción proporciona métodos para tratar un trastorno asociado con baja densidad ósea, o promover crecimiento óseo, en pacientes que necesitan del mismo. Un método puede comprender administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad efectiva de un antagonista activina-ActRI I . En ciertos aspectos, la descripción proporciona usos del antagonista activina-ActRlla para elaborar un medicamento para el tratamiento de un trastorno o condición aquí descrita. En ciertos aspectos, la descripción proporciona un método para identificar un agente que estimula el crecimiento de, o incrementa la mineralización de huesos. El método comprende: a) identificar un agente de prueba que enlaza a activina o un dominio de enlace de ligando de un polipéptido ActRlla; y b) evaluar el efecto del agente en el crecimiento o mineralización de huesos. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1, muestra la purificación de ActRlla-hFc expresado en células CHO. La proteína se purifica en la forma de un pico simple, bien definido. La figura 2, muestra el enlace de ActRlla-hFc a activina y GDF-11, tal como se mide a través del ensayo BiaCore™. La figura 3, muestra un esquema del ensayo de gen reportero A-204. La figura muestra el vector reportero: pGL3 (CAGA) 12 (descrito en la Publicación de Dennier y asociados, 1998, EMBO 17: 3091-3100.) El motivo CAGA12 está presente en genes que responden a TGF-Beta (gen PAI-1), de modo que este vector es de uso general para factores que señalan a través de Smad 2 y 3. La figura 4, muestra los efectos de ActRlla-hFc (rombo) y ActRlla-mFc (cuadrados) en señalización GDF-8 en el ensayo de gen reportero A-204. Ambas proteínas exhibieron inhibición sustancial de señalización transmitida por GDF-8 en concentraciones pico molares. La figura 5, muestra los efectos de tres diferentes preparaciones de ActRlla-hFc en señalización GDF-11 en el ensayo de gen reportero A-204. La figura 6, muestra ejemplo de imágenes DEXA de ratones BALB/c tratados con control ActRlla-mFc, antes (paneles superiores) y después (paneles inferiores) de un período de tratamiento de 12 semanas. El sombreado color pálido indica una densidad ósea incrementada. La figura 7, muestra una cuantificación de los efectos de ActRlla-mFc en la densidad mineral ósea en ratones BALB/c durante el período de 12 semanas. Los tratamientos fueron de control (rombos), 2 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (cuadrados), 6 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (triángulos) y 10 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (círculos). La figura 8, muestra una cuantificación de los efectos de ActRlla-mFc en contenido mineral óseo en ratones BALB/c durante el período de 12 semanas. Los tratamientos fueron de control (diamantes), 2 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (cuadrados), 6 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (triángulos) y 10 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (círculos). La figura 9, muestra una cuantificación de los efectos de ActRlla-mFc en densidad mineral ósea del hueso trabecular en ratones C57BL6 ovariectomizados (OVX) u operados simulados (SHAM), después de un período de 6 semanas. Los tratamientos fueron control (PBS) o 10 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (ActRlla). La figura 10, muestra una cuantificación de los efectos de ActRlla-mFc en el hueso trabecular en ratones C57BL6 ovariectomizados (OVX) durante un período de 12 semanas. Los tratamientos fueron control (PBS; barras pálidas) o 10 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (ActRlla; barras oscuras). La figura 11, muestra una cuantificación de los efectos de ActRlla-mFc en el hueso trabecular en ratones C57BL6 operados simulados después de un período de tratamiento de 6 a 12 semanas. Los tratamientos fueron control (PBS; barras pálidas) o 10 mg/kg de dosificación de ActRlla-mFc (ActRlla; barras oscuras). La figura 12, muestra los resultados de análisis pQCT de densidad ósea en ratones ovariectomizados durante 12 semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron control (PBS; barras pálidas) o ActRlla-mFc (barras oscuras). Ejes y: mg/ccm La figura 13, ilustra los resultados de análisis pQCT de densidad ósea en ratones operados simulados en 12 semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron control (PBS; barras pálidas) o ActRlla-mFc (barras oscuras). Eje y; mg/ccm. Las figuras 14A y 14B, muestran análisis DEXA de cuerpo completo después de 12 semanas de tratamiento (A) y análisis ex vivo de femurs (B). Las áreas claras se ilustran áreas de densidad ósea superior. La figura 15, muestra un análisis pQCT ex vivo del eje medio femoral después de doce semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron control de vehículo (PBS, barras oscuras) y ActRlla-mFc (barras pálidas). Las cuatro barras a la izquierda muestran la densidad ósea total, en tanto que las cuatro barras a la derecha muestran la densidad ósea cortical. El primer par de barras en cada grupo de cuatro barras representa dataos de ratones ovariectomizados, en tanto que el segundo par de barras representa datos de ratones operados simulados. La figura 16, muestra análisis pQCT ex vivo y contenido óseo diafiseal del eje medio del femoral después de doce semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron control de vehículo (PBS, barras oscuras) o ActRlla-mFc (barras pálidas). Las cuatro barras a la izquierda muestran contenido óseo total, en tanto que las cuatro barras a la derecha muestran contenido óseo cortical. El primer par de barras en cada grupo de cuatro barras, representa datos de ratones ovariectomizados, en tanto que el segundo par de barras representa datos de ratones operados simulados. La figura 17, muestra análisis pQCT ex vivo del eje medio femoral y grosor cortical femoral. Los tratamientos fueron control (PBS, barras oscuras) y ActRlla-mFc (barras pálidas). Las cuatro barras a la izquierda muestran circunferencia endosteal en tanto que las cuatro barras de la derecha muestran circunferencia periosteal. El primer par de barras en cada grupo de cuatro barras representa datos de ratones ovariectomizados en tanto que el segundo par de barras representa datos de ratones operados sham. La figura 18, ilustra los resultados de las pruebas mecánicas de fémurs después de doce semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron control (PBS, barras oscuras) y ctRlla-mFc (barras pálidas). Las dos barras a la izquierda representan datos de ratones ovariectomizados en tanto que las dos últimas barras representan datos de ratones operados sham. La figura 19, muestra los efectos de ActrlIa-mFc en volumen óseo trabecular. La figura 20, muestra los efectos de ActrlIa-mFc en arquitectura trabecular en el fémur distal. La figura 21, muestra los efectos de ActrlIa-mFc en hueso cortical. La figura 22 muestra los efectos de ActrlIa-mFc en resistencia mecánica de los huesos.

La figura 23 muestra los efectos de diferentes dosis de ActRlla-mFc en característica óseas en tres diferentes dosificaciones. La figura 24, muestra la histomorfometría ósea que indica que ActRlla-mFc tiene actividad anabólica dual y antireabsorción. Descripción Detallada de la Invención 1. Revisión general La superfamilia del factor beta de transformación de crecimiento (TGF-beta) contiene una variedad de factores de crecimiento que comparte elementos de secuencia común y motivos estructurales. Estas proteínas son conocidas por ejercer efectos biológicos en una gran variedad de tipos de células en vertebrados e invertebrados. Los miembros de la superfamilia llevan a cabo importantes funciones durante el desarrollo embriónico en la formación de patrones y especificación de tejido y pueden influenciar una variedad de procesos de diferenciación, incluyendo adipogénesis, miogenésis, condrogenésis, cardiogénesis, hematopoyesis, neurogenesis y diferenciación de célula epitelial. La familia se divide en dos ramas generales: las ramas BMP/GDF y las ramas TGF-beta/Activina/BMP10, cuyos miembros tienen diversos efectos con frecuencia complementarios. Al manipular la actividad del miembro de la familia TGF-beta, con frecuencia es posible originar cambios fisiológicos significativos en un organismo. Por ejemplo, las crías de becerros Piedmontese y Belgian Blue llevan una mutación de pérdida de función en el gen GDF8 (también denominado miostatina) que origina un incremento marcado en la masa muscular. Grobet y asociados., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. Además, en humanos, los alelos y nativos de GDF8 están asociados con masa muscular incrementada, y según reportes, una resistencia excepcional. Schuelke y asociados, N Engl J Med 2004, 350:2682-8. Las activinas son factores de crecimiento polipéptido diméricos que pertenecen a la superfamilia TGF-beta. Existen tres formas de activina principales (A, B, y AB) que son homo/heterodímeros de' dos subunidades ß relacionadas cercanamente ( APA, PBPB, y PAPB)- El genoma humano también codifica una activina C y una activina E, las cuales principalmente se expresan en el hígado. En la superfamilia TGF-beta, las activinas son únicas y los factores multifuncionales que pueden estimular la producción hormonal de células de ovario y plantas, soportan la supervivencia de célula neuronal, e influencian en forma positiva o negativa el progreso del ciclo celular, dependiendo del tipo de célula, e inducen la diferenciación mesodérmica al menos en embriones de amfibio (DePaolo y asociados., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson y asociados., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963). Además, el factor de diferenciación eritroide (EDF) aislado de células leucémicas monocíticas humanas estimuladas, se descubrió que son idénticas a (Murata y asociados., 1988, PNAS, 85:2434). Se ha sugerido que la activina A actúa como un regulador natural, positivo de eritropoyesis en la médula ósea. En varios tejidos, la señalización de activina es antagonizada por su heterodimero relacionado, inhibina. Por ejemplo, durante la liberación de hormona de estimulación de folículos (FSH) de la pituitaria, la activina promueve la secreción y síntesis de FSH, y al mismo tiempo la inhibina previene la secreción y síntesis de FSH. Otras proteínas que pueden regular la bioactividad de activina y/o enlazar a activina, incluyen (FS), proteína relacionada con folistatina (FSRP), a2-macroglobulina, Cerberus y endoglina. Las señales TGF-ß son transmitidas mediante complejos heteroméricos de receptores de cinasa de serina/treonina tipo I y tipo II, las cuales fosforilan y activan las proteínas Smad de corriente descendente en la estimulación del ligando (Massagué, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 169-178). Estos receptores tipo I y tipo II son proteínas de transmembrana, compuestas de un dominio extracelular de enlace a ligados con una región con alto contenido de cisteína, un dominio de transmembrana, y un dominio citoplásmico con especificidad serina/treonina anticipada. Los receptores tipo I son esenciales para señalización; y los receptores tipo II son requeridos para enlazar a ligandos y para la expresión de los receptores tipo I. Los receptores de activina tipo I y II forman un complejo estable después del enlace a ligandos, dando como resultado la fosforilación de los receptores tipo I a través de los receptores tipo II. Dos receptores tipo II relacionados, ActRlla y ActRllb, han sido identificado como los receptores tipo II para activinas (Mathews y Vale, 1991, Cell 65:973 -982; Attisano y asociados, 1992, Cell 68:97-108). Además de las activinas, ActRlla y ActRllb pueden interactuar bioquímicamente con otras diversas proteínas de la familia TGF-ß, incluyendo BMP7, Nodal, GDF8, y GDF11 (Yamashita y asociados, 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee y McPherron, 2001, Proc. Nati. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo y Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh y asociados, 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 es el receptor tipo I principal para activinas, particularmente para activina A, y ALK-7 puede servir como un receptor también para activinas, particularmente para activina B. Tal como se muestra en la presente invención, un polipéptido ActRlla soluble (sActRlla), que muestra preferencia sustancial en el enlace a activina A, en forma opuesta a otros miembros de la familia TGF-beta, tal como GDF8 o GDF11, es efectivo para promover el crecimiento óseo e incrementar in vivo la densidad ósea. Aunque no se pretende limitarse a un mecanismo particular, se espera que el efecto de sActRlla sea originado principalmente por un efecto antagonista de activina, debido a que el enlace de activina muy fuerte (constante de disociación picomolar) exhibida por la construcción de sActRlla en particular es utilizada en estos estudios. Sin importar el mecanismo, se puede apreciar de los datos presentados en la presente invención, que los antagonistas de ActRI la-activina incrementan la densidad ósea en ratones normales y en modelos de ratón para osteoporosis. Se deberá observar que los huesos son un tejido dinámico, con crecimiento o contracción y una densidad incrementada o disminuida dependiendo de un equilibrio de factores que producen los huesos y estimulan la mineralización (principalmente osteoblastos) y factores que destruyen y desmineralizan los huesos (principalmente osteoclastos). El crecimiento y la mineralización ósea pueden incrementarse, incrementando los factores productivos, disminuyendo los factores destructivos, o ambos. Los términos "promueven crecimiento óseo" y "incrementan mineralización ósea" se refieren a los cambios físicos observables en huesos y están proyectados para ser naturales como el mecanismo a través del cual ocurren los cambios en huesos. Los modelos de ratón para osteoporosis y crecimiento/densidad ósea que fueron utilizados en los estudios descritos en la presente invención, se consideran que son altamente predictivos de la eficacia en humanos, y por consiguiente, esta descripción proporciona métodos para utilizar polipéptidos ActRllas y otros antagonistas de activina- ActRlla que promueven el crecimiento óseo e incrementan la densidad ósea en humanos. Los antagonistas activina-ActRI la incluyen, por ejemplo, polipéptidos ActRllas solubles de enlace a activina, anticuerpos que enlazan a activina (particularmente las sub-unidades de activina A o B también referidos como ß? o ß?) e interrumpen el enlace ActRlla, anticuerpos que enlazan a ActRlla e interrumpen el enlace a activina, proteínas sin anticuerpos seleccionadas para el enlace de activina o ActRlla (ver por ejemplo las Publicaciones WO/2002/088171 , WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, Patente Norteamericana No. 2003/0133939, y Patente Norteamericana No. 2005/0238646 para ejemplos de dichas proteínas y métodos para diseñar y seleccionar las mismas), los péptidos aleoteorizados seleccionados para enlace de activina o ActRlla, con frecuencia se fijan a un dominio Fe. Dos diferentes proteínas (u otras porciones) con actividad de enlace activina o ActRlla, especialmente enlazadores de activina que bloquean los sitios de enlace tipo I (por ejemplo receptor de activina tipo I soluble) y tipo II (por ejemplo receptor de activina tipo II soluble), respectivamente, se pueden enlazar juntas para crear una molécula de enlace bifuncional. Los aptámeros de ácido nucleico, moléculas pequeñas y otros agentes inhiben el eje de señalización activina-ActRI la. Varias proteínas tienen actividad antagonista activina-ActRlla, incluyendo inhibina (por ejemplo, subunidad de alfa inhibina), aunque la inhibina no antagoniza universalmente activina en todos los tejidos, folistatina (por ejemplo, folistatina-288 y folistatina-315), Cerberus, FSRP, endoglina, activina C, alfa(2)- macroglobulina, y una activina A de muíante M108A (cambio de metionina a alanina en la posición 108). De manera general, las formas alternativas de activina, particularmente aquellas con alteraciones en el dominio de enlace de receptor tipo I pueden enlazar a los receptores tipo II y falla en la formación de un completo ternario activo, actuando de esta forma como antagonistas. Además, los ácidos nucleicos tales como moléculas anti-sentido siRNAs o ribosomas que inhiben la activina A, B, C o E, o, particularmente, la expresión ActRlla, se pueden utilizar como antagonistas de activina-ActRlla. Preferentemente, el antagonista activina-ActRlla que será utilizado exhibirá selectividad para inhibir señalización transmitida por activina versus otros miembros de la familia TGF-beta, y particularmente con respecto a GDF8 y GDF11. Las proteínas ActRllb solubles enlazan a activina, sin embargo, la proteína tipo natural no exhibe selectividad significativa en el enlace a activina versus GDF8/11, y los experimentos preliminares sugieren que esta proteína no proporciona los efectos deseados en huesos, aunque también originan un crecimiento sustancial de los músculos. Sin embargo, las formas alteradas de ActRllb con diferentes propiedades de enlace han sido identificadas (por ejemplo, ver la Publicación WO 2006/012627, páginas 55-59, incorporado a la presente invención como referencia) y estas proteínas pueden lograr los efectos deseados en huesos. Las ActRllb nativas o alteradas pueden proporcionar especificidad agregada para activina, acoplando con un segundo agente de enlace selectivo de activina. Los términos utilizados en la presente especificación generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de la presente invención y dentro del contexto específico en donde se utilice cada término. Cientos términos se describen más adelante o en cualquier otra sección en la presente especificación, para proporcionar una quía adicional al practicante en la descripción de las composiciones y métodos de la presente invención, y de cómo elaborarlas y utilizarlas. El alcance o significado de cualquier uso de un término será apreciado a partir del contexto específico en el cual se utilice el término. Los términos "aproximadamente" y "alrededor de" deben significar de manera general un grado aceptable de error de la cantidad medida debido a la naturaleza o precisión de las medidas. Normalmente, los grados de error de ejemplo están dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y más preferentemente dentro del 5% de un valor o rango de valores determinados. Como alternativa, y de manera particular en sistemas biológicos, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y más preferentemente dentro 2 veces de de un valor determinado. La cantidades numéricas aquí proporcionadas son aproximadas a menos que se manifieste lo contrario, lo que significa que el término "alrededor de" o "aproximadamente" pueden ser inferidos cuando no se manifiesten de manera expresa. Los métodos de la presente invención pueden incluir pasos para comparar secuencias entre sí, incluyendo secuencias tipo natural con uno o más mutantes (variantes de secuencias). Dichas comparaciones normalmente comprenden alineaciones de secuencias de polímero, por ejemplo, utilizando programas de alineación de secuencia y asociados algoritmos que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo BLAST, FASTA y MEGALIGN, por nombrar algunos). Los expertos en la técnica podrán apreciar fácilmente que, en dichas alineaciones, cuando una mutación contiene una inserción o eliminación de residuo, la alineación de secuencia introducirá una "brecha" (normalmente representada por un punto o "A") en la secuencia de polímero que no contiene el residuo insertado o eliminado. El término "homólogo" en todas sus formas gramaticales y variaciones de deletreo, se refieren a la relación entre dos proteínas que poseen un "origen de evolución común" incluyendo proteínas de superfamilias en las mismas especies del organismo, así como proteínas homologas de diferentes especies del organismo. Dichas proteínas (y sus ácidos nucleicos de codificación) tienen homología de secuencia, tal como se refleja a través de su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. El término "similitud de secuencias" en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácido nucleico y aminoácido que pueden o no compartir un origen de evolución común. Sin embargo, en uso común y en la presente solicitud, el término "homólogos", cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente", se puede referir a una similitud de secuencia y puede o no relacionarse con un origen de evolución común. 2. Polipéptidos ActRlla En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a polipéptidos ActRllas. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "ActRlla" se refiere a una familia de proteínas receptoras de activina lia (ActRlla) de cualquier especie y las variantes derivadas de dichas proteínas ActRlla mediante mutagénesis u otra modificación. La referencia a ActRlla en la presente invención, se entiende como una referencia a cualesquiera de las formas identificadas normalmente. Los miembros de la familia ActRlla generalmente son proteínas de transmembrana, compuestas de un dominio extracelular de enlace a ligandos con una región de alto contenido de cisteína, un dominio de transmembrana, y un dominio citoplásmico con actividad de cinasa de serina/treonina anticipada. El término "polipéptido ActRlla" incluye polipéptidos que comprenden cualesquiera polipéptidos que ocurren naturalmente de un miembro de la familia ActRlla así como cualquier variante de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que retienen una actividad útil. Por ejemplo, los polipéptidos ActRllas incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier ActRlla conocido que tenga una secuencia al menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de un polipéptido ActRlla, y preferentemente al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más de identidad. Por ejemplo, un polipéptido ActRlla de la presente invención puede enlazar e inhibir la función de una proteína ActRlla y/o activina. Preferentemente, un polipéptido ActRlla promueve el crecimiento óseo y mineralización ósea. Los ejemplos de polipéptidos ActRllas incluyen polipéptido precursor ActRlla humano (SEQ ID NO: 1) y polipéptidos ActRllas humanos solubles (por ejemplo, SEQ ID NOs: 2, 3, 7 y 12). La frecuencia de proteína precursora ActRlla humana es como se indica a continuación: GAAAKLAFAVFLISCSSGAILGRSETQECLFFNANWEKDRTN QTGVEPCYGDKDKRRHCFA WKglSGSIEIVKQGCWLDDINCY DRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG MCNEKFSYFPEMEVTQPTSNP VTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVL VPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEY VAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTS VDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAET ARGLA YLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLA LKFEAGKSAGDTHGQVGTRRY APEVLEGAINFQRDAFLRID YAMGLVLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLED QE VVVHKKKRPVLRDYWQKHAGMA LCETIEECWDHDAEARLSAG CVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL (SEQ ID NO: 1) El péptido de señal está subrayado simple; el dominio extracelular está con letras negritas y los sitios de glucosilacion enlazados-N potenciales está subrayados dobles. La secuencia soluble ActRlla humana (extracelular), de polipéptido procesado es como se indica a continuación: ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFAT KNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCE GNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2) La "cola" C-terminal del dominio extracelular está subrayada. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia ?15) es como se indica a continuación: ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFAT WKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCE GN CNEKFSYFPEM (SEQ ID NO:3) La secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína precursora ActRlla humana, es como se indica a continuación (nucleótidos 164-1705 de la entrada Genbank NM_01616): ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTTCTT CAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGC TAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGT GACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTT CCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGA CAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGC TGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAG TCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCTATTACAACAT CCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGT GCATTTTGGGTGTACAGGCATCACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTC CAACTCAAGACCCAGGACCACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACC ACTGCAGTTATTAGAAGTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAA GCCCAGTTGCTTAACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACA AACAGTCATGGCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCA TGAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAACGAGGCACCAGTGTTGAT GTGGATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACT TTCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAAAC CATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAAAAGAT GGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAATGTGCTGT TGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGGCCTTAAAATT TGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGG TACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCAT TTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTC TCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTTGAG GAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGC ATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAAT GGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCC AGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAA CAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAA TGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA (SEQ ID NO: 4) secue n ci a de á ci d o n u cl ei co q ue cod ifi ca a l po l i pé ptid o ActR l l a h u m a n o (extra cel u l a r) es com o se i nd i ca a continuación: ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGG AAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGA TAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAA ATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTG ATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGG CAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAG CCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC (SEQ ID NO: 5) En una modalidad específica, la presente invención se refiere a polipéptidos ActRllas solubles. Tal como se describe en la presente invención, el término "polipéptido ActRlla soluble" se refiere de manera general a polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de una proteína ActRlla. El término "polipéptido ActRlla soluble," tal como se utiliza en la presente invención, incluye cualquier dominio extracelular que ocurre naturalmente de una proteína ActRlla, así como cualesquiera variantes de la misma (incluyendo mutantes, fragmentos y formas peptidomiméticas). Un polipéptido ActRlla que enlaza a activina es uno que retiene la capacidad de enlazar activina, particularmente activina AA, AB o BB. Preferentemente, el polipéptido ActRlla que enlaza a activina enlazará a activina AA con una constante de disociación de 1 nM o menos. Las secuencias de aminoácidos de la proteína precursora ActRlla humana se proporciona más adelante. El dominio extracelular de una proteína ActRlla se enlaza a activina y es generalmente soluble, y por lo tanto puede ser denominada un polipéptido ActRlla de enlace a activina, soluble. Los ejemplos de polipéptidos ActRlla de enlace a activina, solubles incluyen el polipéptido soluble ilustrado en SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 y 13. SEQ ID NO: 7 es referido como ActRlla-hFc, y se describe más adelante en la sección de ejemplos. Otros ejemplos de polipéptidos ActRlla de enlace a activina solubles, comprenden una secuencia de señal además del dominio extracelular de una proteína ActRlla, por ejemplo, la secuencia líder de melitina de miel de abeja (SEQ ID NO: 8), el líder del activador de plasminógeno de tejido (TPA) (SEQ ID NO: 9) o el líder ActRlla nativo (SEQ ID NO: 10). El polipéptido ActRlla-hFc ilustrado en SEQ ID NO: 13 utiliza un líder TPA. Los fragmentos funcionalmente activos de polipéptidos ActRllas pueden ser obtenidos clasificando polipéptidos producidos en forma recombinante del fragmento correspondiente del ácido nucleico que codifica un polipéptido ActRlla. Además, los fragmentos pueden ser sintetizados en forma química utilizando técnicas conocidas en el arte, tal como una química f-Moc o t-Boc de fase sólida de Merrifield convencional. Los fragmentos pueden ser producidos (en forma recombinante mediante síntesis química) y probados para la identificados de los fragmentos de peptidilo que pueden funcionar como antagonistas (inhibidores) de la proteína ActRlla o señalización transmitida mediante activina. Las variantes funcionalmente activas de polipéptidos ActRllas pueden obtenerse clasificando bibliotecas de polipéptidos modificados producidos en forma recombinante de los ácidos nucleicos mutagenizados correspondientes que codifican un polipéptido ActRlla. Las variantes pueden ser producidas y probadas para identificar las que pueden funcionar como antagonistas (inhibidores) de proteína ActRlla o señalización transmitida mediante activina. En ciertas modalidades, una variante funcional de los polipéptidos ActRllas comprenden una secuencia de aminoácido que es al menos el 75% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NOs: 2 ó 3. En ciertos casos, la variante funcional tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NOs: 2 ó 3. Las variantes funcionales pueden ser generadas modificando la estructura de un polipéptido ActRlla para dichos propósitos, tal como para aumentar la eficacia terapéutica, o estabilidad (por ejemplo, vida en anaquel ex vivo y resistencia a degradación proteolítica in vivo). Dichos polipéptidos ActRllas modificados cuando se seleccionan para retener enlace de activina, se consideran un equivalente funcional de los polipéptidos ActRllas que ocurren naturalmente. Los polipéptidos ActRllas modificados también pueden ser producidos, por ejemplo, mediante sustitución, eliminación o adición de aminoácidos. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con un serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado (por ejemplo mutaciones conservadoras) no tendrán un efecto importante en la actividad biológica de la molécula resultante. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ActRlla da como resultado un homólogo funcional, puede ser determinado evaluando la capacidad de un polipéptido ActRlla variante para producir una respuesta en células en un modo similar al polipéptido ActRlla tipo natural. En ciertas modalidades, la presente invención contempla mutaciones específicas de los polipéptidos ActRllas para alterar de esta forma la glucosilación del polipéptido. Dichas mutaciones pueden ser seleccionadas para introducir o eliminar uno o más sitios de glucosilación, tal como sitios de glucosilación enlazados-O o enlazados-N. Los sitios de reconocimiento de glucosilación enlazados con asparagina generalmente comprenden una secuencia de tripéptido, asparagina-X-treonina (o asparaginas-X-serina) (en donde "X" es cualquier aminoácido) que se reconoce en forma especifica mediante enzimas de glucosilación celulares adecuadas. La alteración puede elaborarse mediante la adición, o sustitución a través de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de polipéptido ActRlla tipo natural (para sitios de glucosilación enlazado-O). Una variedad de sustituciones o eliminaciones de aminoácidos en una o en ambas de las primeras o terceras posiciones de aminoácidos de un sitio de reconocimiento de glucosilación (y/o eliminación de aminoácido en la segunda posición) da como resultado la no glucosilación en la secuencia de tripéptido modificada. Otros medios para incrementar el número de porciones de carbohidrato en un polipéptido ActRlla, es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidas al polipéptido ActRlla. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar(s) puede ser adherido a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfihidrilos libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptofan; o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en la Publicación de Aplin y Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306, incorporadas a la presente invención como referencia. La eliminación de una o más porciones de carbohidrato presentes en un polipéptido ActRlla, pueden lograrse en forma química o enzimática. La desglucosilación química puede implicar, por ejemplo, exposición del polipéptido ActRlla al compuesto de ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. El tratamiento da como resultado la disociación de la mayor parte de todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando al mismo tiempo la secuencia de aminoácido. La desglucosilación química se describe en forma adicional en la Publicación de Hakimuddin y asociados, (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y de Edge y asociados, (1981) Anal. Biochem. 118:131. La disociación enzimáticas de porciones de carbohidrato en polipéptidos ActRllas puede lograrse a través del uso de una variedad de exo y endo glucosidasas tal como se describe en la Publicación de Thotakura y asociados, (1987) Meth. Enzymol. 138:350. La secuencia de un polipéptido ActRlla puede ser ajustada, según sea lo adecuado, dependiendo del tipo de sistema de expresión utilizado, tal como células de mamífero, levadura, insecto y plantas que pueden introducir todas patrones de glucosilación diferentes que pueden ser afectados por la secuencia de aminoácido del péptido. En general, las proteínas ActRlla para uso en humanos será expresada en una línea celular de mamífero que proporciona glucosilación adecuada, tal como líneas de células HEK293 o CHO, aunque se espera que también sean útiles otras líneas celulares de expresión en mamíferos, líneas celulares de levadura con enzimas de glucosilación construidas y células de insecto. La descripción comprende además un método para generar mutantes, particularmente grupos de mutantes de combinación de un polipéptido ActRlla, así como mutantes de truncado; grupos de mutantes de combinación son especialmente útiles para identificar secuencias variantes funcionales. El propósito de clasificar dichas bibliotecas de combinación puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipéptido ActRlla que pueden actuar ya sea como agonistas o antagonistas, o como alternativa que poseen actividades novedosas. Una variedad de ensayos de clasificación se proporciona más adelante. Dichos ensayos pueden ser utilizados para evaluar variantes. Por ejemplo, una variante de polipéptido ActRlla que puede ser clasificada por su capacidad de enlazar a un ligando ActRlla, para prevenir el enlace de un ligado ActRlla a un polipéptido ActRlla o interferir con la señalización originada por un ligando ActRlla. La actividad de un polipéptido ActRlla o sus variantes también puede ser probada en un ensayo in vivo o a base de células. Por ejemplo, el efecto de una variante de polipéptido ActRlla en la expresión de los genes implicada en la producción de huesos o destrucción de huesos, puede ser ensayado. Esto se puede llevar a cabo, según sea necesario, en la presencia de una o más proteínas de ligando ActRlla recombinantes (por ejemplo, activina), y las células pueden ser transfectadas para producir un polipéptido ActRlla y/o variantes del mismo, y opcionalmente un ligando ActRlla. De igual manera, se puede administrar un polipéptido ActRlla a un ratón u otro animal, y se pueden ensayar una o más propiedades de los huesos, tal como densidad o volumen. El rango de curación de fracturas de huesos también puede ser evaluado. La técnica de absortiometría de rayos X de energía doble (DEXA) es una técnica bien establecida, no invasiva y cuantitativa para evaluar la densidad ósea en un animal. En humanos los sistemas DEXA centrales pueden ser utilizados para evaluar la densidad ósea en la columna y pelvis. Estos son los mejores anticipadores de la densidad ósea general. Se pueden utilizar sistemas DEXA periféricos para evaluar la densidad ósea en huesos periféricos, incluyendo, por ejemplo, los huesos de las manos, cintura, muñecas y pies. Los sistemas de generación de imágenes con rayos X tradicionales, incluyendo escaneos CAT, se pueden utilizar para evaluar el crecimiento de huesos y curación de fracturas. También se puede evaluar la fuerza mecánica de los huesos. Se pueden generar variantes derivadas por combinación que tienen una potencia selectiva o generalmente incrementada con relación a un polipéptido ActRlla que ocurre naturalmente. De igual manera, la mutagénesis puede dar surgimiento a variantes que tienen vidas promedio intracelulares gramáticamente diferentes a las que corresponden a un polipéptido ActRlla tipo natural. Por ejemplo, la proteína alterada puede volverse ya sea más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que dan como resultado la destrucción de, o desactivación de otra forma del polipéptido ActRlla nativos. Dichos variantes, y los genes que las codifican, pueden ser utilizados para alterar los niveles de polipéptido ActRlla modelando la vida media de los polipéptidos ActRllas. Por ejemplo, una vida promedio corta puede dar surgimiento a más efectos biológicos temporales y puede permitir un control más estrecho de los niveles de polipéptido ActRlla recombinante dentro del paciente. En una proteína de fusión Fe, las mutaciones pueden elaborarse en el enlazador (si es que existe) y/o la parte Fe para alterar la vida promedio de la proteína. Se puede producir una biblioteca de combinación por medio de una biblioteca de generación de genes que codifican una biblioteca de polipéptidos los cuales incluyen cada uno al menos una parte de la secuencia de polipéptido ActRlla potenciales. Por ejemplo, se puede ligar en forma enzimática una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes, de modo que el grupo de degeneración de las secuencias de nucleótidos de polipéptido ActRlla potenciales se puedan expresar como polipéptidos individuales, o como alternativa, como un grupo de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo para despliegue de fagos). Existen muchas formas a través de las cuales se puede generar la biblioteca de homólogos potenciales de una secuencia de oligonucleótidos de degeneración. Se puede llevar a cabo la síntesis química de una secuencia de genes de generación en un sintetizador de ADN automático, y posteriormente los genes sintéticos pueden ser ligados en un vector adecuado para expresión. La síntesis de oligonucleótidos de degeneración es bien conocido en la técnica (ver por ejemplo las Publicaciones de Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y asociados, (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura y asociados, (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y asociados, (1984) Science 198:1056; Ike y asociados, (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Dichas técnicas han sido empleadas en la evolución directa de otras proteínas (ver, por ejemplo las Publicaciones de Scott y asociados, (1990) Science 249:386-390; Roberts y asociados, (1992) PNAS USA E.U.A. 89:2429-2433; Devlin y asociados, (1990) Science 249: 404-406; Cwirla y asociados, (1990) PNAS USA E.U.A. 87: 6378-6382; así como las Patentes Norteamericanas Nos. 5,223,409, 5,198,346, y 5,096,815). Como alternativa, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca de combinación. Por ejemplo, las variantes de polipéptido ActRlla pueden ser generadas o aisladas de una biblioteca mediante clasificación, utilizando por ejemplo, mutagénesis de exploración de alanina y similares (Ruf y asociados, (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang y asociados, (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint y asociados, (1993) Gene 137:109-118; Grodberg y asociados, (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima y asociados, (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman y asociados, (1991) Biochemistry 30:10832-10838; y Cunningham y asociados, (1989) Science 244:1081-1085), mediante mutagénesis de exploración con enlazador (Gustin y asociados, (1993) Virology 193:653-660; Brown y asociados, (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight y asociados, (1982) Science 232:316); mediante mutagénesis de saturación (Meyers y asociados, (1986) Science 232:613); mediante mutagénesis PCR (Leung y asociados, (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); o mediante mutagénesis aleatoria, incluyendo mutagénesis química, etc. (Miller y asociados, (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener y asociados, (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). La mutagénesis de exploración de enlazador, particularmente en una preparación de combinación, es un método atractivo para identificar formas truncadas (bioactiva) de los polipéptidos ActRllas. Se conocen un amplio rango de técnicas para clasificar productos de genes de bibliotecas de combinación elaboradas mediante mutaciones y truncaciones de punta, y por tal aspecto, para clasificar bibliotecas de cADN de productos genéticos que tienen una cierta propiedad. Dichas técnicas podrán ser adaptables de manera general para la clasificación rápida de bibliotecas de genes generadas a través de la mutagénesis de combinación de polipéptidos ActRllas. Las técnicas más ampliamente utilizadas para clasificar grandes bibliotecas de genes normalmente comprenden clonar la biblioteca de gen en vectores de expresión replicables, transformar células adecuadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresar los genes de combinación bajo condiciones en los cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Los ensayos preferidos incluyen ensayos de enlace de activina y ensayos de señalización de células transmitida por activina. En ciertas modalidades, los polipéptidos ActRllas de la presente invención pueden comprender además modificaciones post-trad ucción además de cualesquiera de las que se encuentran naturalmente en los polipéptidos ActRllas. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. Como resultado, los polipéptidos ActRllas modificados pueden contener elementos sin aminoácido, tales como polietilénglicoles, lípidos, poli o monosacáridos y fosfatos. Los efectos de dichos elementos sin aminoácidos en la funcionalidad del polipéptido ActRlla, se puede probar como se describe en la presente invención para otras variantes de polipéptido ActRlla. Cuando se produce un polipéptido ActRlla en células disociando una forma naciente del polipéptido ActRlla, también puede ser importante el procesamiento posttraducción para corregir el doblez y/o función de la proteína. Diferentes células (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) tienen una maquinaria celular y mecanismos característicos específicos de dichas actividades post-traducción y también pueden ser elegidos para asegurar la correcta modificación y procesamiento de los polipéptidos ActRllas. En ciertos aspectos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos ActRllas incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una parte de los polipéptidos ActRllas y uno o más dominios de fusión. Los ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a polihistidina, Glu-Glu, transferasa de glutationa S (GST), tioredoxin, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fe), proteína de enlace a maltosa (MBP), o albúmina de suero humano. Se puede seleccionar un dominio de fusión para conferir de esta forma una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para aislar las proteínas de fusión mediante cromatografía por afinidad. Para el propósito de purificación mediante afinidad, se utilizan matrices relevantes de cromatografía por afinidad, tal como resinas conjugadas con glutationa, amilasa-, y níquel o cobalto. Muchas de dichas matrices están disponibles en forma de "equipo", tal como sistema de purificación Pharmacia GST y el sistema QIAexpress™ (Qiagen) útil con patrones de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, se puede seleccionar un dominio de fusión para facilitar de esta forma la detección de polipéptidos ActRllas. Los ejemplos de dichos dominios de detección incluyen las diversas proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) así como "etiquetas de epítope" las cuales normalmente son secuencias de péptido cortas para las cuales está disponible el anticuerpo específico. Las etiquetas de epítope bien conocidas para dichos anticuerpos monoclonales específicos que están fácilmente disponibles incluyen FLAG, hemaglutinina de virus de influenza (HA), y etiquetas c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de disociación de proteasa, tal como Factor Xa o Trombina, permite que la proteína relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión, y liberen de esta forma las proteínas recombinantes derivadas. Las proteínas liberadas posteriormente pueden ser aisladas del dominio de fusión mediante separación cromatográfica subsecuente. En ciertas modalidades preferidas, un polipéptido ActRlla se fusiona con un dominio que estabiliza el polipéptido ActRlla in vivo (un dominio "estabilizar"). Por el término "estabilización" se entiende cualquier cosa que incremente la vida promedio en suero, sin importar si esto se debe a una destrucción disminuida, despeje disminuido por parte del riñon u otro efecto farmacocinético. Las fusiones con la parte Fe porción de una inmunoglobulina son conocidos por conferir propiedades farmacocinéticas deseables en un amplio rango de proteínas. De igual manera, las fusiones a albúmina de suero humano, pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusión que pueden ser seleccionados incluyen multimerización (por ejemplo, dimerización, tetramerización), de dominio y dominios funcionales (que confieren una función biológica adicional, tal como estimulación adicional de crecimiento óseo o de crecimiento de músculos, según se desee). Como un ejemplo específico, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular soluble de ActRlla fusionado a un dominio Fe (por ejemplo, SEQ ID NO: 6).

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD (A) VSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK (A) VSNKAL PVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHN (A) HYT QKSLSLSPGK* Opcionalmente, el dominio Fe tiene una o más mutaciones en los residuos tales como Asp-265, Usina 322, y Asn-434. En ciertos casos, el dominio Fe mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, mutación Asp-265) tiene una capacidad de enlace reducida al receptor Fcy con relación a un dominio Fe tipo natural. En otros casos, el dominio Fe mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, mutación Asn-434) ha incrementado la capacidad de enlazar al receptor Fe relacionado con MHC clase-I (FcRN) relativo a un dominio Fe tipo natural. Quedará entendido que se pueden ajustar diferentes elementos de las proteínas de fusión en cualquier formas que sea consistente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, se puede colocar un polipéptido ActRlla en el C-terminal a un dominio heterólogo, o como alternativa, se puede colocar un dominio heterólogo C-terminal a un polipéptido ActRlla. El dominio de polipéptido ActRlla y el dominio heterólogo no necesitan estar adyacentes en la proteína de fusión, y los dominios o secuencias de aminoácidos adicionales pueden incluirse C o N-terminal para cualquier dominio o entre los dominios. En ciertas modalidades, los polipéptidos ActRllas de la presente invención contienen una o más modificaciones que tienen la capacidad de estabilizar los polipéptidos ActRllas. Por ejemplo, dichas modificaciones aumentan la vida promedio in vitro de los polipéptidos ActRllas, aumentan la vida promedio en la circulación de los polipéptidos ActRllas o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos ActRllas. Dichas modificaciones de estabilización incluyen, pero no se limitan a, proteína de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un polipéptido ActRlla y un dominio), modificaciones de un sitio de glucosilacion (que incluyen, por ejemplo, la adición de un sitio de glucosilacion a un polipéptido ActRlla), y modificaciones de la porción de carbohidratos (que incluyen por ejemplo, la eliminación de las porciones de carbohidratos de un polipéptido ActRlla). En el caso de proteínas de fusión, se fusiona un polipéptido ActRlla a un dominio estabilizador tal como una molécula IgG (por ejemplo, un dominio Fe). Tal como se utiliza en la presente invención, el término "dominio estabilizador" no únicamente se refiere a un dominio de fusión (por ejemplo, Fe) que como en el caso de proteínas de fusión, sino también incluye modificaciones no proteinaceas tales como una porción de carbohidratos, o polímero no proteinaceo, tal como polietilénglicol. En ciertas modalidades, la presente invención elabora formas aisladas y/o purificadas disponibles de los polipéptidos ActRllas, los cuales están en forma aislada, o los deja sustancialmente libres de, otras proteínas. Los polipéptidos ActRllas generalmente serán producidos mediante expresión de ácidos nucleicos recombinantes. 3. Acidos Nucleicos que Codifican Polipéptidos ActRlla En ciertos aspectos, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualesquiera de los polipéptidos ActRllas (por ejemplo, polipéptidos ActRlla solubles), incluyendo fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión aquí descritas. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 4 codifica el polipéptido de precursor ActRlla humano que ocurre naturalmente, en tanto que SEQ ID NO: 5 codifica el dominio extracelular procesado de ActRlla. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser de hebra simple o hebra doble. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos pueden ser utilizados, por ejemplo, en métodos para elaborar polipéptidos ActRllas o en la forma de agentes terapéuticos (por ejemplo, en un método de terapia genética). En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos de la presente invención que codifican polipéptidos ActRllas, quedará entendido en formas adicional, que incluyen ácidos nucleicos que son variantes de SEQ ID NO: 4 ó 5. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias que difieren por uno o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, tal como variantes alélicas. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que son al menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEQ ID NO: 4 ó 5. Un experto en la técnica apreciará que las secuencias de ácido nucleico complementarias para SEQ ID NO: 4 ó 5, y la variante de SEQ ID NO: 4 ó 5 también están dentro de la presente invención. En modalidades adicionales, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser aisladas, recombinantes, y/o fusionadas con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una biblioteca de ADN. En otras modalidades, los ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones altamente estrictas para la secuencia de nucleótidos diseñada en SEQ ID NO: 4 ó 5, secuencia complemento de SEQ ID NO: 4 ó 5, o fragmentos de las mismas. Tal como se describió anteriormente, un experto en la técnica podrá comprender fácilmente que las condiciones con rigurosidad adecuada que pueden variar las condiciones de rigurosidad adecuada que promuevan la hibridación del AND. Un experto en la técnica comprenderá fácilmente que se pueden variar las condiciones de rigurosidad adecuadas que promueven la hibridación de AND. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio 6.0 x (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45°C, seguido de un lavado de 2.0 x SSC a una temperatura de 50°C. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede ser seleccionada de una baja rigurosidad de aproximadamente 2.0 x SSC a una temperatura de 50°C, hasta una alta rigurosidad de aproximadamente 0.2 x SSC a una temperatura de 50°C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede implementarse de condiciones de rigurosidad baja a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de alta rigurosidad a una temperatura de aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la sal pueden variar, o la concentración de temperatura y sal se puede mantener constante aunque cambie la otra variable. En una modalidad, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones de baja rigurosidad de 6 x SSC a temperatura ambiente seguido de un lavado en 2 x SSC a temperatura ambiente. Los ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos nucleicos establecidos en las SEQ ID NOs: 4 ó 5 debido a la degeneración en el código genético, también están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, se designa un número de aminoácidos a través de más de un tripleto. Los codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAL) y CAC son sinónimos para histidina) pueden dar como resultado mutaciones "silente" que no afecta las secuencias de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se esperas que los polimorfismos de la secuencia de AND que no conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas de la presente invención, existan entre las células de mamíferos. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie determinada debido a variación alélica natural. Cualesquiera y todas las variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes, están dentro del alcance de la presente invención. En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos recombinantes de la presente invención pueden enlazar en forma operable a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en una construcción de expresión. La secuencia de nucleótidos reguladoras generalmente serán adecuadas para la célula huésped utilizada para la expresión. Se conocen numerosos tipos de vectores de expresión adecuados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células huésped. Normalmente, dichas una o más secuencias de nucleótidos reveladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líder y de señal, sitios de enlace de ribosomas, secuencias de inicio, determinación de transcripción, secuencias de inicio o terminación de traducción y secuencias aumentadoras o activadoras. Los promotores constitutivos o inducidos conocidos en la técnica están contemplados en la presente invención. Los promotores pueden ser ya sea promotores que ocurren naturalmente, o promotores de híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Se puede encontrar una construcción de expresión en una célula en un episome, tal como un plásmido, o la construcción de expresión puede insertarse en un cromosoma. En una modalidad preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionado que permite la selección de células huésped transformadas. Los genes marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped utilizada. En ciertos aspectos de la presente invención, el ácido nucleico de la presente invención se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido ActRlla y que está enlazado en forma operable al menos a una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la técnica y se seleccionan para la expresión directa del polipéptido ActRlla. Por consiguiente, el término secuencia reguladora incluye promotores, aumentadores, y otros elementos de control de expresión. La secuencia reguladora de ejemplo se describen en la Publicación de Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se enlaza en forma operativa a las mismas, se pueden utilizar en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido ActRlla. Dichas secuencias de control de expresión útiles, incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos de SV40, promotor tet, promotor temprano inmediato de adenovirus y citomegalovirus, promotores RSV, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión está dirigida por la polimerasa de ARN 17, las regiones mayores operadoras y promotoras del fago lambda, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor de la cinasa 3-fosfoglicerato u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa de ácido, por ejemplo Pho5, los promotores de los factores de a-coincidencia con levadura, el promotor de polihedrón del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas por controlar expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas y sus viruses, y diversas combinaciones de los mismos. Deberá quedar entendido que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la lección de la célula huésped que será transformada y/o el tipo de proteína deseada que será expresada. Además, el número de copia del vector, la capacidad de controlar el número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores antibióticos, también deben tomarse en cuenta. Un ácido nucleico recombinante de la presente invención puede ser producido ligando el gen clonado, o una parte del mismo, en un vector adecuado para expresión en cualquier célula procariótica, células eucarióticas (levadura, aviar, insecto o mamífero), o ambas. Los vehículos de expresión para la producción de polipéptido ActRlla recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac, y plásmidos derivados de pUC, para la expresión en células procarióticas, tales como E. coli. Algunos vectores de expresión de mamíferos contienen ambas secuencias procarióticas para facilitar la preparación del vector en bacterias, y una o más unidades de transcripción eucariótica que son expresadas en células eucarióticas. Los vectores derivados de pcADNI/amp, pcADNI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos adecuados para transfección de células eucarióticas. Algunos de estos vectores son modificados con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, que facilitan la replica y selección resistente a fármacos en células tanto procarióticas y como eucarióticas. Como alternativa, los derivados de viruses tales como virus de papiloma de bovino (BPV-I), o virus Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) se pueden utilizar para la expresión temporal de proteína en células eucarióticas. Los ejemplos de otros sistemas de expresión viral (incluyendo retroviral) se pueden encontrar más adelante en la descripción de sistemas de suministro de terapia genética. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de los organismos huésped, son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucariótica, así como procedimientos recombinantes generales, ver la Publicación de Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3o Edición, editada por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos casos, puede ser recomendable expresar los polipéptidos recombinantes a través del uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUWI), y vectores derivados de pBlueBac (talcomo ß-gal que contiene pBlueBac III). En una modalidad preferida, el vector será diseñado para producir los polipéptidos ActRlla de la presente invención en células CHO, tales como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif . ), vectores pcADN4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Tal como se podrá apreciar, las construcciones genéticas de la presente invención se pueden utilizar para originar la expresión de los polipéptidos ActRllas de la presente invención en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión o proteínas variantes, para purificación. La presente descripción también pertenece a una célula huésped transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia de codificación (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 ó 5) de uno o más polipéptidos ActRllas de la presente invención. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido ActRlla de la presente invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (por ejemplo, utilizando un sistema de expresión de baculovirus), células de levadura o de mamífero. Otras células huésped adecuadas son conocidas para los expertos en la técnica. Por consiguiente, la presente invención pertenece además a métodos para producir los polipéptidos ActRllas de la presente invención. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido ActRlla puede ser cultivada bajo condiciones adecuadas que permiten que ocurra la expresión del polipéptido ActRlla. El polipéptido ActRlla puede ser secretado y aislado de una mezcla de células y medios que contienen el polipéptido ActRlla. Como alternativa, el polipéptido ActRlla puede ser retenido en forma citoplásmica o en una fracción de membrana y las células recolectadas, Usadas y la proteína aislada. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para cultivo celular son conocidos en la técnica. Los polipéptidos ActRllas de la presente invención pueden ser aislados de un medio de cultivo celular, células huésped o ambos, utilizando técnicas conocidas en el arte para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de filtración de gel, otra filtración, electroforesis, purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos de epitopes particulares de los polipéptidos ActRllas y purificación por afinidad con un agente que enlaza a un dominio fusionado al polipéptido ActRlla (por ejemplo, una columna de proteína A puede ser utilizada para purificar una fusión ActRlla-Fc). En una modalidad preferida, el polipéptido ActRlla es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación. En una modalidad preferida, se asegura la purificación a través de una serie de pasos de cromatografía de columna, que incluyen por ejemplo tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de sefarosa Q, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de intercambio de cationes. La purificación se puede completar con filtración viral e intercambio de amortiguador. Tal como se muestra en la presente invención, se purifica una proteína ActRlla-hFc a una pureza de >98% tal como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y >95% tal como se determina mediante SDS PAGE. Este nivel de pureza fue suficiente para lograr efectos deseables en huesos en ratones y un perfil de seguridad aceptable en ratones, ratas y primates no humanos.

En otra modalidad, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia del sitio de disociación de poli-(His)/enterocinasa en el N-término de la parte deseada del polipéptido ActRlla recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía por afinidad utilizando una resina de metal Ni2 + . La secuencia líder de purificación posteriormente puede ser eliminada mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido ActRlla purificado (por ejemplo, ver la Publicación de Hochuli y asociados, (1987) J Chromatography 411:177; y Janknecht y asociados, PNAS USA E.U.A. 88:8972). Las técnicas para elaborar genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptido, se lleva a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, que emplean términos para ligadura con extremo romo o con extremo escalonado, digestión de enzimas de restricción para proporcionar términos adecuados, relleno de extremos cohesivos según sea adecuado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones iniciales, y ligadura enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sinterizado mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de AND automáticos. Como alternativa, la amplificación PCR de los fragmentos de gen puede llevarse a cabo utilizando cebadores ancla que dan surgimiento a salientes complementarias entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden ser endurecidos subsecuentemente para generar una secuencia de gen quimérico (ver por ejemplo la Publicación de Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y asociados, John Wiley & Sons: 1992). 4. Antagonistas Alternativos de Activina y ActRlla Los datos presentados en la presente invención demuestran que los antagonistas de la señalización de activina-ActRlla para promover el crecimiento de huesos y mineralización ósea. Aunque los polipéptidos ActRlla solubles, y particularmente Actrlla-Fc, son antagonistas preferidos, y aunque dichos antagonistas pueden afectar los huesos a través de un mecanismo diferente al antagonismo activina (por ejemplo, inhibición de activina puede ser un indicador de la tendencia de un agente que inhibe las actividades de un espectro de moléculas, incluyendo posiblemente otros miembros de la superfamilia TGF-beta, y dicha inhibición colectiva puede conducir al efecto deseado en los huesos), se espera que otros tipos de antagonistas activina-ActRI la sean útiles, incluyendo anticuerpo anti-activina (por ejemplo, A, B, C o E), anticuerpos anti-ActRlla, anti-sentido, ARNi o ácidos nucleicos de ribozima que inhiben la producción de ActRlla y otros inhibidores de activina o ActRlla, particularmente los que interrumpen el enlace activina-ActRI la.

Un anticuerpo que es específicamente reactivo con un polipéptido ActRlla (por ejemplo, un polipéptido ActRlla soluble) y que ya sea enlaza en forma competitiva a un ligando con el polipéptido ActRlla o inhibe de otra forma la señalización transmitida por ActRlla puede ser utilizado como un antagonista de las actividades de polipéptido ActRlla. De igual manera, un anticuerpo que es específicamente reactivo con el polipéptido activina A y que interrumpe en enlace ActRlla se puede utilizar como un antagonista. Al utilizar inmunógenos derivados de un polipéptido ActRlla o un polipéptido de activina, se pueden elaborar anticuerpos de anti-suero o monoclonales anti-proteína/anti-péptido mediante protocolos estándar (ver por ejemplo la Publicación de Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lañe (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Harlow and Lañe (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o conejo se pueden inmunizar con una forma inmunogénica de polipéptido ActRlla, un fragmento antigénico que tiene la capacidad de provocar una respuesta de anticuerpos o una proteína de fusión. Las técnicas para conferir inmunogenicidad en una proteína o péptido incluyen conjugación a transportadores u otras técnicas conocidas en el arte. Una parte inmunogénica de un polipéptido ActRlla o activina puede administrarse en la presencia de un adyuvante. El progreso de inmunización puede ser monitoreado mediante la detección de tituladores de anticuerpo en plasma o suero. Se puede utilizar ensayos ELISA estándar u otros inmunoensayos con el inmunogen, como el antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos. Después de la inmunización del animal con una preparación antigénica de un polipéptido ActRlla, se pueden obtener antisueros, y si se desea, se pueden aislar anticuerpos policlonales a partir del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden recolectar células que producen anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos de fusión de célula somática estándar con células de inmortalización, tales como células de mieloma, para producir células de hibridoma. Dichas técnicas son conocidas en el arte, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma (originalmente desarrollada por Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbar y asociados, (1983) Immunology Today, 4: 72), y la técnica de hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé y asociados, (1985) Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Las células de hibridoma pueden ser clasificadas en forma inmunoquímica para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido ActRlla y anticuerpos monoclonales aislados de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente invención, pretende incluir fragmentos que también son específicamente reactivos con un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos clasificados por utilidad en la misma forma que se describió anteriormente para anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab)2 pueden ser generados tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante puede ser tratado para reducir los puentes de disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo de la presente invención está proyectado en forma adicional para incluir moléculas biespecíficas, de cadena simple, quiméricas, humanizadas y completamente humanas que tienen afinidad para un polipéptido ActRlla o activina conferido por al menos una región CDR del anticuerpo. Un anticuerpo puede comprender además una etiqueta debida al mismo y que tenga la capacidad de ser detectado (por ejemplo la etiqueta puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor de enzimas). En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante, cuyo término comprende cualquier anticuerpo generado mediante técnicas de biología molecular, incluyendo anticuerpos injertados con CDR o quiméricos, anticuerpos humanos u otros anticuerpos ensamblados procedentes de dominios de anticuerpos seleccionados con biblioteca, anticuerpos de cadena simple, y anticuerpos de dominio simple (por ejemplo proteínas VH humanas o proteínas VHH de camélido). En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal, y en ciertas modalidades, la presente invención deja disponibles métodos para generar anticuerpos novedosos. Por ejemplo, un método para generar un anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente a un polipéptido ActRlla o polipéptido activina, puede comprender administrar a un ratón una cantidad de una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de antígeno efectivo para estimular una respuesta inmune detectable, obteniendo células que producen que producen anticuerpos (células del bazo) procedente de ratones y fusionar las células que producen anticuerpos con células de mieloma para obtener hibridomas que producen anticuerpo, y probar los hibridomas que producen anticuerpos para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente al antígeno. Una vez obtenido, un hibridoma puede ser propagado en un cultivo celular, opcionalmente en condiciones de cultivo en donde las células derivadas de hibridoma producen el anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente al antígeno. El anticuerpo monoclonal puede ser purificado a partir del cultivo celular. El adjetivo "reactivo específicamente con" tal como se utiliza con referencia a un anticuerpo está proyectado para significar, tal como quedará entendido generalmente en la técnica, que el anticuerpo es lo suficientemente selectivo entre el antígeno de interés (por ejemplo, un polipéptido ActRlla) y otros antígenos que no son de interés ya que el anticuerpo es útil, como mínimo, para detectar la presencia del antígeno de interés en un tipo particular de muestra biológica. En ciertos métodos que emplean el anticuerpo, tal como aplicaciones terapéuticas, se puede desear un alto grado de especificidad en el enlace. Los anticuerpos monoclonales generalmente tienen una mayor tendencia (en comparación con anticuerpos policlonales) de discriminar en forma efectiva entre antígenos deseados y polipéptidos de reticulación. Una característica que influencia la especificidad de una interacción de anticuerpo: antígeno, es la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Aunque la especificidad deseada puede alcanzarse con un rango de diferentes afinidades, los anticuerpos generalmente preferidos tendrán una afinidad (una constante de disociación) de aproximadamente 10"6, 10"7, 10"8, 10"9 o menos. Debido al enlace extraordinariamente estrecho entre activina y ActRlla, se espera que un anticuerpo anti-activina o anti-ActRlla de neutralización generalmente pueda tener una constante de disociación de 10"10 o menos. Además, las técnicas utilizadas para clasificar anticuerpos con el objeto de identificar un anticuerpo deseable, pueden influenciar las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si un anticuerpo será utilizado para enlazar un antígeno en solución, puede ser deseable para probar el enlace de la solución. Una variedad de diferentes técnicas están disponibles para probar la interacción entre anticuerpos y antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Dichas técnicas incluyen ELISAs, ensayos de enlace de resonancia de plasmón de superficie (por ejemplo el ensayo de enlace Bioacore™, Biacore AB, Uppsala, Suecia), ensayos de emparedado (por ejemplo el sistema de cuentas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), manchados Western, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Los ejemplos de categorías de compuestos de ácido nucleico que son antagonistas de activina o ActRlla, incluyen ácidos nucleicos antisentido, construcciones ARNi y construcciones de ácido nucleico catalíticas. Un compuesto de ácido nucleico también puede ser de hebra simple o doble. Un compuesto de hebra doble también puede incluir regiones de salientes o de no complementariedad , en donde una o la otra de las hebras, es una hebra simple. Un compuesto con hebra simple puede incluir regiones de autocomplementariedad, lo que significa que el compuesto forma una estructura denominada "horquilla" o "lazo de tronco", con una región de estructura helicoidal doble. Un compuesto de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleotido que es complementaria a una región que consiste en no más de 1000, no más de 500, no más de 250, no más de 1000 o no más de 50, 35, 30, 25, 22, 20 ó 18 nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico ActRlla de longitud total o secuencia de ácido nucleico activina ß? o activina ß?. La región de complementariedad preferentemente tendrá al menos 8 nucleótidos, y opcionalmente al menos 10 o al menos 15 nucleótidos y opcionalmente entre 15 y 25 nucleótidos. Una región de complementariedad puede caer dentro de un intrón, una secuencia de codificación o una secuencia de no codificación de la transcripción objetivo, tal como la parte de secuencia de codificación. Generalmente, un compuesto de ácido nucleico tendrá una longitud de aproximadamente hasta aproximadamente 500 nucleótidos o pares base de longitud, y opcionalmente la longitud será de entre aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser un híbrido de ADN (particularmente para utilizarse como un antisentido) ARN o ARN: ADN. Cualquier hebra puede incluir una mezcla de ADN y ARN, así como formas modificadas que no pueden ser clasificadas fácilmente ya sea como ADN o ARN. De igual manera, un compuesto de hebra doble puede ser ADN: ADN, ADN:ARN o ARN:ARN, y cualquier hebra también puede incluir una mezcla de ADN y ARN, así como formas modificadas que no pueden ser clasificadas fácilmente ya sea como ADN o ARN. Un compuesto de ácido nucleico puede incluir cualquiera de una variedad de modificaciones, incluyendo una o más modificaciones para el esqueleto (la parte de azúcar-fosfato en un ácido nucleico natural, incluyendo ligaduras internucleótido) o la parte base (la parte de purina o pirimidina de un ácido nucleico natural). Un compuesto de ácido nucleico antisentido preferentemente tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos y con frecuencia contendrá una o más modificaciones para mejorar las características, tales como estabilidad en suero, en una célula o en un lugar en donde el compuesto probablemente sea administrado, tal como el estómago en el caso de compuestos administrados en forma oral y el pulmón para compuestos inhalados. En el caso de una construcción ARNi, la complementariedad de la hebra a la transcripción objetivo generalmente será el ARN o modificaciones del mismo. La otra hebra puede ser ARN, ADN o cualquier variación. La parte dúplex de la construcción de ARNi "de horquilla" de hebra doble o hebra simple tendrá preferentemente una longitud de 18 a 40 nucleótidos y opcionalmente de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos, siempre que sirva como un substrato Dicer. Los ácidos nucleicos catalíticos o enzimáticos pueden ser ribozimas o enzimas de ADN y también pueden contener formas modificadas. Los compuestos de ácido nucleico pueden inhibir la expresión del objetivo en aproximadamente 50%, 75%, 90% o más cuando se contactan con las células bajo condiciones fisiológicas de una concentración en donde un control sin sentido o de sentido tiene poco o nada de efecto. Las concentraciones preferidas para probar el efecto de los compuestos de ácido nucleico son 1, 5 y 10 micromolares. Los compuestos de ácido nucleico también pueden ser probados con respecto a los efectos, por ejemplo, en el crecimiento y mineralización ósea. 5. Ensayos de clasificación En ciertos aspectos, la presente invención se refiere al uso de polipéptidos ActRlla (por ejemplo polipéptidos ActRlla solubles) y polipéptidos de ActRlla para identificar compuestos (agentes) los cuales son agonistas o antagonistas de la trayectoria de señalización activina-ActRI la. Los compuestos identificados a través de esta clasificación pueden ser probados para evaluar su capacidad de modular el crecimiento o mineralización ósea in vitro. Opcionalmente, estos compuestos pueden ser probados en forma adicional en modelos animales para evaluar su capacidad para modular crecimiento de tejido in vivo. Existen numerosos métodos para clasificar agentes terapéuticos para modular el crecimiento de tejido, dirigiendo polipéptidos de activina y ActRlla. En ciertas modalidades, la clasificación de compuestos de alto rendimiento puede llevarse a cabo para identificar agentes que perturben efectos transmitidos por activina o ActRlla en los huesos. En ciertas modalidades, el ensayo se puede llevar a cabo para clasificar e identificar compuestos que inhiben o reducen en forma específica el enlace de un polipéptido ActRlla a activina. Como alternativa, el ensayo puede ser utilizado para identificar compuestos que mejoran el enlace del polipéptido ActRlla a activina. En una modalidad adicional, los compuestos pueden ser identificados por su capacidad de interactuar con un polipéptido de activina o ActRlla. Una variedad de formatos de ensayos serán suficientes, y a la luz de la presente descripción, no se describirán en forma expresa en la presente invención ya que serán completamente comprendidas por un experto en la técnica. Tal como se describe en la presente invención, los compuestos de prueba (agentes) de la presente invención pueden ser creados a través de cualquier método químico de combinación. Como alternativa, los compuestos de la presente invención pueden ser biomoléculas que ocurren naturalmente sintetizadas in vivo o in vitro. Los compuestos (agentes) que serán probados para su capacidad de actuar como moduladores de crecimiento de tejidos pueden ser producidos, por ejemplo, mediante bacterias, levaduras, plantas u otros organismos (por ejemplo productos naturales), producidos en forma química (por ejemplo moléculas pequeñas, incluyendo peptidomimético) o producidos en forma recombinante. Los compuestos de prueba contemplados en la presente invención incluyen moléculas orgánicas sin peptidilo, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácido nucleico. En una modalidad específica, el agente de prueba es una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular menor a aproximadamente 2,000 daltons. Los compuestos de prueba de la presente invención pueden ser proporcionados como entidades simples, independientes o proporcionados en bibliotecas de mayor complejidad, tal como elaboradas mediante química de combinación. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehidos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de compuestos de prueba para el sistema de prueba puede ser ya sea en una forma aislada o como mezclas de compuestos, especialmente en pasos de clasificación inicial. Opcionalmente, los compuestos pueden ser derivados opcionalmente con otros compuestos y tienen grupos de derivación que facilitan el aislamiento de los mismos. Los ejemplos sin limitación de grupos de derivación incluyen biotina, fluoresceína, desoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, polihistidina, cuentas magnéticas, transferasa de glutationa (GST), reticuladores fotoactivables o cualesquiera combinaciones de los mismos. En muchos programas de clasificación de fármacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento con el objeto de maximizar el número de compuestos estudiados durante un período de tiempo determinado. Los ensayos que se llevan a cabo en sistemas libres de células, tales como los que se pueden derivar con proteínas purificadas o semipurificadas, con frecuencia son preferidos como clasificadores "primarios" ya que pueden ser generados para permitir un desarrollo rápido y una detección relativamente fácil de una alteración en un objetivo molecular el cual es transmitido por un compuesto de prueba. Además, los efectos de toxicidad celular o biodisponibilidad del compuesto de prueba generalmente pueden ser ignorados en el sistema in vitro, el ensayo en lugar de estar enfocado principalmente en el efecto del fármaco en el objetivo molecular tal como se puede manifestar en una alteración de afinidad de enlace entre un polipéptido ActRlla y activina. Meramente como ilustración, en un ensayo de clasificación de ejemplo de la presente invención, el compuesto de interés se pone en contacto con un polipéptido ActRlla aislado y purificado el cual tiene la capacidad ordinariamente de enlazar a activina. A la mezcla del compuesto y el polipéptido ActRlla, posteriormente se le agrega una composición que contiene un ligando ActRlla. La detección y cuantificación de complejos ActRlla/activina proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto en la inhibición (o potenciación) de formación de complejos entre el polipéptido ActRlla y activina.

La eficacia del compuesto puede ser evaluada generando las curvas de respuesta de dosis de datos obtenidos utilizando varias concentraciones del compuesto de prueba. Además, también se puede llevar a cabo un ensayo de control para proporcionar una línea de base para comparación. Por ejemplo, en un ensayo de control, la activina aislada y purificada se agrega a una composición que contiene el polipéptido ActRlla, y la formación del complejo ActRI la/actvina se cuantifica en la ausencia del compuesto de prueba. Quedará entendido que, en general, el orden en el cual los reactivos pueden ser mezclados puede ser variado, y pueden mezclarse en forma simultánea. Además, en lugar de proteínas purificadas, se pueden utilizar extractos y lisados celulares para convertir un sistema de ensayo libre de células adecuado. La formación de complejos entre el polipéptido ActRlla y activina pueden ser detectados a través de una variedad de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos puede cuantificarse utilizando, por ejemplo, proteínas etiquetadas en forma detectable tales como radioetiquetadas (por ejemplo, 32P, 35S, 14C o 3H), etiquetadas en forma fluorescente (por ejemplo FITC) o polipéptido ActRlla o activina etiquetada en forma enzimática mediante inmunoensayo o mediante detección cromatográfíca. En ciertas modalidades, la presente invención contempla el uso de ensayos de polarización de fluorescencia y ensayos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en la medición, ya sea directa o indirectamente, del grado de interacción entre el polipéptido ActRlla y su proteína de enlace. Además, otros modos de detección, tales como los que se basan en guías de onda ópticas (Publicación PCT WO 96/26432 y Patente Norteamericana No. 5,677,196), resonancia de plasmón de superficie (SPR), sensores de carga de superficie y sensores de fuerza de superficie, son compatibles con muchas modalidades de la presente invención. Además, la presente invención contempla el uso de un ensayo de trampa de interacción, también conocido como "ensayo de dos híbridos" para identificar agentes que interrumpen o potencian la interacción entre un polipéptido ActRlla y su proteína de enlace. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 5,283,317; Zervos y asociados (1993) Cell 72:223-232; Madura y asociados (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel y asociados (1993) Biotechniques 14:920-924; y Iwabuchi y asociados (1993) Oncogene 8:1693-1696). En una modalidad específica, la presente invención contempla el uso de sistemas de dos híbridos inverso para identificar compuestos (por ejemplo moléculas y péptidos pequeños) que disocian interacciones entre un polipéptido ActRlla y su proteína de enlace. Ver por ejemplo las publicaciones de Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,525,490; 5,955,280; y 5,965,368. En ciertas modalidades, los compuestos de la presente invención son identificados por su capacidad de interactuar con un polipéptido de ActRlla o activina de la presente invención. La interacción entre el compuesto y el polipéptido de ActRlla o activina puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, dicha interacción puede identificarse en el nivel de proteína utilizando métodos bioquímicos in vitro, incluyendo fotoreticulación, enlace de ligandos radioetiquetados y cromatografía por afinidad (Jakoby WB y asociados, 1974, Methods in Enzymology 46: 1). En ciertos casos, los compuestos pueden ser clasificados en un ensayo a base de mecanismo, tal como un ensayo para detectar compuestos que enlazan a un polipéptido activina o ActRlla. Este ensayo puede incluir un evento de enlace de fase sólida o de fase líquida. Como alternativa, el gen que codifica un polipéptido de activina o ActRlla puede ser transfectado con un sistema reportero (por ejemplo ß-galactosidasa, luciferasa, o proteína fluorescente verde) en una célula y clasificado contra la biblioteca preferentemente a través de una clasificación de alto rendimiento o con miembros individuales de la biblioteca. Se pueden utilizar otros ensayos de enlace a base de mecanismo, por ejemplo, ensayos de enlace que detectan cambios en energía libre. Los ensayos de enlace pueden llevarse a cabo con el objetivo fijado a un depósito, cuenta o chip o capturados a través de un anticuerpo inmovilizado o resueltos mediante electroforesis capilar. Los compuestos enlazados pueden ser detectados normalmente utilizando resonancia de plasmón de superficie, o colorimétrica o de fluorescencia. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos y agentes para modular (estimular o inhibir) la formación ósea e incrementar la masa ósea. Por consiguiente, cualquier compuesto identificado puede ser probado en células o tejidos completos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad de modular el crecimiento o mineralización ósea. Varios métodos conocidos en la técnica pueden ser utilizados para este propósito. Por ejemplo, el efecto de los polipéptidos ActRlla o activina o compuestos de prueba en crecimiento óseo de cartílagos puede determinarse midiendo la inducción de Msx2 o diferenciación de células osteoprogenitoras en osteoblastos en ensayos a base de células (ver por ejemplo las publicaciones de Daluiski y asociados, Nat Genet. 2001, 27(l):84-8; Hiño y asociados, Front Biosci. 2004, 9:1520-9). Otro ejemplo de ensayos a base de células incluye analizar la actividad osteogénica de los polipéptidos ActRlla o activina de la presente invención y probar compuestos en células progenitoras mesenquimales y osteoblásticas. Como ilustración, los adenovirus y recombinantes que expresan un polipéptido activina o ActRlla pueden ser construidos para infectar células C3H10T1/2 progenitoras mesenquimales pluripotentes, células C2C12 preosteoblásticas y células TE-85 osteoblásticas. La actividad osteogénica posteriormente se determina midiendo la inducción de fosfatasa alcalina, osteocalcina y mineralización de matriz (ver por ejemplo la publicación de Cheng y asociados, J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8): 1544-52). La presente invención también contempla ensayos in vivo para medir crecimiento óseo y de cartílago (por ejemplo, Namkung-Matthai y asociados, Bone, 28:80-86 (2001) describe un modelo osteoporótico de rata en el cual se estudia la reparación ósea durante el período temprano posterior a una fractura. Kubo y asociados, Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999) también describe un modelo osteoporótico de rata en el cual se estudia la reparación ósea durante el periodo tardío después de una fractura. Andersson y asociados, J. Endocrinol. 170:529-537 describe un modelo de osteoporosis de ratón en el cual los ratones son ovariectomizados, lo cual origina que el ratón pierda el contenido mineral óseo substancial y la densidad mineral ósea, con el hueso trabecular perdiendo cerca del 50% de la densidad mineral ósea. La densidad ósea puede ser incrementada en los ratones ovariectomizados mediante la administración de factores tales como hormona paratiroides. En ciertos aspectos, la presente invención hace uso de ensayos de curación de fracturas que son conocidos en la técnica. Estos ensayos incluyen técnicas de fracturas, análisis histológicos y análisis biomecánicos los cuales se describen, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6,521,750, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia, por su descripción de protocolos experimentales para originar, así como medir, el grado de fracturas, y el proceso de reparación. 6. Usos terapéuticos de ejemplo En ciertas modalidades, los antagonistas activina-ActRlla (por ejemplo polipéptidos ActRlla) de la presente invención se pueden utilizar para tratar o prevenir una enfermedad o condición que está asociada con daño óseo, ya sea, por ejemplo a través de rompimiento, pérdida o desmineralización. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir daño óseo en un individuo que necesita de los mismos, a través de la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista activina-ActRlla, particularmente un polipéptido ActRlla. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona métodos para promover el crecimiento o mineralización ósea en un individuo que necesita del mismo, a través de la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista activina-ActRlla, particularmente un polipéptido ActRlla. Estos métodos se logran preferentemente en tratamientos terapéuticos y profilácticos de animales, y más preferentemente, humanos. En ciertas modalidades, la descripción proporciona el uso de antagonistas activina-ActRI la (particularmente polipéptidos ActRlla solubles y anticuerpos de neutralización dirigidos a activina o ActRlla) para el tratamiento de trastornos asociados con baja densidad ósea o resistencia de fuerzas disminuida. Tal como se utiliza en la presente invención, un terapéutico que "evita" un trastorno o condición se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce el surgimiento del trastorno o condición en la muestra tratada relativa a una muestra de control no tratada, o retrasa el desencadenamiento o reduce la severidad de uno o más síntomas del trastorno o condición relativo a la muestra de control no tratada. El término "tratar" tal como se utiliza en la presente invención, incluye profilaxis de las condiciones nombradas o disminución o eliminación de la condición una vez que se ha establecido. En cualquier caso, la prevención o tratamiento pueden ser diferenciadas en el diagnóstico proporcionado por un especialista y el resultado de la administración proyectada del agente terapéutico. La presente descripción proporciona métodos para inducir formación ósea y/o cartílagos, prevenir pérdida ósea, incrementar la mineralización ósea o evitar la desmineralización ósea. Por ejemplo, los agonistas activina-ActRlla de la presente invención tienen aplicación en el tratamiento de osteoporosis y la curación de fracturas óseas y defectos de cartílagos en humanos y otros humanos. Los polipéptidos ActRlla o activina pueden ser útiles en pacientes que están diagnosticados con baja densidad ósea subclínica, como una medida protectora contra el desarrollo de osteoporosis. En una modalidad específica, los métodos y composiciones de la presente invención pueden encontrar utilidad médica en la curación de fracturas óseas y defectos de cartílagos en humanos y otros animales. Los métodos y composiciones de la presente invención también pueden tener uso profiláctico en reducción de fracturas cerradas así como abiertas y también en la fijación mejorada de uniones artificiales. La formación ósea de novo inducida por un agente osteogénico, contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por trauma o inducidos por resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica cosmética. En ciertos casos, los antagonistas activina-ActRlla de la presente invención pueden proporcionar un ambiente para atraer las células que forman huesos, estimular el crecimiento de células que forman huesos o inducir la diferenciación de progenitores de células que forman huesos. Los antagonistas de activina-ActRlla de la presente invención, también pueden ser útiles en el tratamiento de osteoporosis. Los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser aplicados a condiciones caracterizadas por, o que originan pérdida ósea, tales como osteoporosis (incluyendo osteoporosis secundaria), hiperparatiroidismo, enfermedad de Cushin, enfermedad de Paget, tirotoxicosis, estado de diarrea crónica o mala absorción, acidosis tubular renal o anorexia nerviosa. La osteoporosis puede ser originada, o estar asociada con varios factores. Siendo mujeres, particularmente una mujer post-menopáusica, que tiene un peso corporal bajo, y que lleva a cabo un estilo sedentario, todos son factores de riesgo de osteoporosis (pérdida de densidad mineral ósea, que conduce a riesgo de fractura). Las personas que tienen cualesquiera de los siguientes perfiles, pueden ser candidatas a tratamiento con un antagonista ActRlla: mujeres post-menopáusicas y que no toman estrógenos u otra terapia de reemplazo hormonal; una persona con un historial personal o materno de fractura de cadera o fumadora; mujer post-menopáusica que es alta (de alrededor de 1.70 de estatura) o delgada (menos de 57 kg); un hombre con condiciones químicas asociadas con pérdida ósea; una persona que utiliza medicamentos que son conocidos por originar pérdida ósea, incluyendo corticoesteroides tales como Prednisone™, varios medicamentos anti-convulsiones tales como Dilantin™ y ciertos barbitúricos, o fármacos de reemplazo de tiroides en dosis altas; una persona que tenga diabetes tipo 1, enfermedad de hígado, enfermedad de riñon o historial familiar de osteoporosis; una persona que tenga un alto rendimiento de los huesos (colágeno excesivo en muestras urinarias); una persona con una condición de tiroides, tal como hipertiroidismo; una persona que haya experimentado una fractura después de un trauma leve; una persona que haya tenido evidencia con rayos X de fracturas en las vértebras u otros signos de osteoporosis. Tal como se observó anteriormente, la osteoporosis también puede dar como resultado una condición asociada con otro trastorno o por el uso de ciertos medicamentos. La osteoporosis que resulta de fármacos u otras condiciones médicas, es conocida como osteoporosis secundaria. En una condición conocida como enfermedad de Cushing, la cantidad excesiva de cortisol producido por el cuerpo da como resultado osteoporosis y fracturas. Los medicamentos más comunes asociados con osteoporosis secundaria son corticoesteroides, una clase de fármacos que actúan tipo cortisol, una hormona producida naturalmente por las glándulas suprarrenales. Aunque son necesarios niveles adecuados de hormonas de tiroides (las cuales son producidas por la glándula tiroides) para el desarrollo del esqueleto, el exceso de hormona de tiroides puede disminuir con el tiempo la masa ósea. Los antiácidos que contienen aluminio, pueden conducir a pérdida ósea cuando se toman en altas dosis, por personas con problemas renales, particularmente aquellos que pasan por diálisis. Otros medicamentos que pueden originar osteoporosis secundaria incluyen fenitoína (Dilantin) y barbitúricos que se utilizan para evita convulsiones; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), un fármaco para algunas formas de artritis, cáncer y trastornos inmune; ciclosporina (Sandimmune, Neoral), un fármaco utilizado para tratar ciertas enfermedades autoinmune y para suprimir el sistema inmune en pacientes con trasplante de órganos; agonistas de la hormona de liberación de hormona de luteinización (Lupron, Zoladex), que se utilizan para tratar cáncer de próstata y endometriosis; heparina (Calciparine, Liquaemin), un medicamento anticoagulación; y colestiramina (Questran) y colestipol (Colestid), utilizados para tratar el colesterol alto. La pérdida ósea que resulta de terapia de cáncer, es ampliamente reconocida y denominada pérdida de hueso inducida por terapia de cáncer (CTIBL). Las metástasis en huesos pueden crear cavidades en los huesos que pueden corregirse mediante el tratamiento con antagonistas ActRlla. En una modalidad preferida, los antagonistas activina-ActRlla, particularmente un ActRlla soluble, que se describen en la presente invención se pueden utilizar en pacientes con cáncer. Los pacientes que tienen ciertos tumores (por ejemplo próstata, seno, mieloma múltiple o cualquier tumor que origina hiperparatiroidismo) están en alto riesgo de pérdida ósea debido a la pérdida ósea inducida por el tumor, así como a metástasis en huesos y agentes terapéuticos. Dichos pacientes pueden ser tratados con antagonistas activina-ActRI la incluso en la ausencia de evidencia de pérdida ósea y metástasis en huesos. Los pacientes también pueden ser monitoreados con respecto a la evidencia de pérdida ósea o metástasis en los huesos, y pueden ser tratados con antagonistas activina-ActRlla en el caso en que los indicadores sugieran un riesgo incrementado. Generalmente, se emplean exploradores DEXA para evaluar los cambios en la densidad ósea, en tanto que los indicadores de la remodelación ósea pueden ser utilizados para evaluar la probabilidad de metástasis en los huesos. Se pueden monitorear los marcadores de suero. La fosfatasa alcalina específica ósea (BSAP) es una enzima que se presenta en osteoblastos. Los niveles de sangre de BSAP se incrementan en pacientes con metástasis óseas y otras condiciones que dan como resultado una remodelación ósea incrementada. La osteocalcina y péptidos de procolágeno también están asociados con formación ósea y metástasis ósea. Los incrementos en BSAP han sido detectados en pacientes con metástasis en huesos originadas por cáncer de próstata, y en un menor grado, en metástasis óseas procedentes de cáncer de seno. Los niveles de proteína-7 morfogenética ósea (BMP-7) son altos en cáncer de próstata, la cual ha hecho metástasis a los huesos, pero no en metástasis ósea debido a cáncer en vejiga, piel, hígado o pulmón. El telopéptido carboxi-terminal tipo I (ICTP) es una reticulación encontrada en el colágeno que se forma durante la reabsorción ósea. Ya que los huesos están rompiéndose y reformándose constantemente, ICTP se encontrará en todo el cuerpo. Sin embargo, en el sitio de la metástasis de hueso, el nivel será significativamente mayor que en un área ósea normal. Se ha encontrado ICTP en altos niveles en metástasis ósea debido a cáncer de próstata, pulmón y seno. Otro telopéptido N-terminal tipo I, de reticulación de colágeno (NTx) se produce junto con ICTP durante el rendimiento de los huesos. La cantidad de NTx se incrementa en metástasis ósea originada por muchos diferentes tipos de cáncer, incluyendo, pulmón, próstata, y seno. Asimismo, los niveles de NTx incrementan con el progreso de la metástasis ósea. Por consiguiente, este marcador puede ser utilizado tanto para detectar metástasis como para medir el grado de la enfermedad. Otros marcadores de reabsorción incluyen piridinolina y desoxipiridinolina. Cualquier incremento en marcadores de reabsorción o marcadores de metástasis en huesos indican la necesidad de una terapia con el antagonista activina-ActRI la en un paciente. Los antagonistas activina-ActRI la pueden ser administrados en conjunto con otros agentes farmacéuticos. La administración en conjunto puede lograrse mediante la administración de una co-formulación simple, mediante administración simultánea o mediante administración en momentos separados. Los antagonistas activina-ActRlla pueden ser particularmente convenientes y se administran con otros agentes activos-hueso. Un paciente puede beneficiarse de la recepción en conjunto del antagonista activina-ActRI la e ingiriendo suplementos de calcio, vitamina D, ejercicio adecuado y/o en algunos casos, otros medicamentos. Los ejemplos de otros medicamentos incluyen, bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos, hormona de paratiroides y raloxifeno. Los bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos y raloxifeno, afectan el ciclo de remodelación ósea y se clasifican como medicamentos anti-reabsorción. La remodelación ósea consiste en dos distintas etapas: reabsorción ósea y formación ósea. Los medicamentos anti-absorción hacen más lenta o detienen la parte de reabsorción ósea del ciclo de remodelación ósea, pero no hacen lenta la parte de formación ósea del ciclo. Como resultado, la nueva formación continúa en un mayor rango que la reabsorción ósea, y la densidad ósea puede incrementar con el tiempo. La tireparatida, una forma de hormona de paratiroides, incrementa el rango de formación ósea en el ciclo de remodelación ósea. El alendronato está aprobado tanto para la prevención (5 mg por día o 35 mg una vez a la semana) como para tratamiento (10 mg por día o 70 mg una vez a la semana) de osteoporosis post-menopáusica. El alendronato reduce la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas en la columna, cintura y cadera. El alendronato también está aprobado para el tratamiento de osteoporosis inducida por glucocorticoides en hombres y mujeres, como resultado de uso prolongado de medicamentos (es decir prednisona y cortisona) y para el tratamiento de osteoporosis en hombres. Al alendronato más vitamina D está aprobado para el tratamiento de osteoporosis en mujeres post-menopáusicas (70 mg una vez a la semana más vitamina D) y para tratamiento para mejorar la masa ósea en hombres con osteoporosis. El ibandronato está aprobado para la prevención y tratamiento de osteoporosis post-menopáusica. Tomado una pildora una vez al mes (150 mg) el ibandronato debe ser tomado el mismo día cada mes. El ibandronato reduce la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas en la columna. El risedronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de osteoporosis post-menopáusica. Tomado diariamente (dosis 5 mg) o semanalmente (dosis de 35 mg o dosis de 35 mg con calcio), el risendronato disminuye la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas en la columna y no columna. El risedronato también está aprobado para ser utilizados por hombres y mujeres para evitar y/o tratar osteoporosis inducida por glucocorticoides que resulta del uso prolongado de estos medicamentos (es decir prednisona o cortisona). La calcitonina es una hormona que ocurre naturalmente implicada en la regulación de calcio y metabolismo óseo. En mujeres que tienen más de 5 años de menopausia, la calcitonina hace lenta la pérdida ósea, incrementa la densidad de hueso de la columna y puede liberar el dolor asociado con fracturas óseas. La calcitonina reduce el riesgo de fracturas en la columna. La calcitonina está disponible como una inyección (50-100 IU diariamente) o región nasal (200 IU diariamente). La terapia de estrógenos (ET)/terapia de hormonas (HT) está aprobada para la prevención de osteoporosis. ET ha mostrado reduce la pérdida ósea, incrementar la densidad ósea tanto en la columna como en la cadera y reducir el riesgo de fracturas de la columna y cadera en mujeres post-menopáusicas. ET se administra más comúnmente en la forma de una pildora o parche en la piel que suministra una dosis baja de aproximadamente 0.3 mg al día o una dosis estándar de aproximadamente 0.625 mg al día y es efectiva incluso cuando se comienza después de los 70 años de edad. Cuando los estrógenos se toman solos, pueden incrementar el riesgo de una mujer de desarrollar cáncer del revestimiento uterino (cáncer endometrial). Para eliminar este riesgo, el especialista prescribe la hormona progestina en combinación con estrógenos (terapia de reemplazo hormonal o HT) para aquellas mujeres que tienen un útero intacto. ET/HT libera los síntomas de la menopausia y ha mostrado tener un efecto benéfico en la salud de los huesos. Los efectos secundarios pueden incluir sangrado vaginal, tensión en los senos, perturbaciones de humor y enfermedad de la vesícula. El raloxifeno, 60 mg al día, está aprobado para prevención y tratamiento de osteoporosis post-menopáusica. Proviene de una clase de fármacos denominados Moduladores de Receptor de Estrógeno Selectivo (SERMs) que han sido desarrollados para proporcionar los efectos benéficos de los estrógenos, sin sus desventajas potenciales. El raloxifeno incrementa la masa ósea y reduce el riesgo de fracturas en la columna. Aún no están disponibles los datos que demuestran que el raloxifeno puede reducir el riesgo de fracturas en la cadera y otras partes que no son la columna. La teriparatida, una forma de hormona de paratiroides, está aprobada para el tratamiento de osteoporosis en mujeres post-menopáusicas y hombres, quienes están en riesgo de una fractura. Este medicamento estimula la formación ósea nuevos e incrementa en forma significativa la densidad mineral de los huesos. En mujeres postmenopáusicas, se observó una reducción de fracturas en la columna, cadera, pies, costillas y cintura. En hombres, se observó una reducción de fracturas en la columna, aunque no hubo datos suficientes para evaluar la reducción de fracturas en otros sitios. La teriparatida se autoadministra como una inyección diaria durante hasta 24 meses. 7. Composiciones farmacéuticas En ciertas modalidades, los antagonistas activina-ActRlla (por ejemplo polipéptidos ActRlla) de la presente invención se formulan con un transportador farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido de ActRlla solo o como un componente de una formulación farmacéutica (composición terapéutica). Los compuestos de la presente invención se pueden formular para administración en cualquier forma conveniente para ser utilizados en medicina humana o veterinaria. En ciertas modalidades, el método terapéutico de la presente invención incluye administrar la composición en forma sistémica, o en forma local como un implante o aparato. Cuando se administra, la composición terapéutica para utilizarse en la presente invención, por supuesto está en una forma libre de pirógenos, fisiológicamente aceptable. Los agentes terapéuticamente útiles además de los antagonistas ActRlla que también pueden ser incluidos opcionalmente en las composiciones tal como se describieron anteriormente, pueden administrarse en forma simultánea o en secuencias con los compuestos de la presente invención (por ejemplo polipéptidos ActRlla) en los métodos de la presente invención. Normalmente, los antagonistas ActRlla serán administrados en forma parenteral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender uno o más polipéptidos ActRlla en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosos o no acuosas isotónicas, estériles o polvos estériles farmacéuticamente aceptables que pueden ser reconstituidos en soluciones o dispersiones estériles inyectables justo antes de su uso, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos, solutos que hacen isotónica la formulación con la sangre del receptor proyectado o agentes de suspensión o engrosamiento. Los ejemplos de transportadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilénglicol, polietilénglicol, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, a través del uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, o a través de uso de tensoactivos. Además, la composición puede ser encapsulada o inyectada en una forma para suministrar a un sitio de tejido objetivo (por ejemplo hueso). En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención pueden incluir una matriz con la capacidad de suministrar uno o más compuestos terapéuticos (por ejemplo polipéptidos ActRlla) proporcionando una estructura para desarrollar tejido y con una capacidad óptima de ser reabsorbida en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar la liberación lenta de los polipéptidos ActRlla. Dichas matrices pueden ser formadas de materiales que se encuentran actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas. La elección del material de matriz se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades de interfase. La aplicación particular de las composiciones de la presente invención, definirá la formulación adecuada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, tricalciofosfato, hidroxiapatita, ácido poliláctico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tales como colágeno ósea o dérmico. Las matrices adicionales están comprendidas de proteínas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y químicamente definidas, tales como hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden estar comprendidas de combinaciones de cualesquiera de los tipos de material antes mencionados, tal como ácido poliláctico e hidroxiapatita y colágeno y tricalcio fosfato. Las biocerámicas pueden ser alteradas en su composición, tal como en calcio-aluminato-fosfato y en procesamiento para alterar el tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de partícula y biodegradabilidad. En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser administrados en forma oral, por ejemplo, en la forma de cápsula, sobres, pildoras, tabletas, pastillas (utilizando una base con sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos o como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, como un elíxir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o, enjuagues bucales y similares, que contienen cada uno una cantidad predeterminada de un agente en la forma de un ingrediente activo. Un agente también puede ser administrado como un bolo, remedio o pasta. En formas de dosificación sólida para administración oral (cápsulas, tabletas, pildoras, grageas, polvos, gránulos y similares), se pueden mezclar uno o más compuestos terapéuticos de la presente invención con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o cualesquiera de los siguientes: (1) rellenadores o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) enlazadores tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes tales como glicerol; (4) agentes de desintegración tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes de retardo de la solución, tales como parafina; (6) aceleradores de absorción tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes de humectación, tales como por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorsores tales como arcilla de caolina y bentonita; (9) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilénglicoles sólidos, sulfato laurilo de sodio, y mezclas de los mismos; y (10) agentes de coloración. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de amortiguación. Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden ser empleadas como rellenadores en cápsulas de gelatina con relleno suave y duro que utilizan excipientes tales como lactosa o azúcares de leche, así como polietilénglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación líquida para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas de dosificación líquida pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como agua u otros solventes, agentes de solubilización y emulsificantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular semilla de algodón, nuez, maíz, germen, olivo, castor y de ajonjolí), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilénglicoles y éster de sorbitano de ácido graso y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes de humectación, agentes de emulsificación y suspensión, agentes de saborización, coloración, perfumado y conservadores. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ásteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto y mezclas de los mismos. Las composiciones de la presente invención también contienen adyuvantes, tales como conservadores, agentes de humectación, agentes de emulsificación y agentes de dispersión. La prevención de la acción de microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser recomendable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable puede llevarse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Quedará entendido que el régimen de dosificación será determinado por el médico especialista, considerando varios factores que modifican la acción de los compuestos de la presente invención (por ejemplo polipéptidos ActRlla). Diversos factores incluyen, pero no se limitan a, cantidad que se desea formar en el peso de los huesos, el grado de pérdida de ansiedad ósea, el sitio de daño a los huesos, la condición del hueso dañado, la edad, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier enfermedad que pueda contribuir a la pérdida ósea, tiempo de administración y otros factores químicos. Opcionalmente, la dosis puede variar con el tipo de matriz utilizada en la reconstitución y los tipos de compuestos en la composición. La adición de otros factores de crecimiento conocidos a la composición final, también puede afectar la dosificación. El progreso puede ser monitoreado mediante evaluación periódica de crecimiento y/o reparación ósea, por ejemplo, rayos X (incluyendo DEXA), determinaciones histomorfométricas y etiquetación con tetraciclina. Los experimentos con ratones han demostrado que los efectos de ActRlla en hueso son detectables cuando el compuesto es dosificado en intervalos y cantidades suficientes para lograr concentraciones de suero de 0.2 pg/kg o más, y niveles de suero de 1 pg/kg o 2 pg/kg o más se desean para lograr efectos significativos en densidad y resistencia ósea. Aunque no existe indicación de que dosis mayores de ActRlla-Fc no sean recomendables debido a sus efectos secundarios, los regímenes de dosificación pueden ser diseñados para alcanzar concentraciones de suero de entre 0.2 y 15 pg/kg, y opcionalmente entre 1 y 5 g/kg. En humanos, los niveles de suero de 0.2 pg/kg pueden lograrse con una sola dosis de 0.1 mg/kg o más y los niveles de suero de 1 Mg/kg pueden lograrse con una sola dosis de 0.3 mg/kg. La vida promedio de suero observada de la molécula, es entre aproximadamente 20 y 30 días, substancialmente más larga que la mayor parte de las proteínas de fusión Fe, y por lo tanto se puede lograr un nivel de suero efectivo sostenido, por ejemplo, dosificando con 0.2-0.4 mg/kg en una base semanal o bisemanal, o se pueden utilizar dosis mayores con intervalos más largos entre las dosificaciones. Por ejemplo, las dosis de 1-3 mg/kg pueden ser utilizadas en una base mensual o bimestral, y el efecto en los huesos puede ser lo suficientemente durable para que la dosis sea necesaria únicamente una vez cada 3, 4, 5, 6, 9, 12 ó más meses. En ciertas modalidades, la presente invención también proporciona terapia genética para la producción in vivo de polipéptidos ActRlla. Dicha terapia puede lograr su efecto terapéutico mediante la introducción de secuencias de polinucleótido ActRlla en células o tejidos que tienen los trastornos descritos anteriormente. El suministro de secuencias de polinucleótido ActRlla puede lograrse utilizando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Se prefiere el uso de liposomas dirigidos para el suministro terapéutico de las secuencias de polinucleótido ActRlla. Se pueden utilizar varios vectores virales para terapia genética tal como se enseña en la presente invención, que incluyen adenovirus, virus de herpes, vacunas o preferentemente un virus de ARN tal como un retrovirus. Preferentemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus de murido o aviar. Los ejemplos de vectores retrovirales en los cuales se puede insertar un gen externo simple, incluyen pero no se limitan a: virus de leucemia de murido Moloney (MoMuL ), virus de sarcoma de murido Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario de murido (MuMTV) y virus de sarcoma de Rous (RSV). Un número de vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable, de modo que las células transducidas puedan ser identificadas y generadas. Los vectores retrovirales pueden ser elaborados específicos de la dirección, adhiriendo, por ejemplo, un azúcar, un glucolípido o una proteína. La dirección preferida se logra utilizando un anticuerpo. Los expertos en la técnica reconocerán que las secuencias de polinucleótido específicas pueden ser insertadas en el genoma retroviral o adheridas a una envoltura viral que permite el suministro específico objetivo del vector retroviral que contiene el polinucleótido ActRlla. En una modalidad preferida, el vector es dirigido a huesos o cartílagos.

Como alternativa, las células de cultivo de tejido pueden ser transfectadas directamente con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovirales el gag, pol y env, a través de transfección de fosfato de calcio convencional. Estas células posteriormente son transfectadas con el plásmido de vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo. Otro sistema de suministro dirigido para polinucleótidos ActRlla es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, cuentas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. El sistema coloidal preferido de la presente invención es una liposoma. Las liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. El ARN, ADN y viriones intactos pueden ser encapsulados dentro del interior acuoso y ser suministrados a las células en una forma biológicamente activa (ver por ejemplo la publicación de Fraley, y asociados, Trends Biochem. ScL, 6:77, 1981). Los métodos para transferencia genética eficiente utilizando una vesícula de liposoma, son conocidos en la técnica, ver por ejemplo la publicación de Mannino, y asociados, Biotechniques, 6:682, 1988. La composición de los liposomas normalmente es una combinación de fosfolípidos, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. Otros fosfolípidos u otros lípidos también pueden ser utilizados. Las características específicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los ejemplos de lípidos útiles en producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrosidas y gangliosidas. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y disteroilfosfatidilcolina. La dirección de liposomas también es posible con base o, por ejemplo, en la especificidad del órgano, especificidad de célula y especificidad de organelo, y es conocida en la técnica. Ejemplif icación La presente invención que ha sido descrito hasta ahora de manera general, podrá ser mejor comprendida haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen meramente con los propósitos de ilustración de ciertas modalidades y modalidades de la presente invención, y no pretenden limitar la misma. Ejemplo 1: proteínas de fusión ActRlla-Fc Los solicitantes construyeron una proteína de fusión ActRlla soluble que tiene el dominio extracelular de ActRlla fusionado a un dominio Fe de humano o ratón con un enlazador mínimo entre ellos. Las construcciones son referidas como ActRlla-Fc y ActRlla-mFc, respectivamente. ActRlla-Fc se muestra a continuación como purificada de líneas de célula CHO (SEQ ID NO: 7): I LGRSETQECLFFN AN WEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWK NISGSI EIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSY FPEMEV TQPTSN PVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVH N AKTKPREEQYNSTYR VVS VLTVL HQDWLNGKEYKCKVSN KALPVPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK Las proteínas ActRlla-hFc y ActRlla-mFc fueron expresadas en líneas de célula CHO. Se consideraron tres diferentes secuencias líder. (i) Melitina de miel de abeja (HBML): MKFLVN VALVFM VVYISYI YA (SEQ ID NO: 8) (ii) Activador de plasminogen de tejido (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9) (iii) Nativo: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10). La forma seleccionada emplea el líder TPA y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos no procesada: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAI LGRSETQECLFFN AN WEKD RTNQT GVEPCYGDKDKRRHCFATWK ISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTD CVEKKD SPEVYFCCCEG MCN EKFSYFPEMEVTQPTSN PVTPKPPTGGGTH TCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFN W YVDGVE VH AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PVPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13) Este polipéptido es codificado a través de la siguiente secuencia de ácido nucleico: ATGG ATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTG TGGAG CAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAG ATC AGAA ACTCAG GAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGG AAAAAG ACAGAACCAATC AAAC TGGTGTTGAACCGTGTTATGGTG ACAAAGATAAACGGCGGCATT GTTTTG CTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAAC AAGG TTGTT GGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAA AAAAA AG ACAGCCCTG AAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGT GTAATG AAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGG AAGTCACACAGCCC ACTT CAAAT CCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATG CCCAC CGTGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTC AGTCTTCCT CTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGG ACCCCTGAGGT CACAT GCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTG GTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAG ACAAAGCCG CGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACC GTCCTG CACCAGG ACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACA AAGCCCTCCCAGTCCCCATCG AGAAAACCATCTCCAAAGCC AAA GGGCA GCCCCG AGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAG GAGATG ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCA GCG ACATCGCCGTGGAGTGGG AG AGCAATGGGCAGCCGG AG AA CAACT ACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTAT AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG TCTTCT CATGCTCCGTG ATGCATG AGGCTCTGCAC AACC ACTAC ACGC AG AAGAG CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAG AATTC (SEQ ID NO: 14) Tanto ActRlla-hFc como ActRlla-mFc fueron remarcadamente adaptables para expresión recombinante. Tal como se muestra en la figura 1, la proteína fue purificada como un pico de proteína simple, bien definido. La secuencia N-terminal, reveló una sola secuencia de ILGRSTQE (SEQ ID NO: 11). La purificación se puede lograr a través de una serie de pasos de cromatografía de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de sefarosa Q, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio de cationes. La purificación puede completarse con filtración viral e intercambio de amortiguador. La proteína ActRlla-hFc fue purificada a una pureza de >98% tal como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y >95% tal como se determina mediante SDS PAGE. ActRlla-hFc y ActRlla-mFc mostraron una alta afinidad para ligandos, particularmente activina A. GFD-11 o Activina A ("ActA") fueron inmovilizadas en un chip Biacore CM5 utilizando un procedimiento de acoplamiento de amina estándar. Las proteínas ActRlla-hFc y ActRlla-mFc fueron cargadas en el sistema, y se midió el enlace. ActRlla-hFc se enlazó a activina con una constante de disociación (KD) de 5x10"12, y la proteína enlazó a GDF11 con un KD de 9.96x10"9. Ver figura 2. ActRlla-mFc se comportó de manera similar. Se utilizó un ensayo de gen reportero A-204 para evaluar los efectos de proteínas ActRlla-hFc en señalización mediante GDF-11 y Activina A. Línea celular: Rabdomiosarcoma Humano (derivado de músculo). Vector reportero: pGL3(CAGA)12 (Descrito en la publicación de Dennler y asociados, 1998, EMBO 17: 3091-3100). Ver figura 3. El motivo CAGA12 está presente en genes que responden a TGF-Beta (gen PAI-I) de modo que este vector es de uso general para factores de señalización a través de Smad2 y 3. Día 1: células de división A-204 en placas de 48 depósitos. Días 2: células A-204 transfectadas con 10 pg pGL3(CAGA)12 o pGL3(CAGA)12 (10 pg) + pRLCMV (1 pg) y Fugene. Día 3: Agregar factores (diluidos en el medio + 0.1 % BSA). Los inhibidores necesitan ser preincubados con factores durante 1 hora antes de agregarse a las células. 6 horas después, las células se enjuagaron con PBS y se Usaron las células. Esto estuvo seguido de un ensayo de Luciferasa.

Normalmente en este ensayo, en la ausencia de cualesquiera inhibidores, la Activina a muestra una estimulación rigurosamente de 10 veces de la expresión del gen reportero y un ED50 ~ 2 ng/ml. GDF-11: estimulación de 16 veces, ED50: ~ 1.5 ng/ml. GDF-8 muestra un efecto similar para GDF-11. Tal como se muestra en la figura 4, ActRlla-hFc y ActRlla-mFc inhiben la señalización transmitida por GDF-8 en concentraciones picomolares. Tal como se muestra en la figura 5, Tres diferentes preparaciones de ActRlla-hFc inhibieron la señalización de GDF-11 con un IC50 de aproximadamente 200 pM. El ActRlla-hFc fue muy estable en estudios farmacocinéticos. Las ratas fueron dosificadas con 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg de proteína ActRlla-hFc y los niveles de plasma de la proteína fueron medidos en 24, 48, 72, 144 y 168 horas. En estudio separado, las ratas fueron dosificadas en 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg. En ratas, ActRlla-hFc tuvo una vida promedio de suero de 11 a 14 días y los niveles de circulación del fármaco fueron muy altos después de dos semanas (11 pg/ml, 110 pg/ml o 304 pg/ml para administraciones iniciales de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg, respectivamente). En monos cinomolgus, la vida promedio de plasma fue substancialmente mayor a 14 días, y los niveles de circulación del fármaco fueron de 25 pg/ml, 304 pg/ml o 1440 pg/ml para administraciones iniciales de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg, respectivamente. Los resultados preliminares en humanos sugieren que la vida promedio en suero es de entre aproximadamente 20 y 30 días. Ejemplo 2: ActRlla-mFc promueve el crecimiento óseo in vivo Se dosificaron ratones hembra normales (BALB/c) con ActRlla-mFc en un nivel de 1 mg/kg/dosis, 3 mg/kg/dosis o 10 mg/kg/dosis, con dosis proporcionadas dos veces a la semana.

Se determinó la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo mediante DEXA, ver figura 6. En ratones hembra BALB/c, las exploraciones DEXA mostraron un incremento significativo (>20%) en la densidad y contenido mineral óseo como un resultado del tratamiento ActRlla-mFc. Ver figuras 7 y 8. Por lo tanto, el antagonismo de ActRlla originó una densidad y contenido óseo incrementado en ratones hembra normales. Como un siguiente paso, se probó el efecto de ActRlla-mFc en huesos en un modelo de ratón de osteoporosis. Andersson y asociados (2001), estableció que ratones ovariectomizados sufrieron de una pérdida ósea substancial (una pérdida rigurosa al 50% del hueso trabecular seis semanas después de la operación, y que la pérdida ósea en estos ratones puede ser corregida con agentes terapéuticos candidatos, tales como hormona de paratiroides. Los solicitantes utilizaron ratones hembra C57BL6 que fueron ovariectomizados (OVX) y operados en forma simulada a las 4 a 5 semanas de edad. Ocho semanas después de la cirugía, el tratamiento con ActRlla-mFc (10 mg/kg, dos veces a la semana) o control (PBS) fue iniciado. Se midió la densidad ósea mediante escáner CT. Tal como se muestra en la figura 9, los ratones ovariectomizados, no tratados mostraron una pérdida substancial de la densidad ósea trabecular relativa los controles simulados después de seis semanas. El tratamiento ActRlla-mFc restauró la densidad ósea al nivel de los ratones operados simulados. A las 6 y 12 semanas del tratamiento, ActRlla-mFc originó un incremento substancial en el hueso trabecular de ratones OVX. Ver figura 10. Después de 6 semanas de tratamiento, la densidad ósea incrementó en un 24% con relación a los controles PBS. Después de 12 semanas, el incremento fue del 27%. En ratones operados simulados, ActRlla-mFc también originó un incremento substancial en el hueso trabecular. Ver figura 11. Después de 6 a 12 semanas, el tratamiento produjo un incremento de 35% en forma relativa a los controles. En un grupo de experimentos adicionales, los ratones ovariectomizados (OVX) u operados simulados tal como se describió anteriormente, fueron tratados con ActRlla-mFc (10 mg/kg, dos veces a la semana) o control (PBS) durante doce semanas. Similares a los resultados descritos anteriormente para ActRlla-mFc, los ratones OVX que recibieron ActRlla-mFc exhibieron un incremento en la densidad ósea trabecular del 15%, tan pronto como a las cuatro semanas y 25% después de 12 semanas de tratamiento (figura 12). Los ratones operados simulados que recibieron ActRlla-mFc mostraron en forma similar un incremento en la densidad ósea trabecular del 22%, en forma tan temprana como a las cuatro semanas y del 32% después de 12 semanas de tratamiento (figura 13). Después de doce semanas de tratamiento con ActRlla-mFc, el análisis ActRlla-mFc de cuerpo completo y fémur ex vivo mostró que el tratamiento induce un incremento en la densidad ósea en ratones tanto ovariectomizados como en ratones operados simulados (figuras 14A y 14B, respectivamente). Estos resultados también son soportados por análisis pQCT ex vivo del eje medio femoral que demuestra un incremento significativo en densidad ósea tanto total como cortical después de 12 semanas de tratamiento con ActRlla-mFc. Los ratones ovariectomizados de control tratados con vehículo exhibieron densidades óseas que fueron comparables con ratones operados simulados de control, tratados con vehículo (figura 15). Además de la densidad ósea, el contenido óseo incrementó después del tratamiento ActRlla-mFc. El análisis pQCT ex vivo del eje medio femoral demostró un incremento significativo en el contenido de hueso tanto total como cortical después de doce semanas de tratamiento con ActRlla-mFc, aunque los ratones tratados con control de vehículo tanto ovariectomizados como operados simulados exhibieron contenido óseo comparable (figura 16). El análisis pQCT ex vivo del eje medio femoral también mostró que los ratones tratados con ActRlla-mFc no mostraron un cambio en la circunferencia periosteal; sin embargo, el tratamiento ActRlla-mFc dio como resultado una disminución en la circunferencia endosteal que indica un incremento en grosor cortical debido a crecimiento en la superficie interna del fémur (figura 17). Las pruebas mecánicas de los fémures determinaron que ActRlla-mFc tuvo la capacidad de incrementar las características extrínsecas de los huesos (carga máxima, rigidez y energía para romperse) lo cual contribuyó a un incremento significativo en las propiedades intrínsecas (resistencia final) de los huesos. Los ratones ovariectomizados tratados con ActRlla-mFc exhibieron resistencia a huesos incrementada a niveles más allá de los controles tratados con vehículo, operados simulados, lo que indica una reversión total del fenotipo osteoporótico (figura 18). Estos datos demuestran que un antagonista de activina-ActRlla puede incrementar la densidad ósea en ratones hembra normales, y además, corregir defectos en densidad ósea, contenido óseo y finalmente resistencia ósea, en un modelo de ratón de osteoporosis. En un grupo de experimentos adicional, los ratones fueron ovariectomizados u operados simulados a las 4 semanas, y comenzando a las 12 semanas recibieron ya sea placebo o ActRlla-mFc (2 veces/semana, 10 mg/kg) (también referido como RAP-11 en las figuras 19-24) durante un periodo adicional de 12 semanas. Se evaluó una variedad de parámetros óseos. Tal como se muestra en la figura 19, ActRlla-mFc incrementó el volumen de hueso trabecular vertebral a proporciones de volumen total (BV/TV) tanto en los ratones operados OVX como SHAM. ActRlla-mFc también mejoró la arquitectura trabecular (figura 20), incrementó el grosor cortical (figura 21) y mejoró la resistencia ósea (figura 22). Tal como se muestra en la figura 23, ActRlla-mFc produjo efectos deseables en un rango de dosis de 1 mg/kg a 10 mg/kg. La histomorfometría ósea fue conducida en un punto de tiempo de 2 semanas en ratones operados simulados. Estos datos, presentados en la figura 24, demuestran que ActRlla-mFc tuvo un efecto doble, tanto inhibiendo la reabsorción ósea como promoviendo el crecimiento óseo. Por lo tanto ActRlla-mFc estimula el crecimiento óseo (efecto anabólico) e inhibe la reabsorción ósea (efecto anti-catabólico): Ejemplo 4: Proteínas ActRlla-Fc alternativas Una construcción alternativa puede tener una eliminación de la cola C-terminal (los 15 aminoácidos finales del dominio extracelular de ActRlla. La secuencia para dicha construcción se presenta más adelante (parte Fe subrayada) (SEQ ID NO: 12): I LGRSETQECLFFNAN WEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWK NISGSI El VKQGCWLDDI NCYDRTDCVEKKDSPE VYFCCCEGNMCN EKFSY FPEMTG GGTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDV SHEDPEV KFNWY VDGVE H NAKTKPREEQYNSTYRVVS VLT VLHQDWLNGK EYKCK VSNKALP VPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Incorporación como referencia Todas las publicaciones y patentes aquí mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia, como si cada publicación o patente individual estuviera indicada de manera específica e individual para estar incorporado como referencia. Aunque las modalidades específicas del asunto o materia han sido mencionadas, la especificación anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones podrán ser apreciadas por los expertos en la técnica al revisar la presente especificación y las reivindicaciones que se encuentran más adelante. El alcance total de la presente invención debe ser determinado como referencia a las reivindicaciones, junto con su alcance total de equivalentes, y las especificaciones, junto con dichas variaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido ActRlla de enlace a activina que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
2. El polipéptido ActRlla de enlace a activina tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es al menos el 95% puro, con respecto a los contaminantes de proteína, tal como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
3. El polipéptido ActRlla desenlace a activina tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el polipéptido exhibe al menos una selectividad de 10 veces en constante de disociación para activina versus GDF-11.
4. Una preparación farmacéutica que comprende el polipéptido ActRlla de enlace a activina tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
5. La preparación farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizada porque la preparación están substancialmente libre de pirógenos.
6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de codificación para el polipéptido de enlace a activina tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. El polipéptido aislado tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende una secuencia SEQ ID NO: 14.
8. Un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia promotora enlazada en forma operable a un polinucleótido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.
9. Una célula transformada con un polinucleótido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 8.
10. La célula tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque la célula es una célula de mamífero.
11. La célula tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizada porque la célula es una célula CHO o una célula humana.
12. Un método para elaborar un polipéptido ActRlla de enlace a activina, caracterizado porque comprende: a) cultivar una célula bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido ActRlla soluble, en donde la célula es transformada con un polinucleótido recombinante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 6 a 8; y b) recuperar el polipéptido ActRlla de enlace a activina expresado de esta forma.
13. Un método para promover el crecimiento óseo, incrementar la densidad ósea o incrementar la resistencia ósea, en donde el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 2; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 2; y c) un polipéptido que comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de SEQ ID NO: 2.
14. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido tiene una o más de las siguientes características: i) enlaza a un ligando ActRlla con un KD de al menos 10" 7M; y ii) inhibe la señalización ActRlla en una célula.
15. El método tal como se describe en las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque el polipéptido es una proteína de fusión que incluyen, además de un dominio de polipéptidos ActRlla, una o más porciones de polipéptido que mejoran una o más de estabilidad in vivo, vida media in vivo, captación/administración, localización o distribución de tejido, formación de complejos de proteína y/o purificación.
16. El método tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína de fusión incluye una parte de polipéptido seleccionada del grupo que consiste en: un dominio Fe de ¡nmunoglobulina y una albúmina de suero.
17. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, caracterizado porque el polipéptido incluye uno o más residuos de aminoácido modificados seleccionados de: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a una porción de lípidos y un aminoácido conjugado a un agente de derivación orgánica.
18. Un método para tratar un trastorno relacionado con los huesos, en donde el método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad efectiva de un antagonista activina o ActRlla.
19. El método tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque el antagonista activina o ActRlla es un polipéptido de antagonista activina o ActRlla.
20. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido del antagonista activina o ActRlla es seleccionado porque consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de al menos el 90% idéntica a SEQ ID NO: 2; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 3; y c) un polipéptido que comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de SEQ ID NO: 2.
21. El método tal como se describe en las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque el polipéptido antagonista de activina o ActRlla tiene una o más de las siguientes características: i) enlaza a un ligando ActRlla con un KD de al menos 10" 7M; y ii) inhibe la señalización ActRlla en una célula.
22. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque el polipéptido antagonista de activina o ActRlla es una proteína de fusión que incluyen, además de un dominio de polipéptido ActRlla, una o más partes de polipéptido que aumentan una o más de la estabilidad in vivo, vida media in vivo, captación/administración, localización o distribución de tejido, formación de complejos de proteína y/o purificación.
23. El método tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque la proteína de fusión incluye una parte de polipéptido seleccionada del grupo que consiste en: un dominio Fe de inmunoglobulina y una albúmina de suero.
24. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 23, caracterizado porque el polipéptido antagonista de activina o ActRlla incluye uno o más residuos de aminoácido modificados seleccionados de: un aminoácido glucosilado, un aminoácido pegilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado para una porción de lípido, y un aminoácido conjugado para un agente de derivación orgánica.
25. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 18 a la 24, caracterizado porque el trastorno relacionado con los huesos es seleccionado del grupo que consiste en: osteoporosis primaria y osteoporosis secundaria.
26. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 18 a la 24, caracterizado porque el trastorno relacionado con huesos es seleccionado del grupo que consiste en: osteoporosis post-menstrual, pérdida ósea hipogonadal, pérdida ósea inducida por tumor, pérdida ósea inducida por terapia de cáncer, metástasis en huesos, mieloma múltiple y enfermedad de Paget.
27. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 18 a la 26, caracterizado porque el método comprende además administrar un segundo agente activo-hueso.
28. El método tal como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque el agente activo-hueso es seleccionado del grupo que consiste en: biofosfonato, un estrógeno, un modulador de receptor de estrógeno selectivo, una hormona de paratiroides, una calcitonina, un suplemento de calcio y un suplemento de vitamina D.
29. Una preparación farmacéutica que comprende: (a) un antagonista de activina o ActRlla; y (b) un segundo agente activo-hüeso.
30. Un método para identificar un agente que promueve el crecimiento óseo o incrementa la densidad ósea, en donde el método comprende: a) identificar un agente de prueba que enlaza a un dominio de enlace de ligandos de un polipéptido ActRlla en forma competitiva con un polipéptido antagonista de activina o ActRlla; y b) evaluar el efecto del agente en el crecimiento del tejido.
31. El uso de un polipéptido antagonista de activina o ActRlla para elaborar un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con los huesos.
32. Un método para prevenir un trastorno relacionado con los huesos, en donde el método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad efectiva de un antagonista de activina o ActRlla.
33. El método tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el sujeto tiene cáncer que está asociado con metástasis en huesos.
34. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 32 y 33, caracterizado porque el sujeto es positivo para un indicador de pérdida de densidad ósea, reabsorción ósea o metástasis ósea.
35. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 32 a la 34, caracterizado porque el sujeto es un receptor de un régimen de tratamiento de cáncer que está asociado con pérdida ósea.
36. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 32 a la 34, caracterizado porque el sujeto tiene un cáncer asociado con pérdida ósea.
37. Un polipéptido ActRlla de enlace a activina tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, la preparación farmacéutica de cualesquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 ó 29, o el método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 13 a 28, en donde el polipéptido es glucosilado.
38. Un método para promover el crecimiento óseo e inhibir la reabsorción ósea en un paciente, en donde el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una proteína de fusión ActRlla-Fc, en donde la proteína de fusión ActRlla-Fc comprende una secuencia de aminoácido que es al menos el 90% idéntica con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
39. El método tal como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc comprende una secuencia de aminoácido que es al menos el 95% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
40. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones 38 ó 39, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
41. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 40, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
42. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 41, caracterizado porque el método origina menos del 10% de incremento en la masa de músculo esquelético del paciente.
43. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 41, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc se administra para alcanzar una concentración en suero en el paciente de al menos 0.2 g/kg.
44. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 43, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 7.
45. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 44, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc tiene una vida promedio en suero de entre 15 y 30 días.
46. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 45, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc se administra al paciente en forma no más frecuente de una vez por semana.
47. El método tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 38 a la 46, caracterizado porque la proteína de fusión ActRlla-Fc se administra al paciente en forma no más frecuente de una vez por mes.
48. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:3; y (c) un polipéptido que comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de SEQ ID NO: 2, para la preparación de un medicamento para promover el crecimiento óseo, incrementar densidad ósea o incrementar resistencia ósea.
49. El uso de un polipéptido de antagonista de activina o ActRlla para la preparación de un medicamento para prevenir un trastorno relacionado con los huesos.
50. El uso de una proteína de fusión ActRlla-Fc que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 para la preparación de un medicamento para promover el crecimiento óseo e inhibir la reabsorción ósea.
51. Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 3; y (c) un polipéptido que comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de SEQ ID NO: 2, para utilizarse en la promoción del crecimiento óseo, incrementar densidad ósea o incrementar resistencia ósea.
52. Un polipéptido antagonista de activina o ActRlla para utilizarse en el tratamiento de un trastorno relacionado con los huesos.
53. Un polipéptido antagonista de activina o ActRlla para utilizarse en la prevención de un trastorno relacionado con los huesos.
54. Una proteína de fusión ActRlla que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 para utilizarse en promover el crecimiento óseo e inhibir la reabsorción ósea.