BRPI0806861A2 - Antagonistas de ativina-actriia e usos para tratar ou prevenir câncer de mama - Google Patents

Antagonistas de ativina-actriia e usos para tratar ou prevenir câncer de mama Download PDF

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Description

"ANTAGONISTAS DE ATIVINA-ACTRIIA E USOS PARA TRATAR OU PREVENIR CÂNCER DE MAMA"
Referência cruzada a pedidos relacionados
Este pedido reivindica o benefício para pedido de patente provisório U.S.
60/899.070, depositado em 1 de fevereiro de 2007, e pedido de patente provisório U.S 61/000.54, depositado em 25 de outubro de 2007. Todos os preceitos dos pedidos suprarreferidos estão incorporados aqui pela referência.
Antecedentes da invenção
Câncer de mama é o tipo mais comum de câncer entre as mulheres nos países ocidentais, afetando mais que 180.000 mulheres nos estados Unidos a cada ano. A doença surge na glândula mamária, ou mama, que é constituída de um sistema de duto de derivação. Cada glândula mamária, ou mama, contendo 15 a 20 seções denominadas lobos, e cada lobo contém uma série de dutos derivados que drenam para o mamilo. Células epiteliais que revestem cada duto são responsáveis pela produção de leite. Acredita-se que o câncer de mama invasivo seja originado de epitélio normal da unidade duto/lobular terminal através de uma série de lesões proliferativas cada vez mais anormais. Uma vez que o tumor adquire a capacidade de metastisar, as células cancerígenas da mama se espalham para outros órgãos, tornando o tratamento cada vez mais difícil. Os locais mais comuns de metástase de câncer de mama são o pulmão, fígado e ossos. As metástases ósseas são comumente associadas com dor severa, perda óssea e maior risco de fraturas. Muitas terapias antiestrogênicas usadas no tratamento de câncer de mama são também associadas com perda óssea acelerada.
Pacientes diagnosticados com câncer de mama tipicamente são submetidos a cirurgia e/ou radioterapia para tratar o tumor primário, seguido por terapia adjuvante para tratar qualquer célula cancerígena que possa ter espalhado para locais distantes. A terapia adjuvante consiste em quimioterapia citotóxica e/ou terapia endócrina. Embora a quimioterapia tenha sido efetiva no tratamento de vários tipos de malignidades, muitos compostos antineoplásticos induzem efeitos colaterais. Adicionalmente, muitos tumores tanto não conseguem a responder quanto se tornam resistentes à quimioterapia e terapia endócrina. Embora a terapia adjuvante tenha reduzido a taxa de mortalidade entre pacientes com câncer de mama, a taxa de sobrevivência de 10 anos para pacientes com tipos histopatológicos mais comuns de câncer de mama invasivo é ainda apenas 35 a 50 % (Weigelt et al. 2005 Nat. Rev. Cancer 5: 591-602). Adicionalmente, em virtude de pouco critério de diagnóstico, muitas mulheres que poderiam ser curadas pelo tratamento local sozinho recebem terapia adjuvante desnecessariamente.
Consequentemente, são necessários alvos moleculares mais eficientes e efetivos contra câncer de mama. Terapias alternativas que são menos tóxicas e/ou mais efetivas que quimioterapia e terapias endócrinas melhorariam os regimes de tratamento e aumentariam a sobrevivência. Adicionalmente, agentes que podem ser usados como tratamento preventivo para pacientes que podem estar em risco de desenvolver câncer de mama invasivo ou metastático seriam úteis na clínica. É um objetivo da presente revelação, portanto, prover com5 posições e métodos alternativos para tratar câncer de mama ou inibir ou prevenir o progresso de câncer de mama em pacientes.
Sumário da invenção
Em parte, a revelação diz respeito ao uso de antagonistas de ativina, bem como antagonistas de ActRIIa1 para tratar ou prevenir câncer de mama ou perda óssea associada com câncer de mama. Em particular, a revelação fornece métodos para tratar ou prevenir câncer de mama usando uma forma solúvel de ActRIIa age como um inibidor de ativina. Embora ActRIIa solúvel possa afetar o crescimento ou sobrevivência de células cancerígenas através de um mecanismo sem ser antagonismo de ativina, agentes terapêuticos desejáveis podem no entanto ser selecionados com base no antagonismo de ativina ou antagonismo de ActRIIa, ou ambos. Tais agentes são coletivamente referidos como antagonistas de ativina-ActRIla. Portanto, em certas modalidades, a revelação fornece métodos para usar antagonistas de ativina-ActRIla, incluindo, por exemplo, polipeptídeos ActRIIa de ligação da ativina, polipeptídeos ActRIIa de ligação da ativina, anticorpos anti-ativina, anticorpos antiActRIIa, anticorpos anti-ActRIla, aptâmeros e moléculas pequenos alvejados por ativina ou ActRIIa1 e ácidos nucléicos que diminuem a expressão de ativina e ActRIIa, para tratar ou prevenir câncer de mama em pacientes que necessitam destes. Como descrito no pedido de patente U.S. número de série 1 1/603.485, aqui incorporado pela referência, antagonistas de ativina-ActRIla podem ser usados para promover crescimento ósseo e aumentar a densidade óssea. Da maneira aqui descrita, tais antagonistas podem também ser usados para tratar ou prevenir câncer de mama, metástase de câncer de mama no osso e perda óssea associada com câncer de mama.
Em certos aspectos, a revelação fornece métodos para tratar ou prevenir câncer de mama usando polipeptídeos compreendendo um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina solúvel que se liga à ativina. Os polipeptídeos ActRIIa podem ser formulados como uma 30 preparação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina e um carreador farmaceuticamente aceitável. O polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina pode se ligar à ativina com uma K0 menor que 1 micromolar ou menor que 100, 10 ou 1 nanomolar. Opcionalmente, o polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina liga seletivamente ativina versus GDF11 e/ou GDF8 e, opcionalmente, com uma K0 que é pelo menos 10 vezes, 20 vezes ou 35 50 vezes menor com relação a ativina do que com relação a GDF11 e/ou GDF8. Embora sem querer ficar preso a um mecanismo particular de ação, espera-se que este grau de seletividade para inibição de ativina com relação a inibição de GDF11/GDF8 seja responsável pelos efeitos na sobrevivência ou crescimento no osso ou tumor sem um efeito consistentemente mensurável no músculo. Em muitas modalidades, um polipeptídeo ActRIIa será selecionado para causar menos que 15 %, menos que 10 % ou menos que 5 % de aumento no músculo em doses que atingem efeitos desejáveis nas células cancerígenas. A composição pode ser pelo menos 95 % pura, com relação a outros componentes de polipeptídeo, avaliada por cromatografia por exclusão de tamanho e, opcionalmente, a composição é pelo menos 98% pura. Um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina para uso em uma preparação como esta pode ser qualquer um daqueles aqui revelados, tal como um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7 ou 12, ou com uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % ou 99 % idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 ou 13. Um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina pode incluir um fragmento funcional de um polipeptídeo ActRIIa natural, tal como um que compreende pelo menos 10, 20, 30, 50 ou 90 ou mais aminoácidos de uma seqüência selecionada de SEQ ID NOs: 1-3 ou uma seqüência de SEQ ID NO: 2, faltando os aminoácidos 10 a 15 do terminal C (a “cauda”).
Um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina solúvel pode incluir uma ou mais alterações na seqüência de aminoácidos (por exemplo, no domínio de ligação de ligante) com relação a um polipeptídeo ActRIIa de ocorrência natural. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa alterados são fornecidos em WO 2006/012627, pp. 59-60, aqui incorporado pela referência. 20 A alteração na seqüência de aminoácidos, por exemplo, pode alterar a glicosilação do polipeptídeo durante a produção em um mamífero, inseto ou outra célula eucariótica ou alterar a clivagem proteolítica do polipeptídeo com relação ao polipeptídeo AetRIIa de ocorrência natural.
Um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina pode ser uma proteína de fusão que tem, como um domínio, um polipeptídeo ActRIIa (por exemplo, uma porção de ligação de ligante de uma ActRIIa) e um ou mais domínios adicionais que fornecem uma propriedade desejável, tais como melhor farmacocinética, purificação mais fácil, melhor alvejamento em tecidos particulares, etc. Por exemplo, um domínio de uma proteína de fusão pode melhorar uma ou mais de estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína, multimerização da proteína de fusão, e/ou purificação. Uma proteína de fusão de ActRIIa de ligação da ativina pode incluir um domínio Fc de imunoglobulina (tipo selvagem ou mutante) ou uma albumina sérica ou outra porção de polipeptídeo que fornece propriedades desejáveis tais como melhor farmacocinética, maior soiubilidade ou maior estabilidade. In uma modalidade preferida, uma fusão ActRIIa-Fc compreende um ligante relativamente não estruturado posicionado entre o domínio Fc e o domínio ActRIIa extracelular. Este ligante não estruturado pode corresponder à região grosseiramente não estruturada de 15 aminoácidos na extremidade terminal C do domínio extracelular de ActRIIa (a “cauda”), ou pode ser uma seqüência artificial de 1, 2, 3,
4 ou 5 aminoácidos ou ter um comprimento de entre 5 e 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que são relativamente livres de estrutura secundária, ou um mistura de ambos. Um ligante pode ser rico em resíduos de glicina e prolina e, por exemplo, pode contes uma seqüência 5 única de treonina/serina e glicinas ou seqüências repetitivas de treonina/serina e glicinas (por exemplo, TG4 ou SG4 singletes ou de repetição). Uma proteína de fusão pode incluir uma subsequência de purificação, tal como um marcador de epítopo, um FLAG tag, uma seqüência de poli-histidina, e uma fusão de GST. Opcionalmente, um polipeptídeo ActRIIa solúvel inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de: um amino10 ácido glicosilado, um aminoácido PEGIado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração lipídica, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico. Uma preparação farmacêutica também pode incluir um ou mais compostos adicionais tal como um composto que é usado para tratar um distúrbio ósseo. Preferivelmente, uma preparação farmacêutica é substanci15 almente livre de pirogênio. Em geral, é preferível que uma proteína ActRIIa seja expressa em uma linhagem celular de mamífero, que faça mediação apropriada à glicosilação natural da proteína ActRIIa, de maneira a diminuir a probabilidade de uma resposta imune desfavorável em um paciente. Linhagens celulares humanas e CHO foram usadas com sucesso e espera-se que outros sistemas de expressão de mamífero comuns sejam usados. Adicio20 nalmente, levedura e outros tipos de células foram geneticamente alterados para expressar enzimas de mamíferos que catalisam glicosilação, permitindo assim a geração de glicosilação tipo mamífera rigorosamente controlada nas proteínas expressas nestas células não mamíferas. Estas linhagens celulares recombinantes podem também ser usadas para expressar as proteínas aqui descritas.
Da maneira aqui descrita, proteínas ActRIIa designadas ActRIIa-Fc (uma forma com
um ligante mínimo entre a porção ActRIIa e a porção Fe) têm propriedades desejáveis, incluindo ligação seletiva à ativina versus GDF8 e/ou GDF11, ligação de ligante de alta afinidade e meia-vida sérica maior que duas semanas em modelos animais. Em certas modalidades a invenção fornece métodos para tratar ou prevenir câncer de mama usando polipeptídeos 30 ActRIIa-Fc e preparações farmacêuticas compreendendo tais polipeptídeos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em certos aspectos, a revelação fornece métodos para tratar ou prevenir câncer de mama usando ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina solúvel. Um polinucleotídeo isolado pode compreender uma seqüência de codificação para 35 um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina solúvel, tal como descrito anteriormente. Por exemplo, um ácido nucléico isolado pode incluir uma seqüência que codifica para um domínio extracelular (por exemplo, domínio de ligação de ligante) de uma ActRIIa e uma sequência que codificaria para parte ou todo o domínio transmembrana e/ou o domínio citoplasmático de uma ActRIIa, mas para um códon de parada posicionado no domínio transmembrana ou no domínio citoplasmático, ou posicionado entre o domínio extracelular e o domínio transmembrana ou domínio citoplasmático. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado pode 5 compreender uma seqüência de polinucleotídeo ActRIIa de comprimento total tal como SEQ ID NO: 4 ou 5 ou uma seqüência de polinucleotídeo ActRIIa de comprimento total tal como SEQ ID NO: 18, ou uma versão parcialmente truncada de ActRIIa ou ActRIIa1 o dito polinucleotídeo isolado compreendendo adicionalmente um códon de término de transcrição em pelo menos seiscentos nucleotídeos antes do terminal 3’ ou posicionado de outra forma, de 10 maneira tal que a tradução do polinucleotídeo origina um domínio extracelular opcionalmente fundido a uma porção truncada de uma ActRIIa de comprimento total. Uma seqüência de ácido nucléico preferida para ActRIIa é SEQ ID NO: 14. Os ácidos nucléicos usados de acordo com os métodos aqui descritos podem ser operacionalmente ligados a um promotor para expressão, e a revelação fornece células transformadas com tais polinucleotídeos re15 combinantes. Preferivelmente, a célula é uma célula de mamífero tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).
A revelação também fornece métodos para preparar um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina solúvel, que pode ser usado para tratar ou prevenir câncer de mama Um método como este pode incluir expressar quaisquer dos ácidos nucléicos (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 5 ou 14) aqui revelados em uma célula adequada, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Um método como este pode compreender: a) cultivar uma célula em condições adequadas para expressão do polipeptídeo ActRIIa solúvel, em que a dita célula é transformada com uma construção de expressão ActRIIa solúvel; e b) recuperar o polipeptídeo ActRIIa solúvel assim expresso. Polipeptídeos ActRIIa solúveis podem ser recuperados como frações brutas, parcialmente purificadas ou altamente purificadas. A purificação pode ser atingida por uma série de etapas de purificação, incluindo, por exemplo, um, dois, três ou mais dos seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia de troca aniônica (por exemplo, sefarose Q), cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, fenilsefarose), cromatografia por exclusão de tamanho, e cromatografia de troca catiônica.
Em certos aspectos, um antagonista de ativina-ActRIla aqui revelado, tal como um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina solúvel, pode ser usado para tratar prevenir ou inibir câncer de mama em um sujeito incluindo, por exemplo, métodos para atrasar o início de ação do câncer de mama, inibir o progresso do câncer de mama, reduzir o tamanho do 35 tumor, impedir o crescimento do tumor, atrasar o início de ação da metástase ou impedir a metástase, incluindo metástase no osso. Em certas modalidades, a revelação fornece métodos para diminuir ou inibir o crescimento ou sobrevivência das células cancerígenas da mama em pacientes que necessitam destes. Um método pode compreender administrar a um sujeito que necessita deste, uma quantidade efetiva de antagonista de ativina-ActRIla. Em certos aspectos, a revelação fornece usos de antagonistas de ativina-ActRIla para preparar um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou condição da maneira aqui descrita. A 5 revelação também diz respeito a terapias de combinação compreendendo uns antagonistas de ativina-ActRIla e terapia de radiação, quimioterapia (por exemplo, um agente citotóxico), e/ou terapia endócrina. O antagonista pode ser uma proteína de fusão ActRIIa-Fc, em que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntica à seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:3.
Em modalidades adicionais, a presente invenção diz respeito a métodos de prevenir
ou atrasar o início de ação de câncer de mama em pacientes com um ou mais fatores de risco de câncer de mama. Em algumas modalidades, a presente invenção diz respeito a métodos de prevenir ou atrasar o início de ação doenças metastáticas em pacientes já diagnosticados com um tumor de mama primário ou com uma lesão proliferativa da mama. O 15 método de prevenir ou atrasar o início de ação de câncer de mama em um paciente humano pode compreender administrar a um paciente humano que necessita deste uma quantidade efetiva de um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO:2; b) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à 20 SEQ ID NO:3; e c) um polipeptídeo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos selecionados de SEQ ID NO:2.
Outras modalidades da invenção dizem respeito a um método de inibir sinalização mediada por ativina em um paciente humano com câncer de mama. Em certa modalidades, o método compreende administrar a um paciente humano uma quantidade efetiva de um 25 antagonista da ativina-ActRIla. Em modalidades adicionais o antagonista é um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO:2; b) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO:3; e c) um polipeptídeo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos selecionados de SEQ 30 ID NO:2.
Em certos aspectos, a revelação fornece um método para identificar um agente que inibe o crescimento ou sobrevivência de células cancerígenas (por exemplo, células cancerígenas da mama). O método compreende: a) identificar um agente teste que se liga a ativina ou um domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo ActRIIa; e b) avaliar o efeito do agente na proliferação, sobrevivência ou apoptose de células cancerígenas.
Descrição Resumida dos Desenhos
A figura 1 mostra a purificação de ActRIla-hFc expressa em células CHO. A proteína purifica as um pico bem definido único, visualizado por coluna de classificação por tamanho (painel esquerdo) e SDS-PAGE corada com Coomassie (painel direito) (raia esquerda: padrões de peso molecular; raia direito: ActRIla-hFc).
A figura 2 mostra a ligação de ActRIla-hFc à ativina e GDF-11, medida por ensaio BiaCore™
A figura 3 mostra que o tratamento com ActRIla-mFc reduz bastante a formação de lesões metastáticas em um modelo de camundongo de câncer de mama metastático. Camundongos foram visualizados não invasivamente (anestesiados, imageamento fluorescente) cinco semanas após injeção intracardíaca de células de câncer de mama MDA-MB-231 10 que expressam luciferase. 12/14 camundongos tratados com o veículo apresentaram lesões metastáticas visíveis, ao passo que apenas 4/12 camundongos tratados com ActRIla-mFc apresentaram lesões visíveis.
Descrição Detalhada da Invenção
1. Aspectos gerais
A superfamília de fator de crescimento transformador (TGF-beta) contém uma vari
edade de fatores de crescimento que compartilham elementos de seqüência e motivos estruturais comuns. Sabe-se que estas proteínas exercem efeitos biológicos em uma grande variedade de tipos celulares tanto em vertebrados quanto em invertebrados. Membros da superfamília realizam importantes funções durante o desenvolvimento embrionário na formação padrão e especificação de tecido e podem influenciar uma variedade de processos de diferenciação, incluindo adipogênese, miogênese, condrogênese, cardiogênese, hematopoiese, neurogênese e diferenciação celular epitelial. A família é dividida em duas ramificações gerais: as ramificações BMP/GDF e TGF-beta/Ativina/BMP10, cujos membros têm efeitos complementares frequentemente diversos. Manipulando a atividade de um membro da família TGF-beta, é frequentemente possível causar mudanças fisiológicas significativas em um organismo. Por exemplo, as criações de gado Piedmontese e Belgian Blue carregam uma mutação perda-de-função no gene GDF8 (também chamado miostatina) que causa um aumento acentuado na massa muscular. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1 ):71 -4. Além disso, em humanos, alelos inativos de GDF8 estão associados com maior massa muscular e, reportadamente, força excepcional. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.
Ativinas são fatores de crescimento de polipeptídeo dimérico que pertencem à superfamília TGF-beta. Existem três formas de ativina principais (A, B, e AB) que são homo/heterodímeros de duas subunidades β estreitamente relacionadas (/?A /?a. ββ ββ, e βa ββ, respectivamente). O genoma humano também codifica uma ativina C e uma ativina E, que 35 são basicamente expressas no fígado, e formas heterodiméricas contendo /?c ou βΕ também são conhecidas. Na superfamília TGF-beta, ativinas são fatores exclusivos e multifuncionais que podem estimular a produção de hormônio em células ovarianas e placentárias, auxiliar na sobrevivência da célula neuronal, influenciar positiva ou negativamente o progresso do ciclo celular dependendo do tipo celular e induzir diferenciação mesodérmica pelo menos em embriões de anfíbios (DePaoIo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson etal., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963). Além dis5 so, observa-se que ativina B está envolvida na regulação de diferenciação de célula epitelial mamária em camundongos (Robinson and Hennighousen, 1997 Development 124; 2701- 2708). Em diversos tecidos, a sinalização de ativina é antagonizada por seu heterodímero relacionado, inibina. Por exemplo, durante a liberação do hormônio folículo estimulante (FSH) a partir da pituitária, ativina promove a secreção e síntese de FSH, enquanto a inibina 10 previne a secreção e síntese de FSH. Outras proteínas que podem regular a bioatividade de ativina e/ou se ligar à ativina incluem folistatina (FS), proteína relacionada a folistatina (FSRP) e a2-macroglobulina.
Os sinais de TGF-/? são mediados por complexos heterodiméricos de receptores de quinase serina/treonina tipo I e tipo II, que fosforilam e ativam proteínas Smad à jusante me15 diante estímulo de ligante (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 :169-178). Estes receptores tipo I e tipo Il são proteínas transmembranas compostas de um domínio extracelular de ligação de ligante com região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático com especificidade serina/treonina predita. Os receptores tipo I são essenciais para sinalização; e receptores tipo Il são exigidos para ligar elementos de ligação 20 e para expressão de receptores tipo I. Os receptores de ativina tipo I e Il formam um complexo estável após a ligação do ligante, resultando na fosforilação de receptores tipo I por receptores tipo II.
Dois receptores tipo Il relacionados (ActRIIa), ActRIIa e ActRIIa1 foram identificados como os receptores tipo Il para ativinas (Mathews e Vale, 1991 , Cell 65:973-982; Attisano et 25 al., 1992, Cell 68: 97-108). Além das ativinas, ActRIIa e ActRIIa podem interagir bioquimicamente com diversas outras proteínas da família TGF-/?, incluindo BMP7, Nodal, GDF8, e GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee e McPherron, 2001 , Proc. Natl. Acad. Sei. 98:9306-931 1 ; Yeo e Whitman, 2001 , Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 é o principal receptor tipo I para ativinas, particular30 mente para ativina A, e ALK-7 pode servir como um receptor para ativinas igualmente, particularmente para ativina B.
Da maneira aqui descrita, um peptídeo ActRIIa solúvel (sActRIla), que mostra substancial preferência na ligação a ativina A1 ao contrário de outros membros da família TGFbeta, tal como GDF8 ou GDF11, pode ser usado para tratar ou prevenir câncer, particular35 mente câncer de mama. Embora sem querer ficar preso a nenhum mecanismo particular, espera-se que o efeito de sActRIla seja causado principalmente por um efeito antagonista de ativina, dando a ligação da ativina muito forte (constante de dissociação picomolar) exibida pelo construção sActRIla particular usados nestes estudos. Antagonistas de ActRIIa de ativina incluem, por exemplo polipeptídeos ActRIIa solúvel de ligação da ativina, anticorpos que se ligam à ativina ( particularmente às subunidades de ativina A ou B1 também referidas como β& ou βΒ) e rompe a ligação, anticorpos que se ligam a ActRIIa e rompem a ligação 5 da ativina, proteínas não anticorpo selecionadas por ligação da ativina ou ActRIIa (ver por exemplo, WO/2002/088171, WO/2006/055689, e WO/2002/032925 para exemplos de tais proteínas e métodos para projeto e seleção dos mesmos), polipeptídeos randomizados selecionados pela ligação da ativina ou ActRIIa, frequentemente afixados em um domínio Fe. Duas proteínas diferentes (ou outras frações) com atividade de ligação da ativina ou ActRIIa1 10 especialmente Iigantes de ativina que bloqueiam os sítios de ligação tipo I (por exemplo um receptor de ativina tipo I solúvel) e tipo Il (por exemplo um receptor de ativina tipo Il solúvel), respectivamente, podem ser ligadas uma na outra para criar uma molécula de ligação bifuncional. Aptâmeros de ácido nucléico, pequenas moléculas e outros agentes que inibem o eixo de sinalização de ativina-ActRIla podem também ser usados. Várias proteínas têm ati15 vidade antagonista da ativina-ActRIla , incluindo inibina (isto é, subunidade alfa inibina) embora inibina não antagonize universalmente a ativina em todos os tecidos, floistatina (por exemplo, folistatina-288 e folistatina-315), FSRP, ativina C, alfa(2)-macroglobulina, e uma ativina A mutante MI08A (metionina para mudar alanina na posição 108). Geralmente, formas alternativas de ativina, particularmente aquelas com alterações no domínio de ligação 20 do receptor tipo I pode se ligar aos receptores tipo Il e não conseguem formar um complexo ternário ativo, agindo assim como antagonistas. Adicionalmente, ácidos nucléicos, tais como moléculas antissentido, siRNAs ou ribozimas que inibem ativina A, B, C ou E, ou, particularmente.expressão de ActRIIa, podem ser usados como antagonistas de ativina-ActRIla. O antagonista de ativina-ActRIla pode ser usado para exibir seletividade para inibição de sina25 lização mediada por ativina versus outros elementos da família TGF-beta, e particularmente com relação a GDF8 e GDF11. Proteínas ActRIIb solúveis se ligam a ativina, entretanto, a proteína tipo selvagem não exibe seletividade significativa na ligação da ativina versus GDF8/11. Entretanto, tais polipeptídeos ActRIIb, bem como formas alteradas de ActRIIb com propriedades de ligação diferentes ver, por exemplo, W02006/012627, pp. 55-59, incorpo30 rado aqui pela referência) podem obter os efeitos desejados nas células cancerígenas. ActRIlb nativo ou alterado pode ser dado adicionado especificamente para ativina acoplandose com um segundo agente de ligação seletivo de ativina.
Os termos usados nesta especificação têm seus significados usuais na técnica, no contexto desta invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Certos termos são discutidos a seguir ou em outra parte na especificação, para fornecer orientação adicional ao profissional em descrever as composições e métodos da invenção e como preparar e usá-las. O escopo ou significado de qualquer uso de um termo será aparente a partir do contexto específico no qual o termo é usado. "Cerca de" e "aproximadamente", em geral, devem significar um grau de erro aceitável para a quantidade medida, dada a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, graus de erro exemplares estão em 20 porcento (%), preferivelmente em 10 %, e mais preferivelmente em 5 % de um valor dado ou faixa de valores.
Alternativamente e particularmente, em sistemas biológicos, os termos "cerca de" e "aproximadamente" podem significar valores que estão em uma ordem de magnitude, preferivelmente em 5 vezes e, mais preferivelmente, em 2 vezes de um valor dado. Quantidades numéricas aqui fornecidas são próximas, a menos que de outra forma declarada, significando que o termo "cerca de" ou "aproximadamente" podem ser inferidos quando não expressamente declarados.
Os métodos da invenção podem incluir etapas de comparar seqüências umas com as outras, incluindo seqüência tipo selvagem para um ou mais mutantes (variantes de seqüência). Tais comparações compreendem tipicamente alinhamentos de seqüências de polímero, por exemplo, usando programas e/ou algoritmos de alinhamento de seqüência que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST, FASTA e MEGALIGN, para citar alguns). Os versados na técnica percebem facilmente que, em tais alinhamentos, onde uma mutação contém uma inserção ou deleção de resíduo, o alinhamento de seqüência introduzirá uma "folga" (tipicamente representada um hífen, ou "A") na seqüência de polímero que não contém o resíduo inserto ou deletado.
"Homólogo", em todas as suas formas gramaticais e variações de ortografia, referese ao relacionamento entre duas proteínas que possuem uma "origem evolucionária comum," incluindo proteínas das superfamílias na mesma espécie de organismo, bem como proteínas homólogas de espécie diferente de organismo. Tais proteínas (e seus ácidos nucléicos que codificam) têm homologia de seqüência refletida por sua similaridade de seqüência, quer em termos de identidade percentual ou pela presença de resíduos ou motivos específicos e posições conservadas.
O termo "similaridade de seqüência", em todas as suas formas gramaticais, referese ao grau de identidade ou correspondência entre as seqüências de ácido nucléico ou aminoácidos que podem ou não compartilhar uma origem evolucionária comum.
Entretanto, no uso comum e na aplicação imediata, o termo "homólogo", quando modificado com um advérbio tal como "altamente", pode referir-se a similaridade de seqüência e pode ou não estar relacionado a uma origem evolucionária comum.
O termo “câncer de mama” refere-se a qualquer lesão proliferativa ou anormalidade proliferativa da mama incluindo, por exemplo, início de lesões, lesões pré-malignas e malignas, tumores sólidos, e doenças metastáticas, por exemplo, estágio III, e mais amplamente metastática, por exemplo, estágio IV). Câncer de mama inclui, mas sem limitações, adenocarcinoma, carcinoma Iobular (pequena célula), carcinona intradutal, câncer de mama medular, câncer de mama da mucosa, câncer de mama tubular, câncer de mama papilar, doença de Paget e câncer de mama inflamatória. O câncer de mama também diz respeito a doenças em outros órgãos tais como pulmão, fígado e osso, que se originam da lesão metastáti5 ca na mama. Geralmente, cânceres de mama independentes de hormônio são caracterizados pela ausência ou baixos níveis de receptores de estrógenos e/ou progesterona e esses cânceres são tipicamente refratários a tratamento com terapias anti-hormanais (especialmente antiestrogênico). Os cânceres de mama são também categorizados nas bases de expressão Her2, com tumores Her2+tendo um prognóstico pior do que tumores Her2'
2. Polipeptídeos ActRIIa
Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito a métodos para tratar ou prevenir câncer de mama usando polipeptídeos ActRIIa. Da maneira aqui usada, o termo "ActRIla" refere-se a uma família de proteínas do receptor de ativina tipo Ila (ActRIIa) de quaisquer espécie e variantes derivadas de tais proteínas ActRIIa por mutagênese ou outra modi15 ficação. Entende-se aqui que a referência ActRIIa é uma referência a qualquer uma das formas identificadas atualmente. Membros da família ActRIIa são em geral proteínas transmembranas, compostas de um domínio extracelular de ligação de ligante com uma região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático com atividade quinase serina/treonina predita.
O termo "polipeptídeo ActRIIa" inclui polipeptídeos que compreendem qualquer po
lipeptídeo de ocorrência natural de um membro da família ActRIIa, bem como quaisquer variantes deste (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas peptidomiméticas) que mantêm uma atividade útil. Ver, por exemplo, W0/2006/012627. Por exemplo, polipeptídeos ActRIIa incluem polipeptídeos derivados da seqüência de qualquer ActRIIa conhecida com 25 uma seqüência pelo menos cerca de 80 % idêntica à seqüência de um polipeptídeo AetRIIa e, opcionalmente, pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % ou mais de identidade. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa da invenção pode se ligar e inibir a função de uma proteína ActRIIa e/ou ativina. Um polipeptídeo ActRIIa pode ser selecionado pela atividade de inibir proliferação ou sobrevivência de células cancerígenas in vivo. Exemplos de polipeptí30 deos ActRIIa incluem polipeptídeo precursor de ActRIIa humano (SEQ ID NO: 1) e polipeptídeos ActRIIa humanos solúveis (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 3, 7 e 12).
A seqüência de proteína precursora de ActRIIa humana é da maneira a seguir: MGTVAAKLAFAVFLI SCSSGAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEP CYGDKDKRRHCFATWKNJ S GS IE I VKQGCWLDD INC YDRTDCVEKKDSP EVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPYYNILLYSLVPL
MLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLE KARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHEN ILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANWSWNELCHIAE TMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGL ALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGL VLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVWH KKKRPVL RDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIIT
TEDIVTWTMVTNVDFPPKESSL (SEQ ID NO: 1)
O peptídeo de sinal está sublinhado em linha única; o domínio extracelular está em negrito e os sítios de glicosilação potenciais ligados a N estão sublinhados em linha dupla.
A seqüência de polipeptídeo processado solúvel ActRIIa humano (extracelular) é da maneira a seguir:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISG SIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP EMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2)
Deve-se notar que a seqüência N-terminal começando “ILG...” foi determinada experimentalmente e difere da seqüência N-teminal “AIL...” que é comumente proposta na literatura. A "cauda" do terminal C do domínio extracelular está sublinhado. A seqüência com a "cauda" deletada (uma seqüência Δ15) é da maneira a seguir:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISG SIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP EM (SEQ ID NO:3)
A seqüência de ácido nucléico que codifica proteína precursora de ActRIIa humana é da maneira a seguir (nucleotídeos 164-1705 de acesso ao Genbak NM_001616): ATGGGAGCTGCTGCAA^GTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTTCTTCAGGTGC T AT ACTT GGT AGAT CAG AAACT CAGG AGT GT CTTTT CTTT AAT G CTAATT G GG AAAAAG 25 ACAG AACCAAT CAAACT GGT GTT G AACCGT GTTATG GT G ACAAAGATAAACGG CGG CAT T GTTTT GCTACCT GG AAG AATATTT CTGGTT CCATT GAAAT AGT G AAACAAGGTT GTT G G CT GGAT GATAT CAACT G CTAT GACAGG ACT GATT GT GT AG AAAAAAAAG ACAG CCCTG AAGTATATTTTT GTTGCT GT G AG GG CAATATGTGTAAT G AAAAGTTTT CTTATTTT CCA G AGATGGAAGT CACACAGCCCACTT CAAAT CCAGTT ACACCTAAGCCACCCTATTACAA 30 CATCCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGTGCAT TTT GGGTGT ACAGGCAT CACAAGAT GGCCTACCCT CCTGTACTT GTT CCAACT CAAGAC CCAGG ACCACCCCCACCTT CT CCATT ACTAGG GTT G AAACCACT G CAGTTATTAGAAGT G AAAGCAAG GG G AAG ATTT G GTT GTGTCTG G AAAGCCCAGTT G CTT AACG AATATGTGG CT GT CAAAATATTT CCAATACAG G ACAAACAGT CAT GG CAAAAT GAATACG AAGT CTAC 35 AGTTTGCCTGGAATGAAGCAT GAGAACAT ATTACAGTT CATTGGTGCAGAAAAACGAGG CACCAGT GTT GAT GTGGAT CTTTGGCT GAT CACAGCATTT CAT GAAAAGGGTT CACTAT CAGACTTT CTTAAGGCTAAT GTGGT CT CTTGGAAT GAACT GT GT CAT ATTGCAGAAACC ATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAAAAGATGGCCACAA ACCT GCCATAT CT CACAGGGACAT CAAAAGTAAAAAT GTGCT GTT GAAAAACAACCT GA CAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGGCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGC GATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGC 5 T AT AAACTT CCAAAGG G AT G CATTTTT GAGGAT AGAT ATGT ATG CCAT G GG ATTAGTCC TATGGGAACTGGCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTG CCATTT GAGGAG G AAATTGGCCAG CAT CCAT CT CTT G AAG ACAT G CAG GAAGTT GTT GT GCAT AAAAAAAAGAGGCCT GTTTT AAGAGATTATTGGCAGAAACATGCT GGAATGGCAA TGCTCTGT G AAACCATT G AAG AAT GTTG GG AT CACG ACG CAGAAG CCAGGTTAT CAGCT 10 GG ATGTGTAG GT G AAAG AATTACCCAG AT G CAG AG ACTAACAAATATT ATTACCACAG A GGACATT GTAACAGT GGT CACAAT GGT GACAAAT GTT GACTTT CCT CCCAAAG AAT CTA GTCTATGA (SEQ ID NO: 4)
A seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo solúvel ActRIIa (extracelular) é da maneira a seguir:
ATACTT GGT AGAT CAG AAACT CAG GAGTGT CTTTT CTTTAAT G CT AATT G GG AAAAAG A CAG AACCAAT CAAACT G GTGTT G AACCGT GTTATG GT G ACAAAG ATAAACG GCGG CATT GTTTTGCT ACCT GG AAGAATATTT CTGGTT CCATT GAAATAGT G AAACAAGGTT GTT GG CTGG ATG AT AT CAACT G CT AT GACAG GACT GATT GTGT AG AAAAAAAAG ACAGCCCT GA AGTAT ATTTTT GTTGCT GT G AGGGCAAT AT GT GTAAT GAAAAGTTTT CTTATTTT CCAG 20 AGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC (SEQ ID NO: 5)
Em uma modalidade específica, a invenção diz respeito a métodos para tratar ou prevenir câncer de mama usando polipeptídeos ActRIIa solúvel. Da maneira aqui descrita, o termo "polipeptídeo ActRIIa solúvel" refere-se em geral a polipeptídeos compreendendo um 25 domínio extracelular de uma proteína ActRIIa. O termo "polipeptídeo ActRIIa solúvel", da maneira aqui usada, inclui qualquer domínio extracelular de ocorrência natural de uma proteína ActRIIa, bem como quaisquer variantes deste (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticas). Um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina é um que mantém a capacidade de se ligar a ativina, incluindo, por exemplo, ativina AA, AB1 BB, ou formas que 30 incluem uma subunidade C ou E. Opcionalmente, um polipeptídeo ActRIIa de ligação da ativina se ligará a ativina AA com uma constante de dissociação de 1 nM ou menos. Em geral, o domínio extracelular de uma proteína ActRIIa que se liga a ativina é solúvel e, pode assim, ser denominado um polipeptídeo AetRIIa de ligação da ativina solúvel. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa de ligação da ativina solúveis incluem os polipeptídeos solúveis ilus35 trados em SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 e 13. SEQ ID NO:7 é referida como ActRIla-hFc e é descrita adicionalmente nos exemplos. Outros exemplos de polipeptídeos ActRIIa de ligação da ativina solúveis compreendem um seqüência de sinal além do domínio extracelular de uma proteína ActRIIa, por exemplo, a seqüência líder melitina de mel de abelha (SEQ ID NO: 8), oativador de plasminogênio tecidual (TPA) líder (SEQ ID NO: 9) ou a ActRIIa líder nativa (SEQ ID NO: 10). O polipeptídeo ActRIla-hFc ilustrado em SEQ ID NO: 13 usa um TPA líder.
Fragmentos funcionalmente ativos de polipeptídeos ActRIIa podem ser obtidos tri
ando polipeptídeos produzidos recombinantemente a partir do fragmento correspondente do ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ActRIIa. Além do mais, os fragmentos podem ser quimicamente sintetizados usando técnicas conhecidas na tecnologia tal como química f-Moc ou t-Boc de fase sólida de Merrifield convencional. Os fragmentos podem ser produzi10 dos (recombinantemente ou por síntese química) e testados para identificar aqueles fragmentos de peptidila que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActRIIa ou sinalização mediada por ativina.
Variantes funcionalmente ativos de polipeptídeos ActRIIa podem ser obtidos triando bibliotecas de polipeptídeos modificados produzidos recombinantemente a partir de ácidos 15 nucléicos mutagenizados correspondentes que codificam um polipeptídeo ActRIIa. Os variantes podem ser produzidos e testados para identificar aqueles que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActRIIa ou sinalização mediada por ativina. Em certas modalidades, uma variante funcional dos polipeptídeos ActRIIa compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 75 % idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecio20 nada de SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em certos casos, o variante funcional tem uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98%, 99 % ou 100 % idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3.
Variantes funcionais podem ser geradas modificando a estrutura de um polipeptídeo ActRIIa com propósitos tais como melhorar a eficácia terapêutica, ou estabilidade (por exemplo, vida em prateleira ex vivo e resistência a degradação proteolítica in vivo). Tais polipeptídeos ActRIIa modificados, quando selecionados para manter a ligação da ativina, são considerados equivalentes funcionais dos polipeptídeos ActRIIa de ocorrência natural. Polipeptídeos ActRIIa modificados também podem ser produzidos, por exemplo, por substituição, deleção ou adição de aminoácido. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma Ieucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, mutações conservativas) não terão um efeito importante na atividade biológica da molécula resultante. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem em uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. Pode-se determinar facilmente se uma mudança na seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo AetRIIa resulta em um homólogo funcional avaliando a capacidade do variante de polipeptídeo ActRIIa produzir uma resposta em células de uma maneira simiIar ao polipeptídeo ActRIIa tipo selvagem.
Em certas modalidades, a presente invenção contempla métodos para tratar ou prevenir câncer de mama usando polipeptídeos ActRIIa com mutações específicas que alteram a glicosilação do polipeptídeo. Tais mutações podem ser selecionadas de maneira a introduzir ou eliminar um ou mais sítios de glicosilação, tais como sítios de glicosilação ligados a O ou ligados a N. Os sítios de reconhecimento de glicosilação ligados a asparagina compreendem em geral uma seqüência de tripeptídeo, asparagina-X-treonina ou asparagina-X-serina (onde "X" é qualquer aminoácido) que é reconhecida especificamente por enzimas de glicosilação celular apropriadas. A alteração também pode ser realizada pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na seqüência do polipeptídeo ActRIIa tipo selvagem (para sítios de glicosilação ligados a O). Uma variedade de substituições de aminoácidos ou deleções de uma ou ambas da primeira ou terceira posições de aminoácidos de um sítio de reconhecimento de glicosilação (e/ou deleção de aminoácido na segunda posição) resulta em não glicosilação na seqüência de tripeptídeo modificada. Um outro meio de aumentar o número de frações de carboidrato em um polipeptídeo ActRIIa é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos no polipeptídeo ActRIIa. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(s) pode(m) ser anexado a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxila livres; (c) grupos sulfidrila livres tal como aquele de cisteína; (d) grupos hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. A remoção de uma ou mais frações de carboidrato presente em um polipeptídeo ActRIIa pode ser realizada química e/ou enzimaticamente. A deglicosilação química pode envolver, por exemplo, exposição do polipeptídeo ActRIIa ao composto ácido trifluormetanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares, com exceção do açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N- acetilgalactosamina), deixando ao mesmo tempo a seqüência de aminoácidos intacta. A clivagem enzimática de frações de carboidrato em polipeptídeos ActRIIa pode ser atingida pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases descritas por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. A seqüência de um polipeptídeo ActRIIa pode ser ajustada, da maneira apropriada, dependendo do tipo de sistema de expressão usado, visto que as células de mamífero, de levedura, de inseto e de planta podem todas introduzir padrões de glicosilação diferentes que podem ser afetados pela seqüência de aminoácidos do peptídeo. Em geral, proteínas ActRIIa para uso em humanos pode ser expressa em uma linhagem celular de mamífero que fornece glicosilação própria, tal como linhagens celulares HEK293 ou CHO, embora espera-se que outras linhagens celulares de expressão de mamíferos sejam igualmente usadas.
Esta revelação contempla adicionalmente um método de gerar mutantes, particuIarmente conjuntos de mutantes combinatórios de um polipeptídeo ActRIIa1 bem como mutantes truncados; reuniões de mutantes combinatórios são especialmente usadas para identificar seqüências de variante funcional. O propósito de triar tais bibliotecas combinatórias pode ser para produzir, por exemplo, variantes de polipeptídeo ActRIIa que se ligam a ativi5 na ou outros elementos de ligação. Uma variedade de ensaios de triagem é fornecida a seguir, e tais ensaios podem ser usados para avaliar variantes. Por exemplo, um variante de polipeptídeo ActRIIa pode ser triado pela capacidade de se ligar a um ligante de ActRIIa, prevenir a ligação de um ligante ActRIIa a um polipeptídeo ActRIIa ou interferir na sinalização causada por um ligante ActRI Ia.
A atividade de um polipeptídeo AetRIIa ou seus variantes também pode ser testada
em um ensaio com base em células ou in vivo. Por exemplo, o efeito de um variante de polipeptídeo ActRIIa na expressão de genes envolvidos na hematopoiese pode ser avaliado. Células cancerígenas podem se referir a células em um sujeito vivo que constitui um tumor sólido para células que foram originadas de um tumor e que foram espalhadas para outros 15 locais em um sujeito vivo (isto é, células metastáticas). Adicionalmente, células cancerígenas podem referir-se a células obtidas ou derivadas de um tumor ou crescimento cancerígeno e que são cultivadas in vivo. Células cancerígenas também englobam linhagens celulares que posem ser cultivadas in vitro ou usadas em estudos de xenoenxerto de animal, por exemplo. Células cancerígenas podem referir-se a células derivadas de células metastáticas 20 através de divisão celular depois da metástase. As células podem ser responsivas por hormônio (por exemplo, receptor de estrógeno positivo) ou independentes de hormônio (por exemplo, receptor negativo). Proliferação ou sobrevivência de células cancerígenas pode ser avaliado na presença de uma ou mais proteínas de ligante de ActRIIa recombinante (por exemplo, ativina), e as células podem ser transfectadas de maneira a produzir um polipeptí25 deo ActRIIa e/ou variantes deste e, opcionalmente, um ligante ActRIIa. Similarmente, um polipeptídeo AetRIIa pode ser administrado a um camundongo ou outro animal, e uma ou mais medições, tais como tamanho do tumor ou a taxa de proliferação ou apoptose celular com relação a um controle, podem ser avaliados.
Podem ser geradas variantes combinatoriamente derivadas que têm uma potência 30 seletiva ou em geral maior com relação a um polipeptídeo ActRIIa de ocorrência natural. Similarmente, a mutagênese pode dar origem a variantes que têm meias-vidas intracelulares muito diferentes daquelas que correspondem a um polipeptídeo ActRIIa tipo selvagem. Por exemplo, a proteína alterada pode tornar-se tanto mais estável quanto menos estável a degradação proteolítica ou outros processos celulares que resultam na destruição ou, de outra 35 forma, na inativação de um polipeptídeo ActRIIa nativo. Tais variantes, e os genes que os codificam, podem ser utilizados para alterar níveis de polipeptídeo ActRIIa modulando a meia-vida dos polipeptídeos ActRIIa. Por exemplo, uma meia-vida curta pode dar origem a efeitos biológicos mais transientes e, quando parte de um sistema de expressão indutível, pode permitir controle mais rigoroso dos níveis de polipeptídeo ActRIIa na célula. Em uma proteína de fusão Fe, as mutações podem ser realizadas no ligante (se houver) e/ou na porção Fc para alterar a meia-vida da proteína.
Uma biblioteca combinatória pode ser produzida por meio de uma biblioteca dege
nerada de genes que codificam uma biblioteca de polipeptídeos, em que cada qual inclui pelo menos uma porção de seqüências de polipeptídeo ActRIIa potenciais. Por exemplo, uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos pode ser enzimaticamente ligada nas seqüências de genes, de maneira tal que o conjunto degenerado de seqüências de nucleotídeos de 10 polipeptídeo ActRIIa potenciais sejam expressos como polipeptídeos individuais ou, alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fago).
Existem muitas maneiras pelas quais a biblioteca de homólogos potenciais pode ser produzida a partir de uma seqüência de oligonucleotídeo degenerada. A síntese química de uma seqüência de gene degenerada pode ser realizada em um sintetizador de DNA automático, e os genes sintéticos podem a seguir ser ligados em um vetor apropriado para expressão. A síntese de oligonucleotídeos degenerados é bem conhecida na técnica (ver, por exemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273- 289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic acid Res. 1 1 Ali). Tais técnicas foram empregadas na evolução direcionada de outras proteínas (ver, por exemplo, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al.,(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; bem como patente U.S. 5.223.409, 5.198.346 e 5.096.815).
Alternativamente, outras formas de mutagênese podem ser utilizadas para produzir uma biblioteca combinatória. Por exemplo, variantes de polipeptídeo ActRIIa podem ser produzidos e isolados de uma biblioteca triando pelo uso, por exemplo, mutagênese de varredura de alanina e similares (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., 30 (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-1 18; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597- 601 ; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; e Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), por mutagênese de varredura de ligante (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et 35 al., (1982) Science 232:316); por mutagênese de saturação (Meyers et al., (1986) Science 232:613); por mutagênese por PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1 : 1 1-19); ou por mutagênese aleatória, incluindo mutagênese química, etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; e Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). A mutagênese de varredura de ligante, particularmente em um ajuste combinatório, é um método atrativo para identificar formas truncadas (bioativa) de polipeptídeos ActRIIa.
Uma ampla faixa de técnicas é conhecida na tecnologia para triar produtos genéti
cos de bibliotecas combinatórias feitas por mutações puntuais e truncações e, no que diz respeito ao assunto, para triar bibliotecas de DNAc para produtos genéticos com uma certa propriedade. Tais técnicas serão em geral adaptáveis para triagem rápida das bibliotecas genéticas produzidas pela mutagênese combinatória de polipeptídeos ActRIIa. As técnicas 10 mais amplamente usadas para triar grandes bibliotecas genéticas compreendem tipicamente clonar a biblioteca genética em vetores de expressão replicáveis, transformar células apropriadas com a biblioteca resultante de vetores, e expressar os genes combinatórios em condições nas quais a detecção de uma atividade desejada favorece o isolamento relativamente fácil do vetor que codifica o gene cujo produto foi deletado. Ensaios preferidos incluem en15 saios de ligação da ativina e ensaios de sinalização celular mediados por ativina.
Em certas modalidades, os polipeptídeos ActRIIa de acordo com os métodos aqui descritos podem compreender adicionalmente modificações pós-translacionais além de quaisquer que estejam naturalmente presente nos polipeptídeos ActRIIa. Tais modificações incluem, mas sem limitações, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e 20 acilação. Em função disso, os polipeptídeos ActRIIa modificados podem conter elementos não aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lipídeos, poli- ou mono- sacarídeo e fosfatos. Efeitos de tais elementos não aminoácidos na funcionalidade de um polipeptídeo ActRIIa podem ser testados da maneira aqui descrita para outras variantes de polipeptídeo ActRIIa. Quando um polipeptídeo ActRIIa é produzido nas células clivando uma forma nascente do 25 polipeptídeo ActRIIa1 o processamento pós-translacional também pode ser importante para dobramento e/ou função corretos da proteína. Diferentes células (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ou HEK293) têm maquinário celular e mecanismos característicos específicos para tais atividades pós-translacionais e podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos dos polipeptídeos ActRIIa.
Em certos aspectos, variantes funcionais ou formas modificadas dos polipeptídeos
ActRIIa incluem proteínas de fusão com pelo menos uma porção dos polipeptídeos ActRIIa e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas sem limitações, poli-histidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fe), 35 proteína de ligação da maltose (MBP) ou albumina sérica humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado de maneira a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente usados para isolamento das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Com o propósito de purificação da afinidade, matrizes relevantes para cromatografia de afinidade, tais como resinas conjugadas com glutationa, amilase, e níquel ou cobalto são usadas. Muitas das tais matrizes estão disponíveis na forma de "estojo", tais como o sistema de purificação de GST da Pharmacia e o sistema QIAexpress™ 5 (Qiagen) usado com sócios de fusão (HIS6). Como um outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de maneira a facilitar a detecção dos polipeptídeos ActRIIa. Exemplos de tais domínios de detecção incluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) bem como "marcadores de epítopos," que são usualmente seqüências pequenas de peptídeo seqüências para as quais um anticorpo específico está disponível. Marcadores de epí10 topos bem conhecidos, para os quais anticorpos monoclonais específicos estão facilmente disponíveis incluem FLAG, hemaglutinina do vírus influenza (HA), e marcadores c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um sítio de clivagem de protease, tal como para FatorXa ou Trombina, que permite a protease relevante digerir parcialmente as proteínas de fusão e liberar por meio disto as proteínas recombinantes daí. As proteínas liberadas podem 15 ser isoladas do domínio de fusão por separação cromatográfica subsequente. Em certas modalidade preferidas, um polipeptídeo ActRIIa é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo ActRIIa in vivo (um domínio “estabilizador”). “Estabilizando" significa qualquer coisa que aumente a meia-vida sérica, independendo se isto é em decorrência da menor destruição, menor desobstrução pelo rim, ou outro efeito farmacocinético. Sabe-se que fu20 sões com a porção Fc de uma imunoglobulina conferem propriedades farmacocinéticas desejáveis em uma ampla faixa de proteínas. Similarmente, fusões a albumina sérica humana podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem domínios de multimerização (por exemplo, dimerização, tetramerização) e domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional)
Como um exemplo específico, a presente invenção fornece método para tratar ou
prevenir câncer de mama usando uma proteína de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActRIIa fundido a um domínio Fc (por exemplo, SEQ ID NO: 6). THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWD(A)VSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAK 30 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG PFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN (A) HYTQKSLSLSPGK*
Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações em resíduos tais como Asp-265, Iisina 322 e Asn-434. Em certos casos, o domínio Fc mutante com uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asp-265) reduziu a capacidade de se ligar ao re35 ceptor Fcy com relação a um domínio Fc tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante com uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asn-434) aumentou a capacidade de se ligar ao receptor Fc relacionado a MHC classe I (FcRN) com relação ao dominio Fe tipo selvagem. Deve-se geralmente entender que um domínio Fc pode incluir menores ou maiores partes da região ao constante de uma imunoglobulina, desde que o domínio Fc resultante retenha a capacidade de dimerizar covalentemente através de uma ligação de dissulfeto e formar proteína solúvel relativamente estável.
Entende-se que diferentes elementos das proteínas de fusão podem estar arranja
dos de qualquer maneira que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa pode ser colocado no terminal C de um domínio heterólogo, ou, alternativamente, um domínio heterólogo pode ser colocado no terminal C de um polipeptídeo ActRIIa. O domínio de polipeptídeo ActRIIa e o domínio heterólogo não precisam ser 10 adjacentes em uma proteína de fusão, e domínios adicionais ou seqüências de aminoácidos podem estar incluídos nos terminais C ou N tanto no domínio quanto entre os domínios.
Em certas modalidades, os polipeptídeos ActRIIa usados de acordo com os métodos aqui descritos podem conter uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos ActRIIa. Por exemplo, tais modificações melhoram a meia-vida in vitro dos 15 polipeptídeos ActRIIa1 melhoram a meia-vida circulatória dos polipeptídeos ActRIIa ou diminuem a degradação proteolítica dos polipeptídeos ActRIIa. Tais modificações de estabilização incluem, mas sem limitações, proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo ActRIIa e um domínio estabilizador), modificações de um sítio de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um sítio de glicosilação a um 20 polipeptídeo ActRIIa), e modificações de fração de carboidrato (incluindo, por exemplo, remoção de frações de carboidrato de um polipeptídeo ActRIIa). Da maneira aqui usada, o termo "domínio estabilizador" não se refere apenas a um domínio de fusão (por exemplo, Fe) como no caso de proteínas de fusão, mas também inclui modificações não proteináceas tal como uma fração de carboidrato, ou fração não proteinácea, tal como polietileno glicol.
Em certas modalidades, os métodos descritos aqui utilizam formas isoladas e/ou
purificadas dos polipeptídeos ActRIIa, que são isoladas ou, de outra forma, substancialmente isentas de outras proteínas. Os polipeptídeos ActRIIa serão em geral produzidos por expressão de ácidos nucléicos recombinantes.
3. Ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos ActRIIa São aqui fornecidos ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes que codificam
quaisquer dos polipeptídeos ActRIIa (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa solúveis), incluindo fragmentos, variantes e proteínas de fusão funcionais aqui revelados. Por exemplo, SEQ ID NO: 4 codifica os polipeptídeos precursores de ActRIIa humano de ocorrência natural, enquanto SEQ ID NO: 5 codifica o domínio extracelular de ActRIIa processado. Os ácidos nu35 cléicos em questão podem ser de fita única ou de fita dupla. Tais ácidos nucléicos podem ser moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucléicos podem ser usados, por exemplo, em métodos para preparar polipeptídeos ActRIIa ou como agentes terapêuticos diretos (por exemplo, na abordagem de terapia genética).
Em certos aspectos, entende-se adicionalmente que os ácidos nucléicos em questão que codificam polipeptídeos ActRIIa incluem ácidos nucléicos que são variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5. Seqüências de nucleotídeos variantes incluem seqüências que diferem por uma ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou deleções, tais como variantes alélicas.
Em certas modalidades, a invenção diz respeito a métodos para tratar e prevenir câncer de mama usando seqüências de ácido nucléico isoladas ou recombinantes que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idênticas a SEQ ID NOs: 10 4 ou 5. Versados na tecnologia perceberão que as seqüências de ácido nucléico complementares para SEQ ID NOs: 4 ou 5 e as variantes de SEQ ID NOs: 4 ou 5, estão também no escopo desta invenção. Em modalidades adicionais, as seqüências de ácido nucléico aqui descritas podem ser isoladas, recombinantes e/ou fundidas com uma seqüência de nucleotídeo heteróloga, ou em uma biblioteca de DNA.
Em outras modalidades, ácidos nucléicos usados de acordo com os métodos aqui
descritos também incluem seqüências de nucleotídeos que hibridizam em condições de alto rigor para a seqüência de nucleotídeo designada em SEQ ID NOs: 4 ou 5. Da maneira discutida anteriormente, versados na tecnologia entenderão facilmente que condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridização do DNA podem ser variadas. Versados na 20 tecnologia entenderão facilmente que as condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridização do DNA podem ser variadas. Por exemplo, poderia ser realizada a hibridização a 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45 0C1 seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 °C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50 °C até um alto rigor de cerca de 25 0,2 x SSC a 50 0C. Além do mais, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de baixas condições rigorosas à temperatura ambiente, cerca de 22 °C, para altas condições rigorosas em cerca de 65 0C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou temperatura ou concentração de sal podem ser mantidos constantes enquanto a outra variável é mudada. Em uma modalidade, os métodos aqui descritos utilizam ácidos nucléicos 30 que hibridizam em baixas condições rigorosas de 6 x SSC à temperatura ambiente seguido por uma lavagem a 2 x SSC à temperatura ambiente.
Ácidos nucléicos isolados que diferem dos ácidos nucléicos da maneira apresentada em SEQ ID NOs: 4 ou 5 em virtude da degeneração no código genético estão também contemplados para uso de acordo com os métodos aqui descritos. Por exemplo, inúmeros 35 aminoácidos são projetados por mais que um triplete. Códons que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para histidina) pode resultar em mutações "silenciosa" que não afetam a seqüência de aminoácidos da proteína. Entretanto, espera-se que polimorfismos de seqüência de DNA que leva a mudanças na seqüência de aminoácidos das proteínas em questão possam existir entre as células de mamífero. Versados na tecnologia perceberão que estas variações em um ou mais nucleotídeos (até cerca de 3-5 % dos nucleotídeos) dos nucléicos que codificam uma proteína parti5 cular podem existir entre indivíduos de uma dada espécie em virtude de variação alélica natural. Todas e quaisquer variações de nucleotídeo como essas e polimorfismos de aminoácido resultantes estão no escopo desta invenção.
Em certas modalidades, os ácidos nucléicos recombinantes aqui descritos podem ser operacionalmente ligados a uma ou mais seqüências de nucleotídeos regulatórias em 10 uma construção de expressão. Seqüências de nucleotídeos regulatórias serão geralmente apropriadas para a célula hospedeira usada para expressão. Inúmeros tipos de vetores de expressão apropriados e seqüências regulatórias adequadas são conhecidos na tecnologia por uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, a dita uma ou mais seqüências de nucleotídeos regulatórias podem incluir, mas sem limitações, seqüências promotoras, se15 quências líder ou de sinal, sítios de ligação ribossômica, seqüências de início e término transcricionais, seqüências de início e término translacionais, e seqüências melhoradoras ou ativadoras. Promotores constitutivos ou indutíveis como conhecido na tecnologia são contemplados pela invenção. Os promotores podem ser tanto promotores de ocorrência natural quanto promotores híbridos que combinam elementos de mais que um promotor. Uma cons20 trução de expressão pode estar presente em uma célula em um epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida em um cromossomo. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são bem conhecidos na tecnologia e variarão com a célula hospedeira usada.
Em certos aspectos, os métodos aqui descritos utilizam um vetor de expressão
compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo ActRIIa e operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência regulatória. As seqüências regulatórias são reconhecidas na tecnologia e são selecionadas para direcionar expressão do polipeptídeo ActRIIa. Consequentemente, o termo seqüência regulatória inclui promotores, melhora30 dores, e outros elementos de controle de expressão. Seqüências regulatórias exemplares são descritas em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por exemplo, qualquer de uma ampla variedade de seqüências de controle de expressão que controlam a expressão de um seqüência de DNA quando operacionalmente ligada a ela pode ser usada nestes vetores para expressar se35 quências de DNA que codificam um polipeptídeo ActRIIa. Tais seqüências de controle de expressão usadas incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40, promotor tet, promotor precoce imediato de adenovírus ou citomegalovírus, promotores de RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC1 promotor de T7 cuja expressão é dirigida por T7 RNA polimerase, as regiões operadora e promotora principais de fago lambda, as regiões de controle para proteína revestida de fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de ácido fosfatase, por exemplo, Pho5, os 5 promotores dos fatores de σ-conjugação levedura, o promotor poliedro do sistema de baculovírus e outras seqüências conhecidas por controlar a expressão de genes de células procarióticas e eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações destes. Deve-se entender que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína desejada a ser expressa. Além do 10 mais, o número de cópia do vetor, a capacidade de controlar qual número de cópia e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor, tal como marcadores de antibiótico, podem também ser considerados.
Um ácido nucléico recombinante aqui descrito pode ser produzido ligando o gene clonado, ou uma porção deste, em um vetor adequado para expressão tanto em células 15 procarióticas, células eucarióticas (levedura, ave, inseto ou mamífero), quanto em ambas. Veículos de expressão para produção de um polipeptídeo ActRIIa recombinante incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para ex20 pressão em células procarióticas, tal como E. coli.
Alguns vetores de expressão de mamífero contêm tanto seqüências procarióticas par facilitar a propagação do vetor na bactéria, quanto uma ou mais unidades de transcrição eucariótica que são expressas nas células eucarióticas. Os vetores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, 25 pSVT7, pko-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero adequados para transfecção de células eucarióticas. Alguns desses vetores são modificados com seqüências dos plasmídeos bacterianos, tal como pBR322, para facilitar seleção de replicação e resistência a medicamento tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Alternativamente, derivados de vírus tais como o papiloma vírus bovino (BPV-I), ou vírus Epstein30 Barr (pHEBo, derivado de pREP e p205) podem ser usados para expressão transiente de proteínas em células eucarióticas. Exemplos de outros sistemas de expressão viral (incluindo retroviral) podem ser encontrados a seguir na descrição de sistemas de distribuição de terapia genética. Os vários métodos empregados na preparação dos plasmídeos e na transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos na tecnologia. Para outros sis35 temas de expressão adequados tanto para células procarióticas quanto eucarióticas, bem como procedimentos recombinante em geral, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Em alguns exemplos, pode-se desejar expressar os polipeptídeos recombinantes pelo uso de um sistema de expressão de baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expressão de baculovírus incluem vetores derivados de pVL (tais como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (tal como pAcUWI), e vetores derivados de pBlueBac (tal como o /ff-gal contendo pBlueBac III).
Em uma modalidade preferida, um vetor seria projetados para produção dos polipeptídeos ActRIIa em questão em células CHO, tal como um vetor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif), vetores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vetores pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Conforme ficaria aparente, as construções genéticas em questão podem 10 ser usadas para causar expressão dos polipeptídeos ActRIIa em questão em células propagadas na cultura, por exemplo, para produzir proteínas, incluindo proteínas de fusão ou proteínas variantes, para purificação.
Esta revelação também diz respeito a uma célula hospedeira transfectada com um gene recombinante incluindo uma seqüência e codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 5, 15 18, ou 19) para um ou mais dos polipeptídeos ActRIIa em questão. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa aqui descrito pode ser expresso em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto (por exemplo, usando um sistema de expressão de baculovírus), levedura, ou células de mamífero. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas pelos versados na tecno20 logia.
Também fornecidos aqui são métodos de produzir os polipeptídeos ActRIIa em questão. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIa pode ser cultivado em condições apropriadas para permitir que ocorra expressão do polipeptídeo ActRIIa. O polipeptídeo AetRIIa pode ser 25 secretado e isolado de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo AetRI Ia. Alternativamente, o polipeptídeo ActRIIa pode ser retido citoplasmicamente ou em uma fração de membrana e as células colhidas, Iisadas e as proteína isoladas. Uma cultura celular inclui células hospedeiras, meio e outros subprodutos. Os meios adequados para cultura celular são bem conhecidos na tecnologia. Os Polipeptídeos ActRIIa em questão podem ser isola30 dos a partir do meio de cultura celular, células hospedeiras, ou ambos, usando técnicas conhecidas na tecnologia para purificar proteínas, incluindo cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração de gel, ultrafiltração, eletroforese, purificação de imunoafinidade com anticorpos específicos para epítopos particulares dos polipeptídeos ActRIIa e purificação de afinidade com um agente que liga a um domínio fundido ao polipeptídeo ActRIIa (por 35 exemplo, uma coluna A de proteína pode ser usada para purificar uma fusão de ActRIIa-Fc ou ActRIla-Fc). Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo ActRIIa é um proteína de fusão contendo um domínio que facilita sua purificação. Em uma modalidade preferida, a purificação é obtida por uma série de etapas de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais das seguintes, em qualquer ordem: cromatografia A de proteína, cromatografia de sefarose Q, fenilcromatografia de sefarose, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia de troca catiônica. A purificação pode ser completa com filtração viral e tro5 ca de tampão. Da maneira aqui demonstrada, proteína ActRIla-hFc foi purificada a uma pureza de >98 % da forma determinada por cromatografia de exclusão por tamanho e >95 % da maneira determinada por SDS PAGE. Este nível de pureza foi suficiente para obter resultados desejáveis em camundongos, ratos e primatas não humanos.
Em uma outra modalidade, um gene de fusão que codifica uma seqüência líder de 10 purificação, tal como uma seqüência de sítio de clivagem poli-(His)/enteroquinase no Nterminal da porção desejada do polipeptídeo ActRIIa recombinante, pode permitir a purificação da proteína de fusão expressa por cromatografia de afinidade usando uma resina metálica Ni2+. A seqüência líder de purificação pode então ser subsequentemente removida por tratamento com enteroquinase para fornecer o polipeptídeo ActRIIa purificado (por exemplo, 15 ver Hochuli et al., (1987) J. Cromatography 41 1 : 177; e Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
Técnicas para preparar genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente, a junção de vários fragmentos de DNA que codificam diferentes seqüências de polipeptídeos é realizada de acordo com técnicas convencionais, empregando terminais de ponta romba 20 ou ponta escalonada para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer terminais apropriadas, enchimento de terminais coesivos da maneira apropriada, tratamento de fosfatase alcalina para evitar junções indesejáveis, e ligação enzimática. Em uma outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, amplificação de PCR de fragmentos de gene 25 pode ser realizada usando iniciadores âncora que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem subsequentemente ser anelados para gerar uma seqüência de gene quimérico (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
4. Antagonistas Alternativos de Ativina e ActRIIa A presente revelação diz respeito a métodos para tratar ou prevenir câncer de ma
ma usando antagonistas de sinalização de ativina-ActRIla. Embora polipeptídeos ActRIIa solúveis, e particularmente AetRIIa-Fc sejam antagonistas preferidos, e embora tais antagonistas possam afetar crescimento ou sobrevivência de células cancerígenas da mama através de um mecanismo sem ser antagonismo de ativina (por exemplo, inibição de ativina po35 de ser um indicador da tendência de um agente para inibir as atividades de um espectro de moléculas, incluindo, talvez, outros membros da superfamília TGF-beta, e tal inibição coletiva pode levar ao efeito desejado crescimento ou sobrevivência de células cancerígenas da mama), espera-se que outros tipos de antagonistas de ativina-ActRIla sejam usados, incluindo anticorpos anti-ativina (por exemplo, ativina βa, ββ, Pc e /?e)> anticorpos anti-ActRIla, anticorpos anti-ActRIla, antissentido, RNAi ou ácidos nucléicos ribozima que inibem a produção de ActRIIa e/ou ActRIIa, e outros inibidores de ativina, ActRIIa ou ActRIIa, particular5 mente aqueles que interrompem ligação da ativina-ActRIla e/ou ativina-ActRIla. Em certas modalidades, antagonistas específicos para a ativina B (por exemplo, anticorpos de antiativina B) são usados nos métodos da presente invenção.
Um anticorpo que é especificamente reativo com um polipeptídeo ActRIIa (por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIa solúvel) e que tanto liga competitivamente ao 10 ligante com o polipeptídeo ActRIIa quanto de outra forma inibe sinalização mediada por ActRIla pode ser usado como um antagonista de atividades de polipeptídeo ActRIIa. Similarmente, um anticorpo que é especificamente reativo com um polipeptídeo de ativina /?A, ββ, Pc ou βΕ, ou qualquer heterodímero deste, e que interrompe a ligação de ActRIIa e/ou ActRIIa pode ser usado como um antagonista.
Usando imunógenos derivado de um polipeptídeo ActRIIa1 polipeptídeo ActRIIa ou
um polipeptídeo ativina, antissoro anti-proteína/anti-peptídeo ou anticorpos monoclonais podem ser feitos por protocolos padrões (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. de Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Um mamífero, tais como um camundongo, um hamster ou coelho pode ser imunizado com uma forma imunogênica do 20 polipeptídeo ActRIIa, um fragmento antigênico que é capaz de elicitar uma resposta do anticorpo, ou uma proteína de fusão. Técnicas para conferir imunogenicidade em uma proteína ou peptídeo incluem conjugação a carreadores ou outras técnicas bem conhecidas na tecnologia. Uma porção imunogênica de um ActRIIa ou polipeptídeo ativina pode ser administrada na presença de adjuvante. O progresso de imunização pode ser monitorado por de25 tecção de tituladores de anticorpo em plasma ou soro. ELISA ou outros imunoensaios padrões podem ser usados com o imunógeno como antígeno para avaliar os níveis de anticorpos.
Após a imunização de um animal com uma preparação antigênica de um polipeptídeo AetRIIa1 antissoro pode ser obtido e, se desejado, anticorpos policlonais podem ser iso30 Iadas do soro. Para produzir anticorpos monoclonais, células que produzem anticorpo (linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizado e fundidas por procedimentos de fusão de célula somática padrões com células imortalizantes, tal como células de mieloma para produzir células de hibridoma. Tais técnicas são bem conhecidas na tecnologia, e incluem, por exemplo, a técnica de hibridoma (originalmente desenvolvidas por Kohler and Milstein, 35 (1975) Nature, 256: 495-497), a técnica de hibridoma célula B humana (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), e a técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Células de hibridoma podem ser selecionadas imunoquimicamente para produção de anticorpos especificamente reativos com polipeptídeo ActRIIa e anticorpos monoclonais isolados de uma cultura compreendendo tais células de hibridoma. Anticorpos podem também ser gerados triando bibliotecas (por exemplo, biblioteca de exibição de fago) 5 de domínios variáveis de anticorpo ou fragmentos Fab para identificar Iigantes que ligam aos antígenos selecionados (por exemplo, ativinas ou ActRI Ia). Esta abordagem in vitro é frequentemente usada com proteínas que são altamente conservadas entre mamíferos, particularmente camundongos e humanos.
O termo "anticorpo" da maneira aqui usada deve incluir anticorpos totais, por exempio, de qualquer isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc), e inclui fragmentos ou domínios de imunoglobulinas que são reativos com um antígeno selecionado. Anticorpos podem ser fragmentados usando técnicas convencionais e os fragmentos selecionados para utilidade e/ou interação com um epítopo específico de interesse. Assim, o termo inclui segmentos de porções preparadas recombinantemente ou proteoliticamente clivadas de uma molécula do anticorpo que são capazes de reagir seletivamente com uma certa proteína. Exemplos não Iimitantes de tais fragmentos proteolíticos e/ou recombinante incluem Fab, F(ab')2, Fab' , Fv, e anticorpos de cadeia única (scFv) contendo um domínio V[L] e/ou V[H] unido por um ligante peptídeo. Os scFv's podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados para formar anticorpos tendo dois ou mais sítios de ligação. O termo anticorpo também inclui policlonal, monoclonal, ou outras preparações purificadas de anticorpos e anticorpos recombinantes. O termo "anticorpo recombinante", significa um anticorpo, ou domínio de ligação de antígeno de uma imunoglobulina, expresso de um ácido nucléico que foi construído usando as técnicas de biologia molecular, tais como um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano desenvolvidos a partir de um anticorpo de cadeia única. Domínio único e anticorpos de cadeia única estão também incluídos no termo "anticorpo recombinante".
Em certas modalidades, os métodos aqui descritos podem utilizar um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo monoclonal. Também fornecidos são métodos para gerar anticorpos inéditos. Por exemplo, um método para gerar um anticorpo monoclonal que liga especificamente a um polipeptídeo ActRIIa ou polipeptídeo ativina pode compreender admi30 nistrar a um camundongo uma quantidade de uma composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo do antígeno efetivo para estimular uma resposta imune detectável, obtendo células que produzem anticorpo (por exemplo, células do baço) do camundongo e fundindo as células que produzem anticorpo com células mieloma para obter hibridomas de produção de anticorpo, e testar os hibridomas de produção de anticorpo para identificar um 35 hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que liga especificamente ao antígeno. Uma vez obtido, um hibridoma pode ser propagado em uma cultura celular, opcionalmente nas condições de cultura onde as células derivadas de hibridoma produzem o anticorpo monoclonal que liga especificamente ao antígeno. O anticorpo monoclonal pode ser purificado da cultura celular.
O adjetivo "especificamente reativo com" da maneira usada na referência a um anticorpo deve significar, como é geralmente entendido na tecnologia, que o anticorpo é suficientemente seletivo entre o antígeno de interesse (por exemplo, polipeptídeo ActRI Ia) e outros antígenos que não são de interesse que o anticorpo seja usado, para no mínimo, detectar a presença do antígeno de interesse em um tipo particular de amostra biológica. Em certos métodos que empregam o anticorpo, tal como aplicações terapêuticas, pode ser desejável um grau mais alto de especificidade na ligação. Anticorpos monoclonais geralmente têm uma maior tendência (comparado aos anticorpos policlonais) de discriminar efetivamente entre os antígenos desejados e polipeptídeos de reação cruzada. Uma característica que influencia a especificidade de uma interação anticorpo:antígeno é a afinidade do anticorpo com o antígeno. Embora a especificidade desejada possa ser atingida com uma faixa de diferentes afinidades, geralmente anticorpos preferidos terão uma afinidade (uma constante de dissociação) de cerca de 10“®, 10'7, 10-8, 10'9 M ou menos.
Além do mais, as técnicas usadas para selecionar anticorpos a fim de identificar um anticorpo desejável pode influenciar nas propriedades do anticorpo obtido. Por exemplo, se um anticorpo deve ser usado para ligar um antígeno em solução, pode-se desejar testar a ligação da solução. Uma variedade de diferentes técnicas é disponível para testar interação 20 entre anticorpos e antígenos para identificar anticorpos particularmente desejáveis. Tais técnicas incluem ensaios de ligação de ressonância de plasma superficiais ELISAs, (por exemplo, o ensaio de ligação Biacore™, Biacore AB, Uppsala, Suécia), ensaios sanduíche (por exemplo, o sistema de conta paramagnético de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), western blots, ensaios de imunoprecipitação, e imunoistoquímica.
Exemplos de categorias de compostos de ácido nucléico que são antagonistas ati
vina ou ActRIIa incluem ácidos nucléicos antissentido, construções RNAi e construções de ácido nucléico catalítico. Um composto do ácido nucléico pode ser de fita única ou dupla. Um composto de fita dupla pode também incluir regiões de saliências ou não complementariedade, onde uma ou outra das fitas é fita única. Um composto de fita única pode incluir 30 regiões de auto-complementariedade, significando que o composto forma uma assim chamada estrutura "grampo" ou “semicircular”, com uma região de estrutura helicoidal dupla. Um composto do ácido nucléico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que é complementar com uma região consistindo em não mais que 1.000, não mais que 500, não mais que 250, não mais que 100, ou não mais que 50, 35, 25, 22, 20, 18 ou 15 nucleotídeos 35 da seqüência de ácido nucléico de ActRIIa de comprimento total ou seqüência de ácido nucléico de ativina PA, ββ, βο, ou βε. A região de complementariedade seria preferivelmente pelo menos 8 nucleotídeos, e opcionalmente cerca de 18 a 35 nucleotídeos. Uma região de complementariedade faltaria em um íntron, uma seqüência de codificação ou um seqüência de não codificação do alvo transcrito, tal como a porção da seqüência de codificação. Geralmente, um composto do ácido nucléico teria um comprimento de cerca de 8 a cerca de 500 nucleotídeos ou pares de base em comprimento, e opcionalmente o comprimento seria 5 cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos. Um ácido nucléico pode ser um DNA (particularmente para usar como um antissentido), RNA ou RNA:DNA híbrido. Qualquer uma fita pode incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem facilmente ser classificadas tanto como DNA quanto RNA. Similarmente, um composto de fita dupla pode ser DNA:DNA, DNA:RNA ou RNA:RNA, e qualquer uma fita pode também incluir uma 10 mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem ser facilmente classificado tanto como DNA quanto RNA. Um composto do ácido nucléico pode incluir qualquer de uma variedade de modificações, incluindo uma modificação ou modificações na espinha dorsal (a porção açúcar-fosfato em um ácido nucléico natural, incluindo ligações internucleotídeo) ou a porção base (a porção de purina ou pirimidina de um ácido nucléico natural). Um 15 composto antissentido do ácido nucléico teria preferivelmente um comprimento de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos e conteria frequentemente uma ou mais modificações para melhorar características, tal como estabilidade no soro, em uma célula ou em um local onde o composto deve provavelmente ser distribuído, tais como o estômago no caso de compostos oralmente distribuídos e o pulmão pra compostos inalados. No caso de uma construção 20 RNAi, a fita complementar para o alvo transcrito será geralmente RNA ou modificações deste. A outra fita pode ser RNA, DNA ou qualquer outra variação. A porção duplex de fita dupla ou fita única "grampo" construção RNAi terá geralmente um comprimento de 18 a 40 nucleotídeos em comprimento e opcionalmente cerca de 21 a 23 nucleotídeos em comprimento, desde que ela sirva como um substrato Dicer. Ácidos nucléicos catalíticos ou enzimáticos 25 podem ser ribossomas ou enzimas de DNA e podem também conter formas modificadas. Compostos de ácido nucléico podem inibir expressão do alvo por cerca de 50 %, 75 %, 90 % ou mais quando em contato com células em condições fisiológicas e a uma concentração onde um controle não sentido ou sentido tem pouco ou nenhum efeito. Concentrações preferidas para testar o efeito de compostos de ácido nucléico são 1, 5 e 10 micromolar. Compos30 tos de ácido nucléico podem também ser testados para efeitos, por exemplo, na proliferação ou sobrevivência das células cancerígenas da mama ou tumores da mama.
5. Ensaios de Triagem
Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito ao uso de Polipeptídeos ActRIla (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa solúveis) e polipeptídeo ativina para identificar compostos (agentes) que são agonista ou caminho de sinalização dos antagonistas de ativina ActRIIa e/ou ativina ActRIIa. Compostos identificados através desta seleção podem ser testados para avaliar sua capacidade de modular o crescimento ou sobrevivência de células cancerígenas, particularmente células cancerígenas da mama, in vivo ou in vitro. Estes compostos podem ser testados, por exemplo, em modelos animais, tal como modelos de xenoenxerto. Um modelo animal usado é o modelo de câncer de mama MDA-MB231 de murino, células MDA-MB231 são dependentes de hormônio e são propensos a metastizar 5 no osso. Outros modelos de câncer de mama podem ser gerados, por exemplo, implantando-se células neuroblastoma de rato (das quais o oncogene neu foi inicialmente isolado), ou células NIH-3T3 neu-transformadas em camundongo nude, essencialmente da maneira descrita por Drebin et al. Proc. Nat. Superfície do corpo do ímã USA, 83:9129-9133 (1986).
Existem inúmeras abordagens para selecionar agentes terapêuticos para tratar ou 10 prevenir câncer de mama alvejando sinalização de ativina e ActRIIa. Em certas modalidades, seleção de alta produção de compostos pode ser realizada para identificar agentes que perturbam efeitos mediados por ativina ou ActRIIa em uma linhagem celular selecionada. Em certas modalidades, o ensaio é realizado para selecionar e identificar os compostos que inibem especificamente ou reduzem a ligação de um polipeptídeo ActRIIa em ativina. Alter15 nativamente, o ensaio pode ser usado para identificar compostos que melhoram a ligação de um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIa em ativina. Em uma modalidade adicional, os compostos podem ser identificados pela sua capacidade de interagir com um ativina ou polipeptídeo ActRI Ia.
Uma variedade de formatos de ensaio será suficiente e, sob a Iuz da presente revelação, aqueles não expressamente aqui descritos, no entanto, serão compreendidos pelos versados na tecnologia. Da maneira aqui descrita, compostos testes (agentes) podem ser criados por qualquer método químico combinatorial. Alternativamente, os compostos em questão podem ser de biomoléculas de ocorrência natural sintetizadas in vivo ou in vitro. Compostos (agentes) a ser testados com relação à sua capacidade de agir como moduladores de crescimento do tecido podem ser produzidos, por exemplo, por bactéria, levedura, plantas ou outros organismos (por exemplo, produtos naturais), produzidos quimicamente (por exemplo, pequenas moléculas, incluindo peptidomiméticas), ou produzidos recombinantemente. Compostos teste contemplados aqui incluem moléculas orgânicas não peptidil, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, açúcares, hormônios, e moléculas de ácido nucléico. Em uma modalidade específica, o agente teste é uma pequena molécula orgânica tendo um peso molecular de menos que cerca de 2,000 Daltons.
Os compostos podem ser fornecidos como entidades únicas, discretas, ou fornecidos em bibliotecas de maior complexidade, tal como feito por substâncias químicas combinatoriais. Estas bibliotecas podem compreender, por exemplo, álcoois, haletos de alquila, 35 aminas, amidas, ésteres, aldeídos, éteres e outras classes de compostos orgânicos. A apresentação de compostos teste no sistema teste podem ser tanto em uma forma isoladas quanto como misturas de compostos, especialmente nas etapas de seleção iniciais. Opcionalmente, os compostos podem ser opcionalmente derivatizados com outros compostos e têm grupos de derivatização que facilitam a isolação dos compostos. Exemplos não Iimitantes de grupos de derivatização incluem biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, poliistidina, gotas magnéticas, glutationa S transferase (GST), reticuIadores fotoativáveis ou qualquer combinações destes.
Em muitos medicamentos para selecionar programas que testam bibliotecas de compostos e extratos naturais, ensaios de alta produção são desejáveis a fim de maximizar o número de compostos que sobreviveram em um dado período de tempo. Ensaios que são realizados em sistemas sem célula como esses, podem ser derivados com proteínas purifi10 cadas ou semipurificadas, são frequentemente preferidos como seleções "primárias" no qual eles podem ser gerados para permitir desenvolvimento rápido e detecção relativamente fácil de uma alteração em um alvo molecular que é mediado por um composto teste. Além do mais, os efeitos de toxicidade celular ou biodisponibilidade do composto teste podem ser geralmente ignorados no sistema in vitro, o ensaio em vez disso sendo focado basicamente 15 no efeito do medicamento no alvo molecular como pode ser manifestado em uma alteração de afinidade de ligação entre um polipeptídeo ActRIIa e ativina.
Meramente para ilustrar, em um ensaio de seleção exemplar, o composto de interesse é colocado em contato com um polipeptídeo ActRIIa isolado e purificado que é ordinariamente capaz de se ligar a ativina. À mistura do composto e polipeptídeo ActRIIa é então adicionada uma composição contendo um agente de ligação ActRIIa. A detecção e quantificação de complexos ActRIla/ativina fornece um meio para determinar o eficácia do composto na inibição (ou potencialização) de formação de complexo entre o polipeptídeo ActRIIa e ativina. A eficácia do composto pode ser avaliada gerando curvas de resposta de dose a partir dos dados obtidos usando várias concentrações do composto teste. Além do mais, um ensaio controle pode também ser realizado para fornecer uma linha de base para comparação. Por exemplo, em um ensaio controle, ativina isolada e purificada é adicionada a uma composição contendo o polipeptídeo ActRI Ia, e a formação do complexo ActRIla/ativina é quantificado na ausência do composto teste. Deve-se entender que, em geral, a ordem na qual os reagentes podem ser misturados pode ser variada, e pode ser misturado simultaneamente. Além do mais, no lugar de proteínas purificadas, extratos celulares e Iisatos podem ser usados para tornar um sistema de ensaio sem célula adequado.
Formação do complexo entre o polipeptídeo ActRIIa e ativina pode ser detectada por uma variedade de técnicas. Por exemplo, modulação da formação de complexos pode ser quantificada usando, por exemplo, proteínas marcadas detectáveis tais como polipeptí35 deo ActRIIa ou ActRIIa ou ativina radiomarcados (por exemplo, 32P, 35S, 14C ou 3H), marcados fluorescentemente (por exemplo, FITC), ou marcados enzimaticamente, por imunoensaio, ou por detecção cromatográfica. Em certas modalidades, ensaios polarização de fluorescência e ensaios na medição de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), podem ser usados para medir tanto direta quanto indiretamente, do grau de interação entre um polipeptídeo ActRIIa e sua proteína de ligação. Outros modos de detecção, tal como aqueles com 5 base em guias de onda óticas (Publicação PCT WO 96/26432 e patente U.S. 5.677.196), ressonância de plasma de superfície (SPR), sensores de carga de superfície, e sensores de forca de superfície.
Uma interação de ensaio trap, também conhecido como o "dois ensaios híbridos", podem também ser usados para interromper ou potencializar a interação entre um polipeptí10 deo ActRII e sua proteína de ligação. Ver por exemplo, patente U.S. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 2046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; e Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Em uma modalidade específica, a um sistema de dois híbridos reverso pode ser usado para identificar compostos (por exemplo, pequenas moléculas ou peptídeos) que dissociam interações 15 entre um polipeptídeo ActRIIa e sua proteína de ligação. Ver por exemplo, Vidal and Legrain, (1999) acids nucleics Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374- 81; e patentes U.S. 5.525.490, 5.955.280 e 5.965.368.
Em certas modalidades, os compostos são identificados por sua capacidade de interagir com um polipeptídeo ActRIIa ou ativina aqui descritos. A interação entre o composto e o polipeptídeo ActRI Ia, ou ativina pode ser covalente ou não covalente. Por exemplo, tal interação pode ser identificada no nível de proteína usando métodos bioquímicos in vitro, incluindo fotorreticulação, ligação de agente de ligação radiomarcados, e cromatografia de afinidade (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). Em certos casos, os compostos podem ser selecionados em um mecanismo baseado no ensaio, tal como um ensaio para detectar compostos que se ligam a um ativina ou polipeptídeo ActRIIa. Isto pode incluir um evento de ligação de fase sólida ou fase de fluido. Alternativamente, o gene que codifica um ativina ou polipeptídeo ActRIIa podem ser transfectado com um sistema reportador (por exemplo, /?-galactosidase, luciferase, ou proteína fluorescente verde) em uma célula e selecionada contra a biblioteca opcionalmente por uma seleção de alta produção ou com membros individuais da biblioteca. Outro mecanismo baseado em ensaios de ligação pode ser usado, por exemplo, ensaios de ligação que detectam mudanças em energia livre. Ensaios de ligação podem ser realizados com o alvo fixado em um poço, gota ou chipe ou capturado por um anticorpo imobilizado ou resolvido por eletroforese capilar. Os compostos ligados podem ser detectados usando normalmente ressonância de plasma colorimétrica ou de fluorescência ou de superfície.
6. Usos terapêuticos Exemplares
Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenir câncer de mama em um indivíduo que necessita deste administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um antagonistas de ativina-ActRIla, tal como, por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa. Estes métodos podem ser usados para tratamento terapêutico bem como profilático de humanos particularmente mulheres que têm o risco de de5 senvolver câncer de mama. Como cada mulher com o risco de desenvolver câncer de mama, uma mulher com um alto risco de desenvolver câncer de mama é uma mulher cujos fatores de risco conferem uma maior probabilidade de desenvolver a doença, comparado a população geral ou a população de mulheres em um certo grupo de idade. Fatores de risco exemplares incluem idade, histórico familiar ou constituição genética, hábito de vida tais co10 mo exercício e dieta, exposição a radiação ou outros agentes que causam câncer, idade no momento em que nasce a primeira criança, mudanças genética, e ganho de peso após a menopausa.
Da maneira aqui usada, uma substância terapêutica que "previne" um distúrbio ou condição refere-se a um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência do 15 distúrbio ou condição na amostra tratada com relação a uma amostra controle não tratada, ou atrasa o princípio de ação de um ou mais sintomas ou características do distúrbio ou condição com relação à amostra controle não tratada. Por exemplo, prevenir câncer de mama pode referir-se a ausência de novas lesões após o tratamento, ou a ausência ou atraso de doença metastática.
O termo "tratar câncer de mama" refere-se a uma melhoria de um ou mais sintomas
ou características da doença com relação a um controle não tratado ou com relação à gravidade de doença antes do tratamento. O termo não exige necessariamente que o paciente que recebe o tratamento seja curado ou que a doença seja completamente erradicado do paciente. Um agente que trata câncer de mama pode ser um agente que reduz a gravidade 25 de um ou mais sintomas ou características da doença. Deve-se notar que crescimento e progresso do tumor é influenciado por uma variedade de fatores, incluindo mediadores de progressão do ciclo celular e divisão celular e reguladores de morte celular, ou apoptose. Consequentemente, tratar câncer de mama pode envolver uma diminuição na proliferação de célula cancerígena ou uma diminuição na taxa de divisão celular. Alternativamente ou 30 adicionalmente, tratar câncer de mama pode envolver uma diminuição em sobrevivência da célula cancerígena, um aumento em apoptose ou uma menor ocorrência ou gravidade de câncer de mama metastática, particularmente câncer de mama metastática do osso. Consequentemente, em certas modalidades, tratar câncer de mama pode envolver tanto uma diminuição na divisão celular quanto um aumento na morte celular. Independente do meca35 nismo, a eficácia de um agente em tratar câncer de mama pode ser determinada por matrizes observáveis, tal como um baixo número de células cancerígenas comparadas a um controle (tanto em virtude de menor proliferação, maior apoptose, quanto ambos), ou uma diminuição no tamanho do tumor comparado a um controle. Portanto, tratar câncer de mama ou inibir crescimento de tumor ou célula cancerígena é deve ser neutro como para o mecanismo pelo qual ocorre uma mudança como essa. Tanto prevenção quanto tratamento pode ser discernido no diagnóstico fornecido por um médico ou outro profissional de e a análise do resultado visado de administração do agente terapêutico.
Quando se observam ao mesmo tempo os efeitos dos antagonistas em questão na progressão do câncer de mama em humanos, um efeito pode ser avaliado por uma diminuição ou desaparecimento de doença mensurável e/ou a ausência de novas lesões ou a prevenção de metástases. Por exemplo, antagonistas de ativina ActRIIa podem reduzir ou atra10 sar significativamente a progressão do câncer de mama em pacientes tanto com câncer de mama não invasivo quanto invasivo. Além do mais, os antagonistas podem prevenir ou reduzir o risco de desenvolver câncer de mama em mulher saudável com fatores de risco para a doença. Os antagonistas podem também reduzir o risco de recorrência de câncer de mama em pacientes com um histórico da doença.
Consequentemente, antagonistas ativina da ActRIIa podem ser usados para preve
nir ou atrasar o início de ação de câncer de mama em indivíduos considerados ter o risco de desenvolver a doença, e tais antagonistas podem ser usados em populações de paciente selecionado. Exemplos de populações de paciente apropriados incluem pacientes com um histórico familiar de câncer de mama e ovário, tal como pacientes fêmeas onde uma mãe ou irmã foi diagnosticada com a doença. Pacientes que têm mutações nos genes BRCA 1/2 ou outros genes se mostram mulher predispostas ao câncer de mama e ovário são também incluídos. Em uma modalidade, um paciente considerado com alto risco de desenvolver câncer de mama, mas que não foi diagnosticado com a doença é tratado com um antagonista da ativina ActRIIa. Tal tratamento pode iniciar quando o paciente atinge a idade de 30, 35, ou 40, ou quando um paciente feminino não está tentando conceber (isto é, o paciente não planeja dar a Iuz a uma criança) ou tenha atingido a menopausa. Em particular, dados aqui apresentados demonstram que antagonistas ativina da ActRIIa inibem o espalhamento metastático de uma linhagem celular de câncer de mama introduzido na circulação geral, demonstrando que tais antagonistas podem ser usados na prevenção de metástases de tumores da mama. Tais compostos seriam usados para tratar qualquer paciente que foi diagnosticado com câncer de mama ou suspeito de ter câncer de mama. Adicionalmente, pacientes que são considerados ter uma mastectomia preventiva ou eletiva, em virtude de risco elevado de desenvolver um tumor de mama podem ser leitos em substituição ou em adição para tomar um antagonista da ativina ActRIIa para diminuir o risco de espalhamento metastático de tumores não detectados.
Antagonistas ativina da ActRIIa aqui revelados, e particularmente Proteínas ActRIla-Fc, podem ser usados para tratar ou prevenir câncer de mama em um paciente, incluindo pacientes com tumores sólidos bem como pacientes com câncer metastático. Antagonistas ativina da ActRIIa podem também ser administrados a sujeitos humanos com lesões précancerígenas ou benignas da mama ou com qualquer lesões proliferativas anormais incluindo hiperplasia típica, hiperplasia atípica, e carcinoma não invasivo ou in situ. Os antagonis5 tas da presente revelação são também usados no tratamento ou prevenção tanto de cânceres dependente de hormônio ou responsivo a hormônio (por exemplo, cânceres positivos para receptores de estrógeno) e cânceres independentes de hormônio (por exemplo, cânceres negativos para receptor de estrógeno ou mutantes para receptor de estrógeno). Antagonistas ativina da ActRIIa são também usados como agente terapêuticos para cânceres nos 10 quais fatores de crescimento ou oncogenes são ativados (por exemplo, cânceres de mama nos quais tirosina quinase c-erbB-2 (também conhecido como HER-2/Neu)) é expressa. Antagonistas ativina da ActRIIa podem se mostrar particularmente usados em tumores que expressam elevados níveis (com relação a células derivadas de tecido de mama normal) de ativina (por exemplo, A, AB ou B) ou níveis elevados de ActRIIa ou ActRIIb.
A presente invenção reconhece que a eficácia de terapias convencionais de câncer
(por exemplo, quimioterapia, terapia de radiação, fototerapia, imunoterapia, e cirurgia) pode ser aumentada através do uso dos antagonistas em questão. Consequentemente, antagonistas ativina da ActRIIa podem ser usados em combinação com terapias para o tratamento, prevenção, ou controle de câncer de mama. Os antagonistas podem ser administrados aos 20 pacientes em combinação com radiação e/ou tratamento cirúrgico bem como com quimioterapia citotóxica e/ou terapias endócrinas. Tais tratamentos de combinação podem funcionar sinergisticamente e permite a redução de dosagem de cada um dos tratamentos individuais, reduzindo desta forma os efeitos colaterais detrimentais enxertados por cada tratamento em maiores dosagens. Em outras instâncias, malignidade que são refratárias a um tratamento 25 podem responder a uma terapia de combinação de dois ou mais diferentes tratamentos. Consequentemente, a revelação diz respeito a administração de um antagonista da ativina ActRIIa em combinação com um outro agente antineoplástico convencionais, tanto concomitantemente quanto seqüencialmente, a fim de aumentar o efeito terapêutico do agente antineoplástico ou superar a resistência celular a tal agente antineoplástico.
Compostos farmacêuticos que podem ser usados para terapia antitumor combinató
ria incluem, meramente para ilustrar: aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginase, beg, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfano, campotecina, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatina, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dienestrol, dietilstilbes35 trol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estradiol, estramustina, etoposida, exemestano, filgrastim, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracil, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, genisteina, goserelina, hidroxiuréia, idarubicina, ifosfamida, imatinib, interferon, irinotecano, ironotecano, letrozol, leucovorina, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalano, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotida, oxaliplatina, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfimer, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocina, su5 ramina, tamoxifeno, temozolomida, teniposida, testosterona, tioguanina, tiotepa, dicloreto de titanoceno, topotecano, trastuzumab, tretinoina, vinblastina, vincristina, vindesina, e vinorelbina.
Estes compostos antitumor quimioterapêutico podem ser categorizados por seu mecanismo de ação, por exemplo, nos seguintes grupos: agentes antimetabólitos/anticancerígenos, tal como análogos de pirimidina (5-fluorouracil, floxuridina, capecitabina, gemcitabina e citarabina) e análogos de purina, antagonistas de folato e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodeoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos incluindo produtos naturais tal como alcalóides vinca (vinblastina, vincristina, e vinorelbina), disruptores de microtubulo tal como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposida, teniposido), agentes de danificação de DNA (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfano, camfotecina, carboplatina, clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, hexametilmelamineoxaliplatina, ifosfamida, melfalano, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosouréia, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotero, teniposida, trietilenetiofosforamide e etoposide (VP 16)); antibióticos tal como dactinomicina (actinomina D), daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina, antraciclinaes, mitoxantrona, bleomicinas, plicamina (mihramicina) e mitomicina; enzimas (L- asparaginase que metabolisa sistemicamente L-asparagina e depriva células que não têm a capacidade de sintetizar sua própria asparagina); agentes antiplaquetas; agentes de alquilação antiproliferativos/antimitóticos tal como nitrogênio mostardas (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalano, clorambucil), etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), alquil sulfonatos-busulfano, nitrosoúreias (carmustina (BCNU) e análogos, estreptozocina), trazenos - dacarbazinina (DTIC); antimetabólitos antiproliferativos/antimitóticos tal como análogos de ácido fólico (metotrexato); complexos coordenação de platina (cisplatina, carboplatina), procarbazina, hidroxiuréia, mitotano, aminoglutetimida; hormônios, análogos de hormônio (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores de aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintética e outros inibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (tais como ativador plasminogênio do tecido, estreptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratórios; agentes antisecretórios (breveldina); imunossupressivos (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, micofenolato mofetil); compostos antiangiogênico (TNP-470, genisteína) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator do crescimento endotélico vascular (VEGF)1 inibidores do fator de crescimento de fibroblasto (FGF)); bloqueador do receptor de angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos antissentido; anticorpos (trastuzumab); inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação (tretinoina); inibidores de 5 mTOR, inibidores de topoisomerase (doxorubicina (adriamicina), amsacrina, camfotecina, daunorubicina, dactinomicina, eniposida, epirubicina, etoposida, idarubicina e mitoxantrona, topotecano, irinotecano), corticosteróides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona, e prenisolona); inibidores quinase de transdução de sina do fator de crescimento; indutores de disfunção mitocondrial e ativadores de caspase; e disruptores 10 cromatina.
Em certas modalidades, compostos farmacêuticos que podem ser usados para terapia combinatória incluem agentes anti-angiogêneses tal como (1) inibidores de liberação de "moléculas angiogênicas" tal como bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico); (2) neutralizadores de moléculas angiogênicas, tal como um anticorpos anti-/?bFGF; e (3) inibi15 dores de resposta de célula endotelial ao estímulo angiogênico, incluindo inibidor de colagenase, inibidores de renovação da membrana basal, esteróides angiostáticos, inibidores angiogênese derivados fúngico, 4 fator de plaqueta, trombospondina, medicamentos de artrite tais como D-penicilIamina e tiomalato de ouro, análogos de vitamina D3, alfa-interferon, e similares. Para propostas adicionais de inibidores de angiogênese, ver Blood et al., Bioch. 20 Biophys. Acta., 1032:89-1 18 (1990), Moses et al., Science, 248: 1408- 1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988), and U.S. Pat. Nos. 5,092,885, 5,112,946, 5,192,744, 5,202,352 e 6573256. Além do mais, existe uma ampla variedade de compostos que podes ser usados para inibir angiogênese, por exemplo, peptídeos ou agentes que bloqueiam o caminho de angiogênese mediado por VEGF, endostatina proteína ou derivados, fragmen25 tos de ligação de Iisina de angiostatina, melanina ou compostos promotores de melanina, fragmentos de plasminogênio (por exemplo, Kringles 1-3 de plasminogênio), subunidades de tropoína, antagonistas de vitronectina ανβ3, peptídeos derivados de Saposina B, antibióticos ou análogos (por exemplo, tetraciclina, ou neomicina), composições contendo dienogest, compostos compreendendo um núcleo inibitório de MetAP-2 acoplado a um peptídeo, o 30 composto EM-138, chalcona e seus análogos, e inibidores de naladase. Ver, por exemplo, patentes U.S. Nos. 6.395.718, 6.462.075, 6.465.431, 6.475.784, 6.482.802, 6.482.810, 6.500.431, 6.500.924, 6.518.298, 6.521.439, 6.525.019, 6.538.103, 6.544.758, 6.544.947, 6.548.477, 6.559.126, e 6.569.845.
Dependendo da a natureza da terapia combinatória, a administração dos antagonistas terapêuticos da invenção continuar enquanto a outra terapia é administrada e/ou a seguir. A administração dos antagonistas aqui descritos pode ser feita em uma dose única, ou em doses múltiplas. Em alguns exemplos, a administração dos antagonistas começa pelo menos vários dias antes da terapia convencional, enquanto em outros exemplos, a administração começa tanto imediatamente antes quanto no momento da administração da terapia convencional.
7. Composições farmacêuticas
Em certas modalidades, antagonistas de ativina-ActRIla aqui descritos são formula
dos com um carreador farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa pode ser administrado sozinho ou como um componente de uma formulação farmacêutica (composição terapêutica). Os compostos em questão podem ser formulados para administração de qualquer maneira conveniente para o uso em remédio humano ou veterinário.
Em certas modalidades, os métodos para tratar ou prevenir câncer de mama da
maneira aqui descrita inclui administrar a composição sistematicamente, ou localmente como um implante ou dispositivo. Quando administrada a composição terapêutica para uso nesta invenção, é claro, em uma forma isenta de pirogênio fisiologicamente aceitável. Agentes terapeuticamente usados sem ser os antagonistas ativina- ActRIIa que podem também 15 opcionalmente ser incluídos na composição da maneira descrita anteriormente, podem ser administrados simultaneamente ou seqüencialmente com os antagonistas nos métodos da invenção.
Tipicamente, antagonistas de ativina-ActRIla seriam administrados parenteralmente. Composições farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem compreender um ou mais Polipeptídeos ActRIIa em combinação com um ou mais soluções aquosas ou não aquosas isotônicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injetáveis estéreis imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente visado ou agentes de suspensão ou de espessamento. Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigida no caso de dispersões, e pelo uso de agentes tensoativos.
Adicionalmente, a composição pode ser encapsulada ou injetada em uma forma para distribuição a um sítio do tecido alvejado (por exemplo, epitélio mamário). Em certas modalidades, as composições aqui descritas podem incluir uma matriz capaz de distribuir um 35 ou mais compostos terapêuticos (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa) a um sítio do tecido alvejado (por exemplo, epitélio mamário), fornecendo uma estrutura para o desenvolvimento do tecido e idealmente capaz de ser reabsorvida no corpo. Por exemplo, a matriz pode fornecer lenta liberação dos polipeptídeos ActRIIa. Tais matrizes podem ser formadas de materiais atualmente no uso para outras aplicações médicas implantadas.
A escolha de material da matriz é baseada em biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecânicas, aparência cosmética e interface propriedades. A aplicação particular das composições em questão definirá a formulação apropriada. As matrizes potenciais para as composições podem ser biodegradáveis e sulfato de cálcio quimicamente definido, tricalciofosfato, hidroxiapatite, ácido polilático e polianidretos. Outros materiais potenciais são biodegradáveis e biologicamente bem definidos, tal como colágeno ósseo ou dérmico. Matrizes adicionais são compreendidas de componentes de proteínas puras ou matriz extracelular. Outras matrizes potenciais não são biodegradáveis e quimicamente definidas, tal como hidroxiapatite sinterizado, biovidro, aluminatos, ou outras cerâmicas. As matrizes podem ser compreendidas de combinações de qualquer dos tipos de material mencionados anteriormente, tal como ácido polilático e hidroxiapatite ou colágeno e tricálciofosfato. As biocerâmicas podem ser alteradas na composição, tal como em cálcio-aluminatofosfato e processadas para alterar o tamanho do poro, tamanho de partícula, forma de partícula, e biodegradabilidade.
Em certas modalidades, antagonistas aqui descritos podem ser administrados oralmente, por exemplo, na forma de cápsulas, sachês, pílulas, comprimidos, pílulas em forma de losango (usando uma base flavorizada, normalmente sacase e acácia ou tragacanto), 20 pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida óleo em água ou água em óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (usando uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguante bucal e similares, cada qual contendo uma quantidade predeterminada de um agente como um ingrediente ativo. Um antagonista pode também ser 25 administrado como um bolo, eletuário ou pasta.
Em formas de dosagem sólidas para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos, e similares), um ou mais agonistas terapêuticos podem ser misturados com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio, e/ou qualquer dos seguintes: (1) cargas ou extensores, tais co30 mo amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) gentes aglutinantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarose, e/ou acácia; (3) umectantes, tal como glicerol; (4) agentes de desintegração, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, batata ou amido de tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solução, tal como parafina; (6) acelera35 dores de absorção, tal como compostos amônio quaternário; (7) agentes edulcorantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caolim e argila de bentonita; (9) lubrificantes, tais como talco, cálcio estearato, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, sulfato Iauril de sódio, e misturas destes; e (10) agentes de coloração. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes de tamponamento. Composições sólidas de um tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas gelatina cheias macias e 5 duras usando tais excipientes como Iactose ou açúcares de leite, bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similares.
Formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes comumen10 te usados na tecnologia, tal como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1 p3-butileno glicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, de amendoim, de milho, de germe, de oliva, rícino, e sésamo), glicerol, álcool tetraidrofurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, 15 e misturas destes. Além de diluentes inertes, as composições orais também podem incluir adjuvantes, tal como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes adoçantes, flavorizantes, corantes, perfumantes e conservantes.
Suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, tal como álcoois isostearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol, e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto, e misturas destes.
Composições usadas de acordo com os métodos aqui descritos podem também conter adjuvantes, tal como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes de dispersão. Prevenção da ação de microorganismos pode ser garantida pela in25 clusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol, e similares. Pode-se também ser desejável incluir agentes isotônicos, tal como açúcares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Além do mais, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.
Entende-se que o regime de dosagem adequado para tratar ou prevenir câncer de
mama seria determinado pelo médico atendente considerando vários fatores que modificam a ação dos compostos em questão da invenção (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa). Os vários fatores incluem, mas sem limitações, a idade, sexo, e dieta, a gravidade da doença, tempo de administração e outros fatores clínicos do paciente. A adição de outros fatores de 35 crescimento conhecidos na composição final pode também afetar a dosagem. O progresso pode ser monitorado pela avaliação periódica de vários fatores incluem, mas sem limitações, tamanho do tumor, estágio ou grau histológico estado do receptor de estrógeno ou progesterona, angioinvasão e metástase do linfonódulo regional. O médico pode também monitorar marcadores tal como níveis da proteína uPAII - altos níveis de uPA e uPAII são associados com um alto risco de amplificação de metástase e gene Her-2 e/ou expressão de proteína, que é também associada com metástase (Weigelt et al. 2005 Nat. Rev. Cancer 5: 591-602).
O perfilamento da expressão genética pode se mostrar também útil no monitoramento da progressão da doença (van't Veer et al. 2002 Nature 415: 530-536 and van of Vijver et al. 2002 N. Engl. J. Med. 347: 1999-2009).
Em certas modalidades, a presente invenção também fornece métodos para tratar ou prevenir câncer de mama que envolve terapia genética para a produção in vivo de poli10 peptídeo ActRII. Tal terapia alcançaria seu efeito terapêutico por introdução da seqüência de polinucleotídeos ActRIIa nas células ou tecidos envolvidos em câncer de mama, tal como, por exemplo, células epiteliais mamárias. A distribuição de seqüência de polinucleotídeos ActRII pode ser obtida usando um vetor de expressão recombinante, tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. Preferido para distribuição de seqüência de 15 polinucleotídeos ActRIIa é o uso de Iipossomas alvejadas.
Vários vetores virais que podem ser utilizados para terapia genética, conforme preceituado aqui, incluem adenovírus, herpes vírus, vaccínia, ou um vírus de RNA, tal como um retrovírus. O vetor retroviral pode ser um derivado de um retrovírus de murino ou ave. Exemplos de vetores retrovirais em que um único gene estranho pode ser inserido incluem, 20 mas sem limitações: vírus de leucemia de murino Moloney (MoMuLV), vírus do sarcoma de murino Harvey (HaMuSV), vírus de tumor mamário de murino (MuMTV), e vírus de sarcoma de Rous (RSV). Inúmeros vetores retrovirais adicionais podem incorporar múltiplos genes. Todos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selecionável, de maneira tal que células traduzidas podem ser identificadas e geradas. Vetores retro25 virais podem ser preparados específicos para o alvo anexando, por exemplo, um açúcar, um glicolipídeo, ou uma proteína. O alvejamento preferido é realizado usando um anticorpo. Versados na tecnologia perceberão que seqüência de polinucleotídeos específicas podem ser inseridas no genoma retroviral ou anexadas a um envelope viral para permitir distribuição específica ao alvo do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo ActRIIa.
Alternativamente, células celulares de tecido podem ser diretamente transfectadas
com plasmídeos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol e env, por transfecção com fosfato de cálcio convencional. Estas células são então transfectadas com o plasmídeo do vetor contendo os genes de interesse. As células resultantes liberam o vetor retroviral no meio de cultura.
Um outro sistema de distribuição alvejado para polinucleotídeos ActRIIa é um sis
tema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidais incluem complexos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, gotas, e sistemas a base de lipídeo incluindo emulsões óleo em água, micelas, micelas misturadas e lipossomas. O sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossoma. Lipossomas são vesículas de membrana artificial que são usadas como veículos de distribuição in vitro e in vivo. RNA1 DNA e vírions intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e ser distribuídos às células em uma forma biologica5 mente ativa (ver, por exemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Métodos para transfectar gene eficientes usando um veículo de lipossoma são conhecidos na tecnologia, ver, por exemplo, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. A composição do lipossoma é normalmente uma combinação de fosfolipídeos, normalmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Outros fosfolipídeos ou outros lipídeos também podem 10 ser usados. As características físicas de lipossomas dependem do pH, intensidade iônica e da presença de cátions divalentes.
Exemplos de lipídeos usado em produção de lipossoma incluem compostos de fosfatidil, tal como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfignolipídeos, cerebrosódeos e gangliosídeos. Fosfolipídeos ilustrativos incluem fosfatidilcolina 15 de ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e distearoilfosfatidilcolina. O alvejamento de lipossomas também é possível com base, por exemplo, na especificidade do órgão, especificidade da célula, e especificidade da organela, e é conhecido na tecnologia.
Exemplificacão
A invenção, sendo agora descrita no geral, será mais prontamente entendida pela referência aos seguintes exemplos, que são incluídos meramente com propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não pretende-se que limitem a invenção.
Exemplo 1 : Proteínas de Fusão ActRIIa-Fc
Os requerentes construíram uma proteína de fusão ActRIIa solúvel que tem o domínio extracelular de ActRIIa humano fundido em um domínio Fc humano ou de camundongo, com um mínimo Iigante entre eles. As construções são referidas como ActRIla-hFc e ActRIla-mFc, respectivamente.
ActRIla-hFc é mostrada a seguir da forma purificada a partir de linhagens celulares de CHO (SEQ ID NO: 7):
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQG CWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPK PPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALP VPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP 35 ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSL SPGK
As proteínas ActRIla-hFc e ActRIla-mFc foram expressadas em linhagens celulares de CHO. Três diferentes seqüências líderes foram consideradas:
(i) Melitina de abelha de mel (HBML): MKFLVNVALVFMWYISYIYA (SEQ ID NO: 8)
(ii) Ativador de Tecido plasminogênico (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGA VFVSP (SEQ ID NO: 9) e
(iii) Nativa: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10).
A forma selecionada emprega o líder de TPA e tem a seguinte seqüência não processada de aminoácido:
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCY GDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG 10 NMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13)
Este polipeptídeo é codificado pela seguinte seqüência de ácido nucléico:
ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCT T CGTTT CGCCCGGCGCCGCT ATACTT GGTAGAT CAGAAACT CAGGAGT GT CTTTT TTT AAT GCT AATTGGGAAAAAG ACAGAACCAAT CAAACTGGT GTT GAACCGT GTT ATG GT G ACAAAG ATAAACGGCG GCATT GTTTT GCTACCT G G AAG AAT ATTT CTGG 20 TTCCATT GAATAGT GAAACAAGGTT GTTGGCT GGAT GATAT CAACTGCT AT GACA G GACT GATT GTGTAG AAAAAAAAG ACAGCCCT GAAGTAT ATTT CT GTTGCT GT GA G GG CAATAT GT GT AAT G AAAAGTTTT CTTATTTT CCGG AG ATGG AAGT CACACAG CCCACTT CAAAT CCAGTT ACACCT AAG CCACCCACCGGT G GT GGAACT CACACAT G CCCACCGT G CCCAGCACCT GAACT CCTG G G G G GACCGT CAGT CTT CCT CTT CCC 25 CCCAAAACCCAAGG ACACCCTCAT GAT CT CCCGGACCCCT GAGGT CACATGCGT G GT GGT GGACGT GAG CCACG AAG ACCCT GAGGT CAAGTT CAACTGGTACGTGGAC GGCGTG GAG GTG CATAAT G CCAAG ACAAAG CCG CG GG AG G AG CAGT ACAAC AG CACGTACCGT GTGGT CAGCGT CCT CACCGT CCT GCACCAGG ACTGGCT GAATGGC AAGG AGT ACAAGT G CAAGGT CT CCAACAAAGCCCT CCCAGT CCCCAT CG AG AAA 30 ACCAT CT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCC CCAT CCCGGGAGGAGAT G ACCAAG AACCAG GT CAGCCT GACCT GCCT GGT CAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACT ACAAG ACCACG CCTCCCGTG CTG GACT CCG ACGGCT CCTT CTT CCT CT ATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT 35 G CT CCGT GATG CAT GAG G CTCTG CACAACCACTACACGCAG AAG AGCCT CTCCCT GTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (SEQ ID NO: 14)
Tanto ActRIla-hFc quanto ActRIla-mFc foram consideravelmente receptivas à expressão recombinante. Da forma mostrada na figura 1, a proteína foi purificada como um único pico de proteína bem definido. Sequenciamento N-terminal revelou uma única seqüência de -ILGRSTQE (SEQ ID NO: 11). A purificação pode ser alcançada por uma série de etapas da cromatografia de coluna, incluindo, for exemplo, três ou mais das seguintes, 5 em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia em sefarose Q, cromatografia em fenilsefarose, cromatografia por exclusão de tamanhos e cromatografia de troca catiônica. A purificação pode ser completada com filtração viral e troca de tampão. A proteína ActRIla-hFc foi purificada até uma pureza > 98 %, da forma determinada pela cromatografia por exclusão de tamanhos e > 95 %, da forma determinada por SDS PAGE.
ActRIla-hFc e ActRIla-mFc mostraram uma alta afinidade em relação aos elemen
tos de ligação, particularmente, ativina A. GDF-11 ou Ativina A ("ActA") foram imobilizados em um chip Biacore CM5 usando procedimento de acoplamento de amina padrão. Proteínas ActRIla-hFc e ActRIla-mFc foram carregadas sobre o sistema, e a aglutinação foi medida. ActRIla-hFc aglutinou em ativina com uma constante de dissociação (K0) de 5 x 1012, e a 15 proteína aglutinou em GDF11 com uma K0 de 9,96 x 10'9. Veja figura 2. ActRIla-mFc se comportou de forma similar.
A ActRIla-hFc foi muito estável em estudos farmacocinéticos. Ratos foram dosados com 1 mg / kg, 3 mg / kg ou 10 mg / kg da proteína ActRIla-hFc, e níveis de plasma da proteína foram medidos em 24, 48, 72, 144 e 168 horas. Em um estudo separado, ratos foram 20 dosados com 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg. Em ratos, ActRIla-hFc teve uma meiavida sérica de 11 -14 dias, e níveis de circulação do medicamento foram bastante altos depois de duas semanas (11 //g / ml_, 110 //g / mL ou 304 //g / mL para administrações iniciais de 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg, respectivamente.) Em macacos cinomolgo, a meiavida plasmática foi substancialmente maior que 14 dias, e níveis de circulação do medica25 mento foram 25 //g / mL, 304 μg / mL ou 1.440 //g / mL para administrações iniciais de 1 mg /kg, 10 mg/ kg ou 30 mg /kg, respectivamente.
Exemplo 2: Caracterização de uma proteína ActRIla-hFc
A proteína de fusão ActRIla-hFc foi expressa em células CHO-DUKX B11 transfectadas estáveis de um vetor pAID4 (SV40 ori/melhorador, promotor de CMV), usando uma 30 seqüência líder de plasminogênio do tecido de SEQ ID NO:9. A proteina, purificada da maneira descrita anteriormente no Exemplo 1, tem uma seqüência de SEQ ID NO:7. A porção Fc é uma seqüência IgGI Fc humana, da maneira mostrada em SEQ ID NO:7. A análise ácido siálico mostrou que a proteína continha, em média, entre cerca de 1,5 e 2,5 moles de ácido siálico por molécula de proteína de fusão ActRIla-hFc.
Esta proteína purificada apresentou uma meia vida sérica notalvelmente longa em
todos os animais testados, incluindo uma meia vida de 25-32 dias em pacientes humanos (ver Exemplo 3, a seguir). O material expresso na célula CHO tem uma maior afinidade com agente de ligação da ativina B do que o reportado para uma proteína de fusão ActRIIa- hFc expressa em 293 células humanas (dei Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-
35.). Adicionalmente, o uso da seqüência líder tPa forneceu maior produção do que outras seqüências líder e, ao contrário, ActRIIa-Fc expressa com um líder nativo, forneceu uma seqüência mais alta N-terminal pura. Uso da seqüência líder nativa resultou em duas principais espécies de ActRIIa-Fc1 cada qual tendo um seqüência N-terminal diferente.
Exemplo 3: Experimentos Clínicos Humanos
A proteína de fusão descrita no Exemplo 2 foi administrada em pacientes humanos em um estudo aleatorizado, duplo cego, controlado em relação ao placebo, que foi conduzi10 do para avaliar, basicamente, a segurança da proteína em mulheres saudáveis pósmenopausais. Quarenta e oito sujeitos foram aleatorizados em coortes de 6 para receber tanto uma única dose de ActRIla-hFc quanto placebo (5 ativos: 1 placebo). Os níveis de dose variaram de 0,01 até 3,0 mg / kg intravenosamente (IV) e de 0,03 até 0,1 mg / kg subcutaneamente (SC). Todos os sujeitos foram seguidos por 120 dias. Os sujeitos foram excluí15 dos do estudo se eles tomassem medicações afetando o metabolismo ósseo em 6 meses de entrada do estudo. Avaliações de segurança foram conduzidas após cada coorte para determinar a escalação da dose. Além da análise farmacocinética (PK), a atividade biológica de ActRIla-hFc também foi avaliada pela medição de marcadores bioquímicos de formação e reabsorção óssea, e de níveis de FSH.
Não foi reportado nenhum evento adverso sério neste estudo. Eventos adversos
(Aes) foram geralmente brandos e passageiros. Análises preliminares de Aes incluíram enxaqueca, valores laboratoriais elevados, sintomas de frio, enjôo ou vômito, infiltração intravenosa e hematoma nos locais de injeção.
Análise de PK da ActRIla-hFc exibiu um perfil linear com dose, e a meia-vida média de aproximadamente 25 - 32 dias. A área debaixo da curva (AUC) para ActRIla-hFc foi linearmente relacionada à dose, e a absorção depois da dosagem SC foi essencialmente completa. Estes dados indicam que SC é uma abordagem desejável para dosagem em virtude de ela fornecer equivalente biodisponibilidade e meia-vida sérica ao medicamento, ainda evitando o aumento em concentrações séricas de medicamento associadas com os primeiros poucos dias de dosagem IV. ActRIla-hFc ocasionou um rápido e sustentado aumento dependente de dose nos níveis séricos de fosfatase alcalina específica óssea (BAP), que é um marcador para crescimento ósseo anabólico, e uma diminuição dependente de dose em telopeptídeo colágeno tipo 1 C-terminal e nos níveis de ácido fosfatase 5b resistente ao tartrato, que são marcadores para reabsorção óssea. Outros marcadores, tal como P1NP, mostraram resultados inconclusivos. Níveis de BAP mostraram efeitos quase saturantes na dosagem de medicamento mais alta, indicando que efeitos meio-máximo neste biomarcador ósseo anabólico podem ser alcançados em uma dosagem de 0,3 mg / kg, com aumentos que variam até 3 mg / kg. Calculado como um relacionamento de efeito farmacodinâmico na AUC para o medicamento, o EC50 é 51,465 (dia * ng / mL). Estas mudanças no biomarcador ósseo foram sustentadas por aproximadamente 120 dias nos níveis mais altos da dose testada. Também houve uma diminuição dependente de dose nos níveis de FSH sérico consistente com a inibição de ativina.
Uma dose única de ActRIla-hFc dada a uma mulher em menopausa saudável foi segura e bem tolerada para a faixa de níveis dose testados. Os efeitos de PK e farmacodinâmicos prolongados sugerem que dosagem intermitente seria apropriada para estudos futuros. Por exemplo, dosagem a base de meia vida sérica poderia ser realizada mensal10 mente, ou na ordem de uma vez a cada duas, três, quatro, cinco ou seis semanas. Adicionalmente, em virtude de o efeito farmacodinâmico se estender bem além da residência sérica do medicamento, a dosagem pode ser realizada com base no efeito farmacodinâmico, significando que dosagem a cada três meses ou cada dois, três, quatro, cinco, seis ou mesmo doze meses pode ser efetivo para produzir o efeito desejado em pacientes. Este 15 experimento clínico demonstra que, em humanos, ActRIla-hFc é um agente osteoanabólico com evidência biológica tanto de um aumento na formação óssea quanto uma diminuição em ressorção óssea.
Exemplo 4: ActRIIa-Fc melhora ou Previna Perda Óssea Causada por Metástases de Câncer de mama
Estima-se que 65 a 75 porcento de cânceres de mama metastizem no osso, cau
sando dano substancial à estrutura óssea, aumentando risco de fratura e causando dor e outros efeitos colaterais. Testamos os efeitos de ActRIIa-Fc em um modelo de camundongo de câncer de mama que foi metastasizado no osso. Uma sublinhagem da linhagem celular humana de câncer de mama MDA-MB-231 (clone 2287, Kang et al. Cancer Cell 2003, vol 3:537-549) foi cultivada in vitro e células colhidas em uma densidade de 5 x 106 células/mL. MDA-MB-231 é uma linhagem celular que é altamente competente para semear no osso e causar dano ósseo similar ao causado pelas metástases ósseas. 10 //I de células foram injetados na tíbia de camundongos nude atímicos fêmeas de 6 semanas de idade no dia do estudo 0. No dia do estudo 10 camundongos receberam ActRIla-mFc (10 mg/kg/ duas vezes semanalmente/ subcutânea) (n=8) ou veículo PBS (n=7). Progressão da doença foi avaliada por mudanças em densidade mineral óssea usando absorptiometria de raios X de energia dupla (PIXIMus) em intervalos semanais. Os camundongos foram tratados com ActRIla-mFc por 4 semanas e em seguida sacrificados e as tíbias (tanto tumor injetado quanto sem tumor) foram coletados de cada animal. As tíbias foram em seguida processadas e preparadas para análise de tomografia microcomputadorizada (microCT) e histológica.
Injeção intratibiana de células MDA-MB-231 em camundongos nude atímicos promoveu o desenvolvimento de lesões ósseas osteolíticas na tíbia injetada comparado à prena contralateral. Análise MicroCT da tíbia proximal, demonstraram uma redução de 62 %, no volume ósseo cancerígeno nas tíbias que carregam MDA-MB-231 comparado à tíbia sem tumor nos camundongos tratados com veículo PBS. Tratamento com ActRIla-mFc levou a um aumento de 70 % ou 147 % na tíbia que carrega naíve ou tumor respectivamente com5 parado ao veículo (P<0.01 para ambos). As tíbias que carregam tumor de camundongos tratados com ActRIla-mFc tiveram uma densidade óssea cancerígena similar às tíbias naive dos camundongos tratados com VEH (p=0,39).
Assim, ActRIla-mFc é capaz to eliminar o dano ósseo associado com a presença de células do tumor de mama no osso.
Exemplo 5: ActRIIa-Fc Reduz Metástases de Câncer de mama e Promove Sobrevi
vência
Como um modelo de doença metastática, células MDA-MB-231 podem ser introduzidas em camundongos por injeção intracardíaca. As células injetadas no ventrículo esquerdo migrariam através da corrente sanguínea e formam lesões metastática nos sítios distais. 15 Um linhagem celular derivada MDA-MB-231- luc-D3H2LN (Caliper Life Sciences) é uma linhagem celular que expressa Iuciferase que permite o monitoramento não invasivo formação de tumor metastático usando tecnologia de imageamento biofotônico (Caliper Life Sciences). Este modelo foi usado para avaliar o potencial de ActRIla-mFc de administrar a formação de lesões metastáticas em câncer de mama.
As células MDA-MB-23 I -luc-D3H2LN foram introduzidas por injeção intracardíaca
nos vinte e seis camundongos nude atímicos. Quatorze dos camundongos foram tratados com veículo (Solução Salina tamponada com Fosfato-PBS) e doze foram tratados com ActRIla-mFc (10 mg/kg, duas vezes semanalmente, injeção subcutânea) iniciando duas semanas antes da administração no tumor e continuando através do curso do estudo. Mais nove 25 camundongos foram injetados mock com células e tratados com ActRIla-mFc. Os camundongos foram periodicamente anestesiados e visualizados com emissão bioluminescente para detectar a formação de progressão metastática.
O grupo do tratamento ActRIla-mFc apresentou um desenvolvimento substancialmente menor de lesões metastáticas. Por cinco semanas, doze dos quatorze camundongos 30 tratados com o veículo mostram fortes sinais fluorescentes múltiplos indicativos de espaIhamento metastático, enquanto apenas quatro dos doze camundongos tratados com ActRIIa- mFc mostraram lesões similares (Figure 3). Uma quantificação de intensidade de fluorescência mostrou uma diminuição de aproximadamente dez vezes no sinal de fluorescência nos camundongos tratados.
Além disso, o tratamento com ActRIla-mFc aumentou notavelmente a sobrevivência
dos camundongos. No dia quarenta do estudo, todos (14/14) os camundongos tratados com o veículo morrerem ou foram eutanizados (de acordo com os procedimentos padrões para tratamento humano de estudo animais), enquanto apenas dois (2/12) dos camundongos tratados com ActRIla-mFc morreram ou foram eutanizados. No dia quarenta e cinco, 3/12 camundongos tratados com ActRIla-mFc morreram ou foram eutanizados, e nove de o camundongos injetados com o objeto de simulação morreram.
Portanto, o tratamento com ActRIla-mFc causa uma diminuição substancial na for
mação de lesões metastáticas, e promove a sobrevivência neste modelo de câncer de mama metastática. Estes dados indicam que ActRIIa-Fc pode ser usado para tratar câncer de mama em pacientes humanos, particularmente em conjunto com terapias, tal como cirurgia, terapia hormonal ou quimioterapia tradicional com o tumor primário alvejado.
Exemplo 6: Proteínas ActRIIa-Fc Alternativas
Uma variedade de variantes ActRIIa que podem ser usados de acordo com os métodos aqui descritos são descritos no Pedido de Patente Internacional publicado como W02006/012627 (ver por exemplo, pp. 55-60), aqui incorporado pela referência na sua íntegra. Uma construção alternativa pode ter uma deleção da cauda C-terminal (o final 15 aminoácidos do domínio extracelular de ActRIIa. A seqüência para uma construção como essa está apresentada a seguir (porção Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 12): ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQG CWLDDrNCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK Incorporação pela Referência
Todas as publicações e patentes mencionadas aqui estão dessa forma incorporadas pela referência na sua íntegra como se cada publicação ou patente individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporado pela referência. No caso de conflito, o presente pedido prevalecerá, incluindo qualquer definição aqui.
Embora modalidades específicas do objeto em questão tenham sido discutidas, a especificação anterior é ilustrativa e não restrita. Muitas variações se tornarão aparentes aos versado na tecnologia mediante a revisão desta especificação das revelações a seguir. O escopo total da invenção pode ser determinado pela referência.

Claims (45)

1. Método para tratar ou prevenir câncer de mama ou perda óssea relacionada a câncer de mama em um paciente humano, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar ao paciente uma quantidade efetiva de uma proteína de fusão ActRIla-Fc.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é selecionada do grupo que consiste em: a. um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2; b. um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:3; e c. um polipeptídeo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc tem uma ou mais das seguintes características: i. liga-se a uma agente de ligação de ActRIIa com um K0 de pelo menos 10"7 M; e ii. inibe sinalização de ActRIIa em uma célula.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de fusão ActRIIa-Fc inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGelatado, um aminoácido farnesilado, uma aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, uma aminoácido conjugado a uma fração lipídeo, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3.
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3.
7. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3.
8. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é um dímero formado de dois polipeptídeos que compreendem cada qual uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e em que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende três ou mais frações de ácido siálico.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende entre três e cinco frações de ácido siálico.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o método causa menos que 10 % de aumento na massa muscular esquelética do paciente.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é administrada de maneira a atingir uma concentração sérica no paciente de pelo menos 0,2 mg/kg.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc tem uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:7.
15. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc tem um meia vida sérica de entre 15 e 40 dias em humanos sadios normais.
16. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é administrada ao paciente com uma frequência não mais que uma vez por semana.
17. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é administrada ao paciente com uma frequência não mais que uma vez por semana.
18. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é administrada ao paciente com uma frequência não mais que uma vez por três meses.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente está recebendo, ou recebeu dentro de um ano antes da administração de proteina de fusão ActRIIa-Fc, uma terapia antirressortiva óssea.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente antirressortivo é selecionado do grupo que consiste em: um agente bifosfonato, um Iigante do antagonista RANK e um antagonista de osteoprotegrina.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -18, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente administrar uma terapia de radiação, terapia endócrina ou agente citotóxico ao paciente humano.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -18, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente humano é uma fêmea com um ou mais fatores de risco de câncer de mama.
23. Método de tratar ou prevenir câncer de mama ou perda óssea relacionada a câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar a um sujeito necessitado deste uma quantidade efetiva de um antagonista da ativina ActRIIa.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista da ativina ActRIIa é um polipeptídeo antagonista de ativina ou ActRIIa.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista da ativina ActRIIa é uma anticorpo selecionado do grupo que consiste em: a. um anticorpo anti-ativina; e b. um anticorpo anti-ActRIla.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração do antagonista da ativina ActRIIa causa um atraso no início de ação de câncer de mama, inibe a progressão de câncer de mama, atrasa o princípio de ação de metástase, ou diminui o tamanho do tumor.
27. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é um humano.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o humano é uma fêmea com um ou mais fatores de risco de câncer de mama.
29. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente administrar uma terapia de radiação, terapia endócrina ou agente citotóxico ao sujeito.
30. Método de identificar um agente que é usado para tratar ou prevenir câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: a. identificar um agente de teste que se liga a um agente de ligação-domínio de ligação de um polipeptídeo ActRIIa competitivamente com um agente de ligação ActRIIa; e b. avaliar o efeito do agente na proliferação ou sobrevivência celular de câncer de mama.
31. Método de inibir sinalização mediada por ativina em um paciente humano com câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar ao paciente humano uma quantidade efetiva de um antagonista de ativina-ActRIla.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de ativina-ActRIla é um polipeptídeo antagonista da ativina ou ActRIIa.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista da ativina ActRIIa é um polipeptídeo antagonista da ativina ou ActRIIa.
34. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista da ativina ActRIIa é um anticorpo selecionado do grupo que consiste em: a. um anticorpo anti-ativina; e b. um anticorpo anti-ActRIla.
35. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo antagonista da ativina-ActRIla é selecionado do grupo que consiste em: a. um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2; b. um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:3; e c. um polipeptídeo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos selecionados de SEQ ID NO: 2.
36. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista da polipeptídeo da ativina ActRIIa tem uma ou mais das seguintes características: i. liga-se a uma agente de ligação de ActRIIa com um K0 de pelo menos 10"7 M; e ii. inibe sinalização de ActRIIa em uma célula.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antagonista da polipeptídeo da ativina ActRIIa é um proteína de fusão incluindo, além de um domínio polipeptídeo ActRIIa, uma ou mais porções de polipeptídeo que melhoram uma ou mais de estabilidade in vivo, meia vida in vivo, ingestão/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína e/ou purificação.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de fusão inclui uma porção de polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em: um domínio de imunoglobulina Fc e uma albumina sérica.
39. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antagonista do polipeptídeo da ativina ActRIIa inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, uma aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, uma aminoácido conjugado a um fração lipídeo, e uma aminoácido conjugado a uma agente de derivatização orgânico.
40. Uso de uma proteína de fusão ActRIIa-Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncer de mama ou perda óssea relacionada a câncer de mama em um paciente humano.
41. Proteína de fusão ActRIIa-Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de câncer de mama ou perda óssea relacionada a câncer de mama em um paciente humano.
42. Uso de um antagonista da ativina ActRIIa, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncer de mama ou perda óssea relacionada a câncer de mama em um sujeito.
43. Antagonista da ativina ActRIIa1 CARACTERIZADO pelo fato de que é para no tratamento ou prevenção de câncer de mama ou perda óssea relacionada a câncer de mama em um sujeito.
44. Uso de um antagonista da ativina ActRIIa, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para inibir sinalização mediada por ativina em um paciente humano com câncer de mama.
45. Antagonista da ativina ActRIIa1 CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso na inibição de sinalização mediada por ativina em um paciente humano com câncer de mama.
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