JP6401172B2 - 貧血の治療方法 - Google Patents

Description

本出願は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2012年10月24日に出願された米国仮特許出願第61/718,128号に対する優先権を主張する。

(1.序論)
本明細書に提供されるのは、貧血の治療方法であって、該治療を必要とする対象への成長分化因子11(GDF11;別名、骨形態形成タンパク質11(BMP11))のアンタゴニストの投与を含む、方法である。

(2.背景)
貧血とは、血液中の赤血球の数が減少し又はヘモグロビンの量もしくは機能が正常未満になることである。貧血は、最も一般的な血液障害である。

貧血は、無効造血によって生じ得る。無効造血は、活発な赤血球産生が行われるが、成熟赤血球が適切な割合で発生しない場合に存在する。始原細胞は、成熟赤血球の段階に達する前に、アポトーシスを経る。貧血は、ヘモグロビンの酸素結合能の減少を伴うこともある。

サラセミアは、無効造血の一形態である。サラセミアにおいて、無効造血は、成熟途上の有核赤血球細胞のアポトーシスを特徴とする。特に、β-サラセミアは、赤血球の成熟及び産生の障害をもたらすヘモグロビン(又はHgb)合成の欠陥を特徴とする疾患である。この減少は、主として、成熟赤血球産生の全体的な減少をもたらす、赤血球分化の後期好塩基性/多染性赤芽球段階での赤血球分化の異常な促進及びアポトーシスが原因であると考えられている。β-サラセミアは、過形成性骨髄区画を特徴とし、そこでは、異常な赤芽球が蓄積し、アポトーシスを経て、全身性貧血が結果として生じる。

TGF-β、アクチビン、骨形態形成タンパク質(BMP)、並びに成長及び分化因子(GDF)を含む、形質転換成長因子ベータ(TGF-β)ファミリーは、発生と組織ホメオスタシスの両方における数多くの細胞プロセスを調節することが知られている分泌タンパク質を含む。TGF-β1、アクチビンA、BMP-2、及びBMP-4は全て、様々なモデル系における赤血球産生の調節と関連付けられている。TGF-β1は、状況に応じて、赤血球分化を阻害も促進もし、アクチビンAは、赤血球分化促進物質であることが示され、一方、BMP-4は、マウスモデルにおけるストレス赤血球産生と急性貧血からの回復とに関係があるとされている。BMP-2は、初期赤血球細胞に作用して、動員された末梢血又は骨髄CD34+細胞から得られる試料中でのコロニー形成を増大させる。これらの成長因子の一部の異常に高いレベルは、様々な血液疾患と関連付けられている。例えば、高レベルのGDF-15は、通常は、正常な赤血球産生の特徴ではないが、無効造血の状態では、GDF-15発現が上昇している。

TGF-βスーパーファミリーは、30種を超えるタンパク質からなり、これらは、限られた数の受容体及びシグナル伝達経路だけを通じてシグナルを伝達し、その作用の内在的乱雑性及び冗長性を示している。さらに、どの所与の組織においても、いくつかの異なるリガンドを見出すことができ、シグナル伝達は、おそらくは、重複するサブセットの受容体を介して生じ、特定のリガンドをその機能に関連付ける能力を複雑にしている。GDF11は、GDFサブファミリーのメンバーであり、ミオスタチンとしても知られるGDF8と約90％のアミノ酸相同性を共有している。どちらもアクチビンIIA型及びB型受容体に結合し、Smad 2/3シグナル伝達経路を活性化することができる。GDF11は、発生において大きな役割を果たし、筋肉、軟骨、骨、腎臓、及び神経系の形成に関与するが、成体組織において、GDF11は、膵臓、腸、腎臓、骨格筋、脳、及び歯髄で検出された。少量のGDF-11は、循環中にも見出すことができる。しかしながら、今日まで、赤血球産生におけるGDF-11の役割を説明する証拠はない。

アクチビンのII型受容体はGDF11にも結合することができる。2つの関連するII型受容体、ActRIIa及びActRIIbが同定されている(Mathews及びValeの文献、1991, Cell 65:973-982; Attisanoらの文献、1992, Cell 68: 97-108)。GDF11の他に、ActRIIa及びActRIIbは、BMP7、Nodal、GDF8、及びアクチビンを含む、いくつかの他のTGF-βファミリータンパク質と生化学的に相互作用することができる(Yamashitaらの文献、1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee及びMcPherronの文献、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo及びWhitmanの文献、2001, Mol. Cell 7: 949-957; Ohらの文献、2002, Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4は、アクチビン、特に、アクチビンAの主なI型受容体であり、ALK-7は、同様に、アクチビン、特に、アクチビンBの受容体としての役割を果たし得る。

アクチビン受容体IIA型(ActRIIA)の細胞外ドメイン(ECD)及びヒトIgG1 Fcドメインからなるヒト化融合タンパク質は、アクチビン-A及び他のTGFβスーパーファミリーリガンドに高い親和性で結合し、内在性ActRIIA受容体を介するシグナル伝達を遮断する。アクチビン-Aは、RBC成熟の後期に影響を及ぼす赤血球分化因子(EDF)としても知られている(Murataの文献、1988)。ActRIIインヒビターは、赤血球レベルを増加させることについて記載されている(例えば、特許出願公開第20110038831号;第20100204092号;第20100068215号;第20100028332号;第20100028331号;及び第20090163417号)。

(3.概要)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、患者における貧血、無効造血、βサラセミアを治療し、又は正染性赤芽球(Ery-C)を増加させる方法であって、GDF11のアンタゴニストを投与することを含む、方法である。ある実施態様において、患者は、健常個体と比べて及び/又は貧血の発症前の該患者におけるGDF11レベルと比べて、骨髄、脾臓、肝臓、血清、又は血漿中の上昇したGDF11レベルを有する。

ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストがActRIIAポリペプチドである場合、該ActRIIAポリペプチドは、GDF11に優先的に結合する。GDF11のアンタゴニストがActRIIBポリペプチドである場合、該ActRIIBポリペプチドは、GDF11に優先的に結合する。

ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、GDF11の発現を低下させ、GDF11活性を低下させ、又はGDF11タンパク質レベルを低下させる。ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、抗GDF11抗体である。ある実施態様において、該GDF11のアンタゴニストは、GDF11に結合する切断された受容体である。ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、ActRIIAの突然変異した細胞外ドメインを含み、ここで、該ActRIIAの突然変異した細胞外ドメインは、ActRIIAの野生型と比較したとき、アクチビンAと比べてGDF11に対する増大した親和性を有する。

ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、GDF11レベルをモニタリングすることをさらに含む。ある実施態様において、該方法は、
a.GDF11レベルを決定すること;及び
b.GDF11のアンタゴニストの用量を調整すること(ここで、GDF11が正常と比べて増加している場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を増加させ、GDF11が正常未満に減少している場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を減少させる)をさらに含む。ある実施態様において、該GDF11レベルは、GDF11 mRNAレベル、GDF11タンパク質レベル、又はGDF11タンパク質活性レベルとして決定される。

ある実施態様において、GDF11アンタゴニストの投与は、患者における後期好塩基性及び多染性赤芽球の細胞数の減少をもたらす。ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、GDF11発現、GDF11活性、及び/又はGDF11タンパク質レベルを低下させる。

(4.図面の簡単な説明)
図1は、配列番号7のマウス対応物(mActRIIA-Fc)がβ-サラセミアマウスの血液学的パラメーターを改善することを示している。Hbb^th1/th1マウス(Skow LCらの文献、Cell 34:1043-52, 1983)をPBS又はmActRIIA-Fc(10mg/Kg体重、週2回)で60日間処置した。血液学的パラメーターを5、10、30、及び60日目に評価した。(A)赤血球数、(B)ヘマトクリット、及び(C)ヘモグロビンの評価を(D)網状赤血球増加の減少と関連付けた。循環赤血球(RBC)パラメーターの解析により、(E)平均赤血球容積(MCV)、(F)平均赤血球ヘモグロビン(MCH)、及び(G)MCH濃度(MCHC)が、mActRIIA-Fcで処置したマウスで増加したことも示されている。(H)全体的な抗酸化状態。(I)形態学的解析により、赤血球不同、変形赤血球増加、及び標的赤血球(target cell)の減少が示された。(J)全身鉄レベル、(K)トランスフェリン合成、(L)トランスフェリン、及び(M)フェリチンレベル飽和もサラセミアマウスで評価した。(N)炎症細胞数も評価した。(O)脾臓重量及び全細胞数で評価したサラセミアマウスの脾腫に対するmActRIIA-Fcの効果。(P)骨髄赤芽球数及び増殖(エオシン/ヘマトキシリン染色)もmActRIIA-Fcで処置したマウスで減少した。(Q)骨髄及び脾臓赤芽球をTER119染色によるフローサイトメトリーにより定量した。各々の独立した実験について、^*p＜0.05、N＝3〜5。

図2は、mActRIIA-Fcがサラセミアマウスにおける無効造血を減少させることを示している。(A〜C)骨髄及び脾臓を採取し、赤芽球分化をCD71/TER119染色及びFSC/SSC分布によるフローサイトメトリーにより評価した。(D)全ビリルビン及び直接ビリルビンレベルの解析。(E)初期前赤芽球分化時の活性酸素種(ROS)発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより評価した。(F)mActRIIA-Fc又はPBSで48時間処置した初期サラセミア前赤芽球のヘモグロビン溶解度の解析。各々の独立した実験について、^*p＜0.05、^**p＜0.01、^***p＜0.005、N＝3〜5。

図3は、サラセミアマウス由来の赤芽球のアポトーシスに対するmActRIIA-Fcの効果を示している。mActRIIA-Fc又はPBSで処置したマウス由来の骨髄(A)及び脾臓(B)赤芽球上でのFas-Lの発現。(C)赤芽球のTunel染色は、mActRIIA-Fc処置マウスで増加した。

図4は、サラセミアマウスの脾臓におけるActRIIAリガンドの発現を示している。(A)ActRII、アクチビンA、アクチビンB、及びGDF11のmRNA発現レベルは、mActRIIA-Fc処置動物で増加した。(B)mActRIIA-Fc処置動物で減少したGDF11タンパク質レベルのウェスタンブロット解析。(C)GDF11についての骨髄の免疫組織化学染色は、野生型とmActRIIA-Fcで処置したマウスとの間で変化がないことを示した。

図5は、初期サラセミア前赤芽球におけるGDF11発現に対するmActRIIA-Fcの効果を示している。(A)サラセミアマウスにおけるGDF11、ActRII、及びp-Smad2のレベルの増加を示す、PBS又はmActRIIA-Fcで30日間処置したサラセミアマウスのアクチビン/GDFシグナル伝達経路の免疫組織化学的解析。(B)貧血の他のモデルと比較した、サラセミアマウスのアクチビンA、アクチビンB、及びGDF11の免疫組織化学的解析。(C)アクチビンA、アクチビンB、GDF11プロペプチド、及びGDF8/GDF11切断ペプチドに対する特異的抗体を用いた、PBS又はmActRIIA-Fcで48時間処理した初期サラセミア前赤芽球のFACS解析。GDF11染色の定量は、グラフバーで示されている。(D)PBS又はmActRIIA-Fcで処置したサラセミアマウスの脾臓におけるGDF11プロ形態発現の免疫組織化学的解析。^*p＜0.05、N＝4。

図6は、GDF11の阻害がサラセミアマウスにおける無効造血を軽減することを示している。(A)骨髄及び脾臓を採取し、初期前赤芽球分化をCD71/TER119染色及びFSC/SSC分布によるフローサイトメトリーにより評価した。(B)初期前赤芽球分化時のROS発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより評価した。^*p＜0.05、N＝4。

図7は、血清中のGDF11を検出するサンドイッチELISAアッセイを示している。(A)アッセイの概略図。(B)プレートを5μg/mLのmActRIIA-Fcでコーティングし、増加する用量の組換えGDF11(0ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、2.5ng/μl)又は対照血清(1/4〜1/500希釈)をmActRIIA-Fcでコーティングしたプレートに添加し、該プレートを洗浄し、結合したタンパク質を抗GDF8/11抗体で検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。GDF11タンパク質は、該プレートに用量依存的な様式で結合した。

図8は、β-サラセミア患者の血清中のGDF11のレベルの増加の検出を示している。血清は、サラセミアを示している患者及び健常対照から得られた。

図9は、血清中のアクチビンAを検出するサンドイッチELISAアッセイを示している。(A)アッセイの概略図。(B)プレートを5μg/mLのActRIIA-Fc(配列番号7)でコーティングし、増加する用量の組換えアクチビンA(0ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、2.5ng/μl)又は対照血清(1/4〜1/500希釈)をActRIIA-Fcプレートに添加し、該プレートを洗浄し、結合したタンパク質を抗アクチビンA抗体で検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。アクチビンAタンパク質は、該プレートに用量依存的な様式で結合した。(C)β-サラセミア患者の血清中のアクチビンAのレベルの検出。血清は、サラセミアを示している患者及び健常対照から得られた。サラセミア患者におけるアクチビンAの血清レベルに変化はなかった。

図10は、血清中のアクチビンBを検出するサンドイッチELISAアッセイを示している。(A)アッセイの概略図。(B)プレートを5μg/mLのActRIIA-Fcでコーティングし、増加する用量の組換えアクチビンB(0ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、2.5ng/μl)又は対照血清(1/4〜1/500希釈)をActRIIA-Fcプレートに添加し、該プレートを洗浄し、結合したタンパク質を抗アクチビンB抗体で検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。アクチビンBタンパク質は、該プレートに用量依存的な様式で結合した。(C)β-サラセミア患者の血清中のアクチビンBのレベルの検出。血清は、サラセミアを示している患者及び健常対照から得られた。サラセミア患者におけるアクチビンBの血清レベルに変化はなかった。

図11は、C57BL/6野生型マウスへのmActRIIA-Fcの投与がその血液学的パラメーターを変化させないことを示している。(A)赤血球数、(B)ヘマトクリット、(C)ヘモグロビンの評価は、mActRIIA-Fcとの関連を示さなかった。(D)網状赤血球増加はわずかに減少した。mActRIIA-Fcは、(E)平均赤血球容積(MCV)、(F)平均赤血球ヘモグロビン(MCH)、又は(G)MCH濃度(MCHC)などの赤血球(RBC)パラメーターを変化させなかった。各々の独立の実験について、^*p＜0.05、N＝3〜5。

図12は、C57BL/6野生型マウスへのmActRIIA-Fcの投与が該マウスの脾臓及び骨髄細胞の数に影響を及ぼさなかったことを示している。

図13は、mActRIIA-FcがGDF11の阻害を通じて赤血球分化を刺激することを示している。(A〜C)EPO、+/-50μg/mLのmActRIIA-Fcを含む培地中で培養することにより、CD34+/CD36+細胞の赤血球分化を行った;(A)赤血球始原細胞、(B)細胞増殖、及び(C)赤血球前駆細胞を解析した。(D〜F)EPO、+/-50μg/mLのmActRIIA-Fcを含む培地中で骨髄(BM)細胞と共培養したときのCD34+/CD36+細胞の赤血球分化;(D)赤血球始原細胞、(E)細胞増殖、及び(F)赤血球前駆細胞を解析した。(G〜H)EPO、+/-200ng/mLのGDF11、+/-100ug/mLのmActRIIA-Fcを含む培地中で培養することにより、CD36+細胞の赤血球分化を行った;(G)細胞増殖及び(H)赤血球前駆細胞GPA+のパーセンテージを解析した。

(5.詳細な説明)
(5.1 概説)
本明細書に提供されるのは、一態様において、貧血の治療方法であって、成長分化因子11(GDF11;別名、骨形態形成因子11(BMP-11))のアンタゴニストを、治療を必要とする患者に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、該方法は、それを必要とする個体、例えば、貧血を有する個体に、治療有効量のGDF11アンタゴニストを投与することを含む。ある具体的な実施態様において、GDF11アンタゴニストは、ActRII受容体でも、ActRII受容体の誘導体でもなく、例えば、ActRIIA-Fc融合タンパク質でも、ActRIIB-Fc融合タンパク質でもない。GDF11のアンタゴニストは、GDF11のどのレベルにおいても作用することができ、すなわち、それは、GDF11発現を低下もしくは消失させ、GDF11安定性を(例えば、GDF11分解を増加させることにより)低下させ、又はGDF11活性に(例えば、その受容体へのGDF11結合を妨げることにより)拮抗することができる。GDF11のアンタゴニストのより詳細な説明は、下記の第5.3節に見出すことができる。

ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、貧血を有する患者における赤血球レベルを増加させる方法である(例えば、本明細書に記載の方法で治療される貧血のタイプについては、第5.2節を参照されたい)。本明細書に提供される方法の生理学的結果は、次のように記載することができる。特に、以下のパラメーターの増加は、患者における貧血の治療を示すものである。ある実施態様において、赤血球レベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、ヘモグロビンレベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、ヘマトクリットレベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、コロニー形成単位レベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、平均赤血球容積は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、平均赤血球ヘモグロビンは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、平均赤血球ヘモグロビン濃度は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。

本明細書に提供される方法の生理学的結果は、次のように記載することもできる。特に、以下のパラメーターの減少は、患者における無効造血の治療を示すものである。ある実施態様において、血液中の網状赤血球の割合は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。ある実施態様において、血液中の網状赤血球の割合は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。ある実施態様において、脾臓重量又は脾臓全細胞数は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。ある実施態様において、大腿骨当たりの骨髄細胞数は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。ある実施態様において、骨髄赤芽球数は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。

(5.2 治療される貧血)
ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、貧血と診断される。あるより具体的な実施態様において、貧血は、無効造血によって引き起こされる。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、遺伝性骨髄不全症候群(例えば、限定されないが、無巨核球性血小板減少症、ダイアモンド-ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、ピアソン症候群、重度先天性好中球減少症、シュワックマン-ダイアモンド症候群、血小板減少橈側列無形成)、特に、赤血球に影響を及ぼす遺伝性骨髄不全症候群を治療する方法である。より具体的には、本明細書に提供されるのは、特に赤血球に影響を及ぼす遺伝性骨髄不全症候群を治療する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象がエリスロポエチンの投与に応答しない貧血を治療する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象が、鉄、ビタミンB-12、及び/又は葉酸塩の投与に応答しない貧血を治療する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、赤血球始原細胞及び前駆細胞がアポトーシスによる死に感受性が高い結果として生じる貧血を治療する方法である。

あるさらにより具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、β-サラセミアと診断される。β-サラセミアは、赤血球の成熟及び産生の障害をもたらすヘモグロビン合成の欠陥を特徴とする疾患である。この減少は、主として、成熟赤血球産生の全体的な減少をもたらす、赤血球分化の後期好塩基性/多染性赤芽球段階での赤血球分化の異常な促進及びアポトーシスが原因であると考えられている。この疾患は、過形成性骨髄区画を特徴とし、そこでは、異常な赤芽球が蓄積し、アポトーシスを経て、全身性貧血が結果として生じる。

ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、脾臓及び/又は骨髄及び/又は血清及び/又は血漿及び/又は肝臓におけるGDF11発現及び/又は活性のレベルが増加している。ある実施態様において、該患者のGDF11レベルは、貧血前の同じ人におけるGDF11発現及び/もしくは活性のレベル(試料もしくはデータが入手可能な場合)、又は貧血を有しないヒトにおけるGDF11発現及び/もしくは活性のレベルと比較される。ある実施態様において、GDF11発現及び/又は活性レベルは、脾臓、骨髄、血清、血漿、及び/又は肝臓から測定/比較される。ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者におけるGDF11 mRNAレベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、又は少なくとも500％上昇する。ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者におけるGDF11タンパク質レベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、又は少なくとも500％上昇する。

ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、エリスロポエチンによる治療に応答しない。ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、EPOの共投与をさらに含み、ここで、該EPOは、GDF11のアンタゴニストの投与の前に、その投与と同時に、又はその投与の後に投与することができる。

ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、13g/dl未満、12.5g/dl未満、12g/dl未満、11.5g/dl未満、11g/dl未満、10.5g/dl未満、10g/dl未満、9.5g/dl未満、又は9g/dl未満のヘモグロビンレベルを有する。

ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される貧血は、化学療法誘導性貧血である。

(5.3 GDF11のアンタゴニスト)
本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF11アンタゴニストは、以下に記載されている。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF11アンタゴニストは、GDF11の発現を標的とする。他の実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF11アンタゴニストは、GDF11の活性を標的とする。他の実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF11アンタゴニストは、GDF11のタンパク質安定性を標的とする(例えば、分解を増加させる)。本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF11アンタゴニストの好適性は、例えば、下の第5.4節に記載のアッセイを用いて、立証することができる。

したがって、本明細書に提供される方法で使用されるGDF11アンタゴニストは、例えば、GDF11発現及び/又はGDF11媒介性生体作用を下方調節し/低下させ、中和し、遮断し、阻害し、及び/又は改善する。一実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11の活性、シグナル伝達、受容体結合、発現、プロセシング、又は分泌を阻害することができる。したがって、そのようなGDF11アンタゴニストは、該アンタゴニストの非存在下のGDF11活性と比べて、GDF11の活性を低下させる。ある実施態様において、GDF11タンパク質の活性は、少なくとも約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。GDF11アンタゴニストは、一実施態様において、GDF11タンパク質の安定性にも影響を及ぼし得る。別の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11前駆タンパク質から成熟GDF11形態への変換に影響を及ぼし得る。別の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11の同族受容体(例えば、ActRII受容体)への結合を妨害し、及び/又はGDF11同族受容体による細胞内シグナル伝達を阻害することができる。

GDF11アンタゴニストには、GDF11「トラップ」(例えば、阻害性GDF11受容体ポリペプチド(例えば、ActRIIポリペプチド))、抗GDF11抗体、GDF11プロペプチド、GDF11類似体(例えば、ドミナントネガティブポリペプチド、ペプチド模倣体)、他のGDF11結合タンパク質(例えば、フォリスタチン、フォリスタチン関連遺伝子、フォリスタチンドメイン含有タンパク質)、合成小分子インヒビター、GDF11発現を阻害するポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス、干渉RNA(RNAi)、並びに三重鎖形成分子及びリボザイム)などが含まれる。他の実施態様において、GDF11アンタゴニストには、GDF11受容体(例えば、ActRIIB及びActRIIA)に対する抗体も含まれる。ある具体的な実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、GDF11受容体(例えば、ActRIIB及びActRIIA)に結合し、GDF11のその受容体への(例えば、立体障害による)結合を妨げるが、他のリガンド(例えば、アクチビンA)の結合には影響を及ぼさない(又はより低い程度にしか影響を及ぼさない)。

ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるGDF11アンタゴニストは、ActRIIAポリペプチド及び/又はActRIIBポリペプチドではない。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるGDF11アンタゴニストは、ActRIIAのインヒビター及び/又はActRIIBポリペプチドのインヒビターではない。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるGDF11アンタゴニストは、ActRIIAのリガンド結合部分及び/又はActRIIBのリガンド結合部分を含まない。

ある実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11ポリペプチド配列、その断片又は変異体に結合する。一実施態様において、GDF11アンタゴニストは、非哺乳動物(例えば、ニワトリ、魚)のGDF11タンパク質に結合する。別の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、スナネズミ、ハムスター、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラクダ、カニクイザル、チンパンジー、マーモセット、アカゲザル)のGDF11タンパク質に結合する。いくつかのGDF11分子が記載されており、ホモログは当技術分野で周知である。また別の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、配列番号50又は配列番号52のポリペプチド配列を有するヒトGDF11タンパク質に結合する。

他のTGF-βファミリーメンバーと同様、GDF11は、シグナル配列と、アミノ末端プロペプチドと、ジスルフィド結合断片からなるカルボキシ末端とから構成されるプレプロタンパク質として合成される。該プロペプチドは、分子の残部からタンパク質分解的に切断され、生物活性のあるカルボキシ末端二量体を成熟した受容体結合形態として放出する。該プロペプチドは、結合し、その活性を阻害する、成熟したGDF11二量体のインヒビターとして機能する。プロセシングされていない全長の前駆タンパク質、すなわち、GDF11プレプロタンパク質は、配列番号48のアミノ酸配列を有することができ、該GDFプロペプチドは、配列番号50のアミノ酸配列を有することができ、GDF11の成熟形態は、配列番号52のアミノ酸配列を有する。

(5.3.1 抗GDF11抗体)
ある実施態様において、GDF11に対する抗体を、本明細書に提供される方法とともに使用することができる。ある実施態様において、GDF11に対する抗体は、GDF11に免疫特異的に結合する。特に、ある実施態様において、そのような抗GDF11抗体は、任意の他のタンパク質に対してよりも高い結合親和性でGDF11に結合する。具体的な実施態様において、抗GDF11抗体は、GDF8に対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。具体的な実施態様において、抗GDF11抗体は、GDF8と交差反応しない。具体的な実施態様において、抗GDF11抗体は、アクチビンAに対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。具体的な実施態様において、抗GDF11抗体は、アクチビンAと交差反応しない。

GDF11を免疫原として使用することにより、抗タンパク質/抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体を標準的なプロトコルによって作製することができる(例えば、抗体:実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、Harlow及びLane編(Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照されたい)。哺乳動物、例えば、マウス、ハムスター、又はウサギを、GDF11の免疫原性形態、抗体応答を誘発することができる抗原性断片、又は融合タンパク質で免疫することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を付与する技術には、担体へのコンジュゲーション又は当技術分野で周知の他の技術が含まれる。GDF11の免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫の進捗は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。標準的なELISA又は他の免疫アッセイを抗原としての免疫原とともに用いて、抗体のレベルを評価することができる。

動物をGDF11の抗原性調製物で免疫した後、抗血清を得ることができ、望ましい場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫動物から回収し、標準的な体細胞融合法によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は当技術分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstein(1975) Nature, 256: 495-497により最初に開発されたもの)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbarらの文献(1983) Immunology Today, 4: 72)、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleらの文献(1985) モノクローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)を含む。ハイブリドーマ細胞を、GDF11と特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、その断片を含むことが意図され、該断片もまた、対象ポリペプチドと特異的に反応する。抗体を従来の技術を用いて断片化し、該断片を、全抗体について上で記載されているのと同じ方法で、有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、F(ab)₂断片は、抗体をペプシンで処理することにより作製することができる。得られたF(ab)₂断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元し、Fab断片を産生することができる。抗体は、抗体の少なくとも1つのCDR領域によって付与されるActRII受容体又はアクチビンポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性、単鎖、キメラ、ヒト化、及び完全ヒト分子を含むことがさらに意図される。「抗体」という用語は、Fab、Fab'、及びF(ab')断片も含む。

ある実施態様において、抗体は組換え抗体であり、この用語は、一部は分子生物学の技術によって作製される任意の抗体を包含し、これには、CDR移植又はキメラ抗体、ライブラリー選択抗体ドメインから組み立てられたヒト抗体又は他の抗体、単鎖抗体、並びに単ドメイン抗体(例えば、ヒトV_Hタンパク質又はラクダ科V_HHタンパク質)が含まれる。ある実施態様において、抗体はモノクローナル抗体であることができる。各々のモノクローナル抗体は、通常、単一のエピトープを認識するものであり、均一な、又は実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体である。「モノクローナル」という用語は、任意の特定の産生方法によって限定されない。例えば、GDF11に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な量の抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与し、該マウスから抗体産生細胞(例えば、脾臓由来の細胞)を取得し、該抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させて、抗体産生ハイブリドーマを取得し、該抗体産生ハイブリドーマを試験して、該抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することを含み得る。ひとたび取得されれば、ハイブリドーマを、細胞培養物中で、及び任意に、ハイブリドーマ由来細胞が抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件で増殖させることができる。モノクローナル抗体は、該細胞培養物から精製してもよい。

抗体に関して使用される「と特異的に反応する」という形容詞は、当技術分野で一般に理解されているように、抗体が特定のタイプの生物学的試料中の関心対象の抗原の存在を最小限検出するのに有用であるほど、抗体が関心対象の抗原(例えば、GDF11ポリペプチド)と関心対象ではない他の抗原との間で十分に選択的であることを意味することが意図される。治療への応用などの、抗体を利用する特定の方法において、より高度の結合特異性が望ましい場合がある。モノクローナル抗体は、通常、所望の抗原と交差反応性ポリペプチドとを効果的に識別する傾向が(ポリクローナル抗体と比較して)より高い。抗体:抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす1つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性は様々な異なる親和性を伴って達成され得るが、通常、抗体は、約10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、もしくは10^-10、又はそれ未満の親和性(解離定数)を有する。

さらに、望ましい抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を溶液中の抗原に結合させるのに使用する場合、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。抗体と抗原の相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、種々の異なる技術が利用可能である。そのような技術としては、ELISA、表面プラズモン共鳴結合アッセイ(例えば、Biacore(商標)結合アッセイ、Biacore AB, Uppsala, Sweden)、サンドイッチアッセイ(例えば、IGEN International社, Gaithersburg, Md.の常磁性ビーズシステム)、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、及び免疫組織化学が挙げられる。

一実施態様において、抗GDF11抗体は、高い親和性でGDF11に結合する。したがって、一実施態様において、抗GDF11抗体は、約40nM、30nM、25nM、20nM、又は10nM以下のIC50を有する。別の実施態様において、GDF11に特異的に結合する抗GDF11抗体は、GDF11に対する結合についてのインビトロアッセイ(例えば、BIACOREアッセイ又はELISAアッセイ)において、約5nM、4nM、3nM、又は1nM以下のIC50値を有する。一実施態様において、本方法で使用される抗GDF11抗体は、GDF11に対する強い結合親和性(Kd)を有する。したがって、抗GDF11抗体は、約4.2×10^-9Mもしくは4.0×10^-9M未満、約4.6×10^-10M、4.0×10^-10M、もしくは2×10^-10M未満、又は約8×10^-11M、7×10^-11M、5×10^-12M、もしくは1.4×10^-12M未満のKdを有する。或いは、本明細書に記載の方法で使用される抗GDF抗体は、約4.2×10^-9Mもしくは4.0×10^-9M以下、約4.6×10^-10M、4.0×10^-10M、もしくは2×10^-10M以下、又は約8×10^-11M、7×10^-11M、5×10^-12M、もしくは1.4×10^-12M以下のGDF11に対するKdを有する。抗GDF11抗体のKdは、当技術分野で周知の方法(例えば、BIACORE(商標)システムを使用するもの)により決定することができる。

別の実施態様において、抗GDF11抗体は、ミオスタチン/GDF8と比べて、GDF11に優先的に結合する。したがって、一実施態様において、本明細書に記載の方法で使用される抗GDF11抗体は、GDF-8と比較してGDF11を少なくとも1.5倍以上、少なくとも2倍以上、少なくとも2.5倍以上、少なくとも3倍以上、少なくとも3.5倍以上、又は少なくとも4倍以上優先してGDF11に結合する。別の実施態様において、抗GDF11抗体は、ミオスタチン/GDF8の活性と比べて、GDF11活性を優先的に阻害する。抗GDF8/11抗体の例は、例えば、いくつかの公開特許及び出願、例えば、米国特許第8,066,995号;第7,320,789号(マウスモノクローナル抗体JA-16、ATCC寄託番号PTA-4236);米国特許第7,655,763号(例えば、ヒトモノクローナル抗体Myo29(スタムルマブ)(ATCC寄託番号PTA-4741)、Myo22(ATCC寄託番号PTA-4740)、Myo28(ATCC寄託番号PTA-4739));米国特許第7,261,893号、及び米国特許出願第20110293630号(特許出願第13/115,170号)に開示されている。本明細書に提供される方法とともに使用することができるモノクローナル抗体の例としては、LifeSpan Biosciences社(Seattle, WA)製のカタログ番号LS-C121127、LS-C138772、LS-C105098の抗体(入手可能); Santa Cruz Biotechnology社(Santa Cruz, CA)から入手可能なカタログ番号(X-19)の抗体: sc-81952;及びSigma-Aldrich Co. LLCから入手可能な製品番号: WH0010220M3の抗体が挙げられる。当業者は、ルーチンの技術を用いて、これらの抗体の抗原結合配列(例えば、CDR)を使用し、本明細書に開示される貧血の治療用のヒト化抗体を作製することができる。

(5.3.2 ActRIIポリペプチドを含むGDF11アンタゴニスト)
ある実施態様において、GDF11アンタゴニストは、ActRII受容体、例えば、ActRIIA又はActRIIB、例えば、ヒトActRIIA又はActRIIBの細胞外ドメインの一部を含む。より具体的には、そのようなGDF11アンタゴニストは、ActRII、例えば、ActRIIA又はActRIIBのGDF11結合ドメインを含むポリペプチドであることができる。理論によって束縛されるものではないが、そのようなGDF11結合ドメインを含むポリペプチドは、GDF11を捕捉し、それにより、GDF11シグナル伝達を妨げる。これらのGDF11結合ドメインを含むポリペプチドは、ActRII受容体の細胞外ドメインの全て又は一部(すなわち、ActRIIAの細胞外ドメインの全てもしくは一部又はActRIIBの細胞外ドメインの全てもしくは一部)を含み得る。具体的な実施態様において、ActRII受容体の細胞外ドメインは、可溶性である。

ある実施態様において、ActRII受容体のGDF11結合性細胞外ドメインが任意の他のTGFβに対してよりも高い親和性でGDF11に結合するように、ActRII受容体のGDF11結合性細胞外ドメインを野生型受容体と比べて突然変異させる。特に、ActRII受容体のGDF11結合性細胞外ドメインをがアクチビンAに対してよりも高い親和性でGDF11に結合するように、ActRII受容体のGDF11結合性細胞外ドメインを野生型受容体と比べて突然変異させる。そのようなより高い親和性は、次に高い親和性リガンドに対する親和性よりも少なくとも10％、25％、50％、75％、100％、250％、500％、又は1000％高いものであることができる。

ある実施態様において、GDF11結合ドメインを含むポリペプチドは、抗体のFc部分に連結される(すなわち、ActRII受容体のアクチビン結合ドメインを含むポリペプチドと抗体のFc部分とを含むコンジュゲートが作製される)。理論によって束縛されるものではないが、抗体部分は、コンジュゲートに増大した安定性を付与し、及び/又はGDF11アンタゴニストに対する患者の免疫応答を低下させる。ある実施態様において、GDF11結合ドメインは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して、抗体のFc部分に連結される。

そのようなActRIIポリペプチドGDF11アンタゴニストの例は、いくつかの公開特許/出願に開示されている。例えば、米国特許第7,709,605号;米国特許第8,252,900号;米国特許第7,960,343号;米国特許第7,988,973号に開示されているActRIIAポリペプチドインヒビター。いくつかのTGF-βリガンドに結合するActRIIBポリペプチドインヒビターの例は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第8,138,143号、米国特許第8,058,229号、及び米国特許第7,947,646号に開示されている。GDF8及びGDF11に特異的に結合するActRIIBポリペプチドインヒビターの例は、米国特許第7,842,663号に開示されている。GDF11に特異的に結合するActRIIBアンタゴニストの例は、米国特許第8,216,997号に開示されている。臨床的ActRIIトラップとしては、AMG-745、ACE-031、及びACE-011が挙げられる。

((a)ActRIIA)
本明細書で使用されるように、「ActRIIA」という用語は、任意の種由来のアクチビン受容体IIa型(ActRIIA)タンパク質のファミリー及び突然変異生成又は他の修飾によってそのようなActRIIAタンパク質から得られた変異体を指す。本明細書中でのActRIIAに対する言及は、現在同定されている形態のいずれか1つに対する言及であると理解される。ActRIIAファミリーのメンバーは、一般に、システインに富む領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び予想上のセリン/トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。

「ActRIIAポリペプチド」という用語には、ActRIIAファミリーメンバーの任意の天然のポリペプチド並びに有用な活性を保持するその任意の変異体(突然変異体、断片、融合体、及びペプチド模倣形態を含む)を含むポリペプチドが含まれる。例えば、ActRIIAポリペプチドには、ActRIIAポリペプチドの配列と少なくとも約80％同一な、及び任意に、少なくとも85％、90％、95％、97％、98％、99％、又はそれを上回って同一な配列を有する任意の公知のActRIIAの配列に由来するポリペプチドが含まれる。ActRIIAポリペプチドの例としては、ヒトActRIIA前駆ポリペプチド(配列番号1)並びに可溶性ヒトActRIIAポリペプチド(例えば、配列番号2、3、7、及び12)が挙げられる。そのアミノ酸配列が配列番号1に示されているActRIIA前駆ポリペプチドに関して、ヒトActRIIA前駆ポリペプチドのシグナルペプチドは、アミノ酸位置1〜20に位置し;細胞外ドメインは、アミノ酸位置21〜135に位置し、ヒトActRIIA前駆ポリペプチド(配列番号1)のN結合型グリコシル化部位は、配列番号1のアミノ酸位置43〜56に位置する。配列番号1のヒトActRIIB前駆ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号4(GenbankエントリーNM_001616のヌクレオチド164〜1705)として開示されている。配列番号2の可溶性ヒトActRIIAポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号5として開示されている。配列の説明については、表1を参照されたい。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIAポリペプチドは、可溶性ActRIIAポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「可溶性ActRIIAポリペプチド」という用語は、通常、ActRIIAタンパク質の任意の天然の細胞外ドメインを含む、ActRIIAタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチド並びにその任意の変異体(突然変異体、断片、及びペプチド模倣形態を含む)を指す。本明細書に提供される方法とともに使用される可溶性ActRIIAポリペプチドは、アクチビンAに対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用される可溶性ActRIIAポリペプチドは、TGF-βスーパーファミリーの任意の他のメンバーに対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。天然又は改変ActRIIAタンパク質を第二のGDF11選択的結合剤とカップリングさせることにより、該タンパク質に、GDF11に対する特異性の付加を与えることができる。

具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIAポリペプチドは、配列番号2、3、6、7、12、及び13のアミノ酸配列を有するポリペプチドではなく、これらのアミノ酸配列のどれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である。

ActRIIAポリペプチドの合成のために、以下のリーダー配列:ミツバチメリチンリーダー配列(配列番号8)、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)リーダー(配列番号9)、又は天然のActRIIAリーダー(配列番号10)を使用することができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11アンタゴニストは、抗体のFc部分に連結されたActRIIAのGDF11結合ドメインを含むコンジュゲート/融合タンパク質を含む。ある実施態様において、該アクチビン結合ドメインは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して、抗体のFc部分に連結される。任意に、Fcドメインは、Asp-265、リジン322、及びAsn-434などの残基に1以上の突然変異を有する。ある場合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asp-265突然変異)を有する突然変異体Fcドメインは、野生型Fcドメインと比べてFcγ受容体に結合する能力が低下している。他の場合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asn-434突然変異)を有する突然変異体Fcドメインは、野生型Fcドメイン比べてMHCクラスI関連Fc受容体(FcRN)に結合する能力が増大している。

ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIAのGDF11結合ドメインは、ActRIIAの細胞外ドメインの切断形態を含む。切断は、ActRIIAポリペプチドのカルボキシ末端及び/又はアミノ末端にあることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIBポリペプチドの細胞外ドメインと比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸長いものであることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIAポリペプチドの細胞外ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のN末端アミノ酸であることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIAポリペプチドの細胞外ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のC末端アミノ酸であることができる。例えば、ActRIIAの切断形態としては、アミノ酸20〜119; 20〜128; 20〜129; 20〜130; 20〜131; 20〜132; 20〜133; 20〜134; 20〜131; 21〜131; 22〜131; 23〜131; 24〜131;及び25〜131を有するポリペプチドが挙げられ、ここで、該アミノ酸位置は、配列番号1におけるアミノ酸位置を指す。

ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIAのGDF11結合ドメインは、1以上のアミノ酸置換、付加、及び/又は欠失を有するActRIIAの細胞外ドメインを含む。ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIAのインヒビターは、アミノ酸置換も保有するActRIIA細胞外ドメインの切断形態を含む。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIA受容体の細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIA受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIA受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質であり、ここで、該ヒトActRIIA受容体の切断された細胞外ドメインは、1以上のアミノ酸置換を保有する。

ActRIIAポリペプチドの機能的に活性のある断片は、例えば、ActRIIAポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え産生されたポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。さらに、断片を、従来のメリフィールド固相f-Moc又はt-Boc化学などの当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することができる。該断片を(組換えによるか又は化学合成によって)産生し、試験して、ActRIIAタンパク質又はアクチビンによって媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト(インヒビター)として機能し得るペプチジル断片を同定することができる。

さらに、ActRIIAポリペプチドの機能的に活性のある変異体は、ActRIIAポリペプチドをコードする対応する突然変異核酸から組換え産生された修飾ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。該変異体を産生し、試験して、GDF11シグナル伝達又はActRIIAに対する結合のアンタゴニスト(インヒビター)として機能し得るものを同定することができる。ある実施態様において、ActRIIAポリペプチドの機能的変異体(すなわち、GDF11結合活性を有するもの)は、配列番号2又は3から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75％同一であるアミノ酸配列を含む。ある場合には、該機能的変異体は、配列番号2又は3から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、又は100％同一なアミノ酸配列を有する。

潜在的ホモログのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成装置で実行することができ、その後、合成遺伝子を発現用の適当なベクターに連結することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である(例えば、Narang, S Aの文献(1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraらの文献(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Walton, Amsterdam編: Elsevier pp 273-289; Itakuraらの文献(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraらの文献(1984) Science 198:1056; Ikeらの文献(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。そのような技術は、他のタンパク質の定方向進化において利用されている(例えば、Scottらの文献(1990) Science 249:386-390; Robertsらの文献(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlinらの文献(1990) Science 249: 404-406; Cwirlaらの文献(1990) PNAS USA 87: 6378-6382;並びに米国特許第5,223,409号、第5,198,346号、及び第5,096,815号を参照されたい)。

或いは、他の形態の突然変異生成を用いて、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。例えば、ActRIIAポリペプチド変異体を、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成などを用いるスクリーニングによって(Rufらの文献(1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wangらの文献(1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balintらの文献(1993) Gene 137:109-118; Grodbergらの文献(1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashimaらの文献(1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowmanらの文献(1991) Biochemistry 30:10832-10838;及びCunninghamらの文献(1989) Science 244:1081-1085)、リンカースキャニング突然変異生成によって(Gustinらの文献(1993) Virology 193:653-660; Brownらの文献(1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnightらの文献(1982) Science 232:316);飽和突然変異生成によって(Meyersらの文献(1986)Science 232:613); PCR突然変異生成によって(Leungらの文献(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19);又は化学的突然変異生成などを含むランダム突然変異生成によって(Millerらの文献(1992) 細菌遺伝学の短期講座(A Short Course in Bacterial Genetics)、CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;及びGreenerらの文献(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)、ライブラリーから作製し、単離することができる。特にコンビナトリアル設定でのリンカースキャニング突然変異生成は、ActRIIAポリペプチドの切断(生物活性)形態を同定する魅力的な方法である。

点突然変異及び切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、さらに言うなら、特定の性質を有する遺伝子産物のcDNAライブラリーをスクリーニングするための、広範な技術が当技術分野で公知である。そのような技術は、一般に、ActRIIAポリペプチドのコンビナトリアル突然変異生成によって作製される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技術は、通常、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適当な細胞を得られたベクターのライブラリーで形質転換すること、及びコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的簡単な単離が容易になる条件下で発現させることを含む。好ましいアッセイとしては、GDF11結合アッセイ及びアクチビン媒介性細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。

ある態様において、ActRIIAポリペプチドの機能的変異体又は修飾形態には、ActRIIAポリペプチドの少なくとも一部及び1以上の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。そのような融合ドメインのよく知られた例としては、ポリヒスチジン、Glu-Glu、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、免疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)、マルトース結合タンパク質(MBP)、又はヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。融合ドメインを、所望の特性を付与するように選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的で、親和性クロマトグラフィー用の関連するマトリックス、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、及びニッケル又はコバルトコンジュゲート樹脂が使用される。そのようなマトリックスの多くは、「キット」形態で入手可能であり、これには、例えば、(HIS₆)融合パートナーと合わせて有用な、Pharmacia GST精製システム及びQIAexpress(商標)システム(Qiagen)がある。別の例として、融合ドメインを、ActRIIAポリペプチドの検出を容易にするように選択することができる。そのような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質(例えば、GFP)及び通常、特異的抗体が利用可能な短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的モノクローナル抗体がすぐに利用可能である周知のエピトープタグとしては、FLAG、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)、及びc-mycタグが挙げられる。場合により、融合ドメインは、例えば、第Xa因子又はトロンビン用のプロテアーゼ切断部位を有し、該部位は、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分消化し、それにより、組換えタンパク質をそれから遊離させることを可能にする。その後、遊離したタンパク質を、後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。ある実施態様において、ActRIIAポリペプチドを、インビボでActRIIAポリペプチドを安定化するドメイン(「スタビライザー」ドメイン)と融合させる。「安定化する」とは、血清半減期を延長する全てのことを意味し、これは、破壊の減少によるものか、腎臓によるクリアランスの減少によるものか、又は他の薬物動態作用によるものかを問わない。免疫グロブリンのFc部分との融合は、広範なタンパク質に望ましい薬物動態特性を付与することが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を付与することができる。選択され得る他のタイプの融合ドメインとしては、多量体化(例えば、二量体化、四量体化)ドメイン及び(望ましい場合、追加の生物学的機能、例えば、骨成長又は筋肉成長のさらなる刺激を付与する)機能ドメインが挙げられる。

融合タンパク質の様々なエレメントを、所望の機能と一致する任意の方法で配置し得ることが理解される。例えば、ActRIIAポリペプチドを異種ドメインのC末端に配置することができ、又はその代わりに、異種ドメインをActRIIAポリペプチドのC末端に配置することができる。ActRIIAポリペプチドドメイン及び異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要がなく、追加のドメイン又はアミノ酸配列を、どちらかのドメインのC末端もしくはN末端、又はこれらのドメインの間に含めることができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるActRIIAポリペプチドは、ActRIIAポリペプチドを安定化することができる1以上の修飾を含む。例えば、そのような修飾は、ActRIIAポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、ActRIIAポリペプチドの循環半減期を向上させるか、又はActRIIAポリペプチドのタンパク質分解を低下させる。そのような安定化修飾としては、融合タンパク質(例えば、ActRIIAポリペプチド及びスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む)、グリコシル化部位の修飾(例えば、ActRIIAポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む)、並びに炭水化物部分の修飾(例えば、ActRIIAポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質の場合、ActRIIAポリペプチドを、スタビライザードメイン、例えば、IgG分子(例えば、Fcドメイン)に融合させる。本明細書で使用されるように、「スタビライザードメイン」という用語は、融合タンパク質の場合に見られる融合ドメイン(例えば、Fc)を指すだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性修飾、又はポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含む。

ある実施態様において、他のタンパク質から単離されているか、又は別の方法で他のタンパク質を実質的に含まない、単離及び/又は精製された形態のActRIIAポリペプチドを、本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用することができる。ActRIIAポリペプチドは、通常、組換え核酸からの発現によって産生される。

ある態様において、単離された及び/又は組換え核酸を用いて、本明細書に開示される方法及び組成物で使用される断片、機能的変異体、及び融合タンパク質を含む、ActRIIAポリペプチドのいずれか(例えば、可溶性ActRIIAポリペプチド)を作製することができる。

いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの増殖を促進する原核生物配列と、真核細胞で発現される1以上の真核生物転写ユニットの両方を含む。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo 及びpHyg由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのうちのいくつかは、原核細胞と真核細胞の両方における複製及び薬物耐性選択を容易にするために、pBR322などの細菌プラスミド由来の配列で修飾されている。或いは、ウシパピローマウイルス(BPV-1)、又はエプスタイン-バーウイルス(pHEBo、pREP由来、及びp205)などのウイルスの派生物を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。(レトロウイルスを含む)他のウイルス発現系の例は、以下の遺伝子療法送達系の記載において見出すことができる。プラスミドの増殖及び宿主生物の形質転換に利用される様々な方法は、当技術分野で周知である。原核細胞と真核細胞の両方に関する他の好適な発現系、及び一般的な組換え手順については、分子クローニング 実験マニュアル(Molecular Cloning A Laboratory Manual)、第3版、Sambrook、Fritsch、及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)を参照されたい。いくつかの例において、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、pVL由来ベクター(例えば、pVL1392、pVL1393、及びpVL941)、pAcUW由来ベクター(例えば、pAcUW1)、並びにpBlueBac由来ベクター(例えば、β-gal含有pBlueBac III)が挙げられる。

Pcmv-Scriptベクター(Stratagene, La Jolla, Calif.)、pcDNA4ベクター(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)、及びpCI-neoベクター(Promega, Madison, Wis.)などのベクターを、CHO細胞内での対象ActRIIAポリペプチドの産生用に設計することができる。明らかになるように、対象遺伝子コンストラクトを用いて、例えば、精製用の、融合タンパク質又は変異体タンパク質を含む、タンパク質を産生するために、培養で増殖した細胞内での対象ActRIIAポリペプチドの発現を生じさせることができる。

したがって、本明細書に提供されるのは、ActRIIAポリペプチドを産生する方法である。例えば、ActRIIAポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、ActRIIAポリペプチドの発現が生じるのを可能にする適当な条件下で培養することができる。ActRIIAポリペプチドを分泌させ、細胞とActRIIAポリペプチドを含む培地の混合物から単離することができる。或いは、ActRIIAポリペプチドを細胞質内又は膜画分に保持し、細胞を回収し、溶解させ、タンパク質を単離することができる。細胞培養物には、宿主細胞、培地、及び他の副産物が含まれる。細胞培養用の好適な培地は、当技術分野で周知である。対象ActRIIAポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ActRIIAポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製、及びActRIIAポリペプチドに融合したドメインに結合する物質による親和性精製(例えば、プロテインAカラムを用いて、ActRIIA-Fc融合体を精製することができる)を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で公知の技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、又はその両方から単離することができる。一実施態様において、ActRIIAポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。一実施態様において、精製は、例えば、以下のもの:プロテインAクロマトグラフィー、Qセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーのうちの3つ以上を、任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程により達成される。精製は、ウイルス濾過及びバッファー交換で終了させることができる。本明細書で実証されるように、ActRIIA-hFcタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定して98％を超える純度、SDS PAGEにより決定して95％を超える純度に精製された。この精製レベルは、マウスの骨に対する望ましい効果並びにマウス、ラット、及び非ヒト霊長類における許容し得る安全性プロファイルを達成するのに十分であった。

別の実施態様において、組換えActRIIAポリペプチドの所望の部分のN末端におけるポリ-(His)/エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ni²⁺金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の精製を可能にすることができる。次いで、精製リーダー配列をエンテロキナーゼによる処理によって後から除去し、精製ActRIIAポリペプチドを提供することができる(例えば、Hochuliらの文献(1987) J. Chromatography 411:177;及びJanknechtらの文献、PNAS USA 88:8972を参照されたい)。

融合遺伝子を作製する技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なDNA断片の接続は、ライゲーションのための平滑末端又は互い違い末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要な場合の付着末端の充填(filling-in)、望ましくない接続を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションを利用する従来の技術に従って実施される。別の実施態様において、融合遺伝子は、自動化DNA合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。或いは、後からアニーリングさせてキメラ遺伝子配列を生成させることができる2つの連続する遺伝子断片間の相補的突出を生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のPCR増幅を実施することができる(例えば、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Ausubelら編、John Wiley & Sons: 1992を参照されたい)。

ActRIIA-Fc融合タンパク質は、安定にトランスフェクトされたCHO-DUKX Bl 1細胞で、配列番号9の組織プラスミノーゲンリーダー配列を用いて、pAID4ベクター(SV40 ori/エンハンサー、CMVプロモーター)から発現させることができる。Fc部分は、配列番号7に示されるヒトIgGl Fc配列である。ある実施態様において、発現させたとき、含まれるタンパク質は、ActRIIA-Fc融合タンパク質1分子当たり、平均で約1.5〜2.5モルのシアル酸を有する。

ある実施態様において、ActRIIA-Fc融合体の長い血清半減期は、ヒト患者で25〜32日であることができる。さらに、CHO細胞で発現される物質は、ヒト293細胞で発現されるActRIIA-hFc融合タンパク質について報告されたものよりも高いアクチビンBリガンドに対する親和性を有することができる(del Reらの文献、J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-35)。さらに、理論によって束縛されるものではないが、TPAリーダー配列の使用は、他のリーダー配列よりも大きな産生をもたらし、天然のリーダーで発現されるActRIIA-Fcとは異なり、極めて純粋なN末端配列を提供することができる。天然のリーダー配列の使用は、各々異なるN末端配列を有する2つの主要な種のActRIIA-Fcを生じさせることができる。

((b)ActRIIB)
本明細書で使用されるように、「ActRIIB」という用語は、任意の種由来のアクチビン受容体IIb型(ActRIIB)タンパク質のファミリー及び突然変異生成又は他の修飾によってそのようなActRIIBタンパク質から得られた変異体を指す。本明細書中でのActRIIBに対する言及は、現在同定されている形態のいずれか1つに対する言及であると理解される。ActRIIBファミリーのメンバーは、一般に、システインに富む領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び予想上のセリン/トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。

「ActRIIBポリペプチド」という用語は、ActRIIBファミリーメンバーの任意の天然のポリペプチド並びに有用な活性を保持するその任意の変異体(突然変異体、断片、融合体、及びペプチド模倣形態を含む)を含むポリペプチドを含む。例えば、ActRIIBポリペプチドには、ActRIIBポリペプチドの配列と少なくとも約80％同一な、及び任意に、少なくとも85％、90％、95％、97％、98％、99％、又はそれを上回って同一な配列を有する任意の公知のActRIIBの配列に由来するポリペプチドが含まれる。ActRIIBポリペプチドの例としては、ヒトActRIIB前駆ポリペプチド(配列番号16又は28)及び可溶性ヒトActRIIBポリペプチドが挙げられる。本明細書に記載の全てのActRIIB関連ポリペプチドに関するアミノ酸の付番は、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸付番に基づく。そのアミノ酸配列が配列番号16及び28に示されているActRIIB前駆ポリペプチドに関して、ヒトActRIIB前駆ポリペプチドのシグナルペプチドは、アミノ酸位置1〜18に位置し;細胞外ドメインは、アミノ酸位置19〜134に位置し、ヒトActRIIB前駆ポリペプチドのN結合型グリコシル化部位は、アミノ酸位置42及び65に位置する。配列番号16のヒトActRIIB前駆ポリペプチドの核酸配列は、配列番号19として開示されている。配列の説明については、表1を参照されたい。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBポリペプチドは、可溶性ActRIIBポリペプチドである。「可溶性ActRIIBポリペプチド」という用語は、通常、ActRIIBタンパク質の任意の天然の細胞外ドメインを含む、ActRIIBタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチド並びにその任意の変異体(突然変異体、断片、及びペプチド模倣形態を含む)を指す。本明細書に提供される方法とともに使用される可溶性ActRIIBポリペプチドは、アクチビンAに対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用される可溶性ActRIIBポリペプチドは、TGF-βスーパーファミリーの任意の他のメンバーに対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。天然又は改変ActRIIBタンパク質を第二のGDF11選択的結合剤とカップリングさせることにより、該タンパク質に、GDF11に対する特異性の付加を与えることができる。

具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペプチドは、配列番号17、18、23〜26、27、29、30、31、32、33、36、37、42、及び43のアミノ酸配列を有するポリペプチドではなく、これらのアミノ酸配列のどれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である。ActRIIBポリペプチドを修飾する方法は、例えば、米国出願公開第2009/0005308号及び第2010/0068215号、並びに国際特許出願公開WO 2006/012627号及びWO 2010/019261号に記載されている(これらの参考文献の開示は、完全に本明細書に組み込まれる)。

ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペプチドは、ActRIIB前駆体アミノ酸配列の位置64にアルギニンを有する。

ActRIIBの細胞外ドメインのC末端におけるプロリンノットの欠失は、アクチビンに対する受容体の親和性を低下させることが示されている(例えば、Attisanoらの文献、Cell, 1992, 68(1):97-108を参照されたい)。配列番号28のアミノ酸20〜119を含むActRIIB-Fc融合タンパク質(すなわち、配列番号32)の「ActRIIB(20-119)-Fc」は、プロリンノット領域及び完全な膜近傍領域を含む、配列番号28のアミノ酸20〜134を含むActRIIB-Fc融合タンパク質(すなわち、配列番号31)の「ActRIIB(20-134)-Fc」と比べて、GDF-11及びアクチビンに対する結合が低下している。しかしながら、配列番号28のアミノ酸20〜129を含むActRIIB-Fc融合タンパク質の「ActRIIB(20-129)-Fc」は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、ActRIIBの非切断型細胞外ドメインと比べて、同様の、しかし、若干低下した活性を保持している。したがって、配列番号28(又は配列番号16)のアミノ酸134、133、132、131、130、及び129で終結する細胞外ドメインを含むActRIIBポリペプチドは全て活性を有すると考えられるが、アミノ酸134又は133で終結するコンストラクトが最も高い活性を有し得る。同様に、配列番号28のP129及びP130の突然変異がリガンド結合をそれほど減少させないという事実によって示されるように、残基129〜134のいずれかでの突然変異は、リガンド結合親和性を大幅に変化させるとは考えられない。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物に従って使用されるActRIIBポリペプチドは、配列番号28(又は配列番号16)のアミノ酸109(すなわち、最後のシステイン)で早くも終わり得るが、配列番号28(又は配列番号16)のアミノ酸位置109と119又はその間で終わる形態は、低下したリガンド結合能を有すると考えられる。

ある実施態様において、配列番号16及び配列番号28のアミノ酸29は、ActRIIB前駆体配列中の最初のシステインに相当する。配列番号16もしくは配列番号28のN末端のアミノ酸29、又はこれらのアミノ酸位置の前から始まるActRIIBポリペプチドは、リガンド結合活性を保持していると考えられる。配列番号16又は配列番号28の位置24におけるアラニンからアスパラギンへの突然変異は、リガンド結合にそれほど影響を及ぼすことなく、N結合型グリコシル化配列を導入する。これは、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜29に対応するシグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域の間の領域中の突然変異が良好に許容されることを裏付けるものである。特に、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置20、21、22、23、及び24から始まるActRIIBポリペプチドは活性を保持しており、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置25、26、27、28、及び29から始まるActRIIBポリペプチドも活性を保持すると考えられる。配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置22、23、24、又は25から始まるActRIIBポリペプチドは最も大きい活性を有する。

ある実施態様において、本明細書に記載の方法及び組成物に従って使用されるActRIIB前駆タンパク質(すなわち、配列番号16又は配列番号28)の活性部分(すなわち、ActRIIBポリペプチド)は、通常、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸29〜109を含み、そのようなActRIIBポリペプチドは、例えば、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸19〜29のいずれか1つに対応する残基から始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜134のいずれか1つに対応する位置で終わることができる。本明細書に包含されるActRIIBポリペプチドの具体的な例としては、配列番号16又は配列番号28の19〜29、20〜29、又は21〜29のアミノ酸位置から始まり、配列番号16又は配列番号28の119〜134、119〜133、又は129〜134、129〜133のアミノ酸位置で終わるものが挙げられる。本明細書に包含されるActRIIBポリペプチドの他の具体的な例としては、配列番号16又は配列番号28の20〜24(又は21〜24、又は22〜25)のアミノ酸位置から始まり、配列番号16又は配列番号28の109〜134(もしくは109〜133)、119〜134(もしくは119〜133)、又は129〜134(もしくは129〜133)のアミノ酸位置で終わるものが挙げられる。これらの範囲に含まれる変異体ActRIIBポリペプチド、特に、配列番号16又は配列番号28の対応する部分との少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性又は配列相同性を有するものも企図される。

例えば、ActRIIBの切断形態としては、アミノ酸20〜119; 20〜128; 20〜129; 20〜130; 20〜131; 20〜132; 20〜133; 20〜134; 20〜131; 21〜131; 22〜131; 23〜131; 24〜131;及び25〜131を有するポリペプチドが挙げられ、ここで、該アミノ酸位置は、配列番号16又は配列番号28におけるアミノ酸位置を指す。

ActRIIBのさらなる例示的な切断形態としては、(i)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸21〜29のいずれかのアミノ酸から始まり(任意に、配列番号16又は配列番号28の22〜25)、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜134のいずれかで終わるポリペプチド;(ii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜29のアミノ酸のいずれかから始まり(任意に、配列番号16又は配列番号28の22〜25から始まり)、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(iii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜24のアミノ酸のいずれかから始まり(任意に、配列番号16又は配列番号28の22〜25から始まり)、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(iv)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸21〜24のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜134のいずれかで終わるポリペプチド;(v)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜24のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸118〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(vi)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸21〜24のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸118〜134のいずれかで終わるポリペプチド;(vii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜24のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸128〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(viii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜24のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸128〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(ix)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸21〜29のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸118〜134のいずれかで終わるポリペプチド;(x)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜29のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸118〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(xi)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸21〜29のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸128〜134のいずれかで終わるポリペプチド;及び(xii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜29のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸128〜133のいずれかで終わるポリペプチドが挙げられる。具体的な実施態様において、ActRIIBポリペプチドは、配列番号16もしくは配列番号28のアミノ酸位置25から始まり、配列番号16もしくは配列番号28のアミノ酸位置131で終わるアミノ酸配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。別の具体的な実施態様において、ActRIIBポリペプチドは、配列番号17、18、23、26、27、29、30、31、32、33、36、37、42、もしくは43のアミノ酸配列からなるか、又はそれらから本質的になる。

ActRIIBポリペプチドの合成のために、以下のリーダー配列:ミツバチメリチンリーダー配列(配列番号8)、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)リーダー(配列番号9)、又は天然のActRIIBリーダー(配列番号10)を使用することができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11アンタゴニストは、抗体のFc部分に連結されたActRIIBのGDF11結合ドメインを含むコンジュゲート/融合タンパク質を含む。ある実施態様において、該アクチビン結合ドメインは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して、抗体のFc部分に連結される。任意に、Fcドメインは、Asp-265、リジン322、及びAsn-434などの残基に1以上の突然変異を有する。ある場合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asp-265突然変異)を有する突然変異体Fcドメインは、野生型Fcドメインと比べてFcγ受容体に結合する能力が低下している。他の場合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asn-434突然変異)を有する突然変異体Fcドメインは、野生型Fcドメイン比べてMHCクラスI関連Fc受容体(FcRN)に結合する能力が増大している。

ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBのGDF11結合ドメインは、ActRIIBの細胞外ドメインの切断形態を含む。切断は、ActRIIBポリペプチドのカルボキシ末端及び/又はアミノ末端にあることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIBポリペプチドの細胞外ドメインと比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸長いものであることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIBポリペプチドの細胞外ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のN末端アミノ酸であることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIBポリペプチドの細胞外ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のC末端アミノ酸であることができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBのGDF11結合ドメインは、1以上のアミノ酸置換、付加、及び/又は欠失を有するActRIIBの細胞外ドメインを含む。ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBのインヒビターは、アミノ酸置換も保有するActRIIB細胞外ドメインの切断形態を含む。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIB受容体の細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIB受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIB受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質であり、ここで、該ヒトActRIIB受容体の切断された細胞外ドメインは、1以上のアミノ酸置換を保有する。

ActRIIBポリペプチドの機能的に活性のある断片は、例えば、ActRIIBポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え産生されたポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。さらに、断片を、従来のメリフィールド固相f-Moc又はt-Boc化学などの当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することができる。該断片を(組換えによるか又は化学合成によって)産生し、試験して、ActRIIBタンパク質又はアクチビンによって媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト(インヒビター)として機能し得るペプチジル断片を同定することができる。

さらに、ActRIIBポリペプチドの機能的に活性のある変異体は、例えば、ActRIIBポリペプチドをコードする対応する突然変異核酸から組換え産生された修飾ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。該変異体を産生し、試験して、GDF11シグナル伝達又はActRIIBに対する結合のアンタゴニスト(インヒビター)として機能し得るものを同定することができる。ある実施態様において、ActRIIBポリペプチドの機能的変異体(すなわち、GDF11結合活性を有するもの)は、ActRIIBの細胞外ドメインと少なくとも75％同一であるアミノ酸配列を含む。ある場合には、該機能的変異体は、配列番号から選択されるアミノ酸配列と:ActRIIBの細胞外ドメインと少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、又は100％同一なアミノ酸配列を有する。

潜在的ホモログのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成装置で実行することができ、その後、合成遺伝子を発現用の適当なベクターに連結することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である(例えば、Narang, S Aの文献(1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraらの文献(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Walton, Amsterdam編: Elsevier pp 273-289; Itakuraらの文献(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraらの文献(1984) Science 198:1056; Ikeらの文献(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。そのような技術は、他のタンパク質の定方向進化において利用されている(例えば、Scottらの文献(1990) Science 249:386-390; Robertsらの文献(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlinらの文献(1990) Science 249: 404-406; Cwirlaらの文献(1990) PNAS USA 87: 6378-6382;並びに米国特許第5,223,409号、第5,198,346号、及び第5,096,815号を参照されたい)。

或いは、他の形態の突然変異生成を用いて、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。例えば、ActRIIBポリペプチド変異体を、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成などを用いるスクリーニングにより(Rufらの文献(1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wangらの文献(1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balintらの文献(1993) Gene 137:109-118; Grodbergらの文献(1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashimaらの文献(1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowmanらの文献(1991) Biochemistry 30:10832-10838;及びCunninghamらの文献(1989) Science 244:1081-1085)、リンカースキャニング突然変異生成により(Gustinらの文献(1993) Virology 193:653-660; Brownらの文献(1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnightらの文献(1982) Science 232:316);飽和突然変異生成により(Meyersらの文献(1986)Science 232:613); PCR突然変異生成により(Leungらの文献(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19);又は化学的突然変異生成などを含むランダム突然変異生成により(Millerらの文献(1992) 細菌生物学の短期講座(A Short Course in Bacterial Genetics)、CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;及びGreenerらの文献(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)、ライブラリーから作製し、単離することができる。特にコンビナトリアル設定でのリンカースキャニング突然変異生成は、ActRIIBポリペプチドの切断(生物活性)形態を同定する魅力的な方法である。

点突然変異及び切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、さらに言うなら、特定の性質を有する遺伝子産物のcDNAライブラリーをスクリーニングするための、広範な技術が当技術分野で公知である。そのような技術は、一般に、ActRIIBポリペプチドのコンビナトリアル突然変異生成によって作製される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技術は、通常、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適当な細胞を得られたベクターのライブラリーで形質転換すること、及びコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的簡単な単離が容易になる条件下で発現させることを含む。好ましいアッセイとしては、GDF11結合アッセイ及びアクチビン媒介性細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。

ある態様において、ActRIIBポリペプチドの機能的変異体又は修飾形態には、ActRIIBポリペプチドの少なくとも一部及び1以上の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。そのような融合ドメインのよく知られた例としては、ポリヒスチジン、Glu-Glu、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、免疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)、マルトース結合タンパク質(MBP)、又はヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。融合ドメインを、所望の特性を付与するように選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的で、親和性クロマトグラフィー用の関連するマトリックス、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、及びニッケル又はコバルトコンジュゲート樹脂が使用される。そのようなマトリックスの多くは、「キット」形態で入手可能であり、これには、例えば、(HIS₆)融合パートナーと合わせて有用な、Pharmacia GST精製システム及びQIAexpress(商標)システム(Qiagen)がある。別の例として、融合ドメインを、ActRIIBポリペプチドの検出を容易にするように選択することができる。そのような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質(例えば、GFP)及び通常、特異的抗体が利用可能な短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的モノクローナル抗体がすぐに利用可能である周知のエピトープタグとしては、FLAG、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)、及びc-mycタグが挙げられる。場合により、融合ドメインは、例えば、第Xa因子又はトロンビン用のプロテアーゼ切断部位、を有し、該部位は、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分消化し、それにより、組換えタンパク質をそれから遊離させることを可能にする。その後、遊離したタンパク質を、後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。ある好ましい実施態様において、ActRIIBポリペプチドを、インビボでActRIIBポリペプチドを安定化するドメイン(「スタビライザー」ドメイン)と融合させる。「安定化する」とは、血清半減期を延長する全てのことを意味し、これは、破壊の減少によるものか、腎臓によるクリアランスの減少によるものか、又は他の薬物動態作用によるものかを問わない。免疫グロブリンのFc部分との融合は、広範なタンパク質に望ましい薬物動態特性を付与することが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を付与することができる。選択され得る他のタイプの融合ドメインとしては、多量体化(例えば、二量体化、四量体化)ドメイン及び(望ましい場合、追加の生物学的機能、例えば、骨成長又は筋肉成長のさらなる刺激を付与する)機能ドメインが挙げられる。

融合タンパク質の様々なエレメントを、所望の機能と一致する任意の方法で配置し得ることが理解される。例えば、ActRIIBポリペプチドを異種ドメインのC末端に配置することができ、又はその代わりに、異種ドメインをActRIIBポリペプチドのC末端に配置することができる。ActRIIBポリペプチドドメイン及び異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要がなく、追加のドメイン又はアミノ酸配列を、どちらかのドメインのC末端もしくはN末端、又はこれらのドメインの間に含めることができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるActRIIBポリペプチドは、ActRIIBポリペプチドを安定化することができる1以上の修飾を含む。例えば、そのような修飾は、ActRIIBポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、ActRIIBポリペプチドの循環半減期を向上させるか、又はActRIIBポリペプチドのタンパク質分解を低下させる。そのような安定化修飾としては、融合タンパク質(例えば、ActRIIBポリペプチド及びスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む)、グリコシル化部位の修飾(例えば、ActRIIBポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む)、並びに炭水化物部分の修飾(例えば、ActRIIBポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質の場合、ActRIIBポリペプチドを、スタビライザードメイン、例えば、IgG分子(例えば、Fcドメイン)に融合させる。本明細書で使用されるように、「スタビライザードメイン」という用語は、融合タンパク質の場合に見られる融合ドメイン(例えば、Fc)を指すだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性修飾、又はポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含む。

ある実施態様において、他のタンパク質から単離されているか、又は別の方法で他のタンパク質を実質的に含まない、単離及び/又は精製された形態のActRIIBポリペプチドを、本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用することができる。ActRIIBポリペプチドは、通常、組換え核酸からの発現によって産生される。

ある態様において、単離された及び/又は組換え核酸を用いて、本明細書に開示される方法及び組成物で使用される断片、機能的変異体、及び融合タンパク質を含む、ActRIIBポリペプチドのいずれか(例えば、可溶性ActRIIBポリペプチド)を作製することができる。ActRIIポリペプチドは、ActRIIAポリペプチドについて上で考察されている通りに発現させることができる。

ActRIIB-Fc融合体の長い血清半減期は、ヒト患者で25〜32日であることができる。さらに、CHO細胞で発現される物質は、ヒト293細胞で発現されるActRIIB-hFc融合タンパク質について報告されたものよりも高いアクチビンBリガンドに対する親和性を有することができる。さらに、理論によって束縛されるものではないが、TPAリーダー配列の使用は、他のリーダー配列よりも大きな産生をもたらし、天然のリーダーで発現されるActRIIB-Fcとは異なり、極めて純粋なN末端配列を提供することができる。天然のリーダー配列の使用は、各々異なるN末端配列を有する2つの主要な種のActRIIB-Fcを生じさせることができる。

本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBポリペプチドはいずれも、ホモ二量体として産生することができる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBポリペプチドはいずれも、IgG重鎖由来の定常領域、例えば、Fcドメインを含む異種部分を有する融合タンパク質として製剤化することができる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBポリペプチドはいずれも、任意に、配列番号16又は配列番号28に対する1以上の追加のアミノ酸置換、欠失、又は挿入と組み合わせて、配列番号16又は配列番号28の位置79に対応する位置に酸性アミノ酸を含むことができる。

具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBのインヒビターは、1以上のアミノ酸置換/突然変異を有するActRIIBの細胞外ドメインを含む。そのようなアミノ酸置換/突然変異は、例えば、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置79のロイシンからアスパラギン酸又はグルタミン酸などの酸性アミノ酸への交換であり得る。例えば、配列番号16又は配列番号28の位置L79をActRIIB細胞外ドメインポリペプチド中で改変して、改変されたアクチビン-ミオスタチン(GDF-11)結合特性を付与することができる。L79A及びL79P突然変異は、アクチビン結合よりも大きい程度にGDF-11結合を低下させる。L79E及びL79D突然変異はGDF-11結合を保持する一方で、大きく低下したアクチビン結合を示す。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペプチドは、L79E又はL79D突然変異、及び結果として生じる分子がGDF11に対する増大した結合親和性を保持し又はそれを有するような追加の突然変異を有する。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペプチドは、L79E又はL79D突然変異を有するのではなく、GDF11に対する増大した結合親和性を保持し又はそれを有しながら、別の形で修飾されている。

ActRIIBのリガンド結合ポケットは、配列番号16又は配列番号28の残基Y31、N33、N35、L38〜T41、E47、E50、Q53〜K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78〜N83、Y85、R87、A92、及びE94〜F101によって規定されることが示されている。これらの位置では、保存的突然変異は許容されるが、K74A突然変異は、R40A、K55A、F82A、及び位置L79での突然変異がそうであるように、良好に許容されると考えられる。R40は、ゼノパス(Xenopus)ではKであり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示している。Q53は、ウシActRIIBではR、及びゼノパスActRIIBではKであり、それゆえ、R、K、Q、N、及びHを含むアミノ酸がこの位置で許容される。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるActRIIBポリペプチドの一般式は、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸29〜109を含むが、任意に、配列番号16又は配列番号28の20〜24又は22〜25の範囲のアミノ酸位置から始まり、配列番号16又は配列番号28の129〜134の範囲のアミノ酸位置で終わり、リガンド結合ポケット内に1、2、5、又は15以下の保存的アミノ酸変化を含み、かつリガンド結合ポケット内の配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置40、53、55、74、79、及び/又は82に0、1、又はそれより多くの非保存的変化を含むものである。そのようなActRIIBポリペプチドは、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸29〜109の配列との80％、90％、95％、又は99％を超える配列同一性又は配列相同性を保持し得る。ばらつきが特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位としては、ActRIIBの細胞外ドメインのアミノ末端及びカルボキシ末端、並びに位置42〜46及び65〜73が挙げられる。配列番号16又は配列番号28の位置65におけるアスパラギンからアラニンへの変化(N65A)は、A64バックグラウンドでのリガンド結合を実際に改善し、したがって、R64バックグラウンドでのリガンド結合に悪影響を及ぼさないと考えられる。この変化は、おそらくは、A64バックグラウンドでのN65におけるグリコシル化を消失させ、したがって、この領域での顕著な変化が許容される可能性が高いことを示している。R64A変化はあまり許容されないが、R64Kは良好に許容され、したがって、Hなどの別の塩基性残基は、位置64で許容され得る。

したがって、ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペプチドを作製するために、アミノ酸置換、欠失、又は付加をActRIIBのリガンド結合ポケット中のアミノ酸のうちの1つ又は複数に導入し、得られる分子をGDF11に対するその結合親和性について試験する。あるより具体的な実施態様において、得られる分子を、TGFβスーパーファミリーの他のメンバーと比べたGDF11に対するその結合親和性について試験する。あるより具体的な実施態様において、得られる分子をアクチビンAと比べたGDF11に対するその結合親和性について試験する。

具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペプチドは、リガンド結合ドメイン中で、正電荷を有するアミノ酸残基Asp(D80)に突然変異を有する。具体的な実施態様において、該D80残基を、非荷電アミノ酸残基、負電荷を有する(negative)アミノ酸残基、及び疎水性アミノ酸残基:からなる群から選択されるアミノ酸残基に変化させる。

(5.3.3 GDF11プロペプチド)
ある実施態様において、GDF11プロペプチドは、本明細書に記載の方法で使用されるGDF11アンタゴニストである。GDFに結合し、その活性、シグナル伝達、受容体結合、発現、プロセシング、又は分泌を阻害する任意のGDF11プロペプチド、その断片又は類似体を本明細書に記載の方法で使用することができる。例えば、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、GDF11のその成熟形態への切断を妨げることによるか、成熟GDF11との複合体を形成することによるか、又は他の関連メカニズムによって、GDF11活性を阻害することができる。一実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、配列番号50の天然のGDF11プロペプチドである。GDF11プロペプチドアンタゴニストは、GDF11結合能及びGDF11阻害活性をも保持又は増強する天然のGDF11プロペプチド(配列番号50)のその任意の断片、変異体、類似体、ホモログ、ムテイン、又は模倣体であることもできる。したがって、別の実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、改善された薬物動態特性、例えば、延長された循環半減期又は増大したタンパク質分解からの保護を有する修飾型GDF11ポリペプチドである。そのような安定化修飾としては、他のポリペプチド配列(例えば、IgGのFc領域又はアルブミン)への融合、非タンパク質性ポリマーへの結合、グリコシル化部位の修飾(例えば、付加)、炭水化物部分の修飾(例えば、除去)などを挙げることができる。そのような修飾型GDF11プロペプチドの例は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第7,737,116号及び米国特許第8,236,751号に開示されている。一実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、例えば、ヒト血清中で、単量体、二量体、又は潜在的複合体として平衡状態で存在することができるGDF11の成熟ヒト形態に結合する。別の実施態様において、該GDF11アンタゴニストは、GDF11のホモ二量体活性形態に結合する。

一実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、生物学的源から産生及び単離される。別の実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、組換え産生されるか、又は当技術分野で周知の方法によって合成により作製される。さらに別の実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、ポリヌクレオチド配列として導入及び/又は投与され、該配列からGDF11プロペプチドがインビボで翻訳される。

(5.3.4 GDF11結合タンパク質)
いくつかの実施態様において、他のGDF11結合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用されるGDF11アンタゴニストである。例えば、フォリスタチンは、高い親和性でGDF11に結合し、インビボでGDF11活性に拮抗する。したがって、一実施態様において、本方法で使用されるフォリスタチンGDF11アンタゴニストは、生物学的源で産生され、それから単離される天然タンパク質、組換え産生されるポリペプチド、又は合成によって作製されるフォリスタチンポリペプチドである。阻害性フォリスタチンポリペプチドは、インビトロで、及び好ましくはインビボで、GDF11に結合し、その活性を阻害する、その任意の断片、変異体、又は突然変異体であることができる。ある実施態様において、該フォリスタチンポリペプチドは、GDF11結合以外のフォリスタチン生体活性を示さない。特に、ある実施態様において、該フォリスタチンポリペプチドは、アクチビンに対する結合を示さない。

フォリスタチンとのかなりの構造的及び機能的相同性を共有し、結果として、いくつかのTGF-βファミリーメンバー(例えば、GDF8、骨形態形成タンパク質)にも結合し、その活性をも阻害する遺伝子も存在する。したがって、他の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、フォリスタチン様3(FSTL3)及びフォリスタチン関連タンパク質(FSRP)としても知られる、フォリスタチン関連遺伝子(FLRG)である。FLRGポリペプチドアンタゴニストの例は、例えば、米国特許第8,236,751号に開示されている。

また別の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、1以上のフォリスタチンドメインを有するポリペプチドであり、したがって、GDF11に結合し、その活性を阻害する。フォリスタチンドメインを含むタンパク質は、システインに富む反復を特徴とするアミノ酸ドメインを有し、該反復は、通常、65〜90個のアミノ酸にわたり、10個の保存されたシステイン残基を含有する。一実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11結合タンパク質GDF関連血清タンパク質-1(GASP-1)又は-2(GASP-2)である。GASP-1又はGASP-2ポリペプチドアンタゴニストの例は、例えば、米国特許第7,572,763号に開示されている。

任意のGDF11結合タンパク質、その変異体又は断片を、該ポリペプチドがGDF11に結合し、その生体活性を阻害する限り、本明細書に記載の方法で使用することができる。GDF11結合タンパク質アンタゴニストは、生体発現系において、化学法、組換えDNA法によるか、又は当技術分野で公知の任意の他の方法によって産生させることができる。別の実施態様において、GDF11結合タンパク質アンタゴニストは、ポリヌクレオチド配列として導入及び/又は投与することができる。

(5.3.5 GDF11類似体)
GDF11アンタゴニストには、GDF11に結合し、その活性を阻害するGDF11類似体も含まれる。一実施態様において、拮抗性GDF11類似体は、ドミナントネガティブGDF11ポリペプチドであり、これは、GDF11に結合し(GDF11と二量体化し)、その切断、プロセシング、及び/又は修飾を阻害し、それにより、その活性を阻害するGDF11の変異体を包含する。別の実施態様において、GDF11アンタゴニスト類似体は、非ペプチド性である。例えば、非ペプチドGDF11類似体は、GDF11プロペプチドの結合及び機能を模倣する化合物(GDF11プロペプチドペプチド模倣体)又はGDF11結合タンパク質の結合及び機能を模倣する化合物(GDF11結合タンパク質ペプチド模倣体)であることができる。理論によって束縛されるものではないが、ペプチド模倣体分子は、ペプチドの二次構造のエレメントを模倣する。一実施態様において、その場合、GDF11類似体は、配列番号48又は配列番号50のGDF11に結合し、それを阻害する。

(5.3.6 GDF11ポリヌクレオチドアンタゴニスト)
GDF11発現(例えば、転写又は翻訳)を阻害するポリヌクレオチドも本明細書に記載の方法において有用であり得る。いくつかの実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11アンチセンス分子、干渉RNA(RNAi)、リボ核酸コード酵素(リボザイム)、又は三重鎖形成分子をコードするポリヌクレオチド分子である。GDF11ポリヌクレオチドアンタゴニストは、GDF11標的ヌクレオチド配列(例えば、DNA、RNA、mRNA)に相補的であり(例えば、特異的に結合し)、DNA又はRNAであることができ、かつコード配列又は阻害性配列(例えば、アンチセンス、RNAi)であることができる。一実施態様において、GDF11アンタゴニストポリヌクレオチドは、アンチセンスGDF11分子である。アンチセンス分子は、通常、少なくとも約1〜25ヌクレオチド長であり、GDF11標的配列に特異的にハイブリダイズするように設計される。アンチセンス分子に有用な特異的GDF11アンチセンスヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法によって同定することができる。

ある実施態様において、Santa Cruz Biotechnology社, Santa Cruz, CAから入手可能な以下の遺伝子サイレンサー:カタログ番号: sc-44724、sc-44725、sc-44724-PR、sc-44725-PR; shRNA: sc-44724-SH、sc-44725-SH、sc-44724-V、及びsc-44725-Vの配列を用いたsiRNA遺伝子サイレンサーが使用される。

(5.4 アッセイ)
GDF-11のアンタゴニストを、以下に示す様々なアッセイで試験することができる。これらのアッセイを用いて、GDF11アンタゴニストを試験及び同定することができる。さらに、これらのアッセイを用いて、貧血患者の治療又はGDF11アンタゴニストによる治療に対する患者の応答性を追跡調査することができる。例えば、インビトロ細胞培養系を患者の細胞から作出して、GDF11アンタゴニストによる治療に対する特定の患者の応答性を決定することができる。

(5.4.1 赤血球レベル)
RBC数は、血液の容積当たりの赤血球の実数のカウントであり、標準的な全血算値の一部として含まれ得る。通常、男性は、1マイクロリットル当たり4,700,000〜6,100,000細胞のRBC数を有し、女性は、1マイクロリットル当たり4,200,000〜5,400,000細胞のRBC数を有する。しかしながら、サラセミア患者は、通常見られるRBC数よりも少ないRBC数を有し得る。したがって、本明細書に提供される方法に従って治療されている貧血患者、例えば、サラセミア患者のRBC数の決定により、そのような治療の効力の決定が可能になる。

(5.4.2 赤血球コロニー形成単位(CFU-E))
CFU-Eを、例えば、コロニー形成アッセイで、細胞の数及び形態によって、及び特定の細胞表面マーカーの有無によってアッセイし、同定することができる。赤血球コロニー形成単位のレベルを、例えば、抗体染色、次いで、フローサイトメトリー解析(FACs)を用いて測定して、マーカー、例えば、分化状態マーカー、例えば、Epo受容体、c-Kit(幹細胞因子受容体)、トランスフェリン受容体(CD71+)、CD36、及びTer119(グリコフォリン-A関連抗原)(CFU-E細胞はTer119(グリコフォリン-A関連抗原)陰性である)の発現を評価することができる(例えば、Terszowskyらの文献、2005を参照されたい)。CFU-E段階の細胞は、エリスロポエチン受容体(EpoR)を発現しており、培養培地中のエリスロポエチンのみの存在下、インビトロで、2〜3日で最終分化するように誘導することができる。CFU-E細胞をメチルセルロース上にプレーティングし、ジアミノベンジジン試薬でヘモグロビンについて染色することができ、その後、CFU-Eコロニーをカウントすることができる。プレーティングの時点から2日目までに、各々のCFU-Eコロニーは、その大部分が赤血球分化の最終段階にある8〜64個のヘモグロビン発現(hemoglobinized)細胞を生じさせることができる。

コロニー形成単位アッセイは、当技術分野で公知である(例えば、MesenCult(商標)培地、Stem Cell Technologies社, Vancouver British Columbia; Wuらの文献(Wu H、Liu X、Jaenisch R、Lodish HFの文献(1995)。「運命が決定された(committed)赤血球BFU-E及びCFU-E始原細胞の生成は、エリスロポエチンもエリスロポエチン受容体も必要としない(Generation of committed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the erythropoietin receptor」、Cell 83(1): 59-67; Marley SB, Lewis JL, Goldman JM, Gordon MY(1996)も参照されたい)。

(5.4.3 赤血球バースト形成単位(BFU-E))
CFU-eと同様に、BFU-eを、例えば、コロニー形成アッセイで、細胞の数及び形態によって、及び特定の細胞表面マーカーの有無によってアッセイし、同定することができる。具体的には、BFU-eを、いくつかの細胞表面マーカー、例えば、CD33、CD34、及びHLA-DRの発現、並びにグリコフォリン-Aの発現の欠如によって同定することができる。例えば、Wuらの文献に記載されているBFU-eアッセイを利用することができる(Wu H、Liu X、Jaenisch R、Lodish HFの文献(1995)。「運命が決定された赤血球BFU-E及びCFU-E始原細胞の生成は、エリスロポエチンもエリスロポエチン受容体も必要としない(Generation of committed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the erythropoietin receptor」、Cell 83(1): 59-67)。

(5.4.4 ヘマトクリット)
ヘマトクリットは、所与の容積の全血中の赤血球の割合を測定するものであり、標準的な全血算値の一部として含まれ得る。ヘマトクリットは、通常、男性では約45％、女性では約40％である。しかしながら、サラセミア患者は、一般に、通常見られるよりも低いヘマトクリットを有する。したがって、本明細書に提供される方法に従って治療されているサラセミア患者のヘマトクリットの決定により、そのような治療の効力の決定が可能になる。

(5.4.5 赤血球始原細胞のアポトーシス)
赤血球始原細胞のアポトーシスは、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)染色を用いることにより決定することができる。TUNEL染色は、インサイチュアポトーシス検出キット(Takara Bio, Otsu, Japan)を用いて実施することができる。

(5.4.6 赤血球共培養系)
インビボ環境により類似したインビトロ環境での赤血球分化に対する薬剤の効果を試験するために、骨髄細胞とヒトCD36+細胞の共培養系を使用することができる。赤血球始原細胞が高度に濃縮されているヒトCD36+細胞をエリスロポエチン(EPO)補充培地(2U/mL)中で長期骨髄培養物とともに共培養する。6日後、該培養物の細胞出力(例えば、細胞型)を、例えば、フローサイトメトリー(例えば、FACS)解析により評価することができる。様々な赤血球分化レベルの赤血球細胞(例えば、前赤芽球、好塩基球、後期好塩基性/多染性、正染性/網状赤血球、糖タンパク質A+細胞)の数は、試験されている薬剤が赤血球分化を調節する能力を示す。このアッセイをGDF11の存在下及び非存在下で実施する。その後、GDF11のアンタゴニストを、GDF11の効果を逆転させるその能力について試験することができる。

(5.4.7 転写応答アッセイ)
ある実施態様において、転写応答アッセイを用いて、GDF11のアンタゴニストを試験することができる。GDF11シグナル伝達によって、特定の遺伝子の転写が上方調節又は下方調節される。使用される細胞培養系とGDF11に対する転写応答とを(例えば、RT-PCTにより)測定することができる。転写応答に対するGDF11のアンタゴニストの効果は、アンタゴニストとしてのその有効性の尺度である。例えば、C2C12細胞では、GDF11に対する応答としてrunx2/cbfa1が上方調節される(例えば、Bessaの文献、2009 Protein Expression and Purification 63:89-94を参照されたい)。ある実施態様において、GDF11シグナル伝達に応答することが知られているプロモーター領域をレポーター遺伝子の上流にクローニングすることができる。このように、アッセイを、レポーター遺伝子の活性しかアッセイする必要がないように簡略化することができる。

(5.5 医薬組成物)
ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、本明細書に提供される方法とともに使用される医薬として許容される担体とともに製剤化することができる。例えば、GDF11のアンタゴニストは、単独で又は医薬製剤(治療的組成物)の成分として投与することができる。対象化合物は、ヒト又は動物用医薬品で使用される任意の好都合な方法での投与のために製剤化することができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の治療方法は、該組成物を全身に又はインプラントもしくは装置として局所に投与することを含む。投与されるとき、治療的組成物は、パイロジェンフリーの生理的に許容される形態にあり得る。上記の組成物中に任意に含めることもできるGDF11のアンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤は、GDF11のアンタゴニストと同時に又は連続的に投与することができる。

GDF11のアンタゴニストは非経口投与される。非経口投与に好適な医薬組成物は、GDF11の1以上のアンタゴニストを、1以上の医薬として許容し得る滅菌等張性水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、又は使用直前に滅菌注射溶液もしくは分散液へと再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて含むことができ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、又は懸濁化剤もしくは増粘剤を含有することができる。本明細書に記載の医薬組成物中で利用され得る好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びこれらの好適な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合、必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。

さらに、該組成物は、標的組織部位(例えば、骨)に送達するための形態で封入又は注射することができる。ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、GDF11の1以上のアンタゴニストを標的組織部位(例えば、骨)に送達し、成長する組織に構造を提供し、最適には体内に再吸収されることができるマトリックスを含むことができる。例えば、該マトリックスは、GDF11のアンタゴニストの低速放出を提供することができる。そのようなマトリックスは、他のインプラント型医療用途に現在使用されている材料から形成されてもよい。

マトリックス材料の選択は、生体適合性、生体分解性、機械的特性、美容上の外観、及び界面特性に基づく。対象組成物の特定の用途により、適切な製剤が規定される。該組成物用の潜在的マトリックスは、生体分解性でかつ化学的に規定されている硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸、及びポリ無水物であってもよい。他の潜在的材料は、骨又は皮膚コラーゲンなどの生体分解性でかつ生物学的に十分に規定されているものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質又は細胞外マトリックス成分から構成される。他の潜在的マトリックスは、焼成ハイドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、又は他のセラミックスなどの、非生体分解性でかつ化学的に規定されているものである。マトリックスは、上述のタイプの材料のいずれかの組合せ、例えば、ポリ乳酸とハイドロキシアパタイト又はコラーゲンとリン酸三カルシウムから構成されていてもよい。バイオセラミックスは、例えば、カルシウム-アルミネート-ホスフェート中の組成を変化させ、並びに加工して、孔径、粒径、粒子形状、及び生体分解性を変化させることができる。

ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用される組成物は、各々所定の量の薬剤を活性成分として含む、例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤(フレーバー付きの主成分、通常、スクロース及びアラビアゴムもしくはトラガカントを使用)、散剤、顆粒剤の形態で、又は水性もしくは非水性液中の液剤もしくは懸濁剤として、又は水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、又はエリキシル剤もしくはシロップ剤として、又はトローチ剤(不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン、もしくはスクロース及びアラビアゴムを使用)として、並びに/或いは洗口液などとして、経口投与することができる。薬剤は、大丸剤(bolus)、舐剤、又はペースト剤として投与することもできる。

経口投与用の固体剤形(カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など)中で、本明細書に提供される方法とともに使用される1以上の治療的化合物を、1以上の医薬として許容し得る担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウム、並びに/又は以下のもの:(1)充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び/もしくはケイ酸;(2)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及び/もしくはアラビアゴムなど;(3)保湿剤、例えば、グリセロール;(4)崩壊剤、例えば、寒天-寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム;(5)溶解遅延剤、例えば、パラフィン;(6)吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物;(7)湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなど;(8)吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土;(9)滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物;並びに(10)着色剤のうちのいずれかと混合することができる。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝化剤を含むこともできる。同様のタイプの固体組成物を、ラクトース又は乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールなどような賦形剤を用いる軟及び硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することもできる。

経口投与用の液体剤形としては、医薬として許容し得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、該液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油(特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚種油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、並びにソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、補助剤、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、及び防腐剤を含むこともできる。

懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天-寒天、及びトラガカント、並びにこれらの混合物を含むことができる。

本明細書に記載の組成物は、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含むこともできる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることにより確保することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを該組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらすことができる。

投薬レジメンは、GDF11のアンタゴニストの作用を修飾する様々な因子を考慮して、担当医により決定されるということが理解される。様々な因子としては、血液の生理的パラメーター(例えば、赤血球レベル、ヘマトクリット、網状赤血球レベル、ヘモグロビンレベルなど)並びに脾臓及び/又は骨髄中のGDF11レベルが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される貧血患者は、脾臓、骨髄、肝臓、血清、及び/又は血漿中のGDF11レベルが上昇していると診断されている(第5.2節参照)。ある実施態様において、脾臓、骨髄、肝臓、血清、及び/又は血漿中のGDF11レベルは、GDF11アンタゴニストによる治療の用量を調整するためにモニタリングされる。例えば、患者が、上昇したGDF11レベルを最初に有している場合、GDF11アンタゴニストによる治療を開始してから; 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日; 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週間; 1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10カ月後に、脾臓、骨髄、肝臓、血清、及び/又は血漿中のGDF11レベルを再度測定し、最初のレベルと比較する。GDF11レベルが減少し、正常なGDF11レベルに近づくか又はそれ未満になった場合、GDF11アンタゴニストの投与を減少させることができる。

ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、患者の脾臓及び/又は骨髄及び/又は肝臓に特異的に標的化及び/又は投与される。

ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、GDF11のアンタゴニストのインビボ産生のための遺伝子療法である。そのような療法は、上記の障害を有する細胞又は組織へのGDF11のアンタゴニストのポリヌクレオチド配列の導入によって、その治療効果を達成する。ポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクター、又はコロイド分散系を用いて達成することができる。具体的で例証的な治療的送達系としては、標的化リポソーム、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、又は好ましくは、レトロウイルスなどのRNAウイルスを含むウイルスベクターが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウス又はトリレトロウイルスの派生物である。単一の異種遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては:モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、及びラウス肉腫ウイルス(RSV)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのさらなるレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターは全て、遺伝子導入された細胞を同定及び作製することができるように、選択可能マーカーの遺伝子を転移し又は組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、又はタンパク質を付着させることによって標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、特異的ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入するか、又はウイルスエンベロープに付着させて、GDF11のアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にすることができることを認識しているであろう。一実施態様において、該ベクターは、骨髄及び/又は脾臓に標的化される。

ポリヌクレオチドの別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。具体的な実施態様において、コロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。RNA、DNA、及び無傷のビリオンを水性内部に封入し、生物活性形態で細胞に送達することができる(例えば、Fraley,らの文献、Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981を参照されたい)。リポソームビヒクルを用いる効率的な遺伝子導入法は当技術分野で公知であり、例えば、Manninoらの文献、Biotechniques, 6:682, 1988を参照されたい。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組合せであり、これは、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わされている。他のリン脂質又は他の脂質を使用することもできる。リポソームの物理学的特徴は、pH、イオン強度、及び二価カチオンの存在によって決まる。

リポソーム産生において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドが挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化も、例えば、臓器特異性、細胞特異性、及びオルガネラ特異性に基づいて可能であり、当技術分野で公知である。

ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、医薬組成物中で実質的に純粋である。具体的には、医薬組成物中の化合物の高々20％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％、又は高々0.05％が、GDF11のアンタゴニスト及び医薬として許容し得る担体以外の化合物である。

(6.実施例)
本明細書に提示される実施例は、GDF11タンパク質レベルがサラセミアで上昇していること、及びGDF11の阻害がβ-サラセミアのマウスモデルで貧血を治療することができることを示す。

(6.1 ActRIIAデコイはβ-サラセミアを治療する)
β-サラセミアは、無効造血、赤血球分化の促進、及びアポトーシスと関連し、貧血及び鉄過剰症を引き起こす。無効造血の効果の根底にある分子メカニズムは完全には理解されていない。TGF-βスーパーファミリーのメンバーは赤血球始原細胞の増殖と分化の両方に関係があるとされているが、β-サラセミアで見られる無効造血における多くのTGF-βファミリーメンバーの役割は不明である。

β-サラセミアの無効造血におけるTGF-βファミリーメンバーの役割を評価するために、いくつかのTGF-βスーパーファミリーリガンドに結合する組換え融合タンパク質をヒトβ-サラセミアのマウスモデルで用いた。ActRIIA-Fc融合タンパク質(すなわち、配列番号7のマウス対応物)は、アクチビン受容体IIA(ActRIIA)の細胞外ドメインがヒト免疫グロブリン1(IgG1)Fcドメインに結合したものからなり、該タンパク質は、アクチビンA、アクチビンB、成長分化因子-11(GDF11)、及び骨形態形成タンパク質-10(BMP-10)のようなTGF-βファミリーメンバーのリガンドトラップとして作用する。Hbbth1/th1は、ヒトβ-サラセミアのマウスモデルであり、このマウスは、β-主要遺伝子の天然の欠失を有する(Skowらの文献、1983)。Hbbth1/th1マウスは、異常に低いヘモグロビン(Hgb)、ヘマトクリット(Hct)、及び平均細胞容積(MCV)、並びに骨髄(BM)過形成及び異常に高いレベルのビリルビンを有する。ビリルビンは、広範な赤血球破壊を表すヘモグロビン破壊の副産物である。

(6.2 材料及び方法)
(6.2.1 マウス)
C57BL/6を交配し、INSERM U699のパイロジェンフリーの施設で飼育した。プロトコルは全て、INSERMの動物管理委員会により承認された。Hbbth1/th1モデルは、β-主要遺伝子の天然の欠失から生じた(Skow LCらの文献; Cell 1983)。Hbbth1/th1マウスは、中間型β-サラセミアのモデルに相当する。これらのマウスは、無効な骨髄赤血球産生、前駆細胞アポトーシス、実質内鉄分布、ヘプシジン発現の減少、及び低い骨髄鉄レベルの一方で、肝臓及び脾臓でのレベルが増加していることなどの、ヒトβ-サラセミアを再現するいくつかの臨床パラメーターを有する。

(6.2.2 全血算値)
血液試料をEDTAコートチューブに回収し、全血算値をMS9-5 Blood Analyzer(Melet Schloesing Laboratories)で製造業者の指示に従って測定した。選択されたパラメーターは、赤血球(RBC)、ヘマトクリット(Ht)、平均赤血球容積(MCV)、ヘモグロビン(Hb)であった。網状赤血球数は、網状赤血球計数試薬(BD Biosciences Retic-Count(商標)キット)で決定した。

(6.2.3定量的リアルタイムRT-PCR)
RNAを、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)を用いて、赤血球始原細胞から抽出した。1マイクログラムの全RNAを、iScript reverse transcription Supermix(Bio-rad)を用いる逆転写に42℃で30分間使用した。その後、酵素を85℃で5分間不活化させた。qPCRのために、cDNA試料をCFX96 PCR System(Bio-rad)で増幅させた。PCR産物を、SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-rad)を用いて定量した。

(6.2.4 インビトロ赤芽球培養)
各組織由来の細胞を、2U/mLヒト組換えEpo(Roche)、100ng/mL SCF(PeproTech)、10-6Mデキサメタゾン(D2915; Sigma)、40、及びペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep; Invitrogen)を補充したStemPro34＋栄養補給剤(Life Technologies Gibco-BRL)のどちらかからなる無血清「赤血球増殖培地」に再懸濁させた。培養から5日後、非接着細胞を、10μg/mlのmActRIIA-Fcを補充した又は補充していない分化培地(1U/ml Epo及び1mg/ml鉄-トランスフェリン(Sigma)を補充したStemPro-34)に2〜3日間移した。生細胞数及び死細胞数をTrypan Blue(Gibco/BRL)排出によって毎日決定し、細胞濃度を部分的な培地交換によって2×10⁶全細胞/mLに毎日調整した。

(6.2.5 メチルセルロースアッセイ)
成獣マウスBM又は脾臓の単一細胞懸濁液をmethocult M3434培地(Stem Cell Technologies)と混合し、35mmディッシュにプレーティングし、5％CO₂加湿雰囲気下、37℃で培養した。BFU-Eコロニーを10日目にスコアリングした(いくつかの実験では、マウスBFU-Eを7日目以降10日目までスコアリングし、7日目と10日目のコロニー数に差がなかった)。

(6.2.6 統計解析)
統計解析は、GraphPad Prism(バージョン5.0; GraphPad Software)を用いて実施した。別途注記されない限り、データは、N回の測定の平均±SEMとして表されている。スチューデントt-検定又はマン-ホイットニー検定を用いて、2群を比較したのに対し、多群比較は、二元ANOVA検定、次いで、事後解析(ボンフェローニ検定)を用いて行った。差は、0.05未満(^*)、0.01未満(^**)、又は0.001未満(^***)のP値で有意とみなした。

(6.2.7 フローサイトメトリーによる免疫蛍光解析)
マウス由来の骨髄(BM)及び脾細胞懸濁液について、抗FcγR mAb 2.4G2を用いてIgG受容体のブロッキングを行った。その後、細胞(1×106)を抗TER-119抗体及び抗マウスTfR1抗体で染色した。染色された細胞を、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いるフローサイトメトリー(FACScalibur; Becton Dickinson)によりさらに解析した。

(6.2.8 組織回収及び組織検査)
骨髄及び脾臓を回収し、10％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色用に3〜6μmで薄切した。

(6.2.9 鉄、フェリチン、ビリルビン、及びトランスフェリン定量)
血液をヘパリン添加チューブに採取し、遠心分離した(5分、4℃、1,100g)。血漿を新たに遠心分離して(5分、4℃、1,100g)、混入している赤血球を除去した。生化学的パラメーターを、製造業者の指示に従って、Olympus AU400 automatで定量した。

(6.3 結果)
(6.3.1 mActRIIA-Fcはサラセミアマウスにおける血液学的パラメーターを改善する)
β-サラセミアは、赤血球成熟及び産生の障害をもたらすヘモグロビン合成の欠陥を特徴とする疾患である。赤血球の減少は、主として、成熟赤血球産生の全体的な減少をもたらす、赤血球分化の後期好塩基性/多染性赤芽球段階での赤血球分化の異常な促進及びアポトーシスが原因であると考えられている。この疾患は、異常な赤芽球が蓄積し、アポトーシスを経て、全身性貧血を引き起こす、過形成性骨髄区画を特徴とする。

β-サラセミアの疾患機序におけるTGF-βリガンドの役割を調べるために、Hbbth1/th1マウスを、mActRIIA-Fc(配列番号7のマウス対応物)又はPBSで、0、5、10、30、又は60日間(10mg/Kg体重)、週2回、皮下処置した(各々の独立した実験について、^*p＜0.05、N＝3〜5)。PBS処置動物と比較して、mActRIIA-Fcによる処置は、赤血球数(図1A)並びにヘマトクリット(図1B)及びヘモグロビン(図1C)レベルを有意に増加させ、同時に網状赤血球数(図1D)を(処置後10日目から60日目まで)減少させた。循環赤血球(RBC)パラメーターの解析も、平均赤血球容積(MCV)(図1E)、平均赤血球ヘモグロビン(MCH)(図1F)、及びMCH濃度(MCHC)(図1G)の全てが、mActRIIA-Fcで処置した全てのマウスで増加することを示し、mActRIIA-Fcが、サラセミアの小球性貧血を改善し、RBC当たりのヘモグロビン含有量を回復させることを示唆した。さらに、骨髄及び脾臓細胞充実度並びに後期好塩基性/多染性赤芽球は、mActRIIA-Fcによる治療の後に有意に低下した。赤血球の形態学的解析をメイ-グリュンワルド(MGG)染色で評価し、これにより、赤血球不同、変形赤血球増加、及び標的赤血球(図1I)の減少が示された。β-サラセミアと関連する貧血に対するmActRIIA-Fcの効果を明らかにするために、全身鉄レベル(図1J)、トランスフェリン合成(図1K)、トランスフェリン飽和(図1L)、及びフェリチンレベル(図1M)をサラセミアマウスで評価した。トランスフェリン飽和は、トランスフェリン合成の誘導又は全身鉄レベルの減少を伴って低下していた(図1L)。血小板、単球、リンパ球、及び好中球レベルも評価した(図1N)。

サラセミアマウスの脾腫に対するmActRIIA-Fcの効果を脾臓重量及び全脾臓細胞数測定により評価した。脾臓細胞数及び脾臓重量は、PBS処置サラセミアマウスと比較してmActRIIA-Fcで処置した動物で低下していた(図1O)。同様に、(エオシン/ヘマトキシリン染色で決定したときの)骨髄赤芽球の数及び増殖(図1P)も、mActRIIA-Fc-処置マウスで減少していた。骨髄及び脾臓を採取し、赤芽球をTER119染色によるフローサイトメトリーにより定量した。mActRIIA-Fcによる処置は、サラセミアマウスにおける赤血球の数を有意に低下させ(図1Q)、それによりマウスの無効造血が解消されたことを示している。

(6.3.2 mActRIIA-Fcはサラセミアマウスの無効造血を軽減する)
β-サラセミアの無効造血におけるTGF-βスーパーファミリーリガンドの役割をさらに調べるために、脾臓(図2A、図2C)及び骨髄(図2B、図2C)を採取し、赤芽球分化をCD71/TER119染色及び前方散乱/側方散乱(FSC/SSC)分布によるフローサイトメトリーにより評価した。前赤芽球(Pro-E)、好塩基性赤芽球(Ery-A)、後期好塩基性(Ery-B)及び多染性赤芽球、並びに正染性赤芽球(Ery-C)という赤血球分化の進行段階にある細胞のパーセントの経時的解析から、mActRIIA-Fcで処置したマウスが、脾臓における未成熟TER119/CD71細胞(後期好塩基性及び多染性赤芽球、Ery-B)の有意な減少と同時に、正染性赤芽球(Ery-C)の割合の増加を示すことが示された(図2A)。これらの結果は、mActRIIA-Fcによる無効造血の軽減と一致した。mActRIIA-Fcで処置したマウス由来の骨髄ではTER-199+赤芽球とEry-Bの数とが減少していたが(図2B)、成熟赤芽球の量は増加しておらず、サラセミアマウスの骨髄における無効造血が、mActRIIA-Fcによるマウスの処置では解消されないことを示唆している。

サラセミアの慢性貧血は、ストレス赤血球産生代償性応答を誘導する。しかしながら、これらの応答は、無効造血のために効果がない。無効造血はRBC産生の要求を特徴とする。このRBC産生は、成熟途上の細胞のアポトーシスによる早期の細胞死が原因で、未成熟赤芽球の増殖及び分化の促進によって補償することができない。それゆえ、不均衡な未成熟/成熟赤芽球比は、サラセミアの無効造血の特徴である。赤血球分化及び無効造血に対するmActRIIA-Fcの影響をさらに調べるために、mActRIIA-Fc処置マウス及びそのそれぞれの対照由来の細胞懸濁液を、TfR1及びTER119に対する抗体で標識した。赤血球前駆細胞分化を、先に記載されている通りに(Liuらの文献、Blood 2006)、フローサイトメトリーによりTER119highゲート内で解析した。その結果、mActRIIA-Fc処置マウスは、脾臓での未成熟/成熟赤芽球比の比率の減少を示し、無効なストレス赤血球産生の解消を示した。骨髄では、未成熟/成熟赤芽球比は、対照とmActRIIA-Fc処置マウスで違いがなく、サラセミアマウスの骨髄における無効造血がmActRIIA-Fc処置により解消されなかったことをさらに示唆している。これらの結果は、ActRIIaリガンドが赤芽球分化に寄与するだけでなく、β-サラセミアにおける無効な脾臓赤血球産生にも寄与することを示唆している。

ビリルビンは、ヘモグロビン分解の産物であり、溶血によって生じる血漿ビリルビンの増加は、β-サラセミア18における無効造血の特徴である。経時的解析において、全ビリルビン及び直接ビリルビンの血清レベルは、mActRIIA-Fcで処置したサラセミアマウスで処置5日目から減少しており、無効造血によって生じる溶血がmActRIIA-Fc投与によって影響を受けたことを示唆している(図2D)。ビリルビン値と一致して、血清乳酸脱水素酵素(LDH)のレベルも、処置から60日後に、対照と比較したmActRIIA-Fcで処置した動物で低下しており(図2D)、組織溶血がmActRIIA-Fcで処置したマウスで低下していたことをさらに裏付けている。

後期赤血球産生は、2つのα-グロビンサブユニットと2つのβ-グロビンサブユニットから構成される四量体タンパク質である酸素担体ヘモグロビン(Hb)の産生の方向に大部分向けられる。β-サラセミアは、β-グロビン遺伝子産生の障害又は欠如と、それに伴う、不対α-サブユニットの蓄積を特徴とする一般的な遺伝性異常ヘモグロビン症である。成熟途上の赤血球細胞における過剰な未結合の遊離α-グロビンは沈殿し、赤血球前駆細胞の早期の死を誘導する活性酸素種(ROS)の産生及び細胞性酸化ストレス損傷をもたらす。グロビン沈殿の生成に対するmActRIIA-Fcの影響をさらに調べた。初期前赤芽球分化時のROS発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより評価した(図2E)。mActRIIA-Fc又はPBSで48時間処置した初期サラセミア前赤芽球のヘモグロビン溶解度の解析(図2F)。

mActRIIA-Fcによる処理と関連する細胞メカニズムについての知見を得るために、脾臓由来前赤芽球を培養し、mActRIIA-Fcの存在下又は非存在下でHbbth1/th1マウスから回収した。前赤芽球分化の十分に確立されたインビトロモデルを用いた(脾臓前駆細胞を、マウス幹細胞因子、Epo、及びデキサメタゾンを補充した無血清幹細胞増殖培地中で5日間培養した)。その後、これらの前赤芽球濃縮培養物を1U/ml Epo及び1mg/ml Fe-Tfの存在下で3日間分化させた。インビボでの観察と同様に、mActRIIA-Fcによる処理は、サラセミア赤芽球におけるヘモグロビンの総量を増加させた。しかしながら、これらの細胞は、対照処理細胞と比較したとき、膜に関連した沈殿ヘモグロビンの量の減少を示した(図2F)。したがって、これらの細胞で検出された活性酸素種(ROS)の量は、mActRIIA-Fcで処理した細胞で減少した(図2E)。それゆえ、mActRIIA-Fcによる処理は、無効造血に寄与する細胞傷害性グロビン沈殿及びそれに付随するROS産生の減少をもたらした。まとめると、これらのデータは、ActRIIaシグナル伝達の標的化が赤芽球分化を調節し、mActRIIA-FcによるActRIIaリガンドの捕捉が、成熟赤芽球の形成に有利に働き、かつ膜関連ヘモグロビン沈殿を低下させることによって、無効造血を解消することを示唆した。

(6.3.3 mActRIIA-Fcはサラセミアマウスにおけるアポトーシスを調節する)
赤血球上でのアポトーシス促進タンパク質の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析することにより、β-サラセミア関連無効造血におけるアポトーシス過程へのTGF-βファミリーメンバーの関与を調べた。骨髄赤芽球におけるアポトーシスタンパク質の発現に有意な変化はなかったが(図3A)、脾臓赤芽球の解析は、Fas-LがEry-B細胞集団で増加していることを示した(図3B)。PBS及びmActRIIA-Fcで処置したマウス由来の脾臓細胞に対するマルチパラメトリックフローサイトメトリー比較解析は、Fas-L発現が、未成熟後期好塩基性及び多染性赤芽球(Ery-B)で増加し、正染性赤芽球(Ery-C)で減少していることを示した(図3B)。対照的に、Fas-L発現は、BM赤芽球では調節されなかった(図3A)。まとめると、これらの結果は、ActRIIaシグナル伝達が成熟途上の赤芽球でFas/Fas-L経路を調節することを示した。総合すると、これらのデータは、ActRIIaシグナル伝達が、無効造血の方向に向けられた成熟途上の赤芽球の早期の細胞死を誘導することを示唆した。驚くことに、Fas-L発現は、Ery-A及びEry-Cサブセットの細胞で減少しており、ActRIIaシグナル伝達の影響が成熟途上の赤芽球でより顕著であったことを示している(図3B)。tunel陽性細胞の数も、mActRIIA-Fcで処置した動物で増加していた(図3C)。サラセミアの無効造血は、成熟途上の赤芽球の大規模なアポトーシスを特徴とする。アポトーシスに対するmActRIIA-Fcによる処置の影響を調べることにより、mActRIIA-Fcによるマウスの処置が、そのそれぞれの対照と比較したtunnel陽性細胞の数の減少を示すことが示され(図3C)、Smad-2,3活性化を通じたActRIIaシグナル伝達が、成熟途上の赤芽球のアポトーシスレベルを調節することにより、無効造血を制御し得ることが示唆された。

(6.3.4 アクチビン/GDF11リガンドはサラセミアマウス由来の脾臓で過剰発現している)
ActRII、アクチビンA、アクチビンB、及びGDF11のRNA(mRNA)発現レベルを、qPCRにより、野生型及びサラセミアマウス由来の脾臓で評価した。ActRII、アクチビンA、アクチビンB、及びGDF11のmRNAレベルは全て増加しており、mActRIIA-Fcが、そのリガンドの1つを通じて、その無効造血の改善において作用し得ることが示唆された(図4A)。mActRIIA-Fcで処置したサラセミアマウス由来の脾臓から得られたタンパク質のウェスタンブロット解析は、PBS処置と比較したGDF11タンパク質レベルの有意な減少を示し(図4B)、GDF11を無効造血に関与するActRIIAリガンドとしてさらに関連付けた。さらなる免疫組織化学的解析は、GDF11タンパク質レベル(及びそれよりはるかに劣る程度に、アクチビンA又はアクチビンB)がサラセミアマウス由来の脾臓生検で大きく増加しており、mActRIIA-Fcで処置した動物で抑制されていることを明らかにした(図3A)。これらの結果は、免疫ブロッティングによりさらに確認された(図4B)。脾臓切片とは対照的に、BMに関するActRIIaリガンドの解析は、サラセミアマウスにおけるGDF11の蓄積を示さなかった(図4B)。それゆえ、サラセミアマウスの脾臓切片におけるGDF11過剰発現を無効造血と関連付けることができた。

(6.3.5 mActRIIA-Fcは初期サラセミア前赤芽球で見られるGDF11発現レベルの増加を低下させる)
どのTGF-βファミリーメンバーがmActRIIA-Fcによるβ-サラセミアの治療に関係があり得るかということを決定するために、アクチビン/GDFシグナル伝達経路のタンパク質の免疫組織化学的解析を行った。サラセミアマウスをPBS又はmActRIIA-Fcで30日間処置し、脾臓を採取し、固定し、アクチビンA、アクチビンB、GDF8、GDF11、ActRII、及びp-Smad2について染色した(図5A)。免疫組織化学染色は、サラセミアマウスにおけるGDF11、ActRII、及びp-Smad2のレベルの増加を示した。アクチビン/GDFシグナル伝達経路のタンパク質が貧血の他のマウスモデルで過剰発現されているかどうかを調べるために、サラセミアマウスにおけるアクチビンA、アクチビンB、及びGDF11の発現を、酸素正常状態マウス、低酸素症マウス、及びαRBCマウスと比較した(図5B)。PBS又はmActRIIA-Fcで48時間処理し、その後、アクチビンA、アクチビンB、GDF11プロペプチド、及びGDF8/GDF11切断ペプチドに対する特異的抗体とともにインキュベートした初期サラセミア前赤芽球のFACS解析は、mActRIIA-Fc処置がGDF11発現を正常化することを示した。GDF11染色の定量は、mActRIIA-Fcによるマウスの処理がGDF11レベルを有意に低下させることを示した(図5C)。サラセミアマウスをmActRIIA-Fcで処置したときのこのGDF11発現の低下は、該マウスの脾臓の免疫組織化学的解析により確認された(図5D)。^*p＜0.05、N＝4。したがって、mActRIIA-Fcがサラセミア組織におけるGDF11過剰発現を減少させるという事実は、mActRIIA-FcがGDF11を標的とすることによって無効造血を解消するというさらなる証拠となった。

(6.3.6 GDF11の中和は赤芽球分化を回復させる)
GDF11発現の増加が無効造血に関与するかどうかを明らかにするために、サラセミア前赤芽球をアクチビンA及びB及びGDF11に対するブロッキング抗体の存在下で培養した。(アクチビンA及びB抗体ではなく)抗GDF11抗体は、赤血球産生を促進し、これにより、CD71/TER119染色後のフローサイトメトリーにより定量したとき、GDF11が無効造血を誘導することによって赤血球産生を負に調節することがさらに確認された(図6A)。初期前赤芽球分化時のROS発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより評価した(図6B)。^*p＜0.05、N＝4。したがって、抗GDF11ブロッキング抗体は、細胞分化を回復させ、サラセミア赤芽球におけるヘモグロビン凝集体を低下させた。

(6.3.7 ActRIIAリガンド検出アッセイ)
血液血清中に存在するActRIIAリガンド、並びに特に、無効造血と関連する疾患(例えば、サラセミア、骨髄異形成症候群、慢性悪性貧血、及び鎌状赤血球貧血)におけるその異常な発現を検出、同定、及び定量するためのアッセイを開発した。このアッセイは、ActRIIA-Fcコーティングと、それに続く、血清中に存在するActRIIAリガンドの検出に基づくサンドイッチELISAからなる。治療決定の助けとするために及び/又はTGF-βリガンドもしくは受容体レベルを調節するよう設計された治療の有効性を決定するために、ActRIIA ELISAアッセイを実験的に(例えば、動物に)又は臨床的に(例えば、ヒト患者に)用いて、血液血清中のリガンド又は受容体レベルを同定、検出、及び/又は定量することができる。

(6.3.8 GDF11レベルはサラセミア患者の血清中で上昇している)
血清中のGDF11レベルを測定するために、上記のサンドイッチELISAアッセイを開発した。ELISAプレートを5μg/mLのmActRIIA-Fcでコーティングした(図7A)。増加する用量の組換えGDF11をプレートに添加した(0.1ng/マイクロリットル、0.5ng/マイクロリットル、2.5ng/マイクロリットル)。プレートをPBS 0.1％Tweenで洗浄し、結合したタンパク質を、抗GDF8/11抗体を用いて検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。GDF11は、mActRIIA-Fcでコーティングしたプレートに用量依存的な様式で結合し、これにより、GDF11レベルを検出及び定量するために、このアッセイを効果的に使用することができることが示された(図7B)。mActRIIA-Fcを用いるELISAでは、わずか100pg/mL程度の組換えGDF11が検出された。

サラセミアを有する患者由来の血清を、mActRIIA-FcによるサンドイッチELISAを用いてGDF11発現について試験した。図8に示すように、GDF11レベルは、健常対照でのレベルと比較して、サラセミアを有する患者で3倍上昇していた。

他のActRIIAリガンドのレベルもサラセミア患者で上昇しているかどうかを明らかにするために、アクチビンA及びアクチビンB発現レベルもこれらの患者の血清で測定した。アクチビンA及びアクチビンBを検出するためのELISAアッセイも開発した。ELISAプレートを5マイクログラム/mLのActRIIA-Fcでコーティングした。増加する用量の組換えアクチビンA及びアクチビンBをプレートに添加した(0.1ng/マイクロリットル、0.5ng/マイクロリットル、2.5ng/マイクロリットル)。プレートをPBS 0.1％Tweenで洗浄し、結合したタンパク質を、抗アクチビンA(図9A)及び抗アクチビンB(図10A)抗体(R&D systems)で検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。アクチビンA(図9B)とアクチビンB(図10B)は両方ともActRIIA-Fcコートプレートに用量依存的な様式で結合し、これにより、両方のタンパク質を検出及び定量するために、このアッセイを効果的に使用することができることが示された。GDF11と同様、アクチビンA及びアクチビンBも100pg/mL程度の低いレベルで検出された。

ActRIIA-Fc ELISAを用いて、サラセミアを有する患者の血清中のアクチビンA及びアクチビンBの発現レベルを決定した。GDF11とは対照的に、アクチビンAのタンパク質レベル(図9C)もアクチビンBのタンパク質レベル(図10C)もサラセミア患者で上昇しておらず、ActRIIAリガンドGDF11がサラセミア疾患過程に独自に関与することが示された。

(6.3.9 mActRIIA-Fcは野生型マウスの血液学的パラメーターを変化させない)
野生型C57BL/6マウスをmActRIIA-Fc(10mg/Kg BW、週2回)又はPBSで30日間処置した。赤血球数(図11A)、ヘマトクリット(図11B)、ヘモグロビン(図11C)の評価は、mActRIIA-Fcによるマウスの処置の結果として、これらのパラメーターのレベルの変化を示さなかった。網状赤血球増加のごくわずかな減少が観察された(図11D)。mActRIIA-Fcは、MCV(図11E)、MCH(図11F)、及びMCHC(図12G)などの赤血球(RBC)パラメーターも変化させなかった。各々の独立した実験について、^*p＜0.05、N＝3〜5。

脾臓及び骨髄に対するmActRIIA-Fcの効果も野生型C57BL/6マウスで評価した。mActRIIA-Fcは、野生型マウスの脾臓重量を増加させたが、脾臓細胞数にはそれほど影響を及ぼさなかった。mActRIIA-Fcは、骨髄細胞数にも影響を及ぼさなかった(図12)。

(6.3.10 mActRIIA-FCはGDF11の阻害を通じて赤血球産生性分化を刺激する)
mActRIIA-Fcが赤血球パラメーターを増加させる細胞メカニズムを調べるために、一連のインビトロ実験を実施した。これらの実験において、コロニー形成アッセイ(図13A)及び液体培養物中での赤血球分化(図13B及び13C)で評価したとき、ヒトCD34+細胞に対するmActRIIA-Fcの直接的な作用を支持する証拠は見つけられなかった。臨床的知見と薬理学的知見の両方がRBCパラメーターの刺激におけるmActRIIA-Fcの明白な役割を示したので、mActRIIA-Fcの作用が骨髄(BM)微小環境のアクセサリー細胞によって媒介され得るという仮説を立てた。赤血球始原細胞が高度に濃縮されているヒトCD36+細胞を長期BM培養物とともに共培養し、その後、EPO(2U/mL)補充培地中で6日間培養した後、その赤血球分化を評価した。6日目に、該培養物の産生物は、主に、EryA(〜好塩基性赤芽球)であると特徴付けられたが、mActRIIA-Fc(50μM)を添加すると、CD36+細胞のかなりの割合がEryB/C細胞(多染色性/正染性赤芽球)に成熟し、これにより、BMアクセサリー細胞によって産生される因子がmActRIIA-Fcの赤血球産生作用を媒介すること、及びEPOとは対照的に、mActRIIA-Fcが赤芽球成熟の後期において役割を果たし得ることを示唆した(図13D〜13F)。mActRIIA-Fcの作用を媒介し得るサイトカインを同定するために、CD36+細胞をいくつかのActRIIAリガンドで処理した。GDF11処理は、分化過程における糖タンパク質A陽性(GPA+)細胞の増殖を有意に減少させ、mActRIIA-Fcは、未処理の細胞に影響を及ぼすことなく、この作用を効果的に逆転させた(図13G及び13H)。これらのデータは、GDF11の阻害がmActRIIA-Fcの赤血球産生刺激作用を媒介することを示している。

(6.4 結論)
まとめると、これらのデータは、アクチビン/BMPシグナル伝達が赤芽球分化を制御すること、及びBMP II型/アクチビンII型受容体の標的化が、β-サラセミアにおいて、無効造血を減少させ、貧血を改善することができることを示している。特に、これらのデータは、β-サラセミア関連貧血におけるGDF11の関与を示し、サラセミア患者のGDF11レベルを抑制し又は減少させることが、無効造血と関連する貧血の有効な治療であることを示している。
(7.配列の記載)
表1：配列情報

(8.等価物)
本発明は、その具体的な実施態様に関して詳細に記載されているが、機能的に等価であるバリエーションが本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えた本発明の様々な変更は、前述の説明及び付随する図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様の多くの等価物を認識するか、又はルーチンの実験だけを用いて、それらを確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

本明細書に言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が、その全体として引用により具体的かつ個別に組み込まれることが示される場合と同じ程度に、引用により本明細書中に組み込まれる。

Claims (7)

1. GDF11のアンタゴニストを含む、患者におけるβサラセミアを治療するための医薬組成物であって、該GDF11のアンタゴニストが抗GDF11抗体である、前記医薬組成物。
2. 前記患者が、骨髄、脾臓、肝臓、血清、又は血漿中の上昇したGDF11レベルを有する、請求項1記載の医薬組成物。
3. 前記GDF11のアンタゴニストが、GDF11の発現を低下させ、GDF11活性を低下させ、又はGDF11タンパク質レベルを低下させる、請求項1記載の医薬組成物。
4. a.GDF11レベルを決定し;
   b.前記GDF11のアンタゴニストの用量を調整するように用いられることを特徴とし、
   ここで、GDF11が正常と比べて増加している場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を増加させ、GDF11が正常未満に減少している場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を減少させる、請求項1記載の医薬組成物。
5. 前記GDF11レベルが、GDF11 mRNAレベル、GDF11タンパク質レベル、又はGDF11タンパク質活性レベルとして決定される、請求項4記載の医薬組成物。
6. 前記投与が、患者における後期好塩基性及び多染性赤芽球の細胞数の減少をもたらす、請求項1記載の医薬組成物。
7. 前記GDF11のアンタゴニストが、GDF11発現を低下させ、GDF11活性を低下させ、及び/又はGDF11タンパク質レベルを低下させる、請求項1記載の医薬組成物。

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