CN104379159A

CN104379159A - 变体激活素受体多肽,单独或与化疗结合,及其用途

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Publication number: CN104379159A
Application number: CN201280070103.4A
Authority: CN
Inventors: 宣延勋; L-T·T·谭; 韩汇泉; K·S-N·郭; 周小岚
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2015-02-25
Also published as: JP2015505859A; KR20140108562A; CO7101190A2; EP2793925B1; TN2014000270A1; WO2013106175A1; AU2017248486B2; IL233178A0; EA201491231A1; JP6542433B2; JP6358633B2; BR112014015003A2; CR20140304A; CL2014001648A1; MX358358B; HK1203384A1; JP2017178953A; EP2793925A1; SG10201605027XA; US9610327B2

Abstract

本发明提供了能够结合并抑制激活素A、肌肉生长抑制素或GDF-11的活性的变体激活素IIB可溶性受体多肽和蛋白。本发明还提供了能够产生该变体多肽和蛋白的多核苷酸、载体和宿主细胞。还提供了用于治疗肌肉萎缩及其它疾病和障碍的组合物和方法。

Description

变体激活素受体多肽,单独或与化疗结合,及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年12月19日提交的美国序列号13/329,897的优先权权益，所述申请的完整公开内容出于所有目的以其整体通过引用并入本文。

本申请涉及现在未决的2011年4月5日提交的美国序列号13/080,515，其是现在被授权为美国专利号7,947,646的2008年3月5日提交的美国序列号12/074,877的分案，其要求2008年2月11日提交的美国临时申请序列号61/065,474和2007年3月6日提交的美国临时申请序列号60/905,459的权益，所述申请的公开内容在文本中作为依据并通过引用并入本文。

序列表的引用

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为题为A-1219-US-CIP_SeqList.txt的文件提供，所述文件大小为265,085字节并创建于2011年12月19日。序列表的电子格式中的信息以其整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明的技术领域涉及转化生长因子-β(TGF-β)家族成员和可溶性TGF-β受体，以及用于治疗各种障碍的调节TGF-β家族成员活性的方法。

背景技术

转化生长因子β(TGF-β)蛋白质家族包括转化生长因子-β(TGF-β)、激活素、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和生长/分化因子(GDF)。这些家族成员都参与包括细胞增殖、分化和其它功能的广泛的生物过程。

生长/分化因子8(GDF-8)，也称为肌肉生长抑制素(myostatin)，是大部分在发育和成人骨骼肌组织的细胞中表达的TGF-β家族成员。肌肉生长抑制素似乎在负控制骨骼肌生长中起着关键作用(McPherron等,Nature(London)387,83-90(1997))。拮抗肌肉生长抑制素已被证明增加动物的瘦肌肉量(McFerron等,上文，Zimmers等,Science296:1486(2002))。

另一种TGF-β蛋白质家族的成员是一种相关的生长/分化因子，GDF-11。GDF-11与肌肉生长抑制素的氨基酸序列具有约90％的序列一致性。GDF-11在发育动物的轴向成形中发挥作用(Oh等,Genes Dev11:1812-26(1997))，且也似乎在骨骼肌发育和生长中发挥作用。

激活素A、B和AB分别是两种多肽链(βA和βB)的同型二聚体和异型二聚体(Vale等,Nature321,776-779(1986),Ling等,Nature321,779-782(1986))。最初激活素作为与促卵泡成熟激素合成的调节相关的性腺肽而被发现，而现在认为其与许多生物活性的调节有关。激活素A是激活素的主要形式。

激活素、肌肉生长抑制素、GDF-11和TGF-β超家族的其它成员通过激活素II型和激活素IIB型受体的组合而结合和发送信号，这两者都是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶(Harrison等,J.Biol.Chem.279,28036-28044(2004))。交联研究已经确定肌肉生长抑制素能够体外结合激活素II型受体ActRIIA和ActRIIB(Lee等,PNAS USA 98:9306-11(2001))。还有证据表明，GDF-11既结合ActRIIA，又结合ActRIIB(Oh等,Genes Dev16:2749-54(2002))。

已知TGF-β蛋白表达与各种疾病和障碍有关。因此，能够同时拮抗几种TGF-β蛋白的治疗性分子可这些疾病和障碍特别有效。

此外，蛋白质的表达和纯化过程中存在的问题可以使蛋白质治疗剂的生产复杂化。一个问题是表达或纯化过程中蛋白质的聚集。细胞培养条件过程中蛋白的高水平积累可以导致聚集。纯化过程可以使蛋白质暴露于促进进一步聚集的额外因素(Cromwell,M.E.M.等,The AAPSJournal8:E572-E579,2006)。可以进行尝试以减轻引起聚集的因素，然而，存在对于设计成具有降低的形成聚集体的倾向的蛋白质的需求。本发明对于治疗性分子满足了该需求，所述治疗性分子结合多个配体，并且具有降低的聚集，且因此改善的可制造性，以便有效地生产可用于治疗TGF-β相关疾病状态的蛋白质。

发明概述

本发明提供了包含变体人激活素受体IIB(命名为vActRIIB或sActRIIB)多肽的分离的蛋白质。本文所用的术语vActRIIB多肽是指人vActRIIB多肽和人vActRIIB5多肽。在一个实施方案中，所述蛋白质包含具有SEQ ID NO：2或18的氨基酸序列的多肽，其中位置E28或R40或位置E28和R40两者的氨基酸被另一种非天然氨基酸取代，且其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。在一个实施方案中，所述蛋白质包含具有SEQ ID NO：2或18的氨基酸序列的多肽，其中位置E28或R40或E28和R40两者的氨基酸被非天然氨基酸取代，且其中信号肽被去除，且其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。在一个实施方案中，所述蛋白质包含具有SEQ ID NO：2或18的氨基酸序列的多肽，其中位置E28或R40或E28和R40两者的氨基酸被另一种氨基酸取代，其中信号序列被去除，且成熟多肽的N-末端被截短，且其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。在一个实施方案中，N-末端截短的成熟vActRIIB多肽缺乏成熟序列的N-末端4个氨基酸或N-末端6个氨基酸，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。在一个实施方案中，位置E28处的置换选自W、Y和A。在进一步的实施方案中，位置E28处的置换选自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y。在进一步的实施方案中，位置R40处的置换选自氨基酸G、Q、M、H、K和N。在进一步的实施方案中，位置E28处的置换选自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y，且位置R40处的置换选自氨基酸A、G、Q、M、H、K和N。在进一步的实施方案中，所述多肽进一步包含异源蛋白质。在一个实施方案中，所述异源蛋白质是Fc结构域。在进一步的实施方案中，Fc结构域是人IgG Fc结构域。

在一个实施方案中，所述蛋白质包含具有SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、70、72、87、88、91、93、95、和97所示的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施方案中，所述蛋白质包含具有SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96所示的序列或其互补序列的多核苷酸编码的多肽。

在另一个方面，本发明提供包含编码vActRIIB多肽的多核苷酸的分离的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸分子包含具有SEQ IDNO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、69、71、92、94、96所示的核酸序列或其互补序列的多核苷酸。

在另一个实施方案中，所述核酸分子包含编码由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述核酸分子进一步包含转录或翻译调控序列。在另一个方面，提供包含vActRIIB核酸分子的重组载体。在另一个方面，提供包含重组载体的宿主细胞，且提供产生vActRIIB多肽的方法。

本发明进一步提供含有至少一种本发明的vActRIIB多肽或蛋白的组合物。在一个实施方案中，组合物是含有与药学上可接受的载体混合的vActRIIB多肽或蛋白的药物组合物。

在另一个方面，本发明提供通过向受试者施用含有vActRIIB多肽或蛋白的治疗组合物来治疗或预防患有肌肉萎缩疾病(muscle wastingdisease)的受试者中的此类障碍的方法。肌肉萎缩疾病包括，但并不限于，以下病症或由其引起：癌症恶病质、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺病、慢性心脏衰竭、化学恶病质、HIV/AIDS导致的恶病质、肾衰竭、尿毒症、类风湿关节炎、年龄相关的少肌症、年龄相关的衰弱、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺(androgen deprivation)和由于长期卧床导致的不活动而引起的肌肉萎缩、脊髓损伤、中风、骨折、和老化。肌肉萎缩也可以起因于由于太空飞行导致的失重、胰岛素抵抗、由于烧伤导致的肌肉萎缩、雄激素剥夺和其它障碍。在另一个方面，本发明提供治疗与激活素A的表达相关的疾病的方法。在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在另一个方面，本发明提供治疗代谢障碍的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗组合物，其中代谢障碍选自骨损失、糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量受损、高血糖症、雄激素剥夺和代谢综合征。在另一个方面，本发明提供基因治疗的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用编码本发明的vActRIIB多肽或蛋白的载体，其中所述载体能够在受试者中表达vActRIIB多肽或蛋白。

在另一个实施方案中，提供了药物组合物，包含：i)变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11，和ii)化疗剂。药物组合物的变体激活素IIB受体可以在vActRIIB多肽的位置28处具有置换，其选自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y取代E。在另一个实施方案中，vActRIIB多肽的位置28处的置换选自氨基酸A、W和Y取代E，或者vActRIIB多肽的位置28处的置换是W。仍然在其它实施方案中，vActRIIB多肽缺乏N-末端信号序列。仍然在其它实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、化疗剂和激活素IIB受体多肽变体。

在另一个方面，药物组合物的化疗剂是核苷类似物。在其它实施方案中，化疗剂可以是5-氟尿嘧啶或达卡巴嗪。

在另一个实施方案中，提供了抑制需要此类治疗的受试者中的肌肉生长抑制素活性的方法，包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含i)变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11，和ii)化疗剂。药物组合物的变体激活素IIB受体可以在vActRIIB多肽的位置28处具有置换，其选自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y取代E。在其它实施方案中，vActRIIB多肽的位置28处的置换选自氨基酸A、W和Y取代E，或者vActRIIB多肽的位置28处的置换是W。仍然在其它实施方案中，vActRIIB多肽缺乏N-末端信号序列。

在另一个方面，提供了治疗需要此类治疗的受试者中其中激活素过表达的疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含i)变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ IDNO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11，和ii)化疗剂。药物组合物的变体激活素IIB受体可以在vActRIIB多肽的位置28处具有置换，其选自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y取代E。在其它实施方案中，vActRIIB多肽的位置28处的置换选自氨基酸A、W和Y取代E，或者vActRIIB多肽的位置28处的置换是W。仍然在其它实施方案中，vActRIIB多肽缺乏N-末端信号序列。

在本发明的一个方面，上述方法可用于治疗癌症。癌症可以是睾丸癌、卵巢癌或黑素瘤。

在另一个实施方案中，提供了降低需要此类治疗的受试者中的肿瘤团块大小的方法，包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含i)变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11，和ii)化疗剂。药物组合物的变体激活素IIB受体可以在vActRIIB多肽的位置28处具有置换，其选自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y取代E。在其它实施方案中，vActRIIB多肽的位置28处的置换选自氨基酸A、W和Y取代E，或者vActRIIB多肽的位置28处的置换是W。仍然在其它实施方案中，vActRIIB多肽缺乏N-末端信号序列。肿瘤团块可以起因于睾丸癌或卵巢癌或黑素瘤。

仍然在另一个实施方案中，提供了治疗需要此类治疗的受试者中的黑素瘤的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。

在另一个实施方案中，提供了治疗需要此类治疗的受试者中的具有血管生成因子过表达的病症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。所述病症可以是癌症，且所述癌症可以是卵巢癌。VEGF-A或Ang-1可以是过表达的。

附图简要说明

图1.图1显示了野生型可溶性ActRIIB-人IgG1Fc(SEQ ID NO：98)的氨基酸序列。信号肽序列以粗体表示，随后为成熟ActRIIB胞外结构域和以斜体表示的人IgG1Fc，包括部分铰链区。氨基酸E28和R40用下划线表示。接头序列GGGGS(SEQ ID NO：75)以斜体和下划线表示。

图2.图2显示了可溶性ActRIIB5-人IgG1Fc(SEQ ID NO：99)的氨基酸序列。信号肽序列以粗体表示，随后为成熟ActRIIB5可溶性结构域和以斜体表示的人IgG1Fc，包括部分铰链区。E28和R40用下划线表示。接头序列(GGGGS)(SEQ ID NO：75)以斜体和下划线表示。

图3.图3显示了可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对抑制素-α敲除小鼠中的睾丸(图3A)和卵巢(图3B)质量的影响。

图4A-4B.图4显示了可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对雄性(图4A)和雌性(图4B)抑制素-α敲除小鼠的存活率的影响。

图5.图5显示了可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对携带colon26肿瘤的小鼠的体重的影响。

图6.图6显示了可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对携带colon26肿瘤的小鼠的存活率的影响。

图7A-7D显示了小鼠中的激活素水平(图7A)和sActRIIB(E28W)对KO小鼠中卵巢癌(OC)的影响(图7A-7D)。图7A显示了正常和卵巢癌中激活素的水平。***P<0.001,Student t-检验；n＝20。图7B显示了sActRIIB对激活素水平的影响。数值是平均值±SEM。***:P<0.001vs.WT对照.n＝6-12。图7C显示了卵巢质量随sActRIIB的变化。数值是平均值±SEM。***:P<0.001vs.WT对照。n＝6-10。图7D显示了处理和未处理的小鼠中的卵巢肿瘤。比例尺＝10mm

图8A-8B显示了用sActRIIB(E28W)处理之后激活素A的阻断消除了卵巢肿瘤中VEGF水平的过表达(图8A)和睾丸肿瘤中胱天蛋白酶-3的活化(图8B)。图8A-数值是平均值SEM。*:P<0.05；Student t-检验。n＝10。图8B-**P<0.01,Student t-检验。

图9A-9B显示了激活素拮抗剂sActRIIB(E28W)和细胞毒性化疗剂对肿瘤生长的影响。图9A显示了sActRIIB和5-Fu对裸鼠中的TOV-21G肿瘤生长抑制的影响。纵向记录肿瘤体积的变化。***:P<0.001vs.PBS；^#:P<0.05vs.5-Fu；重复测量ANOVA；n＝12。图9B显示了sActRIIB和达卡巴嗪对裸鼠中G361人黑素瘤异种移植物的生长的影响。肿瘤体积(mm³)的结果表示为平均值±SEM。*:P<0.05vs.PBS组。基于重复测量ANOVA的统计。n＝8。

发明详述

公开了包含变体人激活素IIB受体(vActRIIB；也称作sActRIIB)多肽的蛋白质。这些蛋白质和多肽的特征在于其结合三种TGF-β蛋白(肌肉生长抑制素(GDF-8)、激活素A和GDF-11)中至少一种并抑制这些蛋白质的活性的能力。这些蛋白质和多肽也表现出与不含本文公开的修饰的多肽相比降低的聚集趋势。所述修饰由相对于登录号NP_001097的野生型ActRIIB(SEQ ID NO：47)及ActRIIB(SEQ ID NO：18)或ActRIIB5(SEQ ID NO：2)的胞外结构域的位置28、40或28和40两者处的氨基酸置换组成。

本文所用的术语“TGF-β家族成员”或“TGF-β蛋白”是指转化生长因子家族的结构相关生长因子，所述转化生长因子家族包括激活素、生长和分化因子(GDF)蛋白(Kingsley等Genes Dev.8:133-146(1994),McPherron等Growth factors and cytokines in health and disease,Vol.1B,D.LeRoith和C.Bondy.ed.,JAI Press Inc.,Greenwich,Conn,USA:pp357-393)。

GDF-8，也被称为肌肉生长抑制素，是骨骼肌组织的负调控因子(McPherron等PNAS USA94:12457-12461(1997))。肌肉生长抑制素是以约为375个氨基酸长的失活蛋白复合物合成，具有人GenBank登录号AAB86694(SEQ ID NO：49)。所述前体蛋白通过四碱基加工位点的蛋白酶切割而激活，以产生N-末端失活的前结构域和约109个氨基酸的C-末端蛋白，其二聚化以形成约25kDa的同型二聚体。这种同型二聚体是成熟的生物活性蛋白(Zimmers等,Science296,1486(2002))。

本文所用的术语“前结构域”或“前肽”是指失活的N-末端蛋白，其切割以释放活性C-末端蛋白。本文中所用的术语“肌肉生长抑制素”或“成熟的肌肉生长抑制素”是指成熟的生物活性C-端多肽，以单体、二聚体或其它形式，以及生物活性片段或包括等位基因变体、剪接变体、融合肽和多肽的相关多肽形式存在。据报道，成熟的肌肉生长抑制素已在包括人、小鼠、鸡、猪、火鸡和大鼠的许多物种间具有100％的序列一致性(Lee等,PNAS98,9306(2001))。

本文所用的GDF-11是指具有Swissprot登录号为O95390(SEQ IDNO：50)的BMP(骨形态发生蛋白)，以及该蛋白的变体和物种同源物。GDF-11在氨基酸水平与肌肉生长抑制素具有约90％一致性。GDF-11与中轴骨骼的前/后模式化的调节有关(McPherron等,Nature Genet.22(93):260-264(1999)；Gamer等,Dev.Biol.208(1),222-232(1999))，但出生后的功能未知。

激活素A是多肽链βA的同型二聚体。本文中所用的术语“激活素A”是指具有GenBank登录号NM_002192(SEQ ID NO：48)的激活素蛋白，以及该蛋白的变体和物种同源物。

激活素受体

本文所用的术语激活素IIB型受体(ActRIIB)是指具有登录号NP_001097(SEQ ID NO：47)的人激活素受体。术语可溶性ActRIIB涵盖ActRIIB(SEQ ID NO：18)、ActRIIB5(SEQ ID NO：2)的胞外结构域以及其中位置64处的精氨酸被丙氨酸取代的这些序列。

变体可溶性ActRIIB多肽

本发明提供了分离蛋白，所述分离蛋白包含人变体可溶性ActIIB受体多肽(本文称为vActRIIB多肽或变体多肽或sActRIIB)。本文所用的术语“vActRIIB蛋白”是指包含vActRIIB多肽的蛋白。本文所用的术语“分离的”是指从内源性物质纯化到一定程度的蛋白或多肽分子。这些多肽和蛋白的特点是具有结合并抑制激活素A、肌肉生长抑制素或GDF-11中任一种的活性的能力。在一些实施方案中，与野生型多肽相比，变体多肽对激活素A、肌肉生长抑制素或GDF-11的结合亲和力得到改进。

在一个实施方案中，vActRIIB多肽具有SEQ ID NO：2或18的氨基酸序列，其中位置E28或R40或位置E28和R40两者处的氨基酸被另一种非天然氨基酸取代，且其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。在另一个实施方案中，vActRIIB多肽是这些序列的成熟形式或截短的成熟形式。本文所用的术语“成熟vActRIIB多肽”是指氨基酸信号序列被去除的多肽。在一个实施方案中，成熟序列是，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸19至160，和SEQ ID NO：18的氨基酸19至134，其中位置28和40处的一个或两个氨基酸被另一种非天然氨基酸取代，且所述多肽保留结合激活素A、肌肉生长抑制素或GDF-11的能力。本文所用的术语截短的成熟vActRIIB多肽是指具有信号序列且此外氨基酸从成熟多肽的N-末端去除的多肽。在一个实施方案中，成熟多肽的成熟的N-末端4个氨基酸或N-末端6个氨基酸被去除。在该实施方案中，截短的成熟序列是，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸23至160，或SEQ ID NO：2的氨基酸25至160；和SEQ ID NO：18的氨基酸23至134，或SEQ ID NO：18的氨基酸25至134，其中位置28和40的一个或两个氨基酸被非野生型氨基酸取代，其保留结合激活素A、肌肉生长抑制素或GDF-11的能力。本文所用的术语“位置28”和“位置40”(即，E28和R40)是指相对于包括18个氨基酸信号序列的序列SEQ ID NOS：2和18的氨基酸位置。为了保持一致性，如果相对于成熟或截短的成熟序列，成熟vActRIIB多肽在位置10和/或位置22处具有置换，或截短的成熟多肽在位置6和/或位置18处具有置换，或在位置4和/或位置16处具有置换，则仍然将这些变体相对于全长SEQ IDNO：2和18讨论，或如图1或2中所示，即，在位置E28和/或R40的氨基酸置换。以下例举此类成熟的实施方案或N-末端截短的实施方案。

在一个实施方案中，位置E28处的置换选自氨基酸W、Y和A。在一个实施方案中，位置28处的置换是W。在进一步的实施方案中，位置28处的置换选自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y。在进一步的实施方案中，位置40处的置换选自氨基酸G、Q、M、H、K和N。在进一步的实施方案中，位置28处的置换选自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y，且位置40处的置换选自氨基酸A、G、Q、M、H、K和N。在一个实施方案中，所述蛋白质包含具有选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95、和97的氨基酸序列的多肽。在另一个实施方案中，所述蛋白质包含具有选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96的序列或其互补序列的多核苷酸编码的多肽。

在一个实施方案中，信号序列从vActRIIB多肽去除，留下了成熟的变体多肽。各种信号肽可用于制备本申请的多肽。信号肽可以具有图1和2中显示的序列(SEQ ID NO：73)，或者替代信号序列诸如SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：2和18的信号序列。可以使用可用于表达vActRIIB或vActRIIB5多肽的任何其它信号肽。

在另一个实施方案中，vActRIIB多肽具有基本上类似于SEQ IDNO：2和18的序列。本文所用的术语“基本上类似”是指与SEQ ID NO：2和18中所示的氨基酸序列具有至少约80％一致性，至少约85％一致性，至少约90％一致性，至少约95％一致性，至少约98％一致性，或至少约99％一致性的多肽，并且其中位置28和/或40处的一个或两个氨基酸被非野生型氨基酸取代，其中所述多肽保留SEQ ID NO：2和18多肽的活性，即结合并抑制肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11的能力。此外，术语vActRIIB多肽涵盖SEQ ID NO：2或18的片段，诸如含有本文所述的位置28和/或40处的置换的N和C末端截短，其中所述多肽能够结合并抑制肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。

本文所用的术语vActRIIB和vActRIIB5多肽的“衍生物”是指结合至少一个额外化学部分或至少一个额外多肽以形成共价或聚集偶联物，诸如糖基、脂质、乙酰基或C-末端或N-末端融合多肽，与PEG分子的偶联，和下文更充分描述的其它修饰。变体ActRIIB受体多肽(vActRIIB)还可以包括额外的修饰和衍生物，包括由于在不同细胞类型诸如哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母和其它重组宿主细胞中表达而加工产生的对C和N末端的修饰。进一步包括的是vActRIIB多肽片段和SEQID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示的多肽序列的包含失活的N-糖基化位点、失活的蛋白酶加工位点或保守的氨基酸置换的多肽。

本文所用的术语“vActRIIB或vActRIIB5多肽活性”或“可溶性ActRIIB或ActRIIB5多肽的生物学活性”是指vActRIIB和vActRIIB5多肽的一种或多种体外或体内活性，包括但不限于下文实施例中所证实的那些。vActRIIB多肽的活性包括但不限于，结合肌肉生长抑制素或激活素A或GDF-11的能力，和降低或中和肌肉生长抑制素或激活素A或GDF-11的活性的能力。本文所用的术语“能够结合”肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11是指通过本领域中已知的方法，诸如下文实施例2中所述的Biacore方法所测定的结合。此外，在实施例2中，基于pMAREC2C12细胞的测定法测量了激活素A中和活性、肌肉生长抑制素中和活性和GDF-11中和活性。体内活性包括但不限于增加体重、增加瘦肌肉量、增加骨骼肌量、降低脂肪量，如下文动物模型所证实和本领域中已知的。生物活性进一步包括降低或预防由某些类型的肿瘤引起的恶病质，预防某些类型的肿瘤的生长，和增加某些动物模型的存活率。下文提供vActRIIB多肽活性的进一步讨论。

本发明的多肽进一步包含直接或通过接头序列连接至的vActRIIB多肽以形成融合蛋白的异源多肽。本文所用的术语“融合蛋白”是指具有经由重组DNA技术连接的异源多肽的蛋白质。异源多肽包括但不限于促进变体ActRIIB多肽的寡聚化和稳定化的Fc多肽、His标记和亮氨酸拉链结构域，如例如WO 00/29581(通过引用并入本文)中所描述。在一个实施方案中，异源多肽是Fc多肽或结构域。在一个实施方案中，Fc结构域选自人IgG1、IgG2和IgG4Fc结构域。SEQ ID NO：80、82和84提供这些。vActRIIB可以进一步包含IgG1、IgG2或IgG4中与其各自的IgG Fc区域邻近的铰链序列的全部或部分。SEQ ID NO：76、77和78分别提供了IgG1、IgG2和IgG4的完整铰链序列。

vActRIIB多肽可以任选进一步包含“接头”序列。接头主要充当多肽和第二异源多肽或其它类型的融合体之间，或两个或更多个变体ActRIIB多肽之间的间隔区。在一个实施方案中，接头由通过肽键连接在一起的氨基酸，优选通过肽键连接的1至20个氨基酸构成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一个或多个可以被糖基化，如本领域技术人员所理解的。在一个实施方案中，1至20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。优选地，接头由大多数无空间位阻的氨基酸诸如甘氨酸和丙氨酸构成。示例性接头是聚甘氨酸(特别是(Gly)₅、(Gly)₈、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。如下文实施例中所示的一个示例性的合适接头是(Gly)₄Ser(SEQ ID NO：75)。在进一步的实施方案中，vActRIIB可以包含铰链接头，即如SEQ IDNO：79中例举的邻近于铰链区提供的接头序列。

接头也是非肽接头。例如，可以使用烷基接头诸如-NH-(CH₂)_s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可以被任何非空间位阻基团诸如低级烷基(例如，C₁-C₆)、低级酰基、卤素(例如，Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等取代。

在一个实施方案中，vActRIIB多肽可以直接或经由接头或经由铰链接头连接至Fc多肽。在一个实施方案中，Fc是人IgG Fc。连接至Fc的vActRIIB包括，例如，vActRIIB-IgG1Fc，E28A(SEQ ID NO：60)；vActRIIB-IgG1Fc，E28W(SEQ ID NO：62)、vActRIIB-IgG1Fc，E28Y(SEQID NO：64)、vActRIIB-IgG Fc，R40G(SEQ ID NO：66)、vActRIIB5-IgG1Fc，E28A(SEQ ID NO：70)和vActRIIB5-IgG1Fc E28W(SEQ ID NO：72)，如表1和2中所示和在本文实施例中所述的。进一步的实施方案包括vActRIIB-IgG2Fc，E28W(SEQ ID NO：91)、vActRIIB-IgG2Fc，E28Y(SEQ ID NO：93)和vActRIIB-IgG2Fc(SEQ IDNO：95)。已经表明，与野生型ActRIIB-IgG2IgG2相比，变体产生较少的聚集，如下文实施例中所证实的。

出于赋予ActRIIa多肽期望特性，诸如降低降解和/或增加半衰期、降低毒性、降低免疫原性和/或增加生物活性的目的，本文公开的vActRIIB多肽也可以连接至非多肽分子。示例性分子包括但不限于线性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖；脂质；胆固醇基团(诸如类固醇)；碳水化合物或寡糖分子。

在另一个方面，本发明提供了包含编码本发明的vActRIIB多肽的多核苷酸的分离的核酸分子。本文所用的术语“分离的”是指从内源性物质纯化至一定程度的核酸分子。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97的多肽的多核苷酸。由于已知的遗传密码简并性(其中多于一个密码子可以编码相同的氨基酸)，DNA序列可以从SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94和96所示的序列或SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94和96的互补链发生变化、并且仍然编码具有SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97的氨基酸序列的多肽。此类变体DNA序列可以起因于生产过程中发生的沉默突变，或者可以是这些序列的有意诱变的产物。

在另一个实施方案中，本发明的核酸分子包含具有SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94和96所示的多核苷酸序列或SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94和96的互补链的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了在严格或中等条件与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94和96的多肽编码区域杂交的核酸分子，其中编码的多肽包含SEQ IDNO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97所示的氨基酸序列，且其中编码的多肽保留了vActRIIB多肽的活性。

本发明的核酸分子包括单链和双链形式两者的DNA，以及其RNA互补序列。DNA包括，例如，cDNA、基因组DNA、合成DNA、PCR扩增的DNA及其组合。基因组DNA可通过常规技术，诸如通过采用SEQ ID NO：1或17的DNA或其合适的片段作为探针而分离。编码ActRIIB多肽的基因组DNA获得自对许多物种有用的基因组文库。合成DNA获得自化学合成重叠寡核苷酸片段，随后组装片段以重构编码区和侧翼序列的部分或全部。RNA可获得自引导mRNA高水平合成的原核表达载体，诸如采用T7启动子和RNA聚合酶的载体。cDNA获得自由表达ActRIIB的各种组织分离的mRNA制备的库。本发明的DNA分子包括全长基因以及多核苷酸和其片段。全长基因还可包括编码N末端信号序列的序列。

在本发明的另一个方面，还提供了包含核酸序列的表达载体，并且还提供了用此类载体转化的宿主细胞和产生vActRIIB多肽的方法。术语“表达载体”是指用于从多核苷酸序列表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。用于表达vActRIIB多肽的载体最低限度包含用于载体繁殖和用于表达克隆的插入片段所需的序列。表达载体包含转录单元，其包含(1)一个或多个在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如，启动子或增强子，(2)编码待转录为mRNA并翻译为蛋白质的vActRIIB多肽的序列，和(3)适当的转录起始和终止序列的组装。这些序列可以进一步包括选择标记。适于在宿主细胞中表达的载体是容易获得的，且使用标准重组DNA技术将核酸分子插入载体中。此类载体可以包括在特定组织中发挥功能的启动子，和用于在人或动物靶细胞中表达vActRIIB的病毒载体。适于表达vActRIIB的示例性表达载体是含有vActRIIB多核苷酸的pDSRa(在WO 90/14363中描述，通过引用并入本文)及其衍生物，以及本领域中已知或下文描述的任何额外的合适载体。

本申请进一步提供了制备vActRIIB多肽的方法。可使用其它各种表达/宿主系统。这些系统包括但不限于微生物，诸如用重组噬菌体转化的细菌，质粒或粘粒DNA表达载体；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒,TMV)转染或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。用于重组蛋白产生的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或其衍生物，诸如生长于无血清培养基的Veggie CHO和相关细胞系(参见Rasmussen等,1998,Cytotechnology28:31)或DHFR缺陷的CHO品系DX-B11(参见Urlaub等,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20)、COS细胞(诸如猴肾细胞的COS-7细胞系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等,1981,Cell23:175)，W138、BHK、HepG2、3T3(ATCC CCL163)、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、L细胞、C127细胞、BHK(ATCC CRL10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL70)(参见McMahan等,1991,EMBO J.10:2821)、人胚胎肾细胞诸如293、293EBNA或MSR293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其它转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、来自原代组织体外培养的细胞株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。哺乳动物表达允许可从生长培养基中回收的分泌或可溶性多肽的产生。

采用适当的宿主-载体系统，通过在允许生产的条件下培养用含有本发明核酸分子的表达载体转化的宿主细胞来重组产生vActRIIB多肽。转化细胞可以用于长期、高产率的多肽生产。一旦将此类细胞用含有选择标记以及所需表达盒的载体转化，在将它们转换到选择培养基之前，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天。设计选择标记以允许成功地表达引入序列的细胞的生长和回收。可以采用适合于所用细胞系的组织培养技术使稳定转化细胞的抗性簇增殖。重组蛋白表达的综述在Methods of Enzymology,v.185,Goeddell,D.V.,ed.,Academic Press(1990)中发现。

在某些情况下，诸如在利用原核系统的表达中，本发明所表达的多肽可能需要“重折叠”并氧化为合适的三级结构和产生二硫键，以具有生物活性。重折叠可以通过使用本领域公知的许多程序实现。此类方法包括，例如，使溶解的多肽在离液剂存在下暴露于通常高于7的pH值。该离液剂的选择类似于用于包涵体增溶的选择，但离液剂通常是在较低浓度下使用。典型的离液剂是胍和尿素。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将包含特定比例的还原剂加上其氧化形式以产生特定的氧化还原电位，其允许半胱氨酸桥形成出现的二硫键重整(disulfideshuffling)。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-bME。在许多情况下，共溶剂可用于提高重折叠效率。常用的共溶剂包括丙三醇、不同分子量的聚乙二醇和精氨酸。

此外，所述多肽可以根据常规技术在溶液中或固体载体上合成。各种自动合成器是可商购的，而且可以根据已知的方案使用。参见，例如，Stewart和Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2d.Ed.,Pierce ChemicalCo.(1984)；Tam等,J Am Chem Soc,105:6442,(1983)；Merrifield,Science232:341-347(1986)；Barany和Merrifield,The Peptides,Gross andMeienhofer,eds,Academic Press,New York,1-284；Barany等,Int J PepProtein Res,30:705-739(1987)。

本发明的多肽和蛋白可以根据本领域技术人员公知的蛋白质纯化技术来纯化。这些技术包括，在一个层面上，对蛋白质和非蛋白部分的粗分级分离。肽或多肽与其它蛋白分离之后，目标肽或多肽可使用色谱和电泳技术进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至同质)。本文所用的术语“分离的多肽”或“纯化的多肽”意欲指可从其它成分分离的组合物，其中将所述多肽纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。因此，纯化多肽还指一种免受其天然存在的环境影响的多肽。一般而言，“纯化”是指已经进行分级分离以去除各种其它成分的多肽组合物，而且所述组合物基本上保留其表达的生物活性。当使用术语“基本上纯化的”时，该名称是指多肽或肽形成所述组合物的主要成分，例如占所述组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约85％或约90％或更高的肽或多肽组合物。

适用于纯化的各种技术对本领域技术人员而言是公知的。这些技术包括，例如，用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀)等或通过加热变性，随后通过离心进行沉淀；色谱分析，诸如亲和层析(蛋白A柱)、离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石、疏水相互作用层析、等电聚焦、凝胶电泳；以及这些技术的组合。本领域公知的，据信进行各种纯化步骤的顺序可变化，或者某些步骤可省略，但还是产生一种制备基本上纯化多肽的合适方法。下文实施例提供了示例性的纯化步骤。

根据本发明，用于定量多肽纯化程度的各种方法将是本领域技术人员公知的。这些方法包括，例如，测定活性级分的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析评价级分内肽或多肽的量。评价多肽级分纯度的优选方法是计算所述级分的结合活性，与初始提取物的结合活性比较，从而计算纯化程度，本文中通过“纯化倍数”来评价。当然，用于表示结合活性量的实际单位将取决于进行纯化所选的特定检测技术以及多肽或肽是否表现出可检测的结合活性。

变体激活素IIB型多肽结合活化肌肉降解级联的配体。能够结合配体激活素A、肌肉生长抑制素和/或GDF-11并抑制其活性的vActRIIB多肽具有针对涉及肌肉萎缩的疾病以及治疗某些癌症，例如卵巢肿瘤、前列腺肿瘤和黑素瘤和如下文实施例中所示的其它疾病的治疗可能性。

然而，当表达或纯化野生型ActRIIB或ActRIIB5多肽时，可以发生聚集。这种聚集包括在表达过程中的结构化寡聚物的形成和表达过程中和蛋白纯化后的非结构化聚集物的生成。

结构分析、分子建模和质谱的组合方法已经表明，ActRIIB多肽中可以经由非糖基化的ActRIIB多肽之间的静电和氢键相互作用辅助的分子间二硫键形成而产生多聚化。两个ActRIIB分子的界面处；例如一个ActRIIB中的E28侧链和另一个ActRIIB中的R40侧链之间存在明显的氢键。此外，一个ActRIIB中的E28和另一个ActRIIB中的R40之间存在关键的静电相互作用。

这些静电相互作用可以明显有助于增加暂时的ActRIIB二聚体的群体，导致促进ActRIIB单位之间的非共价键和/或共价键形成。残基28和40之间的相互作用是这些相互作用中最关键的，因为这两个残基参与双氢键和强静电相互作用。残基28和40参与ActRIIB:ActRIIB相互作用，而不参与ActRIIB:配体相互作用。因此，残基28和40根据本发明可以被非天然氨基酸取代，以改善溶解度和降低受体多肽的聚集。因此，如下文所示，E28和R40可以分别被其它可能的天然氨基酸取代、表达、并通过Biacore测试。Biacore测定的结合显示于下文实施例2中的表1A和1B。此外，下文确定了vActRIIB多肽的聚集百分比。

下文实施例中的结果显示了具有本文所述的氨基酸置换的vActRIIB多肽和蛋白质的降低的聚集，同时保留了结合并中和肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11的能力。

抗体

本发明进一步包括结合变体ActRIIB多肽的抗体，包括特异性结合本发明vActRIIB多肽的那些抗体。本文所用的术语“特异性结合”是指抗体对vActRIIB多肽的结合亲和力(K_a)为10⁶M^-1或以上。本文所用的术语“抗体”是指完整的抗体，包括多克隆抗体(参见例如，Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow和Lane(eds),Cold Spring Harbor Press,(1988))和单克隆抗体(参见例如，美国专利号RE 32,011,4,902,614,4,543,439和4,411,993以及Monoclonal Antibodies:A New Dimension in BiologicalAnalysis,Plenum Press,Kennett,McKearn和Bechtol(eds.)(1980))。本文所用的术语“抗体”也指通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学切割产生的抗体片段，诸如F(ab)、F(ab’)、F(ab’)₂、Fv、Fc和单链抗体。术语“抗体”也指双特异性或双功能性抗体，其是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过包括杂交瘤融合或Fab'片段连接的各种方法来制备(参见Songsivilai等,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990),Kostelny等,J.Immunol.148:1547-1553(1992))。

本文所用的术语“抗体”也指嵌合抗体，即，具有偶联至一种或多种非人可变抗体免疫球蛋白结构域的人恒定抗体免疫球蛋白结构域的抗体，或其片段(参见例如，美国专利号5,595,898和美国专利号5,693,493)。抗体也指“人源化”抗体(参见例如，美国专利号4,816,567和WO94/10332)、微抗体(minibody)(WO 94/09817)、巨抗体(maxibody)以及通过转基因动物产生的抗体，其中含有一部分人抗体产生基因但内源抗体产生缺陷的转基因动物能够产生人抗体(参见例如，Mendez等,NatureGenetics15:146-156(1997)和美国专利号6,300,129)。术语“抗体”还包括多聚抗体或蛋白质的较高级复合物，诸如异二聚抗体和抗独特型抗体。“抗体”还包括抗独特型抗体。例如，可以使用针对v ActRIIB的抗体以体外和体内鉴定和定量vActRIIB。

还包括来自任何哺乳动物的多克隆抗体，其特异性结合本文所述的vActRIIB多肽，例如，小鼠和大鼠抗体以及兔抗体，包括SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97。

此类抗体可用作研究工具和用于检测和测定本文所公开的多肽的定量分析中。此类抗体采用上述以及本领域公知的方法制备。

药物组合物

还提供了包含本发明的vActRIIB蛋白和多肽的药物组合物。此类组合物包含与药学上可接受的材料以及生理上可接受的制剂材料混合的治疗或预防有效量的多肽或蛋白质。所述药物组合物可包含用于改变、保持或保存例如，组合物的pH值、重量摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解率或释放率、吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括，但不限于，氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其它有机酸类)；增量剂(诸如甘露醇或甘氨酸)，螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(诸如pluronics、PEG、失水山梨醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨酯20、聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)；稳定性增强剂(蔗糖或山梨醇)；张度增强剂(诸如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇))；递送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences,18^th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990)。

最佳的药物组合物将由本领域技术人员例如根据预定施用途径、递送形式以及所需的剂量而确定。参见例如，Remington’s PharmaceuticalSciences,上文。此类组合物可影响多肽的物理形态、稳定性、体内释放率以及体内清除率。例如，合适的组合物可以是胃肠外施用的注射用水、生理盐水溶液。

药物组合物中的主要介质或载体在性质上可以是含水或非水性的。例如，合适的介质或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于胃肠外施用的组合物中的其它常见材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水也是示例性的介质。其它示例性的药物组合物包含pH为约7.0-8.5的Tris缓冲液或pH为约4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，其可进一步包括山梨醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方案中，组合物可通过将具有所需纯度的选定组合物与任选的制剂试剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences,上文)混合为冻干块状或水溶液形式而制备用于储存。此外，治疗组合物可使用适当的赋形剂诸如蔗糖配制为冻干产物。

所述制剂可以通过多种方法，例如，通过吸入疗法、口服或通过注射来递送。当预期胃肠外施用时，用于本发明的治疗组合物，可以是在药学上可接受的介质中包含所需多肽的无热原、胃肠外可接受的水溶液形式。一种特别合适的胃肠外注射介质是无菌蒸馏水，其中将多肽制成适当保存的无菌等渗溶液。又一种制剂可以涉及所需分子与试剂诸如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、小珠或脂质体的制剂，所述试剂提供然后可通过贮库型注射而递送的产物的控释或缓释。还可使用透明质酸，这可能具有促进循环的持续时间的效果。引入所需分子的其它合适方法包括可植入的药物递送装置。

在另一个方面，适合于注射施用的药物制剂可在水溶液，优选生理上相容的缓冲液诸如汉克斯液、林格氏液或生理缓冲盐水中配制。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，活性化合物的悬浮液可制成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或介质包括脂肪油，诸如芝麻油或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯、甘油三酸脂或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可用于递送。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度并允许制备高浓缩溶液的试剂。在另一个实施方案中，药物组合物可配制成用于吸入。吸入溶液还可与推进剂一起配制，用于气溶胶递送。在又一个实施方案中，可将溶液雾化。肺部施用还在PCT专利申请号PCT/US94/001875中描述，其描述了化学修饰蛋白质的肺部递送。

还预期可以口服使用某些制剂。在本发明的一个实施方案中，以这种方式施用的分子可以配制成含有或不含有通常用于固体剂型诸如片剂和胶囊的配制的那些载体。例如，可将胶囊设计为在生物利用度最大化和系统前降解最小化的胃肠道的点释放活性部分。可以包括其它试剂以促进治疗性分子的吸收。还可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑油、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。口服施用的药物组合物还可使用本领域公知的药学上可接受的载体配制成适合于口服施用的剂量。此类载体能够将药物组合物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂和悬浮液等，以供患者摄入。

口服用药物制剂可通过混合活性化合物与固体赋形剂以及加工所形成的颗粒混合物(任选地，在研磨后)以获得片剂或锭剂核心而制备。如果需要，可以添加合适的助剂。合适的赋形剂包括碳水化合物或蛋白质填料，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，诸如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄芪胶；和蛋白质，诸如明胶和胶原蛋白。如果需要，可添加崩解剂或增溶剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。

锭剂核心可与合适的包衣诸如浓缩糖溶液一起使用，其还可包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向药片或锭剂包衣中加入用于产品鉴定或表征活性化合物量(即，剂量)的染料或颜料。

可以口服的药物制剂还包括由明胶制成的压接式胶囊，以及由明胶和包衣诸如丙三醇或山梨醇制成的软密封胶囊。压接式胶囊可以包含与填料或粘合剂诸如乳糖或淀粉、润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可将活性化合物连同或不连同稳定剂溶解或悬浮于合适的液体中，诸如脂肪油、液体或液体聚乙二醇。

包括涉及缓释或控释递送制剂中多肽的制剂的其它药物组合物对本领域技术人员而言将是将是显而易见的。用于配制其它缓释或控释递送手段，诸如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔小珠和贮库型注射剂的技术也是本领域技术人员公知的。参见例如PCT/US93/00829，其描述了递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控释。缓释制剂的其它实例包括成型制品例如膜或微囊形式的半透型聚合物基质。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(U.S.3,773,919,EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等,Biopolymers,22:547-556(1983)、聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯)(Langer等,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277,(1981)；Langer等,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等,上文)或聚-D(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。缓释组合物还包括脂质体，其可以通过本领域公知的几种方法中的任何一种制得。参见例如Eppstein等,PNAS(USA),82:3688(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。

用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可通过无菌过滤膜的过滤实现。在所述组合物冻干时，采用这种方法的灭菌可以在冷干和重构之前或之后进行。用于胃肠外施用的组合物可能以冻干形式或溶液形式储存。此外，通常将胃肠外组合物置于具有无菌接入端口的容器中，例如，具有通过皮下注射针头刺破的塞子的静脉输液袋或小瓶。

一旦配制了药物组合物，其可以溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或脱水或冻干粉末形式储存于无菌小瓶中。此类制剂可以即时可用形式或以在施用前需要重构的形式(例如，冻干的)储存。

在一个特定的实施方案中，本发明涉及制备单剂量施用单位的试剂盒。所述试剂盒各自可包含：具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。本发明的范围还包括包含单和多腔室预填充注射器的试剂盒(例如，液体注射器和冻干注射器)。

治疗所用的药物组合物的有效量例如将取决于治疗情况和目标。因此，本领域技术人员将会理解治疗的适当剂量水平是变化的，这部分取决于递送的分子、所使用多肽的适应症、施用途径、患者的大小(体重、体表面积或器官大小)和状况(年龄和总体健康)。因此，临床医生可滴定剂量和改变施用途径，以获得最佳的治疗效果。典型的剂量范围为约0.1mg/kg至高达约100mg/kg或以上，这取决于上述因素。多肽组合物可优选为静脉内注射或施用。长效药物组合物可以是每3至4天、每周或每两周施用，这取决于特定制剂的半衰期和清除率。给药的频率将取决于所用制剂中多肽的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，所述组合物可作为一定时期内的单剂量或多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)，或作为连续输注进行施用。适当剂量的进一步改良是常规进行的。适当剂量可通过使用合适的剂量-反应数据来确定。

所述药物组合物的施用途径与已知的方法一致，例如，口服、通过静脉内、腹腔内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内途径、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下或腹腔注射；以及鼻内、肠道、局部、舌下、尿道、阴道或直肠的方法，通过缓释系统或通过植入装置施用。当需要时，所述组合物可通过推注、通过连续输注或通过植入装置而施用。选择性地或另外地，所述组合物可通过其上已吸附或包封所需分子上的膜、海绵或其它适当的材料的植入而局部施用。当使用植入装置时，可将所述装置植入任何合适的组织或器官，且所需分子的递送可通过扩散、定时释放药丸或连续施用而进行。

在一些情况下，本发明的vActRIIB多肽可以使用方法诸如本文所述的方法植入某些基因工程改造的细胞以表达和分泌多肽而递送。此类细胞可以是动物或人细胞，而且可以是自体同源的、异体的或异种的。任选地，所述细胞可以是永生化的。为了降低免疫反应的可能性，可包封所述细胞以避免渗入周围组织。包封材料通常是生物相容的半透型聚合物外壳或膜，其允许多肽产物释放，但防止患者免疫系统或来自周围组织的其它不利因素破坏细胞。

还预期体内vActRIIB基因治疗，其中将编码vActRIIB或vActRIIB衍生物的核酸分子直接引入受试者中。例如，将编码vActRIIB的核酸序列通过含有或不含有适当的递送载体(诸如腺相关病毒载体)的核酸构建体的局部注射引入靶细胞中。可选的病毒载体包括，但不限于，逆转录酶病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的物理转移可通过所需核酸分子构建体或含有所需核酸分子序列的适当递送载体的局部注射、脂质体介导的转移、直接注射(裸DNA)或微粒轰击(基因枪)在体内实现。

vActRIIB组合物的用途

本发明提供了通过接触多肽与vActRIIB多肽而降低或中和肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11在体内和体外的量或活性的方法和药物组合物。vActRIIB多肽对肌肉生长抑制素、激活素A和GDF-11具有高亲和力，并且能够降低和抑制肌肉生长抑制素、激活素A和GDF-11中至少一种的生物活性。在一些实施方案中，与野生型ActRIIB多肽相比，vActRIIB多肽表现出改善的活性。下文实施例中证实了这一点。

一个方面，本发明提供了通过向需要此类治疗的受试者施用有效剂量的vActRIIB组合物治疗所述受试者的肌肉生长抑制素相关和/或激活素A相关障碍的方法和试剂。本文所用的术语“受试者”是指任何动物，诸如哺乳动物，包括人类。

本发明的组合物用于增加体重的瘦肌肉量百分比和降低体重的脂肪量百分比。

可以通过vActRIIB组合物治疗的障碍包括但不限于各种形式的肌肉萎缩，以及代谢障碍，诸如糖尿病及相关障碍，和骨退化病诸如骨质疏松症。已经表明，vActRIIB组合物在下文实施例3中所示的各种疾病模型中有效地治疗肌肉萎缩障碍。这在抑制素-α敲除小鼠中肌肉萎缩的治疗、在colon-26癌症恶病质模型中的肌肉萎缩的治疗、在后肢悬吊模型中肌萎缩的预防、显示瘦肌肉量增加、脂肪量减少和骨矿物质含量增加的OXV雌性治疗中得到证实。

肌肉萎缩障碍还包括营养不良，诸如杜兴肌营养不良、进行性肌营养不良、贝克型肌营养不良、代-兰二氏肌营养不良、欧勃肌营养不良和幼儿神经轴索性营养不良。其它肌肉萎缩障碍是由慢性疾病或障碍引起的，诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化、充血性阻塞性肺疾病、癌症、AIDS、肾衰竭、器官萎缩、雄激素剥夺和类风湿性关节炎。

肌肉生长抑制素和/或激活素的过表达可能促进恶病质(一种严重的肌肉和脂肪萎缩综合征)。vActRIIB多肽在动物模型中处理恶病质的有效性显示在下文实施例3中。恶病质还由于类风湿性关节炎、糖尿病性肾病、肾衰竭、化疗、烧伤导致的损伤以及其它原因而产生。在另一个实例中，发现肌肉生长抑制素-免疫反应性蛋白的血清和肌肉内浓度在具有AIDS相关的肌肉萎缩的男性中增加，并与无脂肪量负相关(Gonzalez-Cadavid等,PNAS USA95:14938-14943(1998))。还表明肌肉生长抑制素水平响应于烧伤而增加，造成肌肉的分解代谢作用(Lang等,FASEB J15,1807-1809(2001))。导致肌肉萎缩的其它病症可能由于残疾(诸如限制于轮椅，因中风、疾病、脊髓损伤、骨折或外伤导致的长期卧床休养)造成的不活动，以及微重力环境下(太空飞行)的肌肉萎缩而产生。例如，发现血浆肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白质在长期卧床休养后增加(Zachwieja等J Gravit Physiol.6(2):11(1999)。还发现，在航天飞机飞行过程中大鼠肌肉暴露于微重力环境下的大鼠肌肉与未暴露的大鼠肌肉相比，表达的肌肉生长抑制素表达量增加(Lalani等,J.Endocrin167(3):417-28(2000))。

此外，年龄相关的脂肪肌肉比增加、以及年龄相关的肌肉萎缩似乎与肌肉生长抑制素有关。例如，平均血清肌肉生长抑制素-免疫反应性蛋白质在年轻组(19-35岁)、中年组(36-75岁)和老年组(76-92岁)男性和女性中随年龄的增加而增加，而平均肌肉量和无脂肪量在这些组中随年龄的增加而下降(Yarasheski等J Nutr Aging6(5):343-8(2002))。此外，现在已发现肌肉生长抑制素在心肌中以低水平表达，且其表达在梗塞后的心肌细胞中上调(Sharma等,J Cell Physiol.180(1):1-9(1999))。因此，降低心肌中的肌肉生长抑制素水平可改善梗塞后心肌的恢复。

肌肉生长抑制素似乎还影响着代谢障碍，包括2型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、高血糖症和肥胖症。例如，已表明缺乏肌肉生长抑制素能改善两种小鼠模型的肥胖和糖尿病表型(Yen等FASEB J.8:479(1994)。美国申请序列号：11/590,962、美国申请公开号：2007/0117130中已经表明，AAV-ActRIIB5载体增加了动物，特别是肥胖动物模型中的肌肉脂肪比。本发明的vActRIIB多肽(诸如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95)适合于这些用途。因此，通过施用本发明组合物降低脂肪组成将改善动物中的糖尿病、肥胖症和高血糖病症。此外，含有vActRIIB多肽的组合物可降低肥胖个体的食物摄入量，如美国申请序列号：11/590,962、美国申请公开号：2007/0117130中对于ActRIIB5多肽所示。

施用本发明ActRIIB多肽可提高骨骼强度，并降低骨质疏松症和其它退化性骨疾病。下文描述的OVX小鼠模型中已经表明了这一点。还发现，例如，肌肉生长抑制素缺陷型小鼠显示了小鼠肱骨的矿物质含量和密度的提高，小梁骨及皮质骨与肌肉连接的区域中矿物质含量的增加，以及肌肉量的增加(Hamrick等Calcif Tissue Int71(1):63-8(2002))。此外，本发明的vActRIIB组合物可以用于治疗雄激素剥夺的效应，诸如，用于治疗前列腺癌的雄激素剥夺疗法。

本发明还提供了通过向所述动物施用效剂量的vActRIIB蛋白质来增加食用动物中肌肉量的方法和组合物。由于成熟的C-末端肌肉生长抑制素多肽在所有测试的物种中相同，预计vActRIIB多肽将有效增加任何重要农业物种(包括牛、鸡、火鸡和猪)的肌肉量，并减少脂肪。

本发明的vActRIIB多肽和组合物还拮抗激活素A的活性。已知激活素A在某些类型的癌症，特别是性腺肿瘤，诸如卵巢癌中表达，并导致严重恶病质。(Ciprano等Endocrinol141(7):2319-27(2000),Shou等,Endocrinol138(11):5000-5(1997)；Coerver等,Mol Endocrinol10(5):534-43(1996)；Ito等British J Cancer82(8):1415-20(2000),Lambert-Messerlian等,Gynecologic Oncology74:93-7(1999)。在下文实施例3中，已经表明，在抑制素-α敲除小鼠模型和colon-26癌症恶病质小鼠模型中，本发明的vActRIIB多肽有效处理严重恶病质，减小肿瘤大小，并延长存活期。因此，本发明的组合物可用于治疗与激活素A过表达以及肌肉生长抑制素表达相关的病症，诸如某些癌症导致的恶病质以及治疗某些性腺型的肿瘤和黑素瘤。

可以单独使用或与其它治疗剂组合使用本公开的组合物以增强其治疗效果或减少潜在副作用。这些特性包括增加的活性，增加的溶解度，降低的降解，增加的半衰期，降低的毒性和降低的免疫原性。因此，本公开的组合物可用于延长的治疗方案。此外，本发明化合物的亲水性和疏水性的特性是良好平衡的，从而增强了它们对于体外和特别是体内两者的实用性。具体地，本公开的化合物在水性介质中具有适当程度的溶解性，其允许在体内吸收和生物利用，同时在脂质中也具有一定程度的溶解性，其允许化合物穿越细胞膜至推定的作用部位，诸如特定的肌肉团块。

本发明的vActRIIB多肽和组合物可以与用于治疗癌症的化疗剂组合使用。化疗剂可以包括抗肿瘤药。化疗剂还可以包括烷化剂、抗代谢物、植物生物碱和萜类化合物。

烷化剂可以包含顺铂和卡铂。抗代谢物可以包括嘌呤类(例如，硫唑嘌呤或巯基嘌呤)或嘧啶类。此外，化疗剂可以是核苷类似物，例如5-氟尿嘧啶。也可以使用长春花生物碱，诸如长春新碱或长春花碱。

其它抗肿瘤剂可以包括，例如，烷化剂，包括：氮芥类，诸如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司丁(甲基-CCNU)；乙烯亚胺类/甲基三聚氰胺，诸如三亚乙基三聚氰胺(TEM)、三乙烯、硫代磷酰胺(噻替派)、六甲基三聚氰胺(HMM,六甲蜜胺)；烷基磺酸酯类，诸如白消安；三嗪类，诸如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物诸如氨甲喋呤和三甲曲沙，嘧啶类似物诸如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿糖核苷(AraC,阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷、2,2′-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物诸如6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2′-脱氧柯福霉素(喷司他丁)、赤型羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨,2-CdA)；天然产物，包括抗有丝分裂药物诸如紫杉醇，长春花生物碱类，包括长春花碱(VLB)、长春新碱和长春瑞滨，泰索帝，雌莫司汀和雌莫司汀磷酸盐；表鬼臼毒素类(ppipodophylotoxins)，诸如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素类，诸如放线菌素D、柔红霉素(红比霉素)、多柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博莱霉素、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉素C和放线菌素；酶类，诸如L-天冬酰胺酶；生物响应调节剂，诸如α-干扰素、IL-2、G-CSF和GM-CSF；各种药剂，包括铂配位络合物诸如顺铂和卡铂，蒽二酮类诸如米托蒽醌，取代的脲诸如羟基脲、甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼，肾上腺皮质抑制剂诸如米托坦(o,p′-DDD)和氨鲁米特；激素类和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂诸如强的松和等效物，地塞米松和氨鲁米特；孕酮，诸如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素，诸如己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素药，诸如他莫昔芬；雄激素类，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素药，诸如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；和非甾类抗雄激素药，诸如氟他胺。

此外，本发明的vActRIIB多肽能用于许多分析中检测和定量肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。一般而言，本发明的ActRIIB多肽可在许多分析中用作结合和固定肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11的捕获剂，类似于(例如)Asai,ed.,Methods in Cell Biology,37,Antibodiesin Cell Biology,Academic Press,Inc.,New York(1993)中所描述的那些。多肽可以某种方式标记或可与第三分子(诸如标记的抗体)反应，使得检测和定量肌肉生长抑制素。例如，多肽或第三分子可以使用可检测部分(诸如生物素)修饰，然后其可以通过第四分子(诸如酶标记的链霉亲和素或其它蛋白质)结合(Akerstrom,J Immunol135:2589(1985)；Chaubert,Mod Pathol10:585(1997))。

已经描述了本发明，以下实例是通过说明性而非限制方式提供。

具体实施方式

实施例1：vActRIIB多肽的表达和纯化

以下方法用于表达和纯化变体ActRIIB多肽。

将人激活素IIB型受体的cDNA从人睾丸源的cDNA库中(Clontech,Inc.)分离，并如美国专利申请序列号：11/590,962、美国专利申请公开号：2007/0117130所述进行克隆。

氨基酸置换的测定

结构分析、分子建模和质谱的组合方法表明可以通过非糖基化的ActRIIB分子之间的静电和氢键相互作用触发的分子间二硫键形成而产生ActRIIB的聚集(寡聚化)。残基28和40被确定为参与ActRIIB:ActRIIB相互作用而不参与ActRIIB与其配体的相互作用。

最初，ActRIIB-Fc上的E28和R40在每个位置上被A取代。光散射和质谱分析证实，完全糖基化的vActRIIB-IgG1Fc，E28A和vActRIIB-IgG1Fc R40A的级分与野生型蛋白相比显著增加。将E28A和R40A vActRIIB-IgG1Fc在37℃孵育6天，与野生型相比产生很少聚集或不产生聚集。进行在位置28和40处(相对于具有信号序列的SEQ IDNO：2和18)的氨基酸置换，以减轻或防止可以在野生型ActRIIB(SEQID NO：2和18)的表达或纯化过程中发生的聚集。这种聚集已被鉴定为在表达过程中的结构化寡聚物形成以及表达过程中和蛋白纯化后的非结构化聚集物生成。

根据下文的程序，使用尺寸排阻色谱法测定生产和纯化过程的不同阶段的聚集。

以下示例性方法用于产生变体ActRIIB多肽(vActRIIB和vActRIIB5)。使用PCR重叠延伸使用含有导致E28W的突变的引物经由铰链接头序列(编码SEQ ID NO：79的核苷酸)将编码vActRIIB，E28W(SEQ ID NO：23)的多核苷酸与编码人IgG1Fc结构域的多核苷酸(SEQID NO：82)或编码人IgG2Fc的多核苷酸(SEQ ID NO：84)融合。完整的多核苷酸序列为SEQ ID NO：61。将双链DNA片段亚克隆到pTT5(Biotechnology Research Institute,National Research Council Canada(NRCC),6100Avenue Royalmount,Montréal(Québec)Canada H4P2R2)、pDSRα(WO/9014363中所描述)和/或pDSRα的衍生物中。在其它实施方案中，将编码vActRIIB多肽的多核苷酸连接至编码接头GGGGS(SEQ ID NO：75)或其多聚体和或铰链接头(诸如SEQ ID NO：79)的多核苷酸。

如下进行工程改造的vActRIIB-Fc和vActRIIB5-Fc的瞬时表达。

上述两种分子的工程改造变体在无血清悬浮适应的293-6E细胞(National Research Council of Canada,Ottawa,Canada)中瞬时表达，所述293-6E细胞维持在补充有250μg/ml遗传霉素(Invitrogen)和0.1％Pluronic F68(Invitrogen)的FreeStyle^TM培养基(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中。对1L培养物进行转染。简言之，将细胞接种物在4L费氏摇瓶(Corning,Inc.)中生长到1.1×10⁶个细胞/ml。将摇瓶培养物以65rpm保持在一个置于维持37℃和5％CO₂的湿润培养箱中的Innova2150摇床平台(News Brunswick Scientific,Edison,NJ)上。在转染时，将293-6E细胞稀释至1.0×10⁶个细胞/ml。

将转染复合物形成于100ml FreeStyle培养基中。先将1mg质粒DNA加入培养基中，随后加入3ml FuGene HD转染试剂(Roche AppliedScience,Indianapolis,IN)。将转染复合物在室温下培养约15分钟，然后加入摇瓶的细胞中。在转染后二十四小时，加入20％(w/v)的蛋白胨TN1(OrganoTechnie S.A.,TeknieScience,QC,Canada)，以达到0.5％(w/v)的终浓度。将转染/表达进行4-7天，之后通过以4000rpm在4℃下离心60分钟收获条件培养基。

稳定的转染和表达如下进行。使用标准电穿孔程序通过用表达质粒pDC323-vActRIIB(E28W)-huIgG2Fc和pDC324-vActRIIB(E28W)-huIgG2Fc(根据Bianchi等,Biotech and Bioengineering,84(4):439-444(2003))转染稳定CHO宿主细胞而生成vActRIIB-人(hu)IgG2-Fc细胞系。在用表达质粒转染宿主细胞系后，将细胞在不含GHT的无血清选择培养基中生长2-3周，以允许质粒的选择和细胞的回收。选择细胞，直到它们达到85％以上的生存力。然后，将该转染细胞合并物在含有150nM甲氨蝶呤的培养基中培养。

细胞系克隆

根据以下程序制备所选择克隆的细胞库。将稳定转染细胞的扩增合并物接种在96孔板中，并在小规模研究中评估候选克隆的生长和生产力表现。从选择的克隆制备约60小瓶的前主细胞库(PMCB)。测试所有PMCB的无菌性、支原体和病毒。

使用典型的补料分批过程将表达vActRIIB-Fc的细胞系放大。将细胞接种到Wave生物反应器(Wave Biotech LLC)中。使用弹丸补料对培养物补料三次。在第10天收获10L，第11天收获剩余物；两次收获都进行深度过滤，随后进行无菌过滤。将条件培养基通过10英寸的0.45/0.2微米预过滤器过滤，随后通过6英寸0.2微米过滤器过滤。

蛋白质纯化

使用5ft²10K膜切向流滤器(Pall)浓缩含有ActRIIB-Fc(IgG1和IgG2两者)、ActRIIB5-Fc(IgG1和IgG2两者)和这些的变体的约5L条件培养基。将浓缩材料应用至已经用PBS(无氯化镁或氯化钙的Dulbecco)平衡过的5mL蛋白A High Performance Column^TM(GE Healthcare)。用平衡缓冲液洗涤该柱直到280nm处的吸光度(OD₂₈₀)小于0.1之后，将结合的蛋白用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱，并立即用1M Tris-HCl(pH8.5)中和。将中和的洗脱合并物浓缩至1ml的体积，并应用至在PBS(无氯化镁或氯化钙的Dulbecco)平衡的320ml Sephacryl-200柱(GEHealthcare)。在4-20％SDS PAGE凝胶(Invitrogen)中运行以确定哪些级分合并。测试这些多肽的活性和聚集的程度，如下所示。

任选地，可以将多肽进一步纯化，使用例如Shp-Sepharose柱。使用OD280测定浓度。

实施例2：体外活性测定

将如上所述纯化的vActRIIB多肽的样品用磷酸盐缓冲盐水(PBS：2.67mM氯化钾、138mM氯化钠、1.47mM磷酸二氢钾、8.1mM磷酸氢二钠，pH7.4)稀释至0.2mg/ml，在37℃孵育6天，然后应用于MALDI-MS(基质辅助激光解吸/电离质谱)、SEC和/或SEC-LS分析。使用SEC或SEC-LS测定蛋白A纯化步骤后野生型和变体多肽的聚集，并且使用下述MALDI-MS程序验证分子的分子量。

尺寸排阻色谱(SEC)。使用串联连接的两个柱(TOSOHAASG3000swxl,7.8x300mm)在Agilent1100HPLC系统上进行实验。以0.5ml/分钟使用2x PBS作为流动相。

尺寸排阻色谱-光散射(SEC-LS)。在具有Superdex-200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia,Waukesha,WI)的Agilent1100HPLC系统上进行实验。然后将样品通过Wyatt miniDawn LS激光光散射检测器和WyattOptilab DSP折射仪(Wyatt Technology Co.,Santa Barbara,CA)以确定分子量。以0.4ml/分钟使用PBS作为流动相。

基质辅助激光解吸/电离质谱法。将样品与芥子酸混合(1:1)，并应用至MALDI-MS(Applied Biosystems Voyager System2009)。该程序用于检查分子的分子量。

如下所述获得结合亲和力的测定和对于激活素和肌肉生长抑制素的IC₅₀值。

定性测定。在如上所述与IgG1Fc的融合体中分别用其它天然氨基酸置换E28和R40。在有或没有接头的情况下生成这些，如下表中所示。将来自条件培养基的各vActRIIB-IgG1Fc样品捕获在山羊抗人IgG1Fc抗体(Jackson Immuno Research,目录号109-005-098,批号63550)包被的CM5表面上。使用BIACore2000(BIACore Life Sciences,Piscataway,New Jersey)将20nM激活素A注射至捕获样品表面。将所得传感图对vActRIIB-IgG1Fc变体的捕获的RL(500RU)标准化。对于一些变体的标准化的结合响应(RU)显示在表2中，并在下文进一步描述。还通过Biacore测量使用从哺乳动物细胞表达获得的条件培养基来确定激活素的相对结合亲和力。使用激活素A(20nM)来捕获条件培养基中的可溶性受体多肽，并将测量的SPR信号标准化。标准化的SPR+++++:>60,++++:40–60,+++:20–40,++:10–20,+:5–10,-:<5。

表1A和表1B总结了相对结合数据的结果。下表显示了vActRIIB-IgG1Fc的某些实施方案特别地以高于野生型的亲和力结合激活素A，或者保留了与野生型相当的亲和力。

表1A：野生型和工程改造的ActRIIB-IgG1Fc结合(稳定转染子)

表1B：野生型和工程改造的ActRIIB-IgG1Fc结合(瞬时转染子)

基于C2C12细胞的活性测定

如上所述生成vActRIIB5-IgG1Fc和vActRIIB-IgG1Fc变体。使用如下所述的基于细胞的活性测定测试这些变体抑制激活素A或肌肉生长抑制素与激活素IIB受体结合的能力。

通过pMARE-luc构建体转染C2C12成肌细胞(ATCC No:CRL-1772)产生肌肉生长抑制素/激活素/GDF-11反应性报道细胞系。pMARE-luc构建体通过将表示肌肉生长抑制素/激活素响应元件(Dennler等EMBO17:3091-3100(1998))的12个CAGA重复序列克隆入TATA盒上游的pLuc-MCS报道载体(Stratagene cat#219087)中制得。C2C12细胞在其细胞表面上天然地表达激活素受体IIB。当肌肉生长抑制素/激活素A/GDF-11结合细胞受体时，Smad途径被激活，磷酸化Smad结合响应元件(Macias-Silva等Cell87:1215(1996))，导致荧光素酶基因的表达。然后根据制造商的方案使用商用荧光素酶报道测定试剂盒(cat#E4550,Promega,Madison,WI)测量荧光素酶活性。根据以下程序将已用pMARE-luc(C2C12/pMARE)转染的稳定C2C12细胞系用于测量活性。将报道细胞接种到96孔培养物中。采用野生型和上述构建的变体ActRIIB-IgG1Fc融合体的稀释液的筛选在固定的4nM激活素的浓度下进行。激活素A与若干浓度的受体一起预孵育。通过测定已处理培养物中荧光素酶活性来测量激活素活性。测定每个多肽的IC₅₀值。这些显示于表2中。对于肌肉生长抑制素的测定遵循如上所述产生的ActRIIB-huIgG2Fc融合体相同的程序。在使用相同方法的肌肉生长抑制素的IC50值的测定中使用蛋白A纯化的野生型和变体。对于这种测定，将多肽与4nM肌肉生长抑制素预孵育。此外，使用上述程序测定聚集程度。这些值在下表3中给出。

在表1A中列出的ActRIIB5-IgG1Fc变体组中，进一步纯化几种ActRIIB-IgG1Fc变体和三种ActRIIB5-IgG1Fc变体以及野生型多肽，并在20nM激活素A浓度下通过SPR(表面等离子共振)来分析。表2显示了选择的vActRIIB-IgG1Fc多肽对于激活素的SPR结合亲和力。使用激活素A(20nM)来捕获样品中的vActRIIB多肽，并将测量的SPR信号标准化。从上述基于细胞的激活素抑制测定获得IC₅₀值。对于所有结果的标准误差小于10％。

表2

如上表2中所示，与野生型相比，vActRIIB-IgG1Fc(E28W)对于阻断激活素的IC₅₀值为2.07nM，且vActRIIB-IgG1Fc(E28Y)的IC₅₀值为2.1nM。此外，vActRIIB-IgG1Fc的E28W和E28Y变体一旦纯化就是稳定的并且不会聚集。

同样对于另外的变体多肽测定肌肉生长抑制素阻断的基于细胞的测定中的IC₅₀值。这些变体是缺乏信号序列和N-末端前六个氨基酸的成熟截短vActRIIB多肽。这些序列显示于表3中。表3显示了蛋白A纯化后的蛋白质聚集百分比和关于肌肉生长抑制素的IC₅₀值。可以看出，与野生型相比，变体多肽的聚集百分比小得多。没有信号序列和N-末端四个氨基酸且具有与如下所示相同置换的成熟截短vActRIIB多肽获得类似结果。

表3

表4鉴定了对应于序列表中SEQ ID NO：1-99的序列。

表4

实施例3：使用vActRIIB的体内治疗

根据下述程序使用成熟截短vActRIIB-IgG2Fc(E28W)多肽(SEQ IDNO：91)进行以下所有的动物研究。

抑制素-α缺陷小鼠中的肌肉萎缩的治疗

抑制素-α是一种天然存在的激活素A的抑制剂。缺乏抑制素-α的小鼠显示出循环中显著升高的激活素A水平，并且患有与肿瘤诸如卵巢癌、睾丸癌和肾上腺癌的自发形成相关的致死性衰竭综合征(Matzuk等,PNAS91(19):8817-21(1994),Cipriano等Endocrinology121(7):2319-27(2000),Matzuk等,Nature360(6402):313-9(1992))。对于以下实验，从Charles River Laboratories获得抑制素-α敲除小鼠(C57BL/6J)。在抑制素-α敲除小鼠中检查vActRIIB-IgG2Fc E28W(SEQ ID NO：91)(下文中称为E28W或E28W多肽或可溶性受体E28W)对体重和肌肉量的影响。进行在8周龄雄性抑制素-α敲除小鼠中的14天单次注射研究。在8周龄时，与年龄匹配的野生型同窝对照小鼠相比，雄性抑制素-α敲除小鼠已经失去超过25％的体重。在第0天，5只敲除小鼠给予E28W(30mg/kg)的单次皮下注射，同时向5只敲除小鼠皮下施用等体积的PBS(介质)。作为基线对照，在第0天，向5只年龄匹配的野生型小鼠施用介质的单次皮下注射。在第0天、第7天和第14天对小鼠称重。在第14天结束时，将所有小鼠处死，并经由尸检分析它们的瘦胴体重量和腓肠肌质量。在14天研究期间内，介质处理的敲除小鼠的平均体重从第0天的22.5g下降至第14天的21.4g，下降约1.1g。相反，E28W处理的敲除小鼠的平均体重显示从第0天的22.1g至第14天的33.1g的11g的急剧增加。末期尸检分析揭示，E28W多肽使抑制素α敲除小鼠中的瘦胴体重量和腓肠肌质量几乎翻倍，如下所示。E28W处理的敲除小鼠的平均瘦胴体重量为约14.9g，相比之下，介质处理的敲除小鼠为约8.0g，并且介质处理的野生型对照小鼠为约12.1g。E28W处理的敲除小鼠的平均腓肠肌重量(来自两条腿)为约426mg，相比之下，介质处理的敲除小鼠为约209mg，并且介质处理的野生型对照小鼠为约324mg。这些结果表明E28W多肽用于治疗体重减轻和肌肉萎缩的疾病状态的有效性，并总结在下表中。

	WT加介质	KO加介质	KO加上E28W
				体重	28.64+/-1.11	21.36+/-0.99^*	33.10+/-1.56^*#
瘦胴体(g)	12.07+/-0.36	8.00+/-0.29^*	14.90+/-0.77^*#
				腓肠肌(g)	0.324+/-0.014	0.209+/-0.012^*	0.426+/-0.024^*#

*:P<0.05vs.WT+介质；#:P<0.05vs.KO+介质.

分别在雄性和雌性抑制素-αKO小鼠中检查施用E28W多肽对睾丸和卵巢肿瘤的形成率的影响。在这项研究中，分别用单次皮下注射E28W(30mg/kg)处理11只抑制素-α敲除小鼠，包括8周龄雄性(n＝5)和9周龄雌性(n＝6)，而另外11只抑制素-α敲除小鼠，包括年龄匹配的雄性(n＝5)和雌性(n＝6)接受单次注射等体积的PBS(介质)。此外，向11只野生型同窝对照小鼠，包括年龄匹配的雄性(n＝5)和雌性(n＝6)，施用单次注射介质。处理后两周，将小鼠处死并进行尸检以检查视觉上可识别的睾丸和卵巢肿瘤的形成率。观察到11只介质处理的敲除小鼠中的10只形成可识别的肿瘤。具体地，分别在检查的5只雄性中的5只和6只雌性中的5只发现睾丸和卵巢肿瘤形成。发现这些肿瘤的大小比野生型对照小鼠中的相应正常睾丸或卵巢大2-3倍。这显示在图3中。只有10％(1/11)的E28W治疗的抑制素-α敲除小鼠显示出可见的肿瘤形成。具体地，在雌性中，6只E28W处理的敲除小鼠中的1只形成可识别的卵巢肿瘤，而与年龄匹配的野生型对照相比，6只未处理的雌性敲除小鼠中的5只的卵巢大小或总体形态具有很少或没有变化。与年龄匹配的野生型对照相比，5只E28W处理的雄性敲除小鼠中的5只没有显示出可见的肿瘤，其中睾丸大小或总体形态具有很少或没有变化。这些结果表明，E28W施用有效降低抑制素-αKO小鼠中睾丸和卵巢肿瘤的形成，并且还有效降低黑素瘤的形成，表明可溶性受体疗法在癌症治疗中的临床实用性。

在雄性抑制素α敲除小鼠中检查E28W多肽在治疗厌食症中的效果。在本研究中，与年龄匹配的野生型小鼠(n＝10)相比，抑制素-α敲除小鼠(n＝5)中的食物消耗显著降低。观察到在检查的3周期间内，E28W处理的抑制素α敲除小鼠的食物摄取显著增加。E28W处理的敲除小鼠中的平均每周食物摄取增加至略高于年龄匹配的野生型对照小鼠的水平，并且比用介质处理的敲除小鼠的平均每周食物摄取高约50％。因此，数据表明，E28W处理能高度有效地改善抑制素-αKO小鼠中的厌食症。

分别在雄性和雌性抑制素αKO小鼠中检查E28W处理对存活的影响。对于雄性，向25只约50日龄的抑制素αKO小鼠施用E28W多肽(10mg/kg/wk,SC)，同时26只年龄匹配的抑制素αKO小鼠接受介质(PBS)。19只年龄匹配的野生型雄性小鼠接受介质并用作基线对照。介质处理的敲除小鼠在研究的第15天(约65日龄)开始死亡。到实验的第34天(约84日龄)，50％的介质处理的敲除小鼠已经死亡，并且到第78天(约128日龄)，其已经100％死亡。相反，25只用E28W多肽处理的敲除小鼠或19只用介质处理的野生型对照小鼠无一在研究的第78天(约128日龄)前死亡。在E28W处理的敲除小鼠中，25只中的1只在研究的第78天(约128日龄)死亡，且25只中的24只存活超过100天(约150日龄)。在100天研究期间过程中，没有介质处理的野生型小鼠死亡。在雌性抑制素αKO小鼠中获得了类似的存活结果。22只约50日龄的雌性抑制素αKO小鼠用E28W(10mg/kg/wk,SC)处理，而23只同龄雌性抑制素αKO小鼠用PBS(介质)处理。同时，17只野生型雌性对照小鼠用介质处理。介质处理的雌性敲除小鼠在研究的第40天(约90日龄)开始死亡。到实验的第58天(约108日龄)，50％的介质处理的雌性敲除小鼠已经死亡，并且到研究的第86天(约136日龄)，其已经100％死亡。相反，只有约5％(1/22)的E28W处理的雌性敲除小鼠已经死亡，同时约90％(20/22)存活超过研究的第120天(约170日龄)。在120天研究期间过程中，没有介质处理的野生型小鼠死亡。因此，该数据表明，E28W多肽治疗能有效地显著延长雄性和雌性抑制素α敲除小鼠两者的存活。雄性和雌性敲除小鼠两者的存活曲线的示意图提供在图4中。

治疗携带COLON-26肿瘤的小鼠中的肌肉萎缩

携带colon-26肿瘤的小鼠是研究癌症恶病质的广泛使用的临床前动物模型(Fujita等,Int J Cancer68(5):637-43(1996),Kwak等,CancerResearch64(22):8193-8(2004))。在携带肿瘤的小鼠中研究E28W多肽对体重变化、肌肉量和存活率的影响。以0.5x10⁶个细胞/小鼠将Colon-26(C-26)肿瘤细胞皮下植入40只10周龄雄性CDF1小鼠。在第0天进行肿瘤植入。在肿瘤植入后第5天开始，用皮下注射10mg/kg vActRIIBIgG2Fc E28W(SEQ ID NO：91)每周处理二十只C-26小鼠，同时用介质(PBS)处理二十只C-26小鼠。同时，只用介质(PBS)处理10只年龄和体重匹配的正常小鼠。每周3次测定体重和食物摄取。每天两次检查携带肿瘤的小鼠的存活。使用连接至PC计算机的卡尺(Ultra-Cal IV IP65电子卡尺,Fred V Fowler Co.Boston MA)测量肿瘤大小，并且将数值自动记录到Microsoft Excel数据文件中的工作表。如图5中显示，肿瘤植入后两周，携带C-26肿瘤的小鼠发展出严重恶病质并且其体重急剧下降。E28W处理有效减轻了携带肿瘤的小鼠中的体重下降。用E28W处理的携带肿瘤的小鼠的平均体重显著高于用介质处理的携带肿瘤的小鼠(p<0.001，肿瘤接种后第7天到第33天。未配对T检验，Graph padSoftware Inc.San Diego CA)。

E28W多肽处理组和介质处理组之间的肿瘤大小没有差异，表明处理对C-26肿瘤生长没有影响。末期尸检分析显示，E28W处理的携带C-26肿瘤的小鼠的平均瘦胴体量和腓肠肌重量显著高于用介质处理的携带肿瘤的小鼠(对于瘦胴体和腓肠肌两者p<0.001)。E28W对携带C-26肿瘤的小鼠的存活率的影响显示于图6中。介质处理的小鼠在肿瘤植入后约第14天开始死亡。在肿瘤植入后第35天，所有20只介质处理的携带C-26肿瘤的小鼠死亡；然而，20只用E28W处理的携带C-26肿瘤的小鼠中的17只仍然存活。因此，E28W处理导致携带C-26肿瘤的小鼠的存活显著延长(p<0.0001，卡方检验)。因此，E28W多肽不仅有效地维持携带C-26肿瘤的小鼠的体重和肌肉量，而且有效地延长携带C-26肿瘤的小鼠的存活。

后肢悬吊小鼠的处理

使用后肢悬吊小鼠模型来研究vActRIIB-IgG2Fc E28W(SEQ IDNO：91)对不使用状态中的肌肉量的影响。后肢悬吊操作基本上与Carlson CJ等之前报道的相同(Carlson CJ,Booth FW and Gordon SE:AmJ Physiol Regul Integr Comp Physiol.277:R601-RR606,1999)。九周龄雌性C57BL/6小鼠用于该研究。如下将总共60只小鼠分为三组：1.用介质(PBS)处理的未悬吊基线对照组(20只小鼠)，2.用介质处理的后肢悬吊组(20只小鼠)，和3.用vActRIIB-IgG2Fc,E28W处理的后肢悬吊小鼠组(20只小鼠)。具体地，在后肢悬吊开始时分别将30mg/kg的vActRIIB-IgG2Fc E28W或介质的单次SC注射给予上述组。每周2-3次纵向测量体重变化。在以下4个不同时间点将来自各组的5只小鼠处死：第1天、第3天、第7天和第14天。经由尸检测定腓肠肌重量。

如下表中显示，后肢悬吊导致体重高达10％的显著损失。如通过ANOVA测量分析，用vActRIIB-IgG2Fc E28W处理后肢悬吊小鼠导致体重显著增加至高于介质处理的后肢悬吊组或未悬吊的基线对照组的水平。在两周研究期间过程中，vActRIIB-IgG2Fc E28W(SEQ ID NO：91)处理组的平均体重增加为12.6％，与之相比，分别地介质处理的悬吊组下降0.2％，和未悬吊的基线对照组重量增加4.8％。时程尸检结果显示，后肢肌肉量平行于体重改变。用vActRIIB-IgG2Fc(E28W)处理悬吊小鼠完全缓解了肌肉损失。因此，本实验的结果显示，E28W能有效治疗与不使用相关的肌肉萎缩。

OVX小鼠的处理

卵巢切除的雌性C57Bl6小鼠(OVX)被认为是雌性性腺功能低下和骨质疏松症的模型。将24只雌性C57Bl6小鼠在3月龄时切除卵巢，并使其恢复3个月。在6月龄时，在3个月处理期内通过NMR和骨量(PIXImus—GE LUNAR Corporation)测量24只OVX小鼠以及24只年龄匹配的假手术对照C57Bl6小鼠的体重、肌肉和脂肪量的纵向变化。在该期间结束时，将动物处死，并且在末期尸检过程中收获骨组织，并进行Faxitron X-射线和microCT(Faxitron X-ray Corporation and GEMedical system)分析。表明E28W变体受体(SEQ ID NO：91)有效增加体重，特别是瘦骨骼肌量和骨量，同时将小鼠的脂肪含量降低至非卵巢切除的小鼠中见到的水平。具体地，在12周期间内，用E28W处理的OVX小鼠的瘦肌肉质量从20g增加至27.0g，相比之下，对于用E28W处理的假手术小鼠从20g增加至27.5g，OVX加上介质或假手术加上介质的瘦肌肉质量几乎没有增加(对于OVX加上介质约19克，对于野生型加上介质约20g)。在相同研究中，在12周研究结束时，用E28W处理的OVX小鼠显示脂肪量从平均每只动物8g降低至平均每只动物约4g，与假手术动物相当。相反，用介质处理的OVX小鼠在研究过程中的任何时间都没有失去脂肪量。最后，与介质处理的OVX小鼠相比，用E28W处理的OVX小鼠的骨量增加。通过pQCT分析(外围定量计算机断层扫描)确定末期尸检过程中收获的解剖骨骼的股骨/胫骨BMC(骨矿物质含量)分析。在12周研究结束时，用E28W处理的OVX小鼠的BMC从约0.045g/cm增加至约0.055g/cm，这与假手术的介质处理的动物的最终BMC相当。在12周研究结束时，用介质处理的OVX小鼠显示出0.045g/cm的大致相同的BMC。在12周研究结束时，E28W处理的野生型小鼠的BMC表现出从约0.054g/cm至约0.065g/cm的增加。这些研究表明E28W多肽作为老化中的衰弱、骨质疏松症和肥胖症的潜在治疗的有效性。

实施例4：用sActRIIB(E28W–SEQ ID NO.91)治疗癌症

研究具有卵巢癌(OC)的小鼠中的激活素水平(图7A)。与正常对照受试者(正常)相比，具有卵巢癌(OC)的小鼠中循环激活素A水平显著升高。通过ELISA测量血清激活素A。用sActRIIB(E28W)(SEQ ID NO：91)治疗卵巢癌的效果显示于图7B-7D中。用单次注射sActRIIB或PBS处理具有确立的卵巢肿瘤的12周龄雌性KO小鼠，持续14天。对照，年龄匹配的雌性WT同窝小鼠接受PBS。在图7B中可以看到，sActRIIB处理使KO小鼠中升高的激活素A循环水平迅速降低至WT对照水平。在处理后第0、1和14天，通过ELISA测量血清激活素A。

在图7C中可以看到，sActRIIB处理使KO小鼠中的卵巢肿瘤质量迅速降低至WT对照水平。在处理后第0、1和14天，经由尸检按照群组分析个体动物的卵巢(左和右)的重量。卵巢的代表性总体形态图像描绘了KO小鼠中晚期卵巢肿瘤响应于14天的sActRIIB处理急剧消退。(图7D)

在用sActRIIB处理的KO小鼠中进行一些额外观察(数据未显示)。在KO小鼠的卵巢肿瘤中看到激活素A mRNA的过表达。sActRIIB处理阻止该过表达。此外，sActRIIB处理完全阻断KO小鼠中卵巢肿瘤中磷酸化Smad2的增加。此外，sActRIIB处理逆转了KO小鼠的卵巢肿瘤中E-钙粘蛋白的严重损失。最后，代表性免疫组织化学图像显示，KO小鼠的卵巢切片中E-钙粘蛋白免疫反应性的完全消失和用sActRIIB处理14天之后强E-钙粘蛋白染色的再次出现。

图8A显示，激活素A的阻断可以消除抑制素-αKO小鼠中卵巢肿瘤中VEGF的过表达。用单次注射sActRIIB或PBS处理具有确立的卵巢肿瘤的12周龄雌性KO小鼠，持续14天。作为对照，年龄匹配的雌性WT同窝小鼠接受PBS。ELISA数据揭示，KO小鼠中血清VEGF水平显著升高，但在sActRIIB处理后降低至WT对照水平。

此外，在未显示的数据中，据观察，免疫组织化学染色图像表明KO小鼠的卵巢肿瘤切片中显著增加的VEGF和Ang-1免疫反应性，这被sActRIIB处理完全消除。Western印迹分析还揭示，肿瘤血管生成相关蛋白内皮糖蛋白、osteropontin、IGFBP-1和IGFBP-2的表达在KO小鼠的卵巢肿瘤中被高度诱导，但在sActRIIB处理后降低至WT对照水平。

免疫组织化学分析表明sActRIIB处理导致KO小鼠的睾丸肿瘤中胱天蛋白酶-3的活化。在图8B中，箭头指向sActRIIB处理的卵巢肿瘤切片中活性胱天蛋白酶-3免疫反应性，其中残留肿瘤细胞成簇。在PBS处理的卵巢肿瘤切片中不存在活性胱天蛋白酶-3免疫染色。右边的柱状图显示基于来自每组3只动物的多个卵巢切片的活性胱天蛋白酶-3的定量分析。

在另一个实验中，表明在TOV-21G人卵巢癌异种移植物中，激活素A拮抗作用抑制血管生成素-1过表达并阻止肿瘤微环境中的新血管形成。TOV-21G卵巢癌异种移植物的植入导致CD1裸鼠中循环激活素A升高。通过ELISA测量激活素A。激活素A拮抗剂sActRIIB的施用抑制CD1裸鼠中的TOV-21G肿瘤生长。在肿瘤植入后第12天，用sActRIIB或用PBS处理携带TOV-21G异种移植物的小鼠。

阻断激活素A对细胞培养中的TOV-21G细胞的体外增殖没有直接影响。使用IncuCyte系统“通过实时体外显微成像”监测TOV21G细胞的生长。在细胞接种时加入激活素A抑制剂。星形孢菌素，作为细胞生长抑制的阳性对照，用于证明该监控系统的可靠性。

在TOV-21G卵巢肿瘤异种移植物中，阻断激活素A抑制Ang-1过表达并抑制肿瘤新生血管形成。在肿瘤植入后第12天，用sActRIIB或PBS处理携带TOV-21G异种移植物的裸鼠。在治疗后不同时间点分离TOV-21G肿瘤，然后针对作为新生血管的标志物的Ang-1和CD31进行免疫组织化学染色。复染细胞核。

TOV-21G异种移植肿瘤中的胱天蛋白酶-3活化和肿瘤细胞凋亡也在阻断激活素A之后。使用活性胱天蛋白酶-3特异性抗体针对胱天蛋白酶-3活化且使用TUNEL染色针对细胞凋亡对TOV-21G肿瘤切片进行免疫组织化学检查。sActRIIB诱导活性胱天蛋白酶-3和细胞凋亡。

实验表明，激活素A能够通过多种细胞类型(即，癌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和单核细胞)刺激血管生成因子过表达(例如，VEGF-A和Ang-1)，而阻断肿瘤中升高的激活素A阻止血管生成因子的过表达，并且因此激活胱天蛋白酶-3和细胞凋亡，从而导致肿瘤抑制。

实施例5:卵巢和睾丸形态

进行已经用PBS或sActRIIB处理两周的10周龄雄性和14周龄雌性抑制素-αKO小鼠以及年龄匹配的WT对照中卵巢和睾丸肿瘤的组织学检查。8周龄雄性和12周龄雌性抑制素-αKO小鼠接受sActRIIB或PBS的单次注射。处理后14天，通过尸检收集卵巢和睾丸器官。对于卵巢使组织切片进行高碘酸-希夫染色，且对于睾丸使组织切片进行马森氏三色染色(Masson’s Trichrome Staining)。

在未处理的雌性KO小鼠，极大地增大的卵巢主要填充有实体癌症团块和大的出血，其中几乎没有留下任何可识别的卵泡。然而，sActRIIB处理后，卵巢大小正常，并且它们的形态呈现为相对正常，具有许多可识别的卵泡、最少的癌侵入和少量出血。因此，这种显微分析因此证实了我们对于肿瘤重量和总体形态的发现，并且确认sActRIIB处理引起KO动物中睾丸和卵巢的显著癌症退化。在未处理的雄性KO小鼠中，正常睾丸结构不再能够通过光学显微镜识别，因为曲细精管大部分被巨大的未分化癌团块替代。然而，sActRIIB处理之后，睾丸结构呈现相对正常，其中大部分曲细精管在很大程度上是完整的，尽管一些小的区域仍含有残余癌细胞，并且一些细管中精原细胞的数目减少。

还注意到，sActRIIB处理使KO小鼠中的睾丸肿瘤团块迅速降低至WT对照水平。在临处理前和处理后第14天，经由尸检按照群组分析个体动物的睾丸(左和右)的重量。对于该实验，相比于WT对照，P<0.001。n＝6-12。

此外，注意到，在抑制素-αKO小鼠的睾丸肿瘤中，sActRIIB消除了VEGF和Ang-1过表达并诱导胱天蛋白酶-3活化。在sActRIIB处理卵巢和睾丸肿瘤后，血管生成素-2转录物朝着对照水平下降。

实施例6:sActRIIB和化疗剂的组合的影响

激活素拮抗剂sActRIIB和细胞毒性化疗剂5-氟尿嘧啶对裸鼠中的TOV-21G肿瘤生长抑制的影响(图9A)。在肿瘤植入后第12天，分别用sActRIIB、5-Fu或sActRIIB和5-Fu的组合处理携带TOV-21G异种移植物的裸鼠。纵向记录肿瘤体积的变化。在图9A中可以观察到，sActRIIB本身使肿瘤体积降低34％，5-氟尿嘧啶(5-FU)本身使肿瘤体积降低49％。然而，将两者组合在一起使肿瘤体积降低74％。

图9B显示sActRIIB和达卡巴嗪对裸鼠中G361人黑素瘤异种移植物的生长抑制的影响。BALB/c裸鼠用sActRIIB、达卡巴嗪或sActRIIB加达卡巴嗪处理。对于达卡巴嗪组合研究，用G361异种移植物(5x10⁶个细胞/小鼠)植入的BALB/c裸鼠在肿瘤植入第18天开始，只用sActRIIB(10mg/kg,SC,1X/wk)、只用达卡巴嗪(连续4天以5mg/kg每天IP注射)或sActRIIB和5-FU组合来处理。直到植入后第26天，通过电子卡尺纵向测量肿瘤体积。

鉴于化疗剂和sActRIIB推测通过不同机制起作用，不一定会预期所示的结果，即两种试剂的组合可以比任一单独试剂更大地影响总体肿瘤生长。

卵巢癌是所有妇科癌症中最致命的。激活素A，一种在调节月经周期中发挥重要功能的性腺细胞因子，在许多恶性肿瘤包括卵巢癌中强烈表达。中和激活素A根除了抑制素缺陷小鼠中确立的卵巢肿瘤，并且明显阻止了裸鼠中多种分泌激活素A的卵巢异种移植肿瘤的生长。阻断激活素A看起来对细胞培养中的卵巢癌细胞的体外增殖没有直接影响，但在体内，其完全消除了血管生成因子(即，VEGF和血管生成素)的过表达并抑制了肿瘤微环境中的新血管形成。因此其诱导卵巢肿瘤中的胱天蛋白酶-3活化和癌细胞凋亡。这种显著的体内效应可以至少部分地通过肿瘤衍生的激活素A触发驻留在肿瘤微环境中的宿主内皮细胞中血管生成因子的过度产生的能力来解释。除了卵巢肿瘤以外，还发现激活素的阻断抑制分泌激活素A的至少两种其它癌症类型(睾丸肿瘤和黑素瘤)的体内生长。重要地，发现激活素拮抗作用的肿瘤抑制效果至少对于5-氟尿嘧啶或达卡巴嗪化疗的肿瘤抑制效果而言是累加的。这些发现表明了激活素A作为肿瘤血管生成和肿瘤发生的关键介质的功能。因此，用sActRIIB阻断升高的激活素A看起来是对抗卵巢癌、睾丸癌、黑素瘤和可能其它恶性肿瘤的有希望的新途径。

本发明在范围上不限于本文描述的具体实施方案，所述具体实施方案旨在作为本发明的个别方面的单一例证，而是功能上等同的方法和成分都在本发明的范围之内。事实上，除了本文中显示和描述的那些以外，本发明的各种改变对于本领域技术人员从前面的描述和附图来看是显而易见的。此类改变旨在落入所附权利要求的范围之内。

Claims

1.药物组合物，包含：i)变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列，并且其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11；和ii)包含5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗剂。

2.药物组合物，包含：i)变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，并且其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11；和ii)化疗剂。

3.权利要求1-2中任一项的药物组合物，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换选自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y取代E。

4.权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换选自氨基酸A、W和Y取代E。

5.权利要求1-4中任一项的药物组合物，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换是W。

6.权利要求1-5中任一项的药物组合物，其中所述多肽包含SEQ IDNO：91的多肽序列或其中所述多肽由SEQ ID NO：91的多肽序列组成。

7.权利要求1-6中任一项的药物组合物，其中所述vActRIIB多肽缺乏N-末端信号序列。

8.权利要求1-7中任一项的药物组合物，其中所述化疗剂是核苷类似物。

9.权利要求1-8中任一项的药物组合物，其中所述化疗剂是5-氟尿嘧啶。

10.权利要求1-9中任一项的药物组合物，其中所述化疗剂是达卡巴嗪。

11.权利要求1-10中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。

12.抑制需要此类治疗的受试者中的激活素活性的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-11中任一项的组合物。

13.权利要求12的方法，其中施用导致所述受试者中血管生成因子的表达水平相对于施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的对照受试者降低。

14.权利要求13的方法，其中所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)、Ang-1、内皮糖蛋白、osteropontin、IGFBP-1或IGFBP-2。

15.权利要求12-14中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中胱天蛋白酶3的活化相对于施用PBS的对照受试者增加。

16.权利要求12-15中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中细胞凋亡相对于施用PBS的对照受试者增加。

17.治疗需要此类治疗的受试者中其中激活素过表达的疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-11中任一项的组合物。

18.权利要求17的方法，其中所述疾病是癌症。

19.权利要求18的方法，其中所述疾病是性腺癌、睾丸癌、卵巢癌、皮肤癌或黑素瘤。

20.权利要求17-19中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中血管生成因子的表达水平相对于施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的对照受试者降低。

21.权利要求20的方法，其中所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)、Ang-1、内皮糖蛋白、osteropontin、IGFBP-1或IGFBP-2。

22.权利要求17-21中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中胱天蛋白酶3的活化相对于施用PBS的对照受试者增加。

23.权利要求17-22中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中细胞凋亡相对于施用PBS的对照受试者增加。

24.权利要求17-23中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中癌细胞的凋亡相对于施用PBS的对照受试者增加。

25.降低需要此类治疗的受试者中的肿瘤团块大小的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-11中任一项的组合物。

26.权利要求25的方法，其中所述肿瘤团块由性腺癌、睾丸癌、卵巢癌、皮肤癌或黑素瘤引起。

27.治疗需要此类治疗的受试者中的性腺癌、睾丸癌、卵巢癌、皮肤癌或黑素瘤的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，其中所述组合物包含变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28的单氨基酸置换，并且其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。

28.权利要求27的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

29.权利要求27-28中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换选自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y取代E。

30.权利要求27-29中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换选自氨基酸A、W和Y取代E。

31.权利要求27-30中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换是W。

32.权利要求27-31中任一项的方法，其中多肽包含SEQ ID NO：91的多肽序列。

33.权利要求27-32中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽缺乏N-末端信号序列。

34.权利要求27-33中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中血管生成因子的表达水平相对于施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的对照受试者降低。

35.权利要求34的方法，其中所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)、Ang-1、内皮糖蛋白、osteropontin、IGFBP-1或IGFBP-2。

36.权利要求27-35中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中胱天蛋白酶3的活化相对于施用PBS的对照受试者增加。

37.权利要求27-36中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中细胞凋亡相对于施用PBS的对照受试者增加。

38.权利要求27-37中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中癌细胞的凋亡相对于施用PBS的对照受试者增加。

39.治疗需要此类治疗的受试者中的黑素瘤的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。

40.治疗需要此类治疗的受试者中的具有血管生成因子过表达的病症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含变体激活素IIB受体多肽(vActRIIB)，其中所述多肽包含SEQID NO：18的多肽序列，除了位置28处的单氨基酸置换，其中所述多肽能够结合肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11。

41.权利要求40的方法，其中所述病症是癌症。

42.权利要求41的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

43.权利要求40-42中任一项的方法，其中VEGF-A或Ang-1被过表达。

44.权利要求40-43中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换选自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y取代E。

45.权利要求40-44中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换选自氨基酸A、W和Y取代E。

46.权利要求40-45中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽的位置28处的置换是W。

47.权利要求40-46中任一项的方法，其中多肽包含SEQ ID NO：91的多肽序列。

48.权利要求40-47中任一项的方法，其中所述vActRIIB多肽缺乏N-末端信号序列。

49.权利要求40-48中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中血管生成因子的表达水平相对于施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的对照受试者降低。

50.权利要求49的方法，其中所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)、Ang-1、内皮糖蛋白、osteropontin、IGFBP-1或IGFBP-2。

51.权利要求40-50中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中胱天蛋白酶3的活化相对于施用PBS的对照受试者增加。

52.权利要求40-51中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中细胞凋亡相对于施用PBS的对照受试者增加。

53.权利要求40-52中任一项的方法，其中施用导致所述受试者中癌细胞的凋亡相对于施用PBS的对照受试者增加。