CN109922821A - 使用新型杂合actriib配体陷阱蛋白治疗肌肉萎缩和骨病的方法 - Google Patents

使用新型杂合actriib配体陷阱蛋白治疗肌肉萎缩和骨病的方法 Download PDF

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Abstract

本公开描述了新型杂合可溶性ActRIIB‑ECD多肽。本公开提供了用于治疗或预防有需要的受试者的肌肉萎缩、骨病、代谢疾病、纤维化、自身免疫/炎性疾病、心血管疾病、癌症或癌症、慢性肾病(CKD)、关节炎、厌食症、肝病、器官或组织移植排斥、贫血、疼痛和/或老化的方法。此外，本公开提供了诱导受试者的干细胞生长用于组织修复或器官再生的方法。上述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的杂合ActRIIB配体陷阱多肽。本公开还提供了包含杂合ActRIIB配体陷阱多肽的药物组合物。

Description

使用新型杂合ACTRIIB配体陷阱蛋白治疗肌肉萎缩和骨病的 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月20日提交的美国临时申请号62/410,595的权益，该临时申请以引用的方式整体并入本文。
背景技术
肌肉萎缩(Muscle wasting)指肌肉质量的进行性损失和/或肌肉的进行性弱化和降解，肌肉包括骨骼肌或随意肌、控制心脏的心肌(心肌病)和平滑肌。慢性肌肉萎缩是特征为肌肉质量进行性损失以及肌肉弱化和降解的一种疾患(即在很长一段时间内持续)。当肌肉蛋白降解的速率超过肌肉蛋白合成的速率时，发生肌肉质量的损失。
肌肉萎缩是一种与很多慢性、神经学、遗传、炎性、纤维化或感染性病理学的发展有关的使人虚弱且威胁生命的疾病状态，包括例如肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化症、肌炎、失神经性肌肉萎缩、厌食症-恶病质综合征、癌症、类风湿性关节炎、骨关节炎、胰岛素抵抗/糖尿病、少肌性肥胖症、年龄相关性少肌症、雄激素剥夺、皮质类固醇肌病、炎性肠病、肝硬化、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、慢性肾病、创伤、心肌病、慢性心力衰竭和HIV感染。据称导致肌肉萎缩的其他疾患包括慢性下背痛、高龄、对中央神经系统的损害、周围神经损伤、化学损伤、长期的灼痛、髋/膝关节置换、废用性萎缩、暴露至微重力和长期住院治疗。
骨病被认为是涉及骨骼系统的任何病痛。骨病可能非常严重，需要及时有效的治疗。骨病可能非常痛苦，可能会使患者丧失行动能力和独立性。虽然致病因素因疾病而异，但许多骨病是由例如遗传因素、病毒感染、化学异常、骨胶原缺乏、损伤、骨折、对血管的损害、过量饮酒或长期服用某些药物所引起的。骨病的实例包括骨质疏松症、骨软化、成骨不全症、进行性骨化性纤维发育不良、皮质类固醇诱导的骨丢失、骨折、骨转移以及佩吉特氏骨病(Paget’s disease of the bone)。
活化素IIA受体(ActRIIA)和活化素IIB受体(ActRIIB)是TGF-β家族成员配体的亚组的II型受体，包括例如活化素A、肌生长抑制素(也称为GDF-8)、生长分化因子-11(GDF-11)和各种其他骨形态发生蛋白(BMP)诸如BMP-3、BMP-6、BMP-9(也称为GDF-2)和BMP-10。ActRIIA和ActRIIB已经被鉴定为活化素(包括活化素A、活化素B和活化素AB)的II型受体。ActRIIB是肌生长抑制素(肌肉生长的关键负调控因子)的高亲和力受体，并因此在控制肌肉质量中发挥核心作用。这些配体与ActRIIA和/或ActRIIB的结合可调控细胞分化、细胞凋亡、蛋白质合成和降解、矿化、造血、血管生成、类固醇合成、粘附、迁移、细胞外基质产生和纤维发生。具体反应取决于TGF-β配体和受体的类型和水平以及细胞状态和环境。ActRIIB信号传导通路通过Smad2/3转录因子介导细胞反应，并且ActRIIB信号传导通路的激活涉及许多疾病的发病机理和进展，这些疾病包括肌肉萎缩、骨丢失、纤维化和炎症。TGF-β家族的若干成员，包括肌生长抑制素、活化素和GDF11，通过偶联ActRIIB介导Smad2/3激活。
先前的研究表明，这些配体与ActRIIB-Fc的药理学隔离在动物模型中引起明显的肌肉生长和骨合成代谢，在正常小鼠中显示出肌肉生长比肌生长抑制素中和抗体高出约3倍，并在肌生长抑制素缺失小鼠中显示出进一步刺激显著肌肉增加的能力(Chiu等人,JGerontol A Biol Sci Med Sci.,68(10):1181-92,2013年10月；Arounleut等人,ExpGerontol.,48(9):898–904,2013年9月)。除了对肌肉和骨有显著的合成代谢作用外，ActRIIB-Fc还显示在临床前模型中具有重要的抗纤维化和抗炎作用；并且已经或者目前正在在患者中对各种ActRIIA-Fc和ActRIIB-Fc融合蛋白进行用于治疗与许多慢性、神经学、遗传、炎性、纤维化或感染性病理学的发展有关的肌肉萎缩病症和/或骨病的临床评估。例如，Acceleron Pharma的ACE-011(一种ActRIIA-Fc融合蛋白)已在多发性骨髓瘤和骨质疏松症的溶骨性病变患者中进行了临床评估(Ph1，Ph2a)，目前正在进行用于治疗患转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者的化疗诱导的贫血(CIA)的评估(Ph2/3)(ClinicalTrials.gov)和用于治疗血液透析患者的终末期肾病的评估；并且已对Acceleron Pharma的ACE-031(一种ActRIIB-Fc融合蛋白)进行了杜兴氏肌营养不良(Duchenne muscle dystrophy，DMD)治疗功效临床评估(Ph1，Ph2)(ClinicalTrials.gov)。
不幸的是，尽管似乎有效，但由于安全性问题(高RBC生长)ACE-011用于治疗骨质疏松症的临床潜能受到阻碍；而ACE-031虽然表现出显著的肌肉增加(这比由肌生长抑制素选择性抑制剂诸如肌生长抑制素抗体、肽体或前肽引起的肌肉增加更明显)，但由于在DMD患者中观察到鼻和齿龈出血的不良事件而受到阻碍，并因此ACE-031的临床使用被搁置(Smith R.C.和Lin B.K.,Curr Opin Support Palliat Care.7(4):352–360,2013)。因此，尽管有前景地表现出改善DMD患者的肌肉质量和功能的功效迹象，但因为鼻和齿龈出血副作用ACE-031在DMD 2期试验中被停止。由此看来野生型ActRIIB-Fc能够阻断BMP9介导的Smad1/3/8信号传导，这对于维持血管稳态至关重要，并且野生型ActRIIB对BMP9的这种功能性阻断被认为是引起出血副作用的潜在原因，因为引人注目的新遗传证据已将BMP9的功能丧失突变与人类血管异常和出血综合征联系起来(Wooderchak-Donahue等人,Am J HumGenet.,93(3):530–537,Sep2013)。
因此，虽然已经取得了重要进展，但仍然迫切需要提供用于治疗与许多慢性、神经学、遗传、炎性、纤维化或感染性病理学的发展有关的肌肉萎缩和/或骨病的既高效又安全的新型治疗剂。
以引用的方式并入
本文所公开的所有参考文献出于所有目的均在此以引用的方式整体并入。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的肌肉萎缩的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。在各种实施方案中，肌肉萎缩与选自由以下组成的组的疾病相关：肌营养不良(诸如DMD、贝克氏MD、肢带型MD、肌强直性MD和FSHD)、肌炎(诸如皮肌炎、多肌炎和包涵体肌炎)、肌病(包括遗传性肌病以及获得性肌病，诸如由雄激素剥夺疗法、皮质类固醇或他汀类药物诱导的肌病)、运动神经元疾病(诸如葛雷克氏病(Lou Gehrig’s Disease)或ALS)、脊髓性肌肉萎缩(包括婴儿进行性脊髓性肌肉萎缩、中度脊髓性肌肉萎缩、青少年脊髓性肌肉萎缩和成人脊髓性肌肉萎缩)、神经肌肉接点疾病(诸如重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)和肉毒中毒)、周围神经疾病(诸如恰克-马利杜斯氏病(Charcot-Marie tooth disease)、索二氏病(Dejerine-Sottas)和弗立特里希氏共济失调(Friedreich's ataxia))、脊髓损伤、中风、神经退行性疾病(包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病和克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease))、癌症(诸如肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、食道癌、头颈癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、胶质瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤、和多发性骨髓瘤、皮肤癌和血癌)、器官衰竭(诸如心力衰竭、肾衰竭和肝衰竭、创伤(诸如烧伤或机动车事故)、废用(诸如长期卧床休息、住院治疗和太空飞行)、感染(诸如HIV、脊髓灰质炎和败血症)、慢性阻塞性肺病(COPD)以及老化(诸如少肌症、少肌性肥胖症和骨关节炎)。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的骨病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，骨病选自由以下组成的组：骨质疏松症、肾性骨营养不良、成骨不全症、进行性骨化性纤维发育不良、皮质类固醇诱导的骨丢失、雄激素剥夺疗法诱导的骨丢失、髋部骨折、癌症诱导的骨丢失、骨转移、佩吉特氏病、佝偻病、骨软化、佩特兹氏病(Perthes'disease)和纤维发育不良。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，代谢病症选自由以下组成的组：代谢综合征、肥胖症、血脂异常、少肌性肥胖症、非酒精性脂肪性肝病诸如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝病、胰岛素抵抗、糖尿病，以及糖尿病性肌病、糖尿病肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病和血色素沉着病。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，纤维化选自由以下组成的组：间质性肺病、独特型肺纤维化、囊性纤维化、肝纤维化、肝硬化、胆道闭锁、心肌梗塞、心脏纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、特发性腹膜后纤维化、肾源性纤维化皮肤病、炎性肠病或克罗恩病、瘢痕疙瘩、硬皮病、腹膜后纤维化和关节纤维化。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的自身免疫/炎性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，所述疾病选自由以下组成的组：包括多发性硬化症(MS)、系统性硬化症、糖尿病(1型)、肾小球肾炎、重症肌无力、银屑病、系统性红斑狼疮、多发性肌炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、和原发性胆汁性肝硬化、关节炎、哮喘以及败血症在内的自身免疫/炎性病症。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的心血管疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，心血管疾病选自由以下组成的组：心力衰竭、心脏萎缩、肺动脉高血压(PAH)、心肌炎、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心律失常、心脏瓣膜疾病、心肌病、心包疾病、主动脉疾病、马凡综合征(Marfan syndrome)和心脏移植。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的癌症或癌症转移的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，癌症选自由以下组成的组：胰腺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈癌、横纹肌肉瘤、胶质瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、黑色素瘤、癌和骨髓增生异常综合征。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的慢性肾病(CKD)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，CKD选自由以下组成的组：包括肾衰竭、间质纤维化、糖尿病性肾病、肾透析、肾性骨营养不良和蛋白质能量耗损(protein energy wasting，PEW)在内的CKD。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，关节炎选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、骨关节炎、斯提耳氏病、强直性脊柱炎、背痛、贝赛特氏病(disease)、滑囊炎、焦磷酸钙沉积病、腕管综合征、髌骨软骨软化症、慢性疲劳综合征、复杂的局部疼痛综合征、隐热蛋白相关周期综合征(cryopyrin-associated periodicsyndrome)、退行性椎间盘疾病、髋关节发育不良、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlossyndrome)、家族性地中海热、纤维肌痛、巨细胞动脉炎、皮肌炎、特发性关节炎、硬皮病、川崎病、狼疮、混合性结缔组织疾病、多肌炎、佩特兹氏病、风湿性疾病、血色素沉着病、感染性关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、斯耶格伦病(disease)、椎管狭窄和肌腱炎。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的厌食症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，厌食症选自神经性厌食症和厌食症-恶病质综合征。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的肝病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，肝病选自由以下组成的组：非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化或肝硬化、肝硬化、自身免疫性肝炎、肝细胞癌、肝衰竭和肝移植。
在另一方面，本公开提供了用于受试者的器官或组织移植的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，移植选自由以下组成的组：心脏、肾、肝、肺、胰腺、肠和胸腺的器官移植，或肌肉、骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经和静脉的组织/细胞移植。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的贫血的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，贫血选自由以下组成的组：炎症性贫血、缺铁性贫血、铁超负荷、地中海贫血、溶血性贫血、镰状细胞性贫血、恶性贫血、范可尼贫血、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、癌症相关性贫血、化疗诱导的贫血以及与CKD和肾透析相关的贫血。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的疼痛的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，疼痛选自由以下组成的组：神经性疼痛、躯体痛、内脏痛、炎性疼痛、癌痛、背痛和关节痛。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的老化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，老化疾患选自由以下组成的组：老年人虚弱、年龄相关性少肌症和骨关节炎。
在另一方面，本公开提供了诱导受试者的干细胞生长用于组织修复或器官再生的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，干细胞选自由以下组成的组：肌肉干(卫星)细胞、心脏干细胞、骨髓来源间充质干细胞和多能干细胞。
在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少一个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。
在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽具有以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB多肽是具有与选自SEQ ID NO:3-37的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB多肽，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但是相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB多肽是具有与选自SEQ ID NO:51-117的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB多肽，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。
在各种实施方案中，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽和至少一种异源蛋白，其中杂合ActRIIB配体陷阱能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，异源蛋白是Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域是人IgG Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域源自SEQ ID NO:38所示的人IgG1重链恒定结构域序列。在各种实施方案中，Fc结构域是具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域源自SEQ ID NO:40所示的人IgG2重链恒定结构域序列。在各种实施方案中，Fc结构域是具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域源自SEQ ID NO:42所示的人IgG4重链恒定结构域序列。在各种实施方案中，Fc结构域是具有SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的Fc结构域。
在各种实施方案中，异源蛋白通过接头和/或铰链接头肽与杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽附连。接头或铰链接头可以是相对不含二级结构的5、10、15、20、30、40或更多个氨基酸之间的人工序列。在各种实施方案中，接头的G/S含量丰富(例如，接头中至少约60％、70％、80％、90％或更多的氨基酸是G或S。在各种实施方案中，接头具有(GGGGS(SEQ ID NO:44))n基序，其中n＝1-6。
在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用，以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至本公开的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽(例如SEQ ID NO:3-37或51-117中的任一个)。
附图说明
图1示出了本公开的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的两种示例性分子构型。
图2显示了示出基于细胞的测定的结果的线图，所述基于细胞的测定用于评估具有AG-0003(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白和具有AG-0005(SEQID NO:7)的氨基酸序列的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白与作为基准的野生型ActRIIB-Fc蛋白(WT)在肌生长抑制素中和(左图)、活化素A中和(中图)和BMP9中和(右图)能力上的比较。
图3显示了示出具有AG-0014(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白和具有AG-0027(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白与作为基准的野生型ActRIIB-Fc蛋白(WT)在基于细胞的针对肌生长抑制素(左上)、活化素A(右上)、活化素B(左下)和BMP9(右下)的中和活性上的比较的结果的线图。如实施例中所述的，通过使用C2C12-CAGA-luc报告基因测定检查肌生长抑制素中和活性、活化素A中和活性和活化素B中和活性，并通过使用C2C12-BRE-luc报告基因测定分析BMP9中和活性。
图4显示了示出在分别用PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc(WT)、AG-0014(SEQ IDNO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)以10mg/kg的剂量每周一次皮下注射的9周龄雄性C57Bl/6小鼠中，对体重的影响的线图。在第0天、第5天、第12天和第18天记录体重。每组n＝6/8。进行Student氏t检验，用于统计分析。***：与媒介物组相比P<0.001。
图5显示了示出在分别用PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc(WT)、AG-0014(SEQ IDNO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)以10mg/kg的剂量每周一次皮下注射的9周龄雄性C57Bl/6小鼠(每组n＝6/8)中，对肌肉质量的影响的柱状图。在最终的尸体剖检期间，解剖来自每只动物的单独的腓肠肌并称重。通过Student氏t检验进行统计分析。***：与媒介物组相比P<0.001。
图6显示了小鼠腹腔的伊文思蓝血管渗透性测试图像。如图中标记的，显示了每组的以外科手术方式暴露的腹腔的代表性图像。分别用PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc(WT)、AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)以10mg/kg的剂量每周一次处理8周龄雄性BalbC小鼠。在处理后2周，经由尾静脉向每组动物(n＝4)中注射200μl伊文思蓝染料(在pH7.2的PBS中的0.5％)。在伊文思蓝染料注射后90min进行尸体剖检。
图7显示了小鼠睾丸的伊文思蓝血管渗透性测试图像。如图中标记的，显示了每组的解剖的睾丸器官的代表性图像。分别用10mg/kg的PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc(WT)、AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)每周一次处理8周龄雄性BalbC小鼠。在处理后2周，经由尾静脉向每组动物(n＝4)中注射200μl伊文思蓝染料(在pH7.2的PBS中的0.5％)。在伊文思蓝染料注射后90min进行尸体剖检。
图8显示了小鼠肺的伊文思蓝血管渗透性测试图像。如图中标记的，显示了每组的解剖的肺组织的代表性图像。分别用10mg/kg的PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc(WT)、AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)每周一次处理8周龄雄性BalbC小鼠。在处理后2周，经由尾静脉向每组动物(n＝4)中注射200μl伊文思蓝染料(在pH7.2的PBS中的0.5％)。在伊文思蓝染料注射后90min进行尸体剖检。
图9显示了示出在如图中标记的不同处理组中，每mg湿肺组织(左图)和睾丸组织(右图)的渗出的伊文思蓝染料的量的柱状图。分别用10mg/kg的PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc蛋白(WT)、AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)每周一次处理8周龄雄性BalbC小鼠。在处理后2周，经由尾静脉向每组动物(n＝4)中注射200μl伊文思蓝染料(在pH7.2的PBS中的0.5％)。在伊文思蓝染料注射后90min进行尸体剖检，以收集睾丸和肺组织。将组织称重，然后单独地置于含有甲酰胺的小瓶中，以提取伊文思蓝染料。在55℃下孵育24小时后，将样品离心，并使用分光光度计在610nm的波长下测量每个样品的水相的吸光度。通过使用Student氏t检验进行统计分析。*：P<0.05。
图10显示了示出多种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白(包括AG-0014(SEQ IDNO:16)、AG-0023(SEQ ID NO:25)、AG-0024(SEQ ID NO:26)、AG-0025(SEQ ID NO:27)、AG-0027(SEQ ID NO:29)、AG-0028(SEQ ID NO:30)、AG-0029(SEQ ID NO:31)和AG-0035(SEQID NO:37))与作为基准的野生型ActRIIB-Fc蛋白(野生型)在基于细胞的针对BMP9的中和活性上的比较的结果。通过使用C2C12-BRE-luc报告基因测定分析BMP9中和活性。
图11显示了相对于野生型ActRIIB-Fc蛋白的值，若干种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白之间的肌生长抑制素中和IC50值的差异。使用C2C12-CAGA-luc报告基因培养物检查各蛋白质的肌生长抑制素中和活性并通过使用Prism软件计算IC50值。该图显示了示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白(包括AG-0014(SEQ ID NO:16)、AG-0023(SEQ ID NO:25)、AG-0024(SEQ ID NO:26)、AG-0027(SEQ ID NO:29)、AG-0028(SEQ ID NO:30)和AG-0029(SEQID NO:31))各自的肌生长抑制素中和IC50值与野生型ActRIIB-Fc的值相比的差异百分比。
图12分别显示了与增加浓度的野生型(WT)ActRIIB-Fc以及野生型ActRIIA-Fc相比，两种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)的BMP9结合的ELISA分析的结果。使用KinEXA仪器(Sapidyne Instruments)进行自动ELISA。使用Sapidyne Instruments推荐的实验程序，将20μg/ml的BMP9偶联至NHS激活琼脂糖凝胶4快流珠(GE Healthcare)。如图中所显示的，测试100pM、1nM和10nM浓度下的WTActRIIB-Fc、WT ActRIIA-Fc和每种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的BMP9结合。野生型和杂合蛋白被捕获到BMP9包被的珠上，并通过Alexa Fluor 647标记的山羊抗人Fc抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.)来检测。用KinExAPro软件(Sapidyne Instruments)记录BMP9结合信号。
图13显示了对用PBS(媒介物对照)、野生型ActRIIB-Fc(WT-ActRIIB-Fc)、杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)或杂合陷阱B(AG-0014；SEQ ID NO:16)处理的129S1/SvlmJ小鼠的后肢爪子的甲床的总体形态的显微镜检查。通过使用倒置显微镜检视后肢爪子的甲床的出血迹象，并使用数码相机拍照。
图14显示了示出杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)施用对ORX C57BL/6小鼠的体重的影响的线图。数据显示了正常对照组、媒介物处理的ORX组和杂合陷阱处理的ORX组中的纵向记录的体重(左图)和体重改变(右图)。使用Student氏t检验进行统计分析。***：与媒介物处理的ORX组相比P<0.001。n＝6。
图15显示了示出杂合ActRIIB配体陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)对切除睾丸的(ORX)小鼠的后肢肌肉质量和瘦胴体质量的影响的柱状图。对于正常对照组、媒介物处理的ORX组和杂合ActRIIB配体陷阱处理的ORX组，在第42天的最终尸体剖检期间记录腓肠肌、四头肌和比目鱼肌重量和瘦胴体重量。关于平均腓肠肌、四头肌和比目鱼肌重量的数据是基于每个后肢肌肉对。使用Student氏t检验进行统计分析。***：P<0.001。n＝6。
图16显示了示出正常小鼠(正常)、媒介物处理的ORX小鼠(ORX+媒介物)和杂合ActRIIB配体陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理的ORX小鼠(ORX+杂合陷阱)的股骨远端的骨体积分数(BV/TV，％)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)、骨小梁数量(Tb.N，mm-1)和骨小梁分离度(Tb.Sp，mm)的微CT分析的柱状图。Student氏t检验用于统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。n＝6。
图17显示了示出正常小鼠(正常)、媒介物处理的ORX小鼠(ORX+媒介物)和杂合ActRIIB配体陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理的ORX小鼠(ORX+杂合陷阱)的第四腰椎的骨体积分数(BV/TV，％)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)、骨小梁数量(Tb.N，mm-1)和骨小梁分离度(Tb.Sp，mm)的微CT分析的柱状图。Student氏t检验用于统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。n＝6。
图18显示了示出杂合ActRIIB配体陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理对糖尿病db/db小鼠的食物摄入量(A)、水消耗量(B)、24小时尿量(C)和空腹血糖水平(D)的影响的柱状图。杂合db/db小鼠(n＝6)用作非糖尿病对照。在处理10周后测量食物摄入量、水消耗量、24小时尿量和空腹血糖水平。通过Student氏t检验进行统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。每组n＝6。
图19显示了单剂量的杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对雌性C57BL/6小鼠的体重改变的影响。通过分别单次注射10mg/kg的杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)、杂合陷阱B(AG-0014；SEQ ID NO:16)和野生型ActRIIB-Fc(WT-ActRIIB-Fc)皮下处理7周龄雌性C57BL/6小鼠(每组n＝6)。对照组接受单次注射媒介物(PBS)。在注射后多至14天的不同时间点记录PBS处理和杂合陷阱处理的小鼠的体重(A)和从基线的体重改变(B)。使用Student氏t检验进行统计分析。***：P<0.001；每组n＝6。误差棒表示标准偏差。
图20显示了单次注射杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对C57BL/6小鼠的后肢肌肉质量和瘦胴体质量的影响的头对头比较。分别用10mg/kg的单剂量的杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)、杂合陷阱B(AG-0014；SEQ ID NO:16)和WT-ActRIIB-Fc(基准)或用媒介物(PBS)皮下处理小鼠。在注射后第14天，对小鼠进行最终的尸体剖检。对于PBS处理的组、杂合陷阱A处理的组和杂合陷阱B处理的组，测定后肢肌肉(包括腓肠肌(A)、四头肌(B)和比目鱼肌(C))的重量，以及瘦胴体重量(D)。使用Student氏t检验进行统计分析。***：P<0.001；每组n＝6。误差棒表示标准偏差。使用Student氏t检验进行统计分析。
图21显示了单次递增剂量的杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对雌性C57BL/6小鼠的体重改变的影响。分别以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg用单次递增剂量的杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)和杂合陷阱B(AG-0014(SEQ ID NO:16)皮下处理6周龄雌性C57BL/6小鼠。对照组用媒介物(PBS)处理。在注射后多至8天记录PBS处理的小鼠和杂合陷阱处理的小鼠的体重和从基线的体重改变。使用Student氏t检验进行统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；每组n＝6。误差棒表示标准偏差。
图22显示了单次递增剂量的杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对雌性C57BL/6小鼠的后肢肌肉质量的影响。分别以1mg/kg、3/mg/kg和10mg/kg皮下给予杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)和杂合陷阱B(AG-0014(SEQ ID NO:16)。在第8天，对小鼠实施安乐死以进行最终的尸体剖检。通过对PBS处理的组、杂合陷阱A处理的组和杂合陷阱B处理的组的尸体剖检程序来确定后肢肌肉(包括腓肠肌(A)和四头肌(B))的重量。使用Student氏t检验进行统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；每组n＝6。误差棒表示标准偏差。使用Student氏t检验进行统计分析。
图23显示了单次递增剂量的杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对雌性C57BL/6小鼠的食物摄入量的影响。分别以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg用单次递增剂量的杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)皮下处理6周龄雌性C57BL/6小鼠。数据显示了PBS处理的小鼠和杂合陷阱处理的小鼠在第8天记录的食物摄入量。使用Student氏t检验进行统计分析。**：P<0.01；每组n＝6。误差棒表示标准偏差。
图24显示了皮下施用杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对杜兴氏肌营养不良(MDX)小鼠的体重的影响。对4周龄MDX小鼠用10mg/kg的媒介物(PBS)或杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)或杂合陷阱B(AG-0014(SEQ ID NO:16)每周皮下处理一次，持续8周。数据显示了在PBS处理的MDX小鼠和杂合陷阱处理的MDX小鼠中纵向记录的体重(A)和从基线的体重改变(B)。使用Student氏t检验进行统计分析。***：P<0.001；每组n＝8。误差棒表示标准偏差。
图25显示了皮下施用杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对MDX小鼠的后肢肌肉质量的影响。对MDX小鼠用10mg/kg的杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)和杂合陷阱B(AG-0014(SEQ ID NO:16)或用媒介物(PBS)每周皮下处理一次，持续8周。在第56天，对MDX小鼠实施安乐死以进行最终的尸体剖检。在用PBS(MDX+PBS)或杂合陷阱A(MDX+杂合陷阱A)或杂合陷阱B(MDX+杂合陷阱B)处理的MDX小鼠中通过尸体剖检程序测定单独的后肢肌肉(包括腓肠肌(A)、四头肌(B)和比目鱼肌(C))的重量。使用Student氏t检验进行统计分析。***：P<0.001；每组n＝8。误差棒表示标准偏差。
图26显示了皮下施用杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对MDX小鼠的握力的影响。在第8周，通过使用BIOSEB握力计(EB-instruments)在用PBS(MDX+PBS)或杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)(MDX+杂合陷阱A)或杂合陷阱B(MDX+杂合陷阱B)(AG-0014(SEQID NO:16)处理的MDX小鼠中分析握力。使用Student氏t检验进行统计分析。***：P<0.001；每组n＝8。误差棒表示标准偏差。
图27显示了皮下施用杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)蛋白对MDX小鼠的循环肌酸激酶(CK)水平的影响。对MDX小鼠每周用10mg/kg的PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)皮下处理，持续8周。年龄相匹配的野生型小鼠用作正常对照。在年龄相匹配的野生型小鼠(WT)和用PBS(MDX+PBS)或杂合陷阱(杂合陷阱+PBS)处理的MDX小鼠中测量血清CK水平。*：P<0.05，Student氏t检验。每组n＝8。误差棒表示标准偏差。
图28显示了由杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理引起的股骨远端的骨小梁骨密度改变的微CT分析的结果。对MDX小鼠每周用10mg/kg的PBS(MDX+PBS)或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)(MDX+杂合陷阱)皮下处理，持续8周。A.PBS和杂合陷阱处理的组的股骨远端的骨体积(BV/TV，％)。Student氏t检验用于统计分析。***：P<0.001。每组n＝8。误差棒表示标准偏差。B.PBS处理的组和杂合陷阱处理的组的股骨远端骨小梁构造的代表性图像。
图29显示了由杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理引起的腰椎的骨小梁骨密度改变的微CT分析的结果。对MDX小鼠每周用10mg/kg的PBS(MDX+PBS)或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)(MDX+杂合陷阱)皮下处理，持续8周。A.PBS处理的组和杂合陷阱处理的组的腰椎的骨体积(BV/TV，％)。Student氏t检验用于统计分析。***：P<0.001。每组n＝8。误差棒表示标准偏差。B.PBS处理的组和杂合陷阱处理的组的腰椎骨小梁构造的代表性图像。
图30显示了杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)对野生型和oim/oim(III型成骨不全)小鼠的肌肉质量的影响。用PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理8周龄野生型对照小鼠和oim/oim小鼠，持续6周。在最终的尸体剖检期间记录三头肌(A)和腓肠肌(B)重量。使用Student氏t检验进行统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。每组n＝9-12。误差棒表示标准偏差。
图31显示了由杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理引起的野生型小鼠和oim/oim小鼠中BMD和BMC改变的双能X射线吸收测定法(DEXA)分析的结果。用PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理8周龄野生型对照小鼠和oim/oim小鼠，持续6周。在用PBS或杂合陷阱处理之前和处理6周之后即刻对BMD(A)和BMC(B)进行DEXA扫描。使用Student氏t检验进行统计分析。**：P<0.01；***：P<0.001。每组n＝9-12。误差棒表示标准偏差。
图32显示了由杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理引起的股骨远端的骨小梁骨密度改变的微CT分析的结果。用PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理8周龄野生型对照小鼠和oim/oim小鼠，持续6周。数据显示了在PBS处理和杂合陷阱处理的野生型小鼠和在PBS处理和杂合陷阱处理的野生型小鼠(图A)和oim/oim小鼠(图B)中的股骨远端的骨体积骨折(BV/TV％)以及骨小梁构造的代表性微CT图像。Student氏t检验用于统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。误差棒表示标准偏差。
图33显示了由杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理引起的腰椎的骨小梁骨密度改变的微CT分析的结果。数据显示了用PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理的野生型小鼠(图A)和oim/oim小鼠(图B)中的第五腰椎的骨体积骨折(BV/TV％)以及骨小梁构造的代表性微CT图像。Student氏t检验用于统计分析。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。误差棒表示标准偏差。
图34显示了杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理对oim/oim小鼠的体长的影响。在用PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理6周后测量oim/oim小鼠和年龄相匹配的野生型对照小鼠的体长。A.处理6周后野生型小鼠和oim/oim小鼠的体长。B.体长绘制为相比野生型对照的改变百分比。误差棒表示标准偏差。
图35显示了杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理对股骨远端的骨面积(A)、骨周长(B)和矿化表面/骨表面比(C)的影响的骨组织形态学分析的结果。在用PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理6周后进行骨组织形态学分析。
图36显示了杂合ActRIIB配体陷阱(杂合陷阱)处理对破骨细胞/骨表面比(A)和破骨细胞数量/骨周长比(B)的影响的骨组织形态学分析结果。在用PBS或杂合陷阱(AG-0027；SEQ ID NO:29)处理6周后进行骨组织形态学分析。
具体实施方式
本公开提供了治疗受试者的肌生长抑制素相关或活化素A相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的新型分离的杂合ActRIIB配体陷阱。新型分离的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白被遗传工程化为融合蛋白，其作为多细胞因子拮抗剂发挥作用，所述多细胞因子拮抗剂被设计为选择性地阻断多种恶病质(诱导萎缩的)细胞因子的作用而不影响非肌肉相关细胞因子的信号传导。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含分离的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述分离的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力(即，保留肌生长抑制素和活化素A中和活性，但是表现出显著降低的BMP9中和作用)。本公开部分地基于发明人的如下独特见解，即被工程化为表现出显著降低的与BMP9的结合(因此具有降低的BMP9中和作用)，同时保留对肌生长抑制素和活化素的强中和活性的杂合ActRIIB配体陷阱，将提供为比目前可用的肌生长抑制素抑制剂更安全且更有效的分子的肌生长抑制素抑制剂。具体地，发明人假设，被工程化为用相应的来自ActRIIA细胞外结构域(ECD)的氨基酸选择性地置换ActRIIB ECD内的氨基酸残基的杂合可溶性ActRIIB多肽，可提供相对于BMP9优先中和肌生长抑制素和活化素A(肌肉生长的关键负调控因子)的新型杂合可溶性ActRIIB多肽。BMP9在许多生理过程中发挥重要作用(参见，例如Tillet E等人,FrontGenet.8；5:456,2015)并且已经显示BMP9信号传导在维持正常血液脉管系统/渗透性方面是必需的(参见例如David L.等人,Circ Res.25；102(8):914-22,2008)。因此假设用本文所述的新型杂合ActRIIB配体陷阱蛋白治疗的受试者可避免在用强烈结合并中和BMP9的现有ActRIIB-Fc分子治疗的受试者中观察到的鼻和齿龈出血的副作用。这些新型杂合ActRIIB配体陷阱蛋白提供的治疗优势提供了对于严重肌肉损失和恶病质的逆转以及对于包括肌肉萎缩、骨丢失、炎症和纤维化的广泛慢性分解代谢疾病的治疗是安全且有效的下一代治疗剂。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。在各种实施方案中，“肽”，“多肽”和“蛋白质”是其α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此，链的一端(氨基末端)的末端氨基酸具有游离氨基，而链的另一端(羧基末端)的末端氨基酸具有游离羧基。如本文所用，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指肽的氨基末端的氨基酸上的游离α-氨基，或该肽中任何其他位置的氨基酸的α-氨基(当参与肽键时为亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”是指肽的羧基末端上的游离羧基或肽中任何其他位置的氨基酸的羧基。肽还基本上包括任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，诸如通过醚键而非酰胺键连接的氨基酸。
本公开的多肽包括以任何方式和出于任何原因被修饰为例如以下的多肽：(1)降低对蛋白水解的敏感性；(2)降低对氧化的敏感性；(3)改变形成蛋白复合体的结合亲和力；(4)改变结合亲和力；以及(5)赋予或修改其他物理化学特性或功能特性。举例来说，可以在天然存在的序列中(例如在形成分子间触点的结构域以外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。“保守氨基酸取代”是指在多肽中用功能相似的氨基酸取代氨基酸。以下六组各含有相互保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
“非保守氨基酸取代”是指这些类别之一的成员被另一类别的成员取代。在进行此类改变时，根据各种实施方案可考虑氨基酸的亲水指数。已经基于氨基酸的疏水性和电荷特征为每个氨基酸分配了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性(参见，例如Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-131)。已知某些氨基酸可以取代具有相似的亲水指数或分数的其他氨基酸，并且仍然保留相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在各种实施方案中，包括亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在各种实施方案中，包括在±1内的那些取代；并且在各种实施方案中，包括在±0.5内的那些取代。
本领域还应理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代，特别是当由此产生的生物学功能蛋白质或肽旨在用于如本文所公开的免疫学实施方案时。在各种实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性决定的)与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学特性相关。
已经为这些氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变时，在各种实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的取代；在各种实施方案中，包括在±1内的那些取代；并且在各种实施方案中，包括在±0.5内的那些取代。
示例性氨基酸取代列于表1中。
表1
技术人员将能够使用熟知的技术确定本文所列出的多肽的合适变体。在各种实施方案中，本领域技术人员可以通过靶向被认为对于活性不重要的区域来鉴定可以在不破坏活性的情况下被改变的分子的合适区域。在其他实施方案中，技术人员可以鉴定在相似多肽间保守的分子的残基和部分。在另外的实施方案中，即使可能对生物活性或对结构重要的区域也可以经历保守氨基酸取代，而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
另外，本领域技术人员可以回顾鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这样的比较，技术人员可以预测对应于相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基的多肽中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择对此类预测的重要氨基酸残基进行化学上相似的氨基酸取代。
本领域技术人员还可以在相似多肽中分析与该结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于这样的信息，本领域技术人员可以对于多肽的三维结构预测其氨基酸残基的排列。在各种实施方案中，本领域技术人员可选择不对预测在多肽表面上的氨基酸残基进行根本改变，因为此类残基可能参与与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以生成在每个期望的氨基酸残基处包含单氨基酸取代的测试变体。然后可使用本领域技术人员已知的活性测定筛选变体。此类变体可用于收集关于合适变体的信息。例如，如果人们发现，特定氨基酸残基的改变导致受损的、不合希望地减少的或不适合的活性，则可以避免具有这种改变的变体。换句话说，基于从此类常规试验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定应避免在该处单独的或与其他突变组合的进一步取代的氨基酸。
如本文所用的术语“多肽片段”和“截短的多肽”是指与相应的全长蛋白质相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在某些实施方案中，片段可以为，例如至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸的长度。在某些实施方案中，片段还可以为，例如最多1000个、最多900个、最多800个、最多700个、最多600个、最多500个、最多450个、最多400个、最多350个、最多300个、最多250个、最多200个、最多150个、最多100个、最多50个、最多25个、最多10个或最多5个氨基酸的长度。片段还可以在其任一个或两个末端包含一个或更多个另外的氨基酸，例如，来自不同天然存在的蛋白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
如本文所用的术语“多肽变体”、“杂合多肽”和“多肽突变体”是指包含以下氨基酸序列的多肽，其中相对于另一个多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入至该氨基酸序列、从该氨基酸序列中缺失和/或被取代到该氨基酸序列中。在某些实施方案中，待被插入、缺失或取代的氨基酸残基的数量可以是例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的长度。本公开的杂合体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是经过化学修饰的多肽，所述化学修饰例如缀合至另一个化学部分(诸如例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白))、磷酸化和糖基化。
本文中术语“％序列同一性”与术语“％同一性”可互换使用并且是指当使用序列比对程序比对时，两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性的水平或两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性的水平。例如，如本文所用的，80％同一性与由定义的算法确定的80％序列同一性指相同的事物，并且指的是，给定序列与另一个序列的另一长度至少80％相同。在某些实施方案中，％同一性选自例如，与给定序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同一性。在某些实施方案中，％同一性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％的范围内。
本文中术语“％序列同源性”与术语“％同源性”可互换使用并且是指当使用序列比对程序比对时，两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同源性的水平或两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性的水平。例如，如本文使用的，80％同源性与由定义的算法确定的80％序列同源性指相同的事物，并且相应地，给定序列的同系物相对于给定序列的长度具有大于80％的序列同源性。在某些实施方案中，％同源性选自例如，与给定序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同源性。在某些实施方案中，％同源性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％的范围内。
可用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序的套件，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP以及TBLASTN，这些程序在互联网在NCBI网站上可公开获得。还参见Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990(特别参考公开的默认设置，即参数w＝4，t＝17)和Altschul等人,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997。当相对于GenBank蛋白质序列和其他公开数据库中的氨基酸序列评估给定氨基酸序列时，通常使用BLASTP程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于相对于GenBank蛋白质序列和其他公开数据库中的氨基酸序列检索在所有阅读框已经被翻译的核酸序列。使用开放空位罚分11.0和延伸空位罚分1.0的默认参数并利用BLOSUM-62矩阵运行BLASTP和BLASTX两者。参见同上。
除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(P(N))，其提供关于两个核苷酸或者核酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率例如小于约0.1、小于约0.01、或小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列相似。
如本文所用的术语“异源”是指非天然或非自然界发现的组分或状态，例如可通过用源自另一来源的组分或状态替换现有的天然组分或状态来实现的组分或状态。相似地，除了其中蛋白质天然地表达的生物体之外的生物体中的蛋白质表达构成异源表达系统和异源蛋白。
如本文所用的术语“抗体”是指包含一个或更多个多肽并且具有对肿瘤抗原的特异性或具有对在病理状态过表达的分子的特异性的蛋白质，所述多肽基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及这些基因的亚型和无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链(LC)被归类为κ或λ。重链(HC)被归类为γ、μ、α、δ或ε，继而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(例如，抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N-末端结构域定义具有约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。
如本文所用的术语“Fc区”定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并任选地包含CH4结构域。抗体的Fc部分介导若干重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合体的半衰期/清除率(例如，新生的FcR(FcRn)在内体中在酸性pH下结合IgG的Fc区并保护IgG免于降解，从而对IgG的长血清半衰期作出贡献)。替换Fc部分中的氨基酸残基以改变抗体效应子功能是本领域已知的(参见，例如Winter等人，美国专利号5,648,260和5,624,821)。
“多核苷酸”是指由核苷酸单元组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，诸如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包括包含以下的那些：非天然存在的碱基；以除天然存在的磷酸二酯键以外的键与其他核苷酸衔接的核苷酸；或包含通过除磷酸二酯键以外的键附连的碱基的核苷酸。因此，核苷酸类似物包括(例如且不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。例如，可以使用自动DNA合成仪合成此类多核苷酸。术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这还包括其中“U”替换“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。
本文中使用常规表示法来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端为5'-端；双链多核苷酸序列的左手方向被称作5'-方向。核苷酸5'至3'添加至初生RNA转录物中的方向被称作转录方向。与mRNA具有相同序列的DNA链被称作“编码链”；在与由所述DNA转录的mRNA具有相同序列的DNA链上并且位于所述RNA转录物的5'至5'-端的序列被称作“上游序列”；在与所述RNA具有相同序列的DNA链上并且在所述编码RNA转录物的3'至3'端的序列被称作“下游序列”。
“互补”是指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，这两个分子可被描述为互补的，此外，接触表面特征为彼此互补。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列基本上相同，或如果第一多核苷酸可与第二多核苷酸在严格杂交条件下杂交，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。
“与...特异性杂交”或“特异性杂交”或“与...选择性杂交”是指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时，核酸分子优先与特定核苷酸序列在严格条件下的结合、双链体化或杂交。术语“严格条件”是指在其下探针将优先与其靶子序列杂交，并且在较小程度上与其他序列杂交或根本不与其他序列杂交的条件。在核酸杂交实验诸如DNA杂交和RNA杂交的背景下，“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”为序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。有关核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,1993,LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicAcid Probes,第I部分,第2章,"Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays",Elsevier,N.Y.；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,第3增补版,NY；以及Ausubel等人,编辑,现行版,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY。
通常，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为比特定序列在限定离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm为50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格的条件被选择为等于特定探针的Tm。用于在DNA印迹或RNA印迹中的滤器上具有多于约100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的实例为在42℃，50％福尔马林与1mg肝素，杂交过夜。高度严格的洗涤条件的实例为在72℃，0.15M NaCl，持续约15分钟。严格洗涤条件的实例为在65℃，0.2x SSC洗涤，持续15分钟。参见Sambrook等人对SSC缓冲液的描述。高严格洗涤之前可进行低严格洗涤以去除背景探针信号。对于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性中度严格洗涤为在45℃，1x SSC，持续15分钟。对于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性低严格洗涤为在40℃，4-6x SSC，持续15分钟。一般来讲，比起在特定杂交测定中对于不相关探针观察到的2倍(或更高)的信噪比指示检测到特异性杂交。
“引物”指能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并提供用于合成互补多核苷酸的起始点的多核苷酸。当将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下，即，在核苷酸、互补多核苷酸模板和用于聚合的剂诸如DNA聚合酶的存在下时，这种合成发生。引物通常是单链的，但可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但是多种合成和天然存在的引物可用于许多应用。引物与模板互补，其被设计为与模板杂交以用作合成起始的位点，但不需要反映模板的确切序列。在这种情况下，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。引物可以用例如生色的、放射性的或荧光的部分标记，并用作可检测的部分。
当提及多核苷酸时，“探针”是指能够与另一多核苷酸的指定序列特异性杂交的多核苷酸。探针与靶互补多核苷酸特异性杂交，但不需要反映模板的确切互补序列。在这种情况下，探针与靶标的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。探针可以用例如生色的、放射性的或荧光的部分标记，并用作可检测的部分。在探针提供用于合成互补多核苷酸的起始点的情况下，探针也可以是引物。
“载体”是可用于将与它连接的另一核酸引入到细胞中的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将另外的核酸区段连接到其中的线性或环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中另外的DNA区段可被引入到病毒基因组中。某些载体能够在引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后被整合进宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是一种可以指导所选多核苷酸的表达的载体。
“调控序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时间或位置)的核酸。调控序列可以例如直接对受调控的核酸发挥其效应，或通过一种或多种其他分子(例如，结合调控序列和/或核酸的多肽)的作用发挥其效应。调控序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调控序列的另外的实例描述于例如Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,AcademicPress,San Diego,Calif.和Baron等人,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06。如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置)，则核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”。
“宿主细胞”是可用于表达本公开的多核苷酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)；或宿主细胞可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞是可用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，所述核酸然后可在宿主细胞中被表达。短语“重组宿主细胞”可用于表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是包含核酸但不以期望的水平表达该核酸的细胞，除非调控序列被引入到宿主细胞中，使得调控序列变成与该核酸可操作地连接。应理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试者细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可以由于例如突变或环境影响而在后续世代中出现，所以此类子代可能实际上与亲本细胞不相同，但仍然包括在本文所用的术语的范围内。
术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽或多核苷酸)是这样的分子：该分子就其起源或衍生来源来说(1)与在它天然状态中与之伴随天然缔合的组分不缔合；(2)基本上不含来自相同物种的其他分子；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)不存在于自然界中。因此，化学合成的、或在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中表达的分子，将是与其天然缔合的组分“分离”的。还可以利用本领域公知的纯化技术通过分离使分子变成基本上不含天然地缔合的组分。分子纯度或均一性可以通过本领域公知的许多手段来测定。例如，多肽样品的纯度可以使用本领域公知的技术使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和使多肽可视化的凝胶染色来测定。出于某些目的，可通过使用HPLC或本领域公知的用于纯化的其他手段提供更高的分辨率。
当样品的至少约60％至75％表现为单一种类的多肽时，蛋白质或多肽是“基本上纯的”、“基本上均一的”或“基本上纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体的或多聚体的。基本上纯的多肽或蛋白质将通常构成蛋白质样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常为约95％，且更优选地将超过99％纯。蛋白质纯度或均一性可通过本领域公知的许多手段来指示，所述手段诸如对蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在用本领域公知的染色剂染色凝胶之后使单一多肽条带可视化。出于某些目的，可通过使用HPLC或本领域公知的用于纯化的其他手段提供更高的分辨率。
“接头”是指共价地或通过离子、范德华力或氢键连接两个其他分子的分子，例如在5'端处与一个互补序列杂交并在3'端处与另一个互补序列杂交，从而连接两个非互补序列的核酸分子。“可切割的接头”是指可被降解或以其他方式切断以使通过该可切割的接头连接的两个组分分离的接头。可切割的接头通常被酶，通常为肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等切割。可切割的接头还可以通过环境诱因，诸如例如温度、pH、盐浓度等的改变来切割。
如本文所用的术语“标记”或“标记的”是指在抗体中掺入另一种分子。在一种实施方案中，标记是可检测的标记物，例如掺入放射性标记的氨基酸或附连到具有可通过标记的亲和素(例如含有可通过光学或量热法检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在另一个实施方案中，标记或标记物可以是治疗性的，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法为本领域已知的并且可以使用。多肽标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体；酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基基团；由第二报告基因识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链配对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；磁化剂，诸如钆类螯合物；毒素，诸如百日咳毒素；紫杉醇；细胞松弛素B；短杆菌肽D；溴化乙锭；吐根碱；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春花碱；秋水仙素；阿霉素；道诺霉素；二羟基蒽二酮；米托蒽醌；光神霉素；放线菌素D；1-去氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。在一些实施方案中，通过各种长度的间隔臂来附连标记以减少潜在的空间位阻。
“药物组合物”是指适用于动物药物用途的组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的载剂。“药理学有效量”是指有效产生预期药理学结果的剂的量。“药学上可接受的载剂”指任何标准的药物载剂、媒介物、缓冲液和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖水性溶液；以及乳液，诸如油/水或水/油乳液；以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。合适的药物载剂和制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第21版2005,Mack Publishing Co,Easton。“药学上可接受的盐”是指可以被配制成用于药物用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨的盐或有机胺的盐。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻或消除生物病症和/或至少一个其伴随的症状的方法。如本文所用，“减轻”疾病、病症或疾患意指减少该疾病、病症或疾患的症状的严重性和/或发生频率。此外，本文对“治疗”的提及包括对治愈性、姑息性和预防性治疗的提及。
应当理解，本文所述的本公开的方面和实施方案包括“由方面和实施方案组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。
本文中，提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变型。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。应当理解，本文所述的本公开的方面和变型包括“由方面和变型”和/或“基本上由方面和变型组成”。
临床适应症-治疗用途
在一方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的肌生长抑制素相关或活化素A相关病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。重要的是，本公开的药物组合物可用于增加以体重百分比计的瘦肌肉质量，以及降低以体重百分比计的脂肪质量，同时避免针对目前的基于ActRIIB-Fc融合蛋白的治疗剂报道的安全性问题。
在一个方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的肌肉萎缩的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。在各种实施方案中，肌肉萎缩与选自由以下组成的组的疾病相关：肌营养不良(诸如DMD、贝克氏MD、肢带型MD、肌强直性MD和FSHD)、肌炎(诸如皮肌炎、多肌炎和包涵体肌炎)、肌病(包括遗传性肌病以及获得性肌病，诸如由雄激素剥夺疗法、皮质类固醇或他汀类药物诱导的肌病)、运动神经元疾病(诸如葛雷克氏病或ALS)、脊髓性肌肉萎缩(包括婴儿进行性脊髓性肌肉萎缩、中度脊髓性肌肉萎缩、青少年脊髓性肌肉萎缩和成人脊髓性肌肉萎缩)、神经肌肉接点疾病(诸如重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征和肉毒中毒)、周围神经疾病(诸如恰克-马利杜斯氏病、索二氏病和弗立特里希氏共济失调)、脊髓损伤、中风、神经退行性疾病(包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病和克雅氏病)、癌症(诸如肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、食道癌、头颈癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、胶质瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤、和多发性骨髓瘤、皮肤癌和血癌)、器官衰竭(诸如心力衰竭、肾衰竭和肝衰竭、创伤(诸如烧伤或机动车事故)、废用(诸如长期卧床休息、住院治疗和太空飞行)、感染(诸如HIV、脊髓灰质炎和败血症)、慢性阻塞性肺病(COPD)以及老化(诸如少肌症、少肌性肥胖症和骨关节炎)。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的骨病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，骨病选自由以下组成的组：骨质疏松症、肾性骨营养不良、成骨不全症、进行性骨化性纤维发育不良、皮质类固醇诱导的骨丢失、雄激素剥夺疗法诱导的骨丢失、髋部骨折、癌症诱导的骨丢失、骨转移、佩吉特氏病、佝偻病、骨软化、佩特兹氏病和纤维发育不良。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，代谢病症选自由以下组成的组：代谢综合征、肥胖症、血脂异常、少肌性肥胖症、非酒精性脂肪性肝病诸如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝病、胰岛素抵抗、糖尿病，以及糖尿病性肌病、糖尿病肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病和血色素沉着病。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，纤维化选自由以下组成的组：间质性肺病、独特型肺纤维化、囊性纤维化、肝纤维化、肝硬化、胆道闭锁、心肌梗塞、心脏纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、特发性腹膜后纤维化、肾源性纤维化皮肤病、炎性肠病或克罗恩病、瘢痕疙瘩、硬皮病、腹膜后纤维化和关节纤维化。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的自身免疫/炎性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，所述疾病选自由以下组成的组：包括多发性硬化症(MS)、系统性硬化症、糖尿病(1型)、肾小球肾炎、重症肌无力、银屑病、系统性红斑狼疮、多发性肌炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、和原发性胆汁性肝硬化、关节炎、哮喘以及败血症在内的自身免疫/炎性病症。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的心血管疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，心血管疾病选自由以下组成的组：心力衰竭、心脏萎缩、肺动脉高血压(PAH)、心肌炎、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心律失常、心脏瓣膜疾病、心肌病、心包疾病、主动脉疾病、马凡综合征和心脏移植。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的心脏功能障碍或心力衰竭的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的杂合ActRIIB配体陷阱。该调节可以使受试者的心脏功能改善至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。心脏功能的改善可以通过超声心动描记术测量以下来评估：1)针对排出的血液体积和排出效率的心脏泵功能；和2)针对心肌收缩的强度的心肌功能。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症细胞的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用抑制癌症细胞的生长和/或增殖。具体地，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱可用于治疗以癌症为特征的病症。此类病症包括但不限于实体瘤，诸如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远端转移、淋巴瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤和白血病。乳腺癌的实例包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。呼吸道的癌症的实例包括但不限于小细胞和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤，以及神经外胚层和松果体肿瘤。男性生殖器官的肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫的肉瘤。消化道的肿瘤包括但不限于肛癌、结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。尿道的肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌和尿道癌。眼癌包括但不限于眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(具有或不具有纤维板层变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合性肝细胞胆管癌。皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、恶性黑色素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell skin cancer)和非黑色素瘤皮肤癌。头颈癌包括但不限于鼻咽癌，以及唇癌和口腔癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS相关性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin'sdisease)和中枢神经系统淋巴瘤。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病。在某些实施方案中，癌症将是具有TGF-β家族成员(诸如活化素A、肌生长抑制素、TGF-β和GDF15)的高表达的癌症，例如胰腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑色素瘤白血病、肺癌、前列腺癌、脑癌、膀胱癌和头颈癌。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的慢性肾病(CKD)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失或抑制肾纤维化。具体地，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱可用于治疗包括肾衰竭、间质纤维化和肾透析以及与CKD相关的蛋白能量耗损(PEW)在内的CKD。该调节可以使受试者的CKD或PEW改善至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。肾功能的改善可以通过测量尿液中的蛋白质/肌酸酐比率(PCR)和肾小球滤过率(GFR)来评估。PEW的改善可以通过测量白蛋白和炎性细胞因子的血清水平、蛋白质合成和降解的速率、体重、肌肉质量、身体活动和营养结果来评估。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者的关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。具体地，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱可用于治疗选自类风湿性关节炎和骨关节炎的关节炎。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者的厌食症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。具体地，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱可用于治疗选自神经性厌食症和厌食厌食症-恶病质综合征的厌食症。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者的肝病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。具体地，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱可用于治疗选自以下的肝病：非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝病、肝硬化、肝衰竭、自身免疫性肝炎和肝细胞癌。
在另一方面，本公开提供了用于受试者的器官或组织移植的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。具体地，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱可用于治疗选自以下的移植：心脏、肾、肝、肺、胰腺、肠和胸腺的器官移植，或骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经和血管的组织移植。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者的贫血的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，贫血选自各种贫血病症，包括癌症相关性贫血、化疗诱导的贫血、慢性肾病相关性贫血、缺铁性贫血、地中海贫血、镰状细胞疾病、再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征。
在另一方面，本发明提供治疗受试者的疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一个实施方案中，受试者是人受试者。在各种实施方案中，疼痛选自神经性疼痛、炎性疼痛或癌症疼痛。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的老化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，老化疾患选自由以下组成的组：老年人虚弱、年龄相关性少肌症和骨关节炎。
在另一方面，本公开提供了诱导受试者的干细胞生长用于组织修复或器官再生的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)在药学上可接受的载剂中的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱。在各种实施方案中，干细胞选自由以下组成的组：肌肉干(卫星)细胞、心脏干细胞、骨髓来源间充质干细胞和多能干细胞。
在各种实施方案中，本公开提供了一种抑制受试者的肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的杂合ActRIIB配体陷阱。该调节可以使受试者的肌肉质量的损失和/或功能的丧失减轻至少5％、10％、至少25％、至少50％、至少75％或至少90％。肌肉质量的损失和功能的丧失的抑制可以通过利用成像技术和身体力量测试来评估。用于肌肉质量评估的成像技术的实例包括双能X射线吸收测定法(DEXA)、磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)。肌肉功能测试的实例包括握力强度测试、登楼测试、简易体能状况量表(short physical performance battery，SPPB)和6分钟步行，以及用于测量呼吸肌强度的最大吸气压力(MIP)和最大呼气压力(MEP)。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指将在一定程度上缓解所治疗病症的一种或多种症状的所施用治疗剂的量。
可以通过确定IC50从细胞培养测定初始估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括如在细胞培养物中测定的IC50的循环血浆浓度范围。这种信息可用于更准确地确定在人体中有用的剂量。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。确切的组合物、施用途径和剂量可以由个体医师根据受试者的状况选择。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量(多个或重复或维持)，并且可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。特别有利的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物以便于剂量的施用和一致性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗哺乳动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算可与所需药物载剂联合产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。本公开内容的剂量单位形式的规格将主要由抗体的独特特征和待被实现的特定治疗效果或预防效果决定。
因此，技术人员基于本文所提供的公开内容应理解，根据治疗领域中公知的方法调整剂量和给药方案。也就是说，可容易建立最大的可允许剂量，并且还可确定对受试者提供可检测的治疗益处的有效量，同样可以确定施用每种剂以对患受试者提供可检测的治疗益处的时间要求。因此，虽然在本文中例示某些剂量和施用方案，但这些实施例决不限制在本公开的实践中提供给受试者的剂量和施用方案。
应注意，剂量值可随待被缓解的疾患的类型和严重性而变化，并且可包括单剂量或多剂量。还应理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。另外，使用本公开的组合物的剂量方案可以基于多个因素，包括疾病的类型、受试者的年龄、体重、性别、医疗状况、疾患的严重性、施用途径和采用的特定抗体。因此，剂量方案可以广泛变化，但可以使用标准方法常规地确定。例如，可基于药代动力学或药效学参数调整剂量，这些参数可包括临床效果，诸如毒性作用和/或实验室值。因此，本公开包括如由技术人员确定的受试者内剂量递增。确定适当的剂量和方案是相关技术领域公知的并且可以被理解为一旦提供本文公开的教导，则由技术人员掌握。
本公开的杂合ActRIIB配体陷阱的治疗有效量或预防有效量的示例性、非限制性每日剂量范围可以为0.001至100mg/kg体重、0.001至90mg/kg体重、0.001至80mg/kg体重、0.001至70mg/kg体重、0.001至60mg/kg体重、0.001至50mg/kg体重、0.001至40mg/kg体重、0.001至30mg/kg体重、0.001至20mg/kg体重、0.001至10mg/kg体重、0.001至5mg/kg体重、0.001至4mg/kg体重、0.001至3mg/kg体重、0.001至2mg/kg体重、0.001至1mg/kg体重、0.010至50mg/kg体重、0.010至40mg/kg体重、0.010至30mg/kg体重、0.010至20mg/kg体重、0.010至10mg/kg体重、0.010至5mg/kg体重、0.010至4mg/kg体重、0.010至3mg/kg体重、0.010至2mg/kg体重、0.010至1mg/kg体重、0.1至50mg/kg体重、0.1至40mg/kg体重、0.1至30mg/kg体重、0.1至20mg/kg体重、0.1至10mg/kg体重、0.1至5mg/kg体重、0.1至4mg/kg体重、0.1至3mg/kg体重、0.1至2mg/kg体重、0.1至1mg/kg体重、1至50mg/kg体重、1至40mg/kg体重、1至30mg/kg体重、1至20mg/kg体重、1至10mg/kg体重、1至5mg/kg体重、1至4mg/kg体重、1至3mg/kg体重、1至2mg/kg体重或1至1mg/kg体重。应注意，剂量值可随待被缓解的疾患的类型和严重性而变化。还应理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
在各种实施方案中，施用的总剂量将实现范围在例如约1至1000μg/ml、约1至750μg/ml、约1至500μg/ml、约1至250μg/ml、约10至1000μg/ml、约10至750μg/ml、约10至500μg/ml、约10至250μg/ml、约20至1000μg/ml、约20至750μg/ml、约20至500μg/ml、约20至250μg/ml、约30至1000μg/ml、约30至750μg/ml、约30至500μg/ml、约30至250μg/ml的血浆抗体浓度。
本公开的药物组合物的毒性和治疗指数可在细胞培养物或实验动物中通过标准制药学程序确定，例如，用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)。毒性和与治疗有效剂量之间的剂量比率为治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。展现大治疗指数的组合物通常是优选的。
施用杂合ActRIIB配体陷阱药物组合物的给药频率取决于疗法的性质和所治疗的特定疾病。可以定期(诸如每周或每月)治疗受试者，直至达到期望的治疗结果。示例性的给药频率包括但不限于：无间断地每周一次；每隔一周地每周一次；每2周一次；每3周一次；无间断地每周一次，持续2周，随后每月一次；无间断地每周一次，持续3周，随后每月一次；每月一次；每隔一个月一次；每3个月一次；每4个月一次；每5个月一次；或每6个月一次，或每年一次。
组合疗法
如本文所用，提及本公开的杂合ActRIIB配体陷阱和一种或多种其他治疗剂时，术语“共施用”、“共施用的”和“与…组合”旨在意指，并且的确指代并包括以下：当此类组分一起配制成在基本上同时将所述组分释放至所述受试者的单一剂型时，将本公开的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白和一种或多种治疗剂的这种组合同时施用至需要治疗的受试者；当此类组分彼此分开配制成在基本上同时被所述受试者服用的单独的剂型，届时所述组分基本上同时释放至所述受试者时，将本公开的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白和一种或多种治疗剂的这种组合基本上同时施用至需要治疗的受试者；当此类组分彼此分开配制成以每次施用之间的显著的时间间隔被所述受试者在连续时间服用的单独的剂型，届时所述组分在基本上不同的时间释放至所述受试者时，将本公开的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白和一种或多种治疗剂的这种组合依次施用至需要治疗的受试者；以及，当此类组分一起配制成以受控方式释放所述组分的单一剂型，届时它们在相同和/或不同的时间同时、连续和/或重叠地释放至所述受试者时，将本公开的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白和一种或多种治疗剂的这种组合依次施用至需要治疗的受试者，其中每个部分可通过相同或不同的途径施用。
在另一方面，本公开涉及治疗受试者的肌肉萎缩疾病的方法，所述方法包括施用以下的组合：a)治疗有效量的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱；和b)第二剂。对于对使用单独的第二剂治疗是耐受性或难治性的肌肉萎缩疾病，该组合疗法可以是特别有效的。在各种实施方案中，第二剂选自生长激素；生长素释放肽；IGF1；胰岛素；泼尼松；皮质类固醇疗法；雄激素剥夺疗法；合成代谢类固醇；血管紧张素或血管紧张素受体的拮抗剂；炎性细胞因子诸如TNF-α、IL-6、IL-1及其受体的拮抗剂；以及肌生长抑制素、活化素A或TGF-β家族的另一成员及其受体的其他拮抗剂；二膦酸酯；RANKL抑制剂；过氧化物酶体增殖物激活受体的激动剂；β2激动剂；PGC-1α的激活剂；蛋白酶体抑制剂；癌症治疗剂；化疗剂；细胞疗法；干细胞疗法；基因疗法；基因靶向疗法；以及反义寡核苷酸疗法。
在各种实施方案中，组合疗法包括同时施用在同一药物组合物中或在单独的药物组合物中的杂合ActRIIB配体陷阱和第二剂组合物。在各种实施方案中，依次施用杂合ActRIIB配体陷阱组合物和第二剂组合物，即，在施用第二剂组合物之前或之后施用杂合ActRIIB配体陷阱组合物。
在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱组合物和第二剂组合物的施用是同时的，即，杂合ActRIIB配体陷阱组合物和第二剂组合物的施用时间段彼此重叠。
在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱组合物和第二剂组合物的施用是非同时的。例如，在各种实施方案中，在施用第二剂组合物之前终止杂合ActRIIB配体陷阱组合物的施用。在各种实施方案中，在施用杂合ActRIIB配体陷阱组合物之前终止第二剂组合物的施用。
活化素受体多肽
如本文所用，术语活化素II B型受体(ActRIIB)指具有登录号NP_001097.2的人活化素受体(本文中为SEQ ID NO:45)，及其变体。术语“野生型ActRIIB-ECD”是指ActRIIB的细胞外结构域，SEQ ID NO:45的氨基酸1至134(具有信号序列)或氨基酸19至134(无信号序列)(本文中称为SEQ ID NO:46)。术语活化素II A型受体(ActRIIA)是指具有登录号UniProtKB/Swiss-Prot P27037.1的人活化素受体(本文中为SEQ ID NO:47)，及其变体。术语“野生型ActRIIA-ECD”是指ActRIIA的细胞外结构域，SEQ ID NO:46的氨基酸1至135(具有信号序列)或氨基酸20至135(无信号序列)(本文中称为SEQ ID NO:48)。
可溶性杂合ActRIIB多肽
本公开的方法利用源自野生型ActRIIB-ECD和野生型ActRIIA-ECD的新型杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。该杂合可溶ActRIIB多肽通过在氨基酸水平上基于序列比对在两个截短的ActRII ECD结构域之间的相应位置处，用来自截短的野生型ActRIIA-ECD的氨基酸替换截短的野生型ActRIIB-ECD的一个或更多个氨基酸而被特别地工程化。一个或更多个氨基酸替换是为了提供如下的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的目的而特别地选择的：所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽与野生型ActRIIB-ECD多肽相比，表现出明显降低的BMP9中和作用，同时完全保留了强肌生长抑制素和活化素A中和作用。
在各种实施方案中，用于制备新型杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的ActRIIB的截短的细胞外结构域具有以下SEQ ID NO:1所示的110个氨基酸序列：
在各种实施方案中，用于制备新型杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的ActRIIA的截短的细胞外结构域具有以下SEQ ID NO:2所示的110个氨基酸序列：
在各种实施方案中，本公开的方法利用分离的新型杂合ActRIIB配体陷阱蛋白，所述陷阱蛋白包含新型杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，这些多肽保留肌生长抑制素和活化素A中和活性，但表现出显著降低的BMP9中和作用。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少一个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少两个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少三个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少四个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少五个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少六个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少七个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少八个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少九个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少十个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少十五个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少二十个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少二十五个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少三十个被另一种氨基酸取代，并且其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ IDNO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71和N72已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q64、E65、A68、T69、E70、E71和N72已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基A68、T69、E70、E71和N72已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基F58、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74和F84已被SEQ IDNO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基A68、T69、E70、E71、N72、Q74和F84已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29和L33已被SEQID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29和L33已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、L14、E15和S20已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、L14和E15已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L14和E15已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y36、S38和K51已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33和F58已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E70已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基F58已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基F58和E70已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、Q29、F58和E70已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、F58和E70已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28和E70已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y7、Y8、L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y36、S38、R40、S42、T45和K51已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q64和E65已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基F84已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28和F58已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33已被SEQID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65已被SEQID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、Q64、E65已被SEQ IDNO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、K51、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、L48、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、T45、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、T45、L48、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、T45、L48、K51、Q64、E65已被SEQ IDNO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q64、E65、F84已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R88、T90、H91、L92、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、R88、T90、H91、L92、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、K51、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、L48、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、T45、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基T45、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L48、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基K51、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基A68、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基A68、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E71、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基N72、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q74、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、Q29、A68、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q29、T69、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、Q29、K51、T69、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、Q29、L48、K51、T69E、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、T45、L48、K51、T69、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基Q29、L48、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ IDNO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、L33、Q70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L33、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、T45、L48、Q64、E65、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L33、T45、T69、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L33、L48、T69、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L33、T45、L48、E70、R88、T90、H91、L92、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、L48、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、T45、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基L48、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E28、L48、T79、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E71、N72、Q74、F84已被SEQ IDNO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
在各种实施方案中，杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基E26、E28、Q29、L33、F56、E68已被SEQ ID NO:2的相应位置中的氨基酸残基取代。
异源蛋白-Fc结构域
在另一方面，杂合ActRII配体陷阱包含杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽和至少一种异源蛋白，所述至少一种异源蛋白直接或通过接头序列与ActRIIB-ECD多肽附连以形成在本文称为杂合ActRIIB配体陷阱的融合蛋白。如本文所用，术语“融合蛋白”是指具有通过重组DNA技术附连的异源多肽的蛋白质。在各种实施方案中，异源蛋白选自但不限于多组氨酸标签、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、人血清白蛋白或Fc多肽或Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域是人IgG Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域源自SEQ ID NO:38所示的人IgG1重链恒定结构域序列。在各种实施方案中，Fc结构域是具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域源自SEQ ID NO:40所示的人IgG2重链恒定结构域序列。在各种实施方案中，Fc结构域是具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的Fc结构域。在各种实施方案中，Fc结构域源自SEQ ID NO:42所示的人IgG4重链恒定结构域序列。在各种实施方案中，Fc结构域是具有SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的Fc结构域。
接头
杂合ActRIIB杂合陷阱可任选地还包含“接头”或“铰链接头”序列。接头主要充当杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽和异源蛋白或其他类型的融合物之间或者两个或更多个杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽之间的间隔物。在各种实施方案中，异源蛋白通过接头或铰链接头肽与杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽附连。接头和/或铰链接头可以是相对不含二级结构的5、10、15、20、30、40或更多个氨基酸之间的人工序列。在各种实施方案中，接头包含选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸的氨基酸。在各种实施方案中，接头由大多数空间无位阻的氨基酸组成，诸如甘氨酸和丙氨酸，并且是聚甘氨酸(特别是(Gly)5、(Gly)8、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。在各种实施方案中，接头的G/S含量丰富(例如，接头中至少约60％、70％、80％、90％或更多的氨基酸是G或S。在各种实施方案中，接头具有(GGGGS(SEQ ID NO:44))n基序，其中n＝1-6。在本领域中已经广泛地描述了此类接头和铰链接头(参见例如US 8,410,043(Sun等人)，其出于教导此类接头的目的以引用方式并入本文)。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头和具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头用于将人IgG1Fc(SEQ ID NO:39)或人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至本公开的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
接头还可以是非肽接头。例如，可以使用烷基接头，诸如--NH--(CH2)s-C(O)--，其中s＝2-20。这些烷基接头可以进一步被任何空间无位阻的基团取代，所述基团诸如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。
杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的分子构型
应当理解，杂合ActRIIB配体陷阱的不同元件可以以与期望功能一致的任何方式排列。例如，可以将异源蛋白放置在杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的C末端，或可选地可以将杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽放置在异源结构域的C末端。杂合可溶性ActRII-ECD多肽结构域和异源结构域不需要邻接，并且可以在任一结构域的C-末端或N-末端或者在结构域之间包含另外的结构域或氨基酸序列(即包含本文所述的接头)。在图1中示出了新型ActRIIB配体陷阱的示例性分子构型。
编码杂合ActRIIB配体陷阱的合成DNA盒的示例性构型通常可描述为包含以下元件：1)置于N-末端的信号肽(或前导序列)，其可以是ActRIIB的天然信号肽(例如SEQ IDNO:49)或能够介导分泌蛋白的加工和分泌的任何替代信号肽(例如通过使用人免疫球蛋白轻链前导序列(SEQ ID NO:50)作为替代信号肽，可以实现CHO细胞中杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的有效分泌)；2)融合至信号肽序列的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽序列(例如SEQ IDNO:3-37或51-117中的任一个)；3)肽接头序列(例如SEQ ID NO:44)和铰链接头序列(SEQID NO:118)；以及4)通过肽/铰链接头融合至杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽序列的Fc结构域(例如SEQ ID NO:39、41或43)。
本公开的各种实施方案的实例包括但不限于表2中描述的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白。
表2
多核苷酸
在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码本公开的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的多核苷酸。主题核酸可以是单链或双链的。此类核酸可以是DNA或RNA分子。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、合成的DNA、通过PCR扩增的DNA以及它们的组合。编码ActRIIB多肽的基因组DNA从基因组文库获得，该基因组文库对许多物种是可得的。合成的DNA可从化学合成重叠的寡核苷酸片段然后组装片段以重构编码区和侧翼序列的部分或全部获得。RNA可从指导mRNA的高水平合成的原核表达载体，诸如使用T7启动子和RNA聚合酶的载体获得。cDNA从分离自表达ActRIIB的各种组织的mRNA制备的文库获得。本公开的DNA分子包括全长基因以及多核苷酸及其片段。全长基因还可以包括编码N-末端信号序列的序列。
此类核酸可用于例如制备新型杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的方法中。在各种实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:3-37或51-117所示多肽序列中的任一个，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:3-37或51-117所示多肽序列中的任一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，多核苷酸编码与SEQ ID NO:3-37或51-117所示多肽序列中的任一个至少90％相同的多肽，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，多核苷酸编码具有与SEQID NO:3-37或51-117所示多肽序列中的任一个至少95％相同的氨基酸序列的多肽，其中杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。在各种实施方案中，本公开的核酸序列可以是分离的、重组的、和/或与异源核苷酸序列融合、或在DNA文库中。
在各种实施方案中，本公开提供了在严格或中等条件下与本文所述的多核苷酸的多肽编码区杂交的核酸分子，其中编码的多肽包含SEQ ID NO:3-37或51-117所示的氨基酸序列，并且其中编码的多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。本领域普通技术人员将容易理解，促进DNA杂交的适当严格条件可以变化。例如，技术人员可以在约45℃下在6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)进行杂交，然后在50℃下用2.0X SSC洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从低严格度的50℃下的约2.0X SSC至高严格度的50℃下的约0.2X SSC之间选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从低严格条件下的约22℃的室温升高至高严格条件下的约65℃。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度可以保持不变，而另一变量改变。在一个实施方案中，本公开提供了在室温在6X SSC的低严格度条件下杂交，然后在室温在2X SSC洗涤的核酸。
在各种实施方案中，分离的核酸分子包含本文所述的多核苷酸，并且还包含编码本文所述的至少一种异源蛋白的多核苷酸。在各种实施方案中，核酸分子还包含编码本文所述的接头或铰链接头的多核苷酸。
在各种实施方案中，本公开的重组核酸可以与表达构建体中的一种或多种调控核苷酸序列可操作地连接。调控序列是本领域所认知的并且被选择以指导杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的表达。因此，术语调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性调控序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。通常，所述一种或更多种调控核苷酸序列可以包含但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活序列。本公开考虑本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或是组合多于一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体诸如质粒上，或者表达构建体可以插入染色体中。在各种实施方案中，表达构建体可以含有选择性标记基因以允许选择已转化的宿主细胞。选择标记基因在本领域中是公知的并且将随所用的宿主细胞而变化。
在本公开的在另一方面，在包含编码杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽并可操作地连接至至少一个调控序列的核苷酸序列的表达载体中提供主题核酸。术语“表达载体”是指用于从多核苷酸序列表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。适合在宿主细胞中表达的载体是容易获得的，并且使用标准重组DNA技术将核酸分子插入到载体中。此类载体可以包括多种表达控制序列，所述表达控制序列当被可操作地连接至DNA序列时控制该DNA序列的表达，并可以在这些载体中使用以表达编码杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的DNA序列。此类有用的表达控制序列包括例如SV40的早期启动子和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒介导的早期启动子、RSV启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达由T7RNA聚合酶指导的T7启动子、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶例如PhoS的启动子、酵母a-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子和已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列，以及它们的各种组合。应当理解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质的类型等因素。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由载体编码的任何其他蛋白质诸如抗生素标记物的表达。适于vActRIIB的表达的示例性表达载体是含有vActRIIB多核苷酸的pDSRa(描述于WO90/14363，以引用方式并入本文)及其衍生物，以及本领域已知或以下描述的任何另外的合适的载体。
通过将克隆的基因或其部分连接到适于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中，可以产生本公开的重组核酸。用于产生重组ActRIIB多肽的表达媒介物包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞诸如大肠杆菌中表达的pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒。
一些哺乳动物表达载体包含利于载体在细菌中增殖的原核序列以及在真核细胞中表达的一种或多种真核转录单元两者。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒诸如pBR322的序列修饰，以利于在原核细胞和真核细胞两者中的复制和抗药性选择。可选地，病毒诸如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)的衍生物或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)可用于蛋白质在真核细胞中的瞬时表达。以下在基因疗法递送系统的说明中可以找到其他病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例。在质粒的制备中以及在宿主生物体的转化中采用的各种方法是本领域熟知的。对于适合于原核细胞和真核细胞两者的其他表达系统以及一般的重组程序，参见Sambrook、Fritsch和Maniatis的Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)第16和17章。在某些情况下，可能需要通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(诸如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(诸如pAcUW1)以及pBlueBac衍生的载体(诸如含有B-gal的pBlueBac III)。
在各种实施方案中，载体将被设计用于在CHO细胞中产生主题杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，诸如Pcmv-Script载体(Stratagene,La Jolla,Calif.)、pcDNA4载体(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)和pCI-neo载体(Promega,Madison,Wis.)。将显而易见的是，主题基因构建体可用于引起主题杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽在增殖于培养物中的细胞中表达，例如以产生用于纯化的蛋白，包括融合蛋白或变体蛋白。
本公开还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包含编码一种或多种主题杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:3-37或51-117)的核苷酸序列。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，本公开的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母、或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞对于本领域技术人员是已知的。
因此，本公开还涉及产生主题杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的方法。例如，可以在适当的条件下培养用编码杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的表达载体转染的宿主细胞，以允许发生杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的表达。可以从含有杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的细胞和培养基的混合物中分泌和分离杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。可选地，可以将杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽保留在细胞质中或保留在膜级分中，并收获、裂解细胞和分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域熟知的。
本公开的多肽和蛋白质可以根据本领域技术人员所熟知的蛋白纯化技术来纯化。这些技术在一个层面上包括蛋白级分和非蛋白级分的粗分级。如果已经从其他蛋白质分离出肽多肽，则可使用色谱和电泳技术进一步纯化目标肽或多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。如本文所用，术语“分离的多肽”或“纯化的多肽”旨在指可与其他组分分离的组合物，其中多肽相对于其天然可获得的状态被纯化至任何程度。因此，纯化的多肽也指脱离其可天然存在的环境的多肽。一般来说，“纯化的”将指已经受分级以去除各种其他组分的多肽，并且所述组合物基本上保留其表达的生物活性。在使用术语“基本上纯化的”时，这种表示是指如下肽或多肽组合物，其中多肽或肽形成组合物的主要组分，诸如构成组合物中的约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、或约90％或更多的蛋白质。
适合用于纯化的各种技术对于本领域技术人员将是熟知的。这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀)等沉淀，或通过热变性，随后离心；色谱法，诸如亲和色谱法(蛋白A柱)、离子交换、凝胶过滤、逆相、羟磷灰石、疏水相互作用色谱法；等电子聚焦；凝胶电泳；以及这些技术的组合。如在本领域中通常已知的，认为进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍然导致制备基本上纯化的多肽的合适方法。
药物组合物
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载剂混合的分离的杂合可溶性ActRIIB多肽或杂合ActRIIB配体陷阱蛋白。此类药学上可接受的载剂是本领域普通技术人员所熟知并理解的，并且已被广泛描述(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro,编辑,Mack PublishingCompany,1990)。出于修改、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的目的，可以包含药学上可接受的载剂。此类药物组合物可影响多肽的物理状态、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。合适的药学上可接受的载剂包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其他有机酸)；膨胀剂(诸如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；小分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物(优选地氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。
药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液、可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其还可包含山梨糖醇或其合适的替代物。在本公开的一个实施方案中，可通过混合具有期望纯度的所选组合物与任选的配制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences，同上)来以冻干饼或水性溶液形式制备组合物以供储存。此外，可以使用合适的赋形剂诸如蔗糖将治疗组合物配制成冻干物。本领域普通技术人员将根据例如预期的施用途径、递送形式和期望的剂量确定最佳药物组合物。
当设想肠胃外施用时，治疗药物组合物可以为在药学上可接受的媒介物中包含期望ActRIIB多肽的无热原、肠胃外可接受的水性溶液的形式。特别适于肠胃外注射的媒介物为多肽于其中被配制成适当防腐的无菌等渗溶液的无菌蒸馏水。在各种实施方案中，适于注射施用的药物制剂可以配制在水性溶液中，优选在生理上相容的缓冲液诸如汉克斯溶液、格林氏溶液或生理缓冲盐水中。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。另外，可以将活性化合物的悬浮液制备成适当的油性注射悬浮液。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度并允许制备高浓缩溶液的剂。
在各种实施方案中，可以使用胶体分散系统配制治疗药物组合物以用于靶向递送。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。可用于脂质体生产的脂质的实例包括磷脂酰化合物，诸如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。示例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。脂质体的靶向还可能基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性并且是本领域已知的。
在各种实施方案中，考虑药物组合物的口服施用。以这个方式施用的药物组合物可与或不与惯常用于混配固体剂型诸如片剂和胶囊的那些载剂一起配制。在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉末、颗粒等)中，本公开的一种或更多种治疗化合物可以与一种或多种药学上可接受的载剂(诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙)和/或以下中的任一者混合：(1)填充剂或增充剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐及碳酸钠；(5)溶液延迟剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及它们的混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂及丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。在使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充和硬填充明胶胶囊中，类似类型的固体组合物还可用作填充剂。用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有本领域通常使用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄基醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及它们的混合物除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、增甜剂、调味剂、着色剂、增香剂和防腐剂。
在各种实施方案中，考虑将药物组合物局部施用至皮肤或施用至粘膜。局部制剂还可以包含已知作为皮肤或角质层渗透增强剂有效的多种剂中的一种或更多种。这些剂的实例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲基亚砜和氮酮。还可以包含另外的剂以使制剂在化妆品上可接受。这些剂的实例是脂肪、蜡、油、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。还可以包含角质层分离剂，诸如本领域已知的那些角质层分离剂。实例是水杨酸和硫磺。用于局部或透皮施用的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载剂混合，并与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除本公开的主题化合物(例如杂合ActRIIB配体陷阱)之外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂可以含有赋形剂，诸如动物和蔬菜脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或它们的混合物。
设想用于本文的其他药物组合物包括在持续或控制递送的制剂中包含多肽的制剂。用于配制多种其他持续或控制递送工具诸如脂质体载剂、生物可侵蚀的微粒或多孔珠和贮库型注射剂的技术也是本领域技术人员所已知的。
待在治疗上采用的药物组合物的治疗有效量将例如取决于治疗情形和目标。本领域技术人员将了解，适用于治疗的剂量水平将因此部分地视递送的分子、使用多肽所针对的适应症、施药途径以及患者的尺寸(体重、体表或器官尺寸)和状况(年龄和总体健康状况)而变化。因此，临床医生可以滴定该剂量并且修改施用途径以获得最佳治疗效果。根据上述因素，典型的剂量可以在约0.1mg/kg至多至约100mg/kg或更高的范围内。多肽组合物可优选地静脉内注射或施用。长效药物组合物可以取决于特定制剂的半衰期和清除速率每三天至每四天、每周、或每两周施用。给药频率将取决于使用的制剂中的多肽的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现期望的效果的剂量。因此，组合物可以作为单剂量施用，或作为多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)随时间施用，或作为连续输注施用。常规地进行适当剂量的进一步改进。适当的剂量可以通过使用适当的剂量-反应数据来确定。
药物组合物的施用途径是依照已知方法，例如口服；通过由静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内途径、髓内、囊内、心室内、透皮、皮下或腹膜内达成的注射；以及鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式；通过持续释放系统或通过植入装置。当期望时，组合物可通过快速浓注施用，或通过输注连续施用，或通过植入装置施用。可选地或另外地，组合物也可经由植入其上已吸收或囊封期望分子的膜、海绵或另一合适材料来局部施用。当使用植入装置时，所述装置可植入到任何适合的组织或器官中，并且期望分子的递送可经由扩散、定时释放推注或连续施用来达成。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的肌肉萎缩的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的骨病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的自身免疫/炎性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的心血管疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的癌细胞的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的肾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的厌食症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的肝病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种诱导受试者的干细胞生长用于组织修复或器官再生的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的贫血的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的疼痛的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
在各种实施方案中，本公开提供了一种用于治疗受试者的老化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的与药学上可接受的载剂混合的杂合ActRIIB配体陷阱，其中杂合ActRIIB配体陷阱包含可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在各种实施方案中，具有SEQID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将人IgG4Fc(SEQ ID NO:43)连接至药物组合物的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
给出以下实施例以更充分地说明本公开，但并不被理解为限制本公开的范围。
实施例1
可以根据本领域技术人员熟知的重组DNA技术制备本公开的多肽。在此实施例中，一般性地描述了杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的制备。
通过将人ActRIIB细胞外结构域内的选择性位置处的多个氨基酸残基用基于在氨基酸水平上的序列比对的相应位置处的源自人ActRIIA细胞外结构域的氨基酸残基取代，设计各种杂合ActRIIB-ECD多肽。通过使用定点诱变生成编码杂合ActRIIB-ECD多肽的DNA表达盒，随后通过在框内在5’端放置编码人免疫球蛋白轻链信号肽的cDNA片段并在3’端放置编码肽接头然后是人Fc的DNA片段，将所述DNA表达盒工程化为Fc融合蛋白构建体。
实施例2
在此实施例中，一般性地描述了如图1中所示构造的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的制备。
将编码各种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的合成DNA盒克隆到Freedom pCHO 1.0和pcDNA3.1表达载体(Life Technologies)中，所述合成DNA盒各自含有信号肽前导序列(SEQID NO:49或50)、来自实施例1的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽(或野生型ActRIIB-ECD序列)、肽接头序列(SEQ ID NO:44)、铰链接头序列(SEQ ID NO:118)和Fc结构域序列(SEQ IDNO:39或41或43)。
对于稳定转染，使用FreeStyle MAX试剂(Life Technologies)将编码各种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的pCHO 1.0表达载体各自转染到CHO-S细胞中。转染后48小时，使细胞在37℃下在CO2震荡培养箱中在包含嘌呤霉素和甲氨蝶呤(MTX)选择的无血清CDFortiCHO培养基中生长持续3-7周。在包含30M嘌呤霉素和500nM氨甲喋呤的条件下，直到细胞超过90％的生存力才产生稳定的库。按照制造商的推荐方案(Life Technologies)通过稀释克隆产生稳定的克隆。对于瞬时转染，使用ExpriFectamine293转染试剂(LifeTechnologies)将编码各种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的pcDNA3.1表达质粒各自转染到Expi293细胞中。
转染后，使稳定转染的CHO-S细胞在37℃下在CO2震荡培养箱中在补充有葡萄糖的完全无血清CD FortiCHO培养基中生长多至14天。收集条件培养基用于蛋白纯化。在37℃下在CO2震荡培养箱中在Expi293表达培养基中培养瞬时转染的Expi293细胞多至7天，并收集培养基用于蛋白纯化。
对于纯化，通过使用AKTA FPLC(GE Healthcare)经由Hitrap蛋白A高性能柱纯化包含杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的条件培养基。将杂合ActRIIB配体陷阱蛋白用乙酸缓冲液(pH 3.6)洗脱，经1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，然后经历缓冲液交换。通过使用分光光度计(Beckman)测定蛋白质浓度。
实施例3
在此实施例中，评估了七种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的肌生长抑制素和BMP9结合活性。
起初使用Octect Red(ForteBio)分析各种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的肌生长抑制素和BMP9结合活性。以最大载量将纯化的蛋白质或条件培养基单独地装载至AHC生物传感器。在基线洗涤阶段之后，将传感器分别暴露于10nM肌生长抑制素或BMP9中以进行缔合步骤，然后进行解离步骤。所有实验均在1,000rpm震荡下进行。使用ForteBio软件分析结合活性，其中使用比率Kd/Ka计算KD。
结果
检查杂合ActRIIB配体陷阱蛋白对肌生长抑制素和BMP9的结合活性以与野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白进行比较。结果表明，与野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白相比，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白表现出对BMP9的结合亲和力明显降低。许多杂合ActRIIB配体陷阱蛋白显示出显著降低的BMP9结合亲和力，比野生型ActRIIB-ECD-Fc蛋白的BMP9结合亲和力弱超过100倍，同时它们保留了与野生型ActRIIB-ECD-Fc蛋白相似的强肌生长抑制素结合亲和力。通过OctetRed分析获得的初步结合数据的总结显示在表3中。
表3
ActRIIB-ECD多肽 肌生长抑制素结合 BMP9结合
野生型 +++ +++
AG-0003(SEQ ID NO:5) +++ ++
AG-0005(SEQ ID NO:7) +++ +
AG-0006(SEQ ID NO:8) +++ +
AG-0007(SEQ ID NO:9) +++ +
AG-0008(SEQ ID NO:10) +++ ++
AG-0014(SEQ ID NO:16) +++ N.D.
AG-0027(SEQ ID NO:29) +++ N.D.
+++KD<10-8M
++KD:10-6-10-7M
+KD 10-4-10-6M
N.D.没有可检测出的结合
通过动力学排除测定(KinExA)(Sapidyne Instruments,Inc.)分析AG-0014和AG-0027。使用Sapidyne Instruments推荐的实验程序，将20-30μg/ml的肌生长抑制素、活化素A或BMP-9分别偶联至NHS激活的琼脂糖4快速流动珠(GE Healthcare)。每种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的浓度保持恒定，因为所述配体经2.5倍系列稀释滴定。通过在室温下孵育多至24小时来使溶液达到平衡，随后使其流过KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments)上用配体包被的琼脂糖凝胶珠预先填充的流动池。通过Alexa Fluor 647标记的山羊抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)检测捕获到珠上的游离杂合ActRIIB配体陷阱蛋白。使用KinExA Pro软件(Sapidyne Instruments)计算配体结合亲和力值(KD)。
结果
通过KinExA分析获得的初步结合数据的总结显示在表4中。数据表明，与野生型ActRIIB-Fc相似，两种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白具有在个位数pM范围的高肌生长抑制素和活化素A亲和力。然而，与表现出在个位数pM范围的强BMP9结合亲和力的野生型ActRIIB-Fc相反，两种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白对BMP9未显示出可检测出的结合。
表4
分子 肌生长抑制素 活化素A BMP9
K<sub>D</sub>(pM) K<sub>D</sub>(pM) K<sub>D</sub>(pM)
WT ActRIIB-Fc 5.06pM 1.38pM 4.25pM
AG-0014(SEQ ID NO:16) 8.75pM 0.357pM 无结合
AG-0027(SEQ ID NO:29) 7.87pM 1.09pM 无结合
实施例4
在此实施例中，描述了肌生长抑制素/活化素A信号传导测定和BMP9信号传导测定，所述测定分别用于定量杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的肌生长抑制素/活化素A阻断活性和BMP9阻断活性。
为了评估肌生长抑制素/活化素A信号传导，将具有12个重复的CAGA序列的报告基因构建体(Dennler等人,EMBO 17:3091-3100,1998)克隆到pGL3-luc报告基因载体(Promega)中。将工程化的pGL3-CAGA12-luc载体稳定地转染到C2C12细胞中，以生成能够感应肌生长抑制素或活化素A介导的Smad3/4信号传导的萤光素酶报告基因细胞系C2C12-CAGA-luc。为了测量肌生长抑制素和活化素A中和活性，将4nM重组肌生长抑制素或活化素A与增加浓度的各种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白以及野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白(作为对照)一起在室温下预孵育1小时。随后，将反应混合物加入C2C12-CAGA-luc细胞培养物中。在37℃下在CO2培养箱中孵育5小时后，通过使用LuminoSkan Ascent(Thermo Scientific)测量C2C12-CAGA-luc报告基因培养物的萤光素酶活性。
在已经用包含感应Smad1/5/8信号传导的BMP响应元件(BRE)的萤光素酶报告基因稳定转染的C2C12细胞中测试BMP9信号传导(Korchynski等人,J.Biol.Chem.277:4883-4891,2002)。具体地，合成双重复BMP响应元件(Briter等人,PLoS One,2012)并将其克隆到pGL3-luc载体(Promega)中。然后将pGL3-2XBRE-luc载体稳定转染到C2C12细胞中。使用稳定转染的报告基因细胞系C2C12-BRE-luc定量BMP9介导的Smad1/5/8信号传导。为了测量BMP中和活性，将4nM BMP9与增加浓度的各种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白以及野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白(作为对照)一起在室温下预孵育1小时。然后将反应混合物加入C2C12-BRE-luc细胞培养物中。在37℃下在CO2培养箱中孵育5小时后，通过使用LuminoskanAscent(Thermo Scientific)测量C2C12 BRE-luc报告基因培养物的萤光素酶活性。
结果
结果显示，与野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白相比，两种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白保留了强肌生长抑制素和活化素A中和活性，但BMP9中和活性明显降低(参见图2)。图2示出两种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白AG-0003(SEQ ID NO:5)和AG-0005(SEQID NO:7)与野生型对照ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白在基于细胞的针对肌生长抑制素、活化素A和BMP9的中和活性上的比较。
实施例5
在此实施例中，实施例4中描述的肌生长抑制素/活化素A信号传导测定和BMP9信号传导测定分别用于定量以下杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的肌生长抑制素/活化素A阻断活性和BMP9阻断活性：AG-0003(SEQ ID NO:5)、AG-0014(SEQ ID NO:16)、AG-0023(SEQ IDNO:25)、AG-0024(SEQ ID NO:26)、AG-0025(SEQ ID NO:27)、AG-0027(SEQ ID NO:29)、AG-0028(SEQ ID NO:30)、AG-0029(SEQ ID NO:31)和AG-0035(SEQ ID NO:37)。
结果
结果显示，与野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白相比，这些杂合ActRIIB配体陷阱蛋白中的若干种保留了强肌生长抑制素和活化素A中和活性，但BMP9中和活性明显降低。图3示出两种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白AG-0014和AG-0027与野生型对照ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白在基于细胞的针对肌生长抑制素、活化素A和BMP9的中和活性上的比较。
并且如表5和表6中所显示的，与野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白(WT ActRIIB-Fc)相比，各种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白在基于细胞的Smad1/5/8BRE-luc报告基因测定中显示出显著降低的BMP9中和活性，而在基于细胞的Smad2/3CAGA-luc报告基因测定中保留了对肌生长抑制素、活化素A和活化素B的强中和活性。表5示出AG-0014和AG-0027与WT ActRIIB-Fc在基于细胞的针对肌生长抑制素、活化素A、活化素B和BMP9的中和的IC50值上的比较。表6概述了几种示例性杂合ActRIIB配体陷阱蛋白与WT ActRIIB-Fc在BMP9和肌生长抑制素中和活性上的比较。与WT ActRIIB-Fc相比，杂合蛋白AG-0003、AG-0004、AG-0005、AG-0014、AG-0023、AG-0024、AG-0025、AG-0027和AG-0028显示出显著减少的BMP9中和活性或几乎无BMP9中和活性(另参见图10)；AG-0003、AG-0005、AG-0014和AG-0027保留了完全的肌生长抑制素中和活性，而AG-0004、AG-0023、AG-0024、AG-0025和AG-0028表现出肌生长抑制素中和活性的丧失(另参见图11)。总之，这些结果证明了各种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白优先阻断肌生长抑制素/活化素介导的Smad2/3信号传导，最小地影响或不影响BMP9介导的Smad1/5/8信号传导的能力。
表5
N.D.：没有可检测出的中和活性
表6
++++：完全中和活性；+++：部分中和活性；++：弱中和活性；+：非常弱的中和活性；+/-：很少或无中和活性；-：无中和活性
实施例6
在此实施例中，在分别用PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc、AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)以10mg/kg的剂量每周一次皮下注射的9周龄雄性C57Bl/6小鼠中评估对体重和肌肉质量的影响。在第0天、第5天、第12天和第18天记录体重。每组n＝6/8。体重改变的值计算为从第0天的基线的重量增加的百分比。在最终的尸体剖检期间，解剖来自每只动物的单独的腓肠肌并称重。将值表示为每个处理组中的平均腓肠肌质量与媒介物组的平均腓肠肌质量相比的增加百分比。如图4和图5以及表7中所示出的，施用两种示例性杂合配体陷阱蛋白中的每一种能够以与野生型ActRIIB-Fc相似的方式明显增强小鼠的体重增加。
表7
从基线的体重增加
如图5和表8所示出的，分别施用两种示例性杂合配体陷阱蛋白AG-0014和AG-0027能够以与野生型ActRIIB-Fc相似的方式明显增加小鼠的肌肉质量。
表8
与媒介物相比的肌肉质量增加
实施例7
在此实施例中，在分别用PBS(媒介物)、野生型ActRIIB-Fc、AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)以10mg/kg的剂量每周一次处理的8周龄雄性BalbC小鼠中评估对小鼠腹腔、小鼠睾丸和小鼠肺组织中伊文思蓝渗透性的影响。在处理后2周，经由尾静脉向每组动物(n＝4)中注射200μl伊文思蓝染料(在pH7.2的PBS中的0.5％)。在伊文思蓝染料注射后90min进行尸体剖检。如分别在图6-图8中标记的，显示了每组的以外科手术方式暴露的腹腔、解剖的睾丸器官和解剖的肺组织的代表性图像。蓝色表示血管的渗漏。将睾丸和肺组织称重，然后单独地置于含有甲酰胺的小瓶中，以提取伊文思蓝染料。在55℃下孵育24小时后，将样品离心。使用分光光度计在610nm的波长下测量每个样品的水相的吸光度。在图9中显示了在不同处理组中，每mg湿肺组织(左图)和睾丸组织(右图)的渗出的伊文思蓝染料的量。
重要的是，如图6-图9中所示出的，在处理的动物中在评估的所有组织中，施用两种示例性杂合配体陷阱蛋白与野生型ActRIIB-Fc蛋白相比明显地降低了血管渗漏的水平。
实施例8
进行自动ELISA分析以进一步表征与野生型ActRIIB ECD-Fc和野生型ActRIIAECD-Fc相比，不同浓度的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白的BMP9结合。如图12所显示的，数据显示，与WT ActRIIB-Fc或WT ActRIIA-Fc相比，两种示例性杂合蛋白AG-0014和AG-0027分别表现出大大降低的BMP9结合。这些数据表明，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白具有不同于WTActRIIB-Fc和WT ActRIIA-Fc的明显的BMP9结合选择性。
实施例9
在此实施例中，评估了杂合ActRIIB配体陷阱蛋白AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)与基准野生型ActRIIB-Fc之间的差异，特别提及了它们对雌性129S1/SvlmJ小鼠的甲床的血管完整性和出血的潜在影响。
将24只年轻成年雌性129S1/SvlmJ小鼠(Jackson Laboratory)分成4个实验组(每组n＝6)，随后使用如下表9中所显示的给药方案分别用媒介物(PBS)或重复高剂量的野生型ActRIIB-Fc(WT)AG-0027和AG-0014处理。
表9
组(n＝6) 化合物 剂量 频率 持续时间 途径
1 媒介物(PBS) - 每周两次 4周 SC
2 WT-ActRIIB-Fc 30mg/kg 每周两次 4周 SC
3 AG-0027 30mg/kg 每周两次 4周 SC
4 AG-0014 30mg/kg 每周两次 4周 SC
在4周的处理后，将每只动物置于透明底容器中，并使用倒置显微镜检查爪子的甲床中的任何出血迹象。
如图13所显示的，对总体形态的显微镜检查显示，在已用重复高剂量的野生型ActRIIB-Fc(WT-ActRIIB-Fc)处理的6只129S1/SvlmJ小鼠的每一只中，几乎所有爪子的甲床都有明显的出血迹象(图13，第二张图)。相反，在已用重复高剂量的两种杂合ActRIIB配体陷阱蛋白中的任一种处理的129S1/SvlmJ小鼠中未观察到爪子的甲床出血的迹象。在杂合ActRIIB配体陷阱蛋白处理的小鼠中爪子的甲床的形态看起来与媒介物处理的对照动物的形态相似。这些发现表明基准化合物野生型ActRIIB-Fc破坏了脉管系统并导致甲床出血，而杂合ActRIIB配体陷阱蛋白不干扰血管稳态并维持甲床中正常的血管完整性。
总的来说，本实施例的结果证明每周两次持续4周以30mg/kg SC施用重复高剂量的WT-ActRIIB-Fc致使129S1/SvlmJ雌性小鼠的爪子的甲床和布氏腺(Brunner’s gland)中出现明显的出血迹象。相反，用AG-0027或AG-0014进行4周的重复高剂量处理并未在129S1/SvlmJ雌性小鼠的甲床中引起出血迹象。因此，杂合ActRIIB配体陷阱分子并未像野生型ActRIIB-Fc那样对血管完整性产生负面影响。这些发现证明，杂合ActRIIB配体陷阱分子与野生型ActRIIB-Fc在体内选择性方面显著不同，并且不同于破坏脉管系统的野生型ActRIIB-Fc，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白维持正常的脉管系统完整性而不干扰血管稳态。因此，借助于优越的体内选择性和体内功效(参见下面的实施例)，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白相比野生型ActRIIB-Fc或任何相似的前代分子在安全性和功效方面显然提供了独特的治疗优势。
实施例10
在此实施例中，评估了AG-0027(SEQ ID NO:29)在增强肌肉质量和骨密度方面的体内功效以及AG-0027在睾丸切除的C57BL/6小鼠中逆转雄激素剥夺诱导的肌肉萎缩和骨丢失的能力。
使用如下表10所显示的给药方案将媒介物(PBS，pH7.4)或AG-0027皮下注射到18只10周龄的雄性C57BL/6小鼠(包括6只正常对照小鼠和12只睾丸切除的(ORX)小鼠(Charles River Laboratory)中：
表10
组 小鼠 n 处理 剂量 频率 途径 持续时间
1 正常 6 媒介物 - 2X/周 SC 6周
2 ORX 6 媒介物 - 2X/周 SC 6周
3 ORX 6 AG-0027 10mg/kg 2X/周 SC 6周
在整个6周的处理期间，每周记录两次纵向体重。在第42天，通过CO2窒息将小鼠安乐死。从每只动物解剖组织，包括瘦胴体、心脏和单独的后肢肌肉(腓肠肌、四头肌和比目鱼肌)以及股骨和腰椎。使用数字天平对瘦胴体、心脏和单独的后肢肌肉对(左和右)进行称重，并记录值。使用微CT成像系统通过高分辨率微计算机断层扫描(微CT)分析骨组织，包括来自每只动物的股骨远端和第四腰椎。基于对每组的6个股骨和腰椎骨样品的连续微CT扫描计算股骨远端和第四腰椎的骨体积(BV/TV，％)、骨小梁数量(Tb.N，mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)和骨小梁分离度(Tb.Sp，mm)。
如图14所显示的，体重数据(左图)表明与正常对照C57BL/6小鼠相比，ORX C57BL/6小鼠的体重明显降低。在一周的处理内，AG-0027使ORX小鼠体重减轻完全逆转(左图)，并且AG-0027施用引起与媒介物处理的ORX小鼠和正常对照小鼠相比快速的、持续的且统计学显著的体重增加(参见右图)。
图15显示了单独的后肢肌肉质量和瘦胴体重量的改变。数据表明，与正常对照组相比，媒介物处理的ORX组的后肢肌肉质量显著损失了9％-13％，且瘦胴体质量损失了近14％。相比之下，与媒介物处理的ORX组相比，AG-0027处理的ORX组显示后肢肌肉质量明显增加了22％-47％，且瘦胴体质量明显增加了近37％；而且与正常对照组相比，后肢肌肉质量显著增加了11％-28％，且瘦胴体质量显著增加了18％。值得注意的是，AG-0027不仅完全逆转了ORX小鼠的肌肉萎缩，它还在处理的ORX小鼠中引起了超过正常对照组水平的强烈的肌肉增加。在媒介物处理的ORX组中，存在快抽搐(即腓肠肌和四头肌)和慢抽搐(即比目鱼肌)肌肉的显著损失，AG-0027处理有效地逆转了ORX小鼠中这两种肌肉类型的损失(参见图15)。这些发现证明AG-0027对肌肉生长具有有效的体内功效，并且能够非常好地逆转肌肉萎缩。
图16和图17还显示了正常对照小鼠、媒介物处理的ORX小鼠和AG-0027处理的ORX小鼠中的股骨远端(图16)和第四腰椎(图17)的骨密度的微CT分析结果。如图18所显示的，与正常对照小鼠相比，ORX小鼠显示出明显的股骨远端骨质量的损失，股骨远端的骨体积分数(BV/TV，％)和骨小梁数量(Tb.N，mm-1)统计学显著地降低了>86％且骨小梁分离度(Tb.Sp，mm)明显增加了144％；然而，用AG-0027处理ORX小鼠使骨体积分数(BV/TV，％)显著增加了726％，骨小梁数量(Tb.N，mm-1)显著增加了667％且骨小梁分离度(Tb.Sp，mm)降低了51％，从而完全逆转了由雄激素剥夺引起的ORX小鼠股骨远端骨密度的损失。此外，如微CT数据所显示的，AG-0027处理使ORX小鼠股骨远端的骨小梁厚度显著增加至超过正常小鼠中观察到的正常对照水平11％。如图17所显示的，睾丸切除术诱导的雄激素剥夺导致ORX小鼠腰椎中骨质量的明显损失，这被AG-0027处理完全逆转(参见图17)。具体地，与正常对照小鼠相比，媒介物处理的ORX小鼠显示出第四椎骨的骨体积分数(BV/TV，％)和骨小梁数量(Tb.N，mm-1)统计学显著地降低了大约50％，而且(Tb.Sp，mm)也统计学显著地降低了33％；然而，用AG-0027处理ORX小鼠使腰椎骨体积分数显著增加了148％，腰椎骨小梁数量显著增加了110％且腰椎骨小梁分离度(Tb.Sp，mm)降低了23％，从而完全改善了由雄激素剥夺引起的ORX小鼠腰椎骨密度的明显损失。此外，AG-0027处理使ORX小鼠腰椎的骨小梁厚度显著增加至超过正常小鼠中观察到的正常对照值19％。这些数据证明AG-0027具有有效的体内骨合成代谢作用，并且AG-0027处理在逆转骨丢失方面非常有效。
总之，该实施例中ORX小鼠的数据显示皮下施用AG-0027使得体重、肌肉质量和骨质量显著增加，并完全逆转由雄激素剥夺引起的深度肌肉萎缩和骨丢失。显著的体内肌肉和骨合成代谢功效证明AG-0027作为下一代治疗剂为治疗各种肌肉和骨病症提供了强大的治疗潜力。
实施例11
糖尿病是一个在全球范围内正在接近流行病比例的主要的公共健康问题。已经表明，通过运动增加肌肉质量和功能可以改善胰岛素敏感性并改善糖尿病状况。前述实施例中的数据清楚地确定了杂合ActRIIB配体陷阱诸如AG-0027(SEQ ID NO:29)能够通过选择性拮抗肌生长抑制素/活化素-Smad2/3信号传导通路而强烈增强肌肉生长和肌肉再生。在此实施例中，使用用AG-0027或媒介物处理的糖尿病小鼠检查肌肉生长对葡萄糖代谢的影响。
用增加剂量(多至30mg/kg)的AG-0027或媒介物(PBS，pH7.4)处理纯合db/db糖尿病小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)10或12周，并将杂合db/db小鼠用作非糖尿病对照(每组n＝6)。检查食物摄入量、水消耗量、24小时尿量、空腹血糖和体重的改变。在研究结束时，用CO2将小鼠安乐死。收集血液样品并使用可商购获得的测定试剂盒测量血清胰岛素、HbA1c、脂联素(adeponectin)水平。通过尸体剖检分析确定身体组成，包括腹部脂肪、肌肉质量和棕色脂肪质量。用H&E染色和油红O染色在组织学上检查肝组织。
图18显示了AG-0027处理对糖尿病db/db小鼠的食物摄入量、水消耗量、24小时尿量和空腹血糖水平的影响。皮下施用杂合ActRIIB配体陷阱蛋白AG-0027使糖尿病db/db小鼠中的食物摄入量、水消耗量、24小时尿量和空腹血糖水平显著地标准化。因此，数据表明db/db糖尿病小鼠肌中生长抑制素/活化素-Smad2/3信号传导的药理学阻断能够改善代谢功能障碍，因为发现用杂合ActRIIB配体陷阱蛋白进行处理可有效减少食物摄入量和水消耗量，降低血糖水平，并减少24小时尿量。该处理还改善了db/db小鼠的脂肪肝。因此，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白如AG-0027似乎为包括糖尿病、糖尿病性肾病、代谢综合征、肥胖症和脂肪肝在内的代谢疾病的治疗提供了治疗潜力。
实施例12
在此实施例中，评估了在C57Bl/6小鼠中与作为基准的野生型ActRIIB-Fc(WT-ActRIIB-Fc)相比，AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)对体重增加和肌肉生长的体内功效。
通过分别单次注射10mg/kg的杂合陷阱A(AG-0027；SEQ ID NO:29)、杂合陷阱B(AG-0014；SEQ ID NO:16)和野生型ActRIIB-Fc(WT-ActRIIB-Fc)或通过单次注射媒介物(PBS)皮下处理7周龄雌性C57BL/6小鼠(每组n＝6)。单次注射后多至14天记录的体重显示，与WT-ActRIIB-Fc相比，AG-0027和AG-0014处理引起同样强烈的体重增加(图19)。在第14天进行最终的尸体剖检分析，并且数据证明用AG-0014和AG-0027处理使所检查的三种单独的后肢肌肉(包括腓肠肌、四头肌和比目鱼肌)质量以与基准WT-ActRIIB-Fc相同水平的显著增加(图20)。这些数据证明，与野生型ActRIIB-Fc相比，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白如AG-0014和AG-0027能够展示出对肌肉生长的完全体内功效。
实施例13
在此实施例中，在C57Bl/6小鼠中评估了AG-0014(SEQ ID NO:16)和AG-0027(SEQID NO:29)在增强体重增加和骨骼肌生长中的剂量依赖性体内功效。
分别以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg用单次递增剂量的杂合陷阱A(AG-0027；SEQ IDNO:29)和杂合陷阱B(AG-0014(SEQ ID NO:16)皮下处理6周龄雌性C57BL/6小鼠。在注射后多至8天记录PBS处理和杂合陷阱处理的小鼠的体重和从基线的体重改变。体重数据证明，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白AG-0014和AG-0027能够以剂量依赖性方式刺激体重增加(图21)。后肢肌肉重量的最终的尸体剖检分析进一步证明，用AG-0014或AG-0027处理以剂量依赖性方式使腓肠肌质量(A)和四头肌质量(B)统计学显著地增加。这些数据显示，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白如AG-0014和AG-0027能够以剂量依赖性方式刺激肌肉生长。
实施例14
肌营养不良是一组使人高度衰弱的疾病，导致进行性的虚弱和肌肉质量损失以及骨脆性。前述实施例中的数据清楚地确定了杂合ActRIIB配体陷阱蛋白诸如AG-0014(SEQID NO:16)和AG-0027(SEQ ID NO:29)能够在MDX小鼠(杜兴氏肌营养不良疾病模型)中通过选择性拮抗肌生长抑制素/活化素-Smad2/3信号传导通路而强烈增强肌肉生长、肌肉再生和骨形成。在此实施例中，评估了AG-0014和AG-0027治疗肌营养不良的治疗潜力。
4周龄雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(mdx)和年龄相匹配的C57BL/10ScSn野生型小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)。将mdx小鼠根据其体重分成体重平衡组，随后用AG-0027(n＝8)以10mg/kg的剂量或用无菌PBS注射液(n＝8)每周皮下注射一次，持续12周。将年龄相匹配的C57BL/10ScSn小鼠(n＝6)用作未处理的野生型对照。每周纵向称重小鼠两次，并在研究开始(第1周)和研究结束(第12周)时确定身体组成。通过将动物置于水平网格上并使其远离实验者，通过使用动物前肢利用BIOSEB的握力计(Bioseb)每周评定前肢握力。在研究结束时，使用CO2将动物安乐死，收集单独的组织(包括瘦胴体、四头肌、腓肠肌、比目鱼肌和膈肌)并称重。通过心脏穿刺从所有实验小鼠收集血清样品，以使用Pointe Scientific肌酸激酶测试试剂盒(Fisher Scientific)定量肌酸激酶(CK)水平。数据表明杂合陷阱蛋白(AG-0027和AG-0014)有效地增强了MDX小鼠的体重增加、肌肉质量和握力(图24和图25)。如图24所显示的，皮下施用杂合陷阱蛋白(AG-0027和AG-0014)使MDX小鼠的体重以统计学显著的方式持续增加。该处理使MDX小鼠的后肢肌肉(腓肠肌、比目鱼肌和四头肌)的质量明显且统计学显著地增加，超过媒介物处理的对照18％-36％(参见图25)。此外，该处理使MDX小鼠的握力显著增加了47％-56％。该处理还使mdx小鼠的血清CK水平显著且统计学显著地降低(参见图27)，表明该处理改善了肌肉修复并减少了肌肉损害。此外，微CT分析显示，该处理使MDX小鼠的股骨远端的骨小梁骨体积增加了168％，腰椎的骨小梁骨体积增加了48％(参见图28和图29)。因此，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白诸如AG-0014和AG-0027能够在MDX小鼠中促进肌肉生长，增加肌肉强度，改善肌肉修复并增强骨密度。总之，这些数据表明杂合ActRIIB配体陷阱蛋白诸如AG-0014和AG-0027具有对抗肌营养不良(包括但不限于杜兴氏肌营养不良)的治疗潜力。
实施例15
活化素(活化素A、活化素B和活化素AB)在许多炎性疾病状态中上调。在循环中升高的活化素在炎症中发挥重要作用。在此实施例中，使用内毒素血症小鼠模型检查了AG-0027(SEQ ID NO:29)的抗炎作用，其中确定了AG-0027减轻由脂多糖(LPS)诱导的促炎细胞因子诱导和死亡率的能力。
为了检查血清促炎细胞因子水平，将4周龄雄性BALB/c小鼠(Charles RiverLaboratory)随机分成3组(n＝8)以接受媒介物(PBS pH 7.4)或AG-0027处理。对于基线控制，将第一组未处理的小鼠用CO2处死，并分析基础血清细胞因子水平。将第二组和第三组在LPS免疫前1小时给予一次AG-0027(20mg/kg)或媒介物皮下注射。然后在1小时后腹膜内注射LPS(400μg/kg)。LPS注射后90分钟，将所有动物用CO2安乐死以收集血液样品，并通过Luminex测定法测定促炎细胞因子(包括活化素A、TNF-α、IL-6和IL-17)的血清水平。为了评估杂合ActRIIB配体陷阱对LPS诱导的内毒素血症的防护作用，将40只雄性BALB/c小鼠随机分配到对照组和AG-0027处理组(n＝20)。在LPS免疫前1小时，对一组皮下注射AG-0027(20mg/kg)，另一组注射媒介物。处理后1小时，对两组均注射LPS(30mg/kg，腹膜内)，并且在LPS施用后立即开始每天两次监测小鼠的存活率，直至LPS注射后7天。数据表明，活化素的药理学螯合能够在患有脂多糖诱导的内毒素血症的小鼠中减轻LPS介导的促炎细胞因子诱导并降低死亡率。因此，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白如AG-0027具有治疗炎性疾病的治疗潜力。
实施例16
纤维化是一种严重的进行性疾病状况，其影响许多不同的器官，包括肺、肾、心脏、肝、骨髓、胃肠道、皮肤和骨骼肌，并可导致器官衰竭。活化素-Smad2/3信号传导通路的激活与纤维化的发病机理有关。在此实施例中，检查了AG-0027(SEQ ID NO:29)在患有博来霉素诱导的肺纤维化的小鼠(一种广泛用于研究潜在纤维化疗法的疾病模型)中抵抗纤维化的能力的治疗潜力。
通过在6周龄雄性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratory)中以3U/kg剂量气管内滴注博来霉素(Calbiochem)诱导肺纤维化。然后在博来霉素滴注后一天用10mg/kg的AG-0027对一半小鼠进行处理，并在第5、9和12天再次处理；并且在同一天用媒介物(PBS，pH7.4)对另一半小鼠进行处理(n＝8)。作为正常对照，用媒介物处理年龄相匹配的雄性C57BL/6小鼠(n＝6)。在第14天，对小鼠实施安乐死。收获血液样品和肺组织以通过纤维化组织学检查评分及羟脯氨酸水平和胶原蛋白含量的测量来量化纤维化的严重性。数据表明，阻断活化素的作用可以有效地减轻博来霉素诱导的纤维化。因此，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白如AG-0027似乎为治疗纤维化疾病提供了治疗潜力。
实施例17
成骨不全症(OI)是一种使人高度衰弱的遗传性疾病，其特征为骨骼脆弱、骨折频繁和废用性肌肉萎缩。已经表明，Smad2/3信号传导通路的激活可能在OI的发病机理和进展中发挥重要作用。在此实施例中，评估了AG-0027(SEQ ID NO:29)在治疗骨丢失和成骨不全症中的废用性肌肉萎缩中的有效性。
研究了纯合B6C3Fe a/a Col1a2oim/J小鼠(一种临床前OI疾病模型)。具体地，从Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)获得8周龄雄性纯合B6C3Fe a/a Col1a2oim/Joim/oim小鼠(OI小鼠)和年龄相匹配的野生型同窝正常对照小鼠。基于体重随机化以及通过双能X射线吸收测定法(DEXA)测量的骨质量随机化，将OI小鼠分成两组。将24只纯合Col1a2oim小鼠(每组n＝12)用AG-0027(15mg/kg，腹膜内)或媒介物(PBS，pH7.4)每周处理一次，持续6周。作为对照，将20只野生型同窝对照小鼠(每组n＝10)用AG-0027(15mg/kg，腹膜内)或媒介物每周处理一次，持续6周。每周纵向测量体重，持续6周。为了评估骨质量，将纯合OI小鼠和野生型同窝对照小鼠麻醉并进行DEXA扫描(Lunar PIXImus)以在实验开始时和终止前即刻测量骨矿密度和含量。在研究结束时，使用CO2将动物安乐死，收获三头肌、四头肌和腓肠肌，并称重。通过心脏穿刺从所有实验小鼠收集血液样品，收集血清用于分析骨转换标记物，包括骨形成标记物前胶原蛋白1型N末端前肽(P1NP)、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)和骨钙蛋白(OC)以及骨吸收标记物，诸如1型胶原的C-端肽(CTX-1)。收集股骨和第四腰椎，并使用显微图像成像系统(μCT,Skyscan,Kontich,Belgium)评定骨体积。数据证明，皮下施用杂合ActRIIB配体陷阱蛋白能够在OI小鼠(oim/oim小鼠)中显著增强肌肉生长和骨形成。用AG-0027(SEQ ID NO:29)处理使OI小鼠的三头肌中的骨骼肌质量显著增加了34％，腓肠肌中的骨骼肌质量显著增加了51％(参见图30)。此外，正如DEXA扫描所显示的，该处理使BMD和BMC分别显著增加了14.6％和36％(参见图31)。此外，如微CT分析所显示的，该处理使OI小鼠(oim/oim小鼠)的股骨远端的骨小梁骨体积增加了251％，腰椎的骨小梁骨体积增加了98％(参见图32和图33)。值得注意的是，随着肌肉质量和骨质量的改善，该处理似乎还通过改善OI小鼠的体长而使身材矮小正常化(图34)。因此，发现杂合ActRIIB配体陷阱AG-0027对肌生长抑制素/活化素-Smad2/3信号传导的药理学抑制在OI小鼠中逆转骨丢失和废用性肌肉萎缩以及改善身材矮小方面非常有效。因此，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白如AG-0027具有治疗OI的治疗潜力。
本公开的总体教导证明，本文所述的新型杂合ActRIIB配体陷阱蛋白有效地结合并中和多种诱导萎缩的细胞因子。并且，重要的是，杂合ActRIIB配体陷阱蛋白显著改善了对肌肉的选择性，即，尽管有效地阻断诱导肌肉萎缩的细胞因子的作用，但它们使非肌肉相关的细胞因子的信号传导保持完整，从而维持了非肌肉细胞的正常生理功能。如上所述，BMP在很多生理过程中发挥重要作用，并且已经显示BMP9信号传导在维持正常的血液脉管结构/渗透性中是必需的。通过保留BMP9信号传导，并且优先地拮抗肌生长抑制素和活化素信号传导，本公开的杂合ActRIIB配体陷阱蛋白提供了比有效地中和BMP-9的现有可溶性ActRIIB蛋白更有效且更安全的治疗，即，通过选择性地以平行方式靶向多种诱导萎缩的细胞因子，并通过避免干扰非肌肉相关细胞因子的信号传导，这些杂合ActRIIB配体陷阱蛋白代表了具有出众的肌肉生长功效和改善的安全特征的一类临床候选物，并且由此其提供了成为用于对抗肌肉萎缩和/或与很多慢性、神经学、遗传、炎性、纤维化或感染性病理学的发展有关的骨病症的一流治疗的潜力。
根据本公开，本文公开和要求保护的所有制品和方法可以在没有过度实验的情况下进行和执行。尽管本公开的制品和方法已经根据优选实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是在不偏离本公开的精神和范围的情况下，可使所述制品和方法发生变化。对于本领域技术人员显而易见的所有这些变型和等同物，无论是现在存在的还是以后开发的，都被认为是在由所附权利要求书限定的本公开的精神和范围内。说明书中提到的所有专利、专利申请和公布指示本公开所属领域中的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物出于所有目的以引用方式整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体和单独地指出出于任何和所有目的以引用方式整体并入。本文中适当地说明性地描述的公开可以在缺少在本文中并未具体公开的任何一个或多个元件的情况下实践。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本公开，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变型，并且这些修改和变型被认为是在由所附权利要求所限定的本公开的范围内。
序列表
如37C.F.R.1.822中所定义的，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:1是截短的野生型人ActRIIB-ECD多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是截短的野生型人ActRIIA-ECD多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3-37是各种杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是人免疫球蛋白γ-1(IgG1)重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:39是IgG1Fc结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO:40是人免疫球蛋白γ-2重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:41是IgG2Fc结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO:42是人免疫球蛋白γ-4重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:43是IgG4Fc结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO:44是肽接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45是人ActRIIB多肽的全长氨基酸序列
SEQ ID NO:46是野生型人ActRIIB细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:45的19-134)
SEQ ID NO:47是人ActRIIA多肽的全长氨基酸序列
SEQ ID NO:48是野生型人ActRIIA细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:47的20-135)
SEQ ID NO:49是ActRIIB天然信号肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:50是免疫球蛋白轻链信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51-117是各种杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:118是肽接头的氨基酸序列。
序列表
截短的野生型ActRIIB-ECD
截短的野生型ActRIIA-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0001)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0002)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0003)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0004)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0005)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0006)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0007)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0008)
混合人类ActRIIA-ECD(AG-0009)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0010)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0011)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0012)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0013)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0014)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0015)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0016)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0017)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0018)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0019)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0020)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0021)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0022)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0023)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0024)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0025)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0026)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0027)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0028)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0029)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0030)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0031)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0032)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0033)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0034)
杂合hu-ActRIIB-ECD(AG-0035)
人免疫球蛋白γ-1重链恒定区
IgG1Fc结构域
人免疫球蛋白γ-2重链恒定区
IgG2Fc结构域
人免疫球蛋白γ-4重链恒定区
IgG4Fc结构域
肽接头序列
GGGGS(SEQ ID NO:44)
人ActRIIB多肽的全长氨基酸序列
野生型人ActRIIB细胞外结构域(SEQ ID NO:45的19-134)
人ActRIIA多肽的全长氨基酸序列
野生型人ActRIIA细胞外结构域(SEQ ID NO:47的20-135)
ActRIIB天然信号肽：
MTAPWVALALLWGSLCAG(SEQ ID NO:49)
免疫球蛋白轻链信号肽：
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO:50)
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
杂合hu-ActRIIB-ECD
肽接头序列
ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:118)
序列表
<110> 活根美国股份有限公司
<120> 用于治疗肌肉萎缩和骨病的新型杂合ACTRIIB配体陷阱蛋白
<130> CACAG1.0004
<160> 118
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
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1 5 10 15
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Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu
35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
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Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 3
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50 55 60
Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys
65 70 75 80
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 4
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Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 5
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Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
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Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 6
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<212> PRT
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 7
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 9
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 10
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 11
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<213> 人工(Artificial)
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<220>
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 19
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 20
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<220>
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 22
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1 5 10 15
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
195 200 205
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
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1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
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275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 41
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
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1 5 10 15
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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180 185 190
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195 200 205
<210> 42
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 43
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
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20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 肽接头
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 45
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
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Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
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Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<213> 人工(Artificial)
<220>
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<220>
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 60
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
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<210> 61
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 61
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 68
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<220>
<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 69
Glu Thr Gln Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
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Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Gln Met Glu
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<213> 人工(Artificial)
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 112
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<213> 人工(Artificial)
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 113
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 114
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<213> 人工(Artificial)
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 116
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<223> 杂合人ActRIIB ECD
<400> 117
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<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 肽接头
<400> 118
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10

Claims (39)

1.一种治疗或预防受试者的肌肉萎缩的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肌肉萎缩与选自由以下组成的组的疾病相关：肌营养不良(诸如DMD、贝克氏MD、肢带型MD、肌强直性MD和FSHD)、肌炎、肌病(包括遗传性肌病和获得性肌病)、运动神经元疾病(诸如葛雷克氏病或ALS)以及神经退行性疾病(诸如帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病)。
3.一种治疗或预防受试者的骨病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述骨病选自由以下组成的组：骨质疏松症、骨软化、成骨不全症、进行性骨化性纤维发育不良、皮质类固醇诱导的骨丢失、骨折和骨转移。
5.一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述代谢病症选自由以下组成的组：肥胖症、血脂异常、少肌性肥胖症、非酒精性脂肪性肝病诸如非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝病、胰岛素抵抗、糖尿病和代谢综合征，以及糖尿病性肌病、糖尿病肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病和血色素沉着病。
7.一种治疗或预防受试者的纤维化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述纤维化选自由以下组成的组：间质性肺病、独特型肺纤维化、囊性纤维化、肝纤维化、肝硬化、心脏纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、特发性腹膜后纤维化、肾源性纤维化皮肤病、炎性肠病、瘢痕疙瘩、硬皮病和关节纤维化。
9.一种治疗或预防受试者的自身免疫/炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：包括多发性硬化症、系统性硬化症、糖尿病(1型)、肾小球肾炎、重症肌无力、银屑病、系统性红斑狼疮、多发性肌炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和原发性胆汁性肝硬化在内的自身免疫病症。
11.一种治疗受试者的心血管疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述心血管疾病选自由以下组成的组：心力衰竭、心脏萎缩、高血压、心肌炎、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心律失常、心脏瓣膜疾病、心肌病、心包疾病、主动脉疾病和马凡综合征。
13.一种治疗或预防受试者的癌症或癌症转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：胰腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、肺癌、前列腺癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌和横纹肌肉瘤。
15.一种治疗或预防受试者的慢性肾病(CKD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述CKD选自由以下组成的组：包括肾衰竭、间质纤维化和肾透析以及与CKD相关的蛋白能量耗损(PEW)在内的CKD。
17.一种治疗或预防受试者的关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述关节炎选自由以下组成的组：类风湿性关节炎和骨关节炎。
19.一种治疗或预防受试者的厌食症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述厌食症选自神经性厌食症和厌食症-恶病质综合征。
21.一种治疗或预防受试者的肝病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述肝病选自由以下组成的组：非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化或肝硬化、肝衰竭、自身免疫性肝炎和肝细胞癌。
23.一种用于受试者的器官或组织移植的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述移植选自由以下组成的组：心脏、肾、肝、肺、胰腺、肠和胸腺的器官移植，以及骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经和静脉的组织移植。
25.一种治疗或预防受试者的贫血的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述贫血选自由以下组成的组：缺铁性贫血、铁超负荷、地中海贫血、溶血性贫血、镰状细胞性贫血、恶性贫血、范可尼贫血和再生障碍性贫血(诸如癌症相关性贫血和化疗诱导的贫血)。
27.一种治疗受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述疼痛选自由以下组成的组：神经性疼痛、躯体痛、内脏痛、炎性疼痛、癌痛、背痛和关节痛。
29.一种治疗受试者的老化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述老化疾患选自由以下组成的组：老年人虚弱、年龄相关性少肌症和骨关节炎。
31.一种诱导受试者的干细胞生长用于组织修复或器官再生的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在组合疗法方案中)与药学上可接受的载剂混合的本公开的杂合ActRIIB配体陷阱，其中这种施用减轻肌肉质量的损失和/或肌肉功能的丧失。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述干细胞选自由以下组成的组：肌肉干(卫星)细胞、心脏干细胞、骨髓来源间充质干细胞和多能干细胞。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中氨基酸残基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少一个被另一种氨基酸取代，并且其中所述杂合ActRIIB-ECD多肽能够结合肌生长抑制素和活化素A，但相对于野生型ActRIIB-ECD多肽表现出降低的对BMP9的结合亲和力。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:115、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述杂合ActRIIB配体陷阱蛋白包含连接至所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽的人Fc结构域，所述人Fc结构域具有选自由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:43组成的组的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的方法，其中具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的铰链接头一起使用以将所述人Fc结构域连接至所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽。
37.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述杂合ActRIIB配体陷阱包含附连至人Fc结构域的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽具有选自由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列，所述人Fc结构域具有选自由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:43组成的组的氨基酸序列。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述杂合ActRIIB配体陷阱包含附连至人Fc结构域的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，所述人Fc结构域具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述杂合ActRIIB配体陷阱包含附连至人Fc结构域的杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽，所述杂合可溶性ActRIIB-ECD多肽具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列，所述人Fc结构域具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
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