TW201827069A - 用於治療肌肉萎縮和骨疾病的新型雜合actriib配體陷阱蛋白 - Google Patents

用於治療肌肉萎縮和骨疾病的新型雜合actriib配體陷阱蛋白 Download PDF

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Abstract

本揭露內容描述了新型雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，其完全保留了對肌生成抑制蛋白(myostatin)和啟動蛋白A的結合親和力，但表現出與BMP、特別地BMP-9顯著減少的結合。本文描述的新型組合物可用於製備新型雜合ActRIIB配體陷阱蛋白，該新型雜合ActRIIB配體陷阱蛋白可用於調節肌肉、骨、軟骨、脂肪、成纖維細胞、血液和神經組織的生長，以在治療上有意義的方式對抗肌肉萎縮、骨質丟失、貧血、炎症和纖維化。因為這些新型下一代肌生成抑制蛋白/啟動蛋白抑制劑是比當前可用的肌生成抑制蛋白抑制劑更安全且更有效的分子，所以它們在非常廣泛的臨床適應症中是有用的。

Description

用於治療肌肉萎縮和骨疾病的新型雜合ACTRIIB配體陷阱蛋白
相關申請的交叉引用 本申請要求於2016年10月20日提交的美國臨時申請第62/410,595號的權益，該申請通過引用以其整體併入本文。
肌肉萎縮(Muscle wasting)指肌肉品質的逐漸丟失及/或肌肉的逐漸弱化和退化，肌肉包括骨骼肌或隨意肌、控制心臟的心肌(心肌病)、和平滑肌。慢性肌肉萎縮是特徵為肌肉品質逐漸丟失以及肌肉弱化和退化的狀況(即在長期的期間內持續)。當肌肉蛋白降解的速率超過肌肉蛋白合成的速率時，發生肌肉品質的丟失。
肌肉萎縮是使人虛弱且威脅生命的疾病狀態，其與很多慢性、神經、遺傳、炎性、纖維化或感染性病理的發展有關，包括例如肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、肌炎、失神經性肌肉萎縮(denervation muscle atrophy)、厭食症-惡病質綜合徵(anorexia-cachexia syndrome)、癌症、類風濕關節炎、骨關節炎、胰島素耐受/糖尿病、肌少型肥胖症(sarcopenic obesity)、年齡相關肌少症(age-related sarcopenia)、雄激素剝奪、皮質類固醇肌病、炎性腸病、肝硬化、慢性阻塞性肺病、肺纖維化、慢性腎病、創傷、心肌病、慢性心力衰竭和HIV感染。據稱導致肌肉萎縮的其他狀況包括慢性下背痛、高齡、對中央神經系統的損害、外週神經損傷、化學損傷、長期的灼痛(extended burns)、髖/膝置換、廢用性萎縮、暴露至微重力和長期住院。
骨疾病被認為是涉及骨骼系統的任何苦惱。骨疾病可以是非常嚴重的，並需要及時和有效的治療。骨疾病可以是非常痛苦的，並可奪去患者的活動性和獨立性。儘管導致因素因疾病而不同，許多骨疾病由例如以下導致：遺傳因素、病毒感染、化學品異常、缺少骨膠原、損傷、骨折、血管破損、過度使用酒精或長期使用某些藥物治療。骨疾病的實例包括骨質疏鬆症、骨軟化症、成骨不全症、進行性骨化性纖維發育不良、皮質類固醇引起的骨質丟失、骨折、骨轉移和佩吉特病。
啟動蛋白(activin) IIA受體(ActRIIA)和啟動蛋白IIB受體(ActRIIB)是包括例如啟動蛋白A、肌生成抑制蛋白(myostatin)(也被稱為GDF-8)、生長分化因數-11 (GDF-11)、和很多其他的骨形態發生蛋白(BMP)諸如BMP-3、BMP-6、BMP-9 (也被稱為GDF-2)和BMP-10的TGF-β家族成員配體的亞組的II型受體。ActRIIA和ActRIIB已經被鑒定為激動蛋白，包括激動蛋白A、激動蛋白B和激動蛋白AB的II型受體。ActRIIB是肌生成抑制蛋白(肌肉生長的關鍵負調控因數)的高親和力受體，並因此在控制肌肉品質中發揮核心作用。這些配體與ActRIIA及/或ActRIIB的結合可調節細胞分化、凋亡、蛋白合成和降解、礦化、血細胞生成、血管發生、類固醇合成、黏附、遷移、細胞外基質產生和纖維發生。具體的回應取決於TGF-β配體和受體的類型和水準以及細胞狀態和環境。ActRIIB訊號傳導途徑介導經由Smad2/3轉錄因數的細胞回應，且ActRIIB訊號傳導途徑的活化已被牽涉在包括肌肉萎縮、骨質丟失、纖維化和炎症的許多疾病的發病機理和進展中。TGF-β家族的複數成員，包括肌生成抑制蛋白、激動蛋白和GDF11，通過與ActRIIB偶聯介導Smad2/3活化。
此前的研究已經顯示，這些配體與ActRIIB-Fc的藥理學螯合(sequestration)在動物模型中導致強烈的肌肉生長和骨合成代謝，在正常小鼠中顯示比肌生成抑制蛋白中和抗體多約三倍的肌肉生長，並顯示在無肌生成抑制蛋白的小鼠中進一步刺激顯著的肌肉獲得的能力(Chiu等人, J Gerontol A Biol Sci Med Sci., 68(10):1181-92, Oct 2013；Arounleut等人, Exp Gerontol., 48(9): 898–904, Sept 2013)。並且除了其對肌肉和骨的顯著的促合成作用，ActRIIB-Fc還已經在臨床前模型中顯示具有重要的抗纖維化和抗炎性作用，且多種ActRIIA-Fc和ActRIIB-Fc融合蛋白已經或目前正在被在患者中臨床評價用於治療與許多慢性、神經性、遺傳性、炎性、纖維化或感染性病理的發展相關的肌肉萎縮紊亂及/或骨疾病。例如，Acceleron Pharma的ACE-011(一種ActRIIA-Fc融合蛋白)已經在患有多發性骨髓瘤和骨質疏鬆症的溶骨性病變的患者中臨床評價(Ph1、Ph2a)，且目前正針對患有轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)的患者中的化學療法引起的貧血(CIA) (Ph2/3) (ClinicalTrials.gov)和處於血液透析的患者中的終末期腎病評價ACE-011，且已經臨床評價(Ph1、Ph2)了Acceleron Pharma的ACE-031(一種ActRIIB-Fc融合蛋白)對迪謝內肌營養不良(Duchenne muscle dystrophy，DMD)的治療效果(ClinicalTrials.gov)。
不幸地，儘管似乎有效，ACE-011用於治療骨質疏鬆症的臨床潛能被安全性考慮(高RBC生長)妨礙，且ACE-031儘管表現出顯著的肌肉獲得，其比由肌生成抑制蛋白選擇性抑制劑諸如肌生成抑制蛋白抗體、肽體(peptibody)或前肽引起的肌肉獲得更明顯，已經被在DMD患者中觀察到的鼻和齒齦出血的不良事件妨礙，因此對ACE-031存在臨床限制(Smith R.C.和Lin B.K., Curr Opin Support Palliat Care. 7(4): 352–360, 2013)。因此，ACE-031由於鼻和齒齦出血的副作用，在DMD 2期試驗中中斷，儘管其在DMD患者中改進肌肉品質和功能的有前景的效力跡象。如此表現為，野生型ActRIIB-Fc能夠阻斷BMP9介導的Smad1/3/8訊號傳導(這對於維持血管內穩態是關鍵的)，且認為BMP9被野生型ActRIIB的這一功能阻斷是出血副作用的潛在原因，因為引人注目的新的遺傳證據已經將BMP9的失去功能突變與人類中的血管異常和出血綜合徵聯繫在一起(Wooderchak-Donahue等人, Am J Hum Genet., 93(3): 530–537, Sep 2013)。
因此儘管已經有重要的進步，對於提供高度有效且安全的用於治療與許多慢性、神經性、遺傳性、炎性、纖維化或感染性病理的發展相關的肌肉萎縮及/或骨疾病的新型治療劑仍存在迫切需要。
通過引用併入 本文揭露的所有參考文獻為了所有目的在此通過引用以其整體併入。
在一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的肌肉萎縮的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱，其中此類施用減弱肌肉品質的丟失及/或肌肉功能的丟失。在多種實施方案中，肌肉萎縮與選自由以下組成的組的疾病相關：肌肉營養不良(諸如DMD、Becker型MD、肢帶型MD、肌強直性MD和FSHD)、肌炎(諸如皮肌炎、多肌炎和包涵體肌炎)、肌病(包括遺傳性肌病和獲得性肌病，諸如雄激素剝奪療法、皮質類固醇或他汀類引起的肌病)、運動神經元疾病(諸如葛雷克氏症(Lou Gehrig’s disease)或ALS)、脊肌萎縮症(包括嬰兒型進行性脊肌萎縮症、中間型脊肌萎縮症、青少年型脊肌萎縮症和成人脊肌萎縮症)、神經肌肉接頭疾病(諸如重症肌無力、蘭伯特-伊頓綜合徵和肉毒中毒)、外週神經疾病(諸如夏科-馬里-圖思病(Charcot-Marie tooth disease)、代-索二氏病和弗裡德賴希氏共濟失調)、脊髓損傷、中風、神經變性疾病(包括帕金森氏病、亨丁頓病、阿茲海默病和克雅氏病)、癌症(諸如肺癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、頭頸癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、神經膠質瘤、成神經細胞瘤、淋巴瘤、和多發性骨髓瘤、皮膚癌、和血液癌症)、器官衰竭(諸如心力衰竭、腎衰竭和肝臟衰竭、外傷(諸如燒傷或摩托車事故)、廢用(諸如長期臥床休息、住院、和宇宙飛行)、感染(諸如HIV、脊髓灰質炎和敗血症)、慢性阻塞性肺病(COPD)、和老化(諸如肌少症(sarcopenia)、肌少性肥胖症和骨關節炎)。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的骨疾病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，骨疾病選自由以下組成的組：骨質疏鬆症、腎性骨營養不良、成骨不全症、進行性骨化性纖維發育異常、皮質類固醇引起的骨質丟失、雄激素剝奪療法引起的骨質丟失、髖骨骨折、癌症引起的骨質丟失、骨轉移、佩吉特病、佝僂病、骨軟化症、佩特茲氏病和纖維性結構不良。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的代謝紊亂的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，代謝紊亂選自由以下組成的組：代謝綜合徵、肥胖症、血脂異常、肌少型肥胖症、非酒精性脂肪肝病諸如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝病、胰島素耐受、糖尿病，以及糖尿病性肌病、糖尿病性腎病、糖尿病性神經病、糖尿病性視網膜病和血色素沉著病。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的纖維化的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，纖維化選自由以下組成的組：間質性肺病、獨特型肺纖維化、囊性纖維化、肝纖維化、肝硬化、膽道閉鎖、心肌梗塞、心臟纖維化、腎纖維化、骨髓纖維化、特發性腹膜後纖維化、腎源性纖維化皮病、炎性腸病或克羅恩病、瘢痕瘤(keloid)、硬皮病、腹膜後纖維化和關節纖維化。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的自身免疫/炎性疾病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，疾病選自由以下組成的組：自身免疫/炎性紊亂，包括多發性硬化(MS)、系統性硬化症、糖尿病(1型)、腎小球腎炎、重症肌無力、銀屑病、系統性紅斑狼瘡、多肌炎、克羅恩病、潰瘍性結腸炎和原發性膽汁性肝硬化、關節炎、哮喘和敗血症。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的心血管疾病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，心血管疾病選自由以下組成的組：心力衰竭、心臟萎縮、肺動脈高血壓(PAH)、心肌炎、冠狀動脈病、心肌梗塞、心律失常、心臟瓣膜病、心肌病、心包疾病、主動脈疾病、馬凡綜合徵和心臟移植。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的癌症或癌症轉移的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，癌症選自由以下組成的組：胰腺癌、胃癌、食管癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸癌、橫紋肌肉瘤、神經膠質瘤、成神經細胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、黑素瘤、上皮癌和骨髓增生異常綜合徵。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的慢性腎病(CKD)的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，CKD選自由以下組成的組：CKD,包括腎衰竭、間質性纖維化、糖尿病性腎病、腎透析、腎性骨營養不良、和蛋白能量耗損(PEW)。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的關節炎的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，關節炎選自由以下組成的組：類風濕關節炎、骨關節炎、斯提耳氏病、強直性脊柱炎、背痛、貝賽特氏症、黏液囊炎、焦磷酸鈣沉積病、腕管綜合徵、髕骨軟化症、慢性疲勞綜合徵、複雜性區域疼痛綜合徵、冷凝比林相關週期性綜合徵(cryopyrin-associated periodic syndrome)、椎間盤退化症、髖關節發育不全、埃-當二氏綜合徵、家族性地中海熱、纖維肌痛、巨細胞性動脈炎、皮肌炎、特發性關節炎、硬皮病、川崎氏病、狼瘡、混合性結締組織病、多肌炎、佩吉特病、風濕性疾病、血色素沉著病、感染性關節炎、銀屑病關節炎、反應性關節炎、交感反射性營養不良、舍葛籣病、脊柱狹窄和腱炎。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的厭食症的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，厭食症選自神經性厭食症和厭食症-惡病質綜合徵。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的肝病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，肝病選自由以下組成的組：非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化或肝硬化、肝硬化、自身免疫肝炎、肝細胞上皮癌、肝臟衰竭和肝移植。
在另一方面，本揭露內容提供了用於受試者的器官或組織移植的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，移植選自由以下組成的組：心臟、腎、肝、肺、胰腺、腸和胸腺的器官移植，或選自肌肉、骨、肌腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、神經和血管的組織/細胞移植。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的貧血的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，貧血選自由以下組成的組：炎症的貧血、缺鐵性貧血、鐵超負荷、地中海貧血、溶血性貧血、鐮狀細胞貧血、惡性貧血、範可尼貧血、骨髓增生異常綜合徵、再生障礙性貧血、癌症相關的貧血、化學療法引起的貧血、和與CKD和腎透析相關的貧血。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的疼痛的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，疼痛選自由以下組成的組：神經性疼痛、軀體痛、內臟痛、炎性疼痛、癌痛、背痛和關節痛。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的老化的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，老化狀況選自由以下組成的組：老年人的虛弱、年齡相關肌少症和骨關節炎。
在另一方面，本揭露內容提供了在受試者中誘導幹細胞生長用於組織修復或器官再生的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，幹細胞選自由以下組成的組：肌肉幹(衛星)細胞、心臟幹細胞、骨髓來源間充質幹細胞和多能幹細胞。
在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少一被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。
在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有以下列出的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 37，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB多肽是具有與選自SEQ ID NO:3-37的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB多肽，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含選自由以下組成的組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116或SEQ ID NO: 117，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB多肽是具有與選自SEQ ID NO:51-117的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB多肽，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。
在多種實施方案中，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含雜合可溶ActRIIB-ECD多肽和至少一種異源蛋白，其中該雜合ActRIIB配體陷阱能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，異源蛋白是Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域是人IgG Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域源自SEQ ID NO:38列出的人IgG1重鏈恆定結構域序列。在多種實施方案中，Fc結構域為具有SEQ ID NO: 39列出的胺基酸序列的Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域源自SEQ ID NO:40列出的人IgG2重鏈恆定結構域序列。在多種實施方案中，Fc結構域為具有SEQ ID NO: 41列出的胺基酸序列的Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域源自SEQ ID NO:42列出的人IgG4重鏈恆定結構域序列。在多種實施方案中，Fc結構域為具有SEQ ID NO: 43列出的胺基酸序列的Fc結構域。
在多種實施方案中，異源蛋白通過接頭及/或鉸鏈接頭肽附連至雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。接頭或鉸鏈接頭可以是相對不含二級結構的在5、10、15、20、30、40個或更多個胺基酸之間的人工序列。在多種實施方案中，接頭中G/S含量豐富(例如接頭中至少約60%、70%、80%、90%或更多的胺基酸是G或S)。在多種實施方案中，接頭具有(GGGGS (SEQ ID NO: 44))n基序，其中n = 1-6。
在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至本揭露內容的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽(例如SEQ ID NO: 3-37或51-117中的任一)。
本揭露內容提供了治療受試者的肌生成抑制蛋白相關紊亂或啟動蛋白A相關紊亂的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的新型、分離的雜合ActRIIB配體陷阱。通常被工程化為融合蛋白的新型、分離的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白，其作為多細胞因數拮抗劑(multi-cytokine antagonist)發揮作用，該多細胞因數拮抗劑被設計為選擇性地阻斷多種惡病質(引起萎縮的)細胞因數的作用而不影響非肌肉相關細胞因數的訊號傳導。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含分離的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，該多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力(即，保留了中和肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A的活性，但表現出顯著降低的BMP9中和作用)。本揭露內容部分基於發明人的如下獨特見解，被工程化為表現出與BMP9顯著降低的結合(因此具有降低的BMP9中和作用)，同時保留其對肌生成抑制蛋白和啟動蛋白的強中和活性的雜合ActRIIB配體陷阱，將提供為比目前可用的肌生成抑制蛋白抑制劑更安全且更有效的分子的肌生成抑制蛋白抑制劑。特別地，發明人假設，被工程化為用來自ActRIIA細胞外結構域(ECD)的相應胺基酸選擇性地置換ActRIIB ECD內的胺基酸殘基的雜合可溶ActRIIB多肽，可提供相對於BMP9優先中和肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A (肌肉生長的關鍵負調控因數)的新型雜合可溶ActRIIB多肽。BMP9在很多生理過程中發揮重要作用(參見，例如Tillet E,等, Front Genet. 8;5:456, 2015)並且已經顯示BMP9訊號傳導在保持正常血液維管結構/滲透性中是重要的(參見例如David L.,等, Circ Res. 25;102(8):914-22, 2008)。因此假設用本文描述的新型雜合ActRIIB配體陷阱蛋白治療的受試者可避免在用強烈結合並中和BMP9的現有ActRIIB-Fc分子治療的受試者中觀察到的鼻和齒齦出血的副作用。這些新型雜合ActRIIB配體陷阱蛋白提供的治療優勢提供了對於嚴重肌肉丟失和惡病質的逆轉以及對於包括肌肉萎縮、骨質丟失、炎症和纖維化的廣泛的慢性分解代謝疾病的治療是安全且有效的下一代治療劑。 定義
術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。在多種實施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”為其α碳通過肽鍵連接的胺基酸鏈。因此鏈的一末尾(胺基末端)的末端胺基酸具有游離胺基，而鏈的另一末尾(羧基末端)的末端胺基酸具有游離羧基。如本文使用的，術語“胺基末端”(縮寫為N-末端)指肽的胺基末端的胺基酸上的游離α-胺基，或該肽中任何其他位置的胺基酸的α-胺基(當參與肽鍵時為亞胺基)。類似地，術語“羧基末端”指肽的羧基末端上的游離羧基，或該肽中任何其他位置的胺基酸的羧基。肽還包括基本上任何多胺基酸，包括但不限於肽模擬物(peptide mimetic)諸如通過醚鍵而非醯胺鍵連接的胺基酸。
本揭露內容的多肽包括已經以任何方式和出於任何原因被修飾為例如以下的多肽：(1)降低對蛋白水解的易感性，(2)降低對氧化的易感性，(3)改變形成蛋白複合體的結合親和力，(4)改變結合親和力，和(5)賦予或改變其他物理化學特性或功能特性。例如，單胺基酸置換或多胺基酸置換(例如，保守胺基酸置換)可以在天然存在的序列中進行(例如，在形成分子間接觸的結構域以外的多肽部分中)。“保守胺基酸置換”指多肽中胺基酸被功能上相似的胺基酸置換。以下六組各自包含互相為保守置換的胺基酸： 1) 丙胺酸(A)、絲胺酸(S)和蘇胺酸(T) 2) 天門冬胺酸(D)和麩胺酸(E) 3) 天門冬醯胺(N)和麩胺醯胺(Q) 4) 精胺酸(R)和離胺酸(K) 5) 異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)和纈胺酸(V) 6) 苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)和色胺酸(W)
“非保守胺基酸置換”指這些類別中的一類別的成員置換為來自另一類別的成員。在進行此類改變時，根據多種實施方案，可以考慮胺基酸的親水指數(hydropathic index)。基於胺基酸的疏水性和荷電性質，每個胺基酸被指定親水指數。它們是：異亮胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；亮胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩胺醯胺(-3.5)；天門冬胺酸(-3.5)；天門冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)和精胺酸(-4.5)。
本領域瞭解親水胺基酸指數在賦予蛋白相互作用的生物功能中的重要性(參見例如，Kyte等人, 1982, J. Mol.Biol.157:105-131)。已知，某些胺基酸可以被具有相似親水指數或分數的其他胺基酸置換，並且仍保持相似的生物活性。在基於親水指數進行改變時，在多種實施方案中，包括親水指數在±2內的胺基酸的置換。在多種實施方案中，包括在±1內的那些，且在多種實施方案中，包括在±0.5內的那些。
本領域還理解，可以基於親水性有效地進行相似胺基酸的置換，特別是當由此產生的生物功能蛋白或肽被意圖用於在如本文揭露的免疫學實施方案中使用時。在多種實施方案中，蛋白的最大局部平均親水性(如由其相鄰胺基酸的親水性決定的)與其免疫原性和抗原性，即，與蛋白的生物學特性相關。
以下親水性值被指定至這些胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天門冬胺酸(+3.0.+-.1)；麩胺酸(+3.0.+-.1)；絲胺酸(+0.3)；天門冬醯胺(+0.2)；麩胺醯胺(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5.+-.1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；亮胺酸(-1.8)；異亮胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)和色胺酸(-3.4)。在基於相似親水性值進行改變時，在多種實施方案中，包括親水性值在±2內的胺基酸的置換，在多種實施方案中，包括在±1內的那些，且在多種實施方案中，包括在±0.5內的那些。
示例性的胺基酸置換在表1中列出。 表1
技術人員能夠使用公知技術確定如本文列出的多肽的適當變體。在多種實施方案中，本領域技術人員可通過靶向被認為對於活性不重要的區來鑒定可被改變而不破壞活性的分子的適合區域。在其他實施方案中，技術人員可以鑒定在相似多肽間保守的分子的殘基和部分。在另外的實施方案中，即使可能對生物活性或對結構重要的區域也可以經歷保守胺基酸置換，而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。
另外，本領域技術人員可以回顧鑒定相似多肽中對活性或結構重要的殘基的結構-功能研究。鑒於這樣的比較，技術人員可以預測多肽中相應於相似多肽中對活性或結構重要的胺基酸殘基的胺基酸殘基的重要性。本領域技術人員可以選擇對此類預測的重要胺基酸殘基進行化學上相似的胺基酸置換。
本領域技術人員還可以在相似多肽中分析與該結構相關的三維結構和胺基酸序列。鑒於這樣的資訊，本領域技術人員可以對於多肽的三維結構預測其胺基酸殘基的排列。在多種實施方案中，本領域技術人員可選擇對預測在多肽表面上的胺基酸殘基不進行根本改變，因為此類殘基可能參與與其他分子的重要相互作用。並且，本領域技術人員可以生成在每個期望的胺基酸殘基處包含單胺基酸置換的測試變體。然後可使用本領域技術人員已知的活性測定篩選變體。此類變體可被用於收集關於合適變體的資訊。例如，如果人們發現，特定胺基酸殘基的改變導致受損的、不期望地減少的或不適合的活性，則可以避免具有此類改變的變體。換句話說，基於從此類常規試驗收集的資訊，本領域技術人員可以容易地確定應避免在該處單獨的或與其他突變組合的進一步置換的胺基酸。
本文中使用的術語“多肽片段”和“截短的多肽”指與相應全長蛋白相比具有胺基末端缺失及/或羧基末端缺失的多肽。在某些實施方案中，片段可以為，例如至少5個、至少10個、至少25個、至少50個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個或至少1000個胺基酸的長度。在某些實施方案中，片段還可以為，例如最多1000個、最多900個、最多800個、最多700個、最多600個、最多500個、最多450個、最多400個、最多350個、最多300個、最多250個、最多200個、最多150個、最多100個、最多50個、最多25個、最多10個或最多5個胺基酸的長度。片段還可以在其任一或二末端包含一或更多個另外的胺基酸，例如，來自不同天然存在的蛋白的胺基酸序列(例如，Fc或亮胺酸拉鍊結構域)或人工胺基酸序列(例如，人工接頭序列)。
本文使用的術語“多肽變體”、“雜合多肽”和“多肽突變體”指包含以下胺基酸序列的多肽，其中相對於另一多肽序列，一或更多個胺基酸殘基被插入至該胺基酸序列、從其中缺失及/或被置換到該胺基酸序列中。在某些實施方案中，待被插入、缺失或置換的胺基酸殘基的數量可以是例如，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少10個、至少25個、至少50個、至少75個、至少100個、至少125個、至少150個、至少175個、至少200個、至少225個、至少250個、至少275個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個或至少500個胺基酸的長度。本揭露內容的雜合體包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是被化學修飾的多肽，該化學修飾例如綴合至另一化學部分諸如例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)，磷酸化和糖基化。
本文中術語“%序列同一性”與術語“%同一性”可互換使用並且指當使用序列比對程式比對時，二或更多個肽序列之間的胺基酸序列同一性的水準或二或更多個核苷酸序列之間的核苷酸序列同一性的水準。例如，如本文使用的，80%同一性與由定義的演算法確定的80%序列同一性指相同的事物，並且指的是，給定序列與另一序列的另一長度至少80%相同。在某些實施方案中，%同一性選自，例如，與給定序列至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%或更大的序列同一性。在某些實施方案中，%同一性在例如約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約99%的範圍內。
本文中術語“%序列同源性”與術語“%同源性”可互換使用並且指當使用序列比對程式比對時，二或更多個肽序列之間的胺基酸序列同源性的水準或二或更多個核苷酸序列之間的核苷酸序列同源性的水準。例如，如本文使用的，80%同源性與由定義的演算法確定的80%序列同源性指相同的事物，並且相應地，給定序列的同源物相對於給定序列的長度具有大於80%的序列同源性。在某些實施方案中，%同源性選自，例如，與給定序列至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%或更大的序列同源性。在某些實施方案中，%同源性在例如約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約99%的範圍內。
可以被用於確定二序列之間的同一性的示例性電腦程式包括但不限於，BLAST程式的套件，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP以及TBLASTN，其在互聯網在NCBI的網站上可揭露獲得。還參見Altschul等人, J. Mol.Biol.215:403-10, 1990 (特別參考揭露的默認設置，即參數w=4、t=17)和Altschul等人, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997。當相對於GenBank蛋白序列和其他揭露資料庫中的胺基酸序列評價給定胺基酸序列時，通常使用BLASTP程式進行序列檢索。BLASTX程式較佳用於相對於GenBank蛋白序列和其他揭露資料庫中的胺基酸序列檢索在所有閱讀框已經被翻譯的核酸序列。使用開放缺口罰分11.0和延伸缺口罰分1.0的默認參數並使用BLOSUM-62矩陣運行BLASTP和BLASTX二者。參見同上。
除了計算序列同一性百分比以外，BLAST演算法還進行二序列之間相似性的統計分析(參見，例如，Karlin & Altschul,Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787, 1993)。由BLAST演算法提供的相似性的一測量值是最小總機率(P(N))，該最小總機率提供二核苷酸序列或胺基酸序列之間的匹配偶然發生的機率的指示。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小總機率為，例如小於約0.1、小於約0.01或小於約0.001，該核酸被認為與參考序列相似。
如本文使用的術語“異源”指非天然或在自然界發現的，例如可通過用源自另一來源的組合物或狀態替換現有的天然組合物或狀態來實現的組合物或狀態。相似地，蛋白在除了其天然地表達的生物體之外的生物體中的表達構成異源表達系統和異源蛋白。
如本文使用的術語“抗體”指包含一或更多個多肽並且具有對腫瘤抗原的特異性或具有對在病理狀態過表達的分子的特異性的蛋白，該多肽基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恆定區基因，以及這些基因的亞型和大量免疫球蛋白可變區基因。輕鏈(LC)被分類為κ或λ。重鏈(HC)被分類為γ、μ、α、δ或ε，其繼而分別定義免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(例如抗體)結構單元包含四聚體。每個四聚體由相同的兩對多肽鏈組成，每對具有一條“輕鏈”(約25 kDa)和一條“重鏈”(約50-70 kDa)。每條鏈的N-末端定義主要負責抗原識別的約100個至110個或更多個胺基酸的可變區。
如本文使用的術語“Fc區”定義了免疫球蛋白重鏈的C末端區域，其可通過完整抗體的木瓜蛋白酶消化生成。Fc區可以是天然序列Fc區或變體Fc區。免疫球蛋白的Fc區通常包含二恆定結構域，CH2 結構域和CH3 結構域，並任選地包含CH4 結構域。抗體的Fc部分介導若干重要的效應器功能，例如細胞因數誘發、ADCC、吞噬作用、補體依賴的細胞毒性(CDC)以及抗體和抗原-抗體複合體的半衰期/清除率(例如，新生的FcR (FcRn)在內體中在酸性pH結合IgG的Fc區並保護IgG免於降解，從而對IgG的長血清半衰期做出貢獻)。替換Fc部分中的胺基酸殘基以改變抗體效應器功能是本領域已知的(參見例如Winter等，美國專利第5,648,260號和第5,624,821號)。
“多核苷酸”指包含核苷酸單元的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，諸如去氧核糖核酸("DNA")和核糖核酸("RNA")以及核酸類似物。核酸類似物包括包含非天然存在的堿基的那些，以除了天然存在的磷酸二酯鍵以外的連接與其他核苷酸連接的核苷酸，或包含通過除了磷酸二酯鍵以外的連接附連的堿基的核苷酸。因此，核苷酸類似物包括，例如，且不限於，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。此類多核苷酸可，例如，使用自動化DNA合成儀合成。術語“核酸”通常指大的多核苷酸。術語“寡核苷酸”通常指短的多核苷酸，通常不大於約50個核苷酸。應當理解，當核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)代表時，這還包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。
本文使用常規符號描述多核苷酸序列：單鏈多核苷酸序列的左手端為5'-末端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向被稱為5'-方向。核苷酸向新生RNA轉錄物的5'至3'添加的方向被稱為轉錄方向。具有與mRNA相同序列的DNA鏈被稱為“編碼鏈”；在具有與從該DNA轉錄的mRNA相同的序列的DNA鏈上且位於RNA轉錄物的5'-末端的5'的序列被稱為“上游序列”；在具有與RNA相同的序列的DNA鏈上並且在編碼RNA轉錄物的3'-末端的3'的序列被稱為“下游序列”。
“互補”指二多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起。因此，二分子可被描述為互補的，且此外，接觸表面特性為彼此互補。如果第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列基本上相同，或如果第一多核苷酸可與第二多核苷酸在嚴格雜交條件下雜交，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。
“與‧‧‧特異性雜交”或“特異性雜交”或“與‧‧‧選擇性雜交”指當該序列存在於複雜混合物(例如，總細胞)DNA或RNA中時，核酸分子優先與特定核苷酸序列在嚴格條件下的結合、雙鏈體化或雜交。術語“嚴格條件”指探針將優先與其靶子序列雜交，並且在較小程度上與其它序列雜交或根本不與其他序列雜交的條件。在核酸雜交實驗諸如DNA雜交和RNA雜交的背景下，“嚴格雜交”和“嚴格雜交洗滌條件”為序列依賴性的，並且在不同的環境參數下是不同的。關於核酸雜交的廣泛指導可在以下中發現：Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, 部分I，第2章，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y.；Sambrook等，2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，3.sup.rd ed., NY；以及Ausubel等，編著，現行版，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY。
通常，高度嚴格的雜交和洗滌條件選擇為比在定義的離子強度和pH下特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。Tm為50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在定義的離子強度和pH下)。非常嚴格的條件選擇為等於特定探針的Tm。用於具有多於約100個互補殘基的互補核酸在DNA印跡或RNA印跡中的濾器上的雜交的嚴格雜交條件的實例為在42°C，50%福馬林與1 mg肝素，雜交被進行過夜。高度嚴格的洗滌條件的實例為在72°C，0.15 M NaCl，持續約15分鐘。嚴格洗滌條件的實例為在65°C，0.2 x SSC洗滌，持續15分鐘。參見Sambrook等對於SSC緩衝液的描述。高嚴格洗滌之前可進行低嚴格洗滌以去除背景探針訊號。對於，例如，多於約100個核苷酸的雙鏈體的示例性中度嚴格洗滌為在45°C，1 x SSC，持續15分鐘。對於，例如，多於約100個核苷酸的雙鏈體的示例性低嚴格洗滌為在40°C，4-6 x SSC，持續15分鐘。通常，比起在特定雜交測定中對於不相關探針觀察到的2倍(或更高)的訊噪比指示檢測到特異性雜交。
“引物”指能夠與指定的多核苷酸範本特異性雜交並提供用於合成互補多核苷酸的起始點的多核苷酸。當多核苷酸引物被置於誘導合成的條件下，即，在核苷酸、互補多核苷酸範本和用於聚合的試劑諸如DNA聚合酶的存在下時，此類合成發生。引物通常為單鏈的，但可以為雙鏈的。引物通常為去氧核糖核酸，但多種合成和天然存在的引物可用於許多應用。引物與範本互補，其被設計為與範本雜交以用作合成起始的位元點，但不需要反映範本的精確序列。在此類情況下，引物與範本的特異性雜交取決於雜交條件的嚴格度。引物可用例如，顯色的、放射性的或螢光的部分標記並用作可檢測的部分。
當提及多核苷酸使用時，“探針”指能夠與另一多核苷酸的指定序列特異性雜交的多核苷酸。探針與靶互補多核苷酸特異性雜交，但不需要反映範本的精確互補序列。在此類情況下，探針與靶的特異性雜交取決於雜交條件的嚴格度。探針可用例如，顯色的、放射性的或螢光的部分標記並用作可檢測的部分。在其中探針提供用於合成互補多核苷酸的起始點的情況下，探針也可以為引物。
“載體”為可用來將與它連接的另一核酸引入到細胞中的多核苷酸。一種類型的載體為“質粒”，其指可將另外的核酸區段連接到其中的線性或環狀雙鏈DNA分子。另一種類型的載體為病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)，其中另外的DNA區段可被引入到病毒基因組中。某些載體能夠在引入了它們的宿主細胞中自主複製(例如，包含細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在引入到宿主細胞後被整合進宿主細胞的基因組中，並且從而與宿主基因組一起複製。“表達載體”為可指導選擇的多核苷酸的表達的一種類型的載體。
“調節序列”為影響與它可操作地連接的核酸的表達(例如，表達的水準、時機或位置)的核酸。調節序列可，例如，直接對調節的核酸發揮其效應，或通過一種或更多種其他分子(例如，結合調節序列及/或核酸的多肽)的作用發揮其效應。調節序列的實例包括啟動子、增強子及其他表達控制元件(例如，聚腺苷酸化訊號)。調節序列的另外的實例在以下中描述：例如，Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.以及Baron等，1995, Nucleic Acids Res.23:3605-06。如果調節序列影響核苷酸序列的表達(例如，表達的水準、時機或位置)，則核苷酸序列與調節序列“可操作地連接”。
“宿主細胞”為可用來表達本揭露內容的多核苷酸的細胞。宿主細胞可以為原核生物，例如，大腸桿菌(E. coli )，或宿主細胞可以為真核生物，例如，單細胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細胞(例如，煙草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人類細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。通常，宿主細胞為可用編碼多肽的核酸轉化或轉染的培養細胞，該核酸然後可在宿主細胞中被表達。短語“重組宿主細胞”可用來表示已用待表達的核酸轉化或轉染的宿主細胞。宿主細胞還可以為包含核酸但不以期望的水準表達該核酸的細胞，除非調節序列被引入到宿主細胞，使得調節序列變成與該核酸可操作地連接。應當理解，術語宿主細胞不僅指特定的受試者細胞，而且還指此類細胞的後代或潛在後代。因為某些修飾可由於，例如，突變或環境影響而在隨後世代中發生，此類後代實際上可能與親本細胞不相同，但仍被包括在如本文使用的該術語的範圍內。
術語“分離的分子”(其中分子為，例如，多肽或多核苷酸)為這樣的分子，該分子憑藉其起源或衍生來源(1)與在它天然狀態中伴隨它的、天然締合的組分不締合，(2)基本上不含來自相同物種的其他分子，(3)由來自不同物種的細胞表達，或(4)不存在於自然界中。因此，化學合成的、或在與其天然起源的細胞不同的細胞系統中表達的分子，將是與其天然締合的組分“分離”的。還可以利用本領域公知的純化技術通過分離使分子變成基本上不含天然地締合的組分。分子純度或均一性可以通過本領域公知的很多方式來測定。例如，多肽樣品的純度可以使用本領域公知的技術使用聚丙烯醯胺凝膠電泳和使多肽視覺化的凝膠染色測定。為了某些目的，可通過使用HPLC或本領域公知的用於純化的其他手段提供更高的解析度。
當樣品的至少約60%至75%表現為單一種類的多肽時，蛋白或多肽是“基本純”、“基本均一”或“基本純化”的。多肽或蛋白可以為單體的或多聚體的。基本純的多肽或蛋白將通常構成蛋白樣品的約50%、60%、70%、80%或90% W/W，更通常約95%，並且較佳地將超過99%純。蛋白純度或均一性可通過本領域公知的許多手段來指示，該手段諸如蛋白樣品的聚丙烯醯胺凝膠電泳，隨後在用本領域公知的染色劑染色凝膠之後視覺化單一多肽條帶。為了某些目的，可通過使用HPLC或本領域公知的用於純化的其他手段提供更高的解析度。
“接頭”指共價地或通過離子、范德華力或氫鍵連接二其他分子的分子，例如在5'末端處與一互補序列雜交並在3'末端處與另一互補序列雜交，從而連接二非互補序列的核酸分子。“可裂解的接頭”指可被降解或以其他方式切斷以分離通過該可裂解的接頭連接的二組分的接頭。可裂解的接頭一般被酶，通常為肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等裂解。可裂解接頭還可以通過環境誘因，諸如例如溫度、pH、鹽濃度等的改變來裂解。
如本文使用的術語“標記”或“標記的”指在抗體中摻入另一種分子。在一種實施方案中，標記是可檢測的標誌物，例如摻入放射性標記的胺基酸或附連至可通過標記的抗生物素蛋白檢測的生物素基部分的多肽(例如包含螢光標誌物的鏈黴親和素或可通過光學方法或量熱法來檢測的酶促活性)。在另一種實施方案中，標記或標誌物可以是治療性的，例如藥物綴合物或毒素。多種標記多肽和糖蛋白的方法是本領域已知的並且可被使用。用於多肽的標記的實例包括但不限於以下：放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)；螢光標記(例如FITC、羅丹明、鑭系元素螢光團)；酶促標記(例如，辣根過氧化物酶、β半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酯酶)；化學發光標誌物；生物素基基團；由第二報導子識別的預先確定的多肽表位(例如，亮胺酸拉鍊配對序列、第二抗體的結合位元點、金屬結合結構域、表位元標籤)；磁化劑，諸如釓類螯合物；毒素，諸如百日咳毒素；紫杉醇；細胞鬆弛素B；短桿菌肽D；溴化乙錠；吐根堿；絲裂黴素；依託泊苷；替尼泊苷；長春新堿；長春花堿；秋水仙素；多柔比星；柔紅黴素；二羥基蒽二酮；米托蒽醌；光神黴素；放線菌素D；1-去氫睾酮；糖皮質激素；普魯卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛爾(propranolol)以及嘌呤黴素及其類似物或同源物。在一些實施方案中，通過多種長度的隔離臂附連標記以減少潛在的位元阻。
“藥物組合物”指適合於在動物中藥物使用的組合物。藥物組合物包含藥理學有效量的活性劑和藥學上可接受的載體。“藥理學有效量”指有效產生預期藥理學結果的劑的量。“藥學上可接受的載體”指任何標準的藥物載體、媒介物、緩衝液和成形劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、5%右旋糖水溶液，以及乳液，諸如油/水或水/油乳液，以及各種類型的潤濕劑及/或佐劑。適當的藥學載體和製劑在Remington’s Pharmaceutical Sciences, 21st Ed.2005, Mack Publishing Co, Easton中描述。“藥學上可接受的鹽”指可以被配製成用於藥學應用的化合物的鹽，包括例如金屬鹽(鈉、鉀、鎂、鈣等)和胺的鹽或有機胺的鹽。
術語“治療(treat)”、“治療(treating)”和“治療(treatment)”指減輕或消除生物紊亂及/或其伴隨的症狀的至少一的方法。如本文使用的，“減輕”疾病、紊亂或狀況意指減少該疾病、紊亂或狀況的症狀的嚴重性及/或發生頻率。另外，本文中對“治療”的提及包括對治癒性、緩解性和預防性治療的提及。
應理解，本文描述的揭露內容的方面和實施方案包括“由這些方面和實施方案組成”及/或“主要由這些方面和實施方案組成”。
本文中，提及“約”值或參數包括(並描述)針對該值或參數本身的變異。例如，提及“約X”的描述包括對“X”的描述。
除非上下文另外明確指出，如本文和所附的申請專利範圍中使用的單數形式“一種”、“或”和“該”包含複數指代物。應理解，本文描述的揭露內容的方面和變化包括“由這些方面和變化組成”及/或“主要由這些方面和變化組成”。 臨床適應症-治療應用
在一方面，本揭露內容提供了用於治療受試者的肌生成抑制蛋白相關紊亂或啟動蛋白A相關紊亂的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。重要的是，本揭露內容的藥物組合物可以被用於增加以體重的百分比計的瘦肌肉品質，以及降低以體重百分比計的脂肪品質，同時避免針對目前的基於ActRIIB-Fc融合蛋白的治療劑報導的安全性問題。
在一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的肌肉萎縮的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱，其中此類施用減弱肌肉品質的丟失及/或肌肉功能的丟失。在多種實施方案中，肌肉萎縮與選自由以下組成的組的疾病相關：肌肉營養不良(諸如DMD、Becker型MD、肢帶型MD、肌強直性MD和FSHD)、肌炎(諸如皮肌炎、多肌炎和包涵體肌炎)、肌病(包括遺傳性肌病和獲得性肌病，諸如雄激素剝奪療法、皮質類固醇或他汀類引起的肌病)、運動神經元疾病(諸如葛雷克氏症或ALS)、脊肌萎縮症(包括嬰兒型進行性脊肌萎縮症、中間型脊肌萎縮症、青少年型脊肌萎縮症和成人脊肌萎縮症)、神經肌肉接頭疾病(諸如重症肌無力、蘭伯特-伊頓綜合徵和肉毒中毒)、外週神經疾病(諸如夏科-馬里-圖思病、代-索二氏病和弗裡德賴希氏共濟失調)、脊髓損傷、中風、神經變性疾病(包括帕金森氏病、亨丁頓病、阿茲海默病和克雅氏病)、癌症(諸如肺癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、頭頸癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、神經膠質瘤、成神經細胞瘤、淋巴瘤、和多發性骨髓瘤、皮膚癌、和血液癌症)、器官衰竭(諸如心力衰竭、腎衰竭和肝臟衰竭、外傷(諸如燒傷或摩托車事故)、廢用(諸如長期臥床休息、住院、和宇宙飛行)、感染(諸如HIV、脊髓灰質炎和敗血症)、慢性阻塞性肺病(COPD)、和老化(諸如肌少症、肌少性肥胖症和骨關節炎)。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的骨疾病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，骨疾病選自由以下組成的組：骨質疏鬆症、腎性骨營養不良、成骨不全症、進行性骨化性纖維發育異常、皮質類固醇引起的骨質丟失、雄激素剝奪療法引起的骨質丟失、髖骨骨折、癌症引起的骨質丟失、骨轉移、佩吉特病、佝僂病、骨軟化症、佩特茲氏病和纖維性結構不良。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的代謝紊亂的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，代謝紊亂選自由以下組成的組：代謝綜合徵、肥胖症、血脂異常、肌少型肥胖症、非酒精性脂肪肝病諸如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝病、胰島素耐受、糖尿病，以及糖尿病性肌病、糖尿病性腎病、糖尿病性神經病、糖尿病性視網膜病和血色素沉著病。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的纖維化的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，纖維化選自由以下組成的組：間質性肺病、獨特型肺纖維化、囊性纖維化、肝纖維化、肝硬化、膽道閉鎖、心肌梗塞、心臟纖維化、腎纖維化、骨髓纖維化、特發性腹膜後纖維化、腎源性纖維化皮病、炎性腸病或克羅恩病、瘢痕瘤、硬皮病、腹膜後纖維化和關節纖維化。
在另一方面，本揭露內容提供了治療或預防受試者的自身免疫/炎性疾病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，疾病選自由以下組成的組：自身免疫/炎性紊亂，包括多發性硬化(MS)、系統性硬化症、糖尿病(1型)、腎小球腎炎、重症肌無力、銀屑病、系統性紅斑狼瘡、多肌炎、克羅恩病、潰瘍性結腸炎和原發性膽汁性肝硬化、關節炎、哮喘和敗血症。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的心血管疾病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)與藥學上可接受的載體混合的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，心血管疾病選自由以下組成的組：心力衰竭、心臟萎縮、肺動脈高血壓(PAH)、心肌炎、冠狀動脈病、心肌梗塞、心律失常、心臟瓣膜病、心肌病、心包疾病、主動脈疾病、馬凡綜合徵和心臟移植。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的心臟功能異常或心力衰竭的方法，包括將有效量的雜合ActRIIB配體陷阱施用至受試者。該調節可以使該受試者的心臟功能改善至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。心臟功能的改善可以通過超聲心動描記術測量以下來評價：1)針對排出的血液體積和排出效率的心臟泵功能，和2)針對心肌收縮的強度的心肌功能。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的癌症細胞的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱，其中此類施用抑制癌症細胞的生長及/或增殖。特別地，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱在治療以癌症為特徵的紊亂中是有用的。此類紊亂包括但不限於實體瘤，諸如乳腺癌、呼吸道癌、腦癌、生殖器官的癌症、消化道的癌症、尿道的癌症、眼癌、肝癌、皮膚癌、頭頸癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌以及其遠端轉移，淋巴瘤，肉瘤，多發性骨髓瘤和白血病。乳腺癌的實例包括但不限於侵襲性導管癌、侵襲性小葉癌、原位導管癌和原位小葉癌。呼吸道的癌症的實例包括但不限於小細胞肺癌和非小細胞肺癌，以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細胞瘤(pleuropulmonary blastoma)。腦癌的實例包括但不限於腦幹和下丘腦膠質瘤、小腦和大腦星形細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤，以及神經外胚層和松果體腫瘤。雄性生殖器官的腫瘤包括但不限於前列腺癌和睾丸癌。雌性生殖器官的腫瘤包括但不限於子宮內膜癌、宮頸癌、卵巢癌、陰道癌和外陰癌，以及子宮的肉瘤。消化道的腫瘤包括但不限於肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食管癌、膽囊癌、胃癌、胰腺癌、直腸癌、小腸癌和唾液腺癌。尿道的腫瘤包括但不限於膀胱癌、陰莖癌、腎癌、腎盂癌、輸尿管癌和尿道癌。眼癌包括但不限於眼內黑色素瘤和視網膜胚細胞瘤。肝癌的實例包括但不限於肝細胞癌(具有或不具有纖維板層變體的肝細胞癌)、膽管癌(肝內膽管癌)和混合性肝細胞膽管癌。皮膚癌包括但不限於鱗狀細胞癌、卡波濟氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、惡性黑色素瘤、梅克爾細胞癌(Merkel cell skin cancer)和非黑色素瘤皮膚癌。頭頸癌包括但不限於鼻咽癌以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括但不限於AIDS相關淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、皮膚T細胞淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)和中樞神經系統淋巴瘤。肉瘤包括但不限於軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白血病包括但不限於急性髓性白血病、急性成淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞性白血病和毛細胞白血病。在某些實施方案中，癌症將是具有TGF-β家族成員，諸如啟動蛋白A、肌生成抑制蛋白、TGF-β和GDF15的高表達的癌症，例如胰腺癌、胃癌、卵巢癌、結腸直腸癌、黑色素瘤白血病、肺癌、前列腺癌、腦癌、膀胱癌和頭頸癌。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的慢性腎病(CKD)的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱，其中此類施用減弱肌肉品質的丟失及/或肌肉功能的丟失或抑制腎纖維化。特別地，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱在治療CKD，包括腎衰竭、間質性纖維化和腎透析以及與CKD有關的蛋白能量耗損(protein energy wasting, PEW)中是有用的。該調節可以使該受試者的CKD或PEW改善至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。腎功能的改善可以通過測量尿中的蛋白/肌酐比率(PCR)和腎小球濾過率(GFR)來評價。PEW的改善可以通過測量白蛋白和炎性細胞因數的血清水準、蛋白合成和降解的速率、體重(body mass)、肌肉品質、身體活動和營養結果來評價。
在另一方面，本揭露內容提供了用於治療受試者的關節炎的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。特別地，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱在治療選自類風濕關節炎和骨關節炎的關節炎中是有用的。
在另一方面，本揭露內容提供了用於治療受試者的厭食症的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。特別地，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱在治療選自神經性厭食症和厭食症-惡病質綜合徵的厭食症中是有用的。
在另一方面，本揭露內容提供了用於治療受試者的肝病的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。特別地，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱在治療選自以下的肝病中是有用的：非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝衰竭、自身免疫性肝炎和肝細胞癌。
在另一方面，本揭露內容提供了用於受試者的器官或組織移植的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。特別地，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱在治療選自心臟、腎、肝、肺、胰腺、腸和胸腺的器官移植，或選自骨、肌腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、神經和血管的組織移植的移植中是有用的。
在另一方面，本揭露內容提供了用於治療受試者的貧血的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，貧血選自多種貧血性紊亂，包括癌症相關的貧血、化學療法引起的貧血、慢性腎病相關性貧血、缺鐵性貧血、地中海貧血、鐮狀細胞疾病、再生障礙性貧血和骨髓增生異常綜合徵。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的疼痛的方法，包括向有相應需要的受試者施用治療有效量的本發明的藥物組合物。在一種實施方案中，受試者是人類受試者。在多種實施方案中，疼痛選自神經性疼痛、炎性疼痛或癌痛。
在另一方面，本揭露內容提供了治療受試者的老化的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，老化狀況選自由以下組成的組：老年人的虛弱、年齡相關肌少症和骨關節炎。
在另一方面，本揭露內容提供了在受試者中誘導幹細胞生長用於組織修復或器官再生的方法，包括向該受試者施用治療有效量的(作為單一療法或在組合療法方案中)在藥學上可接受的載體中的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱。在多種實施方案中，幹細胞選自由以下組成的組：肌肉幹(衛星)細胞、心臟幹細胞、骨髓來源間充質幹細胞和多能幹細胞。
在多種實施方案中，本揭露內容提供了抑制受試者中的肌肉品質及/或肌肉功能的丟失的方法，包括將有效量的雜合ActRIIB配體陷阱施用至受試者。該調節可以使該受試者的肌肉品質及/或功能的丟失減弱至少5%、10%、至少25%、至少50%、至少75%或至少90%。肌肉品質和功能的丟失的抑制可以通過利用成像技術和身體力量測試(physical strength test)來評價。用於肌肉品質評價的成像技術的實例包括雙能X射線吸收測定(DEXA)、磁共振成象(MRI)和電腦斷層掃描(CT)。肌肉功能測試的實例包括握力強度測試、登樓測試、簡易體能狀況量表(short physical performance battery，SPPB)和6分鐘步行，以及用於測量呼吸肌強度的最大吸氣壓力(MIP)和最大呼氣壓力(MEP)。
“治療有效量”或“治療有效劑量”指將使被治療的紊亂的一種或更多種症狀減輕至一定程度所施用的治療劑的量。
可以通過確定IC50 從細胞培養測定最初估計治療有效劑量。隨後，可以在動物模型中配製劑量以獲得包括如在細胞培養中確定的IC50 的迴圈血漿濃度範圍。這些資訊可用於更精確地確定人體中的有用劑量。可以例如通過HPLC測量血漿中的水準。確切的組合物、施用途徑和劑量可以由個體醫師鑒於受試者的狀況選擇。
可以調整劑量方案以提供最適的期望應答(例如，治療應答或預防應答)。例如，可以施用單次團注，可以隨時間施用複數分次劑量(複數或重複或維持)並且劑量可以如治療情境的迫切需要指示的按比例減少或增加。為了容易施用和劑量的一致性，配製劑量單位形式的胃腸外組合物是特別有利的。本文使用的劑量單位形式指適於作為用於待被治療的哺乳動物受試者的單一劑量的物理上的分散單元；每一單元含有被計算以產生期望的治療效果的預先確定的量的活性化合物與要求的藥學載體的組合。本揭露內容的劑量單位形式的規格將主要由抗體的獨特性質和待被實現的特定治療效果或預防效果決定。
因此，技術人員將理解，基於本文提供的揭露內容，根據治療領域公知的方法調整劑量和給藥方案。即，最大可耐受劑量可以被容易地確定，並且向受試者提供可檢測的治療益處的有效量也可以被確定，向受試者提供可檢測的治療益處而施用每個劑的時間要求同樣可以被確定。因此，儘管在本文中舉例說明了某些劑量和施用方案，這些實例絕不限制在實踐本揭露內容時可以被提供至受試者的劑量和施用方案。
應注意到，劑量值可以隨著待被緩解的狀況的類型和嚴重性變化，並且可以包括單劑量或多劑量。還應理解，對於任何特定受試者，應根據個體需要和施用或監督組合物的施用的人士的專業判斷隨時間調整具體劑量方案，並且本文列出的劑量範圍僅是示例性的並且不意圖限制所要求保護的組合物的範圍或實踐。另外，使用此揭露內容的組合物的劑量方案可以基於複數因素，包括疾病的類型、受試者的年齡、體重、性別、醫學狀況、狀況的嚴重性、施用途徑和使用的特定抗體。因此，給藥方案可以廣泛變化，但可以使用標準方法常規地確定。例如，可以基於藥代動力學或藥效學參數調整劑量，該參數可以包括臨床作用諸如毒性作用及/或實驗值。因此，本揭露內容包括如技術人員確定的受試者內的劑量遞增(intra- subject dose-escalation)。確定適當的劑量和方案是相關技術領域公知的並且可以被理解為一旦提供本文揭露的教導，則由技術人員掌握。
本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱的治療有效量或預防有效量的示例性、非限制性每日劑量範圍可以為0.001至100 mg/kg體重、0.001至90 mg/kg體重、0.001至80 mg/kg體重、0.001至70 mg/kg體重、0.001至60 mg/kg體重、0.001至50 mg/kg體重、0.001至40 mg/kg體重、0.001至30 mg/kg體重、0.001至20 mg/kg體重、0.001至10 mg/kg體重、0.001至5 mg/kg體重、0.001至4 mg/kg體重、0.001至3 mg/kg體重、0.001至2 mg/kg體重、0.001至1 mg/kg體重、0.010至50 mg/kg體重、0.010至40 mg/kg體重、0.010至30 mg/kg體重、0.010至20 mg/kg體重、0.010至10 mg/kg體重、0.010至5 mg/kg體重、0.010至4 mg/kg體重、0.010至3 mg/kg體重、0.010至2 mg/kg體重、0.010至1 mg/kg體重、0.1至50 mg/kg體重、0.1至40 mg/kg體重、0.1至30 mg/kg體重、0.1至20 mg/kg體重、0.1至10 mg/kg體重、0.1至5 mg/kg體重、0.1至4 mg/kg體重、0.1至3 mg/kg體重、0.1至2 mg/kg體重、0.1至1 mg/kg體重、1至50 mg/kg體重、1至40 mg/kg體重、1至30 mg/kg體重、1至20 mg/kg體重、1至10 mg/kg體重、1至5 mg/kg體重、1至4 mg/kg體重、1至3 mg/kg體重、1至2 mg/kg體重、或1至1 mg/kg體重。應注意到，劑量值可以隨著待被緩解的狀況的類型和嚴重性變化。還應理解，對於任何特定受試者，應根據個體需要和施用或監督組合物的施用的人士的專業判斷隨時間調整具體劑量方案，並且本文列出的劑量範圍僅是示例性的並且不意圖限制所要求保護的組合物的範圍或實踐。
在複數實施方案中，施用的總劑量將獲得範圍在例如約1至1000 μg/ml、約1至750 μg/ml、約1至500 μg/ml、約1至250 μg/ml、約10至1000 μg/ml、約10至750 μg/ml、約10至500 μg/ml、約10至250 μg/ml、約20至1000 μg/ml、約20至750 μg/ml、約20至500 μg/ml、約20至250 μg/ml、約30至1000 μg/ml、約30至750 μg/ml、約30至500 μg/ml、約30至250 μg/ml的血漿抗體濃度。
本揭露內容的藥物組合物的毒性和治療指數可在細胞培養物或實驗動物中通過標準製藥學過程確定，例如，用於確定LD50 (對群體的50%致死的劑量)和ED50 (對群體的50%治療有效的劑量)。毒性和治療有效劑量之間的劑量比是治療指數，並且其可以表示為比率LD50 /ED50 。表現出大治療指數的組合物通常是較佳的。
雜合ActRIIB配體陷阱藥物組合物的施用的給藥頻率取決於療法的性質和被治療的特定疾病。受試者可以以規律間隔治療，諸如每週地或每月地，直到獲得期望的治療結果。示例性的給藥頻率包括但不限於：無間斷地每週一次；每隔一週地每週一次(once weekly, every other week)；每2週一次；每3週一次；無間斷地每週一次，持續2週，隨後每月一次；無間斷地每週一次，持續3週，隨後每月一次；每月一次；每隔一月一次；每3個月一次；每4個月一次；每5個月一次；或每6個月一次，或每年一次。 組合療法
如本文使用的，提及本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱和一種或更多種其他治療劑時，術語“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administered)”和“與...組合(in combination with)”旨在意指，並且的確指並包括以下：當此類組分被一起配製成在基本上同時將該組分釋放至該受試者的單一劑型時，將本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱和一種或更多種治療劑的此類組合同時施用至需要治療的受試者；當此類組分彼此分開配製成在基本上同時被該受試者服用的單獨的劑型，屆時該組分基本上同時釋放至該受試者時，將本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱和一種或更多種治療劑的此類組合基本上同時施用至需要治療的受試者；當此類組分彼此分開配製成以每次施用之間的顯著的時間間隔被該受試者在連續時間服用的單獨的劑型，屆時該組分在基本上不同的時間釋放至該受試者時，將本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱和一種或更多種治療劑的此類組合依次施用至需要治療的受試者；以及，當此類組分一起配製成以受控方式釋放該組分的單一劑型，屆時它們在相同及/或不同的時間同時、連續及/或重疊地釋放至該受試者，將本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱和一種或更多種治療劑的此類組合依次施用至需要治療的受試者，其中每個部分可通過相同或不同的途徑施用。
在另一方面，本揭露內容涉及治療受試者的肌肉萎縮疾病的方法，包括施用以下的組合：a)治療有效量的本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱；和b)第二劑。對於對使用單獨的第二劑治療是耐受性或難治性的肌肉萎縮疾病，該組合療法可以是特別有效的。在多種實施方案中，第二劑選自生長激素、食欲刺激激素(ghrelin)、IGF1、胰島素、潑尼松、皮質類固醇療法、雄激素剝奪療法、促合成類固醇、血管緊張肽或血管緊張肽受體的拮抗劑、炎性細胞因數諸如TNF-α、IL-6、IL-1及其受體的拮抗劑、和肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A或TGF-β家族的另一成員及其受體的其他拮抗劑、雙膦酸鹽(bisphosphonates)、RANKL抑制劑、過氧化物酶體增殖物活化受體的激動劑、β2激動劑、PGC-1α的活化劑、蛋白酶體抑制劑、癌症治療劑、化學治療劑、細胞療法、幹細胞療法、基因療法、基因靶向療法和反義寡核苷酸療法。
在多種實施方案中，組合療法包括同時施用在同一藥物組合物中或在單獨的藥物組合物中的雜合ActRIIB配體陷阱和第二劑組合物。在多種實施方案中，依次施用雜合ActRIIB配體陷阱組合物和第二劑組合物，即，在施用第二劑組合物之前或之後施用雜合ActRIIB配體陷阱組合物。
在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱組合物和第二劑組合物的施用是同時的(concurrent)，即，雜合ActRIIB配體陷阱組合物和第二劑組合物的施用時間段彼此重疊。
在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱組合物和第二劑組合物的施用是非同時的。例如，在多種實施方案中，在施用第二劑組合物之前終止雜合ActRIIB配體陷阱組合物的施用。在多種實施方案中，在施用雜合ActRIIB配體陷阱組合物之前終止施用第二劑組合物。 啟動蛋白受體多肽
如本文使用的，術語啟動蛋白IIB型受體(ActRIIB)指具有登錄號NP_001097.2 (在本文中SEQ ID NO: 45)的人啟動蛋白受體，及其變體。術語“野生型ActRIIB-ECD”指ActRIIB的細胞外結構域，SEQ ID NO: 45的胺基酸1至134 (具有訊號序列)或胺基酸19到134 (不具有訊號序列)(在本文中被稱為SEQ ID NO: 46)。術語啟動蛋白IIA型受體(ActRIIA)指具有登錄號UniProtKB/Swiss-Prot P27037.1 (在本文中SEQ ID NO: 47)的人啟動蛋白受體，及其變體。術語“野生型ActRIIA-ECD”指ActRIIA的細胞外結構域，SEQ ID NO: 46的胺基酸1至135 (具有訊號序列)或胺基酸20到135 (不具有訊號序列)(在本文中被稱為SEQ ID NO: 48)。 可溶雜合ActRIIB多肽
本揭露內容的方法利用源自野生型ActRIIB-ECD和野生型ActRIIA-ECD的新型雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。雜合可溶ActRIIB多肽通過在胺基酸水準上基於序列比對在二截短的ActRII ECD結構域之間的相應位置處，用來自截短的野生型ActRIIA-ECD的胺基酸替換截短的野生型ActRIIB-ECD的一或更多個胺基酸而被特別地工程化。一或更多個胺基酸替換是為了提供如下的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的目的而特別地選擇的：其與野生型ActRIIB-ECD多肽相比，表現出明顯降低的BMP9中和，同時完全保留了強烈的肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A中和。
在多種實施方案中，用於製備新型雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的ActRIIB的截短的細胞外結構域具有以下SEQ ID NO:1列出的110個胺基酸的序列： ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGC WLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPP TAPT (SEQ ID NO: 1)
在多種實施方案中，用於製備新型雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的ActRIIA的截短的細胞外結構域具有以下SEQ ID NO:2列出的110個胺基酸的序列： ETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCW LDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2)
在多種實施方案中，本揭露內容的方法利用分離的新型雜合ActRIIB配體陷阱蛋白，該蛋白包含新型雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，該多肽保留了中和肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A的活性，但表現出顯著降低的BMP9中和。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少1個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少2個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少3個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少4個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少5個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少6個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少7個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少8個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基 R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少9個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基 R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少10個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少15個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基 R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少20個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基 R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少25個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少30個被另一胺基酸置換，並且其中雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:3的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:5的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:6的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71和N72已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:7的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q64、E65、A68、T69、E70、E71和N72已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:8的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基A68、T69、E70、E71和N72已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基F58、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74和F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基A68、T69、E70、E71、N72、Q74和F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29和L33已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:15的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:16的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29和L33已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:17的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:18的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:19的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、L14、E15和S20已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:20的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、L14和E15已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:21的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L14和E15已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:22的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:23的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Y36、S38和K51已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:24的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33和F58已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:25的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E70已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:26的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基F58已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:27的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基F58和E70已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:28的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、Q29、F58和E70已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:29的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、F58和E70已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:30的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28和E70已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:31的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:32的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、A68、T69、E70、E71、N72和Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:33的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Y7、Y8、L14、E15、S20、L22和R24已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:34的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Y36、S38、R40、S42、T45和K51已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:35的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q64和E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:36的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:37的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28和F58已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:51的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:52的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:53的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:54的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:55的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:56的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:57的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:58的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:59的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:60的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:61的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:62的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:63的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:64的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:65的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:66的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:67的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:68的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:70的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:71的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:72的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基I6、Y7、Y8、L14、E15、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:73的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:74的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、K51、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:75的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、L48、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:76的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、T45、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:77的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、T45、L48、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:78的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、T45、L48、K51、Q64、E65已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:79的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q64、E65、F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:80的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R88、T90、H91、L92、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:81的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:82的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、R88、T90、H91、L92、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:83的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:84的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:85的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、K51、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:86的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、L48、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:87的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、T45、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:88的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基T45、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:89的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L48、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:90的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基K51、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:91的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基A68、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:92的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基A68、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:93的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:94的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E71、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:95的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基N72、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:96的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q74、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:97的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、Q29、A68、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:98的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q29、T69、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:99的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:100的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、Q29、K51、T69、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:101的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、Q29、L48、K51、T69E、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:102的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、T45、L48、K51、T69、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:103的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基Q29、L48、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:104的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、L33、Q70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:105的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L33、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:106的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、T45、L48、Q64、E65、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:107的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L33、T45、T69、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:108的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L33、L48、T69、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:109的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L33、T45、L48、E70、R88、T90、H91、L92、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:110的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、L48、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:111的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、T45、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:112的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:113的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基L48、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110 已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:114的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:115的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E28、L48、T79、E70、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108、T110已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:116的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、Y36、S38、R40、S42、T45、L48、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E71、N72、Q74、F84已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。
在多種實施方案中，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽包含SEQ ID NO:117的胺基酸序列，其中SEQ ID NO:1的胺基酸殘基E26、E28、Q29、L33、F56、E68已被SEQ ID NO:2的相應位置中的胺基酸殘基替換。 異源蛋白-Fc結構域
在另一方面，雜合ActRII配體陷阱包含雜合可溶ActRIIB-ECD多肽和至少一種異源蛋白，該至少一種異源蛋白直接或通過接頭序列附連至ActRIIB-ECD多肽以形成在本文中被稱為雜合ActRIIB配體陷阱的融合蛋白。如本文使用的術語“融合蛋白”指具有經由重組DNA技術附連的異源多肽的蛋白。在多種實施方案中，異源蛋白選自但不限於多組胺酸標籤、Glu-Glu、谷胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G、螢光蛋白、麥芽糖結合蛋白(MBP)、人血清白蛋白或Fc多肽或Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域是人IgG Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域源自SEQ ID NO:38列出的人IgG1重鏈恆定結構域序列。在多種實施方案中，Fc結構域為具有SEQ ID NO: 39列出的胺基酸序列的Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域源自SEQ ID NO:40列出的人IgG2重鏈恆定結構域序列。在多種實施方案中，Fc結構域為具有SEQ ID NO: 41列出的胺基酸序列的Fc結構域。在多種實施方案中，Fc結構域源自SEQ ID NO:42列出的人IgG4重鏈恆定結構域序列。在多種實施方案中，Fc結構域為具有SEQ ID NO: 43列出的胺基酸序列的Fc結構域。 接頭
雜合ActRIIB配體陷阱可以任選地還包含“接頭”或“鉸鏈接頭”序列。接頭主要充當雜合可溶ActRIIB-ECD多肽和異源蛋白或其他類型的融合物之間或者二或更多個雜合可溶ActRIIB-ECD多肽之間的間隔物。在多種實施方案中，異源蛋白通過接頭或鉸鏈接頭肽附連至雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。接頭及/或鉸鏈接頭可以是相對地不含二級結構的在5、10、15、20、30、40個或更多個胺基酸之間的人工序列。在多種實施方案中，接頭包含選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天門冬醯胺、麩胺醯胺和離胺酸的胺基酸。在多種實施方案中，接頭由大多數在空間上無阻礙的胺基酸，諸如甘胺酸和丙胺酸組成，並且是聚甘胺酸(特別地(Gly)5 、 (Gly)8 、聚(Gly-Ala)和聚丙胺酸。在多種實施方案中，接頭中G/S含量豐富(例如接頭中至少約60%、70%、80%、90%或更多的胺基酸是G或S)。在多種實施方案中，接頭具有(GGGGS (SEQ ID NO: 44))n 基序，其中n = 1-6。在本領域已經廣泛地描述了此類接頭和鉸鏈接頭(參見例如US 8,410,043 (Sun等)，為了教導此類接頭的目的通過引用併入本文)。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭和具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭被用於將人IgG1 Fc (SEQ ID NO: 39)或人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至本揭露內容的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
接頭還可以是非肽接頭。例如，可使用烷基(alkyl)接頭，諸如--NH--(CH2 )s -C(O)--，其中s = 2-20。這些烷基接頭還可以被在空間上不阻礙的基團取代，諸如低級烷基(lower alkyl)(例如C1 -C6 )、低級醯基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH2 、苯基等。 雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的分子構造
應理解的是，雜合ActRIIB配體陷阱的不同元件可以以與期望的功能一致的任何方式佈置。例如，可以將異源蛋白佈置至雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的C末端，或任選地可以將雜合可溶ActRIIB-ECD多肽佈置至異源結構域的C末端。雜合可溶ActRII-ECD多肽結構域和異源結構域不需要鄰接，並且可以在任一結構域的C-末端或N-末端或者在結構域之間包含另外的結構域或胺基酸序列(即包含本文描述的接頭)。在第1圖中示出了新型ActRIIB配體陷阱的示例性分子構造。
編碼雜合ActRIIB配體陷阱的合成的DNA盒的示例性構造通常可以被描述為包含以下元件：1)置於N末端的訊號肽(或前導序列)，其可以是ActRIIB的天然訊號肽(例如SEQ ID NO:49)或能夠介導分泌蛋白的加工和分泌的任何替代訊號肽(例如通過使用人免疫球蛋白輕鏈前導序列(SEQ ID NO:50)作為替代訊號肽，可以實現CHO細胞中雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的有效分泌)；2)融合至訊號肽序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽序列(例如SEQ ID NO: 3-37或51-117中的任一種)；3)肽接頭序列(例如SEQ ID NO:44)和鉸鏈接頭序列(SEQ ID NO:118)，以及4)通過肽/鉸鏈接頭融合至雜合可溶ActRIIB-ECD多肽序列的Fc結構域(例如SEQ ID NO:39、41或43)。
本揭露內容的多種實施方案的實例包括，但不限於，表2中描述的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白。 表2
多核苷酸 在另一方面，本揭露內容提供了分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含編碼本揭露內容的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的多核苷酸。主題核酸可以是單鏈的或雙鏈的。此類核酸可以是DNA或RNA分子。DNA包括例如cDNA、基因組DNA、合成的DNA、通過PCR擴增的DNA及其組合。編碼ActRIIB多肽的基因組DNA獲取自基因組文庫，該基因組文庫對很多物種是可得的。合成的DNA是從化學合成重疊的寡核苷酸片段然後組裝片段以重構編碼區域和側翼序列的部分或全部可得的。可以從指導mRNA的高水準合成的原核表達載體，諸如使用T7啟動子和RNA聚合酶的載體獲得RNA。cDNA獲取自從分離自表達ActRIIB的多種組織的mRNA製備的文庫。本揭露內容的DNA分子包括全長基因以及多核苷酸及其片段。全長基因還可以包含編碼N-末端訊號序列的序列。
此類核酸可以例如在用於製備新型雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的方法中使用。在多種實施方案中，該多核苷酸編碼SEQ ID NO:3-37或51-117列出的多肽序列中的任一種，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，該多核苷酸編碼具有與SEQ ID NO:3-37或51-117列出的多肽序列中的任一具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列的多肽，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，該多核苷酸編碼與SEQ ID NO:3-37或51-117列出的多肽序列中的任一具有至少90%同一性的多肽，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，該多核苷酸編碼具有與SEQ ID NO:3-37或51-117列出的多肽序列中的任一至少95%同一的胺基酸序列的多肽，其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。在多種實施方案中，本揭露內容的核酸序列可以是分離的、重組的、及/或與異源核苷酸序列融合、或是DNA文庫中的。
在多種實施方案中，本揭露內容提供了核酸分子，該核酸分子在嚴格或中等條件下與本文描述的多核苷酸的多肽編碼區域雜交，其中編碼的多肽包含SEQ ID NO:3-37或51-117列出的胺基酸序列，並且其中編碼的多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。本領域技術人員將容易地理解，促進DNA雜交的適當嚴格度條件可以變化。例如，技術人員可以在約45℃在6.0 X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)進行雜交，然後在50℃用2.0 X SSC洗滌。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自在50℃約2.0 X SSC的低嚴格度至在50℃約0.2 X SSC的高嚴格度。另外，洗滌步驟中的溫度可以從在室溫，約22℃的低嚴格度條件升高至在約65℃的高嚴格度條件。溫度和鹽二者均可以變化，或者溫度或鹽濃度可以保持恆定而另一變數改變。在一種實施方案中，本揭露內容提供了在室溫在6 X SSC的低嚴格度條件雜交，然後在室溫在2 X SSC洗滌的核酸。
在多種實施方案中，分離的核酸分子包含本文描述的多核苷酸，並且還包含編碼至少一種本文描述的異源蛋白的多核苷酸。在多種實施方案中，核酸分子還包含編碼本文描述的接頭或鉸鏈接頭的多核苷酸。
在多種實施方案中，本揭露內容的重組核酸可以可操作地連接至表達構建體中的一種或更多種調控核苷酸序列。調控序列是本領域所認知的並且被選擇以指導雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的表達。因此，術語調控序列包括啟動子、增強子和其他表達控制元件。示例性調控序列描述於Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。通常，該一種或更多種調控核苷酸序列可以包含但不限於啟動子序列、前導或訊號序列、核糖體結合位元點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強子或啟動物(activator)序列。本揭露內容構思了本領域已知的組成型或誘導型啟動子。啟動子可以是自然存在的啟動子或者組合多於一啟動子的元件的雜合啟動子。表達構建體可以存在於細胞中的附加體諸如質粒上，或者表達構建體可以插入染色體中。在多種實施方案中，表達構建體包含可選擇的標誌物基因以允許轉化的宿主細胞的選擇。可選擇的標誌物基因是本領域眾所週知的並且將隨著使用的宿主細胞變化。
在本揭露內容的另一方面，在包含編碼雜合可溶ActRIIB-ECD多肽並可操作地連接至至少一調控序列的核苷酸序列的表達載體中提供主題核酸。術語“表達載體”指用於從多核苷酸序列表達多肽的質粒、噬菌體、病毒或載體。適合於在宿主細胞中表達的載體是容易地可得的並利用標準重組DNA技術將核酸分子插入到載體中。此類載體可以包括很多種表達控制序列，當被可操作地連接至DNA序列時，該表達控制序列控制該DNA序列的表達，並可以在這些載體中使用以表達編碼雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的DNA序列。此類有用的表達控制序列包括例如SV40的早期啟動子和晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒介導的早期啟動子、RSV啟動子、lac系統、trp系統、TAC或TRC系統、其表達由T7 RNA聚合酶指導的T7啟動子、λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區域、fd包衣蛋白的控制區域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶例如PhoS的啟動子、酵母a-交配因數的啟動子、杆狀病毒系統的多角體啟動子和已知控制原核細胞或真核細胞或其病毒的基因表達的其他序列，及其各種組合。應理解的是，表達載體的設計可以取決於諸如待轉化的宿主細胞的選擇及/或期望表達的蛋白的類型的因素。此外，還應考慮載體的拷貝數、控制該拷貝數的能力、以及載體編碼的任何其他蛋白諸如抗生素標誌物的表達。適合於vActRIIB的表達的示例性表達載體是包含vActRIIB多核苷酸的pDSRa (描述於WO 90/14363，通過引用併入本文)及其衍生物，以及本領域已知或以下描述的任何另外的合適的載體。
本揭露內容的重組核酸可以通過將複製的基因或其一部分連接到適合於在原核細胞、真核細胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)或兩者中表達的載體中來產生。用於產生重組ActRIIB多肽的表達載體包括質粒和其他載體。例如，合適的載體包括以下類型的質粒：用於在原核細胞諸如大腸桿菌(E. coli )中表達的pBR322衍生的質粒、pEMBL衍生的質粒、pEX衍生的質粒、pBTac衍生的質粒和pUC衍生的質粒。
一些哺乳動物表達載體包含利於載體在細菌中增殖的原核序列以及在真核細胞中表達的一種或更多種真核轉錄單元兩者。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的載體為適合於轉染真核細胞的哺乳動物表達載體的實例。這些載體中的一些來自細菌質粒諸如pBR322的序列修飾，以利於在原核細胞和真核細胞兩者中複製和藥物耐受性選擇。可選地，病毒諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒的衍生物(pHEBo、pREP衍生的和p205)可以用於蛋白在真核細胞中的暫時表達。以下在基因療法遞送系統的說明中可以找到其他病毒(包括反轉錄病毒)表達系統的實例。在質粒的製備中以及在宿主生物體的轉化中採用的各種方法是本領域眾所週知的。對於適合於原核細胞和真核細胞兩者的其他表達系統以及一般的重組程式，參見Sambrook、Fritsch和Maniatis的Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 第16和17章。在一些實例中，可以期望通過使用杆狀病毒表達系統表達重組多肽。此類杆狀病毒表達系統的實例包括pVL衍生的載體(諸如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的載體(諸如pAcUW1)以及pBlueBac衍生的載體(諸如含有B-gal的pBlueBac III)。
在多種實施方案中，載體將被設計用於在CHO細胞中產生主題雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，諸如Pcmv-Script載體(Stratagene, La Jolla, Calif.)、pcDNA4載體(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)和pCI-neo載體(Promega, Madison, Wis.)。將明顯的是，主題基因構建體可以被用於引起主題雜合可溶ActRIIB-ECD多肽在增殖於培養基中的細胞中表達，例如以產生用於純化的蛋白，包括融合蛋白或變體蛋白。
本揭露內容還涉及用重組基因轉染的宿主細胞，該重組基因包含編碼一種或更多種主題雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的胺基酸序列(例如，SEQ ID NO:3-37或51-117)的核苷酸序列。宿主細胞可以是任何原核細胞或真核細胞。例如，本揭露內容的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽可以在細菌細胞諸如大腸桿菌、昆蟲細胞(例如，使用杆狀病毒表達系統)、酵母、或哺乳動物細胞中表達。其他的合適的宿主細胞對於本領域技術人員是已知的。
因此，本揭露內容還涉及產生主題雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的方法。例如，可以在適當的條件下培養用編碼雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的表達載體轉染的宿主細胞，以允許發生雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的表達。雜合可溶ActRIIB-ECD多肽可以從含有雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的細胞和培養基的混合物分泌和分離。可選地，雜合可溶ActRIIB-ECD多肽可以保留在細胞質中或保留在膜級分中，並收穫、裂解細胞和分離蛋白。細胞培養物包括宿主細胞、培養基和其他的副產物。用於細胞培養的合適培養基是本領域熟知的。
本揭露內容的多肽和蛋白可以根據本領域技術人員所熟知的蛋白純化技術來純化。這些技術在一層面上包括蛋白級分和非蛋白級分的粗分級。已經將肽或多肽與其他蛋白分離，可以利用層析技術和電泳技術進一步純化感興趣的肽或多肽以實現部分或完全純化(或純化至均一)。如本文使用的術語“分離的多肽”或“純化的多肽”意圖指與其他組分可分離的組合物，其中多肽被純化至相對於其天然可獲得的狀態的任何程度。因此純化的多肽還指脫離其可以天然存在的環境的多肽。通常，“純化的”將指已經經歷分級移除多種其他組分的多肽組合物，並且該組合物基本上保留了其表達的生物活性。當使用術語“基本上純化的”時，該指定將指如下肽或多肽組合物：其中多肽或肽形成該組合物的主要組分，諸如構成該組合物中的蛋白的約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、或約90%或更多。
適合用於純化的多種技術對於本領域技術人員將是熟知的。這些技術包括例如用硫酸銨、PEG、抗體(免疫沉澱)等或通過熱變性沉澱然後離心；層析，諸如親和層析(蛋白A柱)、離子交換、凝膠過濾、反相、羥基磷灰石、疏水相互作用層析；等電聚焦；凝膠電泳；以及這些技術的組合。如本領域通常已知的，認為進行多種純化步驟的順序可以改變，或者某些步驟可以省略，並且仍導致用於製備基本上純化的多肽的合適方法。 藥物組合物
在另一方面，本揭露內容提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含與藥學上可接受的載體混合的分離的雜合可溶ActRIIB多肽或雜合ActRIIB配體陷阱蛋白。此類藥學上可接受的載體是本領域普通技術人員所熟知並理解的，並且已被廣泛描述(參見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版, A. R. Gennaro編輯, Mack Publishing Company, 1990)。可以包括藥學上可接受的載體用於改變、保持或維持例如組合物的pH、滲量(osmolarity)、黏度、透光率、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透的目的。此類藥物組合物可以影響多肽的物理狀態、穩定性、體內釋放速率、以及體內清除速率。合適的藥學上可接受的載體包括但不限於，胺基酸(諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天門冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機酸)；填料(bulking agent)(諸如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；複合劑(complexing agent)(諸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑(filler)；單糖；二糖和其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調味和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；鹽形成抗衡離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯已定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(諸如普朗尼克，PEG，山梨醇酐酯(sorbitan esters)，聚山梨醇酯諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，triton，胺丁三醇，卵磷脂，膽固醇，tyloxapal)；穩定性增強劑(蔗糖或山梨醇)；張度增強劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇和山梨醇)；遞送媒介物；稀釋劑；成形劑及/或藥物佐劑。
藥物組合物中的主要媒介物(vehicle)或載體(carrier)性質上可以是水性的或非水性的。例如，合適的媒介物或載體可以是可能用用於胃腸外施用的組合物中常見的其他材料補充的注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊液。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是另外的示例性媒介物。其他的示例性藥物組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5的醋酸鹽緩衝液，其還可以包含山梨醇或其合適的替代物。在本揭露內容的一種實施方案中，可以通過將選擇的具有期望的純度的組合物與任選的製劑用劑(formulation agent)(Remington’s Pharmaceutical Sciences，同上)混合來製備組合物用於以凍乾的塊狀物或水性溶液形式貯存。另外，可以使用適當的成形劑諸如蔗糖將治療性組合物配製為凍乾物。最佳的藥物組合物將取決於例如意圖的施用途徑、遞送形式或期望的劑量由本領域普通技術人員來確定。
當構思胃腸外施用時，治療性藥物組合物可以為在藥學上可接受的媒介物中包含期望的ActRIIB多肽的無致熱原、胃腸外可接受的水性溶液的形式。特別適用於胃腸外注射的媒介物是無菌蒸餾水，其中多肽被配製為適當地儲存的無菌、等滲溶液。在多種實施方案中，適用於可注射施用的藥物製劑可以在水性溶液，較佳地在生理上相容的緩衝液諸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理緩衝鹽水中配製。含水注射懸浮液可以包含增加懸浮液黏度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、或右旋糖酐。另外，可以將活性化合物的懸浮液製備成適當的油注射懸浮液。任選地，懸浮液還可以包含合適的穩定劑或增加化合物的溶解度並允許高度濃縮的溶液的製備的劑。
在多種實施方案中，可以使用膠體分散系統將治療性藥物組合物配製為用於靶向遞送。膠體分散系統包括大分子複合體、奈米膠囊、微球、珠、和基於脂質的系統，基於脂質的系統包括水包油乳液、微團、混合的微團和脂質體。在脂質體產生中有用的脂質的實例包括磷脂醯化合物，諸如磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷酯醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經節苷脂。示例性磷脂包括蛋卵磷脂、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼和二硬脂醯磷脂醯膽鹼。脂質體的靶向還可能基於例如器官特異性、細胞特異性和細胞器特異性並且是本領域已知的。
在多種實施方案中，構思了藥物組合物的口服施用。以該形式施用的藥物組合物可以使用或不使用固體劑型諸如片劑和膠囊的複合中通常使用的那些載體配製。在用於口服施用的固體劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、粉末、顆粒等)中，本揭露內容的一種或更多種治療化合物可以與一種或更多種藥學上可接受的載體諸如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣(dicalcium phosphate)，及/或以下中的任一種混合：(1)填充劑或增量劑(extender)，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或矽酸；(2)黏合劑，諸如例如羧甲基纖維素、藻酸鹽(alginate)、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖及/或阿拉伯樹膠；(3)保濕劑，諸如甘油；(4)崩解劑，諸如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、藻酸、某些矽酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，諸如石蠟；(6)吸收加速劑，諸如季銨化合物；(7)潤濕劑，諸如例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，諸如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、及其混合物；以及(10)著色劑。在膠囊、片劑和丸劑的情況中，藥物組合物還可以包含緩衝劑。相似類型的固體組合物還可以使用諸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的成形劑作為軟填充和硬填充的明膠膠囊中的填充劑。用於口服施用的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿劑和酏劑。除了活性成分之外，液體劑型可以包含本領域中常用的惰性稀釋劑，諸如水或其他的溶劑、增溶劑和乳化劑諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯、以及其混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物還可以包含佐劑，諸如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、增甜劑、調味劑、著色劑、增香劑和防腐劑。
在多種實施方案中，構思了將藥物組合物局部施用(topical administration)至皮膚或施用至黏膜。局部製劑還可以包含已知作為皮膚或角質層滲透增強劑有效的很多種劑中的一種或更多種。這些劑的實例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、丙二醇、甲醇或異丙醇、二甲基亞碸和氮酮。還可以包含另外的劑以使製劑在化妝品上可接受。這些劑的實例是脂肪、蠟、油、染料、芳香劑、防腐劑、穩定劑和表面活性劑。還可以包含角質軟化劑(keratolytic agent)，諸如本領域已知的那些角質軟化劑。實例是水楊酸和硫磺。用於局部或經皮施用的劑型包括粉末、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、霜劑、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。可以在無菌條件下將活性化合物與藥學上可接受的載體以及與可能需要的任何防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。除了本揭露內容的主題化合物(例如，雜合ActRIIB配體陷阱)之外，軟膏劑、糊劑、霜劑和凝膠可以包含成形劑，諸如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽酮、膨潤土、矽酸、滑石和氧化鋅，或其混合物。
在本文中構思用於使用的另外的藥物組合物包括在持續或控制遞送的製劑中包含多肽的製劑。用於配製多種其他持續或控制遞送工具諸如脂質體載體、生物可侵蝕的微粒或多孔珠和貯庫型注射劑的技術也是本領域技術人員所已知的。
待在治療上使用的藥物組合物的有效量將取決於例如治療背景和治療目標。本領域技術人員將領會到，用於治療的適當劑量水準將因此部分地取決於遞送的分子、多肽所用於的適應症、施用途徑、以及患者的尺寸(體重、體表或器官尺寸)和狀況(年齡和總體健康)而變化。因此，臨床醫師可以調整劑量並且改變施用途徑以獲得最佳治療效果。通常的劑量可以取決於以上提到的因素從約0.1 mg/kg至多達約100 mg/kg或更多變化。多肽組合物可以較佳地靜脈內注射或施用。長效藥物組合物可以取決於特定製劑的半衰期和清除速率每三天至每四天、每週、或每兩週施用。給藥頻率將取決於使用的製劑中的多肽的藥代動力學參數。通常，施用組合物直至達到實現期望的效果的劑量。因此組合物可以作為單劑量，或作為隨時間的複數劑量(相同或不同的濃度/劑量)，或者作為持續的輸注施用。常規地進行適當劑量的進一步改進。適當的劑量可以通過使用適當劑量回應資料來確定。
藥物組合物的施用途徑根據已知方法，例如口服；通過靜脈內、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內、病灶內途徑、髓內、囊內、心室內、經皮、皮下或腹膜內注射；以及鼻內、腸內、局部、舌下、尿道、陰道或直腸方式；通過持續釋放系統或通過植入裝置。當期望時，組合物可以通過團注(bolus)注射施用，或通過輸注持續施用，或通過植入裝置施用。可選地或另外地，組合物可以經由期望的分子已經吸附或包封至其上的膜、海綿狀物或另一種適當的材料的植入局部施用。當使用植入裝置時，可以將該裝置植入到任何合適的組織或器官中，並且期望的分子的遞送可以經由擴散施用、緩釋團注或持續施用。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的肌肉萎縮的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的骨紊亂的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的代謝紊亂的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的纖維化的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的自身免疫/炎性疾病的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的心血管疾病的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的癌細胞的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的腎疾病的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的關節炎的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的厭食症的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的肝病的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種誘導幹細胞生長用於受試者的組織修復或器官再生的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的貧血的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的疼痛的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
在多種實施方案中，本揭露內容提供一種用於治療受試者的老化的方法，包括向受試者施用治療有效量的與藥學上可接受的載體混合的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的可溶ActRIIB-ECD多肽。在多種實施方案中，具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 43)連接至藥物組合物的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
給出以下實施例以更充分地說明本揭露內容，但並不被理解為限制其範圍。 實施例1
本揭露內容的多肽可以根據本領域技術人員所熟知的重組DNA技術來製備。在此實例中，一般性地描述了雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的製備。
通過將人ActRIIB細胞外結構域內的選擇性位置處的複數胺基酸殘基用基於在胺基酸水準上的序列比對的相應位置處的源自人ActRIIA細胞外結構域的胺基酸殘基置換，設計多種雜合ActRIIB-ECD多肽。編碼雜合ActRIIB-ECD多肽的DNA表達盒通過利用定點誘變生成，並且隨後通過符合讀框地在5’末端放置編碼人免疫球蛋白輕鏈訊號肽的cDNA片段並在3’末端放置編碼肽接頭然後人Fc的DNA片段，被工程化為Fc融合蛋白構建體。 實施例2
在該實施例中，一般性地描述了如第1圖中示出的構造的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的製備。
將編碼多種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的合成DNA盒複製到Freedom pCHO 1.0和pcDNA3.1表達載體(Life Technologies)中，每種所述合成DNA盒包含訊號肽前導序列(SEQ ID NO:49或50)、來自實施例1的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽(或野生型ActRIIB-ECD序列)、肽接頭序列(SEQ ID NO:44)、鉸鏈接頭序列(SEQ ID NO:118)和Fc結構域序列(SEQ ID NO:39或41或43)。
對於穩定轉染，使用FreeStyle MAX試劑(Life Technologies)將編碼多種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的pCHO 1.0表達載體各自轉染至CHO-S細胞。轉染後48小時，使細胞在37℃在CO2 震盪培養箱中在包含嘌呤黴素和胺甲喋呤(MTX)選擇的無血清CD FortiCHO培養基中生長持續3-7週。在包含30 M嘌呤黴素和500 nM胺甲喋呤的條件下，直到細胞超過90%的生存力才產生穩定的庫(pool)。通過按照製造商的推薦方案(Life Technologies)稀釋複製來生產穩定的複製。對於暫時轉染，使用ExpriFectamine293轉染試劑(Life Technologies)將編碼多種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的pcDNA3.1表達質粒各自轉染至Expi293細胞。
轉染後，使穩定轉染的CHO-S細胞在37o C在CO2 震盪培養箱中在補充有葡萄糖的完全無血清CD FortiCHO培養基(completed serum-free CD FortiCHO medium)中生長持續直至14天。收集條件培養液用於蛋白純化。在37o C在CO2 震盪培養箱中，在Expi293表達培養基中培養暫時轉染的Expi293細胞持續直至7天，並收集培養基用於蛋白純化。
對於純化，通過利用AKTA FPLC (GE Healthcare)經由Hitrap蛋白A高性能柱(Hitrap Protein A High Performance Column)純化包含雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的條件培養基。將雜合ActRIIB配體陷阱蛋白用經1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和的醋酸緩衝液(pH 3.6)洗脫，並且然後經歷緩衝液交換。通過使用分光光度計(Beckman)確定蛋白濃度。 實施例3
在該實施例中，評價了7種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的肌生成抑制蛋白和BMP9結合活性。
利用Octect Red (ForteBio)初始地分析多種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的肌生成抑制蛋白和BMP9結合活性。以最大載量將純化的蛋白或條件培養基單獨地裝載至AHC生物感測器。在基線洗滌階段後，將感測器分別暴露至10 nM肌生成抑制蛋白或BMP9用於締合步驟，然後是解離步驟。所有的實驗以1,000 rpm震盪進行。利用ForteBio的軟體，用使用比率Kd/Ka計算的KD分析結合活性。 結果
檢查雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的肌生成抑制蛋白和BMP9的結合活性以與野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白比較。結果表明，與野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白相比，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白表現出對BMP9的結合親和力的明顯降低。很多雜合ActRIIB配體陷阱蛋白顯示出BMP9結合親和力的劇烈降低，比野生型ActRIIB-ECD-Fc蛋白的BMP9結合親和力弱100倍，並且同時他們保留了與野生型ActRIIB-ECD-Fc蛋白的肌生成抑制蛋白結合親和力相似的強肌生成抑制蛋白結合親和力。通過Octet Red分析獲得的初步結合資料的總結被示於表3。 表3 +++ KD ＜10-8 M ++ KD: 10-6 - 10-7 M + KD 10-4 - 10-6 M N.D. 無可檢測的結合
通過動力學排除測定(kinetic exclusion assay，KinExA)(Sapidyne Instruments, Inc.)分析AG-0014和AG-0027。使用Sapidyne Instruments推薦的實驗程式將20-30 μg/ml的肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A或BMP9分別偶聯至NHS活化瓊脂糖凝膠4快流珠(NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow beads，GE Healthcare)。隨著以2.5倍系列稀釋滴定配體，每種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的濃度保持恆定。通過在室溫孵育直至24小時允許溶液達到平衡，並且隨後使溶液通過KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments)上用配體包被的瓊脂糖凝膠珠預先填充的流動池。通過Alexa Fluor 647標記的山羊抗人Fc抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)檢測捕獲到珠上的游離雜合ActRIIB配體陷阱蛋白。利用KinExA Pro軟體(Sapidyne Instruments)計算配體結合親和力值(KD )。 結果
通過KinExA分析獲得的初步結合資料的總結被示於表4。資料表明，與野生型ActRIIB-Fc相似，兩種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白對肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A兩者具有在個位數pM的範圍(single-digit pM range)的高親和力。但是，與表現出對BMP9在個位數pM的範圍的強結合親和力的野生型ActRIIB-Fc相反，兩種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白對BMP9未顯示出可檢測的結合。 表4 實施例4
在該實施例中，描述了肌生成抑制蛋白/啟動蛋白A訊號傳導測定和BMP9訊號傳導測定，其分別被用於定量雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的肌生成抑制蛋白/啟動蛋白A阻斷活性和BMP9阻斷活性。
為了評價肌生成抑制蛋白/啟動蛋白A訊號傳導，將具有12個重複的CAGA序列的報導子構建體(Dennler等, EMBO 17:3091-3100, 1998)複製到pGL3-luc報導子載體(Promega)中。將工程化的pGL3-CAGA12-luc載體穩定地轉染到C2C12細胞中，以生成能夠感應肌生成抑制蛋白或啟動蛋白A介導的Smad3/4訊號傳導的螢光素酶報導子細胞系C2C12-CAGA-luc。為了測量肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A中和活性，將4 nM重組肌生成抑制蛋白或啟動蛋白A與遞增濃度的多種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白以及野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白(作為對照)一起在室溫預孵育，持續1小時。隨後，將反應混合物添加至C2C12-CAGA-luc細胞培養物。在CO2 培養箱中在37o C孵育持續5小時後，通過使用LuminoSkan Ascent (Thermo Scientific)測量C2C12-CAGA-luc報導子培養物的螢光素酶活性。
在已經用包含感應Smad1/5/8訊號傳導的BMP響應元件(BRE)的螢光素酶報導子穩定轉染的C2C12細胞中測試BMP9訊號傳導(Korchynski等, J. Biol.Chem.277:4883-4891, 2002)。特別地，合成2個重複的BMP響應元件(Briter等, PLoS One, 2012)並將其複製到pGL3-luc載體(Promega)中。然後將pGL3-2XBRE-luc載體穩定地轉染到C2C12細胞中。使用穩定轉染的報導子細胞系C2C12-BRE-luc來定量BMP9介導的Smad1/5/8訊號傳導。為了測量BMP中和活性，將4 nM BMP9與遞增濃度的多種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白以及野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白(作為對照)一起在室溫預孵育，持續1小時。然後將反應混合物添加至C2C12-BRE-luc細胞培養物。在CO2 培養箱中在37o C孵育5小時後，通過使用LuminoSkan Ascent (Thermo Scientific)測量C2C12 BRE-luc報導子培養物的螢光素酶活性。 結果
結果顯示，與野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白相比，兩種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白保留了強的肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A中和活性，但具有明顯降低的BMP9中和活性(參見第2圖)。第2圖顯示了與野生型對照ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白對肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A和BMP9的基於細胞的中和活性相比，2種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白AG-0003 (SEQ ID NO:5)和AG-0005 (SEQ ID NO:7)對肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A和BMP9的基於細胞的中和活性。 實施例5
在該實施例中，在實施例4中描述的肌生成抑制蛋白/啟動蛋白A訊號傳導測定和BMP9訊號傳導測定分別被用於定量以下雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的肌生成抑制蛋白/啟動蛋白A阻斷活性和BMP9阻斷活性：AG-0003 (SEQ ID NO: 5)、AG-0014 (SEQ ID NO: 16)、AG-0023 (SEQ ID NO: 25)、AG-0024 (SEQ ID NO: 26)、AG-0025 (SEQ ID NO: 27)、AG-0027 (SEQ ID NO: 29)、AG-0028 (SEQ ID NO: 30)、AG-0029 (SEQ ID NO: 31)和AG-0035 (SEQ ID NO: 37)。 結果
結果顯示，與野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白相比，這些雜合ActRIIB配體陷阱蛋白中的若干種保留了強的肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A中和活性，但具有明顯降低的BMP9中和活性。第3圖顯示了與野生型對照ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白的對肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A和BMP9的基於細胞的中和活性相比，2種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白AG-0014和AG-0027對肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A和BMP9的基於細胞的中和活性。
並且如表5和6中顯示的，與野生型ActRIIB-ECD-Fc融合蛋白(WT ActRIIB-Fc)相比，多種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白在基於細胞的Smad1/5/8 BRE-luc報導子測定中顯示出劇烈降低的BMP9中和活性，而在基於細胞的Smad2/3 CAGA-luc報導子測定中保留了對肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A和啟動蛋白B的強烈的中和活性。表5分別顯示了與WT ActRIIB-Fc的基於細胞的對肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A、啟動蛋白B和BMP9的中和的IC50 值相比，AG-0014和AG-0027的那些IC50 值。表6概述了與WT ActRIIB-Fc的BMP9和肌生成抑制蛋白的中和活性相比，若干種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的BMP9和肌生成抑制蛋白中和活性。與WT ActRIIB-Fc相比，雜合蛋白AG-0003、AG-0004、AG-0005、AG-0014、AG-0023、AG-0024、AG-0025、AG-0027和AG-0028顯示出劇烈降低的或幾乎無BMP9中和活性(還參見第10圖)；AG-0003、AG-0005、AG-0014和AG-0027保留了全部的肌生成抑制蛋白中和活性，而AG-0004、AG-0023、AG-0024、AG-0025和AG-0028表現出肌生成抑制蛋白中和活性的損失(還參見第11圖)。總而言之，這些結果表明多種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白優先地阻斷肌生成抑制蛋白/啟動蛋白介導的Smad2/3訊號傳導，最小地損害或不損害BMP9介導的Smad1/5/8訊號傳導的能力。 表5 N.D.: 無可檢測的中和活性 表6 ++++：完全的中和活性；+++：部分的中和活性；++：弱的中和活性；+：很弱的中和活性；+/-：很少的或無中和活性；-：無中和活性 實施例6
在該實施例中，在分別用10 mg/kg的劑量的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)每週一次皮下注射的9週齡雄性C57Bl/6小鼠中評價對體重和肌肉品質的影響。在第0天、第5天、第12天和第18天記錄體重。每組n= 6/8。體重變化的值被計算為從第0天的基線的重量增加的百分比。在末期屍檢期間，將來自每隻動物的單獨的腓腸肌解剖並稱重。將值表示為每個處理組中的平均腓腸肌品質與媒介物組的平均腓腸肌品質相比的增加百分比。如第4圖和第5圖和表7中示出的，施用兩種示例性雜合配體陷阱蛋白中的每一種能夠在小鼠中以與野生型ActRIIB-Fc相似的方式明顯增加體重獲得。 表7 從基線的體重增加 組 第5天 第12天 第18天 媒介物 1.5 % 3.9 % 5.6 % WT ActRIIB-Fc 9.4 % 20.1 % 25.8 % AG-0014 9.0 % 16.8 % 25.2 % AG-0027 7.1 % 18.1 % 24.3 %
如第5圖和表8中示出的，分別施用兩種示例性雜合配體陷阱蛋白AG-0014和AG-0027能夠在小鼠中以與野生型ActRIIB-Fc相似的方式明顯增加肌肉品質。 表8 與媒介物相比的肌肉品質增加 組 與媒介物相比腓腸肌品質的增加 WT ActRIIB-Fc 31.3 % AG-0014 30.0 % AG-0027 30.7 % 實施例7
在該實施例中，評價了對分別用10 mg/kg的劑量的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc (WT)、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)每週一次處理的8週齡雄性BalbC小鼠的小鼠腹腔、小鼠睾丸和小鼠肺組織中的伊文思藍滲透性的影響。在處理後兩週，將200 μl伊文思藍染料(在PBS中0.5%，pH7.2)經由尾靜脈注射入每組動物(n=4)。在伊文思藍染料注射後90 min進行屍檢。如分別在第6至第8圖中標記的，顯示了每組的以外科手術的方式暴露的腹腔、解剖的睾丸器官和解剖的肺組織的代表性影像。藍色表明血管的洩露。將睾丸和肺組織稱重，並且然後單獨地置於含有甲醯胺的小瓶中，以提取伊文思藍染料。在55o C孵育持續24小時後，對樣品離心。使用分光光度計在610 nm的波長測量每個樣品的水相的吸光度。在第9圖中顯示了在不同處理組中，每mg濕肺組織(左圖)和睾丸組織(右圖)的滲出的伊文思藍染料的量。
重要的是，如第6圖至第9圖中所示出的，在處理的動物中在評價的所有組織中，與野生型ActRIIB-Fc蛋白相比，施用兩種示例性雜合配體陷阱蛋白明顯地降低了血管洩露的水準。 實施例8
進行自動ELISA分析以進一步表徵與野生型ActRIIB ECD-Fc和野生型ActRIIA ECD-Fc兩者相比，不同濃度的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的BMP9結合。如第12圖中顯示的，資料顯示，兩種示例性雜合蛋白AG-0014和AG-0027與WT ActRIIB-Fc或WT ActRIIA-Fc相比分別表現出大大地降低的BMP9結合。這些資料表明，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白具有不同於WT ActRIIB-Fc和WT ActRIIA-Fc的明顯的BMP9結合選擇性。 實施例9
在該實施例中，評價了雜合ActRIIB配體陷阱蛋白AG-0014 (SEQ ID NO: 16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)與基準野生型ActRIIB-Fc之間的差異，特別是關於其對雌性129S1/SvlmJ小鼠中的甲床中的血管完整性和出血的潛在影響。
將24隻年輕成年雌性129S1/SvlmJ小鼠(Jackson Laboratory)分成4個實驗組(每組n=6)，並隨後分別用媒介物(PBS)或用重複高劑量的野生型ActRIIB-Fc (WT)、AG-0027和AG-0014處理，使用如以下表9中所示的劑量方案： 表9
在處理4週後，將每隻動物放置在透明底的容器中並使用倒置顯微鏡檢查爪甲床中的任何出血跡象。
如第13圖中所示的，對總體形態學的顯微鏡檢查揭示，在已經用重複高劑量的野生型ActRIIB-Fc (WT-ActRIIB-Fc)處理的六隻129S1/SvlmJ小鼠的每一隻中，幾乎所有爪甲床具有清楚的出血跡象(第13圖，第二圖)。與之相比，在用重複高劑量的兩種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的任一種處理的129S1/SvlmJ小鼠中未觀察到爪甲床的出血跡象。雜合ActRIIB配體陷阱處理的小鼠的爪甲床的形態表現為與媒介物處理的對照動物相似。這些發現表明，基準化合物野生型ActRIIB-Fc破裂脈管系統並導致甲床出血，而雜合ActRIIB配體陷阱蛋白不干擾血管內穩態並維持甲床中的正常血管完整性。
總之，本實施例的結果證明，以30 mg/kg每週兩次SC施用重複高劑量的WT-ActRIIB-Fc持續4週，在129S1/SvlmJ雌性小鼠的爪甲床和十二指腸腺中導致清楚的出血跡象。與之相比，用重複高劑量的AG-0027或AG-0014處理4週在129S1/SvlmJ雌性小鼠的甲床中沒有導致出血跡象。因此，雜合ActRIIB配體陷阱分子不像野生型ActRIIB-Fc那樣對血管完整性具有負面影響。這些發現證明，雜合ActRIIB配體陷阱分子在體內選擇性方面顯著地不同於野生型ActRIIB-Fc，並且不同於破裂脈管系統的野生型ActRIIB-Fc，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白維持正常脈管系統完整性而不干擾血管內穩態。如此，以極佳的體內選擇性和體內功效(參見以下實施例，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白清楚地提供在安全性和功效方面優於野生型ActRIIB-Fc或任何類似的先前代的分子的獨特的治療益處。 實施例10
在此實施例中，評價了AG-0027 (SEQ ID NO: 29)在睾丸切除的C57BL/6小鼠中增強肌肉品質和骨密度的體內功效以及AG-0027逆轉雄激素剝奪引起的肌肉萎縮和骨質丟失的能力。
向18隻10週齡的雄性C57BL/6小鼠，包括6隻正常對照小鼠和12隻睾丸切除的(ORX)小鼠(Charles River Laboratory)，使用如以下表10所示的劑量方案皮下注射媒介物(PBS, pH 7.4)或AG-0027： 表10
在6週處理期間每週兩次記錄縱向體重。在第42天，用CO2 窒息將小鼠安樂死。從每隻動物切下組織，包括瘦胴體、心臟、和單獨的後肢肌肉(腓腸肌、四頭肌和比目魚肌)、以及股骨和腰椎。使用數位天平稱重瘦胴體、心臟、和單獨的後肢肌肉對(左和右二者)，並記錄數值。使用microCT成像系統通過高解析度微型電腦斷層掃描(microCT)分析來自每隻動物的骨組織，包括遠端股骨和第4腰椎。基於對來自每個組的6個股骨和腰椎骨樣品的連續microCT掃描計算遠端股骨和第4腰椎的骨體積(BV/TV, %)、小梁數目(Tb.N, mm-1)、小梁厚度(Tb.Th, mm)和小梁間隙 (Tb.Sp, mm)。
如第14圖所示，體重數據(左圖)指示，ORX C57BL/6小鼠與正常對照C57BL/6小鼠相比具有體重的顯著減少。在處理的一週內，AG-0027導致ORX小鼠中體重喪失的完全逆轉(左圖)且AG-0027施用導致與媒介物處理的ORX小鼠和正常對照小鼠二者相比快速、持續的和統計學上顯著的體重獲得(參見右圖)。
第15圖顯示單獨的後肢肌肉品質和瘦胴體重量的變化。資料指示，與正常對照組相比，媒介物處理的ORX組具有後肢肌肉品質9%-13%的顯著喪失和瘦胴體質量接近14%的喪失。與之相比，AG-0027處理的ORX組顯示與媒介物處理的ORX組相比後肢肌肉品質22%-47%的顯著增加和瘦胴體質量接近37%的顯著增加，且還顯示與正常對照組相比後肢肌肉品質11%-28%的顯著增加和瘦胴體質量18%的顯著增加。顯著地，AG-0027不僅完全逆轉ORX小鼠中的肌肉萎縮，其還導致處理的ORX小鼠中超出正常對照組的水準的強的肌肉增加。在媒介物處理的ORX組中，存在快收縮(即腓腸肌和四頭肌)和慢收縮(即比目魚肌)肌肉二者的顯著喪失，且AG-0027處理有效地逆轉ORX小鼠中這兩種肌肉類型的喪失(參見第15圖)。這些發現證明，AG-0027具有對肌肉生長的強的體內功效並且高度地能夠逆轉肌肉萎縮。
第16圖和第17圖還顯示正常對照小鼠、媒介物處理的ORX小鼠、和AG-0027處理的ORX小鼠中遠端股骨(第16圖)和第4腰椎(第17圖)的骨密度的microCT分析結果。如第18圖所示，與正常對照小鼠相比，ORX小鼠顯示遠端股骨中骨品質的顯著喪失，遠端股骨的骨體積分數(BV/TV, %)和小梁數目 (Tb.N, mm-1)具有＞86%的統計學顯著減少和小梁間隙(Tb.Sp, mm)具有144%的顯著增加；然而，用AG-0027處理ORX小鼠引人注目地使骨體積分數(BV/TV, %)增加726%和小梁數目(Tb.N, mm-1)增加667%並使小梁間隙(Tb.Sp, mm)降低51%，從而完全逆轉ORX小鼠中由雄激素剝奪導致的遠端股骨骨密度的喪失。此外，如microCT資料所示的，AG-0027處理顯著增加ORX小鼠中遠端股骨的小梁厚度，至超過在正常小鼠中觀察到的正常對照水準11%。如第17圖所示的，睾丸切除引起的雄激素剝奪導致ORX小鼠中腰椎的骨品質的顯著喪失，這被AG-0027處理完全逆轉(參見第17圖)。具體地，與正常對照小鼠相比，媒介物處理的ORX小鼠顯示第4腰椎中骨體積分數(BV/TV, %)和小梁數目(Tb.N, mm-1)大約50%的統計學顯著的減少以及(Tb.Sp, mm)的33%的統計學顯著的減少；然而，用AG-0027處理ORX小鼠引人注目地使腰椎骨體積分數增加148%和腰椎小梁數目增加110%並使腰椎小梁間隙(Tb.Sp, mm)減少23%，從而完全改善ORX小鼠中由雄激素剝奪導致的腰椎骨密度的顯著喪失。而且，AG-0027處理顯著增加ORX小鼠中腰椎的小梁厚度，至超過在正常小鼠中觀察到的正常對照值19%。這些資料證明，AG-0027具有強的體內骨合成代謝作用並且AG-0027處理在逆轉骨質丟失方面高度有效。
總之，這一實施例中對ORX小鼠的資料顯示，皮下施用AG-0027導致體重、肌肉品質和骨品質的顯著增加並完全逆轉由於雄激素剝奪的深刻的肌肉萎縮和骨質丟失。對肌肉和骨合成代謝的顯著體內功效證明，AG-0027作為下一代治療劑提供了用於治療多種肌肉和骨紊亂的強的治療潛力。 實施例11
糖尿病是一種重要的公共健康問題，在全球正在接近流行比例。已經顯示，用鍛煉增加肌肉品質和功能可改進胰島素敏感性和改進糖尿病狀況。前面實施例中的資料清楚地確定，雜合ActRIIB配體陷阱諸如AG-0027 (SEQ ID NO: 29)能夠通過選擇性地拮抗肌生成抑制蛋白/啟動蛋白-Smad2/3訊號傳導途徑強烈地增強肌肉生長和肌肉再生。在這一實施例中，利用用AG-0027或媒介物處理的糖尿病小鼠檢查肌肉生長對葡萄糖代謝的影響。
用遞增劑量、直到30 mg/kg的AG-0027或用媒介物(PBS, pH 7.4)處理純合db/db糖尿病小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)持續10或12週，且雜合db/db小鼠用作非糖尿病對照(每組n=6)。檢查了食物攝取、水消耗、24小時尿體積、空腹血糖和體重的變化。在研究結束時，用CO2 將小鼠安樂死。收集血液樣品並使用市售可得的測定試劑盒測量血清胰島素、HbA1c、脂連蛋白水準。通過屍檢分析確定身體組成，包括腹部脂肪、肌肉品質和褐色脂肪品質。用H&E染色法和Oil-Red O染色組織學地檢查肝組織。
第18圖顯示AG-0027處理對糖尿病db/db小鼠中的食物攝取、水消耗、24小時尿體積和空腹葡萄糖水平的作用。皮下施用雜合ActRIIB配體陷阱蛋白AG-0027引人注目地使糖尿病db/db小鼠中的食物攝取、水攝取、24小時尿體積和空腹葡萄糖水準正常化。因此，資料指示，db/db糖尿病小鼠中肌生成抑制蛋白/啟動蛋白-Smad2/3訊號傳導的藥理學阻滯能夠改善代謝功能障礙，因為發現用雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的處理有效減少食物攝取和水消耗，減少血糖水準，和減少24小時尿體積。該處理還改善db/db小鼠中的脂肪肝。因此，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白如AG-0027表現為對於治療包括糖尿病、糖尿病腎病、代謝綜合徵、肥胖症和脂肪肝的代謝疾病提供治療潛力。 實施例12
在此實施例中，與作為基準的野生型ActRIIB-Fc (WT-ActRIIB-Fc)相比，在C57Bl/6小鼠中評價了AG-0014 (SEQ ID NO: 16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)對體重獲得和肌肉生長的體內功效。
分別以10 mg/kg的單次注射雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)、雜合陷阱B (AG-0014; SEQ ID NO: 16)、和野生型ActRIIB-Fc (WT-ActRIIB-Fc)、或媒介物(PBS)的單次注射皮下處理七週齡的雌性C57BL/6小鼠(每組n=6)。在單次注射後記錄多達14天的體重顯示，與WT-ActRIIB-Fc相比，AG-0027和AG-0014處理引發相等地強烈的體重獲得(第19圖)。在第14天進行末期屍檢分析且資料顯示，用AG-0014和AG-0027處理導致包括腓腸肌、四頭肌和比目魚肌的檢查的三種單獨後肢肌肉的品質的顯著增加，在與基準WT-ActRIIB-Fc相同的水準(第20圖)。這些資料證明，與野生型ActRIIB-Fc相比，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白如AG-0014和AG-0027能夠展示完全的對肌肉生長的體內功效。 實施例13
在此實施例中，在C57Bl/6小鼠中評價了AG-0014 (SEQ ID NO: 16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)在增強體重獲得和骨骼肌生長方面的劑量依賴性體內功效。
分別以1 mg/kg、3 mg/kg和10 mg/kg的單遞增劑量的雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)和雜合陷阱B (AG-0014; SEQ ID NO: 16)皮下處理六週齡的雌性C57BL/6小鼠。在PBS處理的和雜合陷阱處理的小鼠中記錄體重和從基線的體重變化，直到注射後8天。體重資料顯示，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白AG-0014和AG-0027能夠以劑量依賴性方式刺激體重獲得(第21圖)。後肢肌肉重量的末期屍檢分析進一步證明，用AG-0014或AG-0027處理以劑量依賴性方式導致腓腸肌肌肉品質(A)和四頭肌肌肉品質(B)的統計學顯著增加。這些資料顯示，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白如AG-0014和AG-0027能夠以劑量依賴性方式刺激肌肉生長。 實施例14
肌營養不良是一組高度使人虛弱的疾病，導致漸進性的衰弱和肌肉品質喪失以及骨骼脆性。前面實施例中的資料清楚地確定，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白諸如AG-0014 (SEQ ID NO: 16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)能夠在MDX小鼠(一種杜興氏肌營養不良的疾病模型)中通過選擇性地拮抗肌生成抑制蛋白/啟動蛋白-Smad2/3訊號傳導途徑強烈地增強肌肉生長、肌肉再生和骨形成。在這一實施例中，評價了AG-0014和AG-0027用於治療肌營養不良的治療潛力。
4週齡的雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx)和年齡匹配的C57BL/10ScSn野生型小鼠購自Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)。將mdx小鼠根據其體重分為體重平衡組，並隨後每週一次用AG-0027 (n=8)以10 mg/kg的劑量或用無菌PBS注射(n =8)皮下施用來處理，持續12週。年齡匹配的C57BL/10ScSn小鼠(n=6)用作未處理的野生型對照。每週兩次縱向地稱重小鼠且在研究開始(第1週)和結束時(第12週)確定身體組成。前肢握力強度使用BIOSEB's握力強度計(Bioseb)每週評估，通過將動物放置在水準網格上並允許其通過利用其前肢從實驗者拉開。在研究結束時，使用CO2將動物安樂死，和收集單獨的組織，包括瘦胴體、四頭肌、腓腸肌、比目魚肌和隔膜肌肉並稱重。經由心臟穿刺從所有實驗小鼠收集血液血清樣品以使用Pointe Scientific肌酸激酶檢驗試劑盒(Fisher Scientific)定量肌酸激酶(CK)水準。資料指示，雜合陷阱蛋白(AG-0027和AG-0014)有效地增強MDX小鼠中的體重獲得、肌肉品質和握力強度(第24圖及第25圖)。如第24圖所示的，皮下施用雜合陷阱蛋白(AG-0027和AG-0014)以統計學顯著的方式導致MDX小鼠體重的持續增加。處理導致MDX小鼠的後肢肌肉(腓腸肌、比目魚肌和四頭肌)的品質的顯著和統計學顯著的增加，超出媒介物處理的對照18%-36%(參見第25圖)。此外，處理使MDX小鼠的握力強度顯著增加47-56%。處理還導致mdx小鼠中血清CK水準的引人注目和統計學顯著的減少(參見第27圖)，指示，處理改進肌肉修復和減少肌肉損傷。而且，microCT分析揭示，處理使MDX小鼠中遠端股骨的小梁骨體積增加168%和腰椎的小梁骨體積增加48%(參見第28圖和第29圖)。如此，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白諸如AG-0014和AG-0027能夠在MDX小鼠中促進肌肉生長，增加肌肉強度，改進肌肉修復和增強骨密度。總之，這些資料指示，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白諸如AG-0014和AG-0027具有對抗肌營養不良，包括但不限於杜興氏肌營養不良的治療潛力。 實施例15
在許多炎性疾病狀態中啟動蛋白(啟動蛋白A、啟動蛋白B和啟動蛋白AB)被上調。迴圈中升高的啟動蛋白在炎症中起重要作用。在此實施例中，使用內毒素血症的小鼠模型評價AG-0027 (SEQ ID NO: 29)的抗炎作用，其中確定AG-0027減弱脂多糖(LPS)引起的促炎性細胞因數的誘導和死亡的能力。
為了檢查血清促炎性細胞因數水準，將四週齡的雄性BALB/c小鼠(Charles River Laboratory)隨機分為3組(n= 8)以接受媒介物(PBS pH 7.4)或AG-0027處理。對於基線對照，將無處理的第1組小鼠用CO2 處死並分析基礎血清細胞因數水準。對第2和第3組提供AG-0027 (20 mg/kg)或媒介物的一次皮下注射，一小時後LPS免疫接種。然後一小時後i.p.注射LPS (400 μg/kg)。LPS注射後90分鐘，將所有動物用CO2 安樂死以收集血液樣品並通過Luminex測定確定包括啟動蛋白A、TNF-α、IL-6和IL-17的促炎性細胞因數的血清水準。為了評價雜合ActRIIB配體陷阱針對LPS引起的內毒素血症的保護作用，將40隻雄性BALB/c小鼠隨機分配到對照組和AG-0027處理組(n=20)。LPS免疫接種之前一小時，將一組皮下注射AG-0027 (20 mg/kg)且另一組皮下注射媒介物。處理後一小時，對二組注射LPS (30 mg/kg, i.p.)，並且LPS施用後立即開始每天兩次監測小鼠的存活率，直到LPS注射後7天。資料指示，啟動蛋白的藥理學螯合能夠減弱LPS介導的促炎性細胞因數的誘導和減少具有脂多糖引起的內毒素血症的小鼠的死亡率。因此，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白如AG-0027具有用於治療炎性疾病的治療潛力。 實施例16
纖維化是一種嚴重和漸進性的疾病狀況，影響包括肺、腎、心臟、肝、骨髓、GI道、皮膚和骨骼肌的許多不同器官，並可導致器官衰竭。啟動蛋白-Smad2/3訊號傳導途徑的啟動已經被牽涉在纖維化的發病機理中。在此實施例中，檢查了AG-0027 (SEQ ID NO: 29)在具有博來黴素引起的肺纖維化的小鼠中對抗纖維化的能力的治療潛力，博來黴素引起的肺纖維化是一種廣泛用於研究潛在的纖維化療法的疾病模型。
肺纖維化在6週齡的雄性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratory)中用3 U/kg劑量博來黴素(Calbiochem)的氣管內滴注來引起。然後，一半的小鼠在博來黴素滴注後一天用10 mg/kg AG-0027處理和在第5、9和12天再次處理，且另一半小鼠在相同的天數用媒介物(PBS, pH 7.4) (n=8)處理。作為正常對照，年齡匹配的雄性C57BL/6小鼠(n=6)用媒介物處理。在第14天，將小鼠安樂死。收集血液樣品和肺組織以通過纖維化評分的組織學檢查和羥脯胺酸水準與膠原含量的測量定量纖維化的嚴重度。資料表明，阻斷啟動蛋白的作用可有效地減弱博來黴素引起的纖維化。因此，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白如AG-0027表現為提供用於治療纖維化疾病的治療潛力。 實施例17
成骨不全症(OI)是一種高度使人衰弱的遺傳疾病，特徵為脆性骨、頻繁骨折和廢用性肌肉萎縮。已經顯示，Smad2/3訊號傳導途徑的啟動可在OI的發病機理和進展中起重要作用。在此實施例中，評價了AG-0027 (SEQ ID NO: 29)在治療成骨不全症中的骨質丟失和廢用性肌肉萎縮的效力。
研究了純合B6C3Fe a/a Col1a2oim/J小鼠，一種OI的臨床前疾病模型。具體地，八週齡的雄性純合B6C3Fe a/a Col1a2oim/J oim/oim小鼠(OI小鼠)和年齡匹配的野生型同窩正常對照小鼠從Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)獲得。將OI小鼠基於體重以及通過雙能X-射線吸光測定法(DEXA)測量的骨品質的隨機化分為兩組。將24隻純合Col1a2oim小鼠(每組n=12)每週一次用AG-0027 (15 mg/kg, i.p.)或用媒介物 (PBS, pH 7.4)處理，持續6週。作為對照，20隻野生型同窩對照小鼠(每組n=10)每週一次用AG-0027 (15 mg/kg, i.p.)或媒介物處理，持續6週。每週縱向地測量體重，持續6週。對於評價骨品質，在實驗開始時和實驗臨結束前將純合OI小鼠和野生型同窩對照小鼠麻醉並進行DEXA掃描(Lunar PIXImus)以測量骨礦物質密度和含量。在研究結束時，將動物使用CO2 安樂死，並收集三頭肌、四頭肌和腓腸肌肌肉和稱重。經由心臟穿刺從所有實驗小鼠收集血液樣品，收集血清用於分析骨更新標誌物，包括骨形成標誌物前膠原1型N末端前肽(P1NP)、骨特異性鹼性磷酸酶(BAP)和骨鈣蛋白(OC)以及骨再吸收標誌物諸如1型膠原的C-端肽(CTX-1)。收集股骨和第四腰椎並使用微型電腦斷層掃描成像系統(μCT, Skyscan, Kontich, Belgium)評估骨體積。資料證明，皮下施用雜合ActRIIB配體陷阱蛋白能夠引人注目地增強OI小鼠(oim/oim小鼠)中的肌肉生長和骨形成二者。用AG-0027 (SEQ ID NO: 29)處理顯著地增加OI小鼠中的骨骼肌肉品質，三頭肌增加34%且腓腸肌增加51%(參見第30圖)。而且，如通過DEXA掃描揭示的，處理引人注目地增加BMD和BMC，分別顯著地增加14.6%和36%(參見第31圖)。而且，如microCT分析顯示的，處理使OI小鼠(oim/oim小鼠)中遠端股骨的小梁骨體積增加251%和腰椎的小梁骨體積增加98%(參見第32圖和第33圖)。顯著地，隨著肌肉品質和骨品質的改善，處理還表現為通過改善OI小鼠的體長將身材矮小正常化(第34圖)。如此，發現用雜合ActRIIB配體陷阱AG-0027藥理學抑制肌生成抑制蛋白/啟動蛋白-Smad2/3訊號傳導在OI小鼠中在逆轉骨質丟失和廢用性肌肉萎縮以及改善身材矮小方面是高度有效的。因此，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白如AG-0027保持用於治療OI的治療潛力。
本揭露內容的共同教導表明，本文描述的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白有效地結合並中和多種引起萎縮的細胞因數。並且，重要的是，雜合ActRIIB配體陷阱蛋白對肌肉具有強烈改善的選擇性，即，儘管有效地阻斷引起肌肉萎縮的細胞因數的活動，它們使非肌肉相關的細胞因數的訊號傳導保持完整，從而維持非肌肉細胞的正常生理功能。如以上說明的，BMP在很多生理過程中發揮重要作用，並且已經顯示BMP9訊號傳導在維持正常的血液維管結構/滲透性中是重要的。通過赦免BMP9訊號傳導，並且優先地拮抗肌生成抑制蛋白和啟動蛋白訊號傳導，本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白提供了比有效地中和BMP-9的現有可溶ActRIIB蛋白更有效且更安全的治療，即，通過選擇性地靶向多種平行的引起萎縮的細胞因數，並通過避免干擾非肌肉相關細胞因數的訊號傳導，這些雜合ActRIIB配體陷阱蛋白代表了具有出眾的肌肉生長效果和改善的安全特徵的一類臨床候選物，並且從而其提供了成為用於對抗(combating)與許多慢性、神經、遺傳、炎性、纖維化或感染性病理的發展相關的肌肉萎縮及/或骨紊亂的一流治療的潛力。
本文揭露的要求保護的所有物品和方法可鑒於本揭露內容被製備和執行，無需過度實驗。儘管已根據較佳的實施方案描述本揭露內容的物品和方法，但是變化形式可被應用到該物品和方法而不偏離本揭露內容的精神和範圍，這對本領域技術人員而言是明顯的。對於本領域技術人員明顯的所有這樣的變化和等效物，無論是現存的或以後開發的，都被認為是在本揭露內容的精神和範圍之內，如由所附申請專利範圍所限定的。說明書中提及的所有專利、專利申請和出版物指示本揭露內容所屬領域的普通技術人員的水準。出於所有目的所有專利、專利申請和出版物通過引用整體併入本文，並且其程度如同每個單獨出版物單獨地且具體地被指示出於任何和所有目的通過引用整體併入本文。本文例證地表述的本揭露內容可在本文未具體地揭露的任何一或更多個要素不存在的條件下被合適地實踐。因此，應理解，儘管本揭露內容已通過較佳的實施方案和任選的特徵被具體地揭露，但是本領域技術人員可尋求本文揭露的概念的改變和變化形式，並且認為此類改變和變化形式在本揭露內容的如由所附的申請專利範圍所限定的範圍內。
序列表 如37 C.F.R. 1.822中規定的，使用核苷酸堿基的標準字母縮寫和胺基酸的三字母代碼示出隨附的序列表中列出的核酸和胺基酸序列。 SEQ ID NO:1是截短的野生型人ActRIIB-ECD多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO:2是截短的野生型人ActRIIA-ECD多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO:3-37是多種雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO:38是人免疫球蛋白γ-1 (IgG1)重鏈恆定區的胺基酸序列 SEQ ID NO:39是IgG1 Fc結構域的胺基酸序列 SEQ ID NO:40是人免疫球蛋白γ-2重鏈恆定區的胺基酸序列 SEQ ID NO:41是IgG2 Fc結構域的胺基酸序列 SEQ ID NO:42是人免疫球蛋白γ-4重鏈恆定區的胺基酸序列 SEQ ID NO:43是IgG4 Fc結構域的胺基酸序列 SEQ ID NO:44是肽接頭的胺基酸序列。 SEQ ID NO:45是人ActRIIB多肽的全長胺基酸序列 SEQ ID NO:46是野生型人ActRIIB細胞外結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO:45的19-34)。 SEQ ID NO:47是人ActRIIA多肽的全長胺基酸序列 SEQ ID NO:48是野生型人ActRIIA細胞外結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO:47的20-135)。 SEQ ID NO:49是ActRIIB天然訊號肽的胺基酸序列 SEQ ID NO:50是免疫球蛋白輕鏈訊號肽的胺基酸序列 SEQ ID NO:51-117是多種雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO:118是肽接頭的胺基酸序列。
序列表 截短的野生型ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLD DFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 1) 截短的野生型ActRIIA-ECD ETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCW LDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0001) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 3) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0002) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 4) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0003) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 5) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0004) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 6) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0005) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVEKKDSPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 7) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0006) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 8) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0007) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 9) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0008) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVEKKDSPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 10) 雜合人ActRIIA-ECD (AG-0009) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 11) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0010) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 12) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0011) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 13) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0012) ETQECIYYNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 14) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0013) ETQECIYYNANWEKDRTNQTGVEPCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 15) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0014) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 16) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0015) ETRECIYYNANWEKDRTNQTGVEPCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 17) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0016) ETQECIYYNANWEKDRTNQTGVEPCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 18) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0017) ETQECIYYNANWEKDRTNQTGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 19) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0018) ETQECIYYNANWEKDRTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 20) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0019) ETRECIYYNANWEKDRTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 21) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0020) ETQECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 22) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0021) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCFATWRNSSGTIELVKQGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 23) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0022) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 24) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0023) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 25) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0024) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 26) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0025) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 27) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0026) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDKDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 28) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0027) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 29) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0028) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 30) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0029) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 31) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0030) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 32) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0031) ETRECIFFNANWEKDRTNQTGVEPCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 33) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0032) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCFATWKNISGSIELVKQGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 34) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0033) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 35) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0034) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNMCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 36) 雜合人ActRIIB-ECD (AG-0035) ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 37) 人免疫球蛋白γ-1重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 38) IgG1 Fc結構域 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 39) 人免疫球蛋白γ-2重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 40) IgG2 Fc結構域 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 41) 人免疫球蛋白γ-4重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 42) IgG4 Fc結構域 APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 43) 肽接頭序列 GGGGS (SEQ ID NO: 44) 人ActRIIB多肽的全長胺基酸序列 MTAPWVALALLWGSLCAGSGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMSRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI (SEQ ID NO: 45) 野生型人ActRIIB細胞外結構域 (SEQ ID NO:45的19-134) SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLD DFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 46) 人ActRIIA多肽的全長胺基酸序列 MGAATKLAFAVFLISCSSGAILGRSETQECIYYNANWEKDKTNRSGIEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRNDCIEKKDSPEVFFCCCEGNMCNERFFYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPLFNTLLYSLVPIMGIAVIVLFSFWMYRHHKLAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLMGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEIYSLPGMKHDNILQFIGAEKRGTSIDVDLWLITAFHEKGSLTDFLKANVVSWNELCHIAQTMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELASRCTASDGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRECWQKHSGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVEERIIQMQKLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL (SEQ ID NO: 47) 野生型人ActRIIA細胞外結構域(SEQ ID NO:47的20-135) AILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCW LDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 48) ActRIIB天然訊號肽： MTAPWVALALLWGSLCAG (SEQ ID NO: 49) 免疫球蛋白輕鏈訊號肽 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID NO: 50) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECLFFNANWEKDRTNQSGVEPCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 51) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECLFFNANWEKDRTNQSGVEPCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 52) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQSGVEPCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 53) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECLFFNANWEKDRTNQSGVEPCYGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 54) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQSGVEPCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 55) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 56) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 57) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 58) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 59) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 60) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 61) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 62) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 63) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 64) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 65) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 66) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 67) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 68) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 69) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCEGEQDKRLHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 70) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQSGVEPCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 71) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECLFFNANWEKDRTNQSGVEPCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 72) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 73) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKQGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 74) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 75) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGSIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 76) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGSIEIVKKGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 77) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGSIEIVKQGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 78) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 79) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 80) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 81) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 82) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 83) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 84) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKQGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 85) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 86) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGSIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 87) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGSIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 88) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 89) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKQGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 90) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVETEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 91) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVAKEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 92) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 93) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEDNPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 94) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEESPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 95) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPEVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 96) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDKDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVETEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 97) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEKDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVAKEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 98) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 99) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDKDKRLHCYASWRNSSGTIELVKQGCWLDDFNCYDRQECVAKKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 100) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDKDKRLHCYASWRNSSGTIEIVKQGCWLDDFNCYDRQECVAEKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 101) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDQDKRLHCYASWRNSSGSIEIVKQGCWLDDFNCYDRQECVAKKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 102) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEKDKRRHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 103) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDQDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPEVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 104) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 105) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGEQDKRLHCYASWRNSSGSIEIVKKGCWLDDFNCYDRTDCVATEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 106) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRRHCYASWRNSSGSIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVAKEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 107) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRRHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVAKEENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 108) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRRHCYASWRNSSGSIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 109) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 110) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGSIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 111) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 112) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 113) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 114) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGDQDKRLHCYASWRNSSGTIEIVKKGCWLDDFNCYDRQECVAKKENPQVYFCCCEGNFCNEKFSYFPQMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 115) 雜合人ActRIIB-ECD ETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 116) 雜合人ActRIIB-ECD ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCYGDKDKRRHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDINCYDRQECVATKENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 117) 肽接頭序列 ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 118)
第1圖示出了本揭露內容的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的兩種示例性分子構造。 第2圖顯示了示出基於細胞的測定的結果的線圖，該基於細胞的測定用於評價與作為基準的野生型ActRIIB-Fc蛋白(WT)的肌生成抑制蛋白中和、啟動蛋白A中和、和BMP9中和能力相比，具有AG-0003 (SEQ ID NO:5)的胺基酸序列的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白和具有AG-0005 (SEQ ID NO:7)的胺基酸序列的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的肌生成抑制蛋白中和(左圖)、啟動蛋白A中和(中圖)和BMP9中和(右圖)能力。 第3圖顯示了示出與作為基準的野生型ActRIIB-Fc蛋白(WT)的基於細胞的對肌生成抑制蛋白、啟動蛋白A、啟動蛋白B和BMP9的中和活性相比，具有AG-0014 (SEQ ID NO:16)的胺基酸序列的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白和具有AG-0027 (SEQ ID NO:29)的胺基酸序列的雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的那些基於細胞的對肌生成抑制蛋白(左上)、啟動蛋白A (右上)、啟動蛋白B (左下)和BMP9 (右下)的中和活性的結果的線圖。如實施例中描述的，通過利用C2C12-CAGA-luc報導子測定檢查肌生成抑制蛋白中和活性、啟動蛋白A中和活性和啟動蛋白B中和活性，並通過利用C2C12-BRE-luc報導子測定分析BMP9中和活性。 第4圖顯示了示出在分別用10 mg/kg的劑量的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc (WT)、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)每週一次皮下注射的9週齡雄性C57Bl/6小鼠中，對體重的影響的線圖。在第0天、第5天、第12天和第18天記錄體重。每組n= 6/8。進行Student’s t檢驗，用於統計分析。***：P＜0.001，與媒介物組相比。 第5圖是示出在分別用10 mg/kg的劑量的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc (WT)、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO: 29)每週一次皮下注射的9週齡雄性C57Bl/6小鼠(每組n= 6/8)中，對肌肉品質的影響的柱狀圖。在末期屍檢期間，將來自每隻動物的單獨的腓腸肌解剖並稱重。通過Student’s t檢驗進行統計分析。***：P＜0.001，與媒介物組相比。 第6圖顯示了小鼠腹腔的伊文思藍(Evans blue)血管滲透性測試影像。如圖中標記的，顯示了每組的外科手術暴露的腹腔的代表性影像。8週齡雄性BalbC小鼠分別用10 mg/kg的劑量的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc (WT)、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO:29)每週一次地處理。在處理後兩週，將200 μl伊文思藍染料(在PBS中0.5%，pH7.2)經由尾靜脈注射入每組動物(n=4)。在伊文思藍染料注射後90 min進行屍檢。 第7圖顯示了小鼠睾丸的伊文思藍血管滲透性測試影像。如圖中標記的，顯示了來自每組的解剖的睾丸器官的代表性影像。8週齡雄性BalbC小鼠分別用10 mg/kg的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc (WT)、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO:29)每週一次地處理。在處理後兩週，將200 μl伊文思藍染料(在PBS中0.5%，pH7.2)經由尾靜脈注射入每組動物(n=4)。在伊文思藍染料注射後90 min進行屍檢。 第8圖顯示了小鼠肺的伊文思藍血管滲透性測試影像。如圖中標記的，顯示了來自每組的解剖的肺組織的代表性影像。8週齡雄性BalbC小鼠分別用10 mg/kg的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc (WT)、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO:29)每週一次地處理。在處理後兩週，將200 μl伊文思藍染料(在PBS中0.5%，pH7.2)經由尾靜脈注射入每組動物(n=4)。在伊文思藍染料注射後90 min進行屍檢。 第9圖顯示了示出在如圖中標記的不同處理組中，每mg濕肺組織(左圖)和睾丸組織(右圖)的滲出的伊文思藍染料的量的柱狀圖。8週齡雄性BalbC小鼠分別用10 mg/kg的PBS (媒介物)、野生型ActRIIB-Fc蛋白(WT)、AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO:29)每週一次地處理。在處理後兩週，將200 μl伊文思藍染料(在PBS中0.5%，pH7.2)經由尾靜脈注射入每組動物(n=4)。在伊文思藍染料注射後90 min進行屍檢，以收集睾丸和肺組織。將組織稱重，並且然後單獨地置於含有甲醯胺的小瓶中，以提取伊文思藍染料。在55°C孵育持續24小時後，離心樣品，並使用分光光度計在610 nm的波長處測量每個樣品的水相的吸光度。通過使用Student’s t檢驗進行統計分析。*：P＜0.05。 第10圖顯示了示出與作為基準的野生型ActRIIB-Fc蛋白(野生型)的基於細胞的對BMP9的中和活性相比，很多種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白的那些基於細胞的中和活性的結果的線圖，該示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包括AG-0014 (SEQ ID NO:16)、AG-0023 (SEQ ID NO:25)、AG-0024 (SEQ ID NO:26)、AG-0025 (SEQ ID NO:27)、AG-0027 (SEQ ID NO:29)、AG-0028 (SEQ ID NO:30)、AG-0029 (SEQ ID NO:31)和AG-0035 (SEQ ID NO:37)。通過利用C2C12-BRE-luc報導子測定分析BMP9中和活性。 第11圖示出了相對於野生型ActRIIB-Fc蛋白的肌生成抑制蛋白中和IC50 值，若干示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白之間的肌生成抑制蛋白中和IC50 值的差異。使用C2C12-CAGA-luc報導子培養物檢查單個蛋白的肌生成抑制蛋白中和活性，並利用Prism軟體計算IC50 值。該圖顯示了示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白，包括AG-0014 (SEQ ID NO:16)、AG-0023 (SEQ ID NO:25)、AG-0024 (SEQ ID NO:26)、AG-0027 (SEQ ID NO:29)、AG-0028 (SEQ ID NO:30)和AG-0029 (SEQ ID NO:31)的每一種的肌生成抑制蛋白中和IC50值與野生型ActRIIB-Fc的肌生成抑制蛋白中和IC50值相比的差異百分比。 第12圖分別顯示了與遞增濃度的野生型(WT) ActRIIB-Fc以及與遞增濃度的野生型ActRIIA-Fc相比，兩種示例性雜合ActRIIB配體陷阱蛋白AG-0014 (SEQ ID NO:16)和AG-0027 (SEQ ID NO:29)的BMP9結合的ELISA分析的結果。使用KinEXA儀器(Sapidyne Instruments)進行自動ELISA。使用Sapidyne Instruments推薦的實驗程式將20 μg/ml的BMP9偶聯至NHS活化瓊脂糖凝膠4快流珠(GE Healthcare)。如圖中顯示的，對100 pM、1 nM和10 nM濃度的WT ActRIIB-Fc、WT ActRIIA-Fc和每種雜合ActRIIB配體陷阱蛋白測試BMP9結合。野生型和雜合蛋白被捕獲到BMP9包被的珠上，並通過Alexa Fluor 647標記的山羊抗人Fc抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)檢測。用KinExA Pro軟體(Sapidyne Instruments)記錄BMP9結合訊號。 第13圖顯示了用PBS (媒介物對照)、野生型ActRIIB-Fc (WT-ActRIIB-Fc)、雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)或雜合陷阱B (AG-0014; SEQ ID NO: 16)處理的129S1/SvlmJ小鼠的後肢爪甲床的總體形態的顯微鏡檢查。通過使用倒置顯微鏡檢查後肢爪甲床的出血跡象並使用數位相機拍照。 第14圖顯示了示出雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)施用對ORX C57BL/6小鼠體重的影響的線圖。資料闡述正常對照組、媒介物處理的ORX組、和雜合陷阱處理的ORX組中縱向記錄的體重(左圖)和體重變化(右圖)。使用Student’s t檢驗進行統計分析。***: P＜0.001，與媒介物處理的ORX組相比。n=6。 第15圖顯示了示出睾丸切除(ORX)小鼠中，雜合ActRIIB配體陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理對後肢肌肉品質和瘦胴體質量的影響的柱狀圖。對於正常對照組、媒介物處理的ORX組和雜合ActRIIB配體陷阱處理的ORX組，在第42天的末期屍檢期間記錄腓腸肌、四頭肌和比目魚肌肌肉重量和瘦胴體重量。關於平均腓腸肌、四頭肌和比目魚肌肌肉重量的資料是基於每個後肢肌肉對。使用Student’s t檢驗進行統計分析。***: P＜0.001. n=6。 第16圖顯示了示出正常小鼠(正常)、媒介物處理的ORX小鼠(ORX + 媒介物)和雜合ActRIIB配體陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理的ORX小鼠(ORX + 雜合陷阱)中，遠端股骨的骨體積分數(BV/TV, %)、骨小梁厚度(Tb.Th, mm)、骨小梁數目(Tb.N, mm-1)和骨小梁間隙(Tb.Sp, mm)的microCT分析的柱狀圖。Student’s t檢驗用於統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001. n=6。 第17圖顯示了示出正常小鼠(正常)、媒介物處理的ORX小鼠(ORX + 媒介物)和雜合ActRIIB配體陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理的ORX小鼠(ORX + 雜合陷阱)中，第4腰椎的骨體積分數(BV/TV, %)、骨小梁厚度(Tb.Th, mm)、骨小梁數目(Tb.N, mm-1)和骨小梁間隙(Tb.Sp, mm)的MicroCT分析的柱狀圖。Student’s t檢驗用於統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001. n=6。 第18圖顯示了示出糖尿病db/db小鼠中，雜合ActRIIB配體陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理對食物攝取(A)、水消耗(B)、24-小時尿體積(C)和空腹血糖水準(D)的影響的柱狀圖。雜合db/db小鼠(n=6)用作非糖尿病對照。食物攝取、水消耗、24-小時尿體積和空腹血糖水準在處理10週後測量。通過Student’s t檢驗進行統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001. 每組n=6。 第19圖顯示單劑量的雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白對雌性C57BL/6小鼠中的體重變化的影響。分別以10 mg/kg的單次注射雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)、雜合陷阱B (AG-0014; SEQ ID NO: 16)、和野生型ActRIIB-Fc (WT-ActRIIB-Fc)皮下處理七週齡的雌性C57BL/6小鼠(每組n=6)。對照組接受單次注射的媒介物(PBS)。在PBS和雜合陷阱處理的小鼠中在注射後不同時間點、直到14天，記錄體重(A)和從基線的體重變化(B)。使用Student’s t檢驗進行統計分析。***: P＜0.001；每組n=6。誤差棒表示標準差。 第20圖顯示了單次注射雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白對C57BL/6小鼠中的後肢肌肉品質和瘦胴體質量的影響的直接比較。小鼠分別用在10 mg/kg的單劑量的雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)、雜合陷阱B (AG-0014; SEQ ID NO: 16)和WT-ActRIIB-Fc (基準)或用媒介物(PBS)皮下處理。在注射後第14天，對小鼠進行末期屍檢。對PBS、雜合陷阱A和雜合陷阱B處理組確定後肢肌肉的重量，包括腓腸肌(A)、四頭肌(B)和比目魚肌(C)和瘦胴體重量(D)。使用Student’s t檢驗進行統計分析。***: P＜0.001；每組n=6。誤差棒表示標準差。使用Student’s t檢驗進行統計分析。 第21圖顯示單遞增劑量的雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白對雌性C57BL/6小鼠中的體重變化的影響。分別以1 mg/kg、3 mg/kg和10 mg/kg的單遞增劑量的雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)和雜合陷阱B (AG-0014; SEQ ID NO: 16)皮下處理六週齡的雌性C57BL/6小鼠。對照組用媒介物(PBS)處理。在PBS處理的和雜合陷阱處理的小鼠中記錄體重和從基線的體重變化，直到注射後8天。使用Student’s t檢驗進行統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001；每組n=6。誤差棒表示標準差。 第22圖闡釋單遞增劑量的雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白對雌性C57BL/6小鼠中的後肢肌肉品質的影響。雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)和雜合陷阱B (AG-0014; SEQ ID NO: 16)分別以1 mg/kg、3/mg/kg和10 mg/kg皮下提供。在第8天，將小鼠安樂死用於末期屍檢。對PBS、雜合陷阱A和雜合陷阱B處理組通過屍檢程式確定後肢肌肉，包括腓腸肌(A)和四頭肌(B)的重量。使用Student’s t檢驗進行統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001；每組n=6。誤差棒表示標準差。使用Student’s t檢驗進行統計分析。 第23圖顯示單遞增劑量的雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白對雌性C57BL/6小鼠中的食物攝取的影響。分別以1 mg/kg、3 mg/kg和10 mg/kg的單遞增劑量的雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)SC處理六週齡的雌性C57BL/6小鼠。資料闡述在第8天在PBS處理的和雜合陷阱處理的小鼠中記錄的食物攝取。使用Student’s t檢驗進行統計分析。**: P＜0.01； 每組n=6。誤差棒表示標準差。 第24圖闡述雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白的皮下施用對杜興氏肌營養不良(MDX)小鼠中的體重的影響。以10 mg/kg用媒介物(PBS)或用雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)或用雜合陷阱B (AG-0014 (SEQ ID NO: 16)每週一次皮下處理四週齡的MDX小鼠，持續八週。資料顯示PBS處理的和雜合陷阱處理的MDX小鼠中縱向記錄的體重(A)和從基線的體重變化(B)。使用Student’s t檢驗進行統計分析。***: P＜0.001；每組n=8。誤差棒表示標準差。 第25圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白的皮下施用對MDX小鼠中的後肢肌肉品質的影響。用10 mg/kg的雜合陷阱A (AG-0027; SEQ ID NO: 29)和雜合陷阱B (AG-0014 (SEQ ID NO: 16)或用媒介物(PBS)每週一次皮下處理MDX小鼠，持續8週。在第56天，將MDX小鼠安樂死用於末期屍檢。用PBS (MDX + PBS)或用雜合陷阱A (MDX + 雜合陷阱A)或用雜合陷阱B (MDX + 雜合陷阱B)處理的MDX小鼠中，通過屍檢程式確定單獨的後肢肌肉，包括腓腸肌(A)、四頭肌(B)和比目魚肌(C)的重量。使用Student’s t檢驗進行統計分析。***: P＜0.001；每組n=8。誤差棒表示標準差。 第26圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白的皮下施用對MDX小鼠中的握力強度的影響。在第8週通過使用BIOSEB握力強度計(EB-instruments)在用PBS (MDX + PBS)或用雜合陷阱A(AG-0027; SEQ ID NO: 29)(MDX + 雜合陷阱A)或雜合陷阱B (MDX + 雜合陷阱B)(AG-0014 (SEQ ID NO: 16)處理的MDX小鼠中分析握力強度。使用Student’s t檢驗進行統計分析。***: P＜0.001；每組n=8。誤差棒表示標準差。 第27圖闡述雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)蛋白的皮下施用對MDX小鼠中的迴圈肌酸激酶(CK)水準的影響。用PBS或用10 mg/kg的雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)每週一次SC處理MDX小鼠，持續8週。年齡匹配的野生型小鼠用作正常對照。在年齡匹配的野生型小鼠 (WT)和用PBS (MDX + PBS)或雜合陷阱(雜合陷阱 + PBS)處理的MDX小鼠中測量血清CK水準。*: P＜0.05, Student’s t檢驗。每組n=8。誤差棒表示標準差。 第28圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理導致的遠端股骨中的小梁骨密度變化的micro-CT分析的結果。用PBS (MDX + PBS)或用10 mg/kg的雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)(MDX + 雜合陷阱)每週一次SC處理MDX小鼠，持續8週。A. PBS和雜合陷阱處理組中遠端股骨的骨體積(BV/TV, %)。Student’s t檢驗用於統計分析。***: P＜0.001。每組n=8。誤差棒表示標準差。B. PBS和雜合陷阱處理組中遠端股骨的小梁結構的代表性影像。 第29圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理導致的腰椎中的小梁骨密度變化的micro-CT分析的結果。用PBS (MDX + PBS)或用雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)(MDX + 雜合陷阱)以10 mg/kg每週一次SC處理MDX小鼠，持續8週。Student’s t檢驗用於統計分析。***: P＜0.001。每組n=8。誤差棒表示標準差。B. PBS和雜合陷阱處理組中腰椎的小梁結構的代表性影像。 第30圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)對野生型和oim/oim (III型成骨不全症)小鼠中的肌肉品質的影響。用PBS或雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理八週齡的野生型對照小鼠和oim/oim小鼠，持續6週。在末期屍檢期間記錄三頭肌(A)和腓腸肌肌肉(B)重量。使用Student’s t檢驗進行統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001。每組n=9-12。誤差棒表示標準差。 第31圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理導致的野生型和oim/oim小鼠中BMD和BMC變化的雙能X射線吸收(DEXA)分析的結果。用PBS或雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理八週齡的野生型對照小鼠和oim/oim小鼠，持續6週。在臨用PBS或雜合陷阱處理之前和處理後6週進行對BMD (A)和BMC (B)的DEXA掃描。使用Student’s t檢驗進行統計分析。**: P＜0.01; ***: P＜0.001。每組n=9-12。誤差棒表示標準差。 第32圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理導致的遠端股骨中的小梁骨密度變化的micro-CT分析的結果。用PBS或雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理八週齡的野生型對照小鼠和oim/oim小鼠，持續6週。資料闡述PBS和雜合陷阱處理的野生型小鼠和PBS和雜合陷阱處理的野生型小鼠(圖A)和oim/oim小鼠(圖B)的遠端股骨中的骨體積分數(BV/TV %)以及小梁結構的代表性microCT影像。Student’s t檢驗用於統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001。誤差棒表示標準差。 第33圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理導致的腰椎中的小梁骨密度變化的micro-CT分析的結果。數據闡述PBS或雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理的野生型小鼠(圖A)和oim/oim小鼠(圖B)的第5腰椎中的骨體積分數(BV/TV %)以及小梁結構的代表性microCT影像。Student’s t檢驗用於統計分析。*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001。誤差棒表示標準差。 第34圖闡述雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理對oim/oim小鼠中的體長的影響。用PBS或雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理6週後測量oim/oim小鼠和年齡匹配的野生型對照小鼠的體長。A. 6週處理後野生型和oim/oim小鼠中的體長。B.作為從野生型對照的變化百分比繪圖的體長。誤差棒表示標準差。 第35圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理對遠端股骨中的骨面積(A)、骨週長(B)和礦化表面/骨表面比率(C)的影響的骨組織形態測定分析的結果。用PBS或雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理6週後進行骨組織形態測定分析。 第36圖顯示雜合ActRIIB配體陷阱(雜合陷阱)處理對遠端股骨中的破骨細胞/骨表面比率(A)和破骨細胞數目/骨週長比率(B)的影響的骨組織形態測定分析的結果。用PBS或雜合陷阱(AG-0027; SEQ ID NO: 29)處理6週後進行骨組織形態測定分析。

Claims (37)

  1. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一肌肉萎縮中使用。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該肌肉萎縮與選自由以下組成的組的疾病相關：肌肉營養不良(諸如DMD、Becker型MD、肢帶型MD、肌強直性MD和FSHD)、肌炎、肌病(包括遺傳性肌病和獲得性肌病)、運動神經元疾病(諸如葛雷克氏症或ALS)和神經變性疾病(諸如帕金森氏病、亨丁頓病和阿茲海默病)。
  3. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一骨疾病中使用。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該骨疾病選自由以下組成的組：骨質疏鬆症、骨軟化症、成骨不全症、進行性骨化性纖維發育不良、皮質類固醇引起的骨質丟失、骨折和骨轉移。
  5. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一代謝紊亂中使用。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該代謝紊亂選自由以下組成的組：肥胖症、血脂異常、肌少型肥胖症、非酒精性脂肪肝病諸如非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝病、胰島素耐受、糖尿病和代謝綜合徵，以及糖尿病性肌病、糖尿病性腎病、糖尿病性神經病、糖尿病性視網膜病和血色素沉著病。
  7. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一纖維化中使用。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該纖維化選自由以下組成的組：間質性肺病、獨特型肺纖維化、囊性纖維化、肝纖維化、肝硬化、心臟纖維化、腎纖維化、骨髓纖維化、特發性腹膜後纖維化、腎源性纖維化皮病、炎性腸病、瘢痕瘤、硬皮病和關節纖維化。
  9. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一自身免疫/炎性疾病中使用。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該疾病選自由以下組成的組：自身免疫紊亂，包括多發性硬化、系統性硬化症、糖尿病(1型)、腎小球腎炎、重症肌無力、銀屑病、系統性紅斑狼瘡、多肌炎、克羅恩病、潰瘍性結腸炎和原發性膽汁性肝硬化。
  11. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一心血管疾病中使用。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該心血管疾病選自由以下組成的組：心力衰竭、心臟萎縮、高血壓、心肌炎、冠狀動脈病、心肌梗塞、心律失常、心臟瓣膜病、心肌病、心包疾病、主動脈疾病和馬凡綜合徵。
  13. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一癌症或癌症轉移中使用。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該癌症選自由以下組成的組：胰腺癌、胃癌、卵巢癌、結腸直腸癌、黑素瘤、白血病、骨髓增生異常綜合徵、肺癌、前列腺癌、腦癌、膀胱癌、頭頸癌和橫紋肌肉瘤。
  15. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一慢性腎病(CKD)中使用。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該CKD選自由以下組成的組：CKD，包括腎衰竭、間質性纖維化和腎透析以及與CKD相關的蛋白能量耗損(PEW)。
  17. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一關節炎中使用。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該關節炎選自由以下組成的組：類風濕關節炎和骨關節炎。
  19. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一厭食症中使用。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該厭食症選自由以下組成的組：神經性厭食症和厭食症-惡病質綜合徵。
  21. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一肝病中使用。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該肝病選自由以下組成的組：非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化或肝硬化、肝臟衰竭、自身免疫肝炎和肝細胞上皮癌。
  23. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在一器官或組織移植中使用。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該移植選自由以下組成的組：心臟、腎、肝、肺、胰腺、腸和胸腺的器官移植，和骨、肌腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、神經和血管的組織移植。
  25. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一貧血中使用。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該貧血選自由以下組成的組：缺鐵性貧血、鐵超負荷、地中海貧血、溶血性貧血、鐮狀細胞貧血、惡性貧血、範可尼貧血和再生障礙性貧血(諸如癌症相關的貧血和化學療法引起的貧血)。
  27. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一疼痛中使用。
  28. 如申請專利範圍第27項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該疼痛選自由以下組成的組：神經性疼痛、軀體痛、內臟痛、炎性疼痛、癌痛、背痛和關節痛。
  29. 一種分離的雜合ActRIIB配體陷阱，用於在治療一老化中使用。
  30. 如申請專利範圍第29項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該老化選自由以下組成的組：老年人的虛弱、年齡相關肌少症和骨關節炎。
  31. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽，在該SEQ ID NO:1的胺基酸序列中胺基酸殘基R3、I6、Y7、Y8、L14、E15、S20、L22、R24、E26、E28、Q29、L33、L48、Y36、S38、R40、S42、T45、K51、F58、Q64、E65、A68、T69、E70、E71、N72、Q74、F84、R88、T90、H91、L92、E94、A95、G96、G97、P98、E99、V100、Y102、E103、P105、P106、T107、A108或T110中的至少1個被另一胺基酸置換，並且其中該雜合ActRIIB-ECD多肽能夠結合肌生成抑制蛋白和啟動蛋白A，但相對於野生型ActRIIB-ECD多肽表現出對BMP9的降低的結合親和力。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含具有選自由以下組成的組的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116和SEQ ID NO: 117。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱蛋白包含連接於該雜合可溶ActRIIB-ECD多肽的具有選自由以下組成的組的胺基酸序列的人Fc結構域：SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 43。
  34. 如申請專利範圍第33項所述的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中具有SEQ ID NO:44列出的胺基酸序列的接頭與具有SEQ ID NO:118列出的胺基酸序列的鉸鏈接頭一起使用，以將人Fc結構域連接至該雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
  35. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項所述的用於使用的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含附連到具有選自由SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 43組成的組的胺基酸序列的人Fc結構域的具有選自由SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 29組成的組的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
  36. 如申請專利範圍第35項所述的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含附連到具有SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的人Fc結構域的具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
  37. 如申請專利範圍第35項所述的分離的雜合ActRIIB配體陷阱，其中該雜合ActRIIB配體陷阱包含附連到具有SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的人Fc結構域的具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的雜合可溶ActRIIB-ECD多肽。
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