MX2014007483A

MX2014007483A - Polipeptidos de receptores de activina variantes y sus usos.

Info

Publication number: MX2014007483A
Application number: MX2014007483A
Authority: MX
Inventors: Lei-Ting Tony Tam; Jeonghoon Sun; Huiquan Han; Keith Soo-Nyung Kwak; Xiaolan Zhou
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2014-09-12
Also published as: JP2017178953A; SG11201403367YA; WO2013106175A1; US9610327B2; KR20140108562A; AU2017248486B2; EP2793925B1; EA201491231A1; MX358358B; PH12014501385A1; AU2017248486A1; JP6358633B2; JP6542433B2; JP2018145198A; US20140348827A1; IL233178A0; NZ626580A; JP2015505859A; CR20140304A; CL2014001648A1

Abstract

La presente invención proporciona polipéptidos y proteínas de receptor soluble lIB de activina variantes capaces de unirse e inhibir las actividades de activina A, miostatina o GDF-11. La presente invención también proporciona polinucleótidos, vectores y células huésped capaces de producir los polipéptidos y proteínas variantes. También se proporcionan composiciones y métodos para tratar el desgaste muscular y otras enfermedades y trastornos.

Description

POLIPÉPTIDOS DE RECEPTORES DE ACTIVINA VARIANTES Y SUS USOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el derecho de prioridad en base al documento U. S. con número de serie 13/329.897, presentado el 19 de diciembre de 2011 , cuya descripción completa se incorpora en la presente por referencia, para todos los fines.

Esta solicitud se refiere al documento U. S. con número de serie 13/080.515, presentada el 5 de abril de 2011 , ahora pendiente, que es un documento divisional U. S. con número de serie 12/074.877, presentado el 5 de marzo de 2008, ahora otorgado como patente U. S. N.° 7.947.646, que reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos con número de serie 61/065.474, presentada el 11 de febrero de 2008 y la solicitud provisional de los Estados Unidos con número de serie 60/905.459, presentada el 6 de marzo de 2007, en las que se basan sus descripciones y se incorporan por referencia en la presente.

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo intitulado A-1219-US-CIP_Seqüst.txt que tiene un tamaño de 265.085 bytes y fue creado el 19 de diciembre de 2011. La información en el formato electrónico del listado de secuencias se incorpora en la presente por referencia en su totalidad CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo técnico de esta invención se refiere a los miembros de la familia del factor de crecimiento transformante ß (TGF-ß) y los receptores de TGF-ß solubles, así como los métodos de modular las actividades de los miembros de la familia de TGF-ß para el tratamiento de diversos trastornos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia de proteínas del factor de crecimiento transformante ß (TGF-ß) incluye los factores de crecimiento transformante ß (TGF-ß), activinas, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), y factores de crecimiento/diferenciación (GDFs). Estos miembros de la familia están involucrados en la regulación de una amplia variedad de procesos biológicos que incluyen la proliferación, diferenciación y otras funciones celulares.

El factor de crecimiento/diferenciación 8 (GDF-8), también conocido como miostatina, es un miembro de la familia de TGF-ß expresado en la mayoría de las células del tejido musculoesquelético en desarrollo y adulto. La miostatina parece cumplir un papel esencial en el control negativo en el crecimiento del músculo esquelético (McPherron et al., Nature (Londres) 387, 83-90 (1997)). Se ha demostrado que el antagonismo de la miostatina aumenta la masa muscular magra en los animales (McFerron et al., supra, Zimmers et al., Science 296:1486 (2002)).

Otro miembro de la familia de proteínas de TGF-ß es un factor de crecimiento/diferenciación relacionado, GDF-11. GDF-11 tiene aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la miostatina. GDF-11 tiene un papel en el patrón axial en el desarrollo de los animales (Oh et al, Genes Dev 1 1 :1812-26 (1997)), y también parece cumplir un papel en el desarrollo y crecimiento del músculo esquelético.

Las activinas A, B y AB son homodímeros y heterodí meros respectivamente de dos cadenas de polipéptidos, ? y 0>B (Vale et al. Nature 321 , 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321 , 779-782 (1986)). Las activinas fueron descubiertas originalmente como péptidos gonadales que participan en la regulación de la síntesis de la hormona folículo estimulante, y en la actualidad se considera que están involucradas en la regulación de diversas actividades biológicas. La activina A es una forma predominante de la activina.

La activina, miostatina, GDF-1 1 y otros miembros de la superfamilia de TGF-ß se unen y señalizan a través de una combinación de los receptores de activina tipo II y activina tipo IIB, los cuales son serina/treonina quinasas de transmembrana (Harrison et al., J. Biol. Chem. 279, 28.036 a 28.044 (2004)). Los estudios de reticulación han determinado que la miostatina es capaz de unirse a los receptores de activina tipo II ActRIIA y ActRIIB in vitro (Lee et al., PNAS USA 98:9306-11 (2001 )). También hay evidencia de que GDF-1 1 se une tanto a ActRIIA como ActRIIB (Oh et al., Genes Dev. 16:2749-54 (2002)).

Se sabe que la expresión de la proteína de TGF-ß se asocia con una variedad de enfermedades y trastornos. Por lo tanto, las moléculas terapéuticas capaces de antagonizar varias proteínas de TGF-ß simultáneamente pueden ser particularmente efectivas para estas enfermedades y trastornos.

Además, la producción de proteínas terapéuticas puede ser complicada por problemas que ocurren durante la expresión y purificación de la proteína. Uno de los problemas es la agregación de proteínas durante la expresión o purificación. La acumulación de altos niveles de proteínas durante las condiciones de cultivo celular puede llevar a la agregación. Los procesos de purificación pueden exponer la proteína a factores adicionales que promueven mayor agregación (Cromwell, M.E.M. et al., The AAPS Journal 8?572-?579, 2006). Se pueden realizar intentos para reducir los factores que causan la agregación, sin embargo, existe la necesidad de diseñar proteínas que tengan una tendencia reducida a formar agregados. La presente invención satisface la necesidad de moléculas terapéuticas que se unen a múltiples ligandos, y tienen agregación reducida y por lo tanto, una mejor capacidad de fabricación, con el fin de producir eficientemente proteínas útiles para el tratamiento de estados de enfermedad de relacionados con TGF-ß.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una proteína aislada que comprende un polipéptido de receptor IIB de activina humana variante (designado vActRIIB o sActRIIB). Tal como se usa en la presente, la expresión polipéptido vActRIIB se refiere tanto a polipéptidos vActRIIB humanos como a polipéptidos vActRIIB5 humanos. En una forma de realización, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 ó 18, en donde los aminoácidos ya sea en la posición E28 o R40 o tanto en la posición E28 como R40 se sustituyen con otro aminoácido no nativo y en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11. En una forma de realización, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 ó 18, en donde los aminoácidos en las posiciones E28 o R40 o tanto E28 como R40 se sustituyen con un aminoácido no nativo y en donde el péptido señal se elimina y en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11. En una forma de realización, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 ó 18, en donde los aminoácidos en las posiciones E28 o R40 o tanto E28 como R40 se sustituyen con otro aminoácido, en donde la secuencia señal se elimina y se trunca el terminal N del polipéptido maduro y en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11. En una forma de realización, polipéptido vActRIIB truncado maduro N-terminal carece de los cuatro aminoácidos N-terminales o los seis aminoácidos N-terminales de la secuencia madura, en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11. En una forma de realización, la sustitución en la posición E28 se selecciona del grupo que consiste en W, Y y A. En otra forma de realización, la sustitución en la posición E28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y. En otra forma de realización, la sustitución en la posición R40 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en G, Q, M, H, K y N. En otra forma de realización, la sustitución en la posición E28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y y la sustitución en la posición R40 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, G, Q, M, H, K y N. En otra forma de realización, el polipéptido también comprende una proteína heteróloga. En una forma de realización, la proteína heteróloga es un dominio Fe. En otra forma de realización, el dominio Fe es un dominio Fe de IgG humana.

En una forma de realización, la proteína comprende polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97.

En otra forma de realización, la proteína comprende un polipéptido codificado por el polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51 , 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 o su complemento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido vActRIIB. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos establecida en SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51 , 53, 55, 59, 61, 63, 65, 69, 71, 92, 94, 96 o su complemento.

En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en el grupo que consiste en SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91 , 93, 95 y 97. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico también comprende una secuencia de regulación de la transcripción o de la traducción. En otro aspecto, se proporciona un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico vActRIIB. En otro aspecto, se proporcionan células huésped que comprenden los vectores recombinantes y se proporcionan métodos de producción de los polipéptidos vActRIIB.

La presente invención también proporciona una composición que contiene al menos un polipéptido vActRIIB o proteína de la presente invención. En una forma de realización, la composición es una composición farmacéutica que contiene el polipéptido vActRIIB o la proteína en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad de desgaste muscular en un sujeto que sufre de un trastorno por administración de una composición terapéutica que contiene un polipéptido vActRIIB o proteína al sujeto. La enfermedad de desgaste muscular incluye o resulta, pero sin limitación, de las siguientes condiciones: caquexia por cáncer, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardíaca crónica, caquexia química, caquexia de HlV/sida, insuficiencia renal, uremia, artritis reumatoidea, sarcopenia relacionada con la edad, fragilidad relacionada con la edad, atrofia orgánica, síndrome del túnel carpiano, deprivación de andrógenos y desgaste muscular debida a la inactividad de un prolongado reposo en cama, lesión de la médula espinal, ACV, fractura ósea y envejecimiento. El desgaste muscular también puede resultar de la ingravidez debida a los vuelos espaciales, resistencia a la insulina, desgaste muscular debido a quemaduras, deprivación de andrógenos y otros trastornos. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad correlacionada con la expresión de la activina A. En una forma de realización, la enfermedad es cáncer. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento de un trastorno metabólico que comprende la administración de una composición terapéutica a un sujeto que necesita de dicho tratamiento, en donde el trastorno metabólico se selecciona de pérdida ósea, diabetes, obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, hiperglicemia, deprivación de andrógenos y síndrome metabólico. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de terapia génica que comprende la administración de un vector que codifica un polipéptido vActRIIB o proteína de la presente invención a un sujeto que lo necesita, en donde el vector es capaz de expresar el polipéptido vActRIIB o la proteína en el sujeto.

En otra forma de realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende i) un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB), en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 18 excepto por una sustitución de aminoácido simple en la posición 28, en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11 , y ii) un agente quimioterapéutico. El receptor IIB de activina variante de la composición farmacéutica puede tener una sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB que se selecciona del grupo que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H. W e Y por E. En otra forma de realización, la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E o la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB es W. En otras formas de realización más, el polipéptido vActRIIB carece de la secuencia señal N-terminal. En otras formas de realización más, la composición farmacéutica también comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un producto quimioterapéutico y el polipéptido de receptor IIB de activina variante.

En otro aspecto, el agente quimioterapéutico de la composición farmacéutica es un análogo de nucleósido. En otras formas de realización, el agente quimioterapéutico puede ser 5-fluorouracilo o dacarbazina.

En otra forma de realización, se proporciona un método de inhibición de la actividad de miostatina en un sujeto que necesita de tal tratamiento que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende i) un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB) en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 18 excepto por una sustitución de aminoácido simple en la posición 28, en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11 y ¡i) un agente quimioterapéutico. El receptor IIB de activina variante de la composición farmacéutica puede tener una sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB que se selecciona del grupo que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y por E. En otra forma de realización, la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E o la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB es W. En otras formas de realización más, el polipéptido vActRIIB carece de la secuencia señal N-terminal.

En otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad, en donde la activina se sobreexpresa en un sujeto que necesita de dicho tratamiento que comprende la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición que comprende i) un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB), en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 18 excepto por una sustitución de aminoácido simple en la posición 28, en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11 y ii) un agente quimioterapéutico. El receptor IIB de activina variante de la composición farmacéutica puede tener una sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB que se selecciona del grupo que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y por E. En otra forma de realización, la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E o la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB es W. En otras formas de realización más, el polipéptido vActRIIB carece de la secuencia señal N-terminal.

En un aspecto de la invención, se puede usar el método anterior para tratar cánceres. Los cánceres pueden ser cáncer testicular, cáncer de ovario o melanoma.

En otra forma de realización, se proporciona un método de reducción del tamaño de una masa tumoral en un sujeto que necesita de dicho tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende i) un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB), en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 18 excepto por una sustitución de aminoácido simple en la posición 28, en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11 y ii) un agente quimioterapéutico. El receptor IIB de activina variante de la composición farmacéutica puede tener una sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB que se selecciona del grupo que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y por E. En otra forma de realización, la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E o la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB es W. En otras formas de realización más, el polipéptido vActRIIB carece de la secuencia señal N-terminal. La masa tumoral puede resultar de cáncer testicular u ovárico o un melanoma.

En otra forma de realización más, se proporciona un método de tratamiento de melanoma, en un sujeto que necesita de dicho tratamiento que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB), en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 18 excepto por una sustitución de aminoácido simple en la posición 28, en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11.

En otra forma de realización, se proporciona un método de tratamiento de una condición que tiene sobreexpresión de factores angiogénicos, en un sujeto que necesita de dicho tratamiento que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB), en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 18 excepto por una sustitución de aminoácido simple en la posición 28, en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11. La condición puede ser cáncer y el cáncer puede ser cáncer de ovario. VEGF-A o Ang-1 puede estar sobreexpresado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de IgGIFc ActRIIB-humana soluble de tipo salvaje (SEQ ID NO: 98). La secuencia del péptido señal está en negrita, seguida por el dominio extracelular maduro ActRIIB, y lgG1 Fe humana en itálica, que incluye una región bisagra parcial. Los aminoácidos E28 y R40 están subrayados. La secuencia ligadora GGGGS (SEQ ID NO: 75) está en itálica y subrayada.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de IgGI Fc ActRIIB5-humana soluble (SEQ ID NO: 99). La secuencia del péptido señal está en negrita, seguida por el dominio de ActRIIB5 soluble maduro, y la lgG1 Fe humana, que incluye una región bisagra parcial, está en itálica. E28 y R40 están subrayadas. La secuencia ligadora (GGGGS) (SEQ ID NO: 75) está en itálica y subrayada.

Las Figura 3A-B muestra el efecto de tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre la masa testicular (Figura 3A) y ovárica (Figura 3B) en ratones deficientes en inhibina-a.

Las Figuras 4A-4B muestra el efecto del tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre las tasas de supervivencia en ratones deficientes en inhibina-a machos (Figura 4A) y hembras (Figura 4B).

La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre el peso corporal en ratones portadores del tumor 26 de colon.

La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre la supervivencia de ratones portadores del tumor 26 de colon.

Las Figuras 7A-7D muestran los niveles de activina en los ratones (Figura 7A) y el efecto de sActRIIB (E28W) sobre el cáncer ovárico (OC) (Figuras 7A-7D) en los ratones KO. La Figura 7A muestra los niveles de activita en tejido normal y cáncer ovárico. ***P<0.001, prueba t de Student; n=20. La Figura 7B muestra el efecto de sActRIIB sobre los niveles de activina. Los valores son media ± SEM. ***: P<0.001 versus control WT. n=6-12. La Figura 7C muestra los cambios en la masa ovárica con sActRIIB. Los valores son media ± SEM. ***: P<0.001 versus control WT. n=6-10. La Figura 7D muestra tumores ováricos en ratones tratados y no tratados. Barra de escala = 10 mm Las Figuras 8A-8B muestran que el bloqueo de la Activina A anula la sobreexpresión de los niveles de VEGF en los tumores ováricos (Figura 8A) y la activación de la caspasa-3 en los tumores testiculares después del tratamiento con sActRIIB (E28W) (Figura 8B). Figura 8A - Los valores son media SEM. *: P<0.05; prueba t de Student. n=10. Figura 8B- ** P<0.01 , prueba t de Student.

Las Figuras 9A-9B muestran el efecto del antagonista de activina sActRIIB (E28W) y agentes quimioterapéuticos citotóxicos sobre el crecimiento tumoral. La Figura 9A muestra el efecto de sActRIIB y 5-Fu sobre la inhibición del crecimiento tumoral de TOV-21G en ratones desnudos. Los cambios en los volúmenes tumorales se registraron en forma longitudinal. ***: P<0.001 versus PBS; : P<0.05 versus 5-Fu; P<0.01 versus sActRIIB; ANOVA de mediciones repetidas; n=12. La Figura 9B muestra el efecto de sActRIIB y dacarbazina sobre el crecimiento de xenoinjertos de melanoma humano G361 en ratones desnudos. Los resultados del volumen tumoral (mm3) se expresan como la media ± SEM. *: P<0.05 versus grupos PBS. Estadística basada en ANOVA de mediciones repetidas =8.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se describen los polipéptidos y proteínas que comprenden la variante del receptor activina humano IIB (vActRIIB; también denominado como sActRIIB). Estas proteínas y polipéptidos se caracterizan por su capacidad para unirse a al menos una de tres proteínas de TGF-ß, miostatina (GDF-8), activina A, y GDF-1 1 , e inhibir las actividades de estas proteínas. Estas proteínas y polipéptidos también presentan una tendencia reducida a agregarse en comparación con los polipéptidos que no contienen las modificaciones descriptas en la presente. Las modificaciones consisten en sustituciones de aminoácidos en las posiciones 28, 40, o ambas 28 y 40 con referencia a ActRIIB de tipo salvaje de número de acceso NP_001097 (SEQ ID NO: 47), y el dominio extracelular de ActRIIB (SEQ ID NO: 18) o ActRIIB5 (SEQ ID N °: 2).

Como se usa en la presente, el término "miembros de la familia TGF-ß" o "proteínas de TGF-ß" se refiere a los factores de crecimiento estructuralmente relacionados de la familia del factor de crecimiento transformante que incluye las activinas, y las proteínas del factor de crecimiento y diferenciación (GDF), Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al. Growth factors and cytokines in health y disease, Vol. 1B, D. LeRoith y C.Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA: pp 357-393).

GDF-8, también denominada como miostatina, es un regulador negativo del tejido músculo esquelético (cPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)). La miostatina se sintetiza como un complejo de proteína inactiva de aproximadamente 375 aminoácidos de longitud, que tiene acceso a GenBank N.°: AAB86694 (SEQ ID NO: 49) para ser humano. La proteína precursora se activa por escisión proteolítica en un sitio de procesamiento tetrabásico para producir un prodominio inactivo N-terminal y una proteína C-terminal de aproximadamente 109 aminoácidos que se dimeriza para formar un homodímero de aproximadamente 25 kDa. Este homodímero es la proteína biológicamente activa madura (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)).

Como se usa en la presente, el término "prodominio" o "propéptido" se refiere a la proteína N-terminal inactiva que se escinde para liberar la proteína C-terminal activo. Como se usa en la presente, el término "miostatina" o "miostatina madura" se refiere al polipéptido C-terminal maduro, biológicamente activo, en forma de monómero, dímero u otro, así como fragmentos biológicamente activos o polipéptidos relacionados que incluyen variantes alélicas, variantes de empalme, y péptidos de fusión y polipéptidos. Se ha informado que la miostatina tiene 100% de identidad de secuencia entre muchas especies, que incluye, seres humanos, ratón, pollo, porcino, pavo, y rata (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)).

Como se usa en la presente. GDF-11 se refiere a la BMP (proteína morfogenética ósea) que tiene el número de acceso de Swissprot O95390 (SEQ ID NO: 50), así como variantes y homólogos de especie de esa proteína. GDF-11 tiene aproximadamente 90% de identidad con la miostatina en el nivel de aminoácidos. GDF-11 está involucrada en la regulación de los patrones anterior/posterior del esqueleto axial (McPherron et al, Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al, Dev. Biol. 208 (1), 222-232 (1999)) pero se desconocen las funciones posnatales.

La activina A es el homodímero de las cadenas de polipéptidos BA. Como se usa en la presente, el término "activina A" se refiere a la proteína de activita que tiene acceso a GenBank Número: NM_002192 (SEQ ID N °: 48), así como variantes y homólogos de especie de esta proteína.

RECEPTORES DE ACTIVINA Como se usa en la presente, el término receptores de activita tipo II B (ActRIIB) se refiere a los receptores de activina humana que tienen número de acceso NP_001097 (SEQ ID NO: 47). El término ActRIIB soluble abarca el dominio extracelular de ActRIIB (SEQ ID NO: 18), ActRIIB5 (SEQ ID NO: 2) y estas secuencias donde la arginina de la posición 64 se sustituye también con alanina.

VARIANTES DE POLIPÉPTIDOS DE ActRIIB La presente invención proporciona proteínas aisladas que comprenden variantes de polipéptidos del receptor ActlIB humano soluble (denominado en la presente como polipéptidos vActRIIB, o variantes de polipéptidos o sActRIIB). Como se usa en la presente, el término "proteína vActRIIB" se refiere a una proteína que comprende un polipéptido vActRIIB. Como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a una molécula de proteína o polipéptido purificada en cierto grado a partir del material endógeno. Estos polipéptidos y proteínas se caracterizan por tener la capacidad de unirse e inhibir la actividad de alguna de activina A, miostatina, o GDF-11. En algunas formas de realización, la afinidad de unión de las variantes de polipéptidos para activina A, miostatina, o GDF-11 es mejor es comparación con los polipéptidos de tipo salvaje.

En una forma de realización, el polipéptido de vActRIIB tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 2 o 18 en que los aminoácidos de la posición E28 o R40, o ambas posiciones E28 y R40 se sustituyen con otro aminoácido no nativo y donde el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A, o GDF-11. En otra forma de realización, los polipéptidos de vActRIIB son las versiones maduras, o las versiones madura truncadas de estas secuencias. Como se usa en la presente, el término "polipéptido de vActRIIB maduro" se refiere al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos señal suprimida. En una forma de realización, las secuencias maduras son, por ejemplo, los aminoácidos 19 a 160 de la SEQ ID NO: 2, y los aminoácidos 19 a 134 de la SEQ ID NO: 18, donde uno o ambos aminoácidos de las posiciones 28 y 40 están sustituidos con otro aminoácido no nativo y los polipéptidos retienen la capacidad de unirse a la activina A, miostatina, o GDF-11. Como se usa en la presente el término polipéptido de vActRIIB maduro truncado se refiere al polipéptido que tiene la secuencia señal y además los aminoácidos del extremo N-terminal del polipéptido maduro suprimidos. En una forma de realización, los 4 aminoácidos N-terminal maduro o los aminoácidos N-terminal maduro del polipéptido maduro están suprimidos. En esta forma de realización, las secuencias maduras truncadas son , por ejemplo, los aminoácidos 23 a 160 de la SEQ ID NO: 2, o aminoácidos 25 a 160 de la SEQ ID NO: 2; y aminoácidos 23 a 134 de la SEQ ID NO: 18, o aminoácidos 25 a 134 de la SEQ ID NO: 18 donde uno o ambos aminoácidos de las posiciones 28 y 40 están sustituidos con aminoácidos no tipo salvaje que retienen la capacidad de unirse a la activina A, miostatina, o GDF-11. Como se usa en la presente, el término "posición 28" y "posición 40" (es decir, E28 y R40) se refiere a la posición del aminoácido con referencia a las secuencias SEQ ID NOS: 2 y 18 que incluye una secuencia señal de 18 aminoácidos. Por coherencia, si los polipéptidos de vActRIIB maduros presentan sustituciones en la posición 10 y/o posición 22, o polipéptidos maduros truncados presentan sustituciones en la posición 6 y/o posición 18, o sustituciones en las posiciones 4 y/o posición 16 con respecto a las secuencias maduras o maduras truncadas, estas variantes también se denominarán con respecto a las SEQ ID NOS: 2 y 18 de longitud completa, o como se muestra en la Figura 1 o 2, es decir, la sustitución de aminoácido en la posición E28 y/o R40. Tales formas de realización maduras o formas de realización N-terminal truncadas se ejemplifican a continuación.

En una forma de realización, la sustitución en la posición E28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en W, Y y A. En una forma de realización, la sustitución en la posición 28 es W. En otra forma de realización la sustitución en la posición 28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y. En otra forma de realización, la sustitución en la posición 40 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en G, Q, M, H, K y N. En otra forma de realización la sustitución en la posición 28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y y la sustitución en la posición 40 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, G, Q, M, H, K y N. En una forma de realización, la proteína comprende polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97. En otra forma de realización, la proteína comprende un polipéptido codificado por el polinucleótido que tiene la secuencia establecida en el grupo que consiste en SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 51 , 53, 55, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 92, 94, 96 o su complemento.

En una forma de realización, las secuencias señal se eliminan del polipéptido vActRIIB, dejando los polipéptidos variantes maduros. Se pueden usar diversos péptidos señal en la preparación de los polipéptidos de la presente solicitud. Los péptidos señal pueden tener la secuencia mostrada en las Figuras 1 y 2 (SEQ ID NO: 73) o secuencias señal alternativas como SEQ ID NO: 74, la secuencia señal para SEQ ID NOS: 2 y 18. Se puede usar cualquier otro péptido señal útil para expresar polipéptidos vActRIIB o vActRIIB5.

En otra forma de realización, los polipéptidos vActRIIB tienen secuencias que son sustancialmente similares a SEQ ID NOS: 2 y 18. Tal como se usa en la presente, la expresión "sustancialmente similar" se refiere a polipéptidos que tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad, al menos aproximadamente el 85% de identidad, al menos aproximadamente el 90% de identidad, al menos aproximadamente el 95% de identidad, al menos aproximadamente el 98% de identidad o al menos aproximadamente el 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 2 y 18 y en donde uno o los dos aminoácidos en las posiciones 28 y/o 40 se sustituyen con aminoácidos de tipo no silvestre, en donde el polipéptido retiene la actividad del polipéptido de SEQ ID NOS: 2 y 18, que es la capacidad de unir e inhibir miostatina, activina A o GDF-11. Además, la expresión "polipéptido vActRIIB" comprende fragmentos de SEQ ID NOS: 2 ó 18 como truncaciones N- y C-terminales que contienen las sustituciones en la posición 28 y/o 40 descritas en la presente, en donde el polipéptido es capaz de unir e inhibir miostatina, activina A o GDF-11.

Tal como se usa en la presente, la expresión "derivado" de los polipéptidos vActRIIB y vActRIIB5 se refiere a la unión de al menos un resto químico adicional o al menos un polipéptido adicional para formar conjugados covalentes o agregados tales como grupos glicosilo, lípidos, grupos acetilo o polipéptidos de fusión C-terminales o N-terminales, conjugación con moléculas de PEG y otras modificaciones que se describen a continuación de forma más completa. Los polipéptidos de receptores ActRIIB variantes (vActRIIB) también pueden incluir modificaciones adicionales y derivados, que incluyen modificaciones a los términos C y N que surgen del procesamiento debido a la expresión en diversos tipos celulares tales como células de mamíferos, E. coli, levaduras y otras células huésped recombinantes. También se incluyen fragmentos de polipéptido vActRIIB y polipéptidos que comprenden sitios inactivados de N-glicosilación, sitios de procesamiento de proteasa inactivada o sustituciones conservativas de aminoácido, de las secuencias de polipéptidos establecidas en SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97.

Tal como se usa en la presente, la expresión una "actividad de polipéptido vActRIIB o vActRIIB5" o "una actividad biológica de un polipéptido ActRIIB o ActRIIB5 soluble" se refiere a una o varias actividades ¡n vitro o in vivo de los polipéptidos vActRIIB y vActRIIB5 incluyendo, pero sin limitación, aquellas demostradas en los Ejemplos siguientes. Las actividades de los polipéptidos vActRIIB incluyen, pero sin limitación, la capacidad de unirse con miostatina o activina A o GDF-11 y la capacidad de reducir o neutralizar una actividad de miostatina o activina A o GDF-11. Tal como se usa en la presente, la expresión "capaz de unirse" con miostatina, activina A o GDF-11 se refiere a una unión medida por medio de métodos conocidos en el arte, como el método Biacore descrito en el Ejemplo 2 de abajo. Además, en el Ejemplo 2, el ensayo pMARE a base de células C2C12 mide la actividad neutralizante de activina A, actividad neutralizante de miostatina y actividad neutralizante de GDF-11. Las actividades in vivo incluyen, pero sin limitación, aumento de peso corporal, aumento de masa muscular magra, aumento de la masa muscular esquelética, reducción de la masa grasa tal como se demuestra en los modelos animales siguientes y como se conoce en el arte. Las actividades biológicas también incluyen la reducción o la prevención de caquexia causada por ciertos tipos de tumores, prevención del crecimiento de ciertos tipos de tumores y mayor supervivencia de ciertos modelos animales. Más abajo se proporciona una posterior discusión de las actividades del polipéptido vActRIIB.

Los polipéptidos de la presente invención también comprenden polipéptidos heterólogos unidos con el polipéptido vActRIIB ya sea directamente o a través de una secuencia ligadora para formar una proteína de fusión. Tal como se usa en la presente, la expresión "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene un polipéptido heterólogo unido por medio de técnicas de ADN recombinante. Los polipéptidos heterólogos incluyen, pero sin limitación, polipéptidos Fe, rótulos His y dominios zipper de leucina para promover la oligomerización y la estabilización de los polipéptidos ActRIIB variantes tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/29581 , que se incorpora en la presente por referencia. En una forma de realización, el polipéptido heterólogo es un polipéptido o dominio Fe. En una forma de realización, el dominio Fe se selecciona de un dominio Fe de lgG1, lgG2 e lgG4 humana. Se proporcionan en SEQ ID NOS: 80, 82 y 84. vActRIIB también puede comprender toda o una parte de la secuencia bisagra de la lgG1, lgG2 o lgG4 adyacente a esta región Fe de IgG respectiva. La secuencia bisagra completa para lgG1 , lgG2 e lgG4 se proporcionan en SEQ ID NOS: 76, 77 y 78, respectivamente.

El polipéptido vActRIIB también puede comprender opcionalmente una secuencia "ligadora". Los ligadores sirven primariamente como un espaciador entre un polipéptido y un segundo polipéptido heterólogo u otro tipo de fusión o entre dos o más polipéptidos ActRIIB variantes. En una forma de realización, el ligador se forma con aminoácidos ligados entre sí por enlaces peptídicos, con preferencia de 1 a 20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos están seleccionados de 20 aminoácidos naturales. Uno o varios de estos aminoácidos pueden estar glicosilados, tal como lo entienden los expertos en el arte. En una forma de realización, los 1 a 20 aminoácidos están seleccionados de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Con preferencia, un ligador se forma de una mayoría de aminoácidos que están estéricamente impedidos, tales como glicina y alanina. Los ligadores de ejemplo son poliglicinas (en particular, (Gly)5, (Gly)8, poli(Gly-Ala) y polialaninas. Un ligador apropiado de ejemplo como se muestra en los Ejemplos siguientes es (Gly)4Ser (SEQ ID NO: 75). En otra forma de realización, vActRIIB puede comprender un ligador bisagra, que es una secuencia ligadora proporcionada adyacente a la región bisagra, tal como se ejemplifica en SEQ ID NO: 79.

Los ligadores también son ligadores no peptídicos. Por ejemplo, se pueden usar ligadores de alquilo como -NH-(CH2)s-C(O)-, en donde s = 2-20. Estos ligadores de alquilo también pueden estar sustituidos por cualquier grupo no estéricamente impedido como alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc.

En una forma de realización, los polipéptidos vActRIIB se pueden unir con un polipéptido Fe, directamente o por medio de un ligador o por medio de un ligador bisagra. En una forma de realización, Fe es un Fe de IgG humana. vActRIIB unido con Fe incluyen, por ejemplo, vActRIIB-lgGI Fc, E28A (SEQ ID NO: 60); vActRIIB-lgGIFc, E28W (SEQ ID NO: 62), vActRIIB-lgGIFc, E28Y (SEQ ID NO: 64), vActRIIB-lgG Fe, R40G (SEQ ID NO: 66), vActRIIB5-lgG1 Fc, E28A (SEQ ID NO: 70) y vActRIIB5-lgG1Fc E28W (SEQ ID NO: 72), tal como se muestra en las Tablas 1 y 2 y se describe en los Ejemplos de la presente. Otras formas de realización incluyen vActRIIB-lgG2 Fe, E28W(SEQ ID NO: 91), vActRIIB-lgG2 Fe, E28Y (SEQ ID NO: 93) y vActRIIB-lgG2 Fe (SEQ ID NO: 95). Las variantes demostraron producir menos agregación en comparación con la lgG2 de ActRIIB-lgG2 de tipo salvaje, tal como se demuestra en los Ejemplos de abajo.

Los polipéptidos vActRIIB revelados en la presente también se pueden unir con una molécula no polipeptídica con fines de conferir propiedades deseadas como reducción de la degradación y/o aumento de la vida media, reducción de la toxicidad, reducción de inmunogenicidad y/o aumento de la actividad biológica de los polipéptidos ActRIIB. Las moléculas de ejemplo incluyen, pero sin limitación, polímeros lineales tales como polietilenglicol (PEG), polilisina, un dextrano; un lípido, un grupo colesterol (como un esteroide); un carbohidrato o una molécula de oligosacárido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aislado que comprenden polinucleótidos que codifican los polipéptidos vActRIIB de la presente invención. Tal como se usa en la presente, la expresión "aislado" se refiere a moléculas de ácido nucleico purificadas en cierto grado de material endógeno. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende un polinucleótido que codifica los polipéptidos de SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91 , 93, 95 y 97. Debido a la degeneración conocida del código genético, en donde más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de la mostrada en SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 51 , 53, 55, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 y 96 o la cadena complementaria de SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 , 92, 94 y 96 y aún codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91 , 93, 95 y 97. Tales secuencias de ADN variantes pueden dar como resultado mutaciones silenciosas que se producen durante la producción o pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de estas secuencias.

En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de polinucleótidos establecida en SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 51 , 53, 55, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 92, 94 y 96 o la cadena complementaria de SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 51 , 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 , 92, 94 y 96. En otra forma de realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas o moderadas con las regiones que codifican los polipéptidos de SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 92, 94 y 96 en donde el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91 , 93, 95 y 97 y en donde el polipéptido codificado mantiene una actividad de un polipéptido vActRIIB.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ADN en forma de cadena simple y cadena doble, así como el complemento de ARN de este. ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintético, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de estos. El ADN genómico se puede aislar por técnicas convencionales, tales como mediante el uso de la ADN de la SEQ ID Nos: 1 o 17, o un fragmento adecuado de este, como una sonda. El ADN genómico que codifica los polipéptidos de ActRIIB se obtiene de bibliotecas genómicas que están disponibles para numerosas especies. El ADN sintético está disponible a partir de la síntesis química de fragmentos de oligonucleótidos superpuestos seguido del ensamblaje de los fragmentos para reconstituir parte o la totalidad de las regiones codificadoras y secuencias flanqueantes. El ARN se puede obtener a partir de vectores de expresión procariotas que dirigen la síntesis de alto nivel de ARNm, tales como vectores que usan promotores T7 y ARN polimerasa. El ADNc se obtiene de bibliotecas preparadas a partir de ARNm aislado de diversos tejidos que expresan ActRIIB. Las moléculas de ADN de la invención incluyen genes de longitud completa así como polinucleótidos y fragmentos de estos. El gen de longitud completa también puede incluir secuencias que codifican la secuencia señal N-terminal.

En otro aspecto de la presente invención, también se proporcionan vectores de expresión que contienen las secuencias de ácidos nucleicos, y también se proporcionan células huésped transformadas con tales vectores y métodos para producir los polipéptidos vActRIIB. El término "vector de expresión" se refiere a un plásmido, fago, virus o vector para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de polinucleótidos. Los vectores para la expresión de los polipéptidos de vActRIIB contienen como mínimo las secuencias requeridas para la propagación del vector y para la expresión del inserto clonado. Un vector de expresión comprende una unidad transcripcional que comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) una secuencia que codifica los polipéptidos vActRIIB que se transcriben en ARNm y se traducen en proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de transcripción apropiadas. Estas secuencias además pueden incluir un marcador de selección. Los vectores adecuados para la expresión en las células huésped son fácilmente disponibles y las moléculas de ácido nucleico se insertan en los vectores usando técnicas de ADN recombinante estándares. Tales vectores pueden incluir promotores que funcionan en tejidos específicos, y vectores virales para la expresión de vActRIIB en células humanas o animales específicas. Un vector de expresión ilustrativo adecuado para la expresión de vActRIIB es el pDSRa, (descripto en WO 90/14363, incorporado en la presente por referencia) y sus derivados, que contiene polinucleótidos vActRIIB, así como cualquier vectores adecuados adicionales conocidos en la técnica o descriptos a continuación.

La aplicación también proporciona métodos de preparación de polipéptidos vActRIIB. Se puede utilizar una variedad de otros sistemas de expresión/huésped. Estos sistemas incluyen, pero sin limitación microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, vectores de expresión de plásmido o cósmido de ADN; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transfectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Las células de mamífero útiles en la producción de proteína recombinante incluyen pero sin limitación células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), o sus derivados tales como Veggie CHO y líneas de células relacionadas que crecen en medio libre de suero (ver Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) o cepa CHO DX-B11 , que es deficiente en DHFR (ver Urlaub et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216-20), células COS tales como línea COS-7 de células de riñon de mono (ATCC CRL 1651) (ver Gluzman et al., 1981 , Cell 23:175), W138, BHK, HepG2, 3T3 (ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, células L, células C127, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñon de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (ver McMahan et al., 1991 , EMBO J. 10:2821), células de riñon embrionarias humanas, tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células epidérmicas humanas A431 , células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, primaria explantes, HL-60, U937, células HaK o Jurkat. La expresión en mamíferos permite la producción de polipéptidos secretados o solubles que pueden ser recuperados del medio de cultivo.

Mediante el uso de un sistema huésped-vector apropiado, los polipéptidos vActRIIB se producen de forma recombinante por medio del cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en condiciones que permiten la producción. Las células transformadas se pueden utilizar para la producción de polipéptidos de alto rendimiento de largo plazo,. Una vez que tales células se transforman con vectores que contienen marcadores seleccionares, así como el cásete de expresión deseado, las células se pueden dejar crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiar a un medio selectivo. El marcador seleccionable se diseña para permitir ei crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias Introducidas. Grupos de células transformadas de manera estable resistentes pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para la línea celular empleada. Un panorama general de la expresión de proteínas recombinantes se encuentra en Methods of Enzymology, 185 v, Goeddell, DV, ed., Academic Press (1990).

En algunos casos, tal como en la expresión mediante sistemas procariotas, los polipéptidos expresados de esta invención pueden necesitar ser "replegados" y oxidados en una estructura terciaria adecuada y se generan uniones disulfuro con el fin de ser biológicamente activos. El replegamiento se puede lograr usando numerosos procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, exponer el polipéptido solubilizado a un pH normalmente por encima de 7 en presencia de un agente caotrópico. La selección de caotropo es similar a las elecciones utilizadas para la solubilización de cuerpos de inclusión, sin embargo un caotropo se usa normalmente en una concentración inferior. Los ejemplos de agentes caotrópicos son guanidina y urea. En la mayoría de los casos, la solución de replegamiento/oxidación también contendrá un agente reductor más su forma oxidada en una relación específica para generar un potencial redox particular que permite que se produzca la transposición de disulfuro para la formación de puentes de cisteína. Algunas cuplas redox comúnmente utilizados incluyen cisteína/cistamina, glutatión/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT /ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (BME)/ditio-bME. En muchos casos, se puede usar un cosolvente para aumentar la eficiencia del replegamiento. Los cosolventes comúnmente usados incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, y arginina.

Además, los polipéptidos se pueden sintetizar en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos están disponibles en el comercio y se pueden utilizar de acuerdo con protocolos conocidos. Ver, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987).

Los polipéptidos y proteínas de la presente invención se pueden purificar de acuerdo con técnicas de purificación de proteínas que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Estas técnicas implican, en un nivel, el fraccionamiento bruto de las fracciones proteínicas y no proteínicas. Después de haber separado los polipéptidos de péptidos de otras proteínas, el péptido o polipéptido de interés se puede purificar adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación parcial o completa (o purificación hasta la homogeneidad). El término "polipéptido aislado" o "polipéptido purificado" tal como se usa en la presente, pretende referirse a una composición, aislable de otros componentes, en la que el polipéptido se purifica en algún grado con respecto a su estado obtenible naturalmente. Por lo tanto, un polipéptido purificado también se refiere a un polipéptido que está libre del ambiente en el que se puede producir naturalmente. Generalmente, "purificado" se referirá a una composición de polipéptido que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar diversos otros componentes, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se utiliza el término "sustancialmente purificado", esta denominación se referirá a un péptido o composición de polipéptido en la que el polipéptido o péptido forma el componente principal de la composición, tales como que constituye aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, o aproximadamente 90% o más de las proteínas en la composición.

Diversas técnicas adecuadas para usar en la purificación serán bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos (inmunoprecipitación) y similares o por desnaturalización térmica, seguido de centrifugación; cromatografía, tal como cromatografía de afinidad (columnas de Proteína-A), intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatita, cromatografía de interacción hidrofóbica; isoelectroenfoque; electroforesis en gel; y combinaciones de estas técnicas. Como es generalmente conocido en la técnica, se considera que se puede modificar el orden de realización de las diversas etapas de purificación, o que se pueden omitir ciertas etapas, y aún dar como resultado un método adecuado para la preparación de un polipéptido sustancialmente purificado. Los ejemplos de etapas de purificación se proporcionan en los siguientes Ejemplos.

Los expertos en la técnica conocerán varios métodos para cuantificar el grado de purificación del polipéptido a la luz de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, la determinación de la actividad de unión específica de una fracción activa, o evaluación de la cantidad de péptido o polipéptido dentro de una fracción mediante análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción de polipéptido es calcular la actividad de unión de la fracción, para compararla con la actividad de unión del extracto inicial, y de este modo calcular el grado de purificación, en la presente evaluado por un "número de veces de purificación". Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad de unión, obviamente, dependerán de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación y si el polipéptido o péptido exhibe o no una actividad de unión detectable.

Las variantes de "polipéptidos de activina tipo IIB se unen a ligandos que activan las cascadas de degradación en músculo. Los polipéptidos de vActRIIB capaces de unirse e inhibir la actividad de los ligandos activina A, la miostatina, y/o GDF-11 , tienen potencial terapéutico contra las enfermedades que implican la atrofia muscular, así como el tratamiento de ciertos tipos de cáncer, por ejemplo, tumores de ovario, tumores de próstata y melanoma y otras enfermedades como se muestra en los siguientes Ejemplos.

Sin embargo, la agregación se puede producir cuando se expresan o purifican los polipéptidos de ActRIIB o ActRIIB5 tipo salvaje. Esta agregación incluye la formación de oligómeros estructurados durante la expresión y la generación de agregado no estructurado durante la expresión y después de la purificación del polipéptido.

Los enfoques combinados de análisis de la estructura, modelado molecular, y espectrometría de masas han indicado que la multimerización puede surgir en los polipéptidos de ActRIIB mediante la formación de enlaces disulfuro intermolecular con la ayuda de las interacciones electrostáticas y de enlace hidrógeno entre los polipéptidos ActRIIB no glicosiladas. Existen enlaces de hidrógeno significativos en la ¡nterfaz de dos moléculas de ActRIIB; por ejemplo, entre la cadena lateral E28 en un ActRIIB y la cadena lateral R40 en el otro ActRIIB. Además, existen interacciones electrostáticas críticos entre E28 en un ActRIIB y R40 en el otro ActRIIB.

Estas interacciones electrostáticas pueden contribuir significativamente a aumentar la población de dímeros de ActRIIB temporales, lo que produce la promoción de formación de enlaces no covalentes y/o covalentes entre las unidades de ActRIIB. La interacción entre los residuos 28 y 40 es la más crítica entre estas interacciones ya que estos dos residuos están involucrados en los enlaces dobles de hidrógeno y una fuerte interacción electrostática. Los residuos 28 y 40 están involucrados en las interacciones ActRIIB:ActRIIB y no en las interacciones ActRIIB: ligando. Por lo tanto, los residuos 28 y 40 se pueden sustituir con aminoácidos no nativos de acuerdo con la invención, para mejorar la solubilidad, y reducir la agregación de los polipéptidos del receptor. Por lo tanto, E28 y R40 fueron sustituidos, respectivamente, con otros posibles aminoácidos naturales, expresados, y analizados por Biacore como se muestra a continuación. La unión determinada por Biacore se muestra en las Tablas 1A y 1 B en el siguiente Ejemplo 2. Además, el porcentaje de agregación de los polipéptidos vActRIIB se determinan a continuación.

Los resultados de los siguientes Ejemplos muestran reducción de la agregación para los polipéptidos y proteínas de vActRIIB que tienen las sustituciones de aminoácidos descriptas en la presente, mientras que retienen la capacidad para unirse y neutralizar la miostatina, activina A, o GDF-11.

ANTICUERPOS La presente invención incluye además anticuerpos que se unen a las variantes de polipéptidos de ActRIIB, que incluyen los que se unen específicamente a los polipéptidos vActRIIB de la presente invención. Como se usa en la presente el término "se une específicamente" se refiere a anticuerpos que tienen una afinidad de unión (Ka) para los polipéptidos de vActRIIB de 106 M-1 o mayor. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos intactos que incluyen anticuerpos policlonales (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988)), y anticuerpos monoclonales (ver, por ejemplo, Patente U.S. Nos. RE 32.011, 4,902.614, 4.543.439 y 4.411 ,993, y Monoclonal Antibodies: A New Dimensión in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980)). Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" también se refiere a un fragmento de un anticuerpo tal como F (ab), F (ab1), F (ab') 2, Fv, Fe, y anticuerpos de cadena simple que se producen por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. El término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos biespecíficos o bifuncionales, que son un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/liviana diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir por una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. (Ver Songsivilai et al, Clin. Exp. Immunol 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol.148: 1547-1553 (1992)).

Como se usa en la presente el término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que tienen un dominio constante del anticuerpo ¡nmunoglobulina humana acoplado a uno o más dominios variables del anticuerpo ¡nmunoglobulina no humanas, o fragmentos de estos (ver, por ejemplo, la patente U.S. N.° 5.595.898 y la Patente U.S. N.° 5.693.493). Los anticuerpos también se refieren anticuerpos "humanizados" (ver, por ejemplo, Pat U.S. N.° 4.816.567 y WO 94/10332), minicuerpos (WO 94/09817), maxicuerpos, y los anticuerpos producidos por animales transgénicos, en los que un animal transgénico que contiene una proporción de los genes productores de anticuerpo humano, pero deficientes en la producción de anticuerpos endógenos son capaces de producir anticuerpos humanos (ver, por ejemplo, Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), y en la patente U.S. N 0 6.300.129). El término "anticuerpos" también incluye anticuerpos multiméricos, o un complejo de orden superior de proteínas, tales como anticuerpos heterodiméricos y anticuerpos antiidiotípicos. "Anticuerpos" incluye también anticuerpos anti-idiotípicos. Se pueden usar anticuerpos contra v de ActRIIB, por ejemplo, para identificar y cuantificar vActRMB in vitro e in vivo.

También se incluyen anticuerpos policlonales de cualquier mamífero, por ejemplo anticuerpos de ratón y rata, y anticuerpos de conejo, que se unen específicamente a los polipéptidos de vActRMB descriptos en la presente, que incluyen las SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, y 97.

Dichos anticuerpos se utilizan como herramientas de investigación y en ensayos cuantitativos para la detección y el ensayo de los polipéptidos descriptos en la presente. Tales anticuerpos se obtienen usando métodos descritos anteriormente y como se conoce en la técnica.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas y polipéptidos vActRIIB de la presente invención. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva del polipéptido o proteína en mezcla con materiales farmacéuticamente aceptables y materiales de formulación fisiológicamente aceptables. La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o sodio de hidrógeno sulfito); tampones (tales como borato, bicarbonato, TrisHCI, citratos, fosfatos, otros ácidos orgánicos); agentes de aumento de volumen (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como el ácido etilendiamintetraacético (EDTA)); agentes complejizantes (tales como cafeína, polivinilpírrolídona, betaciclodextrina o hidroxipropilbetaciclodextrina); rellenos; monosacáridos; disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, mañosa, o dextrinas); proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas); colorantes; aromatizantes y agentes de dilución; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones de formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, Tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (sacarosa o sorbitol); agentes de tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos (preferentemente sodio o cloruro de potasio, sorbitol manitol); vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, AR Gennaro, ed., ack Publishing Company, 1990).

La composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en el arte dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración pretendida, formato de suministro y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de clearance in vivo del polipéptido. Por ejemplo, las composiciones adecuadas pueden ser agua para inyección y solución fisiológica para la administración parenteral.

El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero son ejemplos de vehículos adicionales. Otros ejemplos de composiciones farmacéuticas comprenden tampón de Tris con pH 7,0-8,5 aproximadamente, o tampón de acetato con pH 4,0-5,5 aproximadamente, que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En una forma de realización de la presente invención, las composiciones se pueden preparar para su almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de torta liofilizada o de solución acuosa. Además, la composición terapéutica puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las formulaciones se pueden suministrar por una variedad de métodos, por ejemplo, por terapia de inhalación, por vía oral o por inyección. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden ser en forma de solución acuosa libre de pirógenos, parenteralmente aceptable, que comprende el polipéptido deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es el agua destilada estéril en la que un polipéptido se formula como una solución estéril, isotónica, conservada adecuadamente. Otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto que después puede suministrarse a través de una inyección de depósito. El ácido hialurónico también puede utilizarse y esto puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen los dispositivos de administración de fármacos implantables.

En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración inyectable se pueden formular en soluciones acuosas, con preferencia, en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódico, sorbitol o dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo, triglicéridos o los liposomas. Los polímeros amino policatiónicos no lipidíeos también se pueden usar para la entrega. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados para aumentar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En otra forma de realización, una composición farmacéutica puede formularse para su inhalación. Las soluciones para ser inhaladas también se pueden formular con un propulsor para su administración en aerosol. En aún otra forma de realización, las soluciones se pueden nebulizar. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT N° PCT/US94/001875, que describe la administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente.

También se contempla que ciertas formulaciones puedan administrarse por vía oral. En una forma de realización de la presente invención, las moléculas que se administran de esta manera se pueden formular con o sin los vehículos utilizados habitualmente en la composición de formas de dosificación sólidas tales como los comprimidos y las cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en un punto en el tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad; y así la degradación presistémica se reduce al mínimo. Pueden incluirse algunos agentes adicionales para facilitar la absorción de la molécula terapéutica. Pueden emplearse también diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes. Las composiciones farmacéuticas para administración oral también pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el arte en dosificaciones adecuadas para la administración oral.

Tales vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, y similares, para su ingestión por el paciente.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener a través de la combinación de compuestos activos con excipiente sólido y tratando la mezcla de gránulos resultante (opcionalmente, después de la molienda) para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Se pueden añadir auxiliares adecuados, si así se desea. Los excipientes adecuados incluyen cargas de hidratos de carbono o proteínas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio; gomas, incluyendo goma árabica y tragacanto; y proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar y el ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se pueden usar junto con los revestimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentradas, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Colorantes o pigmentos pueden añadirse a los comprimidos o recubrimientos de las grageas para identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral también incluyen cápsulas de ajuste por presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con cargas o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como los aceites grasos, líquido o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.

Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en el arte, incluyendo formulaciones que implican polipéptidos en formulaciones de entrega sostenida, o controlada. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de entrega sostenida, o de entrega controlada, tales como los portadores de liposomas, las micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también son conocidas por los expertos en el arte. Véase, por ejemplo, PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolímeros, 22:547-556 (1.983), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed Mater Res., 15:167-277, (1.981); Langer et al., Chem. Tech, 12:98-105 (1982)), etileno acetato de vinilo (Langer et al., supra.) o poli— D(— )— 3— hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de los varios métodos conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., PNAS (U.S.), 82:3.688 (1985); EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949.

La composición farmacéutica que se utilizará para la administración in vivo típicamente debe ser estéril. Esto puede conseguirse por filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando se liofiliza la composición, la esterilización usando este método puede llevarse a cabo ya sea antes o después de la liofilización y la reconstitución. La composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere la reconstitución antes de la administración.

En una realización específica, la presente invención se refiere a kits para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits pueden contener cada uno tanto un primer recipiente que tenga una proteína seca y un segundo recipiente que tenga una formulación acuosa. También se incluyen dentro del alcance de esta invención kits que contienen jeringas individuales y de cámaras múltiples precargadas (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).

Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y de los objetivos. Un experto en el arte apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento, por lo tanto, variarán dependiendo, en parte, de la molécula suministrada, de la indicación para la que se está utilizando el polipéptido, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, órgano superficie o el tamaño del órgano) y condición del paciente (la edad y salud general). De acuerdo con ello, el clínico puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica puede variar desde aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Las composiciones polipéptidos pueden ser preferiblemente inyectables o que se administren por vía intravenosa. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada tres a cuatro días, cada semana o cada dos semanas dependiendo de la tasa media de vida y el aclaramiento de la formulación particular. La frecuencia de la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del polipéptido en la formulación utilizada. Típicamente, una composición se administra hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. Por consiguiente, la composición se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (en las mismas o diferentes concentraciones/dosis) con el paso del tiempo o como una infusión continua. El perfeccionamiento de la dosis adecuada se realiza de forma rutinaria. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse a través del uso de datos de dosis/respuesta apropiados.

La vía de administración de la composición farmacéutica concuerda con procedimientos conocidos, por ejemplo, por vía oral, a través de inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intralesional, intraportales, ¡ntraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, o intraperitoneal; así como intranasal, enteral, tópica, sublingual, uretral, medios vaginales, rectales o por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones se pueden administrar por inyección de bolo o continuamente mediante infusión o mediante dispositivo de implantación. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede administrarse localmente a través de la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado y la entrega de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación temporizada o una administración continua.

En algunos casos, los polipéptidos de vActRIIB de la presente invención se pueden liberar mediante el implante de ciertas células que se han manipulado genéticamente, usando métodos tales como los descriptos en la presente, para expresar y secretar el polipéptido. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Con el fin de disminuir la probabilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden ser encapsuladas para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son normalmente recintos o membranas poliméricas biocompatibles, semipermeables que permiten la liberación del producto de polipéptido pero impiden la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

También se prevé la terapia génica in vivo de vActRIIB en la que una molécula de ácido nucleico que codifica vActRIIB, o un derivado de vActRIIB se introduce directamente en el sujeto. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un vActRIIB se introduce en las células blanco a través de la inyección local de un constructo de ácido nucleico con o sin un vector de suministro apropiado, tal como un vector de virus adeno-asociado. Los vectores virales alternativos incluyen, pero sin limitación, retrovirus, adenovirus, herpes simple, virus y vectores de virus del papiloma. La transferencia física del vector de virus se puede obtener in vivo por la inyección local del constructo de ácido nucleico deseado u otro vector de suministro apropiado que contiene la secuencia de ácidos nucleicos deseada, transferencia mediada por liposomas, inyección directa (ADN desnudo), o bombardeo de micropartículas (pistola génica).

USOS DE COMPOSICIONES DE vActRIIB La presente invención proporciona métodos y composiciones farmacéuticas para reducir o neutralizar la cantidad o actividad de la miostatina, activina A, o GDF-11 in vivo e in vitro mediante el contacto de los polipéptidos con el polipéptido de vActRIIB. Los polipéptidos de vActRIIB tienen una alta afinidad por la miostatina, activina A, y GDF-11, y son capaces de reducir e inhibir las actividades biológicas de al menos uno de miostatina, activina A y GDF-11. En algunas formas de realización, los polipéptidos de vActRIIB exhiben mejor actividad en comparación con los polipéptidos de ActRIIB tipo salvaje. Esto se demuestra en los siguientes Ejemplos.

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos y reactivos para el tratamiento trastornos relacionados con miostatina y/o relacionados con activina A en un sujeto que necesita tal tratamiento mediante la administración de una dosis efectiva de una composición de vActRIIB al sujeto. Como se usa en la presente el término "sujeto" se refiere a cualquier animal, tal como mamíferos, que incluyen los seres humanos.

Las composiciones de la presente invención se usan para aumentar la masa muscular magra como un porcentaje del peso corporal y disminuir la masa de grasa como porcentaje del peso corporal.

Los trastornos que pueden ser tratados con una composición de vActRIIB incluyen, pero sin limitación varias formas de debilitamiento muscular, así como trastornos metabólicos tales como la diabetes y trastornos relacionados, y enfermedades degenerativas óseas tales como osteoporosis. Se ha demostrado que las composiciones de vActRIIB son efectivas en el tratamiento de los trastornos de debilidad muscular en diversos modelos de enfermedad expuestos en el siguiente Ejemplo 3. Esto se demuestra en el tratamiento de la debilitamiento muscular en los ratones deficientes en inhibina-a, el tratamiento de debilitamiento muscular en los modelos de caquexia de cáncer de colon-26, la prevención de la atrofia muscular el modelo de suspensión del miembro trasero, tratamiento de las mujeres OXV que muestran aumento de la masa muscular magra, disminución de la masa grasa y aumento del contenido mineral de los huesos.

Los trastornos de debilitamiento muscular también incluyen distrofias tales como distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular tipo Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Erb, y la distrofia muscular neuroaxonal infantil. Los trastornos de debilitamiento muscular adicional derivan de las enfermedades o trastornos crónicos tales como la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, cáncer, SIDA, insuficiencia renal, atrofia de los órganos, deprivación de andrógenos, y artritis reumatoide.

La sobreexpresión de la miostatina y/o activina pueden contribuir a la caquexia, síndrome de debilitamiento de músculo y grasa grave. La efectividad de los polipéptidos de vActRIIB en el tratamiento de las caquexias en modelos animales se muestra en el siguiente Ejemplo 3. La caquexia también surge debido a la artritis reumatoide, nefropatía diabética, insuficiencia renal, quimioterapia, lesión debido a quemaduras, así como otras causas. En otro ejemplo, se halló que las concentraciones séricas e intramusculares de la proteína inmunorreactiva de miostatina aumentan en los hombres que presentan debilitamiento muscular relacionado con el SIDA y estaban inversamente relacionadas con la masa libre de grasa (Gonzalez-Cadavid et al, PNAS USA 95:. 14938 a 14943 (1998)). También se ha demostrado que los niveles de miostatina aumentan en respuesta a lesiones por quemaduras, lo que produce un efecto muscular catabólica (Lang et al, FASEB J 15, 1807-1809 (2001)). Otras afecciones que resultan en debilitamiento muscular pueden surgir de la inactividad debido a la discapacidad, como el confinamiento en una silla de ruedas, reposo en cama prolongado debido a un accidente cerebrovascular, enfermedad, lesión de la médula espinal, fractura o trauma óseo, y atrofia muscular en un ambiente de microgravedad (vuelo espacial). Por ejemplo, se halló que la proteína inmunorreactiva miostatina plasmática aumenta después del reposo prolongado en cama (Zachwieja et al J Physiol Gravit 6(2): 11 (1999). También se halló que los músculos de las ratas expuestas a un ambiente de microgravedad durante un vuelo del transbordador espacial expresó una mayor cantidad de miostatina en comparación con los músculos de las ratas que no fueron expuestos (Lalani et al., J.Endocrin 167 (3): 417-28 (2000)).

Además, los aumentos relacionados con la edad en las relaciones de grasa a músculo, y la atrofia muscular relacionada con la edad parecen estar relacionados con la miostatina. Por ejemplo, la proteína inmunorreactiva de miostatina sérica promedio aumentó con la edad en los grupos de hombres y mujeres jóvenes (19-35 años), mediana edad (36-75 años) y edad avanzada (76-92 años), mientras que la masa muscular y la masa libre de grasa promedio disminuyeron con la edad en estos grupos (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6 (5) :343-8 (2002)). Además, en la actualidad se ha hallado que la miostatina se expresa en niveles bajos en el músculo cardíaco y la expresión es regulada por aumento en los cardiomiocitos después del infarto (Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (1) :1-9 (1999)). Por lo tanto, la reducción de los niveles de miostatina en el músculo del corazón puede mejorar la recuperación del músculo cardiaco después de infarto.

La miostatina también parece influir en los trastornos metabólicos que incluyen diabetes tipo 2, diabetes mellitus no insulinodependiente, hipergiucemia, y obesidad. Por ejemplo, se ha demostrado que la falta de miostatina mejora los fenotipos obesos y diabéticos de dos modelos de ratón (Yen et al FASEB J. 8:479 (1994). Se ha demostrado en la solicitud U.S. serie N.° 11/590, 962, publicación de la solicitud U.S. N.°: 2007/0117130, que los vectores AAV-ActRIIB5 aumentan la relación de músculo a grasa en un animal, en particular para modelos animales obesos. Los polipéptidos de vActRIIB de la presente descripción, tales como las SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 , 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68 , 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 son adecuados para tales usos. Por lo tanto, la disminución de la composición de grasa mediante la administración de las composiciones de la presente invención mejorará la diabetes, obesidad, y condiciones de hipergiucemia en animales. Además, las composiciones que contienen los polipéptidos de vActRIIB pueden reducir la ingestión de alimentos en los individuos obesos, como se demuestra en la solicitud U.S serie n.°: 11/590. 962, publicación de solicitud U.S n°: 2007/0117130 para el polipéptido de ActRIIB5.

La administración de los polipéptidos de ActRIIB de la presente invención pueden mejorar la resistencia ósea y reducir la osteoporosis y otras enfermedades óseas degenerativas. Esto ha sido demostrado en el modelo de ratón OVX que se describe a continuación. También se ha hallado, por ejemplo, que los ratones deficientes en miostatina mostraron aumento del contenido mineral y la densidad del húmero de ratón y aumento del contenido mineral del hueso trabecular y cortical en las regiones en las que se unen los músculos, así como aumento de la masa muscular (Hamrick et al. Calcif Tissue Int. 71 (1) :63-8 (2002)). Además, las composiciones de vActRIIB de la presente invención se pueden usar para tratar los efectos de la privación de andrógenos tales como la terapia de privación de andrógenos usada para el tratamiento de cáncer de próstata.

La presente invención también proporciona métodos y composiciones para aumentar la masa muscular en los animales destinados al consumo mediante la administración de una dosis efectiva de las proteínas de vActRIIB al animal. Debido a que el polipéptido C-terminal maduro de miostatina es idéntico en todas las especies analizadas, se puede esperar que los polipéptidos vActRIIB sean efectivos para aumentar la masa muscular y reducir la grasa en cualquiera de las especies agrícolamente importantes, que incluyen ganado vacuno, pollo, pavos y cerdos.

Los polipéptidos y las composiciones de vActRIIB de la presente invención también antagonizan la actividad de la activina A. Se sabe que la activina A se expresa en ciertos tipos de cáncer, en particular tumores gonadales tales como carcinomas de ovario, y para causar caquexia severa. . (Ciprano et al. Endocrinol 141 (7):2319-27 (2000), Shou et al., Endocrinol 138 (11 ):5000-5 (1997); Coerver et al, Mol Endocrinol 10(5):534- 3 (1996); Ito et al. British J Cáncer 82(8):1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al, Gynecologic Oncology 74:93-7 (1999). En el siguiente Ejemplo 3, se ha demostrado que los polipéptidos de vActRIIB de la presente invención son efectivos en el tratamiento de la caquexia grave, reducen el tamaño del tumor, y prolongar la supervivencia en modelos de ratones deficientes en inhibina-a y modelos de ratón de caquexia por cáncer colon 26. Por lo tanto, las composiciones de la presente descripción se pueden utilizar para tratar afecciones relacionadas con la sobreexpresión de activina A, así como la expresión de miostatina, tal como la caquexia de ciertos tipos de cáncer y el tratamiento de ciertos tumores de tipo gonadal y el melanoma.

Las composiciones de la presente descripción se pueden utilizar solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para mejorar sus efectos terapéuticos o disminuir los efectos secundarios potenciales. Estas propiedades incluyen aumento de la actividad, aumento de la solubilidad, reducción de la degradación, aumento de la vida media, reducción de la toxicidad, ya reducción de la inmunogenicidad. En consecuencia, las composiciones de la presente descripción son útiles para los regímenes de tratamiento extendidos. Además, las propiedades de hidrofilicidad e hidrofobicidad de los compuestos de la invención están bien equilibradas, de este modo mejora su utilidad para los usos in vitro y especialmente in vivo. Específicamente, los compuestos de la descripción tienen un grado apropiado de solubilidad en medios acuosos que permite la absorción y biodisponibilidad en el cuerpo, mientras que también tiene un grado de solubilidad en los lípidos que permite que los compuestos atraviesen la membrana celular a un sitio putativo de acción, tales como una masa muscular particular.

Los polipéptidos y composiciones de vActRIIB de la presente invención se pueden usar en combinación con agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer. Los quimioterapéuticos pueden incluir fármacos anti-neoplásicos. Los quimioterapéuticos también pueden incluir agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de plantas y terpenoides.

Los agentes alquilantes puede comprender cisplatino y caroplatino. Los anti-metabolitos pueden incluir purinas (por ejemplo azatioprina o mercaptopurina) o pirimidinas. Adicionalmente, los agentes quimioterapéuticos pueden ser análogos de nucleósidos, por ejemplo, 5-fluorouracilo. También se pueden usar alcaloides de la vinca, tales como vincristina o vinblastina.

Los agentes antineoplásicos adicionales pueden incluir, por ejemplo, agentes alquilantes que incluyen: mostazas nitrogenadas, tales como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan y clorambucilo; nitrosoureas, tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), y semustina (metil-CCNU); etileniminas/metilmelamina tales como trietilenmelamina (TEM), trietileno, tiofosoforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquilo tales como busulfano; triazinas tales como dacarbazina (DTIC); antimetabolitos que incluyen análogos del ácido fólico tales como metotrexato y trimetrexato, análogos de pirimidina tales como 5-fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, gemcitabina, arabinósido de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodesoxicitidina, análogos de purina tales como 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desox¡coformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); productos naturales, incluidos los fármacos antimitóticos tales como paclitaxel, alcaloides de la vinca, que incluyen vinblastina (VLB), vincristina, y vinorelbina, taxótero, estramustina, y fosfato de estramustina; ppipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos como actimomícina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C, y actinomicina; enzimas tales como L-asparaginasa; modificadores de la respuesta biológica tales como interferón-alfa, IL-2, G-CSF y GM-CSF; agentes misceláneos que incluyen complejos de coordinación de platino tales como cisplatino y carboplatino, antracenodionas tales como mitoxantrona, urea sustituida tal como hidroxiurea, derivados de metilhidrazina que incluyen N-metilhidrazina (MIH) y procarbazina, supresores adrenocorticales tales como mitotano (o, p -DDD) y la aminoglutetimida ; hormonas y antagonistas que incluyen antagonistas adrenocorticosteroide como la prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; progestina tales como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol; estrógenos tales como dietilestilbestrol y etinil estradiol equivalentes; antiestrógeno tal como tamoxifeno; andrógenos que incluyen propionato de testosterona y fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos tales como flutamida, análogos de la hormona liberadora de gonadotropina y leuprolida; y antiandrógenos no esferoides tales como flutamida.

Además, los polipéptidos de vActRIIB de la presente invención son útiles para detectar y cuantificar la miostatina, activina A, o GDF-11 en numerosos ensayos. En general, los polipéptidos de ActRIIB de la presente invención son útiles como agentes de captura para unir e inmovilizar la miostatina, activina A, o GDF-11 en una variedad de ensayos, similares a los descriptos, por ejemplo, en Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993). Los polipéptidos se pueden marcar de alguna manera o pueden reaccionar con una tercera molécula tal como un anticuerpo que está marcado para permitir detectar y cuantificar la miostatina. Por ejemplo, un polipéptido o una tercera molécula se pueden modificar con un resto detectable, tal como biotina, que luego se puede unir con una cuarta molécula, tal como estreptavidina marcada con enzima, u otras proteínas. (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod. Pathol 10:585 (1997)).

Habiendo descripto la invención, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS POLIPÉPTIDOS DE VACTRIIB Los siguientes métodos se utilizaron para la expresión y purificación de las variantes de polipéptidos de ActRIIB.

El ADNc del receptor tipo IIB de activina humano se aisló de una biblioteca de ADNc de origen de testículo humano (Clontech, Inc.) y se clonó como se describe en la solicitud U.S. serie n.°: 11/590, 962, publicación de solicitud de U.S. N.°: 2007/0117130.

DETERMINACIÓN DE LAS SUSTITUCIONES DE AMINOÁCIDOS Los enfoques combinados de análisis de la estructura, modelado molecular, y espectrometría de masas indicaron que la agregación (oligomerización) puede surgir en ActRMB través de la formación de enlaces disulfuro intermolecular desencadenada por interacciones electrostáticas y enlaces H entre las moléculas de ActRMB no glicosiladas. Se determinó que los residuos 28 y 40 están involucrados en las interacciones ActRIIB:ActRIIB y no en las interacciones de ActRMB con sus ligandos.

Inicialmente, E28 y R40 en ActRIIB-Fc se sustituyeron con A en cada posición. Los análisis de dispersión de la luz y espectrometría de masas confirmaron que la fracción de vActRIIB-lgGIFc, E28A y vActRIIB-lgGIFc R40A totalmente glicosilada fue significativamente mayor en comparación con la proteína tipo salvaje. E28A y R40A vActRIIB-Fc de lgG1 se incubaron a 37 °C durante 6 días, lo que produce poca o ninguna agregación en comparación con el tipo salvaje. Las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 28 y 40 (con respecto a las SEQ ID NOS: 2 y 18 con la secuencia señal) se realizaron para aliviar o prevenir la agregación que puede ocurrir durante la expresión o purificación de la ActRMB de tipo salvaje (SEQ ID Nros: 2 y 18). Esta agregación se ha identificado como la formación de oligómeros estructurados durante la expresión y la generación de agregado no estructurado durante la expresión y después de la purificación de proteínas.

La agregación en diferentes etapas de los procesos de producción y de purificación se determinó usando cromatografía de exclusión de tamaño de acuerdo con el siguiente procedimiento.

El siguiente ejemplo de método se utilizó para producir las variantes de los polipéptidos de ActRIIB (vActRIIB y vActRIIB5). Los polinucleótidos que codifican la vActRIIB, E28W (SEQ ID N °: 23) se fusionaron a los polinucleótidos que codifican el dominio Fe de lgG1 humana (SEQ ID N °: 82) o polinucleótidos que codifican Fe de lgG2 humana (SEQ ID NO: 84), a través de una secuencia ligadora bisagra (nucleótidos que codifican la SEQ ID NO: 79) mediante PCR de extensión superpuesta usando los cebadores que contienen la mutación que produce E28W. La secuencia de polinucleótidos completa es la SEQ ID NO: 61. Los fragmentos de ADN de doble cadena se subclonaron en pTT5 Biotechnology Research Institute, National Research Council Canadá (NRCC), 6100 Avenue Royalmount, Montréal (Québec) Canadá H4P 2R2), pDSRoc (descripto en WO/9014363) y/o derivados de pDSRa. En otras formas de realización, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de vActRIIB estaban unidos a los polinucleótidos que codifican el ligador GGGGS (SEQ ID NO: 75) o multímeros de estos, y/o ligadores de bisagra (tales como SEQ ID NO: 79).

La expresión transitoria de vActRIIB-Fc y vActRIIB5-Fc manipulada genéticamente se llevó a cabo de la siguiente manera.

Las variantes manipuladas genéticamente de las dos moléculas anteriores se expresaron de modo transitorio en las células 293-6E adaptadas a la suspensión libre de suero (National Research Council of Canadá, Ottawa, Canadá) que se mantienen en medio FreeStyle ™ (Invitrogen Corporation, Carisbad, CA), suplementado con 250 pg/ml de geneticina (Invitrogen) y Pluronic F68 0,1% (Invitrogen). Las transfecciones se realizaron como cultivos de 1 litro. Brevemente, el inoculo celular se cultivó a razón de 1 ,1 ? 106 células/ml en un matraz de agitación Fernbach de 4 L (Corning, Inc.). El cultivo en matraz de agitación se mantuvo en una plataforma agitadora Innova 2150 (News Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 65 rpm que se colocó en un incubador humidificado mantenido a 37 °C y 5% de C02. En el momento de la transfección, las células 293-6E se diluyeron a 1,0 ? 106 células/ml.

Los complejos de transfección se formaron en 100 mi de medio FreeStyle. Primero se añadió 1 mg de ADN plásmido en el medio, seguido de 3 mi de reactivo de transfección FuGene HD (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). El complejo de transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y después se añadió a las células en el matraz de agitación. Veinticuatro horas s después de la transfección, se añadió 20% (p/v) de TN1 peptona (OrganoTechnie SA, TeknieScience, QC, Canadá), para alcanzar una concentración final de 0,5% (p/v). La transfección/expresión se realizó durante 4-7 días, después de lo cual se recolectó el medio acondicionado por centrifugación a 4.000 rpm durante 60 minutos a 4 ° C.

La transfección y expresión estable se llevaron a cabo de la siguiente manera. Las las líneas celulares de lgG2-Fc de vActRIIB humano (hu) se crearon mediante la transfección estable de células huésped CHO con los plásmidos de expresión pDC323-vActRIIB (E28W)-hulgG2 Fe y pDC324-vActRIIB (E28W)-hulgG2 Fe (de acuerdo con Bianchi et al., Biotech and Bioengineering, 84(4):439-444 (2003)) usando un procedimiento de electroporación estándar. Después de la transfección de la línea celular huésped con los plásmidos de expresión, las células se cultivaron en medio de selección libre de suero sin GHT durante 2-3 semanas para permitir la selección del plásmido y la recuperación de las células. Las células se seleccionan hasta que lograron más del 85% de viabilidad. Esta mezcla de células transfectadas luego se cultivó en un medio que contiene 150 nM de metotrexato.

CLONACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR Se preparó un banco de células de los clones seleccionados de acuerdo con el siguiente procedimiento. Una mezcla amplificada de células transfectadas estables se sembró en placas de 96 pocilios, y los clones candidatos se evaluaron para determinar el desempeño de crecimiento y productividad en los estudios en pequeña escala. Se prepararon bancos de células premaestras (PMCB) de aproximadamente 60 viales a partir del clon elegido. Todos los PMCBs se analizaron para determinar esterilidad, micoplasma y virus.

Una línea celular que expresa vActRIIB-Fc se amplió mediante un proceso de alimentación discontinuo típico. Las células se inocularon en un biorreactor Wave (Wave Biotech LLC). El cultivo se alimentó tres veces con alimentaciones en bolo. Se recolectaron 10 L en el día 10, el resto se recolectó el día 11 ; ambas recolecciones se sometieron a filtración en profundidad, seguido de filtración estéril. El medio acondicionado se filtró a través de un prefiltro 10 pulgadas 0,45/0,2 micrones, seguido de una filtración a través de un filtro de 6 pulgadas de 0,2 micrones.

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Aproximadamente 5 I del medio acondicionado que contiene ActRIIB-Fc (lgG1 e lgG2), ActRIIB5-Fc (lgG1 e lgG2), y variantes de estas se concentraron utilizando un filtro de flujo de tangencial de membrana 5 ft2 10K (Pall). El material concentrado se aplicó a 5 mi de una columna de alto rendimiento™ de proteína A (GE Healthcare) que se había equilibrado con PBS (Dulbecco sin cloruro de magnesio o cloruro de calcio). Después de lavar la columna con el buffer de equilibrado hasta que la absorbancia a 280 nm (DO280) fue menor de 0,1, la proteína unida se eluyó con glicina 0,1 M-HCI, pH 2,7, e inmediatamente se neutralizó con 1 M de Tris-HCI, pH 8,5. La mezcla eluida neutralizada se concentró a un volumen de 1 mi y se aplicó a 320 mi de una columna de Sephacryl -200 (GE Healthcare) que se equilibró en PBS (Dulbecco sin cloruro de magnesio o cloruro de calcio. Se corrieron geles de 4-20% SDS PAGE (Invitrogen) para determinar qué fracciones mezclar. Estos polipéptidos se analizaron para determinar la actividad, y el grado de agregación, como se muestra a continuación.

Opcionalmente, los polipéptidos se pueden purificar adicionalmente, utilizando, por ejemplo, una columna de SHP-Sepharose. La concentración se determinó usando DO280.

EJEMPLO 2: ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VITRO Las muestras de polipéptidos vActRIIB purificados como se describió anteriormente se diluyeron con solución salina regulada con fosfato (PBS: 2,67 mM de cloruro de potasio, 138 mM de cloruro de sodio, 1 ,47 mM de fosfato de potasio monobásico, 8,1 mM de fosfato de sodio dibásico, pH 7,4) a 0,2 mg/ml, se incubaron a 37 °C durante 6 días, luego se aplicaron a MALDI-MS (espectrometría de masa por desorción láser asistida por matriz/ionización), análisis de SEQ y/o SEQ-LS. La agregación de los polipéptidos wt y variantes después de la etapa de purificación de proteína A se determinaron utilizando SEQ o SEQ-L y el peso molecular de las moléculas se confirmó usando el procedimiento MALDI-MS que se describe a continuación.

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEQ). Los experimentos se realizaron en un sistema HPLC Agilent 1100 con dos columnas (TOSOHAAS G3000SWXL, 7,8 x 300 mm) en tándem. Se utilizó 2x PBS como la fase móvil a 0,5 ml/minuto.

Cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz (SEQ-LS). Los experimentos se realizaron en un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna de filtración en gel Superdex-200 (Amersham Pharmacia, Waukesha, Wl). Las muestras luego se pasaron a través de un detector dispersión de luz láser Wyatt miniDawn LS y refractómetro Wyatt Optilab DSP (Wyatt Technology Co., Santa Bárbara, CA) para determinar la masa molecular. Se utilizó PBS como la fase móvil a 0,4 ml/minuto.

Espectrometría de masa por desorción láser asistida por matriz/ionización. Las muestras se mezclaron (1 :1) con ácido sinapínico y se aplicaron a MALDI-MS (Applied Biosystems Voyager System 2009). Este procedimiento se utilizó para comprobar el peso molecular de las moléculas.

La determinación de la afinidad de unión, y los valores de IC50 para la activina y la miostatina se obtuvieron como se describe a continuación.

Ensayo cualitativo BIAcore ®. E28 y R40 fueron sustituidos, respectivamente, con otros aminoácidos naturales en fusiones con Fe de lgG1 como se describió anteriormente. Estos se generaron con o sin ligadores, como se muestra en las siguientes tablas. Cada muestra de vActRIIB-lgGIFc del medio condicionado se capturó en una superficie recubierta CM5 con anticuerpo anti-lgG1 Fe humana de cabra (Jackson Immuno Research, Cat# 109-005-098, lote 63550). Se inyectaron 20 nM de activina A sobre las superficies de la muestra capturada utilizando BIACore2000 (Life Sciences BIACORE, Piscataway, Nueva Jersey). Los sensogramas resultantes se normalizaron al RL capturado (500 RU) de variantes vActRIIB-lgGIFc. La respuesta de unión normalizada (RU) para algunas variantes se muestran en la Tabla 2, y se describe adicionalmente más adelante. La afinidad de unión relativa para la activina también se determinó mediante mediciones de Biacore utilizando medio acondicionado obtenido de la expresión de células de mamíferos. La activina A (20 nM) se utilizó para capturar el polipéptido de receptor soluble en los medios condicionados y se normalizaron las señales SPR medidas. SPR normalizado de +++++: > 60, ++++: 40 - 60, +++: 20 - 40, ++: 10 - 20, +: 5 - 10, -: <5.

La Tabla 1A y Tabla 1B resumen los resultados de los datos de unión relativos. La siguiente tabla muestra que ciertas formas de realización de la vActRIIB-lgGI Fc en particular se unen a activina A con mayor afinidad que el tipo salvaje o retienen una afinidad comparable con el tipo salvaje.

Tabla 1A: Unión de Fe de ActRIIB-lgG1 de tipo salvaje y manipulada ingeniería (transfectantes estables) Tabla 1 B: Unión de Fe de ActRIIB-lgG1 de tipo salvaje y manipulada por ingeniería (transfectantes transitorios) ENSAYO DE ACTIVIDAD BASADA EN CÉLULAS C2C12 Las variantes vActRIIB5-Fc de lgG1 y vActRIIB-Fc de lgG1 se generaron como se describió anteriormente. La capacidad de estas variantes para inhibir la unión de la activina A o la miostatina al receptor de activina IIB se analizó usando un ensayo de actividad basado en células que se describe a continuación.

Se generó una línea celular indicadora receptiva para miostatina/activina/GDF-11 por transfección de células de mioblastos C2C12 (ATCC N.°: CRL-1772) con un constructo pMARE-luc. El constructo pMARE-luc se obtiene por clonación de doce repeticiones de la secuencia CAGA, que representa los elementos de respuesta a miostatina/activina (Dennler et al EMBO 17:. 3091 a 3100 (1998)) en un vector indicador pLuc-MCS (Stratagene Cat# 219087) corriente arriba de la caja TATA. Las células C2C12 expresan naturalmente el receptor de activina I IB en su superficie celular. Cuando miostatina /activina A/GDF-11 se une a los receptores de las células, la vía Smad se activa, y Smad fosforilado se une al elemento de respuesta (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), lo que produce la expresión del gen de luciferasa. A continuación, la actividad luciferasa se midió usando un kit de ensayo indicador de luciferasa (Cat# E4550, Promega, Madison, Wl) según el protocolo del fabricante. Una línea estable de células C2C12 que se ha transfectado con pMARE-luc (C2C12/pMARE) se utilizó para medir la actividad de acuerdo con el siguiente procedimiento. Las células indicadoras se sembraron en cultivos de 96 pocilios. Se realizó la prueba utilizando diluciones de las fusiones de células tipo salvaje y variante ActRIIB-lgG1 Fe construidas como se describió anteriormente con la concentración fija en 4 n de activina. La activina A se preincubó con los receptores a varias concentraciones. La actividad de activina se midió mediante la determinación de la actividad de luciferasa en los cultivos tratados. Los valores de IC50 se determinaron para cada polipéptido. Estos se muestran en la Tabla 2. El mismo procedimiento se siguió para fusiones de ActRIIB-hulgG2 Fe producidas como se describió anteriormente para la determinación de la miostatina. Se usaron proteína A purificada wt y variantes en la determinación de los valores de IC50 para la miostatina utilizando la misma metodología. Para esta determinación, los polipéptidos se preincubaron con miostatina 4 nM. Además, se determinó el grado de agregación usando los procedimientos descriptos anteriormente. Estos valores se dan en la siguiente Tabla 3.

Del conjunto de variantes ActRIIB5-lgG1 Fe que se enumeran en la Tabla 1A, varias variantes ActRIIB-lgG1 Fe y tres variantes ActRIIB5-lgG1 Fe junto con los polipéptidos de tipo salvaje se purificaron adicionalmente y analizaron por SPR (resonancia de plasmón superficial) a 20 nM de activina A. La Tabla 2 muestra la afinidad de unión de SPR de polipéptidos vActRIIB-lgG1 Fe seleccionados para la activina. La activina A (20 nM) se utilizó para capturar polipéptidos vActRIIB en las muestras y se normalizaron las señales SPR medidas. Los valores de CI50 se obtuvieron a partir de ensayos de inhibición de la activina basados en células descriptos anteriormente. Los errores estándar son menos de 10% para todos los resultados.

Tabla 2 RU de SPR Variante normalizado (RU = IC50 (nM) de activina unidad de respuesta) ActRIIB-lgG Fc (SEQ 35 8.20 ID NO:58) vActRIIB-lgGI Fc, 20 25.30 E28A (SEQ ID NO:60) vActRIIB-lgGIFc, 128 2.07 E28W (SEQ ID NO:62) RU de SPR Variante normalizado (RU = IC50 (nM) de activina unidad de respuesta) vActRIIB-lgGI Fc, ??5 2.10 E28Y (SEQ ID NO:64) vActRIIB-lgGI Fc, 18 R40G (SEQ ID NO:66) ActRIIB5-lgG1 Fc 37 (SEQ ID NO:68) vActRIIB5-lgG1 Fc, 8 E28A (SEQ ID NO:70) vActRIIB5-lgG1 Fc, 45 16.86 E28W (SEQ ID NO:72) Como se muestra anteriormente en la Tabla 2, el valor IC50 de vActRIIB-IgGI Fc (E28W) para bloquear la activina fue 2,07 nM y el valor IC50 de vActRIIB-IgGI Fc (E28Y) fue 2,1 nM en comparación con el tipo salvaje. Por otra parte, las variantes E28W y E28Y de vActRIIB-lgGI Fc eran estables y no se agregaron una vez purificadas.

También se determinó el valor de IC50 en un ensayo de bloqueo de miostatina basado en células para las variantes de polipéptidos adicionales. Estas variantes fueron los polipéptidos de vActRIIB maduros truncados que carecen de secuencia señal y los primeros seis aminoácidos del extremo N-terminal. Estas secuencias se muestran en la Tabla 3. La Tabla 3 muestra el porcentaje de agregación de la proteína después de la purificación de proteína A, y el valor de IC50 con respecto a miostatina. Se puede observar que el porcentaje de agregación es mucho menor para las variantes de polipéptidos en comparación con los de tipo salvaje. Se obtuvieron resultados similares para los polipéptidos vActRIIB maduros truncados sin la secuencia señal y los cuatro aminoácidos N-terminales, y con sustituciones idénticas como se muestra a continuación.

Tabla 3 La Tabla 4 identifica las secuencias correspondientes a SEQ ID NOS: 1-99 en el listado de secuencias.

Tabla 4 EJEMPLO 3: TRATAMIENTOS IN VIVO USANDO vActRIIB Todos los siguientes estudios con animales se llevaron a cabo utilizando el polipéptido vActRIIB-lgG2 Fe maduro truncado (E28W), (SEQ ID NO: 91), de acuerdo con los procedimientos que se describen a continuación.

TRATAMIENTO DE DEBILITAMIENTO MUSCULAR EN RATONES DEFICIENTES DE INHIBINA-ct La inhibina-a es un inhibidor natural de la activina A. Los ratones que carecen de la inhibina-a muestran niveles de activina A significativamente elevados en circulación y sufren de un síndrome de debilitamiento letal que se asocia con la formación espontánea de tumores tales como de ovario, cáncer de testículo y cánceres suprarrenales ((Matzuk et al., PNAS 91 (19):8817-21 (1994), Cipriano et al. Endocrinology 121 (7): 2319-27(2000), Matzuk et al., Nature 360(6402):313-9 (1992)). Para los siguientes experimentos, se obtuvieron ratones deficientes en inhibina-a (C57BL/6J) de Charles River Laboratories. Los efectos de la vActRIIB-Fc lgG2 E28W (SEQ ID NO: 91) (de aquí en adelante, E28W, o polipéptido E28W, o receptor soluble de E28W) sobre el peso corporal y la masa muscular se examinaron en ratones deficientes en inhibina-a. Se realizó un estudio de inyección única de 14 días en ratones macho deficientes en inhibina-a de 8 semanas. A las 8 semanas, los ratones macho deficientes en inhibina-a habían perdido más del 25% del peso corporal en comparación con los ratones control de carnada de tipo salvaje de la misma edad. A 5 de los ratones deficientes se les dio una sola inyección subcutánea de E28W (30 mg/kg), mientras que a 5 ratones deficientes se les administró por vía subcutánea un volumen igual de PBS (vehículo) en el día 0. Como control basal, a 5 ratones de tipo salvaje de la misma edad se les administró una sola inyección subcutánea de vehículo en el día 0. Los ratones se pesaron en el día 0, día 7 y día 14. Al final del día 14, todos los ratones se sacrificaron, y se analizaron los pesos del cadáver magro y la masa muscular de la pantorrilla por medio de la necropsia. Durante el período de estudio de 14 días, el peso corporal promedio de los ratones deficientes tratados con vehículo se redujo en aproximadamente 1 ,1 g desde 22,5 g en el día 0 hasta 21,4 g en el día 14. Por el contrario, el peso corporal promedio de los ratones deficientes tratados con E28W mostraron un aumentó muy importante de 11 g desde 22,1 g en el día 0 hasta 33,1 g en el día 14. El análisis de la necropsia terminal reveló que el polipéptido E28W prácticamente duplicó la masa del peso del cadáver magro y masa muscular de la pantorrilla en los ratones deficientes en inhibina-a, como se muestra a continuación . El peso promedio del cadáver magro de los ratones deficientes tratados con E28W fue de aproximadamente 14,9 g en comparación con aproximadamente 8,0 g para los ratones deficientes tratados con vehículo, y aproximadamente 12,1 g para los ratones de control de tipo salvaje tratados con vehículo. El peso promedio muscular de la pantorrilla (de ambas patas) de los ratones deficientes tratados con E28W fue de aproximadamente 426 mg en comparación con aproximadamente 209 mg para los ratones deficientes tratados con vehículo, y aproximadamente 324 mg para los ratones control de tipo salvaje tratados con vehículo. Estos resultados demuestran la efectividad del polipéptido E28W para el tratamiento de estados de enfermedad de pérdida de peso y debilitamiento muscular y se resumen en la Tabla siguiente.

*: P<0,05 versus WT + Veh; #: P<0,05 versus KO + Veh.

Se examinaron los efectos de la administración del polipéptido E28W sobre las tasas de formación de tumores testiculares y ováricos en ratones machos y hembras-KO inhibina-a, respectivamente. En este estudio, 11 de los ratones deficientes en inhibina-a, que incluyen machos de 8 semanas de edad (n = 5) y hembras de 9 semanas (n = 6), se trataron con una sola inyección subcutánea de E28W (30 mg/kg), mientras que otros 11 de los ratones deficientes en inhibina-a, que incluyen machos (n = 5) y hembras (n = 6) de la misma edad recibieron una única inyección de un volumen igual de PBS (vehículo). Además, a 11 de los ratones de control de carnada de tipo salvaje, que incluyen machos (n = 5) y hembras (n = 6) de la misma edad se les administró una sola inyección de vehículo. Dos semanas después del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y sometidos a necropsia para examinar las tasas de formación de tumores testiculares y ováricos ¡dentificables visualmente. Se observó que 10 de los 11 ratones deficientes tratados con vehículos desarrollaron tumores ¡dentificables. Específicamente, se hallaron formaciones tumorales testiculares y ováricas en 5 de los 5 machos y 5 de las 6 hembras examinadas, respectivamente. Se encontró que los tamaños de estos tumores son 2-3 veces más grande que el correspondiente testículo u ovario normal en los ratones control de tipo salvaje. Esto se muestra en la Figura 3. Sólo 10% (1 de 11) de los ratones deficientes en inhibina-a tratados con E28W mostró la formación de tumores visibles. Específicamente, en las hembras, 1 de cada 6 ratones deficientes tratados con E28W desarrolló un tumor de ovario identificable, mientras que 5 de las 6 hembras deficientes no tratadas tenían poco o ningún cambio en el tamaño o morfología macroscópica del ovario en comparación con los controles de tipo salvaje de la misma edad. 5 de 5 de los ratones macho deficientes tratados con E28W no mostraron tumores visibles con poco o ningún cambio en el tamaño o morfología macroscópica de los testículos en comparación con los controles de tipo salvaje de la misma edad. Estos resultados demuestran que la administración E28W fue efectiva en la reducción de la formación de tumores testiculares y ováricos en los ratones KO inhibina-a y también en la reducción de la formación de los melanomas, lo que sugiere una utilidad clínica para la terapia del receptor soluble en el tratamiento del cáncer.

La efectividad del polipéptido E28W en el tratamiento de la anorexia se examinó en ratones macho deficientes en inhibina-a. En este estudio, el consumo de alimentos en ratones deficientes en inhibina-a (n = 5) se redujo significativamente en comparación con la de los ratones de tipo salvaje de la misma edad (n = 10). Se observó que la ingesta de alimentos de los ratones deficientes en inhibina-a tratados con E28W se incrementó significativamente durante un período de 3 semanas examinado. La ingesta de alimentos semanales promedio en los ratones deficientes en inhibina-a tratados con E28W aumentó a un nivel ligeramente más alto que en los ratones de control de tipo salvaje de la misma edad, y fue aproximadamente 50% mayor que la ingesta de alimentos semanal promedio de los ratones deficientes tratados con el vehículo. Por lo tanto, los datos muestran que el tratamiento E28W fue muy efectivo en la mejora de la anorexia en los ratones KO inhibina a.

El efecto del tratamiento con E28W sobre la supervivencia se examinó en ratones machos y hembras KO ¡nhibina-a, respectivamente. Para los machos, a 25 ratones KO inhibina-a de alrededor de 50 días se les administró el polipéptido E28W (10 mg/kg/semana, SC), mientras que 26 ratones 26 KO inhibina-a de la misma recibieron vehículo (PBS). 19 ratones macho de tipo salvaje de la misma edad recibieron vehículo y se utilizaron como control basal. Los ratones deficientes tratados con vehículo comenzaron a morir en el día 15 del estudio (alrededor de 65 días de edad). En el día 34 del experimento (alrededor de 84 días de edad), el 50% de los ratones deficientes tratados con vehículo había muerto, y al día 78 (de alrededor de 128 días de edad), el 100% de ellos había muerto. En contraste, ninguno de los 25 ratones deficientes tratados con el polipéptido E28W, o de los 19 ratones de control de tipo salvaje tratados con vehículo, murió antes de día 78 del estudio (alrededor de 128 días de edad). En los ratones deficientes tratados con E28W, 1 de cada 25 murió el día 78 del estudio (alrededor de 128 días de edad) y 24 de los 25 sobrevivieron más allá de los 100 días (alrededor de 150 días de edad). Ningún ratón de tipo salvaje tratado con vehículo murió durante el período de estudio de 100 días. Se obtuvieron resultados de supervivencia similares en ratones KO inhibina-a hembras. 22 de ratones KO inhibina-a hembra de aproximadamente 50 días se trataron con E28W (10 mg/kg/semana, SC), mientras que 23 ratones KO inhibina-a hembra de la misma edad se trataron con PBS (vehículo). Mientras que, 17 de los ratones hembra control de tipo salvaje se trataron con vehículo. Los ratones hembra tratados con vehículo empezaron a morir el día 40 del estudio (alrededor de 90 días). En el día 58 del experimento (alrededor de 108 días de edad), el 50% de los ratones hembra tratados con vehículo había muerto, y en el día 86 del estudio (aproximadamente 136 días de edad) el 100% de ellos había muerto. En contraste, solo aproximadamente 5% (1 de cada 22) de los ratones hembra deficientes tratados con E28W había muerto mientras que deficientes el 90% (20 de 22) sobrevivió más allá del día 120 del estudio (aproximadamente 170 días de edad). Ninguno de los ratones de tipo salvaje tratados con vehículo murieron durante el período de estudio de 120 días. Por lo tanto, los datos demuestran que la terapia con el polipéptido E28W es efectiva para prolongar drásticamente la supervivencia de los ratones deficientes en inhibina-a machos y hembras. Un gráfico esquemático de las curvas de supervivencia para los ratones deficientes macho y hembra se proporciona en la Figura 4A-B.

TRATAMIENTO DEL DEBILITAMIENTO MUSCULAR EN RATONES PORTADORES DE TUMOR DE COLON-26 Los ratones portadores de tumor de colon-26 son un modelo animal preclínico ampliamente utilizado para el estudio de la caquexia del cáncer (Fujita et al., Int J Cáncer 68(5):637-43 (1996), Kwak et al., Cáncer Research 64(22):8193-8 (2004)). El efecto del polipéptido E28W sobre el cambio de peso corporal, masa muscular y tasa de supervivencia se estudió en los ratones portadores de tumores. Células tumorales de colon-26 (C-26) se implantaron por vía subcutánea en 40 ratones CDF1 machos de 10 semanas a razón de 0,5 x 106 células por ratón. La implantación del tumor se realizó en el día 0. A partir del día 5 después de la implantación del tumor, veinte ratones C-26 se trataron semanalmente con una inyección subcutánea de 10 mg/kg de vActRIIB Fe lgG2 E28W (SEQ ID NO: 91), mientras que veinte ratones C-26 se trataron con un vehículo (PBS). Al mismo tiempo, 10 ratones normales de peso y edad igual se trataron solo con vehículo (PBS). El peso corporal y la ingesta de alimentos se determinaron 3 veces por semana. Los ratones portadores de tumores se inspeccionaron dos veces al día para la supervivencia. Se midieron los tamaños de los tumores utilizando calibres (calibre electrónico Ultra-Cal IV IP65, Fred V Fowler Co. Boston MA) conectados a una computadora PC y valores se registraron de forma automática en una hoja de cálculo en un archivo de datos de Microsoft Excel. Como se muestra en la Figura 5, dos semanas después de la implantación del tumor, los ratones portadores de tumores C-26 desarrollaron caquexia severa y perdieron su peso corporal drásticamente. El tratamiento con E28W redujo eficazmente la pérdida de peso corporal en los ratones portadores de tumores. El peso corporal promedio de los ratones portadores de tumor tratados con E28W fue significativamente mayor que la de los ratones portadores de tumor tratados con vehículo (p <0,001 , desde el día 7 al día 33 después de la inoculación del tumor-. Prueba t no apareada, software Graph Pad Inc. de San Diego, CA).

No hubo diferencia en el tamaño del tumor entre los grupos tratados con el polipéptido E28W y tratados con el vehículo que indican que el tratamiento no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor C-26. El análisis de la necropsia de terminal mostró que el peso promedio de la masa magra del cádaver y músculo de la pantorrilla de los ratones portadores de tumor C-26 tratados con E28W fueron significativamente más altos que los de los ratones portadores de tumor tratados con vehículo (p <0,001 tanto para el cadáver magro y el músculo de la pantorrilla). El efecto de E28W sobre la supervivencia de los los ratones portadores de tumor C-26 se muestra en la Figura 6. Los ratones tratados con vehículo comenzaron a morir en aproximadamente 14 días después de la implantación del tumor. En el día 35 después de la implantación del tumor, los 20 ratones portadores de tumor C-26 tratados con el vehículo murieron; sin embargo 17 de los 20 ratones portadores de tumores C-26 tratados con E28W aún sobrevivían. Por lo tanto, el tratamiento con E28W llevó a una prolongación significativa de la supervivencia de los ratones portadores de tumor C-26 (p <0,0001 , prueba de chi-cuadrado). Por lo tanto, el polipéptido E28W no solo fue efectivo en el mantenimiento del peso corporal y la masa muscular, sino también en la prolongación de la supervivencia de los ratones portadores de tumores C-26.

TRATAMIENTO DE LOS RATONES CON SUSPENSIÓN DEL MIEMBRO POSTERIOR El modelo de ratón de suspensión del miembro posterior se utilizó para examinar el efecto de la vActRIIB-Fc lgG2 E28W (SEQ ID N °: 91) sobre la masa muscular en estado de desuso. El procedimiento de suspensión posterior es esencialmente el mismo que se informó anteriormente por Carlson CJ et al (Carlson CJ, Booth FW y Gordon SE: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 277:. R601-RR606, 1999). Se usaron ratones hembra C57BL/6 de 9 semanas para el estudio. Un total de 60 ratones se dividieron en tres grupos de la siguiente manera: 1. Grupo control basal no suspendido (20 ratones) tratados con vehículo (PBS), 2. Grupo de suspensión posterior (20 ratones) tratados con vehículo, y 3. Grupo de ratones con suspensión posterior (20 ratones) tratado con vActRIIB-Fc lgG2, E28W. Específicamente, se administró una única inyección SC de 30 mg/kg de vActRIIB-lgG Fe 2 E28W o vehículo a los grupos descriptos anteriormente, respectivamente, en el momento de la iniciación de la suspensión posterior. Se midieron los cambios de peso corporal longitudinalmente 2-3 veces por semana. 5 ratones de cada grupo fueron sacrificados en los siguientes 4 puntos de tiempo diferentes: día 1 , día 3, día 7 y el día 14. Se determinaron los pesos del músculo de la pantorrilla por medio de una necropsia.

Como se muestra en la siguiente Tabla, la suspensión posterior condujo a una pérdida significativa en el peso corporal de hasta 10%. El tratamiento de los ratones suspendidos del miembro posterior con vActRIIB-Fc lgG2 E28W llevó a un aumento del peso corporal significativo a un nivel más alto que sea el grupo de suspensión posterior tratado con el vehículo o el grupo de control basal suspendido como se analiza mediante la medición de ANOVA. Durante el período de estudio de dos semanas, el aumento de peso corporal promedio del grupo de tratamiento con de la vActRIIB-Fc lgG2 E28W (SEQ ID NO: 91) fue del 12,6% en comparación con el descenso del 0,2% en el grupo de suspensión tratado con vehículo y un aumento de peso de 4,8% en el grupo de control basal no suspendido, respectivamente. Los resultados de la necropsia de curso temporal mostraron que la masa muscular del miembro inferior cambió en paralelo con los pesos corporales. El tratamiento de los ratones en suspensión con vActRIIB-Fc lgG2 (E28W) redujo por completo la pérdida de masa muscular. Por lo tanto, los resultados de este experimento muestran que E28W es efectivo en el tratamiento de la atrofia muscular asociada con el desuso.

TRATAMIENTO DE RATONES OVX Los ratones C57BL6 hembra ovariectomizadas (OVX) se consideran como un modelo para el hipogonadismo femenino y osteoporosis. 24 ratones hembra C57BI6 fueron ovariectomizadas a la edad de 3 meses y se dejaron recuperar durante 3 meses. A la edad de 6 meses, a 24 ratones OVX, así como 24 ratones C57BI6 control con operación simulada de igual edad se midieron cambios longitudinales en el peso corporal, músculo, y la masa grasa por RMN y masa ósea (PIXImus-GE Lunar Corporation) durante un período de tratamiento de 3 meses. Al final del período, los animales se sacrificaron, y se recolectaron los tejidos óseos durante la necropsia terminal y se sometieron al análisis Faxitron de rayos X y microCT (Faxitron X-ray Corporation y GE Medical system) análisis. Se demostró que la variante del receptor E28W (SEQ ID NO: 91) fue efectiva para aumentar el peso corporal, específicamente la masa muscular esquelética magra, y la masa ósea, mientras que disminuye el contenido de grasa de los ratones al nivel observado en los ratones no ovariectomizadas. Específicamente, durante un período de 12 semanas, la masa muscular magra se incrementó desde 20 g hasta 27,0 g para los ratones OVX tratados con E28W, en comparación con 20 g hasta 27,5 g para los ratones con operación simulada tratados con E28W, en comparación con casi ningún aumento de la masa muscular magra para OVX más vehículo u operación simulada más vehículos (aproximadamente 19 gramos para OVX más vehículo y aproximadamente 20 g para el tipo salvaje más vehículo). En el mismo estudio, los ratones OVX tratados con E28W demostraron una reducción de la masa grasa de 8 g promedio por animal a aproximadamente 4 g de promedio por animal, comparables con los animales con operación simulada, al final del estudio de 12 semanas. Los ratones OVX tratados con el vehículo, en contraste, no perdieron masa grasa en ningún momento durante el estudio. Finalmente, la masa ósea se incrementó en los ratones OVX tratados con E28W en comparación con los ratones OVX tratados con vehículo. El análisis de BMC de fémur/tibia (contenido mineral óseo) del hueso diseccionado recogido durante la necropsia terminal se determinó por análisis de pQCT (tomografía computada cuantitativa periférica). Los ratones OVX tratados con E28W aumentaron el BMC de aproximadamente 0,045 g/cm a aproximadamente 0,055 g/cm al final del estudio de 12 semanas, que es comparable a la del BMC final con animales con operación simulada tratados con vehículo. Los ratones OVX tratados con vehículo mostraron aproximadamente el mismo BMC de 0,045 g/cm al final del estudio de 12 semanas. Los ratones de tipo salvaje tratados con E28W mostraron un aumento del BMC de aproximadamente 0,054 g/cm a aproximadamente 0,065 g/cm al final del estudio de 12 semanas. Estos estudios demuestran la efectividad del polipéptido E28W como tratamientos potenciales de la fragilidad, osteoporosis, y obesidad en el envejecimiento.

EJEMPLO 4: TRATAMIENTO DEL CÁNCER SACTRIIB (E28W - SEQ ID NO. 91) Se investigaron los niveles de activina en ratones con cáncer de ovario (CO) (Figura 7A-D). Los niveles circulantes de activina A fueron significativamente elevados en los ratones con cáncer de ovario (CO) en comparación con sujetos normales de control (normales). La activina A en suero se midió por ELISA.

El efecto del tratamiento del cáncer de ovario con sActRIIB (E28W) (SEQ ID NO:. 91) se muestra en las figuras 7B-7D. Ratones hembras KO de 12 semanas con tumores ováricos establecidos se trataron durante 14 días con una sola inyección de sActRIIB o PBS. Los controles, compañeros de camada WT hembras de la misma edad recibieron PBS. Se puede observar en la Figura 7B que los niveles circulantes elevados de activina A en los ratones KO se redujeron rápidamente al nivel WT control mediante el tratamiento con sActRIIB. La activina A en suero se midió por ELISA en el día 0, 1 y 14 después del tratamiento.

En la figura 7C se puede observar que el tratamiento sActRIIB redujo rápidamente la masa del tumor de ovario en los ratones KO en el nivel WT control. Los pesos de los ovarios (izquierdo y derecho) de los animales individuales se analizaron por cohortes mediante necropsia en el día 0, 1 y 14 después del tratamiento. Las imágenes representativas de la morfología macroscópica de los ovarios ¡lustran la regresión drástica de los tumores de ovario avanzado en ratones KO en respuesta a 14 días de tratamiento con sActRIIB. (Figura 7D) Se realizaron varias observaciones adicionales en ratones KO tratados con sActRIIB (datos no presentados). La sobreexpresión de ARNm de activina A se observó en los tumores ováricos de ratones KO. La sobreexpresión fue impedido por el tratamiento sActRIIB. Además, el tratamiento sActRIIB bloqueó completamente el aumento de fosfo-Smad2 en los tumores de ovario en ratones KO. Además, la grave pérdida de E-cadherina en los tumores de ovario de ratones KO fue revertida por tratamiento con sActRIIB. Finalmente, las imágenes representativas de inmunohistoquímica mostraron la completa desaparición de ¡nmunorreactividad de la la E-cadherina proveniente de las secciones ováricas de ratones KO y la reaparición de una fuerte tinción de cadherina E después de un tratamiento de 14 días con sActRIIB.

La Figura 8A muestra que el bloqueo de la activina A puede anular la sobreexpresión de VEGF en tumores de ovario en ratones KO-inhibina a. Ratones hembras KO ratones de 2-semanas de edad con tumores ováricos establecidos se trataron durante 14 días con una sola inyección de sActRIIB o PBS. Como controles, compañeros de carnada hembra WT de la misma edad recibieron PBS. Los datos de ELISA revelan que los niveles de VEGF en suero están marcadamente elevados en los ratones KO, pero se reducen a los niveles de control WT después del tratamiento con sActRIIB Además, en los datos que no se muestran, se observó que las imágenes de tinción inmunohistoquímica demostraron el aumento drástico de las inmunorreactividades de VEGF y Ang-1 en las secciones de tumor de ovario en ratones KO, que fueron totalmente anuladas por el tratamiento con sActRIIB. El análisis de transferencia Western también reveló que las expresiones de las proteínas relacionadas con la angiogénesis del tumor endoglina, Osteropontina, IGFBP-1 e IGFBP-2 estaban altamente inducidas en los tumores de ovario en ratones KO, pero se redujeron a los niveles de control WT después del tratamiento con ActRIIB.

El análisis inmunohistoquímico muestra que el tratamiento con sActRIIB conduce a la activación de la caspasa-3 en los tumores testiculares en los ratones KO. En la Figura 8B las flechas apuntan a la ¡nmunorreactividad de la caspasa-3 activa en la sección de tumor de ovario tratada con sActRIIB donde se agrupan las células tumorales residuales. Hubo una ausencia de inmunotinción de caspasa-3 activa en la sección de tumor de ovario tratado con PBS. El histograma de la derecha muestra el análisis cuantitativo de la caspasa-3 activa basada en múltiples secciones de ovario de 3 animales en cada grupo.

En otro experimento, se demostró que el antagonismo de la activina A suprimió la sobreexpresión de angiopoyetina-1 e impidió la neovascularización en el microambiente del tumor en los xenoinjertos de cáncer de ovario humano TOV-21G. La implantación de los xenoinjertos de cáncer de ovario TOV-21G produjo activina A elevada en circulación en los ratones desnudos CD1. La activina A se midió por ELISA. La administración del antagonista de activina A, sActRIIB, suprimió el crecimiento del tumor TOV-21G en ratones desnudos CD1. Los ratones portadores de xenoinjertos TOV-21G se trataron con sActRIIB o con PBS en el día después de la implantación del tumor.

El bloqueo de la activina A no tuvo efecto directo sobre la proliferación in vitro de las células TOV-21G en los cultivos celulares. El crecimiento de las células TOV 21 G fue monitoreado "por micro-imágenes in vitro en tiempo real" utilizando el sistema IncuCyte. Los inhibidores de la activina A se añadieron en el momento de la siembra de células. Se usó estaurosporina, como un control positivo para la inhibición del crecimiento celular, para demostrar la confiabilidad del sistema de monitoreo.

El bloqueo de activina A suprimió la sobreexpresión de Ang-1 e inhibió la neovascularización tumoral en los xenoinjertos de tumores ováricos TOV-21G.

Los ratones desnudos portadores de xenoinjertos TOV-21G se trataron con sActRIIB o PBS en el día 12 después de la implantación del tumor. Los tumores TOV-21G se aislaron en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento y después se sometieron a la tinción inmunohistoquímica para Ang-1 y CD31 como marcador de la neovasculatura. Los núcleos celulares se tiñeron con coloración de contraste.

La activación de la caspasa-3 y la apoptosis de las células del cáncer en los tumores de xenoinjertos TOV-2 G también siguieron el bloqueo de activina A. Las secciones tumorales TOV-21G se examinaron en forma inmunohistoquímica para determinar la activación de la caspasa-3 utilizando anticuerpo específico de caspasa-3 activa y para la apoptosis de las células utilizando la tinción de TUNEL. sActRIIB indujo la caspasa-3 activa y la apoptosis celular.

Los experimentos demuestran que la activina A es capaz de estimular la sobreexpresión del factor de angiogénesis (por ejemplo, VEGF-A y Ang-1) por múltiples tipos de células (es decir, células cancerosas, endoteliales, fibroblastos y monocíticas), mientras que el bloqueo de la activina A elevada en los tumores impidió la sobreexpresión de los factores angiogénicos y, como consecuencia de la caspasa-3 activada y la apoptosis celular, lo que lleva a la supresión del tumor. EJEMPLO 5: MORFOLOGÍA OVÁRICA Y TESTICULAR Se llevó a cabo una examinación histológica de tumores de ovario y testículos en ratones KO de inhibina-a machos de 10 semanas de edad y hembras de 14 semanas de edad que se trataron durante dos semanas con PBS o sActRIIB junto con controles de tipo salvaje de igual edad. Ratones KO de inhibina-a machos de 8 semanas de edad y hembras de 12 semanas de edad recibieron una única inyección de sActRIIB o PBS. 14 días después del tratamiento, se recolectaron por necropsia órganos ováricos y testiculares. Se sometieron secciones tisulares a una tinción de Schiff con ácido periódico para ovarios y tinción tricromo de Masson para testículos.

En los ratones KO hembras no tratados, los ovarios muy agrandados se llenaron predominantemente con masa cancerosa sólida y se dejaron grandes hemorragias con folículos poco reconocibles. Sin embargo, después del tratamiento de sActRIIB, los ovarios tenían un tamaño normal y su morfología parecía relativamente normal con muchos folículos reconocibles, invasión mínima de cáncer y pocas hemorragias. Este análisis microscópico así corrobora nuestros hallazgos acerca del peso tumoral y macromorfología y confirmó que el tratamiento de sActRIIB provocó una regresión dramática del cáncer en los testículos y los ovarios en los animales KO. En los ratones KO machos no tratados, las estructuras testiculares normales ya no se podían reconocer por microscopía óptica, porque los túbulos seminíferos se habían reemplazado mayormente por una masa cancerosa no diferenciada maciza. Sin embargo, después del tratamiento de sActRIIB, las estructuras testiculares parecían relativamente normales con la mayor parte de los túbulos seminíferos ampliamente intactos, a pesar de que unas pocas áreas pequeñas aún contenían células cancerosas residuales y la cantidad de células de espermatogonia en algunos túbulos era reducida.

También se observó que el tratamiento de sActRIIB redujo rápidamente la masa tumoral testicular en los ratones KO al nivel de control del tipo salvaje. Los pesos de los testículos (izquierdo y derecho) de animales individuales se analizaron por cohortes por medio de necropsia inmediatamente antes y 14 días después del tratamiento. Para el experimento P<0,001 vs. control de tipo salvaje, n = 6-12.

Además, se observó que sActRIIB anuló la sobreexpresión de VEGF y Ang-1 e indujo la activación de caspasa-3 en tumores testiculares en ratones KO de inhibina-a. Los transcriptos de angiopoyetina-2 se redujeron hacia los niveles de control después del tratamiento de sActRIIB tanto en tumores ováricos como testiculares.

EJEMPLO 6: EFECTO DE LA COMBINACIÓN DE sActRIIB Y UN QUIMIOTERAPÉUTICO El efecto del antagonista de activina sActRIIB y agente quimioterapéutico citotóxico 5-Fluorouracilo sobre la inhibición del crecimiento del tumor TOV-21G en ratones desnudos (Figura 9A). Se trataron ratones desnudos portadores de xenoinjertos TOV-21G en el día 12 después de la implantación del tumor con sActRIIB, 5-Fu o una combinación de sActRIIB y 5-Fu, respectivamente. Se registraron los cambios de los volúmenes tumorales de forma longitudinal. Se puede observar en la Figura 9A que sActRIIB por sí mismo reduce el volumen tumoral en un 34% y 5-fluorouracil (5-FU) por sí mismo reduce el volumen tumoral en un 49%. La combinación de los dos, sin embargo, reducen el volumen tumoral en un 74%.

La Figura 9B muestra los efectos de sActRIIB y dacarbazina sobre la inhibición de crecimiento del xenoinjerto de melanoma humano G361 en ratones desnudos. Se trataron ratones desnudos BALB/c con sActRIIB, dacarbazina o sActRIIB más dacarbazina. Para el estudio de combinación de dacarbazina, se implantaron ratones desnudos BALB/c con xenoinjerto G361 (5x106 células/ratón) con sActRIIB solamente (10 mg/kg, SC, 1X/wk), dacarbazina solamente (4 días consecutivos de inyección IP diaria a 5 mg/kg) o combinación de sActRIIB y 5-FU comenzando el día 18 posterior a la implantación del tumor. Los volúmenes tumorales se midieron longitudinalmente por medio de un calibre electrónico hasta el día 26 después de la implantación.

Dado que el agente quimioterapéutico y sActRIIB actúen presumiblemente por medio de diferentes mecanismos, no sería necesario esperar que los resultados demostrados, es decir, ambos agentes en combinación, afectarían el crecimiento general del tumor más que cualquier agente de forma individual.

El cáncer de ovario es el más letal de todos los cánceres ginecológicos. La activina A, una citoquina gonadal que tiene importantes funciones en la regulación del ciclo menstrual, se expresa fuertemente en muchas malignidades incluyen cáncer de ovario. La activina A neutralizante erradica los tumores de ovario establecidos en ratones deficientes de inhibina e impide marcadamente el crecimiento de múltiples tumores de xenoinjerto segregantes de activina A en ratones desnudos. El bloqueo de la activina A parece no tener un efecto directo sobre la proliferación in vitro de células de cáncer de ovario en cultivos celulares pero, in vivo, anula por completo la sobreexpresión de factores angiogénicos (es decir, VEGF y angiopoyetinas) e inhibe la neovascularización en el microambiente tumoral. Así, induce la activación de la caspasa-3 y la apoptosis de células cancerosas en tumores ováricos. Este profundo efecto ¡n vivo se puede explicar, al menos en parte, por medio de la capacidad que tiene la activina A derivada de tumor de disparar la sobreproducción de factores angiogénicos en las células endoteliales del huésped que residen en el microambiente tumoral. Además de los tumores ováricos, también se halló que el bloqueo de la activina inhibe el crecimiento in vivo de al menos dos otros tipos de cáncer (tumores testiculares y melanoma) que segregan activina A. Es importante que se hallara que el efecto inhibidor de tumores del antagonismo de activina fuera al menos aditivo al que la quimioterapia con 5-fluorouracil o dacarbazina. Estos hallazgos demuestran una función de la activina A como un mediador crítico de la angiogénesis tumoral y la tumorigénesis. El bloqueo de la elevada activina A con sActRIIB, por ende, parece ser un promisorio enfoque para combatir cáncer de ovario, cáncer testicular, melanoma y posiblemente otras malignidades.

La presente invención no está limitada en su alcance por las formas de realización específicas descritas en la presente que se pretenden como simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención y métodos funcionalmente equivalentes y componentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán obvias para los expertos en el arte de la descripción previa y los dibujos anexos. Estas modificaciones pretenden entrar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende i) una proteína aislada que comprende un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB) en donde vActRIIB comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 25 a 134 de la SEQ ID NO: 18, en donde el polipéptido comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 28 y en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11 y ii) un agente quimioterapéutico.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB se selecciona del grupo que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y por E.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la sustitución en la posición 28 del polipéptido vActRIIB es W.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el agente quimioterapéutico es un análogo de nucleósido, 5-fluorouracilo y/o dacarbazina.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la secuencia de polipéptidos tiene al menos el 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 25 a 134 de SEQ ID NO: 18, en donde vActRIIB comprende una sustitución de aminoácido W en la posición 28, en donde la proteína aislada también comprende un dominio Fe ligado a vActRIIB por medio de un ligador, en donde la secuencia del dominio Fe es muestra en la SEQ ID NO:80 y en donde la secuencia del ligador se muestra en la SEQ ID NO:79.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde vActRIIB comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 25 a 134 de la SEQ ID NO: 18.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde vActRIIB comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 98% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 25 a 134 de la SEQ ID NO: 18.

9. Un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto que necesita de dicho tratamiento que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de acuerdo con la reivindicación 1 al sujeto, en donde la sustitución en la posición 28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer es un cáncer de tumor sólido, cáncer ovárico o cáncer testicular.

11. Un método de reducción del tamaño de una masa tumoral en un sujeto que necesita de dicho tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de la composición de acuerdo con la reivindicación 1 al sujeto, en donde la sustitución en la posición 28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde la masa tumoral resulta de un tumor sólido, cáncer testicular o cáncer ovárico.

13. Un método de reducción del tamaño de una masa tumoral en un sujeto que necesita de tal tratamiento que comprende la administración al sujeto: una cantidad efectiva de una proteína aislada que comprende un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB), en donde vActRIIB comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 25 a 134 de SEQ ID NO: 18, en donde el polipéptido comprende una sustitución de aminoácido en la posición 28, en donde la sustitución en la posición 28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E y en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11 ; y un agente quimioterapéutico.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la masa tumoral es una masa de tumor ovárico o una masa de tumor sólido.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la proteína aislada y el agente quimioterapéutico se administran al mismo tiempo.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la proteína aislada y el agente quimioterapéutico se administran cada uno en diferentes momentos.

17. Un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto que necesita de tal tratamiento que comprende la administración al sujeto: de una cantidad efectiva de una proteína aislada que comprende un polipéptido de receptor IIB de activina variante (vActRIIB), en donde vActRIIB comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 25 a 134 de SEQ ID NO: 18, en donde el polipéptido comprende una sustitución de aminoácido en la posición 28, en donde la sustitución en la posición 28 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en A, W e Y por E y en donde el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GDF-11 ; y un agente quimioterapéutico.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el cáncer es cáncer ovárico o un cáncer de tumor sólido.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la proteína aislada y el agente quimioterapéutico son cada uno administrados en diferentes momentos.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la proteína aislada y el agente quimioterapéutico se administran en el mismo momento.