CN110461349A - 激活素受体iia型变体及其使用方法 - Google Patents

激活素受体iia型变体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110461349A
CN110461349A CN201780082824.XA CN201780082824A CN110461349A CN 110461349 A CN110461349 A CN 110461349A CN 201780082824 A CN201780082824 A CN 201780082824A CN 110461349 A CN110461349 A CN 110461349A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
seq
bone
subject
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780082824.XA
Other languages
English (en)
Inventor
J.S.西拉
J.拉基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Corus Therapy
Original Assignee
Corus Therapy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Corus Therapy filed Critical Corus Therapy
Publication of CN110461349A publication Critical patent/CN110461349A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/1103—Receptor protein serine/threonine kinase (2.7.11.30)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Abstract

本发明的特征在于包含细胞外ActRIIa变体的多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽包含与Fc结构域单体或部分融合的细胞外ActRIIa变体。本发明的特征还在于使用所述多肽来治疗涉及骨损伤的疾病和病况、例如原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的药物组合物和方法。

Description

激活素受体IIA型变体及其使用方法
发明背景
健康骨骼经历涉及骨骼破坏和骨骼生长的不断重塑。骨生长由成骨细胞类型介导，而破骨细胞吸收骨。当这些系统通过合成代谢程序的下调、分解代谢系统的上调或两者的组合失去平衡时，发生病理学，导致净骨损失。因此，控制骨重塑中的平衡可用于促进骨折愈合和对骨骼的其他损伤，以及治疗与骨量损失和骨矿质化相关的病症、诸如骨质疏松症。
骨损伤可以由一系列根本原因(包括年龄或癌症相关的骨损失、遗传状况、药物治疗的不良副作用或骨折)引起。世界卫生组织估计，骨质疏松症仅在美国、欧洲和日本就影响7500万人，并且是骨折的重要危险因素。通常，整个骨损失代表有效治疗很少的病理状态。相反，治疗聚焦于固定、运动和饮食调整，而不是直接促进骨骼生长和增加骨密度的药剂。关于骨质疏松症，雌激素、降钙素、骨钙素与维生素K或高剂量的膳食钙都用作治疗干预。骨质疏松症的其他治疗方法包括双膦酸盐、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)拟钙剂、他汀类、合成代谢类固醇、镧和锶盐以及氟化钠。然而，此类治疗剂经常与不希望的副作用相关。对于导致骨损伤或骨脱矿质作用的疾病，需要新型且有效的治疗方法。
发明概述
本发明的特征在于包含细胞外激活素受体IIa型(ActRIIa)变体的多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽包含与Fc结构域单体或部分的N-或C-末端融合的细胞外ActRIIa变体。此类部分可以通过氨基酸或其他共价键连接。包括与Fc结构域单体融合的细胞外ActRIIa变体的多肽也可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)。本发明的多肽可用于增加受试者中的骨量或骨矿物质密度，所述受试者具有涉及骨损伤的疾病或病况，例如原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动。进一步，本发明的多肽还可用于影响受试者中的肌肉生长抑制素、激活素和/或骨形态发生蛋白9(BMP9)信号传导，所述受试者具有发展涉及骨损伤或骨脱矿质作用的疾病或病况的风险或具有涉及骨损伤或骨脱矿质作用的疾病或病况。
在一个方面，本发明的特征在于包含细胞外激活素受体IIa型(ActRIIa)变体的多肽，所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLX1X2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9X10X11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX17X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ IDNO:1)，其中X1是F或Y；X2是F或Y；X3是E或A；X4是K或L；X5是D或E；X6是R或A；X7是P或R；X8是Y或E；X9是D或E；X10是K或Q；X11是D或A；X12是K或A；X13是R或A；X14是R或L；X15是F或Y；X16是K、R或A；X17是K、A、Y、F或I；X18是Q或K；X19是W或A；X20是L或A；X21是D、K、R、A、F、G、M、N或I；X22是I、F或A；X23是K或T；X24是K或E；X25是D或E；X26是S或N；且X27是E或Q，且其中所述变体相对于具有SEQ ID NO:73的序列的野生型细胞外ActRIIa或具有SEQ ID NO:76-96的序列中的任一个的细胞外ActRIIa具有至少一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9KX11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX1 7X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ IDNO:2)，其中X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26和X27如上所定义。
在一些实施方案中，所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4X5RTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO:3)，其中X2、X4、X5、X7、X8、X9、X14、X15、X16、X18、X22、X23、X24、X25、X26和X27如上所定义。
在一些实施方案中，所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO:4)，其中X2、X4、X7、X8、X9、X14、X15、X16、X18、X22、X23、X25、X26和X27如上所定义。
在一些实施方案中，所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEPCX8GX9KDKRX14HCFATWKNISGSIEIVKX18GCWLDDINCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO:5)，其中X2、X4、X8、X9、X14、X18、X23、X25、X26和X27如上所定义。
在任何前述实施方案中，X1是F或Y。在任何前述实施方案中，X2是F或Y。在任何前述实施方案中，X3是E或A。在任何前述实施方案中，X4是K或L。在任何前述实施方案中，X5是D或E。在任何前述实施方案中，X6是R或A。在任何前述实施方案中，X7是P或R。在任何前述实施方案中，X8是Y或E。在任何前述实施方案中，X9是D或E。在任何前述实施方案中，X10是K或Q。在任何前述实施方案中，X11是D或A。在任何前述实施方案中，X12是K或A。在任何前述实施方案中，X13是R或A。在任何前述实施方案中，X14是R或L。在任何前述实施方案中，X15是F或Y。在任何前述实施方案中，X16是K、R或A。在任何前述实施方案中，X17是K、 A、Y、F或I。在任何前述实施方案中，X18是Q或K。在任何前述实施方案中，X19是W或A。在任何前述实施方案中，X20是L或A。在任何前述实施方案中，X21是D、K、R、A、F、G、M、N或I。在任何前述实施方案中，X22是I、F或A。在任何前述实施方案中，X23是K或T。在任何前述实施方案中，X24是K或E。在任何前述实施方案中，X25是D或E。在任何前述实施方案中，X26是S或N。在任何前述实施方案中，X27是E或Q。在任何前述实施方案中，X23是T，X24是E，X25是E，且X26是N，或者X23是T，X24是K，X25是E，且X26是N。在任何前述实施方案中，X17是K。
在任何前述实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:6-72中的任一个的序列。
在任何前述实施方案中，位置X24处的氨基酸可以用氨基酸K替代。
在任何前述实施方案中，位置X24处的氨基酸可以用氨基酸E替代。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽可以进一步包含一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、更多个氨基酸)的C-末端延伸。在一些实施方案中，所述C-末端延伸是氨基酸序列NP。在一些实施方案中，所述C-末端延伸是氨基酸序列NPVTPK (SEQ ID NO:155)。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽可以进一步包含与多肽的C-末端融合或共价连接的部分。所述部分可以增加多肽的稳定性或改善多肽的药代动力学特性。在一些实施方案中，所述部分是Fc结构域单体、Fc结构域、白蛋白结合肽、纤连蛋白结构域或血清白蛋白。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽可以进一步包含通过接头的方式与多肽的C-末端融合的Fc结构域单体。在一些实施方案中，包含与Fc结构域单体融合的本文所述的细胞外ActRIIa变体的多肽可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)。在一些实施方案中，所述Fc结构域单体具有SEQ ID NO:97的序列。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽可以进一步包含通过接头的方式与多肽的C-末端融合的Fc结构域。在一些实施方案中，所述Fc结构域是野生型Fc结构域。在一些实施方案中，所述野生型Fc结构域具有SEQ ID NO:151的序列。在一些实施方案中，所述Fc结构域含有一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，含有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域不形成二聚体。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽可以进一步包含通过接头的方式与多肽的C-末端融合的白蛋白结合肽。在一些实施方案中，所述白蛋白结合肽具有SEQ ID NO:152的序列。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽可以进一步包含通过接头的方式与多肽的C-末端融合的纤连蛋白结构域。在一些实施方案中，纤连蛋白结构域肽具有SEQ ID NO:153的序列。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽可以进一步包含通过接头的方式与多肽的C-末端融合的人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述人血清白蛋白具有SEQ ID NO:154的序列。
在一些实施方案中，所述接头是氨基酸间隔区。在一些实施方案中，所述氨基酸间隔区是GGG、GGGA (SEQ ID NO:98)、GGGG (SEQ ID NO:100)、GGGAG (SEQ ID NO:130)、GGGAGG (SEQ ID NO:131)或GGGAGGG (SEQ ID NO:132)。
在一些实施方案中，所述氨基酸间隔区是GGGS (SEQ ID NO:99)、GGGGA (SEQ IDNO:101)、GGGGS (SEQ ID NO:102)、GGGGG (SEQ ID NO:103)、GGAG (SEQ ID NO:104)、GGSG(SEQ ID NO:105)、AGGG (SEQ ID NO:106)、SGGG (SEQ ID NO:107)、GAGA (SEQ ID NO:108)、GSGS (SEQ ID NO:109)、GAGAGA (SEQ ID NO:110)、GSGSGS (SEQ ID NO:111)、GAGAGAGA (SEQ ID NO:112)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:113)、GAGAGAGAGA (SEQ ID NO:114)、GSGSGSGSGS (SEQ ID NO:115)、GAGAGAGAGAGA (SEQ ID NO:116)和GSGSGSGSGSGS (SEQ IDNO:117)、GGAGGA (SEQ ID NO:118)、GGSGGS (SEQ ID NO:119)、GGAGGAGGA (SEQ ID NO:120)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO:121)、GGAGGAGGAGGA (SEQ ID NO:122)、GGSGGSGGSGGS (SEQID NO:123)、GGAGGGAG (SEQ ID NO:124)、GGSGGGSG (SEQ ID NO:125)、GGAGGGAGGGAG(SEQ ID NO:126)和GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO:127)、GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:128)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:129)、AAAL (SEQ ID NO:133)、AAAK (SEQ ID NO:134)、AAAR (SEQ ID NO:135)、EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO:136)、GSAGSAAGSGEF (SEQ IDNO:137)、AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO:138)、KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:139)、GENLYFQSGG (SEQ ID NO:140)、SACYCELS (SEQ ID NO:141)、RSIAT (SEQ ID NO:142)、RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO:143)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQID NO:144)、AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO:145)、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO:146)、EAAAK (SEQ ID NO:147)或PAPAP(SEQ ID NO:148)。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽具有至少7天的血清半衰期。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽以200 pM或更高的KD结合人骨形态发生蛋白9 (BMP9)。在一些实施方案中，所述多肽结合激活素和/或肌肉生长抑制素且与人BMP9的结合减少(例如，微弱)。在一些实施方案中，所述多肽实质上不结合人BMP9。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽以800 pM或更低的KD结合人激活素A。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽以近似800 pM或更低的KD结合人激活素B。
在任何前述实施方案中，本文所述的多肽以近似5 pM或更高的KD结合人GDF-11。
在另一个方面，本发明的特征在于编码本文所述的多肽(例如，包含具有SEQ IDNO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体的多肽)的核酸分子。在另一个方面，本发明的特征还在于包含本文所述的核酸分子的载体。
在另一个方面，本发明的特征在于表达本文所述的多肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含前两个方面中描述的核酸分子或载体，其中所述核酸分子或载体在宿主细胞中表达。
在另一个方面，本发明的特征在于制备本文所述的多肽的方法，其中所述方法包括：a)提供包含本文所述的核酸分子或载体的宿主细胞，和b)在允许形成多肽的条件下在宿主细胞中表达所述核酸分子或载体。
在另一个方面，本发明的特征在于药物组合物，其包含本文所述的多肽、核酸分子或载体和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在药物组合物的一些实施方案中，所述多肽、核酸分子或载体呈治疗有效量。
在另一个方面，本发明的特征还在于包含两个相同多肽的构建体(例如，同二聚体)，每个多肽包含具有与Fc结构域单体(例如，SEQ ID NO:97的序列)的N-或C-末端融合的SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体。两个多肽中的两个Fc结构域单体相互作用以在构建体中形成Fc结构域。
在另一个方面，本发明的特征还在于包含两个不同多肽的构建体(例如，异二聚体)，每个多肽包含具有与Fc结构域单体的N-或C-末端融合的SEQ ID NO:1-72(例如，SEQID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体。两个多肽中的两个Fc结构域单体相互作用以在构建体中形成Fc结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于增加有此需要的受试者中的骨矿物质密度的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物。
在另一个方面，本发明的特征在于减少有此需要的受试者中的骨吸收的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物。
在另一个方面，本发明的特征在于增加有此需要的受试者中的骨形成的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述患者具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失。
在另一个方面，本发明的特征在于影响具有涉及骨损伤的疾病或病况的受试者中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导(例如，减少或抑制肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9与其受体的结合)的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物。在该方面的一些实施方案中，所述疾病或病况是原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有原发性骨质疏松症的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有继发性骨质疏松症的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有骨质减少症的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有骨折的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有骨癌或癌症转移相关的骨损失的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有佩吉特氏病的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有肾性骨营养不良的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有治疗相关的骨损失的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有饮食相关的骨损失的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有与肥胖治疗相关的骨损失的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有低重力相关的骨损失的受试者的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或本文所述的药物组合物来治疗具有不动相关的骨损失的受试者的方法。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述原发性骨质疏松症是年龄相关的骨质疏松症。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述原发性骨质疏松症是激素相关的骨质疏松症。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述继发性骨质疏松症是固定诱导的骨质疏松症。
在任何上述方面的一些实施方案中，其中所述继发性骨质疏松症是糖皮质激素诱导的骨质疏松症。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述治疗是FGF-21治疗。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述治疗是GLP-1治疗。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述治疗是癌症疗法。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述治疗是肥胖症和/或2型糖尿病的治疗。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述饮食相关的骨损失是佝偻病。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法增加受试者中的骨形成。在任何上述方面的一些实施方案中，其中所述方法减少受试者中的骨吸收。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法增加成骨细胞活性或成骨细胞生成。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法减少破骨细胞活性或减少破骨细胞生成。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法减少或抑制激活素和/或肌肉生长抑制素与其受体的结合。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法不引起受试者中的血管并发症(例如，增加血管通透性或渗漏)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法增加受试者中的骨矿物质密度。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述骨是皮质骨。在任何上述方面的一些实施方案中，所述骨是小梁骨。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述多肽、核酸、载体或药物组合物以一定量施用，所述量足以在受试者中增加骨密度，减少骨吸收，降低骨吸收速率，增加骨形成，增加骨形成速率，降低破骨细胞活性，增加成骨细胞活性，或影响肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:69的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:69的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸NP或NPVTPK (SEQ ID NO:155))。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:69的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:58的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:58的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸NP或NPVTPK (SEQ ID NO:155))。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:58的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:6的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:6的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸NP或NPVTPK (SEQ ID NO:155))。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:6的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:38的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:38的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸NP或NPVTPK (SEQ ID NO:155))。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:38的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:41的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:41的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸NP或NPVTPK (SEQ ID NO:155))。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:41的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:44的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:44的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸NP或NPVTPK (SEQ ID NO:155))。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:44的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:70的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:70的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸NP或NPVTPK (SEQ ID NO:155))。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:70的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:71的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:71的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸(例如，C-末端的1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸，例如，氨基酸VTPK)。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:71的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K，位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN，和/或C-末端延伸)的变体或含有所述变体的药物组合物来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
在任何上述方面的一些实施方案中，所述变体具有SEQ ID NO:72的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:72的序列的变体具有位置X17处的氨基酸K，和/或位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN。在任何上述方面的一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的具有SEQ ID NO:72的序列(任选地具有位置X17处的氨基酸K和/或位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN或TKEN)的变体来增加骨矿物质密度，增加骨形成，减少骨吸收，或治疗涉及有此需要的受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的涉及骨损伤的病况或疾病，或影响受试者(例如，具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者)中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
定义
如本文所用，术语“细胞外激活素受体IIa型(ActRIIa)变体”是指相对于野生型细胞外ActRIIa(例如，下文所示的SEQ ID NO:75的序列的粗体部分)或具有SEQ ID NO:76-96的序列中的任一个的细胞外ActRIIa具有至少一个氨基酸取代的包括单个跨膜受体ActRIIa的可溶性、细胞外部分的肽。野生型、人ActRIIa前体蛋白的序列如下所示(SEQ ID NO:75)，其中信号肽为斜体，且细胞外部分为粗体。
野生型、人ActRIIa前体蛋白(SEQ ID NO:75)：
细胞外ActRIIa变体可以具有SEQ ID NO:1-72中的任一个的序列。在具体实施方案中，细胞外ActRIIa变体具有SEQ ID NO:6-72中的任一个的序列(表2)。在一些实施方案中，细胞外ActRIIa变体可以与野生型细胞外ActRIIa (SEQ ID NO:73)的序列具有至少85%(例如，至少85%、87%、90%、92%、95%、97%或更高)氨基酸序列同一性。
如本文所用，术语“细胞外ActRIIb变体”是指相对于野生型细胞外ActRIIb(例如，SEQ ID NO:74的序列)具有至少一个氨基酸取代的包含单个跨膜受体ActRIIb的可溶性、细胞外部分ActRIIb的肽。细胞外ActRIIb变体可以具有如下所示的SEQ ID NO:149的序列：
细胞外ActRIIb变体(SEQ ID NO:149)：
如本文所用，术语“接头”是指两个元件(例如肽或蛋白结构域)之间的连接。本文所述的多肽可以包括与部分融合的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)。所述部分可以增加稳定性或改善多肽的药代动力学特性。所述部分(例如，Fc结构域单体，野生型Fc结构域，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽，纤连蛋白结构域或人血清白蛋白)可以通过接头的方式与多肽融合。接头可以是共价键或间隔区。术语“键”是指化学键，例如酰胺键或二硫键，或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何种类的键。术语“间隔区”是指在两个元件(例如，肽或蛋白结构域)之间存在以提供两个元件之间的空间和/或柔性的部分(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)或氨基酸序列(例如，1-200个氨基酸序列)。氨基酸间隔区是多肽的一级序列的一部分(例如，通过多肽主链与间隔的肽融合)。例如在形成Fc结构域的两个铰链区之间形成二硫键不被认为是接头。
如本文所用，术语“Fc结构域”是指两个Fc结构域单体的二聚体。Fc结构域与包含至少CH2结构域和CH3结构域的人Fc结构域具有至少80%序列同一性(例如，至少85%、90%、95%、97%或100%序列同一性)。Fc结构域单体包含第二和第三抗体恒定结构域(CH2和CH3)。在一些实施方案中，所述Fc结构域单体还包含铰链结构域。Fc结构域不包含能够充当抗原识别区域的免疫球蛋白的任何部分，例如可变结构域或互补决定区(CDR)。在野生型Fc结构域中，两个Fc结构域单体通过两个CH3抗体恒定结构域以及在两个二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键之间的相互作用而二聚化。在一些实施方案中，可以使Fc结构域突变以缺乏效应子功能，这是典型的“死亡Fc结构域”。在某些实施方案中，Fc结构域中的每个Fc结构域单体包含CH2抗体恒定结构域中的减少Fc结构域和Fcγ受体之间的相互作用或结合的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述Fc结构域含有一个或多个减少或抑制Fc结构域二聚化的氨基酸取代。Fc结构域可以是任何免疫球蛋白抗体同种型，包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。另外，Fc结构域可以是IgG亚型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。所述Fc结构域也可以是非天然存在的Fc结构域，例如重组Fc结构域。
如本文所用，术语“白蛋白结合肽”是指12至16个氨基酸的氨基酸序列，其具有对血清白蛋白的亲和力和结合血清白蛋白的功能。白蛋白结合肽可以是不同来源(例如,人、小鼠或大鼠)的。在一些实施方案中，白蛋白结合肽具有序列DICLPRWGCLW (SEQ ID NO:152)。
如本文所用，术语“纤连蛋白结构域”是指细胞外基质的高分子量糖蛋白或其片段，其结合例如跨膜受体蛋白诸如整联蛋白和细胞外基质组分诸如胶原蛋白和纤维蛋白。在一些实施方案中，纤连蛋白结构域是具有UniProt ID NO:P02751的序列的氨基酸610-702的纤连蛋白III型结构域(SEQ ID NO:153)。在其他实施方案中，纤连蛋白结构域是adnectin蛋白。
如本文所用，术语“人血清白蛋白”是指存在于人血浆中的白蛋白。人血清白蛋白是血液中最丰富的蛋白。其构成血清蛋白的约一半。在一些实施方案中，人血清白蛋白具有UniProt ID NO:P02768的序列(SEQ ID NO:154)。
如本文所用，术语“融合”用于描述两个或更多个元件、组分或蛋白结构域(例如，肽或多肽)通过包括化学缀合、重组手段和化学键(例如，酰胺键)的手段的组合或附接。例如，串联系列的两个单一肽可以通过化学缀合、化学键、肽接头或任何其他共价连接的手段融合以形成一个连续的蛋白结构，例如多肽。在本文所述多肽的一些实施方案中，细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)可以与部分(例如，Fc结构域单体(例如，SEQ ID NO:97的序列)，野生型Fc结构域(例如，SEQ ID NO:151的序列)，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽(例如，SEQ ID NO:152的序列)，纤连蛋白结构域(例如，SEQ ID NO:153的序列)或人血清白蛋白(例如，SEQ ID NO:154的序列))的N-或C-末端通过接头的方式以串联系列融合。例如，细胞外ActRIIa变体与部分(例如，Fc结构域单体，野生型Fc结构域，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽，纤连蛋白结构域或人血清白蛋白)通过肽接头的方式融合，其中肽接头的N-末端通过化学键(例如，肽键)与细胞外ActRIIa变体的C-末端融合，并且肽接头的C-末端与部分(例如，Fc结构域单体，野生型Fc结构域，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽，纤连蛋白结构域或人血清白蛋白)通过化学键(例如，肽键)融合。
如本文所用，术语“C-末端延伸”是指将一个或多个氨基酸添加至包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-70(例如，SEQ ID NO:6-70)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽。C-末端延伸可以是一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸)。示例性的C-末端延伸是氨基酸序列NP(两个氨基酸C-末端延伸)和氨基酸序列NPVTPK (SEQ ID NO:155)(六个氨基酸C-末端延伸)。可以使用不破坏多肽的活性的任何氨基酸序列。SEQ ID NO:71(其为具有NP的C-末端延伸的SEQ ID NO:69的序列)和SEQ IDNO:72(其为具有NPVTPK的C-末端延伸的SEQ ID NO:69的序列)代表可以修饰本发明多肽以包括C-末端延伸的两种可能方式。
如本文所用，术语“百分比(%)同一性”是指在比对序列和引入空位(如果必要)以实现最大百分比同一性(即，可以在候选和参考序列中的一者或两者中引入空位用于最佳比对，并且为了比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列(例如，细胞外ActRIIa变体)的氨基酸(或核酸)残基与参考序列(例如，野生型细胞外ActRIIa (例如，SEQ ID NO:73))的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。为了确定百分比同一性的目的的比对可以以本领域技术内的各种方式，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实现待比较序列全长内的最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，给定候选序列对、与或针对给定参考序列的百分比氨基酸(或核酸)序列同一性(其可以替代地表达为对、与或针对给定参考序列具有或包括特定百分比氨基酸(或核酸)序列同一性的给定候选序列)如下计算：
100 x (A/B的分数)
其中A是在候选序列和参考序列的比对中评分为相同的氨基酸(或核酸)残基的数目，并且其中B是参考序列中氨基酸(或核酸)残基的总数。在其中候选序列的长度不等于参考序列的长度的一些实施方案中，候选序列与参考序列的百分比氨基酸(或核酸)序列同一性不等于参考序列与候选序列的百分比氨基酸(或核酸)序列同一性。
在具体实施方案中，比对用于与候选序列比较的参考序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核酸)残基的选择部分上表现出50%至100%同一性。为了比较目的而比对的候选序列的长度为参考序列的长度的至少30%，例如，至少40%，例如，至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。当候选序列中的位置被与参考序列中的相应位置相同的氨基酸(或核酸)残基占据时，则分子在该位置是相同的。
如本文所用，术语“血清半衰期”是指在将治疗性蛋白施用于受试者的背景下，受试者中蛋白的血浆浓度减少一半所需的时间。蛋白可以从血流重新分配或清除，或者例如通过蛋白水解降解。如本文所述，包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽展现在人类中的7天的血清半衰期。如本文所用，术语“亲和力”或“结合亲和力”是指两个分子之间的结合相互作用的强度。通常，结合亲和力是指分子和其结合配偶体(诸如细胞外ActRIIa变体和BMP9或激活素A)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则结合亲和力是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员之间的1:1相互作用。两个分子之间的结合亲和力通常通过解离常数(KD)或亲和常数(KA)来描述。两个对彼此具有低结合亲和力的分子通常缓慢结合，倾向于容易解离，并且表现出大的KD。两个对彼此具有高亲和力的分子通常容易结合，倾向于保持更长的结合，并且表现出小的KD。可以使用本领域中众所周知的方法和技术，例如表面等离子体共振，确定两个相互作用分子的KD。KD计算为koff/kon的比率。
如本文所用，术语“骨矿物质密度(BMD)”、“骨密度”和“骨量”是指骨组织中骨矿物质(例如钙)的量的量度。BMD可以通过本领域技术人员已知的良好确立的临床技术(例如，通过单一-1或双能光子或X射线吸收测定法)来测量。BMD的概念涉及每体积骨的矿物质量，尽管临床上其通过代理人根据成像时每平方厘米骨表面的光密度来测量。BMD测量值在临床医学中用作骨质疏松症和骨折风险的间接指标。在一些实施方案中，BMD测试结果作为T-评分提供，其中T-评分代表与健康的30岁成人的理想或峰值骨矿物质密度相比的受试者的BMD。0的评分表示BMD等于健康年轻成人的正常参考值。测量的受试者BMD和健康年轻成人的参考值之间的差异以标准偏差单位(SD)测量。因此，在+1 SD和-1 SD之间的T-评分可以指示正常BMD，在-1 SD和-2.5 SD之间的T-评分可以指示低骨量(例如，骨质减少症)，且低于-2.5 SD的T-评分可以指示骨质疏松症或严重的骨质疏松症。在一些实施方案中，将本发明的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72 (例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽、编码这种多肽的核酸或含有这种核酸分子的载体施用于有此需要的受试者，其中所述患者具有低骨量(例如，T-评分在-1 SD和-2.5 SD之间)。在一些实施方案中，将本发明的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽、编码这种多肽的核酸或含有这种核酸分子的载体施用于有此需要的受试者，其中所述患者具有骨质疏松症(例如，T-评分小于-2.5 SD)。在一些实施方案中，本发明的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72 (例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽、编码这种多肽的核酸或含有这种核酸分子的载体的施用通过增加其BMD来治疗受试者。在一些实施方案中，本发明的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽、编码这种多肽的核酸或含有这种核酸分子的载体的施用增加受试者的BMD，导致受试者的T-评分增加(例如，导致受试者的T-评分增加0.1或更多、0.2或更多、0.3或更多、0.4或更多、0.5或更多、1.0或更多或2.0或更多)。
如本文所用，术语“骨重塑”或“骨代谢”是指通过用新合成的蛋白质基质包替换旧骨的离散部分来维持骨强度和离子内稳态的过程。骨被破骨细胞吸收，并且在称为骨化的过程中通过成骨细胞沉积。骨细胞活性在该过程中起关键作用。导致骨量减少的病况可以由吸收的增加或骨化的减少引起。在健康的个体中，在儿童期期间，骨形成超过吸收。随着老化过程发生，吸收超过形成。由于与更年期相关的雌激素缺乏，骨吸收率在绝经后老年女性中通常也高得多。
如本文所用，术语“骨吸收”或“骨分解代谢活性”是指破骨细胞分解骨中的组织并且释放矿物质、导致矿物质(例如，钙)从骨组织转移至血液的过程。骨吸收速率的增加与衰老(包括绝经后妇女)相关。高骨吸收速率或超过骨化速率的骨吸收速率，与骨骼病症(诸如骨矿物质密度降低，包括骨质减少症和骨质疏松症)相关。在一些实施方案中，将本发明的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72 (例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽、编码这种多肽的核酸或含有这种核酸分子的载体施用于有此需要的受试者，以减少受试者中的骨吸收(例如，受试者中的骨吸收速率)。
如本文所用，术语“骨形成”、“骨化”、“骨生成”或“骨合成代谢活性”是指通过成骨细胞形成新骨组织的过程。在一些实施方案中，将本发明的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72 (例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽、编码这种多肽的核酸或含有这种核酸分子的载体施用于有此需要的受试者，以增加骨形成(例如，增加受试者中的骨形成或骨生成的速率)。
如本文所用，短语“影响肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导”是指改变肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9与其受体、例如ActRIIa、ActRIIb和BMPRII (例如，ActRIIa)的结合。在一些实施方案中，包括本文所述的细胞外ActRIIa变体的多肽减少或抑制肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9与其受体、例如ActRIIa、ActRIIb和BMPRII (例如，ActRIIa)的结合。如本文所述，本发明的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽可以具有对BMP9的弱结合亲和力(例如，200pM或更高的KD)。
如本文所用，术语“血管并发症”是指血管病症或对血管的任何损伤，诸如对血管壁的损伤。对血管壁的损伤可以引起血管通透性或渗漏的增加。术语“血管渗透性或渗漏”是指血管壁允许小分子、蛋白和细胞流入和流出血管的能力。血管渗透性或渗漏的增加可能由内衬血管壁的内皮细胞之间的间隙增加(例如，间隙的大小和/或数量的增加)和/或血管壁变薄引起。
如本文所用，术语“多肽”描述单一聚合物，其中单体是通过酰胺键共价缀合在一起的氨基酸残基。多肽旨在涵盖天然存在的、重组的或合成产生的任何氨基酸序列。
如本文所用，术语“同二聚体”是指由两个相同的大分子(诸如蛋白或核酸)形成的分子构建体。两个相同的单体可以通过共价键或非共价键形成同二聚体。例如，如果两个Fc结构域单体含有相同的序列，则Fc结构域可以是两个Fc结构域单体的同二聚体。在另一个实例中，本文所述的包含与Fc结构域单体融合的细胞外ActRIIa变体的多肽可以通过两个Fc结构域单体的相互作用形成同二聚体，所述Fc结构域单体在同二聚体中形成Fc结构域。
如本文所用，术语“异二聚体”是指由两个不同的大分子(诸如蛋白或核酸)形成的分子构建体。两个单体可以通过共价键或非共价键形成异二聚体。例如，本文所述的包含与Fc结构域单体融合的细胞外ActRIIa变体的多肽可以通过两个Fc结构域单体(其各自与不同的ActRIIa变体融合)的相互作用形成异二聚体，所述Fc结构域单体在异二聚体中形成Fc结构域。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含从其相应核酸表达蛋白所需的必需细胞组分(例如细胞器)的媒介物。核酸通常包括在核酸载体中，所述核酸载体可以通过本领域中已知的常规技术(转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)引入宿主细胞中。宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，或真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如CHO细胞或HEK293细胞)。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指本发明的多肽、核酸或载体或含有本发明的多肽、核酸或载体的药物组合物在治疗患者中有效地实现期望的治疗效果的量，所述患者具有疾病，诸如骨质疏松症，或涉及骨损伤的病况，例如，原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失。术语“治疗有效量”还指本发明的多肽、核酸或载体或含有本发明的多肽、核酸或载体的药物组合物在治疗患者中有效地实现期望的治疗效果的量，所述患者具有疾病，诸如涉及骨损伤的疾病或病况。具体而言，治疗有效量的多肽、核酸或载体避免了不良副作用。
如本文所用，术语“药物组合物”是指包含活性成分以及使得活性成分能够适合于施用方法的赋形剂和稀释剂的医药或药物制剂。本发明的药物组合物包含与所述多肽、核酸或载体相容的药学上可接受的组分。药物组合物可以呈用于口服施用的片剂或胶囊形式，或者呈用于静脉内或皮下施用的水性形式。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体必须与制剂的其他成分相容并且对受体无害。在本发明中，药学上可接受的载体或赋形剂必须为包含细胞外ActRIIa变体的多肽、编码所述多肽的核酸分子或含有这种核酸分子的载体提供足够的药物稳定性。载体或赋形剂的性质随着施用模式而不同。例如，对于静脉内施用，通常使用水溶液载体；对于口服施用，优选固体载体。
如本文所用，术语“治疗和/或预防”是指使用本发明的方法和组合物治疗和/或预防疾病，例如骨疾病或病症(例如，原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失)。通常，治疗骨骼疾病或病况发生在受试者已经发展骨骼疾病或病况和/或已经被诊断具有骨骼疾病或病况之后。预防骨骼疾病或病况是指当受试者处于发展骨骼疾病或病况的风险中时采取的步骤或程序。受试者可能显示由医生判断为发展骨骼疾病或病况的迹象或危险因素的体征或轻微症状，或者具有发展骨骼疾病或病况的家族史或遗传倾向，但尚未发病。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如优选人。哺乳动物包括但不限于人类和家畜和农场动物，诸如猴(例如，食蟹猴)，小鼠，狗，猫，马和牛等。
附图描述
图1是显示细胞外ActRIIa和ActRIIb的野生型序列和ActRIIa变体中的氨基酸取代的序列比对。
发明详述
本发明的特征在于包含细胞外激活素受体IIa型(ActRIIa)变体的多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽包含与部分(例如，Fc结构域单体，野生型Fc结构域，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽，纤连蛋白结构域或人血清白蛋白)融合的细胞外ActRIIa变体。包含与Fc结构域单体融合的细胞外ActRIIa变体的多肽也可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)。与激活素和肌肉生长抑制素相比，本文所述的ActRIIa变体对骨形态发生蛋白9(BMP9)具有微弱结合亲和力或无结合亲和力。本发明还包括通过经由向受试者施用包含本文所述的细胞外ActRIIa变体的多肽来在受试者中增加骨矿物质密度或骨形成或影响肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导来治疗涉及骨损伤的疾病和病况的方法。
I. 细胞外激活素受体IIa型(ActRIIa)变体
激活素II型受体是单跨膜结构域受体，其调节转化生长因子β(TGF-β)超家族中的配体的信号。TGF-β超家族中的配体参与许多生理过程，诸如肌肉生长、血管生长、细胞分化、体内平衡和成骨作用。TGF-β超家族中的配体的实例包括，例如，激活素、抑制素、生长分化因子(GDF)(例如，GDF8，也称为肌肉生长抑制素)和骨形态发生蛋白(BMP)(例如，BMP9)。激活素在骨组织中丰富表达，并通过控制成骨细胞和破骨细胞功能来调节骨形成。已报道激活素在骨病中上调并抑制成骨细胞活性。肌肉生长抑制素还通过增加骨生成和抑制成骨细胞活性而牵涉于骨内稳态。这些数据表明激活素受体配体(例如，激活素和肌肉生长抑制素)促进骨吸收，这可能导致涉及骨损伤的疾病或病况，诸如原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失。因此，减少或抑制该信号传导的方法可用于治疗涉及骨损伤的疾病和病况。
存在两种类型的激活素II型受体：ActRIIa和ActRIIb。研究已显示，BMP9结合ActRIIb，其结合亲和力比ActRIIa高约300倍(参见，例如，Townson等人, J. Biol. Chem.287:27313, 2012)。已知ActRIIa与ActRIIb相比具有更长的半衰期。本发明描述了通过将ActRIIb的氨基酸残基引入ActRIIa而构建的细胞外ActRIIa变体，其目的是赋予ActRIIb所赋予的生理学特性，同时还维持ActRIIa的有益生理学和药代动力学特性。例如，最佳肽赋予骨矿物质密度的显著增加，同时维持更长的血清半衰期和对BMP9的低结合亲和力。优选的ActRIIa变体还表现出与野生型ActRIIa相比改善的与激活素和/或肌肉生长抑制素的结合，其允许它们与内源性激活素受体竞争配体结合并减少或抑制内源性激活素受体信号传导。这些变体可用于治疗其中激活素受体信号传导升高的病症，诸如骨疾，导致骨吸收或破骨细胞活性降低，以及骨形成、骨矿物质密度或骨强度增加。在一些实施方案中，可以将氨基酸取代引入细胞外ActRIIa变体以降低或去除所述变体与BMP9的结合亲和力。人ActRIIa和ActRIIb的细胞外部分的野生型氨基酸序列如下所示。
人ActRIIa，细胞外部分(SEQ ID NO:73)：
人ActRIIb，细胞外部分(SEQ ID NO:74)：
本文所述的多肽包含相对于具有SEQ ID NO:73的序列的野生型细胞外ActRIIa或具有SEQ ID NO:76-96的序列中的任一个的细胞外ActRIIa具有至少一个氨基酸取代的细胞外ActRIIa变体。可以将27个不同位置处的可能的氨基酸取代引入细胞外ActRIIa变体(表1)。在一些实施方案中，细胞外ActRIIa变体可以与野生型细胞外ActRIIa (SEQ ID NO:73)的序列具有至少85%(例如，至少85%、87%、90%、92%、95%、97%或更高)氨基酸序列同一性。细胞外ActRIIa变体可以相对于野生型细胞外ActRIIa (SEQ ID NO:73)的序列具有一个或多个(例如，1-27、1-25、1-23、1-21、1-19、1-17、1-15、1-13、1-11、1-9、1-7、1-5、1-3或1-2；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个)氨基酸取代。在一些实施方案中，细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的细胞外ActRIIa变体)可以包含如表1中所列的所有27个位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，细胞外ActRIIa变体可以包含在许多位置处、例如在如表1中所列的27个位置中的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个处的氨基酸取代。
氨基酸取代可以恶化或改善本发明的ActRIIa变体的活性和/或结合亲和力。为了维持多肽功能，重要的是保留表1和2中所示的序列(SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72))中的位置X17处的赖氨酸(K)。在该位置处的取代可以导致活性的丧失。例如，具有序列GAILGRSETQECLFYNANWELERTNQTGVERCEGEKDKRLHCYATWRNISGSIEIVAKGCWLDDFNCYDRTDCVETEENPQVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO: 150)的ActRIIa变体具有降低的体内活性，表明不能耐受丙氨酸(A)取代位置X17处的赖氨酸(K)。因此，本发明的ActRIIa变体，包括表1和2中的变体(例如，SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72))在位置X17处保留氨基酸K。
本发明的ActRIIa变体与BMP9的结合优选减少、微弱或实质上不结合。在含有位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TEEN的ActRIIa变体中，以及维持位置X24处的氨基酸K且具有位置X23、X24、X25和X26处的氨基酸序列TKEN的变体中，BMP9结合减少。序列TEEN和TKEN可以在本发明的ActRIIa变体(例如，表1和2中的变体，例如，SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72))中可互换使用以提供减少的BMP9结合。
本发明的ActRIIa变体可以进一步包含C-末端延伸(例如，C-末端的额外氨基酸)。C-末端延伸可以向表1和2中所示的任何变体(例如，SEQ ID NO:1-70(例如，SEQ ID NO:6-70))添加在C-末端的一个或多个额外氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸)。可以在本发明的ActRIIa变体中包含的一种潜在的C-末端延伸是氨基酸序列NP。例如，包含C-末端延伸的序列是SEQ ID NO:71(例如，具有NP的C-末端延伸的SEQ ID NO:69)。可以在本发明的ActRIIa变体中包含的另一种示例性C-末端延伸是氨基酸序列NPVTPK (SEQ ID NO:155)。例如，包含C-末端延伸的序列是SEQ ID NO:72(例如，具有NPVTPK的C-末端延伸的SEQID NO:69)。
表1. 具有 SEQ ID NO:1-5中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体中的氨基酸取代
。
在具有SEQ ID NO:2的序列的细胞外ActRIIa变体的一些实施方案中，X3是E，X6是R，X11是D，X12是K，X13是R，X16是K或R，X17是K，X19是W，X20是L，X21是D，且X22是I或F。在具有SEQID NO:1或2的序列的细胞外ActRIIa变体的一些实施方案中，X17是K。在具有SEQ ID NO:1-3的序列的细胞外ActRIIa变体的一些实施方案中，X17是K，X23是T，X24是E，X25是E，且X26是N。在具有SEQ ID NO:1-5中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体的一些实施方案中，X17是K，X23是T，X24是K，X25是E，且X26是N。
在一些实施方案中，本文所述的多肽包含具有 SEQ ID NO:6-72中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体(表2)。
表2. 具有SEQ ID NO:6-72的序列的细胞外ActRIIa变体
。
在一些实施方案中，包含细胞外ActRIIa变体(例如，SEQ ID NO:1-72(例如，SEQID NO:6-72)中的任一个)的本发明的多肽具有位置X17处的氨基酸K。改变位置X17处的氨基酸可以导致活性降低。例如，具有序列GAILGRSETQECLFYNANWELERTNQTGVERCEGEKDKRLHCYATWRNISGSIEIVAKGCWLDDFNCYDRTDCVETEENPQVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO:150)的ActRIIa变体具有降低的体内活性，表明不能耐受A取代位置X17处的K。
在一些实施方案中，包含具有位置X23、X24、X25和X26处的序列TEEN的细胞外ActRIIa变体(例如，SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个)的本发明的多肽可以用氨基酸K取代位置X24处的氨基酸E。在一些实施方案中，包含具有位置X23、X24、X25和X26处的序列TKEN的细胞外ActRIIa变体(例如，SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个)的本发明的多肽可以用氨基酸E取代位置X24处的氨基酸K。具有位置X23、X24、X25和X26处的序列TEEN或TKEN的多肽具有降低或微弱的与BMP9的结合。
在一些实施方案中，包含细胞外ActRIIa变体(例如，SEQ ID NO:1-70(例如，SEQID NO:6-70)中的任一个)的本发明的多肽可以进一步包含C-末端延伸(例如，C-末端的额外氨基酸)。在一些实施方案中，所述C-末端延伸是氨基酸序列NP。例如，包含C-末端延伸的序列是SEQ ID NO:71(例如，具有NP的C-末端延伸的SEQ ID NO:69)。在一些实施方案中，所述C-末端延伸是氨基酸序列NPVTPK (SEQ ID NO:155)。例如，包含C-末端延伸的序列是SEQID NO:72(例如，具有NPVTPK的C-末端延伸的SEQ ID NO:69)。C-末端延伸可以在C-末端添加一个或多个额外氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸)。
在一些实施方案中，包含细胞外ActRIIa变体的本发明的多肽可以进一步包含部分(例如，Fc结构域单体，野生型Fc结构域，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽，纤连蛋白结构域或人血清白蛋白)，其可以通过接头的方式与细胞外ActRIIa变体的N-或C-末端(例如，C-末端)融合。在一些实施方案中，所述部分增加多肽的稳定性或改善多肽的药代动力学特性。包含与Fc结构域单体融合的细胞外ActRIIa变体的多肽可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)，所述两个Fc结构域单体组合以在二聚体中形成Fc结构域。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外ActRIIa变体不具有下表3中所示的SEQ IDNO:76-96中的任一个的序列。
表3. 排除的细胞外ActRIIa变体。
此外，在一些实施方案中，本文所述的多肽在人类中具有至少7天的血清半衰期。所述多肽可以以200 pM或更高的KD结合骨形态发生蛋白9 (BMP9)。所述多肽可以以10 pM或更高的KD结合激活素A。在一些实施方案中，所述多肽不结合BMP9或激活素A。在一些实施方案中，所述多肽结合激活素和/或肌肉生长抑制素且表现出与BMP9的结合减少(例如，微弱)。在一些实施方案中，与BMP9的结合降低或微弱的多肽在位置X23、X24、X25和X26处具有序列TEEN或TKEN。
另外，在一些实施方案中，所述多肽可以以约200 pM或更高的KD (例如，约200、300、400、500、600、700、800或900 pM或更高的KD，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50 nM或更高的KD，例如，约200 pM至约50 nM的KD)结合人BMP9。在一些实施方案中，所述多肽实质上不结合人BMP9。在一些实施方案中，所述多肽可以以约800 pM或更低的KD (例如，约800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 pM或更低的KD，例如，约800 pM至约200 pM的KD)结合人激活素A。在一些实施方案中，所述多肽可以以约800 pM或更低的KD (例如，约800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 pM或更低的KD，例如，约800 pM至约200 pM的KD)结合人激活素B。所述多肽也可以以约5 pM或更高的KD(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200 pM或更高的KD)结合生长和分化因子11 (GDF-11)。
II. Fc结构域
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以包含与免疫球蛋白的Fc结构域单体或Fc结构域的片段融合以增加多肽的血清半衰期的细胞外ActRIIa变体。包含与Fc结构域单体融合的细胞外ActRIIa变体的多肽可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)，所述两个Fc结构域单体在二聚体中形成Fc结构域。如本领域常规已知，Fc结构域是在免疫球蛋白的C-末端发现的蛋白结构。Fc结构域包含两个Fc结构域单体，其通过CH3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化。野生型Fc结构域形成结合Fc受体的最小结构，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIV。在一些实施方案中，可以突变Fc结构域以缺乏效应子功能，这是典型的“死亡”Fc结构域。例如，Fc结构域可以包含已知使Fc结构域和Fcγ受体之间的相互作用最小化的特定氨基酸取代。在一些实施方案中，Fc结构域来自IgG1抗体并且包含氨基酸取代L234A、L235A和G237A。在一些实施方案中，Fc结构域来自IgG1抗体并且包含氨基酸取代D265A、K322A和N434A。上述氨基酸位置根据Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))定义。通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的氨基酸残基的Kabat编号。此外，在一些实施方案中，Fc结构域不诱导任何免疫系统相关的应答。例如，可以修饰包含与Fc结构域单体融合的细胞外ActRIIa变体的多肽的二聚体中的Fc结构域，以减少Fc结构域和Fcγ受体之间的相互作用或结合。可以与细胞外ActRIIa变体融合的Fc结构域单体的序列如下所示(SEQ ID NO:97)：
在一些实施方案中，Fc结构域来自IgG1抗体且相对于SEQ ID NO:97的序列包含氨基酸取代L12A、L13A和G15A。在一些实施方案中，Fc结构域来自IgG1抗体且相对于SEQ IDNO:97的序列包含氨基酸取代D43A、K100A和N212A。在一些实施方案中，本文所述的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体) )可以通过常规遗传或化学方式、例如化学缀合，与Fc结构域单体(例如，SEQ ID NO:97)的N-或C-末端融合。如果期望，可以在细胞外ActRIIa变体和Fc结构域单体之间插入接头(例如，间隔区)。Fc结构域单体可以与细胞外ActRIIa变体的N-或C-末端(例如，C-末端)融合。
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以包含与Fc结构域融合的细胞外ActRIIa变体。在一些实施方案中，所述Fc结构域含有一个或多个减少或抑制Fc结构域二聚化的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述Fc结构域含有铰链结构域。所述Fc结构域可以是免疫球蛋白抗体同种型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD的Fc结构域。另外，所述Fc结构域可以是IgG亚型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。所述Fc结构域也可以是非天然存在的Fc结构域，例如重组Fc结构域。
工程改造具有减少的二聚化的Fc结构域的方法是本领域中已知的。在一些实施方案中，可以将一个或多个具有大侧链的氨基酸(例如，酪氨酸或色氨酸)引入CH3-CH3二聚体界面以由于空间碰撞而阻碍二聚体形成。在其他实施方案中，可以将一个或多个具有小侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸或苏氨酸)引入CH3-CH3二聚体界面以除去有利的相互作用。在CH3结构域中引入具有大或小侧链的氨基酸的方法描述于例如Ying等人(J Biol Chem. 287:19399-19408, 2012)，美国专利公开号2006/0074225，美国专利号8,216,805和5,731,168, Ridgway等人 (Protein Eng. 9:617-612, 1996), Atwell等人(J Mol Biol.270:26-35, 1997)，和Merchant等人 (Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998)，其全部都通过引用以其整体并入本文。
在还有其他实施方案中，构成两个Fc结构域之间的CH3-CH3界面的CH3结构域中的一个或多个氨基酸残基用带正电荷的氨基酸残基(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)或带负电荷的氨基酸残基(例如，天冬氨酸或谷氨酸)替代，使得相互作用变得静电不利，这取决于引入的特定带电荷的氨基酸。在CH3结构域中引入带电荷的氨基酸以不利于或阻止二聚体形成的方法描述于例如Ying等人 (J Biol Chem. 287:19399-19408, 2012)，美国专利公开号2006/0074225，2012/0244578和2014/0024111，其全部都通过引用以其整体并入本文。
在本发明的一些实施方案中，相对于人IgG1的序列，Fc结构域包含以下氨基酸取代中的一个或多个：T366W、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L351T、L351H、L351N、L352K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q、K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T和K409I。在一个具体实施方案中，相对于人IgG1的序列，Fc结构域包含氨基酸取代T366W。野生型Fc结构域的序列显示于SEQ ID NO:151中。
III. 白蛋白结合肽
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以包含与血清蛋白结合肽融合的细胞外ActRIIa变体。与血清蛋白肽的结合可以改善蛋白药物的药代动力学。
作为一个实例，可用于本文所述的方法和组合物中的白蛋白结合肽通常是本领域中已知的。在一个实施方案中，所述白蛋白结合肽包含序列DICLPRWGCLW (SEQ ID NO:152)。
在本发明中，白蛋白结合肽可以连接至本文所述的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的N-或C-末端(例如，C-末端)以增加细胞外ActRIIa变体的血清半衰期。在一些实施方案中，白蛋白结合肽直接或通过接头连接至细胞外ActRIIa变体的N-或C-末端。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)可以通过常规遗传或化学方式、例如化学缀合，与白蛋白结合肽(例如，SEQ ID NO:152)的N-或C-末端融合。如果期望，可以在细胞外ActRIIa变体和白蛋白结合肽之间插入接头(例如，间隔区)。不受理论束缚，预期在本文所述的细胞外ActRIIa变体中包含白蛋白结合肽可以通过其与血清白蛋白的结合而导致治疗性蛋白的延长保留。
IV. 纤连蛋白结构域
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以包含与纤连蛋白结构域融合的细胞外ActRIIa变体。与纤连蛋白结构域的结合可以改善蛋白药物的药代动力学。
纤连蛋白结构域是细胞外基质的高分子量糖蛋白或其片段，其结合例如跨膜受体蛋白诸如整联蛋白和细胞外基质组分诸如胶原蛋白和纤维蛋白。在本发明的一些实施方案中，纤连蛋白结构域连接至本文所述的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的N-或C-末端(例如，C-末端)以增加细胞外ActRIIa变体的血清半衰期。纤连蛋白结构域可以直接或通过接头连接至细胞外ActRIIa变体的N-或C-末端。
作为一个实例，可用于本文所述的方法和组合物中的纤连蛋白结构域通常是本领域中已知的。在一个实施方案中，所述纤连蛋白结构域是具有UniProt ID NO:P02751的序列的氨基酸610-702的纤连蛋白III型结构域(SEQ ID NO:153)。在另一个实施方案中，所述纤连蛋白结构域是adnectin蛋白。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体) )可以通过常规遗传或化学方式、例如化学缀合，与纤连蛋白结构域(例如，SEQ ID NO:153)的N-或C-末端融合。如果期望，可以在细胞外ActRIIa变体和纤连蛋白结构域之间插入接头(例如，间隔区)。不受理论束缚，预期在本文所述的细胞外ActRIIa变体中包含纤连蛋白结构域可以通过其与整联蛋白和细胞外基质组分(诸如胶原蛋白和纤维蛋白)的结合而导致治疗性蛋白的延长保留。
V. 血清白蛋白
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以包含与血清白蛋白融合的细胞外ActRIIa变体。与血清白蛋白的结合可以改善蛋白药物的药代动力学。
血清白蛋白是一种球状蛋白，其为哺乳动物中最丰富的血液蛋白。血清白蛋白在肝脏中产生，并且占血清蛋白的约一半。它是单体的且可溶于血液中。血清白蛋白的一些最重要的功能包括在体内运输激素、脂肪酸和其他蛋白，缓冲pH，和维持体液在血管和身体组织之间的正确分布所需的渗透压。在优选实施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白。在本发明的一些实施方案中，人血清白蛋白连接至本文所述的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的N-或C-末端(例如，C-末端)以增加细胞外ActRIIa变体的血清半衰期。人血清白蛋白可以直接或通过接头连接至细胞外ActRIIa变体的N-或C-末端。
作为一个实例，可用于本文所述的方法和组合物中的血清白蛋白通常是本领域中已知的。在一个实施方案中，所述血清白蛋白包含UniProt ID NO:P02768的序列(SEQ IDNO:154)。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体) )可以通过常规遗传或化学方式、例如化学缀合，与人血清白蛋白(例如，SEQ ID NO:154)的N-或C-末端融合。如果期望，可以在细胞外ActRIIa变体和血清白蛋白之间插入接头(例如，间隔区)。不受理论束缚，预期在本文所述的细胞外ActRIIa变体中包含血清白蛋白可以导致治疗性蛋白的延长保留。
VI. 接头
本文所述的多肽可以包含通过接头的方式与部分融合的细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)。在一些实施方案中，所述部分增加多肽的稳定性。示例性部分包括Fc结构域单体，野生型Fc结构域，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽，纤连蛋白结构域或人血清白蛋白。在本发明中，部分(例如，Fc结构域单体(例如，SEQ IDNO:97的序列)，野生型Fc结构域(例如，SEQ ID NO:151)，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽(例如，SEQ ID NO:152)，纤连蛋白结构域(例如，SEQ ID NO:153)，或人血清白蛋白(例如，SEQ ID NO:154))和细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72 (例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)之间的接头，可以是包括1-200个氨基酸的氨基酸间隔区。合适的肽间隔区是本领域中已知的，并且包括例如含有柔性氨基酸残基(诸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)的肽接头。在一些实施方案中，间隔区可以含有GA、GS、GG、GGA、GGS、GGG、GGGA (SEQ ID NO:98)、GGGS(SEQ ID NO:99)、GGGG (SEQ ID NO:100)、GGGGA (SEQ ID NO:101)、GGGGS (SEQ ID NO:102)、GGGGG (SEQ ID NO:103)、GGAG (SEQ ID NO:104)、GGSG (SEQ ID NO:105)、AGGG(SEQ ID NO:106)或SGGG (SEQ ID NO:107)的基序，例如多个或重复基序。在一些实施方案中，间隔区可以含有2至12个氨基酸，包括GA或GS，例如GA、GS、GAGA (SEQ ID NO:108)、GSGS(SEQ ID NO:109)、GAGAGA (SEQ ID NO:110)、GSGSGS (SEQ ID NO:111)、GAGAGAGA (SEQID NO:112)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:113)、GAGAGAGAGA (SEQ ID NO:114)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:115)、GAGAGAGAGAGA (SEQ ID NO:116)和GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO:117)的基序。在一些实施方案中，间隔区可以含有3至12个氨基酸，包括GGA或GGS，例如GGA、GGS、GGAGGA (SEQ ID NO:118)、GGSGGS (SEQ ID NO:119)、GGAGGAGGA (SEQ ID NO:120)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO:121)、GGAGGAGGAGGA (SEQ ID NO:122)和GGSGGSGGSGGS (SEQ IDNO:123)的基序。在还有一些实施方案中，间隔区可以含有4至12个氨基酸，包括GGAG (SEQID NO:104)、GGSG (SEQ ID NO:105)，例如，GGAG (SEQ ID NO:104)、GGSG (SEQ ID NO:105)、GGAGGGAG (SEQ ID NO:124)、GGSGGGSG (SEQ ID NO:125)、GGAGGGAGGGAG (SEQ IDNO:126)和GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO:127)的基序。在一些实施方案中，间隔区可以含有GGGGA (SEQ ID NO:101)或GGGGS (SEQ ID NO:102)，例如，GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:128)和GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:129)的基序。在本发明的一些实施方案中，部分(例如，Fc结构域单体，野生型Fc结构域，具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域，白蛋白结合肽，纤连蛋白结构域，或血清白蛋白)和细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72 (例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)之间的接头可以是GGG、GGGA (SEQ ID NO:98)、GGGG (SEQ ID NO:100)、GGGAG (SEQ IDNO:130)、GGGAGG (SEQ ID NO:131)或GGGAGGG (SEQ ID NO:132)。
在一些实施方案中，间隔区还可以含有除了甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸以外的氨基酸，例如AAAL (SEQ ID NO:133)、AAAK (SEQ ID NO:134)、AAAR (SEQ ID NO:135)、EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO:136)、GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO:137)、AEAAAKEAAAKA (SEQID NO:138)、KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:139)、GENLYFQSGG (SEQ ID NO:140)、SACYCELS (SEQ ID NO:141)、RSIAT (SEQ ID NO:142)、RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO:143)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO:144)、AAANSSIDLISVPVDSR(SEQ ID NO:145)或GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO:146)。在一些实施方案中，间隔区可以含有EAAAK (SEQ ID NO:147)的基序，例如多个或重复基序。在一些实施方案中，间隔区可以含有富含脯氨酸的序列(诸如(XP)n)的基序，例如多个或重复基序，其中X可以是任何氨基酸(例如，A、K或E)且n为1-5，和PAPAP(SEQ ID NO:148)。
肽间隔区的长度和使用的氨基酸可以根据所涉及的两种蛋白和最终蛋白融合多肽中期望的柔性程度进行调节。可以调节间隔区的长度以确保适当的蛋白折叠并避免聚集体形成。
VII. 载体、宿主细胞和蛋白产生
本发明的多肽可以从宿主细胞产生。宿主细胞是指包含从其相应的核酸表达本文所述的多肽和融合多肽所需的必需细胞组分(例如，细胞器)的媒介物。核酸可以包括在核酸载体中，所述核酸载体可以通过本领域中已知的常规技术(例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射、注射等)引入宿主细胞中。核酸载体的选择部分取决于待使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是真核生物(例如，哺乳动物)或原核生物(例如，细菌)来源的。
核酸载体构建和宿主细胞
编码本发明的多肽的氨基酸序列的核酸序列可以通过本领域中已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于寡核苷酸介导的(或定点的)诱变和PCR诱变。编码本发明的多肽的核酸分子可以使用标准技术(例如，基因合成)获得。或者，可以使用本领域中的标准技术(例如，QuikChangeTM诱变)突变编码野生型细胞外ActRIIa的核酸分子以包括特定氨基酸取代。可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成核酸分子。
可以将编码本发明的多肽的核酸序列插入能够在原核或真核宿主细胞中复制和表达核酸分子的载体中。许多载体在本领域中可得，并且可用于本发明的目的。每种载体可以包括可以针对与特定宿主细胞的相容性进行调整和优化的各种组分。例如，载体组分可以包括但不限于复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点、信号序列、编码目标蛋白的核酸序列和转录终止序列。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞可用作本发明的宿主细胞。哺乳动物细胞类型的实例包括但不限于人胚肾(HEK)(例如，HEK293、HEK 293F)、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、COS、PC3、Vero、MC3T3、NS0、Sp2/0、VERY、BHK、MDCK、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0(不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在一些实施方案中，大肠杆菌细胞也可用作本发明的宿主细胞。大肠杆菌菌株的实例包括但不限于大肠杆菌294(ATCC® 31,446)、大肠杆菌λ1776(ATCC® 31,537，大肠杆菌BL21 (DE3)(ATCC® BAA-1025)，和大肠杆菌RV308(ATCC® 31,608)。不同宿主细胞具有转录后加工和修饰蛋白产物的特征和特定机制(例如，糖基化)。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的多肽的正确的修饰和加工。可以使用本领域中的常规技术(例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀和直接显微注射)将上述表达载体引入适当的宿主细胞中。一旦将载体引入宿主细胞中用于蛋白生产，宿主细胞在适当改良的常规营养培养基中培养，用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因。用于表达治疗性蛋白的方法是本领域中已知的，参见，例如，Paulina Balbas, Argelia Lorence (编) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), HumanaPress; 第2版 2004以及Vladimir Voynov和Justin A. Caravella (编) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press;第2版 2012。
蛋白产生、回收和纯化
用于产生本发明的多肽的宿主细胞可以在本领域中已知且适合于培养选择的宿主细胞的培养基中生长。用于哺乳动物宿主细胞的合适培养基的实例包括最小必需培养基(MEM)、Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)、Expi293™表达培养基、补充胎牛血清(FBS)的DMEM和RPMI-1640。用于细菌宿主细胞的合适培养基的实例包括Luria肉汤(LB)加必需的补充剂，诸如选择剂，例如氨苄青霉素。宿主细胞在合适的温度诸如约20℃至约39℃，例如25℃至约37℃，优选37℃，和CO2水平，诸如5至10%下培养。培养基的pH通常为约6.8至7.4，例如7.0，这主要取决于宿主生物体。如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合于激活启动子的条件下诱导蛋白表达。
在一些实施方案中，取决于使用的表达载体和宿主细胞，表达的蛋白可以从宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)分泌至细胞培养基中。蛋白回收可以涉及过滤细胞培养基以去除细胞碎片。可以进一步纯化蛋白。本发明的多肽可以通过蛋白纯化领域中已知的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力和大小排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于蛋白纯化的任何其他标准技术进行纯化。例如，可以通过适当选择和组合亲和柱、诸如蛋白A柱(例如，POROS蛋白A色谱))和色谱柱(例如，POROS HS-50阳离子交换色谱)、过滤、超滤、盐析和透析程序来分离和纯化蛋白。
在其他实施方案中，可以破坏宿主细胞，例如通过渗透压休克、超声处理或裂解破坏宿主细胞，以回收表达的蛋白。一旦细胞被破坏，就可以通过离心或过滤除去细胞碎片。在一些情况下，多肽可以与标记序列(诸如肽)缀合以促进纯化。标记氨基酸序列的实例是六组氨酸肽(His-标签)，其以微摩尔亲和力结合镍官能化的琼脂糖亲和柱。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人, Cell 37:767, 1984)。
或者，本发明的多肽可以由受试者(例如，人)的细胞产生，例如，在基因疗法的背景下，通过施用含有编码本发明的多肽的核酸分子的载体(诸如病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，诸如修饰的牛痘病毒Ankara(MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体))来产生。载体，一旦在受试者的细胞内(例如，通过转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射、感染等)，将促进多肽的表达，然后所述多肽从细胞分泌。如果疾病或病症的治疗是期望的结果，则可能不需要进一步行动。如果期望收集蛋白，则可以从受试者收集血液，并且通过本领域中已知的方法从血液纯化蛋白。
VIII. 药物组合物和制剂
本发明的特征在于药物组合物，其包含本文所述的多肽(例如，包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽)。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含具有C-末端延伸(例如，1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸)的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽作为治疗性蛋白。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含与部分(例如，Fc结构域单体或其二聚体、野生型Fc结构域、具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域、白蛋白结合肽、纤连蛋白结构域或血清白蛋白)融合的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽作为治疗性蛋白。在一些实施方案中，包含本发明的多肽的本发明的药物组合物可以与其他药剂(例如，治疗性生物制剂和/或小分子)或组合物组合用于疗法中。除了治疗有效量的多肽以外，所述药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，其可以通过本领域技术人员已知的方法配制。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含编码本发明的多肽的核酸分子(DNA或RNA，例如mRNA)，或含有这种核酸分子的载体。
药物组合物中可接受的载体和赋形剂在所用剂量和浓度下对受体无毒。可接受的载体和赋形剂可以包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES和TAE，抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸，防腐剂，诸如氯化六甲基铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵，蛋白，诸如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖和免疫球蛋白，亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸，和碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨糖醇。本发明的药物组合物可以以可注射制剂的形式肠胃外施用。可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物配制用于注射的药物组合物。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水和细胞培养基(例如Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)，α-改良的Eagles培养基(α-MEM)，F-12培养基)。配制方法是本领域中已知的，参见例如，Banga (编) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (第3版) Taylor & Francis Group, CRC Press(2015)。
本发明的药物组合物可以在微胶囊、诸如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中制备。本发明的药物组合物还可以在其他药物递送系统、诸如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊中制备。此类技术描述于Remington: TheScience and Practice of Pharmacy 第22版(2012)。待用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤而容易地完成。
本发明的药物组合物也可以制备为持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的多肽的固体疏水聚合物的半透性基质。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。一些持续释放制剂使得能够经几个月、例如一至六个月释放分子，而其他制剂释放本发明的药物组合物较短时间段，例如数天至数周。
药物组合物可以根据需要以单位剂型形成。药物制备物中包括的活性成分(例如，本发明的多肽)的量是使得提供指定范围内的合适剂量(例如，0.01-100 mg/kg体重范围内的剂量)。
用于基因疗法的药物组合物可以在可接受的稀释剂中，或者可以包含其中嵌入基因递送载体的缓释基质。如果使用流体动力学注射作为递送方法，则含有编码本文所述的多肽的核酸分子或含有所述核酸分子的载体(例如，病毒载体)的药物组合物以大流体体积静脉内快速递送。可用作体内基因递送媒介物的载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，诸如修饰的牛痘病毒Ankara)、腺相关病毒载体和甲病毒载体。
IX. 途径、剂量和施用
包含本发明的多肽作为治疗性蛋白的药物组合物可以配制用于例如静脉内施用、肠胃外施用、皮下施用、肌内施用、动脉内施用、鞘内施用或腹膜内施用。所述药物组合物还可以配制用于口服、鼻、喷雾、气溶胶、直肠或阴道施用或经由口服、鼻、喷雾、气溶胶、直肠或阴道施用而施用。对于可注射制剂，各种有效的药物载体是本领域中已知的。参见，例如，ASHPHandbook on Injectable Drugs, Toissel, 第18版 (2014)。
在一些实施方案中，包含编码本发明的多肽的核酸分子或含有这种核酸分子的载体的药物组合物可以通过基因递送的方式施用。基因递送的方法是本领域技术人员众所周知的。可用于体内基因递送和表达的载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，诸如修饰的牛痘病毒Ankara (MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体。在一些实施方案中，编码本发明的多肽的mRNA分子可以直接施用于受试者。
在本发明的一些实施方案中，可以使用流体动力学注射平台施用编码本文所述的多肽的核酸分子或含有此类核酸分子的载体。在流体动力学注射方法中，将编码本文所述的多肽的核酸分子置于工程改造的质粒(例如病毒质粒)中的强启动子的控制下。经常以大流体体积静脉内快速递送质粒。流体动力学注射使用静脉中的受控流体动力学压力来增强细胞通透性，使得来自快速注射大流体体积的升高的压力导致流体和质粒从静脉外渗。核酸分子的表达主要由肝脏驱动。在小鼠中，经常通过将质粒注射至尾静脉中来进行流体动力学注射。在某些实施方案中，可以使用流体动力学注射施用编码本文所述的多肽的mRNA分子。
本发明的药物组合物的剂量取决于因素，包括施用途径、待治疗的疾病和受试者的身体特征，例如年龄、体重、总体健康状况。本发明的药物组合物可以包括范围为如下的本发明的多肽的剂量：0.01至500 mg/kg(例如，0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500 mg/kg)，并且在一个更具体实施方案中，约0.1至约30 mg/kg，并且在一个更具体实施方案中，约0.3至约30mg/kg。剂量可以由医师根据常规因素、诸如疾病的程度和受试者的不同参数进行调整。
药物组合物以与剂量制剂相容的方式和导致症状的改善或补救的治疗有效的量施用。药物组合物以各种剂型、例如静脉内剂型、皮下剂型和口服剂型(例如，可摄入的溶液、药物释放胶囊)施用。通常，治疗性蛋白以0.1-100 mg/kg、例如1-50 mg/kg给药。包含本发明的多肽的药物组合物可以施用于有此需要的受试者，例如，每天、每周、每两周、每月、每两月、每季度、每两年、每年一次或多次(例如，1-10次或更多次)，或在医疗上必需时。在一些实施方案中，包含本发明的多肽的药物组合物可以每周、每两周、每月、每两月或每季度施用于有此需要的受试者。剂量可以以单剂量或多剂量方案提供。随着患者的健康状况下降，随着医疗条件改善或增加，施用之间的时机可以减少。
X. 处理方法
本发明基于以下发现：将来自ActRIIb的细胞外部分的氨基酸取代至ActRIIa的细胞外部分中，产生具有改善特性的ActRIIa变体。通过将ActRIIb中的残基引入ActRIIa而生成的ActRIIa变体保留ActRIIa的有益特性，诸如更长的血清半衰期和对BMP9的低结合亲和力，并获得ActRIIb的一些有益特性，诸如增加的与激活素A和B的结合(参见表4)。这些ActRIIa变体特性产生可以治疗性地使用以便与内源性激活素受体竞争配体结合的多肽。由于ActRIIa变体含有所述受体的细胞外部分，它们是可溶的并且能够结合并隔绝配体(例如，激活素A和B、肌肉生长抑制素、GDF11)而不激活细胞内信号传导途径。因此，细胞外ActRIIa变体可用于治疗其中升高的激活素信号传导已牵涉(例如，与激活素受体或激活素受体配体的表达增加相关)的疾病或病况。例如，已发现激活素在骨病中上调并且已知其抑制成骨细胞活性，表明增加的激活素水平导致骨病。因此，用结合激活素并减少其与内源性受体的相互作用的治疗剂的治疗可用于增加骨矿物质密度并治疗具有涉及骨损伤的疾病或病况的受试者。
本发明提供了可用于在有此需要的受试者中增加骨矿物质密度、增加骨形成或减少骨吸收的组合物和治疗方法。在一些实施方案中，所述受试者可以具有导致骨损伤的疾病(例如，骨质疏松症或骨质减少症)。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及影响具有涉及骨损伤的疾病或病况的受试者中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。在一些实施方案中，包含本文所述的细胞外ActRIIa变体的多肽减少或抑制肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9与其受体、例如ActRIIa、ActRIIb和BMPRII (例如，ActRIIa)的结合。在一些实施方案中，影响肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导(例如，减少或抑制肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9与其受体、例如ActRIIa、ActRIIb和BMPRII (例如，ActRIIa)的结合)导致受试者的骨矿物质密度或骨形成增加或受试者的骨吸收减少。
在一些实施方案中，可以将本文所述的多肽(例如，包括细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽)施用于受试者以便在受试者中增加骨矿物质密度、增加骨形成或减少骨吸收，或影响肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。在一些实施方案中，本文所述的方法增加受试者的骨矿物质密度。在一些实施方案中，本文所述的方法不会引起受试者中的任何血管并发症，诸如血管通透性或渗漏增加。在本文所述方法的一些实施方案中，所述受试者具有涉及骨损伤的疾病或病况(例如，原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失)。
本发明还包括通过向受试者施用本文所述的多肽(例如，包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽)来治疗具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失的受试者的方法。在一些实施方案中，所述原发性骨质疏松症是年龄相关或激素相关的骨质疏松症(例如，与雌激素下降相关)。在一些实施方案中，所述继发性骨质疏松症是固定诱导或糖皮质激素诱导的骨质疏松症。在一些实施方案中，所述骨癌是多发性骨髓瘤或所述癌症转移相关的骨损失由多发性骨髓瘤引起。在一些实施方案中，所述治疗相关的骨损失由于用FGF-21或GLP-1治疗、用含有FGF-21或GLP-1的治疗剂治疗或2型糖尿病和/或肥胖症的治疗或由于癌症疗法(例如，化学疗法或放射疗法)而发生。在一些实施方案中，所述饮食相关的骨损失是佝偻病(例如，维生素D缺乏)。在一些实施方案中，所述低重力相关的骨损失缺乏负荷相关的骨损失。
在一些实施方案中，本文所述的多肽(例如，包含细胞外ActRIIa变体(具有SEQ IDNO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽)可用于预防涉及骨损伤的疾病或病况(例如，原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、骨硬化症、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失)的发展和/或治疗已经诊断具有涉及骨损伤的疾病或病况的患者。可以向可能发展涉及骨损伤的疾病或病况的患者，例如具有骨损伤或低骨量的遗传倾向、家族史的个体预防性地施用本文所述的多肽(例如，包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ IDNO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽)，使得所述细胞外ActRIIa多肽可以预防或延迟骨损伤的发展。
在一些实施方案中，可以将本文所述的多肽(例如，包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽)施用于受试者以预防涉及骨损伤的疾病或病况(例如，原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失)的发展和/或治疗具有涉及骨损伤的疾病或病况(例如，原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失)的患者，或影响受试者中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导(例如，减少或抑制激活素、肌肉生长抑制素和/或BMP9与其受体的结合)。在一些实施方案中，本文所述的方法增加骨矿物质密度(例如，增加骨量)。在一些实施方案中，本文所述的方法减少骨吸收(例如，降低骨分解代谢活性)。在一些实施方案中，本文所述的方法增加骨形成(例如，增加骨合成代谢活性或增加骨生成)。在一些实施方案中，本文所述的方法增加成骨细胞活性或成骨细胞生成。在一些实施方案中，本文所述的方法降低破骨细胞活性或破骨细胞生成。在一些实施方案中，本文所述的方法减少或抑制激活素和/或肌肉生长抑制素与其受体的结合。在一些实施方案中，所述方法增加骨形成，增加骨矿物质密度或减少皮质或小梁骨的骨吸收。
在任何本文所述的方法中，进一步包括一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸)的C-末端延伸的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-71(例如，SEQ ID NO:6-71)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽可以用作治疗性蛋白。在任何本文所述的方法中，与Fc结构域单体融合的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-71(例如，SEQ ID NO:6-71)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽的二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)可以用作治疗性蛋白。在任何本文所述的方法中，与部分(例如，野生型Fc结构域、具有氨基酸取代(例如，一个或多个减少二聚化的取代)的Fc结构域、白蛋白结合肽、纤连蛋白结构域或人血清白蛋白)融合的包含细胞外ActRIIa变体(例如，具有SEQ ID NO:1-72(例如，SEQ ID NO:6-72)中的任一个的序列的细胞外ActRIIa变体)的多肽可以用作治疗性蛋白。编码本文所述的多肽的核酸或含有所述核酸的载体也可以根据本文所述的任何方法施用。在任何本文所述的方法中，所述多肽、核酸或载体可以作为药物组合物的一部分施用。
实施例
实施例1-通过表面等离子体共振(SPR)评估ActRIIa变体结合亲和力
Biacore 3000用于测量ActRIIa变体和配体激活素A、激活素B、生长分化因子11(GDF11)和BMP-9之间相互作用的动力学。ActRIIa变体在HEK293细胞中瞬时表达，并使用蛋白-A琼脂糖凝胶色谱法从调节培养基中纯化。将ActRIIa变体在流动室2-4中用捕获抗体(来自GEGE的抗小鼠)固定在芯片(CM4或CM5)上以确保正确定向。流动室1用作参考室以减去任何非特异性结合和体积效应。来自GE Healthcare™的HBS-EP +缓冲液用作运行缓冲液。每种配体以40μl/ min的浓度系列运行以避免质量传递效应。使用BioLogic™软件的Scrubber2分析数据以计算每种相互作用的KD(表4)。
表4：ActRIIa变体与各种配体的结合亲和力(KD)的比较
。
实施例2-细胞外ActRIIa变体对骨矿物质密度的影响
成年雄性C57/BL6小鼠接受假性手术(SHAM)或阉割-手术(ORX)。允许两个手术组在手术后恢复14天。所有动物都圈养在常规的笼子里，可自由获取食物(常规食物)和水。然后将SHAM和ORX动物分配至媒介物处理组(VEH)或ActRII变体处理组，并接受媒介物或ActRII变体(10 mg/kg)的两周一次全身腹膜内施用71天。在治疗时每周两次测量体重。使用MiniSpec LF50 NMR分析仪，在研究第0天，然后在开始处理后第14、28、47和71天分析身体组成。在研究终止日期时，手术移取目标组织(肌肉、脂肪贮库和胫骨)，称重并适当储存用于进一步分析。此时，还检查ORX动物以证实睾丸的完全去除。在终止实验之后，还使用微计算机断层扫描评估各种骨骼的皮质形态测量和小梁结构。
其他实施方案
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但应该理解，其能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖本发明的任何变型、用途或调整，其遵循一般而言本发明的原理且包括属于本发明所属领域内的已知或惯常实践的与本公开的此类偏离，并且可以应用于上文所述的基本特征。
所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用以其整体并入。
其他实施方案在以下权利要求内。

Claims (146)

1.包含细胞外激活素受体IIa型(ActRIIa)变体的多肽，所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLX1X2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9X10X11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX1 7X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ IDNO:1),
其中X1是F或Y；X2是F或Y；X3是E或A；X4是K或L；X5是D或E；X6是R或A；X7是P或R；X8是Y或E；X9是D或E；X10是K或Q；X11是D或A；X12是K或A；X13是R或A；X14是R或L；X15是F或Y；X16是K、R或A；X17是K、A、Y、F或I；X18是Q或K；X19是W或A；X20是L或A；X21是D、K、R、A、F、G、M、N或I；X22是I、F或A；X23是K或T；X24是K或E；X25是D或E；X26是S或N；且X27是E或Q，且
其中所述变体相对于具有SEQ ID NO:73的序列的野生型细胞外ActRIIa或具有SEQ IDNO:76-96的序列中的任一个的细胞外ActRIIa具有至少一个氨基酸取代。
2.权利要求1的多肽，其中所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9KX11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX1 7X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ IDNO:2)。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4X5RTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO:3)。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO:4)。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述变体具有以下序列：
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEPCX8GX9KDKRX14HCFATWKNISGSIEIVKX18GCWLDDINCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS (SEQ ID NO:5)。
6.权利要求1的多肽，其中X1是F。
7.权利要求1的多肽，其中X1是Y。
8.权利要求1、6或7的多肽，其中X10是K。
9.权利要求1、6或7的多肽，其中X10是Q。
10.权利要求1-9中任一项的多肽，其中X2是F。
11.权利要求1-9中任一项的多肽，其中X2是Y。
12.权利要求1、2和6-11中任一项的多肽，其中X3是E。
13.权利要求1、2和6-11中任一项的多肽，其中X3是A。
14.权利要求1-13中任一项的多肽，其中X4是K。
15.权利要求1-13中任一项的多肽，其中X4是L。
16.权利要求1、2、3和6-15中任一项的多肽，其中X5是D。
17.权利要求1、2、3和6-15中任一项的多肽，其中X5是E。
18.权利要求1、2和6-17中任一项的多肽，其中X6是R。
19.权利要求1、2和6-17中任一项的多肽，其中X6是A。
20.权利要求1-4和6-19中任一项的多肽，其中X7是P。
21.权利要求1-4和6-19中任一项的多肽，其中X7是R。
22.权利要求1-21中任一项的多肽，其中X8是Y。
23.权利要求1-21中任一项的多肽，其中X8是E。
24.权利要求1-23中任一项的多肽，其中X9是D。
25.权利要求1-23中任一项的多肽，其中X9是E。
26.权利要求1、2和6-25中任一项的多肽，其中X11是D。
27.权利要求1、2和6-25中任一项的多肽，其中X11是A。
28.权利要求1、2和6-27中任一项的多肽，其中X12是K。
29.权利要求1、2和6-27中任一项的多肽，其中X12是A。
30.权利要求1、2和6-29中任一项的多肽，其中X13是R。
31.权利要求1、2和6-29中任一项的多肽，其中X13是A。
32.权利要求1-31中任一项的多肽，其中X14是R。
33.权利要求1-31中任一项的多肽，其中X14是L。
34.权利要求1-4和6-33中任一项的多肽，其中X15是F。
35.权利要求1-4和6-33中任一项的多肽，其中X15是Y。
36.权利要求1-4和6-35中任一项的多肽，其中X16是K。
37.权利要求1-4和6-35中任一项的多肽，其中X16是R。
38.权利要求1-4和6-35中任一项的多肽，其中X16是A。
39.权利要求1、2和6-38中任一项的多肽，其中X17是K。
40.权利要求1、2和6-38中任一项的多肽，其中X17是A。
41.权利要求1、2和6-38中任一项的多肽，其中X17是Y。
42.权利要求1、2和6-38中任一项的多肽，其中X17是F。
43.权利要求1、2和6-38中任一项的多肽，其中X17是I。
44.权利要求1-43中任一项的多肽，其中X18是Q。
45.权利要求1-43中任一项的多肽，其中X18是K。
46.权利要求1、2和6-45中任一项的多肽，其中X19是W。
47.权利要求1、2和6-45中任一项的多肽，其中X19是A。
48.权利要求1、2和6-47中任一项的多肽，其中X20是L。
49.权利要求1、2和6-47中任一项的多肽，其中X20是A。
50.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是D。
51.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是K。
52.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是R。
53.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是A。
54.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是F。
55.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是G。
56.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是M。
57.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是N。
58.权利要求1、2和6-49中任一项的多肽，其中X21是I。
59.权利要求1-4和6-58中任一项的多肽，其中X22是I。
60.权利要求1-4和6-58中任一项的多肽，其中X22是F。
61.权利要求1-4和6-58中任一项的多肽，其中X22是A。
62.权利要求1-61中任一项的多肽，其中X23是K。
63.权利要求1-61中任一项的多肽，其中X23是T。
64.权利要求1、2、3和6-63中任一项的多肽，其中X24是K。
65.权利要求1、2、3和6-63中任一项的多肽，其中X24是E。
66.权利要求1-65中任一项的多肽，其中X25是D。
67.权利要求1-65中任一项的多肽，其中X25是E。
68.权利要求1-67中任一项的多肽，其中X26是S。
69.权利要求1-67中任一项的多肽，其中X26是N。
70.权利要求1-69中任一项的多肽，其中X27是E。
71.权利要求1-69中任一项的多肽，其中X27是Q。
72.权利要求1-71中任一项的多肽，其中X23是T，X24是E，X25是E，且X26是N。
73.权利要求1-71中任一项的多肽，其中X23是T，X24是K，X25是E，且X26是N。
74.权利要求1-73中任一项的多肽，其中X17是K。
75.权利要求1的多肽，其中所述变体具有SEQ ID NO:6-72中的任一个的序列。
76.权利要求1-75中任一项的多肽，其中位置X24处的氨基酸用氨基酸K替代。
77.权利要求1-75中任一项的多肽，其中位置X24处的氨基酸用氨基酸E替代。
78.权利要求1-77中任一项的多肽，其进一步包含一个或多个氨基酸的C-末端延伸。
79.权利要求78的多肽，其中所述C-末端延伸是NP。
80.权利要求78的多肽，其中所述C-末端延伸是NPVTPK。
81.权利要求1-80中任一项的多肽，其进一步包含通过接头的方式与所述多肽的C-末端融合的Fc结构域单体。
82.权利要求81的多肽，其中所述Fc结构域单体包含SEQ ID NO:97的序列。
83.权利要求1-80中任一项的多肽，其进一步包含通过接头的方式与所述多肽的C-末端融合的野生型Fc结构域。
84.权利要求83的多肽，其中所述野生型Fc结构域包含SEQ ID NO:151的序列。
85.权利要求1-80中任一项的多肽，其进一步包含通过接头的方式与所述多肽的C-末端融合的具有氨基酸取代的Fc结构域。
86.权利要求85的多肽，其中所述Fc结构域不形成二聚体。
87.权利要求1-80中任一项的多肽，其进一步包含通过接头的方式与所述多肽的C-末端融合的白蛋白结合肽。
88.权利要求87的多肽，其中所述白蛋白结合肽包含SEQ ID NO:152的序列。
89.权利要求1-80中任一项的多肽，其进一步包含通过接头的方式与所述多肽的C-末端融合的纤连蛋白结构域。
90.权利要求89的多肽，其中所述纤连蛋白结构域包含SEQ ID NO:153的序列。
91.权利要求1-80中任一项的多肽，其进一步包含通过接头的方式与所述多肽的C-末端融合的人血清白蛋白。
92.权利要求91的多肽，其中所述人血清白蛋白包含SEQ ID NO:154的序列。
93.权利要求81或82的多肽，其中所述多肽形成二聚体。
94.权利要求81-93中任一项的多肽，其中所述接头是氨基酸间隔区。
95.权利要求94的多肽，其中所述氨基酸间隔区是GGG、GGGA (SEQ ID NO:98)、GGGG(SEQ ID NO:100)、GGGAG (SEQ ID NO:130)、GGGAGG (SEQ ID NO:131)或GGGAGGG (SEQ IDNO:132)。
96.权利要求1-95中任一项的多肽，其中所述多肽具有至少7天的血清半衰期。
97.权利要求1-96中任一项的多肽，其中所述多肽以200 pM或更高的KD结合人骨形态发生蛋白9 (BMP9)。
98.权利要求97的多肽，其中所述多肽结合激活素和/或肌肉生长抑制素且与人BMP9的结合减少或微弱。
99.权利要求97或98的多肽，其中所述多肽实质上不结合人BMP9。
100.权利要求1-99中任一项的多肽，其中所述多肽以800 pM或更低的KD结合人激活素A。
101.权利要求1-100中任一项的多肽，其中所述多肽以800 pM或更低的KD结合人激活素B。
102.权利要求1-101中任一项的多肽，其中所述多肽以5 pM或更高的KD结合人GDF-11。
103.核酸分子，其编码权利要求1-102中任一项的多肽。
104.载体，其包含权利要求103的核酸分子。
105.表达权利要求1-102中任一项的多肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含权利要求103的核酸分子或权利要求104的载体，其中所述核酸分子或载体在宿主细胞中表达。
106.制备权利要求1-102中任一项的多肽的方法，其中所述方法包括：
a)提供包含权利要求103的核酸分子或权利要求104的载体的宿主细胞，和
b)在允许形成多肽的条件下在所述宿主细胞中表达所述核酸分子或载体。
107.药物组合物，其包含权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，或权利要求104的载体，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
108.权利要求107的药物组合物，其中所述多肽呈治疗有效量。
109.增加有此需要的受试者中的骨矿物质密度的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
110.减少有此需要的受试者中的骨吸收的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
111.增加有此需要的受试者中的骨形成的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
112.权利要求109-111中任一项的方法，其中所述患者具有原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失。
113.影响具有涉及骨损伤的疾病或病况的受试者中的肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
114.权利要求113的方法，其中所述疾病或病况是原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、骨质减少症、骨硬化症、骨折、骨癌或癌症转移相关的骨损失、佩吉特氏病、肾性骨营养不良、治疗相关的骨损失、饮食相关的骨损失、与肥胖治疗相关的骨损失、低重力相关的骨损失或不动相关的骨损失。
115.治疗具有原发性骨质疏松症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
116.治疗具有继发性骨质疏松症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
117.治疗具有骨质减少症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
118.治疗具有骨折的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
119.治疗具有骨癌或癌症转移相关的骨损失的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
120.治疗具有佩吉特氏病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
121.治疗具有肾性骨营养不良的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
122.治疗具有治疗相关的骨损失的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
123.治疗具有饮食相关的骨损失的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
124.治疗具有低重力相关的骨损失的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
125.治疗具有不动相关的骨损失的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-102中任一项的多肽，权利要求103的核酸分子，权利要求104的载体，或权利要求107或108的药物组合物。
126.权利要求112、114和115中任一项的方法，其中所述原发性骨质疏松症是年龄相关的骨质疏松症。
127.权利要求112、114和115中任一项的方法，其中所述原发性骨质疏松症是激素相关的骨质疏松症。
128.权利要求112、114和116中任一项的方法，其中所述继发性骨质疏松症是固定诱导的骨质疏松症。
129.权利要求112、114和116中任一项的方法，其中所述继发性骨质疏松症是糖皮质激素诱导的骨质疏松症。
130.权利要求112、114和119中任一项的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
131.权利要求112、114和122中任一项的方法，其中所述治疗是FGF-21治疗。
132.权利要求112、114和122中任一项的方法，其中所述治疗是GLP-1治疗。
133.权利要求112、114和122中任一项的方法，其中所述治疗是癌症疗法。
134.权利要求112、114和122中任一项的方法，其中所述治疗是肥胖症或2型糖尿病的治疗。
135.权利要求112、114和123中任一项的方法，其中所述饮食相关的骨损失是佝偻病。
136.权利要求109-135中任一项的方法，其中所述方法增加受试者中的骨形成。
137.权利要求109-136中任一项的方法，其中所述方法减少受试者中的骨吸收。
138.权利要求109-137中任一项的方法，其中所述方法增加成骨细胞活性或成骨细胞生成。
139.权利要求109-138中任一项的方法，其中所述方法减少破骨细胞活性或减少破骨细胞生成。
140.权利要求109-139中任一项的方法，其中所述方法减少或抑制激活素和/或肌肉生长抑制素与其受体的结合。
141.权利要求109-140中任一项的方法，其中所述方法不引起受试者中的血管并发症。
142.权利要求141的方法，其中所述方法不增加血管通透性或渗漏。
143.权利要求109-142中任一项的方法，其中所述方法增加受试者中的骨矿物质密度。
144.权利要求109-143中任一项的方法，其中所述骨是皮质骨。
145.权利要求109-144中任一项的方法，其中所述骨是小梁骨。
146.权利要求109-145中任一项的方法，其中所述多肽、核酸、载体或药物组合物以一定量施用，所述量足以在受试者中增加骨密度，减少骨吸收，降低骨吸收速率，增加骨形成，增加骨形成速率，降低破骨细胞活性，增加成骨细胞活性，或影响肌肉生长抑制素、激活素和/或BMP9信号传导。
CN201780082824.XA 2016-11-10 2017-11-09 激活素受体iia型变体及其使用方法 Pending CN110461349A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662420476P 2016-11-10 2016-11-10
US62/420476 2016-11-10
US201762531943P 2017-07-13 2017-07-13
US62/531943 2017-07-13
PCT/US2017/060970 WO2018089715A1 (en) 2016-11-10 2017-11-09 Activin receptor type iia variants and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110461349A true CN110461349A (zh) 2019-11-15

Family

ID=62109935

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780082790.4A Pending CN110430890A (zh) 2016-11-10 2017-11-09 激活素受体iia型变体及其使用方法
CN201780082824.XA Pending CN110461349A (zh) 2016-11-10 2017-11-09 激活素受体iia型变体及其使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780082790.4A Pending CN110430890A (zh) 2016-11-10 2017-11-09 激活素受体iia型变体及其使用方法

Country Status (7)

Country Link
US (4) US11013785B2 (zh)
EP (2) EP3538123A4 (zh)
JP (4) JP7139326B2 (zh)
CN (2) CN110430890A (zh)
AU (2) AU2017357935B2 (zh)
CA (2) CA3043180A1 (zh)
WO (2) WO2018089706A2 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7280182B2 (ja) 2016-10-05 2023-05-23 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびその使用
US11013785B2 (en) 2016-11-10 2021-05-25 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIA variants and methods of use thereof
WO2019094751A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-16 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
WO2019106592A2 (en) * 2017-11-30 2019-06-06 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Immunoassays and engineered proteins for monitoring antibody treatments to the immune checkpoint inhibitors pd1 and pd-l1
JP2021518745A (ja) 2018-01-12 2021-08-05 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アクチビンｉｉｂ型受容体変異体およびそれらの使用方法
AU2019266314A1 (en) * 2018-05-09 2020-11-19 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
AU2021237730A1 (en) * 2020-03-20 2022-10-06 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type II chimeras and methods of use thereof
EP4230196A1 (en) 2022-02-21 2023-08-23 Som Innovation Biotech, S.A. Compounds for use in the treatment of dystrophinopathies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060068468A1 (en) * 2004-07-23 2006-03-30 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
CN102131515A (zh) * 2008-06-26 2011-07-20 阿塞勒隆制药公司 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
CN103298832A (zh) * 2010-11-08 2013-09-11 阿塞勒隆制药公司 Actriia结合剂及其用途

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
CA3045808C (en) 2005-11-23 2022-08-16 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
WO2007130619A1 (en) 2006-05-03 2007-11-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for regulating osteoclast differentiation, activation and bone resorption
US8895016B2 (en) * 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
ES2415666T3 (es) 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2484372A1 (en) 2007-02-09 2012-08-08 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Promoting Bone Growth in Cancer Patients
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
WO2009015345A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
CA2699936A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
WO2009111793A2 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Myoscience, Inc. Subdermal tissue remodeling using myostatin, methods and related systems
WO2009158025A2 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HRP20230761T1 (hr) 2008-08-14 2023-10-13 Acceleron Pharma Inc. Gdf zamke
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
EA201791940A3 (ru) 2008-11-26 2018-04-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора iib активина и их использование
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
AU2010258931B2 (en) 2009-06-08 2015-04-23 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
US8293881B2 (en) 2009-06-12 2012-10-23 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleic acid encoding a truncated ActRIIB fusion protein
IL287990B (en) 2009-08-13 2022-07-01 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
CN102781518A (zh) 2009-09-09 2012-11-14 阿塞勒隆制药公司 Actriib拮抗剂及其给药和用途
WO2011056896A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
CA2852683A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ineffective erythropoiesis
WO2013074557A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing gdf8 and/or activin a
SG10201605027XA (en) 2011-12-19 2016-08-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
KR101995751B1 (ko) 2012-01-05 2019-07-03 주식회사 와이바이오로직스 Ｄｌｋ１ 세포 외 수용성 도메인을 유효성분으로 포함하는 미오스타틴 저해제
JP2015525230A (ja) 2012-06-11 2015-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド デュアル受容体アンタゴニスト性抗原結合タンパク質およびその使用
WO2014138485A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Irm Llc Ex vivo production of platelets from hematopoietic stem cells and the product thereof
US20160038588A1 (en) 2013-03-15 2016-02-11 Amgen Inc. Myostatin Antagonism in Human Subjects
EP3816625A1 (en) 2013-05-06 2021-05-05 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
TW201920262A (zh) * 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
WO2015108972A1 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
JP2017509647A (ja) 2014-03-21 2017-04-06 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法
EP3808778A1 (en) 2014-04-18 2021-04-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
CA2951926C (en) 2014-06-13 2023-01-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ulcers
TW201625675A (zh) 2014-06-13 2016-07-16 聖塔瑪麗亞生物治療公司 經調配之受體多肽及相關方法
GB201421379D0 (en) 2014-12-02 2015-01-14 Isis Innovation Ltd And Medical Res Council Molecule
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
ES2946160T3 (es) 2014-12-03 2023-07-13 Celgene Corp Antagonistas de activina-ActRII y usos para tratar síndrome mielodisplásico
CN107849114B (zh) * 2015-04-06 2021-08-20 阿塞勒隆制药公司 单臂i型和ii型受体融合蛋白和其用途
SG11201708351XA (en) 2015-04-22 2017-11-29 Alivegen Usa Inc Novel hybrid actriib ligand trap proteins for treating muscle wasting diseases
JP6976859B2 (ja) 2015-05-13 2021-12-08 セルジーン コーポレイション ＡｃｔＲＩＩリガンドトラップを用いたβ−サラセミアの治療
CA2986432A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Celgene Corporation In vitro cell culture methods for beta-thalassemia using activin type ii receptor ligand traps
US11123430B2 (en) 2015-11-04 2021-09-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
EP3380121B1 (en) 2015-11-23 2023-12-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for use in treating eye disorders
AU2017222526A1 (en) 2016-02-22 2018-08-23 Acceleron Pharma Inc. ActRII antagonists for use in increasing immune activity
RS62011B1 (sr) 2016-07-15 2021-07-30 Acceleron Pharma Inc Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije
KR20190040972A (ko) 2016-07-27 2019-04-19 악셀레론 파마 인코포레이티드 골섬유증 치료 방법 및 조성물
AU2017340504A1 (en) 2016-10-05 2019-04-11 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and method for treating kidney disease
JP7280182B2 (ja) 2016-10-05 2023-05-23 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびその使用
JOP20190085A1 (ar) 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة
US11013785B2 (en) * 2016-11-10 2021-05-25 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIA variants and methods of use thereof
CN110461880A (zh) 2016-11-10 2019-11-15 科乐斯疗法公司 Gdnf融合多肽及其使用方法
GB201620119D0 (en) 2016-11-29 2017-01-11 Pharmafox Therapeutics Ag Compounds
WO2018144542A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Acceleron Pharma Inc. TGFβ AND ACTRII ANTAGONISTS FOR USE IN INCREASING IMMUNE ACTIVITY
CA3052625A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating heart failure
WO2019094751A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
JP2021518745A (ja) 2018-01-12 2021-08-05 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アクチビンｉｉｂ型受容体変異体およびそれらの使用方法
AU2019266314A1 (en) 2018-05-09 2020-11-19 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
WO2021189006A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iia variants
AU2021237730A1 (en) 2020-03-20 2022-10-06 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type II chimeras and methods of use thereof
EP4121088A1 (en) 2020-03-20 2023-01-25 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060068468A1 (en) * 2004-07-23 2006-03-30 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
CN102131515A (zh) * 2008-06-26 2011-07-20 阿塞勒隆制药公司 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
CN103298832A (zh) * 2010-11-08 2013-09-11 阿塞勒隆制药公司 Actriia结合剂及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
董瑞等: "骨质疏松症的影响因素及诊断治疗", 《医学综述》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP7379573B2 (ja) 2023-11-14
AU2017357944A1 (en) 2019-06-20
US20190282663A1 (en) 2019-09-19
AU2017357935A1 (en) 2019-06-20
US20190345225A1 (en) 2019-11-14
US11013785B2 (en) 2021-05-25
JP7139326B2 (ja) 2022-09-20
JP2020503262A (ja) 2020-01-30
US20210275637A1 (en) 2021-09-09
EP3538128A4 (en) 2020-07-22
CN110430890A (zh) 2019-11-08
WO2018089706A2 (en) 2018-05-17
WO2018089715A1 (en) 2018-05-17
CA3043184A1 (en) 2018-05-17
JP2022088575A (ja) 2022-06-14
JP2019535268A (ja) 2019-12-12
WO2018089706A3 (en) 2018-09-20
US20240050528A1 (en) 2024-02-15
EP3538123A1 (en) 2019-09-18
AU2017357935B2 (en) 2022-04-28
US11717558B2 (en) 2023-08-08
JP2023181445A (ja) 2023-12-21
JP7051846B2 (ja) 2022-04-11
EP3538123A4 (en) 2020-10-14
EP3538128A2 (en) 2019-09-18
CA3043180A1 (en) 2018-05-17
US11090361B2 (en) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110461349A (zh) 激活素受体iia型变体及其使用方法
US11484573B2 (en) Activin receptor type IIa variants and methods of use thereof
CN102548617B (zh) Bmp‑alk3拮抗剂和促进骨生长的用途
KR20200109330A (ko) 액티빈 수용체 유형 iib 변이체 및 그의 사용 방법
CN105001320A (zh) Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
TW200900076A (en) Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth and treating multiple myeloma
MX2013010011A (es) Agentes de unión biespecífica.
TW201226565A (en) Designer osteogenic proteins
AU2017293778A1 (en) TGF-beta superfamily heteromultimers and uses thereof
CN101370511B (zh) Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
CN110461880A (zh) Gdnf融合多肽及其使用方法
NZ794251A (en) Activin receptor type iia variants and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40015854

Country of ref document: HK