CN102131515A - 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 - Google Patents
激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102131515A CN102131515A CN2009801332800A CN200980133280A CN102131515A CN 102131515 A CN102131515 A CN 102131515A CN 2009801332800 A CN2009801332800 A CN 2009801332800A CN 200980133280 A CN200980133280 A CN 200980133280A CN 102131515 A CN102131515 A CN 102131515A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- actriia
- activin
- polypeptide
- patient
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
在某些方面,本发明提供了用于提高脊椎动物中的红细胞和/或血红蛋白水平的组合物和方法,所述脊椎动物包括啮齿动物和灵长类动物,特别是人。
Description
相关申请
本申请要求2008年6月26日提交的美国临时申请号61/133,368的权益,该申请的说明书在此通过全文引用并入本文。
发明背景
成熟的红细胞(或红血球)负责脊椎动物循环系统中的氧运输。红细胞携带高浓度的血红蛋白,血红蛋白是一种蛋白,其在相对高的氧分压(pO2)下在肺中与氧结合,并将氧送递至具有相对低pO2的身体区域。
成熟的红细胞在称为红细胞生成的过程中由多能造血干细胞产生。在出生后的个体中,红细胞生成主要在骨髓和脾的红髓中进行。各种信号转导途径的协同作用控制细胞增殖、分化、存活和死亡的平衡。在正常条件下,红细胞以可维持体内恒定的红细胞量的速率产生,且反应于各种刺激(包括上升或下降的氧压力或组织需求)可增加或减少其生成。红细胞生成的过程开始于谱系定型的前体细胞的形成,并通过一系列的不同前体细胞类型进行。红细胞生成的最终阶段出现为网织红细胞,其释放进入血流,并失去它们的线粒体和核糖体,同时呈现成熟红细胞的形态。在血液中网织红细胞水平的上升或者网织红细胞:红细胞比例的上升标志着红细胞产生速率的上升。
促红细胞生成素(Epo)被广泛认为是出生后脊椎动物中最重要的红细胞生成的正调节剂。Epo调节对减少的组织氧压力(低氧)和低红细胞水平或低血红蛋白水平的补偿性红细胞生成反应。在人体内,上升的Epo水平可通过刺激骨髓和脾中祖红细胞的生成而促进红细胞的形成。在小鼠中,Epo主要增加脾中的红细胞生成。
医生们采用了各种形式的重组Epo来增加各种临床设置中的红细胞水平,特别用于贫血的治疗。贫血是一种具有较宽定义的状况,其特征在于血液中的血红蛋白或红细胞低于正常水平。在一些情况下中,贫血是由红细胞的生成或存活中的原发性病症所引起的。更常见情况下,贫血继发于其它系统的疾病(Weatherall & Provan
(2000) Lancet 355,1169-1175)。贫血可由红细胞生成速率下降或破坏速率上升所导致,或者由因出血引起的红细胞丢失所导致。贫血可由多种病症引起,所述病症包括,例如,慢性肾功能衰竭、骨髓异常增生综合征、类风湿关节炎以及骨髓移植。
以Epo进行治疗通常可导致健康人在一周中血红蛋白上升约1-3 g/dL。当施用至贫血个体时,该治疗方案通常可提供血红蛋白和红细胞水平的实质上升,并使得生活质量改善和存活时间延长。Epo并非一律有效,许多个体甚至在高剂量下仍然是难治的(Horl等人 (2000) Nephrol Dial
Transplant 15,43-50)。50%以上的癌症患者对Epo的反应不足,大约10%的末期肾疾病患者具有低反应性(Glaspy等人 (1997) J Clin Oncol 15,1218-1234;Demetri等人 (1998) J Clin Oncol 16,3412-3425),以及不到10%的骨髓异常增生综合征患者能够有利地反应(Estey (2003) Curr Opin
Hematol 10,60-67)。一些因素,包括炎症、铁和维生素缺乏、透析不充分、铝毒性以及甲状旁腺功能亢进可预测较差的治疗反应,对Epo耐受的分子机制仍然不清楚。
因此,本公开内容的一个目的是提供提高患者红细胞水平的替代性组合物和方法。
发明概述
本公开内容部分证明激活素拮抗剂以及ActRIIa拮抗剂(统称为“激活素- ActRIIa拮抗剂”)可以用于提高红细胞和血红蛋白水平。本公开内容部分证明了激活素- ActRIIa拮抗剂可以提高红细胞和血红蛋白水平并且也增加骨密度。这种双重作用在具有贫血和骨丢失这两者的患者,例如很多癌患者(其中贫血和骨丢失可以是肿瘤的后果或放疗或化疗的后果)、骨质疏松患者和肾功能衰竭患者中特别有利。具体地,本公开内容证明了ActRIIa的可溶形式充当激活素的抑制剂,并且当体内施用时,提高红细胞水平。尽管可溶性ActRIIa可以通过除激活素拮抗作用之外的机制影响红细胞水平,但本公开内容证明了可以基于激活素拮抗作用或ActRIIa拮抗作用或这两者选择期望的治疗剂。所述药剂统称为激活素-ActRIIa拮抗剂。因此,在某些实施方式中,本公开内容提供了使用激活素-ActRIIa拮抗剂来提高患者中的红细胞和血红蛋白水平并在有需要的患者中治疗与低红细胞或血红蛋白水平相关的病症,或对骨和红细胞产生联合作用的方法,该激活素-ActRII拮抗剂包括,例如,结合激活素的ActRIIa多肽,抗激活素抗体,抗ActRIIa抗体,靶向激活素或ActRIIa的小分子和适体以及减少激活素或ActRIIa的表达的核酸。如美国专利申请系列号11/603,485和公开的专利申请WO 2008/100384 和WO/2007/062188(在此通过引用并入本文)所述,激活素-ActRIIa拮抗剂可用于促进骨生长和提高骨密度。如本文所述,激活素-ActRIIa拮抗剂对红细胞水平的作用相对该种拮抗剂对骨的作用更为快速并在更低剂量下发生。因此,在某些实施方式中,本公开内容提供使用激活素-ActRIIa拮抗剂来提高红细胞或血红蛋白水平,而不引起骨密度显著升高的方法。例如,一种方法可引起小于3%、5%、10%或15%的骨密度增加。这种选择性作用可通过使用例如较低剂量的激活素-ActRIIa拮抗剂、较低给药频率而达到,或通过使用经计算可提供较低血清浓度的剂量和频率下的具有较短血清半衰期的激活素-ActRIIa拮抗剂而达到。此外,考虑到激活素-ActRIIa拮抗剂促进骨生长和提高红细胞水平,本公开内容提高了用于促进骨生长和提高红细胞水平,特别是在患有特征在于贫血和骨丢失的病症的患者中促进骨生长和提高红细胞水平的方法,所述病症例如炎性肠病、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、癌和癌治疗相关的骨丢失和很多形式的肾功能衰竭,包括末期肾疾病。
在某些方面,本公开内容提供多肽,包括与激活素结合的可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽。可将ActRIIa多肽配制成包含该结合激活素的ActRIIa多肽和药学可接受的载体的药物制剂。该结合激活素的ActRIIa多肽可以小于1微摩尔或小于100、10或1纳摩尔的KD与激活素结合。任选地,相对于GDF11和/或GDF8,该结合激活素的ActRIIa多肽选择性地结合激活素,并任选地以比结合GDF11和/或GDF8的KD至少低10倍、20倍或50倍的KD结合激活素。尽管不希望受到特定作用机制的束缚,预期ActRIIa-Fc中这种激活素抑制相对于GDF11/GDF8抑制的选择性程度解释了对骨或红细胞生成的作用,而对肌肉没有一致可测的作用。在许多实施方案中,将选择ActRIIa多肽,从而在达到对红细胞水平的理想作用的剂量下,引起肌肉中小于15%、小于10%或小于5%的增长。在其它实施方案中,对肌肉的作用是可接受的,并且不需要针对其进行选择。如通过大小排阻层析所评估的,该组合物相对于其它多肽成分可具有至少95%的纯度,任选地,该组合物具有至少98%的纯度。用于此类制剂的结合激活素的ActRIIa多肽可以是本文公开的那些多肽的任意种,例如具有(即,包含)选自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列的多肽,或具有(即,包含)与选自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。结合激活素的ActRIIa多肽可包含天然ActRIIa多肽的功能性片段,例如包含选自SEQ ID NOs: 1-3的序列或SEQ ID NO: 2的序列的至少10、20或30个氨基酸,缺乏C-末端10至15个氨基酸(“尾”)的功能性片段。
可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽可包括相对天然存在的ActRIIa多肽在氨基酸序列(例如,在配体结合域)中的一个或多个改变。分别在WO 2006/012627的第59-60页和55-58页(通过引用并入本文)和美国专利序列号12/012,652(通过引用并入本文)中提供了改变的ActRIIa多肽的实例。氨基酸序列中的改变可以例如,当在哺乳动物、昆虫或其它真核细胞中产生时改变多肽的糖基化,或者相对于天然存在的ActRIIa多肽改变多肽的蛋白酶剪切。
结合激活素的ActRIIa多肽可以是融合蛋白,其具有作为一个结构域的ActRIIa多肽(例如,ActRIIa的配体结合部分)和提供理想特性(例如改善的药代动力学、更容易的纯化、对特定组织的靶向等)的一个或多个其它结构域。例如,融合蛋白的结构域可增强以下一项或多项:体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化。结合激活素的ActRIIa融合蛋白可包含提供理想特性(例如改善的药代动力学、改善的溶解度或改善的稳定性)的免疫球蛋白Fc结构域(野生型或突变体)或血清白蛋白或其它多肽部分。在优选的实施方式中,ActRIIa-Fc融合体包含位于Fc结构域和胞外ActRIIa结构域之间的相对非结构化的接头。该非结构化的接头可以是相对不含二级结构的、1、2、3、4或5个氨基酸的人工序列或长度在5到15、20、30、50或更多氨基酸之间的人工序列,或者两者的混合物。接头可富含甘氨酸和脯氨酸残基,并可以例如,含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单序列或苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列(例如,TG4(SEQ ID NO:
15)或SG4(SEQ ID NO:
16)单序列或重复序列)。融合蛋白可包含纯化子序列(subsequence),例如表位标记、FLAG标记、聚组氨酸序列和GST融合体。任选地,可溶性ActRIIa多肽包含选自如下的一种或多种修饰的氨基酸残基:糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸以及与有机衍生剂缀合的氨基酸。药物制剂还可包含一种或多种额外化合物,例如用于治疗骨病症的化合物或用于治疗贫血的化合物。优选地,药物制剂基本不含热原。一般而言,优选在哺乳动物细胞系中表达ActRIIa蛋白,该细胞系合适地介导ActRIIa蛋白的天然糖基化,从而减少患者中的不利免疫应答的可能性。人和CHO细胞系已被成功使用,预期其它常见的哺乳动物表达系统将是有用的。
如本文所述的,ActRIIa蛋白是指具有理想特性的ActRIIa-Fc,所述特性包括在动物模型和人患者中相对GDF8和/或GDF11,对激活素的选择性结合、高亲和力配体结合和大于两周的血清半衰期。在某些实施方式中,本发明提供ActRIIa-Fc多肽和包含此类多肽和药学可接受的赋形剂的药物制剂。
在某些方面,本公开内容提供编码可溶性的结合激活素的ActRIIa多肽的核酸。分离的多核苷酸可包含例如上文所述的可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽的编码序列。例如,分离的核酸可包含编码ActRIIa的胞外域(例如,配体结合域)的序列以及编码ActRIIa的部分或全部跨膜结构域和/或胞质域的序列(除定位在该跨膜结构域或胞质域中或定位在该胞外域与该跨膜结构域或胞质域之间的终止密码子)。例如,分离的多核苷酸可包含全长ActRIIa多核苷酸序列,例如,SEQ ID NO: 4,或ActRIIa的部分截短的形式,例如包含SEQ ID NO: 5的核酸序列的核酸,其对应于ActRIIa的胞外域。所述分离的多核苷酸可以进一步包含在3'-末端之前至少六百个核苷酸处或其它位置的转录终止密码子,从而使该多核苷酸的翻译产生任选地融合至全长ActRIIa的截短部分的胞外域。优选的ActRIIa的核酸序列为SEQ ID NO: 14。本文公开的核酸可以可操作地连接至启动子从而进行表达,且本公开内容提供用此类重组多核苷酸转化的细胞。所述细胞优选为哺乳动物细胞,例如CHO细胞。
在某些方面,本公开内容提供制备可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽的方法。所述方法可包括在合适的细胞,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人细胞中表达本文公开的任意核酸(例如,SEQ ID NO: 4、5或14)。此类方法可包括:a)在适于表达所述可溶性ActRIIa多肽的条件下培养细胞,其中用可溶性ActRIIa表达构建体转化所述细胞;和b)回收如此表达的可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRIIa多肽可作为粗制的、部分纯化的或高度纯化的级分回收。可通过一系列纯化步骤实现纯化,所述纯化步骤包括例如,任意顺序的如下步骤中的一个、两个或三个或更多个:蛋白A层析、阴离子交换层析(例如Q琼脂糖)、疏水作用层析(例如苯基琼脂糖)、大小排阻层析以及阳离子交换层析。可溶性ActRIIa可以配制为液体或固体(如冻干的)形式。
在某些方面,本文公开的激活素-ActRII拮抗剂可用于在受试者中促进红细胞产生或提高红细胞水平的方法中。在某些实施方式中,本公开内容提供了在有需要的患者中治疗与低红细胞计数或低血红蛋白水平相关的病症(例如,贫血)的方法。方法可包括给有需要的受试者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂。在某些实施方案中,本公开内容提供了在有需要的患者中提高红细胞水平和骨形成的方法。方法可以包括给有需要的受试者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂。在某些实施方案中,本公开内容证明了,在啮齿动物中,激活素-ActRIIa拮抗剂主要通过对脾的作用提高祖红细胞水平。因此,本公开内容提供了增加从脾释放红细胞的方法,该方法包括给患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂。在某些方面,所述公开内容提供了激活素-ActRIIa拮抗剂在制备用于治疗本文描述的病症或状况的药物中的用途。
在某些方面,所述公开内容提供了鉴定刺激红细胞产生的药剂的方法。所述方法包括:a) 鉴定结合激活素或ActRIIa多肽的配体结合域的测试药剂;以及b) 评估所述药剂对红细胞、血红蛋白水平和/或红细胞前体水平(例如,网织红细胞水平)的作用。
附图简述
图1显示了在CHO细胞中表达的ActRIIa-hFc的纯化。所述蛋白纯化为单一的、充分确定的峰,其通过大小区分柱(sizing column)(左图)和考马斯染色的SDS-PAGE(右图)显现(左泳道:分子量标准;右泳道:ActRIIa-hFc)。
图2显示了通过BiaCoreTM测定而测量的ActRIIa-hFc与激活素及GDF-11的结合。
图3显示了ActRIIa-hFc对雌性非人灵长类动物的红细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天用安慰剂或l mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治疗雌性猕猴(四组,每组五只猴)。图3A显示红细胞(RBC)计数。图3B显示血红蛋白水平。统计学显著性是相对于每个治疗组的基线。在第57天,每个组保留两只猴。
图4显示了ActRIIa-hFc对雄性非人灵长类动物的红细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天用安慰剂或l mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治疗雄性猕猴(四组,每组五只猴)。图4A显示红细胞(RBC)计数。图4B显示血红蛋白水平。统计学显著性是相对于每个治疗组的基线。在第57天,每个组保留两只猴。
图5显示了ActRIIa-hFc对雌性非人灵长类动物的网织红细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天用安慰剂或l mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治疗猕猴(四组,每组五只猴)。图5A显示绝对网织红细胞计数。图5B显示网织红细胞相对于RBC的百分比。统计学显著性是相对于每个组的基线。在第57天,每个组保留两只猴。
图6显示了ActRIIa-hFc对雌性非人灵长类动物的网织红细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天用安慰剂或l mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治疗猕猴(四组,每组五只猴)。图6A显示绝对网织红细胞计数。图6B显示网织红细胞相对于RBC的百分比。统计学显著性是相对于每个组的基线。在第57天,每个组保留两只猴。
图7显示了实施例5中描述的人类临床试验所得的结果,其中曲线下面积(AUC)和ActRIIa-hFc的施用剂量具有线性关系,而与ActRIIa-hFc是通过静脉内(IV)施用还是皮下(SC)施用无关。
图8显示了IV或SC施用的患者中的ActRIIa-hFc血清水平的比较。
图9显示了反应于不同剂量水平的ActRIIa-hFc的骨碱性磷酸酶(BAP)水平。BAP是合成代谢骨生长的标志。
图10描绘了从实施例5所述人临床试验的血细胞比容水平基线的中值改变。ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。
图11描绘了从实施例5所述人临床试验的血红蛋白水平基线的中值改变。ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。
图12描绘了从实施例5所述人临床试验的RBC(红细胞)计数基线的中值改变。ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。
图13描绘了从实施例5所述人临床试验的网织红细胞计数基线的中值改变。ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。
图14显示了具有本文推测的残基的人ActRIIA和ActRIIB的比对,所述推测是基于用方框表示的、直接接触配体的多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构(配体结合袋)的复合分析。
图15显示化疗诱导的贫血的小鼠模型中ActRIIA-mFc对血细胞比容的作用。数据是平均值± SEM。 *,在同一时间点与载体相比P < 0.05。在化疗前单剂ActRIIA-mFc防止了原本会在施用化疗剂紫杉醇后观察到的血细胞比容水平的下降。
图16显示化疗诱导的贫血的小鼠模型中ActRIIA-mFc对血细胞比容的剂量依赖性作用。数据是平均值± SEM。**, 在同一时间点与载体相比P < 0.01; ***, 在同一时间点与载体相比P < 0.001。在施用紫杉醇2周后,ActRIIA-mFc治疗提高了血细胞比容水平,该提高是剂数的函数。
图17显示慢性肾疾病的部分肾切除的(NEPHX)小鼠模型中ActRIIA-mFc对血细胞比容的作用。数据是平均值± SEM。 *,在同一时间点与载体相比P < 0.05。ActRIIA-mFc治疗防止了原本会在4周时观察到的血细胞比容水平的下降,并且在8周时产生了血细胞比容的有益趋势。
发明详述
1.
综述
转化生长因子-β (TGF-β)超家族包含多种生长因子,它们具有共同的序列元件和结构基序。已知这些蛋白在脊椎动物和无脊椎动物中对多种细胞类型施加生物作用。该超家族的成员在胚胎发育过程中在模式形成和组织特化方面行使重要功能,并且能够影响多种分化过程,包括脂肪生成、肌发生、软骨发生、心脏生成、血细胞生成、神经发生和上皮细胞分化。该家族分成两大分支:BMP/GDF 和TGF-β/激活素/BMP10分支,其成员具有多样的,通常互补的作用。通过操纵TGF-β家族成员的活性,通常可以导致生物中的显著生理学改变。例如,皮埃蒙特和比利时蓝牛品种携带GDF8(也称作肌肉抑制素)基因中的功能丧失突变,其导致肌肉量的显著增加。Grobet等人, Nat Genet. 1997, 17(1):71-4。此外,在人类中,GDF8的无活性等位基因与增加的肌肉量相关,并且,据报道,与优越的强度相关。Schuelke等人, N Engl J Med 2004,
350:2682-8。
激活素是二聚多肽生长因子,其属于TGF--β超家族。存在三种主要的激活素形式(A,B和AB),其为两种密切相关的β亚基的同/异二聚体(分别为βAβA,βBβB和βAβB)。人基因组还编码激活素C和激活素E,它们主要在肝中表达,同样已知包括βc或βe的异二聚体形式。在TGF-β超家族中,激活素是独特的和多功能的因子,它能刺激卵巢和胎盘细胞中的激素生成,支持神经元细胞存活,根据细胞类型正面或负面影响细胞周期进程,并至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层的分化(DePaolo等人,1991,Proc Soc Ep Biol Med.
198:500-512;Dyson等人,1997,Curr Biol. 7:81-84;Woodruff,1998,Biochem Pharmacol.
55:953-963)。此外,业已发现从刺激后的人单核细胞白血病细胞中分离的红细胞分化因子(EDF)与激活素A相同(Murata等人,1988,PNAS,85:2434)。业已表明激活素A促进骨髓中的红细胞生成。在一些组织中,激活素信号传导被它的相关异二聚体,即抑制素所拮抗。例如,在从脑垂体释放促卵泡激素(FSH)的过程中,激活素促进FSH分泌和合成,而抑制素阻止FSH的分泌和合成。其它可调节激活素生物活性和/或结合激活素的蛋白包括促滤泡素抑制素(FS)、促滤泡素抑制素相关蛋白(FSRP)和α2-巨球蛋白。
TGF-β信号由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物介导,该复合物在受到配体刺激时磷酸化和激活下游Smad蛋白(Massagué,2000,Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
1 :169-178)。这些I型和II型受体为跨膜蛋白,由具有富含半胱氨酸的区域的结合配体的胞外域、跨膜结构域、具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的胞质域所组成。I型受体为信号传导所必需;在结合配体和I型受体的表达中需要II型受体。I和II型激活素受体在配体结合后形成稳定的复合物,导致I型受体被II型受体磷酸化。
两种相关的II型受体(ActRII),即ActRIIa和ActRIIb已被鉴定为激活素的II型受体(Mathews和Vale,1991 ,Cell 65:973-982;Attisano等人,1992,Cell 68: 97-108)。除了激活素外,ActRIIa和ActRIIb能够与一些其它的TGF-β家族蛋白(包括BMP7、Nodal、GDF8和GDF11)进行生物化学相互作用(Yamashita等人,1995,J. Cell Biol. 130:217-226;Lee和McPherron,2001 ,Proc. Natl. Acad. Sci.
98:9306-9311 ;Yeo和Whitman,2001 ,Mol. Cell 7: 949-957;Oh等人,2002,Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4是激活素(特别是激活素A)的主要的I型受体,而ALK-7也可作为激活素(特别是激活素B)的受体。
如本文所证实,相对其它TGF-b家族成员(例如GDF8或GDF11)显示与激活素A的结合的实质优先性的可溶性ActRIIa多肽(sActRIIa)能够有效提高体内红细胞水平。尽管不希望受限于任何具体机理,考虑到在这些研究中所用的具体sActRIIa构建体所显示的极强激活素结合(皮摩尔解离常数),预期sActRIIa的作用主要由激活素拮抗剂作用所引起。不考虑机理,从本公开内容可显而易见地看出:ActRIIa-激活素拮抗剂提高了啮齿动物、猴和人的红细胞水平。应指出:血细胞生成是一种复杂的过程,它受到多种因素的调节,包括促红细胞生成素、G-CSF和铁的体内稳态。术语“提高红细胞水平”和“促进红细胞形成”指临床可观察的度量,例如血细胞比容、红细胞计数和血红蛋白测量值,其意在对于发生该种改变的机理是中立的。
本文报道的关于非人类灵长类动物的数据也可在小鼠、大鼠和人中重复,因此,本公开内容提供了采用ActRII多肽和其它激活素- ActRII拮抗剂在从啮齿动物到人的哺乳动物中促进红细胞生成和提高红细胞水平的方法。激活素-ActRIIa拮抗剂包括,例如,结合激活素的可溶性ActRIIa多肽、结合激活素(特别是激活素A和B亚基,也称为βA和βB)并破坏ActRIIa结合的抗体、结合ActRIIa并破坏激活素结合的抗体、选择用于激活素或ActRIIa结合的非抗体蛋白(此类蛋白及其设计和选择的方法的实例参见例如WO/2002/088171、WO/2006/055689和WO/2002/032925)、选择用于激活素或ActRIIa结合的随机化的肽,其通常附着在Fc结构域上。具有激活素或ActRIIa结合活性的两种不同蛋白(或其它部分),特别是分别阻断I型(例如可溶性I型激活素受体)和II型(例如可溶性II型激活素受体)结合位点的激活素结合剂,可连接在一起建立双功能结合分子。抑制该激活素-ActRIIa信号传导轴的核酸适体、小分子和其它试剂也包括为激活素-ActRIIa拮抗剂。多种蛋白具有激活素-ActRIIa拮抗剂活性,包括抑制素(即抑制素α亚基)(尽管抑制素并不在所有的组织中普遍拮抗激活素)、促滤泡素抑制素(例如促滤泡素抑制素-288和促滤泡素抑制素-315)、FSRP、FLRG、激活素C、α(2)-巨球蛋白、以及M108A(在位置108处由甲硫氨酸改变为丙氨酸)突变激活素A。一般而言,激活素的替代形式(特别是在I型受体结合域中具有改变的那些形式)能够结合II型受体且不能形成活性三元复合物,因此充当拮抗剂。此外,抑制激活素A、B、C或E或者特别是抑制ActRIIa表达的核酸,例如反义分子、siRNA或核酶可被用作激活素-ActRII拮抗剂。相对于其它TGF-b家族成员,特别是相对于GDF8和GDF11,待使用的激活素-ActRIIa拮抗剂可对抑制激活素介导的信号传导显示选择性。
在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定的上下文中,在本说明书中所用的术语通常具有其在本领域中的普通含义。在下文以及说明书的其它部分讨论了某些术语,以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们的方面为从业者提供额外的指导。术语的任何使用范围或含义将从使用该术语的特定上下文显而易见。
“约”和“大约”一般应表示考虑到测量法的性质和精确性,测得的量的可接受误差程度。典型地,示例性误差程度为在给定的数值或数值范围的20%以内,优选在10%以内,更优选在5%以内。
或者,特别是在生物系统中,术语“约”和“大约”可表示在一定数量级内,优选在给定值的5倍以内,更优选在2倍以内的值。除非另有说明,本文给出的数量为近似值,表示在未明确指出时,可推出术语“约”或“大约”。
本发明的方法可包括对序列彼此比较的步骤,包括将野生型序列与一种或多种突变体(序列变体)进行比较。此类比较通常包括聚合物序列的比对,例如,采用本领域熟知的序列比对程序和/或算法(例如,稍加举例,BLAST、FASTA和MEGALIGN)进行。本领域技术人员可容易地理解:在此类比对中,当突变包含残基插入或缺失时,该序列比对将在不包含该插入或缺失的残基的聚合物序列中引入“空位”(通常由破折号或“A”表示)。
以及其所有的语法形式和拼写变化表示的“同源性”均指具有“共同进化起源”的两种蛋白(包括来自相同生物物种的超家族的蛋白,以及来自不同生物物种的同源性蛋白)之间的关系。此类蛋白(及其编码核酸)具有序列同源性,这反映在它们的序列相似性,不管是在同一性百分比方面还是在特定残基或基序以及保守位置的存在方面。
以其所有的语法形式表示的术语“序列相似性”指可共有或可不共有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度。
然而,在通常的使用以及在本申请中,当术语“同源性”被副词例如“高度”修饰时,可表示序列相似性,并可涉及或可不涉及共同进化起源。
2. ActRIIa 多肽
在某些方面,本发明涉及ActRIIa多肽。本文所用的术语“ActRIIa”指来自任意物种的IIa型激活素受体(ActRIIa)蛋白以及通过诱变或其它修饰从所述ActRIIa蛋白衍生的变体的家族。本文提及ActRIIa时,应理解为提及目前鉴定的形式中的任意一种。该ActRIIa家族的成员通常为跨膜蛋白,由具有富含半胱氨酸的区域的配体结合胞外域、跨膜结构域以及具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质域组成。
术语“ActRIIa多肽”包括包含ActRIIa家族成员的任何天然存在的多肽及其保留了有用活性的任意变体(包括突变体、片段、融合物以及肽模拟(peptidomimetic)形式)的多肽。参见,例如WO/2006/012627。例如,ActRIIa多肽包括由任意已知ActRIIa的序列所衍生的、具有与ActRIIa多肽的序列有至少约80%同一性、任选至少85%、90%、95%、97%、99%或更高同一性的序列的多肽。例如,本发明的ActRIIa多肽可结合ActRIIa蛋白和/或激活素并抑制其功能。可针对在体内促进红细胞形成的活性选择ActRIIa多肽。ActRIIa多肽的实例包括人ActRIIa前体多肽(SEQ ID NO: 1)和可溶性人ActRIIa多肽(例如,SEQ ID NOs: 2、3、7和12)。
人ActRIIa前体蛋白序列如下:
信号肽以单下划线表示;胞外域以粗体表示,而潜在的N-连接的糖基化位点以双下划线表示。
人ActRIIa可溶性(细胞外)、加工的多肽序列如下:
胞外域的C-末端“尾”以下划线表示。去除“尾”的序列(Δ15序列)如下所示:
编码人ActRIIa前体蛋白的核酸序列如下所示(Genbank 条目NM_001616的核苷酸164-1705):
编码人ActRIIa可溶性(细胞外)多肽的核酸序列如下:
在特定实施方案中,本发明涉及可溶性ActRIIa多肽。本文所述的术语“可溶性ActRIIa多肽”通常指包含ActRIIa蛋白的胞外域的多肽。本文所用的术语“可溶性ActRIIa多肽”包括任何天然存在的ActRIIa蛋白及其任何变体(包括突变体、片段以及肽模拟形式)的胞外域。结合激活素的ActRIIa多肽是一种保留了与激活素(包括例如,激活素AA、AB、BB或包含C或E亚基的形式)结合的能力的多肽。结合激活素的ActRIIa多肽将任选以1 nM或更小的解离常数与激活素AA结合。ActRIIa蛋白的胞外域与激活素结合,并通常在生理条件下是可溶的,因此可被称为可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽。可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽的实例包括SEQ ID NOs: 2、3、7、12和13所示的可溶性多肽。SEQ ID NO:7被称为ActRIIa-hFc,并在实施例中进一步描述。可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽的其它实例除ActRIIa蛋白的胞外域以外还包含信号序列,例如,蜜蜂蜂毒肽前导序列(SEQ ID NO: 8)、组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO: 9)或天然ActRIIa前导序列(SEQ ID NO: 10)。在SEQ ID NO: 13中所示的ActRIIa-hFc多肽采用TPA前导序列。
活性ActRIIa变体蛋白的通式是分别包含SEQ ID No. 2的氨基酸12-82的通式,但任选分别在范围是1-5或3-5的位置开始,在范围是110-116或110-115的位置终止,并且在配体结合袋中包含不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸改变,并且在配体结合袋中的40、53、55、74、79 和/或82位包含0、1或更多个非保守改变。这样的蛋白可以包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸29-109的序列保持大于80%、90%、95%或99%的序列同一性的氨基酸序列。
ActRIIa多肽的功能活性片段可通过筛选从编码ActRIIa多肽的核酸的相应片段重组产生的多肽获得。此外,可采用本领域已知技术(如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学)来化学合成片段。可(通过重组或化学合成)产生片段并进行测试,以鉴定能够充当ActRIIa蛋白或激活素介导的信号传导的拮抗剂(抑制剂)的那些肽基片段。
ActRIIa多肽的功能活性变体可通过筛选从编码ActRIIa多肽的相应诱变核酸重组产生的经修饰的多肽文库获得。可产生变体并进行测试,以鉴定能够充当ActRIIa蛋白或激活素介导的信号传导的拮抗剂(抑制剂)的那些变体。在某些实施方案中,ActRIIa多肽的功能变体包含与选自SEQ ID NO: 2或3的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些情况下,该功能变体具有与选自SEQ ID NO: 2或3的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
功能变体可通过为诸如增强疗效或稳定性(例如,离体保质期以及对体内蛋白水解降解的耐受性)等目的对ActRIIa多肽的结构进行修饰来生成。在经选择而保留激活素结合时,此类修饰的ActRIIa多肽被认为是天然存在的ActRIIa多肽的功能等价物。修饰的ActRIIa多肽还可通过例如,氨基酸取代、去除或添加来产生。例如,可以合理预期单独以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、以谷氨酸取代天冬氨酸、以丝氨酸取代苏氨酸或以结构相关氨基酸进行的类似氨基酸取代(例如,保守突变)将不对所得分子的生物活性产生较大的影响。保守取代是发生在侧链相关的氨基酸家族内的那些取代。在ActRIIa多肽的氨基酸序列中的改变是否产生功能性同源物可通过评估变体ActRIIa多肽以类似于野生型ActRIIa多肽的方式在细胞中产生应答的能力容易地测定。
在某些实施方案中,本发明考虑ActRIIa多肽的特定突变,从而改变该多肽的糖基化。可对此类突变进行选择,以便引入或消除一个或多个糖基化位点,例如O-连接的或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺-连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列,即天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸(其中“X”为任意氨基酸),其被适当的细胞糖基化酶特异性识别。还可通过对野生型ActRIIa多肽序列进行一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加或取代(对于O-连接的糖基化位点)来进行这种改变。在糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置之一或两者进行的多种氨基酸取代或去除(和/或在第二位的氨基酸去除)导致在修饰的三肽序列处的非糖基化。增加ActRIIa多肽上的碳水化合物部分的数量的另一种方式是通过将糖苷化学或酶促偶联至该ActRIIa多肽。根据所用的偶联模式,糖可被连接至(a)精氨酸和组氨酸;(b)游离羧基基团;(c)游离巯基基团,例如半胱氨酸中的那些;(d)游离羟基基团,例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸中的那些;(e)芳族残基,例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些;或者(f)谷氨酰胺中的酰胺基团。可化学和/或酶促实现将存在于ActRIIa多肽上的一个或多个碳水化合物部分去除。化学去糖基化可涉及,例如,将ActRIIa多肽暴露至化合物三氟甲磺酸或等同的化合物。该处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外大部分或全部糖的裂解,同时保持氨基酸序列完整。ActRIIa多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过采用Thotakura等人 (1987) Meth. Enzymol.
138:350所述的多种内切和外切糖苷酶来实现。适当时,ActRIIa多肽的序列可根据所用表达系统的类型进行调整,因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞均可导入可受到肽的氨基酸序列影响的不同的糖基化模式。一般而言,虽然其它的哺乳动物表达细胞系也预期有用,但是用于人类的ActRIIa蛋白可在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系(例如HEK293或CHO细胞系)中表达。可以使用其它非哺乳动物细胞系(如酵母、大肠杆菌、昆虫细胞),并且在某些情况下,所述细胞系可以工程化,以包括在表达的蛋白上赋予哺乳动物型糖基化模式的酶。
本公开内容进一步考虑生成突变体的方法,特别是生成ActRIIa多肽的组合突变体组和截短突变体的方法;组合突变体集合对于鉴定功能性变体序列特别有用。筛选此类组合文库的目的可以是生成例如结合激活素或其它配体的ActRIIa多肽变体。下文提供了多种筛选测定,此类测定可用于评估变体。例如,可针对结合ActRIIa配体、防止ActRIIa配体与ActRIIa多肽结合或者干扰ActRIIa配体引起的信号传导的能力筛选ActRIIa多肽变体。
ActRIIa多肽或其变体的活性也可在基于细胞的测定或体内测定中进行测试。例如,可以评估ActRIIa多肽变体对参与血细胞生成的基因的表达的作用。根据需要,这可以在一种或多种重组ActRIIa配体蛋白(例如激活素)的存在下进行,且可转染细胞以产生ActRIIa多肽和/或其变体,以及任选产生ActRIIa配体。同样地, 可给小鼠或其它动物施用ActRIIa多肽,并可评估一种或多种血液测量值,例如RBC计数、血红蛋白或网织红细胞计数。
可生成相对于天然存在的ActRIIa多肽具有选择性效力或通常具有增加的效力的组合衍生的变体。同样地,诱变可以产生变体,该变体的胞内半衰期明显不同于相应的野生型ActRIIa多肽。例如,改变的蛋白可变得对于蛋白水解降解或导致天然ActRIIa多肽破坏或以其它方式灭活的其它细胞过程更加稳定或更加不稳定。这些变体以及编码它们的基因可用于通过调节ActRIIa多肽的半衰期来改变ActRIIa多肽水平。例如,短的半衰期可以产生更为短暂的生物效应,并且,对于可诱导的表达系统的部分,可允许对细胞中重组ActRIIa多肽水平的更紧密控制。在Fc融合蛋白中,可在接头(如有)和/或Fc部分进行突变以改变该蛋白的半衰期。
组合文库可通过编码多肽文库的基因的简并文库产生,其中每个多肽包含潜在ActRIIa多肽序列的至少一部分。例如,可将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接至基因序列,从而使潜在ActRIIa多肽核苷酸序列的简并组能表达为单个多肽,或者替代性地,表达为更大的融合蛋白组(例如用于噬菌体展示)。
可通过多种方式从简并寡核苷酸序列生成潜在同源物的文库。简并基因序列的化学合成可在自动化DNA合成仪中进行,然后合成的基因可被连接至适当的载体进行表达。简并寡核苷酸的合成已为本领域熟知(例如参见Narang,SA (1983) Tetrahedron 39:3;Itakura等人,(1981) Recombinant DNA,Proc. 3rd Cleveland
Sympos. Macromolecules,ed. AG Walton,Amsterdam: Elsevier pp273-289;Itakura等人,(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323;Itakura等人,(1984) Science 198:1056;Ike等人,(1983) Nucleic Acid Res.
11:477)。该种技术已经被用于其它蛋白的直接进化中(例如参见Scott等人,(1990) Science 249:386-390;Roberts等人,(1992) PNAS USA
89:2429-2433;Devlin等人,(1990) Science 249:
404-406;Cwirla等人,(1990) PNAS USA 87:
6378-6382;以及美国专利号5,223,409、5,198,346和5,096,815)。
替代性地,可采用其它的诱变形式来生成组合文库。例如,可使用如下方式生成ActRIIa多肽变体和通过筛选从文库中分离ActRIIa多肽变体:例如,丙氨酸扫描诱变等(Ruf等人,(1994) Biochemistry
33:1565-1572;Wang等人,(1994) J. Biol. Chem.
269:3095-3099;Balint等人,(1993) Gene 137:109-118;Grodberg等人,(1993) Eur. J. Biochem.
218:597- 601 ;Nagashima等人,(1993) J. Biol. Chem.
268:2888-2892;Lowman等人,(1991) Biochemistry
30:10832-10838;以及Cunningham等人,(1989) Science
244:1081-1085)、接头扫描诱变(Gustin等人,(1993) Virology
193:653-660;Brown等人,(1992) Mol. Cell Biol.
12:2644-2652;McKnight等人,(1982) Science 232:316)、饱和诱变(Meyers等人,(1986) Science 232:613)、PCR诱变(Leung等人,(1989) Method Cell Mol
Biol 1 : 11-19);或者随机诱变,包括化学诱变等(Miller等人,(1992) A Short Course in
Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY;以及Greener等人,(1994) Strategies in Mol
Biol 7:32-34)。接头扫描诱变,特别是以组合设置,是一种具有吸引力的鉴定ActRIIa多肽的截短(生物活性)形式的方法。
本领域已知多种用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物的技术,并且,因此,已知筛选cDNA文库得到具有某种性质的基因产物的技术。这些技术通常可适用于通过ActRIIa多肽的组合诱变生成的基因文库的快速筛选。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将该基因文库克隆进入可复制表达载体,用所得的载体文库转化适当的细胞,并在所需活性的检测促进编码基因(检测其产物)的载体相对容易分离的条件下表达该组合基因。优选的测定包括激活素结合测定和激活素介导的细胞信号传导测定。
在某些实施方案中,除ActRIIa多肽中天然存在的任意修饰之外,本发明的ActRIIa多肽可进一步包括翻译后修饰。这些修饰包括,但不限于,乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。其结果是,修饰的ActRIIa多肽可包含非氨基酸元件,例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖以及磷酸酯。该种非氨基酸元件对ActRIIa多肽功能性的作用可按照本文针对其它ActRIIa多肽变体描述的方法进行测试。当ActRIIa多肽通过裂解ActRIIa多肽的新生形式在细胞中产生时,翻译后加工也可能对该蛋白正确的折叠和/或功能是重要的。不同的细胞(例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)对这种翻译后活动具有特异性的细胞结构和特征机制,并可以进行选择以确保该ActRIIa多肽的正确修饰和加工。
在某些方面,ActRIIa多肽的功能性变体或修饰形式包括具有ActRIIa多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白。熟知的这种融合结构域的实例包括,但不限于,聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构域来赋予所需的特性。例如,有些融合结构域对于通过亲和层析分离该融合蛋白特别有用。针对进行亲和纯化的目的,可使用亲和层析的相关基质,例如谷胱甘肽-、淀粉酶-、以及镍-或钴-缀合的树脂。该类基质中许多可以“试剂盒”形式获得,例如可与(HIS6)融合配偶体一起使用的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpress™系统(Qiagen)。作为另一实例,可选择融合结构域以促进该ActRIIa多肽的检测。该种检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如,GFP)以及“表位标记”,其通常为能够获得特异性抗体的短肽序列。可容易地获得特异性单克隆抗体的熟知表位标记包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标记。在一些情况下,融合结构域具有蛋白酶切割位点,例如Xa因子和凝血酶的切割位点,其允许相关的蛋白酶部分消化该融合蛋白,从而由其释放重组蛋白。该释放的蛋白可随后通过后续的层析分离从该融合结构域分离出来。在某些优选实施方案中,ActRIIa多肽与在体内稳定该ActRIIa多肽的结构域(“稳定剂”结构域)相融合。“稳定”表示增加血清半衰期的任意情况,而不论它是由破坏减少、肾清除率降低或其它药代动力学作用所引起。与免疫球蛋白的Fc部分的融合体已知能对多种蛋白赋予所需药代动力学特性。来自免疫球蛋白,特别是IgG重链的恒定区也可以用作稳定结构域。同样地,与人血清白蛋白的融合体可赋予期望的特性。可供选择的其它融合结构域类型包括多聚化(例如,二聚化、四聚化)结构域和功能性结构域(其赋予附加的生物功能,如肌肉生长的进一步刺激)。
作为一个特定实例,本发明提供了包含与Fc结构域融合的ActRIIa的可溶胞外域的融合蛋白。IgG1 Fc结构域的一个实例如下所示(SEQ ID NO: 6)。
任选地,该Fc结构域在诸如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434的残基具有一个或多个突变。在某些情况下,具有一个或多个所述突变(例如Asp-265突变)的突变体Fc结构域与Fcγ受体的结合能力相对于野生型Fc结构域有所下降。在其它情况下,具有一个或多个所述突变(例如Asn-434突变)的突变体Fc结构域与I类MHC相关的Fc受体(FcRN)的结合能力相对于野生型Fc结构域有所上升。也可以使用来自IgG2、IgG3和IgG4的Fc结构域。
可以理解该融合蛋白的不同元件可以与所需功能性一致的任意方式排列。例如,ActRIIa多肽可置于异源结构域的C-末端,或者替代地,异源结构域可置于ActRIIa多肽的C-末端。该ActRIIa多肽结构域和该异源结构域无需在融合蛋白中彼此相邻,并且在任一结构域的C-或N-末端或者在结构域之间可包含另外的结构域或氨基酸序列。
在某些实施方案中,本发明的ActRIIa多肽包含能够稳定该ActRIIa多肽的一种或多种修饰。例如,这些修饰提高ActRIIa多肽的体外半衰期,提高ActRIIa多肽的循环半衰期或减少ActRIIa多肽的蛋白酶水解降解。这些稳定化修饰包括,但不限于,融合蛋白(包括,例如,包含ActRIIa多肽和稳定剂结构域的融合蛋白)、糖基化位点的修饰(包括,例如,向ActRIIa多肽添加糖基化位点)以及碳水化合物部分的修饰(包括,例如,从ActRIIa多肽除去碳水化合物部分)。本文所用的术语“稳定剂结构域”不仅指融合蛋白情况下的融合结构域(例如Fc),还包括非蛋白质性质的修饰,例如碳水化合物部分,或非蛋白质性质的部分,例如聚乙二醇。
在某些实施方案中,本文使得可以获得ActRIIa多肽的分离和/或纯化形式,其分离自其它蛋白,或者基本不含其它蛋白。ActRIIa多肽通常通过重组核酸表达产生。
3. 编码 ActRIIa 多肽的核酸
在某些方面,本发明提供了编码本文公开的任意ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽),包括片段、功能性变体和融合蛋白的分离和/或重组核酸。例如,SEQ ID NO: 4编码天然存在的人ActRIIa前体多肽,而SEQ ID NO: 5编码加工后的ActRIIa胞外域。所述主题核酸可以是单链的或是双链的。这样的核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可以在,例如,制备ActRIIa多肽的方法中使用,或者作为直接的治疗剂(例如在基因治疗方法中)使用。
在某些方面,编码ActRIIa多肽的主题核酸应进一步理解为包括作为SEQ ID NO: 4或5的变体的核酸。
在某些实施方案中,本发明提供了与SEQ ID NOs: 4或5具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的分离或重组核酸序列。本领域普通技术人员将能理解:与SEQ ID NOs: 4或5互补的核酸序列、以及SEQ ID NOs: 4或5的变体同样在本发明的范围之内。在进一步的实施方案中,本发明的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源核苷酸序列融合,或者在DNA文库中。
在其它实施方案中,本发明的核酸还包括在高度严格的条件下与SEQ ID NOs: 4或5所示的核苷酸序列、SEQ ID NOs: 4或5的互补序列或其片段杂交的核苷酸序列,以及由所述核酸编码的ActRIIa多肽。如上文所讨论的,本领域普通技术人员将容易理解,促进DNA杂交的合适的严格条件是可以改变的。本领域普通技术人员将容易理解:促进DNA杂交的合适的严格条件是可以改变的。例如,可在6.0 x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、约45℃下杂交,然后在2.0 x SSC、50℃下洗涤。例如,该洗涤步骤中的盐浓度可从低严格性的约2.0 x SSC、50℃至高严格性的约0.2 x SSC、50℃中选择。此外,该洗涤步骤中的温度可从低严格性条件的室温,即约22℃上升至高严格条件的约65℃。温度和盐可都改变,或者可将温度或盐浓度保持恒定,而改变另一变量。在一种实施方案中,本发明提供以下核酸:其在6 x SSC、室温的低严格条件下杂交,然后在2 x SSC、室温下洗涤。
由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NOs: 4或5所示核酸的分离的核酸也在本发明的范围内。例如,许多氨基酸由一个以上的三联体密码所指定。指定相同氨基酸的密码子,或称同义密码子(例如,CAU和CAC为组氨酸的同义密码子)可导致不影响蛋白氨基酸序列的“沉默”突变。然而,预期在哺乳动物细胞中存在确实可导致主题蛋白的氨基酸序列改变的DNA序列多态性。本领域技术人员将能理解:在编码特定蛋白的核酸中一个或多个核苷酸(最多约3-5%的核苷酸)的这些变异可能由于天然等位基因变异而在特定物种的个体中存在。这些核苷酸变异的任意一个或全部以及由此产生的氨基酸多态性均在本发明的范围之内。
在某些实施方案中,本发明的重组核酸可以在表达构建体中可操作地连接至一种或多种调节性核苷酸序列。调节性核苷酸序列通常适合用于表达的宿主细胞。本领域已知用于多种宿主细胞的多种类型的合适的表达载体以及合适的调节序列。所述一种或多种调节性核苷酸序列通常可包括,但不限于,启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。本发明也考虑本领域已知的组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然存在的启动子,或者是合并了一个以上启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞中的游离体(例如质粒)上,或者该表达构建体可插入染色体中。在优选的实施方案中,该表达载体包含选择标记基因,从而允许选择转化的宿主细胞。选择标记基因已为本领域熟知,并将随所用的宿主细胞而改变。
在本发明的某些方面,在表达载体中提供主题核酸,所述表达载体包含编码ActRIIa多肽并可操作地连接于至少一种调节序列的核苷酸序列。调节序列已为本领域所了解,并选择用于指导ActRIIa多肽的表达。因此,术语调节序列包括启动子、增强子以及其它表达控制元件。示范性的调节序列描述于Goeddel;Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego,CA (1990)。例如,在与DNA序列可操作地连接时能控制该DNA序列表达的多种表达控制序列中的任意一种可用于这些载体中,以表达编码ActRIIa多肽的DNA序列。这些有用的表达控制序列包括,例如,SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒和巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、由T7 RNA聚合酶指导表达的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子,例如Pho5、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列,及其各种组合。应当理解,表达载体的设计可能取决于诸如待转化宿主细胞的选择和/或需要表达的蛋白类型等因素。此外,还应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力以及由该载体编码的任何其它蛋白(例如抗生素标记)的表达。
本发明的重组核酸可通过将克隆的基因或其部分连接至适于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中而产生。生产重组ActRIIa多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如,合适的载体包括如下类型的质粒:用于在原核细胞(例如大肠杆菌)中表达的pBR322-衍生的质粒、pEMBL-衍生的质粒、pEX -衍生的质粒、pBTac -衍生的质粒以及pUC -衍生的质粒。
一些哺乳动物表达载体同时包含促进载体在细菌中繁殖的原核序列和一种或多种在真核细胞中表达的真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适于真核细胞转染的哺乳动物细胞表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒(如pBR322)的序列进行修饰,以促进在原核和真核细胞这两者中的复制和药物抗性选择。或者,病毒的衍生物如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP-衍生的和p205)可用于真核细胞中蛋白的瞬时表达。其它病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例可在下文有关基因治疗送递系统的描述中找到。用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法已为本领域熟知。其它合适的原核和真核细胞表达系统以及一般的重组程序参见Molecular Cloning A
Laboratory Manual,3rd Ed.,ed. Sambrook,Fritsch and Maniatis (Cold
Spring Harbor Laboratory Press,2001)。在某些情况下,可能需要采用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。这些杆状病毒表达系统的实例包括pVL-衍生的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW-衍生的载体(例如pAcUW1)以及pBlueBac-衍生的载体(例如含β-gal的pBlueBac III)。
在优选的实施方案中,将设计用于在CHO细胞中产生主题ActRIIa多肽的载体,例如Pcmv-Script载体(Stratagene,La Jolla,Calif)、pcDNA4载体(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)和pCI-neo载体(Promega,Madison,Wisc)。显而易见地,该主题基因构建体可用于引起该主题ActRIIa多肽在培养物中繁殖的细胞中表达,例如,以产生蛋白,包括融合蛋白或变体蛋白,用于纯化。
本公开内容还涉及用包含一种或多种主题ActRIIa多肽的编码序列(例如,SEQ ID NO: 4或5)的重组基因转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如,本发明的ActRIIa多肽可在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(例如采用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞已为本领域技术人员所熟知。
因此,本发明进一步涉及生产主题ActRIIa多肽的方法。例如,用编码ActRIIa多肽的表达载体转染的宿主细胞可在适当条件下培养,以允许发生该ActRIIa多肽的表达。所述ActRIIa多肽可被分泌并从细胞和含有该ActRIIa多肽的培养基的混合物中分离。或者,ActRIIa多肽可保留在细胞质内或者在膜级份中,收获、裂解该细胞并分离蛋白。细胞培养物包含宿主细胞、培养基和其它副产物。细胞培养的合适培养基已为本领域熟知。该主题ActRIIa多肽可从细胞培养基、宿主细胞或两者中采用本领域已知的用于纯化蛋白的技术分离,该技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、用ActRIIa多肽的特定表位的特异性抗体进行免疫亲和纯化、以及采用与融合于ActRIIa多肽的结构域结合的试剂进行亲和纯化(例如,蛋白A柱可用于纯化ActRIIa-Fc融合体)。在优选的实施方案中,ActRIIa多肽是包含促进其纯化的结构域的融合蛋白。在优选的实施方案中,纯化可通过一系列的柱层析步骤实现,包括,例如,以任意顺序排列的以下三个或更多:蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、大小排阻层析以及阳离子交换层析。该纯化可通过病毒过滤和缓冲液交换完成。如本文所证明的,ActRIIa-hFc蛋白被纯化至用大小排阻层析测得的>98%的纯度和用SDS PAGE测得的>95%的纯度。该纯度水平足以在小鼠、大鼠、非人灵长类动物和人类中达到期望的结果。
在另一实施方案中,编码纯化前导序列(例如在重组ActRIIa多肽的所需部分的N末端的聚组氨酸/肠激酶切割位点序列)的融合基因,可允许通过采用Ni2+金属树脂的亲和层析来纯化表达的融合蛋白。然后该纯化前导序列可通过肠激酶处理而去除,以提供纯化的ActRIIa多肽(例如,参见Hochuli等人,(1987) J. Chromatography
411: 177;和Janknecht等人,PNAS USA 88:8972)。
制备融合基因的技术已经熟知。本质上,采用平端或交错端的用于连接的末端,根据常规技术连接编码不同多肽序列的各种DNA片段,限制酶消化以提供合适的末端,根据需要补平粘端,碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接,并且酶促连接。在另一实施方案中,融合基因可通过包括自动化DNA合成仪的常规技术合成。或者,可使用在两个连续基因片段之间产生互补突出端的锚定引物进行基因片段的PCR扩增,此两个连续基因片段随后可退火形成嵌合基因序列(例如,参见Current Protocols in
Molecular Biology,eds. Ausubel等人,John Wiley & Sons: 1992)。
4. 替代的激活素和 ActRIIa 拮抗剂
本文提供的数据证明了激活素-ActRIIa信号传导的拮抗剂可以用于提高红细胞或血红蛋白水平。尽管可溶性ActRIIa多肽,特别是ActRIIa-Fc是优选的拮抗剂,且尽管这种拮抗剂可通过除激活素拮抗以外的机制影响红细胞水平(例如,激活素抑制可以是一种试剂抑制一系列分子的活性的倾向的指示,所述分子有可能包括TGF-β超家族的其它成员,且该种集合抑制可导致对血细胞生成的所需作用),其它类型的激活素-ActRIIa拮抗剂预期也是有用的,包括抗激活素(例如,激活素βA、βB、βC和βE)抗体,抗ActRIIa抗体,抑制ActRIIa的产生的反义、RNAi或核酶核酸,以及其它的激活素或ActRIIa抑制剂,特别是破坏激活素-ActRIIa结合的抑制剂。
与ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)特异性反应并与ActRIIa多肽竞争性结合配体或者以其它方式抑制ActRIIa介导的信号传导的抗体可用作ActRIIa多肽活性的拮抗剂。同样地,与激活素βA、βB、βC或βE多肽或其任何异二聚体特异性反应并破坏ActRIIa结合的抗体可用作拮抗剂。
使用由ActRIIa多肽或激活素多肽衍生的免疫原,可通过标准流程制备抗蛋白/抗肽抗血清或单克隆抗体(参见,例如Antibodies: A Laboratory
Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988))。哺乳动物如小鼠、仓鼠或兔可用激活素或ActRIIa多肽的免疫原形式、能够引发抗体应答的抗原性片段,或融合蛋白进行免疫。给蛋白或肽赋予免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域熟知的其它技术。ActRIIa或激活素多肽的免疫原性部分可在佐剂的存在下施用。免疫的进展可通过检测血浆或血清中的抗体滴度进行监测。标准的ELISA或其它免疫测定可与作为抗原的免疫原一起使用,从而评估抗体水平。
在用激活素或ActRIIa多肽的抗原性制剂免疫动物后可获得抗血清,且在需要时可从该血清中分离多克隆抗体。为产生单克隆抗体,可从免疫后的动物采集抗体生产细胞(淋巴细胞),并通过标准的体细胞融合步骤与永生化细胞如骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞。这些技术已为本领域熟知,其包括,例如,杂交瘤技术(最初由Kohler and Milstein,(1975) Nature,256: 495-497开发)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等人,(1983) Immunology Today,4: 72)、以及产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人,(1985) Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss,Inc. pp. 77-96)。可通过免疫化学筛选杂交瘤细胞,用于产生与激活素或ActRIIa多肽特异性反应的抗体,并从包含该种杂交瘤细胞的培养物分离单克隆抗体。
本文所用的术语“抗体”意在包括完整的抗体,例如任意同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗体,并且包括与选定的抗原反应的免疫球蛋白的片段或结构域。抗体可通过常规技术分成片段,并根据效用和/或与感兴趣的特定表位的相互作用筛选片段。因此,该术语包括能够与特定蛋白选择性反应的抗体分子的蛋白酶剪切的片段或重组制备的部分。这种蛋白水解和/或重组的片段的非限制性实例包括Fab、F(ab')2、Fab' 、Fv以及包含通过肽接头连接的V[L]和/或V[H]结构域的单链抗体(scFv)。该scFv可共价或非共价连接形成具有两个或多个结合位点的抗体。术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体、或抗体和重组抗体的其它纯化制剂。术语“重组抗体”表示由采用分子生物学技术构建的核酸表达的抗体,或免疫球蛋白的抗原结合域,例如从单链抗体开发的人源化抗体或全人抗体。单结构域和单链抗体也包括在术语“重组抗体”之内。
在某些实施方案中,本发明的抗体是单克隆抗体,并且在某些实施方案中,本发明使得可以获得产生新抗体的方法。例如,产生特异性结合ActRIIa多肽或激活素多肽的单克隆抗体的方法可包括给小鼠施用一定量的免疫原性组合物,其包含能有效刺激可检测的免疫应答的抗原多肽,从该小鼠获得产生抗体的细胞(例如来自脾的细胞)并将该产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合获得产生抗体的杂交瘤,并测试该产生抗体的杂交瘤,以鉴定产生特异性结合抗原的单克隆抗体的杂交瘤。一旦获得,杂交瘤可在细胞培养物中增殖,任选在杂交瘤衍生的细胞产生特异性结合抗原的单克隆抗体的培养条件下增殖。可从该细胞培养物中纯化单克隆抗体。
形容词“与...特异性反应”在形容抗体时,如本领域的一般理解,表示该抗体在感兴趣的抗原(例如激活素或ActRIIa多肽)与其它不感兴趣的抗原之间具有足够的选择性,使得该抗体最低限度可用于在特定类型的生物样品中检测该感兴趣的抗原的存在。在使用该抗体的某些方法中,例如治疗应用中,可能期望更高程度的结合特异性。单克隆抗体通常具有更强的有效区分需要的抗原和交叉反应性多肽的趋势(与多克隆抗体相比)。影响抗体:抗原相互作用的特异性的一个特征是该抗体对该抗原的亲和力。尽管可通过一定范围的不同亲和力实现所需的特异性,一般优选的抗体具有约10-6、10-7、10-8、10-9 M或更小的亲和力(解离常数)。
此外,用于筛选抗体以鉴定期望的抗体的技术可能影响所得抗体的特性。例如,如果抗体是用于在溶液中结合抗原,可能期望测试溶液结合。已有多种不同的技术来测试抗体和抗原之间的相互作用,以鉴定特别期望的抗体。这些技术包括ELISA、表面等离子共振结合测定(例如,Biacore™结合测定,Biacore AB,瑞典Uppsala)、夹心测定(例如,顺磁珠系统,IGEN International,Inc.,Gaithersburg,Maryland)、蛋白质印迹、免疫沉淀测定以及免疫组化。
作为激活素或ActRIIa拮抗剂的核酸化合物类别的实例包括反义核酸、RNAi构建体和催化性核酸构建体。核酸化合物可以是单链或双链的。双链化合物还可包含突出端或非互补区,其中一条链或另一条链为单链的。单链化合物可包含自身互补区,表示该化合物以双链螺旋结构区形成所谓的“发夹”或“茎环”结构。核酸化合物可包含与全长ActRIIa核酸序列或激活素βA、βB、βC或βE核酸序列的不超过1000个、不超过500个、不超过250个、不超过100个或不超过50、35、25、22、20、18或15个核苷酸组成的区域互补的核苷酸序列。该互补区域优选是至少8个核苷酸,并任选是约18至35个核苷酸。互补区可在内含子中,后者是靶转录物的编码序列或非编码序列,例如编码序列部分。一般而言,核酸化合物具有约8至约500个核苷酸或碱基对的长度,且任选地,该长度为约14至约50个核苷酸。核酸可以是DNA(特别是用作反义核酸时)、RNA或RNA:DNA杂交体。任意一条链可包括DNA和RNA的混合物以及不能容易分类为DNA或RNA的修饰形式。同样地,双链化合物可以是DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA,且任意一条链也可包含DNA和RNA的混合物以及不能容易分类为DNA或RNA的修饰形式。核酸化合物可包含多种修饰的任意一种,包括对主链(在天然核酸中的糖-磷酸部分,包括核苷酸间键)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一个或多个修饰。反义核酸化合物将优选具有约15至约30个核苷酸的长度,并通常包含一个或多个修饰以改善其特征,例如在血清、在细胞或在该化合物可能送递到的位置(例如在口服送递化合物情况下的胃和吸入化合物情况下的肺)中的稳定性。在RNAi构建体的情况下,与靶转录物互补的链通常为RNA或其修饰形式。另一条链可以是RNA、DNA或任意其它变化形式。双链或单链“发夹”RNAi构建体的双链体部分通常具有18-40个核苷酸的长度,任选约21-23个核苷酸的长度,只要其可用作切酶(Dicer)底物。催化性或酶性质的核酸可以是核酶或DNA酶,并且还可包含修饰的形式。在生理条件下以及无义或有义控制作用很小或没有作用的浓度下与细胞接触时,核酸化合物可使靶的表达抑制约50%、75%、90%或更多。用于测试核酸化合物作用的优选浓度为1、5和10微摩尔。还可测试核酸化合物对例如,红细胞水平的作用。
在某些实施方案中,激活素-ActRIIa拮抗剂可以是拮抗激活素生物活性和/或结合激活素的促滤泡素抑制素多肽。术语“促滤泡素抑制素多肽”包括以下多肽:其包括任何天然存在的促滤泡素抑制素的多肽以及保留了有用活性的其任意变体(包括突变体、片段、融合体和肽模拟形式),并且进一步包括促滤泡素抑制素的任何功能性单体或多聚体。可以基于以前涉及促滤泡素抑制素和激活素相互作用的研究,鉴定保留了激活素结合特性的促滤泡素抑制素多肽的变体。例如,WO2008/030367公开了特定的促滤泡素抑制素结构域 ("FSDs") ,显示其对于激活素结合是重要的。如下文在SEQ ID NOs: 19-21中所示,N-末端促滤泡素抑制素结构域 ("FSND" SEQ ID
NO: 19)、FSD2 (SEQ ID NO: 20)以及从较低程度上说FSD1 (SEQ ID NO: 21),代表了促滤泡素抑制素中对于激活素结合重要的示例性结构域。此外,上文在ActRIIa多肽的上下文中描述了用于制备和测试多肽文库的方法,并且所述方法也涉及制备和测试促滤泡素抑制素的变体。促滤泡素抑制素多肽包括衍生自任何已知促滤泡素抑制素的序列、与促滤泡素抑制素多肽的序列具有至少约80%同一性,并且任选具有至少85%、90%、95%、97%、99%或更高同一性的多肽。促滤泡素抑制素多肽的实例包括例如WO2005/025601中描述的成熟促滤泡素抑制素多肽或人促滤泡素抑制素前体多肽(SEQ ID NO: 17) 的较短同种型或其它变体。
人促滤泡素抑制素前体多肽同种型FST344 如下:
信号肽是加单下划线的;以粗体表示的最后27个残基代表与下面的更短的促滤泡素抑制素同种型FST317 (NP_006341)相比额外的氨基酸。
人促滤泡素抑制素前体多肽同种型FST317 如下所示:
信号肽是加单下划线的。
N-末端促滤泡素抑制素结构域(FSND) 序列如下:
gncwlrqakngrcqvlyktelskeeccstgrlstswteedvndntlfkwmifnggapncipck
(SEQ ID NO: 19; FSND)
FSD1和FSD2序列如下:
etcenvdcgpgkkcrmnkknkprcv
(SEQ ID NO: 20; FSD1)
ktcrdvfcpgsstcvvdqtnnaycvt
(SEQ ID NO: 21; FSD2)
在其它实施方案中,激活素-ActRIIa拮抗剂可以是拮抗激活素生物活性和/或结合激活素的促滤泡素抑制素样相关基因 (FLRG)。术语“FLRG多肽”包括以下多肽:其包括任何天然存在的FLRG的多肽以及保留了有用活性的其任意变体(包括突变体、片段、融合体和肽模拟形式)的多。可以使用常规方法来测定FLRG和激活素相互作用,从鉴定保留了激活素结合特性的FLRG多肽的变体。参见,例如,US 6,537,966。此外,上文在ActRIIa多肽的上下文中描述了用于制备和测试多肽文库的方法,并且所述方法也涉及制备和测试FLRG的变体。FLRG多肽包括衍生自任何已知FLRG的序列、与FLRG多肽的序列具有至少约80%同一性,并且任选具有至少85%、90%、95%、97%、99%或更高同一性的多肽。
人FLRG前体多肽如下:
信号肽是加单下划线的。
在某些实施方案中,促滤泡素抑制素多肽和 FLRG多肽的功能性变体或修饰的形式包括具有促滤泡素抑制素多肽或FLRG多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白,所述融合结构域诸如,例如,促进多肽的分离、检测、稳定化或多聚化的结构域。合适的融合结构域在上文参照ActRIIa多肽进行了详细讨论。在一个实施方案中,激活素-ActRIIa拮抗剂是包含与 Fc结构域融合的促滤泡素抑制素多肽的激活素结合部分的融合蛋白。在另一实施方案中,激活素-ActRIIa拮抗剂是包含与 Fc结构域融合的FLRG多肽的激活素结合部分的融合蛋白。文献中和申请人针对FLRG已经显示了促滤泡素抑制素和FLRG对激活素A具有皮摩尔范围内的亲和力,表明这些试剂使激活素A信号传导抑制的程度类似于ActRIIa-Fc。
5. 筛选测定
在某些方面,本发明涉及ActRIIa多肽和激活素多肽用于鉴定作为激活素-ActRIIa信号传导途径的激动剂或拮抗剂的化合物(药剂)的应用。可测试通过该筛选所鉴定的化合物,以评估它们在体内或体外调节红细胞、血红蛋白和/或网织红细胞水平的能力。这些化合物可以在,例如,动物模型中测试。
有多种方法可以筛选通过靶向激活素和ActRIIa信号传导来提高红细胞或血红蛋白水平的治疗剂。在某些实施方式中,可进行化合物的高通量筛选,从而鉴定在选定的细胞系上干扰激活素或ActRIIa-介导的作用的药剂。在某些实施方式中,实施该测定以筛选并鉴定特异性抑制或减少ActRIIa多肽与激活素的结合的化合物。或者,该测定可用于鉴定增加ActRIIa多肽与激活素的结合的化合物。在进一步的实施方式中,化合物可通过其与激活素或ActRIIa多肽相互作用的能力来鉴定。
多种测定形式可满足需要,且根据本公开内容,未在本文明确描述的测定可被本领域普通技术人员所理解。如本文所述,本发明的测试化合物(药剂)可通过任意组合的化学方法生成。或者,该主题化合物可以是在体内或体外合成的天然存在的生物分子。用于测试其作为组织生长调节剂的能力的待测试化合物(药剂)可通过,例如,细菌、酵母、植物或其它生物产生(例如,天然产物),通过化学方法产生(例如,小分子,包括肽模拟物(peptidomimetics)或重组产生。本发明考虑的测试化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在特定实施方式中,该测试药剂是分子量小于约2000道尔顿的小有机分子。
本发明的测试化合物可以作为单独的、分散的实体提供,或者在更复杂的文库中提供,例如通过组合化学制备。这些文库可包含,例如,醇、卤代烷、胺、酰胺、酯、醛、醚和其它有机化合物类别。测试化合物可以分离形式或化合物的混合物展示于测试系统(特别是在初始筛选步骤中)。任选地,化合物任选可用其它化合物衍生,并具有促进该化合物分离的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括,生物素、荧光素、洋地黄毒苷、绿色荧光蛋白、同位素、聚组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶(GST)、可光活化的交联剂或其任意组合。
在许多对化合物和天然提取物文库进行测试的药物筛选程序中均期望使用高通量测定,从而使给定时间范围内所考察的化合物数量达到最大化。在无细胞系统中进行的测定(如可以用纯化或半纯化蛋白衍生)常被优选为“初级”筛选,因为可以产生它们,从而允许快速开发和相对容易检测由测试化合物介导的分子靶中的改变。此外,测试化合物的细胞毒性或生物利用度通常在体外系统中可被忽略,从而使测定可以主要集中在药物对分子靶的作用,其可通过ActRIIa多肽与激活素之间的结合亲和力的改变所显示。
仅为阐述目的,在本发明的示例性筛选测定中,感兴趣的化合物与分离和纯化的ActRIIa多肽(其通常能够结合激活素)相接触。然后向化合物与ActRIIa多肽的混合物中添加含有ActRIIa配体的组合物。对ActRIIa/激活素复合物的检测和定量为测定化合物抑制(或加强)ActRIIa多肽和激活素之间复合物形成的效力提供了方法。该化合物的效力可通过由不同浓度的测试化合物所得的数据生成剂量反应曲线而进行评估。此外,还可进行对照测定以提供用于比较的基线。例如,在对照测定中,向含有ActRIIa多肽的组合物中添加分离和纯化的激活素,并在缺乏测试化合物的情况下对ActRIIa/激活素复合物的形成进行定量。应当理解,一般而言混合反应物的顺序可以变化,并且可以同时混合。此外,细胞提取物和裂解物可取代纯化蛋白,用于产生合适的无细胞测定系统。
ActRIIa多肽和激活素之间的复合物形成可通过多种技术检测。例如,可采用,例如,可检测地标记的蛋白如放射性标记的(例如,32P、35S、14C或3H)、荧光标记的(例如,FITC)或酶标记的ActRIIa多肽或激活素,通过免疫测定或通过色谱检测对复合物形成的调节进行定量。
在某些实施方式中,本发明考虑使用荧光极化测定和荧光共振能量转移(FRET)测定来直接或间接测量ActRIIa多肽和它的结合蛋白之间的相互作用程度。此外,其它检测模式,例如基于光波导(PCT公开WO 96/26432和美国专利号5,677,196)、表面等离子共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器的那些,可适用于本发明的多种实施方式。
此外,本发明考虑使用相互作用捕获测定(也称为“双杂交测定”)来鉴定破坏或加强ActRIIa多肽及其结合蛋白之间的相互作用的药剂。例如,参见,美国专利号5,283,317;Zervos等人 (1993) Cell 72:223-232;Madura等人 (1993) J Biol Chem
268:12046-12054;Bartel等人 (1993) Biotechniques
14:920-924;以及Iwabuchi等人 (1993) Oncogene
8:1693-1696)。在特定实施方式中,本发明考虑使用逆向双杂交系统来鉴定使ActRIIa多肽及其结合蛋白之间的相互作用解离的化合物(例如,小分子或肽)。例如,参见Vidal和Legrain,(1999) Nucleic Acids Res
27:919-29;Vidal和Legrain,(1999) Trends Biotechnol
17:374-81;以及美国专利号5,525,490;5,955,280;和 5,965,368。
在某些实施方式中,可通过与本发明的ActRIIa或激活素多肽相互作用的能力来鉴定主题化合物。化合物与ActRIIa或激活素多肽之间的相互作用可以是共价或非共价的。例如,这种相互作用可通过体外生物化学方法在蛋白水平上鉴定,所述生物化学方法包括光交联、放射性标记的配体结合以及亲和层析(Jakoby WB等人,1974,Methods in Enzymology 46:
1)。在某些情况下,可在基于机理的测定(例如检测结合激活素或ActRIIa多肽的化合物的测定)中筛选化合物。这可包括固相或液相结合事件。或者,编码激活素或ActRII多肽的基因可用报道系统(例如,β-半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白)转染进入细胞,并任选通过高通量筛选对文库进行筛选或用文库的各个成员进行筛选。可使用其它的基于机理的结合测定,例如,检测自由能变化的结合测定。可在靶被固定至孔、珠或芯片或者被固定化抗体捕获或者被毛细管电泳分辨的情况下实施结合测定。结合化合物通常可采用比色或荧光或表面等离子共振进行检测。
6. 示例性治疗用途
在某些实施方式中,本发明的激活素- ActRIIa拮抗剂(例如ActRIIa多肽)可用于在哺乳动物(如啮齿动物和灵长类动物,特别是在人类患者)中提高红细胞水平。在某些实施方式中,本发明提供了通过给个体施用治疗有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂(例如ActRIIa多肽)而治疗或预防有需要的个体的贫血的方法。在某些实施方式中,本发明提供了通过给个体施用治疗有效量的激活素- ActRIIa拮抗剂(特别是ActRIIa多肽)而促进个体中红细胞形成的方法。这些方法可用于对哺乳动物(特别是人)的治疗性或预防性治疗。
本文所用的“预防”病症或状况的治疗剂指在统计样本中相对未治疗的对照样本减少治疗样本中的病症或状况的发生,或者相对未治疗的对照样本延迟病症或状况的一种或多种症状的发作或减少其严重性的化合物。本文所用的术语“治疗”包括预防指定的状况或者在其形成后改善或消除该状况。在任一情况下,预防或治疗可在医师或其他健康护理提供者所提供的诊断和该治疗剂的施用的预期结果中得到辨别。
如本文所示,激活素-ActRIIa拮抗剂可用于提高健康个体的红细胞、血红蛋白或网织红细胞水平,且这些拮抗剂可用于选定的患者群体。合适的患者群体的实例包括具有不希望的低红细胞或血红蛋白水平的患者,例如患有贫血的患者,以及具有发展不希望的低红细胞或血红蛋白水平的风险的患者,例如正要进行可能导致大量失血的大手术或其它过程的患者。在一个实施方式中,采用激活素-ActRIIa拮抗剂治疗具有足够红细胞水平的患者以提高红细胞水平,然后抽出血液并保存,供以后输血使用。
如实施例中的描述,激活素-ActRIIa拮抗剂可以通过激活脾红细胞生成而刺激红细胞的产生。这种新的机理表明,这些拮抗剂可能与其它贫血治疗,如促红细胞生成素激动剂(如Epogen, Procrit, Aranesp,
Epo模拟物,Epo受体激动剂等)协同作用。
本文公开的激活素-ActRII拮抗剂,特别是ActRIIa-Fc蛋白,可用于提高患有贫血的患者中的红细胞水平。当在人类中观察血红蛋白水平时,尽管考虑个体变异,低于适当的年龄和性别分类的正常值的水平可表示贫血。例如,12 g/dl的血红蛋白水平通常认为是一般成年群体中的正常值的下限。潜在的原因包括失血、营养缺乏、药物反应、与骨髓和多种疾病有关的各种问题。更具体而言,贫血与多种病症相关,其包括,例如,慢性肾功能衰竭、骨髓异常增生综合征(包括缺失5q MDS)、骨髓纤维化、类风湿关节炎、骨髓移植。贫血还可与如下状况相关:实体瘤(如乳腺癌、肺癌、结肠癌);淋巴系统的肿瘤(如慢性淋巴细胞白血病,非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤);造血系统的肿瘤(如白血病、骨髓异常增生综合征、多发性骨髓瘤);放疗;化疗(如含铂的方案);炎性和自身免疫疾病,包括但不限于类风湿关节炎、其它炎性关节炎疹、系统性红斑狼疮(SLE)、急性或慢性皮肤疾病(例如,牛皮癣)、炎性肠病(例如,克隆氏病和溃疡性结肠炎);急性或慢性肾疾病或衰竭,包括特发性或先天性状况;急性或慢性肝疾病;急性或慢性出血;由于患者的异体或自体抗体和/或由于宗教原因(例如,某些耶和华证人)而不能输注红细胞的情况;感染(例如,疟疾,骨髓炎);血红蛋白病,包括,例如,镰状细胞疾病、地中海贫血;药物使用或滥用,例如,酒精滥用;由于任何避免输血的原因导致的贫血的儿科患者;以及由于担心循环负荷而不能接受输血的患贫血的年长患者或基础心肺疾病患者。
激活素-ActRIIa拮抗剂(如ActRIIa 多肽)对于治疗低增殖性(hypoproliferative)骨髓的贫血(其典型地与RBC形态的很少改变相关)是合适的。低增殖性贫血包括:1)慢性疾病的贫血,2)肾疾病的贫血,和3)与低代谢状态相关的贫血。在这些类型的每一种中,内源性促红细胞生成素水平对于观察到的贫血程度是不适当低的。其它低增殖性贫血包括:4)早期缺铁性贫血,和5)由骨髓损伤导致的贫血。在这些类型中,内源性促红细胞生成素水平对于观察到的贫血程度是合适地升高的。
最常见的类型是慢性疾病的贫血,所述慢性疾病包括炎症、感染、组织损伤和诸如癌的状况,并且通过低促红细胞生成素水平和骨髓中对促红细胞生成素的反应不足这两者来区分(Adamson, 2008, Harrison’s Principles of Internal
Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634)。很多因素会导致癌相关的贫血。一些与疾病过程本身和炎性细胞因子如白介素-1、干扰素-γ和肿瘤坏死因子的产生相关(Bron 等人, 2001, Semin Oncol
28(Suppl 8):1-6)。在其效果中,炎症诱导关键的铁调节肽hepcidin,从而抑制铁从巨噬细胞运出,并且通常限制用于红细胞生成的铁利用度(Ganz, 2007, J Am Soc
Nephrol 18:394-400)。经各种途径的失血也会导致癌相关的贫血。由于癌进展导致的贫血的普遍程度随癌类型而不同,从前列腺癌中的5%多至多发性骨髓瘤中的95%。癌相关的贫血给患者带来明显后果,包括疲乏和生活质量下降、疗效降低和死亡率上升。
慢性肾疾病与低增殖性贫血相关,所述贫血的严重程度随肾损害的程度改变。所述贫血主要是由于促红细胞生成素的产生不足和红细胞存活减少。慢性肾疾病通常在数年或数十年的时间中逐渐进展到末期(5期)疾病,此时需要进行透析或肾移植来使患者存活。贫血通常在此过程的早期发生,并且随疾病进展恶化。已充分记载了肾疾病的贫血的临床后果,包括发展左心室肥厚、认知功能受损、生活质量下降和免疫功能改变(Levin 等人, 1999, Am J Kidney Dis
27:347-354; Nissenson, 1992, Am J Kidney Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki 等人, 1995, Am J Kidney Dis
25:548-554; Gafter 等人, 1994, Kidney Int 45:224-231)。如申请人在慢性肾疾病的小鼠模型中所证明的(参见下文实施例),ActRIIa多肽或其它激活素- ActRIIa拮抗剂可以用于治疗肾疾病的贫血。
很多导致低代谢速率的状况会产生轻到中度低增殖性贫血。在所述状况中包括内分泌缺陷状况。例如,在阿狄森病、甲状腺机能减退、甲状旁腺功能亢进或去势或用雌激素治疗的男性中会发生贫血。轻到中度贫血也可以随蛋白的饮食摄取减少(在老年人中特别普遍的一种状况)而发生。最后,具有由几乎任何原因导致的慢性肝病的患者中也会发展贫血(Adamson, 2008, Harrison’s Principles of Internal
Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634)。
缺铁性贫血是不断增加的铁缺乏的分级进展(其包括作为中间阶段的铁的负平衡和缺铁性红细胞生成)中的最终阶段。铁缺乏可以由增加的铁需求、减少的铁摄取或增加的铁丢失导致,其在以下状况中示例:诸如妊娠、饮食不足、肠吸收不良、急性或慢性炎症,以及急性或慢性失血。伴随这种类型的轻到中度贫血,骨髓保持低增殖性,并且RBC形态大致正常;但是,即使轻度贫血也会导致一些小红细胞低血色素的RBC,并且,向严重缺铁性贫血的转变伴随骨髓的高增殖和越来越普遍存在的小红细胞和低血色素的RBC (Adamson, 2008,
Harrison’s Principles of Internal
Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634)。缺铁性贫血的适当治疗取决于其原因和严重程度,口服铁制剂、肠胃外铁制剂和RBC输注是主要的常规选择。ActRIIa多肽或其它激活素-ActRIIa拮抗剂可以单独用于治疗慢性缺铁性贫血(参见下文实施例,临床试验患者中)或与常规治疗方法,特别是用于治疗多因素来源的贫血的治疗方法组合。
低增殖性贫血可以由骨髓的原发功能障碍或衰竭(而不是继发于炎症、感染或癌进展的功能障碍)导致。突出的实例是由癌化疗药物或癌放疗导致的骨髓抑制。广泛的临床试验综述发现100%的化疗后患者中会发生轻度贫血,而在多至80%的这些患者中会发生更严重的贫血(Groopman 等人, 1999, J Natl Cancer Inst
91:1616-1634)。骨髓抑制药物包括:1)烷化剂,如氮芥(如美法仑)和亚硝基脲(如链脲霉素);2) 抗代谢药,如叶酸拮抗剂 (如氨甲喋呤)、嘌呤类似物 (如硫鸟嘌呤),和嘧啶类似物 (如吉西他滨); 3)细胞毒性抗生素如蒽环类抗生素 (如阿霉素); 4) 激酶抑制剂(如gefitinib); 5) 有丝分裂抑制剂如紫杉烷类(如紫杉醇)和长春花生物碱 (如维诺利宾); 6) 单克隆抗体 (如利妥昔单抗); 和7) 拓扑异构酶抑制剂 (如托泊替堪和依托泊苷)。如在化疗诱导的贫血的小鼠模型中所证明的(参见下文实施例),ActRIIa多肽或其它激活素-ActRIIa拮抗剂可以用于治疗化疗剂和/或放疗导致的贫血。
激活素- ActRIIa拮抗剂(如ActRIIa多肽)也适合于治疗RBC成熟紊乱的贫血,其特征部分在于尺寸不足(小红细胞)、尺寸过大(巨红细胞)、奇形怪状或异常颜色的(低血色素的)RBC。
尽管较低的目标水平可引起较少的心血管或其它副作用,可采用目的在于将患者恢复至目标血红蛋白水平的给药方案来治疗患者,该目标血红蛋白水平通常在约10 g/dl和约12.5 g/dl之间,典型地约为11.0 g/dl(也参见Jacobs等人 (2000) Nephrol Dial
Transplant 15,15-19)。或者,血细胞比容水平(细胞占血样体积的百分比)可用作对红细胞状况的测量值。对于健康个体的血细胞比容水平,成年男性的范围为41-51%,成年女性的范围为35-45%。目标血细胞比容水平通常约为30-33%。此外,血红蛋白/血细胞比容水平可随个体而变化。因此,最佳情况下,该目标血红蛋白/血细胞比容水平可针对每位患者进行个体化。
本文公开的激活素-ActRIIa拮抗剂对红细胞水平的快速作用显示这些药剂可以不同于Epo的机制进行作用。因此,这些拮抗剂可用于在对Epo不能良好反应的患者中提高红细胞和血红蛋白水平。例如,激活素-ActRIIa拮抗剂可对施用正常至增加(>300 IU/kg/周)剂量的Epo不能使血红蛋白水平上升至目标水平的患者有益。对于所有类型的贫血均发现了对Epo反应不足的患者,而在癌患者和末期肾疾病患者中特别频繁地观察到了更多的非反应者。Epo的反应不足既可以是组成型的(即,在第一次用Epo治疗时观察到)或获得的(例如,用Epo重复治疗后观察到的)。
激活素-ActRIIa拮抗剂还可用于治疗对Epo的副作用易感的患者。Epo的主要副作用为血细胞比容或血红蛋白水平的过量增加和红细胞增多症。血细胞比容水平升高可导致高血压(更特别而言,高血压的加重)和血管血栓。业已报道的Epo的其它副作用(一些与高血压相关)为头痛、流感样综合征、分流阻塞、心肌梗死和由于血栓引起的脑惊厥、高血压脑病、以及红细胞发育不全(applasia)(Singibarti,(1994) J. Clin Investig
72(suppl 6),S36-S43;Horl等人 (2000) Nephrol Dial
Transplant 15(suppl 4),51-56;Delanty等人 (1997) Neurology 49,686-689;Bunn (2002) N Engl J Med
346(7),522-523)。
如美国专利申请序列号11/603,485和公开的专利申请WO 2008/100384和WO/2007/062188(在此通过引用并入本文)所描述的,激活素- ActRIIa拮抗剂可以用于促进骨生长和增加骨密度。因此,激活素- ActRIIa拮抗剂可能对于患有与骨丢失和贫血相关的病症的患者特别有帮助。实例包括肾疾病(特别是慢性肾疾病和末期肾疾病)、骨质疏松、癌和癌治疗(特别是上文提到的骨髓抑制疗法和WO 2008/100384和WO/2007/062188中讨论的抗雌激素药物)以及炎性病症,如炎性肠病和类风湿关节炎。
7. 药物组合物
在某些实施方案中,本发明的激活素-ActRIIa拮抗剂(例如,ActRIIa多肽)与药学可接受的载体一起配制。例如,ActRIIa多肽可单独施用或作为药物制剂(治疗组合物)的组分施用。可以配制所述主题化合物,从而以任何方便的方式施用,用于人或兽医中。
在某些实施方式中,本发明的治疗方法包括作为移植物或装置全身或局部施用该组合物。在施用时,用于本发明的该治疗组合物当然地呈无热原、生理学可接受的形式。除了激活素-ActRIIa拮抗剂以外的、也可任选包含在上述组合物中的治疗有用的药剂可在本发明的方法中与该主题化合物(例如,ActRIIa多肽)同时或序贯施用。
典型地,将肠胃外施用激活素-ActRIIa拮抗剂。适合肠胃外施用的药物组合物可包含一种或多种ActRIIa多肽,其与以下组分组合:一种或多种药学可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、混悬液或乳状液;或者可在即将使用之前重配成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质、或者悬浮剂或增稠剂。可在本发明药物组合物中采用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物;植物油,如橄榄油;以及可注射的有机酯,如油酸乙酯。例如,可通过使用包覆材料如卵磷脂,在分散液的情况下通过维持所需要的粒度,以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
此外,可以用于送递到靶组织部位(如骨髓)的形式将组合物包胶囊或注射。在某些实施方案中,本文所述的组合物可包含能够将一种或多种治疗化合物(如ActRIIa多肽)送递到靶组织部位(如骨髓)的基质,为发育中组织提供结构且最优能够被再吸收进入体内。例如,所述基质可提供ActRIIa多肽的缓慢释放。此类基质可由当前用于其它植入医疗应用中的材料形成。
基质材料的选择基于生物相容性、生物可降解性、机械性质、外观和界面性质。主题组合物的具体应用将限定合适的制剂。用于组合物的可能的基质可以是生物可降解的和在化学上定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其它可能的材料是生物可降解的且在生物学上充分定义的,例如骨或真皮胶原。进一步的基质包括纯蛋白或细胞外基质组分。其它可能的基质是不可生物降解且经化学定义的,例如烧结的羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可包含任意上述类型的材料的组合,例如聚乳酸与羟磷灰石或者胶原蛋白与磷酸三钙的组合。可以在组成上(如钙-铝酸盐-磷酸盐)改变生物陶瓷,并进行加工,以改变它的孔径、粒度、粒子形状和生物可降解性。
在某些实施方案中,本发明的方法可以口服施用,例如为以下的形式:胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、糖锭(使用矫味的基料(flavored basis),通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒或作为在水性或非水性液体中的溶液或混悬液、或者作为水包油或油包水的液体乳状液、或作为酏剂或糖浆、或作为锭剂(采用惰性基质,如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶)和/或作为漱口剂等等,每种形式含有预定量的药剂作为有效成分。药剂也可以以大丸剂、药糖剂(electuary)或糊剂的形式给予。
用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣剂、粉剂、颗粒等等)中,一种或多种本发明的治疗化合物可与一种或多种药学可接受的载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或任意以下物质混合:(1)填充剂或增量剂,如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸;(2)粘结剂,诸如,例如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/阿拉伯树胶;(3)保湿剂如甘油;(4)崩解剂,如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐以及碳酸钠;(5)溶液阻滞剂,如石蜡;(6)吸收促进剂,如季铵化合物;(7)湿润剂,如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯;(8)吸附剂,如高岭土和膨润土;(9)润滑剂,如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物;以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下,药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以在软和硬填充明胶胶囊中用作填充剂,所述胶囊使用诸如以下的赋形剂:乳糖或奶糖,以及高分子量聚乙二醇等等。
用于口服施用的液体剂型包括药学可接受的乳状液、微乳状液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外,液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂(如水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂,如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇)、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯,及其混合物。除了惰性稀释剂,口服组合物也可以包含佐剂,如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、香料和防腐剂。
除了活性化合物,混悬液可包含悬浮剂,如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇、失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄芪胶,及其混合物。
本发明的组合物也可以含有佐剂,如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过引入各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来保证防止微生物的作用。也可希望将等渗剂(如糖、氯化钠等)包含入组合物中。此外,可通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。
可以理解剂量方案可由主治医师考虑改变本发明主题化合物(例如,ActRIIa多肽)的作用的各种因素来确定。所述各种因素包括,但不限于,患者的红细胞计数,血红蛋白水平或其它诊断评估,所需的目标红细胞计数,患者的年龄、性别和饮食,可导致红细胞水平降低的任意疾病的严重性、施用时间以及其它临床因素。向最终组合物中添加其它已知的生长因子也可能影响剂量。可通过周期性评估红细胞和血红蛋白水平,以及评估网织红细胞水平和其它的造血过程指示剂来监测进展。
以灵长类动物和人类进行的实验证实了以足够在至少约20-30天的期间内达到约100ng/ml或更高的血清浓度的间隔和量给予ActRIIa-Fc时,该化合物对红细胞水平的作用是可测的。也可采用能在至少20-30天的期间内达到200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml或更高的血清水平的剂量。在至少约20-30天的期间中,在约200 ng/ml的血清水平下可观察到对骨的作用,而实质性作用起始于约1000 ng/ml或更高。因此,如果想要实现对红细胞的作用,同时对骨产生很小的作用,给药方案可设计成在约20-30天的期间内送递约100-1000 ng/ml的血清浓度。在人类中,200 ng/ml的血清水平可通过0.1 mg/kg或更高的单次剂量实现,而1000 ng/ml的血清水平可通过0.3 mg/kg或更高的单次剂量实现。对该分子观察到的血清半衰期在约20-30天之间,远长于大多数Fc融合蛋白,因此可通过,例如,每周或每两周给药约0.05-0.5 mg/kg实现持续的有效血清水平,或者可在更长的给药间隔的情况下使用更高的剂量。例如,每月或每两月使用0.1-1 mg/kg的剂量。
在某些实施方式中,本发明还提供了用于体内生成ActRIIa多肽的基因治疗。该种治疗可通过将ActRIIa多核苷酸序列导入具有上述列举的病症的细胞或组织实现其疗效。可采用重组表达载体(例如嵌合病毒或胶体分散系统)实现ActRIIa多核苷酸序列的送递。优选使用靶向的脂质体进行ActRIIa多核苷酸序列的治疗性送递。
本文教导的可用于基因治疗的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或RNA病毒如逆转录病毒。该逆转录病毒载体可以是鼠或禽类逆转录病毒的衍生物。可插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包括,但不限于:莫洛尼鼠氏白血病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)以及劳斯肉瘤病毒(RSV)。一些其它的逆转录病毒载体可掺入多种基因。所有这些载体可转移或掺入选择标记基因,从而可鉴别和生成转导的细胞。逆转录病毒载体可通过连接例如,糖、糖脂或蛋白而具有靶特异性。优选通过使用抗体实现靶向作用。本领域技术人员将认识到,特定的多核苷酸序列可被插入逆转录病毒基因组或连接至病毒包膜,以允许包含该ActRIIa多核苷酸的逆转录病毒载体的靶特异性送递。
或者,可采用编码逆转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒通过传统的磷酸钙转染直接转染组织培养细胞。然后用含有感兴趣的基因的载体质粒转染这些细胞。所得的细胞将该逆转录病毒载体释放进入培养基。
ActRIIa多核苷酸的另一靶向送递系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠以及基于脂质的系统(包括水包油乳状液、微团、混合微团以及脂质体)。本发明优选的胶体系统为脂质体。脂质体是可在体外和体内用作送递载体的人工膜泡。RNA、DNA和完整的病毒体可被包封在水相内部,并以生物活性形式送递至细胞(例如,参见Fraley等人,Trends Biochem. Sci.,6:77,1981)。使用脂质体载体有效转移基因的方法已为本领域所知,例如,参见Mannino等人,Biotechniques,6:682,1988。脂质体的组成通常为磷脂的组合,并常与类固醇(特别是胆固醇)联用。也可使用其它的磷脂或其它的脂质。脂质体的物理特征依赖于pH、离子强度以及二价阳离子的存在。
用于产生脂质体的脂质的例子包括磷脂酰基化合物,如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂以及神经节苷脂。例示性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。脂质体的靶向也可能基于,例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性,并且在本领域内是已知的。
实施例
以上对本发明进行了一般描述,参考以下的实施例将更容易理解本发明,所包括的实施例仅仅是为了举例说明本发明的某些实施方案和实施方案,并不意欲限制本发明。
实施例
1
:
ActRIIa-Fc
融合蛋白
申请人构建了一种具有人ActRIIa胞外域的可溶性ActRIIa融合蛋白,所述胞外域用最小的接头融合于人或小鼠的Fc结构域。所述构建体分别称为ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc。
ActRIIa-hFc如下所示,其纯化自CHO细胞系(SEQ ID NO: 7):
ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。考虑三种不同的前导序列:
(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ
ID NO: 8);
(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA):
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9);
(iii) 天然序列: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA
(SEQ ID NO: 10)。
选择的形式采用TPA前导序列,且具有以下的未加工的氨基酸序列:
这种多肽由以下的核酸序列编码:
ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc都明显易于重组表达。如图1中所示,所述蛋白被纯化为单一、充分确定的蛋白峰。N-末端测序揭示单一序列-ILGRSTQE (SEQ ID NO: 11)。纯化可通过一系列的柱层析步骤来实现,包括例如任意顺序的以下三种或更多种:蛋白质A层析,Q琼脂糖层析,苯基琼脂糖层析、大小排阻层析以及阳离子交换层析。所述纯化可用病毒过滤和缓冲液交换来完成。如大小排阻层析测得的,ActRIIa-hFc蛋白纯化至纯度>98%,而通过SDS PAGE测得的纯度>95%。
ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc对配体表现出高的亲和力,尤其对激活素A。使用标准的胺偶联程序将GDF-11或激活素A (“ActA”)固定在Biacore CM5芯片上。将ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白载入到系统中,对结合进行测定。ActRIIa-hFc以5x10-12的解离常数(KD)与激活素结合,蛋白以9.96x10-9的KD与GDF11结合(参见图2)。 ActRIIa-mFc的行为类似。
在药代动力学中研究中,ActRIIa-hFc非常稳定。给予大鼠1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg 的ActRIIa-hFc 蛋白,并在24、48、72、144和168小时测量蛋白的血浆浓度。在分开的研究中,大鼠的给药剂量为1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg。在大鼠中,ActRIIa-hFc的血清半衰期为11-14天,两周以后,药物的循环水平相当高(对于初次施用1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg,分别为11μg/ml、110μg/ml或304μg/ml)。在猕猴中,血浆半衰期基本上大于14天,在初次施用1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg时的药物循环水平分别为25μg/ml、304μg/ml 或1440μg/ml。人类中的初步结果提示血清半衰期是约20-30天。
实施例
2: ActRIIa-hFc
蛋白的表征
使用组织纤溶酶原前导序列SEQ ID NO:9,使ActRIIa-hFc融合蛋白在稳定转染的CHO-DUKX B11细胞中从pAID4载体(SV40 ori/增强子,CMV启动子)表达。按以上实施例1中所述纯化的蛋白的具有SEQ ID NO:7的序列。Fc部分是如序列SEQ ID NO:7中所示的人IgG1 Fc序列。唾液酸分析结果表明蛋白中平均含有约1.5-2.5摩尔的唾液酸/摩尔ActRIIa-hFc融合蛋白。
这种纯化的蛋白在所有测试的动物中表现出显著长的血清半衰期,包括病人中的25-32天的半衰期(见以下的实施例6)。此外,与报道的在人293细胞中表达的ActRIIa-hFc融合蛋白(del Re 等人 J Biol Chem. 2004.12
17;279(51):53126-35)相比,CHO细胞表达的物质对激活素B配体具有更高的亲和力。此外,使用tPa前导序列比使用其它的前导序列提供更大的产量,并且与天然的前导序列表达的ActRIIa-Fc不同,使用tPa前导序列提供了高纯度的N-末端序列。使用天然的前导序列产生两种主要的ActRIIa-Fc,每种都具有不同的N-末端序列。
实施例
3
:
ActRIIa-hFc
提高非人灵长类动物中的红细胞水平
该研究使用四组,每组五只雄性和五只雌性猕猴,其中每组每种性别中的三只计划在第29天终止,并计划每组每种性别中的两只在第57天终止。每只动物在第1、8、15和22天通过静脉内(IV)注射施用载体(组1)或剂量为1、10或30 mg/kg的ActRIIa-Fc(分别为组2,3和4)。剂量体积维持在3 mL/kg。在第一次施用前2天和第一次施用后15、29和57天(针对剩余的两只动物)评估红细胞水平的多个测量值。
在整个研究中的所有剂量水平和时间点,ActRIIa-hFc均引起了雄性和雌性平均红细胞参数(红细胞计数[RBC],血红蛋白[HGB]和血细胞比容[HCT])的统计学上显著升高,并伴有绝对和相对网织红细胞计数(ARTC;RTC)的增加。参见图3-6。
计算每个治疗组相对于该治疗组基线均值的统计学显著性。
明显地,红细胞计数和血红蛋白水平的上升的幅度约等于对促红细胞生成素所报导的作用。采用ActRIIa-Fc时这些作用的开始比采用促红细胞生成素时更为快速。
在大鼠和小鼠中观察到了类似的结果。
实施例
4
:
ActRIIa-hFc
提高人类患者中的红细胞水平和骨形成的标志
将实施例1中描述的ActRIIa-hFc融合蛋白在随机、双盲、安慰剂对照的研究中施用至人类患者,该研究主要用于评估该蛋白健康、绝经后女性的安全性。48位受试者被随机分为6个队列,以接受单剂ActRIIa-hFc或安慰剂(5个活性:1个安慰剂)。剂量水平范围为静脉内(IV) 0.01-3.0 mg/kg至皮下(SC) 0.03-0.1 mg/kg。所有的受试者均随访120天。除了药代动力学(PK)分析,还通过测量骨形成和重吸收的生化标志以及FSH水平来评估ActRIIa-hFc的生物活性。
为了寻找潜在的改变,在研究过程中详细检查所有受试者的血红蛋白和RBC计数,并与基线水平进行比较。在相同的时间比较血小板计数,作为对照。血小板计数并未随时间从基线值产生具有临床意义的改变。
对ActRIIa-hFc的PK分析显示了与剂量呈线性的曲线,平均半衰期约为25-32天。ActRIIa-hFc的曲线下面积(AUC)与剂量线性相关,且在SC给药后的吸收基本完全(参见图7和8)。这些数据显示SC是理想的给药途径,因为它为该药物提供了等同的生物利用度和血清半衰期,同时避免了与IV给药首几天相关的药物血清浓度的峰值(见图8)。ActRIIa-hFc引起了骨特异性的碱性磷酸酶(BAP)(合成代谢骨生长的标志)的血清水平的快速、持续的剂量依赖性上升,以及C末端1型胶原端肽和酒石酸抗性酸性磷酸酶5b水平(骨重吸收的标志)的剂量依赖性下降。其它的标志(如P1NP)显示了不确定的结果。BAP水平在最高药物剂量下显示接近饱和效应,表示在0.3 mg/kg的剂量下可实现对该合成代谢骨标志的半最大效应,所述剂量可上升最多3 mg/kg。由药物的药效作用与AUC的关系计算得到EC50为51,465(天*ng/ml)。参见图9。在所测试的最高剂量水平下,这些骨生物标志的改变持续约120天。与激活素的抑制相一致,血清FSH水平也存在剂量依赖性下降。
整体而言,在研究的第一周仅有极少的非药物相关性血红蛋白减少,这可能与不管是IV还是SC给予的0.01和0.03 mg/kg组的静脉切开放血术研究相关。0.1 mg/kg SC和IV血红蛋白结果在第8-15天保持稳定或者显示了略微的上升。在0.3 mg/kg IV剂量水平,早在第2天便可看到HGB水平的明显上升,并通常在第15-29天出现峰值,这在安慰剂受试者中并未出现。在1.0 mg/kg的IV剂量和 3.0 mg/kg的IV剂量,反应于单剂观察到血红蛋白的平均增加大于1 g/dl,伴随RBC计数和血细胞比容的相应增加。这些血液学参数在给药后约60天达到峰值,并且到第120天显著降低。这表明如果以小于120天的间隔进行(即,在回归到基线前),为了提高红细胞水平的目的进行的给药可能更有效,90天或更小或60天或更小的给药间隔可能是理想的。关于血液学改变的概括,参见图10-13。
总体上,ActRIIa-hFc显示对红细胞计数和网织红细胞计数的剂量依赖性作用,和对骨形成标志的剂量依赖性作用。
实施例
5
:用
ActRIIa-hFc
治疗贫血患者
设计临床研究,用于以0.1 mg/kg、0.3 mg/kg和1.0 mg/kg的剂量水平,用多剂ActRIIa-hFc治疗患者,每30天给药。试验中的正常健康患者表现血红蛋白和血细胞比容的增加,这与实施例4中报道的I期临床试验中观察到的增加一致,只是在某些情况下,血红蛋白和血细胞比容增加到超过了正常范围。血红蛋白约7.5的贫血患者也以1mg/kg水平接受2剂,导致在两个月后血红蛋白水平大约10.5。患者的贫血是小红细胞性贫血,认为这是由慢性缺铁导致的。
实施例
6. ActRIIa-mFc
通过刺激脾红细胞释放提高小鼠中的红细胞水平
在该研究中,分析了体内施用ActRIIa-mFc对骨髓和脾中造血祖细胞的频率的影响。给一组小鼠注射作为对照的PBS,第二组小鼠施用两剂10 mg/kg的ActRIIa-mFc,这两组都在8天后处死。用外周血进行全血细胞计数,用股骨和脾进行体外产克隆测定,用于评估每个器官中的淋巴祖细胞、祖红细胞和骨髓祖细胞含量。在外周血中,在化合物治疗的小鼠中观察到了红细胞和血红蛋白含量的显著增加。在股骨中,在对照和治疗组之间有核细胞数目或祖细胞含量方面没有差异。在脾中,化合物治疗组在红细胞裂解前的有核细胞数和每培养皿的成熟祖红细胞(CFU-E)集落数、每个脾的祖细胞频率和总数方面经历了统计学显著的增加。此外,在每个脾的骨髓祖细胞(CFU-GM)、未成熟的祖红细胞(BFU-E)和总祖细胞数目方面观察到了增加。
动物:
将16只6-8周龄的BDF1雌性小鼠用于研究中。以10 mg/kg的剂量在第1和3天给8只小鼠皮下注射测试化合物ActRIIa-mFc,并且以每只小鼠100 μL的体积给8只小鼠皮下注射载体对照,即磷酸缓冲盐水(PBS)。第一次注射后8天根据相关动物管理指南处死所有小鼠。通过心脏穿刺收集来自个体动物的外周血(PB)样品,并且用于全血细胞计数和分类计数 (CBC/Diff)。从每只小鼠收获股骨和脾。
进行的测试:
CBC/Diff计数
通过心脏穿刺收集来自每只小鼠的PB,并且放置在合适的microtainer管中。将样品送到CLV,用于在CellDyn 3500计数器上进行分析。
产克隆测定
用下文描述的体外基于甲基纤维素的培养基系统评估骨髓、红细胞和淋巴系的产克隆祖细胞。
成熟的祖红细胞
在MethoCultTM 3334,即一种含有重组人(rh)促红细胞生成素(3 U/mL)的基于甲基纤维素的培养基中培养成熟的红细胞 (CFU-E)系的产克隆祖细胞。
淋巴祖细胞
在MethoCult® 3630,即一种含rh白介素7 (10 ng/mL)的基于甲基纤维素的培养基中培养淋巴(CFU-pre-B)系的产克隆祖细胞。
骨髓祖细胞和未成熟的祖红细胞
在MethoCultTM 3434,即一种含重组鼠(rm) 干细胞因子(50 ng/mL)、rh白介素6 (10 ng/mL)、rm白介素3 (10 ng/mL)和rh促红细胞生成素(3 U/mL)的基于甲基纤维素的培养基中培养粒细胞-单核细胞(CFU-GM)、红细胞 (BFU-E)和多能细胞(CFU-GEMM)系的产克隆祖细胞。
方法:
通过标准流程处理小鼠股骨和脾。简言之,通过使用21号针头和1 cc注射器,用含2%胎牛血清(IMDM 2% FBS)的Iscove改良的Dulbecco培养基冲洗股骨腔,获得骨髓。通过70 μM过滤器挤压脾,获得脾细胞,用IMDM 2% FBS冲洗过滤器。然后用Neubauer计数室在单细胞悬浮液上进行3%冰醋酸中的有核细胞计数,从而可以计算每个器官的总细胞。为了除去污染红细胞,随后用3倍体积的氯化铵裂解缓冲液稀释总脾细胞,在冰上孵育10分钟。然后洗涤细胞并且重悬于IMDM 2% FBS中,进行第二次细胞计数,以确定裂解后的细胞的细胞浓度。
制备细胞原液,添加到每个基于甲基纤维素的培养基制剂中,获得每个培养基制剂中每种组织的最优铺板浓度。将骨髓细胞以每个培养皿1x105 个细胞铺板到MethoCultTM 3334中,以评估成熟的祖红细胞,以每个培养皿2x105 个细胞铺板到MethoCultTM 3630中,以评估淋巴祖细胞,并且以每个培养皿3x104个细胞铺板到MethoCultTM 3434中,以评估未成熟的祖红细胞和骨髓祖细胞。将脾细胞以每个培养皿4x105 个细胞铺板到MethoCultTM 3334中,以评估成熟的祖红细胞,以每个培养皿4x105 个细胞铺板到MethoCultTM 3630中,以评估淋巴祖细胞,并且以每个培养皿2x105个细胞铺板到MethoCultTM 3434中,以评估未成熟的祖红细胞和骨髓祖细胞。铺板到三个重复培养皿的培养物在37°C, 5% CO2中孵育,直到由受过训练的人进行集落计数和评价。将成熟的祖红细胞培养2天,将淋巴祖细胞培养7天,将成熟的祖红细胞和骨髓祖细胞培养12天。
分析
对于产克隆测定的三次重复培养物,并且对于所有数据集的对照和治疗组计算平均值 +/- 1标准差。
如下计算每个组织中的集落形成细胞(CFC)的频率:
每个培养皿铺板的细胞
每个培养皿的平均CFC得分
每个股骨或脾的总CFC如下计算:
总CFC得分x每个股骨或脾的有核细胞计数(RBC裂解后)
培养的有核细胞数
进行标准t检验,用于评估在PBC对照小鼠和化合物治疗小鼠之间细胞或造血祖细胞的平均数是否有差异。由于集落计数可能具有主观性,小于0.01的p值认为是显著的。每组的平均值(+/- SD)示于下表。
表
:
血液学参数
* = p <
0.01
**= p <
0.0005
表
:
来自股骨和脾的
CFC
* = p <
0.005
**= p <
0.0001
用ActRIIa-mFc治疗小鼠导致一些造血参数的显著增加。在外周血中,在化合物治疗的小鼠中观察到了红细胞和血红蛋白含量的显著增加。在股骨中,在对照和治疗组之间有核细胞数目或祖细胞含量方面没有差异。在脾中,化合物治疗组在红细胞裂解前的有核细胞数目和每个培养皿的成熟祖红细胞(CFU-E)集落数目、每个脾的祖细胞频率和总数方面经历了统计学显著的增加。此外,在每个脾的骨髓祖细胞(CFU-GM)、不成熟的祖红细胞(BFU-E)和总祖细胞数目方面观察到了增加。
实施例
7
:
替代的
ActRIIa-Fc
蛋白
公布为WO2006/012627(例如,参见第55-58页)的国际专利申请中描述了多种可根据本文所述的方法使用的ActRIIa变体,所述专利申请在此通过全文引用并入本文。替代的构建体可去除C末端尾(ActRIIa胞外域的最后15个氨基酸)。该种构建体的序列显示如下(Fc部分下划线显示)(SEQ ID NO: 12):
实施例
8: ActRIIA-mFc
对小鼠中化疗诱导的贫血的作用
申请人研究了ActRIIA-mFc对小鼠中化疗诱导的贫血的作用。在两个研究中的第一个,在单剂化疗剂紫杉醇(20 mg/kg, i.p.)前,用单剂ActRIIA-mFc (10 mg/kg,
s.c.) 或载体(磷酸缓冲盐水)治疗6周龄的雌性C57BL/6小鼠3天。在化疗前采集血样,然后在施用紫杉醇后3、7和14天(每个时间点每个队列n = 6)采集。ActRIIA-mFc预防了原本在施用紫杉醇后观察到的血细胞比容水平降低(图15),并且对血红蛋白浓度和RBC计数观察到了相似作用。在第二个研究中,在施用紫杉醇(20 mg/kg 单剂, i.p.)前开始给予6周龄的雌性C57BL/6小鼠不同剂数的ActRIIA-mFc (10 mg/kg,
s.c.)或载体(PBS),并且以3或4天的间隔继续。在施用紫杉醇后3、7和14天(每个时间点每个队列n = 8)采集血样。在第14天,ActRIIA-mFc治疗逐渐提高了血细胞比容水平,其作为剂数的函数(图16)。因此,ActRIIA-mFc能够足够地刺激红细胞生成,从而减轻或预防化疗诱导的贫血。
实施例
9: ActRIIA-mFc
对慢性肾疾病的小鼠模型中贫血的作用
申请人研究了ActRIIA-mFc对作为慢性肾疾病模型的小鼠中肾切除术诱导的贫血的作用。在两个研究中第一个,雌性C57BL/6小鼠进行部分手术肾切除术,去除了总肾体积的大约5/6,以减少促红细胞生成素的产生。给予小鼠4周的恢复期,其中采用高脂肪饮食,从而进一步促进肾缺陷,然后用ActRIIA-mFc (10 mg/kg,
s.c.)或载体 (PBS)每周治疗小鼠两次,总共8周。在给药开始前、治疗4周后和治疗8周后(每个时间点每个队列n = 8)采集血样。对照小鼠在8周治疗期中表现出血细胞比容水平的降低,而ActRIIA-mFc治疗在4周时防止了降低,并且在8周时产生了有益的趋势(图17)。在第二个研究中观察到了ActRIIA-mFc治疗相对于对照的相似益处,该研究主要的不同是使用了更长的恢复期(2个月)和标准饮食。因此,ActRIIA-mFc能够足够地刺激红细胞生成,从而预防或减轻慢性肾脏疾病模型中的贫血。
综合考虑,这些发现表明,可溶性ActRIIA-Fc融合蛋白可以用作TGF-家族配体导致的信号传导的拮抗剂,以提高循环红细胞水平,从而治疗由慢性疾病如癌和肾疾病导致的低增殖性贫血,并且可能治疗其它炎性或感染性疾病。注意与啮齿动物中较适中的作用相比,ACE-011对人患者中的贫血的作用一般是强的。
通过引用并入
本文所提及的所有公开文献和专利均通过全文引用并入本文,如同每一个单独的公开文献和专利均被特别地和单独地通过引用并入。
尽管已经讨论了主题的特定实施方式,以上的说明书仅作阐述之用,而不具有限制性。在阅读本说明书和以下权利要求书后,本发明的许多变化形式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明的完整范围应当参照权利要求书及其所有的等同范围以及说明书及各种变化形式得以确定。
Claims (32)
1. 提高有需要的患者中的红细胞水平的方法,该方法包括以每周一次到每90天一次的给药间隔,给患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂。
2. 权利要求1的方法,其中给药间隔是每周一次到每60天一次。
3. 提高有需要的患者中的红细胞水平和骨形成的方法,该方法包括给患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂。
4. 治疗有需要的患者中的贫血的方法,该方法包括给患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂。
5. 增加从脾释放红细胞的方法,该方法包括给患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗剂。
6. 权利要求5的方法,其中所述患者患有骨髓的病症。
7. 提高患者中的红细胞水平的方法,该方法包括施用有效量的激活素拮抗剂和促红细胞生成素激动剂。
8. 权利要求1-7的任一项的方法,其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是与选自激活素和ActRIIa的靶蛋白结合的抗体。
9. 权利要求1-7的任一项的方法,其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是抑制素或抑制素的保守变体。
10. 权利要求1-7的任一项的方法,其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是包含结合并拮抗激活素的促滤泡素抑制素结构域的蛋白。
11. 权利要求1-7的任一项的方法,其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是选自下组的蛋白:促滤泡素抑制素、FLRG和前述物质的保守变体。
12. 权利要求1-7的任一项的方法,其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是选自下组的ActRIIa多肽:
a) 包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽;
b) 包含与SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽;
c) 包含选自SEQ ID NO: 2的至少50个连续氨基酸的多肽;
d) 包含与SEQ ID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽;和
e) 包含由在严格条件下与SEQ ID NO: 5的互补序列杂交的核酸编码的氨基酸序列的蛋白。
13. 权利要求12的方法,其中所述多肽具有一种或多种以下特征:
i) 以至少10-7 M的KD结合ActRIIa配体;和
ii) 抑制细胞中的ActRIIa信号传导。
14. 权利要求12的方法,其中所述多肽是融合蛋白,其除了包含ActRIIa多肽结构域外,还包含一种或多种多肽部分,所述多肽部分增强以下一种或多种:体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形成和/或纯化。
15. 权利要求12的方法,其中所述融合蛋白包括选自免疫球蛋白Fc结构域和血清白蛋白的多肽部分。
16. 权利要求12的方法,其中所述多肽包括一个或多个选自下组的修饰的氨基酸残基:糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
17. 权利要求12的方法,其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列:
a) SEQ ID NO: 3的氨基酸序列,
b) SEQ ID NO: 2的氨基酸序列,
c) SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。
18. 权利要求4的方法,其中所述患者患有低增殖性贫血。
19. 权利要求18的方法,其中所述患者患有肾疾病。
20. 权利要求18的方法,其中所述患者患有癌。
21. 权利要求20的方法,其中所述癌选自多发性骨髓瘤和乳腺癌。
22. 权利要求18的方法,其中所述患者是缺铁的。
23. 权利要求18的方法,其中所述患者患有骨髓的病症。
24. 权利要求4的方法,其中所述患者患有小红细胞性贫血。
25. 权利要求4的方法,其中所述患者已经用骨髓抑制疗法进行过治疗。
26. 权利要求25的方法,其中所述骨髓抑制疗法选自放疗和化疗。
27. 权利要求25的方法,其中所述骨髓移植疗法选自:烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、激酶抑制剂、有丝分裂抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。
28. 权利要求25的方法,其中患者已经用紫杉烷进行过治疗。
29. 权利要求28的方法,其中所述紫杉烷是紫杉醇。
30. 权利要求3的方法,其中所述患者患有贫血和骨丢失。
31. 权利要求3的方法,其中所述患者患有选自下组的病症:炎性肠病、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、实体瘤和肾病症。
32. 权利要求3的方法,其中所述患者患有末期肾疾病。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710403739.0A CN107252486B (zh) | 2008-06-26 | 2009-06-26 | 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13336808P | 2008-06-26 | 2008-06-26 | |
US61/133368 | 2008-06-26 | ||
PCT/US2009/003838 WO2009158033A2 (en) | 2008-06-26 | 2009-06-26 | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710403739.0A Division CN107252486B (zh) | 2008-06-26 | 2009-06-26 | 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102131515A true CN102131515A (zh) | 2011-07-20 |
CN102131515B CN102131515B (zh) | 2017-06-27 |
Family
ID=41445146
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710403739.0A Active CN107252486B (zh) | 2008-06-26 | 2009-06-26 | 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 |
CN200980133280.0A Active CN102131515B (zh) | 2008-06-26 | 2009-06-26 | 激活素‑actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710403739.0A Active CN107252486B (zh) | 2008-06-26 | 2009-06-26 | 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (4) | EP3804746A1 (zh) |
JP (8) | JP5773868B2 (zh) |
KR (4) | KR20210047374A (zh) |
CN (2) | CN107252486B (zh) |
AU (4) | AU2009262968A1 (zh) |
CA (3) | CA2729054C (zh) |
DK (1) | DK2318028T3 (zh) |
ES (2) | ES2852699T3 (zh) |
HK (1) | HK1245147A1 (zh) |
NZ (2) | NZ602471A (zh) |
WO (2) | WO2009158033A2 (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104981250A (zh) * | 2012-10-24 | 2015-10-14 | 细胞基因公司 | 用于治疗贫血的方法 |
CN110461349A (zh) * | 2016-11-10 | 2019-11-15 | 科乐斯疗法公司 | 激活素受体iia型变体及其使用方法 |
CN113015743A (zh) * | 2018-11-15 | 2021-06-22 | 三菱化学株式会社 | 改变型激活素a |
CN113583104A (zh) * | 2014-06-04 | 2021-11-02 | 阿塞勒隆制药公司 | 促滤泡素抑制素多肽、其组合物及其使用方法 |
US11884715B2 (en) | 2018-01-12 | 2024-01-30 | Keros Therapeutics, Inc. | Activin receptor type IIB variants and methods of use thereof |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2426005T3 (es) | 2004-07-23 | 2013-10-18 | Acceleron Pharma Inc. | Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones |
US8128933B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
AU2006318449B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-07-05 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-actRIIa antagonists and uses for promoting bone growth |
US8895016B2 (en) | 2006-12-18 | 2014-11-25 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
CA2677007A1 (en) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer |
TWI782836B (zh) | 2007-02-02 | 2022-11-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
TWI667038B (zh) | 2007-02-09 | 2019-08-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 包含ActRIIa-Fc融合蛋白的醫藥組合物;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途 |
US7960343B2 (en) | 2007-09-18 | 2011-06-14 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-ActRIIa antagonists and uses for decreasing or inhibiting FSH secretion |
US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
SI3750552T1 (sl) * | 2008-08-14 | 2023-10-30 | Acceleron Pharma Inc. | GDF pasti |
CA2749544A1 (en) | 2009-01-13 | 2010-07-22 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing adiponectin |
EP3845239A1 (en) | 2009-06-08 | 2021-07-07 | Acceleron Pharma Inc. | Use of anti-actriib proteins for increasing thermogenic adipocytes |
CN107267520A (zh) | 2009-06-12 | 2017-10-20 | 阿塞勒隆制药公司 | 截短的actriib‑fc融合蛋白 |
AU2015203400A1 (en) * | 2009-08-13 | 2015-07-16 | Acceleron Pharma Inc. | Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels |
CN102655872B (zh) * | 2009-08-13 | 2016-01-20 | 阿塞勒隆制药公司 | Gdf捕获物和促红细胞生成素受体激活剂联合应用以增加红细胞水平 |
US8710016B2 (en) | 2009-11-17 | 2014-04-29 | Acceleron Pharma, Inc. | ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy |
CN103298832A (zh) * | 2010-11-08 | 2013-09-11 | 阿塞勒隆制药公司 | Actriia结合剂及其用途 |
GR1007832B (el) * | 2011-11-21 | 2013-02-14 | Ιδρυμα Ιατροβιολογικων Ερευνων Ακαδημιας Αθηνων, | Αδρανοποιητες της ακτιβινης και χρηση τους για την θεραπεια ασθενειων που σχετιζονται με παρεκκλινουσα ενεργοποιηση της "αμυντικης αποκρισης του ξενιστη" |
US9809636B2 (en) | 2012-04-06 | 2017-11-07 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9 |
CA2890217C (en) | 2012-11-02 | 2021-07-20 | Yifu FANG | Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders |
WO2014116981A1 (en) * | 2013-01-25 | 2014-07-31 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Follistatin in treating duchenne muscular dystrophy |
EP3131931B1 (en) * | 2014-04-18 | 2020-10-21 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease |
WO2015192111A1 (en) * | 2014-06-13 | 2015-12-17 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods and compositions for treating ulcers |
MA41052A (fr) | 2014-10-09 | 2017-08-15 | Celgene Corp | Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii |
BR112017011722A2 (pt) | 2014-12-03 | 2018-02-27 | Acceleron Pharma Inc | antagonistas de activina-actrii e usos para o tratamento de anemia |
HUE054180T2 (hu) * | 2015-04-06 | 2021-08-30 | Acceleron Pharma Inc | Egykarú I. típusú és II. típusú receptorral rendelkezõ fúziós fehérjék, illetve ezek alkalmazásai |
PL3286206T3 (pl) | 2015-04-22 | 2021-09-13 | Biogen Ma Inc. | Nowe hybrydowe białka pułapki na ligand actriib do leczenia chorób powodujących zanik mięśni |
KR20180096645A (ko) | 2015-11-23 | 2018-08-29 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 눈 질환의 치료 방법 |
EP3439741A4 (en) * | 2016-04-06 | 2020-05-06 | Acceleron Pharma Inc. | ALK7 ANTAGONISTS AND USES THEREOF |
WO2018067874A1 (en) * | 2016-10-05 | 2018-04-12 | Acceleron Pharma Inc. | Variant actriib proteins and uses thereof |
JP7258021B2 (ja) | 2017-11-09 | 2023-04-14 | ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド | アクチビンIIa型受容体変異体を含む医薬組成物 |
AU2019266314A1 (en) * | 2018-05-09 | 2020-11-19 | Keros Therapeutics, Inc. | Activin receptor type iia variants and methods of use thereof |
Family Cites Families (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US1265208A (en) | 1915-09-07 | 1918-05-07 | Edward C Kahn | Liquid-fuel burner. |
US5080891A (en) | 1987-08-03 | 1992-01-14 | Ddi Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5096815A (en) | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
US5198346A (en) | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
EP0548276A4 (en) * | 1990-09-13 | 1993-12-29 | Children's Hospital Medical Center Of Northern California | Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides |
US5677196A (en) | 1993-05-18 | 1997-10-14 | University Of Utah Research Foundation | Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays |
US5525490A (en) | 1994-03-29 | 1996-06-11 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Reverse two-hybrid method |
US5814565A (en) | 1995-02-23 | 1998-09-29 | University Of Utah Research Foundation | Integrated optic waveguide immunosensor |
NZ502795A (en) | 1995-04-11 | 2001-09-28 | Gen Hospital Corp | Method of identifying molecular interactions employing counterselection and at least two hybrid molecules or two hybrid systems |
US6231880B1 (en) * | 1997-05-30 | 2001-05-15 | Susan P. Perrine | Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders |
US6953662B2 (en) * | 1997-08-29 | 2005-10-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Follistatin-3 |
JP2001513982A (ja) * | 1997-08-29 | 2001-09-11 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | フォリスタチン−3 |
US6468543B1 (en) * | 1999-05-03 | 2002-10-22 | Zymogenetics, Inc. | Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4 |
CA2418835A1 (en) | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Phylos, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
AU2002256371B2 (en) | 2001-04-26 | 2008-01-10 | Amgen Mountain View Inc. | Combinatorial libraries of monomer domains |
US7074901B2 (en) * | 2001-05-25 | 2006-07-11 | Serono Genetics Institute S.A. | Isolated human vCOL16A1 polypeptide and fragments thereof |
US6855344B2 (en) * | 2001-07-17 | 2005-02-15 | Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. | Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation |
US20040223966A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-11-11 | Wolfman Neil M. | ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor |
US20070184052A1 (en) * | 2003-05-09 | 2007-08-09 | Lin Herbert Y | Soluble tgf-b type III receptor fusion proteins |
WO2005025601A1 (en) | 2003-09-15 | 2005-03-24 | Monash University | Follistatin isoforms and uses thereof |
JP4688483B2 (ja) | 2004-04-15 | 2011-05-25 | 株式会社テクノネットワーク四国 | フォリスタチン変異体ポリペプチド |
ES2426005T3 (es) | 2004-07-23 | 2013-10-18 | Acceleron Pharma Inc. | Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones |
EP1778275A2 (en) * | 2004-08-12 | 2007-05-02 | Wyeth | Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using gdf-8 inhibitors |
US20060234299A1 (en) | 2004-11-16 | 2006-10-19 | Avidia Research Institute | Protein scaffolds and uses thereof |
AU2006318449B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-07-05 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-actRIIa antagonists and uses for promoting bone growth |
CA2652235A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Hemaquest Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating blood disorders |
US20090288739A1 (en) * | 2006-07-13 | 2009-11-26 | Basf Se | Binder-comprising thermoplastic compositions for producing shaped metallic bodies |
EP2484352B1 (en) * | 2006-07-21 | 2014-07-09 | Lyne Laboratories, Inc. | Liquid compositions of calcium acetate |
WO2008030367A2 (en) | 2006-09-01 | 2008-03-13 | The General Hospital Corporation | Selective myostatin inhibitors |
US7547781B2 (en) * | 2006-09-11 | 2009-06-16 | Curis, Inc. | Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety |
CN104524548A (zh) * | 2006-12-18 | 2015-04-22 | 阿塞勒隆制药公司 | 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 |
TWI782836B (zh) | 2007-02-02 | 2022-11-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
TWI667038B (zh) | 2007-02-09 | 2019-08-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 包含ActRIIa-Fc融合蛋白的醫藥組合物;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途 |
US7960343B2 (en) * | 2007-09-18 | 2011-06-14 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-ActRIIa antagonists and uses for decreasing or inhibiting FSH secretion |
DE102008016742B4 (de) * | 2008-03-31 | 2010-01-14 | Thyssenkrupp Presta Ag | Lenksäule für ein Kraftfahrzeug |
-
2009
- 2009-06-26 CN CN201710403739.0A patent/CN107252486B/zh active Active
- 2009-06-26 DK DK09770571.9T patent/DK2318028T3/da active
- 2009-06-26 EP EP20195139.9A patent/EP3804746A1/en not_active Withdrawn
- 2009-06-26 KR KR1020217011646A patent/KR20210047374A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-06-26 AU AU2009262968A patent/AU2009262968A1/en not_active Abandoned
- 2009-06-26 CA CA2729054A patent/CA2729054C/en active Active
- 2009-06-26 JP JP2011516323A patent/JP5773868B2/ja active Active
- 2009-06-26 ES ES09770553T patent/ES2852699T3/es active Active
- 2009-06-26 NZ NZ602471A patent/NZ602471A/en unknown
- 2009-06-26 ES ES09770571T patent/ES2791699T3/es active Active
- 2009-06-26 KR KR1020177008278A patent/KR102024444B1/ko active IP Right Grant
- 2009-06-26 CA CA3049354A patent/CA3049354A1/en not_active Abandoned
- 2009-06-26 CN CN200980133280.0A patent/CN102131515B/zh active Active
- 2009-06-26 EP EP09770553.7A patent/EP2303917B1/en active Active
- 2009-06-26 EP EP09770571.9A patent/EP2318028B1/en active Active
- 2009-06-26 CA CA2729098A patent/CA2729098C/en active Active
- 2009-06-26 KR KR1020197012336A patent/KR20190049912A/ko active Application Filing
- 2009-06-26 NZ NZ590326A patent/NZ590326A/xx unknown
- 2009-06-26 KR KR1020117001139A patent/KR20110031951A/ko active Application Filing
- 2009-06-26 WO PCT/US2009/003838 patent/WO2009158033A2/en active Application Filing
- 2009-06-26 EP EP19191414.2A patent/EP3620795A1/en not_active Withdrawn
- 2009-06-26 WO PCT/US2009/003808 patent/WO2009158015A2/en active Application Filing
-
2014
- 2014-02-07 JP JP2014022289A patent/JP2014088438A/ja not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-07-23 JP JP2015145499A patent/JP2015187180A/ja not_active Withdrawn
-
2016
- 2016-05-12 AU AU2016203098A patent/AU2016203098B2/en active Active
- 2016-11-11 JP JP2016220297A patent/JP2017036331A/ja not_active Withdrawn
-
2018
- 2018-04-16 HK HK18104885.0A patent/HK1245147A1/zh unknown
- 2018-06-08 AU AU2018204105A patent/AU2018204105A1/en not_active Abandoned
- 2018-09-03 JP JP2018164195A patent/JP6643432B2/ja active Active
- 2018-09-03 JP JP2018164196A patent/JP2018184484A/ja not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-12-23 JP JP2019231523A patent/JP2020041002A/ja not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-08-17 AU AU2020220046A patent/AU2020220046A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-10-28 JP JP2021176418A patent/JP2022023184A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104981250A (zh) * | 2012-10-24 | 2015-10-14 | 细胞基因公司 | 用于治疗贫血的方法 |
CN113583104A (zh) * | 2014-06-04 | 2021-11-02 | 阿塞勒隆制药公司 | 促滤泡素抑制素多肽、其组合物及其使用方法 |
CN110461349A (zh) * | 2016-11-10 | 2019-11-15 | 科乐斯疗法公司 | 激活素受体iia型变体及其使用方法 |
US11884715B2 (en) | 2018-01-12 | 2024-01-30 | Keros Therapeutics, Inc. | Activin receptor type IIB variants and methods of use thereof |
CN113015743A (zh) * | 2018-11-15 | 2021-06-22 | 三菱化学株式会社 | 改变型激活素a |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102131515A (zh) | 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 | |
US20210355181A1 (en) | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels | |
CN101687015B (zh) | 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途 | |
CN102131822A (zh) | 进行激活素-ActRIIa拮抗剂给药和监测受治疗患者的方法 | |
CN101835485A (zh) | 活化素-actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途 | |
AU2018282452A1 (en) | Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels | |
ES2543890T3 (es) | Antagonistas de activina-ActRII para su uso en el tratamiento de la anemia |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |