JP2019535268A - アクチビンＩＩａ型受容体変異体およびそれらの使用方法 - Google Patents

アクチビンＩＩａ型受容体変異体およびそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体または部分に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む。本発明はまた、骨損傷、例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を含む疾患および病態を治療するためにこれらのポリペプチドを使用する医薬組成物および方法に関する。

Description

本発明は、アクチビンＩＩａ型受容体変異体およびそれらの使用方法に関する。
健康な骨は、骨の破壊と骨の成長の両方を含む絶え間ないリモデリングを受けている。骨の成長は骨芽細胞種により媒介され、一方、破骨細胞は骨を吸収する。これらのシステムは、同化プログラムのダウンレギュレーション、異化システムのアップレギュレーションまたは両者の組合せによってバランスを欠き正味の骨量減少がもたらされる際に病状が発生する。よって、骨のリモデリングのバランスの制御は、骨折および骨に対する他の損傷の治癒の促進ならびに骨量および骨石灰化の減少に関連する骨粗鬆症などの障害の治療に有用であり得る。
骨の損傷は、加齢性または癌関連の骨量減少、遺伝子的条件、薬物治療の有害副作用、または骨折を含む一定の範囲の根本原因から起こり得る。世界保健機関は、骨粗鬆症だけで米国、欧州および日本で７千５百万人の罹患があり、骨折の重大なリスク因子であると推計している。一般に、骨量減少そのものは、有効な治療がほとんどない病的状態である。代わりに治療は、直接骨の成長を促進し、かつ骨密度を増す薬剤よりも、不動、運動および食事の改善に焦点を当てている。骨粗鬆症に関しては、エストロゲン、カルシトニン、ビタミンＫ併用のオステオカルシン、または高用量の食事性カルシウムは全て、治療的介入として使用されている。骨粗鬆症に対する他の治療アプローチとしては、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ：ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）カルシウム受容体作動薬、スタチン、同化ステロイド、ランタンおよびストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが含まれる。しかしながら、このような治療薬には望まない副作用が伴うことが多い。骨損傷または骨脱灰をもたらす疾患の新規かつ有効な治療の必要性が存在する。
本発明は、細胞外アクチビンＩＩａ型受容体（ＡｃｔＲＩＩａ：ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ＩＩａ）変異体を含むポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドとしては、Ｆｃドメイン単量体または部分のＮ末端またはＣ末端に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む。このような部分は、アミノ酸または他の共有結合によって結合されていてもよい。Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドはまた、２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を介して二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得る。本発明のポリペプチドは、骨損傷、例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動を含む疾患または病態を有する対象において骨量または骨塩密度を増加させるために使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドはまた、骨損傷もしくは骨脱灰を含む疾患もしくは病態を発症するリスクがある対象、またはそのような疾患もしくは病態を有する対象においてミオスタチン、アクチビン、および／または骨形成因子９（ＢＭＰ９）シグナル伝達に作用するために使用することもできる。
一態様において、本発明は、
細胞外アクチビンＩＩａ型受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）変異体を含み、前記変異体は、
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＸ１Ｘ２ＮＡＮＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＸ１７Ｘ１８ＧＣＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号１）
の配列を有し、
配列中、Ｘ１はＦまたはＹであり；Ｘ２はＦまたはＹであり；Ｘ３はＥまたはＡであり；Ｘ４はＫまたはＬであり；Ｘ５はＤまたはＥであり；Ｘ６はＲまたはＡであり；Ｘ７はＰまたはＲであり；Ｘ８はＹまたはＥであり；Ｘ９はＤまたはＥであり；Ｘ１０はＫまたはＱであり；Ｘ１１はＤまたはＡであり；Ｘ１２はＫまたはＡであり；Ｘ１３はＲまたはＡであり；Ｘ１４はＲまたはＬであり；Ｘ１５はＦまたはＹであり；Ｘ１６はＫ、Ｒ、またはＡであり；Ｘ１７はＫ、Ａ、Ｙ、Ｆ、またはＩであり；Ｘ１８はＱまたはＫであり；Ｘ１９はＷまたはＡであり；Ｘ２０はＬまたはＡであり；Ｘ２１はＤ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｎ、またはＩであり；Ｘ２２はＩ、Ｆ、またはＡであり；Ｘ２３はＫまたはＴであり；Ｘ２４はＫまたはＥであり；Ｘ２５はＤまたはＥであり；Ｘ２６はＳまたはＮであり；かつ、Ｘ２７はＥまたはＱであり、かつ前記変異体は、配列番号７３の配列を有する野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａまたは配列番号７６〜９６の配列のうちいずれか１つを有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、ポリペプチドに関する。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９ＫＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＸ１７Ｘ１８ＧＣＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号２）
の配列を有し、配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、およびＸ２７は上記のように定義される。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＥＸ４Ｘ５ＲＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９ＫＤＫＲＸ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＸ１８ＧＣＷＬＤＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号３）
の配列を有し、配列中、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１８、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、およびＸ２７は上記のように定義される。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＥＸ４ＤＲＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９ＫＤＫＲＸ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＸ１８ＧＣＷＬＤＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３ＫＸ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号４）
の配列を有し、配列中、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１８、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５、Ｘ２６、およびＸ２７は上記のように定義される。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＥＸ４ＤＲＴＮＱＴＧＶＥＰＣＸ８ＧＸ９ＫＤＫＲＸ１４ＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＸ１８ＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３ＫＸ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号５）
の配列を有し、配列中、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２３、Ｘ２５、Ｘ２６、およびＸ２７は上記のように定義される。
上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１はＦまたはＹである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２はＦまたはＹである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ３はＥまたはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ４はＫまたはＬである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ５はＤまたはＥである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ６はＲまたはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ７はＰまたはＲである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ８はＹまたはＥである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ９はＤまたはＥである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１０はＫまたはＱである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１１はＤまたはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１２はＫまたはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１３はＲまたはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１４はＲまたはＬである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１５はＦまたはＹである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１６はＫ、Ｒ、またはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１７はＫ、Ａ、Ｙ、Ｆ、またはＩである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１８はＱまたはＫである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１９はＷまたはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２０はＬまたはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２１はＤ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｎ、またはＩである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２２はＩ、Ｆ、またはＡである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２３はＫまたはＴである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２４はＫまたはＥである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２５はＤまたはＥである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２６はＳまたはＮである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２７はＥまたはＱである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ２３はＴであり、Ｘ２４はＥであり、Ｘ２５はＥであり、かつ、Ｘ２６はＮであるか、またはＸ２３はＴであり、Ｘ２４はＫであり、Ｘ２５はＥであり、かつ、Ｘ２６はＮである。上述の実施形態のいずれにおいても、Ｘ１７はＫである。
上述の実施形態のいずれにおいても、前記変異体は、配列番号６〜７２のうちいずれか１つの配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、位置Ｘ２４のアミノ酸は、アミノ酸Ｋで置換可能である。
上述の実施形態のいずれにおいても、位置Ｘ２４のアミノ酸は、アミノ酸Ｅで置換可能である。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、１以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６個を超えるアミノ酸）のＣ末端伸長部をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、アミノ酸配列ＮＰである。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、アミノ酸配列ＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５）である。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端に融合または共有結合された部分をさらに含み得る。この部分は、ポリペプチドの安定性を増すか、または薬物動態特性を改善することができる。いくつかの実施形態では、この部分は、Ｆｃドメイン単量体、Ｆｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミンである。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたＦｃドメイン単量体をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体に融合された本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドは、２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を介して二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、配列番号９７の配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたＦｃドメインをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、野生型Ｆｃドメインは、配列番号１５１の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインは、二量体を形成しない。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号１５２の配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたフィブロネクチンドメインをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンドメインペプチドは、配列番号１５３の配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたヒト血清アルブミンをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、配列番号１５４の配列を有する。
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸スペーサーである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、ＧＧＧ、ＧＧＧＡ（配列番号９８）、ＧＧＧＧ（配列番号１００）、ＧＧＧＡＧ（配列番号１３０）、ＧＧＧＡＧＧ（配列番号１３１）、またはＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号１３２）である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、ＧＧＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号１０１）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０２）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１０３）、ＧＧＡＧ（配列番号１０４）、ＧＧＳＧ（配列番号１０５）、ＡＧＧＧ（配列番号１０６）、ＳＧＧＧ（配列番号１０７）、ＧＡＧＡ（配列番号１０８）、ＧＳＧＳ（配列番号１０９）、ＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１０）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１１）、ＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１３）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１４）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１５）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１６）、およびＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１７）、ＧＧＡＧＧＡ（配列番号１１８）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１１９）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１２０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２１）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１２２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２３）、ＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号１２４）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１２５）、ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号１２６）、およびＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１２７）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号１２８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２９）、ＡＡＡＬ（配列番号１３３）、ＡＡＡＫ（配列番号１３４）、ＡＡＡＲ（配列番号１３５）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１３６）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１３７）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３８）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１３９）、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１４０）、ＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号１４１）、ＲＳＩＡＴ（配列番号１４２）、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ（配列番号１４３）、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号１４４）、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ（配列番号１４５）、ＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＥＡＡＡＫ（配列番号１４７）、またはＰＡＰＡＰ（配列番号１４８）である。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、少なくとも７日の血清半減期を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、２００ｐＭ以上のＫＤでヒト骨形成因子９（ＢＭＰ９）と結合する。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、アクチビンおよび／またはミオスタチンと結合し、ヒトＢＭＰ９との結合は低い（例えば、弱い）。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ヒトＢＭＰ９とは実質的に結合しない。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、８００ｐＭ以下のＫＤでヒトアクチビンＡと結合する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、およそ８００ｐＭ以下のＫＤでヒトアクチビンＢと結合する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、およそ５ｐＭ以上のＫＤでヒトＧＤＦ−１１と結合する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチド）をコードする核酸分子に関する。別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターに関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞に関し、その宿主細胞は、前記２つの態様に記載されている核酸分子またはベクターを含み、この核酸分子またはベクターは宿主細胞内で発現される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを作製する方法に関し、その方法は、ａ）本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供すること、およびｂ）前記ポリペプチドの形成を可能とする条件下、宿主細胞内で前記核酸分子またはベクターを発現させること、を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、またはベクターと１以上の薬学上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物のいくつかの実施形態では、ポリペプチド、核酸分子、またはベクターは治療上有効な量である。
別の態様では、本発明はまた、Ｆｃドメイン単量体（例えば、配列番号９７の配列）のＮ末端またはＣ末端に融合された、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体をそれぞれ含む２つの同一のポリペプチドを含む構築物（例えば、ホモ二量体）に関する。これら２つのポリペプチド内の２つのＦｃドメイン単量体は相互作用して、構築物内にＦｃドメインを形成する。
別の態様では、本発明はまた、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合された、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体をそれぞれ含む２つの異なるポリペプチドを含む構築物（例えば、ヘテロ二量体）に関する。これら２つのポリペプチド内の２つのＦｃドメイン単量体は相互作用して、構築物内にＦｃドメインを形成する。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨塩密度を増加させる方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨吸収を低減する方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨形成を増加させる方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、前記対象は、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する。
別の態様では、本発明は、骨損傷を含む疾患または病態を有する対象において、ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用する（例えば、ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９のそれらの受容体への結合を低減または阻害する）方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。この態様のいくつかの実施形態では、その疾患または病態は、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって原発性骨粗鬆症を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって続発性骨粗鬆症を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって骨減少症を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって骨折を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって骨癌または癌転移関連骨量減少を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによってパジェット病を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって腎性骨異栄養症を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって治療関連骨量減少を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって食事関連骨量減少を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって肥満の治療に関連する骨量減少を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって低重力関連骨量減少を有する対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって不動関連骨量減少を有する対象を治療する方法に関する。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、原発性骨粗鬆症は加齢性骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、原発性骨粗鬆症はホルモン関連骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、続発性骨粗鬆症は不動誘発性骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、続発性骨粗鬆症はグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療はＦＧＦ−２１治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療はＧＬＰ−１治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療は癌治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療は、肥満および／または２型糖尿病のための治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、食事関連骨量減少はくる病である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨形成を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨吸収を低減する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、破骨細胞活性を低減するか、または破骨細胞形成を低減する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、アクチビンおよび／またはミオスタチンのそれらの受容体への結合を低減または阻害する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において血管合併症を引き起こさない（例えば、血管透過性または漏出を増加させない）。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨塩密度を増加させる。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、骨は皮質骨である。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、骨は骨梁である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチド、核酸、ベクター、または医薬組成物は、対象において骨密度を増加させる、骨吸収を低減する、骨吸収の速度を低減する、骨形成を増加させる、骨形成の速度を増す、破骨細胞活性を低減する、骨芽細胞活性を増加させる、またはミオスタチン、アクチビン、および／もしくはＢＭＰ９シグナル伝達に作用するために十分な量で投与される。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号６９の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６９の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＮＰまたはＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５））を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号６９の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号５８の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５８の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＮＰまたはＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５））を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号５８の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号６の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＮＰまたはＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５））を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号６の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号３８の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３８の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＮＰまたはＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５））を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号３８の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号４１の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４１の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＮＰまたはＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５））を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号４１の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号４４の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４４の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＮＰまたはＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５））を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号４４の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号７０の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７０の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＮＰまたはＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５））を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号７０の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号７１の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７１の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部（Ｃ末端に例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸ＶＴＰＫ）を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮ、ならびに／またはＣ末端伸長部を有する配列番号７１の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号７２の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７２の配列を有する変異体は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、ならびに／または位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮを有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋ、ならびに／または位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮもしくはＴＫＥＮを有する配列番号７２の配列を有する治療上有効な量の変異体を投与することによって、必要とする対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象）においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することを含む。
定義
本明細書で使用する場合、用語「細胞外アクチビンＩＩａ型受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）変異体」は、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａに対して少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、下記に示す配列番号７５の配列の太字部分）を有する１回膜貫通型受容体ＡｃｔＲＩＩａの可溶型細胞外部分または配列番号７６〜９６の配列のうちいずれか１つを有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａを含むペプチドを指す。野生型ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質の配列を下記に示し（配列番号７５）、シグナルペプチドを斜体で、細胞外部分を太字で示す。
野生型ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質（配列番号７５）：
細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、配列番号１〜７２のうちいずれか１つの配列を有し得る。特定の実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、配列番号６〜７２（表２）のうちいずれか１つの配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａの配列（配列番号７３）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、またはそれを超える）アミノ酸配列同一性を有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「細胞外ＡｃｔＲＩＩｂ変異体」は、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩｂ（例えば、配列番号７４の配列）に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１回膜貫通型受容体ＡｃｔＲＩＩｂの可溶型細胞外部分を含むペプチドを指す。細胞外ＡｃｔＲＩＩｂ変異体は、下記に示す配列番号１４９の配列を有し得る。
細胞外ＡｃｔＲＩＩｂ変異体（配列番号１４９）：
ＧＲＧＥＡＥＴＲＥＣＩＦＹＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＳＧＬＥＰＣＹＧＤＱＤＫＲＲＨＣＦＡＳＷＫＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＱＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＫＤＳＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ
本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、２つの要素、例えば、ペプチドまたはタンパク質ドメインの間の結合を指す。本明細書に記載のポリペプチドは、ある部分に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含み得る。この部分は、ポリペプチドの安定性を増すか、または薬物動態特性を改善することができる。この部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン）は、リンカーを介してポリペプチドに融合されていてもよい。リンカーは、共有結合またはスペーサーであり得る。用語「結合」は、化学結合、例えば、アミド結合またはジスルフィド結合、または化学反応、例えば、化学共役から作り出されるいずれの種類の結合も指す。用語「スペーサー」は、２つの要素の間に空間および／またはフレキシビリティを設けるために２つの要素、例えば、ペプチドまたはタンパク質ドメインの間に存在する部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）またはアミノ酸配列（例えば、１〜２００アミノ酸の配列）を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部である（例えば、ポリペプチド主鎖により空間が設けられたペプチドに融合されている）。例えば、Ｆｃドメインを形成する２つのヒンジ領域の間のジスルフィド結合の形成は、リンカーと見なされない。
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃドメイン」は、２つのＦｃドメイン単量体の二量体を指す。Ｆｃドメインは、少なくともＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むヒトＦｃドメインと少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％の配列同一性）を有する。Ｆｃドメイン単量体は、第２および第３の抗体定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体はまた、ヒンジドメインも含む。Ｆｃドメインは、例えば可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）など、抗原認識領域として働き得る免疫グロブリンのいずれの部分も含まない。野生型Ｆｃドメインでは、２つのＦｃドメイン単量体は、２つのＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用、ならびに２つの二量体形成Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン間で形成する１以上のジスルフィド結合によって二量体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、「デッドＦｃドメイン」の典型としてエフェクター機能を欠くように変異させてもよい。特定の実施形態では、Ｆｃドメインの各Ｆｃドメイン単量体は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体の間の相互作用または結合を低減するようにＣＨ２抗体定常ドメイン内にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの二量体形成を低減または阻害する１以上のアミノ酸置換を含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＤを含むいずれの免疫グロブリン抗体アイソタイプであってもよい。加えて、Ｆｃドメインは、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であってもよい。Ｆｃドメインはまた、非天然Ｆｃドメイン、例えば、組換えＦｃドメインであってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「アルブミン結合ペプチド」は、血清アルブミンに対して親和性を有し、血清アルブミンと結合する働きをするアミノ酸１２〜１６個のアミノ酸配列を指す。アルブミン結合ペプチドは、例えば、ヒト、マウス、またはラットなど、起源の異なるものであってもよい。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１５２）を有する。
本明細書で使用する場合、用語「フィブロネクチンドメイン」は、例えば、インテグリンなどの膜貫通受容体タンパク質、ならびにコラーゲンおよびフィブリンなどの細胞外マトリックス成分と結合する、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質、またはそのフラグメントを指す。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ ＮＯ：Ｐ０２７５１の配列のアミノ酸６１０〜７０２を有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号１５３）である。他の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、アドネクチンタンパク質である。
本明細書で使用する場合、用語「ヒト血清アルブミン」は、ヒト血漿中に存在するアルブミンタンパク質を指す。ヒト血清アルブミンは、血液中に最も豊富なタンパク質である。ヒト血清アルブミンは、血清タンパク質の約半分を占める。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ ＮＯ：Ｐ０２７６８（配列番号１５４）の配列を有する。
本明細書で使用する場合、用語「融合された」は、化学共役、組換え手段、および化学結合、例えば、アミド結合を含む手段による、２以上の要素、成分、またはタンパク質ドメイン、例えば、ペプチドまたはポリペプチドの組合せまたは結合を表すために使用される。例えば、化学共役、化学結合、ペプチドリンカー、または他のいずれかの共有結合手段を介して２つの単一のペプチドを直列に融合して１つの連続するタンパク質構造、例えばポリペプチドを形成することができる。本明細書に記載のポリペプチドのいくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を、リンカーを介して、ある部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体（例えば、配列番号９７の配列）、野生型Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１５１の配列）、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド（例えば、配列番号１５２の配列）、フィブロネクチンドメイン（例えば、配列番号１５３の配列）、またはヒト血清アルブミン（例えば、配列番号１５４の配列））のＮ末端またはＣ末端に直列で融合させてよい。例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を、ペプチドリンカーを介して、ある部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン）に融合させるが、この場合、ペプチドリンカーのＮ末端を、化学結合、例えば、ペプチド結合を介して細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のＣ末端に融合させ、かつ、ペプチドリンカーのＣ末端を、化学結合、例えば、ペプチド結合を介して、その部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン）のＮ末端に融合させる。
本明細書で使用する場合、用語「Ｃ末端伸長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」は、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７０（例えば、配列番号６〜７０）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチドのＣ末端への１以上のアミノ酸の付加を指す。Ｃ末端伸長部は、１以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれを超えるアミノ酸）であり得る。例示的なＣ末端伸長部は、アミノ酸配列ＮＰ（２個のアミノ酸Ｃ末端伸長部）およびアミノ酸配列ＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５）（６個のアミノ酸Ｃ末端伸長部）である。ポリペプチドの活性を混乱させないいずれのアミノ酸配列も使用可能である。配列番号７１、すなわち、ＮＰのＣ末端伸長部を有する配列番号６９の配列、および配列番号７２、すなわち、ＮＰＶＴＰＫのＣ末端伸長部を有する配列番号６９の配列は、本発明のポリペプチドがＣ末端伸長部を含むように改変され得る可能性のある方法のうち２つに相当する。
本明細書で使用する場合、用語「同一性パーセント（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ（％）ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列をアラインし、最大同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後（すなわち、ギャップは、最適なアラインメントのために候補配列と参照配列の一方または両方に導入することができ、比較の目的で非相同配列を無視することができる）、参照配列、例えば、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａ（例えば、配列番号７３）のアミノ酸（または核酸）残基と同一である、候補配列、例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージを指す。同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公開コンピュータソフトウエアを使用するなど、当技術分野の技術の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを得るために必要なアルゴリズムを含め、アラインメントを評価するための適当なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、所与の参照配列に対する（ｔｏ，ｗｉｔｈ，ｏｒ ａｇａｉｎｓｔ）所与の候補配列のアミノ酸（または核酸）配列同一性パーセント（あるいは、これは所与の参照配列に対して特定のアミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを有するまたは含む所与の候補配列と表現することもできる）は次のように計算される：
１００×（Ａ／Ｂの分数）
式中、Ａは、候補配列と参照配列のアラインメントにおいて同一スコアが与えられたアミノ酸（または核酸）残基の数であり、Ｂは、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基の総数である。いくつかの実施形態では、候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合、参照配列に対する候補配列のアミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントは、候補配列に対する参照配列のアミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントと等しくない。
特定の実施形態では、候補配列との比較のためにアラインされる参照配列は、候補配列が候補配列の全長または候補配列の連続するアミノ酸（または核酸）残基の選択された部分にわたって５０％〜１００％の同一性を示すことを示し得る。比較目的でアラインされる候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。候補配列の位置が参照配列の対応する位置と同じアミノ酸（または核酸）残基で占められていれば、それらの分子はその位置において同一である。
本明細書で使用する場合、用語「血清半減期」は、対象に治療タンパク質を投与するという文脈で、その対象においてそのタンパク質の血漿濃度が半分に減少するのに要する時間を指す。タンパク質は、再分布したり、または血流から排除されたり、または例えば、タンパク質分解によって分解されたりすることがある。本明細書に記載されるように、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチドは、ヒトにおいて７日の血清半減期を示す。本明細書で使用する場合、用語「親和性」または「結合親和性」は、２分子間の結合相互作用の強度を指す。一般に、結合親和性は、分子とその結合相手、例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体とＢＭＰ９またはアクチビンＡの間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。そうではないことが示されない限り、結合親和性は、固有結合親和性を指し、これは結合対のメンバー間の１：１相互作用を表す。２分子間の結合親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）または親和性定数（ＫＡ）によって記載される。互いに低い結合親和性を有する２分子は、一般に、ゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があり、大きなＫＤを示す。互いに高い親和性を有する２分子は、一般に、容易に結合し、結合をより長く維持する傾向があり、小さいＫＤを示す。２つの相互作用分子のＫＤは、例えば、表面プラズモン共鳴などの当技術分野で周知の方法および技術を用いて決定することができる。ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。
本明細書で使用する場合、用語「骨塩密度（ＢＭＤ：ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）」、「骨密度」および「骨量」は、骨組織の骨塩（例えば、カルシウム）の量の尺度を指す。ＢＭＤは、当業者に公知の十分に確立された臨床技術によって（例えば、単一１（ｓｉｎｇｌｅ−１）または二重エネルギー光子またはＸ線吸収測定法によって）測定することができる。ＢＭＤの概念は、骨の体積当たりの無機塩の量に関するが、臨床上は、それは代用として、イメージング時の骨表面平方センチメートル当たりの光学密度に従って測定される。ＢＭＤの測定値は、臨床医学において骨粗鬆症および骨折リスクの間接的指標として使用されている。いくつかの実施形態では、ＢＭＤ試験結果はＴスコアとして示され、Ｔスコアは健康な３０歳の成人の理想的またはピーク骨塩密度と比較した対象のＢＭＤを表す。スコア０は、ＢＭＤが健康な若年成人の正常参照値に相当することを示す。測定された対象のＢＭＤと健康な若年成人の参照値のＢＭＤとの違いは、標準偏差単位（ＳＤ）で評価される。よって、＋１ＳＤ〜−１ＳＤの間のＴスコアは正常なＢＭＤを示し、−１ＳＤ〜−２．５ＳＤの間のＴスコアは低い骨量（例えば、骨減少症）を示し、−２．５ＳＤより低いＴスコアは骨粗鬆症または重度の骨粗鬆症を示し得る。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターがそれを必要とする対象に投与され、ここで、患者は低い骨量（例えば、−１ＳＤ〜−２．５ＳＤの間のＴスコア）を有する。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターがそれを必要とする対象に投与され、患者は骨粗鬆症（例えば、−２．５ＳＤ未満のＴスコア）を有する。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターの投与は、対象を、それらのＢＭＤを増加させることによって治療する。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターの投与は、対象のＢＭＤを増加させて、対象のＴスコアに増加をもたらす（例えば、対象のＴスコアに０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、１．０以上、または２．０以上の増加をもたらす）。
本明細書で使用する場合、用語「骨リモデリング」または「骨代謝」は、古い骨の不連続部分を新たに合成されたタンパク質性マトリックスのパケットで置き換えることによって骨の強度およびイオンの恒常性を維持するプロセスを指す。骨は破骨細胞によって吸収され、骨化と呼ばれるプロセスで骨芽細胞によって埋められる。骨細胞活性は、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。骨量の減少をもたらす状態は、吸収の増加または骨化の減少のいずれかによって起こり得る。健康な個体では、小児期に、骨形成が吸収を上回る。加齢が進むと、吸収が形成を上回る。また、閉経後の高齢女性でも閉経に関連するエストロゲン欠乏のために骨吸収速度の方が一般にはるかに高い。
本明細書で使用する場合、用語「骨吸収」または「骨異化活性」は、破骨細胞が骨の組織を破壊し、無機塩を放出して、骨組織から血液への無機塩（例えば、カルシウム）の移行をもたらすプロセスを指す。骨吸収速度の上昇は、閉経後の女性における加齢を含め、加齢に関連する。高い骨吸収速度、または骨化速度を上回る骨吸収速度は、骨減少症および骨粗鬆症を含む骨塩密度の低下などの骨障害に関連する。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターは、それを必要とする対象に、その対象における骨吸収（例えば、その対象における骨吸収速度）を低減するために投与される。
本明細書で使用する場合、用語「骨形成（ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、「骨化」、「骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、または「骨同化活性」は、骨芽細胞によって新たな骨組織を形成するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターは、それを必要とする対象に、骨形成を増加させる（例えば、その対象において骨形成（ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を増すまたは骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）の速度を増す）ために投与される。
本明細書で使用する場合、「ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用する（ａｆｆｅｃｔｉｎｇ）」という句は、ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９のそれらの受容体、例えば、ＡｃｔＲＩＩａ、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩａ）への結合を変化させることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９のそれらの受容体、例えば、ＡｃｔＲＩＩａ、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩａ）への結合を低減または阻害する。本明細書に記載されるように、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含む本発明のポリペプチドは、ＢＭＰ９に対して弱い結合親和性（例えば、ＫＤ ２００ｐＭ以上）を有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「血管合併症」は、血管障害または血管に対するいずれかの損傷、例えば、血管壁に対する損傷を指す。血管壁に対する損傷は、血管透過性または漏出の増加を招き得る。用語「血管透過性または漏出」は、小分子、タンパク質、および細胞を血管に流入させ、血管から流出させる血管壁の能力を指す。血管透過性または漏出の増加は、血管壁に並ぶ内皮細胞間の間隙の増大（例えば、間隙の大きさおよび／もしくは数の増大）ならびに／または血管壁の薄化によって起こり得る。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、単量体がアミノ酸残基であり、それらがアミド結合を介して相互に共有結合されている単一のポリマーを表す。ポリペプチドとは、天然型、組換え型、または合成生産されたいずれのアミノ酸配列も包含するものとする。
本明細書で使用する場合、用語「ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）」は、２つの同一の高分子、例えば、タンパク質または核酸によって形成された分子構築物を指す。これら２つの同一の単量体は、共有結合または非共有結合によってホモ二量体を形成し得る。例えば、Ｆｃドメインは、２つのＦｃドメイン単量体が同じ配列を含めば、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体であり得る。別の例では、Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む本明細書に記載のポリペプチドは、２つのＦｃドメイン単量体の相互作用を介してホモ二量体を形成することができ、これらのＦｃドメイン単量体はホモ二量体においてＦｃドメインを形成する。
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）」は、２つの異なる高分子、例えば、タンパク質または核酸によって形成された分子構築物を指す。これら２つの単量体は、共有結合または非共有結合によってヘテロ二量体を形成し得る。例えば、Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む本明細書に記載のポリペプチドは、異なるＡｃｔＲＩＩａ変異体にそれぞれ融合された２つのＦｃドメイン単量体の相互作用を介してヘテロ二量体を形成することができ、これらのＦｃドメイン単量体はヘテロ二量体においてＦｃドメインを形成する。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、必要な細胞成分、例えば、対応する核酸からタンパク質を発現させるために必要とされる細胞小器官を含む媒体を指す。核酸は一般に、当技術分野で公知の従来技術（形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ダイレクトマイクロインジェクションなど）によって宿主細胞に導入することができる核酸ベクター内に含まれる。宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞、または真核細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞）であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「治療上有効な量」は、骨粗鬆症などの疾患、あるいは骨損傷、例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を含む病態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を有する患者の治療において所望の治療効果を達成する上で有効な、本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクター、または本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクターを含有する医薬組成物の量を指す。用語「治療上有効な量」はまた、疾患、例えば、骨損傷を含む疾患または病態を有する患者の治療において所望の治療効果を達成する上で有効な、本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクター、または本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクターを含有する医薬組成物の量を指す。特に、ポリペプチド、核酸、またはベクターの治療上有効な量は、有害な副作用を回避する。
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、有効成分ならびにその有効成分を投与方法に適したものとできるように賦形剤および希釈剤を含む医薬または医薬製剤を指す。本発明の医薬組成物は、ポリペプチド、核酸、またはベクターと適合する薬学上許容される成分を含む。医薬組成物は経口投与用の錠剤もしくはカプセル剤形であっても、または静脈投与または皮下投与用の水性剤形であってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「薬学上許容される担体または賦形剤」は、医薬組成物中の賦形剤または希釈剤を指す。薬学上許容される担体は、その製剤の他の成分と適合し、かつ、レシピエントに有害であってはならない。本発明では、薬学上許容される担体または賦形剤は、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチド、そのポリペプチドをコードする核酸分子、またはそのような核酸分子を含有するベクターに十分な薬学的安定性を提供しなければならない。担体または賦形剤の性質は、投与様式によって異なる。例えば、静脈内投与には、水溶液担体が一般に使用され、経口投与には、固体担体が好ましい。
本明細書で使用する場合、用語「治療するおよび／または予防する」とは、本発明の方法および組成物を用いた、疾患、例えば、骨疾患または病態（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少）の治療および／または予防を指す。一般に、骨疾患または病態の治療は、対象がその骨疾患または病態を発症し、かつ／またはその骨疾患または病態を有すると既に診断された後に行われる。骨疾患または病態の予防は、対象にその骨疾患または病態を発症するリスクがある場合に講じられる方法または手順を指す。この対象は、医師により適応となることが判断される徴候もしくは軽度の症状またはその骨疾患もしくは病態を発症するリスク因子を示し得るか、または家族歴もしくはその骨疾患もしくは病態を発症する遺伝的素因を有し得るが、その疾患をまだ発症していない。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物、例えば、好ましくは、ヒトを指す。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ヒトおよび飼育動物および農用動物、例えば、サル（例えば、カニクイザル）、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどが含まれる。
図１は、細胞外ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂの野生型配列ならびにＡｃｔＲＩＩａ変異体のアミノ酸置換を示す配列アラインメントである。
本発明は、細胞外アクチビンＩＩａ型受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）変異体を含むポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ある部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン）に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む。Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドはまた、２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を介して二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得る。本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩａ変異体は、アクチビンおよびミオスタチンに比べて骨形成因子９（ＢＭＰ９）に対して結合親和性が弱いか、または結合親和性を全く持たない。本発明はまた、対象に本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドを投与することによって、対象において骨塩密度もしくは骨形成を増加させること、またはミオスタチン、アクチビン、および／もしくはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することにより、骨損傷を含む疾患および病態を治療する方法も含む。
Ｉ．細胞外アクチビンＩＩａ型受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）変異体
アクチビンＩＩ型受容体は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β）スーパーファミリーのリガンドに対するシグナルを調節する１回膜貫通ドメイン受容体である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドは、宿主において筋肉成長、血管成長、細胞分化、恒常性、および骨形成などの多くの生理学的プロセスに関与する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドの例としては、例えば、アクチビン、インヒビン、成長分化因子（ＧＤＦ：ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）（例えば、ＧＤＦ８、ミオスタチンとしても知られる）、および骨形成因子（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ９）が挙げられる。アクチビンは、骨組織に豊富に発現し、骨芽細胞機能および破骨細胞機能の両方を制御することによって骨形成を調節する。アクチビンは、骨疾患ではアップレギュレーションを受け、骨芽細胞活性を阻害することが報告されている。ミオスタチンもまた、骨形成の増加および骨芽細胞活性の阻害を介した骨の恒常性に関連付けられている。これらのデータは、アクチビン受容体リガンド（例えば、アクチビンおよびミオスタチン）が骨吸収を促進し、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少などの骨損傷を含む疾患および病態をもたらし得ることを裏づけている。よって、このシグナル伝達を低減または阻害する方法は、骨損傷を含む疾患および病態の治療において使用可能である。
２つのタイプのアクチビンＩＩ型受容体：ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂが存在する。研究によれば、ＢＭＰ９はＡｃｔＲＩＩａの約３００倍の結合親和性でＡｃｔＲＩＩｂと結合することが示されている（例えば、Ｔｏｗｎｓｏｎ他のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：２７３１３，２０１２参照）。ＡｃｔＲＩＩａは、ＡｃｔＲＩＩｂに比べて長い半減期を有することが知られている。本発明は、ＡｃｔＲＩＩａの有益な生理学的特性および薬物動態特性も維持しつつ、ＡｃｔＲＩＩｂによって与えられる生理学的特性を付与するという目的でＡｃｔＲＩＩａにＡｃｔＲＩＩｂのアミノ酸残基を導入することによって構築される細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を記載する。最適なペプチドは、より長い血清半減期および例えば、ＢＭＰ９に対して低い結合親和性を保持しつつ、骨塩密度の有意な増加を与える。好ましいＡｃｔＲＩＩａ変異体はまた、野生型ＡｃｔＲＩＩａに比べてアクチビンおよび／またはミオスタチンに対する結合の改善を示し、これにより、それらはリガンド結合に関して内因性のアクチビン受容体と競合可能となり、内因性のアクチビン受容体シグナル伝達を低減または阻害することができる。これらの変異体は、アクチビン受容体シグナル伝達が上昇している障害、例えば、骨疾患を治療し、骨吸収または破骨細胞活性の低減、および骨形成、骨塩密度、または骨強度の増加をもたらすために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ９に対する変異体の結合親和性を低減または除去するために細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体にアミノ酸置換を導入することができる。ヒトＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂの細胞外部分の野生型アミノ酸配列を下記に示す。
ヒトＡｃｔＲＩＩａ細胞外部分（配列番号７３）：
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＦＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＴＧＶＥＰＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＫＫＤＳＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ
ヒトＡｃｔＲＩＩｂ細胞外部分（配列番号７４）：
ＧＲＧＥＡＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ
本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号７３の配列を有する野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａまたは配列番号７６〜９６の配列のうちいずれか１つを有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む。２７箇所の異なる位置の潜在的アミノ酸置換が細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体に導入され得る（表１）。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａ（配列番号７３）の配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、またはそれを超える）アミノ酸配列同一性を有し得る。細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａ（配列番号７３）の配列に対して１以上（例えば、１〜２７、１〜２５、１〜２３、１〜２１、１〜１９、１〜１７、１〜１５、１〜１３、１〜１１、１〜９、１〜７、１〜５、１〜３、または１〜２；例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７）のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１の配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）は、表１に挙げられているような２７箇所の位置の全てにアミノ酸置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、表１に挙げられているような２７箇所の位置のうち複数の位置、例えば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６箇所にアミノ酸置換を含んでいてもよい。
アミノ酸置換は、本発明のＡｃｔＲＩＩａ変異体の活性および／または結合親和性を低下または向上させ得る。ポリペプチド機能を維持するためには、表１および２に示される配列（配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２））の位置Ｘ１７のリシン（Ｋ）が保持されることが重要である。その位置における置換は、活性の消失をもたらし得る。例えば、
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＴＧＶＥＲＣＥＧＥＫＤＫＲＬＨＣＹＡＴＷＲＮＩＳＧＳＩＥＩＶＡＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号１５０）
の配列を有するＡｃｔＲＩＩａ変異体はｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性が低減され、Ｘ１７におけるリシン（Ｋ）のアラニン（Ａ）での置換が許容されないことを示す。よって、表１および２の変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）を含む本発明のＡｃｔＲＩＩａ変異体）は、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋを保持する。
本発明のＡｃｔＲＩＩａ変異体は好ましくは、ＢＭＰ９に対する結合が低減されているか、弱いか、または実質的に無い。位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＥＥＮを含むＡｃｔＲＩＩａ変異体ならびに位置Ｘ２４にアミノ酸Ｋを維持し、かつ、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６にアミノ酸配列ＴＫＥＮを有する変異体では、ＢＭＰ９結合が低減されている。配列ＴＥＥＮおよびＴＫＥＮは、本発明のＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、表１および２の変異体、例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２））では、ＢＭＰ９結合の低減をもたらすために互換的に使用可能である。
本発明のＡｃｔＲＩＩａ変異体は、Ｃ末端伸長部（例えば、Ｃ末端における付加的アミノ酸）をさらに含み得る。Ｃ末端伸長部には、表１および２（例えば、配列番号１〜７０（例えば、配列番号６〜７０））に示される変異体のいずれかのＣ末端に１以上の付加的アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６以上の付加的アミノ酸）を付加することができる。本発明のＡｃｔＲＩＩａ変異体に含まれ得る１つの可能性のあるＣ末端伸長部はアミノ酸配列ＮＰである。例えば、Ｃ末端伸長部を含む配列は、配列番号７１（例えば、Ｃ末端伸長部ＮＰを有する配列番号６９）である。本発明のＡｃｔＲＩＩａ変異体に含まれ得るもう１つの例としてのＣ末端伸長部はアミノ酸配列ＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５）である。例えば、Ｃ末端伸長部を含む配列は、配列番号７２（例えば、Ｃ末端伸長部ＮＰＶＴＰＫを有する配列番号６９）である。
配列番号２の配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のいくつかの実施形態では、Ｘ３はＥであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ１１はＤであり、Ｘ１２はＫであり、Ｘ１３はＲであり、Ｘ１６はＫまたはＲであり、Ｘ１７はＫであり、Ｘ１９はＷであり、Ｘ２０はＬであり、Ｘ２１はＤであり、かつ、Ｘ２２はＩまたはＦである。配列番号１または２の配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のいくつかの実施形態では、Ｘ１７はＫである。配列番号１〜３の配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のいくつかの実施形態では、Ｘ１７はＫであり、Ｘ２３はＴであり、Ｘ２４はＥであり、Ｘ２５はＥであり、かつ、Ｘ２６はＮである。配列番号１〜５のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のいくつかの実施形態では、Ｘ１７はＫであり、Ｘ２３はＴであり、Ｘ２４はＫであり、Ｘ２５はＥであり、かつ、Ｘ２６はＮである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号６〜７２（表２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つ）を含む本発明のポリペプチドは、位置Ｘ１７にアミノ酸Ｋを有する。位置Ｘ１７のアミノ酸を変更すると、活性の低減がもたらされる。例えば、
ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＴＧＶＥＲＣＥＧＥＫＤＫＲＬＨＣＹＡＴＷＲＮＩＳＧＳＩＥＩＶＡＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号１５０）
の配列を有するＡｃｔＲＩＩａ変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性が低減され、Ｘ１７におけるＫのＡでの置換が許容されないことを示す。
いくつかの実施形態では、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６に配列ＴＥＥＮを有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つ）を含む本発明のポリペプチドは、位置Ｘ２４にアミノ酸Ｅのアミノ酸Ｋでの置換を有し得る。いくつかの実施形態では、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６に配列ＴＫＥＮを有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つ）を含む本発明のポリペプチドは、位置Ｘ２４にアミノ酸Ｋのアミノ酸Ｅでの置換を有し得る。位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６に配列ＴＥＥＮまたはＴＫＥＮを有するポリペプチドは、ＢＭＰ９に対する結合が低減されているか、または弱い。
いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７０（例えば、配列番号６〜７０）のうちいずれか１つ）を含む本発明のポリペプチドは、Ｃ末端伸長部（例えば、Ｃ末端における付加的アミノ酸）をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、アミノ酸配列ＮＰである。例えば、Ｃ末端伸長部を含む配列は、配列番号７１（例えば、Ｃ末端伸長部ＮＰを有する配列番号６９）である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、アミノ酸配列ＮＰＶＴＰＫ（配列番号１５５）である。例えば、Ｃ末端伸長部を含む配列は、配列番号７２（例えば、Ｃ末端伸長部ＮＰＶＴＰＫを有する配列番号６９）である。Ｃ末端伸長部には、Ｃ末端に１以上の付加的アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６以上の付加的アミノ酸）を付加することができる。
いくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含む本発明のポリペプチドは、ある部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン）をさらに含んでいてもよく、この部分はリンカーを介して細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）に融合させることができる。いくつかの実施形態では、この部分は、ポリペプチドの安定性を増すか、または薬物動態特性を改善する。Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドは、２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を介して二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成することができ、これらのＦｃドメイン単量体は合わさって二量体においてＦｃドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、以下の表３に示される配列番号７６〜９６のうちいずれの配列も持たない。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ヒトにおいて少なくとも７日の血清半減期を有する。ポリペプチドは、２００ｐＭ以上のＫＤで骨形成因子９（ＢＭＰ９）と結合し得る。このポリペプチドは、１０ｐＭ以上のＫＤでアクチビンＡと結合し得る。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ＢＭＰ９またはアクチビンＡと結合しない。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、アクチビンおよび／またはミオスタチンと結合し、かつ、ＢＭＰ９に低い（例えば、弱い）結合を示す。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ９に対する結合が低いまたは弱いポリペプチドは、位置Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、およびＸ２６に配列ＴＥＥＮまたはＴＫＥＮを有する。
加えて、いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、約２００ｐＭ以上のＫＤ（例えば、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ｐＭ以上のＫＤ、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０ｎＭ以上のＫＤ、例えば、約２００ｐＭ〜約５０ｎＭの間のＫＤ）でヒトＢＭＰ９と結合し得る。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ヒトＢＭＰ９と実質的に結合しない。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、約８００ｐＭ以下のＫＤ（例えば、約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｐＭ以下のＫＤ、例えば、約８００ｐＭ〜約２００ｐＭの間のＫＤ）でヒトアクチビンＡと結合し得る。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、８００ｐＭ以下のＫＤ（例えば、約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｐＭ以下のＫＤ、例えば、約８００ｐＭ〜約２００ｐＭの間のＫＤ）でヒトアクチビンＢと結合し得る。このポリペプチドは、およそ５ｐＭ以上のＫＤ（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、または２００ｐＭ以上のＫＤ）で成長および分化因子１１（ＧＤＦ−１１）とも結合し得る。
ＩＩ．Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドの血清半減期を延長するために、免疫グロブリンのＦｃドメイン単量体またはＦｃドメインのフラグメントに融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含み得る。Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドは、２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を介して二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成することができ、これらのＦｃドメイン単量体は二量体においてＦｃドメインを形成する。従来から当技術分野で知られているように、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのＣ末端に見られるタンパク質構造である。Ｆｃドメインは、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体を形成する２つのＦｃドメイン単量体を含む。野生型Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＶに結合する最小構造を形成する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、「デッド（ｄｅａｄ）」Ｆｃドメインに典型的に、エフェクター機能を欠くように変異させることができる。例えば、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃγ受容体の間の相互作用を最小にすることが知られている特定のアミノ酸置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１抗体に由来し、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１抗体に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｋ３２２Ａ、およびＮ４３４Ａを含む。上記のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））に従って定義される。アミノ酸残基のＫａｂａｔのナンバリングは、所与の抗体に関して、抗体配列の相同性領域を「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列とアラインすることによって決定することができる。さらに、いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、いずれの免疫系関連応答も誘導しない。例えば、Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドの二量体におけるＦｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃγ受容体の間の相互作用または結合を低減するように改変されてもよい。細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体に融合させることができるＦｃドメイン単量体の配列を下記に示す（配列番号９７）：
ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＶＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＰＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１抗体に由来し、配列番号９７の配列に対してアミノ酸置換Ｌ１２Ａ、Ｌ１３Ａ、およびＧ１５Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１抗体に由来し、配列番号９７の配列に対してアミノ酸置換Ｄ４３Ａ、Ｋ１００Ａ、およびＮ２１２Ａを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってＦｃドメイン単量体（例えば、配列番号９７）のＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。任意選択にて、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体とＦｃドメイン単量体の間にリンカー（例えば、スペーサー）を挿入することができる。Ｆｃドメイン単量体は、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）に融合させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、Ｆｃドメインに融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの二量体形成を低減または阻害する１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメインを含む。Ｆｃドメインは、免疫グロブリン抗体アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのものであり得る。加えて、Ｆｃドメインは、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であり得る。Ｆｃドメインはまた、非天然Ｆｃドメイン、例えば、組換えＦｃドメインであってもよい。
二量体形成が低減されたＦｃドメインを作出する方法は当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、立体衝突のために二量体形成を障害するように、ＣＨ３−ＣＨ３二量体界面に大きな側鎖を有する１以上のアミノ酸（例えば、チロシンまたはトリプトファン）を導入してもよい。他の実施形態では、有利な相互作用を除くために、ＣＨ３−ＣＨ３二量体界面に小さい側鎖を有する１以上のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、またはトレオニン）を導入してもよい。ＣＨ３ドメインに大きなまたは小さな側鎖を有するアミノ酸を導入する方法は、例えば、Ｙｉｎｇ他（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８７：１９３９９−１９４０８，２０１２）、米国特許出願公開第２００６／００７４２２５号明細書、米国特許第８，２１６，８０５号明細書および米国特許第５，７３１，１６８号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ他（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７−６１２，１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ他（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２７０：２６−３５，１９９７）、およびＭｅｒｃｈａｎｔ他（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８）に記載されており、これらは全て、それらの全内容を本明細書の一部として援用する。
さらに他の実施形態では、２つのＦｃドメイン間でＣＨ３−ＣＨ３界面を構成するＣＨ３ドメインの１以上のアミノ酸残基を、正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジン）または負電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸）で置換し、その相互作用が、導入された特定の電荷のアミノ酸によって静電気的に不利となるようにする。二量体形成に不利となるように、または二量体形成を妨げるようにＣＨ３ドメインに電荷アミノ酸を導入する方法は、例えば、Ｙｉｎｇ他（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８７：１９３９９−１９４０８，２０１２）、米国特許出願公開第２００６／００７４２２５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２４４５７８号明細書、および米国特許出願公開第２０１４／００２４１１１号明細書に記載されており、これらは全て、それらの全内容を本明細書の一部として援用する。
本発明のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１の配列に対し以下のアミノ酸置換：Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｖ、Ｌ３５１Ｔ、Ｌ３５１Ｈ、Ｌ３５１Ｎ、Ｌ３５２Ｋ、Ｐ３５３Ｓ、Ｓ３５４Ｄ、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｓ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ａ、Ｔ３６６Ｅ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｙ、Ｌ３６８Ｅ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｎ、Ｐ３９５Ｎ、Ｐ３９６Ｔ、Ｖ３９７Ｔ、Ｖ３９７Ｑ、Ｌ３９８Ｔ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｎ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｒ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｈ、Ｙ４０７Ｉ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｔ、およびＫ４０９Ｉの１以上を含む。特定の一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１の配列に対してアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含む。野生型Ｆｃドメインの配列を配列番号１５１に示す。
ＩＩＩ．アルブミン結合ペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、血清タンパク質結合ペプチドに融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含み得る。血清タンパク質ペプチドとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
一例として、本明細書に記載の方法および組成物において使用可能なアルブミン結合ペプチドは一般に当技術分野で公知である。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１５２）を含む。
本発明では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体の血清半減期を延長するために、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）にアルブミン結合ペプチドを連結することができる。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のＮ末端またはＣ末端に直接またはリンカーを介して連結する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってアルブミン結合ペプチド（例えば、配列番号１５２）のＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。所望により、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体とアルブミン結合ペプチドの間にリンカー（例えば、スペーサー）を挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体にアルブミン結合ペプチドが含まれると、その血清アルブミンへの結合を介して治療タンパク質の保持の延長がもたらされ得ると思われる。
ＩＶ．フィブロネクチンドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、フィブロネクチンドメインに融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含み得る。フィブロネクチンドメインとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
フィブロネクチンドメインは、例えば、インテグリンなどの膜貫通受容体タンパク質、ならびにコラーゲンおよびフィブリンなどの細胞外マトリックス成分と結合する細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質、またはそのフラグメントである。本発明のいくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体の血清半減期を延長するために、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）にフィブロネクチンドメインが連結される。フィブロネクチンドメインは、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のＮ末端またはＣ末端に直接またはリンカーを介して連結することができる。
一例として、本明細書に記載の方法および組成物において使用可能なフィブロネクチンドメインは一般に当技術分野で公知である。一実施形態では、フィブロネクチンドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ ＮＯ：Ｐ０２７５１の配列のアミノ酸６１０〜７０２を有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号１５３）である。別の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、アドネクチンタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってフィブロネクチンドメイン（例えば、配列番号１５３）のＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。所望により、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体とフィブロネクチンドメインの間にリンカー（例えば、スペーサー）を挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体にフィブロネクチンドメインが含まれると、そのインテグリンならびにコラーゲンおよびフィブリンなどの細胞外マトリックス成分への結合を介して治療タンパク質の保持の延長がもたらされ得ると思われる。
Ｖ．血清アルブミン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、血清アルブミンに融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含み得る。血清アルブミンとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
血清アルブミンは、哺乳動物において最も豊富な血液タンパク質である球状のタンパク質である。血清アルブミンは、肝臓で生産され、血清タンパク質の約半分を占める。血清アルブミンは血液中では単量体で可溶型である。血清アルブミンの最も重要ないくつかの機能として、体内におけるホルモン、脂肪酸、およびその他のタンパク質の輸送、ｐＨの緩衝、ならびに血管と身体組織の間の体液の適正な分布に必要とされる浸透圧の維持が挙げられる。好ましい実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。本発明のいくつかの実施形態では、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体の血清半減期を延長するために、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）のＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）にヒト血清アルブミンが連結される。ヒト血清アルブミンは、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体のＮ末端またはＣ末端に直接またはリンカーを介して連結することができる。
一例として、本明細書に記載の方法および組成物において使用可能な血清アルブミンは一般に当技術分野で公知である。一実施形態では、血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ ＮＯ：Ｐ０２７６８（配列番号１５４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってヒト血清アルブミン（例えば、配列番号１５４）のＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。所望により、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体と血清アルブミンの間にリンカー（例えば、スペーサー）を挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体に血清アルブミンが含まれると、治療タンパク質の保持の延長がもたらされ得ると思われる。
ＶＩ．リンカー
本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してある部分に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含み得る。いくつかの実施形態では、その部分は、ポリペプチドの安定性を高める。例としての部分には、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンが含まれる。本発明では、ある部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体（例えば、配列番号９７の配列）、野生型Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１５１）、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド（例えば、配列番号１５２）、フィブロネクチンドメイン（例えば、配列番号１５３）、またはヒト血清アルブミン（例えば、配列番号１５４））と細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）の間のリンカーは、１〜２００個のアミノ酸を含むアミノ酸スペーサーであり得る。好適なペプチドスペーサーは当技術分野で公知であり、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどのフレキシブルなアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＧＡ、ＧＳ、ＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＧ、ＧＧＧＡ（配列番号９８）、ＧＧＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＧＧ（配列番号１００）、ＧＧＧＧＡ（配列番号１０１）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０２）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１０３）、ＧＧＡＧ（配列番号１０４）、ＧＧＳＧ（配列番号１０５）、ＡＧＧＧ（配列番号１０６）、またはＳＧＧＧ（配列番号１０７）のモチーフ、例えば、多重または反復モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＧＡまたはＧＳ、例えば、ＧＡ、ＧＳ、ＧＡＧＡ（配列番号１０８）、ＧＳＧＳ（配列番号１０９）、ＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１０）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１１）、ＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１３）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１４）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１５）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１１６）、およびＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１７）のモチーフを含む２〜１２個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡまたはＧＧＳ、例えば、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＡＧＧＡ（配列番号１１８）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１１９）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１２０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２１）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１２２）、およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２３）のモチーフを含む３〜１２個のアミノ酸を含み得る。さらにいくつかの実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＧ（配列番号１０４）、ＧＧＳＧ（配列番号１０５）、例えば、ＧＧＡＧ（配列番号１０４）、ＧＧＳＧ（配列番号１０５）、ＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号１２４）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１２５）、ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号１２６）、およびＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１２７）のモチーフを含む４〜１２個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＧＧＧＧＡ（配列番号１０１）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１０２）、例えば、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号１２８）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２９）のモチーフを含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、ある部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン）と細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）の間のアミノ酸スペーサーは、ＧＧＧ、ＧＧＧＡ（配列番号９８）、ＧＧＧＧ（配列番号１００）、ＧＧＧＡＧ（配列番号１３０）、ＧＧＧＡＧＧ（配列番号１３１）、またはＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号１３２）であり得る。
いくつかの実施形態では、スペーサーはまた、グリシン、アラニン、およびセリン以外のアミノ酸、例えば、ＡＡＡＬ（配列番号１３３）、ＡＡＡＫ（配列番号１３４）、ＡＡＡＲ（配列番号１３５）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１３６）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１３７）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３８）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１３９）、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１４０）、ＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号１４１）、ＲＳＩＡＴ（配列番号１４２）、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ（配列番号１４３）、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧタグＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号１４４）、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ（配列番号１４５）、またはＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１４６）も含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＥＡＡＡＫ（配列番号１４７）のモチーフ、例えば、多重または反復モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、（ＸＰ）ｎ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｋ、またはＥ）であってもよく、ｎは１〜５である）、およびＰＡＰＡＰ（配列番号１４８）などのプロリンリッチ配列のモチーフ、例えば、多重または反復モチーフを含み得る。
使用するペプチドスペーサーおよびアミノ酸の長さは、関与する２つのタンパク質および最終的なタンパク質融合ポリペプチドに求められるフレキシビリティの程度によって調節することができる。スペーサーの長さは、適正なタンパク質折り畳みを確保し、凝集の形成を避けるように調節することができる。
ＶＩＩ．ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生産
本発明のポリペプチドは、宿主細胞から生産することができる。宿主細胞とは、必要な細胞成分、例えば、対応する核酸から本明細書に記載のポリペプチドおよび融合ポリペプチドを発現させるために必要とされる細胞小器官を含む媒体を指す。これらの核酸は、当技術分野で公知の従来技術（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ダイレクトマイクロインジェクション、または感染など）によって宿主細胞に導入することができる核酸ベクター内に含まれていてもよい。核酸ベクターの選択は、一部は使用する宿主細胞によって異なる。一般に、好ましい宿主細胞は真核生物（例えば、哺乳動物）または原核生物（例えば、細菌）起源である。
核酸ベクターの構築および宿主細胞
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（または部位指定）突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発が含まれる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、遺伝子合成などの標準技術を用いて得ることができる。あるいは、野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａをコードする核酸分子は、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発などの当技術分野における標準技術を用いて、特定のアミノ酸置換を含むように変異させることができる。核酸分子は、ヌクレオチド合成装置またはＰＣＲ技術を用いて合成することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、原核生物または真核生物の宿主細胞で核酸分子を複製および発現することができるベクターに挿入することができる。当技術分野では多くのベクターが利用可能であり、本発明の目的において使用できる。各ベクターは種々の成分を含んでいてもよく、これらの成分は特定の宿主細胞と適合するように調節および最適化することができる。例えば、ベクター成分としては、限定されるものではないが、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、目的タンパク質をコードする核酸配列、および転写終結配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を本発明の宿主細胞として使用することができる。哺乳動物細胞種の例としては、限定されるものではないが、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＣ３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２０細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＮＳ０細胞（免疫グロブリン鎖を内因的に生産しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞も本発明の宿主細胞として使用可能である。大腸菌株としては、限定されるものではないが、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１０２５）、および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）が挙げられる。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシングおよびタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）に特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系は、発現されるポリペプチドの適正な修飾およびプロセシングを確保するために選択することができる。上記の発現ベクターは、当技術分野における従来技術、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、およびダイレクトマイクロインジェクションを用いて適当な宿主細胞に導入することができる。タンパク質生産用のためにベクターが宿主細胞に導入されれば、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地で宿主細胞を培養する。治療タンパク質の発現のための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ Ｂａｌｂａｓ，Ａｒｇｅｌｉａ Ｌｏｒｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第２版（２００４年）、およびＶｌａｄｉｍｉｒ ＶｏｙｎｏｖおよびＪｕｓｔｉｎ Ａ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（ｅｄｓ．）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第２版（２０１２年）が参照される。
タンパク質生産、回収および精製
本発明のポリペプチドを生産するために使用される宿主細胞は、当技術分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に好適な培地で増殖させることができる。哺乳動物宿主細胞に好適な培地の例としては、最小必須培地（ＭＥＭ：Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を添加したＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ−１６４０が挙げられる。細菌宿主細胞に好適な培地の例としては、選択薬剤、例えば、アンピシリンなどの必要な添加を行ったＬｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）が挙げられる。宿主細胞は、好適な温度、例えば、約２０℃〜約３９℃、例えば、２５℃〜約３７℃、好ましくは、３７℃、および５〜１０％などのＣＯ２レベルで培養する。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、一般に、約６．８〜７．４、例えば、７．０である。本発明の発現ベクターでは誘導プロモーターが使用され、プロモーターの活性化に好適な条件下でタンパク質発現が誘導される。
いくつかの実施形態では、使用する発現ベクターおよび宿主細胞に応じて、発現されるタンパク質を宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）から細胞培養培地へ分泌させることができる。タンパク質の回収は、細胞残渣を除去するために細胞培養培地を濾過することを含み得る。これらのタンパク質をさらに精製してもよい。本発明のポリペプチドは、タンパク質精製の技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質精製のための他のいずれかの標準技術によって、精製することができる。タンパク質は、例えば、プロテインＡカラム（例えば、ＰＯＲＯＳプロテインＡクロマトグラフィー）などのアフィニティーカラムを適切に選択し、クロマトグラフィーカラム（例えば、ＰＯＲＯＳ ＨＳ−５０陽イオン交換クロマトグラフィー）、濾過、限外濾過、塩析および透析法と組み合わせることによって単離および精製することができる。
他の実施形態では、宿主細胞は、発現されたタンパク質を回収するために、例えば、浸透圧ショック、音波処理、または溶解によって破壊することができる。細胞が破壊されれば、細胞残渣を遠心分離または濾過によって除去することができる。場合によっては、精製を容易にするためにポリペプチドをペプチドなどのマーカー配列に結合させることもできる。マーカーアミノ酸配列の例は、ヘキサヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）であり、これはマイクロモルの親和性で、ニッケル官能基を有するアガロースアフィニティーカラムに結合する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、血球凝集素「ＨＡ」タグが含まれ、これはインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する（Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｃｅｌｌ ３７：７６７，１９８４）。
あるいは、本発明のポリペプチドは、例えば、遺伝子療法において、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ））、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクター））を投与することにより、対象（例えば、ヒト）の細胞によって生産することができる。ベクターは、対象の細胞内にあれば（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ダイレクトマイクロインジェクション、感染など）、ポリペプチドの発現を促進し、これは次に細胞から分泌される。疾患または障害の治療が所望の転帰である場合には、それ以上の作用は必要とされないと思われる。タンパク質の採集が望まれる場合には、対象から血液を採取し、当技術分野で公知の方法によって血液からタンパク質を精製することができる。
ＶＩＩＩ．医薬組成物および製剤
本発明は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチド）を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療タンパク質として、Ｃ末端伸長部（例えば、１、２、３、４、５、６以上の付加的アミノ酸）を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７０（例えば、配列番号６〜７０）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療タンパク質として、ある部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、またはその二量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン）に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含む本発明の医薬組成物は、療法において、他の薬剤（例えば、治療生物製剤および／または小分子）または組成物と併用することができる。治療上有効な量のポリペプチドに加え、医薬組成物は１種類以上の薬学上許容される担体または賦形剤を含んでいてもよく、当業者に公知の方法によって調剤することはできる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、またはそのような核酸分子を含有するベクターを含む。
医薬組成物の許容される担体および賦形剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに無毒である。許容される担体および賦形剤は、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、およびＴＡＥなどのバッファー、アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤、塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、レゾルシノール、および塩化ベンザルコニウムなどの保存剤、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン、および免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、およびリシンなどのアミノ酸、ならびにグルコース、マンノース、スクロース、およびソルビトールなどの炭水化物を含み得る。本発明の医薬組成物は、注射製剤の形態で非経口的に投与することができる。注射用医薬組成物は、無菌溶液または任意の薬学上許容される液体をビヒクルとして用いて調剤することができる。薬学上許容されるビヒクルとしては、限定されるものではないが、無菌水、生理食塩水、および細胞培養培地（例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２培地）が挙げられる。調剤方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｎｇａ（ｅｄ．）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（第３版）、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２０１５）が参照される。
本発明の医薬組成物は、ヒドロキシルメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルなどのマイクロカプセル中に調製してもよい。本発明の医薬組成物はまた、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセルなどの他の薬物送達システム中に調製してもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版（２０１２年）に記載されている。ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成される。
本発明の医薬組成物はまた、徐放性製剤として調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、本発明のポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅｓ）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。一部の徐放性製剤は、数ヶ月、例えば、１〜６か月にわたって分子の放出を可能とするが、他の製剤は本発明の医薬組成物をより短い期間、例えば、数日〜数週間で放出する。
医薬組成物は、必要であれば、単位剤形で形成することができる。医薬製剤中に含まれる有効成分、例えば、本発明のポリペプチドの量は、指定の範囲内で適切な用量が提供されるような量（例えば、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の用量）である。
遺伝子療法用の医薬組成物は許容される希釈剤中にあってよく、または遺伝子送達ビヒクルが包埋された緩徐放出マトリックスを含み得る。送達方法として流体力学的注射が使用される場合には、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子またはその核酸分子を含有するベクター（例えば、ウイルスベクター）を含有する医薬組成物は、大きな液量で静脈内に容易に送達される。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達ビヒクルとして使用可能なベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、変異ワクシニアアンカラ）、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられる。
ＩＸ．経路、用量、および投与
治療タンパク質として本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば、静脈内投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、または腹腔内投与向けに調剤されてよい。医薬組成物はまた、経口投与、鼻腔投与、噴霧投与、エアロゾル投与、直腸、もしくは膣投与用に調剤し、またはそれらを介して投与することができる。注射製剤に関しては、種々の有効な医薬担体が当技術分野で知られている。例えば、ＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，第１８版（２０１４）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子またはそのような核酸分子を含有するベクターを含む医薬組成物は、遺伝子送達によって送達することができる。遺伝子送達の方法は、当業者に周知である。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達および発現に使用可能なベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ））、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を直接対象に投与してもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子またはそのような核酸分子を含有するベクターは、流体力学的注射プラットフォームを用いて投与することができる。流体力学的注射法では、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を、操作したプラスミド（例えば、ウイルスプラスミド）内の強力なプロモーターの制御下に置く。プラスミドは多くの場合、大きな液量で静脈内に容易に送達される。流体力学的注射は、大きな液量の迅速な注射から得られる高圧が静脈からの流体およびプラスミドの管外遊出をもたらすように細胞透過性を高めるために、静脈内で、制御された流体力学的圧力を使用する。核酸分子の発現は、主として肝臓によって駆動される。マウスでは、流体力学的注射は、多くの場合、プラスミドの尾静脈への注射によって行われる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子は、流体力学的注射を用いて投与することができる。
本発明の医薬組成物の用量は、投与経路、治療される疾患、および対象の身体的特徴、例えば、年齢、体重、健康状態を含む因子によって決まる。本発明の医薬組成物は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｍｇ／ｋｇ）、より具体的な実施形態では、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、より具体的な実施形態では、約０．３〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明のポリペプチドを含み得る。用量は、対象の疾患の程度および種々のパラメータなどの従来の因子に従って医師が適合させることができる。
医薬組成物は、その剤形に適した様式で、症状の改善または修復をもたらすために治療上有効な量で投与される。医薬組成物は、様々な剤形、例えば、静脈内剤形、皮下剤形、および経口剤形（例えば、摂取可能な溶液、薬物放出カプセル）で投与される。一般に、治療タンパク質は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１〜５０ｍｇ／ｋｇで投与される。本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、それを必要とする対象に、例えば、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、四半期毎、半年毎、１年毎、または医学的に必要に応じて１回以上（例えば、１〜１０回以上）投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、それを必要とする対象に、毎週、隔週、毎月、隔月、または四半期毎に投与することができる。用量は単回または複数回の投与計画で提供することができる。投与間のタイミングは、医学的状態が改善すると減らすことができ、または患者の健康が減退すると増やすことができる。
Ｘ．治療方法
本発明は、ＡｃｔＲＩＩｂの細胞外部分からＡｃｔＲＩＩａの細胞外部分へアミノ酸を置換すると、特性が改善されたＡｃｔＲＩＩａ変異体が得られるという発見に基づく。ＡｃｔＲＩＩｂからＡｃｔＲＩＩａに残基を導入することによって作出されたＡｃｔＲＩＩａ変異体は、より長い血清半減期およびＢＭＰ９に対する低い結合親和性などのＡｃｔＲＩＩａの有益な特性を保持し、かつ、アクチビンＡおよびＢに対する結合の増強（表４参照）などのＡｃｔＲＩＩｂの有益な特性のいくつかを獲得する。これらのＡｃｔＲＩＩａ変異体特性は、リガンド結合に関して内因性のアクチビン受容体と競合させるために治療的に使用することができるポリペプチドを生産する。ＡｃｔＲＩＩａ変異体は受容体の細胞外部分を含むので、それらは可溶型であり、かつ、細胞内シグナル伝達経路を活性化することなく、リガンド（例えば、アクチビンＡおよびＢ、ミオスタチン、ＧＤＦ１１）と結合してそれらを隔離することができる。よって、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体は、アクチビンシグナル伝達の上昇が関連付けられている（例えば、アクチビン受容体またはアクチビン受容体リガンドの発現の増加に関連する）疾患または病態を治療するために使用することができる。例えば、アクチビンは骨疾患においてアップレギュレーションを受けることが判明しており、骨芽細胞活性を阻害することが知られ、アクチビンレベルの増加が骨疾患に寄与することが示唆される。アクチビンと結合し、内因性受容体とのその相互作用を低減する治療薬による治療は、骨塩密度を増加させ、骨損傷を含む疾患または病態を有する対象を治療するために使用可能であるということになる。
本発明は、必要とする対象において骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、または骨吸収を低減するために使用可能な組成物および治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、骨損傷（例えば、骨粗鬆症または骨減少症）をもたらす疾患を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨損傷を含む疾患または病態を有する対象においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用することに向けられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９のそれらの受容体、例えば、ＡｃｔＲＩＩａ、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩａ）への結合を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用する（例えば、ミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９のそれらの受容体、例えば、ＡｃｔＲＩＩａ、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩａ）への結合を低減または阻害する）と、対象の骨塩密度もしくは骨形成の増加、または対象の骨吸収の低減がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体を含むポリペプチド）は、対象において骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、骨吸収を低減する、またはミオスタチン、アクチビン、および／もしくはＢＭＰ９シグナル伝達に作用するために対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象の骨塩密度を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象において血管合併症、例えば、血管透過性または漏出の増加を引き起こさない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、対象は、骨損傷を含む疾患または病態（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少）を有する。
本発明はまた、対象に本明細書に記載のポリペプチド（例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチド）を投与することによって、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象を治療する方法も含む。いくつかの実施形態では、原発性骨粗鬆症は、加齢性またはホルモン関連骨粗鬆症（例えば、エストロゲンの低下に関連する）である。いくつかの実施形態では、続発性骨粗鬆症は、不動誘発性またはグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である。いくつかの実施形態では、骨癌は多発性骨髄腫であり、または癌転移関連骨量減少は多発性骨髄腫によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、治療関連骨量減少は、ＦＧＦ−２１もしくはＧＬＰ−１による治療、ＦＧＦ−２１もしくはＧＬＰ−１含有治療薬による治療、または２型糖尿病および／もしくは肥満の治療のため、あるいは癌治療（例えば、化学療法または放射線）のために起こる。いくつかの実施形態では、食事関連骨量減少は、くる病（例えば、ビタミンＤ欠乏症）である。いくつかの実施形態では、低重力関連骨量減少は、負荷関連骨量減少である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチド）は、骨損傷を含む疾患または病態（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、大理石骨病、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少）の発症を予防するため、および／あるいは骨損傷を含む疾患または病態を有すると既に診断された患者を治療するために使用することができる。骨損傷を含む疾患または病態を発症する可能性のある患者、例えば、骨損傷、または低骨量の遺伝的素因、家族歴を有する個体に、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチド）を、予防的に、細胞外ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドが骨損傷の発生を予防または遅延し得るように投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチド）は、対象に、骨損傷を含む疾患または病態（例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折（ｆａｃｔｕｒｅ）、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少）の発症を予防するため、および／あるいは前記疾患または病態を有する患者を治療するため、あるいは対象においてミオスタチン、アクチビン、および／またはＢＭＰ９シグナル伝達に作用するため（例えば、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＢＭＰ９のそれらの受容体への結合を低減または阻害するため）に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨塩密度を増加させる（例えば、骨量を増加させる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨吸収を低減する（例えば、骨異化活性を低減する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨形成を増加させる（例えば、骨同化活性を増加させる、または骨形成を増加させる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、破骨細胞活性または破骨細胞形成を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、アクチビンおよび／またはミオスタチンのそれらの受容体への結合を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、骨形成を増加させるか、骨塩密度を増加させるか、または皮質骨もしくは骨梁の骨吸収を低減する。
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、１以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６以上のアミノ酸）のＣ末端伸長部をさらに含む、細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７１（例えば、配列番号６〜７１）のいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチドは、治療タンパク質として使用可能である。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、Ｆｃドメイン単量体に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチドの二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）は、治療タンパク質として使用可能である。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、ある部分（例えば、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換（例えば、二量体形成を低減する１以上の置換）を有するＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン）に融合された細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体（例えば、配列番号１〜７２（例えば、配列番号６〜７２）のうちいずれか１つの配列を有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体）を含むポリペプチドは、治療タンパク質として使用可能である。本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸、または前記核酸を含有するベクターもまた、本明細書に記載の方法のいずれかに従って投与することができる。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、ポリペプチド、核酸、またはベクターは医薬組成物の一部として投与することができる。
実施例１：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＡｃｔＲＩＩａ変異体結合親和性の評価
ＡｃｔＲＩＩａ変異体とリガンドであるアクチビンＡ、アクチビンＢ、成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）、およびＢＭＰ−９との間の相互作用の動態を測定するためにＢｉａｃｏｒｅ ３０００を使用した。ＡｃｔＲＩＩａ変異体をＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させ、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーを用いて細胞馴化培地から精製した。ＡｃｔＲＩＩａ変異体を、適正な配向を確保するためにフローセル２〜４において捕捉抗体（ＧＥＧＥからの抗マウス）を用いてチップ（ＣＭ４またはＣＭ５）に固定した。フローセル１は非特異的結合およびバルク効果を差し引くために参照セルとして使用した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）からのＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーをランニングバッファーとして使用した。物質移動効果を避けるために４０μｌ／分にて、一定の濃度系で各リガンドを流した。各相互作用のＫＤを計算するため、ＢｉｏＬｏｇｉｃ（商標）ソフトウエアによりＳｃｒｕｂｂｅｒ２を用いてデータを解析した（表４）。
実施例２：骨塩密度に及ぼす細胞外ＡｃｔＲＩＩａ変異体の影響
成体雄Ｃ５７／ＢＬ６マウスに偽手術（ＳＨＡＭ）または去勢手術（ＯＲＸ）のいずれかを施す。両手術群を術後１４日間回復させる。全ての動物を従来のケージで食物（既定食）および水を自由に摂らせて飼育する。次に、ＳＨＡＭ動物およびＯＲＸ動物をビヒクル処置群（ＶＥＨ）またはＡｃｔＲＩＩ変異体処置群のいずれかに割り当て、７１日間、ビヒクルまたはＡｃｔＲＩＩ変異体（１０ｍｇ／ｋｇ）の週２回（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）、全身腹腔内投与を施す。体重を週に２回、処置時に測定した。体組成を試験０日目、次いで、治療開始後１４日目、２８日目、４７日目、および７１日目に、ＭｉｎｉＳｐｅｃ ＬＦ５０ ＮＭＲアナライザーを用いて分析する。試験終了日に、対象組織（筋肉、脂肪組織、および脛骨）を外科的に摘出し、秤量し、さらなる分析のために適切に保存する。この時点で、ＯＲＸ動物をまた、試験（ｔｅｓｔｅｓ）の完全な撤退を確定するために検査する。また、試験終了後にマイクロコンピュータ断層撮影法を用いて、種々の骨の皮質形態計測および柱状構造も評価する。
その他の実施形態
本発明をその特定の実施形態に関して記載してきたが、さらなる改変が可能であり、本願は、一般に本発明の原理に従う本発明のいずれの変形形態、使用、または適応も包含することが意図され、本開示からのそのような逸脱を含むことは、本発明が属する技術分野内の既知または関連の実施の範囲内にあり、以上に示す本質的特徴に該当し得ることが理解されるであろう。
各個の刊行物、特許、および特許出願の全内容が本明細書の一部として援用されることが具体的かつ個々に示される場合と同等に、全ての刊行物、特許、および特許出願の全内容は本明細書の一部として援用される。
他の実施形態も以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (146)

  1. 細胞外アクチビンＩＩａ型受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）変異体を含み、
    前記変異体は
    ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＸ１Ｘ２ＮＡＮＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＸ１７Ｘ１８ＧＣＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号１）
    の配列を有し、
    配列中、Ｘ１はＦまたはＹであり；Ｘ２はＦまたはＹであり；Ｘ３はＥまたはＡであり；Ｘ４はＫまたはＬであり；Ｘ５はＤまたはＥであり；Ｘ６はＲまたはＡであり；Ｘ７はＰまたはＲであり；Ｘ８はＹまたはＥであり；Ｘ９はＤまたはＥであり；Ｘ１０はＫまたはＱであり；Ｘ１１はＤまたはＡであり；Ｘ１２はＫまたはＡであり；Ｘ１３はＲまたはＡであり；Ｘ１４はＲまたはＬであり；Ｘ１５はＦまたはＹであり；Ｘ１６はＫ、Ｒ、またはＡであり；Ｘ１７はＫ、Ａ、Ｙ、Ｆ、またはＩであり；Ｘ１８はＱまたはＫであり；Ｘ１９はＷまたはＡであり；Ｘ２０はＬまたはＡであり；Ｘ２１はＤ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｎ、またはＩであり；Ｘ２２はＩ、Ｆ、またはＡであり；Ｘ２３はＫまたはＴであり；Ｘ２４はＫまたはＥであり；Ｘ２５はＤまたはＥであり；Ｘ２６はＳまたはＮであり；かつ、Ｘ２７はＥまたはＱであり、かつ
    前記変異体は、配列番号７３の配列を有する野生型細胞外ＡｃｔＲＩＩａまたは配列番号７６〜９６の配列のうちいずれか１つを有する細胞外ＡｃｔＲＩＩａに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、
    ポリペプチド。
  2. 前記変異体が
    ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９ＫＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＸ１７Ｘ１８ＧＣＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号２）
    の配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記変異体が
    ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＥＸ４Ｘ５ＲＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９ＫＤＫＲＸ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＸ１８ＧＣＷＬＤＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号３）
    の配列を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 前記変異体が
    ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＥＸ４ＤＲＴＮＱＴＧＶＥＸ７ＣＸ８ＧＸ９ＫＤＫＲＸ１４ＨＣＸ１５ＡＴＷＸ１６ＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＸ１８ＧＣＷＬＤＤＸ２２ＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３ＫＸ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号４）
    の配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 前記変異体が
    ＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＸ２ＮＡＮＷＥＸ４ＤＲＴＮＱＴＧＶＥＰＣＸ８ＧＸ９ＫＤＫＲＸ１４ＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＸ１８ＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＸ２３ＫＸ２５Ｘ２６ＰＸ２７ＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳ（配列番号５）
    の配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. Ｘ１がＦである、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. Ｘ１がＹである、請求項１に記載のポリペプチド。
  8. Ｘ１０がＫである、請求項１、６、または７に記載のポリペプチド。
  9. Ｘ１０がＱである、請求項１、６、または７に記載のポリペプチド。
  10. Ｘ２がＦである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. Ｘ２がまたはＹである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. Ｘ３がＥである、請求項１、２、および６〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. Ｘ３がＡである、請求項１、２、および６〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. Ｘ４がＫである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. Ｘ４がＬである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. Ｘ５がＤである、請求項１、２、３、および６〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. Ｘ５がＥである、請求項１、２、３、および６〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. Ｘ６がＲである、請求項１、２、および６〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. Ｘ６がＡである、請求項１、２および６〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. Ｘ７がＰである、請求項１〜４および６〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. Ｘ７がＲである、請求項１〜４および６〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. Ｘ８がＹである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. Ｘ８がＥである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. Ｘ９がＤである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  25. Ｘ９がＥである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. Ｘ１１がＤである、請求項１、２および６〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. Ｘ１１がＡである、請求項１、２および６〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  28. Ｘ１２がＫである、請求項１、２および６〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  29. Ｘ１２がＡである、請求項１、２および６〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  30. Ｘ１３がＲである、請求項１、２および６〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  31. Ｘ１３がＡである、請求項１、２および６〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  32. Ｘ１４がＲである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  33. Ｘ１４がＬである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  34. Ｘ１５がＦである、請求項１〜４および６〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  35. Ｘ１５がＹである、請求項１〜４および６〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  36. Ｘ１６がＫである、請求項１〜４および６〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. Ｘ１６がＲである、請求項１〜４および６〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  38. Ｘ１６がＡである、請求項１〜４および６〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  39. Ｘ１７がＫである、請求項１、２および６〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  40. Ｘ１７がＡである、請求項１、２および６〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  41. Ｘ１７がＹである、請求項１、２および６〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  42. Ｘ１７がＦである、請求項１、２および６〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  43. Ｘ１７がＩである、請求項１、２および６〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  44. Ｘ１８がＱである、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  45. Ｘ１８がＫである、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  46. Ｘ１９がＷである、請求項１、２および６〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  47. Ｘ１９がＡである、請求項１、２および６〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  48. Ｘ２０がＬである、請求項１、２および６〜４７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  49. Ｘ２０がＡである、請求項１、２および６〜４７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  50. Ｘ２１がＤである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  51. Ｘ２１がＫである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. Ｘ２１がＲである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  53. Ｘ２１がＡである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  54. Ｘ２１がＦである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  55. Ｘ２１がＧである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  56. Ｘ２１がＭである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  57. Ｘ２１がＮである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  58. Ｘ２１がＩである、請求項１、２および６〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  59. Ｘ２２がＩである、請求項１〜４および６〜５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  60. Ｘ２２がＦである、請求項１〜４および６〜５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  61. Ｘ２２がＡである、請求項１〜４および６〜５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  62. Ｘ２３がＫである、請求項１〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  63. Ｘ２３がＴである、請求項１〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  64. Ｘ２４がＫである、請求項１、２、３、および６〜６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  65. Ｘ２４がＥである、請求項１、２、３、および６〜６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  66. Ｘ２５がＤである、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  67. Ｘ２５がＥである、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  68. Ｘ２６がＳである、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  69. Ｘ２６がＮである、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  70. Ｘ２７がＥである、請求項１〜６９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  71. Ｘ２７がＱである、請求項１〜６９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  72. Ｘ２３がＴであり、Ｘ２４がＥであり、Ｘ２５がＥであり、かつ、Ｘ２６がＮである、請求項１〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  73. Ｘ２３がＴであり、Ｘ２４がＫであり、Ｘ２５がＥであり、かつ、Ｘ２６がＮである、請求項１〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  74. Ｘ１７がＫである、請求項１〜７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  75. 前記変異体が配列番号６〜７２のうちいずれか１つの配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  76. 位置Ｘ２４のアミノ酸がアミノ酸Ｋで置換されている、請求項１〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  77. 位置Ｘ２４のアミノ酸がアミノ酸Ｅで置換されている、請求項１〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  78. １以上のアミノ酸のＣ末端伸長部をさらに含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  79. 前記Ｃ末端伸長部がＮＰである、請求項７８に記載のポリペプチド。
  80. 前記Ｃ末端伸長部がＮＰＶＴＰＫである、請求項７８に記載のポリペプチド。
  81. リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたＦｃドメイン単量体をさらに含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  82. 前記Ｆｃドメイン単量体が配列番号９７の配列を含む、請求項８１に記載のポリペプチド。
  83. リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合された野生型Ｆｃドメインをさらに含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  84. 前記野生型Ｆｃドメインが配列番号１５１の配列を含む、請求項８３に記載のポリペプチド。
  85. リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合された、アミノ酸置換を有するＦｃドメインをさらに含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  86. 前記Ｆｃドメインが二量体を形成しない、請求項８５に記載のポリペプチド。
  87. リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  88. 前記アルブミン結合ペプチドが配列番号１５２の配列を含む、請求項８７に記載のポリペプチド。
  89. リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたフィブロネクチンドメインをさらに含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  90. 前記フィブロネクチンドメインが配列番号１５３の配列を含む、請求項８９に記載のポリペプチド。
  91. リンカーを介してポリペプチドのＣ末端に融合されたヒト血清アルブミンをさらに含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  92. 前記ヒト血清アルブミンが配列番号１５４の配列を含む、請求項９１に記載のポリペプチド。
  93. 二量体を形成する、請求項８１または８２に記載のポリペプチド。
  94. 前記リンカーがアミノ酸スペーサーである、請求項８１〜９３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  95. 前記アミノ酸スペーサーがＧＧＧ、ＧＧＧＡ（配列番号９８）、ＧＧＧＧ（配列番号１００）、ＧＧＧＡＧ（配列番号１３０）、ＧＧＧＡＧＧ（配列番号１３１）、またはＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号１３２）である、請求項９４に記載のポリペプチド。
  96. 少なくとも７日の血清半減期を有する、請求項１〜９５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  97. ２００ｐＭ以上のＫＤでヒト骨形成因子９（ＢＭＰ９）と結合する、請求項１〜９６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  98. アクチビンおよび／ミオスタチンのうちの少なくとも１つと結合し、かつ、ヒトＢＭＰ９との結合は低いかまたは弱い、請求項９７に記載のポリペプチド。
  99. ヒトＢＭＰ９と実質的に結合しない、請求項９７または９８に記載のポリペプチド。
  100. ８００ｐＭ以下のＫＤでヒトアクチビンＡと結合する、請求項１〜９９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  101. ８００ｐＭ以下のＫＤでヒトアクチビンＢと結合する、請求項１〜１００のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  102. ５ｐＭ以上のＫＤでヒトＧＤＦ−１１と結合する、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  103. 請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  104. 請求項１０３の核酸分子を含むベクター。
  105. 請求項１０３に記載の核酸分子または請求項１０４に記載のベクターを含み、前記核酸分子またはベクターが宿主細胞内で発現される、請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。
  106. 請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）請求項１０３に記載の核酸分子または請求項１０４に記載のベクターを含む宿主細胞を提供すること、および
    ｂ）前記ポリペプチドの形成を可能とする条件下、宿主細胞内で前記核酸分子またはベクターを発現させること
    を含む、方法。
  107. 請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、または請求項１０４に記載のベクターと１種類以上の薬学上許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
  108. 前記ポリペプチドが治療上有効な量である、請求項１０７に記載の医薬組成物。
  109. 必要とする対象において骨塩密度を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  110. 必要とする対象において骨吸収を低減する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  111. 必要とする対象において骨形成を増大させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  112. 前記対象が原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する、請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 骨損傷を含む疾患または病態を有する対象においてミオスタチン、アクチビンおよびＢＭＰ９のうちの少なくとも１つのシグナル伝達に作用する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  114. 前記疾患または病態が原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である、請求項１１３に記載の方法。
  115. 原発性骨粗鬆症を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  116. 続発性骨粗鬆症を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  117. 骨減少症を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  118. 骨折を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  119. 骨癌または癌転移関連骨量減少を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  120. パジェット病を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  121. 腎性骨異栄養症を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  122. 治療関連骨量減少を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  123. 食事関連骨量減少を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  124. 低重力関連骨量減少を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  125. 不動関連骨量減少を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０３に記載の核酸分子、請求項１０４に記載のベクター、または請求項１０７もしくは１０８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  126. 前記原発性骨粗鬆症が加齢性骨粗鬆症である、請求項１１２、１１４、および１１５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記原発性骨粗鬆症がホルモン関連骨粗鬆症である、請求項１１２、１１４、および１１５のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記続発性骨粗鬆症が不動誘発性骨粗鬆症である、請求項１１２、１１４、および１１６のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記続発性骨粗鬆症がグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である、請求項１１２、１１４、および１１６のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記癌が多発性骨髄腫である、請求項１１２、１１４、および１１９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記治療がＦＧＦ−２１治療である、請求項１１２、１１４、および１２２のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記治療がＧＬＰ−１治療である、請求項１１２、１１４、および１２２のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記治療が癌治療である、請求項１１２、１１４、および１２２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記治療が肥満または２型糖尿病の治療である、請求項１１２、１１４、および１２２のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記食事関連骨量減少がくる病である、請求項１１２、１１４、および１２３のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記対象において骨形成を増大させる、請求項１０９〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記対象において骨吸収を低減する、請求項１０９〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増大させる、請求項１０９〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 破骨細胞活性を低減する、または破骨細胞形成を低減する、請求項１０９〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. アクチビンおよびミオスタチンのうちの少なくとも１つのそれらの受容体への結合を低減するまたは阻害する、請求項１０９〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記対象において血管合併症を引き起こさない、請求項１０９〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 血管透過性または漏出を増大させない、請求項１４１の方法。
  143. 前記対象において骨塩密度を増加させる、請求項１０９〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記骨が皮質骨である、請求項１０９〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記骨が骨梁である、請求項１０９〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 前記ポリペプチド、核酸、ベクター、または医薬組成物が、前記対象において骨密度を増加させる、骨吸収を低減する、骨吸収の速度を低減する、骨形成を増大させる、骨形成の速度を増大させる、破骨細胞活性を低減する、骨芽細胞活性を増大させる、またはミオスタチン、アクチビン、およびＢＭＰ９のうちの少なくとも１つのシグナル伝達に作用するために十分な量で投与される、請求項１０９〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
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