KR20150030706A - 이중 수용체 길항 항원-결합 단백질 및 그것의 사용 - Google Patents

Abstract

본 개시는 길항 이중 수용체 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체 및 병리학적 질환의 치료를 위해 이중 수용체 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 이중 수용체 항체는 ActRII 수용체에 대한 항체를 포함할 수 있고, 병리학적 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 병리학적 상태는 근육 소모 질환 또는 근육 성장의 자극이 필요한 어떤 질환을 포함할 수 있다.

Description

이중 수용체 길항 항원-결합 단백질 및 그것의 사용{DUAL RECEPTOR ANTAGONISTIC ANTIGEN-BINDING PROTEINS AND USES THEREOF}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2012년 6월 11일자 제출된 미국 가 출원 제61/658,237호의 이익을 주장하며, 이것의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해서 그 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.

연방 지원 연구 또는 개발에 관한 언급

해당 없음

기술분야

본 개시내용은 길항 이중 수용체 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체 및 그 이중 수용체 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이중 수용체 항체는 ActRII 수용체에 대한 항체를 포함할 수 있으며, 근육 성장을 자극하기 위해 사용될 수 있다.

단백질의 형질전환 성장인자-β(TGF-β) 패밀리는 형질전환 성장인자-β(TGF-β), 액티빈, 골형성 단백질(BMP), 신경성장인자(NGF), 뇌유래 신경영양인자(BDNF) 및 성장/분화 인자(GDF)를 포함한다. 이들 패밀리 구성원들은 세포 증식, 분화 및 다른 기능을 포함하는 광범위한 생물학적 과정의 조절에 연루된다.

성장/분화 인자 8(GDF-8)은 미오스타틴이라고도 하며, 발생중인 성인 골격근 조직의 세포에서 대부분 발현되는 TGF-β 패밀리 구성원이다. 미오스타틴은 골격근 성장을 음성(negatively) 제어하는데 필수적인 역할을 하는 것으로 보인다(McPherron et al., Nature(London), 387:83-90, (1997); Zimmers et al., Science, 296:1486-1488, (2002)). 미오스타틴의 길항작용은 동물의 순수 근육 질량을 증가시키는 것으로 확인되었다.

단백질의 TGF-β 패밀리의 다른 구성원은 관련된 성장/분화 인자인 성장/분화 인자 11(GDF-11)이다. GDF-11은 미오스타틴의 아미노산 서열과 대략 90% 서열 동일성을 가진다. GDF-11은 발생중인 동물의 축방향 패턴화에서 어떤 역할을 하며(Oh et al., Genes Dev., 11:1812-26, (1997)), 골격근 발생과 성장에서도 어떤 역할을 하는 것으로 보인다.

액티빈 A, B 및 AB는 각각 두 폴리펩티드 사슬 βA와 βB의 호모다이머와 헤테로다이머이다(Vale et al., Nature, 321:776-779, (1986); Ling et al., Nature, 321:779-782, (1986)). 액티빈은 원래 여포자극 호르몬 합성의 조절에 연루된 생식선 펩티드로서 발견되었으며, 현재는 다수의 생물학적 활성의 조절에 연루된다고 여겨진다. 액티빈 A가 액티빈의 전형적인 형태이다.

액티빈, 미오스타틴, GDF-11 및 TGF-β 수퍼패밀리의 다른 구성원들은 액티빈 타입 IIA(ActRIIA)와 액티빈 타입 IIB(ActRIIB) 수용체의 조합을 통해서 결합하여 신호를 내보내며, 이들은 둘 다 경막(transmembrane) 세린/트레오닌 키나아제이다(Harrison et al., J. Biol. Chem., 279:28036-28044, (2004)). 교차-결합 연구는 미오스타틴이 시험관내에서 액티빈 타입 II 수용체 ActRIIA 및 ActRIIB와 결합할 수 있음을 증명하였다(Lee et al., PNAS USA, 98:9306-11, (2001)). GDF-11이 ActRIIA 및 ActRIIB와 모두 결합한다는 증거도 있다(Oh et al., Genes Dev., 16:2749-54, (2002)).

ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB-Fc의 가용성 변이체로서 제조될 수 있다. 가용성 ActRIIB-Fc는 미오스타틴, 액티빈 및 GDF11과 같은 다수의 리간드들을 서열화함으로써 근육 성장을 강력하게 자극한다(Lee SJ, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 102(50):18117-22, (2005 Dec 13) (Epub. 2005 Dec 5)). 미오스타틴을 포함한 이들 리간드들은 2개의 고 친화성 수용체 ActRIIB 및 ActRIIA와 결합한다. 이들 두 수용체는 두 상이한 유전자에 의해서 암호화되는데, 이들은 아미노산 수준에서 약 65% 서열 상동성을 지닌 2개의 다른 경막 수용체 단백질을 암호화한다. 세포막에서 이들 두 수용체들 중 어느 하나와 결합한 리간드는 Smads 2/3의 인산화를 야기하는 것으로 나타났으며, 결과적으로 세포에서 하류 전사 변화를 활성화한다(Lee SJ, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 102(50):18117-22, (2005 Dec 13) (Epub. 2005 Dec 5)). 골격근 세포는 이들 수용체들을 모두 발현한다. 액티빈 수용체에 의한 방해, 예를 들어 길항 이중 수용체 항체를 사용함에 의한 방해는 액티빈 신호화 경로를 차단함으로써 생리학적 효과를 가져올 수 있다.

본 발명은 적어도 액티빈 활성을 차단하는 생물학적으로 활성인 치료제를 제공하며, 이로써 골격근 성장을 자극할 수 있다.

본 발명은 ActRII 수용체와 결합하는 길항 이중 액티빈 수용체 항원-결합 단백질 및 그것의 단편에 관한 것이다. 다양한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 항체이다. 상기 항체는 ActRIIA 및 ActRIIB와 결합할 수 있다. 또한, 본원에서 설명된 항원-결합 단백질의 용도, 예를 들어 골격근 성장의 자극이 제공된다.

다양한 구체예에서, 두 액티빈 수용체와 결합하는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 상기 항원 결합 단백질은 동시에 두 액티빈 수용체와 결합할 수 있다. 상기 분리된 항원-결합 단백질은 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합한다. 또는, 상기 분리된 항원-결합 단백질은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 17과 특이적으로 결합한다. 다양한 양태에서, 항원-결합 단백질이 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 17과 결합했을 때 근육 성장을 자극한다. 다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 상기 항원-결합 단백질은 마우스 항체, 사람화된 항체(humanized antibody), 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편일 수 있다.

다양한 구체예에서, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16을 포함하는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 다양한 양태에서, 분리된 항원-결합 단백질은 SEQ ID NO: 15 및 16에 대해 97% 동일성을 가질 수 있다. 상기 분리된 항원-결합 단백질은 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 결합할 수 있다. 다양한 양태에서, 항원-결합 단백질이 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 결합했을 때 근육 성장을 자극한다. 다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 상기 항체는 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편일 수 있다.

다양한 구체예에서, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 상기 분리된 항원-결합 단백질은 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합한다. 상기 항원-결합 단백질이 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 모두 결합했을 때 근육 성장을 자극할 수 있다. 다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 상기 항체는 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편일 수 있다.

다양한 구체예에서, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5를 포함하는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 상기 분리된 항원-결합 단백질은 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 결합할 수 있다. 다양한 양태에서, 항원-결합 단백질이 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 결합했을 때 근육 성장을 자극한다. 다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 상기 항체는 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편일 수 있다.

다양한 구체예에서, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 상기 분리된 항원-결합 단백질은 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 결합할 수 있다. 다양한 양태에서, 항원-결합 단백질이 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 모두 결합했을 때 근육 성장을 자극한다. 다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 상기 항체는 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편일 수 있다.

다양한 구체예에서, 항원-결합 단백질 중 어느 것을 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산과 숙주 세포를 포함하는 발현 벡터가 또한 제공된다. 상기 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 상기 진핵 세포는 포유류 세포일 수 있다.

다양한 구체예에서, 적어도 SEQ ID NO: 3-5 또는 SEQ ID NO: 4-6을 포함하는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 다양한 양태에서, 핵산이 발현되어 항체를 생성하도록 하는 적합한 조건에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항원-결합 단백질의 생성 방법이 제공된다. 상기 항체는 숙주 세포의 배양물로부터 회수될 수 있다.

다양한 구체예에서, 항원-결합 단백질 및 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.

다른 구체예에서, 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 단백질을 함유하는 제약 조성물의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11 활성을 감소시키거나 차단하는 방법이 제공된다.

또 다른 구체예에서, 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 단백질을 함유하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상의 순수 근육 질량을 증가시키거나 지방 질량에 대한 순수 근육 질량의 비율을 증가시키는 방법이 제공된다.

다양한 구체예에서, 항원-결합 단백질을 함유하는 치료 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육 소모 질환으로 고통받는 대상에서 이러한 장애를 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다. 상기 근육 소모 질환은 암 악액질, 근이영양증, 근위축성 측삭경화증, 울혈성 폐쇄성 폐질환, 만성 심부전, 화학적 악액질, HIV/AIDS로 인한 악액질, 신부전, 요독증, 류마티스 관절염, 노인성 근육감소증, 노인성 허약증, 장기 위축, 손목터널 증후군, 안드로겐 결핍, 또는 장기간의 침상 안정, 척수 손상, 뇌졸중, 골절, 화상, 노화 또는 인슐린 내성으로 인한 무활동으로 인한 근육 소모를 포함할 수 있다.

다양한 구체예에서, BIAcore 분석에서 10 pM 이하의 ActRIIB에 대한 K_D를 갖는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 1 pM 이하의 ActRIIB에 대한 K_D를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 분리된 항원-결합 단백질은 BIAcore 분석에서 4 nM 이하의 ActRIIA에 대한 K_D를 가진다. 상기 항원-결합 단백질은 1 pM 이하의 ActRIIA에 대한 K_D를 가질 수 있다.

다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 BIAcore 분석에서 ActRIIB와 ActRIIA 둘 다에 대해 1 pM 이하의 K_D를 가질 수 있다.

다양한 구체예에서, 세포-기반 분석에서 8 nm 이하의 ActRIIB에 대한 IC₅₀을 갖는 분리된 항원-결합 단백질이 제공된다. 다른 양태에서, 항원-결합 단백질은 2 nM 이하의 ActRIIB에 대한 IC₅₀을 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 분리된 항원-결합 단백질은 세포-기반 분석에서 2 nM 이하의 ActRIIA에 대한 IC₅₀을 가질 수 있다. 상기 항원-결합 단백질은 1 nM 이하의 ActRIIA에 대한 IC₅₀을 가질 수 있다. 상기 항원-결합 단백질은 세포-기반 분석에서 ActRIIB에 대해 2 nM 이하의 IC₅₀ 및 Act-RIIA에 대해 1 nM 이하의 IC₅₀을 가질 수 있다.

다양한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 길항 이중-수용체 항체이다. 상기 이중-수용체 항체는 사람 항체일 수 있다.

다양한 구체예에서, 이중 수용체 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이들을 함유하는 제약 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11 활성을 감소시키거나 차단하는 방법이 제공된다. 상기 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 상기 항체는 ActRIIB와 ActRIIA에 대한 것일 수 있다.

다른 양태에서, 이중 수용체 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 조성물 또는 제약 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상의 순수 근육 질량을 증가시키거나 지방 질량에 대한 순수 근육 질량의 비율을 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 상기 항체는 ActRIIB와 ActRIIA에 대한 것일 수 있다.

다른 양태에서, 이중 수용체 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육 소모 질환으로 고통받는 대상에서 이러한 장애를 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다. 상기 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 상기 항체는 ActRIIB와 ActRIIA에 대한 것일 수 있다. 상기 근육 소모 질환은, 제한은 아니지만 다음의 상태들을 포함한다: 암 악액질, 근이영양증, 근위축성 측삭경화증, 울혈성 폐쇄성 폐질환, 만성 심부전, 화학적 악액질, HIV/AIDS로 인한 악액질, 신부전, 요독증, 류마티스 관절염, 노인성 근육감소증, 노인성 허약증, 장기 위축, 손목터널 증후군, 안드로겐 결핍, 및 장기간의 침상 안정, 척수 손상, 뇌졸중, 골절, 화상, 노화 또는 인슐린 내성으로 인한 무활동으로 인한 근육 소모, 및 다른 장애들. 상기 근육 소모는 또한 우주 비행으로 인한 무중력의 결과일 수 있다. 상기 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 상기 항체는 ActRIIB와 ActRIIA에 대한 것일 수 있다.

다른 양태에서, 이중 액티빈 수용체 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상에서 액티빈이 과발현되는 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 질환은 암이다. 다른 양태에서, 본 발명은 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대사 장애는 골 손실, 당뇨병, 비만, 내당능장애, 고혈당증, 및 대사 증후군으로부터 선택된다.

도 1은 항체 M43(SEQ ID NO: 3-8) 및 R31-1(SEQ ID NO: 9-14)의 HC 및 LC에 대한 CDR 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2A-2D는 M43 HC(SEQ ID NO: 15) 및 LC(SEQ ID NO: 16)의 아미노산 서열을 나타낸다. 굵은 글자는 CDR 영역을 표시한다. 밑줄친 글자는 R31-1과의 아미노산 차이를 표시한다. 도 2B는 M43 HC(SEQ ID NO: 21) 및 M43 LC(SEQ ID NO: 22)의 핵산 서열을 나타낸다. 도 2C는 본 출원의 추가 항체의 서열을 제공한다. 굵은 글자는 CDR 영역을 표시한다. 밑줄친 글자는 R31-1과의 아미노산 차이를 표시한다. 도 2D는 ActRIIB(SEQ ID NO: 2 및 20) 및 ActRIIB-huFc(SEQ ID NO: 1 및 24)에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 제공한다.
도 3은 세포-기반 분석에서 M43에 대한 효현 활성의 결여를 나타낸다.
도 4A-4C는 체중(도 4A), 제지방 체중(도 4B) 및 골격근 질량(도 4C)에 대한 용량-의존적 효과를 나타낸다.
도 5A-5D는 체중, 체조성 및 근육 질량에 대한 M43의 효과를 나타낸다. 8주령 수컷 인히빈-알파 KO 마우스(n = 7/그룹)가 2주 동안 M43 또는 sActRIIB 중 어느 하나의 1회 주사(30 mg/kg, SC)로 치료되었다.
도 6A-6B는 체중 및 제지방 체중에 대한 M43의 효과를 나타낸다. 8주령 수컷 CD1 누드 마우스; 용량: 10 mg/kg/주, S.C. n = 8/그룹.
도 7A-7F는 모 항체와 5개의 돌연변이체 항체의 huActRIIB 및 huActRIIA 결합 비교를 나타낸다.

ActRII 수용체와 결합하는 이중 수용체 길항 항원-결합 단백질(항체 및 그것의 기능성 결합 단편과 같은)이 본원에 개시된다. 일부 구체예에서, ActRII 수용체는 ActRIIA 및 ActRIIB 수용체이다. 상기 항원-결합 단백질은 액티빈 수용체와 결합하여 다양한 방식으로 액티빈 수용체가 기능하는 것을 방지한다. 예를 들어, 상기 이중 수용체 결합 단백질은 액티빈 수용체와 결합하여, 액티빈의 수용체와의 결합을 방지함으로써, 생리학적 효과를 야기할 수 있는데, 예를 들어 골격근 성장을 자극할 수 있다.

전술한 요약은 본 발명의 모든 양태 또는 구체예를 한정하는 것을 의도하지 않으며, 추가의 양태들이 다른 항목에서 설명될 수 있다. 본 명세서는 단일화된 개시내용으로서 관련되도록 의도되며, 특징들의 조합이 본원의 동일한 문장, 또는 단락, 또는 항목에서 함께 발견되지 않더라도 본원에 설명된 특징들의 모든 조합이 고려될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

전술한 것에 더하여, 추가의 양태로서, 본원에서 구체적인 단락에 의해서 정의된 변화보다 어떤 식으로든 더 좁은 범위의 모든 구체예가 본 개시내용에 포함될 수 있다. 예를 들어, 특정 양태가 어떤 속으로서 설명되고, 속의 모든 구성원이 개별적으로 어떤 구체예일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 속으로서 설명된 양태나 속의 구성원을 선택하는 양태는 해당 속의 둘 이상의 구성원의 조합을 포괄한다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 다양한 구체예들이 다양한 환경에서 "포함하는"이란 말을 사용하여 제시되지만, 관련된 구체예는 또한 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"이란 말을 사용하여 설명될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

본원의 설명은 단지 예시적이며 설명적인 것일 뿐, 청구된 본 발명을 제한하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 출원에서 단수형의 사용은 구체적으로 달리 언급되지 않는다면 복수형을 포함한다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달린 언급되지 않는다면 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는", 뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태들의 사용은 제한이 아니다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 구체적으로 달리 언급되지 않는다면 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 성분과 하나보다 많은 서브유닛을 포함하는 요소 및 성분들을 모두 포괄한다. 또한, 용어 "일부"의 사용은 부분 또는 전체 부분의 일부분을 포함할 수 있다.

또한, 값들의 범위를 설명할 때 설명중인 특징이 해당 범위 내에서 발견된 개별 값일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, "약 pH 4 내지 약 pH 6의 pH"는, 제한은 아니지만 pH 4, 4.2, 4.6, 5.1, 5.5 등, 및 이러한 값들 사이에 있는 어떤 값일 수 있다. 또한, "약 pH 4 내지 약 pH 6의 pH"는 해당 pH가 pH 4에서 pH 6까지 2 pH 단위를 변화시킨다는 의미로 해석되어서는 안 되며, 용액의 pH에 대해 두 pH 범위 내에서 임의로 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, 용어 "약"이 사용될 때 그것은 인용된 수 플러스 또는 마이너스 해당 인용된 수의 5%, 10%, 15% 이상을 의미한다. 의도된 실제 변화는 문맥으로부터 결정될 수 있다.

본원에서 사용된 항목 표제는 단지 조직화의 목적일 뿐, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 제한은 아니지만 특허, 특허출원, 논문, 책 및 전문서를 포함하여 본 출원에 인용된 모든 문헌, 또는 문헌의 일부는 모든 목적을 위해서 이들의 전체가 참고자료로 본원에 명백히 포함된다. 개시내용에 따라서 활용되었을 때 이후의 용어들은 달리 나타내지 않는다면 다음의 의미들을 갖는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용된 용어 "TGF-β 패밀리 구성원" 또는 "TGF-β 단백질"은 액티빈, 및 성장 및 분화 인자(GDF) 단백질을 포함하는 형질전환 성장인자 패밀리의 구조적으로 관련된 성장인자들을 말한다(Kingsley et al., Genes Dev., 8:133-146 (1994); McPherron et al. Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith and C.Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA, pp 357-393).

GDF-8은 미오스타틴이라고도 하는데, 골격근 조직의 음성(negatively) 조절제이다(Mc-Pherron et al., PNAS USA, 94:12457-12461 (1997)). 미오스타틴은 대략 375 아미노산 길이의 비활성 단백질 복합체로서 합성되며, 사람에 대해서 GenBank 수탁번호 AAB86694를 가진다. 전구체 단백질이 4염기성 가공 부위에서 단백질 가수분해 절단에 의해서 활성화되어 N-말단 비활성 프로도메인과 대략 109 아미노산 C-말단 단백질이 생성되고, 이것이 다이머화하여 약 25kDa의 호모다이머를 형성한다. 이 호모다이머는 성숙한 생물학적 활성 단백질이다(Zimmers et al., Science, 296:1486 (2002)).

본원에서 사용된 GDF-11은 Swissprot 수탁번호 O95390을 갖는 BMP(골형성 단백질)(SEQ ID NO: 50), 뿐만 아니라 이 단백질의 변이체 및 종 상동체들을 말한다. GDF-11은 아미노산 수준에서 미오스타틴과 대략 90% 동일성을 가진다. GDF-11은 축방향 골격의 전방/후방 패턴화의 조절에 연루되지만, 출생 후 기능은 아직 불명이다(McPherron, et al., Nature Genet., 22(93): 260-264 (1999); Gamer, et al., Dev. Biol., 208(1):222-232 (1999)).

본원에서 사용된 용어 "ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드의 유도체"는 공유 또는 집합 곤쥬게이트를 형성하기 위한 적어도 하나의 추가 화학 부분, 또는 적어도 하나의 추가 폴리펩티드, 예컨대 글리코실 기, 지질, 아세틸 기, 또는 C-말단 또는 N-말단 융합 폴리펩티드의 부착, PEG 분자와의 콘쥬게이션, 및 아래 더 충분히 설명된 다른 변형들을 말한다. 변이체 ActRIIB 수용체 폴리펩티드(vActRIIB)는 또한 포유류 세포, E. coli, 효모 및 다른 재조합 숙주 세포와 같은 다양한 세포 타입에서 발현으로 인한 가공으로부터 생기는 C 및 N 말단에 대한 변형을 포함하여, 추가의 변형 및 유도체를 포함할 수 있다. 더 나아가, 비활성화된 N-글리코실화 부위(들), 비활성화된 프로테아제 가공 부위(들), 또는 보존성 아미노산 치환(들)을 포함하는 vActRIIB 폴리펩티드 단편 및 폴리펩티드가 포함된다.

본원에서 사용된 항체 또는 항원-결합 단편은 효현제(agonist) 또는 길항제일 수 있다.

"효현제"는 폴리펩티드(수용체와 같은), 또는 폴리뉴클레오티드와 결합하여 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성이나 발현을 자극, 증가, 활성화, 촉진, 활성화 증진, 감작 또는 상향조절하는 제제를 말한다.

"길항제"는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하거나 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 결합하여 자극을 완전히 또는 부분적으로 차단하거나 활성을 감소, 방지, 활성화 지연, 비활성화, 탈감작, 또는 하향조절하는 제제를 말한다.

"항원-결합 단백질"(ABP)은 특정된 표적 항원과 결합하는 어떤 단백질을 말한다. 본 명세서에서, 특정된 표적 항원은 액티빈 수용체 또는 그것의 단편 또는 영역, 예를 들어 ActRIIA, ActRIIB, ActRIIA-huFc 또는 ActRIIB-huFc일 수 있다. "항원-결합 단백질"은, 제한은 아니지만 항체 및 그것의 결합 부분, 예컨대 면역학적 기능성 단편을 포함한다. 펩티바디는 항원-결합 단백질의 다른 예이다.

"이중 수용체 항원-결합 단백질"은 2개의 수용체와 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 상기 결합은 동일한 시간에 또는 동시에 이루어질 수 있거나, 또는 수용체 중 어느 하나는 동일한 시간에 결합하지 않을 수 있다. "이중 수용체 항원-결합 단백질"은 2개의 수용체와 결합하는 "이중 수용체 길항 항체"일 수 있다. 상기 수용체는 미오스타틴/액티빈 수용체, 또는 ActRIIA와 ActRIIB 또는 ActRIIA-huFc와 ActRIIB-huFc일 수 있다. 상기 이중 수용체 항체는 ActRIIB와 ActRIIA의 둘 다의 신호화를 차단할 수 있다. 상기 신호화 차단은 생리학적 반응을 야기할 수 있으며, 예를 들어 골격근 또는 뼈 성장을 자극할 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일 가닥 및 이중 가닥 뉴클레오티드 중합체를 모두 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 어느 한 타입의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기 변형, 예컨대 브로모유리딘 및 이노신 유도체, 리보오스 변형, 예컨대 2',3'-디데옥시리보오스, 및 뉴클레오티드간 결합 변형, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스호라닐라데이트(phoshoraniladate) 및 포스포로아미데이트를 포함한다.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 200 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 60 염기 길이이다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 또는 약 20 내지 약 40 뉴클레오티드 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 예를 들어 돌연변이체 유전자의 구성에서 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 분석을 위하여 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 또는 항원 표지를 포함하는 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다.

"분리된 핵산 분자"는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이들의 어떤 조합을 의미하며, 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연관되지 않는다. 또한, 분리된 폴리뉴클레오티드는 자연에서 발견되거나, 자연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드와 연결된다. 본 개시내용의 목적에 있어서, 특정한 뉴클레오티드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 무손상 염색체를 포함하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 특정된 핵산 서열을 "포함하는" 분리된 핵산 분자는 특정된 서열에 더하여 최대 10개 또는 심지어 최대 12개의 다른 단백질 또는 그것의 일부에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 인용된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 벡터 서열을 포함할 수 있다.

달리 명시되지 않는다면, 본원에서 논의된 어떤 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 쪽 단부는 5' 단부이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 방향은 5' 방향이라고 한다. 발생기 RNA 전사체의 5'에서 3'으로 부가 방향은 전사 방향이라고 하고, RNA 전사체의 5'에서 5' 단부까지 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥의 서열 영역은 "상류 서열"이라고 하며, RNA 전사체의 3'에서 3' 단부까지 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥의 서열 영역은 "하류 서열"이라고 한다.

분리된 핵산은 본원의 다양한 구체예들에 개시된 항원-결합 단백질, 예를 들어 이중 수용체 항원-결합 단백질 또는 항-액티빈 이중 수용체 항체를 암호화할 수 있다. 상기 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치되었을 때 "작동가능하게 연결된다"라고 언급된다. 예를 들어, 전-서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전-단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열이 서로 가까이 있으며, 분비 리더의 경우 연속적 판독 단계에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요가 없다. 연결은 제한 부위에서 리게이션에 의해서 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 종래의 실시에 따라서 사용된다.

용어 "아미노산"은 천연 및/또는 비-자연 발생 아미노산을 말하며, 본 분야에서 그것의 일반적인 의미를 포함한다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 자생 단백질, 즉 자연 발생 및 비-재조합 세포에 의해서 생성된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 의미한다. 또한, 상기 단백질은 유전자 조작된 또는 재조합 세포에 의해서 생성될 수 있고, 자생 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 자생 서열의 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 특히 액티빈 이중 수용체 항원-결합 단백질, 항체, 또는 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 갖는 서열을 포괄한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장(full-length) 자생 단백질과 비교하여 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 이러한 단편은 또한 자생 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 다양한 구체예에서, 단편은 약 5 내지 약 500 아미노산 길이일 수 있다. 예를 들어, 단편은 적어도 약 5, 약 6, 약 8, 약 10, 약 14, 약 20, 약 50, 약 70, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400 또는 약 450 아미노산 길이일 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편은 결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적 기능성 단편을 포함한다. 이중 액티빈 수용체-결합 항체의 경우, 유용한 단편은, 제한은 아니지만 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 사슬의 일부 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR을 포함하는 그것의 가변 영역 등을 포함한다.

용어 "분리된 단백질"은 해당 단백질이 (1) 그것과 함께 보통 발견되는 적어도 어떤 다른 단백질이 없고, (2) 동일한 공급원, 예를 들어 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 본질적으로 없고, (3) 상이한 종들로부터의 세포에 의해서 발현되고, (4) 관련된 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질의 적어도 50 퍼센트로부터 분리되고, (5) 관련되지 않는 폴리펩티드와 작동 가능하게 연결되고(공유 또는 비-공유 상호작용에 의해서), 또는 (6) 발생하지 않는 것을 의미한다. 전형적으로, "분리된 단백질"은 주어진 샘플의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 그 이상을 구성한다. 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 또는 이들의 어떤 조합이 이러한 분리된 단백질을 암호화할 수 있다. 다양한 구체예에서, 분리된 단백질은 그것의 치료, 진단, 예방, 연구 또는 다른 용도를 방해할 수 있는 천연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물질을 실질적으로 갖지 않는다.

폴리펩티드(예를 들어 항원-결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 대해 아미노산 서열에 삽입, 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 아미노산 서열에 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.

본원에서 사용된 20개의 종래의(예를 들어 자연 발생한) 아미노산 및 이들의 약자는 종래의 용법에 따른다. Immunology - A Synthesis (2nd Ed., E. S. Golub & D. R. Gren, Eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991)를 참조하며, 이것은 모든 목적을 위해서 본원에 참고자료로 포함된다. 20개의 종래의 아미노산, 비천연 아미노산, 예컨대 α-,α-이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비종래 아미노산들의 입체이성질체(예를 들어 D-아미노산)이 또한 본원에 설명된 다양한 구체예들의 폴리펩티드를 위한 적합한 성분일 수 있다. 비종래 아미노산의 예들은 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용된 폴리펩티드 명명에 있어서 왼손 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른손 방향은 카복시-말단 방향이며, 표준 용법 및 관례에 따른다.

보존성 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포괄할 수 있고, 이것은 전형적으로 생물학적 시스템 내의 합성에 의해서가 아니라 화학적 펩티드 합성에 의해서 통합된다. 이들은 펩티도미메틱스 및 아미노산 부분의 다른 역전 또는 반전된 형태를 포함한다.

자연 발생한 잔기들은 공통 측쇄 특성을 기준으로 분류될 수 있다:

소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

산성: Asp, Glu;

염기성: His, Lys, Arg;

사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

방향족: Trp, Tyr, Phe.

예를 들어, 비-보존성 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원의 다른 부류로부터의 구성원으로의 교환을 포함할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는, 예를 들어 비-사람 항체와 상동성인 사람 항체의 영역에, 또는 해당 분자의 비-상동성 영역에 도입될 수 있다.

항원-결합 단백질(항체와 같은)에 어떤 변화를 만드는데 있어서, 특정 구체예에 따라서, 아미노산의 수향성(hydropathic) 지수가 고려될 수 있다. 소수성 및 전하 특징을 기초로 각각의 아미노산에 수향성 지수를 배정한다. 이들은 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수향성 아미노산 지수의 중요성은 본 분야에서 공지된 사실이다(Kyte, et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982)). 특정 아미노산은 유사한 수향성 지수나 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 것이 알려져 있다. 수향성 지수를 기초로 변화를 만드는데 있어서, 특정 구체예에서 수향성 지수가 ±2 이내인 아미노산들의 치환이 포함된다. 특정 구체예에서 수향성 지수가 ±1 이내인 경우가 포함되고, 다른 특정 구체예에서 수향성 지수가 ±0.5 이내인 경우가 포함된다.

또한, 비슷한 아미노산들의 치환이 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 본 분야에서 공지되어 있으며, 특히 이렇게 생성된 생물학적 기능성 단백질 또는 펩티드는 면역학적 구체예에서 유용하다. 특정 구체예에서, 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 인접 아미노산의 친수성에 의해서 좌우되며, 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상호관련된다.

다음의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기들에 배정되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값을 기초로 변화를 만드는데 있어서, 특정 구체예에서 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산들의 치환이 포함되며, 다른 특정 구체예에서 친수성 값이 ±1 이내인 경우가 포함되고, 또 다른 특정 구체예에서 친수성 값이 ±0.5 이내인 경우가 포함된다. 또한, 친수성에 기초하여 주 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이들 영역은 "에피토프 코어 영역"이라고도 한다.

예시적인 아미노산 치환이 표 1에 제시된다.

아미노산 치환

원래 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala	Val, Leu, Ile	Val
Arg	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn	Gln	Gln
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser, Ala	Ser
Gln	Asn	Asn
Glu	Asp	Asp
Gly	Pro, Ala	Ala
His	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, 노르류신	Leu
Leu	노르류신, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys	Arg, 1,4 디아미노-부티르산, Gln, Asn	Arg
Met	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro	Ala	Gly
Ser	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr, Phe	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val	Ile, Met, Leu, Phe, Ala, 노르류신	Leu

용어 "유도체"는 아미노산(또는 핵산)의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 다른 화학적 변형을 포함하는 분자를 말한다. 특정 구체예에서, 유도체는, 제한은 아니지만 중합체, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 부분과의 화학 결합을 포함하는 공유 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 화학적으로 변형된 항원-결합 단백질은 화학적으로 변형되지 않은 항원-결합 단백질보다 더 큰 순환 반감기를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 화학적으로 변형된 항원-결합 단백질은 원하는 세포, 조직 및/또는 장기에 대해 개선된 표적화 능력을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 유도체 항원-결합 단백질은, 제한은 아니지만 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함해서 하나 이상의 수용성 중합체 부착을 포함하도록 공유 변형된다. 예를 들어, 미국특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 및 제4,179,337호를 참조한다. 특정 구체예에서, 유도체 항원-결합 단백질은, 제한은 아니지만 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 다른 탄수화물 기재 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올, 뿐만 아니라 이러한 중합체의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 중합체를 포함한다.

특정 구체예에서, 유도체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 서브유닛으로 공유 변형된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 수용성 중합체가 하나 이상의 특이적 위치에서, 예를 들어 유도체의 아미노 말단에서 결합된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 수용성 중합체가 유도체의 하나 이상의 측쇄에 무작위 부착된다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질의 치료 능력을 개선하기 위해 PEG가 사용된다. 특정 구체예에서, 사람화된 항체의 치료 능력을 개선하기 위해 PEG가 사용된다. 특정한 이러한 방법들은, 예를 들어 미국특허 제6,133,426호에서 논의되며, 이것은 모든 목적을 위해서 본원에 참고자료로 포함된다.

펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 지닌 비-펩티드 약물로서 제약 산업에서 통상 사용된다. 이런 종류의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 의태체" 또는 "펩티도미메틱스"라고 명명된다(Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29, (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985); Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987), 이들은 모든 목적을 위해서 본원에 참고자료로 포함된다). 이러한 화합물은 주로 전산화된 분자 모델링의 도움을 받아 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 의태체는 유사한 치료 또는 예방 효과를 위해서 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱스는 사람 항체와 같은 전형적인 양태의 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성이나 약물학적 활성을 가진 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 하나 이상의 펩티드 결합이 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(시스 & 트랜스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- 및 -CH₂SO-로부터 선택된 적어도 하나의 결합으로 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해서 선택적으로 치환된다. 특정 구체예에서, 더욱 안정한 펩티드를 생성하기 위해 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의 동일한 타입의 D-아미노산(예를 들어 L-리신 대신에 D-리신)으로의 체계적 치환이 사용될 수 있다. 이에 더하여, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변화를 포함하는 강제된 펩티드가 본 분야에 공지된 방법에 의해서 생성될 수 있으며(Rizo & Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992), 모든 목적으로 위해서 본원에 참고자료로 포함된다), 예를 들어 펩티드를 고리화하는 분자내 이황화 다리를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가하는 것이 있다.

폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 관련하여 본 명세서 전체에서 사용된 용어 "자연 발생"은 자연에서 발견되는 물질 또는 자연에서 발견되는 물질들의 형태를 말한다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 아래 설명된 디폴트 변수와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 수동 정렬과 육안 조사를 통해서 측정되었을 때(예를 들어 NCBI 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조) 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 명시된 퍼센트로 갖는(즉, 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐서 최대 상응성에 대해 비교 및 정렬되었을 때 명시된 영역에 걸쳐서 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 더 높은 동일성) 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 이하, 이러한 서열은 "실질적으로 동일한"이라고 언급된다. 이런 정의는 또한 시험 서열의 보체를 말하거나, 적용될 수 있다. 이 정의는 또한 결실 및/또는 부가를 가진 서열, 뿐만 아니라 치환을 가진 것들을 포함한다. 본원에 설명된 대로, 알고리즘은 갭 등을 고려할 수 있다. 다양한 구체예에서, 동일성은 적어도 약 25 아미노산, 약 50 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐서, 또는 50-100 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐서 존재한다.

서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이것과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때 시험 서열과 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 변수가 사용될 수 있거나, 대안적인 변수가 지정될 수 있다. 그 후, 서열 비교 알고리즘이 프로그램 변수에 기초하여 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.

"비교 창"은 원하는 만큼 연속 위치의 수 중 어느 하나의 구간에 대한 기준을 포함한다. 일부 구체예에서, "비교 창"은 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150, 또는 150 초과로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 원한다면 서열은 연속 위치가 동일한 수인 기준 서열과 두 서열이 최적 정렬된 후에 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith & Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), Needleman & Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), Pearson & Lipman의 유사성 방법을 위한 검색(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)), 이들 알고리즘의 전산화된 실시형태(Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 위스콘신 매디슨 사이언스 드라이브 575), 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1995 증보판) 참조) 에 의해서 수행될 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트의 결정에 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)에 각기 설명된다. BLAST 및 BLAST 2.0은 다양한 구체예의 핵산 및 단백질에 대하여 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 본원에 설명된 변수와 함께 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information를 통해서 공개적으로 이용할 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 문자와 정렬되었을 때 어떤 양수 값의 역치 점수 T와 일치하거나 그것을 만족하는, 길이 W의 짧은 문자를 쿼리 서열에서 확인함으로써 고 득점 서열 쌍(HSP)을 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 문자 점수 역치를 말한다(Altschul et al., supra). 이들 초기 이웃 문자 히트들은 이들을 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 이 문자 히트들은 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한에서 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 변수 M(일치한 잔기들의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치한 잔기들에 대한 벌칙 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 누적 점수를 계산하기 위해 득점 행렬이 사용된다. 각 방향에서 문자 히트의 확장은 누적 정렬 점수가 최대 달성값으로부터 양 X까지 하락했을 때; 하나 이상의 음수 득점한 잔기 정렬의 축적으로 인해서 누적 점수가 0 이하가 되었을 때; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달했을 때 중단된다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 11의 문자길이(W), 10의 기대값(E), M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 문자길이, 및 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 득점 행렬(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989) 참조), 50의 정렬값(B), 10의 기대값(E), M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.

용어 "제어 서열"은 리게이션된 코딩 서열의 발현 및 가공에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 이러한 제어 서열의 속성은 숙주 유기체에 의존할 수 있다. 특정 구체예에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터, 전사 인핸서 서열, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. "제어 서열"은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 숙주 세포에 단백질 코딩 정보를 전달하는데 사용된 어떤 분자 또는 존재(예를 들어 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.

용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구성물"은 숙주 세포의 형질전환에 적합한 벡터를 말하며, 작동가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 코딩 영역의 발현을 지시 및/또는 제어하는(숙주 세포와 함께) 핵산 서열을 함유한다. 발현 구성물은, 제한은 아니지만 전사, 번역에 영향을 미치거나 그것을 제어하며, 인트론이 존재한다면 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있다. 본원에 설명된 다양한 구체예에 유용한 발현 벡터는 발현되어야 하는 DNA 서열 또는 단편에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 제어 서열을 함유할 수 있다. 제어 서열은 클론된 DNA 서열의 발현을 제어하고 조절하기 위해서 벡터에 삽입된다. 유용한 발현 제어 서열의 예들은 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파지 람다의 주 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 제어 영역, 효모의 당분해 프로모터, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나아제에 대한 프로모터, 효모 산 포스파타아제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-메이팅 인자의 프로모터, 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 및 유인원 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예를 들어 조기 및 후기 프로모터 또는 SV40, 및 원핵 또는 진핵 세포 및 이들의 바이러스의 유전자 발현을 제어한다고 알려진 다른 서열들 또는 이들의 조합이다.

용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되거나, 형질전환될 수 있어서 관심 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 이 용어는 모 세포의 자손을 포함하며, 상기 자손은 관심 유전자가 존재하는 한 원래 모 세포와 형태학상 또는 유전자 구성상 동일하거나 동일하지 않다.

용어 "형질감염"(transfection)은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하며, 외인성 DNA가 세포막 내에 도입되었을 때 세포가 "형질감염"되었다고 한다. 다수의 형질감염 기술이 본 분야에 잘 알려져 있으며 본원에 개시된다. 예를 들어, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197을 참조한다. 이러한 기술들은 적합한 숙주 세포에 하나 이상의 외인성 DNA 부분을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 형질감염은 일시적일 수 있다.

용어 "형질전환"(transformation)은 세포의 유전적 특징에 있어서 어떤 변화를 말하며, 세포가 새로운 DNA 또는 RNA를 함유하도록 변형되었을 때 형질전환되었다고 한다. 예를 들어, 세포는 형질감염, 형질도입(transduction), 또는 다른 기술을 통해서 새로운 유전 물질을 도입함으로써 자생 상태로부터 유전적으로 변형된 경우 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, 형질전환한 DNA는 세포의 염색체에 물리적으로 통합시킴으로써 세포의 DNA와 재조합할 수 있거나, 복제되지 않은 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제할 수 있다. 세포는 형질전환한 DNA가 세포의 분열과 함께 복제되었을 때 "안정하게 형질전환"되었다고 간주된다.

본원에서 사용된 용어 항체 또는 면역글로불린 사슬(중쇄 또는 경쇄) 항원-결합 단백질의 "면역학적 기능성 단편"(또는 간단히 "단편")은 전장 사슬에 존재하는 아미노산의 적어도 일부를 결여하지만 여전히 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부(그 일부가 얻어지거나 합성된 방식과는 무관하게)를 포함하는 항원-결합 단백질의 종들이다.

"특이적 결합"은 항원-결합 단백질에 의해서 결합된 지배적인 항원이 항원-결합 단백질에 대한 액티빈 수용체, 예를 들어 ActRIIA(SEQ ID NO: 1) 및 Act-RIIB(SEQ ID NO: 2)인 것을 의미한다. 그러나, 이것이 반드시 액티빈 수용체 이외의 다른 단백질과 항원-결합 단백질의 결합을 배제하는 것은 아니다. 다양한 구체예에서, 다른 단백질과의 결합은 전체 결합된 단백질의 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만 또는 약 25% 미만을 나타낸다.

항원-결합 단백질의 단편은 표적 항원과 결합하고, 주어진 에피토프나 항원과의 결합을 위해서 무손상 항체를 포함하는 다른 항원-결합 단백질과 경쟁할 수 있다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 일부 구체예에서, 단편은 중화 단편이다. 일부 구체예에서, 단편은 액티빈과 그것의 수용체(들) 사이의 상호작용 가능성을 차단하거나 감소시킬 수 있다. 한 양태에서, 이러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 보유할 것이며, 일부 구체예에서 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그것의 일부를 포함할 것이다. 이들 생물학적 활성 단편들은 재조합 DNA 기술에 의해서 생성될 수 있거나, 무손상 항체를 포함하는 항원-결합 단백질의 효소 또는 화학 절단에 의해서 생성될 수 있다. 면역학적 기능성 면역글로불린 단편은, 제한은 아니지만 Fab, 디아바디(너무 짧아서 동일한 사슬에서 두 도메인이 쌍을 이룰 수 없는 짧은 펩티드 링커를 통해서 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 중쇄 가변 도메인), Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 및 단쇄 항체를 포함하며, 제한은 아니지만 사람, 마우스, 래트, 낙타 또는 토끼를 포함하는 어떤 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 더 나아가, 본원에 개시된 항원-결합 단백질의 기능성 부분, 예를 들어 하나 이상의 CDR은 신체에서 특정한 표적을 지향하거나, 이중기능성 치료 특성을 지니거나, 연장된 혈청 반감기를 갖는 치료제를 생성하기 위해서 제2 단백질 또는 소 분자와 공유 결합될 수 있다. 당업자에 의해서 인정되는 대로, 항원-결합 단백질은 비단백질 성분을 포함할 수 있다.

본원에 설명된 특정 항원-결합 단백질은 항체이거나 항체로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질의 폴리펩티드 구조는, 제한은 아니지만 단클론성 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때로 "항체 의태체"라고도 한다), 키메라 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 항체 융합체(때로 "항체 콘쥬게이트라고"도 한다) 및 이들의 단편을 각기 포함하는 항체에 기초한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 아비머(avimer)(밀착 결합 펩티드)를 포함하거나 그것으로 구성된다.

"Fc" 영역은 항체의 C_H1 및 C_H2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 이 2개의 중쇄 단편은 둘 이상의 이황화 결합과 C_H3 도메인의 소수성 상호작용에 의해서 함께 고정된다.

"Fab 단편"은 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄의 C_H1 및 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.

"Fab' 단편"은 1개의 경쇄 및 VH 도메인과 C_H1 도메인 및 C_H1과 C_H2 도메인 사이의 영역을 또한 함유하는 1개의 경쇄의 일부를 포함하며, 이로써 F(ab')2 분자를 형성하기 위해 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성될 수 있다.

"F(ab')₂ 단편"은 2개의 경쇄 및 C_H1과 C_H2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 이로써 2개의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성된다. F(ab')₂ 단편은 이와 같이 2개의 중쇄 사이에서 이황화 결합에 의해서 함께 고정된 2개의 Fab' 단편으로 이루어진다.

"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 양쪽으로부터의 가변 영역을 포함하며, 불변 영역은 결여한다.

"단쇄 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해서 연결되어 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하고, 이것이 항원-결합 영역을 형성하는 Fv 분자이다. 단쇄 항체는 국제특허출원 WO 88/01649 및 미국특허 제4,946,778호와 제5,260,203호에 상세히 논의되며, 이들의 개시내용은 참고자료로 포함된다.

"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학적 기능성 면역글로불린 단편이다. 일부 예에서, 둘 이상의 V_H 영역이 펩티드 링커로 공유 연결되어 이가 도메인 항체를 생성한다. 이가 도메인 항체의 두 V_H 영역은 동일한 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다.

"이가 항원-결합 단백질" 또는 "이가 항체"는 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 예에서, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 가진다. 이가 항원-결합 단백질 및 이가 항체는 본원에 정의된 대로 이중특이적일 수 있다. "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체 이외의 다른 이가 항체는, 특정 구체예에서 전형적으로 결합 부위가 각각 동일하다는 것이 이해된다.

"다중특이적 항원-결합 단백질" 또는 "다중특이적 항체"는 하나보다 많은 항원 또는 에피토프를 표적화하는 것이다.

"이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이중기능성" 항원-결합 단백질 또는 항체는 각각 2개의 상이한 항원-결합 부위를 갖는 하이브리드 항원-결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이적 항원-결합 단백질 및 항체는 다중특이적 항원-결합 단백질 항체의 종으로서, 제한은 아니지만 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 결합을 포함하는 다양한 방법에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai 및 Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553을 참조한다. 이중특이적 항원-결합 단백질 또는 항체의 두 결합 부위는 동일한 또는 상이한 단백질 표적에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프와 결합할 것이다.

각 개별 면역글로불린 사슬은 전형적으로 몇 개의 "면역글로불린 도메인"으로 이루어진다. 이들 도메인들은 항체 폴리펩티드로 이루어진 염기성 유닛이다. 사람의 IgA 및 IgD 이소타입은 4개의 중쇄와 4개의 경쇄를 함유하고, IgG 및 IgE 이소타입은 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 함유하며, IgM 이소타입은 5개의 중쇄와 5개의 경쇄를 함유한다. 중쇄 C 영역은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인의 수는 이소타입에 의존할 것이다. IgG 중쇄는, 예를 들어 C_H1, C_H2 및 C_H3라고 알려진 3개의 C 영역 도메인을 함유한다. 제공되는 항체는 이들 이소타입 및 서브타입 중 어느 것을 가질 수 있다.

"항원-결합 영역"은 특정된 항원(예를 들어 파라토프)과 특이적으로 결합하는 단백질, 또는 단백질의 일부를 의미한다. 예를 들어, 항원과 상호작용하여 항원-결합 단백질에 항원에 대한 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항원-결합 단백질의 부분은 "항원-결합 영역"이라고 한다. 항원-결합 영역은 전형적으로 하나 이상의 상보성 결합 영역(CDR)을 포함한다. 특정 항원-결합 영역은 또한 하나 이상의 "프레임워크" 영역을 포함한다. "CDR"은 항원-결합 특이성 및 친화성에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역은 항원-결합 영역과 항원 사이의 결합을 촉진하도록 CDR의 적절한 입체구조를 유지하는데 도움을 줄 수 있다. 구조적으로 프레임워크 영역은 항체에서 CDR 사이에 위치될 수 있다.

특정 양태에서, 이중 액티빈 수용체와 결합하는 재조합 항원-결합 단백질이 제공된다. 이와 관련하여, "재조합 항원-결합 단백질"은 재조합 기술을 사용하여, 즉 여기 설명된 재조합 핵산의 발현을 통해서 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생성을 위한 방법 및 기술은 본 분야에 잘 알려져 있다.

용어 "항체"는 표적 항원과의 특이적 결합을 위해 무손상 항체와 경쟁할 수 있는 어떤 이소타입의 무손상 면역글로불린, 또는 그것의 단편을 말하며, 예를 들어 키메라 항체, 사람화된 항체, 완전 사람 항체, 및 이중특이적 항체를 포함한다. "항체"는 항원-결합 단백질의 종이다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 예에서 단지 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타에서 자연 발생한 항체와 같이 더 적은 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터 단독으로 유래될 수 있거나, "키메라"일 수 있는데, 즉 항체의 상이한 부분들이 아래 더 설명된 대로 두 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항원-결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해서, 또는 무손상 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해서 생성될 수 있다. 달리 나타내지 않는다면, 용어 "항체"는, 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 더하여, 그것의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 이들의 예들은 아래 설명된다. 또한, 명백히 제외되지 않는다면, 항체는 단클론성 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때로 여기서 "항체 의태체"라고 한다), 키메라 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 항체 융합체(때로 여기서 "항체 콘쥬게이트"라고 한다), 및 그것의 단편을 각각 포함한다. 일부 구체예에서, 이 용어는 또한 펩티바디를 포괄한다.

자연 발생한 항체 구조 유닛은 전형적으로 테트라머를 포함한다. 각각의 이러한 테트라머는 전형적으로 폴리펩티드 사슬의 두 동일한 쌍으로 이루어지며, 각 쌍은 하나의 전장 "경쇄"와 하나의 전장 "중쇄"를 가진다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 전형적으로 가변 영역을 포함하며, 전형적으로 항원 인식을 담당한다. 각 사슬의 카복시-말단 부분은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 불변 영역을 한정한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원-결합 부위를 형성한다.

가변 영역은 전형적으로 3개의 초고 가변 영역에 의해서 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타내며, 또한 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고 칭한다. 각 쌍의 2개 사슬로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해서 정렬되며, 이것은 특이적 에피토프와의 결합을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 둘 다 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산 배정은 전형적으로 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest의 정의에 따른다(National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987 and 1991) 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917, (1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883, (1989)).

특정 구체예에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄의 부재하에 항원과 결합한다. 특정 구체예에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄의 부재하에 항원과 결합한다. 특정 구체예에서, 항체 결합 영역은 항체 경쇄의 부재하에 항원과 결합한다. 특정 구체예에서, 항체 결합 영역은 항체 중쇄의 부재하에 항원과 결합한다. 특정 구체예에서, 개별적 가변 영역은 다른 가변 영역의 부재하에 항원과 특이적으로 결합한다.

특정 구체예에서, CDR의 정의적 묘사와 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 풀고 및/또는 항체-리간드 복합체의 구조를 풀음으로써 달성된다. 특정 구체예에서, 이것은 엑스선 결정학과 같은 당업자에게 알려진 다양한 기술 중 어느 것에 의해서 달성될 수 있다. 특정 구체예에서, CDR 영역을 확인하기 위하여 다양한 분석 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법의 예들은, 제한은 아니지만 Kabat 정의, Chothia 정의, "AbM" 정의 및 접촉 정의를 포함한다.

Kabat 정의는 항체의 잔기에 번호를 매기기 위한 표준이며, 전형적으로 CDR 영역을 확인하기 위해 사용된다. 예를 들어, Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28:214 8, (2000)를 참조한다. Chothia 정의는 Kabat 정의와 유사하지만, 별도로 특정 구조적 루프 영역 위치를 고려한다. 예를 들어, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-17, (1986); Chothia et al., Nature, 342:877-83, (1989)를 참조한다. "AbM" 정의는 항체 구조를 모델링하는 Oxford Molecular Group에 의해서 제작된 컴퓨터 프로그램의 통합 도구를 사용한다. 예를 들어, Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:9268-9272, (1989); "AbMTM, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.를 참조한다. AbM 정의는 기지의 데이터베이스와 초기 방법의 조합을 사용하여 주 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델링하며, 예컨대 Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics, Suppl. 3:194-198, (1999)에 설명된 방법들이 있다. 접촉 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다. 예를 들어, MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45, (1996)를 참조한다.

중쇄의 CDR 영역은 전형적으로 H1, H2 및 H3이라고 하며, 아미노 말단에서 카복시 말단의 방향으로 순차적으로 번호가 매겨진다. 경쇄의 CDR 영역은 전형적으로 L1, L2 및 L3이라고 하며, 아미노 말단에서 카복시 말단의 방향으로 순차적으로 번호가 매겨진다.

용어 "특이적으로 결합한다"는 항원-결합 단백질이 특정된 표적(들) 또는 특정된 서열과 우선적으로 결합한다는 것을 의미한다. "특이적으로 결합한다"는 인용된 표적(들) 또는 특이적 서열 이외의 다른 것과 결합하는 것을 배제하는 것으로 해석되지는 않지만, 지배적인 결합 활성은 특정된 표적(들) 또는 아미노산 서열에 대해서만 있다. "동시에 결합한다"는 항원-결합 단백질이 2개의 상이한 표적, 예를 들어 2개의 상이한 액티빈 수용체와 동일한 시간에 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 2개의 상이한 액티빈 수용체는 ActRIIA 및 ActRIIB일 수 있다. 항원-결합 단백질은 길항 이중-수용체 항체일 수 있다. 이중 수용체 항체는 2개의 수용체와 동시에 결합할 수 있거나, 개별적으로 2개의 상이한 수용체와 특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 ActRIIA 호모다이머, ActRIIB 호모다이머 또는 ActRIIA/ActRIIB 헤테로다이머와 결합할 수 있다. 수용체와 결합함으로써 항체는 해당 수용체(들)을 통해서 매개된 생물학적 활성을 억제하거나 방지한다.

용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 그것의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, V_L, 및 불변 영역 도메인, C_L을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다.

액티빈 수용체에 대한, 다양한 구체예의 항체 또는 그것의 단편의 특이성은 친화성 및/또는 항원항체결합성에 기초하여 결정될 수 있다. 항체에 의한 항원의 해리에 대한 평형 상수(Kd)로 표시되는 친화성은 항원 결정소와 항체-결합 부위 사이의 결합 강도를 측정한다. 항원항체결합성은 항체와 항원 사이의 결합 강도를 측정한다. 항원항체결합성은 항체에서 항원-결합 부위를 가진 에피토프 사이의 친화성, 및 항체의 원자가와 모두 관련되며, 이것은 특정한 에피토프에 특이적인 항원-결합 부위의 수를 말한다. Kd 값이 적을수록 항원 결정소와 항체 결합 부위 사이의 결합 강도는 더 강하다.

용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 그것의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, V_H, 및 3개의 불변 영역 도메인, C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함한다. V_H 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, C_H 도메인은 카복실-말단에 있으며, C_H3는 폴리펩티드의 카복시-말단에 가장 인접해 있다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입을 포함한다), IgA(IgA1 및 IgA2 서브타입을 포함한다), IgM 및 IgE를 포함하는 어떤 이소타입의 것일 수 있다.

이중특이적 또는 이중기능성 항체는 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공적 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는, 제한은 아니지만 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 결합을 포함하는 다양한 방법에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321, (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553, (1992)를 참조한다.

또한, 일부 포유류 종들은 단일 중쇄만을 갖는 항체를 생성할 수 있다.

각 개별 면역글로불린 사슬은 전형적으로 몇 개의 "면역글로불린 도메인"으로 이루어진다. 이들 도메인들은 항체 폴리펩티드로 이루어진 염기성 유닛이다. 중쇄 C 영역은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인의 수는 이소타입에 의존할 것이다. 제공되는 항체는 이소타입 및 서브타입 중 어느 것을 가질 수 있다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부를 말한다. 특정 구체예에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체 중에서도 아미노산 서열에 광범하게 차이가 있다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 특정한 항체의 표적에 대한 특이성을 결정한다.

용어 "중화 항원-결합 단백질" 또는 "중화 항체"는 각각 리간드와 결합하여 리간드와 결합 파트너의 결합을 방지하거나 감소시키는 항원-결합 단백질 또는 항체를 말한다. 이것은 예를 들어 리간드 상의 결합 부위를 직접 차단함으로써, 또는 리간드와 결합하여 간접 수단을 통해서 결합할 수 있는 리간드의 능력을 변경함으로써(예컨대 리간드의 구조적 또는 에너지적 변경) 행해질 수 있다. 일부 구체예에서, 이 용어는 결합된 단백질이 생물학적 기능을 수행하는 것을 방지하는 항원-결합 단백질을 나타낼 수 있다. 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 그것의 면역학적 기능성 단편의 결합 및/또는 특이성을 평가하는데 있어서, 항체 또는 단편은 과량의 항체가 리간드에 결합된 결합 파트너의 양을 적어도 약 1-20, 약 20-30%, 약 30-40%, 약 40-50%, 약 50-60%, 약 60-70%, 약 70-80%, 약 80-85%, 약 85-90%, 약 90-95%, 약 95-97%, 약 97-98%, 약 98-99% 또는 그 이상(시험관내 경쟁 결합 분석에서 측정됨)까지 감소시킬 때 리간드와 그것의 결합 파트너의 결합을 실질적으로 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 이중 액티빈 수용체 항원-결합 단백질의 경우, 이러한 중화 분자는 수용체와 결합하는 액티빈의 능력을 감쇠시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 중화 능력은 경쟁 분석을 통해서 특성화되고 및/또는 설명된다. 일부 구체예에서, 중화 능력은 IC₅₀ 또는 EC₅₀ 값의 항목으로 설명된다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 비-중화 항원-결합 단백질일 수 있다.

용어 "표적"은 항원-결합 단백질에 의해서 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 말한다. 특정 구체예에서, 표적은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 표적은 항원이다. "항원-결합 단백질"이란 문구에서 "항원"의 사용은 단순히 그 항원을 포함하는 단백질 서열이 항체에 의해서 결합될 수 있음을 나타낸다. 이와 관련하여, 단백질이 외래 단백질이거나, 면역 반응을 유도할 수 있는 것은 필요하지 않다.

용어 "경쟁한다"는 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원-결합 단백질(예를 들어 중화 항원-결합 단백질 또는 중화 항체)와 관련하여 사용되었을 때 항원-결합 단백질들 간의 경쟁을 의미하며, 이것은 시험된 항원-결합 단백질(예를 들어 항체 또는 그것의 면역학적 기능성 단편)이 공통 항원(예를 들어 액티빈 또는 그것의 단편)에 대한 기준 항원-결합 단백질(예를 들어 리간드 또는 기준 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제하는(예를 들어 감소시키는) 분석에 의해서 결정된다. 많은 타입의 경쟁 결합 분석이 하나의 항원-결합 단백질이 다른 것과 경쟁하는지 결정하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 고체상 직접 또는 간접 방사성 면역분석(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예를 들어 Stahli, et al., 1983, Methods in Enzymology, 9:242-253 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들어 Kirkland, et al., 1986, J. Immunol,. 137:3614-3619 참조); 고체상 직접 표지 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(예를 들어 Harlow 및 Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 참조); I125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA(예를 들어 Morel, et al., 1988, Molec. Immunol., 25:7-15 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들어 Cheung, et al., 1990, Virology, 176:546-552 참조); 및 직접 표지 RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol., 32:77-82)가 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 이들 표지되지 않은 시험 항원-결합 단백질 및 표지된 기준 항원-결합 단백질 중 어느 하나를 지닌 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 시험 항원-결합 단백질의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 경쟁적 억제가 측정된다. 일반적으로, 시험 항원-결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해서 확인된 항원-결합 단백질(경쟁 항원-결합 단백질)은 기준 항원-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합한 항원-결합 단백질 및 입체 장애가 일어날 수 있을 만큼 기준 항원-결합 단백질에 의해서 결합된 에피토프에 충분히 근접한 에피토프와 결합한 항원-결합 단백질을 포함한다. 경쟁 결합을 결정하기 위한 방법에 관한 추가의 상세한 내용은 본원 실시예에 제공된다. 일반적으로, 경쟁 항원-결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 그것은 공통 항원에 대한 기준 항원-결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 약 40-45%, 약 45-50%, 약 50-55%, 약 55-60%, 약 60-65%, 약 65-70%, 약 70-75% 또는 약 75% 이상까지 억제(예를 들어 감소)할 것이다. 일부 예에서, 결합은 적어도 약 80-85%, 약 85-90%, 약 90-95%, 약 95-97%, 또는 약 97% 이상까지 억제된다.

용어 "항원"은 항원-결합 단백질(예를 들어 항체 또는 그것의 면역학적 기능성 단편을 포함한다)과 같은 선택적 결합제에 의해서 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 말한다. 일부 구체예에서, 항원은 해당 항원과 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위하여 동물에서 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 지닐 수 있다.

용어 "에피토프"는 항체 또는 T-세포 수용체와 같은, 항원-결합 단백질에 의해서 결합될 수 있는 어떤 결정소를 포함한다. 에피토프는 해당 항원을 표적화하는 항원-결합 단백질에 의해서 결합되는 항원의 영역이며, 항원이 단백질일 때 항원-결합 단백질과 직접 접촉하는 특이적 아미노산을 포함한다. 가장 흔하게 에피토프는 단백질 상에 존재하지만, 일부 예에서 핵산과 같은 다른 종류의 분자에 존재할 수 있다. 에피토프 결정소는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 부류를 포함할 수 있으며, 특이적인 3차원 구조 특징, 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.

본원에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 설명된 분자 종이 존재하는 지배적인 종이라는 의미이며, 즉 몰 기준으로 동일한 혼합물 중에 어떤 다른 개별 종보다 더욱 풍부하다는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 실질적으로 순수한 분자는 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종들 중 적어도 약 50%(몰 기준으로)를 구성하는 조성물이다. 다른 구체예에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종들의 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%를 포함할 것이다. 다른 구체예에서, 대상 종은 종래의 검출 방법에 의해서 조성물에서 오염 종들이 검출되지 않을 수 있는 본질적인 동종성까지 정제되며, 이로써 조성물은 단일의 검출가능한 거대분자 종으로 구성된다.

본원에서 사용된 용어 "생물학적 샘플"은, 제한은 아니지만 살아 있는 것이나 이전에 살아 있었던 것으로부터의 물질의 어떤 양을 포함한다. 이러한 살아 있는 것은, 제한은 아니지만 사람, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼, 및 다른 동물들을 포함한다. 이러한 물질은, 제한은 아니지만 혈액, 혈청, 소변, 세포, 장기, 조직, 뼈, 골수, 림프절, 및 피부를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "제약학적 제제 조성물"(또는 제제 또는 약물)은 환자에게 적절히 투여되었을 때 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물, 조성물, 제제 또는 약물을 말한다. 그것은 반드시 하나보다 많은 타입의 원료를 필요로 하지는 않는다.

용어 "치료적 유효량" 및 "치료적 유효 용량"은 포유류에서 치료적 반응을 생성하도록 결정된 이중 액티빈 수용체 항원-결합 단백질의 양을 말한다. 당업자라면 이러한 치료적 유효량을 알 수 있다. 정확한 용량 및 조제는 치료 목적에 의존할 것이며, 당업자라면 공지된 기술을 사용하여 이를 알 수 있다(예를 들어 Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003) 및 Pickar, Dosage Calculations (1999) 참조).

용어 "제약학적으로 허용되는 염" 또는 "제약학적으로 허용되는 담체"는 본원에 설명된 화합물에서 발견된 특정한 치환체에 따라서, 상대적으로 비독성인 산 또는 염기와 함께 제조된 활성 화합물의 염을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "조정제"는 분자의 활성 또는 기능을 변화시키거나 변경하는 화합물이다. 예를 들어, 조정제는 조정제의 부재하에 관찰된 활성 또는 기능과 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 조정제는 분자의 적어도 하나의 활성 또는 기능을 감소시키는 억제제이다. 분자의 예시적인 특정 활성 및 기능은, 제한은 아니지만 결합 친화성, 효소 활성 및 신호 전달을 포함한다. 예시적인 특정 억제제는, 제한은 아니지만 단백질, 펩티드, 항원-결합 단편, 항체, 펩티바디, 탄수화물 또는 작은 유기 분자를 포함한다. 항체는 이중 액티빈 수용체에 대해 만들어질 수 있다. 펩티바디는, 예를 들어 미국특허 제6,660,843호(PCT 출원 WO 01/83525에 상응한다)에 설명된다.

용어 "환자" 및 "대상"은 상호 교환하여 사용되며, 사람 및 비-사람 동물 대상, 뿐만 아니라 공식적으로 진단된 장애를 가진 것들, 공식적으로 인정된 장애가 없는 것들, 의학적 처치를 받은 것들, 장애가 발생할 위험이 있는 것들 등을 포함한다.

용어 "치료한다" 및 "치료"는 치료적 치료, 예방적 치료, 및 대상에서 장애나 다른 위험 인자가 발생할 위험을 감소시키는 용도를 포함한다. 치료는 장애의 완벽한 치유를 필요로 하지 않으며, 증상 또는 근본적 위험 인자를 감소시키는 구체예들을 포괄한다.

용어 "방지한다"는 사건의 확률의 100% 제거를 필요로 하지 않으며, 사건 발생 가능성이 화합물 또는 방법의 존재하에 감소한 것을 의미한다.

재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환을 위한 표준 기술들이 사용될 수 있다(예를 들어 전기천공, 리포펙션). 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 명세서에 따라서 또는 본 분야에서 통상 달성되는 대로 또는 본원에 설명된 대로 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 과정은 일반적으로 본 분야에 잘 알려진 종래의 방법에 따라서 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 다양한 일반적이며 더 구체적인 참고자료에 설명된 대로 수행될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))를 참조하며, 이것은 모든 목적을 위해서 본원에 참고자료로 포함된다. 구체적인 정의가 제공되지 않는다면, 본원에 설명된 분석화학, 합성유기화학, 및 의학 및 제약화학과 관련되어 활용된 명명법, 및 실험실 과정 및 기술은 본 분야에 잘 알려진 통상 사용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 제약학적 제조, 조제, 및 송달, 및 환자의 치료를 위한 표준 기술들이 사용될 수 있다.

이중 액티빈 수용체와 결합하는 항원-결합 단백질(ABP)이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 제공된 항원-결합 단백질은 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 항원-결합 단백질에서, CDR은 "프레임워크" 영역에 매립되며, 이것은 CDR(들)의 적절한 항원-결합 특성이 달성되도록 CDR(들)을 배향한다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 항원-결합 단백질은 액티빈과 액티빈 수용체 사이의 상호작용을 방해, 차단, 감소 또는 조정할 수 있다. 이러한 항원-결합 단백질은 "중화"로서 표시된다. 일부 구체예에서, 중화 항원-결합 단백질은 액티빈이 액티빈 수용체와 결합하는 것을 방지하는 위치에서 및/또는 방식으로 이중 액티빈 수용체와 결합한다.

일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항원-결합 단백질은 액티빈-매개 활성(결합을 포함한다)을 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 액티빈 수용체 에피토프와 결합한 항원-결합 단백질은 특히 액티빈과 액티빈 수용체 사이의 상호작용, 및 액티빈/액티빈 수용체 상호작용에 의해서 매개된 다른 생리학적 효과를 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 사람/마우스 키메라와 같은 키메라이다.

항원-결합 단백질은 본원에 설명된 바와 같은 다양한 치료 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 액티빈 수용체 항원-결합 단백질은 근육 소모와 관련된 질환과 같은 액티빈 및/또는 액티빈 수용체와 관련된 질환 및 상태를 치료하는데 유용하다. 근육 소모 질환은, 제한은 아니지만 다음의 상태들을 포함할 수 있다: 암 악액질, 근이영양증, 근위축성 측삭경화증, 울혈성 폐쇄성 폐질환, 만성 심부전, 화학적 악액질, HIV/AIDS로 인한 악액질, 신부전, 요독증, 류마티스 관절염, 노인성 근육감소증, 노인성 허약증, 장기 위축, 손목터널 증후군, 안드로겐 결핍, 및 장기간의 침상 안정, 척수 손상, 뇌졸중, 골절, 화상, 노화, 인슐린 내성, 및 다른 장애로 인한 무활동으로 인한 근육 소모. 근육 소모는 또한 우주 비행으로 인한 무중력의 결과일 수 있다. 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 항체는 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 것일 수 있다.

또한, 제한은 아니지만 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11 활성을 감소시키거나 차단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 이중 수용체 항원-결합 단백질 및 폴리펩티드, 또는 이들을 함유하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 항체는 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 것일 수 있다.

다른 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상의 순수 근육 질량을 증가시키거나 지방 질량에 대한 순수 근육 질량의 비율을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이중 수용체 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 조성물 또는 제약 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 항체는 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 것일 수 있다.

다른 양태에서, 근육 소모 질환으로 고통받는 대상을 치료하거나 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항원-결합 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는 치료 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 액티빈이 과발현되는 상태 관련 질환 치료를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 질환은 암이다. 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상에게 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대사 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대사 장애는 골 손실, 당뇨병, 비만, 내당능장애, 고혈당증, 및 대사 증후군으로부터 선택된다. 항원-결합 단백질은 길항 이중 수용체 항체일 수 있다. 항체는 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 것일 수 있다.

일부 구체예에서, 제공되는 항원-결합 단백질은 하나 이상의 CDR(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 (a) 폴리펩티드 구조 및 (b) 폴리펩티드 구조에 삽입 및/또는 연결된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 폴리펩티드 구조는 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 구조는 자연 발생한 항체의 프레임워크, 또는 그것의 단편 또는 변이체이거나, 또는 자연에서 완전히 합성된 것일 수 있다.

특정 구체예에서, 항원-결합 단백질의 폴리펩티드 구조는, 제한은 아니지만 단클론성 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때로 "항체 의태체"라고도 한다), 키메라 항체, 사람화된 항체, 항체 융합체(때로 "항체 콘쥬게이트"라고도 한다), 및 각각의 일부 또는 단편을 각기 포함하는 항체로부터 유래된다. 일부 예에서, 항원-결합 단백질은 항체의 면역학적 단편이다(예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 scFv와 같은 단쇄 항체 분자).

항원-결합 단백질이 치료 용도에 사용되는 구체예에서, 항원-결합 단백질은 액티빈의 하나 이상의 생리학적 활성을 억제, 방해 또는 조정할 수 있다. 한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 액티빈 수용체와 특이적으로 결합하여, 적어도 약 20%-40%, 약 40-60%, 약 60-80%, 약 80-85% 또는 그 이상까지(예를 들어 시험관내 경쟁 결합 분석에서 결합을 측정함으로써) 사람 액티빈과 액티빈 수용체의 결합을 실질적으로 억제한다.

본원에 제공되는 항원-결합 단백질의 일부는 항체이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 약 10^-7, 약 10^-8, 약 10^-9, 약 10^-10, 약 10^-11, 약 10^-12, 약 10^-13 M보다 적은(더 밀착 결합하는) Kd를 가진다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 약 1 μM 미만, 약 1000 nM 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 1 nM, 약 1000 pM 내지 약 500 pM, 약 500 pM 내지 약 200 pM, 약 200 pM 미만, 약 200 pM 내지 약 150 pM, 약 200 pM 내지 약 100 pM, 약 100 pM 내지 약 10 pM, 약 10 pM 내지 약 1 pM의 액티빈 수용체와 액티빈의 결합을 차단하는 IC₅₀을 가진다.

일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 액티빈이 수용체와 상호작용하는 것을 방지하기 위해서 액티빈 수용체의 특이적 입체구조와 결합한다. 액티빈이 액티빈 수용체와 상호작용하는 것이 방지되었을 때, 액티빈 또는 액티빈 수용체 매개 활성과 그 상호작용으로 인한 결과인 병리상태를 방지하거나 차단할 수 있다.

본원에 설명된 대로, 액티빈 수용체에 대한 항원-결합 단백질은 사람화된 항체 및/또는 그것의 일부분을 포함할 수 있다. 이러한 전략의 실제적인 적용으로는 마우스 체액 면역 시스템의 "사람화"가 있다.

특정 구체예에서, 사람화된 항체는 사람에서 실질적으로 비-면역성이다. 특정 구체예에서, 사람화된 항체는 사람화된 항체가 유래된 다른 종으로부터의 항체와 표적에 대해서 실질적으로 동일한 친화성을 가진다. 예를 들어, 미국특허 제5,530,101호; 미국특허 제5,693,761호; 미국특허 제5,693,762호; 및 미국특허 제5,585,089호를 참조한다.

특정 구체예에서, 면역원성을 감소시키면서 항원-결합 도메인의 자생 친화성의 감쇠 없이 변형될 수 있는 항체 가변 도메인의 아미노산이 확인된다. 예를 들어, 미국특허 제5,766,886호 및 제5,869,619호를 참조한다.

특정 구체예에서, 본 분야에 공지된 방법에 의한 항체의 변형은 전형적으로 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 달성하고 및/또는 수여자에서 항체의 면역원성을 감소시키도록 설계된다. 특정 구체예에서, 사람화된 항체는 동족 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위하여 글리코실화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Co et al., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993)를 참조한다. 특정 구체예에서, "재성형", "고키메라화" 또는 "베니어링/재표면형성"과 같은 기술들이 사람화된 항체의 생성을 위해 사용된다. 예를 들어, Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol., 81:105 (1998); Roguska et al., Prot. Engin., 9:895-904 (1996); 및 미국특허 제6,072,035호를 참조한다. 이러한 특정 구체예에서, 이러한 기술들은 전형적으로 외래 잔기의 수를 감소시킴으로써 항체 면역원성을 감소시키지만, 항체의 반복된 투여 후에 항-이디오타입 및 항-알로타입 반응을 막지 않는다. 면역원성을 감소시키기 위한 다른 특정 방법은, 예를 들어 Gilliland et al., J. Immunol., 62(6):3663-71 (1999)에 설명된다.

특정 예에서, 사람화 항체는 항원-결합 능력의 손실을 가져올 수 있다. 상기 사람화된 항체는 이후 "역-돌연변이"될 수 있다. 이러한 구체예에서, 사람화된 항체는 공여자 항체에서 발견된 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함하도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, Saldanha et al., Mol. Immunol., 36:709-19 (1999)를 참조한다.

특정 구체예에서, 액티빈 수용체에 대한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)이 동일한 종이나 다른 종으로부터의 프레임워크 영역(FR)에 접목될 수 있다. 특정 구체예에서, 액티빈 수용체에 대한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 공통 사람 FR에 접목될 수 있다. 특정 구체예에서, 공통 사람 FR을 생성하기 위해서, 몇몇 사람 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR을 정렬하여 공통 아미노산 서열을 확인한다. 특정 구체예에서, 액티빈 수용체 중쇄 또는 경쇄에 대한 항체의 FR이 상이한 중쇄 또는 경쇄로부터의 FR로 치환된다. 특정 구체예에서, 액티빈 수용체에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄의 FR에서 희귀 아미노산은 치환되지 않고, FR 아미노산의 나머지가 치환된다. 희귀 아미노산은 FR에서 일반적으로 발견되지 않는 위치에 있는 특이적 아미노산이다. 특정 구체예에서, 액티빈 수용체에 대한 항체로부터의 접목된 가변 영역은 액티빈 수용체에 대한 항체의 불변 영역과 상이한 불변 영역과 함께 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 접목된 가변 영역은 단쇄 Fv 항체의 일부분이다. CDR 접목은, 예를 들어 미국특허 제6,180,370호; 제6,054,297호; 제5,693,762호; 제5,859,205호; 제5,693,761호; 제5,565,332호; 제5,585,089호; 및 제5,530,101호; 및 Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter FEBS Letts., 430:92-94 (1998)에 설명되며, 이들은 모든 목적을 위해서 본원에 참고자료로 포함된다.

특정 구체예에서, 항원-결합 단백질(항체와 같은)은 항원(예를 들어 액티빈 수용체 또는 그것의 단편)에 의한 면역화에 의해서 생성된다. 항체는 전장 수용체, 수용체의 가용성 형태, 촉매 도메인 단독, 액티빈 수용체의 성숙한 형태, 수용체의 스플라이스 변이체 형태 또는 이들의 단편에 의한 면역화에 의해서 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있고, 및/또는 재조합 항체일 수 있다.

특정 구체예에서, 표적에 대한 항체의 친화성과 같은 항체의 고유한 특성을 조작하기 위한 전략이 이용될 수 있다. 이러한 전략들은, 제한은 아니지만 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 부위-특이적으로 사용하거나 무작위 돌연변이시켜 항체 변이체가 생성하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 생성에 이어서 원하는 변화, 예를 들어 증가된 또는 감소된 친화성을 나타내는 항체 변이체가 스크리닝된다.

특정 구체예에서, 돌연변이유발 전략에서 표적화되는 아미노산 잔기는 CDR의 것들이다. 다른 구체예에서, 가변 도메인의 프레임워크 영역의 아미노산이 표적화될 수 있다. 이러한 프레임워크 영역은 특정 항체의 표적 결합 특성에 기여하는 것으로 확인 되었다(예를 들어 Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999)와 이의 참고자료를 참조한다).

특정 구체예에서, 항체 변이체의 더 작으면서 더 효과적으로 스크리닝된 라이브러리가 CDR에서 고-돌연변이 부위에 무작위 또는 부위-지정 돌연변이유발을 국한함으로써 생성될 수 있으며, 이들은 체세포 친화성 성숙화 과정 동안 돌연변이의 경향을 나타내는 영역에 상응하는 부위들이다(예를 들어 Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17:568-572 (1999)와 이의 참고자료를 참조한다). 특정 구체예에서, 특정 타입의 DNA 요소가, 제한은 아니지만 특정 직접 및 반전 반복부, 특정 공통 서열, 특정 이차 구조, 및 특정 팔린드롬을 포함하는 고-돌연변이 부위를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고-돌연변이 부위를 확인하는데 사용될 수 있는 이러한 DNA 요소는, 제한은 아니지만 퓨린(A 또는 G), 구아닌(G), 피리미딘(C 또는 T), 아데노신 또는 티미딘 중 어느 하나(A 또는 T)를 차례로 포함하는 4염기 서열(즉 A/G-G-C/T-A/T)을 포함한다. 고-돌연변이 부위를 확인하는데 사용될 수 있는 DNA 요소의 다른 예는 세린 코돈, A-G-C/T이다.

다양한 구체예를 위한 적합한 항체, 예를 들어 재조합, 단클론성, 또는 다클론성 항체의 제조를 위해서 본 분야에 공지된 많은 기술이 사용될 수 있다(예를 들어 Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); 및 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2d ed. 1986) 참조). 관심 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자가 세포로부터 클론될 수 있으며, 예를 들어 단클론성 항체를 암호화하는 유전자가 하이브리도마로부터 클론되어 재조합 단클론성 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 단클론성 항체들의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자 라이브러리가 하이브리도마 또는 혈장 세포로부터 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 생성물의 무작위 조합은 상이한 항원 특이성을 가진 항체들의 큰 풀을 생성한다(예를 들어 Kuby, Immunol.(3rd ed. 1997) 참조). 단쇄 항체 또는 재조합 항체의 생성을 위한 기술(미국특허 제4,946,778호; 미국특허 제4,816,567호)이 다양한 구체예를 위한 항체 및 폴리펩티드를 생성하도록 개조될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 유기체, 예컨대 다른 포유류들이 사람화된 또는 사람 항체를 발현하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어 미국특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783(1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13(1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14:845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); 및 Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93(1995) 참조). 또한, 파지 디스플레이 기술이 선택된 항원과 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머 Fab 단편을 확인하기 위해서 사용될 수 있다(예를 들어 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Marks, et al., Biotechnology, 10:779-783 (1992) 참조). 또한, 항체는 이중특이적으로, 즉 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있도록 제조될 수 있다(예를 들어 WO 93/08829, Traunecker, et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991); 및 Suresh, et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) 참조). 또한, 항체는 헤테로콘쥬게이트, 예를 들어 2개의 공유 연결된 항체 또는 면역독소일 수 있다(예를 들어 미국특허 제4,676,980호, WO 91/00360; WO 92/200373; 및 EP 03089 참조).

비-사람 항체를 사람화하거나 영장류화하기 위한 방법이 본 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 사람화된 항체는 비-사람 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비-사람 아미노산 잔기는 주로 임포트 잔기라고 하며, 전형적으로 임포트 가변 도메인으로부터 채용된다. 사람화는 Winter와 동료들의 방법에 따라서 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 사람 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 본질적으로 수행될 수 있다(예를 들어 Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, et al., Science, 239:1534-1536 (1988) 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참조). 따라서, 이러한 사람화된 항체는 무손상 사람 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다(미국특허 제4,816,567호). 실제로, 사람화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기와 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 사람 항체이다.

GenPharm International, Inc.를 포함하는 다른 회사들 경우 "미니로쿠스" 접근법을 활용했다. 미니로쿠스 접근법에서, 외인성 Ig 유전자좌가 Ig 유전자좌로부터 조각들(개별 유전자들)의 봉입을 통해 의태된다. 이로써 하나 이상의 V_H 유전자, 하나 이상의 D_H 유전자, 하나 이상의 J_H 유전자, mu 불변 영역, 및 보통의 제2 불변 영역(예를 들어 감마 불변 영역)이 동물에의 삽입을 위한 구성물에 형성된다. 이 접근법은 미국특허 제5,545,807호(Surani et al.) 및 미국특허 제5,545,806호; 제5,625,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; 제5,770,429호; 제5,789,650호; 제5,814,318호; 제5,877,397호; 제5,874,299호; 및 제6,255,458호(각 Lonberg & Kay), 미국특허 제5,591,669호 및 제6,023.010호(Krimpenfort & Berns), 미국특허 제5,612,205호, 제5,721,367호 및 제5,789,215호(Berns et al.), 및 미국특허 제5,643,763호(Choi & Dunn), 및 GenPharm 국제 미국 특허출원 제07/574,748호; 제07/575,962호; 제07/810,279호; 제07/853,408호; 제07/904,068호; 제07/990,860호; 제08/053,131호; 제08/096,762호; 제08/155,301호; 제08/161,739호; 제08/165,699호; 제08/209,741호에 설명되며, 이들의 개시내용은 본원에 참고자료로 포함된다. 또한, 유럽특허 제0 546 073 B1호, 국제특허출원 WO 92/03918; WO 92/22645; WO 92/22647; WO 92/22670; WO 93/12227; WO 94/00569; WO 94/25585; WO 96/14436; WO 97/13852; 및 WO 98/24884 및 미국특허 제5,981,175호를 참조하며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고자료로 포함된다. 더 나아가, Taylor, et al., 1992, Chen, et al., 1993; Tuaillon, et al., 1993; Choi, et al., 1993, Lonberg, et al. (1994); Taylor, et al. (1994), 및 Tuaillon, et al. (1995), Fishwild, et al. (1996)를 참조하며, 이들의 개시내용은 본원에 참고자료로 포함된다.

한 구체예에서, 항체는 "이펙터" 부분에 콘쥬게이트된다. 이펙터 부분은 방사성 활성 표지 또는 형광 표지와 같은 표지화 부분을 포함하는 어떤 수의 분자일 수 있거나, 또는 치료적 부분일 수 있다.

항체는 추가의 아미노산 잔기와 융합될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 아마도 분리를 용이하게 할 수 있는 펩티드 태그일 수 있다. 특이적 장기나 조직으로의 항체의 귀소를 위한 다른 아미노산 잔기도 또한 고려된다.

특정 구체예에서, 본원에 설명된 단클론성 항체 중 어느 것의 항체 또는 항원-결합 영역은 암 또는 망막병증의 치료에 사용될 수 있다.

"암"은 주변 조직으로 침입할 수 있고, 몇몇 부위로 전이할 수 있고, 제거를 시도한 후에 재발 가능성이 있을 수 있는 다양한 타입의 악성 신생물 중 어느 것을 나타내기 위해 사용될 수 있는 일반적인 용어로 해석된다. 이 용어는 또한 어떤 암종 또는 육종을 말할 수 있다.

"망막병증"은 망막염과는 구분되는 망막의 비-염증성 질환을 의미한다. "당뇨병성 망막병증"은 당뇨병에서 발생하는 망막 변화를 의미하며, 뚜렷한 출혈, 미세동맥류 및 윤곽이 선명한 왁스질 삼출물로 나타날 수 있다.

암을 치료하는데 있어서, 항원-결합 영역은 치료 활성을 갖는 제2 단백질의 적어도 기능적 활성 부분에 연결될 수 있다. 제2 단백질은, 제한은 아니지만 효소, 림포카인, 온코스타틴 또는 톡신을 포함할 수 있다. 적합한 톡신은 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 에티듐 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 디하이드록시 안트라신 디온, 액티노마이신 D, 디프테리아 톡신, 슈도모나스 엑소톡신(PE) A, PE40, 리신, 아브린, 글루코코르티코이드 및 방사성 동위원소를 포함한다.

항체는 하이브리도마 셀라인 이외의 다른 셀라인에서 발현될 수 있다. 특정한 항체를 암호화하는 서열이 적합한 포유류 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다. 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 어떤 공지된 방법에 의해서 이루어질 수 있고, 예를 들어 바이러스(또는 바이러스 벡터)에 폴리뉴클레오티드의 포장과 바이러스(또는 벡터)에 의한 숙주 세포의 형질도입 또는 미국특허 제4,399,216호; 제4,912,040호; 제4,740,461호; 및 제4,959,455호(이들 특허는 모든 목적을 위해서 본원에 참고자료로 포함된다)에 예시된 것과 같은 본 분야에 알려진 형질감염 과정을 포함한다. 형질전환 과정은 형질전환될 숙주에 의존할 수 있다. 포유류 세포에 이종성 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 제한은 아니지만 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜에 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵에 DNA의 직접 마이크로인젝션을 포함한다.

발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유류 셀라인은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 제한은 아니지만 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 이용가능한 많은 불멸화된 셀라인을 포함하며, 제한은 아니지만 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 사람 간세포 암종 세포(예를 들어 Hep G2), 사람 상피 신장 293 세포, 및 다수의 다른 셀라인들을 포함한다. 특정한 바람직한 셀라인은 셀라인이 관심 항체에 대해 높은 발현 수준을 갖는지를 결정함으로써 선택된다.

특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 및 IgM 이소타입 중 적어도 하나의 면역글로불린 분자를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 사람 카파 경쇄 및/또는 사람 중쇄를 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 또는 IgM 이소타입의 것이다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 포유류 세포에서 발현을 위해 클론되었다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 및 IgM 이소타입의 불변 영역 중 어느 것 이외의 다른 불변 영역을 포함한다.

특정 구체예에서, 액티빈 수용체에 대한 항체의 기능적 및/또는 화학적 특징의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 입체구조인, 치환 영역의 분자 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 효과에 유의한 차이가 있는 치환을 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열에서 선택함으로써 달성될 수 있다.

예를 들어, "보존성 아미노산 치환"은 해당 위치에 있는 아미노산 잔기의 극성이나 전하에 대한 효과가 거의 또는 전혀 없도록 비-자생 잔기로 자생 아미노산 잔기를 치환하는 것을 포함할 수 있다. 또한, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"에 대해 이미 설명된 대로, 폴리펩티드의 어떤 자생 잔기는 알라닌으로 치환될 수 있다.

바람직한 아미노산 치환(보존성이든 비-보존성이든)은 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 아미노산 치환은 액티빈 수용체에 대한 항체의 중요한 잔기를 확인하기 위해서, 또는 본원에 설명된 대로 액티빈 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가 또는 감소시키기 위해서 사용될 수 있다.

특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단백질은 하이브리도마 셀라인 이외의 다른 셀라인에서 발현될 수 있다. 특정한 항체를 암호화하는 서열이 적합한 포유류 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 특정 구체예에 따라서, 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 어떤 공지된 방법에 의해서 이루어질 수 있고, 예를 들어 바이러스(또는 바이러스 벡터)에 폴리뉴클레오티드의 포장과 바이러스(또는 벡터)에 의한 숙주 세포의 형질도입 또는 미국특허 제4,399,216호; 제4,912,040호; 제4,740,461호; 및 제4,959,455호(이들 특허는 모든 목적을 위해서 본원에 참고자료로 포함된다)에 예시된 것과 같은 본 분야에 알려진 형질감염 과정을 포함한다. 특정 구체예에서, 사용되는 형질전환 과정은 형질전환될 숙주에 의존할 수 있다. 포유류 세포에 이종성 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 제한은 아니지만 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜에 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵에 DNA의 직접 마이크로인젝션을 포함한다.

발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유류 셀라인은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 제한은 아니지만 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 이용가능한 많은 불멸화된 셀라인을 포함하며, 제한은 아니지만 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 사람 간세포 암종 세포(예를 들어 Hep G2), 및 다수의 다른 셀라인들을 포함한다. 특정 구체예에서, 셀라인은 셀라인이 높은 발현 수준을 갖는지와 구성성 HGF 결합 특성을 가진 항체를 생성하는지를 결정함으로써 선택될 수 있다. 포유류 숙주 세포를 위한 적절한 발현 벡터는 잘 알려져 있다.

특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 다양한 발현 벡터/숙주 시스템 중 어느 것이 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는데 활용될 수 있다. 이러한 시스템은, 제한은 아니지만 미생물, 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염된 또는 박테리아 발현 벡터(예를 들어 Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함한다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드는 효모에서 재조합 발현된다. 이러한 특정 구체예는 상업상 이용가능한 발현 시스템, 예를 들어 Pichia 발현 시스템(Invitrogen, 캘리포니아 샌디에고)을 제조자의 지시에 따라서 사용한다. 특정 구체예에서, 이러한 시스템은 분비를 지시하는 프레-프로-알파 서열에 의존한다. 특정 구체예에서, 삽입체의 전사는 메탄올에 의한 유도시 알코올 옥시다아제(AOX1) 프로모터에 의해서 유래된다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 분비된 폴리펩티드가 효모 성장 배지로부터 정제된다. 특정 구체예에서, 효모 성장 배지로부터 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 방법은 박테리아 및 포유류 세포 상청액으로부터 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 것들과 동일하다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 pVL1393(PharMingen, 캘리포니아 샌디에고)와 같은 배큘로바이러스 발현 벡터에 클론된다. 특정 구체예에서, 이러한 벡터는 sF9 단백질-무함유 배지에서 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 감염시키고 재조합 폴리펩티드를 생성하기 위해서 제조자의 지시(PharMingen)에 따라서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 헤파린-세파로오스 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 이러한 배지로부터 정제되고 농축된다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드가 곤충 시스템에서 발현된다. 폴리펩티드 발현을 위한 특정 곤충 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 시스템에서, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다면체병 바이러스(AcNPV)가 스포도프테라 프루기페르다 세포나 트리코플루시아 라바에(Trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 바이러스의 비필수 유전자에, 예를 들어 폴리헤드린 유전자 내에 삽입되고, 그 유전자에 대한 프로모터의 제어하에 놓일 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 분자를 성공적으로 삽입시켜서 비필수 유전자가 비활성화시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 이 비활성화는 검출가능한 특징을 가져온다. 예를 들어, 폴리헤드린 유전자를 비활성화시키면 외피 단백질이 결여된 바이러스가 생성된다.

특정 구체예에서, 재조합 바이러스가 S. frugiperda 세포 또는 트리코플루시아 라바에를 감염시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Smith et al., J. Virol., 46:584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91:3224-7 (1994)를 참조한다.

특정 구체예에서, 박테리아 세포에서 만들어진 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드가 박테리아에서 불용성 봉입체로서 생성된다. 이러한 봉입체를 포함하는 숙주 세포가 원심분리에 의해서 수집되고, 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA에서 세척되고, 실온에서 15분간 0.1 mg/ml 리소자임(Sigma, 미주리 세인트루이스)으로 처리된다. 특정 구체예에서, 세포용해물이 음파처리에 의해서 투명해지고, 세포 파편은 12,000 x g에서 10분간 원심분리에 의해서 펠릿화된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드-함유 펠릿이 50 mM Tris, pH 8 및 10 mM EDTA에 재현탁되고, 50% 글리세롤 위에 층상화되고, 6000 x g에서 30분간 원심분리된다. 특정 구체예에서, 이 펠릿은 Mg⁺⁺와 Ca⁺⁺이 없는 표준 포스페이트 완충 식염수 용액(PBS)에 재현탁될 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 재현탁된 펠릿을 분별함으로써 더 정제된다(예를 들어 Sambrook et al., supra 참조). 특정 구체예에서, 이러한 겔은 단백질의 시각화를 위하여 0.4 M KCl에서 소킹될 수 있으며, SDS를 결여한 겔-전개 버퍼 중에서 추출되어 전기용출될 수 있다. 특정 구체예에 따라서, 글루타티온-S-트랜스페라아제(GST) 융합 단백질이 가용성 단백질로서 박테리아에서 생성된다. 특정 구체예에서, 이러한 GST 융합 단백질은 GST 정제 모듈(Pharmacia)을 사용해서 정제된다.

특정 구체예에서, 특정 폴리펩티드, 예를 들어 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드를 "리폴딩"하는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 이러한 폴리펩티드는 본원에 논의된 특정 재조합 시스템을 사용하여 생성된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 원하는 3차 구조를 형성하고 및/또는 이황화 결합을 생성하기 위해서 "리폴딩" 및/또는 산화된다. 특정 구체예에서, 이러한 구조 및/또는 결합은 폴리펩티드의 특정 생물학적 활성과 관련된다. 특정 구체예에서, 리폴딩은 본 분야에 공지된 다수의 과정 중 어느 것을 사용하여 달성된다. 예시적인 방법은, 제한은 아니지만 카오트로픽제의 존재하에 전형적으로 7 이상의 pH에 가용화된 폴리펩티드를 노출시키는 것을 포함한다. 예시적인 카오트로픽제는 구아니딘이다. 특정 구체예에서, 리폴딩/산화 용액은 환원제 및 그 환원제의 산화된 형태를 함유한다. 특정 구체예에서, 환원제 및 그것의 산화된 형태는 이황화 셔플링이 일어나는 것을 허용하는 특정한 레독스 전위를 발생시키는 비율로 존재한다. 특정 구체예에서, 이러한 셔플링은 시스테인 다리의 형성을 허용한다. 예시적인 레독스 커플은, 제한은 아니지만 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화제2구리, 디티오트레이톨 DTT/디티안 DTT, 및 2-메르캅토에탄올(bME)/디티오-bME를 포함한다. 특정 구체예에서, 리폴딩의 효능을 증가시키기 위해서 공-용매가 사용된다. 예시적인 공-용매는, 제한은 아니지만 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 및 아르기닌을 포함한다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드가 실질적으로 정제된다. 특정 단백질 정제 기술들이 당업자에게 알려져 있다. 특정 구체예에서, 단백질 정제는 비-폴리펩티드 분획으로부터 폴리펩티드 분별의 조 분별을 수반한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기술을 사용하여 정제된다. 예시적인 정제 방법은, 제한은 아니지만 황산암모늄 침전; PEG 침전; 면역침전; 열 변성 후 원심분리; 제한은 아니지만 친화성 크로마토그래피(예를 들어 단백질-A-세파로오스), 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피; 겔 여과; 하이드록시아파타이트 크로마토그래피; 등전 포커싱; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 및 이러한 기술과 다른 기술의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 쾌속 단백질 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 정제된다. 특정 구체예에서, 정제 단계는 변화될 수 있거나, 특정 단계가 생략될 수 있으며, 이 경우에도 여전히 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조를 위한 적합한 방법일 수 있다.

특정 구체예에서, 폴리펩티드 제제의 정제도가 정량된다. 정제도를 정량하기 위한 특정 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예시적인 특정 방법은, 제한은 아니지만, 제제의 특이적 결합 활성을 결정하고, SDS/PAGE 분석에 의해서 제제 내에서 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 폴리펩티드 제제의 정제량을 평가하기 위한 예시적인 특정 방법은 제제의 결합 활성을 계산하고, 그것을 초기 추출물의 결합 활성과 비교하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 계산의 결과는 "배수 정제"로서 표시된다. 결합 활성의 양을 표시하는데 사용된 단위는 수행된 특정한 분석에 의존한다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 항원-결합 단백질 성분 또는 항원-결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드가 부분적으로 정제된다. 부분 정제는 동일한 일반적인 정제 방법의 상이한 형태를 이용함으로써 또는 더 적은 정제 단계를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 일반적으로 HPLC 장치를 활용하여 수행된 양이온-교환 칼럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 활용한 동일한 기술보다 큰 "배수 정제"를 가져올 것이다. 특정 구체예에서, 더 낮은 정제도를 가져오는 방법은 폴리펩티드의 총 회수율에, 또는 폴리펩티드의 결합 활성을 유지하는데 있어서 이점을 가질 수 있다.

특정 예에서, 폴리펩티드의 전기영동 이주는 상이한 조건의 SDS/PAGE을 사용하여 때로 유의하게 변할 수 있다(예를 들어 Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425 (1977) 참조). 상이한 전기영동 조건에서 정제된 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드의 겉보기 분자량은 상이할 수 있다는 것이 인정될 것이다.

본원에 설명된 다양한 구체예에서, 항체는 본 분야에 잘 알려진 조사 또는 진단 방법을 위해 생체내 및 시험관내 사용될 수 있다. 진단 방법은 다양한 구체예에서의 항체를 함유하는 키트를 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에 설명된 항체는 치료제로서 사용될 수 있다.

이중-수용체 항체는, 예방 또는 치료의 목적을 위해서 포유류에 사용되는 경우, 제약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있는 조성물의 형태로 투여될 수 있다는 것이 이해된다. 적합한 제약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 이들의 조합 중 하나 이상의 포함한다.

제약학적으로 허용되는 담체는 습윤 또는 유화제, 보존제 또는 버퍼와 같은 보조 물질을 소량 더 포함할 수 있으며, 이들은 항원-결합 단백질의 저장 수명이나 효능을 증진시킨다. 주사 조성물은 본 분야에 잘 알려진 대로 포유류에 투여 후에 활성 원료의 쾌속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 조제될 수 있다.

특히 본원에 설명된 항체의 제약 조제물은 원하는 순도를 갖는 항체를 선택적인 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조제물은 동결건조된 조제물 또는 수성 용액일 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 수여자에게 비독성이다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산들; 항산화제(예를 들어 아스코르브산), 보존제, 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 젤라틴, 또는 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 및 아미노산, 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물들; 킬레이트제; 및 이온성 및 비이온성 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트); 염-형성 카운터-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 항체는 0.5-200 mg/ml의 농도로 조제될 수 있다.

치료 용도로서, 조성물은 "치료적 유효 용량"으로 질환(예를 들어 근육 소모 질환)으로 고통받는 환자에게 투여된다. 이런 사용을 위한 효과적인 양은 질환의 중증도 및 환자의 일반적인 건강 상태에 의존할 것이다. 환자에 의해서 관용되는 필요한 용량 및 빈도에 따라 조성물이 단일 또는 다수 투여될 수 있다. 본원에 언급된 "환자" 또는 "대상"은 사람과 다른 동물들, 특히 포유류를 둘 다 포함할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 사람의 치료법과 수의학적 용도에 모두 적용될 수 있다. 다양한 구체예에서, 환자는 포유류이다. 포유류는 영장류, 또는 사람일 수 있다.

제약 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따르며, 예를 들어 경구 투여, 정맥내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내, 병소내 경로, 골수내, 척수강내, 심실내, 경피, 피하 또는 복강내 주사를 통한 투여; 뿐만 아니라 지속 방출 시스템 또는 이식 장치에 의한 비내, 장, 국소, 설하, 요도, 질, 또는 직장 수단을 통한 투여가 있다. 원하는 경우, 조성물은 볼루스 주사에 의해서 투여되거나, 또는 주입, 또는 이식 장치에 의해서 연속적으로 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 원하는 분자가 흡수되거나 캡슐화된 막, 스펀지, 또는 다른 적절한 재료의 이식을 통해서 국소 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 어떤 적합한 조직이나 장기에 이식될 수 있으며, 원하는 분자의 송달이 확산, 시간지정-방출 볼루스, 또는 연속 투여를 통해서 이루어질 수 있다.

특정 구체예에서, 조제 성분들은 투여 부위에서 허용되는 농도로 존재한다. 특정 구체예에서, 버퍼는 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 조성물을 유지하기 위해서 사용된다.

특정 구체예에서, 비경구 투여가 고려될 때, 치료 조성물은 제약학적으로 허용되는 부형제 중에, 추가의 치료제와 함께 또는 그것 없이, 액티빈에 대한 원하는 이중 수용체 항원-결합 단백질을 포함하는 발열원-무함유, 비경구 허용되는 수성 용액의 형태일 수 있다. 특정 구체예에서, 비경구 주사를 위한 비히클은 멸균 증류수이며, 여기에서 액티빈 수용체에 대한 이중 수용체 항원-결합 단백질이 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 그것 없이 적절히 보존된 멸균, 등장 용액으로 조제된다. 특정 구체예에서, 제조는 주사가능한 마이크로스피어, 생체-식용가능한 입자, 중합 화합물(폴리락트산 또는 폴리글리콜산과 같은), 비드 또는 리포솜과 같은 제제와 원하는 분자의 조제를 포함할 수 있으며, 이것은 생성물의 제어 또는 지속 방출을 제공하고, 이어서 생성물은 데포 주사를 통해 송달될 수 있다. 특정 구체예에서, 히알루론산이 또한 사용될 수 있고, 순환계에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 야기할 수 있다. 특정 구체예에서, 이식가능한 약물 송달 장치가 원하는 분자를 도입하기 위해서 사용될 수 있다.

이중 수용체 항원-결합 조성물의 용도

본 발명은 생체내 및 시험관내에서 미오스타틴, 액티빈 또는 GDF-11의 양 또는 활성을 감소시키거나 중화하기 위한 방법 및 제약 조성물을 제공한다. 액티빈 이중 수용체 항원-결합 단백질은 미오스타틴, 액티빈 A 및 GDF-11 중 적어도 하나의 생물학적 활성을 감소시키고 억제할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 대상에게 이중 액티빈 수용체 항원-결합 단백질 조성물의 유효 용량을 투여함으로써 이러한 치료를 필요로 하는 대상에서 미오스타틴-관련 및/또는 액티빈 A 관련 장애를 치료하기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "대상"은 어떤 동물, 예컨대 사람을 포함하는 포유류를 말한다.

본 발명의 조성물은 대상의 순수 근육 질량을 증가시키는데 유용하다. 이 조성물은 또한 지방 질량과 비례하여 순수 근육 질량을 증가시키고, 이로써 대상에서 체중의 퍼센트로서 지방 질량을 감소시키는데 유용할 수 있다. 실시예 3은 본원에 설명된 이중 액티빈 항체가 동물의 순수 근육 질량을 증가시킬 수 있음을 증명한다.

이중 액티빈 수용체 항원-결합 단백질 조성물에 의해서 치료될 수 있는 장애는, 제한은 아니지만 다양한 형태의 근육 소모, 뿐만 아니라 당뇨병 및 관련된 장애들과 같은 대사 장애, 및 골다공증과 같은 골 퇴행성 질환을 포함한다.

근육 소모 장애는 뒤셴근이영양증, 진행성 근이영양증, 베커 타입 근이영양증, 디제린-란도르 근이영양증, Erb 근이영양증, 및 영아 신경축삭 근이영양증과 같은 이영양증을 포함한다. 추가의 근육 소모 장애는 근위축성 측삭경화증, 울혈성 폐쇄성 폐질환, 암, AIDS, 신부전, 장기 위축, 안드로겐 결핍 및 류마티스 관절염과 같은 만성 질환 또는 장애로부터 생긴다.

미오스타틴 및/또는 액티빈의 과발현은 중증의 근육 손상 증후군인 악액질에 기여할 수 있다. 악액질은 암으로 인한 결과이며, 또한 류마티스 관절염, 당뇨병성 신장병증, 신부전, 화학요법, 화상으로 인한 손상, 뿐만 아니라 다른 원인으로 인해서도 발생한다. 다른 예에서, 미오스타틴-면역반응성 단백질의 혈성 및 근육내 농도는 AIDS-관련 근육 소모를 나타내는 남성에서 증가되는 것으로 판명되었고, 제지방 체중과 역으로 관련되었다(Gonzalez-Cadavid, et al., PNAS USA, 95:14938-14943 (1998)). 미오스타틴 수준은 또한 이화작용 근육 효과를 가져오는 화상 손상에 반응하여 증가하는 것으로 밝혀졌다(Lang, et al, FASEB J., 15, 1807-1809 (2001)). 근육 소모를 가져오는 추가의 상태는 휠체어에 의존, 뇌졸중, 질병, 척수 손상, 골절 또는 외상으로 인한 장기간의 침상 안정, 및 미소중력 환경(우주 비행)에서의 근위축과 같은 장애로 인한 무활동으로부터 생길 수 있다. 예를 들어, 혈장 미오스타틴 면역반응성 단백질은 장기간의 침상 안정 후에 증가하는 것으로 판명되었다(Zachwieja, et al. J. Gravit. Physiol., 6(2):11 (1999)). 또한, 우주왕복선 비행 동안 미소중력 환경에 노출된 래트의 근육은 그러한 환경에 노출되지 않은 래트의 근육과 비교하여 증가된 양의 미오스타틴을 발현하는 것으로 판명되었다(Lalani, et al., J. Endocrin., 167(3):417-28 (2000)).

또한, 지방 대 근육 비율에서 노인성 증가, 및 노인성 근위축이 미오스타틴과 관련된 것으로 확인된다. 예를 들어, 평균 혈청 미오스타틴-면역반응성 단백질은 청년(19-35세), 중년(36-75세) 및 노년(76-92)층 남성 및 여성 그룹에서 연령과 함께 증가했으며, 평균 근육 질량과 제지방 체중은 이들 그룹에서 연령과 함께 감쇠했다(Yarasheski, et al., J. Nutr. Aging, 6(5):343-8 (2002)). 또한, 미오스타틴은 심장 근육에서 낮은 수준으로 발현되는 것으로 판명되었으며, 발현은 경색 후에 심근세포에서 상향조절된다(Sharma, et al., J. Cell Physiol., 180(1):1-9 (1999)). 따라서, 심장 근육에서 미오스타틴 수준의 감소는 경색 후에 심장 근육의 회복을 개선할 수 있다.

미오스타틴은 또한 제2형 당뇨병, 비인슐린-의존성 당뇨병, 고혈당증 및 비만을 포함하는 대사 장애에 영향을 미치는 것으로 보인다. 예를 들어, 미오스타틴의 결여는 두 마우스 모델에서 비만 및 당뇨병 표현형을 개선하는 것으로 확인되었다(Yen, et al,. FASEB J., 8:479 (1994)). 본 개시내용의 항원-결합 단백질은 이러한 대사 장애를 치료하는데 적합하다. 따라서, 본 발명의 조성물의 투여는 적합한 대상에서 당뇨병, 비만 및 고혈당 상태를 개선할 수 있다. 이에 더하여, 항원-결합 단백질을 함유하는 조성물은 비만인 개체에서 음식 섭취를 감소시킬 수 있다.

본원에 설명된 안정화된 항원-결합 단백질의 투여는 골 강도를 개선하고, 골다공증 및 다른 퇴행성 골 질환들을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 미오스타틴-결핍 마우스는 마우스 상완골의 증가된 광질 함량 및 밀도와 근육이 부착된 영역에서 소주골과 피질골 모두의 증가된 광질 함량, 뿐만 아니라 증가된 근육 질량을 나타낸 것이 확인되었다(Hamrick, et al., Calcif. Tissue Int., 71(1):63-8 (2002)). 이에 더하여, 본원에 설명된 항원-결합 단백질은, 예를 들어 전립선암의 치료에 사용된 안드로겐 결핍 요법과 같은 사례들에서 안드로겐 결핍을 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 동물에 항원-결합 단백질의 유효 용량을 투여함으로써 식용 동물에서 근육 질량을 증가시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 성숙한 C-말단 미오스타틴 폴리펩티드는 시험된 모든 종에서 유사하거나 동일하므로, 본원에 설명된 항원-결합 단백질은 소, 닭, 칠면조 및 돼지를 포함하는 어떤 농업상 중요한 종들에서 순수 근육 질량을 증가시키고 지방을 감소시키는데 효과적인 것으로 예상될 수 있다.

본 발명의 다른 양태들이 당업자에 의해서 인정될 것이며, 본원에 설명된다. 이후의 실시예를 포함하여 본 발명의 다양한 구체예들이 본원에 설명되었지만, 당업자는 본원에 상세히 설명된 구체적인 실시예들과 연구가 단지 예시일 뿐임을 쉽게 인정할 것이다. 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 다양한 변형들이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.

실시예

마우스에서 변이체 ActRIIB-Fc에 의한 치료는 미오스타틴을 선택적으로 억제함으로써 달성된 것의 약 3배를 초과하는 근육 성장을 야기했다. 이런 상당한 근육 성장 효과는 치료적으로 유의하며, 암, 신부전, 심부전, 화상, 중증 감염 및 많은 다른 이화작용 질환들을 가진 환자에서 기존의 근육 손실을 개선시키는데 사용될 수 있다. 가용성 ActRIIB-Fc 분자를 개발하는 것에 더하여, 근육 성장을 자극하기 위한 ActRIIB/ActRIIA 수용체 차단 항체를 개발했다. 세포 신호화에서 여분의 기능으로 인하여, ActRIIB-Fc와 유사한 근육 성장 효과를 달성하기 위해서 ActRIIB(SEQ ID NO: 2)(도 2D)와 ActRIIA(SEQ ID NO: 18)를 모두 차단할 수 있는 길항제 항체를 개발했다.

다음의 서열들이 본 출원과 관련된다:

SEQ ID NO.	설명*
1	ActRIIB-huFc
2	ActRIIB
3	M43 HC-CDR1
4	M43 HC-CDR2
5	M43 HC-CDR3
6	M43 LC-CDR1
7	M43 LC-CDR2
8	M43 LC-CDR3
9	R31-1 HC-CDR1
10	R31-1 HC-CDR2
11	R31-1 HC-CDR3
12	R31-1 LC-CDR1
13	R31-1 LC-CDR2
14	R31-1 LC-CDR3
15	M43 HC
16	M43 LC
17	ActRIIA-huFc
18	ActRIIA
19	ActRIIA (핵산 서열)
20	ActRIIB (핵산 서열)
21	M43 HC (핵산 서열)
22	M43 LC (핵산 서열)
23	Alk4 (핵산 서열)
24	ActRIIB-huFC (핵산 서열)
25	M10 LC
26	M10HC
27	M25 LC
28	M25HC
29	M37 LC
30	M37 HC
31	M39 LC
32	M39 HC
* 달리 나타내지 않는다면 설명은 아미노산 서열을 말한다

실시예 1: 항체 생성 및 성숙화

항원으로서 ActRIIB-huFc (SEQ ID NO: 1)(도 2D)를 사용하여 초기에 항체 작업을 수행함으로써 이중-수용체 항체를 생성했다.

항체를 스크리닝하기 위해서, ActRIIB(SEQ ID NO: 20); (더하기 ALK4, 타입 1 경막 리포터 키나아제), 또는 ActRIIA(더하기 ALK4) 또는 ActRIIB와 ActRIIA(SEQ ID NO: 19)(더하기 ALK 4)의 둘 다로 안정하게 형질감염된 C2C12/PMARE-Luc 세포를 함유한 세포 리포터 분석 시스템을 개발했다.

항원으로서 ActRIIB 단백질을 사용해서 몇몇 항-ActRIIB 항체를 확인했다. 그러나, 마우스에서 ActRIIB 결합에 대해 특이적인 항체의 시험은 ActRIIB-Fc보다 훨씬 약한 생체내 근육 성장 효능을 보여주었다(항체가 근육 성장에 대해 일부 효과를 가졌으나). 이것은 ActRIIA와 ActRIIB 수용체의 신호화를 둘 다 효과적으로 차단할 수 있는 이중 수용체 항체에 대한 추가의 시험을 제시했다.

이를 위해서, ActRIIB 스크린으로부터의 항체들의 주의 깊은 검사는 ActRIIB와 강하게 결합하는 동시에 ActRIIA와 약하지만 확실한 결합을 나타내는 항체(R31-1)를 드러냈다.

다음에, ActRIIB에 대한 친화성의 감소 없이 ActRIIA에 대한 친화성을 개선하기 위해서 모 분자로서 R31-1을 사용하여 친화성 성숙화를 수행했다(SEQ ID NO: 2).

M43 으로 R31 -1의 친화성 성숙화

면역원으로서 가용성 ActRIIB-huFc를 사용하여 제노마우스 면역화로부터 얻어진 항-ActRIIB 사람 IgG R31-1은 AcRIIB-huFc에 대해 < 10 pM 결합 친화성 및 ActRIIA-huFc에 대해 -1 nM 결합 친화성을 갖는 것으로 나타났다.

액티빈 수용체 신호화 경로를 완전히 제거하기 위해서, ActRIIA와 ActRIIB의 둘 다의 동시 차단이 필요했다. 이 목표를 달성하기 위해서, ActRIIB에 대한 친화성에 영향 없이 ActRIIA에 대한 R31-1의 친화성을 개선하기 위한 친화성 성숙화 및 스크리닝 전략을 설계했다.

단일 아미노산 잔기 무작위 돌연변이유발(NNK 코돈)(N = A, T, G, 또는 C; K = T 또는 G)을 R31-1 IgG2 분자의 도 1에서 모든 3개 HC-CDR(SEQ ID NOs: 9-11)과 도 1에서 모든 3개의 LC-CDR(SEQ ID NOs: 12-14)의 모든 잔기에 대해 수행했다.

표적화된 위치에 24 야생형 뉴클레오티드 5-프라임 및 24 야생형 뉴클레오티드 3-프라임과 함께 NNK를 측면 연결함으로써 돌연변이유발 프라이머를 설계했다. HC-CDR에서 31개 위치와 LC-CDR에서 31개 위치가 돌연변이되었다.

pTT5 벡터에 R31-1 IgG2 γ 사슬을 함유하는 플라스미드 DNA 및 R31-1 κ 경쇄를 함유하는 플라스미드 DNA를 62개의 돌연변이유발 반응을 위한 주형으로서 사용했다. 총 1178개의 개별 돌연변이체가 서열화에 의해서 확인되었고 분리되었다. 하나의 사슬의 단일 잔기 돌연변이체를 293 6E 세포에의 96-웰 일시 형질감염에서 모 분자의 다른 사슬과 쌍을 맞추었다(돌연변이체 HC; 모 LC 또는 모 HC; 돌연변이체 LC). 컨디셔닝 배지(CM)를 형질감염 7일 후 수거하고 결합 평가를 위해 ELISA에 사용했다.

바이오틴-ActRIIB-huFc 8O% 포화 농도(0.5 μg/ml) 및 바이오틴-ActRIIA-huFc 95% 포화 농도(3.33 μg/ml)로 코팅된 NeutrAvidin 플레이트를 ELISA에 사용했다. 돌연변이체의 CM을 항원 코팅된 플레이트 상에서 인큐베이션하기 전에 2% BSA/2% MPBS에서 차단했다. 1시간 RT(실온) 인큐베이션 후, 플레이트를 PBST로 5번 세척했다. 1시간 인큐베이션 후 결합된 돌연변이체를 항-huIgG HRP 1:3000 희석물로 검출했다. 플레이트를 PBST로 5번 세척했다. LumiGLO 화학발광 기질(KPL, #54-61-01)을 첨가하고 플레이트를 Envision에서 판독했다. R31-1과 비교하여 손상된 ActRIIA 및 ActRIIB 결합 활성을 가진 돌연변이체를 제외시켰다.

유익한 단일 잔기 돌연변이를 확인하기 위한 2차 스크리닝을 위해, 바이오틴-ActRIIB-huFc 0.1 μg/ml 및 바이오틴-ActRIIA-huFc 0.5 μg/ml로 코팅된 Neutr-Avidin 플레이트를 사용하여 높은 긴축성에서 ELISA를 행했다. R31-1과 비교하여 유사한 또는 개선된 ActRIIB 결합 활성 및 개선된 ActRIIA 결합 활성을 가진 14개의 유익한 단일-잔기 돌연변이체(다섯 위치에서 11개의 HC 돌연변이 및 세 위치에 서 3개의 LC 돌연변이)가 확인되었다. 1개의 돌연변이체는 LC-CDR1(LC1-Y12W)에, 2개는 LC-CDR3(LC3-Y3W, LC3-W9H)에, 3개는 HC-CDR1(HC1-Y2S, HC1-Y2D, HC1-S5A)에, 5개는 HC-CDR2(HC2-G1D, HC2-G1V, HC2-G1S, HC2-G1A, HC2-Y10F)에, 그리고 3개는 HC-CDR3(HC3-S4W, HC3-S4Y, HC3-S4T)에 있다.

단일-잔기 HC 돌연변이체를 96-웰 플레이트에서 293 6E로의 일시 형질감염을 위한 행렬에서 단일-잔기 LC 돌연변이와 쌍을 맞춰서 LC 및 He에 각각 하나의 돌연변이를 함유하는 33개의 이중-돌연변이체 IgG를 생성했다. 조 CM 샘플의 IgG2 농도를 단백질 A 바이오센서를 사용하여 ForteBio에 의해 측정하고 정규화했다. 유의하게 개선된 ActRIIA 결합과 변하지 않은 ActRIIB 결합을 가진 이중 돌연변이체를 선택하기 위하여, 10 μg/ml에서 0.001 μg/ml까지 다양한 농도의 바이오틴-VMS hFc IgG1-ACTR-2B(E2BW) 및 바이오틴-hACTR-2A(El19Q,E121Q)-hFc과 1 μg/ml IgG2로 조정된 조 CM으로 코팅된 NeutrAvidin 플레이트에서 적정 ELISA를 행했다. 선택된 이중 돌연변이체의 결합 동력학 연구를 ForteBio에서 행했다. 칩 상에 조 CM 중의 IgG를 포착하고 가용성 수용체를 통해 흘려보냄으로써 BiaCore에서 K-off 순위를 확인했다. HC2-G1S와 LC1-Y12W에 돌연변이를 가진 31-1-16은 상위 클론인 것으로 확인되었다. 31-1-27 및 31-1-43도 또한 좋은 클론이었다.

ActRIIA에 대한 친화성을 더 개선하기 위해서, PCR을 중복하여 LC 또는 HC의 상이한 CDR에서 단일-잔기 유익 돌연변이를 조합해서 사슬의 2 또는 3개 CDR에 단일 돌연변이를 가진 HC 돌연변이체와 LC 돌연변이체를 생성했다. 2 또는 3개 CDR에 단일 돌연변이를 가진 69개의 HC 다중-부위 돌연변이체(mmHC)와 CDR1 및 CDR3에 단일 돌연변이를 가진 2개의 LC 다중-부위 돌연변이체(mmLC)를 구성했다. 96-웰 일시 형질감염에서 각 mmHC는 모 LC와 쌍을 이루었고, 단일-잔기 LC 돌연변이체와 mmLC 및 두 mmLC가 모 HL와 쌍을 이루었다. 조 CM 샘플을 ForteBiO 동력학 연구에 사용했다. 23개의 돌연변이체는 벤치마크 분자 311-16과 동일하거나 그보다 나았다. BiaCore로 확인 후, finalS 탑 돌연변이체[M10(SEQ ID NOs: 25-26), M25(SEQ ID NOs: 27-28), M37(SEQ ID NOs: 29-30), M39(SEQ ID NOs: 31-32) 및 M43(SEQ ID NOs: 15-16)]를 선택했다(도 2A 및 2C에 나타낸 LC 및 HC 아미노산 서열).

실시예 2: 항체 특징

ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합 및 차단 활성을 결정하기 위해서 세포-기반 분석을 사용했다. pMARE-luc 구성물로 C2C12 근아세포 세포(ATCC No: CRL-1772)를 형질감염시켜서 미오스타틴/액티빈-반응성 리포터 셀라인을 생성했다. pMARE-luc 구성물은 TATA 박스의 상류에서 pLuc-MCS 리포터 벡터(Stratagene cat # 219087)에 미오스타틴/액티빈 반응 요소(Dennler, et al., EMBO, 17: 3091-3100, (1998))를 표시하는, CAGA 서열의 12개 반복부를 클로닝함으로써 제조된다. 이 안정한 셀라인(C2C12/PMARE-Luc)을 액티빈 타입 IIA 수용체(ActRIIA) 더하기 액티빈 타입 1 경막 리포터 키나아제(ALK4) 또는 액티빈 타입 IIB 수용체(ActRIIB) 더하기 ALK4 또는 ActRIIA과 ActRIIB 조합 더하기 ALK4로 더 형질감염시켰고, 각각 개별적으로 안정한 셀라인을 생성했다. 미오스타틴 또는 액티빈 A가 세포 수용체와 결합할 때 Smad 경로가 활성화되며, 인산화된 Smad가 반응 요소와 결합하여(Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), 루시페라제 유전자의 발현을 야기한다. 다음에, 루시페라제 활성을 상업적 루시페라제 리포터 분석 키트(cat # E4550, Promega, 위스콘신 매디슨)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 측정했다. ActRIIA+ALK4 또는 ActRIIB+ALK4 또는 ActRIIA/IIB+ALK4로 형질감염된 C2C12/pMARE-luc 세포의 이들 안정한 셀라인을 사용하여 다음의 과정에 따라서 활성을 측정했다. 리포터 세포를 96-웰 배양물에 평판했다. 상기 설명된 대로 이중 수용체 항체의 희석물을 사용한 스크리닝을 4 nM 미오스타틴 또는 액티빈으로 고정된 농도에서 수행했다. 미오스타틴 또는 액티빈을 몇몇 농도에서 이중 수용체 항체와 함께 예비 인큐베이션했다. 처리된 배양물에서 루시페라제 활성을 결정함으로써 미오스타틴 또는 액티빈 활성을 측정했다. 각 항체에 대해 IC₅₀ 값을 결정했다.

KinExa에서 측정된 huActRIIA-huFc에 대한 M43, M37 및 M25의 친화성은 < 1 pM이었으며, 이것은 모 분자 R31-1의 적어도 1000배 개선이다. huActRIIB-huFc에 대한 M43의 친화성은 < 1 pM이었으며, 이것은 약 10배 개선이다(표 3 참조). M43에 대한 HC 및 LC의 서열이 도 2A에 제공된다.

BIAcore KD	성숙화 전 (R31-1)	성숙화 후 (M43)
ActRIIB에 대한 결합	10 pM	1 pM
ActRIIA에 대한 결합	4 nM	1 pM
세포-기반 IC50	성숙화 전 (R31-1)	성숙화 후 (M43)
ActRIIB 신호화	8 nM	2 nM
ActRIIA 신호화	2 nM	nM

이것은 이중 수용체 차단 항체 M43, 및 몇 개의 다른 관련된 항체 분자를 제공했는데, 이들은 ActRIIA 뿐만 아니라 ActRIIB에 대해 강한 친화성을 나타냈다.

리포터 세포 시스템을 사용한 세포 분석은 이중 수용체 항체들이 ActRIIB와 ActRIIA 수용체 모두에 의해서 매개되는 미오스타틴 및 액티빈 리간드 신호화를 강하게 차단할 수 있었음을 나타냈다. M43이 세포 리포터 분석에 단독으로 첨가되었을 때 매우 높은 농도에서도 신호화가 유발되지 않았다.

추가의 결합 분석은 모 항체와 돌연변이체 항체(M10, M25, M37, M39, M43)의 결합 활성을 비교했다(도 7B-7F). 이 도면들에서 모 31-1(도 7A)와 5개의 돌연변이체의 huActRIIB 및 huActRIIA 결합이 비교되었다. 100 nM Ab 샘플을 고정된 마우스 항-사람 IgG2, 3, 4 Ab 표면 위에 특정 밀도까지 주사했다. hFc(G1)-hActR2A(WT), hActR2B(R64)-hFc(G1, hActR2A(E119Q)-hFc(G1)을 각기 3분간 표면 위로 흘려보내고, 이어서 10분을 넘게 버퍼를 흘려보냈다. Y-축은 수용체 결합 반응(RU)을 나타내고, X-축은 시간(초)을 나타낸다.

세포-기반 분석은 도 3에 나타낸 대로 ActRIIB 수용체의 어떤 고유한 효현 활성을 배제했다. 따라서, M43은 항체-매개 수용체 활성화에 대한 활성은 갖지 않는다.

실시예 3: 체중 및 골격 질량에 대한 M43 의 효과

생체내에서 M43은 누드 마우스에서 체중 및 골격근 질량에 대한 M43의 용량-의존적 효과를 나타냈다(도 4A-4C). 3 mg, 10 mg 및 30 mg/kg에서 체중, 제지방 체중 변화 및 비복근에 대한 효과를 도면에 나타낸다. 모든 용량에서 차이가 유의했다.

인히빈-α 녹아웃 마우스에서 직접 생체내 비교 연구는 또한 M43이 ActRIIB-Fc와 유사한 강한 근육 성장 효능을 가졌음을 보였다(도 5A-5D). 체중, 체조성 및 근육 질량에 대한 효과가 확인되었다.

누드 마우스에서 M43 활성과 미오스타틴 펩티바디 및 액티빈 수용체 폴리펩티드를 비교하는 추가 연구를 행했다. 체중 변화에 대한 결과를 도 5A-5B에 나타낸다. 또한, 도 6A-B에서는 체중 및 제지방 체중 변화의 항목으로 대조군에 상대적으로 M43이 미오스타틴 펩티바디 및 가용성 액티빈 수용체와 유리하게 필적하다는 것을 볼 수 있다.

M43(및 관련된 항체들)의 확인 및 시험관내 및 생체내 데이터는 ActRIIB와 ActRIIB 수용체를 모두 차단하는 것이 근육 성장 효능을 달성했음을 분명히 보여주었다. ActRIIB와 ActRIIA 단백질(이들의 ECD) 간의 상동성이 약하다면, 길항제 이중 수용체 단클론성 항체로서 M43의 발견은 기대되지 않았다. M43은 완전 사람 항체이며, 분명히 효능 있는 임상 활용성을 가진다. 경로 차단제로서 M43은 미오스타틴 신호화를 약화시킬 뿐만 아니라 액티빈 및 다른 리간드, 예를 들어 그 증가가 질환의 병리상태에 연루되었던 GDF-11의 신호화를 억제할 수 있다.

예를 들어, 증가된 액티빈 A 발현은 많은 암과 관련되었다. 또한, 최근 동물 종양 모델을 사용하여 액티빈 A가 특정 종양의 생체내 성장에 대한 강력한 자극제이며, 상승된 액티빈 A는 종양 미소환경에서 ㄹ 인자의 과생성을 임계적으로 매개하고, 그것의 차단은(sActRIIB 또는 항-액티빈 항체에 의한) 종양 진행을 극적으로 지연시킨다는 것이 발견되었다. 이에 더하여, 액티빈 A의 과생성은 마우스에서 심부전을 야기하고, 그것의 차단은 심장 기능부전을 개선시켰다. 따라서, M43도 역시 근육 손실의 치료 외에 여러가지 효능 있는 임상 활용성을 가질 것이다.

본 명세서 전체에서 다양한 간행물, 특허 및 특허출원이 참조되었다. 이들 문헌의 개시내용은 그 전체가 본 출원에 참고자료로 포함된다. 그러나, 이러한 문헌에 대한 참조는 이러한 문헌이 본 출원에 대한 선행기술임을 인정하는 것으로 해석되지는 않는다. 더 나아가, 문헌은 단지 참고자료로 포함될 수 있기 때문에 본 출원원이 문헌의 내용에 완전히 동의함을 반드시 나타내는 것은 아니다.

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cttggtgcca cttatgttaa ttgcggggat tgtcatttgt gcattttggg 480 tgtacaggca tcacaagatg gcctaccctc ctgtacttgt tccaactcaa gacccaggac 540 cacccccacc ttctccatta ctaggtttga aaccactgca gttattagaa gtgaaagcaa 600 ggggaagatt tggttgtgtc tggaaagccc agttgcttaa cgaatatgtg gctgtcaaaa 660 tatttccaat acaggacaaa cagtcatggc aaaatgaata cgaagtctac agtttgcctg 720 gaatgaagca tgagaacata ttacagttca ttggtgcaga aaaacgaggc accagtgttg 780 atgtggatct ttggctgatc acagcatttc atgaaaaggg ttcactatca gactttctta 840 aggctaatgt ggtctcttgg aatgaactgt gtcatattgc agaaaccatg gctagaggat 900 tggcatattt acatgaggat atacctggcc taaaagatgg ccacaaacct gccatatctc 960 acagggacat caaaagtaaa aatgtgctgt tgaaaaacaa cctgacagct tgcattgctg 1020 actttgggtt ggccttaaaa tttgaggctg gcaagtctgc aggcgatacc catggacagg 1080 ttggtacccg gaggtacatg gctccagagg tattagaggg tgctataaac ttccaaaggg 1140 atgcattttt gaggatagat atgtatgcca tgggattagt cctatgggaa ctggcttctc 1200 gctgtactgc tgcagatgga cctgtagatg aatacatgtt gccatttgag gaggaaattg 1260 gccagcatcc atctcttgaa gacatgcagg aagttgttgt gcataaaaaa aagaggcctg 1320 ttttaagaga ttattggcag aaacatgctg gaatggcaat gctctgtgaa accattgaag 1380 aatgttggga tcacgacgca gaagccaggt tatcagctgg atgtgtaggt gaaagaatta 1440 cccagatgca gagactaaca aatattatta ccacagagga cattgtaaca gtggtcacaa 1500 tggtgacaaa tgttgacttt cctcccaaag aatctagtct atga 1544 <210> 20 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtggcc cggctctggg 60 cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120 accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180 gcctcctggg ccaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240 gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300 ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gagcgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360 ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca cc 402 <210> 21 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagg aactctgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtgtta ctggtggtag cacattttac 180 acagactccg tgaagggccg gttcaccgtc tccagagaca attccaggaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtctac 300 tactatagtt tctttgacta ctggggccag ggaaccttgg tcaccgtctc tagtgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 660 tgtgtcgagt gctcaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 720 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1020 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aa 1332 <210> 22 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 cagactgtgg tgacccagga gccaagtttc tcagtgtccc ctggagggac agtcacactc 60 acttgtggct tcaactctgg ctcagtctct actagttact ggcccagctg gtaccaacag 120 accccaggcc aggctccacg cacgctcatc tacaacacaa acactcgctc ttctggggtc 180 cctgatcgct tctctggctc catccttggg aacaaagctg ccctcaccat cacgggggcc 240 caggcagatg atgaatctga ttattactgt 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atgccctcgg gcttgtatat tgggagattg ctcgaagatg caattctgga 1260 ggagtccatg aagaatatca gctgccatat tacgacttag tgccctctga cccttccatt 1320 gaggaaatgc gaaaggttgt atgtgatcag aagctgcgtc ccaacatccc caactggtgg 1380 cagagttatg aggcactgcg ggtgatgggg aagatgatgc gagagtgttg gtatgccaac 1440 ggcgcagccc gcctgacggc cctgcgcatc aagaagaccc tctcccagct cagcgtgcag 1500 gaagacgtga agatctaa 1518 <210> 24 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtggcc cggctctggg 60 cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120 accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180 gcctcctggg ccaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240 gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300 ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gagcgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360 ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccgtcgacaa aactcacaca 420 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Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 29 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Phe Asn Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Tyr Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Met Gly Ser 85 90 95 Gly Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 30 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Tyr Tyr Thr Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 31 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Phe Asn Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Tyr Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Tyr Met Gly Ser 85 90 95 Gly Ile His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 32 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Ser 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Tyr Tyr Tyr Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 33 <211> 1539 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60 cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120 accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180 gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240 gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300 ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360 ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420 tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480 cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540 ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600 tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660 ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720 cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780 ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840 atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900 ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960 gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020 ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080 acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140 ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200 aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260 cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320 aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380 tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440 attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500 accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatctaa 1539

Claims (55)

1. SEQ ID NO: 15와 97% 이상의 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 16과 97% 이상의 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함하는 분리된 항원-결합 단백질.
   
2. SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16을 포함하는 분리된 항원-결합 단백질.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하고, 결합시 근육 성장을 자극하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
   
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
   
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 마우스 항체, 사람화된 항체(humanized antibody), 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 사람화된 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
   
7. 2개의 액티빈 수용체와 결합하는 분리된 항원-결합 단백질.
   
8. 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
   
9. 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하고, 결합시 근육 성장을 자극하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
   
10. 제 7 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
11. 제 7 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 사람화된 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
12. SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 분리된 항원 결합 단백질.
    
13. 제 12 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
14. 제 12 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하고, 결합시 근육 성장을 자극하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
15. 제 12 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
16. 제 12 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 사람화된 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
17. SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 5를 포함하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
18. 제 17 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
19. 제 17 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하고, 결합시 근육 성장을 자극하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
20. 제 17 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
21. 제 17 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 사람화된 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
22. SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 분리된 항원 결합 단백질.
    
23. 제 22 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
24. 제 22 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 18과 특이적으로 결합하고, 결합시 근육 성장을 자극하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
25. 제 22 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
26. 제 22 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 사람화된 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
27. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 및 제 52 항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질을 암호화하는 분리된 핵산.
    
28. 제 27 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
    
29. 제 28 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
    
30. 제 29 항에 있어서, 상기 세포는 진핵 또는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
    
31. 제 30 항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
    
32. 적어도 SEQ ID NO: 3-5 또는 SEQ ID NO: 4-6을 포함하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
33. 핵산이 발현되어 항체를 생성하기 적합한 조건에서, 제 29 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항원-결합 단백질의 제조 방법.
    
34. 제 33 항에 있어서, 숙주 세포의 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
35. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 및 제 52 항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질 및 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
    
36. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 또는 제 52 항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 단백질을 함유하는 제약 조성물의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 미오스타틴, 액티빈 A 또는 GDF-11 활성을 감소시키거나 차단하는 방법.
    
37. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 또는 제 52 항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질 또는 항원 결합 단백질을 함유하는 제약 조성물의 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상의 순수 근육 질량을 증가시키거나 지방 질량에 대한 순수 근육 질량의 비율을 증가시키는 방법.
    
38. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 또는 제 52 항 중 어느 한 항의 항원-결합 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육 소모 질환으로 고통받는 대상의 이러한 장애를 치료하거나 예방하는 방법.
    
39. 제 38 항에 있어서, 상기 근육 소모 질환은 암 악액질, 근이영양증, 근위축성 측삭경화증, 울혈성 폐쇄성 폐질환, 만성 심부전, 화학적 악액질, HIV/AIDS로 인한 악액질, 신부전, 요독증, 류마티스 관절염, 노인성 근육감소증, 노인성 허약증, 장기 위축, 손목터널 증후군, 안드로겐 결핍, 또는 장기간의 침상 안정, 척수 손상, 뇌졸중, 골절, 화상, 노화 또는 인슐린 내성으로 인한 무활동으로 인한 근육 소모를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
40. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 및 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIB에 대해 BIAcore 분석에서 10 pM 이하의 K_D를 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
41. 제 40 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIB에 대해 1 pM 이하의 K_D를 갖는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
42. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 및 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIA에 대해 BIAcore 분석에서 4 nM 이하의 K_D를 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
43. 제 42 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIA에 대해 1 pM 이하의 K_D를 갖는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
44. ActRIIB 및 ActRIIA에 대해 BIAcore 분석에서 1 pM 이하의 K_D를 갖는 항원-결합 단백질.
    
45. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 및 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIB에 대해 세포-기반 분석에서 8 nm 이하의 IC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
46. 제 40 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIB에 대해 2 nM 이하의 IC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
47. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 및 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIA에 대해 세포-기반 분석에서 2 nM 이하의 IC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
48. 제 42 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 ActRIIA에 대해 1 nM 이하의 IC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
49. 세포-기반 분석에서 ActRIIB에 대해 2 nM 이하의 IC₅₀ 및 ActRIIA에 대해 1 nM 이하의 IC₅₀을 갖는 항원-결합 단백질.
    
50. 제 1 항, 제 2 항, 제 7 항, 제 12 항, 제 17 항, 제 22 항 및 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 길항 이중-수용체 항체인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
51. 제 50 항에 있어서, 상기 이중-수용체 항체가 사람 항체인 것을 특징으로 하는 길항 이중-수용체 항체.
    
52. 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 17과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원-결합 단백질.
    
53. 제 52 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 17과 특이적으로 결합하고, 결합시 근육 성장을 자극하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
54. 제 52 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.
    
55. 제 52 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질이 마우스 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 마우스 항체, 사람화된 항체, 키메라 항체 또는 다중특이적 항체의 단편인 것을 특징으로 하는 항원-결합 단백질.

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