CN104540961A - 双重受体拮抗性抗原结合蛋白及其用途 - Google Patents

双重受体拮抗性抗原结合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及拮抗性双重受体抗原结合蛋白，例如抗体，和使用所述双重受体抗体用于治疗病理性疾病的方法。所述双重受体抗体可以包含针对ActRII受体的抗体且可用于治疗病理性病症。所述病理性病症可以包含肌肉萎缩疾病或需要刺激肌肉生长的任何疾病。

Description

双重受体拮抗性抗原结合蛋白及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年6月11日提交的美国临时申请号61/658,237的权益，所述申请的全部公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入此处。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不适用。
序列表的引用
不适用。
发明领域
本公开涉及拮抗性双重受体抗原结合蛋白，例如抗体，和使用所述双重受体抗体的方法。所述双重受体抗体可包含针对ActRII受体的抗体且可用于刺激肌肉生长。
背景技术
转化生长因子β(TGF-β)蛋白家族包括转化生长因子β(TGF-β)、激活素(activin)、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和生长/分化因子(GDF)。这些家族成员参与调节广泛的生物学过程(包括细胞增殖、分化和其他功能)。
生长/分化因子8(GDF-8)，也称为肌肉生长抑制素(myostatin)，是大部分在发育和成人骨骼肌组织的细胞中表达的TGF-β家族成员。肌肉生长抑制素表现为在负性控制骨骼肌生长中发挥重要作用(McPherron等人,Nature(London),387:83-90,(1997)；Zimmers等人,Science,296:1486-1488,(2002))。已经显示拮抗肌肉生长抑制素增加动物中的瘦肌肉质量。
TGF-β蛋白家族的另一成员是一种相关的生长/分化因子，即生长/分化因子11(GDF-11)。GDF-11与肌肉生长抑制素的氨基酸序列具有约90％的序列一致性。GDF-11在正在发育的动物的轴向模式形成(axialpatterning)中具有作用(Oh等人,Genes Dev.,11:1812-26,(1997))，并且也表现为在骨骼肌发育和生长中发挥作用。
激活素A、B和AB分别是两条多肽链βA和βB的同二聚体和异二聚体(Vale等人,Nature,321:776-779,(1986)；Ling等人,Nature,321:779-782,(1986))。激活素最初被发现为参与卵泡刺激激素合成的调节的性腺肽，并且现在据信参与多种生物学活性的调节。激活素A是激活素的主要形式。
激活素、肌肉生长抑制素、GDF-11和TGF-β超家族的其他成员结合激活素IIA型(ActRIIA)和激活素IIB型(ActRIIB)受体(两者都是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶)并通过激活素IIA型(ActRIIA)和激活素IIB型(ActRIIB)受体的组合传导信号(Harrison等人,J.Biol.Chem.,279:28036-28044,(2004))。交联研究已经确定，肌肉生长抑制素能够在体外结合激活素II型受体ActRIIA和ActRIIB(Lee等人,PNAS USA,98:9306-11,(2001))。还存在GDF-11结合ActRIIA和ActRIIB两者的证据(Oh等人,Genes Dev.,16:2749-54,(2002))。
可以将ActRIIB多肽制备为ActRIIB-Fc的可溶性变体。可溶性ActRIIB-Fc通过隔绝多种配体例如肌肉生长抑制素、激活素和GDF11有效地刺激肌肉生长(Lee SJ,等,Proc Natl Acad Sci U S A.,102(50):18117-22,(2005Dec 13)(2005年12月5日电子出版))。这些配体，包括肌肉生长抑制素，结合两种高亲和力受体ActRIIB和ActRIIA。这两种受体由两种不同的基因编码，所述基因编码在氨基酸水平具有约65％序列同源性的两种不同的跨膜受体蛋白。已经显示配体在细胞膜处与这两种受体中任一种的结合引起Smads 2/3的磷酸化，并且作为结果，激活细胞中的下游转录变化(Lee SJ,等人,Proc Natl Acad Sci U S A.,102(50):18117-22,(2005年12月13日)(2005年12月5日电子出版))。骨骼肌细胞表达这两种受体。例如通过使用拮抗性双重受体抗体来干扰激活素受体可以通过阻断激活素信号传导途径产生生理效应。
本发明提供了阻断至少激活素活性、从而能够刺激骨骼肌生长的生物活性治疗剂。
发明概述
本发明涉及结合ActRII受体的拮抗性双重激活素受体抗原结合蛋白及其片段。在多个实施方案中，抗原结合蛋白是抗体。所述抗体可以结合ActRIIA和ActRIIB。提供了本文所述的抗原结合蛋白的用途，例如，刺激骨骼肌生长。
在多个实施方案中，提供了结合两种激活素受体的分离的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以同时结合两种激活素受体。分离的抗原结合蛋白特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18。或者，分离的抗原结合蛋白特异性结合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:17。在各个方面，当抗原结合蛋白结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18或结合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:17时，它刺激肌肉生长。在其他方面，抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。其可以是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
在多个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的分离的抗原结合蛋白。在各个方面，分离的抗原结合蛋白可以与SEQ ID NO:15和16具有97％的一致性。分离的抗原结合蛋白可以结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18。在各个方面，当抗原结合蛋白结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18时，其刺激肌肉生长。在其他方面，抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。所述抗体可以是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
在多个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的分离的抗原结合蛋白。分离的抗原结合蛋白可以特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18。当抗原结合蛋白结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18两者时，其可以刺激肌肉生长。在其他方面，抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。所述抗体可以是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
在多个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的分离的抗原结合蛋白。分离的抗原结合蛋白可以结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18。在各个方面，当抗原结合蛋白结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18时，其刺激肌肉生长。在其他方面，抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。所述抗体可以是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或小鼠抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
在多个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的分离的抗原结合蛋白。分离的抗原结合蛋白可以结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18。在各个方面，当抗原结合蛋白结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18两者时，其刺激肌肉生长。在其他方面，抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。所述抗体可以是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
在多个实施方案中，提供了编码任何抗原结合蛋白的分离的核酸。还提供了包含所述核酸的表达载体和宿主细胞。所述宿主细胞可以是真核或原核细胞。所述真核细胞可以是哺乳动物细胞。
在多个实施方案中，提供了包含至少SEQ ID NO:3-5或SEQ ID NO:4-6的分离的抗原结合蛋白。在各个方面，提供了产生抗原结合蛋白的方法，其包括在使得核酸表达以产生抗体的合适条件下培养宿主细胞。所述抗体可以从宿主细胞的培养物中回收。
在多个实施方案中，提供了包含抗原结合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
在其他实施方案中，提供了降低或阻断肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11活性的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的抗原结合蛋白或包含所述抗原结合蛋白的药物组合物。
仍然在其他实施方案中，提供了增加需要此类治疗的受试者中的瘦肌肉质量或增加需要此类治疗的受试者中的瘦肌肉质量与脂肪质量的比率的方法，其包括施用有效量的抗原结合蛋白或包含所述抗原结合蛋白的药物组合物。
在多个实施方案中，提供了治疗或预防患有肌肉萎缩疾病的受试者中的此类病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含抗原结合蛋白的治疗组合物。所述肌肉萎缩疾病可以包含癌症恶病质、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺病、慢性心脏衰竭、化学恶病质、HIV/AIDS导致的恶病质、肾衰竭、尿毒症、类风湿关节炎、年龄相关的肌肉减少症、年龄相关的虚弱、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺、或由于长期卧床不活动、脊髓损伤、中风、骨折、烧伤、老化或胰岛素抵抗导致的肌肉萎缩。
在多个实施方案中，提供了分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白在BIAcore测定中具有10pM或更小的针对ActRIIB的KD。在其他方面，抗原结合蛋白可以具有1pM或更小的针对ActRIIB的KD。仍然在其他方面，分离的抗原结合蛋白在BIAcore测定中具有4nM或更小的针对ActRIIA的KD。抗原结合蛋白还可以具有1pM或更小的针对ActRIIA的KD。
在其他方面，抗原结合蛋白在BIAcore测定中可以具有1pM或更小的针对ActRIIB和ActRIIA两者的KD。
在多个实施方案中，提供了分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白在基于细胞的测定中具有8nm或更小的针对ActRIIB的IC50。在其他方面，抗原结合蛋白可以具有2nM或更小的针对ActRIIB的IC50。仍然在其他方面，分离的抗原结合蛋白在基于细胞的测定中具有2nM或更小的针对ActRIIA的IC50。抗原结合蛋白还可以具有1nM或更小的针对ActRIIA的IC50。抗原结合蛋白在基于细胞的测定中具有2nM或更小的针对ActRIIB的IC50和1nM或更小的针对ActRIIA的IC50。
在多个实施方案中，抗原结合蛋白是拮抗性双重受体抗体。双重受体抗体可以是人抗体。
在多个实施方案中，提供了降低或阻断肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11活性的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用双重受体抗原结合蛋白或多肽、或包含这些的药物组合物。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。
在另一个方面，提供了增加需要此类治疗的受试者中的瘦肌肉质量或增加需要此类治疗的受试者中的瘦肌肉质量与脂肪质量的比率的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含双重受体抗原结合蛋白或多肽的组合物或药物组合物。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。
在另一个方面，提供了治疗或预防患有肌肉萎缩疾病的受试者中的此类病症的方法，其包括向所述受试者施用包含双重受体抗原结合蛋白或多肽的治疗组合物。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。肌肉萎缩疾病包括，但不限于，以下病症：癌症恶病质、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺病、慢性心脏衰竭、化学恶病质、HIV/AIDS导致的恶病质、肾衰竭、尿毒症、类风湿关节炎、年龄相关的肌肉减少症、年龄相关的虚弱、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺和由于长期卧床不活动、脊髓损伤、中风、骨折、烧伤、老化、胰岛素抵抗和其他病症导致的肌肉萎缩。肌肉萎缩还可以由于太空飞行的失重而导致。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。
在另一个方面，提供了治疗需要此类治疗的受试者中激活素过表达的病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含双重激活素受体抗原结合蛋白或多肽的治疗组合物。在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在另一个方面，本发明提供了治疗代谢病症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用包含抗原结合蛋白或多肽的治疗组合物，其中代谢病症选自骨损失(bone loss)、糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量受损、高血糖症、和代谢综合征。
附图说明
图1.图1显示抗体M43的HC和LC的CDR氨基酸序列(SEQ IDNO:3-8)和R31-1的HC和LC的CDR氨基酸序列(SEQ ID NO:9-14)。
图2A-2D.图2A显示M43HC(SEQ ID NO:15)和LC(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。粗体字母代表CDR区。下划线字母代表与R31-1的氨基酸差异。图2B显示M43HC的核酸序列(SEQ ID NO:21)和M43LC的核酸序列(SEQ ID NO:22)。图2C提供本申请的另外抗体的序列。粗体字母代表CDR区。下划线字母代表与R31-1的氨基酸差异。图2D提供ActRIIB的氨基酸和核酸序列(SEQ ID NO:2和20)和ActRIIB-huFc的氨基酸和核酸序列(SEQ ID NO:1和24)。
图3.图3显示基于细胞的测定中M43激动活性的缺乏。
图4A-4C.图4A-4C显示M43对体重(图4A)、瘦体重(lean mass)(图4B)和骨骼肌质量(图4C)的剂量依赖性的效应。
图5A-5D.图5A-5D显示M43对体重、机体组成和肌肉质量的影响。8周龄雄性抑制素-αKO小鼠(n＝7只/组)分别用M43或sActRIIB的单次注射(30mg/kg,SC)处理2周。
图6A-6B.图6A-B显示M43对体重和瘦体重的影响。8周龄，雄性CD1裸鼠；剂量：10mg/kg/周，S.C.n＝8只/组。
图7A-7F.图7A-7F显示亲本抗体和5种突变抗体的huActRIIB和huActRIIA结合比较。
发明详述
本文公开了结合ActRII受体的双重受体拮抗性抗原结合蛋白(诸如抗体及其功能结合片段)。在一些实施方案中，ActRII受体是ActRIIA和ActRIIB受体。该抗原结合蛋白结合激活素受体并阻止激活素受体以各种方式发挥功能。例如，双重受体结合蛋白可结合激活素受体，阻止激活素与受体结合和产生生理效应，例如刺激骨骼肌生长。
前述概述并非意在限定本发明的每一个方面或实施方案，并且额外的方面可以在其他部分进行描述。整个文献意在作为统一的公开而关联，并且应当理解的是，可以预想本文所述特征的所有组合，即使特征的组合在该文献的相同句子或段落或部分中没有一起存在。
除了前述以外，作为额外方面，其范围以任何方式比本文具体段落所定义的变型更窄的所有实施方案可以包括在本公开中。例如，某些方面被描述为属，并且应当理解的是，属的每个成员可以单独地是一实施方案。此外，被描述为属或选择属的成员的方面应该被理解为包括属的两个或更多个成员的组合。还应当理解的是，尽管说明书中的各个实施方案使用“包含”的语言呈现，但在各种情况下，相关实施方案也可以使用“由......组成”或“基本上由.…组成”的语言来描述。
应当理解的是，本文的描述仅是示例性和说明性的，并且不限制要求保护的发明。在本申请中，除非另有明确说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。而且，术语“包括(including)”以及其他形式，诸如“包括(include)”和“包括的(included)”的使用不是限制性的。而且，除非另有明确说明，否则术语诸如“元件”或“组分”涵盖包含一个单元的元件和组分以及包含多于一个亚单元的元件和组分。而且，术语“部分”的使用可以包括组成部分的一部分或整个组成部分。
还应当理解的是，当描述值的范围时，所描述特征可以是范围内发现的单个值。例如，“约pH 4至约pH 6的pH”可以是，但不限于，pH 4、4.2、4.6、5.1、5.5等，和此类值之间的任何值。此外，“约pH4至约pH6的pH”不应当被解释为表示所讨论的pH从pH 4变化2个pH单位至pH 6，而应当被解释为溶液的pH值可以选自两个pH范围内。
在一些实施方案中，当使用术语“约”时，其表示记载的数字加或减该所记载数字的5％、10％、15％或更多。意指的实际变化可从上下文确定。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制描述的主题。本申请中引用的所有文献或文献部分包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，出于所有目的通过引用以其整体明确并入本文。如根据本公开使用的，除非另有说明，否则以下术语应当被理解为具有以下含义：
如本文所使用的术语“TGF-β家族成员”或“TGF-β蛋白”是指转化生长因子家族的结构相关的生长因子，包括激活素及生长和分化因子(GDF)蛋白(Kingsley等人,Genes Dev.,8:133-146,(1994)；McPherron等人.Growth factors and cytokines in health and disease,Vol.1B,D.LeRoith和C.Bondy.ed.,JAI Press Inc.,Greenwich,Conn,USA,pp 357-393)。
GDF-8，也被称为肌肉生长抑制素，是骨骼肌组织的负调节剂(McPherron等人,PNAS USA,94:12457-12461,(1997))。肌肉生长抑制素被合成为约375个氨基酸长度的非活性蛋白复合物，对于人具有GenBank登录号：AAB86694。所述前体蛋白通过在四价加工位点(tetrabasic processing site)的蛋白水解切割而活化以产生N-末端非活性前结构域和约109个氨基酸的C-末端蛋白，其二聚化以形成约25kDa的同二聚体。该同二聚体是成熟的生物活性的蛋白(Zimmers等人,Science,296:1486(2002))。
如本文所使用的GDF-11是指具有Swissprot登录号O95390的BMP(骨形态发生蛋白)以及该蛋白的变体和物种同源物。GDF-11与肌肉生长抑制素在氨基酸水平上具有约90％的一致性。GDF-11参与中轴骨骼的前部/后部模式形成的调节(McPherron等人,Nature Genet.,22(93):260-264,(1999)；Gamer等人,Dev.Biol.,208(1):222-232,(1999))，但出生后功能是未知的。
如本文所使用的术语“ActRIIA和ActRIIB多肽的衍生物”是指至少一个额外化学部分或至少一个额外多肽的结合以形成共价或聚集缀合物，诸如糖基、脂质、乙酰基、或C-末端或N-末端融合多肽，与PEG分子缀合，和下文更充分描述的其他修饰。变体ActRIIB受体多肽(vActRIIB)还可以包括额外的修饰和衍生物，包括由于在各种不同细胞类型诸如哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母和其他重组宿主细胞中表达而由加工产生的对C和N末端的修饰。进一步包括的是包含失活的N-糖基化位点、失活的蛋白酶加工位点或保守氨基酸取代的vActRIIB多肽片段和多肽。
如本文所使用，抗体或抗原结合片段可以是激动剂或拮抗剂。
“激动剂”是指结合多肽(诸如受体)或多核苷酸并刺激、增加、激活、促进、增强活化、敏化或上调该多肽或多核苷酸的活性或表达的试剂。
“拮抗剂”是指抑制多肽或多核苷酸的表达或者结合、部分或完全阻断刺激、降低、阻止、延迟活化、灭活、去敏化或下调该多肽或多核苷酸的活性的试剂。
“抗原结合蛋白”(“ABP”)是指结合指定靶抗原的任何蛋白。在本说明书中，指定靶抗原可以是激活素受体或其片段或区域，例如，ActRIIA、ActRIIB、ActRIIA-huFc或ActRIIB-huFc。“抗原结合蛋白”包括但不限于抗体及其结合部分，诸如免疫功能性片段。肽体是抗原结合蛋白的另一实例。
“双重受体抗原结合蛋白”是指可以结合两种受体的蛋白。所述结合可以是在相同的时间或同时，或者可选地可以是任一受体，但不是在同时。“双重受体抗原结合蛋白”可以是结合两种受体的“双重受体拮抗性抗体”。受体可以是肌肉生长抑制素/激活素受体，或受体可以是ActRIIA和ActRIIB或ActRIIA-huFc和ActRIIB-huFc。双重受体抗体可以阻断ActRIIB和ActRIIA两者的平行信号传导。阻断信号传导可以具有生理反应，例如刺激骨骼肌或骨生长。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或者任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰诸如溴代尿苷和肌苷衍生物，核糖修饰诸如2’,3’-二脱氧核糖，和核苷酸间键修饰诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺硫酸酯(phosphoraniladate)和氨基磷酸酯。
术语“寡核苷酸”表示包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为约10至约60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸的长度为约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20至约40个核苷酸。寡核苷酸可为例如用于构建突变基因的单链或双链寡核苷酸。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射标记、荧光标记、半抗原或抗原性标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
“分离的核酸分子”表示基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA，或其一些组合，其不与所述分离的多核苷酸自然存在于其中的多核苷酸的全部或一部分结合，或与其自然界中不与之连接的多核苷酸连接。为了本公开的目的，应理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不涵盖完整染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除了指定序列外还可包括多达十个或甚至多达二十个其他蛋白或其部分的编码序列，或可包括控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调控序列，和/或可包括载体序列。
除非另有规定，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左手端为5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的5'至3'添加的方向称为转录方向；DNA链上与RNA转录物具有相同序列的在RNA转录物5'端的5'侧的序列区域称为“上游序列”；DNA链上与RNA转录物具有相同序列的在RNA转录物3'端的3'侧的序列区域称为“下游序列”。
分离的核酸可以编码本文各个实施方案中公开的抗原结合蛋白，例如双重受体抗原结合蛋白或抗激活素双重受体抗体。当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中时，该核酸被称为是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则其DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”表示所连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下是连续的且在阅读框中。然而，增强子不一定是连续的。通过在方便的限制位点结合而完成连接。如果这种位点不存在，则合成的寡核苷酸接合体或接头根据常规实践来使用。
术语“氨基酸”是指天然和/或非天然存在的氨基酸，并且包括其在本领域的通常含义。
术语“多肽”或“蛋白质”表示具有天然蛋白质的氨基酸序列的大分子，即，由天然存在且非重组细胞产生的蛋白质；或者蛋白质可以由基因工程或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或者具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。该术语还包括其中一个或多个氨基酸是相应的天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物的氨基酸聚合物。术语“多肽”和“蛋白质”尤其明确涵盖激活素双重受体抗原结合蛋白、抗体或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。这种片段还可以包含与天然蛋白质相比修饰的氨基酸。在各个实施方案中，片段可以是大约5至大约500个氨基酸长。例如，片段可以是至少约5、约6、约8、约10、约14、约20、约50、约70、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400或约450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能性片段，包括结合结构域。在双重激活素受体-结合抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的部分或者仅包含一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR等的其可变区。
术语“分离的蛋白质”表示所述蛋白质(1)不含至少一些通常与其一起存在的其他蛋白，(2)基本上不含来自相同来源、例如来自相同物种的其他蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)与至少约50％的其天然结合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或者其他物质相分离，(5)可操作结合(通过共价或非共价相互作用)与其非天然结合的多肽，或(6)不是天然存在的。通常，“分离的蛋白质”构成给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％、或至少约50％、至少约75％、至少约90％或更多。基因组DNA、cDNA、mRNA或合成来源的其他RNA或者其任意组合可以编码这种分离的蛋白质。在各种实施方案中，分离的蛋白质基本上不含将干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的其天然环境中存在的蛋白质或多肽或其他污染物。
多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包括其中相对于另一多肽序列，氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。
如本文使用的，二十个常规(例如，天然存在的)氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub & D.R.Gren，编辑，Sinauer Assoc.，Sunderland，Mass.(1991))，其出于任何目的通过引用并入本文。二十个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本文所述各个实施方案的多肽的适合组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。
保守氨基酸取代可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过生物系统合成来并入。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或反转形式。
天然存在的残基可以根据共同的侧链性质来分类：
疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
酸性：Asp、Glu；
碱性：His、Lys、Arg；
影响链定向的残基：Gly、Pro；和
芳族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代可以包括这些类别之一的成员交换为另一类别的成员。这种取代的残基可以被引入例如人抗体的与非人抗体同源的区域中，或者被引入该分子的非同源区域中。
根据某些实施方案，在对抗原结合蛋白(诸如抗体)进行改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。已经基于其疏水性和电荷特性赋予每个氨基酸亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
氨基酸亲水指数在赋予蛋白交互式生物功能中的重要性是本领域已知的。Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸，并且还保持相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在某些实施方案中，包括其亲水指数在±2内的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括在±1内的那些，并且在某些实施方案中，包括在±0.5内的那些。
本领域还理解，可以基于亲水性有效进行相似氨基酸的取代，特别是当由此产生的生物功能性蛋白或肽意欲用于免疫实施方案时。在某些实施方案中，如通过其相邻氨基酸的亲水性控制的，蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性(即与蛋白的生物性质)相关。
已经给这些氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，包括其亲水性值在±2内的氨基酸取代，在某些实施方案中，包括在±1内的那些，并且在某些实施方案中，包括在±0.5内的那些。还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域也称为“表位核心区”。
示例性氨基酸取代示于表1中。
表1:氨基酸取代
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala Val、Leu、Ile Val
Arg Lys、Gln、Asn Lys
Asn Gln Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser、Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro、Ala Ala
His Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸 Leu
Leu 正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys Arg、1,4-二氨基-丁酸、Gln、Asn Arg
Met Leu、Phe、Ile Leu
Phe Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr、Ala、Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr、Phe Tyr
Tyr Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val Ile、Met、Leu、Phe、Ala、正亮氨酸 Leu
术语“衍生物”是指包括不同于氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包括共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可以具有大于非化学修饰的抗原结合蛋白的循环半衰期。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可以具有针对期望细胞、组织和/或器官的提高的靶向能力。在一些实施方案中，将衍生的抗原结合蛋白共价修饰为包括一个或多个水溶性聚合物连接，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。参见例如，美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192和4,179,337。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一个或多个聚合物，包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇以及此类聚合物的混合物。
在某些实施方案中，衍生物用聚乙二醇(PEG)亚单元共价修饰。在某些实施方案中，一个或多个水溶性聚合物在衍生物的一个或多个特定位置(例如氨基末端)键合。在某些实施方案中，一个或多个水溶性聚合物与衍生物的一个或多个侧链随机连接。在某些实施方案中，PEG用于提高抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，PEG用于提高人源化抗体的治疗能力。某些此类方法讨论于例如美国专利号6,133,426，其出于任何目的通过引用并入本文。
肽类似物常在制药工业中用作性质类似于模板肽的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“拟肽”。Fauchere,J.,Adv.DrugRes.,15:29,(1986)；Veber & Freidinger,TINS,p.392,(1985)；和Evans等人,J.Med.Chem.,30:1229,(1987)，其出于任何目的通过引用并入本文。这种化合物通常借助计算机分子建模来开发。结构上类似于治疗有用肽的肽模拟物可用于产生相似的治疗或预防效果。通常，拟肽在结构上类似于范式多肽(即，具有生化性质或药理活性的多肽)，诸如人抗体，但是具有任选通过本领域公知的方法被选自以下的至少一个连接替代的一个或多个肽连接：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH-(顺式&反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸的系统取代(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于某些实施方案以产生更稳定的肽。此外，可以通过本领域已知的方法产生包含共有序列或基本上相同的共有序列变化的约束肽(constrained peptide)(Rizo & Gierasch，Ann.Rev.Biochem.，61：387(1992)，出于任何目的通过引用并入本文)；例如，通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基。
整个说明书中结合生物材料诸如多肽、核酸、宿主细胞等使用的术语“天然存在的”是指天然存在的材料或天然存在的材料形式。
在两个或多个核酸或多肽序列的情况中，术语“相同的”或百分比“一致性”是指相同的或者具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当根据对比窗或指定区域中最大对应来对比和比对时，在指定区域内约60％一致性，约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高一致性)的两个或更多个序列或子序列，如使用具有下述缺省参数的BLAST或BLAST 2.0序列比对算法或者通过人工比对以及目测检查测量的(参见例如，NCBI网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或类似网站)。这类序列则据说是“基本上一致的”。该定义还指或者可应用于测试序列的评论。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些。如本文所描述，算法可考虑空位等。在各个实施方案中，在长度为约25个氨基酸、约50个氨基酸或核苷酸的区域内或者在长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域内存在一致性。
为了序列对比，通常，一个序列用作参考序列，测试序列与之对比。当使用序列对比算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或者可以指定可选参数。然后序列对比算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分序列一致性。
“对比窗”包括对如所需的连续位置数目的任何一个的区段的指称。在一些实施方案中，如果需要，“对比窗”可以选自：约50至约200、或约100至约150、或大于150，其中序列可以在两个序列最佳比对之后与相同数目连续位置的参考序列对比。用于对比序列的比对方法是本领域公知的。可以对比序列的最佳比对，例如通过Smith &Waterman，Adv.Appl.Math.2:482,(1981)的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,(1970)的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,(1988)的相似性方法检索，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或者通过人工比对和目测检查(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑.1995增刊))进行。
适合测定百分序列一致性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。使用具有本文描述的参数的BLAST和BLAST 2.0来测定各个实施方案的核酸和蛋白质的百分序列一致性。进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)为公众获得。该算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，其在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈评分T。T被称为相邻字评分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始相邻字命中用作起动查询的种子以发现包含它们的更长的HSP。沿着每个序列的两个方向延伸字命中，直到累计比对评分可以增加。对于核苷酸序列而言，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(失配残基的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。当存在以下情况时停止每个方向的字命中的延伸：累积比对评分从其最大达到值下降量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分达到零或以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为缺省值：字长(W)11、预期(E)10、M＝5、N＝-4和双链对比。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为缺省值：字长3和预期(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))算法(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4和双链对比。
术语“控制序列”是指可以影响与之连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。这种控制序列的性质可以取决于宿主生物体。在特定实施方案中，原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可以包括包含转录因子的一个或多个识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合伴体序列。
术语“载体”表示用于将蛋白编码信息转移入宿主细胞的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指适合宿主细胞的转化的载体，并且包含指导和/或控制(与宿主细胞结合)与之可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列。表达构建体可以包括但不限于影响或控制与之可操作地连接的编码区的转录、翻译并且如果存在内含子的话，影响该编码区的RNA剪接的序列。用于本文所述各个实施方案的表达载体可以包含与待表达的DNA序列或片段可操作地连接的至少一个表达控制序列。将所述控制序列插入载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操作子和启动子区、fd包衣蛋白的控制区、酵母的糖酵解启动子(例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子)、酵母酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、和来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子(例如早期和晚期启动子或SV40)和已知控制原核或真核细胞及其病毒的基因的表达的其他序列或其组合。
术语“宿主细胞”表示已经被核酸序列转化或者能够被核酸序列转化从而表达目标基因的细胞。该术语包括母细胞的后代，无论该后代在形态或遗传构成上是否与原始母细胞相同，只要存在目的基因。
术语“转染”表示外来或外源DNA被细胞摄取，并且当外源DNA被引入细胞膜内时细胞被“转染”。许多转染技术是本领域公知的并且在本文中公开。参见例如，Graham等人，1973，Virology 52：456；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同上；Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等人，1981，Gene 13：197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入适当的宿主细胞中。转染可以是瞬时的。
术语“转化”是指细胞遗传特性的改变，并且细胞在它被修饰为包含新DNA或RNA时被转化。例如，细胞在它从其天然状态通过经由转染、转导或其他技术而引入新的遗传物质而遗传修饰时被转化。转染或转导之后，转化DNA可以通过物理整合入细胞的染色体中而与细胞DNA重组，或者可以作为游离体元件短暂保持而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。当转化DNA随着细胞分裂而被复制时，认为细胞已经被“稳定转化”。
如本文所使用的术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫功能性片段”(或简单说“片段”)是一类抗原结合蛋白，其包含缺少全长链中存在的至少一些氨基酸、但依然能够特异性结合抗原的抗体的部分(不论该部分是获得还是合成的)。
“特异性结合”应当被理解为表示抗原结合蛋白结合的主要抗原是抗原结合蛋白针对的激活素受体，例如ActRIIA(SEQ ID NO:1)和ActRIIB(SEQ ID NO:2)。然而，这不是必然排除抗原结合蛋白与除激活素受体以外的蛋白的结合。在各个实施方案中，与其他蛋白的结合占到结合的总蛋白的小于约5％、小于约10％、小于约15％、小于约20％或小于约25％。
抗原结合蛋白的片段是生物活性的，因为它们结合靶抗原，并且能够与其他抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定表位或抗原。在一些实施方案中，片段是中和片段。在一些实施方案中，片段可以阻断或降低激活素和其受体之间相互作用的可能性。一方面，这种片段将保持全长轻链或重链中存在的至少一个CDR，并且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促或化学裂解来产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、双抗体(通过短肽接头连接的在轻链可变结构域的同一多肽上的重链可变结构域，所述短肽接头太短以至于不允许相同链上的两个结构域之间的配对)、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可以源自任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。进一步预期，本文公开的抗原结合蛋白的功能性部分，例如一个或多个CDR，可以与第二蛋白或与小分子共价结合以产生针对机体中特定靶标的治疗剂，所述治疗剂具有双功能治疗性质或者具有延长的血清半衰期。如本领域技术人员所理解的，抗原结合蛋白可以包括非蛋白质组分。
本文公开的某些抗原结合蛋白是抗体或者来源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(在本文有时称为“抗体缀合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括avimer(紧密结合肽)或者由avimer(紧密结合肽)组成。
“Fc”区包括包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用结合在一起。
“Fab片段”包含一个轻链及一个重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab’片段”包括一个轻链，和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一个重链的部分，使得可以在两个Fab’片段的两个重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包括两个轻链及含有CH1和CH2结构域之间恒定区的部分的两个重链，使得在两个重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两个重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。
“单链抗体”是其中重链和轻链可变区已经被柔性接头连接以形成单个多肽链的Fv分子，其形成抗原结合区。单链抗体详细讨论于国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中，其公开内容通过引用并入。
“结构域抗体”是仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价结合以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是如本文定义的双特异性的。在某些实施方案中，“多特异性”或“多功能性”抗体以外的二价抗体通常被理解为其各结合位点相同。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向多于一个抗原或表位的抗体。
“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体分别是具有两个不同的抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体是一类多特异性抗原结合蛋白抗体，并且可以通过多种方法产生，所述方法包括但不限于杂交瘤的融合或者Fab’片段的连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，其可以位于相同或不同蛋白质靶标上。
每个个体免疫球蛋白链通常由几个“免疫球蛋白结构域”组成。这些结构域是构成抗体多肽的基本单元。在人类中，IgA和IgD同种型包含四个重链和四个轻链；IgG和IgE同种型包含两个重链和两个轻链；并且IgM同种型包含五个重链和五个轻链。重链C区通常包含可以负责效应子功能的一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。例如，IgG重链包含称为CH1、CH2和CH3的三个C区结构域。提供的抗体可以具有这些同种型和亚型的任何一个。
“抗原结合区”表示特异性结合指定抗原(例如，互补位)的蛋白质或蛋白质的一部分。例如，包含与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白对该抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗原结合蛋白的部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个互补结合区(CDR)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架”区。“CDR”是造成抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区可以帮助维持CDR的适当构象以促进抗原结合区与抗原之间的结合。结构上，框架区可以在抗体中位于CDR之间。
在某些方面，提供了结合双重激活素受体的重组抗原结合蛋白。在这种情况中，“重组抗原结合蛋白”是使用重组技术，即，通过如本文描述的重组核酸的表达制备的蛋白质。用于产生重组蛋白的方法和技术是本领域公知的。
术语“抗体”是指可以与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的任何同种型的完整免疫球蛋白或其片段，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。“抗体”是一类抗原结合蛋白。完整抗体一般包括至少两个全长重链和两个全长轻链，但是在一些情况下可以包括较少链，例如骆驼中天然存在的抗体，其可以仅包含重链。抗体可以仅仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可以源自两种不同抗体，如下文进一步描述的。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可以在杂交瘤中、通过重组DNA技术、或者通过完整抗体的酶促或化学裂解而产生。除非另有说明，否则除了包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体以外，术语“抗体”还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白(mutein)，其实例在下文描述。而且，除非明确排除，否则抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(在本文有时称为“抗体缀合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，该术语还涵盖肽体。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这种四聚体通常由两个相同的多肽链对组成，每对具有一个全长“轻”链和一个全长“重”链。每个链的氨基末端部分通常包括可变区，其通常负责抗原识别。每个链的羧基末端部分通常定义了可以负责效应子功能的恒定区。每个轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常表现出由三个超变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构。来自每对的两个链的CDR通常通过框架区对齐，其能够结合特异性表位。从N端到C端，两个轻链和重链可变区通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每个结构域的氨基酸的指定通常根据Kabat Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia & Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature，342：878-883(1989)的定义。
在某些实施方案中，抗体重链在不存在抗体轻链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体轻链在不存在抗体重链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在不存在抗体轻链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在不存在抗体重链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，单个可变区在不存在其他可变区的情况下特异性结合抗原。
在某些实施方案中，通过解析抗体结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成CDR的明确划分和包含抗体结合位点的残基的鉴定。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的许多技术的任何一种(例如X射线结晶学)来完成。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或近似CDR区。此类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、“AbM”定义和接触定义(contact definition)。
Kabat定义是编号抗体残基的标准，并且通常用于鉴定CDR区。参见例如，Johnson & Wu，Nucleic Acids Res.，28：214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但是Chothia定义考虑某些结构环区的位置。参见例如，Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901-17(1986)；Chothia等人，Nature，342：877-83(1989)。“AbM”定义使用Oxford Molecular Group制作的模拟抗体结构的计算机程序的集成套件。参见例如，Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：9268-9272(1989)；“AbMTM，A ComputerProgram for Modeling Variable Regions of Antibodies”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd。AbM定义使用知识数据库和从头开始方法(abinitio methods)的组合从一级序列模拟抗体的三级结构，例如Samudrala等人，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a CombinedHierarchical Approach”PROTEINS，Structure，Function and Genetics增刊，3：194-198(1999)描述的那些。接触定义基于可获得的复合物晶体结构的分析。参见例如，MacCallum等人，J.Mol.Biol.，5：732-45(1996)。
根据惯例，重链中的CDR区通常被称为H1、H2和H3，并且以从氨基末端到羧基末端的方向顺序编号。轻链中的CDR区通常被称为L1、L2和L3，并且以从氨基末端到羧基末端的方向顺序编号。
术语“特异性结合”表示抗原结合蛋白优先结合指定靶标或指定序列。“特异性结合”不应当被解释为排除所述靶标或特定序列以外的结合，然而，主要结合活性应当针对指定靶标或氨基酸序列。“同时结合”表示抗原结合蛋白可以同时结合两种不同的靶标，例如两种不同的激活素受体。两种不同的激活素受体可以是ActRIIA和ActRIIB。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。双重受体抗体可以同时结合两种受体，或者可以单独地特异性结合两种不同的受体。所述抗体可以结合ActRIIA同二聚体、ActRIIB同二聚体或ActRIIA/ActRIIB异二聚体。通过结合于受体，所述抗体抑制或阻止通过该/那些受体介导的生物活性。
术语“轻链”包括全长轻链及具有足以赋予结合特异性的可变区序列的其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
在各个实施方案中的抗体或其片段对激活素受体的特异性可以基于亲和力和/或亲合力来测定。由抗原与抗体的解离平衡常数(Kd)代表的亲和力测量抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合强度的量度。亲合力与表位和抗体上其抗原结合位点之间的亲和力以及抗体的效价有关，抗体的效价是指对特定表位特异性的抗原结合位点的数目。Kd值越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度越强。
术语“重链”包括全长重链及具有足以赋予结合特异性的可变区序列的其片段。全长重链包括可变区结构域VH及三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，并且CH结构域位于羧基末端，其中CH3最接近于多肽的羧基末端。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
双特异性或双功能抗体通常是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过许多方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai等人，Clin.Exp.Immunol.，79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)。
一些哺乳动物物种还可以产生仅具有单个重链的抗体。
各单个体免疫球蛋白链通常由几个“免疫球蛋白结构域”构成。这些结构域是构成抗体多肽的基本单元。重链C区通常包含可以负责效应子功能的一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。提供的抗体可以具有任何同种型和亚型。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体轻链和/或重链的一部分。在某些实施方案中，即使在相同物种的抗体之间，不同抗体的可变区的氨基酸序列有很大不同。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
术语“中和抗原结合蛋白”或“中和抗体”分别是指结合配体并阻止或减少配体与结合伴体结合的抗原结合蛋白或抗体。这可以例如通过直接封闭配体上的结合位点或者通过结合配体并改变配体通过间接方式(例如配体中的结构或能量改变)结合的能力来进行。在一些实施方案中，该术语还可以指示阻止与之结合的蛋白发挥生物功能的抗原结合蛋白。在评估抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫功能性片段)的结合和/或特异性时，当过量抗体使与配体结合的结合伴体的量减少至少约1-20％、约20-30％、约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-85％、约85-90％、约90-95％、约95-97％、约97-98％、约98-99％或更多(如在体外竞争性结合测定中所测量的)时，抗体或片段可以基本上抑制配体与其结合伴体的结合。在一些实施方案中，在双重激活素受体抗原结合蛋白的情况下，这种中和分子可以减弱激活素结合受体的能力。在一些实施方案中，中和能力通过竞争测定来表征和/或描述。在一些实施方案中，中和能力根据IC50或EC50值来描述。在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以是非中和抗原结合蛋白。
术语“靶标”是指能够被抗原结合蛋白结合的分子或分子的一部分。在某些实施方案中，靶标可以具有一个或多个表位。在某些实施方案中，靶标是抗原。在短语“抗原结合蛋白”中“抗原”的使用简单地指示包含可以被抗体结合的抗原的蛋白序列。在该情况中，它不需要蛋白质是外来的或者能够诱导免疫应答。
在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，中和抗原结合蛋白或中和抗体)的上下文中使用的术语“竞争”表示抗原结合蛋白之间的竞争，如通过其中测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能性片段)阻止或抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，激活素或其片段)的特异性结合的分析所测定的。许多类型的竞争性结合测定可用于确定一个抗原结合蛋白是否与另一个竞争，例如：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人，1983，Methods inEnzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如，Kirkland等人，1986，J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel等人，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如，Cheung等人，1990，Virology 176：546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，这种测定涉及与携带这些中任一个的固体表面或细胞结合的纯化抗原或者、未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白的使用。竞争性抑制通过测定在测试抗原结合蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测定。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包括与参考抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白和结合与参考抗原结合蛋白结合的表位足够靠近的相邻表位而发生空间位阻的抗原结合蛋白。有关测定竞争性结合的方法的其他细节提供于本文实施例中。通常，当竞争抗原结合蛋白过量存在时，它使参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制(例如，减少)至少约40-45％、约45-50％、约50-55％、约55-60％、约60-65％、约65-70％、约70-75％或约75％或更多。在一些情况下，结合被抑制至少约80-85％、约85-90％、约90-95％、约95-97％或约97％或更多。
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂、例如抗原结合蛋白(包括例如抗体或其免疫功能性片段)结合的分子或分子的一部分。在一些实施方案中，抗原能够在动物中使用以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可以具有能够与不同抗原结合蛋白、例如抗体相互作用的一个或多个表位。
术语“表位”包括能够被抗原结合蛋白(例如抗体)结合或者结合至T细胞受体的任何决定簇。表位是被靶向该抗原的抗原结合蛋白结合的抗原区域，并且当抗原是蛋白质时，包括直接接触抗原结合蛋白的特定氨基酸。大多数情况下，表位位于蛋白质上，但是在一些情况下可以位于其他种类的分子、例如核酸上。表位决定簇可以包括化学活性表面分子群例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的群集，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，特异于特定靶抗原的抗体将在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优先识别靶抗原上的表位。
如本文使用的，“基本上纯的”表示所描述的分子种类是存在的优势种类，即，以摩尔计，它比相同混合物中任何其他单个种类更丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子是其中目标种类占存在的所有大分子种类的至少约50％(以摩尔计)的组合物。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子种类的至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在其他实施方案中，目标种类被纯化至必要的同质度，其中污染种类不能通过常规检测方法在组合物中被检测到，因此组合物由单一可检测的大分子种类组成。
如本文所使用的术语“生物样品”包括但不限于来自活物或原来活物的任何量的物质。这种活物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。这种物质包括但不限于血液、血清、尿、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴结和皮肤。
如本文使用的术语“药物试剂组合物”(或试剂或药物)是指当向患者适当施用时能够产生期望治疗效果的化合物、组合物、试剂或药物。它不一定需要多于一种类型的成分。
术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”是指经测定在哺乳动物中产生治疗响应的双重激活素受体抗原结合蛋白的量。这种治疗有效量可以由本领域普通技术人员确定。确切的剂量和制剂将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro，Editor(2003)，和Pickar，Dosage Calculations(1999))。
术语“药学可接受的盐”或“药学可接受的载体”表示包括活性化合物的盐，其根据本文描述的化合物上存在的特定取代基用相对无毒性的酸或碱制备。
如本文所使用的术语“调节剂”是变化或改变分子活性或功能的化合物。例如，调节剂可以引起分子的某些活性或功能的量级与不存在调节剂时观察到的活性或功能的量级相比的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是抑制剂，其降低分子的至少一种活性或功能的量级。分子的某些示例性活性和功能包括但不限于结合亲和力、酶活性和信号转导。某些示例性抑制剂包括但不限于蛋白质、肽、抗原结合片段、抗体、肽体、碳水化合物或有机小分子。抗体可以针对双重激活素受体进行制备。肽体描述于例如美国专利号6,660,843(对应于PCT申请号WO01/83525)中。
术语“患者”和“受试者”在本文可互换使用并且包括人和非人动物受试者以及之前被诊断出疾病的那些、之前没有发现疾病的那些、接受医疗关注的那些、处于发生疾病的风险中的那些、等。
术语“治疗(treat)”和“处理(treatment)”包括治疗性治疗、预防性治疗和其中降低受试者发生疾病的风险或其他风险因素的应用。治疗不需要疾病的完全治愈，并且涵盖其中减少症状或基础风险因素的实施方案。
术语“预防”不需要100％消除事件的可能性。相反，它指示事件发生的概率在化合物或方法存在下已经被降低。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据生产商说明书或者如本领域普遍实现的或者如本文描述的进行。上述技术和程序一般可以根据本领域公知以及在本说明书通篇引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中描述的常规方法来进行。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，其出于任何目的通过引用并入本文。除非提供具体定义，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学相关使用的命名以及本文描述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的实验程序和技术是本领域公知且普遍使用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
本文提供了结合双重激活素受体的抗原结合蛋白(ABP)。在一些实施方案中，提供的抗原结合蛋白是包含如本文描述的一个或多个互补决定区(CDR)的多肽。在一些抗原结合蛋白中，CDR被嵌入“框架”区中，其定向CDR以使得实现CDR的适当抗原结合性能。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白可以干扰、阻断、减少或调节激活素和激活素受体之间的相互作用。这种抗原结合蛋白被指示为“中和的”。在一些实施方案中，中和抗原结合蛋白以阻止激活素结合激活素受体的位置和/或方式结合双重激活素受体。
在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白能够抑制激活素介导的活性(包括结合)。在一些实施方案中，结合激活素受体表位的抗原结合蛋白可以尤其抑制激活素和激活素受体之间的相互作用及由激活素/激活素受体相互作用介导的其他生理作用。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是嵌合体，诸如人/小鼠嵌合体。
如本文解释的，抗原结合蛋白可用于多种治疗应用。例如，在一些实施方案中，激活素受体抗原结合蛋白可用于治疗与激活素和/或激活素受体相关的疾病和病症，诸如涉及肌肉萎缩的疾病。肌肉萎缩疾病可以包括，但不限于，以下病症：癌症恶病质、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺病、慢性心脏衰竭、化学恶病质、HIV/AIDS导致的恶病质、肾衰竭、尿毒症、类风湿关节炎、年龄相关的肌肉减少症、年龄相关的虚弱、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺和由于长期卧床不活动、脊髓损伤、中风、骨折、烧伤、老化、胰岛素抵抗和其他病症导致的肌肉萎缩。肌肉萎缩还可以由于太空飞行的失重而导致。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。
其他用途可以包括，但不限于，提供了降低或阻断肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11活性的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用双重受体抗原结合蛋白和多肽、或含有这些的药物组合物。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。
在另一个方面，提供了增加需要此类治疗的受试者中的瘦肌肉质量或增加需要此类治疗的受试者中的瘦肌肉质量与脂肪质量的比率的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含双重受体抗原结合蛋白或多肽的组合物或药物组合物。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。
在另一个方面，提供了治疗或预防患有肌肉萎缩疾病的受试者中的此类病症的方法，其包括向所述受试者施用包含抗原结合多肽或蛋白的治疗组合物。
在另一个方面，提供了治疗需要此类治疗的受试者中激活素过表达的病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含抗原结合蛋白或多肽的治疗组合物。在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在另一个方面，本发明提供了治疗代谢病症的方法，包括向需要此类治疗的受试者施用包含抗原结合蛋白或多肽的治疗组合物，其中代谢病症选自骨损失、糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量受损、高血糖症、和代谢综合征。抗原结合蛋白可以是拮抗性双重受体抗体。所述抗体可以是针对ActRIIB和ActRIIA。
在一些实施方案中，提供的抗原结合蛋白包含一个或多个CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含(a)多肽结构和(b)被插入和/或结合至多肽结构的一个或多个CDR。多肽结构可以采取多种不同形式。例如，它可以是或者包含天然存在的抗体的框架或其片段或变体，或者可以是性质上完全合成的。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构是抗体或者源自抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合体(有时称为“抗体缀合物”)及其各自的部分或片段。在一些情况下，抗原结合蛋白是抗体的免疫片段(例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子，诸如scFv)。
在抗原结合蛋白用于治疗应用的实施方案中，抗原结合蛋白可以抑制、干扰或调节激活素的一种或多种生物活性。在一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合激活素受体和/或基本上抑制人激活素与激活素受体的结合至少约20％-40％、约40-60％、约60-80％、约80-85％或更多(例如，通过在体外竞争性结合测定中测量结合)。
本文提供的抗原结合蛋白的一些是抗体。在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有小于(更紧密地结合)约10-7、约10-8、约10-9、约10-10、约10-11、约10-12、约10-13M的Kd。在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有小于约1μM、约1000nM至约100nM、约100nM至约10nM、约10nM至约1nM、约1000pM至约500pM、约500pM至约200pM、小于约200pM、约200pM至约150pM、约200pM至约100pM、约100pM至约10pM、约10pM至约1pM的阻断激活素与激活素受体结合的IC50。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合激活素受体的特定构象状态以阻止激活素与受体相互作用。当阻止激活素与激活素受体相互作用时，这可以阻止或阻断激活素或激活素受体介导的活性和由所述相互作用导致的最终病理。
如本文描述的，针对激活素受体的抗原结合蛋白可以包含人源化抗体和/或其部分。这种策略的实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。
在某些实施方案中，人源化抗体在人体中是基本上非免疫原性的。在某些实施方案中，人源化抗体具有与人源化抗体来源的另一物种的抗体基本上相同的对靶标的亲和力。参见例如，美国专利号5,530,101；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；和美国专利号5,585,089。
在某些实施方案中，鉴定了可以被修饰而不减少抗原结合结构域的天然亲和力、同时减少其免疫原性的抗体可变结构域的氨基酸。参见例如，美国专利号5,766,886和5,869,619。
在某些实施方案中，通过本领域已知的方法对抗体的修饰通常被设计为实现对靶标增加的结合亲和力和/或减少抗体在接受者中的免疫原性。在某些实施方案中，可以修饰人源化抗体以消除糖基化位点，以增加抗体对其同源抗原的亲和力。参见例如，Co等人，Mol.Immunol.，30：1361-1367(1993)。在某些实施方案中，使用诸如“重构”、“超嵌合”或“饰面/表面重建”等技术产生人源化抗体。参见例如，Vaswami等人，Annals of Allergy，Asthma，& Immunol.81：105(1998)；Roguska等人，Prot.Engin.，9：895-904(1996)；和美国专利号6,072,035。在某些此类实施方案中，这类技术通常通过减少外源残基的数目来降低抗体免疫原性，但是没有阻止重复施用抗体之后的抗独特型反应和抗异型反应。用于降低免疫原性的某些其他方法描述在Gilliland等人，J.Immunol.，62(6)：3663-71(1999)中。
在某些情况下，人源化抗体可以导致抗原结合能力的丧失。然后人源化抗体可以“回复突变”。在此类实施方案中，可以将人源化抗体突变成包括在供体抗体中发现的氨基酸残基的一个或多个。参见例如，Saldanha等人，Mol.Immunol.36：709-19(1999)。
在某些实施方案中，可以将针对激活素受体的抗体的轻链和重链可变区的互补决定区(CDR)移植至来自相同或另一物种的框架区(FR)。在某些实施方案中，可以将针对激活素受体的抗体的轻链和重链可变区的CDR移植至共有人FR。为了产生共有人FR，在某些实施方案中，比对来自若干人重链或轻链氨基酸序列的FR以鉴定共有氨基酸序列。在某些实施方案中，针对激活素受体的抗体重链或轻链的FR被来自不同重链或轻链的FR替代。在某些实施方案中，针对激活素受体的抗体重链和轻链的FR中的稀有氨基酸没有被替代，而其余FR氨基酸被替代。稀有氨基酸是位于它们在FR中通常不存在其中的位置的特定氨基酸。在某些实施方案中，来自针对激活素受体的抗体的移植的可变区可以与不同于针对激活素受体的抗体的恒定区的恒定区一起使用。在某些实施方案中，移植的可变区是单链Fv抗体的部分。CDR移植描述于例如美国专利号6,180,370；6,054,297；5,693,762；5,859,205；5,693,761；5,565,332；5,585,089；和5,530,101，以及Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)，Winter，FEBS Letts.，430：92-94(1998)中，其出于任何目的通过引用并入本文。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白(诸如抗体)通过用抗原(例如，激活素受体或其片段)免疫来产生。抗体可以通过用全长受体、受体的可溶形式、仅催化结构域、激活素受体的成熟形式、受体的剪接变体形式或其片段免疫来产生。在某些实施方案中，抗体可以是多克隆或单克隆的，和/或可以是重组抗体。
在某些实施方案中，可以利用控制抗体的固有性质的策略，诸如抗体对其靶标的亲和力。这种策略包括但不限于使用编码抗体的多核苷酸分子的定点诱变或随机诱变来产生抗体变体。在某些实施方案中，这种产生之后是筛选表现出期望的改变(例如增加或减少的亲和力)的抗体变体。
在某些实施方案中，在诱变策略中靶向的氨基酸残基是CDR中的那些氨基酸残基。在其他实施方案中，可变结构域的框架区中的氨基酸可以被靶向。这种框架区已经显示促进某些抗体的靶标结合性质。参见例如，Hudson，Curr.Opin.Biotech.，9：395-402(1999)和其中的参考文献。
在某些实施方案中，抗体变体的较小且更有效筛选的文库可以通过将随机诱变或定点诱变局限于CDR中的超变位点来产生，所述超变位点是对应于在体细胞亲和成熟过程中易于突变的区域的位点。参见例如，Chowdhury & Pastan，Nature Biotech.，17：568-572(1999)和其中的参考文献。在某些实施方案中，某些类型的DNA元件可用于鉴定超变位点，包括但不限于某些同向和反向重复序列、某些共有序列、某些二级结构以及某些回文序列。例如，可用于鉴定超变位点的这类DNA元件包括但不限于四碱基序列，包括嘌呤(A或G)，随后是鸟嘌呤(G)，随后是嘧啶(C或T)，随后是腺苷或胸苷(A或T)(即，A/G-G-C/T-A/T)。可用于鉴定超变位点的DNA元件的另一实例是丝氨酸密码子，A-G-C/T。
为了制备用于各个实施方案的适当抗体，例如重组、单克隆或多克隆抗体，可以使用许多本领域已知的技术(参见例如，Kohler &Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人，ImmunologyToday 4：72(1983)；Cole等人，pp.77-96，于Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，CurrentProtocols in Immunology(1991)；Harlow & Lane，Antibodies，ALaboratory Manual(1988)；和Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版.1986))。编码目标抗体的重链和轻链的基因可以从细胞克隆，例如，编码单克隆抗体的基因可以从杂交瘤克隆，并且用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库还可以从杂交瘤或血浆细胞制备。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的抗体的大集合(参见例如，Kuby，Immunol.(第3版.1997))。用于产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利号4,946,778，美国专利号4,816,567)可适于产生针对用于各个实施方案的多肽的抗体。而且，转基因小鼠或其他生物体例如其他哺乳动物可以用于表达人源化或人抗体(参见例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；和Lonberg & Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。或者，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合选定抗原的抗体和异聚Fab片段(参见例如，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；Marks等人，Biotechnology 10：779-783(1992))。还可以将抗体制成双特异性的，即，能够识别两种不同的抗原(参见例如，WO 93/08829，Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659(1991)；和Suresh等人，Methods inEnzymology 121：210(1986))。抗体还可以是异缀合物(heteroconjugate)，例如，两个共价结合的抗体，或免疫毒素(参见例如，美国专利号4,676,980，WO 91/00360；WO 92/200373；和EP 03089)。
用于人源化或灵长类动物化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化可以基本上按照Winter及同事的方法通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行(参见例如，Jones等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿类抗体中相似位点的残基取代的人抗体。
在可选方法中，包括GenPharm International Inc.在内的其他方已经使用了“微型基因座(minilocus)”方法。在微型基因座方法中，通过包括来自Ig基因座的片段(单个基因)来模拟外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和通常第二恒定区(例如γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。该方法描述于Surani等人的美国专利号5,545,807和Lonberg & Kay的美国专利号5,545,806；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；5,770,429；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；和6,255,458，Krimpenfort &Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010，Berns等人的美国专利号5,612,205、5,721,367和5,789,215，以及Choi & Dunn的美国专利号5,643,763，和GenPharm International美国专利申请序号07/574,748；07/575,962；07/810,279；07/853,408；07/904,068；07/990,860；08/053,131；08/096,762；08/155,301；08/161,739；08/165,699；08/209,741中，其公开内容通过引用并入本文。还参见欧洲专利号0546073B1、国际专利申请号WO 92/03918；WO 92/22645；WO 92/22647；WO 92/22670；WO93/12227；WO 94/00569；WO 94/25585；WO 96/14436；WO 97/13852；和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175，其公开内容通过引用整体并入本文。还参见Taylor等人，1992，Chen等人，1993；Tuaillon等人，1993；Choi等人，1993，Lonberg等人，(1994)；Taylor等人，(1994)，和Tuaillon等人，(1995)，Fishwild等人，(1996)，其公开内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，将抗体偶联至“效应子”部分。效应子部分可以是任何数目的分子，包括标记部分，例如放射性标记或荧光标记，或者可以是治疗性部分。
抗体可以与其他氨基酸残基融合。此类氨基酸残基可以是肽标签，可能促进分离。还预期了用于针对特定器官或组织的抗体归巢(homing)的其他氨基酸残基。
在某些实施方案中，本文所述的任何单克隆抗体的抗体或抗原结合区可用于治疗癌症或视网膜病变。
“癌症”应被理解为可用于指示各种类型的恶性肿瘤(其可侵入周围组织，可转移至多个部位并且可能在尝试去除后复发)中的任何一种的通用术语。该术语也可指任何癌瘤或肉瘤。
“视网膜病变”应被理解为表示视网膜的非炎性疾病，这与视网膜炎区分。“糖尿病性视网膜病变”应被理解为表示在糖尿病中发生的视网膜改变，其可以特征在于点状出血(punctuate hemorrhages)、微动脉瘤和边界清楚的蜡状渗出物。
在癌症治疗中，抗原结合区可以与具有治疗活性的第二蛋白的至少功能活性部分结合。该第二蛋白可以包括但不限于酶、淋巴因子、抑癌蛋白或毒素。适当的毒素包括阿霉素、柔红霉素、紫杉酚、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、二羟基炭疽毒素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、糖皮质激素和放射性同位素。
如可以理解的，抗体可以在不同于杂交瘤细胞系的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化适当的哺乳动物宿主细胞。转化可以是通过用于将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法，包括例如将多核苷酸包裹在病毒中(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者通过本领域已知的转染程序，如美国专利号4,399,216；4,912,040；4,740,461；和4,959,455所示例的(所述专利据此通过引用并入本文)。使用的转化程序取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域公知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中以及将DNA直接显微注入细胞核中。
可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，并且包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、人上皮肾293细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有目标抗体的高表达水平来选择特别优选的细胞系。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白可以包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型的至少一个的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括人κ轻链和/或人重链。在某些实施方案中，重链为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同种型的。在某些实施方案中，抗原结合蛋白已经被克隆用于在哺乳动物细胞中表达。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括不同于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型中的任何一个的恒定区的恒定区。
在某些实施方案中，针对激活素受体的抗体的功能和/或化学特征的实质改变可以通过选择重链和轻链的氨基酸序列中对其以下的作用明显不同的取代来完成：维持(a)取代区域中分子骨架的结构，例如作为折叠(sheet)或螺旋构象，(b)目标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链大小。
例如，“保守氨基酸取代”可以包括用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得在该位置处氨基酸残基的极性或电荷很少或没有影响。而且，多肽中任何天然残基还可以用丙氨酸取代，如之前已经针对“丙氨酸扫描诱变”描述的。
期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可以由本领域技术人员在期望这种取代时确定。在某些实施方案中，氨基酸取代可用于鉴定针对激活素受体的抗体的重要残基，或者增加或减少如本文所述的针对激活素受体的抗体的亲和力。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合蛋白可以在不同于杂交瘤细胞系的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化适当的哺乳动物宿主细胞。根据某些实施方案，转化可以是通过用于将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法，包括例如将多核苷酸包裹在病毒中(或者在病毒载体中)并用该病毒(或载体)转染宿主细胞，或者通过本领域已知的转染程序，如美国专利号4,399,216；4,912,040；4,740,461；和4,959,455(该专利通过引用并入本文用于任何目的)所示例的。在某些实施方案中，使用的转化程序可以取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的，并且包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中以及将DNA直接显微注入细胞核中。
可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，并且包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和许多其他细胞系。在某些实施方案中，通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有组成型HGF结合性质的抗体来选择细胞系。用于哺乳动物宿主细胞的适当表达载体是公知的。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个多肽。许多表达载体/宿主系统中的任一种可用于表达编码包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身的多核苷酸分子。这种系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti质粒或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
在某些实施方案中，包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身在酵母中重组表达。某些此类实施方案根据制造商的说明书使用商购的表达系统、例如毕赤酵母(Pichia)表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)。在某些实施方案中，这样的系统依赖前原α序列(pre-pro-alpha sequence)来指导分泌。在某些实施方案中，插入序列的转录在甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。
在某些实施方案中，包含一个或多个抗原结合蛋白组分的分泌多肽或抗原结合蛋白本身从酵母生长培养基纯化。在某些实施方案中，用于从酵母生长培养基纯化多肽的方法与用于从细菌和哺乳动物细胞上清液纯化多肽的那些方法相同。
在某些实施方案中，将编码包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身的核酸克隆入杆状病毒表达载体，诸如pVL1393(PharMingen，San Diego，CA)。在某些实施方案中，这种载体可以根据制造商的指导(PharMingen)用于在无sF9蛋白的培养基中感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞并产生重组多肽。在某些实施方案中，使用肝素-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)从这种培养基纯化并浓缩多肽。
在某些实施方案中，包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身在昆虫系统中表达。用于多肽表达的某些昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以在草地贪夜蛾细胞或在夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因。在某些实施方案中，可以将编码多肽的核酸分子插入病毒的非必需基因中(例如多角体蛋白基因内)，并置于该基因的启动子的控制之下。在某些实施方案中，核酸分子的成功插入将使非必需基因失活。在某些实施方案中，该失活结果导致可检测的特征。例如，多角体蛋白基因的失活导致缺少外壳蛋白的病毒的产生。
在某些实施方案中，重组病毒可用于感染草地贪夜蛾细胞或夜蛾幼虫。参见例如，Smith等人，J.Virol.，46：584(1983)；Engelhard等人，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)，91：3224-7(1994)。
在某些实施方案中，在细菌细胞中制备的包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身作为不溶性包涵体在细菌中产生。通过离心收集包含这种包涵体的宿主细胞；在0.15M NaCl，10mM Tris，pH 8，1mM EDTA中洗涤；并且用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO)在室温下处理15分钟。在某些实施方案中，溶菌产物通过超声处理澄清，并且细胞碎片通过在12,000X g离心10分钟来沉淀。在某些实施方案中，将包含多肽的沉淀重悬于50mM Tris，pH 8和10mMEDTA中；经50％甘油而分层；并在6000X g离心30分钟。在某些实施方案中，可以将该沉淀重悬于不含Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。在某些实施方案中，通过将重悬的沉淀在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离来进一步纯化多肽(参见例如，Sambrook等人，同上)。在某些实施方案中，将这种凝胶浸泡在0.4M KCl中以使蛋白质可视化，其可以切下并在缺乏SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。根据某些实施方案，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白作为可溶性蛋白在细菌中产生。在某些实施方案中，使用GST Purification Module(Pharmacia)纯化这种GST融合蛋白。
在某些实施方案中，期望的是“重折叠”某些多肽，例如包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身。在某些实施方案中，使用本文讨论的某些重组系统产生这种多肽。在某些实施方案中，将多肽“重折叠”和/或氧化以形成期望的四级结构和/或产生二硫键。在某些实施方案中，这种结构和/或键与多肽的某些生物活性相关。在某些实施方案中，使用本领域已知的许多程序的任何一个完成重折叠。示例性方法包括但不限于将溶解的多肽试剂在离液剂存在下暴露于通常高于7的pΗ。示例性离液剂是胍。在某些实施方案中，重折叠/氧化溶液还包含还原剂和该还原剂的氧化形式。在某些实施方案中，还原剂及其氧化形式以产生允许二硫键改组发生的特定氧化还原电位的比例存在。在某些实施方案中，这种改组允许形成半胱氨酸桥。示例性的氧化还原电对包括但不限于半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT、和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-bME。在某些实施方案中，使用共溶剂来提高重折叠的效率。示例性共溶剂包括但不限于甘油、各种分子量的聚乙二醇以及精氨酸。
在某些实施方案中，基本上纯化包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身。某些蛋白质纯化技术是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，蛋白质纯化包括从非多肽级分进行多肽级分的粗分级分离。在某些实施方案中，使用色谱和/或电泳技术纯化多肽。示例性纯化方法包括但不限于用硫酸铵沉淀；用PEG沉淀；免疫沉淀；热变性、随后离心；色谱，包括但不限于亲和色谱(例如，蛋白-A-琼脂糖)、离子交换色谱、排阻色谱和反相色谱；凝胶过滤；羟基磷灰石色谱；等电聚焦；聚丙烯酰胺凝胶电泳；和这些及其他技术的组合。在某些实施方案中，通过快速蛋白质液相色谱或者通过高压液相色谱(HPLC)纯化多肽。在某些实施方案中，可以改变纯化步骤，或者可以忽略某些步骤，并且依然得到适合制备基本上纯化的多肽的方法。
在某些实施方案中，量化多肽制品的纯化程度。用于量化纯化程度的某些方法是本领域技术人员已知的。某些示例性方法包括但不限于测定制品的特异性结合活性和通过SDS/PAGE分析评估制品内多肽的量。用于评估多肽制品纯化的量的某些示例性方法包括计算制品的结合活性并将其与最初提取物的结合活性相比较。在某些实施方案中，这种计算的结果表示为“纯化倍数(fold purification)”。用于代表结合活性的量的单位取决于进行的特定测定。
在某些实施方案中，包含一个或多个抗原结合蛋白组分的多肽或抗原结合蛋白本身是部分纯化的。部分纯化可以通过使用更少的纯化步骤或通过利用相同的通用纯化方案的不同形式来实现。例如，在某些实施方案中，利用HPLC装置进行的阳离子交换柱色谱法通常比利用低压色谱系统的相同技术产生更大的“纯化倍数”。在某些实施方案中，得到较低纯化程度的方法在多肽的总回收率或在保持多肽的结合活性方面可能具有优势。
在某些情况下，多肽的电泳迁移有时可能随不同的SDS/PAGE条件而明显改变。参见例如Capaldi等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76：425(1977)。将理解，在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的多肽的表观分子量可以不同。
在本文描述的各个实施方案中，抗体可体内和体外用于研究或诊断方法中，这是本领域中众所周知的。所述诊断方法包括试剂盒，其包含各个实施方案中的抗体。在其他实施方案中，本文所描述的抗体可以用作治疗剂。
应当理解的是，当为了预防或治疗目的而在哺乳动物中使用时，双重受体抗体可以以组合物的形式施用，所述组合物还可以包含药学可接受的载体。适当的药学可接受载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等的一种或多种以及其组合。
药学可接受载体还可以包括少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗原结合蛋白的贮存期或效力。如本领域公知的，可以配制注射组合物以在向哺乳动物施用之后提供快速、持续或延迟的活性成分释放。
特别用于本文所述用途的抗体的药物制剂可以通过混合具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂来制备。这种制剂可以是冻干制剂或水性溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对于受体无毒性。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)防腐剂低分子量多肽；蛋白质例如血清白蛋白或明胶，或亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyllolidone)；和氨基酸、单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；和离子和非离子表面活性剂(例如，聚山梨酸酯)；形成盐的反离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂。抗体可以以0.5-200mg/ml的浓度配制。
在治疗性应用中，将组合物以“治疗有效剂量”向罹患疾病(例如，肌肉萎缩疾病)的患者施用。对于该用途有效的量将取决于疾病严重度和患者总体健康状态。组合物的单次或多次施用可以根据患者所需以及耐受的剂量和频率施用。如本文所称的“患者”或“受试者”可以包括人和其他动物，特别是哺乳动物。因此，所述方法适用于人类治疗和兽医应用。在各个实施方案中，所述患者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是灵长类动物，或者甚至是人。
药物组合物的施用途径与己知方法相符，例如，口服；通过静脉内、腹膜内、大脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内途径、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、或腹膜内注射；以及鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式，通过持续释放系统或植入装置施用。当期望时，可通过大丸注射或输注连续地施用或通过植入装置施用组合物。可替代地或额外地，可通过植入其上已吸收或包封了所需分子的膜、海绵或另一适当材料来局部施用组合物。当使用植入装置时，可将该装置植入任何合适的组织或器官中，并可通过扩散、定时释放大丸剂或连续施用来实现所需分子的递送。
在某些实施方案中，制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲剂可以用来将组合物保持在生理pH或稍低的pH，通常在约5到约8的pH范围之内。
在某些实施方案中，当预期肠胃外施用时，治疗组合物可以是在药学上可接受的媒介物中包含期望的针对激活素的双重受体抗原结合蛋白且含或不含其他治疗剂的无热原的、肠胃外可接受的水性溶液的形式。在某些实施方案中，用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中将针对激活素受体的双重受体抗原结合蛋白(含或不含至少一种其他治疗剂)配制成适当地保存的无菌、等渗溶液。在某些实施方案中，制备可以包括将期望的分子与可提供可随后通过贮库注射递送的产物的控制或持续释放的试剂一起配制，所述试剂例如可注射的微球、生物可蚀解的颗粒、多聚化合物(聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体。在某些实施方案中，也可以使用透明质酸，并且可以具有增加在循环中持续时间的作用。在某些实施方案中，可以使用可植入的药物递送装置以引入期望的分子。
双重受体抗原结合组合物的用途
本发明提供了用于体内和体外降低或中和肌肉生长抑制素、激活素或GDF-11的量或活性的方法和药物组合物。激活素双重受体抗原结合蛋白能够降低和抑制肌肉生长抑制素、激活素A和GDF-11中至少一种的生物活性。
在一个方面，本发明提供了用于通过向受试者施用有效剂量的双重激活素受体抗原结合蛋白组合物而治疗需要此类治疗的受试者中的肌肉生长抑制素相关和/或激活素A相关病症的方法和试剂。如本文所使用的术语“受试者”是指任何动物，诸如哺乳动物包括人。
本发明的组合物可用于增加受试者中的瘦肌肉质量。所述组合物也可用于提高瘦肌肉质量相对于脂肪质量的比例，并且因此减少受试者中作为体重百分比的脂肪质量。实施例3表明，本文所述的双重激活素抗体可以增加动物中的瘦肌肉质量。
双重激活素受体抗原结合蛋白组合物可以治疗的病症包括但不限于：各种形式的肌肉萎缩，以及代谢性病症诸如糖尿病和相关病症，以及骨退行性疾病诸如骨质疏松症。
肌肉萎缩病症还包括营养不良，诸如杜氏肌营养不良、进行性肌营养不良、贝克尔型肌营养不良、Dejerine-Landouzy肌营养不良、Erb氏肌营养不良和婴儿轴索肌营养不良。其他肌肉萎缩病症起因于慢性疾病或病症，诸如肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺病、癌症、AIDS、肾衰竭、器官萎缩、雄激素剥夺和类风湿性关节炎。
肌肉生长抑制素和/或激活素的过表达可能导致恶病质，严重的肌肉萎缩综合征。恶病质起因于癌症，并且还由于类风湿性关节炎、糖尿病性肾病、肾衰竭、化疗、由于烧伤的损伤、以及其他原因而产生。在另一个实例中，发现肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白的血清和肌内浓度在呈现AIDS相关的肌肉萎缩的男性中增加，且与无脂肪质量负相关(Gonzalez-Cadavid等人,PNAS USA,95:14938-14943,(1998))。也已经显示肌肉生长抑制素水平响应于烧伤而增加，从而导致肌肉的分解代谢效应(Lang等人,FASEB J.,15,1807-1809,(2001))。导致肌肉萎缩的其他状况可以起因于以下：由于残疾而无法活动，诸如限制于轮椅中，由于中风、疾病、脊髓损伤、骨折或外伤而长期卧床，和微重力环境(太空飞行)中的肌肉萎缩。例如，发现血浆肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白在长时间卧床后增加(Zachwieja等人J.Gravit.Physiol.,6(2):11,(1999)。还发现，与未暴露于微重力环境的大鼠的肌肉相比，在太空航天飞机飞行过程中暴露于微重力环境的大鼠的肌肉表达增加量的肌肉生长抑制素(Lalani等人,J.Endocrin.,167(3):417-28,(2000))。
此外，年龄相关的脂肪-肌肉比率的增加和年龄相关的肌肉萎缩看起来与肌肉生长抑制素有关。例如，平均血清肌肉生长抑制素免疫反应性蛋白在年轻(19-35岁)、中年(36-75岁)和老年(76-92岁)男性和女性群体中随着年龄增加，而平均肌肉质量和无脂肪质量在这些群体中随着年龄下降(Yarasheski等人,J.Nutr.Aging,6(5):343-8,(2002))。此外，现已发现，肌肉生长抑制素在心肌中以低水平表达，并且表达在梗塞后的心肌细胞中上调(Sharma等人,J.Cell Physiol.,180(1):1-9,(1999))。因此，降低心肌中的肌肉生长抑制素水平可改善梗塞后心肌的恢复。
肌肉生长抑制素还看起来影响代谢病症，包括2型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、高血糖症和肥胖症。例如，已显示肌肉生长抑制素的缺乏改善两种小鼠模型的肥胖和糖尿病表型(Yen等人.FASEB J.,8:479,(1994)。本公开的抗原结合蛋白适于治疗此类代谢病症。因此，施用本发明的组合物可以改善合适受试者中的糖尿病、肥胖症和高血糖病症。此外，包含所述抗原结合蛋白的组合物可以减少肥胖个体中的食物摄取。
施用本文描述的稳定化抗原结合蛋白可以改善骨强度并降低骨质疏松症和其他退行性骨疾病。已经发现，例如，肌肉生长抑制素缺陷小鼠显示小鼠肱骨的矿物质含量和密度的增加，和肌肉结合区域处骨小梁和皮质骨两者的矿物质含量的增加，以及肌肉质量的增加(Hamrick等人,Calcif.Tissue Int.,71(1):63-8,(2002))。此外，本文所述的抗原结合蛋白可用于治疗诸如例如用于治疗前列腺癌的雄激素剥夺疗法的情况下的雄激素剥夺的效应。
还提供了通过向动物施用有效剂量的抗原结合蛋白而增加食用动物中的肌肉质量的方法和组合物。由于成熟C-末端肌肉生长抑制素多肽在测试的所有物种中相似或相同，可以预期本文所述的抗原结合蛋白可有效用于增加任何农业上重要的物种(包括牛、鸡、火鸡和猪)中的瘦肌肉质量并减少脂肪。
本发明的其他方面将被本领域技术人员所理解，并且描述于本文中。尽管本发明的各个实施方案已经在本文中描述，包括以下实施例，但本领域技术人员将容易地理解，本文详述的具体实施例和研究仅仅是说明性的。应当理解，在不偏离本发明精神的情况下可以进行各种修改。
实施例
在小鼠中，用变体ActRIIB-Fc处理产生的肌肉生长是通过选择性抑制肌肉生长抑制素所实现的肌肉生长的约3倍。该强大肌肉生长功效具有治疗意义，因为它可以用来逆转患有癌症、肾衰竭、心脏衰竭、烧伤、严重感染和许多其他分解代谢疾病的患者中预先存在的肌肉损失。除了开发可溶性ActRIIB-Fc分子以外，开发了ActRIIB/ActRIIA受体阻断抗体以刺激肌肉生长。由于细胞信号传导中的冗余功能，为了实现与ActRIIB-Fc类似的肌肉生长功效，开发了能够阻断ActRIIB(SEQ IDNO:2)(图2D)和ActRIIA(SEQ ID NO:18)两者的拮抗剂抗体。
以下序列与该应用相关：
表2
SEQ ID NO. 描述*
1 ActRIIB-huFc
2 ActRIIB
3 M43 HC-CDR1
4 M43 HC-CDR2
5 M43 HC-CDR3
6 M43 LC-CDR1
7 M43 LC-CDR2
8 M43 LC-CDR3
9 R31-1 HC-CDR1
10 R31-1 HC-CDR2
11 R31-1 HC-CDR3
12 R31-1 LC-CDR1
13 R31-1 LC-CDR2
14 R31-1 LC-CDR3
15 M43 HC
16 M43 LC
17 ActRIIA-huFc
18 ActRIIA
19 ActRIIA(核酸序列)
20 ActRIIB(核酸序列)
21 M43 HC(核酸序列)
22 M43 LC(核酸序列)
23 Alk4(核酸序列)
24 ActRIIB-huFC(核酸序列)
25 M10 LC
26 M10HC
27 M25 LC
28 M25HC
29 M37 LC
30 M37 HC
31 M39 LC
32 M39 HC
*除非另有指出，所述描述是指氨基酸序列
实施例1：抗体生成和突变
通过最初使用ActRIIB-huFc(SEQ ID NO:1)(图2D)作为抗原进行抗体运动来生成双重受体抗体。
为了筛选抗体，开发了细胞报道分子测定系统，其包含用ActRIIB(SEQ ID NO:20)(加上ALK4，1型跨膜报道激酶)，或用ActRIIA(加上ALK4)，或用ActRIIB和ActRIIA(SEQ ID NO:19)两者(加上ALK 4)稳定转染的C2C12/PMARE-Luc细胞。
这导致使用ActRIIB蛋白作为抗原鉴定了几种抗ActRIIB抗体。然而，在小鼠中测试对于ActRIIB结合特异性的抗体显示比ActRIIB-Fc弱得多的体内肌肉生长功效(尽管抗体对肌肉生长确实具有一些效果)。这提示进一步测试可以有效地阻断ActRIIA和ActRIIB受体两者的信号传导的双重受体抗体。
为此，仔细检查来自ActRIIB筛选的抗体，其揭示强烈结合ActRIIB、而同时呈现微弱但明确结合ActRIIA的抗体(R31-1)。
接着使用R31-1作为亲本分子进行亲和力成熟，以改进针对ActRIIA的亲和力而不降低针对ActRIIB的亲和力。(SEQ ID NO:2)
R31-1至M43的亲和力成熟
显示从使用可溶性ActRIIB-huFc的Xenomouse免疫获得的抗ActRIIB人IgG R31-1具有针对AcRIIB-huFc的<10pM的结合亲和力和针对ActRIIAhuFc的-1nM的结合亲和力。
为了完全去除激活素受体信号传导途径，ActRIIA和ActRIIB两者的同时阻断是必要的。为了实现该目标，设计亲和力成熟和筛选策略以改进R31-1针对ActRIIA的亲和力，而不影响针对ActRIIB的亲和力。
在R31-1IgG2分子的图1中所有三个HC-CDR(SEQ ID NO:9-11)和图1中所有三个LC-CDR(SEQ ID NO:12-14)中的每个残基上进行单个氨基酸残基随机诱变(NNK密码子)(N＝A、T、G或C；K＝T或G)。
诱变引物通过使NNK侧接相对于靶向位置的24个野生型核苷酸5-引物和24个野生型核苷酸3-引物来设计。突变了HC-CDR中的31个位置和LC-CDR中的31个位置。
使用pTT5载体中包含R31-1IgG2γ链的质粒DNA和包含R31-1κ轻链的质粒DNA作为用于62个诱变反应的模板。通过测序鉴定并分离总共1178个单个突变体。在96孔瞬时转染进入2936E细胞中将一条链的单一残基突变体与亲本分子的另一条链配对(突变HC:亲本LC或亲本HC:突变LC)。在转染后第7天收获条件化培养基(CM)，并在ELISA中用于结合评价。
在BO％饱和浓度(0.5μg/ml)下用生物素-ActRIIB-huFc和在95％饱和浓度(3.33μg/ml)下用生物素-ActRIIA-huFc包被的NeutrAvidin板用于ELISA。将突变体的CM在2％BSA/2％MPBS中封闭，然后在抗原包被板上孵育。1小时RT(室温)孵育后，将板用PBST洗涤5次。1小时孵育后，结合的突变体用1:3000稀释的抗huIgG HRP检测。将板用PBST洗涤5次。添加LumiGLO化学发光底物(KPL,#54-61-01)，并在Envision上读板。去除相比于R31-1具有受损的ActRIIA和ActRIIB结合活性的突变体。
为了二次筛选以鉴定有利的单一残基突变体，使用以0.1μg/ml的生物素-ActRIIB-huFc和0.5μg/ml的生物素-ActRIIA-huFc包被的NeutrAvidin板以更高严格性进行ELISA。鉴定了相比于R31-1具有相似或改进的ActRIIB结合活性和改进的ActRIIA结合活性的十四个有利的单一残基突变体(在5个位置的11个HC突变和在3个位置的3个LC突变)。一个突变体是在LC-CDR1中(LC1-Y12W)，两个突变体是在LC-CDR3中(LC3-Y3W、LC3-W9H)，三个突变体是在HC-CDR1中(HC1-Y2S、HC1-Y2D、HC1S5A)，五个突变体是在HC-CDR2中(HC2-G1D、HC2-G1V、HC2-G1S、HC2-G1A、HC2-Y10F)，且三个突变体是在HC-CDR3中(HC3-S4W、HC3-S4Y、HC3-S4T)。
将单一残基HC突变体与单一残基LC突变体在基质中配对，用于瞬时转染到96孔板中的2936E中，以生成在LC和HC中各包含一个突变的33个双突变IgG。通过ForteBio使用蛋白A生物传感器测量粗CM样品的IgG2浓度并归一化。为了选择具有明显改进的ActRIIA结合和不变的AcRIIB结合的双突变体，在用10μg/ml至0.001μg/ml的各种浓度的生物素-VMS hFc IgG1-ACTR-2B(E2BW)和生物素-hACTR-2A(El19Q,E121Q)-hFc和调节至1μg/ml IgG2的粗CM包被的NeutrAvidin板上进行滴定ELISA。在ForteBio上进行所选择的双突变体的结合动力学研究。通过在芯片上捕获粗CM中的IgG且使可溶性受体流过而在BiaCore上进行K-off排序验证。具有突变HC2-G1S和LC1-Y12W的31-1-16被鉴定为最佳克隆。31-1-27和31-1-43也是良好克隆。
为了进一步改进针对ActRIIA的亲和力，通过重叠PCR组合LC或HC的不同CDR中的有利单一残基突变，以生成在链的2或3个CDR中具有单一突变的HC突变体和LC突变体。构建在2或3个CDR中具有单一突变的69个HC多位点突变体(mmHC)和在CDR1和CDR3中具有单一突变的2个LC多位点突变体(mmLC)。将每个mmHC与亲本LC、单一残基LC突变体和mmLC配对，且两个mmLC与亲本HC在96孔瞬时转染中配对。粗CM样品用于ForteBio动力学研究中。23个突变体等于或好于基准标记分子311-16。通过BiaCore验证后，选择最后5个最佳突变体[M10(SEQ ID NO:25-26)、M25(SEQ ID NO:27-28)、M37(SEQ ID NO:29-30)、M39(SEQ ID NO:31-32)和M43(SEQ ID NO:15-16)](图2A和2C中显示的LC和HC氨基酸序列)。
实施例2：抗体特征
一种基于细胞的测定法用来测定针对ActRIIB和ActRIIA的结合和阻断活性。通过用pMARE-luc构建体转染C2C12成肌细胞(ATCC号:CRL-1772)生成肌肉生长抑制素/激活素响应报道细胞系。通过将代表肌肉生长抑制素/激活素响应元件的CAGA序列的十二个重复序列(Dennler等人,EMBO,17:3091-3100,(1998))克隆入pLuc-MCS报道载体(Stratagene目录号219087)中TATA盒的上游来制备pMARE-luc构建体。该稳定细胞系(C2C12/PMARE-Luc)用激活素IIA型受体(ActRIIA)加上激活素1型跨膜报道激酶(ALK4)或激活素IIB型受体(ActRIIB)加上ALK4或者ActRIIA和ActRIIB组合加上ALK4进一步转染，以生成各个单个稳定细胞系。当肌肉生长抑制素或激活素A结合细胞受体时，Smad通路被激活，并且磷酸化的Smad结合响应元件(Macias-Silva等人.Cell 87:1215(1996))，导致荧光素酶基因的表达。然后根据制造商的方案使用市售荧光素酶报道分子测定试剂盒(目录号E4550,Promega,Madison,WI)来测量荧光素酶活性。这些已经用ActRIIA+ALK4或ActRIIB+AlK4或ActRIIA/IIB+ALK4转染的C2C12/pMARE-luc细胞的稳定细胞系用于根据以下程序来测量活性。将报道细胞接种到96孔培养中。用浓度固定在4nM的肌肉生长抑制素或激活素进行上述使用双重受体抗体的稀释液的筛选。将肌肉生长抑制素或激活素与几种浓度的双重受体抗体一起预孵育。通过测定在经处理的培养物中的荧光素酶活性来测量肌肉生长抑制素或激活素活性。测定每种抗体的IC50值。
KinExa中测量的M43、M37和M25针对huActRIIA-huFc的亲和力为<1pM，这是亲本分子R31-1的至少1000倍的改进。M43针对huActRIIB-huFc的亲和力为<1pM，这是约10倍的改进。(参见，表3。)M43的HC和LC的序列提供在图2A中。
表3
BIAcore KD 成熟前(R31-1) 成熟后(M43)
结合ActRIIB 10pM 1pM
结合ActRIIA 4nM 1pM
基于细胞的IC50 成熟前(R31-1) 成熟后(M43)
ActRIIB信号传导 8nM 2nM
ActRIIA信号传导 2nM nM
这得到了显示对于ActRIIA以及对于ActRIIB的强亲和力的双重受体阻断抗体M43和几个其他相关抗体分子。
使用报道细胞系统的细胞测定表明，双重受体抗体能够强烈阻断由ActRIIB和ActRIIA受体两者介导的肌肉生长抑制素和激活素配体信号传导。当将M43单独添加至细胞报道测定中时，甚至在非常高的浓度也没有引发信号传导。
其他结合测定比较了亲本抗体与突变抗体(M10、M25、M37、M39、M43)的结合活性(图7B-7F)。在所述图中，进行了亲本31-1(图7A)和5种突变体的huActRIIB和huActRIIA结合比较。将100nM Ab样品注射到固定化的小鼠抗人IgG2、3、4Ab表面至特定密度。使hFc(G1)-hActR2A(WT)、hActR2B(R64)-hFc(G1),hActR2A(E119Q)-hFc(G1)分别流过表面3min，随后使缓冲液流过超过10min。Y轴显示受体结合响应(RU)，且时间(秒)显示于X轴上。
重要地，基于细胞的测定排除了ActRIIB受体的任何内在激动剂活性，如图3显示。因此，M43没有抗体介导的受体活化的活性。
实施例3：M43对体重和骨骼质量的影响
体内M43证实了M43对裸鼠体重和骨骼肌质量的剂量依赖性效果(图4A-4C)。在3mg、10mg和30mg/kg下对体重、瘦体重变化和腓肠肌的影响显示于图中。差异在所有剂量下都显著。
抑制素α敲除小鼠中的头对头体内比较研究也显示，M43具有类似于ActRIIB-Fc的强肌肉生长功效。(图5A-5D)。观察到对体重、机体组成和肌肉质量的影响。
进行了另外的研究，其在裸鼠中比较M43活性与肌肉生长抑制素肽体和激活素受体多肽。体重变化的结果显示于图5A-5B。在图6A-B中还可以看到，在相对于对照的体重和瘦体重变化方面，M43与肌肉生长抑制素肽体和可溶性激活素受体有利地相当。
M43(和相关抗体)的鉴定和体外和体内数据清楚地显示，阻断ActRIIB和ActRIIB受体两者实现了肌肉生长功效。鉴于ActRIIB和ActRIIA蛋白(它们的ECD)之间的同源性较差，M43作为拮抗剂双重受体单克隆抗体的发现是出乎意料的。M43是完全人抗体，且具有明显潜在的临床效用。作为途径阻断剂，M43不仅衰减肌肉生长抑制素信号传导，而且可以抑制激活素和其增加涉及疾病的发病机制的其他配体(例如，GDF-11)的信号传导。
例如，增加的激活素A表达已经与许多癌症相关。此外，最近使用动物肿瘤模型发现，激活素A是某些肿瘤的体内生长的强效刺激剂，因为升高的激活素A关键地介导肿瘤微环境中血管生成因子的过度产生，并且激活素A的阻断(由sActRIIB或抗激活素抗体)急剧减缓肿瘤进展。此外，激活素A的过度产生引起小鼠中的心脏衰竭，并且激活素A的阻断逆转心脏功能障碍。因此，M43在治疗肌肉损失之外也应该具有潜在的临床效用。
贯穿整个本说明书，引用了各种出版物、专利和专利申请。这些文献的公开内容在此处以其整体通过引用并入本申请。然而，对此类文献的引用不应该被解释为承认此类文献是本申请的现有技术。此外，仅仅因为文献可以通过引用并入，这不一定表明申请人完全同意所述文献的内容。

Claims (55)

1.分离的抗原结合蛋白，其包含与SEQ ID NO:15具有至少97％一致性的第一多肽和与SEQ ID NO:16具有至少97％序列一致性的第二多肽。
2.分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
3.权利要求1或2的分离的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:18。
4.权利要求1或2的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18，并且在结合后刺激肌肉生长。
5.权利要求1或2的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。
6.权利要求1或2的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
7.分离的抗原结合蛋白，其结合两种激活素受体。
8.权利要求7的分离的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18。
9.权利要求7的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18，并且在结合后刺激肌肉生长。
10.权利要求7的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。
11.权利要求7的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
12.分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
13.权利要求12的分离的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:18。
14.权利要求12的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18，并且在结合后刺激肌肉生长。
15.权利要求12的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。
16.权利要求12的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
17.分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
18.权利要求17的分离的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:18。
19.权利要求17的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18，并且在结合后刺激肌肉生长。
20.权利要求17的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。
21.权利要求17的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
22.分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
23.权利要求22的分离的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:18。
24.权利要求22的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18，并且在结合后刺激肌肉生长。
25.权利要求22的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。
26.权利要求22的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
27.分离的核酸，其编码权利要求1、2、7、12、17、22和52中任一项的抗原结合蛋白。
28.表达载体，其包含权利要求27的核酸。
29.宿主细胞，其包含权利要求28的载体。
30.权利要求29的宿主细胞，其中所述细胞是真核或原核细胞。
31.权利要求30的宿主细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
32.分离的抗原结合蛋白，其包含至少SEQ ID NO:3-5或SEQ IDNO:4-6。
33.产生抗原结合蛋白的方法，其包括在使得核酸表达以产生抗体的合适条件下培养权利要求29的宿主细胞。
34.权利要求33的方法，其进一步包括从宿主细胞的培养物中回收所述抗体。
35.组合物，其包含权利要求1、2、7、12、17、22和52中任一项的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
36.降低或阻断肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11活性的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求1、2、7、12、17、22或52中任一项的抗原结合蛋白或包含权利要求1、2、7、12、17、22或52中任一项的抗原结合蛋白的药物组合物。
37.增加需要治疗的受试者中的瘦肌肉质量或增加需要治疗的受试者中的瘦肌肉质量与脂肪质量的比率的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用有效量的权利要求1、2、7、12、17、22或52中任一项的抗原结合蛋白或包含权利要求1、2、7、12、17、22或52中任一项的抗原结合蛋白的药物组合物。
38.治疗或预防患有肌肉萎缩疾病的受试者中的此类病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含权利要求1、2、7、12、17、22或52中任一项的抗原结合多肽的治疗组合物。
39.权利要求38的方法，其中所述肌肉萎缩疾病包括癌症恶病质、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺病、慢性心脏衰竭、化学恶病质、HIV/AIDS导致的恶病质、肾衰竭、尿毒症、类风湿关节炎、年龄相关的肌肉减少症、年龄相关的虚弱、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺、或由于长期卧床不活动、脊髓损伤、中风、骨折、烧伤、老化或胰岛素抵抗导致的肌肉萎缩。
40.权利要求1、2、7、12、17、22和52中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在BIAcore测定中具有10pM或更小的针对ActRIIB的KD。
41.权利要求40的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有1pM或更小的针对ActRIIB的KD。
42.权利要求1、2、7、12、17、22和52中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在BIAcore测定中具有4nM或更小的针对ActRIIA的KD。
43.权利要求42的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白还具有1pM或更小的针对ActRIIA的KD。
44.抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在BIAcore测定中具有1pM或更小的针对ActRIIB和ActRIIA的KD。
45.权利要求1、2、7、12、17、22和52中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在基于细胞的测定中具有8nm或更小的针对ActRIIB的IC50。
46.权利要求40的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有2nM或更小的针对ActRIIB的IC50。
47.权利要求1、2、7、12、17、22和52中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在基于细胞的测定中具有2nM或更小的针对ActRIIA的IC50。
48.权利要求42的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白还具有1nM或更小的针对ActRIIA的IC50。
49.抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在基于细胞的测定中具有2nM或更小的针对ActRIIB的IC50和1nM或更小的针对ActRIIA的IC50。
50.权利要求1、2、7、12、17、22和52中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是拮抗性双重受体抗体。
51.权利要求50的拮抗性双重受体抗体，其中所述双重受体抗体是人抗体。
52.权利要求7的分离的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:17。
53.权利要求52的抗原结合蛋白，其特异性结合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:17，并且在结合后刺激肌肉生长。
54.权利要求52的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体或其片段。
55.权利要求52的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或者小鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体的片段。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109311998A (zh) * 2016-02-22 2019-02-05 阿塞勒隆制药公司 用于增加免疫活性的ActRII拮抗剂
CN110087684A (zh) * 2016-12-21 2019-08-02 诺华股份有限公司 用于治疗肥胖及相关病症的肌肉生长抑制素、激活素或激活素受体拮抗剂

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TN2015000448A1 (en) * 2012-06-11 2017-04-06 Amgen Inc Dual receptor antagonistic antigen-binding proteins and uses therof
PE20150954A1 (es) 2012-09-13 2015-06-20 Bristol Myers Squibb Co Proteinas del dominio de soporte basadas en fibronectina que se fijan a miostatina
TN2017000217A1 (en) * 2014-12-08 2018-10-19 Novartis Ag Myostatin or activin antagonists for the treatment of sarcopenia
GB201500464D0 (en) * 2015-01-12 2015-02-25 Crescendo Biolog Ltd Method of producing optimised therapeutic molecules
CN109153713B (zh) 2016-03-10 2022-12-27 艾科赛扬制药股份有限公司 活化素2型受体结合蛋白及其用途
JP7051846B2 (ja) 2016-11-10 2022-04-11 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビンＩＩａ型受容体変異体および同変異体を含む医薬組成物
US11693013B2 (en) * 2017-03-10 2023-07-04 UCL Business Ltd. Method relating to myostatin pathway inhibition
WO2018183376A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-04 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Acvr2a-specific antibody and method of use thereof
US11484573B2 (en) 2017-11-09 2022-11-01 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIa variants and methods of use thereof
CA3087008A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iib variants and methods of use thereof
JP2022534966A (ja) * 2019-05-30 2022-08-04 アクセレロン ファーマ インコーポレーテッド Ａｃｔｒｉｉ結合性タンパク質及びその使用
EP4121088A4 (en) * 2020-03-20 2024-07-03 Keros Therapeutics Inc METHODS OF USING ACTIVIN TYPE IIB RECEPTOR VARIANTS
WO2021189006A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iia variants

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060068468A1 (en) * 2004-07-23 2006-03-30 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
WO2010125003A1 (en) * 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Compositions and methods for increasing muscle growth

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
KR0149181B1 (ko) 1990-06-29 1998-08-17 데이비드 알, 맥지 형질전환된 미생물에 의한 멜라닌의 제조방법
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546091B1 (en) 1990-08-29 2007-01-24 Pharming Intellectual Property BV Homologous recombination in mammalian cells
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69233204T2 (de) 1991-12-13 2004-07-15 Xoma Corp., Berkeley Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH07508410A (ja) 1992-06-18 1995-09-21 ジェンファーム　インターナショナル　インコーポレイテッド 酵母人工染色体を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法
US6066718A (en) 1992-09-25 2000-05-23 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP2003533187A (ja) 2000-05-03 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド
US20100120627A1 (en) * 2006-08-02 2010-05-13 Abdelmajid Belouchi Genemap of the human genes associated with psoriasis
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
AU2009320364B2 (en) 2008-11-26 2013-05-16 Amgen Inc. Variants of activin IIB receptor polypeptides and uses thereof
US8524217B2 (en) * 2010-05-11 2013-09-03 Merck Sharp & Dohme Corp. MCP1-Ig fusion variants
SG11201403367YA (en) 2011-12-19 2014-07-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
TN2015000448A1 (en) * 2012-06-11 2017-04-06 Amgen Inc Dual receptor antagonistic antigen-binding proteins and uses therof
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060068468A1 (en) * 2004-07-23 2006-03-30 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
WO2010125003A1 (en) * 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Compositions and methods for increasing muscle growth

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109311998A (zh) * 2016-02-22 2019-02-05 阿塞勒隆制药公司 用于增加免疫活性的ActRII拮抗剂
CN110087684A (zh) * 2016-12-21 2019-08-02 诺华股份有限公司 用于治疗肥胖及相关病症的肌肉生长抑制素、激活素或激活素受体拮抗剂
CN110087684B (zh) * 2016-12-21 2023-12-01 诺华股份有限公司 用于治疗肥胖及相关病症的肌肉生长抑制素、激活素或激活素受体拮抗剂

Also Published As

Publication number Publication date
US10266598B2 (en) 2019-04-23
US10981999B2 (en) 2021-04-20
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CA2877669A1 (en) 2013-12-19
EP2859114A2 (en) 2015-04-15
IL236133A0 (en) 2015-01-29
NZ703724A (en) 2017-06-30
EP2859114B1 (en) 2019-05-15
US20190256605A1 (en) 2019-08-22
AU2013274347B2 (en) 2018-03-08
BR112014031028A2 (pt) 2017-08-15
HK1208499A1 (zh) 2016-03-04
EP2859114A4 (en) 2016-08-03
US9453080B2 (en) 2016-09-27
CO7240399A2 (es) 2015-04-17
WO2013188448A8 (en) 2014-05-08
JP2015525230A (ja) 2015-09-03
TN2015000448A1 (en) 2017-04-06
MA37761A1 (fr) 2017-09-29
CL2014003372A1 (es) 2015-04-10
KR20150030706A (ko) 2015-03-20
AU2013274347A1 (en) 2015-02-05
WO2013188448A3 (en) 2014-04-10
EP3498857A1 (en) 2019-06-19
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MX2014015195A (es) 2015-02-17
WO2013188448A2 (en) 2013-12-19
EP3540070A1 (en) 2019-09-18
US20210340262A1 (en) 2021-11-04
PE20150642A1 (es) 2015-05-26
TN2014000513A1 (en) 2016-03-30
PH12014502754A1 (en) 2015-03-02
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SG11201408228QA (en) 2015-01-29
SG10201610356YA (en) 2017-01-27

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