ES2727806T3 - Inmunocitocinas basadas en el dominio sushi alfa de IL-15 e IL-15R - Google Patents

Inmunocitocinas basadas en el dominio sushi alfa de IL-15 e IL-15R Download PDF

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Géraldine TEPPAZ
Yannick Jacques
Bruno Robert
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Abstract

Una inmunocitocina que comprende: a) un conjugado, y b) un anticuerpo o un fragmento del mismo unido directa o indirectamente por covalencia a dicho conjugado, en el que dicho fragmento del mismo puede reaccionar con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo, en la que dicho conjugado comprende: (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15, y (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de la IL-15Rα, en la que el conjugado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunocitocinas basadas en el dominio sushi alfa de IL-15 e IL-15R
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevas inmunocitocinas como se definen en las reivindicaciones y a su uso como medicamento, en particular para el tratamiento del cáncer.
Antecedentes
La inmunoterapia, en medicina, se refiere a una serie de estrategias de tratamiento basadas en el concepto de modular el sistema inmunitario para lograr un objetivo profiláctico y/o terapéutico.
En los últimos años, la inmunoterapia se ha usado para el tratamiento o la prevención de varias patologías, en particular los cánceres. Desde el desarrollo de la técnica de fusión celular para la producción de anticuerpos monoclonales, los investigadores han producido una gran cantidad de anticuerpos monoclonales. Después de esto, se han desarrollado otras técnicas para la generación de anticuerpos monoclonales, incluyendo la técnica del hibridoma de linfocitos B y la técnica del hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos. Se pueden desarrollar anticuerpos monoclonales (Mab) para dirigirlos a casi cualquier epítopo. La propiedad del reconocimiento y la unión específicos a células/moléculas particulares ha fomentado el desarrollo de Mab como reactivos de diagnóstico y terapéuticos para una variedad de estados de enfermedad. Se han utilizado técnicas de ADN recombinante para producir anticuerpos quiméricos o humanizados para adaptar su administración a los humanos. Actualmente, se comercializan y están disponibles varios anticuerpos monoclonales para el tratamiento de cánceres, enfermedades infecciosas, enfermedades inmunitarias, etc., tales como RITUXAN®, HERCEPTIN®, AVASTIN®.
Los anticuerpos monoclonales son moléculas dirigidas y se pueden localizar dentro de una zona específica (células, tejidos ...) tal como tejidos tumorales. Esta propiedad también ha dado lugar al desarrollo de Mab conjugados con diversas sustancias (cargas útiles) en un esfuerzo por dirigirlos a moléculas específicas en los sitios de tumores llamados antígenos tumorales. Dichas sustancias (cargas útiles) pueden ser toxinas, fármacos, radionúclidos, compuestos profármacos ... Muchos de estos enlaces implican la conjugación química del resto reactivo (carga útil) con una preparación dada de anticuerpo, un proceso que puede ser engorroso y estar sujeto a variación (documento US 4.671.958).
Entre estas nuevas moléculas, las inmunocitocinas son de particular interés. Dichas inmunocitocinas corresponden a proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo y una citocina. Estas proteínas retienen tanto la capacidad de unión al antígeno como la actividad de la citocina.
Las citocinas son una categoría de proteínas de señalización y glucoproteínas que, como las hormonas y los neurotransmisores, se usan ampliamente en la comunicación celular. Mientras que las hormonas son secretadas por órganos específicos a la sangre, y los neurotransmisores están relacionados con la actividad neuronal, las citocinas son una clase más diversa de compuestos en términos de origen y propósito. Son producidos por una amplia variedad de tipos de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas y pueden tener efectos tanto en células cercanas como en todo el organismo, a veces dependiendo mucho de la presencia de otros productos químicos. La familia de las citocinas se compone principalmente de proteínas más pequeñas solubles en agua y glucoproteínas con una masa de entre 8 y 30 kDa. Las citocinas son fundamentales para el funcionamiento de las respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas. A menudo son secretadas por células inmunitarias que han encontrado un patógeno como forma de activar y reclutar más células inmunitarias y aumentar la respuesta del sistema al patógeno. Sin embargo, aparte de su papel en el desarrollo y funcionamiento del sistema inmunitario, las citocinas también están implicadas en varios procesos de desarrollo durante la embriogénesis.
Entre las citocinas, la interleucina 15 (IL-15) es una citocina con similitud estructural a la IL-2 que es secretada por los fagocitos mononucleares (y algunas otras células) después de la infección por virus o la estimulación indirecta por células reconocidas como no propias o debilitadas. Esta citocina induce la proliferación celular de linfocitos citolíticos naturales; células del sistema inmunitario innato cuya función principal es destruir células infectadas por virus. La proteína codificada por este gen es una citocina que regula la proliferación y activación de linfocitos citolíticos naturales y T; véase, por ejemplo, el documento EP1777294 o Bessard et al. (2009), Molecular Cancer Therapeutics 8, 9: 2736-2745.
La construcción de inmunocitocinas sobre la base de IL-15 sería, por tanto, de particular interés para la combinación de los activos dirigidos a tumores de anticuerpos específicos de tumores con los efectos inmunomoduladores de la interleucina 15. Varias inmunocitocinas que usan especialmente interleucina-2 (IL-2) ya se han obtenido y demostrado resultados muy interesantes y alentadores en ensayos clínicos de oncología de fase 2. Algunos ejemplos de estas proteínas de fusión se describen en varias solicitudes de patente (el documento US 5.645.835, el documento EP 0.305.967, el documento WO 86/01533, el documento EP 0.439.095 y el documento WO 85/00974), en Kermer et al. (2010), CIMT abstract book, páginas 1-171 o en Ronca et al. (2009), Immunobiology 214, 9-10: 800­ 810.
Por tanto, la inmunocitocina basada en la interleucina 15 se ha producido en células HEK-293 y se divulga en la solicitud de patente internacional PCT WO 2007/128563 y en Ka SpAR et al. (Cancer Research, vol.67(10), p:4940-4948, 2007).
Sin embargo, los autores de la presente invención establecieron que dichas inmunocitocinas basadas en la interleucina 15 tienen una actividad de interleucina 15 muy limitada, y que su producción es muy difícil, especialmente en células CHO con rendimiento bajo y muchas proteínas contaminantes.
Por tanto, todavía existe una necesidad de inmunocitocinas basadas en la interleucina 15 que se puedan usar en inmunoterapias.
Sumario de la invención
La invención se refiere a una inmunocitocina que comprende:
A) un conjugado, y
B) un anticuerpo o un fragmento del mismo, unido directa o indirectamente por covalencia a dicho conjugado, en el que dicho fragmento del mismo puede reaccionar con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo,
en el que dicho conjugado comprende:
(i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15, y
(ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra, en el que el conjugado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una inmunocitocina como se describe anteriormente.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico como se describe anteriormente.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped genomanipulada con el polinucleótido o con el vector descrito anteriormente. La presente invención también se refiere a un procedimiento para producir una célula huésped genomanipulada que expresa una inmunocitocina de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico o un vector como se describe anteriormente en una célula huésped, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula huésped recombinante genomanipulada y (iii) , opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicha inmunocitocina.
En un modo de realización preferente, dicha célula huésped genomanipulada es una célula animal, y preferentemente una célula CHO.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la inmunocitocina como se describe anteriormente, un ácido nucleico que codifica la misma, o un vector de ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico, eventualmente asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un modo de realización preferente, dicha composición comprende otro agente terapéutico, que es preferentemente un agente antineoplásico.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se describe anteriormente para tratar un cáncer en un sujeto.
En el séptimo aspecto, la presente invención se refiere a los productos que contienen:
(i) una inmunocitocina como se describe anteriormente, una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma, o un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, y
(ii) un agente terapéutico, preferentemente un agente antineoplásico,
como una preparación combinada para su uso simultáneo para tratar un cáncer en un sujeto.
En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se describe anteriormente para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer en un sujeto.
En un aspecto final, la presente invención se refiere a (i) una inmunocitocina como se describe anteriormente, una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma, o un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, y (ii) un agente terapéutico, preferentemente un agente antineoplásico para nosotros en un procedimiento para tratar un cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar simultáneamente, por separado o secuencialmente a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de (i) y (ii) definida anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la actividad de inmunocitocinas de anti-CD20 e IL-15 en comparación con la IL15.
La figura 2 muestra la actividad de la inmunocitocina anti-GD2-0-acetilado e IL15 en comparación con la IL15. La figura 3 muestra la actividad de unión a CD20, GD2-0-acetilado y HER-2 de inmunocitocinas de anti-CD20I e IL15, anti-GD2-0-acetilado y anti-HER2 e IL-15, respectivamente.
La figura 4 muestra la actividad de unión a IL-15Ra de la inmunocitocina de anti-CD20 e IL15 en comparación con el anticuerpo anti-CD20 (Rituximab).
La figura 5 muestra la actividad de unión a CD20, GD2-0-acetilado y HER-2 de inmunocitocinas de anti-CD20I e IL15, anti-GD2-0-acetilado y anti-HER2 e RLI, respectivamente.
La figura 6 muestra la actividad de unión a IL-15Ra de inmunocitocinas de anti-CD20 e RLI y anti-GD2-0-acetilado e IL15.
La figura 7 muestra la actividad de inmunocitocinas de anti-CD20 y RLI en comparación con IL15.
La figura 8 muestra la actividad de inmunocitocinas de anti-GD2-0-acetilado y RLI en comparación con IL15.
La figura 9 muestra la actividad antimetastática de la inmunocitocina de anti-GD2-0-acetilado en comparación con el anticuerpo anti-GD2-0 acetilado.
La figura 10 muestra la actividad antitumoral de la inmunocitocina de anti-CD20 en el modelo de Raji.
La figura 11 muestra la actividad de inmunocitocinas de anti-HER2 e IL-15 en comparación con la IL15.
La figura 12 muestra la actividad de inmunocitocinas de anti-HER2 y RLI en comparación con IL15.
Descripción detallada
La presente invención se basa en el descubrimiento por los autores de la presente invención de que, mientras que la producción de una inmunocitocina que comprende interleucina 15 da lugar a la pérdida de más de un 90 % de la actividad de la interleucina 15, la producción de inmunocitocinas basadas en RLI da lugar a innovadoras inmunocitocinas de IL15 que presentan una potente actividad biológica en las células inmunitarias apY y Py que es en gran parte superior a las inmunocitocinas basadas en IL-15.
Sorprendentemente, las inmunocitocinas basadas en RLI con un anticuerpo monoclonal IgG completo presentan una eficacia biológica mejorada en las células inmunitarias Py en comparación con RLI sola o con anticuerpo del fragmento scFv. Esta sorprendente ganancia de actividad en las células inmunitarias Py podría ser crítica en términos de activación/reactivación de los linfocitos NK y los linfocitos T en el entorno inmunosupresor.
Todavía sorprendentemente, y mientras que una inmunocitocina de interleucina 15 necesita la presencia de un conector entre la inmunoglobulina y los restos de interleucina 15 para estar activa, la inmunocitocina de la invención presenta una actividad de interleucina 15 similar con o sin ningún conector entre sus respectivas partes de inmunoglobulina y citocina. Esta presencia innecesaria de una región de conector podría representar argumentos potentes en términos de inmunogenicidad de la proteína de fusión, limitando las regiones bisagra que generan un novedoso epítopo antigénico e inmunogenicidad y en términos de rendimiento de producción con formas escindidas limitadas.
Todavía sorprendentemente, las inmunocitocinas de la invención son superagonistas de IL-15 que muestran un aumento de la actividad (es decir, de 10 a 100 veces) en comparación con RLI sola.
Además, los autores de la presente invención obtuvieron un buen rendimiento de producción de la inmunocitocina de la invención en células CHO, y esto con un rendimiento de más de un 90 %. Esto es sorprendente ya que la producción en las mismas células de la inmunocitocina de interleucina 15 en células CHO fue muy difícil.
Como las inmunocitocinas tienen una semivida en suero limitada tradicionalmente y como la tasa de localización tumoral relacionada con inmunocitocinas es un problema crítico para generar un efecto antitumoral robusto, la actividad biológica específica de las inmunocitocinas basadas en RLI que permiten activar células inmunitarias a una concentración muy baja representa una importante etapa innovadora en este campo y podría mejorar la eficacia de dichos compuestos biológicos en pacientes con cáncer.
Finalmente, la potente actividad de la inmunocitocina de la invención permite pronosticar un uso terapéutico realista de esta inmunocitocina, que se debería administrar mediante inyección a una dosis de 2,5-1 mg/kg de sujeto o menos, e incluso a una dosis de 0,1 mg/kg o menos. De hecho, la baja actividad de las inmunocitocinas de interleucina 15 tal como la divulgada en la solicitud de patente internacional WO 2007/128563 no permite ningún uso terapéutico realista (es decir, obtener un efecto terapéutico requería una dosis de más de 20 pg de inmunocitocina con cuatro inyecciones diarias en una modelo tumoral de ratón, lo que sugería la necesidad de una dosis de más de 5 mg/kg de inmunocitocina para obtener algún efecto terapéutico).
En consecuencia, un aspecto de la presente invención se refiere a una inmunocitocina que comprende:
A) un conjugado, y
B) un anticuerpo o un fragmento del mismo, unido directa o indirectamente por covalencia a dicho conjugado, en el que dicho fragmento del mismo puede reaccionar con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo,
en el que dicho conjugado comprende:
(i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15, y
(ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra, en el que el conjugado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
El término "inmunocitocina" se refiere a una molécula que comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo directa o indirectamente unidos por covalencia a una citocina o derivados de la misma. Dicho anticuerpo y dicha citocina de pueden unir mediante un péptido conector.
Conjugado de la inmunocitocina de la invención
El término "interleucina 15" en su significado general en la técnica y se refiere a una citocina con similitud estructural a IL-2 (GRABSTEIN et al., Science, vol.264(5161), p:965-968, 1994). Esta citocina también se conoce como IL-15, IL15 o MGC9721. Esta citocina e IL-2 comparten muchas actividades biológicas y se encontró que se unían a subunidades comunes del receptor de hematopoyetina. Por tanto, pueden competir por el mismo receptor, regulando negativamente la actividad de la otra. Se ha establecido que la IL-15 regula la activación y proliferación de los linfocitos T y linfocíticos naturales, y que se muestra que el número de células de memoria CD8+ está controlado por un equilibrio entre esta citocina e IL2. La actividad de IL-15 se puede medir determinando su inducción de proliferación en la línea celular kit225 (HORI et al., Blood, vol.70(4), p:1069-72, 1987), como se divulga en los ejemplos.
Se describen derivados de IL-15 que tienen al menos un10 % de la actividad de la interleucina-15 humana en la inducción de proliferación de la línea celular kit225, preferentemente al menos un 25 % y más preferentemente al menos un 50 %.
La IL-15 de la inmunocitocina de la presente invención es la interleucina 15 humana.
El experto puede identificar sencillamente la interleucina 15 de mamífero. Como ejemplo, se puede citar la interleucina 15 de Sus scrofa (número de acceso ABF82250), de Rattus norvegicus (número de acceso NP_037261), de Mus musculus (número de acceso NP_032383), de Bos Taurus (número de acceso NP_776515), de Oryctolagus cuniculus (número de acceso NP_001075685), de Ovies aries (número de acceso NP_001009734), de Felis catus (número de acceso NP_001009207), de Macaca fascicularis (número de acceso BAA19149), de Homo sapiens (número de acceso NP_000576), de Macaca Mulatta (número de acceso NP_001038196), de Cavia porcellus (número de acceso NP_001166300) o de Chlorocebus sabaeus (número de acceso ACI289).
Como se usa en el presente documento, el término "interleucina 15 de mamífero" se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 1.
El experto puede identificar sencillamente la interleucina 15 de primate. Como ejemplo, se puede citar la interleucina15 de Sus scrofa (número de acceso ABF82250), de Oryctolagus cuniculus (número de acceso NP_001075685), de Macaca fascicularis (número de acceso BAA19149), de Homo sapiens (número de acceso NP_000576), de Macaca Mulatta (número de acceso NP_001038196) o de Chlorocebus sabaeus (número de acceso ACI289).
Como se usa en el presente documento, el término "interleucina 15 de primate" se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 2.
La interleucina 15 humana puede ser identificada sencillamente por el experto y se refiere a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
Como se usa en el presente documento, el término "derivados de interleucina 15" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos un 92,5 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 10 sustituciones de aminoácidos) con una secuencia de aminoácidos seleccionada en el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, preferentemente de al menos un 96 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos), y más preferentemente de al menos un 98,5 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 2 sustituciones de aminoácidos) o de al menos un 99 %, es decir, correspondiente a aproximadamente 1 sustitución de aminoácidos). Dichos derivados pueden ser identificados sencillamente por el experto en vista de su conocimiento personal y de la enseñanza de la presente solicitud de patente. Como ejemplo de dichos derivados, se pueden citar los descritos en la solicitud de patente internacional PCT WO 2009/135031. También se entenderá que los aminoácidos naturales se pueden reemplazar por aminoácidos modificados químicamente. Típicamente, dichos aminoácidos modificados químicamente aumentan la semivida del polipéptido.
Como se usa en el presente documento, "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos significa el porcentaje de aminoácidos idénticos, entre las dos secuencias que se van a comparar, que se obtiene con la mejor alineación de dichas secuencias, siendo este porcentaje puramente estadístico y distribuyéndose aleatoriamente las diferencias entre estas dos secuencias con respecto a las secuencias de aminoácidos. Como se usa en el presente documento, "mejor alineación" o "alineación óptima" significa la alineación para la cual el porcentaje de identidad determinado (véase a continuación) es el más alto. La comparación de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos generalmente se realiza normalmente comparando estas secuencias que se han alineado previamente de acuerdo con la mejor alineación; esta comparación se realiza en segmentos de comparación para identificar y comparar las regiones locales de similitud. La mejor alineación de secuencias para realizar la comparación se puede realizar, además de por una forma manual, usando el algoritmo de homología global desarrollado por SMITH y WATERMAN (Ad. App. Math., Vol.2, p:482, 1981), usando el algoritmo de homología local desarrollado por NEDDLEMAN y Wu NSc H (J. Mol. Biol., Vol.48, p:443, 1970), usando el procedimiento de similitudes desarrollado por PEARSON y LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), usando programas informáticos que usan dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA en el paquete de programa informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, EE. UU.), usando los algoritmos de alineación múltiple MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Para obtener la mejor alineación local, se puede usar preferentemente el programa informático BLAST con la matriz BLOSUM 62. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas de manera óptima, pudiendo englobar las secuencias de aminoácidos adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para obtener la alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre estas dos secuencias, y dividiendo este número entre el número total de posiciones comparadas, y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Los derivados de interleuquina 15 pueden ser un agonista o superagonista de IL-15. Un experto en la técnica puede identificar sencillamente un agonista o superagonista de IL-15. Como ejemplo de agonista o superagonista de IL-15, se pueden citar los divulgados en la solicitud de patente internacional WO 2005/085282 o en ZHU et al. (J. Immunol., vol.183(6), p:3598-607, 2009).
El agonista o superagonista de IL-15 se puede seleccionar en el grupo que comprende/que consiste en L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y y N72P (en referencia a la secuencia de la IL-15 humana, SEQ ID NO: 3).
Como se usa en el presente documento, el término "el dominio sushi de IL-15Ra" tiene su significado general en la técnica y se refiere a un dominio que comienza en el primer residuo de cisteína (C1) después del péptido señal de IL-15Ra, y termina en el cuarto residuo de cisteína (C4) después de dicho péptido señal. Dicho dominio sushi correspondiente a una parte de la región extracelular de IL-15Ra es necesario para su unión a IL-15(WEI et al., J. Immunol., vol.167(1), p:277-282, 2001).
Dicho dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo tiene al menos un 10 % de la actividad de unión del dominio sushi de IL-15Ra humano a interleuquina-15 humana, preferentemente al menos un 25 % y más preferentemente al menos un 50 %. Dicha actividad de unión se puede determinar sencillamente por el procedimiento divulgado en WEI et al. (mencionado anteriormente, 2001).
Dicho dominio sushi del IL-15Ra es el dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero, preferentemente el dominio sushi de un IL-15Ra de primate y más preferentemente el dominio sushi del IL-15Ra humano.
El experto puede identificar sencillamente el dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero. Como ejemplo, se puede citar el dominio sushi de un IL-15Ra de Rattus norvegicus (número de acceso XP_002728555), de Mus musculus (número de acceso EDL08026), de Bos Taurus (número de acceso XP_002692113), de Oryctolagus cuniculus (número de acceso XP_002723298), de Macaca fascicularis (número de acceso ACI42785), de Macaca nemestrina (número de acceso ACI42783), de Homo sapiens (número de acceso CAI41081), de Macaca Mulatta (número de acceso NP_001166315), Pongo abelii(número de acceso XP_002820541), Cercocebus torquatus (número de acceso ACI42784), Callithrix jacchus (número de acceso XP_002750073) o de Cavia porcellus (número de acceso NP_001166314).
Como se usa en el presente documento, el término "dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero" se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 4.
El polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 5.
El experto puede identificar sencillamente el dominio sushi de un IL-15Ra de primate. Como ejemplo, se pueden citar los dominios sushi de IL-15Ra de Oryctolagus cuniculus, de Macaca fascicularis, de Macaca nemestrina, de Homo Sapiens, de Macaca Mulatta, Pongo abelii, Cercocebus torquatus o Callithrix jacchus.
Como se usa en el presente documento, el término "dominio sushi de un IL-15Ra de primate" se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 6.
El polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de un IL-15Ra de primate se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 7.
El dominio sushi de IL-15Ra humano puede ser identificado sencillamente por el experto y se refiere a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
El polipéptido de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra humano se refiere a SEQ ID NO: 9.
Como se usa en el presente documento, el término "derivados del dominio sushi del IL-15Ra" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos un 92 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos) con una secuencia de aminoácidos seleccionada en el grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, preferentemente de al menos un 96 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 2 sustituciones de aminoácidos), y más preferentemente de al menos un 98 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 1 sustitución de aminoácidos). Dichos derivados comprenden los cuatro residuos de cisteína del dominio sushi de L-15Ra y el experto los pueden identificar sencillamente en vista de su conocimiento general y de la enseñanza de la presente solicitud de patente. También se entenderá que los aminoácidos naturales se pueden reemplazar por aminoácidos modificados químicamente. Típicamente, dichos aminoácidos modificados químicamente permiten aumentar la semivida del polipéptido.
La inmunocitocina de la presente invención comprende (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de IL-15Ra mostrada en SEQ ID NO: 12.
El dominio bisagra de IL-15Ra se define como la secuencia de aminoácidos que comienza en el primer residuo amino después del dominio sushi y termina en el último residuo de aminoácido antes del primer sitio potencial de glucosilación. En el IL-15Ra humano, la secuencia de aminoácidos de la región bisagra consiste en los catorce aminoácidos que se sitúan después del dominio sushi de este IL-15Ralpha, en una posición C-terminal con respecto a dicho dominio sushi, es decir, dicha región bisagra de IL-15Ralpha comienza en el primer aminoácido después de dicho residuo de cisteína (C4) y termina en el decimocuarto aminoácido (contando en la orientación estándar "desde N-terminal a C-terminal").
Dichos dominios sushi y bisagra de IL-15Ra son los dominios sushi y bisagra del IL-15Ra humano.
El experto puede identificar sencillamente la secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de mamífero" se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 10.
El experto puede identificar sencillamente la secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de primate. Como se usa en el presente documento, el término "dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de primate" se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 11.
El experto puede identificar sencillamente la secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de humano. Como se usa en el presente documento, el término "dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de humano" se refiere a la secuencia consenso SEQ ID NO: 12.
Como se usa en el presente documento, el término "derivados de los dominio sushi y bisagra del IL-15Ra" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos un 93 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos) con una secuencia de aminoácidos seleccionada en el grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, preferentemente de al menos un 97 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 2 sustituciones de aminoácidos), y más preferentemente de al menos un 98 % (es decir, correspondiente a aproximadamente 1 sustitución de aminoácidos). Dichos derivados comprenden los cuatro residuos de cisteína del dominio sushi de L-15Ra y el experto los pueden identificar sencillamente en vista de su conocimiento general y de la enseñanza de la presente solicitud de patente. También se entenderá que los aminoácidos naturales se pueden reemplazar por aminoácidos modificados químicamente. Típicamente, dichos aminoácidos modificados químicamente permiten aumentar la semivida del polipéptido.
Se describe que los polipéptidos i) y ii) del conjugado se pueden enlazar de manera no covalente, como en el complejo divulgado en la patente US 8.124.084 B2. Dicho conjugado o complejo se puede obtener sencillamente proporcionando una cantidad adecuada del polipéptido i), proporcionando una cantidad adecuada del polipéptido ii), mezclando ambos polipéptidos en con un pH adecuado y condiciones iónicas durante un tiempo suficiente para permitir la formación del complejo (es decir, conjugado) y
opcionalmente concentrando o purificando dicho complejo. Los polipéptidos del complejo (es decir, conjugado) se pueden formar, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de acuerdo con procedimientos estándar; expresando cada polipéptido por separado en una célula o extracto celular, a continuación aislando y purificando el polipéptido. Opcionalmente, el complejo polipeptídico terapéutico de la invención se puede formar expresando ambos polipéptidos i) y ii) en la misma célula o extracto celular, a continuación aislando y purificando los complejos, por ejemplo, usando técnicas cromatográficas, tal como cromatografía de afinidad con anticuerpos contra la parte de linfocinas, la parte del receptor de linfocinas o el complejo.
Ambos polipéptidos i) y ii) del conjugado se unen covalentemente en una proteína de fusión.
Se describen agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, que son bien conocidos para el experto, tal como métodos que los usan, e incluyen, como ejemplos, N-succinimidil-(2-piridididiol)-propionato (SPDP), succinimidil (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato,iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetilo adipimidato HCL), ésteres activos (tal como disuccinimidil suberato), aldehídos (tal como glutareldehído), compuestos bis-azido (tal como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
El término "proteína de fusión" se refiere a una proteína creada a través de la unión de dos o más genes que originalmente codificaron proteínas separadas. También se conoce como una proteína quimérica. La traducción de este gen de fusión da como resultado un único polipéptido con propiedades funcionales que se derivan de cada una de las proteínas originales. Las proteínas de fusión recombinantes se crean artificialmente mediante tecnología de ADN recombinante para su uso en investigación biológica o terapéutica. Una proteína de fusión recombinante es una proteína creada a través de la genomanipulación de un gen de fusión. Esto típicamente implica eliminar el codón de terminación de una secuencia de ADNc que codifica la primera proteína, a continuación agregar la secuencia de ADNc de la segunda proteína en el marco a través de ligadura o PCR de extensión por solapamiento. Esa secuencia de ADN será expresada a continuación por una célula como una proteína única. La proteína se puede genomanipular para incluir la secuencia completa de ambas proteínas originales, o solo una parte de cualquiera de las dos.
El conjugado de la invención es una proteína de fusión.
La secuencia de aminoácidos de interleucina 15 puede estar en una posición C-terminal o N-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo. En la inmunocitocina de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15 está en una posición C-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra.
La secuencia de aminoácidos de la interleucina 15 y la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra están separadas por una primera secuencia de aminoácidos "de conector". Dicha primera secuencia de aminoácidos "de conector" tiene una longitud suficiente para garantizar que la proteína de fusión forme estructuras secundarias y terciarias apropiadas.
Se describe que la longitud de la primera secuencia de aminoácidos de conector puede variar sin afectar significativamente a la actividad biológica de la proteína de fusión. Típicamente, la primera secuencia de aminoácidos de conector comprende al menos uno, pero menos de 30 aminoácidos, por ejemplo, un conector de 2­ 30 aminoácidos,
de 10-30 aminoácidos, de 15-30 aminoácidos, de 15-25 aminoácidos o de 18-22 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos de conector preferentes son aquellas que permiten que el conjugado adopte una conformación adecuada (es decir, una conformación que permite una actividad de transducción de señal apropiada a través de la vía de señalización de IL-15Rbeta/gamma).
Las primas secuencias de aminoácidos de conector más adecuadas (1) adoptarán una conformación extendida flexible, (2) no presentarán propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que pueda interactuar con los dominios funcionales de proteínas de fusión, y (3) tendrán un carácter hidrófobo o cargado mínimo que podría promover la interacción con los dominios de proteínas funcionales.
Se describe que la primera secuencia de aminoácidos de conector comprende aminoácidos casi neutros seleccionados en el grupo que comprende Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) y Gln (Q), lo más preferentemente en el grupo que comprende Gly (G), Asn (N) y Ser (S).
Ejemplos de secuencias de conefctor se describen en las patentes de EE. UU. n.° 5.073.627 y 5.108.910.
El conector flexible de la presente invención está codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG). En el presente documento también se divulgan conectores flexibles codificados por las secuencias de SEQ ID NO: 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ) y SEQ ID NO: 15 (SGGGSGGGGSGGGGGGGGSLQ).
Anticuerpo de la inmunocitocina de la invención
El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que corresponde a un tetrámero que comprende cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) idénticas (aproximadamente 50-70 kDa cuando son de longitud completa) y dos cadenas ligeras (L) idénticas (aproximadamente 25 kDa cuando son de longitud completa) interconectadas por enlaces disulfuro. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada de término N (abreviada en el presente documento como HCVR) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios (CH1, CH2 y CH3) para IgG, IgD e IgA; y 4 dominios (CH1, CH2, CH3 y CH4) para IgM e IgE. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera del término N (abreviada en el presente documento como LCVR) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones de HCVR y LCVR se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada HCVR y LCVR se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con convenciones bien conocidas. La capacidad funcional del anticuerpo para unirse a un antígeno particular depende de las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada, y está determinada en gran medida por las CDR.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal per se. Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. De forma ventajosa, el término anticuerpo se refiere a una IgG, tal como IgG1, IgG2 (IgG2a o IgG2b), IgG3 e IgG4. Preferentemente, el término anticuerpo se refiere a IgG1 o IgG2, y más preferentemente a IgG2a.
"Anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo que se compone de regiones variables de una inmunoglobulina murina y de regiones constantes de una inmunoglobulina humana. Esta alteración consiste simplemente en sustituir la región constante de un anticuerpo humano con la región constante murina, dando como resultado, por tanto, una quimera humana/murina que puede tener una inmunogenicidad suficientemente baja para ser aceptable para uso farmacéutico. Se ha informado de varios procedimientos para producir dichos anticuerpos quiméricos, que forman parte, por tanto, del conocimiento general del experto (véase, por ejemplo, la patente de EE. Uu . n.° 5.225.539). "Anticuerpo humanizado" significa un anticuerpo que está compuesto parcial o totalmente por secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de anticuerpo humano por alteración de la secuencia de un anticuerpo que tiene regiones determinantes de complementariedad no humanas (CDR). Esta humanización de la región variable del anticuerpo y, finalmente, la c Dr se realiza mediante técnicas que ahora son bien conocidas en la técnica. Como ejemplo, la solicitud de patente británica GB 2188638A y la patente de EE. UU. n.° 5.585.089 divulgan procesos en los que se producen anticuerpos recombinantes donde la única parte del anticuerpo que está sustituida es la región determinante de complementariedad, o "CDR". La técnica de injerto de CDR se ha usado para generar anticuerpos que consisten en c Dr murinos y el marco de la región variable humana y las regiones constantes (véase, por ejemplo, RIECHMANN et al., Nature, vol.332, p: 323-327, 1988). Estos anticuerpos conservan las regiones constantes humanas que son necesarias para la función efectora dependiente de Fc, pero tienen muchas menos probabilidades de provocar una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo. Como ejemplo, las regiones marco de las regiones variables están sustituidas por las regiones marco humanas correspondientes dejando la CDR no humana sustancialmente intacta, o incluso reemplazando la CDR con secuencias derivadas de un genoma humano (véase, por ejemplo, la solicitud de patente US 2006/25885). Se producen anticuerpos totalmente humanos en ratones modificados genéticamente cuyos sistemas inmunitarios se han alterado para corresponder a los sistemas inmunitarios humanos. Como se menciona anteriormente, es suficiente para su uso en los procedimientos de la invención, emplear un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, incluyendo fragmentos que representan formas de cadena única.
Un anticuerpo humanizado nuevamente se refiere a un anticuerpo que comprende un marco humano, al menos una CDR de un anticuerpo no humano, y en el que cualquier región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85 o 90 %, preferentemente al menos un 95 % idéntica. Por lo tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana natural. Por ejemplo, una inmunoglobulina humanizada típicamente no englobaría un anticuerpo quimérico de región variable de ratón/región constante humana. Como ejemplo, el diseño de inmunoglobulinas humanizadas se puede llevar a cabo como sigue: cuando un aminoácido se incluye en la siguiente categoría, el aminoácido de marco de una inmunoglobulina humana que se va a usar (inmunoglobulina aceptora) se reemplaza por un aminoácido de marco de una inmunoglobulina no humana que proporciona una CDR (inmunoglobulina donante): (a) el aminoácido en la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora es inusual para la inmunoglobulina humana en esa posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es típico para la inmunoglobulina humana en esa posición; (b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o (c) cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido de marco está dentro de aproximadamente 5-6 angstroms (centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional (QUEEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991). Cuando cada uno de los aminoácidos en la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora y un aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es inusual para la inmunoglobulina humana en esa posición, dicho aminoácido se reemplaza por un aminoácido típico para una inmunoglobulina humana en esa posición.
El término "fragmento de anticuerpo" como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de anticuerpo que puede reaccionar con el mismo antígeno que su contraparte de anticuerpo. Dichos fragmentos pueden ser identificados sencillamente por el experto y comprenden, como ejemplo, el fragmento Fab (por ejemplo, por digestión con papaína), el fragmento Fab' (por ejemplo, por digestión con pepsina y reducción parcial), el fragmento F(ab')2 (por ejemplo, por digestión con pepsina), Facb (por ejemplo, por digestión con plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión con pepsina, reducción parcial y reagregación) y también el fragmento scFv (Fv monocatenario; por ejemplo, mediante técnicas de biología molecular) están englobados por la invención.
Dichos fragmentos se pueden producir mediante escisión enzimática, técnicas sintéticas o recombinantes, como se conoce en la técnica y/o como se describe en el presente documento. También se pueden producir anticuerpos en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en los que se han introducido uno o más codones de terminación en dirección 5' del sitio de terminación natural. Por ejemplo, se puede diseñar un gen de combinación que codifica una parte de cadena pesada de F(ab')2 para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena pesada. Las diversas partes de anticuerpos se pueden unir químicamente por técnicas convencionales, o se pueden preparar como una proteína contigua usando técnicas de genomanipulación. Preferentemente, dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv.
En un modo de realización preferente, dicho anticuerpo o fragmento del mismo se dirige contra un antígeno relacionado con la neovascularización tumoral o con la matriz extracelular del tumor, o contra un antígeno tumoral. Como se usa en el presente documento, un "antígeno relacionado con la neovascularización tumoral" se refiere a un antígeno que se expresa por los vasos sanguíneos neosintetizados presentes en el tumor.
Como ejemplo de dicho antígeno, se pueden citar los dominios EDA y EDB de fibronectina, endosalina/TEM1, endoglina/105, PSMA o B7-H4.
Como se usa en el presente documento, un "antígeno relacionado con la matriz extracelular del tumor" se refiere a un antígeno que se expresa en la matriz extracelular presente en el tumor.
Como ejemplo de dicho antígeno, se puede citar el fragmento G45 de laminina 332 (ROUSSELLE et al., Cancer Research, vol.68(8), p:2885-94, 2008).
Como se usa en el presente documento, un "antígeno tumoral" se refiere a una sustancia antigénica producida en células tumorales. Muchos antígenos tumorales son bien conocidos por los expertos y se pueden citar, como ejemplos no limitativos, CD-20, CEA, EGFR, GD2, EPCAM, MUC1, PSMA, CD-19, GD3, GM1, CAIX, GD2-0-acetilado o HER2.
CD-20 es una fosfoproteína no glucosilada expresada durante el desarrollo de prelinfocitos B y permanece hasta la diferenciación de las células plasmáticas. Específicamente, la molécula CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación que se requiere para el inicio del ciclo celular y la diferenciación, y normalmente se expresa en niveles muy altos en los linfocitos B neoplásicos ("tumorales"). CD20, por definición, está presente tanto en los linfocitos B "normales" como en los linfocitos B "cancerosos". Por tanto, el antígeno de superficie CD20 tiene el potencial de servir como un candidato para "dirigirse a" los linfomas de linfocitos B.
Con respecto a los anticuerpos dirigidos contra CD-20, se puede citar rituximab ("RITUXAN®") (patente de EE. UU. n.° 5.736.137); el anticuerpo murino 2B8 marcado con itrio [90] denominado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetán" ZEVALIN® (patente de EE. UU. n.° 5.736.137); IgG2a murina "BI", también llamada "Tositumomab", opcionalmente marcado con 131I para generar el anticuerpo "131I-BI" (tositumomab marcado con yodo 131, BEXXAR®) (patente de EE. UU. n.° 5.595.721); y 2H7 humanizado; ofatumumab, una IgG1 completamente humanizada contra un nuevo epítopo en CD20 huMax-CD20 (solicitud de patente internacional PCT WO 2004/035607). Entre ellos, rituximab, ibritumomab, tiuxetan y tositumomab recibieron la autorización de comercialización para el tratamiento de un linfoma específico, y ofatumumab recibió la autorización de comercialización para el tratamiento de una leucemia específica. La glucoproteína CEA (antígeno carcinoembrionario) es un marcador tumoral implicado en la adhesión celular. Con respecto a los anticuerpos dirigidos contra el CEA, se puede citar arcitumomab (IMMUNOMEDICS).
Los receptores ErbB se expresan en diversos tejidos de origen epitelial, mesenquimal y neuronal. En condiciones normales, la activación de los receptores ErbB se controla mediante la expresión espacial y temporal de sus ligandos, que son miembros de la familia de factores de crecimiento EGF. La unión del ligando a los receptores ErbB induce la formación de homodímeros y heterodímeros de los receptores, y la activación del dominio cinasa intrínseco, dando como resultado la fosforilación de residuos de tirosina cinasa específicos dentro de la cola citoplásmica. Estos residuos fosforilados sirven como sitios de acoplamiento para diversas proteínas, cuyo reclutamiento da lugar a la activación de vías de señalización intracelular. Entre los receptores ErbB, se sabe que EGFR y HER2 desempeñan un papel esencial en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. Tienen una fuerte tendencia a ensamblarse con otros receptores HER en homodímeros y/o heterodímeros tras la unión al factor de crecimiento extracelular, lo que da lugar a diversas formas de activación de las vías de transducción de señales, dando lugar a apoptosis, supervivencia o proliferación celular.
Con respecto a los anticuerpos dirigidos contra el EGFR, se puede citar el anticuerpo monoclonal humanizado 425, también designado como matuzumab (hMAb 425, patente de EE. UU. n.° 5.558.864; documento EP 0531 472), el anticuerpo monoclonal quimérico 225 (cMAb 225), también denominado cetuximab (ERBITUX®; patente de EE. UU. n.° 7.060.808) y el anticuerpos anti-EGFR completamente humano panitumumb (VECTIBIX®; patente de EE. UUn.° 6.235.883). Entre ellos, se demostró que el cetuximab y el panitumumab inhiben los tumores colorrectales humanos in vivo y ambos recibieron una aprobación marcada.
Con respecto a los anticuerpos dirigidos contra Her2, se puede citar la versión humanizada recombinante del anticuerpo de ratón 4D5 (patente de EE. UU. n.° 5.677.171), designada como huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab o HERCEPTlN® (patente de EE. UU. n.° 5.821.337). Este anticuerpo recibió la autorización de comercialización en 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína ErbB2.
GD2 es un disialogangliósido expresado en tumores de origen neuroectodérmico, incluyendo el neuroblastoma y el melanoma.
Con respecto a los anticuerpos dirigidos contra GD2, se puede citar el anticuerpo monoclonal IgG3 murino 3F8, que se ha usado en el tratamiento del neuroblastoma, o el anticuerpo monoclonal IgG3 murino 8B6, que es específico de la forma O-acetilada de GD2 (solicitud de patente internacional PCT WO 2008/043777).
Preferentemente, el anticuerpo se dirige contra CD-20 (por ejemplo, rituximab divulgado en la patente de EE. UU. n.° 5.736.137), GD2-0-acetilado (por ejemplo, el divulgado en la solicitud de patente internacional PCT WO 2008/043777) o HER2 (por ejemplo, trastuzumab o HERCEPTIN ® divulgado en la patente de EE. UU. n.° 5.821.337).
Tanto el conjugado como el anticuerpo o fragmento del mismo se pueden unir covalentemente usando agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales o en una proteína de fusión.
Los procedimientos de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales son bien conocidos por los expertos y se han divulgado previamente. Como ejemplo, el experto puede usar el procedimiento divulgado en TILL et al. (Proc. Natl. Acad. U.S.A., vol.86(6), p:1987-91, 1989)
En un modo de realización preferente, la inmunocitocina es una proteína de fusión.
En otro modo de realización preferente, la inmunocitocina es un complejo, preferentemente un complejo que comprende un conjugado entre los polipéptidos i) y ii), en el que el polipéptido i) o ii) se fusiona con un anticuerpo o fragmento del mismo, en el que dicho fragmento del mismo puede reaccionando con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo.
El polipéptido i), el polipéptido ii) o el conjugado pueden estar en una posición C-terminal o N-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo, en el que dicho fragmento del mismo puede reaccionar con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo.
Preferentemente, el conjugado es una proteína de fusión y la secuencia de aminoácidos del conjugado está en una posición C-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o
fragmento del mismo, lo más preferentemente en una posición C-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos de al menos una de la región constante de cadena pesada del anticuerpo o fragmento del mismo, en el que dicho fragmento del mismo puede reaccionar con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo.
La secuencia de aminoácidos del conjugado y la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo pueden estar separadas o no por una segunda secuencia de aminoácidos "de conector".
En un modo de realización particular, la inmunocitocina de la invención es una proteína de fusión en la que el conjugado y el anticuerpo o fragmento del mismo no están separados por ningún conector, en la que dicho fragmento del mismo puede reaccionar con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo.
De hecho, los autores de la presente invención han establecido sorprendentemente que la inmunocitocina de la invención no necesita ningún conector entre las partes de inmunoglobulina y citocina para ser activa.
En cuanto a la primera secuencia de aminoácidos de conector, dicha segunda secuencia de aminoácidos "de conector" puede ser de una longitud suficiente para garantizar que la proteína de fusión forme estructuras secundarias y terciarias apropiadas.
La longitud de la primera secuencia de aminoácidos de conector puede variar sin afectar significativamente a la actividad biológica de la proteína de fusión. Típicamente, la primera secuencia de aminoácidos de conector comprende al menos uno, pero menos de 30 aminoácidos, por ejemplo, un conector de 2-30 aminoácidos, preferentemente de 10-30 aminoácidos, más preferentemente de 15-30 aminoácidos, lo más preferentemente de 15­ 25 aminoácidos.
En cuanto a la primera secuencia de aminoácidos de conector, la segunda secuencia de aminoácidos de conector más adecuada (1) adoptará una conformación extendida flexible, (2) no presentará propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que pueda interactuar con los dominios funcionales de proteínas de fusión, y (3) tendrá características hidrófoba o cargada mínimas que podrían promover la interacción con los dominios de proteínas funcionales.
Preferentemente, la segunda secuencia de aminoácidos de conector comprende un aminoácido casi neutro seleccionado en el grupo que comprende Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) y Gln (Q), lo más preferentemente en el grupo que comprende Gly (G), Asn (N) y Ser (S).
Como ejemplo de una segunda secuencia de aminoácidos de conector que es adecuada para la presente invención, se puede citar la secuencia SEQ ID NO: 16 (SGGGGSGGGGGGGGSGGGGSG) o AAGGGSGGGSGGGGGGGGSAA.
Ácidos nucleicos, vectores y células huésped recombinantes
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una inmunocitocina como se describe anteriormente, preferentemente una inmunocitocina correspondiente a una proteína de fusión.
Dicho ácido nucleico corresponde a ARN o ADN, preferentemente a ADN.
De acuerdo con un modo de realización preferente, el ácido nucleico que codifica la inmunocitocina de la invención se une de forma funcional a una secuencia de expresión génica, que dirige la expresión del ácido nucleico dentro de una célula procariota o eucariota, preferentemente dentro de una célula eucariota. La "secuencia de expresión génica" es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, tal como una secuencia de promotor o una combinación promotor-potenciador, que facilita la transcripción y traducción eficaz del ácido nucleico de la inmunocitocina al que está unido de forma funcional. La secuencia de expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero o vírico, tal como un promotor constitutivo o inducible.
Los promotores constitutivos de mamífero incluyen, pero no se limitan a, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPTR), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, promotor de beta.-actina, promotor de creatina cinasa muscular, promotor de factor de elongación humano y otros promotores constitutivos. Los promotores víricos ejemplares que funcionan de manera constitutiva en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores del virus símico (por ejemplo, SV40), virus del papiloma, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), citomegalovirus (CMV), virus del sarcoma de Rous (VSR), virus de la hepatitis B (VHB), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Otros promotores constitutivos son conocidos por los expertos en la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, la metalotiona en el promotor es inducida para promover la transcripción y la traducción en presencia de determinados iones metálicos. Otros promotores inducibles son conocidos por los expertos en la técnica.
En general, la secuencia de expresión génica incluirá, según sea necesario, secuencias en 5' no de transcripción y secuencias en 5' no de traducción implicadas con el inicio de la transcripción y la traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, secuencia de caperuza, secuencia CAAT y similares. Especialmente, dichas secuencias en 5' no de transcripción incluirán una región promotora que incluye una secuencia de promotor para el control transcripcional del ácido nucleico unido de forma funcional. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias de potenciador o secuencias de activador en dirección 5' según se des ee. Como se usa en el presente documento, se dice que la secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunocitocina de la invención y la secuencia de expresión génica estás "unidas de forma funcional" cuando están unidas covalentemente de tal manera que se coloca la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia codificante de la inmunocitocina. de la invención bajo la influencia o control de la secuencia de expresión génica.
Se dice que dos secuencias de ADN están unidas de forma funcional si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica en 5' da como resultado la transcripción de la inmunocitocina de la invención y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de marco de lectura, (2) interfiere en la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la inmunocitocina de la invención, o (3) interfiere en la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para su traducción en una proteína. Por tanto, una secuencia de expresión génica estaría unida de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunocitocina de la invención si la secuencia de expresión génica pudiera efectuar la transcripción de esa secuencia de ácido nucleico de modo que el transcrito resultante se traduzca en el polipéptido deseado. De forma ventajosa, dicha secuencia de ácido nucleico comprende un intrón, ya que a menudo se ha demostrado que las moléculas de preARNm mejoran los rendimientos de producción de moléculas recombinantes. Se puede seguir cualquier secuencia de intrón, y como ejemplo, se pueden citar las divulgadas en ZAGO et al. (Biotechnol. Appl. Biochem., vol.52(Pt 3), p:191-8, 2009) y en CAMPOS-DA-PAZ et al. (Mol. Biotechnol., vol.39(2), p: 155-8, 2008).
El ácido nucleico que codifica la inmunocitocina de la invención se puede administrar in vivo solo o en asociación con un vector.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico como se describe anteriormente.
En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo que puede facilitar la transferencia del ácido nucleico que codifica la inmunocitocina de la invención a las células. Preferentemente, el vector transporta el ácido nucleico a las células con una degradación reducida en relación con el grado de degradación que daría como resultado la ausencia del vector. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, fágmidos, episomas, cromosomas artificiales, virus, otros vehículos derivados de fuentes víricas o bacterianas que se han manipulados por la inserción o incorporación de las ecuencias de ácidos nucleicos de inmunocitocina.
Los vectores plasmídicos son un tipo preferente de vector y se han descrito ampliamente en la técnica y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, SAMBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Los ejemplos no limitantes de plásmidos incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 y pBlueScript, y otros plásmidos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Adicionalmente, los plásmidos se pueden diseñar a la medida usando enzimas de restricción y reacciones de ligado para eliminar y añadir fragmentos específicos de ADN.
Preferentemente, el vector de ácido nucleico puede incluir marcadores seleccionables que son activos tanto en bacterias como en células de mamífero.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped genomanipulada con el ácido nucleico o con el vector descrito previamente.
Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped genomanipulada" se refiere a células huésped que se han transducido, transformado o transfectado con el ácido nucleico o con el vector descrito previamente. Como ejemplos representativos de células huésped apropiadas, se pueden citar células bacterianas, tales como E. coli, células fúngicas tales como levaduras, células de insectos tales como Sf9, células de animales tales como CHO o COS, células de plantas, etc. La selección de un huésped apropiado se considera que está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento.
Preferentemente, la célula huésped genomanipulada es una célula de animal, y más preferentemente la célula CHO-S (INVITROGENO, n.° de cat. 11619-012).
Las células de ovario de hámster chino (CHO) se usan con frecuencia en la industria biofarmacéutica para la fabricación de productos biológicos tales como proteínas recombinantes, anticuerpos, pepticuerpos y ligandos de receptores. Una de las razones por las que las células CHO se usan a menudo es que estas células tienen un extenso historial de seguridad para la producción de productos biológicos. Se considera que esta es una línea celular bien caracterizada y, como resultado, las pruebas de seguridad requeridas pueden ser menos rigurosas en algunos aspectos (por ejemplo, seguridad retrovírica) que las requeridas para otros tipos de células. Sin embargo, la producción de interleucina 15 es muy difícil, especialmente en esta célula.
Sorprendentemente, los autores de la invención establecieron que las inmunocitocinas de la invención se producen bien en esta célula, teniendo además las inmunocitocinas obtenidas una muy buena pureza y actividad.
La introducción del ácido nucleico o del vector descrito previamente en la célula huésped se puede realizar mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica, tal como la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-Dextrano o la electroporación.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para producir una célula huésped genomanipulada que expresa una inmunocitocina de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico o un vector como se describe anteriormente en una célula huésped, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula huésped recombinante genomanipulada y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicha inmunocitocina. Dichas células huésped recombinantes se pueden usar para la producción de la inmunocitocina de la invención.
Composición farmacéutica que comprende la inmunocitocina de la invención
Un objetivo adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la inmunocitocina como se describe anteriormente, un ácido nucleico que codifica la misma, o un vector que comprende dicho ácido nucleico, finalmente asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente reacciones alérgicas o indeseables similares, tal como malestar gástrico, mareo y similares cuando se administran a un ser humano. Preferentemente, como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" signidica susceptible de aprobación por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, incluidos los seres humanos.
El término "vehículo" se refiere a un disolvente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de vaselina, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite vegetal, aceite de sésamo y similares.
La composición farmacéutica comprende una "cantidad eficaz" de la inmunocitocina de la invención, siendo cantidad eficaz suficiente para inhibir el crecimiento de células cancerosas, preferentemente suficiente para inducir la regresión del crecimiento del tumor. Las dosis utilizadas para la administración se pueden adaptar en función de diversos parámetros, en particular en función del modo de administración usado, de la patología pertinente o, de forma alternativa, de la duración deseada del tratamiento. Naturalmente, la forma de la composición farmacéutica, la ruta de administración, la dosis y el régimen dependen naturalmente de la afección que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del sujeto, etc. Los intervalos de dosis eficaces proporcionados a continuación no pretenden limitar la invención y representan intervalos de dosis preferentes. Sin embargo, la dosis preferente se puede adaptar al sujeto individual, como entienda y pueda determinarlo un experto en la técnica, sin experimentación excesiva.
En vista de la marcada eficacia de la inmunocitocina de la invención, el experto puede planear usar dosis muy pequeñas para tratar a un sujeto. Como un ejemplo no limitante, la inmunocitocina de la invención se puede administrare mediante inyección a una dosis de 2,5 mg/kg o 1 mg/kg de sujeto o menos, preferentemente a una dosis de 0,5 mg/kg o menos o 0,25 mg/kg o menos y lo más preferentemente a una dosis de 0,1 mg/kg o menos. Como ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para administraciones tópicas, orales, intranasales, intraoculares, intravenosas, intramusculares o subcutáneas y similares. Preferentemente, la composición farmacéutica contiene vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que se pretende inyectar. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables. Vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martín.
La inmunocitocina de la invención, los ácidos nucleicos que codifican la misma o los vectores de ácido nucleico se pueden solubilizar en un tampón o agua o incorporar en emulsiones, microemulsiones, hidrogeles (por ejemplo, hidrogeles basados en copolímeros de tribloques PLGA-PEG-PLGA), en microesferas, en nanoesferas, en micropartículas, en nanopartículas (por ejemplo, poli(ácido láctico-co-glicólico) micropartículas (por ejemplo, poli(ácido láctico) (PLA); poli(lactida-co-ácido glicólico) (PLGA); microesferas, nanoesferas, micropartículas o nanopartículas de poliglutamato), en liposomas u otras formulaciones galénicas. En todos los casos, la formulación debe ser estéril y fluida hasta el punto de tener una inyectabilidad aceptable. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa.
También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las inmunocitocinas de acuerdo con la invención se pueden formular en una composición en forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
El vehículo también puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Las inmunocitocinas de la invención también se pueden modificar, por pegilación como ejemplo, para aumentar su biodisponibilidad. Cuando la inmunocitocina de la invención tiene una forma de ácido nucleico, el vehículo también puede ser un vector, tal como un virus (por ejemplo, MVA, rAAV, lentivirus, etc.)
La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede ser conseguir mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, lo preferente será incluir agentes isotónicos, por ejemplo, sacáridos o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina, polioles, formulaciones covalentes y no covalentes que potencian la semivida.
Existen numerosas causas de inestabilidad o degradación de los péptidos, incluyendo la hidrólisis y la desnaturalización. La interacción hidrófoba puede causar la aglomeración de moléculas (es decir, agregación). Se pueden añadir estabilizantes para reducir o evitar dichos problemas.
Los estabilizantes incluyen ciclodextrina y derivados de la misma (véase la patente de EE. UU. n.° 5.730.969). También se pueden añadir conservantes adecuados tales como sacarosa, manitol, sorbitol, trehalosa, dextrano y glicerina para estabilizar la formulación final. Se puede añadir a la formulación un estabilizante seleccionado de tensioactivos iónicos y no iónicos, D-glucosa, D-galactosa, D-xilosa, ácido D-galacturónico, trehalosa, dextranos, almidones de hidroxietilo y mezclas de los mismos. La adición de sal de metal alcalino o cloruro de magnesio puede estabilizar un péptido. El péptido también se puede estabilizar poniéndolo en contacto con un sacárido seleccionado del grupo que consiste en dextrano, ácido sulfúrico de condroitina, almidón, glucógeno, dextrina y sal de ácido algínico. Otros sacáridos que se pueden añadir incluyen monosacáridos, disacáridos, alditoles y mezclas de los mismos (por ejemplo, glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, manitol, xilitol). Los polioles pueden estabilizar un péptido y son miscibles en agua o solubles en agua. Los polioles adecuados pueden ser alcoholes polihidroxilados, monosacáridos y disacáridos incluyendo manitol, glicol, etilenglicol, propilenglicol, trimetilglicol, vinilpirrolidona, glucosa, fructosa, arabinosa, manosa, maltosa, sacarosa y polímeros de los mismos. Diversos excipientes también pueden estabilizar péptidos, incluyendo seroalbúmina, aminoácidos, heparina, ácidos grasos y fosfolípidos, tensioactivos, metales, polioles, agentes reductores, agentes quelantes de metales, polivinilpirrolidona, gelatina hidrolizada y sulfato de amonio.
La promesa del tratamiento con citocinas se deriva de la identificación de estas novedosas citocinas, pero aún más fundamentalmente, el campo se beneficia enormemente de la cantidad cada vez mayor de datos preclínicos que demuestran de manera convincente efectos biológicos sinérgicos y/o novedosos, que se pueden lograr a través del uso de varias combinaciones de citocinas con capacidades inmunoestimulantes complementarias. Las posibles combinaciones de agentes activos terapéuticos con inmunocitocinas basadas en RLI incluyen, por ejemplo, agentes quimioterápicos, agentes antiangiogénicos o agentes inmunomoduladores.
En un modo de realización preferente, la composición de la invención puede comprender otro agente activo terapéutico, tal como agentes quimioterápicos, agentes antiangiogénicos o agentes inmunomoduladores.
Para los agentes quimioterápicos, se ha demostrado que sus efectos terapéuticos podrían estar mediados en parte por un efecto indirecto sobre las respuestas inmunitarias, ya sea induciendo una muerte celular inmunógena, equilibrando los entornos inmunosupresores, reduciendo el tamaño del gran tumor primario y facilitando a continuación el ataque inmunitario o induciendo una linfopenia transitoria seguida de linfoproliferación homeostática. Muchos de ellos son bien conocidos por los expertos y, y como ejemplo de agente quimioterápico que se puede combinar con la inmunocitocina de la invención, se pueden citar fludarabina, gemcitabina, capecitabina, metotrexato, taxol, taxotere, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, complejos de platino, tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, etopósido, tenipósido, campatecinas, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, L-asparaginasa, doxorubicina, epimbicina, 5-fluorouracilo, taxanos tales como docetaxel y paclitaxel, ácido folínico, levamisol, irinotecán, estramustina, etopósido, mostazas nitrogenadas, BCNU, nitrosoureas tales como carmustina y lomustina, alcaloides de la vinca tales como vincristina y vinorelbina, mesilato de imatinib, hexametilnelamina, topotecán, inhibidores de cinasas, inhibidores de fosfatasa, inhibidores de ATPasa, tirfostinas, inhibidores de la proteasa, inhibidores herbimicina A, genisteína, erbstatinas, y lavendustina A.
Para los agentes antiangiogénicos, se ha demostrado que tienen efectos colaterales en el sistema inmunitario y a continuación podrían facilitar las respuestas inmunitarias del tumor. Como ejemplo de agente antiangiogénico que se puede combinar con la inmunocitocina de la invención, se pueden citar fármacos dirigidos al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) por medio su tirosina cinasa, como sorafenib, sunitinib y pazopanib, o la dian de la rapamicina en mamíferos (mTOR), como temsirólimus y everólimus.
Para agentes inmunomoduladores que se pueden combinar con la inmunocitocina de la invención, se pueden citar citocinas (IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, iL l8, IL-21, GM-CSF, G-CSF, IFNa, ...), quimiocinas/citocinas antiangiogénicas (IP10, Mig, SDF-1, RANTES, ...), agonistas de TLR y anticuerpos inmunorreguladores (anti-CTLA4, anti-PDl, anti-TGFb, agonista anti-CD40, ...).
Procedimientos y usos terapéuticos
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se describe anteriormente para tratar el cáncer en un sujeto, preferentemente de una composición farmacéutica que comprende una inmunocitocina como se describe previamente.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" denota un mamífero, tal como un roedor, un felino, un cánido o un primate, y lo más preferentemente un ser humano.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a productos que contienen:
(i) una inmunocitocina como se describe anteriormente, una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma, o un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, y
(ii) un agente terapéutico, preferentemente un agente antineoplásico,
como una preparación combinada para su uso simultáneo para tratar un cáncer en un sujeto.
Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se describe anteriormente para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer en un sujeto.
En un aspecto final, la presente invención se refiere a (i) una inmunocitocina como se describe anteriormente, una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma, o un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, y (ii) un agente terapéutico, preferentemente un agente antineoplásico para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar simultáneamente, por separado o secuencialmente a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de (i) y (ii) definida anteriormente. En el contexto de la invención, el término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso o prevenir el trastorno o afección a la que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección. El término "tratar el cáncer" como se usa en el presente documento significa la inhibición del crecimiento de las células cancerosas. Preferentemente, tal tratamiento también da lugar a la regresión del crecimiento del tumor, es decir, la disminución del tamaño de un tumor mensurable. Lo más preferentemente, dicho tratamiento da lugar a la regresión completa del tumor.
A continuación, la invención se describe con más detalle con referencia a secuencias de aminoácidos, secuencias de ácidos nucleicos y ejemplos. Sin embargo, no se pretende ninguna limitación de la invención por los detalles de los ejemplos.
EJEMPLOS
1) Construcción de inmunocitocinas bsadas en la interleucina 15
Construcción de inmunocitocinas de anti-CD20 (rituximab) y anti-GD2-O-acetilado
Los plásmidos de expresión que codifican las cadenas ligeras de IgG quimérica anti-CD20 y las cadenas ligeras de IgG quimérica anti-GD2-0-acetilada fueron amablemente proporcionadas por el Dr. WATlER (Université Franqois-Rabelais de Tours, Francia) y el Dr. BIRKLE (INSERM, Université de Nantes, U892, Francia), respectivamente. Las secuencias de cadena pesada de IgG quimérica de cada anticuerpo se diseñaron p ara su fusión en el término 3' con o sin un conector de 22 aminoácidos (SEQ ID NO: 16) a IL15 (SEQ ID NO: 3, en el que el aminoácido en la posición 93 es K). Estas secuencias de nucleótidos fueron sintetizadas y clonadas en plásmidos pcDNA3.1 por GENEART. La secuencia completa de cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-GD2-0-acetilado (8B6) se divulga en la solicitud de patente EP 2.076.542 A1 y en CERATO et al. (Hybridoma, vol.16(4), p:307-16, 1997). La secuencia completa de cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-CD20 (2B8) se divulga en la patente US 5.736.137 (ANDERSON et al. as the antibody called "C2B8") y en REFF et al. (Blood, vol.83(2), p:435-45, 1994).
Preparación de ADN de plásmido y reactivo de transfección
Se obtuvo un PEI lineal de 40 kDa de POLYSCIENCE. Se preparó una solución madre de 1 mg/ml disolviendo el PEI en agua con calentamiento, neutralizando con NaOH y esterilizando por filtración a través de un filtro de 0,22 |jm. La solución madre se dividió en alícuotas y almacenó a -20 °C.
Los plásmidos de ADN para transfecciones se purificaron usando los kits de purificación de plásmidos siguiendo el protocolo del fabricante (MACHEREY-NAGEL) y esterilizando por filtración a través de un filtro de 0,22 jm.
Producción y purificación de las inmunocitocinas
1-Transfección transitoria en suspensión:
Se sembraron células CHO-S rutinariamente mantenidas (Invitrogen) a una densidad de 1 * 106 células/ml en medio PowerCHO2 (LONZA) y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una incubadora con agitación (100 rpm) con 5% de CO2. Para la transfección, se diluyeron a continuación las células a 2 * 106 células/ml en medio CD-CHO (INVITROGEN). Los complejos de transfección se prepararon en UN 10 % del volumen de cultivo usando NaCl 150 mM. Se mezclaron construcciones de expresión de ADN (2,5 mg/l de volumen de cultivo, usando una proporción 1:2 de plásmido que codifica cadena pesada con respecto plásmido que codifica cadena ligera) con PEI diluido en NaCl (10 mg/l de volumen de cultivo final) y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente antes de añadir al cultivo. Se cultivaron células en una incubadora con agitación (130 rpm) a 37 °C durante 5 h antes de duplicar el volumen de cultivo con medio PowerCHO2. El sobrenadante se recogió 5 días después de la transfección.
2- Transfección estable sobre células adherentes
Se cultivaron células CHO-K1 (ATCC n.° CCL-61) en DMEM complementado con 1-glutamina, FCS al 10 % y penicilina (100 unidades/ml)/estreptomicina (100 pg/ml) y se transfectaron con cada vector usando un reactivo de lipofectamina 2000 (INVITROGEN), según lo recomendado por el fabricante. Seleccionaron clones por dilución límite con medio que contenía geneticina e higromicina (0,5 mg/ml) o blasticina e higromicina (5 pg/ml y 100 pg/ml) para el ICK anti-GD2-0-aceilado y el ICK anti-CD20, respectivamente. El sobrenadante de cultivo de cada clon se analizó para determinar la producción de proteínas bifuncionales mediante ELISA. Para la producción de ICK, se amplificaron clones seleccionados en medio DMEM al 25 % y medio AIM al 75 % (INVITROGEN). Las células se mantuvieron a continuación en un 100 % de AIM, y el sobrenadante se recogió y reemplazó cada 2 días, durante 10 días.
3- Purificación del sobrenadante:
El sobrenadante recogido se centrifugó a 3000 rpm durante 20 minutos a 4 °C, se equilibró a pH 7,8 con NaOH y se filtró a través de un filtro de 0,22 pm. Los medios acondicionados se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando una columna de proteína A (GE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas purificadas se concentraron con unidades AMICON de 50 kDa (MILLIPORE). Durante esta etapa, el tampón de elución fue reemplazado por PBS. Las proteínas purificadas se analizaron finalmente mediante ELISA y se midió la absorbancia a 280 nm. La pureza se evaluó por electroforesis.
4- Detección del resto de inmunoglobulina mediante ELISA.
Se recubrió una placa de microtitulación de fondo plano Maxisorp (NUNC) con 100 pl de anticuerpo de cabra contra globulinas humanas (UP892370, INTERCHIM) diluido en PBS a 1,5 pg/ml durante 4 horas a 4 °C. La placa se bloqueó a continuación con 200 pl de tampón de bloqueo (BSA al 1 % TWEEN 20 al 0,1 % en PBS) durante 1 hora a 37 °C. A continuación, la placa se lavó 3 veces con tampón de lavado (TWEEN 20 al 0,1 % en PBS) y la muestra diluida en tampón de bloqueo se añadió y se incubó 30 min a 37 °C (100 pl). Después de 3 lavados, se añadió anticuerpo de cabra contra IgG1 humana conjugado con peroxidasa (109-036-003, JACKSON) diluido 1:10000 y se incubó durante 30 min a 37 °C. Se usó sustrato TMB (INTERCHIM) para determinar los niveles de proteína y se leyeron las placas a 450 nm. Se usó rituximab purificado (ROCHE) para generar una curva de calibración en la placa.
5- Detección del resto de citocinas por ELISA.
Se recubrió una placa de microtitulación de fondo plano Maxisorp (NUNC) con 100 pl de anti-IL15 B-E29 (DIACLONE) diluido en tampón de carbonato a 2 pg/ml durante 16 horas a 4 °C. La placa se bloqueó a continuación con 200 pl de tampón de bloqueo (BSA al 1 % en PBS) durante 1 h a 37 °C. La placa se lavó a continuación 3 veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05 % en PBS). Se añadió la muestra diluida en TBS BSA al 0,05 % y se incubó 1 h 30 min a 37 °C (100 pl). Después de 3 lavados, se añadió el anticuerpo anti-IL15 biotinilado BAM 247 (R&D SYSTEM) diluido a 200 ng/ml y se incubó durante 1 h 30 min a 37 °C. La placa se lavó 3 veces y se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa en una dilución 1:1000. Se usó sustrato TMB (INTERCHIM) para determinar los niveles de proteína y se leyeron las placas a 450 nm. Se usó IL-15 (PEPROTECH) para generar una curva de calibración en la placa.
Los resultados han demostrado que la preparación obtenida de inmunocitocinas comprende muchos contaminantes proteicos (es decir, iguales o superiores a un 25 %). Para reducir estas contaminaciones con proteínas, las dos inmunocitocinas de anti-GD2-0 -acetilado/interleucina 15 se han sometido a otra ronda de purificación de proteína A sefarosa.
Después de esta segunda ronda de purificación de proteína A sefarosa, la pureza de ICK c8B6-l22-IL15 y c8B6-IL15 fue, respectivamente, de un 70 y un 90 %.
Actividad de proliferación de las inmunocitocinas
Se sometió a prueba la actividad de proliferación de interleucina-15 de las inmunocitocinas obtenidas. Las respuestas proliferativas de las células Kit 225 y 32Dp a ICK se midieron mediante la incorporación de [3H] timidina. Las células se mantuvieron en medio de cultivo durante 3 días, se lavaron dos veces y se las privó de nutrientes en medio sin citocina durante 24 h o 4 h para Kit 225 and 32Dp, respectivamente. A continuación, se sembraron en placas de múltiples pocillos a 104 células/pocillo en 100 pl y se cultivaron durante 48 h en medio complementado con una concentración creciente de muestra. Se usaron rIL-15 y RLI humanos como calibrador. Las células se pulsaron durante 16 h con 0,5 pCi/pocillo de [3H] timidina, se recogieron en filtros de fibra de vidrio y se midió la radioactividad asociada a las células.
La figura 1 muestra la incorporación de [3H] timidina por células Kit 225 y 32Dp cultivadas con concentraciones crecientes de rIL-15 (■), c8B6-IL15 (A) y c8B6-122-IL15 ( o ).
La figura 2 muestra la incorporación de [3H] timidina por células Kit 225 y 32Dp cultivadas con concentraciones crecientes de rIL-15 y c2B8-122-IL15 ( o ).
Los resultados muestran que la actividad biológica de IL-15 disminuye drásticamente en el contexto de la inmunocitocina, lo que significa que la conjugación de la IL-15 con el anticuerpo monoclonal induce una pérdida de actividad. Además, esta pérdida es más importante en ausencia de conector entre los dos restos. Cabe señalar que esta pérdida de actividad es más pronunciada en el contexto Py.
Actividad de unión de las inmunocitocinas
La unión específica de ICK de anti-CD20 y anti-GD2-O-acetilado se evaluó mediante citometría de flujo en las células de tumores Raji e IMR32, respectivamente. La capacidad de ICK para unirse al receptor de IL-15 en células efectoras se sometió a prueba en Kit225. Las ICK recubiertas en células seleccionadas se revelaron con un mAb de cabra contra IgG humanas conjugado con PE (PN IM0550, BECKMAN COULTER), o con un anticuerpo anti-IL15 de ratón biotinilado (BAM247, R&D SYSTEM) acoplado a PE-estreptavidina (SIGMA-ALDRICH). Se incubaron células seleccionadas (1 * 105) con cada ICK durante 1 h a 4 °C, se lavaron y a continuación se incubaron con un conjugado de PE durante 1 h a 4 °C. Las células lavadas se analizaron finalmente en un FACSCALIBUR (BECTON DICKINSON).
La figura 3 muestra la evaluación por citometría de flujo de ICK de anti-CD20 (c2B8-l22-IL15) y anti-GD2-0-acetilado (c8B6-IL15 y c8B6-l22-IL15) en células Raji que expresan CD20 y células IMR32 que expresan GD2-0-acetilado. Las células se incubaron primero con ICK, a continuación con un mAb de cabra contra IgG humanas conjugado con PE para anti-CD20 o con anti-IL15 biotinilado conjugado con PE estreptavidina para anti-CD20 y anti-GD2, respectivamente. Finalmente, la muestra fue analizada en un FACSCALIBUR. Las ICK se compararon en células Raji con el Mab anti-CD20 Rituximab (MABTHERA, ROCHE).
La figura 4 muestra la evaluación por citometría de flujo de ICK de anti-CD20 (c2B8-122-IL15) y anti-GD2-0-acetilado (c8B6-IL15 y c8B6-l22-IL15) en células Kit 225 que expresan IL15R. Las células se incubaron primero con ICK, a continuación con un mAb de cabra contra IgG humanas conjugado con PE. Finalmente, la muestra fue analizada en un FACSCALIBUR. Las ICK se compararon con el Mab anti-CD20 rituximab (MABTHERA, ROCHE). Los resultados muestran que las diferentes inmunocitocinas se unen al receptor de IL-15 y también a su respectiva diana de antígeno tumoral.
Por tanto, la pérdida de actividad de la interleucina 15 en estas inmunocitocinas no es el resultado de una pérdida de la unión de la interleucina 15 en su receptor específico. No obstante, parece que esta unión existente no permite inducir una proliferación celular normal
Construcción de inmunocitocinas basadas en RLI
Construcción de inmunocitocinas de RLI con anti-CD20 y anti-GD2-O-acetilado
Las inmunocitocinas de anti-CD20 y anti-GD2-0-acetilado se construyeron como previamente, excepto que la secuencia de IL15 de Homo sapiens se reemplazó por la secuencia RLI2 (SEQ ID NO: 17).
Producción y purificación de las inmunocitocinas
La producción y purificación de las inmunocitocinas se realizó tal como se divulgó previamente, excepto que estas inmunocitocinas se obtuvieron con buenos rendimientos y buena pureza (es decir, mayor de un 90 %) después de solo una ronda de purificación de proteína A sefarosa.
Actividad de unión de las inmunocitocinas
La unión específica de ICK RLI y anti-CD20 y anti-GD2-O-acetilado se evaluó mediante citometría de flujo en las células tumorales Raji, WM266.4 e IMR32. La capacidad de ICK RLI para unirse al receptor de IL-15 en células efectoras se sometió a prueba en Kit225. Las ICK RLI recubiertas en células seleccionadas se revelaron con un mAb de cabra contra IgG humanas conjugado con PE (PN IM0550, BECKMAN COULTER), o con un anticuerpo anti-IL15 de ratón biotinilado (BAM247, R&D SYSTEM) acoplado a PE-estreptavidina (SiGmA-ALDRICH). Se incubaron células seleccionadas (1 * 105) con cada ICK durante 1 h a 4 °C, se lavaron y a continuación se incubaron con un conjugado de PE durante 1 h a 4 °C. Las células lavadas se analizaron finalmente en un FACSCALIBUR (BECTON DICKINSON).
La figura 5 muestra la evaluación por citometría de flujo de ICK c2B8-RLI, c8B6-RLI y c8B6-122-RLI en células Raji que expresan CD20 y células WM266.4 e IMR32 que expresan GD2-0-acetilado. Las células se incubaron primero con ICK RLI, a continuación con un mAb de cabra contra IgG humanas conjugado con PE para anti-CD20 o con anti-IL15 biotinilado conjugado con PE estreptavidina para anti-CD20 y anti-GD2-0-acetilado, respectivamente. Finalmente, las muestras fueron analizadas en un FACSCALIBUR. Las iCk RLI se compararon en células Raji con el Mab anti-CD20 Rituximab (MABTHERA, ROCHE).
La figura 6 muestra la evaluación por citometría de flujo de ICK RLI de anti-CD20 (c2B8-RLI) y anti-GD2-0-acetilado (c8B6-RLI y c8B6-122-RLI) en células Kit 225 que expresan IL15Ra. Las células se incubaron primero con ICK RLI, a continuación con un mAb de cabra contra IgG humanas conjugado con PE. Finalmente, la muestra fue analizada en un FACSCALIBUR.
Los resultados muestran que las inmunocitocinas de la invención se unen al receptor de IL-15 y también a su respectiva diana de antígeno tumoral.
Actividad de proliferación de las inmunocitocinas
Se sometió a prueba la actividad de proliferación de interleucina-15 de las inmunocitocinas recién obtenidas.
La figura 7 muestra la incorporación de [3H] timidina por células Kit 225 y 32DP cultivadas con concentraciones crecientes de RLI (■), rIL-15 (♦) c8B6-RLI (A) y c8B6-122-RLI (o ).
La figura 8 muestra la incorporación de [3 H] timidina por células 32Dp cultivadas con concentraciones crecientes de RLI (■), rIL-15 (♦) y c2B8-RLI (A).
Los resultados muestran que la actividad biológica de la IL-15 se conserva en el contexto de las inmunocitocinas derivadas de RLI a pesar de las inmunocitocinas de IL15, lo que significa que la conjugación de RLI con un anticuerpo monoclonal permite sorprendentemente la conservación de esta actividad de la IL-15. Además, este efecto intrigante no requiere ningún segundo conector entre RLI y el anticuerpo monoclonal. Sorprendentemente, cabe destacar que las inmunocitocinas derivadas de RLI presentan un aumento significativo de la actividad biológica en comparación con la IL-15 libre en el contexto de Py (un aumento de aproximadamente 10 a 100 veces).
Capacidad antitumoral de la inmunocitocina de anti-GD2-O-acetilado
La línea celular de neuroblatomas NXS2 murinos se propagó en DMEM (FCS al 10 %) en condiciones estándar de cultivo tisular (37 °C, 5 % de CO2). La línea celular NXS2 NB que expresa g D2-0-Ac fue desarrollada y caracterizada por LODE et al. (J. Natl. Cancer Inst., vol.89(21), p: 1586-94, 1997).
Se adquirieron ratones A/JOlaHsd, de 8 semanas de edad, de los laboratorios HARLAN. Los ratones se alojaron en la instalación de animales de Inserm U892, que está aprobada por la Asociación Francesa para la Acreditación de Laboratorios de Cuidado Animal y se mantiene de acuerdo con las normas y estándares del Instituto Inserm y el Departamento de Agricultura de Francia.
Se indujeron metástasis hepáticas experimentales mediante una inyección en la vena de la cola de 1 * 105 células tumorales NXS2 NB en 200 pl de DMEM (pH 7,4). El tratamiento se inició un día después de la inoculación de células tumorales y consistió en 4 inyecciones i.p. de 80 pmol de c8B6-RLI2 o c8B6 en los días 1, 4, 7 y 11. Los ratones se sacrificaron 25 días después del injerto y se evaluó la carga del tumor hepático por el peso del hígado húmedo.
La figura 9 muestra la eficacia de c8B6-RLI2 en la metástasis hepática NXS2. c8B6 (12 pg) o c8B6-RLI (16 pg) se administró i.p. los días 1, 4, 7 y 11. Izquierda: El gráfico representa la media de cada grupo (n = 5); barras, EMM. Derecha: imágenes representativas del hígado, las flechas indican alguna metástasis.
Los resultados muestran que los ratones que han recibido ICK permanecen libres de metástasis hepáticas. Por tanto, y a diferencia de c8B6, ICK puede erradicar el desarrollo de metástasis hepáticas NXS2, lo que significa que la conjugación de RLI con un anticuerpo monoclonal mejora espectacularmente sus capacidades antitumorales. Capacidad antitumoral de anti-CD20-RLI2 en el modelo Raji:
Los linfocitos B Raji humanos se cultivaron en medio RPMI1640 complementado con suero de ternera fetal al 10 %, 1-glutamina 2 mM.
Se adquirieron ratones SCID CB-17, de 8 semanas de edad, en los laboratorios de cría CHARLES RIVER. Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en una instalación separada usando jaulas esterilizadas en autoclave de unidades de microaislamiento y se alimentaron con alimentos sólidos irradiados y agua esterilizada.
Para la inoculación, se recogieron células Raji en su fase logarítmica, se lavaron y se resuspendieron a 2,5 x 106 células/0,1 ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de inyectarlas por vía intravenosa en los ratones, seguido de un tratamiento i.p. con inmunocitocinas 3 veces a la semana (comenzando el día 5) durante 3 semanas después de la implantación. Los ratones recibieron tratamiento en cantidad equimolar, excepto por los grupos de "inmunocitocina" y "rituximab RLI", que recibieron la mitad de la dosis. Los ratones se monitorizaron diariamente para detectar la presencia de parálisis de la pata trasera y, en ese caso, se sacrificaron y se puntuaron como muertos.
La figura 10 muestra el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones CB17 SCID a los que se inyectó i.v. células Raji (n = 5) y se trató en J5-J7-J9; J12-J14-J16; J19-J21-J23 con PBS (■); RLI (Á;2 pg); rituximab (+; 12pg); rituximab + RLI (•; 6 pg + 1 pg), anti-CD20-RLI (▼; 8 pg).
Los resultados muestran que el porcentaje de supervivencia obtenido en los ratones Raji tratados con RLI o con rituximab fue similar y extendió la supervivencia en un 50 % de los ratones portadores de tumores de 20 a 27 días y a 28 días, respectivamente, respecto al control de PBS.
Los resultados muestran un aumento adicional en un 50 % del porcentaje de supervivencia de los ratones portadores de tumores para el grupo de "Rituximab RLI", cuyo aumento es significativamente diferente del obtenido en el grupo de RLI (p <0,01 o menos).
Finalmente, y sorprendentemente, los resultados muestran que el tratamiento con inmunocitocina de anti-CD20 anula totalmente el desarrollo del tumor sin muerte del ratón al final del experimento (día 50).
3) Construcción de inmunocitocinas adicionales
Construcción de inmunocitocinas de anti-HER2Neu (IgG de longitud completa y ScFv) y RLI e IL15
El Dr. DONDA (Instituto de Bioquímica de Lausana, Suiza) proporcionó amablemente la codificación de la secuencia de cadenas ligeras de anti-HER2 IgD 4D5, cadenas pesadas de anti-HER2 IgG 4D5 y scFv anti-HER2. Las inmunocitocinas de anti-HER2Neu con IL15 y RLI se construyeron como anteriormente en base a las cadenas ligeras de anti-HER2Neu (SEQ ID NO: 18) y pesadas (SEQ ID NO: 19) del anticuerpo anti-HER2Neu. Para estas construcciones, la secuencia que codifica la secuencia líder de la microglobulina beta2 en el marco con la secuencia que codifica las secuencias de cadenas pesadas de IgG quiméricas se diseñó para su fusión en el término 3' con o sin un conector de 22 aminoácidos (SEQ ID NO: 16) a IL15 (SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente) y a RLI (SEQ ID NO: 22 y 23, respectivamente).
Se diseñaron y produjeron construcciones correspondientes a la secuencia que codifica la secuencia líder de la microglobulina beta2 en el marco con la secuencia que codifica el fragmento ScFv anti-HER2Neu fusionado en el término 3' con o sin un enlazador de 22 aminoácidos a IL15 (SEQ ID NO: 24 y 25, respectivamente) y a RLI (SEQ ID NO: 26 y 27, respectivamente). Estas secuencias de nucleótidos se sintetizaron por GENEART y se subclonaron en plásmidos pCR3 (INVITROGEN)
Se sometieron a prueba las actividades biológicas y de unión de estos compuestos.
Construcción de inmunocitocinas basadas en interleucina 15
Preparación de ADN de plásmido y reactivo de transfección
Se obtuvo un PEI lineal de 40 kDa de POLYSCIENCE. Se preparó una solución madre de 1 mg/ml disolviendo el PEI en agua con calentamiento, neutralizando con NaOH y esterilizando por filtración a través de un filtro de 0,22 |jm. La solución madre se dividió en alícuotas y almacenó a -20 °C.
Los plásmidos de ADN para transfecciones se purificaron usando los kits de purificación de plásmidos siguiendo el protocolo del fabricante (MACHEREY-NAGEL) y esterilizando por filtración a través de un filtro de 0,22 jm.
Producción y purificación de las inmunocitocinas
1- Transfección transitoria:
Se sembraron células HEK293T, proporcionada amablemente por el Dr. SCHNEIDER (Instituto de Bioquímica de Lausanna, Suiza) en un matraz T175 cm2 en DMEM-Glutamax SVF al 10 % a 37 °C y 5 % de CO2. El día de la transfección, un complejo de plásmido de ADN y PEI se prepararon en NaCl 150 mM estéril. El ADN plasmídico diluido en NaCI (1,25 mg/l de volumen de cultivo) se mezcló con PEI diluido en NaCI (12,5 mg/l de volumen de cultivo) y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente antes de añadirlo al cultivo celular. Para la inmunocitocina anti-HER2 IgG-RLI o -IL15 se usó una proporción de plásmido de ADN 1: 2 (cadena pesada:ligera). Las células se cultivaron a 37 °C durante 4 h. Después de este tiempo, se retiró el medio y se añadió DMEN fresco sin SVF. El sobrenadante se recogió 5 días después de la transfección.
2- Purificación del sobrenadante:
El sobrenadante recogido se centrifugó primero a 1000 rpm durante 5 minutos y luego a 3000 rpm durante 15 minutos a 4 °C, se ajustó a fosfato de sodio 20 mM pH 8-9 según lo recomendado por el fabricante y se filtró a través de un filtro de 0,22 |jm. El medio acondicionado se purificó por cromatografía de afinidad usando una columna de proteína A (GE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas purificadas se concentraron con unidades a MicOn de 50 kDa (MILLIPORE) para IgG-ICK o 10 kDa para scFv-ICK. Durante esta etapa, el tampón de elución fue reemplazado por PBS. Las proteínas purificadas se analizaron finalmente mediante ELISA y se midió la absorbancia a 280 nm. La pureza se evaluó por electroforesis.
Actividad de unión de las inmunocitocinas
La unión específica de anti-HER2 IgG-ICK o scFv-ICK se evaluó mediante citometría de flujo en las células positivas para HER2 SK-BR-3 usando un anticuerpo anti-IL15. La capacidad de ICK para unirse al receptor de IL-15 en células efectoras se sometió a prueba en Kit225. Las ICK recubiertas en células específicas se revelaron con un mAb de cabra contra IgG murina conjugado con FITC (SIGMA-ANDRICH) o con un anticuerpo anti-IL15 de ratón conjugado con FITC (R&D SYSTEM). Se incubaron células seleccionadas (1 * 105) con cada ICK durante 1 h a 4 °C, se lavaron y a continuación se incubaron con un conjugado de FITC durante 1 h a 4 °C. Las células lavadas se analizaron finalmente en un FACSCALIBUR (BECTON DICKINSON).
La figura 3 muestra la evaluación por citometría de flujo de anti-HER2 (trastuzumab-IL15 y trastuzumab-122-IL15) en células SKBR3 que expresan HER2.
La figura 5 muestra la evaluación por citometría de flujo de ICK Trastuzumab-RLI en células SKBR3 que expresan HER2. La ICK de anti-HER2 se comparó en células SKBR3 con el trastuzumab (Herceptin®, Genentech)
Los resultados han demostrado la capacidad de la ICK trastuzumab-RLI para recubrir líneas de células tumorales que expresan el TAA relevante.
Actividad de proliferación de las inmunocitocinas
La actividad de proliferación de interleucina-15 de la fusión de los fragmentos de IL-15 y trastuzumab o fragmentos scFv anti-HER2 se sometió a prueba en células Kit 225 y 32Dp midiendo la incorporación de [3H] timidina de acuerdo con el procedimiento descrito previamente.
La figura 11 muestra la incorporación de [3 H] timidina por células Kit 225 y 32Dp cultivadas con concentraciones crecientes de trastuzumab-122-IL-15 ( o ), trastuzumab-IL-15 (△ ) y rIL-15 (■).
La figura 12 muestra la incorporación de [3 H] timidina por células Kit 225 y 32Dp cultivadas con concentraciones crecientes de trastuzumab-RLI (△ ), RLI (■) y rIL-15 (♦).
Los resultados muestran que la actividad biológica de IL-15 disminuye drásticamente en las células apY en el contexto de la inmunocitocina, lo que significa que la conjugación de IL-15 con el anticuerpo monoclonal induce una pérdida de actividad. Además, esta pérdida es más importante en ausencia de conector entre los dos restos. En las células Py, la conjugación anula completamente la actividad biológica de IL-15 con o sin conector.
En el contexto de las inmunocitocinas derivadas de RLI a pesar de las inmunocitocinas de IL15, los resultados muestran que la actividad biológica de IL-15 se conserva, lo que significa que la conjugación de RLI con un anticuerpo monoclonal permite sorprendentemente la conservación de esta actividad de IL-15. Además, este efecto intrigante no requiere ningún segundo conector entre RLI y el anticuerpo monoclonal.
Todavía sorprendentemente, los resultados muestran que las inmunocitocinas de trastuzumab derivadas de RLI presentan aumento significativo de la actividad biológica en comparación con la IL-15 libre en el contexto de Py (un aumento de aproximadamente 10 a 100 veces).
Los resultados han demostrado además que, en el contexto de las inmunocitocinas de scFv derivadas de RLI a pesar de las inmunocitocinas de IL15, la actividad biológica de IL-15 también se conserva, lo que significa que la conjugación de RLI con un fragmento scFv permite sorprendentemente la conservación de esta actividad de IL-15 (datos no mostrados). De nuevo, este efecto intrigante no requiere ningún segundo conector entre RLI y el fragmento scFv (datos no mostrados).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una inmunocitocina que comprende:
a) un conjugado, y
b) un anticuerpo o un fragmento del mismo unido directa o indirectamente por covalencia a dicho conjugado, en el que dicho fragmento del mismo puede reaccionar con el mismo antígeno que su anticuerpo homólogo, en la que dicho conjugado comprende:
(i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15, y
(ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de la IL-15Ra, en la que el conjugado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
2. La inmunocitocina de la reivindicación 1, en la que
a) los polipéptidos i) y ii) del conjugado se unen covalentemente en una proteína de fusión; y
b) dicho conjugado y el anticuerpo o fragmento del mismo se unen covalentemente en una proteína de fusión.
3. La inmunocitocina de la reivindicación 2, en la que la secuencia de aminoácidos del conjugado y la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo no están separadas por ninguna secuencia de aminoácidos de conector.
4. La inmunocitocina de la reivindicación 2, en la que la secuencia de aminoácidos del conjugado y la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo no están separadas por una segunda secuencia de aminoácidos de conector.
5. La inmunocitocina de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que el anticuerpo o fragmento del mismo se dirige contra un antígeno seleccionado en el grupo que comprende antígenos relacionados con neovascularización tumoral o con matriz extracelular de tumor y antígenos tumorales.
6. La inmunocitocina de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que la secuencia de aminoácidos del conjugado está en una posición C-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo.
7. Un ácido nucleico que codifica una inmunocitocina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un vector que comprende un ácido nucleico como se define en la reivindicación 7.
9. Una célula huésped genomanipulada con el ácido nucleico de la reivindicación 7 o con el vector de la reivindicación 8, preferentemente dicha célula huésped es una célula de animal y más preferentemente una célula CHO.
10. Una composición farmacéutica que comprende la inmunocitocina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ácido nucleico de la reivindicación 7, o el vector de la reivindicación 8, finalmente asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que dicha composición farmacéutica es para tratar el cáncer en un sujeto, preferentemente mediante una administración mediante inyección a una dosis de 2,5 mg/kg de sujeto o menos.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 y un agente antineoplásico como una preparación combinada para uso simultáneo para tratar un cáncer en un sujeto.
13. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer en un sujeto.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 y un agente antineoplásico para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento simultáneamente, por separado o secuencialmente administrar dicha composición farmacéutica y dicho agente antineoplásico a dicho sujeto.
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