KR20200127207A - Il-15 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20200127207A
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isolated
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KR1020207027445A
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카롤리나 이. 카파로
제로드 프타신
마르코스 밀라
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신톡스, 인크.
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Abstract

인터류킨(IL) 15 접합체 및 하나 이상의 적응증의 치료에서의 용도가 본원에 개시된다. 하나 이상의 IL-15 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 키트는 본원에 또한 기재된다.

Description

IL-15 접합체 및 이의 용도
상호 참조
본원은 2018년 2월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/635,133호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
구별되는 T 세포 집단은 면역계가 면역 항상성 및 관용을 유지하도록 조절한다. 예를 들어, 조절 T(Treg) 세포는 병리학적 자가 반응성을 방지함으로써 면역계에 의한 부적절한 반응을 방지하는 한편, 세포독성 T 세포는 감염된 세포 및/또는 암성 세포를 표적화하고 파괴한다. 일부 구현예에서, 상이한 T 세포 집단의 조절은 질환 또는 적응증의 치료에 대한 옵션을 제공한다.
소정의 구현예에서, IL-15 접합체 및 암의 치료에서의 용도가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 특이적 T 세포 집단을 자극하거나 팽창시키도록 IL-15와 IL-15 수용체 사이의 상호작용을 조절하는 방법이 본원에 또한 기재된다. 추가의 경우에, 하나 이상의 본원에 기재된 IL-15 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 본원에 추가로 기재된다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드가 본원에 개시되고, 여기서 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 15 수용체 α(IL-15R α)의 결합 친화도를 선택적으로 감소시키는 잔기 위치에 있고, 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15Rα 사이의 결합 친화도에 대비되고, 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 2/인터류킨 15 수용체 βγ(IL-2/IL-15R βγ)의 상호작용은 상당히 영향을 받지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93; Y26, E46, V49, E53 및 L25; A23, T24, E89 및 E93; D22, L44, Q48 및 E90; L25, E53, N77 및 S83; 또는 L25 및 E53으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E89, E53, E93, V49, E46, Y26, L25, T24, A23, D22, I21 및 L52로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20 및 S83으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46, V49, E53 및 T24로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V49, E53 및 T24로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46 및 Y26으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46이고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Y26이고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V49이고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E53이고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 T24이고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N4, K11, N65, L69, S18, H20 및 S83으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O- 4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 또는 N6-(2-아지도에톡시)-카보닐-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 도 2c에 도시된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해 변형된 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합; 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG는 선형 PEG 또는 분지된 PEG이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알우론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 포화 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 포화 지방산은 헥사데칸산, 테트라데칸산 또는 15-아지도펜타데칸산을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민, 트랜스페린, 트랜스티레틴 또는 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 XTEN 펩타이드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩타이드, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP), CTP 펩타이드 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 변형된 IL-15의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 직접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-15의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 동종이작용성 링커는 Lomant 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(설포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 디숙신이미딜 수버레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수버레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포숙신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-(3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠과 같은 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐설폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디요오도-p-자일렌 설폰산, N,N'-에틸렌-비스(요오도아세트아미드) 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(요오도아세트아미드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 이종이작용성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이작용성 링커는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(설포-MB), N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 설포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)설포숙신이미드 에스테르(설포-GMB), 숙신이미딜 6-((요오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((요오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-(((((4-요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 요오도아세테이트(NPIA), 카보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 가교결합제, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NO), 설포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-설포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(설포-sADP), 설포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(설포-sAPB), 설포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 설포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(설포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(요오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-요오도아세트아미드, ρ-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA) 또는 ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩타이드 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 디펩타이드 링커는 Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala 또는 Val-Lys를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 말레이미드기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 p-아미노벤질 알콜(PAB), p-아미노벤지옥시카보닐(PABC), 이의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 변형된 IL-15 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 연장할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 감소이다. 일부 구현예에서, IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 전장 IL-15 폴리펩타이드의 기능적 활성 단편이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 재조합 IL-15 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 재조합 인간 IL-15 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 감소를 갖는 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 효과기 T(Teff) 세포 및 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드가 본원에 개시되고, 여기서 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 15 수용체 α(IL-15R α) 또는 IL-2/인터류킨 15 수용체 βγ(IL-2/IL-15R βγ)의 결합 친화도에 상당히 영향을 미치지 않는 잔기 위치에 있다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 연장된 반감기를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93; Y26, E46, V49, E53 및 L25; A23, T24, E89 및 E93; D22, L44, Q48 및 E90; L25, E53, N77 및 S83; 또는 L25 및 E53으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 M1, S18, H20, K36, K41, G55, D56, S75, S76, N77, G78, V80, T81, S83 및 K86로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O- 4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 또는 N6-(2-아지도에톡시)-카보닐-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 도 2c에 도시된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해 변형된 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합; 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG는 선형 PEG 또는 분지된 PEG이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알우론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 포화 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 포화 지방산은 헥사데칸산, 테트라데칸산 또는 15-아지도펜타데칸산을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민, 트랜스페린, 트랜스티레틴 또는 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 XTEN 펩타이드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩타이드, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP), CTP 펩타이드 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 변형된 IL-15의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 직접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-15의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 동종이작용성 링커는 Lomant 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(설포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 디숙신이미딜 수버레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수버레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포숙신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-(3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠과 같은 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐설폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디요오도-p-자일렌 설폰산, N,N'-에틸렌-비스(요오도아세트아미드) 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(요오도아세트아미드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 이종이작용성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이작용성 링커는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(설포-MB), N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 설포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)설포숙신이미드 에스테르(설포-GMB), 숙신이미딜 6-((요오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((요오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-(((((4-요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 요오도아세테이트(NPIA), 카보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 가교결합제, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NO), 설포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-설포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(설포-sADP), 설포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(설포-sAPB), 설포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 설포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(설포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(요오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-요오도아세트아미드, ρ-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA) 또는 ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩타이드 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 디펩타이드 링커는 Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala 또는 Val-Lys를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 말레이미드기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 p-아미노벤질 알콜(PAB), p-아미노벤지옥시카보닐(PABC), 이의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 전장 IL-15 폴리펩타이드의 기능적 활성 단편이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 재조합 IL-15 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 재조합 인간 IL-15 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 감소를 갖는 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 효과기 T(Teff) 세포 및 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드가 본원에 개시되고, 여기서 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 2/인터류킨 15 수용체 β(IL-2/IL-15R β)와의 결합 친화도를 선택적으로 감소시키지만, 인터류킨 15 수용체 α(IL-15R α)와의 상호작용에 영향을 미치지 않는 잔기 위치에 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114; E28, P33, S102 및 V104; 또는 I6 및 V31로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 및 N72로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N4, S7, K11 및 D61; D8, E64, N65, I68 및 N72; 또는 N1, T62 및 L69로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O- 4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 또는 N6-(2-아지도에톡시)-카보닐-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해 변형된 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합; 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG는 선형 PEG 또는 분지된 PEG이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알우론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 포화 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 포화 지방산은 헥사데칸산, 테트라데칸산 또는 15-아지도펜타데칸산을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민, 트랜스페린, 트랜스티레틴 또는 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 XTEN 펩타이드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩타이드, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP), CTP 펩타이드 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 변형된 IL-15의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 직접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-15의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 동종이작용성 링커는 Lomant 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(설포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 디숙신이미딜 수버레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수버레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포숙신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-(3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠과 같은 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐설폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디요오도-p-자일렌 설폰산, N,N'-에틸렌-비스(요오도아세트아미드) 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(요오도아세트아미드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 이종이작용성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이작용성 링커는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(설포-MB), N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 설포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)설포숙신이미드 에스테르(설포-GMB), 숙신이미딜 6-((요오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((요오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-(((((4-요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 요오도아세테이트(NPIA), 카보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 가교결합제, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NO), 설포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-설포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(설포-sADP), 설포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(설포-sAPB), 설포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 설포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(설포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(요오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-요오도아세트아미드, ρ-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA) 또는 ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩타이드 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 디펩타이드 링커는 Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala 또는 Val-Lys를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 말레이미드기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 p-아미노벤질 알콜(PAB), p-아미노벤지옥시카보닐(PABC), 이의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 변형된 IL-15 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 연장할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 감소이다. 일부 구현예에서, IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 전장 IL-15 폴리펩타이드의 기능적 활성 단편이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 재조합 IL-15 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 재조합 인간 IL-15 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 감소를 갖는 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 효과기 T(Teff) 세포 및 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드; 및 N4, E46, D61, E64, N65, I68 및 L69로부터 선택된 아미노산 위치에서 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티를 포함하는 인터류킨 15(IL-15) 접합체가 본원에 개시되고, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 1에 상응한다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치는 N4이다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치는 E46이다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치는 D61이다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치는 E64이다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치는 N65이다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치는 I68이다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치는 L69이다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기는 시스테인에 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기는 리신에 돌연변이된다. 일부 구현예에서, N4, E46, N65 및 L69로부터 선택된 아미노산 잔기는 비천연 아미노산에 추가로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O- 4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 또는 N6-(2-아지도에톡시)-카보닐-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 도 2c에 도시된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15 수용체 α(IL-15Rα) 아단위에 대한 친화도의 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 감소이다. 일부 구현예에서, IL-15Rα에 대한 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상이다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15Rα와의 IL-15의 결합을 손상시키거나 차단한다.
소정의 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비경구 투여를 위해 제제화된다.
소정의 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 증식성 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 구현예에서, 고형 종양 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 눈암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암이다. 일부 구현예에서, 암은 혈액학적 악성상태이다. 일부 구현예에서, 혈액학적 악성상태는 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), 소형 림프구성 림프종(SLL: small lymphocytic lymphoma), 소포성 림프종(FL: follicular lymphoma), 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma), 외투 세포 림프종(MCL: mantle cell lymphoma), 발데스트롬 마크로글로불린증, 다발성 골수종, 결절외 가장자리 영역 B 세포 림프종, 노드 가장자리 영역 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비버킷 고등급 B 세포 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종(PMBL: primary mediastinal B-cell lymphoma), 면역아구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 형질구성 림프종, 비장 가장자리 영역 림프종, 혈장 세포 골수종, 형질세포종, 종격(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종 또는 림프종모양 육아종증이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체 및 추가 치료제는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체 및 추가 치료제는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 추가 치료제의 투여 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
소정의 구현예에서, (a) 세포를 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) IL-15를 IL-15Rβ 및 IL-15Rγ 아단위와 상호작용시켜 IL-15/IL-15Rβγ 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 효과기 T(Teff) 세포 및 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시키는 방법이 본원에 개시되고; 여기서 IL-15 접합체는 IL-15Rα 아단위에 대한 친화도의 감소를 갖고, IL-15/IL-15Rβγ 복합체는 Teff 및 NK 세포의 팽창을 자극한다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드, 및 N4, E46, N65 및 L69로부터 선택된 아미노산 잔기에서 단리된 및 정제된 IL-2 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티를 포함하고, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 1에 상응한다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 감소이다. 일부 구현예에서, IL-15Rα에 대한 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 약 IL-15Rα 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상이다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15와 IL-15Rα의 결합을 손상시키거나 차단한다.
소정의 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드, IL-15 접합체, 또는 약학적 조성물을 포함하는 키트가 본원에 개시된다.
소정의 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산 분자를 포함하는 키트가 본원에 개시된다.
본 발명의 다양한 양태는 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예 및 첨부 도면을 설명하는 다음의 상세한 설명을 참조하여 얻어질 것이다.
도 1은 예시적인 비천연 아미노산을 예시한다. 이 도면은 문헌[Young et al., "Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon," J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010)]의 도 2로부터 채택된다.
도 2a 내지 도 2b는 예시적인 비천연 아미노산을 예시한다. 도 2a는 예시적인 리신 유도체를 예시한다. 도 2b는 예시적인 페닐알라닌 유도체를 예시한다.
도 3a 내지 도 3d는 예시적인 비천연 아미노산을 예시한다. 이 비천연 아미노산(UAA)은 단백질에서 유전자 암호화된다(도 3a - 1번 내지 42번 UAA; 도 3b - 43번 내지 89번 UAA; 도 3c - 90번 내지 128번 UAA; 도 3d - 129번 내지 167번 UAA). 도 3a 내지 도 3d는 문헌[Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69] 의 표 1로부터 채택된다.
도 4는 음이온 교환 크로마토그래피의 그래프를 예시한다.
도 5는 역상 크로마토그래피의 그래프를 예시한다.
도 6은 CTLL2 증식 검정에서 자연적 효력을 갖는 예시적인 IL-15 접합체에 대한 EC50 값을 예시한다. 결과는 반응의 백분율로 작도된다.
도 7은 CTLL2 증식 검정에서 효력이 감소한 예시적인 IL-15 접합체에 대한 EC50 값을 예시한다. 여기 도시된 것처럼, 부위 특이적 페길화는 시험관내 약리학에 기여한다. 결과는 반응의 백분율로 작도된다.
도 8은 상이한 PEG 크기에 접합된 예시적인 IL-15에 대한 EC50 값을 예시한다. 결과는 반응의 백분율로 작도된다.
도 9a 내지 도 9c는 IL-15Rα에 결합하는 rHuIL-15, IL-15 접합된 화합물에 대한 시간(초, X축)에 대한 반응 단위(RU, Y축)를 보여준다. 도 9a: rHuIL-15; 도 9b: IL15 접합체 N77PEG30 및 S83PEG30; 및 도 9c: IL15 접합체 E46PEG30 및 E53PEG30.
도 10은 IL-15Rα 및 IL-2Rβ에 결합하는 rHuIL-15, IL-15 N77PEG30에 대한 시간(초, X축)에 대한 반응 단위(RU, Y축)를 보여준다.
도 11은 IL-15Rα 및 IL-2Rβ에 결합하는 rHuIL-15, IL-15 E53PEG30에 대한 시간(초, X축)에 대한 반응 단위(RU, Y축)를 보여준다.
도 12의 A 내지 도 12의 D는 예시적인 IL-15 PEG 접합체에 의한 자극 시 NK 및 CD8+ T 세포에 대한 STAT5 인산화를 예시한다. 도 12의 A 및 도 12의 C: 반감기 연장(S83PEG30 및 N77PEG30); 도 12의 B 및 도 12의 D: IL-15Rα와의 조절된 상호작용(V49PEG30, E53PEG30 및 L25PEG30).
도 13은 0.3 mg/kg에서의 rHuIL-15, IL-15 S83PEG30, IL-15 V49PEG30 IL-15 L25 PEG30 및 IL-15 N77 PEG30의 혈장 농도 프로필을 보여준다.
도 14의 A 내지 도 14의 D는 rHuIL-15 또는 페길화 화합물이 투약된 마우스에서 CD8+ T 세포(도 14의 A), CD8 기억 세포(도 14의 B), NK 세포(도 14의 C) 및 Treg 세포(도 14의 D)에서의 STAT5 인산화의 백분율을 보여준다.
도 15의 A 내지 도 15의 D는 페길화 화합물이 투약된 동물에서 Treg 세포(도 15의 D)가 아니라 CD8+ T(도 15의 A), NK 세포(도 15의 B), CD8+ Tmem(도 15의 C)에서의 초기 증식 분자 마커 Ki67의 증가된 발현을 보여준다.
도 16의 A 내지 도 16의 C는 CD8+ T 세포(도 16의 A), NK 세포(도 16의 B) 및 CD8 기억 T 세포(도 16의 C)의 증식의 유도를 보여준다.
도 17의 A 내지 도 17의 B는 마우스에서 증가된 용량의 IL-15 L25PEG30 화합물을 갖는 NK 세포(도 17의 A) 및 CD8+ T(도 17의 B)에서의 증가된 Ki67 발현을 보여준다.
암은 다른 신체 부분으로 침입하거나 퍼질 가능성을 갖는 비정상 세포 성장을 포함하는 복잡한 질환 그룹이다. 암 유발자 및 경로를 표적화하는 방사선 및 화학요법과 같은 암 치료가 성공적일 수 있다. 일부 경우에, 암 세포는 이 치료에 적응될 수 있어서, 이러한 치료의 효율을 제한한다. 면역요법은 수술, 화학요법 또는 방사선과 달리 면역계가 종양 세포를 인식하고 사멸하게 자극한다.
여러 사이토카인은 면역 반응을 촉발하는 이의 능력에 대해 면역요법에 사용된다. 그러나, 사이토카인을 사용하는 현재의 면역요법은 독성 및 비조절된 세포 증식을 포함하는 여러 부작용을 생성한다. 치료를 개선하고 부작용을 감소시키는 특정 T 세포 및 NK 집단을 자극하거나 팽창시키는 능력을 갖는 암의 치료에 사용하기 위한 변형된 사이토카인 또는 사이토카인 접합체가 본원에 제공된다.
사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자와 같은 세포 신호전달 단백질의 패밀리를 포함한다. 사이토카인은 대식세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 상이한 기질 세포와 같은 면역 세포에 의해 생산된다. 일부 경우에, 사이토카인은 체액성 면역 반응과 세포계 면역 반응 사이의 균형을 조절한다.
인터류킨은 T 및 B 림프구 및 조혈 세포의 발생 및 분화를 조절하는 신호전달 단백질이다. 인터류킨은 헬퍼 CD4 T 림프구, 단핵구, 대식세포 및 내피 세포에 의해 생산된다. 일부 경우에, 약 15 인터류킨, 인터류킨 1-13, 인터류킨 15 및 인터류킨 17이 있다.
인터류킨-15(IL-15)는 구조가 14 내지 15 kDa 당단백질인 다면발현성 사이토카인이다. IL-15 전사, 번역 및 분비는 다수의 복잡한 기전을 통해 조절된다. IL-15 및 IL-15 수용체 α(IL-15R α, CD215) 단백질은 주로 활성화된 단핵구 및 수지상 세포(DC)에 의해 동시발현된다. 이종이합체 IL-15/IL-15Rα의 전사는 단핵구/DC와 1형 또는 2형 인터페론(IFN) 또는 CD40 결찰 또는 NF-kB를 활성화하는 톨형 수용체(TLR)를 통해 작용하는 물질의 상호작용 후에 발생한다. 추가로, IL-15/IL-15Rα 단백질 발현은 주로 번역 및 분비의 수준에서 조절된다.
IL-15는 고유한 α 사슬(IL-15R α), IL-2(CD122)를 갖는 공유된 β 아단위(IL-15R β, CD132) 및 여러 사이토카인과 공유된 공통 γ 아단위(CD132; IL-15R γ)를 포함하는 이종삼합체성 수용체를 통해 신호전달한다. IL-15Rα는 Kd 약 10-11 M로 IL-15에 대한 높은 친화도를 갖는다.
일부 구현예에서, IL-15 신호전달은 T 세포 반응을 조절하기 위해 그리고 후속하여 암의 치료를 위해 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 신호전달은 한정된 효과기 T-세포 하위집단에서 활성화된 CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식 및 이의 분화를 모의하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 신호전달은 천연 살해(NK) 세포의 생성 및 증식을 모의하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 신호전달은 기억 CD8 T 세포, 미경험 CD8 T 세포 및 NK 세포의 유지 및 생존을 촉진하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 신호전달은 기억 CD8 T 세포의 형성을 유도하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 신호전달은 NK 세포 표적 특이적 활성화를 프라이밍하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 신호전달은 Treg를 팽창시키지 않는다.
일부 구현예에서, T 세포 반응을 조절하기 위해 그리고 후속하여 암의 치료를 위해 변형된 IL-15 폴리펩타이드가 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 인터류킨 15 수용체 α(IL-15Rα)와의 결합의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15Rα 사이의 결합 친화도에 대비된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 2/인터류킨 15 수용체 βγ(IL-2/IL-15R βγ)의 상호작용에 적은 효과를 갖거나 효과를 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15R α 및 IL-15R βγ의 결합 친화도에 적은 효과를 갖거나 효과를 갖지 않는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 IL-2/IL-15R βγ와의 결합의 감소를 갖고, IL-15R α 상호작용은 영향을 받지 않는다.
항종양 반응을 자극하는 능력이 개선된 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체가 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 안전성 프로필이 개선된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 반감기를 증가시키기 위한 부위 특이적 페길화를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 페길화는 반감기를 증가시키고, 생물학적 활성에 적은 효과를 갖거나 효과를 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 신호전달은 IL-15R βγ에 바이어싱된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 반감기를 증가시키고 독성을 감소시키기 위한 부위 특이적 페길화를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 페길화는 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 투약을 줄인다. 일부 구현예에서, 독성은 IL-15R α 상호작용을 차단하는 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체에 의해 감소한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 활성은 종양 부위로 제한된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 IL-15의 다른쪽 제시(trans-presentation)가 천연 살해(NK) 및 효과기 세포 증식 및 기능에 필요하지 않도록 부위 특이적 페길화를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 청소율이 저해되거나 금지되도록 부위 특이적 페길화를 포함한다.
변형된 IL-15 폴리펩타이드 및 IL-15 접합체
일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드가 본원에 기재된다. 일부 경우에, 그 변형은 천연 아미노산에 대한 것이다. 일부 경우에, 그 변형은 비천연 아미노산에 대한 것이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드가 본원에 기재된다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 단리된 및 정제된 포유류 IL-15, 예를 들어 인간 IL-15 단백질이다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 인간 IL-15 단백질이다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 절두된 변이체이다. 일부 경우에, 절두는 N-말단 결실이다. 다른 경우에, 절두는 C-말단 결실이다. 추가의 경우에, 절두는 N-말단 및 C-말단 결실 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 절두는 N-말단 또는 C-말단, 또는 말단 둘 다로부터 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개 이상의 잔기의 결실일 수 있다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개 이상의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 2개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 3개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 4개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 5개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 6개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 7개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 8개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 9개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 10개의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 기능적 활성 단편이다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-15 영역 5-114, 10-114, 15-114, 20-114, 1-110, 5-110, 10-110, 15-110, 20-110, 1-105, 5-105, 10-105, 15-105, 20-105, 1-100, 5-100, 10-100, 15-100 또는 20-100을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치에 참조된다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-15 영역 5-114, 10-114, 15-114 또는 20-114를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치에 참조된다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-15 영역 1-110, 5-110, 10-110, 15-110 또는 20-110을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치에 참조된다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-15 영역 1-105, 5-105, 10-105, 15-105 또는 20-105를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치에 참조된다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-15 영역 1-100, 5-100, 10-100, 15-100 또는 20-100을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치에 참조된다.
일부 구현예에서, 기능적 활성 IL-15 단편은 내부 결실을 포함한다. 일부 경우에, 내부 결실은 루프 영역을 포함한다. 일부 경우에, 내부 결실은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 잔기의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 및 F110으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97 및 E98로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 및 N72로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Y26, E46, V49, E53 및 L25로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N4, S7, K11 및 D61로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 L25, E53, N77 및 S83으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 L25 및 E53으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20 및 S83으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46 및 Y26으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 L25이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Y26이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V49이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E53이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 T24이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N77이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N4, K11, N65, L69, S18, H20 및 S83으로부터 선택된다. IL-15에 대한 예시적인 아미노산 서열은 하기 표 1에 예시되어 있다.
Figure pct00001
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 근접하게 위치한다. 본원에 사용된 바와 같이, 근접은 N-말단 잔기로부터 적어도 1개의 잔기로 멀리 그리고 N-말단 잔기로부터 약 50개까지의 잔기로 멀리 위치한 잔기를 지칭한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 10개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 20개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 30개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 40개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 50개의 잔기 내에 위치한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기이다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게 위치한다. 본원에 사용된 바와 같이, 근접은 C-말단 잔기로부터 적어도 1개의 잔기로 멀리 그리고 C-말단 잔기로부터 약 50개까지의 잔기로 멀리 위치한 잔기를 지칭한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 10개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 20개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 30개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 40개의 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 50개의 잔기 내에 위치한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 IL-15 폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 15 수용체 α(IL-15R α)의 결합 친화도를 선택적으로 감소시키는 잔기 위치에 있다. 일부 구현예에서, 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15Rα 사이의 결합 친화도에 대비된다. 일부 구현예에서, IL-15R α에 대한 변형된 IL-15 폴리펩타이드의 결합은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 2/ 인터류킨 15 수용체 βγ(IL-2/IL-15R βγ)의 상호작용에 영향을 미치지 않거나, 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 IL-2/IL-15R βγ의 상호작용을 개선한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Y26, E46, V49, E53 및 L25로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 A23, T24, E89 및 E93으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D22, L44, Q48 및 E90으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Y26이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E46이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V49이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E53이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 L25이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 PEG를 추가로 포함한다. 일부 경우에, PEG는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93으로부터 선택된 잔기 위치에서 접합된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 증가된 반감기를 위해 PEG를 추가로 포함한다. 일부 경우에, PEG는 증가된 반감기를 위해 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 및 F110으로부터 선택된 잔기 위치에서 접합된다. 일부 경우에, PEG는 N71, N72 및 N77로부터 선택된 잔기 위치에서 접합된다. 일부 경우에, PEG에 접합된 잔기는 천연 아미노산에 돌연변이된다. 다른 경우에, PEG에 접합된 잔기는 비천연 아미노산에 돌연변이된다. 추가의 경우에, N71, N72 또는 N77에서의 돌연변이는 CMC 조건(예를 들어, 수율, 순도, 안정성, 응집의 감소, 및/또는 단백질 폴딩의 개선), 효력, 또는 이의 조합을 추가로 개선한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 IL-15 폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 IL-2/IL-15R β, IL-15Rγ, 또는 이의 조합의 결합 친화도를 선택적으로 감소시키는 잔기 위치에 있다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15는 IL-15R α와의 상호작용에 적은 효과를 갖거나 효과를 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E28, S29, D30, V31, H32, P33, D61, T62, E64, N65, I68, L69, N72, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 IL-2/IL-15R β의 결합 친화도를 선택적으로 감소시키는 잔기 위치에 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 및 N72로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N4, S7, K11 및 D61로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D8, E64, N65, I68 및 N72로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, T62 및 L69로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N4이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S7이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 K11이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D61이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 IL-2/IL-15Rγ의 결합 친화도를 선택적으로 감소시키는 잔기 위치에 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E28, P33, S102 및 V104로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 I6 및 V31로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 K10이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S29이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D30이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 H32이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 H105이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Q108이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 M109이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 I111이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N112이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 T113이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S114이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 PEG를 추가로 포함한다. 일부 경우에, PEG는 N1, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E28, S29, D30, V31, H32, P33, D61, T62, E64, N65, I68, L69, N72, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된 잔기 위치에서 접합된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 증가된 반감기를 위해 PEG를 추가로 포함한다. 일부 경우에, PEG는 증가된 반감기를 위해 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 및 F110으로부터 선택된 잔기 위치에서 접합된다. 일부 경우에, PEG는 N71, N72 및 N77로부터 선택된 잔기 위치에서 접합된다. 일부 경우에, PEG에 접합된 잔기는 천연 아미노산에 돌연변이된다. 다른 경우에, PEG에 접합된 잔기는 비천연 아미노산에 돌연변이된다. 추가의 경우에, N71, N72 또는 N77에서의 돌연변이는 CMC 조건(예를 들어, 수율, 순도, 안정성, 응집의 감소, 및/또는 단백질 폴딩의 개선), 효력, 또는 이의 조합을 추가로 개선한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 IL-15 폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15R α 및 IL-15R βγ의 결합 친화도에 영향을 미치지 않는 잔기 위치에 있다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 증가된 반감기를 위해 PEG를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-15는 생물학적 활성의 변화 없이 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 잔기는 반감기 연장을 위해 변형된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 및 F110으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97 및 E98로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E13, L15, M19, H20, K36, V37, T38, S54, H60, I67, N71, G78, K86, E87 및 Q101로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 I21, S34, C35, L44, V63, S73, L74, E82, C85, C88, L91, I96, L100 및 F110으로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N71, N72 및 N77로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N77 및 S83으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D14이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 Q17이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S18이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 K41이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S51이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 L52이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 G55이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 D56이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 A57이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S58이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S75이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S76이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N77이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N79이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V80이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 T81이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 S83이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 G84이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E92이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 K94이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N95이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 K97이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 E98이다. 일부 경우에, N71, N72 또는 N77에서의 돌연변이는 천연 아미노산에 대한 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, N71, N72 또는 N77에서의 돌연변이는 CMC 조건(예를 들어, 수율, 순도, 안정성, 응집의 감소, 및/또는 단백질 폴딩의 개선), 효력, 또는 이의 조합을 추가로 개선한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드는 IL-15 접합체를 생성하기 위해 접합 모이어티에 추가로 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 아미노산 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 또는 S114에 있고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 아미노산 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 또는 S114에 있다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 적어도 하나의 비천연 아미노산에 결합된다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기에 결합된다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 적어도 하나의 비천연 아미노산 또는 말단 잔기에 직접적으로 결합된다. 다른 경우에, 접합 모이어티는 하기 기재된 링커를 통해 적어도 하나의 비천연 아미노산 또는 말단 잔기에 간접적으로 결합된다.
일부 구현예에서, 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15 수용체 α(IL-15Rα) 아단위에 대한 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 친화도의 감소는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 10%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 20%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 40%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 50%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 60%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 80%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 90%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 95%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 100%이다.
일부 구현예에서, 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15 수용체 α(IL-15Rα) 아단위에 대한 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 친화도의 감소는 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 1배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 2배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 4배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 5배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 6배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 8배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 10배이다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 IL-15Rα와 상호작용하지 않는다.
일부 구현예에서, 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-2 수용체(IL-2R) 아단위에 대한 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 친화도의 감소는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%이다. 일부 구현예에서, IL-2R 아단위는 IL-2R βγ이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 10%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 20%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 40%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 50%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 60%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 80%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 90%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 95%이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 100%이다.
일부 구현예에서, 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-2 수용체(IL-2R) 아단위에 대한 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 친화도의 감소는 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상이다. 일부 구현예에서, IL-2R 아단위는 IL-2R βγ이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 1배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 2배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 4배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 5배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 6배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 8배이다. 일부 구현예에서, 친화도의 감소는 약 10배이다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 IL-2Rα와 상호작용하지 않는다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 반감기의 증대를 갖는다. 일부 경우에, 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기와 비교된다.
일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 90분 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 2시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 3시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 4시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 5시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 6시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 10시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 12시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 18시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 24시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 36시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 48시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 3일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 4일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 5일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 6일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 7일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 10일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 12일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 14일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 21일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 28일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기보다 적어도 30일 이상 더 길다.
일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 반감기의 증대는 야생형 IL-15 단백질 또는 야생형 IL-15 접합체의 반감기와 비교하여 약 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일 또는 30일이다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 90분 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 2시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 3시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 4시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 5시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 6시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 7시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 8시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 9시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 10시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 11시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 12시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 18시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 24시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 36시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 48시간 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 3일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 4일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 5일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 6일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 7일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 10일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 12일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 14일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 21일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 28일 반감기가 증대된다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 약 30일 반감기가 증대된다.
일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 인터류킨 15 수용체 βγ(IL-15Rβγ) 신호전달 복합체와 상당한 신호전달 효력을 보유한다. 일부 경우에, 신호전달 효력은 야생형 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15Rβγ 사이의 신호전달 효력과 비교된다. 일부 경우에, 변형된 IL-15/IL-15Rβγ 복합체와 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체 사이의 수용체 신호전달 효력의 차이는 1000배 미만, 500배 미만, 200배 미만, 100배 미만, 50배 미만, 10배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만 또는 1배 미만이다. 일부 경우에, 변형된 IL-15/IL-15Rβγ 복합체와 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체 사이의 수용체 신호전달 효력의 차이는 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과 또는 500배 초과이다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 부분 작용제, 예를 들어 수용체(예를 들어, IL-15βγ 신호전달 복합체)를 활성화하지만, 완전 작용제에 비해 그 수용체에서 오직 부분 효율을 갖는 작용제이다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 완전 작용제, 예를 들어 최대 반응에서 수용체(예를 들어, IL-15βγ 신호전달 복합체)를 활성화하는 작용제이다.
일부 경우에, 수용체 신호전달 효력은 EC50 값에 의해 측정된다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체의 EC50 값보다 상이한 1000배 미만, 500배 미만, 200배 미만, 100배 미만, 50배 미만, 10배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만 또는 1배 미만인 EC50 값을 제공한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체의 EC50 값보다 상이한 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과 또는 500배 초과인 EC50 값을 제공한다.
일부 경우에, 수용체 신호전달 효력은 ED50 값에 의해 측정된다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체의 ED50 값보다 상이한 1000배 미만, 500배 미만, 200배 미만, 100배 미만, 50배 미만, 10배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만 또는 1배 미만인 ED50 값을 제공한다. 일부 경우에, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체의 ED50 값보다 상이한 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과 또는 500배 초과인 ED50 값을 제공한다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 화학합성, 공장생산 및 품질관리(CMC: Chemistry, Manufacturing and Control) 단계 동안 반감기의 연장, 안정성의 개선, 정제 수율의 개선, 순도의 개선, 응집의 감소, 단백질 폴딩의 개선 또는 이들의 조합을 위해 변형(예를 들어, 페길화)된다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 N71, N72 또는 N77의 아미노산 위치에서 변형되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 CMC 단계 동안 반감기의 연장, 안정성의 개선, 정제 수율의 개선, 순도의 개선, 응집의 감소, 단백질 폴딩의 개선 또는 이들의 조합을 위해 예를 들어 페길화를 통해 잔기 N77에서 변형된다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 또는 S114의 위치에서 추가로 변형된다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 또는 E93의 위치에서 추가로 변형되고, 여기서 변형은 IL-15Rα와의 상호작용을 손상시킨다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 또는 N72의 위치에서 추가로 변형되고, 여기서 변형은 IL-15Rβ와의 상호작용을 손상시킨다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 또는 S114의 위치에서 추가로 변형되고, 여기서 변형은 IL-15Rγ와의 상호작용을 손상시킨다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 또는 F110의 위치에서 추가로 변형되고, 여기서 변형은 반감기 연장을 개선한다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 IL-15Rα와의 상호작용의 손상, IL-15Rβ와의 상호작용의 손상, IL-15Rγ와의 상호작용의 손상, 반감기 연장의 개선, 또는 이들의 조합을 위해 상기 위치 중 하나 이상에서 추가로 변형된다.
IL-15 접합체 전구체
변형된 IL-15 폴리펩타이드를 포함하는 IL-15 접합체 전구체가 본원에 개시되고, 여기서 하나 이상의 아미노산은 야생형 아미노산으로부터 돌연변이된다. 이러한 전구체는 질환 또는 병태의 치료를 위해 본원에 개시된 방법과 대개 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 전구체는 접합되지 않는다. 이러한 돌연변이는 다양하게 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 경우에, 부가는 IL-15 폴리펩타이드의 N-말단, C-말단, 또는 내부 영역에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 잔기의 포함을 포함한다. 추가의 경우에, 결실은 IL-15 폴리펩타이드의 N-말단, C-말단으로부터, 또는 내부 영역 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 잔기의 제거를 포함한다.
천연 아미노산 및 비천연 아미노산
일부 구현예에서, (예를 들어, IL-15 폴리펩타이드 내의) 본원에 개시된 아미노산 잔기는 접합 모이어티에 결합하기 전에(또는 이것과 반응하기 전에) 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 또는 티로신에 돌연변이된다. 예를 들어, 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 측쇄는 본원에 개시된 접합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 시스테인, 리신 또는 히스티딘에 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 시스테인에 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 리신에 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 히스티딘에 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 티로신에 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 트립토판에 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단에, N-말단 또는 C-말단에서 또는 내부 잔기 위치에서 근접하게 위치한다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단 잔기이고, 돌연변이는 시스테인 또는 리신에 대한 것이다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단 잔기에 근접하게(예를 들어, N-말단 또는 C-말단 잔기로부터 50개, 40개, 30개, 20개 또는 10개의 잔기 내에) 위치하고, 돌연변이는 시스테인 또는 리신에 대한 것이다.
일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단 잔기에 부가되고, 즉 IL-15 폴리펩타이드는 N-말단 또는 C-말단에서 추가의 아미노산 잔기를 포함하고, 추가의 아미노산 잔기는 시스테인 또는 리신이다. 일부 경우에, 추가의 아미노산 잔기는 시스테인이다. 일부 경우에, 추가의 아미노산은 접합 모이어티에 접합된다.
일부 구현예에서, (예를 들어, IL-15 폴리펩타이드 내의) 본원에 기재된 아미노산 잔기는 비천연 아미노산에 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 접합 모이어티와 접합되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-15 폴리펩타이드는 비천연 아미노산을 포함하고, 여기서 IL-15는 부착 점이 비천연 아미노산이 아닌 단백질에 접합된다.
일부 구현예에서, (예를 들어, IL-15 폴리펩타이드 내의) 본원에 개시된 아미노산 잔기는 접합 모이어티에 결합하기 전에 비천연 아미노산에 돌연변이된다. 일부 경우에, 비천연 아미노산에 대한 돌연변이는 면역계의 자가-항원 반응을 방지하거나 최소화한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 아미노산"은 단백질에서 자연 발생하는 20개의 아미노산 이외의 아미노산을 지칭한다. 비천연 아미노산의 비제한적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, p-메톡시페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O- 4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-보로노페닐알라닌, O-프로파길티로신, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, 셀레노시스테인, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, N6-[(2-아지도에톡시)카보닐]-L-리신(AzK), 티로신 아미노산의 비천연 유사체; 글루타민 아미노산의 비천연 유사체; 페닐알라닌 아미노산의 비천연 유사체; 세린 아미노산의 비천연 유사체; 트레오닌 아미노산의 비천연 유사체; 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 시아노, 할로, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드록실, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 설포닐, 셀레노, 에스테르, 티오산, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 복소환식, 에논, 이민, 알데하이드, 하이드록실아민, 케토 또는 아미노 치환된 아미노산, 또는 이들의 조합; 광활성화 가교결합제를 갖는 아미노산; 스핀 표지된 아미노산; 형광 아미노산; 금속 결합 아미노산; 금속 함유 아미노산; 방사성 아미노산; 광 케이징된 및/또는 광이성질체화 아미노산; 비오틴 또는 비오틴-유사체 함유 아미노산; 케토 함유 아미노산; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산; 무거운 원자 치환된 아미노산; 화학적으로 절단 가능한 또는 광 절단 가능한 아미노산; 길쭉한 측쇄를 갖는 아미노산; 독성 기를 함유하는 아미노산; 당 치환된 아미노산; 탄소 연결된 당 함유 아미노산; 산화환원 활성 아미노산; a-하이드록시 함유 산; 아미노 티오 산; α,α-이치환된 아미노산; β-아미노산; 프롤린 또는 히스티딘 이외의 환식 아미노산 및 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판 이외의 방향족 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 선택적 반응성 기 또는 표적 폴리펩타이드의 부위 선택적 표지를 위한 반응성 기를 포함한다. 일부 경우에, 화학은 쌍직교성 반응(예를 들어, 생체적합성 및 선택적 반응)이다. 일부 경우에, 화학은 Cu(I) 촉매된 또는 "구리 비함유" 알킨-아지드 트리아졸 형성 반응, 슈타우딩거(Staudinger) 결찰, 역전자 수요 디엘스-앨더(IEDDA: inverse-electron-demand Diels-Alder) 반응, "광-클릭" 화학 또는 금속 매개 공정, 예컨대 올레핀 복분해 및 스즈키-미야우라(Suzuki-Miyaura) 또는 소노가시라(Sonogashira) 교차-커플링이다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 예를 들어 UV에 의한 조사 시 가교결합하는 광 반응성 기를 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 광 케이징된 아미노산을 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 파라-치환된, 메타-치환된 또는 오르토-치환된 아미노산 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-메톡시페닐알라닌, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O- 4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌 또는 이소프로필-L-페닐알라닌을 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 3-아미노티로신, 3-니트로티로신, 3,4-디하이드록시-페닐알라닌 또는 3-요오도티로신이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 페닐셀레노시스테인이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 벤조페논, 케톤, 요오다이드, 메톡시, 아세틸, 벤조일 또는 아지드 함유 페닐알라닌 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 벤조페논, 케톤, 요오다이드, 메톡시, 아세틸, 벤조일 또는 아지드 함유 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함하지 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 아지도기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 마이클(Michael)-억셉터 기를 포함한다. 일부 경우에, 마이클-억셉터 기는 1,2-부가 반응을 통해 공유 결합을 형성할 수 있는 불포화 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 마이클-억셉터 기는 전자 결핍 알켄 또는 알킨을 포함한다. 일부 경우에, 마이클-억셉터 기는 알파,베타 불포화: 케톤, 알데하이드, 설폭사이드, 설폰, 니트릴, 이민 또는 방향족을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 데하이드로알라닌이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 알데하이드 또는 케톤기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 알데하이드 또는 케톤기를 포함하는 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 베타, 감마 또는 델타 위치에서 하나 이상의 O, N, Se 또는 S 원자를 포함하는 리신 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 감마 위치에서 O, N, Se 또는 S 원자를 포함하는 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 엡실론 N 원자가 산소 원자로 대체된 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 번역 후 변형된 자연 발생 리신이 아닌 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 알파 위치로부터의 제6 원자가 카보닐기를 포함하는 측쇄를 포함하는 아미노산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 알파 위치로부터의 제6 원자가 카보닐기를 포함하고, 알파 위치로부터의 제5 원자가 질소인 측쇄를 포함하는 아미노산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 알파 위치로부터의 제7 원자가 산소 원자인 측쇄를 포함하는 아미노산이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 셀레늄을 포함하는 세린 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 셀레노세린(2-아미노-3-하이드로셀레노프로판산)이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 셀레늄을 포함하고, 여기서 셀레늄의 산화는 알켄을 포함하는 비천연 아미노산을 형성시킨다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 사이클로옥티닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 트랜스사이클로옥테닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 노르보르네닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 사이클로프로페닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 디아지린기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 테트라진기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 측쇄 질소가 카바밀화된 리신 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 측쇄 질소가 아실화된 리신 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(tert-부톡시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(tert-부톡시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-Boc-N6-메틸리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-아세틸리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 피로리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-트리플루오로아세틸리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(p-요오도벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(p-니트로벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-프롤릴리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(사이클로펜틸옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(사이클로펜탄카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(테트라하이드로퓨란-2-카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(3-에티닐테트라하이드로퓨란-2-카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((프로프-2-인-1-일옥시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(2-아지도사이클로펜틸옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-[(2-아지도에톡시)카보닐]리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-[(2-니트로벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(2-사이클로옥티닐옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(2-아미노부트-3-이노일)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-((2-아미노부트-3-이노일)옥시)헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(알릴옥시카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(부테닐-4-옥시카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(펜테닐-5-옥시카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((부트-3-인-1-일옥시)카보닐)-리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((펜트-4-인-1-일옥시)카보닐)-리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(티아졸리딘-4-카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-8-옥소노난산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-8-옥소옥탄산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(2-옥소아세틸)리신이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-프로피오닐리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-부티릴리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(부트-2-에노일)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((바이사이클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일옥시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((스피로[2.3]헥스-1-엔-5-일메톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(((4-(1-(트리플루오로메틸)사이클로프로프-2-엔-1-일)벤질)옥시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((바이사이클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일메톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 시스테이닐리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((1-(6-니트로벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)에톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((2-(3-메틸-3H-디아지린-3-일)에톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((3-(3-메틸-3H-디아지린-3-일)프로폭시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((메타 니트로베닐옥시)N6-메틸카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시)카보닐)-리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((사이클로헵트-3-엔-1-일옥시)카보닐)-L-리신이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-3-(((((벤질옥시)카보닐)아미노)메틸)셀라닐)프로판산이다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 재창출된 앰버(amber), 오팔(opal) 또는 오커(ochre) 중지 코돈에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 4-염기 코돈에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 재창출된 희귀 센스 코돈 또는 재창출된 공통 센스 코돈에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 비천연 핵산을 포함하는 합성 코돈에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 직교성 변형된 합성효소/tRNA 쌍에 의해 IL-15로 편입된다. 이러한 직교성 쌍은 a) 다른 내인성 아미노산을 비천연 tRNA로 하전시키는 것 및 b) 비천연 아미노산을 다른 내인성 tRNA로 하전시키는 것을 최소화하면서 비천연 tRNA를 비천연 아미노산로 하전시킬 수 있는 비천연 합성효소를 포함한다. 이러한 직교성 쌍은 내인성 합성효소에 의해 다른 내인성 아미노산이 하전되는 것을 피하면서 비천연 합성효소에 의해 하전될 수 있는 tRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 쌍은 다양한 유기체, 예컨대 박테리아, 효모, 고세균 또는 인간 원천으로부터 확인된다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍은 단일 유기체로부터의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍은 2개의 상이한 유기체로부터의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍은 변형 전에 2개의 상이한 아미노산의 번역을 촉진하는 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 알라닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 아르기닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 아스파라긴 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 아스파르트산 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 시스테인 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 글루타민 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 글루탐산 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 알라닌 글리신이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 히스티딘 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 류신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 이소류신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 리신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 메티오닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 페닐알라닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 프롤린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 세린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 트레오닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 트립토판 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 티로신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 발린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 포스포세린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 알라닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 아르기닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 아스파라긴 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 아스파르트산 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 시스테인 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 글루타민 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 글루탐산 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 알라닌 글리신이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 히스티딘 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 류신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 이소류신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 리신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 메티오닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 페닐알라닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 프롤린 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 세린 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 트레오닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 트립토판 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 티로신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 발린 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 포스포세린 tRNA이다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 아미노아실(aaRS 또는 RS)-tRNA 합성효소-tRNA 쌍에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 예시적인 aaRS-tRNA 쌍은 메타노코커스 야나스키(Methanococcus jannaschii)(Mj-Tyr) aaRS/tRNA 쌍, E. 콜라이 TyrRS(Ec-Tyr)/B. 스테아로써모필루스(B. stearothermophilus) tRNACUA 쌍, E. 콜라이 LeuRS(Ec-Leu)/B. 스테아로써모필루스 tRNACUA 쌍 및 피롤리실-tRNA 쌍을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 Mj - TyrRS/tRNA 쌍에 의해 사이토카인(예를 들어, IL 폴리펩타이드)으로 편입된다. Mj - TyrRS/tRNA 쌍에 의해 편입될 수 있는 예시적인 UAA는 파라-치환된 페닐알라닌 유도체, 예컨대 p-아미노페닐알라닌 및 p-메톡시페닐알라닌; 메타-치환된 티로신 유도체, 예컨대 3-아미노티로신, 3-니트로티로신, 3,4-디하이드록시페닐알라닌 및 3-요오도티로신; 페닐셀레노시스테인; p-보로노페닐알라닌; 및 o-니트로벤질티로신을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 Ec - Tyr/tRNACUA 또는 Ec -Leu/tRNACUA 쌍에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. Ec - Tyr/tRNACUA 또는 Ec -Leu/tRNACUA 쌍에 의해 편입될 수 있는 예시적인 UAA는 벤조페논, 케톤, 요오다이드 또는 아지드 치환기를 함유하는 페닐알라닌 유도체; O-프로파길티로신; α-아미노카프릴산, O-메틸 티로신, O-니트로벤질 시스테인; 및 3-(나프탈렌-2-일아미노)-2-아미노-프로판산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 피롤리실-tRNA 쌍에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 일부 경우에, PylRS는 원시세균, 예를 들어 메탄생성 원시세균으로부터 얻어진다. 일부 경우에, PylRS는 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei) 또는 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans)로부터 얻어진다. 피롤리실-tRNA 쌍에 의해 편입될 수 있는 예시적인 UAA는 아미드 및 카바메이트 치환된 리신, 예컨대 2-아미노-6-((R)-테트라하이드로퓨란-2-카복스아미도)헥산산, N-ε-D-프롤릴-L-리신 및 N-ε-D-사이클로펜틸옥시카보닐-L-리신; N-ε-아크릴로일-L-리신; N-ε-[(1-(6-니트로벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)에톡시)카보닐]-L-리신; 및 N-ε-(1-메틸사이클로프로-2-엔카복스아미도)리신을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 US 9,988,619호 및 9,938,516호에 개시된 합성효소에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 이러한 합성효소에 의해 편입될 수 있는 예시적인 UAA는 파라-메틸아지도-L-페닐알라닌, 아랄킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아랄킬 비천연 아미노산 및 기타를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 피리딜, 피라지닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티오페닐 또는 다른 헤테로사이클을 포함한다. 이러한 아미노산은 일부 구현예에서 아지드, 테트라진 또는 커플링 파트너, 예컨대 수용성 모이어티에 접합할 수 있는 다른 화학 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 합성효소는 발현되고 생체내 사이토카인으로 UAA를 편입시키기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 이러한 합성효소는 무세포 번역 시스템을 사용하여 사이토카인으로 UAA를 편입시키기 위해 사용된다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 자연 발생 합성효소에 의해 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 하나 이상의 아미노산에 영양요구성인 유기체에 의해 사이토카인으로 편입된다. 일부 구현예에서, 영양요구성 아미노산에 상응하는 합성효소는 상응하는 tRNA를 비천연 아미노산으로 하전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 셀레노시스테인 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 셀레노메티오닌 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 방향족 아미노산이고, 여기서 방향족 아미노산은 아릴 할라이드, 예컨대 요오다이드를 포함한다. 구현예에서, 비천연 아미노산은 영양요구성 아미노산과 구조적으로 유사하다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 도 1에 예시된 비천연 아미노산을 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 리신 또는 페닐알라닌 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 리신 유도체 또는 리신 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 피로리신(Pyl)을 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 페닐알라닌 유도체 또는 페닐알라닌 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 문헌[Wan, et al., "Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool," Biocheim Biophys Aceta 1844(6): 1059-4070 (2014)]에 기재된 비천연 아미노산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 도 2(예를 들어, 도 2a 및 도 2b)에 예시된 비천연 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 도 3a 내지 도 3d에 예시된 비천연 아미노산(문헌[Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69]의 표 1로부터 채택됨)을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드로 편입된 비천연 아미노산은 US 제9,840,493호; US 제9,682,934호; US 제2017/0260137호; US 제9,938,516호; 또는 US 제2018/0086734호에 개시되어 있다. 이러한 합성효소에 의해 편입될 수 있는 예시적인 UAA는 파라-메틸아지도-L-페닐알라닌, 아랄킬, 헤테로사이클릴 및 헤테로아랄킬 및 리신 유도체 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 피리딜, 피라지닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티오페닐 또는 다른 헤테로사이클을 포함한다. 이러한 아미노산은 일부 구현예에서 아지드, 테트라진 또는 커플링 파트너, 예컨대 수용성 모이어티에 접합할 수 있는 다른 화학 기를 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 링커를 통해 방향족 모이어티에 부착된 아지드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬 링커는 C1-C10 링커이다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 링커를 통해 방향족 모이어티에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 아미노기를 통해 방향족 모이어티에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬아미노기를 통해 방향족 모이어티에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 사슬을 통해 아미노산 측쇄의 말단 질소(예를 들어, 리신 유도체의 N6, 또는 더 짧은 알킬 측쇄를 포함하는 유도체의 N5, N4 또는 N3)에 부착된 아지드를 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 사슬을 통해 아미노산 측쇄의 말단 질소에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 링커를 통해 아미드에 부착된 아지드 또는 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 3-아미노알라닌, 세린, 리신 또는 이의 유도체의 아지드 또는 테트라진 함유 카바메이트 또는 아미드이다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 생체내 사이토카인으로 편입된다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 무세포 시스템에서 사이토카인으로 편입된다.
접합 모이어티
소정의 구현예에서, 상기 기재된 하나 이상의 변형된 IL-15 폴리펩타이드에 결합된 접합 모이어티가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15와 이의 수용체의 상호작용을 교란하는 분자이다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15에 결합할 때 IL-15 접합체가 면역 반응을 조절하게 하는 임의의 분자이다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 공유 결합을 통해 IL-15에 결합된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15는 트리아졸기로 접합 모이어티에 부착된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15는 디하이드로피리다진 또는 피리다진기로 접합 모이어티에 부착된다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 다른 경우에, 접합 모이어티는 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 펩타이드를 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 핵산을 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 소분자를 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 생체접합체(예를 들어, TLR 작용제, 예컨대 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 작용제; 또는 합성 리간드, 예컨대 Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, 폴리 I:C, 폴리 A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA 또는 플라젤린)를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 혈청 반감기를 증가시키고/시키거나, 안정성을 개선한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 하나 이상의 사이토카인 수용체 도메인 또는 아단위와의 사이토카인 상호작용을 감소시킨다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 하나 이상의 IL-15 도메인 또는 아단위와 이의 동족 수용체(들)와의 IL-15 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 다수의 접합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15 폴리펩타이드에서 비천연 아미노산 또는 천연 아미노산에 부착된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 천연 아미노산에 부착된 접합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 사이토카인 펩타이드에서 비천연 아미노산에 부착된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15 폴리펩타이드의 N 또는 C 말단 아미노산에 부착된다. 다양한 조합 부위가 본원에 개시되고, 예를 들어 제1 접합 모이어티는 IL-15 폴리펩타이드에서 비천연 아미노산 또는 천연 아미노산에 부착되고, 제2 접합 모이어티는 IL-15 폴리펩타이드의 N 또는 C 말단 아미노산에 부착된다. 일부 구현예에서, 단일 접합 모이어티는 IL-15 폴리펩타이드의 다수의 잔기(예를 들어, 스테이플)에 부착된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15 폴리펩타이드의 N 및 C 말단 아미노산 둘 다에 부착된다.
수용성 중합체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 수용성 중합체이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 비펩타이드성, 비독성 및 생체분해성이다. 본원에 사용된 바와 같이, 살아 있는 조직과 연결되어(예를 들어, 환자에 대한 투여) 물질 단독 또는 다른 물질(예를 들어, 활성제, 예컨대 IL-15 모이어티)과의 사용과 연관된 유리한 효과가 임상의, 예를 들어 의사가 평가하는 임의의 해로운 효과를 능가하면 그 물질은 생체적합하다고 생각된다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 추가로 비면역원성이다. 일부 구현예에서, 생체내 의도된 물질 사용이 원치 않는 면역 반응(예를 들어, 항체의 형성)을 생성하지 않으면 또는 면역 반응이 생성되고, 이러한 반응이 임상의, 예를 들어 의사, 독성학자 또는 임상 개발 전문가가 평가하는 바대로 임상적으로 유의미하거나 중요하다고 간주되지 않으면 그 물질은 비면역원성으로 생각된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 약 2개 내지 약 300개의 말단을 갖는 것을 특징으로 한다. 예시적인 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 등, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린("POZ")(WO 2008/106186호에 기재된 것), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 임의의 상기의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 특정한 구조로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 각각 하나 이상의 분해성 연결을 갖거나 갖지 않는 선형 구성(예를 들어, 말단 캡핑된, 예를 들어 알콕시 PEG 또는 이작용성 PEG), 분지된 또는 다중 팔 구성(예를 들어, 포킹된 PEG 또는 폴리올 코어에 부착된 PEG), 수지상 구성(또는 별 구성)이다. 게다가, 수용성 중합체의 내부 구조는 임의의 수의 상이한 반복 패턴으로 체계화될 수 있고, 단독중합체, 교대 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교대 삼원중합체, 랜덤 삼원중합체 및 블록 삼원중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-21 접합체에서의 수용성 중합체의 중량 평균 분자량은 약 100 달톤 내지 약 150,000 달톤이다. 예시적인 범위는 예를 들어 5,000 달톤 초과 내지 약 100,000 달톤의 범위, 약 6,000 달톤 내지 약 90,000 달톤의 범위, 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 10,000 달톤 초과 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 53,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 25,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 29,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 35,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 및 약 40,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위의 중량 평균 분자량을 포함한다.
수용성 중합체에 대한 예시적인 중량 평균 분자량은 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤 및 약 75,000 달톤을 포함한다. 임의의 상기의 총 분자량을 갖는 수용성 중합체의 분지된 버전(예를 들어, 2개의 20,000 달톤 중합체로 이루어진 분지된 40,000 달톤 수용성 중합체)을 또한 사용할 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 접합체는 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 임의의 PEG 모이어티를 가지지 않을 것이고, PEG는 약 6,000 달톤 미만의 중량 평균 분자량을 갖는다.
PEG는 전형적으로 다수의 (OCH2CH2) 단량체[또는 PEG가 어떻게 정의되는지에 따라 (CH2CH2O) 단량체]를 포함할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 반복 단위의 수는 "(OCH2CH2)n"에서 첨자 "n"에 의해 확인된다. 따라서, (n)의 값은 전형적으로 하기 범위 중 하나 이상 내에 해당한다: 2 내지 약 3400, 약 100 내지 약 2300, 약 100 내지 약 2270, 약 136 내지 약 2050, 약 225 내지 약 1930, 약 450 내지 약 1930, 약 1200 내지 약 1930, 약 568 내지 약 2727, 약 660 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 909 내지 약 2730, 및 약 1,200 내지 약 1,900. 분자량이 알려진 임의의 주어진 중합체에 대해, 반복 단량체의 분자량에 의해 중합체의 총 중량 평균 분자량을 나누어서 반복 단위의 수(즉, "n")를 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 말단 캡핑된 중합체, 즉 저급 C1-6 알콕시기 또는 하이드록실기와 같은 비교적 불활성인 기로 캡핑된 적어도 하나의 말단을 갖는 중합체이다. 중합체가 PEG일 때, 예를 들어 PEG의 선형 형태인 메톡시-PEG(흔히 mPEG라 칭함)를 사용할 수 있고, 여기서 중합체의 하나의 말단은 메톡시(-OCH3) 기인 한편, 다른 말단은 하이드록실 또는 선택적으로 화학적으로 변형될 수 있는 다른 작용성 기이다.
일부 구현예에서, 예시적인 수용성 중합체는 Quanta Biodesign, Ltd로부터의 선형 또는 분지된 별개의 PEG(dPEG); Nektar Therapeutics로부터의 선형, 분지된 또는 포킹된 PEG; JenKem Technology로부터의 선형, 분지된 또는 Y-형상의 PEG 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 등, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린("POZ"), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 이들의 조합으로부터 선택된 수용성 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 PEG에 접합(예를 들어, PEG화)된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 PPG에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 POZ에 접합된다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 PVP에 접합된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 폴리글리세롤(PG)을 포함한다. 일부 경우에, 폴리글리세롤은 과분지된 PG(HPG)이다(예를 들어, 문헌[Imran, et al. “Influence of architecture of high molecular weight linear and branched polyglycerols on their biocompatibility and biodistribution," Biomaterials 33:9135-9147 (2012)]에 의해 기재된 바와 같음). 다른 경우에, 폴리글리세롤은 선형 PG(LPG)이다. 추가의 경우에, 폴리글리세롤은 중작용성 PG, 선형-블록-과분지된 PG(예를 들어, 문헌[Wurm et. Al., "Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library of linear and hyperbranched poly(glycerol)-protein conjugates," Biomacromolecules 13:1161-1171 (2012)]에 의해 기재된 바와 같음), 또는 측쇄 작용성 PG(예를 들어, 문헌[Li, et. al., "Synthesis of linear polyether polyol derivatives as new materials for bioconjugation," Bioconjugate Chem. 20:780-789 (2009)]에 의해 기재된 바와 같음)이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 PG, 예를 들어 HPG, LPG, 중작용성 PG, 선형-블록-과분지된 PG 또는 측쇄 작용성 PG에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 분해성 합성 PEG 대안이다. 예시적인 분해성 합성 PEG 대안은 폴리[올리고(에틸렌 글리콜)메틸 메타크릴레이트](POEGMA); 텔레켈릭 또는 디-말단-작용기화 PEG계 마크로단량체의 중합에 의해 생성된 골격 변형된 PEG 유도체; 분해성 연결을 포함하는 공단량체를 포함하는 PEG 유도체, 예컨대 폴리[(에틸렌 옥사이드)-코-(메틸렌 에틸렌 옥사이드)][P(EO-코-MEO)], OEGMA와 공중합된 5,6-벤조-2-메틸렌-1,3-디옥세판(BMDO), 2-메틸렌-1,3-디옥세판(MDO) 및 2-메틸렌-4-페닐-1,3-디옥솔란(MPDL)과 같은 환식 케텐 아세탈; 또는 폴리-(ε-카프로락톤)-그래프트-폴리(에틸렌 옥사이드)(PCL-g-PEO)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 예를 들어 POEGM; 텔레켈릭 또는 디-말단-작용기화 PEG계 마크로단량체의 중합에 의해 생성된 골격 변형된 PEG 유도체; P(EO-코-MEO); OEGMA와 공중합된 환식 케텐 아세탈, 예컨대 BMDO, MDO 및 MPDL; 또는 PCL-g-PEO와 같은 분해성 합성 PEG 대안에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리(양쪽성 이온)을 포함한다. 예시적인 폴리(양쪽성 이온)은 폴리(설포베타인 메타크릴레이트)(PSBMA), 폴리(카복시베타인 메타크릴레이트)(PCBMA) 및 폴리(2-메틸아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린)(PMPC)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 폴리(양쪽성 이온), 예컨대 PSBMA, PCBMA 또는 PMPC에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리카보네이트를 포함한다. 예시적인 폴리카본은 펜타플루오로페닐 5-메틸-2-옥소-1,3-디옥산-5-카복실레이트(MTC-OC6F5)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 폴리카보네이트, 예컨대 MTC-OC6F5에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 예를 들어 폴리카보네이트/PEG 중합체 하이브리드, 펩타이드/단백질-중합체 접합체, 또는 하이드록실 함유 및/또는 양쪽성 이온성 유도체화 중합체(예를 들어, 하이드록실 함유 및/또는 양쪽성 이온성 유도체화 PEG 중합체)와 같은 중합체 하이브리드를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 폴리카보네이트/PEG 중합체 하이브리드, 펩타이드/단백질-중합체 접합체, 또는 하이드록실 함유 및/또는 양쪽성 이온성 유도체화 중합체(예를 들어, 하이드록실 함유 및/또는 양쪽성 이온성 유도체화 PEG 중합체)와 같은 중합체 하이브리드에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리사카라이드를 포함한다. 예시적인 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알우론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 덱스트란에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 PSA에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 HA에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 아밀로스에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 헤파린에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 HS에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 덱스트린에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 HES에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 글리칸을 포함한다. 예시적인 글리칸 종류는 N-연결된 글리칸, O-연결된 글리칸, 당지질, O-GlcNAc 및 글리코사미노글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 글리칸에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 N-연결된 글리칸에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 O-연결된 글리칸에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 당지질에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 O-GlcNAc에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 글리코사미노글리칸에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리옥사졸린 중합체를 포함한다. 폴리옥사졸린 중합체는 선형 합성 중합체이고, PEG와 유사하고, 낮은 다분산도를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리옥사졸린 중합체는 평균 분자량을 특징으로 하는 다분산된 폴리옥사졸린 중합체이다. 일부 구현예에서, 폴리옥사졸린 중합체의 평균 분자량은 예를 들어 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000 또는 500,000 Da를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리옥사졸린 중합체는 폴리(2-메틸 2-옥사졸린)(PMOZ), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(PEOZ) 또는 폴리(2-프로필 2-옥사졸린)(PPOZ)을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 폴리옥사졸린 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 PMOZ에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 PEOZ에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 PPOZ에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리아크릴산 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 폴리아크릴산 중합체에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리아민을 포함한다. 폴리아민은 2개 이상의 1차 아미노기를 포함하는 유기 중합체이다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 분지된 폴리아민, 선형 폴리아민 또는 환식 폴리아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 저분자량 선형 폴리아민이다. 예시적인 폴리아민은 푸트레신, 카다베린, 스페르미딘, 스페르민, 에틸렌 디아민, 1,3-디아미노프로판, 헥사메틸렌디아민, 테트라에틸메틸렌디아민 및 피페라진을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 폴리아민에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 푸트레신, 카다베린, 스페르미딘, 스페르민, 에틸렌 디아민, 1,3-디아미노프로판, 헥사메틸렌디아민, 테트라에틸메틸렌디아민 또는 피페라진에 접합된다.
지질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 지질이다. 일부 경우에, 지질은 지방산이다. 일부 경우에, 지방산은 포화 지방산이다. 다른 경우에, 지방산은 불포화 지방산이다. 예시적인 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12 내지 약 18 탄소 원자를 포함하는 지방산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 지질은 하나 이상의 혈청 단백질에 결합하여 혈청 안정성 및/또는 혈청 반감기를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 지질은 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드에 접합된다. 일부 경우에, 지질은 지방산, 예를 들어 포화 지방산 또는 불포화 지방산이다. 일부 경우에, 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12 내지 약 18 탄소 원자이다. 일부 경우에, 지방산은 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 탄소 원자의 길이를 포함한다. 일부 경우에, 지방산은 카프로산(헥산산), 에난트산(헵탄산), 카프릴산(옥탄산), 펠라르곤산(노난산), 카프르산(데칸산), 운데실산(운데칸산), 라우르산(도데칸산), 트리데실산(트리데칸산), 미리스트산(테트라데칸산), 펜타데실산(펜타데칸산), 팔미트산(헥사데칸산), 마르가르산(헵타데칸산), 스테아르산(옥타데칸산), 노나데실산(노나데칸산), 아라키드산(에이코산산), 헤네이코실산(헤네이코산산), 베헨산(도코산산), 트리코실산(트리코산산), 리그노세르산(테트라코산산), 펜타코실산(펜타코산산) 또는 세로트산(헥사코산산)을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 지질 접합체는 혈청 안정성 및/또는 혈청 반감기를 향상시킨다.
단백질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 단백질 또는 이의 결합 단편이다. 예시적인 단백질은 알부민, 트랜스페린 또는 트랜스티레틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 결합 단편은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함하는 IL-15 접합체는 혈청 반감기, 및/또는 안정성이 증가한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함하는 IL-15 접합체는 하나 이상의 IL-15R/IL-2R 아단위와의 IL-15 상호작용이 감소한다. 추가의 경우에, 단백질 또는 이의 결합 단편은 하나 이상의 IL-15R/IL-2R 아단위와의 IL-15 상호작용을 차단한다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 알부민이다. 알부민은 수용성 구상형 단백질의 패밀리이다. 이것은 모든 혈장 단백질의 약 55% 내지 60%를 포함하는 혈액 혈장에서 흔히 발견된다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 3차 구조가 도메인 I(1번 내지 195번 아미노산 잔기), 도메인 II(196번 내지 383번 아미노산 잔기) 및 도메인 III(384번 내지 585번 아미노산 잔기)의 3가지의 도메인으로 나눠진 585개의 아미노산 폴리펩타이드이다. 각각의 도메인은 내인성 리간드와 가역적으로 또는 비가역적으로 상호작용할 수 있는 결합 부위, 예컨대 긴 사슬 및 중간 사슬 지방산, 빌리루빈 또는 헤민, 또는 외인성 화합물, 예컨대 복소환식 또는 방향족 화합물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 알부민에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 인간 혈청 알부민(HSA)에 접합된다. 추가의 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 알부민의 작용성 단편에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 트랜스페린이다. 트랜스페린은 약 80 kDa 크기이고, N-말단 도메인에서 하나이고 C-말단 도메인에서 다른 하나인 2개의 Fe3 + 결합 부위를 포함하는 679개의 아미노산 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 인간 트랜스페린은 약 7일 내지 12일의 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 트랜스페린에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 인간 트랜스페린에 접합된다. 추가의 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 트랜스페린의 작용성 단편에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 트랜스티레틴(TTR)이다. 트랜스티레틴은 갑상선 호르몬 티록신(T4) 및 레티놀에 결합된 레티놀 결합 단백질을 운반시키는 혈청 및 뇌척수액에 있는 운반 단백질이다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 (이의 말단 중 하나를 통해 또는 내부 힌지 영역을 통해) 트랜스티레틴에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 트랜스티레틴의 작용성 단편에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 쥣과 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 휴마바디, 디설파이드 안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일-도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타 항체 또는 이의 결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다.
일부 경우에, 접합 모이어티는 scFv, 비스-scFv, (scFv)2, dsFv 또는 sdAb를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 scFv를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 비스-scFv를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 (scFv)2를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 dsFv를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 sdAb를 포함한다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 항체, 예를 들어 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 모이어티는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 결합 단편에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 쥣과 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 휴마바디, 디설파이드 안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일-도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타 항체 또는 이의 결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체에 접합된다. 추가의 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 항체의 Fc 부분에 접합된다. 추가의 경우에, IL-15 폴리펩타이드는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 부분에 접합된다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 및 항체 또는 이의 결합 단편에 접합된다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 쥣과 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 휴마바디, 디설파이드 안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일-도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타 항체 또는 이의 결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 scFv, 비스-scFv, (scFv)2, dsFv 또는 sdAb를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 scFv를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-15 접합체를 관심 표적 세포로 안내하고, 수용성 중합체는 안정성 및/또는 혈청 반감기를 향상시킨다.
일부 경우에, 하나 이상의 IL-15 폴리펩타이드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체는 항체 또는 이의 결합 단편에 추가로 결합된다. 일부 경우에, IL-15 접합체 대 항체의 비율은 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1 또는 12:1이다. 일부 경우에, IL-15 접합체 대 항체의 비율은 약 1:1이다. 다른 경우에, IL-15 접합체 대 항체의 비율은 약 2:1, 3:1 또는 4:1이다. 추가의 경우에, IL-15 접합체 대 항체의 비율은 약 6:1 이상이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 IL-15 폴리펩타이드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체는 항체 또는 이의 결합 단편에 직접적으로 결합된다. 다른 경우에, IL-15 접합체는 링커로 항체 또는 이의 결합 단편에 간접적으로 결합된다. 예시적인 링커는 동종이작용성 링커, 이종이작용성 링커, 말레이미드계 링커, 0-트레이스 링커, 자가-비등몰 링커, 스페이서 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-15 폴리펩타이드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체의 IL-15 폴리펩타이드 부분에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. 이러한 경우에, IL-15 폴리펩타이드에 대한 항체의 접합 부위는 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15R의 결합을 방해하지 않는 부위에 있다. 추가의 경우에, IL-15 폴리펩타이드에 대한 항체의 접합 부위는 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15R의 결합을 부분적으로 차단하는 부위에 있다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-15 폴리펩타이드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체의 수용성 중합체 부분에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
펩타이드
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 비구조화된 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 사이토카인(예를 들어, 인터류킨, IFN 또는 TNF) 폴리펩타이드는 펩타이드에 접합된다. 일부 구현예에서, 펩타이드를 포함하는 IL-15 접합체는 혈청 반감기, 및/또는 안정성이 증가한다. 일부 구현예에서, 펩타이드를 포함하는 IL-15 접합체는 하나 이상의 IL-15R 아단위와의 감소된 IL-15 상호작용을 갖는다. 추가의 경우에, 펩타이드는 하나 이상의 IL-15R 아단위와의 IL-15 상호작용을 차단한다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 XTEN™ 펩타이드(Amunix Operating Inc.)이고, 변형은 XTEN화라 칭해진다. XTEN화는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 상이한 백분율의 Ala, Glu, Gly, Ser 및 Thr의 6개의 아미노산을 포함하는 긴 비구조화된 친수성 펩타이드인 XTEN™ 펩타이드(Amunix Operating Inc.)를 암호화하는 핵산과의 유전 융합이다. 일부 구현예에서, XTEN™ 펩타이드는 관심 폴리펩타이드와 조합되어 발현, 유전자 안정성, 용해도, 응집 저항, 반감기의 증대, 효력의 증가, 및/또는 시험관내 활성의 증가와 같은 특성에 기초하여 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인(예를 들어, 인터류킨, IFN 또는 TNF) 폴리펩타이드는 XTEN 펩타이드에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 XTEN 펩타이드에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP)이고, 변형은 HAP화라 칭해진다. HAP화는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP)를 암호화하는 핵산의 유전 융합이다. 일부 구현예에서, HAP 중합체는 (Gly4Ser)n 반복 모티프를 포함하고, 때때로 약 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개 이상의 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 사이토카인(예를 들어, 인터류킨, IFN 또는 TNF) 폴리펩타이드는 HAP에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 HAP에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 PAS 폴리펩타이드이고, 변형은 PAS화라 칭해진다. PAS화는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 PAS 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 유전 융합이다. PAS 폴리펩타이드는 Pro, Ala 및 Ser 잔기로 이루어진 친수성 비하전 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, PAS 폴리펩타이드의 길이는 적어도 약 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 사이토카인(예를 들어, 인터류킨, IFN 또는 TNF) 폴리펩타이드는 PAS 폴리펩타이드에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 PAS 폴리펩타이드에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP)이고, 변형은 ELP화라 칭해진다. ELP화는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP)를 암호화하는 핵산의 유전 융합이다. ELP는 VPGxG 반복 모티프를 포함하고, 여기서 x는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 사이토카인(예를 들어, 인터류킨, IFN 또는 TNF) 폴리펩타이드는 ELP에 접합된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 ELP에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 CTP 펩타이드이다. CTP 펩타이드는 31개의 아미노산 잔기 펩타이드 FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ를 포함하고, 여기서 S*는 O-글라이코실화 부위(OPKO)를 나타낸다. 일부 구현예에서, CTP 펩타이드는 사이토카인 폴리펩타이드(예를 들어, IL-15 폴리펩타이드)에 유전자 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인 폴리펩타이드(예를 들어, IL-15 폴리펩타이드)는 CTP 펩타이드에 접합된다.
일부 구현예에서, 사이토카인(예를 들어, IL-15 폴리펩타이드)은 글루타밀화에 의해 변형된다. 글루타밀화(또는 폴리글루타밀화)는 글루타메이트의 가역적인 번역 후 변형이고, 여기서 글루타메이트의 γ-카복시기는 유리 글루타메이트의 아미노기와 펩타이드-유사 결합을 형성하고, 여기서 α-카복시기는 폴리글루타메이트 사슬로 확장된다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, GLK 중합체는 다수의 Gly-Xaa-Yaa 반복부를 포함하고, 여기서 Xaa 및 Yaa는 주로 각각 프롤린 및 4-하이드록시프롤린을 포함한다. 일부 구현예에서, GLK 중합체는 아미노산 잔기 Pro, Gly, Glu, Qln, Asn, Ser 및 Lys를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, GLK 중합체의 길이는 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 150개 이상의 잔기이다.
추가의 접합 모이어티
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 세포외 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 바이오마커는 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 예시적인 세포외 바이오마커는 CD19, PSMA, B7-H3, B7-H6, CD70, CEA, CSPG4, EGFRvIII, EphA3, EpCAM, EGFR, ErbB2(HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, 루이스-Y, 메소텔린, Muc1, Muc 16, ROR1, TAG72, VEGFR2, CD11, Gr-1, CD204, CD16, CD49b, CD3, CD4, CD8 및 B220을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-15에 결합되거나 접합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 예를 들어 IL-15의 N-말단 또는 C-말단에서 유전자 융합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 번역 후 변형으로부터의 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 번역 후 변형의 예는 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화(또는 프레닐화)(예를 들어, 파르네실화 또는 게라닐게라닐화), 글리피화, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, S-아실화), 알킬화(예를 들어, 알킬기, 예컨대 메틸 또는 에틸기의 첨가), 아미드화, 글라이코실화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오타이드 첨가, 산화, 인산화, 숙신일화, 황화, 당화, 카바밀화, 글루타밀화 또는 탈아미드화를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15는 번역 후 변형, 예컨대 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화(또는 프레닐화)(예를 들어, 파르네실화 또는 게라닐게라닐화), 글리피화, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, S-아실화), 알킬화(예를 들어, 알킬기, 예컨대 메틸 또는 에틸기의 첨가), 아미드화, 글라이코실화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오타이드 첨가, 산화, 인산화, 숙신일화, 황화, 당화, 카바밀화, 글루타밀화 또는 탈아미드화에 의해 변형된다.
링커
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드에 접합 모이어티를 접합하거나 결합시키기 위한 유용한 작용성 반응성 기는 예를 들어 0 또는 더 고차의 링커를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 인터류킨으로 편입된 비천연 아미노산은 작용성 반응성 기를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 본원에 기재된 인터류킨으로 편입된 비천연 아미노산과 반응하는 작용성 반응성 기를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 본원에 기재된 인터류킨으로 편입된 비천연 아미노산과 반응하는 작용성 반응성 기를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 본원에 기재된 링커(선택적으로 사이토카인 펩타이드에 미리 부착됨)와 반응하는 작용성 반응성 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드에서 천연 아미노산과 반응하는 반응성 기를 포함한다. 일부 경우에, 더 고차의 링커는 이작용성 링커, 예컨대 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커를 포함한다. 예시적인 동종이작용성 링커는 Lomant 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(설포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 디숙신이미딜 수버레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수버레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포숙신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠과 같은 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐설폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디요오도-p-자일렌 설폰산, N,N'-에틸렌-비스(요오도아세트아미드) 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(요오도아세트아미드)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 이작용성 링커는 이종이작용성 링커를 포함한다. 예시적인 이종이작용성 링커는 아민 반응성 및 설프하이드릴 가교결합제, 예컨대 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(설포-MB), N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 설포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)설포숙신이미드 에스테르(설포-GMB), 숙신이미딜 6-((요오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((요오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-((((4-요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 요오도아세테이트(NPIA), 카보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 가교결합제, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), 아민 반응성 및 광 반응성 가교결합제, 예컨대 N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NO), 설포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-설포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(설포-sADP), 설포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(설포-sAPB), 설포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 설포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(설포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 설프하이드릴 반응성 및 광 반응성 가교결합제, 예컨대 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(요오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-요오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 카보닐 반응성 및 광 반응성 가교결합제, 예컨대 ρ-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 카복실레이트 반응성 및 광 반응성 가교결합제, 예컨대 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA), 및 아르기닌 반응성 및 광 반응성 가교결합제, 예컨대 ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 반응성 작용성 기는 결합 모이어티(예를 들어, 접합 모이어티 또는 IL-15)에 존재하는 친전자성 기에 반응성인 친핵성 기를 포함한다. 예시적인 친전자성 기는 카보닐기, 예컨대 알데하이드, 케톤, 카복실산, 에스테르, 아미드, 에논, 아실 할라이드 또는 산 언하이드라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응성 작용성 기는 알데하이드이다. 예시적인 친핵성 기는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴하이드라지드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 인터류킨으로 편입된 비천연 아미노산은 친전자성 기를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 디펩타이드 링커이다. 일부 구현예에서, 디펩타이드 링커는 발린-시트룰린(Val-Cit), 페닐알라닌-리신(Phe-Lys), 발린-알라닌(Val-Ala) 및 발린-리신(Val-Lys)이다. 일부 구현예에서, 디펩타이드 링커는 발린-시트룰린이다.
일부 구현예에서, 링커는 예를 들어 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 링커이다. 일부 경우에, 펩타이드 링커는 기껏해야 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 이하의 아미노산을 포함한다. 추가의 경우에, 펩타이드 링커는 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 자가-비등몰 링커 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-비등몰 링커 모이어티는 p-아미노벤질 알콜(PAB), p-아미노벤지옥시카보닐(PABC), 또는 이의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 디펩타이드 링커 모이어티 및 자가-비등몰 링커 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-비등몰 링커 모이어티는 예컨대 미국 특허 제9089614호 및 WIPO 출원 WO2015038426호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 글루쿠로나이드이다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 산 절단 가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 산 절단 가능한 링커는 하이드라진이다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 환원성 링커이다.
일부 구현예에서, 링커는 말레이미드기를 포함한다. 일부 경우에, 말레이미드기는 또한 말레이미드 스페이서라 칭해진다. 일부 경우에, 말레이미드기는 추가로 카프로산을 포함하여 말레이미도카프로일(mc)을 형성한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 경우에, 말레이미드기는 상기 기재된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC) 또는 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-sMCC)와 같은 말레이미도메틸기를 포함한다.
일부 구현예에서, 말레이미드기는 자가 안정화 말레이미드이다. 일부 경우에, 자가 안정화 말레이미드는 티오숙신이미드 고리 가수분해의 분자내 촉매작용을 제공하기 위해 말레이미드에 인접한 염기성 아미노기를 편입하기 위해 디아미노프로피온산(DPR)을 사용하여 레트로-마이클(retro-Michael) 반응을 통해 제거 반응을 겪는 말레이미드를 제거한다. 일부 경우에, 자가 안정화 말레이미드는 문헌[Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)]에 기재된 말레이미드기이다. 일부 경우에, 링커는 자가 안정화 말레이미드를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 자가 안정화 말레이미드이다.
접합 화학
다양한 접합 반응은 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드로 편입된 링커, 접합 모이어티 및 비천연 아미노산을 접합시키도록 사용된다. 이러한 접합 반응은 대개 수성 조건, 예컨대 "생물직교" 반응에 적합하다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 화학 시약, 예컨대 촉매, 광, 또는 링커에서 발견된 반응성 화학 기, 접합 모이어티 또는 비천연 아미노산에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 효소에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 접합 반응은 문헌[Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 접합 반응은 문헌[Chen, X.; Wu. Y-W. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5417]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 접합 반응은 케톤 또는 알데하이드와 친핵체의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 옥심을 형성하기 위한 케톤과 아미녹시기의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 이민을 형성하기 위한 케톤과 아릴 또는 헤테로아릴 아민기의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 이민을 형성하기 위한 알데하이드와 아릴 또는 헤테로아릴 아민기의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 옥심을 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-15 폴리펩타이드를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 알데하이드 또는 케톤과 트립타민 친핵체의 피테트-스펭글러(Pictet-Spengler) 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 하이드라지노-피테트-스펭글러 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 피테트-스펭글러 결찰을 포함한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드 및 포스핀의 반응(슈타우딩거 결찰)을 포함한다. 일부 구현예에서, 포스핀은 아릴 포스핀이다. 일부 구현예에서, 아릴 포스핀은 오르토 에스테르기를 포함한다. 일부 구현예에서, 포스핀은 구조 메틸 2-(디페닐포스파네일)벤조에이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아릴아미드를 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-15 폴리펩타이드를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아미드를 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-15 폴리펩타이드를 생성시킨다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 1,3-양극이온 고리화첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 1,3-양극이온 고리화첨가 반응은 아지드 및 포스핀의 반응("클릭(Click)" 반응)을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 구리에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 트리아졸을 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-15 폴리펩타이드를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 구속된 올레핀의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 구속된 알킨의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 사이클로알킨, 예를 들어 OCT, DIFO, DIFBO, DIBO, BARAC, TMTH 또는 다른 구속된 사이클로알킨의 반응을 포함하고, 이의 구조는 문헌[Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 1,3-양극이온 고리화첨가 반응은 광에 의해 촉매된다("광클릭"). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 말단 알릴기와 테트라졸 및 광의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 말단 알키닐기와 테트라졸 및 광의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 O-알릴 아미노산과 테트라진 및 광의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 O-알릴 티로신과 테트라진 및 광의 반응을 포함한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 디엔 및 친디엔체를 포함하는 역-전자 수요 고리화첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 디엔은 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, 친디엔체는 알켄을 포함한다. 일부 구현예에서, 친디엔체는 알킨을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킨은 구속된 알킨이다. 일부 구현예에서, 알켄은 구속된 디엔이다. 일부 구현예에서, 알킨은 트랜스-사이클로옥틴이다. 일부 구현예에서, 알킨은 사이클로옥텐이다. 일부 구현예에서, 알켄은 사이클로프로펜이다. 일부 구현예에서, 알켄은 플루오로사이클로프로펜이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 고리에서 2개의 질소 원자를 포함하는 6원 고리 헤테로사이클을 통해 링커 또는 접합 모이어티에 부착된 IL-15 폴리펩타이드를 형성시킨다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 올레핀 복분해 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 알켄 및 알킨과 루테늄 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 2개의 알켄과 루테늄 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 2개의 알킨과 루테늄 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 알켄 또는 알킨과 루테늄 촉매 및 알릴기를 포함하는 아미노산의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 알켄 또는 알킨과 루테늄 촉매 및 알릴 설파이드 또는 셀레나이드를 포함하는 아미노산의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 루테늄 촉매는 호베다-구럽(Hoveda-Grubbs) 2세대 촉매이다. 일부 구현예에서, 올레핀 복분해 반응은 하나 이상의 구속된 알켄 또는 알킨의 반응을 포함한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 알켄과의 (4+2+ 고리화첨가 반응을 포함한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 교차-커플링 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 교차-커플링 반응은 전이 금속 촉매, 예컨대 이리듐, 금, 루테늄, 로듐, 팔라듐, 니켈, 백금, 또는 다른 전이 금속 촉매 및 하나 이상의 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속 촉매는 수용성이다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 스즈키-미야우라 교차-커플링 반응을 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아릴 할라이드(또는 트리플레이트 또는 토실레이트), 아릴 또는 알케닐 보론산, 및 팔라듐 촉매의 반응을 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 소노가시라 교차-커플링 반응을 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아릴 할라이드(또는 트리플레이트 또는 토실레이트), 알킨 및 팔라듐 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 교차-커플링 반응은 탄소-탄소 결합을 통해 IL-15 폴리펩타이드에 링커 또는 접합 모이어티를 부착시킨다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 접합 전에 반응성 기의 탈보호 또는 "비케이징" 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 광에 의한 반응성 기의 비케이징, 이어서 접합 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 하나 이상의 니트로기를 포함하는 아랄킬 모이어티로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응성 기의 비케이징은 유리 아민, 설파이드 또는 다른 반응성 기를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 전이 금속 촉매에 의한 반응성 기의 비케이징, 이어서 접합 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속 촉매는 팔라듐 및 하나 이상의 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 알릴 모이어티로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 알릴 카바메이트로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 프로파길 모이어티로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 프로파길 카바메이트로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 친디엔체로 보호되고, 여기서 디엔(예컨대, 테트라진)에 대한 노출은 반응성 기를 탈보호시킨다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 리간드-지정 반응을 포함하고, 여기서 (선택적으로) 반응성 기에 부착된 리간드는 반응성 기와 IL-15 폴리펩타이드 사이의 접합의 부위를 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 리간드는 IL-15 폴리펩타이드와 반응성 기의 반응 동안에 또는 후에 절단된다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드의 접합 부위는 천연 아미노산이다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드의 접합 부위는 리신, 시스테인 또는 세린이다. 일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드의 접합 부위는 본원에 기재된 비천연 아미노산이다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 이탈기, 예컨대 전자 부족 아릴 또는 헤테로아릴기를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응성 기는 이탈기, 예컨대 IL-15 폴리펩타이드에 의해 대체된 전자 부족 알킬기를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 라디칼 포획제와 라디칼 종의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 산화성 라디칼 첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 라디칼 포획제는 아릴아민이다. 일부 구현예에서, 라디칼 종은 티로실 라디칼이다. 일부 구현예에서, 라디칼 종은 루테늄 촉매(예컨대, [Ru(bpy)3]) 및 광에 의해 생성된다.
효소 반응은 선택적으로 본원에 기재된 접합 반응에 사용된다. 예시적인 효소 접합은 SortA 매개 접합, TGs 매개 접합 또는 FGE 매개 접합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아미드 결합을 형성하도록 티오에스테르에 의한 말단 1-아미노-2-티오기의 자연적 단백질 결찰(NPL: native protein ligation)을 포함한다.
링커 또는 접합 모이어티를 IL-15 폴리펩타이드와 반응시키기 위한 다양한 접합 반응이 본원에 기재되고, 여기서 반응은 IL-15 폴리펩타이드에서 천연("정규") 아미노산에 의해 발생한다. 일부 구현예에서, 접합 위치에서 발견된 천연 아미노산은 야생형 서열에서 발견되거나, 대안적으로 그 위치는 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 IL-15 잔기에서 디설파이드 결합의 형성을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 시스테인 또는 리신의 1,4 마이클 첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 IL-15의 시아노벤조티아졸 결찰을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 아세톤 모이어티, 예컨대 1,3-디클로로-2-프로피오논과의 가교결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 시스테인과 O-메시틸렌설포닐하이드록실아민의 반응에 의해 형성된 데하이드로알라닌에 대한 1,4 마이클 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 티로신과 트리아졸린디온(TAD) 또는 TAD 유도체의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 트립토판과 로듐 카르베노이드의 반응을 포함한다.
사용 방법
증식성 질환 또는 병태
일부 구현예에서, 치료학적 유효량의 본원에 기재된 IL-15 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 증식성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드 및 접합 모이어티를 포함하고, 여기서 IL-15 접합체는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15 수용체 α(IL-15Rα) 아단위에 대한 친화도가 감소한다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드; 및 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된 아미노산 위치에서 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티를 포함하고, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 1에 상응한다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드; 및 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된 아미노산 위치에서 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 접합체는 IL-15/IL-15Rβγ 복합체를 형성하기 위해 우선적으로 IL-15Rβ 및 IL-15Rβγ 아단위와 상호작용한다. 일부 구현예에서, IL-15/IL-15Rβγ 복합체는 Teff 세포(예를 들어, CD8+ Teff 세포) 및/또는 NK 세포의 팽창을 자극하고/하거나 향상시킨다. 추가의 경우에, Teff 세포의 팽창은 Teff 집단을 향한 Teff:Treg 비율을 왜곡한다.
일부 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 고형 종양을 치료하기 위해 고형 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 이러한 경우에, 대상체는 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 눈암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 방광암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 유방암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 결장직장암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 식도암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 두경부암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 신장암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 폐암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 흑색종의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 난소암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 췌장암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 전립선암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 전이성 암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 추가의 경우에, IL-15 접합체는 재발성 또는 난치성 암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 암은 혈액학적 악성상태이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 혈액학적 악성상태를 치료하기 위해 이 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소형 림프구성 림프종(SLL), 소포성 림프종(FL), 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL), 외투 세포 림프종(MCL), 발데스트롬 마크로글로불린증, 다발성 골수종, 결절외 가장자리 영역 B 세포 림프종, 노드 가장자리 영역 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비버킷 고등급 B 세포 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종(PMBL), 면역아구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 형질구성 림프종, 비장 가장자리 영역 림프종, 혈장 세포 골수종, 형질세포종, 종격(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종 또는 림프종모양 육아종증을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 CLL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 SLL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 FL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 DLBCL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 MCL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 발데스트롬 마크로글로불린증의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 다발성 골수종의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 버킷 림프종의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 전이성 혈액학적 악성상태의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 추가의 경우에, IL-15 접합체는 재발성 또는 난치성 혈액학적 악성상태의 치료를 위해 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 추가의 치료제는 대상체에게 추가로 투여된다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 IL-15 접합체와 동시에 투여된다. 다른 경우에, 추가의 치료제 및 IL-15 접합체는 순차적으로 투여되고, 예를 들어 IL-15 접합체는 추가의 치료제 전에 투여되거나, IL-15 접합체는 추가의 치료제의 투여 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 추가의 치료제는 화학치료제, 면역치료제, 표적화 치료, 방사선 치료 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 추가의 치료제는 알킬화제, 예컨대 알트레타민, 부술판, 카보플라틴, 카르무스틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 다카르바진, 로무스틴, 멜팔란, 옥살라플라틴, 테모졸로마이드 또는 티오테파; 항대사물질, 예컨대 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈, 사이타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트 또는 페메트렉세드; 안트라사이클린, 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 또는 이다루비신; 토포아이소머라제 I 저해제, 예컨대 토포테칸 또는 이리노테칸(CPT-11); 토포아이소머라제 II 저해제, 예컨대 에토포사이드(VP-16), 테니포사이드 또는 미톡산트론; 유사분열 저해제, 예컨대 도세탁셀, 에스트라무스틴, 익사베필론, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈; 또는 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 덱사메타손을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 추가의 치료제는 제1선 치료를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "제1선 치료"는 암을 갖는 대상체에 대한 1차 치료를 포함한다. 일부 경우에, 암은 원발성 또는 국소 암이다. 다른 경우에, 암은 전이성 또는 재발성 암이다. 일부 경우에, 제1선 치료는 화학요법을 포함한다. 다른 경우에, 제1선 치료는 면역요법, 표적화 치료 또는 방사선 치료를 포함한다. 당업자는 상이한 제1선 치료가 상이한 유형의 암에 적용 가능할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
일부 구현예에서, IL-15 접합체는 알킬화제, 예컨대 알트레타민, 부술판, 카보플라틴, 카르무스틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 다카르바진, 로무스틴, 멜팔란, 옥살라플라틴, 테모졸로마이드 또는 티오테파; 항대사물질, 예컨대 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈, 사이타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트 또는 페메트렉세드; 안트라사이클린, 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 또는 이다루비신; 토포아이소머라제 I 저해제, 예컨대 토포테칸 또는 이리노테칸(CPT-11); 토포아이소머라제 II 저해제, 예컨대 에토포사이드(VP-16), 테니포사이드 또는 미톡산트론; 유사분열 저해제, 예컨대 도세탁셀, 에스트라무스틴, 익사베필론, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈; 또는 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 덱사메타손으로부터 선택된 추가의 치료제와 투여된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 효소 폴리 ADP 리보스 중합효소(PARP)의 저해제와 투여된다. 예시적인 PARP 저해제는 올라파립(AZD-2281, Lynparza®, Astra Zeneca로부터), 루카파립(PF-01367338, Rubraca®, Clovis Oncology로부터), 니라파립(MK-4827, Zejula®, Tesaro로부터), 탈라조파립(BMN-673, BioMarin Pharmaceutical Inc.로부터), 벨리파립(ABT-888, AbbVie로부터), CK-102(이전에 CEP 9722, Teva Pharmaceutical Industries Ltd.로부터), E7016(Eisai로부터), 이니파립(BSI 201, Sanofi로부터) 및 파미파립(BGB-290, BeiGene으로부터)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, IL-15 접합체는 PARP 저해제, 예컨대 올라파립, 루카파립, 니라파립, 탈라조파립, 벨리파립, CK-102, E7016, 이니파립 또는 파미파립과 조합되어 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 티로신 키나제 저해제(TKI)와 투여된다. 예시적인 TKI는 아파티닙, 아렉티닙, 악시티닙, 보수티닙, 카보잔티닙, 세리티닙, 코비메티닙, 크리조티닙, 다브라페닙, 다사티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 이브루티닙, 이마티닙, 라파티닙, 렌바티닙, 닐로티닙, 닌테다닙, 오시메르티닙, 파조파닙, 포나티닙, 레고라페닙, 룩솔리티닙, 소라페닙, 수니티닙, 토파시티닙 및 반데타닙을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 면역 관문 조절제와 투여된다. 예시적인 관문 조절제는 하기를 포함한다:
PD-L1 조절제, 예컨대 Genentech의 MPDL3280A(RG7446), Merck/Pfizer로부터의 아벨루맙(Bavencio), AstraZeneca로부터의 더발루맙(Imfinzi), BioXcell로부터의 항-마우스 PD-L1 항체 클론 10F.9G2(카탈로그 BE0101호), Bristol-Meyer's Squibb로부터의 항-PD-L1 단일클론 항체 MDX-1105(BMS-936559), BMS-935559 및 BMS-986192, XytomX Therapeutics로부터의 MSB0010718C, 마우스 항-PD-L1 클론 29E.2A3, CX-072, Novartis Pharmaceuticals로부터의 FAZ053, 3D Medicine으로부터의 KN035, Eli Lilly로부터의 LY3300054 및 AstraZeneca의 MEDI4736;
PD-L2 조절제, 예컨대 GlaxoSmithKline의 AMP-224(엠플이뮨(Amplimmune)) 및 rHIgM12B7;
PD-1 조절제, 예컨대 BioXcell로부터의 항-마우스 PD-1 항체 클론 J43(카탈로그 BE0033-2호), BioXcell로부터의 항-마우스 PD-1 항체 클론 RMP1-14(카탈로그 BE0146호), 마우스 항-PD-1 항체 클론 EH12, Merck의 MK-3475 항-마우스 PD-1 항체(Keytruda, 펨브롤리주맙, 람브롤리주맙), ANB011로 공지된 AnaptysBio의 항-PD-1 항체, 항체 MDX-1 106(ONO-4538), Bristol-Myers Squibb의 인간 IgG4 단일클론 항체 니볼루맙(Opdivo®, BMS-936558, MDX1106), AstraZeneca의 AMP-514 및 AMP-224, Eli Lilly/Innovent Biologics로부터의 신틸리맙(IBI-308), Agenus로부터의 AGEN 2034, BeiGene으로부터의 BGB-A317, Boehringer-Ingelheim Pharmaceuticals로부터의 Bl-754091, CBT Pharmaceuticals로부터의 CBT-501(게놀림주맙), Incyte로부터의 INCSHR1210, Janssen Research & Development로부터의 JNJ-63723283, MedImmune으로부터의 MEDI0680, Novartis Pharmaceuticals로부터의 PDR001, Pfizer로부터의 PF-06801591, Regeneron Pharmaceuticals로부터의 REGN2810 및 CureTech Ltd로부터의 피딜리주맙(Pidilizumab)(CT-011);
CTLA-4 조절제, 예컨대 Bristol Meyers Squibb의 항-CTLA-4 항체 이필리무맙(Yervoy®, MDX-010, BMS-734016 및 MDX-101로도 공지됨), Millipore로부터의 항-CTLA4 항체 클론 9H10, Pfizer의 트레멜리무맙(CP-675,206, 티실리무맙), Agenus로부터의 AGEN 1884 및 Abcam으로부터의 항-CTLA4 항체 클론 BNI3;
LAG3 조절제, 예컨대 eBioscience로부터의 항-Lag-3 항체 클론 eBioC9B7W(C9B7W), LifeSpan Biosciences로부터의 항-Lag3 항체 LS-B2237, Novartis Pharmaceuticals로부터의 IMP701 및 LAG525, Immutep으로부터의 IMP321(ImmuFact), Bristol-Myers Squibb로부터의 항-Lag3 항체 BMS-986016, BMS-986016, Regeneron Pharmaceuticals로부터의 REGN3767 및 LAG-3 키메라 항체 A9H12;
B7-H3 조절제, 예컨대 MGA271;
KIR 조절제, 예컨대 Bristol-Myers Squibb로부터의 리릴루맙(Lirilumab)(IPH2101);
CD137 조절제, 예컨대 우렐루맙(BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), PF-05082566(항-4-1BB, PF-2566, Pfizer) 또는 XmAb-5592(Xencor);
PS 조절제, 예컨대 바비툭시맙;
OX40 조절제, 예컨대 Bristol-Myers Squibb로부터의 BMS-986178, GlaxoSmithKline으로부터의 GSK3174998, Agenus로부터의 INCAGN1949, MedImmune으로부터의 MEDI0562, Pfizer로부터의 PF-04518600 또는 Genentech로부터의 RG7888;
GITR 조절제, 예컨대 Novartis Pharmaceuticals로부터의 GWN323, Agenus로부터의 INCAGN1876 또는 Leap Therapeutics로부터의 TRX518;
TIM3 조절제, 예컨대 Novartis Pharmaceuticals로부터의 MBG453 또는 TESARO로부터의 TSR-042; 및
조절제, 예컨대 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 단일클론 항체, 인간, 인간화 또는 키메라 항체), RNAi 분자, 또는 CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, ICOS, BTLA(CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2 또는 SLAM에 대한 소분자.
일부 경우에, IL-15 접합체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 트레멜리무맙 또는 이필리무맙과 조합되어 투여된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 항체, 예컨대 알렘투주맙, 트라스투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 브렌툭시맙 베도틴, 아도-트라스투주맙 엠탄신 또는 블리나투모맙과 투여된다.
일부 경우에, IL-15 접합체는 항-VEGFR 항체로부터 선택된 추가의 치료제와 투여된다. 예시적인 항-VEGFR 항체는 베바시주맙 또는 라무시루맙을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, IL-15 접합체는 추가의 치료제의 ADCC 효과를 향상시킨다.
일부 경우에, IL-15 접합체는 세툭시맙, 임가투주맙, 마투주맙(EMD 72000), 토무조툭시맙 또는 파니투무맙으로부터 선택된 추가의 치료제와 투여된다. 일부 경우에, IL-15 접합체는 추가의 치료제의 ADCC 효과를 향상시킨다.
일부 경우에, IL-15 접합체는 추가의 사이토카인(예를 들어, 자연적 사이토카인 또는 조작된 사이토카인, 예컨대 PEG화 및/또는 융합 사이토카인)으로부터 선택된 추가의 치료제와 투여된다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 T 효과기 세포 팽창 및/또는 증식을 향상시키고/시키거나 상승작용시킨다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 또는 TNFα를 포함한다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-2이다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-21이다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-10이다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 TNFα이다.
일부 경우에, IL-15 접합체는 수용체 작용제로부터 선택된 추가의 치료제와 투여된다. 일부 경우에, 수용체 작용제는 톨-유사 수용체(TLR) 리간드를 포함한다. 일부 경우에, TLR 리간드는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9를 포함한다. 일부 경우에, TLR 리간드는 예를 들어 Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, 폴리 I:C, 폴리 A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA 또는 플라젤린과 같은 합성 리간드를 포함한다. 일부 경우에, IL-21 접합체는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 및 TLR9로부터 선택된 하나 이상의 TLR 작용제와 투여된다. 일부 경우에, IL-15 접합체는 Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, 폴리 I:C, 폴리 A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA 및 플라젤린으로부터 선택된 하나 이상의 TLR 작용제와 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 입양 T 세포 전달(ACT) 치료와 함께 사용된다. 일 구현예에서, ACT는 예를 들어 항종양 활성을 갖는 대상체에서 자가유래 T 림프구의 확인, 시험관내 자가유래 T 림프구의 팽창 및 후속하여 대상체로의 팽창된 T 림프구의 재주입을 수반한다. 다른 구현예에서, ACT는 예를 들어 항종양 활성을 갖는 동종이계 T 림프구의 사용, 시험관내 T 림프구의 팽창 및 후속하여 주입을 필요로 하는 대상체로의 팽창된 동종이계 T 림프구의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 ACT 치료의 일부로서 자가유래 T 림프구와 함께 사용된다. 다른 경우에, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 ACT 치료의 일부로서 동종이계 T 림프구와 함께 사용된다. 일부 구현예에서, IL-15 접합체는 치료를 필요로 하는 대상체에게 ACT 치료와 동시에 투여된다. 다른 경우에, IL-15 접합체는 치료를 필요로 하는 대상체에게 ACT 치료와 순차적으로 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 생체외 활성화 및/또는 자가유래 및/또는 동종이계 T 세포 전달의 팽창에 사용된다. 이러한 경우에, IL-15 접합체는 자가유래 및/또는 동종이계 T 세포를 포함하는 샘플을 활성화하고/하거나 팽창시키기 위해 사용되고, IL-15 접합체는 이를 필요로 하는 대상체에게 샘플을 투여하기 전에 샘플로부터 선택적으로 제거된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 접합체는 백신과 투여된다. 일부 경우에, IL-21 접합체는 종양세포붕괴성 바이러스(oncolytic virus)와 조합되어 사용된다. 이러한 경우에, IL-21 접합체는 면역 반응을 조절하는 자극제로서 작용한다. 일부 경우에, IL-21 접합체는 아쥬반트 치료의 일부로서 종양세포붕괴성 바이러스와 사용된다. 예시적인 종양세포붕괴성 바이러스는 T-Vec(Amgen), G47Δ(Todo et al.), JX-594(Sillajen), CG0070(Cold Genesys) 및 Reolysin(Oncolytics Biotech)을 포함한다. 일부 경우에, IL-21 접합체는 종양세포붕괴성 바이러스, 예컨대 T-Vec, G47Δ, JX-594, CG0070 또는 Reolysin과 조합되어 사용된다.
일부 구현예에서, IL-15 접합체는 방사선 치료와 조합되어 투여된다.
세포 집단 팽창 방법
일부 구현예에서, 림프구 집단, 예를 들어 효과기 T(Teff) 세포, 기억 T(Tmem) 세포, 및/또는 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시키는 방법이 본원에 추가로 기재된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 본원에 기재된 사이토카인 접합체와 접촉시키는 단계, 및 사이토카인을 사이토카인 수용체와 상호작용시켜 복합체를 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 복합체는 별개의 림프구 집단의 팽창을 자극한다.
일부 구현예에서, 효과기 T(Teff) 세포, 기억 T(Tmem) 세포, 및/또는 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시키는 방법으로서, (a) 세포를 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체와 접촉시키는 단계; 및 IL-15를 IL-15Rβ 및 IL-15Rγ 아단위와 상호작용시켜 IL-15/IL-15Rβγ 복합체를 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 IL-15 접합체는 IL-15Rα 아단위에 대한 친화도가 감소하고, IL-15/IL-15Rβγ 복합체는 Teff, Tmem 및 NK 세포의 팽창을 자극한다. 본원에 기재된 바대로, 일부 구현예에서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된 잔기 위치에서 적어도 하나의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 및 F110으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97 및 E98로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 및 N72로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 Y26, E46, V49, E53 및 L25로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N4, S7, K11 및 D61로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 L25, E53, N77 및 S83으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 L25 및 E53으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20 및 S83으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46 및 Y26으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 L25이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 Y26이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V49이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E53이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 T24이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N77이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 S83이다.
본원에 기재된 바와 같은 효과기 T(Teff) 세포, 기억 T(Tmem) 세포, 및/또는 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시키는 방법은 일부 구현예에서 세포를 IL-15 접합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 바대로, 일부 구현예에서, 인터류킨 15(IL-15) 접합체는 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드; 및 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된 아미노산 위치에서 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 및 F110으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97 및 E98로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 및 N72로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 Y26, E46, V49, E53 및 L25로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N4, S7, K11 및 D61로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 L25, E53, N77 및 S83으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 L25 및 E53으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20 및 S83으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46, Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 Y26, V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V49, E53 및 T24로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46 및 Y26으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E46이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 L25이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 Y26이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 V49이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 E53이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 T24이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 N77이다. 일부 구현예에서, 잔기 위치는 S83이다.
IL-15 폴리펩타이드 생산
일부 구현예에서, 천연 아미노산 돌연변이 또는 비천연 아미노산 돌연변이를 함유하는 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 재조합으로 생성되거나 화학적으로 합성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드는 예를 들어 숙주 세포 시스템에 의해 또는 무세포 시스템으로 재조합으로 생성된다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 숙주 세포 시스템을 통해 재조합으로 생성된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포(예를 들어, 포유류 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 식물 세포), 원핵생물 세포(예를 들어, 그램 양성 박테리아 또는 그램 음성 박테리아) 또는 고세균 세포이다. 일부 경우에, 진핵생물 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다. 일부 경우에, 포유류 숙주 세포는 안정한 세포주, 또는 관심 유전 재료를 그 자체의 게놈으로 편입시키고 많은 세포 분열 세대 후 유전 재료의 산물을 발현하는 능력을 갖는 세포주이다. 다른 경우에, 포유류 숙주 세포는 일시적 세포주, 또는 관심 유전 재료를 그 자체의 게놈으로 편입시키지 않고 많은 세포 분열 세대 후 유전 재료의 산물을 발현하는 능력을 갖지 않는 세포주이다.
예시적인 포유류 숙주 세포는 293T 세포주, 293A 세포주, 293FT 세포주, 293F 세포, 293 H 세포, A549 세포, MDCK 세포, CHO DG44 세포, CHO-S 세포, CHO-K1 세포, Expi293F™ 세포, Flp-In™ T-REx™ 293 세포주, Flp-In™ 293 세포주, Flp-In™ 3T3 세포주, Flp-In™ BHK 세포주, Flp-In™ CHO 세포주, Flp-In™ CV-1 세포주, Flp-In™ Jurkat 세포주, FreeStyle™ 293-F 세포, FreeStyle™ CHO-S 세포, GripTite™ 293 MSR 세포주, GS-CHO 세포주, HepaRG™ 세포, T-REx™ Jurkat 세포주, Per.C6 세포, T-REx™ 293 세포주, T-REx™ CHO 세포주 및 T-REx™ HeLa 세포주를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포는 곤충 숙주 세포이다. 예시적인 곤충 숙주 세포는 드로소필라(Drosophila) S2 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, High Five™ 세포 및 expresSF+® 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 예시적인 효모 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 균주, 예컨대 GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H 및 X-33, 및 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 효모 균주, 예컨대 INVSc1을 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포는 식물 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 식물 세포는 조류로부터의 세포를 포함한다. 예시적인 식물 세포주는 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 137c 또는 시네초코쿠스 이롱가투스(Synechococcus elongatus) PPC 7942로부터의 균주를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 예시적인 원핵생물 숙주 세포는 BL21, Mach1™, DH10B™, TOP10, DH5α, DH10Bac™, OmniMax™, MegaX™, DH12S™, INV110, TOP10F', INVαF, TOP10/P3, ccdB Survival, PIR1, PIR2, Stbl2™, Stbl3™ 또는 Stbl4™를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드의 생산을 위한 적합한 다중핵산 분자 또는 벡터는 진핵생물 또는 원핵생물 원천으로부터 유래된 임의의 적합한 벡터를 포함한다. 예시적인 다중핵산 분자 또는 벡터는 박테리아(예를 들어, E. 콜라이), 곤충, 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스), 조류 또는 포유류 원천으로부터의 벡터를 포함한다. 박테리아 벡터는 예를 들어 pACYC177, pASK75, pBAD 벡터 시리즈, pBADM 벡터 시리즈, pET 벡터 시리즈, pETM 벡터 시리즈, pGEX 벡터 시리즈, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, pQE 벡터 시리즈, pRSET A, pRSET B, pRSET C, pTrcHis2 시리즈, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC 또는 pTAC-MAT-2를 포함한다.
곤충 벡터는 예를 들어 pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M30b, pFastBac, M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, FLAG 벡터, 예컨대 pPolh-FLAG1 또는 pPolh-MAT 2, 또는 MAT 벡터, 예컨대 pPolh-MAT1 또는 pPolh-MAT2를 포함한다.
효모 벡터는 예를 들어 Gateway® pDEST™ 14 벡터, Gateway® pDEST™ 15 벡터, Gateway® pDEST™ 17 벡터, Gateway® pDEST™ 24 벡터, Gateway® pYES-DEST52 벡터, pBAD-DEST49 Gateway® 지칭 벡터, pAO815 피치아 벡터, pFLD1 피치아 파스토리스 벡터, pGAPZA, B 및 C 피치아 파스토리스 벡터, pPIC3.5K 피치아 벡터, pPIC6 A, B 및 C 피치아 벡터, pPIC9K 피치아 벡터, pTEF1/Zeo, pYES2 효모 벡터, pYES2/CT 효모 벡터, pYES2/NT A, B 및 C 효모 벡터, 또는 pYES3/CT 효모 벡터를 포함한다.
조류 벡터는 예를 들어 pChlamy-4 벡터 또는 MCS 벡터를 포함한다.
포유류 벡터는 예를 들어 일시적 발현 벡터 또는 안정한 발현 벡터를 포함한다. 예시적인 포유류 일시적 발현 벡터는 p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a,b,c, pFLAG-CMV 5.1, pFLAG-CMV 5a,b,c, p3xFLAG-CMV 7.1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP-CMV 3 또는 pBICEP-CMV 4를 포함한다. 예시적인 포유류 안정한 발현 벡터는 pFLAG-CMV 3, p3xFLAG-CMV 9, p3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, p3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc-CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1 또는 pBICEP-CMV 2를 포함한다.
일부 구현예에서, 무세포 시스템은 본원에 기재된 IL-15 폴리펩타이드의 생산에 사용된다. 일부 구현예에서, 무세포 시스템은 세포로부터의 세포질 및/또는 핵 성분의 혼합물을 포함하고(예를 들어, 완전히 정제된 재조합 성분 또는 부분적으로 정제된 성분으로 이루어짐), 시험관내 핵산 합성에 적합하다. 일부 경우에, 무세포 시스템은 원핵생물 세포 성분을 사용한다. 다른 경우에, 무세포 시스템은 진핵생물 세포 성분을 사용한다. 핵산 합성은 예를 들어 드로소필라 세포, 제노푸스(Xenopus) 달걀, 고세균 또는 HeLa 세포에 기초한 무세포 시스템에서 얻어진다. 예시적인 무세포 시스템은 E. 콜라이 S30 Extract 시스템, E. 콜라이 T7 S30 시스템 또는 PURExpress®, XpressCF 및 XpressCF+를 포함한다.
무세포 번역 시스템은 다양하게 성분, 예컨대 플라스미드, mRNA, DNA, tRNA, 합성효소, 방출 인자, 리보솜, 샤페론 단백질, 번역 개시 및 인장 인자, 천연 및/또는 비천연 아미노산, 및/또는 단백질 발현에 사용된 다른 성분을 포함한다. 이러한 성분은 수율을 개선하거나 합성 속도를 증가시키거나 단백질 산물 신뢰도를 증가시키거나 비천연 아미노산을 편입시키도록 선택적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 사이토카인은 US 8,778,631호; US 2017/0283469호; US 2018/0051065호; US 2014/0315245호; 또는 US 8,778,631호에 기재된 무세포 번역 시스템을 사용하여 합성된다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템은 변형된 방출 인자 또는 심지어 그 시스템으로부터의 하나 이상의 방출 인자의 제거를 포함한다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템은 감소된 프로테아제 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템은 비천연 아미노산을 암호화하기 위해 사용된 재배열된 코돈을 갖는 변형된 tRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산의 편입을 위한 본원에 기재된 합성효소는 무세포 번역 시스템에 사용된다. 일부 구현예에서, tRNA는 무세포 번역 시스템에 첨가되기 전에 효소 또는 화학 방법을 사용하여 비천연 아미노산이 예비로딩된다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템을 위한 성분은 변형된 유기체, 예컨대 변형된 박테리아, 효모 또는 다른 유기체로부터 얻어진다.
일부 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 발현 숙주 시스템을 통해 또는 무세포 시스템을 통해 원형으로 재배치된 형태로 생성된다.
비천연 아미노산을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드의 생산
직교성 또는 팽창된 유전 암호가 본 발명에 사용될 수 있는데, 여기서 IL-15 폴리펩타이드의 핵산 서열에 존재하는 하나 이상의 특정 코돈은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍을 사용함으로써 IL-15로 유전적으로 편입될 수 있도록 비천연 아미노산을 암호화하도록 배정된다. 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍은 tRNA를 비천연 아미노산으로 하전할 수 있고, 코돈에 반응하여 그 비천연 아미노산을 폴리펩타이드 사슬로 편입시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 코돈은 코돈 앰버, 오커, 오팔 또는 쿼드러플렛 코돈이다. 일부 경우에, 코돈은 비천연 아미노산을 보유하도록 사용되는 직교성 tRNA에 상응한다. 일부 경우에, 코돈은 앰버이다. 다른 경우에, 코돈은 직교성 코돈이다.
일부 경우에, 코돈은 직교성 리보솜 리보-Q1에 의해 해독될 수 있는 쿼드러플렛 코돈이다. 일부 경우에, 쿼드러플렛 코돈은 문헌[Neumann, et al., "Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome," Nature, 464(7287): 441-444 (2010)]에 예시되어 있다.
일부 경우에, 본 발명에 사용된 코돈은 재암호화된 코돈, 예를 들어 대안적인 코돈에 의해 대체된 동의 코돈 또는 희귀 코돈이다. 일부 경우에, 재암호화된 코돈은 문헌[Napolitano, et al., "Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli," PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016)]에 기재되어 있다. 일부 경우에, 재암호화된 코돈은 문헌[Ostrov et al., "Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome," Science 353(6301): 819-822 (2016)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 IL-15로의 하나 이상의 비천연 아미노산의 혼입을 야기하도록 사용된다. 예시적인 비천연 핵산은 우라실-5-일, 하이포잔틴-9-일(I), 2-아미노아데닌-9-일, 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 구체적으로 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 비천연 핵산, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2 치환된 퓨린, N-6 치환된 퓨린, O-6 치환된 퓨린, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐사이토신, 5-메틸사이토신, 듀플렉스 형성의 안정성을 증가시키는 것, 보편적 핵산, 소수성 핵산, 무차별 핵산, 크기 확대된 핵산, 플루오르화 핵산, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 예를 들어 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신. 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸, 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실, 5-할로사이토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실, 5-프로피닐 사이토신, 피리미딘 핵산의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 6-아조 사이토신, 6-아조 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 구체적으로 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 삼환식 피리미딘, 페녹사진 사이티딘([5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘(1H-피리미도[5,4-b][l,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 페녹사진 사이티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 카바졸 사이티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 사이티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온), 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 복소환으로 대체된 것, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘, 2-피리돈, 아자사이토신, 5-브로모사이토신, 브로모우라실, 5-클로로사이토신, 염화 사이토신, 사이클로사이토신, 사이토신 아라비노사이드, 5-플루오로사이토신, 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 5,6-디하이드로사이토신, 5-요오도사이토신, 하이드록시우레아, 요오도우라실, 5-니트로사이토신, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 및 5-요오도우라실, 2-아미노-아데닌, 6-티오-구아닌, 2-티오-티민, 4-티오-티민, 5-프로피닐-우라실, 4-티오-우라실, N4-에틸사이토신, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8- 아자구아닌, 5-하이드록시사이토신, 2'-데옥시우리딘, 2-아미노-2'-데옥시아데노신, 및 미국 특허 제3,687,808호; 제4,845,205호; 제4,910,300호; 제4,948,882호; 제5,093,232호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제5,763,588호; 제5,830,653호 및 제6,005,096호; WO 99/62923호; 문헌[Kandimalla et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858- 859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; 및 Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crookeand Lebleu Eds., CRC Press, 1993, 273-288]에 기재된 것. 추가의 염기 변형은, 예를 들어 미국 특허 제3,687,808호; 문헌[Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; 및 Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke and Lebleu ed., CRC Press, 1993]에서 발견될 수 있다.
다양한 복소환식 염기 및 다양한 당 모이어티(및 당 유사체)를 포함하는 비천연 핵산은 당해 분야에 이용 가능하고, 일부 경우에 핵산은 자연 발생 핵산의 주요한 5개의 염기 성분 이외의 하나 또는 여러 복소환식 염기를 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 복소환식 염기는 우라실-5-일, 사이토신-5-일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일, 구아닌-7-일, 구아닌-8-일, 4-아미노피롤로[2.3-d]피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로[2.3-d] 피리미딘-3-일기를 포함하고, 여기서 퓨린은 9-위치를 통하여, 피리미딘은 1-위치를 통하여, 피롤로피리미딘은 7-위치를 통하여, 그리고 피라졸로피리미딘은 1-위치를 통하여 핵산의 당 모이어티에 부착된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 또한 포스페이트 모이어티에서 변형된다. 변형된 포스페이트 모이어티는 2개의 뉴클레오타이드 사이의 연결에서 변형을 갖는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않으며, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예를 들어 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보라노포스페이트를 함유한다. 2개의 뉴클레오타이드 사이의 이러한 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 연결은 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결을 통한 것이며, 연결은 3'-5'에서 5’-3’, 또는 2'-5'에서 5'-2'와 같은 반전 극성을 함유한다고 이해된다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태가 또한 포함된다. 다수의 미국 특허는 변형된 포스페이트를 함유하는 뉴클레오타이드의 제조 및 사용 방법을 교시하며, 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 2',3'-디데옥시-2',3'-디데하이드로-뉴클레오사이드(PCT/US2002/006460호), 5'-치환된 DNA 및 RNA 유도체(PCT/US2011/033961호; Saha et al., J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; 및 Mikhailov et al., Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343; Leonid et al., 1995, 14(3-5), 901-905; 및 Eppacher et al., Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020; PCT/JP2000/004720호; PCT/JP2003/002342호; PCT/JP2004/013216호; PCT/JP2005/020435; PCT/JP2006/315479호; PCT/JP2006/324484호; PCT/JP2009/056718호; PCT/JP2010/067560호), 또는 변형된 염기를 갖는 모노포스페이트로서 제조된 5'-치환된 단량체(Wang et al., Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337)를 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 당 고리의 5'-위치 및 2'-위치에서의 변형(PCT/US94/02993호), 예컨대 5'-CH2-치환된 2'-O-보호된 뉴클레오사이드(Wu et al., Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 및 Wu et al., Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924)를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 핵산은 아미드 연결된 뉴클레오사이드 이합체가 올리고뉴클레오타이드로 혼입되는 것을 위하여 제조된 것을 포함하며, 여기서 이합체에서 3' 연결된 뉴클레오사이드(5'→3')는 2'-OCH3 및 5'-(S)-CH3을 포함한다(Mesmaeker et al., Synlett, 1997, 1287-1290). 비천연 핵산은 2'-치환된 5'-CH2(또는 O) 변형된 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다(PCT/US92/01020호). 비천연 핵산은 5'-메틸렌포스포네이트 DNA 및 RNA 단량체, 및 이합체를 포함할 수 있다(Bohringer et al., Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al., Synlett, 1995, 7, 703-705; 및 Hutter et al., Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). 비천연 핵산은 2'-치환을 갖는 5'-포스포네이트 단량체(US2006/0074035호) 및 다른 변형된 5'-포스포네이트 단량체(WO1997/35869호)를 포함할 수 있다. 비천연 핵산은 5'-변형된 메틸렌포스포네이트 단량체를 포함할 수 있다(EP614907호 및 EP629633호). 비천연 핵산은 5' 및/또는 6'-위치에 하이드록실기를 포함하는 5' 또는 6'-포스포네이트 리보뉴클레오사이드의 유사체를 포함할 수 있다(Chen et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al., Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509; Gallier et al., Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933; 및 Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). 비천연 핵산은 5'-포스페이트기를 갖는 5'-포스포네이트 데옥시리보뉴클레오사이드 단량체 및 이합체를 포함할 수 있다(Nawrot et al., Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82). 비천연 핵산은 6'-포스포네이트기를 갖는 뉴클레오사이드를 포함할 수 있으며, 여기서 5' 및/또는 6'-위치는 비치환되거나 티오-tert-부틸기(SC(CH3)3)(및 이의 유사체); 메틸렌아미노기(CH2NH2)(및 이의 유사체) 또는 시아노기(CN)(및 이의 유사체)로 치환된다(Fairhurst et al., Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038; Kappler et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184; Vrudhula et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377; Geze et al., J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640; 및 Hampton et al., J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414).
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 또한 당 모이어티의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오사이드를 함유한다. 이러한 당 변형된 뉴클레오사이드는 향상된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화도 또는 일부 다른 유익한 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 소정의 구현예에서, 핵산은 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리의 예는 제한 없이 치환기(5' 및/또는 2' 치환기를 포함함; 2개의 고리 원자를 가교시켜 이환식 핵산(BNA)을 형성함; 리보실 고리 산소 원자를 S, N(R) 또는 C(R1)(R2)(R = H, C1-C12 알킬 또는 보호기)로 대체함); 및 이들의 조합의 부가를 포함한다. 화학적으로 변형된 당의 예는 WO2008/101157호, US2005/0130923호 및 WO2007/134181호에서 발견될 수 있다.
일부 경우에, 변형된 핵산은 변형된 당 또는 당 유사체를 포함한다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스 이외에, 당 모이어티는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스, 또는 당 "유사체” 사이클로펜틸기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 푸라노실 형태일 수 있다. 당 모이어티는 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬리보스의 푸라노사이드일 수 있고, 당은 [알파] 또는 [베타] 아노머 구성으로 각각의 복소환식 염기에 부착될 수 있다. 당 변형은 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 당 변형은 2'-O-메틸-우리딘 또는 2'-O-메틸-사이티딘을 포함할 수 있다. 당 변형은 2'-O-알킬-치환된 데옥시리보뉴클레오사이드 및 2'-O-에틸렌글리콜 유사 리보뉴클레오사이드를 포함한다. 이러한 당 또는 당 유사체 및 각각의 "뉴클레오사이드"의 제조(여기서, 이러한 당 또는 유사체는 복소환식 염기(핵산 염기)에 부착됨)가 알려져 있다. 당 변형이 또한 이루어지고 다른 변형과 조합될 수 있다.
당 모이어티에 대한 변형은 리보스 및 데옥시 리보스의 천연 변형, 및 비천연 변형을 포함한다. 당 변형은 2' 위치에서의 하기 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬(여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 비치환된 C1 내지 C10, 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 2' 당 변형은 또한 -O[(CH2)nO]m CH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)nONH2 및 -O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않으며, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다.
2' 위치에서의 다른 변형은 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터컬레이터, 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오타이드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. 유사한 변형이 또한 당 상의 다른 위치, 구체적으로 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오타이드 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 변형된 당은 또한 CH2 및 S와 같은 가교 고리 산소에서의 변형을 함유하는 것을 포함한다. 뉴클레오타이드 당 유사체는 또한 당 모방체, 예컨대 사이클로부틸 모이어티를 펜토푸라노실 당 대신 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하고 일련의 염기 변형을 상술하고 기술하는 다수의 미국 특허, 예컨대 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 및 제5,700,920호가 있으며, 이들 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
변형된 당 모이어티를 갖는 핵산의 예는 제한 없이 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 핵산을 포함한다. 2' 위치에서의 치환기는 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-(C1-C1O 알킬), OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 및 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다.
소정의 구현예에서, 본원에 기재된 핵산은 하나 이상의 이환식 핵산을 포함한다. 소정의 이러한 구현예에서, 이환식 핵산은 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이의 가교체를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본원에 제공된 핵산은 하나 이상의 이환식 핵산을 포함하며, 여기서 가교체는 4'→2' 이환식 핵산을 포함한다. 이러한 4'→2' 이환식 핵산의 예는 화학식 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 및 이의 유사체(미국 특허 제7,399,845호 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 이의 유사체(WO2009/006478호, WO2008/150729호, US2004/0171570호, 미국 특허 제7,427,672호, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 209, 74, 118-134, 및 WO2008/154401호 참조) 중 하나를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 예를 들어 다음을 참조한다: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; 미국 특허 제4,849,513호; 제5,015,733호; 제5,118,800호; 제5,118,802호; 제7,053,207호; 제6,268,490호; 제6,770,748호; 제6,794,499호; 제7,034,133호; 제6,525,191호; 제6,670,461호; 및 제7,399,845호; 국제 공개 WO2004/106356호, WO1994/14226호, WO2005/021570호, WO2007/090071호 및 WO2007/134181호; 미국 특허 공개 US2004/0171570호, US2007/0287831호 및 US2008/0039618호; 미국 가출원 60/989,574호, 61/026,995호, 61/026,998호, 61/056,564호, 61/086,231호, 61/097,787호 및 61/099,844호; 및 국제 출원 PCT/US2008/064591호, PCT US2008/066154호, PCT US2008/068922호 및 PCT/DK98/00393호.
소정의 구현예에서, 핵산은 연결된 핵산을 포함한다. 핵산은 임의의 핵산간 연결을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 핵산간 연결 기의 2가지 주요 종류는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 대표적인 인 함유 핵산간 연결은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트(P=S)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대표적인 인 비함유 핵산간 연결 기는 메틸렌메틸이미노(-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르(-O-C(O)-S-), 티오노카바메이트(-O-C(O)(NH)-S-); 실록산(-O-Si(H)2-O-); 및 N,N*-디메틸하이드라진(-CH2-N(CH3)-N(CH3))을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 키랄 원자를 갖는 핵산간 연결은 라세미 혼합물로서, 별개의 거울상이성질체로서, 예를 들어 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트로서 제조될 수 있다. 비천연 핵산은 단일 변형을 함유할 수 있다. 비천연 핵산은 모이어티 중 하나 내에 또는 상이한 모이어티 사이에 다수의 변형을 함유할 수 있다.
핵산에 대한 골격 포스페이트 변형은 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트(가교 또는 비가교), 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 포스포디티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않으며, 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 다른 비-포스페이트 연결을 또한 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 골격 변형(예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오타이드간 연결)은 변형된 핵산에 면역조절 활성을 부여하고/하거나 생체내 이의 안정성을 향상시킬 수 있다.
일부 경우에, 인 유도체(또는 변형된 포스페이트기)는 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착되고, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 등일 수 있다. 변형된 포스페이트 연결 또는 비-포스페이트 연결을 포함하는 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 문헌[Peyrottes et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; and Schultz et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci, 1997,:Oligonucleotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick and Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY; Zon, 1993, "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190; Miller et al., 1971, JACS 93:6657-6665; Jager et al., 1988, Biochem. 27:7247-7246; Nelson et al., 1997, JOC 62:7278-7287; 미국 특허 제5,453,496호; 및 Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179]에서 발견될 수 있다.
일부 경우에, 골격 변형은 포스포디에스테르 연결이 대안적인 모이어티, 예컨대 음이온성, 중성 또는 양이온성 기로 대체된 것을 포함한다. 이러한 변형의 예는 다음을 포함한다: 음이온성 뉴클레오사이드간 연결; N3'→P5' 포스포르아미데이트 변형; 보라노포스페이트 DNA; 프로올리고뉴클레오타이드; 중성 뉴클레오사이드간 연결, 예컨대 메틸포스포네이트; 아미드 연결된 DNA; 메틸렌(메틸이미노) 연결; 포름아세탈 및 티오포름아세탈 연결; 설포닐기를 함유하는 골격; 모르폴리노 올리고; 펩티드 핵산(PNA); 및 양으로 하전된 데옥시리보핵산 구아니딘(DNG) 올리고(Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179). 변형된 핵산은 하나 이상의 변형, 예를 들어 포스페이트 연결의 조합, 예컨대 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결의 조합을 포함하는 키메라 또는 혼합된 골격을 포함할 수 있다.
포스페이트의 치환기는, 예를 들어 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결, 혼합된 이종원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 이종원자 또는 복소환식 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 이들은 모르폴리노 연결을 갖는 것(뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것을 포함한다. 다수의 미국 특허는 이러한 유형의 포스페이트 대체물의 제조 및 사용 방법을 개시하며, 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 뉴클레오타이드 치환기에서 뉴클레오타이드의 당 및 포스페이트 모이어티 둘 다가, 예를 들어 아미드 유형 연결(아미노에틸글리신)에 의해 대체될 수 있음(PNA)이 또한 이해된다. 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호는 PNA 분자의 제조 및 사용 방법을 교시하며, 이들의 각각은 본원에 참고로 포함된다. 또한 문헌[Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]을 참조한다. 다른 유형의 분자(접합체)를 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체에 연결하여, 예를 들어 세포 흡수를 향상시키는 것이 또한 가능하다. 접합체는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체에 화학적으로 연결될 수 있다. 이러한 접합체는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 l-디-O-헥사데실-rac-글리세로-S-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다수의 미국 특허는 이러한 접합체의 제조를 교시하며, 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 비천연 염기 쌍을 추가로 형성한다. 생체내 조건 하에서 비천연 DNA 또는 RNA 염기 쌍(UBP)을 형성할 수 있는 예시적인 비천연 뉴클레오타이드는 5SICS, d5SICS, NAM, dNaM, TPT3TP, dTPT3TP, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 비천연 뉴클레오타이드는 다음을 포함한다:
Figure pct00002
일부 구현예에서, 비천연 염기 쌍은 문헌[Dumas et al., "Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology," Chemical Science, 6: 50-69 (2015)]에 기재된 비천연 아미노산을 생성한다.
본원에 개시된 작제물 또는 벡터가 도입된 숙주 세포는 관심 tRNA, tRNA 합성효소 및 단백질이 생산되도록 적합한 배지에서 배양되거나 유지된다. 배지는 또한 관심 단백질이 비천연 아미노산(들)을 편입시키도록 비천연 아미노산(들)을 포함한다.
직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍은 tRNA를 비천연 아미노산으로 하전시키고, 코돈에 반응하여 비천연 아미노산을 폴리펩타이드 사슬로 편입시킨다. 예시적인 aaRS-tRNA 쌍은 메타노코커스 야나스치(Mj - Tyr) aaRS/tRNA 쌍, E. 콜라이 TyrRS(Ec-Tyr)/B. 스테아로써모필루스 tRNACUA 쌍, E. 콜라이 LeuRS(Ec -Leu)/B. 스테아로써모필루스 tRNACUA 쌍 및 피롤리실-tRNA 쌍을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
비천연 아미노산(들)을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드는 tRNA 및 tRNA 합성효소를 포함하고 하나 이상의 인-프레임 직교성 (중지) 코돈을 갖는 관심 핵산 서열을 포함하는 본원에 기재된 핵산 작제물을 숙주 세포로 도입함으로써 제조된다. 숙주 세포는 비천연 아미노산(들)을 포함하는 생리학적 용액에 노출되고, 숙주 세포는 이후 관심 암호화 서열의 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 유지된다. 비천연 아미노산(들)은 코돈에 반응하여 폴리펩타이드 사슬로 편입된다. 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산은 IL-15 폴리펩타이드로 편입된다. 대안적으로 2개 이상의 비천연 아미노산은 단백질에서 2개 이상의 부위에서 IL-15 폴리펩타이드로 편입될 수 있다.
다수의 비천연 아미노산이 IL-15 폴리펩타이드로 편입될 때, tRNA 합성효소/tRNA 쌍이 코돈(들)에 반응하여 비천연 아미노산의 편입을 지시할 수 있도록 다수의 코돈이 원하는 위치에서 암호화 핵산 서열로 편입될 필요가 있다고 이해될 것이다. 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 코돈 암호화 핵산은 관심 핵산 서열로 편입될 수 있다.
하나 초과의 유형의 비천연 아미노산을 단일 단백질로 관심 단백질로 편입하는 것이 바람직할 때, 제2의 또는 추가로 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍은 제2의 또는 추가의 비천연 아미노산을 편입하도록 사용될 수 있고; 적합하게는 2개 이상의 비천연 아미노산이 단일 제조 단계에서 단백질에서 상이한 한정된 부위로 특이적으로 편입될 수 있도록 상기 제2의 또는 추가의 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍은 관심 단백질을 암호화하는 핵산에서 상이한 코돈을 인식한다. 소정의 구현예에서, 2개 이상의 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍이 따라서 사용될 수 있다.
비천연 아미노산(들)이 편입된 IL-15 폴리펩타이드가 숙주 세포에서 생산되면, 이것은 효소, 화학 및/또는 삼투성 용해 및 물리적 파괴를 포함하는 당해 분야에 알려진 다양한 기법에 의해 이로부터 추출될 수 있다. IL-15 폴리펩타이드는 당해 분야에 알려진 표준 기법, 예컨대 제조용 크로마토그래피, 친화도 정제 또는 임의의 다른 적합한 기법에 의해 정제될 수 있다.
적합한 숙주 세포는 박테리아 세포(예를 들어, E. 콜라이)를 포함할 수 있지만, 가장 적합하게는 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 곤충 세포(예를 들어, 드로소필라, 예컨대 드로소필라 멜라노가스터), 효모 세포, 선충(예를 들어, 카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)), 마우스(예를 들어, 무스 무스쿨루스(Mus musculus)) 또는 포유류 세포(예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포, 인간 293T 세포, HeLa 세포, NIH 3T3 세포 및 마우스 적백혈병(MEL: mouse erythroleukemia) 세포) 또는 인간 세포 또는 다른 진핵생물 세포이다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 알려져 있다. 적합하게는, 숙주 세포는 포유류 세포, 예컨대 인간 세포 또는 곤충 세포이다.
본 발명의 구현예에서 일반적으로 사용될 수 있는 다른 적합한 숙주 세포는 실시예 부문에 언급된 것이다. 벡터 DNA는 관습적인 형질전환 또는 형질주입 기법을 통해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환" 및 "형질주입"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 동시침전, DEAE-덱스트란 매개 형질주입, 리포펙션 또는 전기천공을 포함하는 숙주 세포로 외래 핵산 분자(예를 들어, DNA)를 도입하기 위한 다양한 잘 인지된 기법을 지칭하도록 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질주입하기 위한 적합한 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
세포주를 생성할 때, 안정한 세포주가 제조되는 것이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 포유류 세포의 안정한 형질주입을 위해, 사용된 발현 벡터 및 형질주입 기법에 따라 오직 작은 분획의 세포가 외래 DNA를 이의 게놈으로 통합시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 이 통합체를 확인하고 선택하기 위해, (예를 들어, 항생제에 대한 내성에 대해) 선택 가능한 마커를 암호화하는 유전자는 관심 유전자와 함께 일반적으로 숙주 세포로 도입된다. 바람직한 선택 가능한 마커는 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선택 가능한 마커를 암호화하는 핵산 분자는 동일한 벡터에서 숙주 세포로 도입될 수 있거나, 별개의 벡터에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산 분자로 안정하게 형질주입된 세포는 약물 선택에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 선택 가능한 마커 유전자가 편입한 세포는 생존하는 반면에, 다른 세포는 죽는다).
일 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 숙주 세포의 게놈으로 편입된다. 안정한 편입의 장점은 개별 세포 또는 클론 사이의 균일성이 달성된다는 점이다. 다른 장점은 최고의 생산자의 선택이 수행될 수 있다는 점이다. 따라서, 안정한 세포주를 생성하는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 숙주 세포로 형질주입된다. 숙주 세포로 작제물을 형질주입하는 것의 장점은 단백질 수율이 최대화될 수 있다는 점이다. 일 양태에서, 본원에 기재된 핵산 작제물 또는 벡터를 포함하는 세포가 기재된다.
약학적 조성물 및 제제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물 및 제제는 비제한적인 예로서 비경구, 경구 또는 피부경유 투여 경로를 포함하는 다수의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 비경구 투여는 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 비강내, 동맥내, 관절내, 진피내, 유리체내, 골내 주입, 복강내 또는 초내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 약학적 조성물은 국소 투여를 위해 제제화된다. 다른 경우에, 약학적 조성물은 전신 투여를 위해 제제화된다.
일부 구현예에서, 약학적 제제는 수성 액체 분산액, 자가-유화 분산액, 리포솜 분산액, 에어로졸, 속방형 제제, 제어방출형 제제, 서방형 제제, 지속방출형 제제, 박동방출형 제제, 및 혼합 속방형 및 제어방출형 제제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 약학적 제제는 본원에 개시된 조성물과의 상용성, 및 원하는 투여형의 방출 프로필 특성을 기준으로 선택된 담체 또는 담체 재료를 포함한다. 예시적인 담체 재료는 예를 들어 결합제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 활택제, 습윤제, 희석제 등을 포함한다. 약학적 상용성 담체 재료는 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 락트산칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 규산마그네슘, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 나트륨 카제이네이트, 대두 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로스 및 셀룰로스 접합체, 당 나트륨 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 전호화분 녹말 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980, 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)]을 참조한다.
일부 경우에, 약학적 조성물은 리포솜의 지질 이중층에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 복수의 IL-15 접합체를 포함하는 면역리포솜으로서 제제화된다. 예시적인 지질은 지방산; 인지질; 스테롤, 예컨대 콜레스테롤; 스핑고지질, 예컨대 스핑고미엘린; 글리코스핑고지질, 예컨대 강글리오사이드, 글로보사이드 및 세레브로사이드; 계면활성제 아민, 예컨대 스테아릴, 올레일 및 리놀레일 아민을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 지질은 양이온성 지질을 포함한다. 일부 경우에, 지질은 인지질을 포함한다. 예시적인 인지질은 포스파티드산("PA"), 포스파티딜콜린("PC"), 포스파티딜글리세롤("PG"), 포파티딜에탄올아민("PE"), 포파티딜이노시톨("PI") 및 포스파티딜세린("PS"), 스핑고미엘린(뇌 스핑고미엘린을 포함), 레시틴, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 세레브로사이드, 디아라키도일포스파티딜콜린("DAPC"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜콜린("DDPC"), 디엘라이도일포스파티딜콜린("DEPC"), 디라우로일포스파티딜콜린("DLPC"), 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"), 디올레오일포스파티딜콜린("DOPC"), 디팔미토일포스파티딜콜린("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜린("DSPC"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린("POPC"), 디아라키도일포스파티딜글리세롤("DAPG"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜글리세롤("DDPG"), 디엘라이도일포스파티딜글리세롤("DEPG"), 디라우로일포스파티딜글리세롤("DLPG"), 디리놀레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤("DMPG"), 디올레오일포스파티딜글리세롤("DOPG"), 디팔미토일포스파티딜글리세롤("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤("DSPG"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤("POPG"), 디아라키도일포스파티딜에탄올아민("DAPE"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜에탄올아민("DDPE"), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민("DEPE"), 디라우로일포스파티딜에탄올아민("DLPE"), 디리놀레오일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민("DMPE"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민("DOPE"), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민("DPPE"), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민("DSPE"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민("POPE"), 디아라키도일포스파티딜이노시톨("DAPI"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜이노시톨("DDPI"), 디엘라이도일포스파티딜이노시톨("DEPI"), 디라우로일포스파티딜이노시톨("DLPI"), 디리놀레오일포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜이노시톨("DMPI"), 디올레오일포스파티딜이노시톨("DOPI"), 디팔미토일포스파티딜이노시톨("DPPI"), 디스테아로일포스파티딜이노시톨("DSPI"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜이노시톨("POPI"), 디아라키도일포스파티딜세린("DAPS"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜세린("DDPS"), 디엘라이도일포스파티딜세린("DEPS"), 디라우로일포스파티딜세린("DLPS"), 디리놀레오일포스파티딜세린, 디미리스토일포스파티딜세린("DMPS"), 디올레오일포스파티딜세린("DOPS"), 디팔미토일포스파티딜세린("DPPS"), 디스테아로일포스파티딜세린("DSPS"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜세린("POPS"), 디아라키도일 스핑고미엘린, 디데카노일 스핑고미엘린, 디엘라이도일 스핑고미엘린, 디라우로일 스핑고미엘린, 디리놀레오일 스핑고미엘린, 디미리스토일 스핑고미엘린, 스핑고미엘린, 디올레오일 스핑고미엘린, 디팔미토일 스핑고미엘린, 디스테아로일 스핑고미엘린 및 1-팔미토일-2-올레오일-스핑고미엘린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 약학적 제제는 산, 예컨대 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산, 염기, 예컨대 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 락트산나트륨 및 트리스-하이드록시메틸아미노메탄, 및 완충액, 예컨대 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄을 포함하는 pH 조정제 또는 완충제를 추가로 포함한다. 이러한 산, 염기 및 완충액은 허용 가능한 범위에서 조성물의 pH를 유지시키는 데 필요한 양으로 포함된다.
일부 경우에, 약학적 제제는 조성물의 삼투질농도가 허용 가능한 범위로 되게 하는 데 필요한 양으로 하나 이상의 염을 포함한다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 바이카보네이트, 설페이트, 티오설페이트 또는 바이설파이트 음이온을 갖는 것을 포함하고, 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 나트륨 티오설페이트, 중아황산나트륨 및 황산암모늄을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 제제는 폴리펩타이드의 용해도 및 생체내 안정성을 증가시키기 위해 트레할로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 말토스, 글루코스와 같은 당, 또는 인산칼륨, 시트르산나트륨, 황산암모늄과 같은 염 및/또는 다른 물질, 예컨대 헤파린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 약학적 제제는 보다 안정한 환경을 제공할 수 있으므로 화합물을 안정화시키기 위해 사용되는 희석제를 추가로 포함한다. 완충 용액에 용해된(또한 pH 제어 또는 유지를 제공할 수 있는) 염은 당해 분야에서 비제한적인 예로서 인산염 완충 식염수 용액을 포함하는 희석제로서 사용된다.
안정화제는 화합물, 예컨대 임의의 항산화 물질, 완충액, 산, 보존제 등을 포함한다. 예시적인 안정화제는 L-아르기닌 하이드로클로라이드, 트로메타민, 알부민(인간), 시트르산, 벤질 알콜, 페놀, 디나트륨 디포스페이트 탈수물, 프로필렌 글리콜, 메타크레솔 또는 m-크레솔, 아세트산아연, 폴리소르베이트-20 또는 Tween® 20 또는 트로메타몰을 포함한다.
계면활성제는 화합물, 예컨대 황산 라우릴 나트륨, 나트륨 도쿠세이트, Tween 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트, 폴록사머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 공중합체, 예를 들어 Pluronic®(BASF) 등을 포함한다. 추가의 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세라이드 및 식물성 오일, 예를 들어 폴리옥시에틸렌(60) 수소화 캐스터유, 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 때때로, 계면활성제는 물리적 안정성을 향상시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 포함된다.
치료학적 요법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 치료학적 분야를 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회 이상 투여된다. 약학적 조성물은 매일, 일마다, 격일로, 1주 5일, 1주 1회, 격주로, 달마다 2주, 달마다 3주, 달마다 1회, 달마다 2회, 달마다 3회 이상 투여된다. 약학적 조성물은 적어도 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 7달, 8달, 9달, 10달, 11달, 12달, 18달, 2년, 3년 이상 동안 투여된다.
환자의 상태가 개선하는 경우에, 의사의 결정에 의해 조성물의 투여는 연속적으로 주어지고, 대안적으로, 투여되는 조성물의 용량은 소정의 기간(즉, "약물 휴약") 동안 일시적으로 감소하거나 일시적으로 중지된다. 일부 구현예에서, 약물 휴약의 길이는 2일 내지 1년, 예를 들어 오직 예로서 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일 또는 365일 사이로 변한다. 약물 휴약 동안 용량 감소는, 오직 예로서 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 포함하여, 10% 내지 100%이다.
환자 상태 개선이 발생하면, 필요한 경우 유지 용량이 투여된다. 후속하여, 투약량 또는 투여 빈도, 또는 둘 다가 개선된 질환, 장애 또는 병태가 보유되는 수준으로 증상의 함수로서 감소할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 양에 상응하는 주어진 물질의 양은 특정 화합물, 질환의 중증도, 치료를 필요로 하는 대상체 또는 숙주의 정체(예를 들어, 중량)와 같은 인자에 따라 변하지만, 그럼에도 불구하고, 예를 들어 투여되는 특정 물질, 투여 경로, 및 치료되는 대상체 또는 숙주를 포함하는 사례를 둘러싼 특정 상황에 따라 당해 분야에 알려진 방식으로 일상적으로 결정된다. 일부 구현예에서, 원하는 용량은 단일 용량으로 또는 동시에(또는 짧은 기간에 걸쳐) 투여되는 분할 용량으로 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 매일 2회, 3회, 4회 이상의 하위용량으로 편리하게 제시된다.
개별 치료 요법과 관련하여 변수의 수가 크고, 이들 추천된 값에서 상당한 이동이 흔하므로, 상기 범위는 단지 제안이다. 이러한 투약량은 비제한적인 예로서 사용된 화합물의 활성, 치료되는 질환 또는 병태, 투여 방식, 개별 대상체의 요건, 치료되는 질환 또는 병태의 중증도, 및 의사의 판단의 다수의 변수에 따라 변경된다.
일부 구현예에서, 이러한 치료학적 요법의 독성 및 치료 효율은 비제한적인 예로서 LD50(집단의 50%에 치사인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)의 결정을 포함하는 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학 절차에 의해 결정된다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고, 이것은 LD50과 ED50 사이의 비율로서 표시된다. 높은 치료 지표를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 일련의 투약량을 제제화하는 데 사용된다. 이러한 화합물의 투약량은 바람직하게는 최소 독성으로 ED50을 포함하는 일련의 순환 농도 내에 있다. 투약량은 사용된 투여형 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에 변한다.
키트/제조 물품
소정의 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품이 본원에 개시된다. 이러한 키트는 바이알, 관 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하기 위해 구획화된 캐리어, 패키지 또는 용기를 포함하고, 각각의 용기(들)는 본원에 기재된 방법에 사용되는 별개의 요소들 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 일 구현예에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성된다.
본원에 제공된 제조 물품은 패키징 재료를 함유한다. 약학적 패키징 재료의 예는 블리스터 팩, 병, 관, 백, 용기, 병, 및 선택된 제제 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 패키징 재료를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예를 들어, 용기(들)는 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체의 전달을 용이하게 하도록 하나 이상의 본원에 개시된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체, 및 선택적으로 하나 이상의 본원에 기재된 약학적 부형제를 포함한다. 이러한 키트는 식별 표현 또는 라벨 또는 본원에 기재된 방법에서의 사용과 관련한 설명서를 추가로 선택적으로 포함한다.
키트는 전형적으로 내용물을 수록한 라벨 및/또는 사용 설명서, 및 사용 설명서를 갖는 패키지 인서트를 포함한다. 일련의 설명서가 또한 전형적으로 포함될 것이다.
일 구현예에서, 라벨은 용기 상에 있거나 이와 연관된다. 일 구현예에서, 라벨을 형성하는 철자, 숫자 또는 다른 부호가 용기 자체에 부착되거나 성형되거나 에칭될 때 라벨은 용기 위에 있을 수 있고, 라벨이 예를 들어 패키지 인서트로서 용기를 또한 보유하는 리셉터클 또는 캐리어 내에 존재할 때 라벨은 용기와 관련된다. 일 구현예에서, 라벨은 내용물이 특정 치료 분야에 사용된다는 것을 나타내도록 사용된다. 라벨은 또한 예컨대 본원에 기재된 방법에서 내용물의 사용을 위한 지시를 나타낸다.
소정의 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 제공된 화합물을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유하는 팩 또는 디스펜서 장치에 존재한다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 함유한다. 일 구현예에서, 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서를 동반한다. 일 구현예에서, 팩 또는 디스펜서는 또한 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 정한 형태의 용기와 관련된 안내문이 동반되고, 이 안내문은 인간 또는 수의학적 투여를 위한 약물의 형태의 기관에 의한 허가를 반영한다. 이러한 안내문은 예를 들어 미국 식품의약청이 허가한 라벨링 또는 허가된 제품 인서트이다. 일 구현예에서, 상용성 약학적 담체에서 제제화된 본원에 제공된 화합물을 함유하는 조성물은 또한 제조되고 적절한 용기에 배치되고 표시된 병태의 치료에 대해 표지된다.
특정 용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 청구된 대상이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며, 청구된 임의의 대상을 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 구체적으로 달리 진술되지 않는 한 복수형을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형은 달리 문맥에서 명확하게 표시되지 않는 한 복수의 지시어를 포함한다는 것이 주지되어야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 진술되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 및 다른 형태, 예컨대 "포함하다", "포함하는" 및 "포함된"의 사용은 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 다양한 특징이 단일의 구현예의 맥락에서 기재될 수 있지만, 그 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수 있다. 반대로, 본 발명이 명확성을 위해 별개의 구현예의 맥락에서 본원에 기재될 수 있지만, 본 발명은 또한 단일 구현예에서 실시될 수 있다.
"여러 구현예", "일 구현예", "하나의 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 명세서에서의 언급은 구현예와 연결되어 특정 특징, 구조 또는 특성이 반드시 본 발명의 모든 구현예가 아니라 적어도 일부 구현예에 포함된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "대략적인" 특정 값 또는 범위로 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 그러므로, "약 5 ㎕"는 "약 5 ㎕" 및 또한 "5 ㎕"를 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내에 있을 것으로 예상되는 양을 포함한다.
본원에 사용된 부문의 제목은 단지 구조적 목적을 위한 것으로, 기재된 대상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개체(들)", "대상체(들)" 및 "환자(들)"는 임의의 포유류를 의미한다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다. 일부 구현예에서, 포유류는 비인간이다. 용어의 어느 것도 건강 관리 노동자(예를 들어, 의사, 공인 간호사, 전담 간호사, 의사 보조인, 잡역부 또는 호스피스 노동자)의 감독(예를 들어, 일정한 또는 간헐적)을 특징으로 하는 상황을 요하거나 이것으로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어는 "유의미한" 및 "유의미하게"는 수용체 결합과 관련하여 표적 수용체에 대한 IL-15 폴리펩타이드의 결합에 영향을 미치기에 충분한 변화를 의미한다. 일부 경우에, 상기 용어는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 변화를 지칭한다. 일부 경우에, 상기 용어는 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 50배, 100배, 500배, 1000배 이상의 변화를 의미한다.
일부 경우에, 용어 "유의미하게"는 사이토카인 신호전달 복합체를 통한 하나 이상의 세포 집단의 활성화와 관련하여 세포 집단을 활성화하기에 충분한 변화를 의미한다. 일부 경우에, 세포 집단을 활성화하기 위한 변화는 수용체 신호전달 효력으로서 측정된다. 이러한 경우에, EC50 값이 제공될 수 있다. 다른 경우에, ED50 값이 제공될 수 있다. 추가의 경우에, 사이토카인의 농도 또는 투약량이 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효력"은 표적 효과를 생성하는 데 필요한 사이토카인(예를 들어, IL-15 폴리펩타이드)의 양을 지칭한다. 일부 경우에, 용어 "효력"은 표적 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-15 수용체)를 활성화하는 데 필요한 사이토카인(예를 들어, IL-15 폴리펩타이드)의 양을 지칭한다. 다른 경우에, 용어 "효력"은 표적 세포 집단을 활성화하는 데 필요한 사이토카인(예를 들어, IL-15 폴리펩타이드)의 양을 지칭한다. 일부 경우에, 효력은 ED50(유효 용량 50), 또는 최대 효과의 50%를 생성하는 데 필요한 용량으로서 측정된다. 다른 경우에, 효력은 EC50(유효 농도 50), 또는 집단의 50%에서 표적 효과를 생성하는 데 필요한 용량으로서 측정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "종양 침윤 면역 세포(들)"는 (예를 들어, 종양 미세환경에서) 종양 세포를 포함하는 영역으로 침윤된 면역 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역 세포는 종양 세포 파괴, 종양 세포 증식의 감소, 종양 부담의 감소 또는 이들의 조합과 연관된다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역 세포는 종양 침윤 림프구(TIL)를 포함한다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역 세포는 T 세포, B 세포, 천연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 또는 호염기구를 포함한다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
실시예
이 실시예는 오직 예시 목적을 위해 제공되고, 본원에 제공된 청구범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1.
변형된 IL-15 폴리펩타이드의 발현
변형된 IL-16 폴리펩타이드는 37℃, 250 rpm 및 5시간 유도에서 성장되었다. 배지 성분은 표 2에 예시되어 있다.
[표 2]
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발현 배양이 OD600 0.85 내지 0.9에 도달할 때, 배양은 (250 μM의 최종 농도에서) NaMTP, (25 μM의 최종 농도에서) TPT3TP 및 (15 mM의 최종 농도에서) 아지도-리신이 예비 로딩되었다. 리보뉴클레오타이드 및 아미노산에 의한 예비 로딩 후 약 15분 내지 20분에, IPTG를 첨가하고, 단백질은 약 5시간 동안 발현되었다.
봉입체
세포 펠릿 수집 시, 펠릿은 봉입체에 추가로 처리되었다. 간단히 말하면, 1 ℓ 세포 펠릿을 10 ㎖의 용해 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl; 1 mM DTT; 및 프로테아제 저해제(1 펠릿/50 ㎖))에 재현탁시켰다. 재현탁 후, 1 ℓ 펠릿의 부피는 용해 완충액으로 45 ㎖까지 증가하고, 2x에 대한 미세유동화기(microfluidizer)를 통해 흘렀다. 이후, 샘플을 50 ㎖의 원심분리 관으로 옮기고, 4℃에서 20분 동안 16k rpm에서 원심분리하였다. 다음에, 펠릿을 5 ㎖의 용해 완충액에 펠릿 재현탁시키고, 총 부피는 용해 완충액으로 30 ㎖까지 증가하였다. 약 10% Triton X-100을 0.5%의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후, 용액을 4℃에서 16k rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 이후 펠릿을 수집하고, 30 ㎖의 용해 완충액으로 3x 세척하였다. 침을 갖는 5 ㎖의 주사기를 사용하여 각 세척에서 완전히 재현탁시켰다. 최종 회전 후, 상청액을 버리고, 펠릿을 급속 동결시켜 -80℃에서 저장하였다.
가용화 및 재폴딩
약 5 ㎖의 가용화 완충액을 봉입체 펠릿에 첨가하였다. 재현탁 후, 부피는 가용화 완충액 중에 30 ㎖까지 증가하였다. 다음에, 샘플을 30분 내지 60분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이후, 샘플을 2 x 50 ㎖ 원심분리 관(15 ㎖/관)으로 옮기고, 15 ㎖의 희석 완충액을 각각의 관에 첨가하였다. 이후, 샘플을 후속하여 4℃에서 밤새 완충액 A1, 이어서 A2 투석 완충액, A3 투석 완충액, A4 투석 완충액 및 A5 투석 완충액 중에 투석하였다. 투석 후, 샘플을 4℃에서 30분 동안 4000 rpm에서 원심분리하고, 약 5 ㎖까지 농축시켰다.
표 3은 가용화 완충액을 예시한다.
Figure pct00004
정제
샘플을 처음에 1x PBS 용리 완충액으로 GE HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 겔 여과 칼럼, 이어서 유리 PEG를 제거하도록 GE HiTrapQ 음이온 교환 칼럼, 및 이후 20 칼럼 부피에서 30% 내지 70% 용리 완충액의 구배 용리로 역상 크로마토그래피에서 정제하였다.
표 4는 음이온 교환 크로마토그래피에 사용된 완충액을 예시한다. 표 5는 역상 크로마토그래피에 사용된 완충액을 예시한다.
[표 4]
Figure pct00005
[표 5]
Figure pct00006
도 4는 음이온 교환 크로마토그래피의 예시적인 실행을 보여준다.
도 5는 역상 크로마토그래피의 예시적인 실행을 보여준다.
실시예 2
자연적 또는 무 IL- 15Rα 관여를 갖는 페길화 IL-15 화합물의 확인에 대한 세포 기반 스크리닝
IL-15/이종삼합체성 수용체 신호전달 복합체(PDB: 4GS7)의 구조 데이터는 이종삼합체성 수용체와의 자연적 상호작용을 보유하거나 IL-15 및 IL-15 수용체 α 아단위(IL-15Rα)의 상호작용을 특이적으로 폐지하도록 nAA-페길화 부위의 설계를 지도하도록 사용되었다. 예시적인 IL-15 접합체는 기능 분석에 처리되었다: S18, A23, T24, L25, Y26, E46, V49, L52, E53, N77, S83, E89, E90. IL-15 접합체는 E. 콜라이에서 봉입체로서 발현되고, 정제되고, AzK에 안정한 공유 mPEG 모이어티를 부착시키기 위해 DBCO 매개 구리 비함유 클릭 화학을 사용하여 IL-15 산물을 부위 특이적으로 폐길화하기 전에 표준 절차를 사용하여 재폴딩되었다. IL-15 접합체는 비색 CTLL2 증식 검정을 사용하여 기능 활성에 대해 스크리닝되었다. CTLL2는 모든 3개의 IL-15 수용체 아단위를 발현하고 성장을 위해 IL-2/IL-15를 필요로 하는 마우스 T 세포의 서브클론이다. 예비 실험은 최적 세포 밀도, 적절한 용량-반응 곡선에 대한 IL-15 표준품 또는 IL-15 접합체의 범위, 및 항온처리 시간을 결정하도록 수행되었다. 인하우스 재조합 인간 IL-15(rHuIL-15)는 상업용 IL-15 표준품(R&D, 카탈로그 247-IL)과 비교되었다. 한정된 조건 하에서, 상업용 IL-15 표준품에 대한 EC50은 인하우스 rHuIL-15에 대해 약 10.7 pM 및 9.7 pM이었다.
표 6은 이종삼합체성 IL-15 수용체와의 자연적 상호작용을 보유하도록 설계된 30 kDa 선형 페길화 IL-15 접합체에 대한 EC50 데이터를 보여준다. 평균에 포함된 값의 숫자는 괄호 내에 표시된다. 결과는 30 kDa PEG에 대한 생체접합이 천연 IL-15와 비교하여 5배 미만 감소한 EC50으로 삼합체성 수용체에서 효력을 방해하지 않는다는 것을 보여준다.
[표 6]
Figure pct00007
표 7은 IL-15 및 IL-15 수용체 α 아단위(IL-15Rα)의 상호작용을 특이적으로 폐지하도록 설계된 30 kDa 선형 및 40 kDa 분지된 페길화 IL-15 접합체에 대한 EC50 데이터를 보여준다. 평균에 포함된 값의 숫자는 괄호 내에 표시된다. 결과는 30 kDa PEG에 대한 생체접합이 천연 IL-15와 비교하여 삼합체성 수용체에서 효력을 감소시킨다는 것을 보여준다. V49에 대한 선형 PEG 30 kDa 또는 분지된 40 kDa PEG의 생체접합은 rHuIL-15와 비교하여 삼합체성 수용체에 대한 효력을 적당히 감소시켰다(약 6배 내지 8배, 각각 124.62 pg/㎖에 대한 814.4 pg/㎖ 내지 1,029 pg/㎖). 또한, L25 PEG39의 효력은 rHuIL-15에 비해 더 강하게 감소하였다(약 54배, 각각 124.62 pg/㎖에 대한 6,827 pg/㎖).
[표 7]
Figure pct00008
도 6은 CTLL2 증식 검정에서 자연적 효력을 갖는 예시적인 IL-15 접합체에 대한 EC50 값을 예시한다. 결과는 반응의 백분율로 작도된다.
도 7은 예시적인 IL-15 접합체에 대한 EC50 값을 예시한다. 여기 도시된 것처럼, 부위 특이적 페길화는 시험관내 약리학에 기여한다. 결과는 반응의 백분율로 작도된다.
도 8은 상이한 PEG 크기에 접합된 예시적인 IL-15에 대한 EC50 값을 예시한다. 결과는 반응의 백분율로 작도된다.
실시예 3
페길화 IL-15와 인간 IL-15 수용체 아단위의 생화학 상호작용
인간 IL-15 수용체 아단위와의 페길화 IL-15 화합물 상호작용의 동역학은 Biofizik(캘리포니아주 샌 디에고)에서 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정되었다. 이 연구를 위해, 인간 IgG1 Fc-융합된 IL-15 Rα(Sino Biological #18366-H02H, R&D # 7194-IR) 및 IL-2 Rβ(Sino Biological #10696-H02H) 세포외 도메인은 Biacore Protein A-코팅된 CM3 또는 CM4 센서 칩의 표면에 포획되었다. 단백질 A는 25℃에서 CM3 칩에서 대략 1500 RU의 밀도로 아민 커플링에 의해 커플링되었다. IL15Rα-Fc 융합의 대략 400 RU는 분석물질 주사 전에 4분 접촉 시간, 이어서 20분 대기 시간을 사용하여 포획되었다. 주사 사이의 표면의 재생은 100 mM 인산을 사용하여 달성되었다. 새로운 수용체는 재생 이후에 각각의 사이클에 포획되었다. 이 표면은 25℃에서 3중 프로빙되었다. 전형적인 실험에서, 500 nM의 가장 높은 농도를 갖는 분석물질의 10 용량이 주사되었다. 일부 경우에, 높은 농도 범위가 필요하고, 다른 것에서 더 높은 용량이 분석으로부터 생략되었다.
IL2Rβ에 대한 화합물의 더 약한 결합으로 인해, 재생은 필요하지 않고, 직교성 결합 연구는 재생 단계 없이 수행되었다. IL2Rβ Fc 융합의 대략 600 내지 700 RU는 전개 완충액에서 스톡의 1/100 희석의 1분 내지 2분 접촉 시간을 사용하여 포획되었다. 시험 화합물에 대해 가장 높은 농도의 1000 nM을 갖는 분석물질의 10 용량이 주사되었다. 원시 데이터는 이중 참조 절차를 사용하여 Scrubber2 프로그램을 사용하여 분석되었고, 여기서 화합물 신호는 단백질 표면에 걸쳐 블랭크 표면 및 완충액 주사로 보정되었다. 표 8 내지 표 10을 참조한다.
[표 8]
Figure pct00009
[표 9]
Figure pct00010
[표 10]
Figure pct00011
부동화된 IL-15Rα, 자연적 IL-15(rHuIL-15 및 R&D로부터의 상업용 IL-15)를 함유하는 온 센서 표면은 신속한 결합 및 매우 느린 분해 동역학을 보여주어서, 매우 높은 친화도 결합을 입증한다(도 9a). IL-15 수용체와의 상호작용을 차단하지 않으면서 반감기를 연장하도록 설계된 IL-15 페길화 변이체는 자연적 IL-15와 유사한 결합 동역학을 보여준다. 아단위에 대해 화합물 사이에 관찰된 KD의 적당한 차이(각각 IL-15 N77PEG30 및 IL-15 S83PEG30에 대한 약 10배 및 약 3배 감소한 KD)는, 페길화 화합물의 더 낮은 확산 계수 및 먼 결합 표면에 대한 큰 PEG 모이어티의 비특이적 차폐 효과로부터 예상된, rHuIL-15에 비해 IL-15 접합된 화합물의 감소한 결합 속도로 인한다(도 9b). 그에 반해서, IL-15 E46PEG30은 느린 결합 및 느린 분해로 IL-15 Rα와 상호작용하는 반면에, IL-15 E53PEG30은 IL-15Rα 결합 표면에 대한 PEG 모이어티의 특정한 국재화로 인해 신속한 결합 및 신속한 분해를 보여준다(도 9c).
부동화된 IL-2 Rβ를 함유하는 표면은 자연적 IL-15 및 자연적 수용체 관여를 갖는 반감기 연장을 위해 설계된 화합물 둘 다와의 필적하는 결합 및 분해 반응을 보여주었다. PEG 모이어티가 IL-15Rα 결합 표면에 국소화된 화합물은 IL-2Rβ 표면에 대한 상이한 결합 동역학을 보여준다. IL-15 E46PEG30 및 IL-15 L25PEG가 이 표면에 약 10배 및 약 30배 감소한 결합을 보여주지만, IL-15 E53PEG30은 IL-2Rβ에 대한 "자연적" 결합을 보유한다. 이 결과는 PEG 모이어티의 특정한 국소화가 수용체와의 IL-15 상호작용에 대한 상이한 양상을 부여할 수 있다는 것을 제안한다.
도 9a 내지 도 9c는 IL-15Rα에 결합하는 rHuIL-15, IL-15 접합된 화합물에 대한 시간(초, X축)에 대한 반응 단위(RU, Y축)를 보여준다. 결합 동역학 분석은 부위 특이적 페길화가 IL-15Rα와의 상호작용을 조절한다는 것을 확인시켜준다.
도 10은 IL-15Rα 및 IL-2Rβ에 결합하는 rHuIL-15, IL-15 N77PEG30에 대한 시간(초, X축)에 대한 반응 단위(RU, Y축)를 보여준다. 결합 동역학 분석은 N77번 위치에서의 부위 특이적 페길화가 IL-15Rα 및 IL-2Rβ와의 자연적 상호작용을 보유한다는 것을 확인시켜준다.
도 11은 IL-15Rα 및 IL-2Rβ에 결합하는 rHuIL-15, IL-15 E53PEG30에 대한 시간(초, X축)에 대한 반응 단위(RU, Y축)를 보여준다. 결합 동역학 분석은 E53번 위치에서의 부위 특이적 페길화가 IL-2Rβ와의 자연적 상호작용을 보유하면서 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시킨다는 것을 확인시켜준다.
실시예 4
1차 인간 백혈구 감소 시스템( LRS ) 유래 PBMC 샘플에서의 IL-15 PEG 접합체의 생체외 면역 반응 프로파일링
IL-15 PEG 접합체의 차등적 수용체 특이성이 1차 면역 세포 하위집단의 활성화에 영향을 미치는지는 결정하기 위해, 인간 LRS 유래 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플에서의 림프구 활성화의 농도-반응 프로파일링은 멀티-컬러 유세포분석법을 사용하여 수행되었다. 이 연구는 PrimityBio LLC(캘리포니아주 프리몬트)에서 수행되었다. 새로운 LRS 유래 샘플을 30 ㎍/㎖의 상부 농도로 시작하는 5배 희석 시리즈에서 rHuIL-15 또는 상이한 IL-15 페길화 화합물로 치료하였다. 치료된 세포 집단을 BD Lyse/Fix 완충액을 첨가하고 표 11에 기재된 형광 항체 패널로 염색하기 전에 37℃에서 45분 동안 항온처리하였다. 멀티-컬러 유세포분석법은 상이한 T 세포 및 NK 세포 하위집단에서 pSTAT5 활성화를 검출하고 정량화하도록 사용되었다. 유세포분석법 데이터는 rHuIL-15 또는 IL-15 페길화 화합물에 의한 치료 후 pSTAT5 축적을 판독하여 농도-반응 모드에서 상이한 T 및 NK 세포 하위집단의 활성화에 대해 분석되었다.
[표 11]
Figure pct00012
NK 및 효과기 T 세포(CD3+ CD8+) 집단에서, IL-15 N77PEG30 및 IL-15 S83PEG30은 rHuIL-15에 비해 효력을 유지하였고, pSTAT5 생성에 대한 EC50 값은 자연적 사이토카인의 2배 내이다. 그에 반해서, CD8+ T 및 NK 세포 집단에서 IL-15 L25PEG30에 대한 pSTAT5 유도에 대한 EC50 값은 rHuIL-15와 비교하여 각각 약 14배 및 약 18배 감소하였다. IL-15 L25PEG30에 대한 EC50의 실질적인 증가는 이 위치에서의 IL-15의 페길화가 IL-15 수용체의 아고니즘(agonism)을 감소시킨다는 것을 나타낸다. CD8+ T 및 NK 세포 집단에서의 IL-15 E53PEG30에 대한 pSTAT5 유도에 대한 EC50 값은 rHuIL-15와 비교하여 불과 2배 감소하였다. 이를 고려하여 화합물은 IL-15Rα에 대한 신속한 결합 및 신속한 분해 결합 동역학을 보여준다.
표 12는 rHuIL-15 또는 IL-15 접합체로 치료된 인간 LRS 샘플에서 STAT5 신호전달(EC50)에 대한 용량 반응을 보여준다.
Figure pct00013
도 12의 A 내지 도 12의 D는 예시적인 IL-15 PEG 접합체에 의한 자극 시 NK 및 CD8+ T 세포에 대한 STAT5 인산화를 예시한다.
실시예 5
예시적인 IL-15 접합체의 생체내 약리학 연구
자연적(E3826-U1821) C57BL /6 마우스에서의 PK 연구
마우스는 0.3 ㎎/㎏에서 rHuIL-15 및 IL-15 접합체 S83-PEG 30kDa, V49-PEG 30kDa, L25-PEG 30kDa 또는 N77-PEG 30kDa가 투약되었다. 0.25시간, 0.5시간, 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간 및 192시간의 시점에 채혈하였다.
표 13은 실험 설정을 보여준다. 각각의 마우스는 비히클, rHuIL-15, 또는 3개 중 1개의 IL-15 접합체의 단일 IV 용량을 받았다.
Figure pct00014
혈장으로부터 유래된 샘플에서의 rHuIL-15, IL-15 페길화 화합물 및 내부 표준품의 농도는 ELISA 검정을 사용하여 결정되었다. PK 데이터 분석은 NW Solutions(워싱턴주 시애틀)에서 수행되었다. 분석을 위해 Phoenix WinNonlin v6.4(Certara/Pharsight, Princeton, NJ)로 PK 데이터를 불러왔다. 시간에 대한 그룹 평균 혈장 농도 데이터는 IV 볼루스 투여 모델을 사용하여 3구획 방법으로 분석되었다.
표 14는 rHuIL-15에 비해 마우스에서 IL-15 접합체의 연장된 반감기를 보여준다.
Figure pct00015
도 13은 0.3 ㎎/㎏에서 rHuIL-15, IL-15 S83PEG30, IL-15 V49PEG30, IL-15 N77PEG30 및 IL-15 L25 PEG30의 혈장 농도 프로필을 보여준다.
예상된 것처럼, 페길화 화합물은 표 14에 요약된 바대로 rHuIL-15에 비해 우수한 PK 프로필을 나타낸다. MRT(평균 체류 시간)는 시험 물품 분자가 신체에 머무는 평균 시간을 나타내고, 전체 PK 프로필을 고려한다. 페길화 화합물은 rHuIL-15와 비교하여 MRT의 약 5배 증가를 보여준다. IL-15 S18PEG30은 rHuIL-15와 비교하여 약 15배 연장된 베타 t1/2(15.8시간 대 1.08시간) 및 약 59배 감소한 CL2(5.68 대 333 ㎖/h/㎏)를 입증하였다. 페길화 화합물에 대한 분포 부피는 rHuIL_15에 비해 감소하고, 페길화 화합물이 전신 순환 내에 대부분 분포된다는 것을 제안한다.
실시예 6
말초 혈액 구획에서의 약력학적 관찰
자연적(E3826-U1821) C57BL/6 마우스에서의 PD 연구
마우스는 0.1, 0.3 또는 1 ㎎/㎏에서 rHuIL-15, IL-15 접합체 S18-PEG 30kDa, IL-15 접합체 V49-PEG 30kDa 또는 IL-15 접합체 S83-PEG 30kDa가 투약되었다(표 10). 0.25시간, 0.5시간, 2시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간 및 192시간의 시점에 채혈하였다. 추가의 0.13 시점은 알려진 짧은 반감기를 고려하여 rHuIL-15에 포함되었다. PD 판독은 모든 시점에 대해 세포내 pSTAT5 모니터링 및 CD8+ T 세포의 표현형분석을 포함하였다.
표 15는 실험 설정을 보여준다. 각각의 마우스는 비히클, rHuIL-15, 또는 3개 중 1개의 IL-15 접합체의 단일 IV 용량을 받았다.
Figure pct00016
세포 증식의 STAT5 인산화 및 유도(초기 분자 마커 Ki-67 및 세포 계수치)는 IL-15 S18PEG30, IL-15 V49PEG30 및 IL-15 L25 PEG30의 약물학적 프로필을 평가하기 위해 약력학적 판독으로 사용되었다. pSTAT5의 더 낮거나 유사한 상승이 페길화 화합물이 투약된 마우스에서 관찰되었지만, STAT5 인산화는 더 높은 증식으로 번역되고, Treg 세포가 아니라 NK 세포 및 CD8+ 효과기 및 기억 T 세포가 지속되었다(투약 후 1일 내지 7일)(도 14 내지 도 17).
도 14의 A 내지 도 14의 D는 상이한 말초 혈액 세포 집단에서의 % pSTAT5를 보여준다.
도 15의 A 내지 도 15의 D는 페길화 화합물이 투약된 동물에서 Treg 세포가 아니라 CD8+ T, CD8+ Tmem 및 NK 세포에서 조기 증식 분자 마커 Ki67의 발현 증가를 보여준다.
도 16의 A 내지 도 16의 C는 페길화 화합물이 투약된 동물에서 Treg 세포가 아니라 튼튼한 말초 CD8+ T, CD8+ Tmem 및 NK 세포를 보여준다.
도 17의 A 내지 도 17의 B는 마우스에서 IL-15 L25PEG30 화합물의 용량이 증가한 CD8+ T 및 NK 세포에서 Ki67 발현 증가를 보여준다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 제시되고 기재되어 있지만, 이러한 구현예는 오직 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다수의 변경, 변화 및 치환이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기 청구항이 본 발명의 범위를 한정하고, 이 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 이의 등가물이 이에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> SYNTHORX, INC. <120> IL-15 CONJUGATES AND USES THEREOF <130> 46085-713.601 <140> PCT/US2019/019637 <141> 2019-02-26 <150> 62/635,133 <151> 2018-02-26 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys 20 25 30 Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr 35 40 45 Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys 50 55 60 Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser 65 70 75 80 Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu 100 105 110 Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile 115 120 125 Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser 130 135 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid except Pro <400> 3 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Phe Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 30 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (93)

  1. 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 15 수용체 α(IL-15Rα) 사이의 결합을 감소시키지만, IL-15/IL-15Rβγ 복합체를 형성하도록 인터류킨 15 수용체 βγ(IL-15Rβγ) 신호전달 복합체와의 상당한 결합을 보유하는 폴리펩타이드 상의 위치에서 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 및 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드로서, IL-15Rα에 대한 결합 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15Rα 사이의 결합과 비교되는, 단리된 및 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드.
  2. 반감기를 향상시키는 폴리펩타이드 상의 위치에서 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 및 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드로서, 반감기 증대는 야생형 IL-15 단백질의 반감기와 비교되는, 단리된 및 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드.
  3. 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 15 수용체 α(IL-15Rα) 사이의 결합을 감소시키지만, 인터류킨 15 수용체 βγ(IL-15Rβγ) 신호전달 복합체에 의한 상당한 신호전달 효력을 보유하는 폴리펩타이드 상의 위치에서 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 및 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드로서, IL-15Rα에 대한 결합 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15Rα 사이의 결합과 비교되는, 단리된 및 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 신호전달 효력은 야생형 IL-15 폴리펩타이드와 IL-15Rβγ 사이의 신호전달 효력과 비교되는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 변형된 IL-15/IL-15Rβγ 복합체와 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체 사이의 수용체 신호전달 효력의 차이는 1000배 미만, 500배 미만, 200배 미만, 100배 미만, 50배 미만, 10배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만 또는 1배 미만인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 변형된 IL-15/IL-15Rβγ 복합체와 야생형 IL-15/IL-15Rβγ 복합체 사이의 수용체 신호전달 효력의 차이는 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과 또는 500배 초과인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 및 E93;
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 Y26, E46, V49, E53 및 L25;
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 A23, T24, E89 및 E93;
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 D22, L44, Q48 및 E90;
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 L25, E53, N77 및 S83; 또는
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 L25 및 E53으로부터 선택되는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  9. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 및 F110;
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97 및 E98;
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 E13, L15, M19, H20, K36, V37, T38, S54, H60, I67, N71, G78, K86, E87 및 Q101; 또는
    잔기 위치가 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는 I21, S34, C35, L44, V63, S73, L74, E82, C85, C88, L91, I96, L100 및 F110으로부터 선택되는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은
    Figure pct00017
    리신 유사체이거나;
    Figure pct00018
    방향족 측쇄를 포함하거나;
    Figure pct00019
    아지도기를 포함하거나;
    Figure pct00020
    알킨기를 포함하거나;
    Figure pct00021
    알데하이드 또는 케톤기를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함하지 않는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-아지도에톡시-L-리신(AzK), N6-프로파길에톡시-L-리신(PraK), BCN-L-리신, 노르보르넨 리신, TCO-리신, 메틸테트라진 리신, 알릴옥시카보닐리신, 2-아미노-8-옥소노난산, 2-아미노-8-옥소옥탄산, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 2-아미노-8-옥소노난산, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, O-알릴티로신, O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 포스포노티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-포스포세린, 포스포노세린, L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산, 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산 또는 셀레노시스테인을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해 변형된 IL-15 폴리펩타이드로 편입되는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍의 직교성 tRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  15. 제13항에 있어서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍의 직교성 tRNA는 비천연 염기 쌍을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 공유 부착된, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 지질, 단백질 또는 펩타이드를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  18. 제17항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  19. 제17항에 있어서, 수용성 중합체는 PEG 분자를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, PEG 분자는 선형 PEG인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  21. 제19항에 있어서, PEG 분자는 분지된 PEG인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  22. 제17항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리사카라이드를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  23. 제22항에 있어서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알우론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  24. 제17항에 있어서, 지질은 지방산을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서, 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12개 내지 약 18개의 탄소 원자를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  26. 제24항에 있어서, 지방산은 포화 지방산인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  27. 제17항에 있어서, 단백질은 알부민, 트랜스페린 또는 트랜스티레틴을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  28. 제16항에 있어서, 접합 모이어티는 TLR 작용제를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  29. 제17항에 있어서, 단백질은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  30. 제29항에 있어서, 항체 또는 이의 결합 단편은 항체의 Fc 부분을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  31. 제17항에 있어서, 펩타이드는 XTEN 펩타이드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩타이드, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP), CTP 펩타이드 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  32. 제16항에 있어서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-15의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  33. 제32항에 있어서, 링커는 동종이작용성 링커, 이종이작용성 링커, 0-길이 링커, 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩타이드 링커, 말레이미드기, 스페이서, 또는 이들의 조합을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 N71, N72 또는 N77의 잔기 위치에서의 변형을 추가로 포함하고, 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  35. 제34항에 있어서, 변형은 CMC 조건 및/또는 효력을 개선하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  36. 제1항 또는 제3항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 또는 F110의 잔기에서의 변형을 추가로 포함하고, 여기서 변형은 반감기 연장을 개선하기 위한 것인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  37. 제2항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는
    D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 또는 E93의 잔기에서의 변형으로서, 여기서 변형은 IL-15Rα와의 상호작용을 손상시키는 변형;
    N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 또는 N72의 잔기에서의 변형으로서, 여기서 변형은 IL-15Rβ와의 상호작용을 손상시키는 변형;
    V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 또는 S114의 잔기에서의 변형으로서, 여기서 변형은 IL-15Rγ와의 상호작용을 손상시키는 변형; 또는
    이들의 조합을 추가로 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 변형은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산에 대한 것인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 감소인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15Rα에 대해 약 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  41. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는
    전장 IL-15 폴리펩타이드의 기능적 활성 단편;
    재조합 IL-15 폴리펩타이드; 또는
    재조합 인간 IL-15 폴리펩타이드인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  42. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 N-말단 결실, C-말단 결실, 또는 이들의 조합을 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  43. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 결실은 N-말단으로부터의 처음의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개 또는 30개의 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  44. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 결실은 C-말단으로부터의 마지막의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개 이상의 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  45. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 감소를 갖는 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 CD8+ 효과기 미경험 및 기억 세포, 천연 살해(NK) 세포, 천연 살해 T(NKT) 세포 집단, 또는 이들의 조합을 팽창시킬 수 있는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  46. 제16항에 있어서, 접합 모이어티 또는 비천연 아미노산은 IL-15와 IL-15Rα의 결합을 손상시키거나 차단하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  47. 제16항에 있어서, 접합 모이어티 또는 비천연 아미노산은 반감기를 연장시키지만, IL-15와 IL-15 수용체의 결합을 손상시키지 않거나 차단하지 않는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  48. 제16항에 있어서, 접합 모이어티 또는 비천연 아미노산은 IL-15Rβ 및/또는 IL-15Rγ에 대한 IL-15의 결합을 증가시키는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  49. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL-15의 반감기 증대는 야생형 IL-15의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상 더 긴, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  50. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL-15의 반감기 증대는 약 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  51. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드에 의한 IL-15Rβγ 복합체를 통한 CD8+ 효과기 미경험 및 기억 세포, 천연 살해(NK) 세포 또는 천연 살해 T(NKT) 세포 집단의 활성화는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 상기 세포 집단의 활성화의 상당한 효력을 보유하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  52. 제51항에 있어서, IL-15Rβγ 복합체에 대한 변형된 IL-15 폴리펩타이드의 수용체 신호전달 효력은 IL-15Rβγ 복합체에 대한 야생형 IL-15 폴리펩타이드의 수용체 신호전달 효력보다 더 높은, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  53. 제51항에 있어서, IL-15Rβγ 복합체에 대한 변형된 IL-15 폴리펩타이드의 수용체 신호전달 효력은 IL-15Rβγ 복합체에 대한 야생형 IL-15 폴리펩타이드의 수용체 신호전달 효력보다 더 낮은, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  54. 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 및 변형된 인터류킨 15(IL-15) 폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 변형된 IL-15 폴리펩타이드와 인터류킨 2/인터류킨 15 수용체 β(IL-2/IL-15Rβ), 인터류킨 15 수용체 γ(IL-15Rγ), 또는 이들의 조합의 결합 친화도를 선택적으로 감소시키지만, 인터류킨 15 수용체 α(IL-15R α)와의 상호작용에 영향을 미치지 않는 잔기 위치에 있는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  55. 제54항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 IL-15Rβ에 대한 결합 친화도가 감소한, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  56. 제55항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 및 N72로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  57. 제55항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는
    N4, S7, K11 및 D61;
    D8, E64, N65, I68 및 N72; 또는
    N1, T62 및 L69로부터 선택되는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  58. 제54항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 IL-15Rγ에 대한 결합 친화도가 감소한, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  59. 제58항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는 V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  60. 제58항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 잔기 위치는
    V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 및 S114;
    E28, P33, S102 및 V104; 또는
    I6 및 V31로부터 선택되는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 반감기 연장을 개선하는 변형을 추가로 포함하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  62. 제61항에 있어서, 변형은 잔기 위치 E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101 또는 F110에 있고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드는 잔기 위치 N71, N72 또는 N77에서의 변형을 추가로 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치에 상응하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 비천연 아미노산에 대한 것인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  65. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 천연 아미노산에 대한 것인, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  66. 제63항에 있어서, 변형은 CMC 조건 및/또는 효력을 개선하는, 단리된 및 변형된 IL-15 폴리펩타이드.
  67. 인터류킨 15(IL-15) 접합체로서,
    단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드; 및
    N4, E46, D61, E64, N65, I68 및 L69로부터 선택된 아미노산 위치에서 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티로서, 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 1에 상응하는, 접합 모이어티를 포함하는, IL-15 접합체.
  68. 제67항에 있어서, 아미노산 잔기는 시스테인 또는 리신에 돌연변이된, IL-15 접합체.
  69. 제67항에 있어서, 아미노산 잔기는 N4, E46, N65 및 L69로부터 선택되고, 비천연 아미노산에 추가로 돌연변이된, IL-15 접합체.
  70. 약학적 조성물로서,
    제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에서와 같은 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에서와 같은 IL-15 접합체; 및
    약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 약학적 조성물은 비경구 투여를 위해 제제화된, 약학적 조성물.
  72. 증식성 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 증식성 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에서와 같은 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에서와 같은 IL-15 접합체의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 증식성 질환 또는 병태는 암인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 암은 고형 종양 암인, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 고형 종양 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 눈암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암인, 방법.
  76. 제73항에 있어서, 암은 혈액학적 악성상태인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 혈액학적 악성상태는 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), 소형 림프구성 림프종(SLL: small lymphocytic lymphoma), 소포성 림프종(FL: follicular lymphoma), 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma), 외투 세포 림프종(MCL: mantle cell lymphoma), 발데스트롬 마크로글로불린증, 다발성 골수종, 결절외 가장자리 영역 B 세포 림프종, 노드 가장자리 영역 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비버킷 고등급 B 세포 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종(PMBL: primary mediastinal B-cell lymphoma), 면역아구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 형질구성 림프종, 비장 가장자리 영역 림프종, 혈장 세포 골수종, 형질세포종, 종격(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종 또는 림프종모양 육아종증인, 방법.
  78. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체 및 추가의 치료제는 동시에 투여되는, 방법.
  80. 제78항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체 및 추가의 치료제는 순차적으로 투여되는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 추가의 치료제 전에 투여되는, 방법.
  82. 제80항에 있어서, 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 IL-15 접합체는 추가의 치료제의 투여 후에 투여되는, 방법.
  83. 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  84. 효과기 T(Teff) 세포, 기억 T(Tmem) 세포 및 천연 살해(NK) 세포 집단을 팽창시키는 방법으로서,
    a) 세포를 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에서와 같은 변형된 IL-15 폴리펩타이드 또는 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에서와 같은 IL-15 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    b) IL-15를 IL-15Rβ 및 IL-15Rγ 아단위와 상호작용시켜 IL-15/IL-15Rβγ 복합체를 형성하는 단계를 포함하고;
    IL-15 접합체는 IL-15Rα 아단위에 대한 친화도가 감소하고, IL-15/IL-15Rβγ 복합체는 Teff, Tmem 및 NK 세포의 팽창을 자극하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 세포는 진핵생물 세포인, 방법.
  86. 제84항 또는 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 포유류 세포인, 방법.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인, 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, IL-15 접합체는 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드 및 N4, E46, N65 및 L69로부터 선택된 아미노산 잔기에서 단리된 및 정제된 IL-15 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티를 포함하고, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 1에 상응하는, 방법.
  89. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15Rα에 대한 결합 친화도의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 감소인, 방법.
  90. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, IL-15Rα에 대한 친화도의 감소는 야생형 IL-15 폴리펩타이드에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상인, 방법.
  91. 제84항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 접합 모이어티는 IL-15와 IL-15Rα의 결합을 손상시키거나 차단하는, 방법.
  92. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에서와 같은 변형된 IL-15 폴리펩타이드, 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에서와 같은 IL-15 접합체, 또는 제70항 또는 제71항에서와 같은 약학적 조성물을 포함하는 키트.
  93. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에서와 같은 변형된 IL-15 폴리펩타이드를 암호화하는 다중핵산 분자를 포함하는 키트.
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