TWI834636B - Il-15結合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文揭示介白素(IL) 15結合物及治療一或多種適應症之用途。本文亦描述包括包含IL-15結合物之一或多者之醫藥組合物及套組。

Description

IL-15結合物及其用途
T細胞之不同群體調節免疫系統以維持免疫穩態及耐受性。例如，調節T (Treg)細胞藉由阻止病理性自我反應來阻止免疫系統之不適當反應，而細胞毒性T細胞靶向並破壞受感染之細胞及/或癌細胞。在一些實施例中，T細胞之不同群體之調節為治療疾病或適應症提供選項。
在某些實施例中，本文揭示IL-15結合物及在癌症治療中之用途。在一些實施例中，本文亦描述調節IL-15與IL-15受體之間的相互作用以刺激或擴增特異性T細胞群體之方法。在另外實例中，本文進一步描述包含一或多種本文描述之IL-15結合物之醫藥組合物及套組。
在某些實施例中，本文揭示經修飾之介白素15 (IL-15)多肽，其等包含至少一個經轉譯後修飾之非天然胺基酸，其中該至少一個非天然胺基酸係於選擇性減小經修飾之IL-15多肽與介白素15受體α (IL-15R α)之結合親和力之殘基位置，其中結合親和力之減小係相對於野生型IL-15多肽與IL-15Rα之間的結合親和力，且其中經修飾之IL-15多肽與介白素2/介白素15受體βγ (IL-2/IL-15R βγ)之相互作用未受顯著影響。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90及E93；Y26、E46、V49、E53及L25；A23、T24、E89及E93；D22、L44、Q48及E90；L25、E53、N77及S83；或L25及E53。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E89、E53、E93、V49、E46、Y26、L25、T24、A23、D22、I21及L52，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53、T24、N4、K11、N65、L69、S18、H20及S83，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53及T24，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46、V49、E53及T24，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自Y26、V49、E53及T24，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V49、E53及T24，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46及Y26，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E46，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係Y26，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係V49，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E53，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係T24，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N4、K11、N65、L69、S18、H20及S83，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸包含對乙醯基-L-苯丙胺酸、對碘-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、對丙炔氧基苯丙胺酸、對丙炔基-苯丙胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、左旋多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸或N6-(2-疊氮基乙氧基)-羰基-L-離胺酸。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸包含如圖2C中所述之非天然胺基酸。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸係由正交tRNA合成酶/tRNA對併入經修飾之IL-15多肽內。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係通過該至少一個非天然胺基酸結合至結合部分。在一些實施例中，該結合部分包含水溶性聚合物、蛋白質或多肽。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含：聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇) (PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧乙化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)，或其組合；或多醣。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含PEG。在一些實施例中，該PEG係直鏈PEG或分支鏈PEG。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含聚醣。在一些實施例中，該多醣包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、透明質酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基澱粉(HES)。在一些實施例中，該結合部分包含飽和脂肪酸。在一些實施例中，該飽和脂肪酸包含十六酸、十四酸或15-疊氮基十五酸。在一些實施例中，該蛋白質包含白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白或抗體之Fc部分。在一些實施例中，該多肽包含XTEN肽、富含甘胺酸之高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白(GLK)聚合物。在一些實施例中，該結合部分係直接結合至該經修飾之IL-15之至少一個非天然胺基酸。在一些實施例中，該結合部分係通過連接子間接結合至該經修飾之IL-15之至少一個非天然胺基酸。在一些實施例中，該連接子包含同雙官能連接子。在一些實施例中，該同雙官能連接子包含洛曼特試劑(Lomant's reagent)二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯) DSP、3'3'-二硫雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯) (DTSSP)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(磺基DST)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯) (EGS)、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、N,N'-碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)、己二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫雙丙酸亞胺酯(DTBP)、1,4-二-(3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙馬來醯亞胺己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB) (諸如，例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二環氧丙醚、己二酸二醯肼、卡肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基二苯基、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。在一些實施例中，該連接子包含異雙官能連接子。在一些實施例中，該異雙官能連接子包含3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性-長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-sMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝基苯酯(NPIA)、羰基反應性及巰基反應性交聯劑，諸如4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8 (M2 C2 H)、3-(2-吡啶基二硫)丙醯基醯肼(PDPH)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-疊氮基柳基醯胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(對疊氮基柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基琥珀醯亞胺(ANB-NOs)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-疊氮基苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀醯亞胺基(4-疊氮基苯基)-1,3'-二硫丙酸酯(磺基-sADP)、4-(對疊氮基苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮基丙酮酸對硝基苯酯(ρNPDP)、對硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸鹽(PNP-DTP)、1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙醯胺、對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)、4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)或對疊氮基苯基乙二醛(APG)。在一些實施例中，該連接子包含可裂解或非可裂解二肽連接子。在一些實施例中，該二肽連接子包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些實施例中，該連接子包含馬來醯亞胺基團。在一些實施例中，該連接子包含間隔基團。在一些實施例中，該間隔基團包含對胺基苯甲醇(PAB)、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或類似物。在一些實施例中，該結合部分可延長該經修飾之IL-15多肽之血清半衰期。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，結合親和力之減小係約對IL-15Rα之結合親和力之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%減小。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，對IL-15Rα之結合親和力之減小係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係全長IL-15多肽之功能活性片段。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係重組IL-15多肽。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係重組人類IL-15多肽。在一些實施例中，對IL-15Rα之結合親和力減小之該經修飾之IL-15多肽可擴增效應T (Teff)細胞及自然殺手(NK)細胞群體。
在某些實施例中，本文揭示經修飾之介白素15 (IL-15)多肽，其等包含至少一個經轉譯後修飾之非天然胺基酸，其中該至少一個非天然胺基酸係於非顯著影響該經修飾之IL-15多肽與介白素15受體α (IL-15R α)或IL-2/介白素15受體βγ (IL-2/IL-15R βγ)之結合親和力之殘基位置。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽包含經延長之半衰期。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90及E93；Y26、E46、V49、E53及L25；A23、T24、E89及E93；D22、L44、Q48及E90；L25、E53、N77及S83；或L25及E53。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自M1、S18、H20、K36、K41、G55、D56、S75、S76、N77、G78,V80、T81、S83及K86，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸包含對乙醯基-L-苯丙胺酸、對碘-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、對丙炔氧基苯丙胺酸、對丙炔基-苯丙胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、左旋多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸或N6-(2-疊氮基乙氧基)-羰基-L-離胺酸。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸包含如圖2C中所述之非天然胺基酸。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸係由正交tRNA合成酶/tRNA對併入經修飾之IL-15多肽內。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係通過該至少一個非天然胺基酸結合至結合部分。在一些實施例中，該結合部分包含水溶性聚合物、蛋白質或多肽。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含：聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇) (PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧乙化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)，或其組合；或多醣。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含PEG。在一些實施例中，該PEG係直鏈PEG或分支鏈PEG。在一些實施例中，該等水溶性聚合物包含聚醣。在一些實施例中，該多醣包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、透明質酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基澱粉(HES)。在一些實施例中，該結合部分包含飽和脂肪酸。在一些實施例中，該飽和脂肪酸包含十六酸、十四酸或15-疊氮基十五酸。在一些實施例中，該蛋白質包含白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白或抗體之Fc部分。在一些實施例中，該多肽包含XTEN肽、富含甘胺酸之高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白(GLK)聚合物。在一些實施例中，該結合部分係直接結合至該經修飾之IL-15之至少一個非天然胺基酸。在一些實施例中，該結合部分係通過連接子間接結合至該經修飾之IL-15之至少一個非天然胺基酸。在一些實施例中，該連接子包含同雙官能連接子。在一些實施例中，該同雙官能連接子包含洛曼特試劑二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯) DSP、3'3'-二硫雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯) (DTSSP)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(磺基DST)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯) (EGS)、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、N,N'-碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)、己二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫雙丙酸亞胺酯(DTBP)、1,4-二-(3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙馬來醯亞胺己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB) (諸如，例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二環氧丙醚、己二酸二醯肼、卡肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基二苯基、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。在一些實施例中，該連接子包含異雙官能連接子。在一些實施例中，該異雙官能連接子包含3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性-長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-sMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝基苯酯(NPIA)、羰基反應性及巰基反應性交聯劑，諸如4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8 (M2 C2 H)、3-(2-吡啶基二硫)丙醯基醯肼(PDPH)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-疊氮基柳基醯胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(對疊氮基柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基琥珀醯亞胺(ANB-NOs)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-疊氮基苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀醯亞胺基(4-疊氮基苯基)-1,3'-二硫丙酸酯(磺基-sADP)、4-(對疊氮基苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮基丙酮酸對硝基苯酯(ρNPDP)、對硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸鹽(PNP-DTP)、1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙醯胺、對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)、4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)或對疊氮基苯基乙二醛(APG)。在一些實施例中，該連接子包含可裂解或非可裂解二肽連接子。在一些實施例中，該二肽連接子包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些實施例中，該連接子包含馬來醯亞胺基團。在一些實施例中，該連接子包含間隔基團。在一些實施例中，該間隔基團包含對胺基苯甲醇(PAB)、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或類似物。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係全長IL-15多肽之功能活性片段。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係重組IL-15多肽。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係重組人類IL-15多肽。在一些實施例中，對IL-15Rα之結合親和力減小之該經修飾之IL-15多肽可擴增效應T (Teff)細胞及自然殺手(NK)細胞群體。
在某些實施例中，本文揭示經修飾之介白素15 (IL-15)多肽，其等包含至少一個經轉譯後修飾之非天然胺基酸，其中該至少一個非天然胺基酸係於選擇性減小該經修飾之IL-15多肽與介白素2/介白素15受體β (IL-2/IL-15R β)之結合親和力但不影響與該介白素15受體α (IL-15R α)之相互作用之殘基位置。在一些實施例中，其中該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V3、I6、K10、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V3、K10、S29、D30、H32、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114；E28、P33、S102及V104；或I6及V31。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、N4、S7、D8、K11、D61、T62、E64、N65、I68、L69及N72。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N4、S7、K11及D61；D8、E64、N65、I68及N72；或N1、T62及L69。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸包含對乙醯基-L-苯丙胺酸、對碘-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、對丙炔氧基苯丙胺酸、對丙炔基-苯丙胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、左旋多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸或N6-(2-疊氮基乙氧基)-羰基-L-離胺酸。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸包含如圖1至3中所述之非天然胺基酸。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸係由正交tRNA合成酶/tRNA對併入該經修飾之IL-15多肽內。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係通過該至少一個非天然胺基酸結合至結合部分。在一些實施例中，該結合部分包含水溶性聚合物、蛋白質或多肽。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含：聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇) (PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧乙化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)，或其組合；或多醣。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含PEG。在一些實施例中，該PEG係直鏈PEG或分支鏈PEG。在一些實施例中，該水溶性聚合物包含聚醣。在一些實施例中，該多醣包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、透明質酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基澱粉(HES)。在一些實施例中，該結合部分包含飽和脂肪酸。在一些實施例中，該飽和脂肪酸包含十六酸、十四酸或15-疊氮基十五酸。在一些實施例中，該蛋白質包含白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白或抗體之Fc部分。在一些實施例中，該多肽包含XTEN肽、富含甘胺酸之高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白(GLK)聚合物。在一些實施例中，該結合部分係直接結合至該經修飾之IL-15之至少一個非天然胺基酸。在一些實施例中，該結合部分係通過連接子間接結合至該經修飾之IL-15之至少一個非天然胺基酸。在一些實施例中，該連接子包含同雙官能連接子。在一些實施例中，該同雙官能連接子包含洛曼特試劑二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯) DSP、3'3'-二硫雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯) (DTSSP)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(磺基DST)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯) (EGS)、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、N,N'-碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)、己二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫雙丙酸亞胺酯(DTBP)、1,4-二-(3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙馬來醯亞胺己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB) (諸如，例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二環氧丙醚、己二酸二醯肼、卡肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基二苯基、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。在一些實施例中，該連接子包含異雙官能連接子。在一些實施例中，該異雙官能連接子包含3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性-長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-sMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝基苯酯(NPIA)、羰基反應性及巰基反應性交聯劑，諸如4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8 (M2 C2 H)、3-(2-吡啶基二硫)丙醯基醯肼(PDPH)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-疊氮基柳基醯胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(對疊氮基柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基琥珀醯亞胺(ANB-NOs)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-疊氮基苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀醯亞胺基(4-疊氮基苯基)-1,3'-二硫丙酸酯(磺基-sADP)、4-(對疊氮基苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮基丙酮酸對硝基苯酯(ρNPDP)、對硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸鹽(PNP-DTP)、1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙醯胺、對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)、4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)或對疊氮基苯基乙二醛(APG)。在一些實施例中，該連接子包含可裂解或非可裂解二肽連接子。在一些實施例中，該二肽連接子包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些實施例中，該連接子包含馬來醯亞胺基團。在一些實施例中，該連接子包含間隔基團。在一些實施例中，該間隔基團包含對胺基苯甲醇(PAB)、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或類似物。在一些實施例中，該結合部分可延長該經修飾之IL-15多肽之血清半衰期。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，結合親和力之減小係約對IL-15Rα之結合親和力之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%減小。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，對IL-15Rα之結合親和力之減小係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係全長IL-15多肽之功能活性片段。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係重組IL-15多肽。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係重組人類IL-15多肽。在一些實施例中，對IL-15Rα之結合親和力減小之該經修飾之IL-15多肽可擴增效應T (Teff)細胞及自然殺手(NK)細胞群體。
在某些實施例中，本文揭示介白素15 (IL-15)結合物，其包含：經分離及純化之IL-15多肽；及於選自N4、E46、D61、E64、N65、I68及L69之胺基酸位置結合至該經分離及純化之IL-15多肽之結合部分，其中該等胺基酸殘基之編號對應於SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，該胺基酸位置係N4。在一些實施例中，該胺基酸位置係E46。在一些實施例中，該胺基酸位置係D61。在一些實施例中，該胺基酸位置係E64。在一些實施例中，該胺基酸位置係N65。在一些實施例中，該胺基酸位置係I68。在一些實施例中，該胺基酸位置係L69。在一些實施例中，該胺基酸殘基係突變為半胱胺酸。在一些實施例中，該胺基酸殘基係突變為離胺酸。在一些實施例中，選自N4、E46、N65及L69之該胺基酸殘基係進一步突變為非天然胺基酸。在一些實施例中，該非天然胺基酸包含對乙醯基-L-苯丙胺酸、對碘-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、對丙炔氧基苯丙胺酸、對丙炔基-苯丙胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、左旋多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸或N6-(2-疊氮基乙氧基)-羰基-L-離胺酸。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸包含如圖2C中所述之非天然胺基酸。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，該IL-15結合物對IL-15受體α (IL-15Rα)亞單元具有減小之親和力。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，該減小之親和力係約對IL-15Rα之結合親和力之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%減小。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，對IL-15Rα之減小之親和力係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在一些實施例中，該結合部分損害或阻斷IL-15與IL-15Rα之結合。
在某些實施例中，本文揭示醫藥組合物，其包含：經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物；及醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施例中，該醫藥組合物係經調配用於非經腸投與。
在某些實施例中，本文揭示治療有此需要之個體之增殖性疾病或病症之方法，其包括向該個體投與治療有效量之經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物。在一些實施例中，該增殖性疾病或病症係癌症。在一些實施例中，該癌症係實性瘤癌症。在一些實施例中，該實性瘤癌症係膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些實施例中，該癌症係血液學惡性腫瘤。在一些實施例中，該血液學惡性腫瘤係慢性淋巴細胞白血病(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、多發性骨髓瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結邊緣區B細胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、非伯奇氏高級別B細胞淋巴瘤(non-Burkitt high grade B cell lymphoma)、原發性縱膈B細胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤或淋巴瘤樣肉芽腫。在一些實施例中，方法進一步包括投與另外治療劑。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物及另外治療劑係同時投與。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物及另外治療劑係依序投與。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物係在另外治療劑之前投與。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物係在投與另外治療劑之後投與。在一些實施例中，該個體係人類。
在某些實施例中，本文揭示擴增效應T (Teff)細胞及自然殺手(NK)細胞群體之方法，其包括：(a)使細胞與經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物接觸；及(b)使該IL-15與IL-15Rβ及IL-15Rγ亞單元相互作用以形成IL-15/IL-15Rβγ複合物；其中該IL-15結合物對IL-15Rα亞單元具有減小之親和力，且其中該IL-15/IL-15Rβγ複合物刺激Teff及NK細胞之擴增。在一些實施例中，該細胞係真核細胞。在一些實施例中，該細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，該細胞係人類細胞。在一些實施例中，該IL-15結合物包含經分離及純化之IL-15多肽及於選自N4、E46、N65及L69之胺基酸殘基結合至該經分離及純化之IL-2多肽之結合部分，其中該等胺基酸殘基之編號對應於SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，該減小之親和力係約對IL-15Rα之結合親和力之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%減小。在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，對IL-15Rα之減小之親和力係約IL-15Rα 1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在一些實施例中，該結合部分損害或阻斷IL-15與IL-15Rα之結合。
在某些實施例中，本文揭示包含經修飾之IL-15多肽、IL-15結合物或醫藥組合物之套組。
在某些實施例中，本文揭示包含編碼經修飾之IL-15多肽或IL-15多肽之多核酸分子之套組。
本申請案主張2018年2月26日申請之美國臨時申請案第62/635,133號之權利，其係以全文引用之方式併入本文中。
癌症係一組複雜之疾病，其等涉及異常之細胞生長及有可能侵入或擴散至身體之其他部分。靶向癌症驅動物及途徑之癌症治療(諸如放射及化學治療)可係成功的。在一些實例中，癌細胞可適應於此等治療，限制此等治療之效用。不同於手術、化學治療或放射，免疫治療刺激免疫系統以識別並殺死腫瘤細胞。
數種細胞介素因其等觸發免疫反應之能力而用於免疫治療中。然而，利用細胞介素之當前免疫治療導致數種副作用，包括毒性及不受控制之細胞增殖。本文提供經修飾之細胞介素或細胞介素結合物以刺激或擴增特異性T細胞及NK群體之能力用於治療癌症，導致改良之治療及減少之不良事件。
細胞介素包含細胞傳訊蛋白質家族，諸如趨化介素、干擾素、介白素、淋巴因子及腫瘤壞死因子。細胞介素係由免疫細胞產生，諸如巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞及肥大細胞、內皮細胞、纖維母細胞及不同之基質細胞。在一些實例中，細胞介素調節基於體液與細胞之免疫反應之間的平衡。
介白素係調節T及B淋巴細胞及造血細胞之發展及分化之傳訊蛋白質。介白素係由輔助CD4 T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞及內皮細胞產生。在一些實例中，存在約15種介白素，介白素1-13、介白素15及介白素17。
介白素-15 (IL-15)係多效性細胞介素，其等結構係14-15 kDa醣蛋白。IL-15轉錄、轉譯及分泌係通過多種複雜機制調節。IL-15及IL-15受體α (IL-15R α、CD215)蛋白係主要由經活化之單核細胞及樹突狀細胞(DC)共表現。異源二聚體IL-15/IL-15Rα之轉錄在單核細胞/DC與1型或2型干擾素(IFN)或CD40連接或通過活化NF-kB之鐸樣受體(TLR)發揮作用之藥劑之相互作用後發生。此外，IL-15/IL-15Rα蛋白質表現係主要在轉譯及分泌之水平下進行控制。
IL-15通過異源三聚體受體傳訊號，該異源三聚體包含獨特之α鏈(IL-15R α)、共用之β亞單元(IL-15R β、CD132)及IL-2 (CD122)及與數種細胞介素共用之共同之γ亞單元(CD132；IL-15R γ)。IL-15Rα對IL-15具有高親和力且Kd 為約10-11 M。
在一些實施例中，IL-15傳訊係用以調節T細胞反應及接著用於治療癌症。在一些實施例中，IL-15傳訊係用以刺激經活化之CD4- CD8- 、CD4+ CD8+ 、CD4+ 及CD8+ T細胞之增殖及其等於經定義之效應T細胞子集中之分化。在一些實施例中，IL-15傳訊係用以刺激自然殺手(NK)細胞之產生及增殖。在一些實施例中，IL-15傳訊係用以促進記憶CD8 T細胞、初始CD8 T細胞及NK細胞之維持及存活。在一些實施例中，IL-15傳訊係用以誘導記憶CD8 T細胞之形成。在一些實施例中，IL-15傳訊係用於引發NK細胞靶向特異性活化。在一些實施例中，IL-15傳訊不導致Treg表現。
在一些實施例中，本文描述用於調節T細胞反應並接著用於治療癌症之經修飾之IL-15多肽。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽包含減小與介白素15受體α (IL-15Rα)之結合。在一些實施例中，結合親和力之減小係相對於野生型IL-15多肽與IL-15Rα之間的結合親和力。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽對該經修飾之IL-15多肽及介白素2/介白素15受體βγ (IL-2/IL-15R βγ)之相互作用影響較小或無影響。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽包含對該經修飾之IL-15多肽與IL-15R α及IL-15R βγ之結合親和力影響較小或無影響之一或多種修飾。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽包含減小與IL-2/IL-15R βγ之結合及IL-15R α相互作用不受影響。
本文描述具有刺激抗腫瘤反應之經改良之能力之經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物。在一些實施例中，該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物具有經改良之安全概況。在一些實施例中，該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物包含用於增加半衰期之位點特異性聚乙二醇化。在一些實施例中，該位點特異性聚乙二醇化增加半衰期且對生物活性影響較小或無影響。在一些實施例中，該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物之傳訊偏向於IL-15R βγ。在一些實施例中，該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物包含用於增加半衰期並減小毒性之位點特異性聚乙二醇化。在一些實施例中，該位點特異性聚乙二醇化導致該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物之劑量減少。在一些實施例中，毒性係藉由該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物阻斷IL-15R α相互作用減小。在一些實施例中，該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物之活性限於腫瘤位點。在一些實施例中，該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物包含位點特異性聚乙二醇化使得IL-15之反式呈現無需自然殺手(NK)及效應細胞增殖及功能。在一些實施例中，該等經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物包含位點特異性聚乙二醇化使得廓清係經抑制或禁止。 經修飾之IL-15多肽及IL-15結合物
在一些實施例中，本文描述經修飾之IL-15多肽。在一些實例中，該修飾係修飾為天然胺基酸之修飾。在一些實例中，該修飾係修飾為非天然胺基酸。在一些實例中，本文描述經分離及修飾之IL-15多肽，其包含至少一個非天然胺基酸。在一些實例中，該IL-15多肽係經分離及純化之哺乳動物IL-15，例如，人類IL-15蛋白。在一些實例中，該IL-15多肽係人類IL-15蛋白。在一些實例中，該IL-15多肽包含與SEQ ID NO: 1或2之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實例中，該IL-15多肽包含SEQ ID NO: 1或2之序列或由SEQ ID NO: 1或2之序列組成。
在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽係經截斷之變體。在一些實例中，該截斷係N端刪除。在其他實例中，該截斷係C端刪除。在另外實例中，該截斷包含N端及C端刪除兩者。例如，該截斷可為自N端或C端或兩端刪除至少或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多個殘基。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約2個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約3個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約4個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約5個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約6個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約7個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約8個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約9個殘基之N端刪除。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽包含至少或約10個殘基之N端刪除。
在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽係功能活性片段。在一些實例中，該功能活性片段包含IL-15區5-114、10-114、15-114、20-114、1-110、5-110、10-110、15-110、20-110、1-105、5-105、10-105、15-105、20-105、1-100、5-100、10-100、15-100或20-100，其中該等殘基位置係參考SEQ ID NO: 1中之位置。在一些實例中，該功能活性片段包含IL-15區5-114、10-114、15-114或20-114，其中該等殘基位置係參考SEQ ID NO: 1中之位置。在一些實例中，該功能活性片段包含IL-15區1-110、5-110、10-110、15-110或20-110，其中該等殘基位置係參考SEQ ID NO: 1中之位置。在一些實例中，該功能活性片段包含IL-15區1-105、5-105、10-105、15-105或20-105，其中該等殘基位置係參考SEQ ID NO: 1中之位置。在一些實例中，該功能活性片段包含IL-15區1-100、5-100、10-100、15-100或20-100，其中該等殘基位置係參考SEQ ID NO: 1中之位置。
在一些實施例中，功能活性IL-15片段包含內部刪除。在一些實例中，該內部刪除包含環區。在一些實例中，該內部刪除包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個殘基之刪除。
在一些實施例中，本文描述之IL-15多肽包含至少一個非天然胺基酸。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、T27、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、A39、K41、L44、L45、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、S51、L52、S54、G55、D56、A57、S58、H60、V63、I67、N71、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、L91、E92、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101及F110。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D14、Q17、S18、K41、S51、L52、G55、D56、A57、S58、S75、S76、N77、N79、V80、T81、S83、G84、E92、K94、N95、K97及E98。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、N4、S7、D8、K11、D61、T62、E64、N65、I68、L69及N72。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V3、I6、K10、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90及E93。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自Y26、E46、V49、E53及L25。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V3、K10、S29、D30、H32、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N4、S7、K11及D61。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自L25、E53、N77及S83。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自L25及E53。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53、T24、N4、K11、N65、L69、S18、H20及S83。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53及T24。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46、V49、E53及T24。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自Y26、V49、E53及T24。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V49、E53及T24。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E46及Y26。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E46。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係L25。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係Y26。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係V49。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E53。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係T24。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係N77。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N4、K11、N65、L69、S18、H20及S83。IL-15之例示性胺基酸序列係闡述於下表1中。
在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於N端附近。如本文使用，附近係指殘基位於遠離N端殘基至少1個殘基及遠離N端殘基多達至約50個殘基。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該N端殘基的前10、20、30、40或50個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該N端殘基的前10個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該N端殘基的前20個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該N端殘基的前30個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該N端殘基的前40個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該N端殘基的前50個殘基內。
在一些實例中，至少一個非天然胺基酸係N端殘基。
在一些實例中，至少一個非天然胺基酸係位於C端附近。如本文使用，附近係指殘基位於遠離C端殘基至少1個殘基及遠離C端殘基多達至約50個殘基。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該C端殘基的前10、20、30、40或50個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該C端殘基的前10個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該C端殘基的前20個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該C端殘基的前30個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該C端殘基的前40個殘基內。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸係位於自該C端殘基的前50個殘基內。
在一些實例中，至少一個非天然胺基酸係C端殘基。
在一些實施例中，經修飾之IL-15多肽包含至少一個非天然胺基酸，其中該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係於選擇性減小該IL-15多肽與介白素15受體α (IL-15R α)之結合親和力之殘基位置。在一些實施例中，結合親和力之減小係相對於野生型IL-15多肽與IL-15Rα之間的結合親和力。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽對IL-15R α之結合不影響該經修飾之IL-15多肽與介白素2/介白素15受體βγ (IL-2/IL-15R βγ)之相互作用或改良該經修飾之IL-15多肽與IL-2/IL-15R βγ之相互作用。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90及E93，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自Y26、E46、V49、E53及L25，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自A23、T24、E89及E93，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D22、L44、Q48及E90，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係Y26。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E46。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係V49。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E53。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係L25。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽進一步包含PEG。在一些實例中，該PEG係結合於選自D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90及E93之殘基位置。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽進一步包含用於增加半衰期之PEG。在一些實例中，就增加之半衰期而言，該PEG係結合於選自E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、S51、L52、S54、G55、D56、A57、S58、H60、V63、I67、N71、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、L91、E92、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101及F110之殘基位置。在一些實例中，該PEG係結合於選自N71、N72及N77之殘基位置。在一些實例中，與該PEG結合之殘基係突變為天然胺基酸。在其他實例中，與該PEG結合之殘基係突變為非天然胺基酸。在另外實例中，於N71、N72或N77之突變進一步改良CMC條件(例如，產率、純度、穩定性、減少之聚集及/或改良蛋白質折疊)、效力或其組合。
在一些實例中，經修飾之IL-15多肽包含至少一個非天然胺基酸，其中該至少一個非天然胺基酸係於選擇性減小該經修飾之IL-15多肽與IL-2/IL-15R β、IL-15Rγ或其組合之結合親和力之殘基位置。在一些實施例中，該經修飾之IL-15對與IL-15R α之相互作用影響較小或無影響。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E28、S29、D30、V31、H32、P33、D61、T62、E64、N65、I68、L69、N72、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸係於選擇性減小該經修飾之IL-15多肽與IL-2/IL-15R β之結合親和力之殘基位置。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、N4、S7、D8、K11、D61、T62、E64、N65、I68、L69及N72，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N4、S7、K11及D61。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D8、E64、N65、I68及N72。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N1、T62及L69。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係N4。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S7。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係K11。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係D61。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸係於選擇性減小該經修飾之IL-15多肽與IL-2/IL-15Rγ之結合親和力之殘基位置。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V3、I6、K10、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自V3、K10、S29、D30、H32、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E28、P33、S102及V104。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自I6及V31。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係V3。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係K10。在一些實例中，該至少一種非天然胺基酸之殘基位置係S29。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係D30。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係H32。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係H105。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係Q108。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係M109。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係I111。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係N112。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係T113。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S114。在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽進一步包含PEG。在一些實例中，該PEG係結合於選自N1、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E28、S29、D30、V31、H32、P33、D61、T62、E64、N65、I68、L69、N72、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114之殘基位置。在一些實施例中，就增加之半衰期而言，該經修飾之IL-15多肽進一步包含PEG。在一些實例中，就增加之半衰期而言，該PEG係結合於選自E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、S51、L52、S54、G55、D56、A57、S58、H60、V63、I67、N71、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、L91、E92、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101及F110之殘基位置。在一些實例中，該PEG係結合於選自N71、N72及N77之殘基位置。在一些實例中，與該PEG結合之殘基係突變為天然胺基酸。在其他實例中，與該PEG結合之殘基係突變為非天然胺基酸。在另外實例中，於N71、N72或N77之突變進一步改良CMC條件(例如，產率、純度、穩定性、減少之聚集及/或改良蛋白質折疊)、效力或其組合。
在一些實例中，經修飾之IL-15多肽包含至少一個非天然胺基酸，其中該至少一個非天然胺基酸係於不影響該經修飾之IL-15多肽與IL-15R α及IL-15R βγ之結合親和力之殘基位置。在一些實施例中，就增加之半衰期而言，該經修飾之IL-15多肽進一步包含PEG。在一些實施例中，該經修飾之IL-15包含PEG及生物活性無變化。在一些實施例中，該殘基係經修飾以延長半衰期。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、S51、L52、S54、G55、D56、A57、S58、H60、V63、I67、N71、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、L91、E92、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101及F110，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自D14、Q17、S18、K41、S51、L52、G55、D56、A57、S58、S75、S76、N77、N79、V80、T81、S83、G84、E92、K94、N95、K97及E98，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自E13、L15、M19、H20、K36、V37、T38、S54、H60、I67、N71、G78、K86、E87及Q101，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自I21、S34、C35、L44、V63、S73、L74、E82、C85、C88、L91、I96、L100及F110，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N71、N72及N77，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自N77及S83。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係D14。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係Q17。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S18。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係K41。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S51。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係L52。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係G55。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係D56。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係A57。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S58。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S75。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S76。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係N77。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係N79。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係V80。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係T81。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係S83。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係G84。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E92。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係K94。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係N95。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係K97。在一些實施例中，該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係E98。在一些實例中，於N71、N72或N77之突變包含突變為天然胺基酸。在一些實例中，於N71、N72或N77之突變進一步改良CMC條件(例如，產率、純度、穩定性、減少之聚集及/或改良蛋白質折疊)、效力或其組合。
在一些實施例中，包含至少一個非天然胺基酸之IL-15多肽係進一步結合至結合部分以產生IL-15結合物。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之胺基酸位置係於N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、T27、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、A39、K41、L44、L45、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113或S114處，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實例中，該至少一個非天然胺基酸之胺基酸位置係於N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113或S114處。在一些實例中，該結合部分係結合至該至少一個非天然胺基酸。在一些實例中，該結合部分係結合至N端或C端胺基酸殘基。在一些實例中，該結合部分係直接結合至該至少一個非天然胺基酸或末端殘基。在其他實例中，該結合部分係經由下文描述之連接子間接結合至該至少一個非天然胺基酸或末端殘基。
在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，IL-15多肽或IL-15結合物對IL-15受體α (IL-15Rα)亞單元之減小之親和力係約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在一些實施例中，該減小之親和力係約10%。在一些實施例中，該減小之親和力係約20%。在一些實施例中，該減小之親和力係約40%。在一些實施例中，該減小之親和力係約50%。在一些實施例中，該減小之親和力係約60%。在一些實施例中，該減小之親和力係約80%。在一些實施例中，該減小之親和力係約90%。在一些實施例中，該減小之親和力係約95%。在一些實施例中，該減小之親和力係100%。
在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，IL-15多肽或IL-15結合物對IL-15受體α (IL-15Rα)亞單元之減小之親和力係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約1倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約2倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約4倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約5倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約6倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約8倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約10倍。
在一些實施例中，IL-15多肽或IL-15結合物不與IL-15Rα相互作用。
在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，IL-15多肽或IL-15結合物對IL-2受體(IL-2R)亞單元之減小之親和力係約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在一些實施例中，該IL-2R亞單元係IL-2R βγ。在一些實施例中，該減小之親和力係約10%。在一些實施例中，該減小之親和力係約20%。在一些實施例中，該減小之親和力係約40%。在一些實施例中，該減小之親和力係約50%。在一些實施例中，該減小之親和力係約60%。在一些實施例中，該減小之親和力係約80%。在一些實施例中，該減小之親和力係約90%。在一些實施例中，該減小之親和力係約95%。在一些實施例中，該減小之親和力係100%。
在一些實施例中，相對於野生型IL-15多肽，IL-15多肽或IL-15結合物對IL-2受體(IL-2R)亞單元之減小之親和力係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在一些實施例中，該IL-2R亞單元係IL-2R βγ。在一些實施例中，該減小之親和力係約1倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約2倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約4倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約5倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約6倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約8倍。在一些實施例中，該減小之親和力係約10倍。
在一些實施例中，IL-15多肽或IL-15結合物不與IL-2Rα相互作用。
在一些實施例中，IL-15多肽或IL-15結合物具有提高之半衰期。在一些實例中，該提高之半衰期係與野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期比較。
在一些實例中，IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、48小時、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、14天、21天、28天、30天，或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少90分鐘或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少2小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少3小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少4小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少5小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少6小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少10小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少12小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少18小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少24小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少36小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少48小時或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少3天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少4天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少5天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少6天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少7天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少10天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少12天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少14天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少21天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少28天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。在一些實例中，該IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係至少30天或長於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期。
在一些實例中，相較於該野生型IL-15蛋白或野生型IL-15結合物之半衰期，IL-15多肽或IL-15結合物之提高之半衰期係約4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、48小時、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、14天、21天、28天或30天。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約90分鐘之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約2小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約3小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約4小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約5小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約6小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約7小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約8小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約9小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約10小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約11小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約12小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約18小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約24小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約36小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約48小時之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約3天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約4天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約5天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約6天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約7天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約10天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約12天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約14天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約21天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約28天之提高之半衰期。在一些實例中，該生物活性IL-15多肽或IL-15結合物具有約30天之提高之半衰期。
在一些實施例中，經修飾之IL-15多肽保留與介白素15受體βγ (IL-15Rβγ)傳訊複合物之顯著傳訊效力。在一些實例中，該傳訊效力係與在野生型IL-15多肽與IL-15Rβγ之間的傳訊效力比較。在一些實例中，該經修飾之IL-15/IL-15Rβγ複合物與該野生型IL-15/IL-15Rβγ複合物之間的受體傳訊效力之差異係小於1000倍、小於500倍、小於200倍、小於100倍、小於50倍、小於10倍、小於5倍、小於4倍、小於3倍、小於2倍或小於1倍。在一些實例中，該經修飾之IL-15/IL-15Rβγ複合物與該野生型IL-15/IL-15Rβγ複合物之間的受體傳訊效力之差異係大於10倍、大於20倍、大於30倍、大於40倍、大於50倍、大於100倍、大於200倍、大於300倍、大於400倍或大於500倍。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽係部分促效劑，例如，相對於完全促效劑，活化受體(例如，IL-15βγ傳訊複合物)但於該受體處具有僅部分效力之促效劑。在一些實例中，該經修飾之IL-15多肽係完全促效劑，例如，在最大反應下活化受體(例如，IL-15βγ傳訊複合物)之促效劑。
在一些實例中，受體傳訊效力係藉由EC50值衡量。在一些實例中，不同於野生型IL-15/IL-15Rβγ複合物之EC50值，該經修飾之IL-15多肽提供小於1000倍、小於500倍、小於200倍、小於100倍、小於50倍、小於10倍、小於5倍、小於4倍、小於3倍、小於2倍或小於1倍之EC50值。在一些實例中，不同於野生型IL-15/IL-15Rβγ複合物之EC50值，該經修飾之IL-15多肽提供大於10倍、大於20倍、大於30倍、大於40倍、大於50倍、大於100倍、大於200倍、大於300倍、大於400倍或大於500倍之EC50值。
在一些實例中，受體傳訊效力係藉由ED50值衡量。在一些實例中，不同於野生型IL-15/IL-15Rβγ複合物之EC50值，該經修飾之IL-15多肽提供小於1000倍、小於500倍、小於200倍、小於100倍、小於50倍、小於10倍、小於5倍、小於4倍、小於3倍、小於2倍或小於1倍之ED50值。在一些實例中，不同於野生型IL-15/IL-15Rβγ複合物之EC50值，該經修飾之IL-15多肽提供大於10倍、大於20倍、大於30倍、大於40倍、大於50倍、大於100倍、大於200倍、大於300倍、大於400倍或大於500倍之ED50值。
在一些實施例中，IL-15多肽係經修飾(例如，聚乙二醇化)以在化學過程、製造及控制(CMC)階段期間，延長半衰期、改良穩定性、改良純化產率、改良純度、減少聚集、改良蛋白質折疊或其組合。在一些實例中，該IL-15多肽係於胺基酸位置：N71、N72或N77經修飾，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實例中，該IL-15多肽係於殘基N77經修飾，例如，經由聚乙二醇化，以在CMC階段期間，延長半衰期、改良穩定性、改良純化產率、改良純度、減少聚集、改良蛋白質折疊或其組合。在一些實例中，該IL-15多肽係於位置N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113或S114。在一些實例中，該IL-15多肽係係於位置D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90或E93經進一步修飾，其中該修飾損害與IL-15Rα之相互作用。在一些實例中，該IL-15多肽係於位置N1、N4、S7、D8、K11、D61、T62、E64、N65、I68、L69或N72經進一步修飾，其中該修飾損害與IL-15Rβ之相互作用。在一些實例中，該IL-15多肽係於位置V3、I6、K10、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113或S114經進一步修飾，其中該修飾損害與IL-15Rγ之相互作用。在一些實例中，該IL-15多肽係於位置E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、S51、L52、S54、G55、D56、A57、S58、H60、V63、I67、N71、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、L91、E92、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101或F110經進一步修飾，其中該修飾改良半衰期延長。在一些實例中，該IL-15多肽係於上文位置中之任何一者或多者經進一步修飾來損害與IL-15Rα之相互作用、損害與IL-15Rβ之相互作用、損害與IL-15Rγ之相互作用、改良半衰期延長或其組合。 IL-15結合物前體
本文揭示IL-15結合物前體，其等包含經修飾之IL-15多肽，其中一或多個胺基酸已自野生型胺基酸突變。此等前體通常與本文揭示之方法一起用於治療疾病或病症。在一些實施例中，IL-15前體未結合。此等突變不同地包含添加、刪除或取代。在一些實例中，該添加包括於IL-15多肽之N端、C端或內部區域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個殘基。在另外實例中，該刪除包含自IL-15多肽之N端、C端或內部區域內移除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個殘基。 天然及非天然胺基酸
在一些實施例中，本文揭示之胺基酸殘基(例如，於IL-15多肽內)係在結合至結合部分(或與之反應)之前突變為離胺酸、半胱胺酸、組胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸。例如，離胺酸、半胱胺酸、組胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸之側鏈可結合至本文揭示之結合部分。在一些實例中，該胺基酸殘基係突變為半胱胺酸、離胺酸或組胺酸。在一些實例中，該胺基酸殘基係突變為半胱胺酸。在一些實例中，該胺基酸殘基係突變為離胺酸。在一些實例中，該胺基酸殘基係突變為組胺酸。在一些實例中，該胺基酸殘基係突變為酪胺酸。在一些實例中，該胺基酸殘基係突變為色胺酸。在一些實例中，該胺基酸殘基係位於N或C端附近、位於N或C端或位於內部殘基位置。在一些實例中，該胺基酸殘基係N或C端殘基且突變係突變為半胱胺酸或離胺酸。在一些實例中，該胺基酸殘基係位於N或C端殘基附近(例如，於自N或C端殘基之50、40、30、20或10個殘基內)且突變係突變為半胱胺酸或離胺酸。
在一些實例中，將胺基酸殘基添加至N或C端殘基，即，IL-15多肽於N或C端包含另外之胺基酸殘基且該另外之胺基酸殘基係半胱胺酸或離胺酸。在一些實例中，該另外之胺基酸殘基係半胱胺酸。在一些實例中，該另外之胺基酸係結合至結合部分。
在一些實施例中，本文描述之胺基酸殘基(例如，於IL-15多肽內)係突變為非天然胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸不與結合部分結合。在一些實施例中，本文揭示之IL-15多肽包含非天然胺基酸，其中該IL-15係結合至蛋白質，其中結合點非該非天然胺基酸。
在一些實施例中，本文揭示之胺基酸殘基(例如，於IL-15多肽內)係在結合至結合部分之前突變為非天然胺基酸。在一些實例中，突變為非天然胺基酸會防止或最小化免疫系統之自體抗原反應。如本文使用，術語「非天然胺基酸」係指除蛋白質中天然存在之20種胺基酸外之胺基酸。非天然胺基酸之非限制性實例包括：對乙醯基-L-苯丙胺酸、對碘-L-苯丙胺酸、對甲氧基苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、對丙炔氧基苯丙胺酸、對丙炔基-苯丙胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、左旋多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對二羥硼基苯丙胺酸、O-丙炔基酪胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對溴苯丙胺酸、硒半胱胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、N6-[(2-疊氮基乙氧基)羰基]-L-離胺酸(AzK)、酪胺酸胺基酸之非天然類似物；麩醯胺酸胺基酸之非天然類似物；苯丙胺酸胺基酸之非天然類似物；絲胺酸胺基酸之非天然類似物；蘇胺酸胺基酸之非天然類似物；經烷基、芳基、醯基、疊氮基、氰基、鹵基、肼、醯肼、羥基、烯基、炔基、醚、巰基、磺醯基、硒基、酯、硫酸、硼酸根(borate)、二羥基硼酸根(boronate)、二氧磷基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或胺基取代之胺基酸，或其組合；與可光活化之交聯劑形成之胺基酸；經自旋標記之胺基酸；螢光胺基酸；金屬結合之胺基酸；含有金屬之胺基酸；放射性胺基酸；光籠蔽(photocaged)及/或可光致異構之胺基酸；含有生物素或生物素類似物之胺基酸；含有酮基之胺基酸；包含聚乙二醇或聚醚之胺基酸；經重原子取代之胺基酸；可化學裂解或可光解之胺基酸；具有加長側鏈之胺基酸；含有毒性基團之胺基酸；經糖取代之胺基酸；與碳連接之含糖胺基酸；氧化還原活性胺基酸；含有羥基之酸；胺基硫酸；經α,α二取代之胺基酸；β-胺基酸；除脯胺酸或組胺酸外之環形胺基酸，及除苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸外之芳族胺基酸。
在一些實施例中，非天然胺基酸包含選擇性反應基，或用於標靶多肽之位點選擇性標記之反應基。在一些實例中，化學過程係雙正交反應(例如，生物相容性及選擇性反應)。在一些實例中，該化學過程係經Cu(I)催化或「無銅」炔烴-疊氮化物三唑形成反應、施陶丁格連接(Staudinger ligation)、反電子需求之狄爾斯-阿爾德(inverse-electron-demand Diels-Alder) (IEDDA)反應、「光點擊」化學或由金屬介導之過程，諸如烯烴複分解及鈴木-宮浦(Suzuki-Miyaura)或薗頭交叉偶合(Sonogashira cross-coupling)。
在一些實施例中，非天然胺基酸包含光反應性基團，其一經(例如) UV照射即交聯。
在一些實施例中，非天然胺基酸包含光籠蔽胺基酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係經對位取代、間位取代或鄰位取代之胺基酸衍生物。
在一些實例中，非天然胺基酸包含對乙醯基-L-苯丙胺酸、對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)、對碘-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、對甲氧基苯丙胺酸、對丙炔氧基苯丙胺酸、對丙炔基-苯丙胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、左旋多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸或異丙基-L-苯丙胺酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係3-胺基酪胺酸、3-硝基酪胺酸、3,4-二羥基-苯丙胺酸或3-碘酪胺酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係苯基硒半胱胺酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係含有二苯甲酮、酮、碘化物、甲氧基、乙醯基、苯甲醯基或疊氮化物之苯丙胺酸衍生物。
在一些實例中，非天然胺基酸係含有二苯甲酮、酮、碘化物、甲氧基、乙醯基、苯甲醯基或疊氮化物之離胺酸衍生物。
在一些實例中，非天然胺基酸包含芳族側鏈。
在一些實例中，非天然胺基酸不包含芳族側鏈。
在一些實例中，非天然胺基酸包含疊氮基。
在一些實例中，非天然胺基酸包含邁克爾(Michael)-受體基團。在一些實例中，邁克爾-受體基團包含可通過1,2-加成反應形成共價鍵之不飽和部分。在一些實例中，邁克爾-受體基團包含缺電子烯烴或炔烴。在一些實例中，邁克爾-受體基團包括(但不限於) α、β不飽和：酮、醛、亞碸、碸、腈、亞胺或芳族基團。
在一些實例中，非天然胺基酸係脫氫丙胺酸。
在一些實例中，非天然胺基酸包含醛或酮基。
在一些實例中，非天然胺基酸係包含醛或酮基之離胺酸衍生物。
在一些實例中，非天然胺基酸係於β、γ或δ位置包含一或多個O、N、Se或S原子之離胺酸衍生物。在一些實例中，非天然胺基酸係於γ位置包含O、N、Se或S原子之離胺酸衍生物。
在一些實例中，非天然胺基酸係其中ε N原子經氧原子置換之離胺酸衍生物。
在一些實例中，非天然胺基酸係非天然生成之經轉譯後修飾之離胺酸之離胺酸衍生物。
在一些實例中，非天然胺基酸係包含側鏈之胺基酸，其中自α位置之第六個原子包含羰基。在一些實例中，該非天然胺基酸係包含側鏈之胺基酸，其中自α位置之第六個原子包含羰基，及自α位置之第五個原子係氮。在一些實例中，該非天然胺基酸係包含側鏈之胺基酸，其中自α位置之第七個原子係氧原子。
在一些實例中，非天然胺基酸係包含硒之絲胺酸衍生物。在一些實例中，該非天然胺基酸係硒基絲胺酸(2-胺基-3-氫硒基丙酸)。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-側氧基丙基)胺基)乙基)氫硒基)丙酸。在一些實例中，2-胺基-3-(苯基氫硒基)丙酸。在一些實例中，該非天然胺基酸包含硒，其中該硒之氧化導致包含烯烴之非天然胺基酸之形成。
在一些實例中，非天然胺基酸包含環辛炔基。
在一些實例中，非天然胺基酸包含反式環辛烯基。
在一些實例中，非天然胺基酸包含降冰片烯基。
在一些實例中，非天然胺基酸包含環丙烯基。
在一些實例中，非天然胺基酸包含二氮雜環丙烯基。
在一些實例中，非天然胺基酸包含四嗪基。
在一些實例中，非天然胺基酸係離胺酸衍生物，其中側鏈氮係經胺甲醯化。在一些實例中，該非天然胺基酸係離胺酸衍生物，其中該側鏈氮係經醯化。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(第三丁氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(第三丁氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-Boc-N6-甲基離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-乙醯基離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係吡咯離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-三氟乙醯基離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(對碘苯甲氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(p-硝基苯甲氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-脯胺醯基離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(環戊氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(環戊烷羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(四氫呋喃-2-羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(3-乙炔基四氫呋喃-2-羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((丙-2-炔-1-氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(2-疊氮基環戊氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-[(2-疊氮基乙氧基)羰基]離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(2-硝基苯甲氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-{[(2-環辛炔氧基)羰基]胺基}己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(2-胺基丁-3-炔基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-6-((2-胺基丁-3-炔基)氧基)己酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(烯丙氧基羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(丁烯-4-氧基羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(戊烯-5-氧基羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((丁-3-炔-1-氧基)羰基)-離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((戊-4-炔-1-氧基)羰基)-離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(四氫噻唑-4-羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-8-側氧基壬酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係2-胺基-8-側氧基辛酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(2-側氧基乙醯基)離胺酸。
在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-丙醯基離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-丁醯基離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(丁-2-烯醯基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((螺[2.3]己-1-烯-5-基甲氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-(((4-(1-(三氟甲基)環丙-2-烯-1-基)苯甲基)氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-基甲氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係半胱胺醯基離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)乙氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((2-(3-甲基-3H-二氮雜環丙烯-3-基)乙氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((3-(3-甲基-3H-二氮雜環丙烯-3-基)丙氧基)羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((間硝基苯氧基)N6-甲基羰基)離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基)羰基)-離胺酸。在一些實例中，該非天然胺基酸係N6-((環庚-3-烯-1-氧基)羰基)-L-離胺酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係2-胺基-3-(((((苯甲氧基)羰基)胺基)甲基)氫硒基)丙酸。
在一些實施例中，非天然胺基酸係由經重新定位之琥珀、蛋白石或赭石終止密碼子併入IL-15多肽內。
在一些實施例中，非天然胺基酸係由4鹼基密碼子併入IL-15多肽內。
在一些實施例中，非天然胺基酸係由經重新定位之稀有有義密碼子或經重新定位之常識密碼子併入IL-15多肽內。
在一些實施例中，非天然胺基酸係由包含非天然核酸之合成密碼子併入IL-15多肽內。
在一些實例中，非天然胺基酸係係由正交、經修飾之合成酶/tRNA對併入IL-15內。此等正交對包含非天然合成酶，其可用非天然胺基酸充添非天然tRNA，同時最小化a)於該非天然tRNA上充添其他內源性胺基酸及b)於其他內源性tRNA上充添非天然胺基酸。此等正交對包含tRNA，其等可由非天然合成酶充添，同時避免由內源性合成酶充添其他內源性胺基酸。在一些實施例中，此等對係經識別自各種生物體，諸如細菌、酵母、古細菌或人類來源。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含來自單一生物體之組分。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含來自兩種不同生物體之組分。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含在修飾前，促進兩種不同胺基酸之轉譯之組分。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之丙胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之精胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之天冬醯胺合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之天冬胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之半胱胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之麩醯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之麩胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之丙胺酸甘胺酸。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之組胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之白胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之異白胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之離胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之甲硫胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之苯丙胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之脯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之絲胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之蘇胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之色胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之酪胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之纈胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶係經修飾之磷絲胺酸合成酶。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之丙胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之精胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之天冬醯胺tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之天冬胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之半胱胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之麩醯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之麩胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之丙胺酸甘胺酸。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之組胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之白胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之異白胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之離胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之甲硫胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之苯丙胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之脯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之絲胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之蘇胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之色胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之酪胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之纈胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA係經修飾之磷絲胺酸tRNA。
在一些實施例中，非天然胺基酸係由胺醯基(aaRS或RS)-tRNA合成酶-tRNA對併入IL-15多肽內。例示性aaRS-tRNA對包括(但不限於)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii ) (Mj-Tyr) aaRS/tRNA對、大腸桿菌TyrRS (Ec-Tyr)/嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus ) tRNACUA 對、大腸桿菌LeuRS (Ec-Leu)/嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNACUA 對及吡咯離胺醯-tRNA對。在一些實例中，該非天然胺基酸係由Mj-TyrRS/tRNA對併入細胞介素(例如，IL多肽)內。可由Mj-TyrRS/tRNA對併入之例示性UAA包括(但不限於)經對位取代之苯丙胺酸衍生物，諸如對胺基苯丙胺酸及對甲氧基苯丙胺酸；經間位取代之酪胺酸衍生物，諸如3-胺基酪胺酸、3-硝基酪胺酸、3,4-二羥基苯丙胺酸及3-碘酪胺酸；苯基硒半胱胺酸；對硼磷醯基丙胺酸；及鄰硝基苯甲基酪胺酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係由Ec-Tyr/tRNACUA 或Ec-Leu/tRNACUA 對併入IL-15多肽內。可由Ec-Tyr/tRNACUA 或Ec-Leu/tRNACUA 對併入之例示性UAA包括(但不限於)含有二苯甲酮、酮、碘化物或疊氮化物取代基之苯丙胺酸衍生物；O-丙炔基酪胺酸；α-胺基辛酸、O-甲基酪胺酸、O-硝基苯甲基半胱胺酸；及3-(萘-2-基胺基)-2-胺基-丙酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係由吡咯離胺醯-tRNA對併入IL-15多肽內。在一些實例中，PylRS係獲得自古細菌，例如，獲得自產甲烷古細菌。在一些實例中，該PylRS係獲得自巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri )、馬氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina mazei )或乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans )。可由吡咯離胺醯-tRNA對併入之例示性UAA包括(但不限於)經醯胺及胺甲酸鹽取代之離胺酸，諸如2-胺基-6-((R)-四氫呋喃-2-甲醯胺基)己酸、N-ε-D -脯胺醯基-L -離胺酸及N-ε-環戊氧基羰基-L -離胺酸；N-ε-丙烯醯基-L -離胺酸；N-ε-[(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)乙氧基)羰基]-L -離胺酸；及N-ε-(1-甲基環丙-2-烯甲醯胺基)離胺酸。
在一些實例中，非天然胺基酸係由US 9,988,619及US 9,938,516中揭示之合成酶併入IL-15多肽內。可由此等合成酶併入之例示性UAA包括對甲基疊氮基-L-苯丙胺酸、芳烷基、雜環基、雜芳烷基非天然胺基酸及其他。在一些實施例中，此等UAA包含吡啶基、吡嗪基、吡唑基、三唑基、噁唑基、噻唑基、苯硫基或其他雜環。在一些實施例中，此等胺基酸包含疊氮化物、四嗪或可結合至偶合搭配物之其他化學基團，諸如水溶性部分。在一些實施例中，此等合成酶係經表現及用以活體內將UAA併入細胞介素內。在一些實施例中，此等合成酶係用以使用無細胞轉譯系統將UAA併入細胞介素內。
在一些實例中，非天然胺基酸係由天然生成之合成酶併入IL-15多肽內。在一些實施例中，非天然胺基酸係由針對一或多種胺基酸呈營養缺陷型之生物體併入細胞介素內。在一些實施例中，對應於營養缺陷型胺基酸之合成酶可用非天然胺基酸充添相應之tRNA。在一些實施例中，該非天然胺基酸係硒半胱胺酸或其衍生物。在一些實施例中，該非天然胺基酸係硒基甲硫胺酸或其衍生物。在一些實施例中，該非天然胺基酸係芳族胺基酸，其中該芳族胺基酸包含芳基鹵化物，諸如碘化物。在實施例中，該非天然胺基酸係結構上類似於該營養缺陷型胺基酸。
在一些實例中，非天然胺基酸包含圖1中闡述之非天然胺基酸。
在一些實例中，非天然胺基酸包含離胺酸或苯丙胺酸衍生物或類似物。在一些實例中，該非天然胺基酸包含離胺酸衍生物或離胺酸類似物。在一些實例中，該非天然胺基酸包含吡咯離胺酸(Pyl)。在一些實例中，該非天然胺基酸包含苯丙胺酸衍生物或苯丙胺酸類似物。在一些實例中，該非天然胺基酸係Wan等人，「Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool」，Biocheim Biophys Aceta 1844(6): 1059-4070 (2014)中描述之非天然胺基酸。在一些實例中，該非天然胺基酸包含圖2 (例如，圖2A及圖2B)中闡述之非天然胺基酸。
在一些實施例中，非天然胺基酸包含圖3A至圖3D (獲取自Dumas等人，Chemical Science 2015, 6, 50-69之表1)中闡述之非天然胺基酸。
在一些實施例中，併入IL-15多肽內之非天然胺基酸係揭示於US 9,840,493；US 9,682,934；US 2017/0260137；US 9,938,516；或US 2018/0086734中。可由此等合成酶併入之例示性UAA包括對甲基疊氮基-L-苯丙胺酸、芳烷基、雜環基及雜芳烷基，及離胺酸衍生物非天然胺基酸。在一些實施例中，此等UAA包含吡啶基、吡嗪基、吡唑基、三唑基、噁唑基、噻唑基、苯硫基或其他雜環。在一些實施例中，此等胺基酸包含疊氮化物、四嗪或可結合至偶合搭配物之其他化學基團，諸如水溶性部分。在一些實施例中，UAA包含經由烷基連接子結合至芳族部分之疊氮化物。在一些實施例中，烷基連接子係C1 -C10 連接子。在一些實施例中，UAA包含經由烷基連接子結合至芳族部分之四嗪。在一些實施例中，UAA包含經由胺基結合至芳族部分之四嗪。在一些實施例中，UAA包含經由烷基胺基結合至芳族部分之四嗪。在一些實施例中，UAA包含經由烷基鏈結合至胺基酸側鏈之末端氮(例如，離胺酸衍生物之N6，或包含較短烷基側鏈之衍生物之N5、N4或N3)之疊氮化物。在一些實施例中，UAA包含經由烷基鏈結合至胺基酸側鏈之末端氮之四嗪。在一些實施例中，UAA包含經由烷基連接子結合至醯胺之疊氮化物或四嗪。在一些實施例中，該UAA係含有3-胺基丙胺酸、絲胺酸、離胺酸或其衍生物之胺甲酸鹽或醯胺之疊氮化物或四嗪。在一些實施例中，此等UAA係活體內併入細胞介素內。在一些實施例中，此等UAA係在無細胞系統中併入細胞介素內。 結合部分
在某些實施例中，本文揭示結合至上文描述之一或多種經修飾之IL-15多肽之結合部分。在一些實施例中，該結合部分係擾亂IL-15與其受體之相互作用之分子。在一些實施例中，該結合部分係當結合至IL-15時，使得IL-15結合物可調節免疫反應之任何分子。在一些實施例中，該結合部分係通過共價鍵結合至該IL-15。在一些實例中，本文描述之IL-15係結合至具有三唑基之結合部分。在一些實例中，本文描述之IL-15係結合至具有二氫噠嗪或噠嗪基之結合部分。在一些實例中，該結合部分包含水溶性聚合物。在其他實例中，該結合部分包含蛋白質或其結合片段。在另外實例中，該結合部分包含肽。在另外實例中，該結合部分包含核酸。在另外實例中，該結合部分包含小分子。在另外實例中，該結合部分包含生物結合物(例如，TLR促效劑，諸如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9促效劑；或合成配體，諸如Pam3Cys、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1、Hib-OMPC、聚I:C、聚A:U、AGP、MPL A、RC-529、MDF2β、CFA或鞭毛蛋白)。在一些實例中，該結合部分增加血清半衰期及/或改良穩定性。在一些實例中，該結合部分減小與一或多個細胞介素受體域或單元之細胞介素相互作用。在另外實例中，該結合部分阻斷與具有其同源受體之一或多個IL-15域或亞單元之IL-15相互作用。在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物包含多個結合部分。在一些實施例中，結合部分係在IL-15多肽中結合至非天然或天然胺基酸。在一些實施例中，IL-15結合物包含結合至天然胺基酸之結合部分。在一些實施例中，IL-15結合物係在細胞介素肽中結合至非天然胺基酸。在一些實施例中，結合部分係結合至該IL-15多肽之N或C端胺基酸。各種組合位點係如本文揭示，例如，第一結合部分係在該IL-15多肽中結合至非天然或天然胺基酸，及第二結合部分係結合至該IL-15多肽之N或C端胺基酸。在一些實施例中，單一結合部分係結合至該IL-15多肽(例如，短纖維)之多個殘基。在一些實施例中，結合部分係結合至該IL-15多肽之N及C端胺基酸。 水溶性聚合物
在一些實施例中，本文描述之結合部分係水溶性聚合物。在一些實施例中，該水溶性聚合物係非肽類、非毒性且生物可相容的。如本文使用，如由臨床醫生(例如，醫師)評估，若與單獨使用物質或與與活組織(例如，向病患投與)相關之另一物質(例如，活性劑，諸如IL-15部分)一起使用相關聯之有利影響超過任何有害影響，則認為該物質係生物可相容的。在一些實施例中，水溶性聚合物係又非免疫原性的。在一些實施例中，如臨床醫生(例如，醫師、毒理學家或臨床研發專家)評估，若活體內預期使用物質不產生非所需之免疫反應(例如，形成抗體)，或若產生免疫反應，但不認為此反應臨床顯著或重要，則認為該物質係非免疫原性的。
在一些實施例中，水溶性聚合物之特徵在於具有自約2至約300個末端。例示性水溶性聚合物包括(但不限於)聚(烷二醇)，諸如聚乙二醇(「PEG」)、聚(丙二醇) (「PPG」)、乙二醇及丙二醇之共聚物及類似物，聚(氧乙化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(「POZ」) (其等係描述於WO 2008/106186中)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)，及上述中之任何一者之組合。
在一些實施例中，水溶性聚合物不限於特定結構。在一些實施例中，該水溶性聚合物係直鏈(例如，封端，例如，烷氧基PEG或雙官能PEG)、分支鏈或多臂(例如，分叉PEG或結合至多元醇核心之PEG)、樹枝狀(或星形)構架，各有或無一或多個可降解鍵聯。此外，水溶性聚合物之內部結構可以任何數量之不同重複圖案組織且可選自由以下組成之群：均聚物、交替共聚物、無規共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規三聚體及嵌段三聚體。
在一些實施例中，水溶性聚合物於IL-21結合物中之重量平均分子量係自約100道耳頓至約150,000道耳頓。例示性範圍包括(例如)在大於5,000道耳頓至約100,000道耳頓之範圍內、在自約6,000道耳頓至約90,000道耳頓之範圍內、在自約10,000道耳頓至約85,000道耳頓之範圍內、在大於10,000道耳頓至約85,000道耳頓之範圍內、在自約20,000道耳頓至約85,000道耳頓之範圍內、在自約53,000道耳頓至約85,000道耳頓之範圍內、在自約25,000道耳頓至約120,000道耳頓之範圍內、在自約29,000道耳頓至約120,000道耳頓之範圍內、在自約35,000道耳頓至約120,000道耳頓之範圍內及在自約40,000道耳頓至約120,000道耳頓之範圍內之重量平均分子量。
水溶性聚合物之例示性重量平均分子量包括約100道耳頓、約200道耳頓、約300道耳頓、約400道耳頓、約500道耳頓、約600道耳頓、約700道耳頓、約750道耳頓、約800道耳頓、約900道耳頓、約1,000道耳頓、約1,500道耳頓、約2,000道耳頓、約2,200道耳頓、約2,500道耳頓、約3,000道耳頓、約4,000道耳頓、約4,400道耳頓、約4,500道耳頓、約5,000道耳頓、約5,500道耳頓、約6,000道耳頓、約7,000道耳頓、約7,500道耳頓、約8,000道耳頓、約9,000道耳頓、約10,000道耳頓、約11,000道耳頓、約12,000道耳頓、約13,000道耳頓、約14,000道耳頓、約15,000道耳頓、約20,000道耳頓、約22,500道耳頓、約25,000道耳頓、約30,000道耳頓、約35,000道耳頓、約40,000道耳頓、約45,000道耳頓、約50,000道耳頓、約55,000道耳頓、約60,000道耳頓、約65,000道耳頓、約70,000道耳頓及約75,000道耳頓。亦可使用具有前述中之任何一者之總分子量之水溶性聚合物之分支形式(例如，包含兩種20,000道耳頓聚合物之分支40,000道耳頓水溶性聚合物)。在一或多項實施例中，該結合物將不具有與具有小於約6,000道耳頓之重量平均分子量之PEG直接或間接結合之任何PEG部分。
PEG將通常包含許多(OCH2 CH2 )單體[或(CH2 CH2 O)單體，取決於如何定義PEG]。如本文使用，重複單元之數量係由「(OCH2 CH2 )n 」中之下標「n」定義。因此，(n)之值通常落於下列範圍中之一或多者內：自2至約3400、自約100至約2300、自約100至約2270、自約136至約2050、自約225至約1930、自約450至約1930、自約1200至約1930、自約568至約2727、自約660至約2730、自約795至約2730、自約795至約2730、自約909至約2730及自約1,200至約1,900。就其中分子量已知的任何給定聚合物而言，可能藉由聚合物之總重量平均分子量除以由重複單體之分子量來確定重複單元之數量(即，「n」)。
在一些實施例中，水溶性聚合物係封端聚合物，即，具有經相對惰性基團封端之至少一端之聚合物，諸如低碳數C1-6 烷氧基或羥基。當該聚合物係PEG時，例如，可使用甲氧基-PEG (通常被稱為mPEG)，其係PEG之直鏈形式，其中該聚合物之一端係甲氧基(-OCH3 )，而另一端係羥基或可視需要化學修飾型其他官能基。
在一些實施例中，例示性水溶性聚合物包括(但不限於)來自Quanta Biodesign, Ltd之直鏈或分支鏈離散PEG (dPEG)；來自Nektar Therapeutics之直鏈、分支鏈或分叉PEG；來自JenKem Technology之直鏈、分支鏈或Y形PEG衍生物。
在一些實施例中，本文描述之IL-15多肽係結合至選自以下之水溶性聚合物：聚(烷二醇) (諸如聚乙二醇(「PEG」)、聚(丙二醇) (「PPG」))、乙二醇及丙二醇之共聚物及類似物、聚(氧乙化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(「POZ」)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)及其組合。在一些實施例中，該IL-15多肽係結合至PEG (例如，聚乙二醇化)。在一些實施例中，該IL-15多肽係結合至PPG。在一些實施例中，該IL-15多肽係結合至POZ。在一些實例中，該IL-15多肽係結合至PVP。
在一些實例中，水溶性聚合物包含聚甘油(PG)。在一些實例中，該聚甘油係超支化PG (HPG) (例如，如由Imran等人，「Influence of architecture of high molecular weight linear and branched polyglycerols on their biocompatibility and biodistribution」，Biomaterials 33:9135–9147 (2012)描述)。在其他實例中，該聚甘油係直鏈PG (LPG)。在另外實例中，該聚甘油係中功能PG、直鏈嵌段超支化PG (例如，如由Wurm等人，「Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library of linear and hyperbranched poly(glycerol)−protein conjugates」，Biomacromolecules 13:1161–1171 (2012)描述)或側鏈功能PG (例如，如由Li等人，「Synthesis of linear polyether polyol derivatives as new materials for bioconjugation」，Bioconjugate Chem. 20:780–789 (2009)描述。
在一些實例中，本文描述之IL-15多肽係結合至PG，例如，HPG、LPG、中功能PG、直鏈嵌段超支化PG或側鏈功能PG。
在一些實施例中，水溶性聚合物係可降解合成PEG替代物。例示性可降解合成PEG替代物包括(但不限於)聚[寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯] (POEGMA)；藉由基於遙螯或二端官能化PEG之巨分子單體之聚合產生之經主鏈修飾之PEG衍生物；包含包含可降解鍵聯之共聚單體之PEG衍生物，諸如聚[(環氧乙烷)-共-(亞甲基環氧乙烷)][P(EO-共-MEO)]，環烯酮縮醛，諸如與OEGMA共聚合之5,6-苯并-2-亞甲基-1,3-二氧雜環庚烷(BMDO)、2-亞甲基-1,3-二氧雜環庚烷(MDO)及2-亞甲基-4-苯基-1,3-二氧雜環戊烷(MPDL)；或聚-(ε-己內酯)-接枝-聚(環氧乙烷) (PCL-g-PEO)。
在一些實例中，本文描述之IL-15多肽係結合至可降解合成PEG替代物，諸如例如，POEGM；藉由基於遙螯或二端官能化PEG之巨分子單體之聚合產生之經主鏈修飾之PEG衍生物；P(EO-共-MEO)；環烯酮縮醛，諸如與OEGMA共聚合之BMDO、MDO及MPDL；或PCL-g-PEO。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(兩性離子)。例示性聚(兩性離子)包括(但不限於)聚(磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯) (PSBMA)、聚(羧基甜菜鹼甲基丙烯酸酯) (PCBMA)及聚(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷醯膽鹼) (PMPC)。在一些實例中，IL-15多肽係結合至聚(兩性離子)，諸如PSBMA、PCBMA或PMPC。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚碳酸酯。例示性多碳化合物包括(但不限於) 5-甲基-2-側氧基-1,3-二噁烷-5-羧酸五氟苯基酯(MTC-OC6 F5 )。在一些實例中，本文描述之IL-15多肽係結合至聚碳酸酯，諸如MTC-OC6 F5 。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚合物雜化物，諸如例如，聚碳酸酯/PEG聚合物雜化物、肽/蛋白質-聚合物結合物或含有羥基及/或經兩性離子衍生之聚合物(例如，含有羥基及/或經兩性離子衍生之PEG聚合物)。在一些實例中，本文描述之IL-15多肽係結合至聚合物雜化物，諸如聚碳酸酯/PEG聚合物雜化物、肽/蛋白質-聚合物結合物或含有羥基及/或經兩性離子衍生之聚合物(例如，含有羥基及/或經兩性離子衍生之PEG聚合物)。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含多醣。例示性聚醣包括(但不限於)聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、透明質酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基澱粉(HES)。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至聚葡萄糖。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至PSA。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至HA。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至直鏈澱粉。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至肝素。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至HS。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至糊精。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至HES。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚醣。聚醣之例示性類別包括N連接之聚醣、O連接之聚醣、醣脂、O-GlcNAc及糖胺聚醣。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至聚醣。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至N連接之聚醣。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至O連接之聚醣。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至醣脂。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至O-GlcNAc。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至糖胺聚醣。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚噁唑啉聚合物。聚噁唑啉聚合物係直鏈、合成聚合物，且類似於PEG，其包含低多分散性。在一些實施例中，聚噁唑啉聚合物係多分散聚噁唑啉聚合物，其特徵在於平均分子量。在一些實施例中，聚噁唑啉聚合物之平均分子量包括(例如) 1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000、100,000、200,000、300,000、400,000或500,000 Da。在一些實施例中，聚噁唑啉聚合物包含聚(2-甲基2-噁唑啉) (PMOZ)、聚(2-乙基2-噁唑啉) (PEOZ)或聚(2-丙基2-噁唑啉) (PPOZ)。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至聚噁唑啉聚合物。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至PMOZ。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至PEOZ。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至PPOZ。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚丙烯酸聚合物。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至聚丙烯酸聚合物。
在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚胺。聚胺係包含兩個或更多個一級胺基之有機聚合物。在一些實施例中，聚胺包括分支鏈聚胺、直鏈聚胺或環形聚胺。在一些實施例中，聚胺係低分子量直鏈聚胺。例示性聚胺包括腐胺、屍胺、亞精胺、精胺、乙二胺、1,3-二胺丙烷、六亞甲二胺、四乙基亞甲基二胺及哌嗪。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至聚胺。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至腐胺、屍胺、亞精胺、精胺、乙二胺、1,3-二胺丙烷、六亞甲二胺、四乙基亞甲基二胺或哌嗪。 脂質
在一些實施例中，本文描述之結合部分係脂質。在一些實例中，該脂質係脂肪酸。在一些實例中，該脂肪酸係飽和脂肪酸。在其他實例中，該脂肪酸係不飽和脂肪酸。例示性脂肪酸包括(但不限於)包含自約6至約26個碳原子、自約6至約24個碳原子、自約6至約22個碳原子、自約6至約20個碳原子、自約6至約18個碳原子、自約20至約26個碳原子、自約12至約26個碳原子、自約12至約24個碳原子、自約12至約22個碳原子、自約12至約20個碳原子或自約12至約18個碳原子之脂肪酸。在一些實例中，該脂質結合至一或多種血清蛋白，藉此增加血清穩定性及/或血清半衰期。
在一些實施例中，脂質係結合至本文描述之IL-15多肽。在一些實例中，該脂質係脂肪酸，例如，飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。在一些實例中，該脂肪酸係自約6至約26個碳原子、自約6至約24個碳原子、自約6至約22個碳原子、自約6至約20個碳原子、自約6至約18個碳原子、自約20至約26個碳原子、自約12至約26個碳原子、自約12至約24個碳原子、自約12至約22個碳原子、自約12至約20個碳原子或自約12至約18個碳原子。在一些實例中，該脂肪酸在長度上包含約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個碳原子。在一些實例中，該脂肪酸包含羊油酸(己酸)、庚酸(enanthic acid) (heptanoic acid)、羊脂酸(辛酸)、天竺葵酸(壬酸)、癸酸(capric acid) (decanoic acid)、十一酸(undecylic acid) (undecanoic acid)、月桂酸(十二酸)、十三酸(tridecylic acid) (tridecanoic acid)、肉豆蔻酸(十四酸)、十五酸(pentadecylic acid) (pentadecanoic acid)、棕櫚酸(十六酸)、珠光脂酸(十七酸)、硬脂酸(十八酸)、十九酸(nonadecylic acid) (nonadecanoic acid)、花生酸(二十酸)、二十一酸(heneicosylic acid) (heneicosanoic acid)、榆樹酸(二十二酸)、二十三酸(tricosylic acid) (tricosanoic acid)、木答酸(二十四酸)、二十五酸(pentacosylic acid) (pentacosanoic acid)或蠟酸(二十六酸)。
在一些實施例中，IL-15脂質結合物增強血清穩定性及/或血清半衰期。 蛋白質
在一些實施例中，本文描述之結合部分係蛋白質或其結合片段。例示性蛋白質包括白蛋白、轉鐵蛋白或甲狀腺素運載蛋白。在一些實施例中，該蛋白質或其結合片段包含抗體或其結合片段。在一些實施例中，IL-15結合物包含蛋白質或其結合片段。在一些實施例中，包含蛋白質或其結合片段之IL-15結合物具有增加之血清半衰期及/或穩定性。在一些實施例中，包含蛋白質或其結合片段之IL-15結合物具有減小之與一或多個L-15R/IL-2R亞單元之IL-15相互作用。在另外實例中，該蛋白質或其結合片段阻斷與一或多個IL-15R/IL-2R亞單元之IL-15相互作用。
在一些實施例中，該結合部分係白蛋白。白蛋白係水溶性球狀蛋白質之家族。白蛋白通常於血漿中發現，其佔所有血漿蛋白之約55至60%。人類血清白蛋白(HSA)係585個胺基酸多肽，其中將三級結構分為三個域，域I (胺基酸殘基1至195)、域II (胺基酸殘基196至383)及域III (胺基酸殘基384至585)。各域進一步包含結合位點，其可與內源性配體，諸如長鏈及中鏈脂肪酸、膽紅素或氯化血紅素，或外源性化合物，諸如雜環或芳族化合物可逆或不可逆地相互作用。
在一些實施例中，IL-15多肽係結合至白蛋白。在一些實施例中，該IL-15多肽係結合至人類血清白蛋白(HSA)。在另外實例中，該IL-15多肽係結合至白蛋白之功能片段。
在一些實施例中，該結合部分係轉鐵蛋白。轉鐵蛋白係679個胺基酸多肽，其尺寸為約80 kDa且包含兩個Fe3+ 結合位點，及一個於N端域處及另一個於C端域處。在一些實施例中，人類轉鐵蛋白具有約7至12天之半衰期。
在一些實施例中，IL-15多肽係結合至轉鐵蛋白。在一些實施例中，該IL-15多肽係結合至人類轉鐵蛋白。在另外實例中，該IL-15多肽係結合至轉鐵蛋白之功能片段。
在一些實施例中，該結合部分係甲狀腺素運載蛋白(TTR)。甲狀腺素運載蛋白係位於血清及腦脊髓液中之運輸蛋白，其運輸甲狀腺激素甲狀腺素(T4 )及結合至視黃醇之視黃醇結合蛋白。
在一些實施例中，IL-15多肽係結合至甲狀腺素運載蛋白(經由其末端中之任何一者或經由內部鉸鏈區)。在一些實施例中，該IL-15多肽係結合至甲狀腺素運載蛋白之功能片段。
在一些實施例中，該結合部分係抗體或其結合片段。在一些實施例中，抗體或其結合片段包含人類化抗體或其結合片段、鼠科抗體或其結合片段、嵌合抗體或其結合片段、單株抗體或其結合片段、單價Fab’、二價Fab2 、F(ab)'3 片段、單鏈可變片段(scFv)、雙-scFv、(scFv)2 、雙功能抗體、微抗體、奈米抗體、三功能抗體、四功能抗體、humabody、由二硫鍵穩定之Fv蛋白(dsFv)、單域抗體(sdAb)、Ig NAR、駱駝抗體或其結合片段、雙特異性抗體或其結合片段或其化學修飾型衍生物。
在一些實例中，結合部分包含scFv、雙-scFv、(scFv)2 、dsFv或sdAb。在一些實例中，該結合部分包含scFv。在一些實例中，該結合部分包含雙-scFv。在一些實例中，該結合部分包含(scFv)2 。在一些實例中，該結合部分包含dsFv。在一些實例中，該結合部分包含sdAb。
在一些實施例中，結合部分包含抗體之Fc部分，例如，IgG、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc部分。在一些實施例中，該部分包含IgG (例如，IgG1 、IgG3 或IgG4 )之Fc部分。
在一些實施例中，IL-15多肽係結合至抗體或其結合片段。在一些實施例中，該IL-15多肽係結合至人類化抗體或其結合片段、鼠科抗體或其結合片段、嵌合抗體或其結合片段、單株抗體或其結合片段、單價Fab’、二價Fab2 、F(ab)'3 片段、單鏈可變片段(scFv)、雙-scFv、(scFv)2 、雙功能抗體、微抗體、奈米抗體、三功能抗體、四功能抗體、humabody、二硫鍵穩定之Fv蛋白(dsFv)、單域抗體(sdAb)、Ig NAR、駱駝抗體或其結合片段、雙特異性抗體或其結合片段或其化學修飾型衍生物。在另外實例中，該IL-15多肽係結合至抗體之Fc部分。在另外實例中，該IL-15多肽係結合至IgG (例如，IgG1 、IgG3 或IgG4 )之Fc部分。
在一些實施例中，IL-15多肽係結合至水溶性聚合物(例如，PEG)及抗體或其結合片段。在一些實例中，該抗體或其結合片段包含人類化抗體或其結合片段、鼠科抗體或其結合片段、嵌合抗體或其結合片段、單株抗體或其結合片段、單價Fab’、二價Fab2 、F(ab)'3 片段、單鏈可變片段(scFv)、雙-scFv、(scFv)2 、雙功能抗體、微抗體、奈米抗體、三功能抗體、四功能抗體、humabody、二硫鍵穩定之Fv蛋白(dsFv)、單域抗體(sdAb)、Ig NAR、駱駝抗體或其結合片段、雙特異性抗體或其結合片段或其化學修飾型衍生物。在一些實例中，該抗體或其結合片段包含scFv、雙-scFv、(scFv)2 、dsFv或sdAb。在一些實例中，該抗體或其結合片段包含scFv。在一些實例中，該抗體或其結合片段引導IL-15結合物至受關注之靶細胞及該水溶性聚合物增強穩定性及/或血清半衰期。
在一些實例中，一或多種IL-15多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)結合物係進一步結合至抗體或其結合片段。在一些實例中，該IL-15結合物相對於該抗體之比率係約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1或12:1。在一些實例中，該IL-15結合物相對於該抗體之比率係約1:1。在其他實例中，該IL-15結合物相對於該抗體之比率係約2:1、3:1或4:1。在另外實例中，該IL-15結合物相對於該抗體之比率係約6:1或更高。
在一些實施例中，一或多種IL-15多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)結合物係直接結合至抗體或其結合片段。在其他實例中，該IL-15結合物係以連接子間接結合至該抗體或其結合片段。例示性連接子包括同雙官能連接子、異雙官能連接子、基於馬來醯亞胺之連接子、零蹤跡連接子、自消化連接子、間隔基團及類似物。
在一些實施例中，抗體或其結合片段係直接或間接結合至IL-15多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)結合物之IL-15多肽部分。在此等實例中，該抗體對該IL-15多肽之結合位點係於將不妨礙該IL-15多肽與該IL-15R之結合之位點。在另外實例中，該抗體對該IL-15多肽之結合位點係於部分阻斷該IL-15多肽與該IL-15R之結合之位點。在其他實施例中，該抗體或其結合片段係直接或間接結合至該IL-15多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)結合物之水溶性聚合物部分。 肽
在一些實施例中，本文描述之結合部分係肽。在一些實施例中，該肽係非結構化肽。在一些實施例中，細胞介素(例如，介白素、IFN或TNF)多肽係結合至肽。在一些實施例中，包含肽之IL-15結合物具有增加之血清半衰期及/或穩定性。在一些實施例中，包含肽之IL-15結合物具有減小之與一或多個IL-15R亞單元之IL-15相互作用。在另外實例中，該肽阻斷與一或多個IL-15R亞單元之IL-15相互作用。
在一些實施例中，結合部分係XTEN™肽(Amunix Operating Inc.)及修飾被稱為XTEN化。XTEN化係編碼受關注之多肽之核酸與編碼XTEN™肽(Amunix Operating Inc.)(一種包含不同百分率之六種胺基酸：Ala、Glu、Gly、Ser及Thr之長非結構化親水肽)之核酸之基因融合。在一些實施例中，XTEN™肽係基於性質選擇，諸如表現、基因穩定性、溶解性、聚集抗性、提高之半衰期、增加之效力及/或受關注之多肽組合之增加之活體外活性。在一些實施例中，細胞介素(例如，介白素、IFN或TNF)多肽係結合至XTEN肽。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至XTEN肽。
在一些實施例中，結合部分係富含甘胺酸之高胺基酸聚合物(HAP)及修飾被稱為HAP化。HAP化係編碼受關注之多肽之核酸與編碼富含甘胺酸之高胺基酸聚合物(HAP)之核酸之基因融合。在一些實施例中，該HAP聚合物包含(Gly4 Ser)n 重複結構組元且有時在長度上係約50、100、150、200、250、300或更多個殘基。在一些實施例中，細胞介素(例如，介白素、IFN或TNF)多肽係結合至HAP。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至HAP。
在一些實施例中，該結合部分係PAS多肽及修飾被稱為PAS化。PAS化係編碼受關注之多肽之核酸與編碼PAS多肽之核酸之基因融合。PAS多肽係由Pro、Ala及Ser殘基組成之親水不帶電多肽。在一些實施例中，PAS多肽之長度係至少約100、200、300、400、500或600個胺基酸。在一些實施例中，細胞介素(例如，介白素、IFN或TNF)多肽係結合至PAS多肽。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至PAS多肽。
在一些實施例中，該結合部分係彈性蛋白樣多肽(ELP)及修飾被稱為ELP化。ELP化係編碼受關注之多肽之核酸與編碼彈性蛋白樣多肽(ELP)之核酸之基因融合。ELP包含VPGxG重複結構組元，其中x係除脯胺酸外之任何胺基酸。在一些實施例中，細胞介素(例如，介白素、IFN或TNF)多肽係結合至ELP。在一些實施例中，IL-15多肽係結合至ELP。
在一些實施例中，該結合部分係CTP肽。CTP肽包含31個胺基酸殘基肽FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ，其中S*指示O-醣化位點(OPKO)。在一些實施例中，CTP肽係經基因融合至細胞介素多肽(例如，IL-15多肽)。在一些實施例中，細胞介素多肽(例如，IL-15多肽)係結合至CTP肽。
在一些實施例中，細胞介素(例如，IL-15多肽)係藉由麩胺醯化修飾。麩胺醯化(或聚麩胺醯化)係麩胺酸鹽之可逆轉譯後修飾，其中麩胺酸鹽之γ-羧基與游離麩胺酸鹽之胺基形成肽樣鍵，其中α-羧基延伸至聚麩胺酸鹽鏈內。
在一些實施例中，IL-15多肽係由明膠樣蛋白(GLK)聚合物修飾。在一些實施例中，該GLK聚合物包含多個重複之Gly-Xaa-Yaa，其中Xaa及Yaa分別主要包含脯胺酸及4-羥基脯胺酸。在一些實施例中，該GLK聚合物進一步包含胺基酸殘基Pro、Gly、Glu、Qln、Asn、Ser及Lys。在一些實施例中，該GLK聚合物之長度係約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150個殘基或更長。 另外之結合部分
在一些實施例中，該結合部分包含細胞外生物標誌物。在一些實施例中，該細胞外生物標誌物係腫瘤抗原。在一些實施例中，例示性細胞外生物標誌物包含CD19、PSMA、B7-H3、B7-H6、CD70、CEA、CSPG4、EGFRvIII、EphA3、EpCAM、EGFR、ErbB2 (HER2)、FAP、FRα、GD2、GD3、Lewis-Y、間皮素、Muc1、Muc 16、ROR1、TAG72、VEGFR2、CD11、Gr-1、CD204、CD16、CD49b、CD3、CD4、CD8及B220。在一些實施例中，該結合部分係結合(bond)或結合(conjugate)至IL-15。在一些實施例中，該結合部分係基因融合於(例如)該IL-15之N端或C端。
在一些實施例中，該結合部分包含來自轉譯後修飾之分子。在一些實施例中，轉譯後修飾之實例包括肉豆蔻醯化、棕櫚醯化、異平基化(或異戊二烯化) (例如，法尼基化或香葉基香葉基化)、糖基磷脂醯肌醇化、醯化(例如，O-醯化、N-醯化、S-醯化)、烷化(例如，添加烷基，諸如甲基或乙基)、醯胺化、醣化、羥化、碘化、核苷酸添加、氧化、磷酸化、琥珀醯化、硫酸化、醣化、胺甲醯化、麩胺醯化或脫醯胺化。在一些實施例中，IL-15係藉由轉譯後修飾進行修飾，諸如肉豆蔻醯化、棕櫚醯化、異平基化(或異戊二烯化) (例如，法尼基化或香葉基香葉基化)、糖基磷脂醯肌醇化、醯化(例如，O-醯化、N-醯化、S-醯化)、烷化(例如，添加烷基，諸如甲基或乙基)、醯胺化、醣化、羥化、碘化、核苷酸添加、氧化、磷酸化、琥珀醯化、硫酸化、醣化、胺甲醯化、麩胺醯化或脫醯胺化。 連接子
在一些實施例中，適用於將結合部分結合或連接至本文描述之IL-15多肽之官能反應性基團包括(例如)零或更高階連接子。在一些實例中，併入本文描述之介白素內之非天然胺基酸包含官能反應性基團。在一些實例中，連接子包含與併入本文描述之介白素內之非天然胺基酸反應之官能反應性基團。在一些實例中，結合部分包含與併入本文描述之介白素內之非天然胺基酸反應之官能反應性基團。在一些實例中，結合部分包含與本文描述之連接子(視需要經預先結合至細胞介素肽)反應之官能反應性基團。在一些實施例中，連接子包含與本文描述之IL-15多肽中之天然胺基酸反應之反應基。在一些實例中，更高階連接子包含雙官能連接子，諸如同雙官能連接子或異雙官能連接子。例示性同雙官能連接子包括(但不限於)洛曼特試劑二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯) DSP、3'3'-二硫雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯(DTSSP)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(磺基DST)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯) (EGS)、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、N,N'-碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)、己二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫雙丙酸亞胺酯(DTBP)、1,4-二-3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙馬來醯亞胺己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB) (諸如，例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二環氧丙醚、己二酸二醯肼、卡肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基二苯基、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。
在一些實施例中，雙官能連接子包含異雙官能連接子。例示性異雙官能連接子包括(但不限於)胺反應性及巰基交聯劑，諸如3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性-長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-sMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀醯亞胺基(4-碘醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(sIAC)、6-((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝基苯酯(NPIA)、羰基反應性及巰基反應性交聯劑，諸如4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8 (M2 C2 H)、3-(2-吡啶基二硫)丙醯基醯肼(PDPH)，胺反應性及光反應性交聯劑，諸如N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基柳酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-疊氮基柳基醯胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(對疊氮基柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基琥珀醯亞胺(ANB-NOs)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-疊氮基苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀醯亞胺基(4-疊氮基苯基)-1,3'-二硫丙酸酯(磺基-sADP)、4-(對疊氮基苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀醯亞胺基 2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮基丙酮酸對硝基苯酯(ρNPDP)、對硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸鹽(PNP-DTP)，巰基反應性及光反應性交聯劑，諸如1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫)丙醯胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙醯胺，二苯甲酮-4-馬來醯亞胺羰基反應性及光反應性交聯劑，諸如對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)，羧酸根反應性及光反應性交聯劑，諸如4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)，及精胺酸反應性及光反應性交聯劑，諸如對疊氮基苯基乙二醛(APG)。
在一些實例中，反應性官能基包含可與結合部分上(例如，結合部分上或IL-15上)存在之親電子基團反應之親核基團。例示性親電子基團包括羰基-諸如醛、酮、羧酸、酯、醯胺、烯酮、醯基鹵化物或酸酐。在一些實施例中，該反應性官能基係醛。例示性親核基團包括醯肼、肟、胺基、肼、縮胺基硫脲、羧酸肼及芳基醯肼。在一些實施例中，併入本文描述之介白素內之非天然胺基酸包含親電子基團。
在一些實施例中，連接子係可裂解連接子。在一些實施例中，該可裂解連接子係二肽連接子。在一些實施例中，該二肽連接子係纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)、苯丙胺酸-離胺酸(Phe-Lys)、纈胺酸-丙胺酸(Val-Ala)及纈胺酸-離胺酸(Val-Lys)。在一些實施例中，該二肽連接子係纈胺酸-瓜胺酸。
在一些實施例中，連接子係包含(例如)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個胺基酸之肽連接子。在一些實例中，該肽連接子包含至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50或更少個胺基酸。在另外實例中，該肽連接子包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。
在一些實施例中，該連接子包含自消化連接子部分。在一些實施例中，該自消化連接子部分包含對胺基苯甲醇(PAB)、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)，或其衍生物或類似物。在一些實施例中，該連接子包含二肽連接子部分及自消化連接子部分。在一些實施例中，該自消化連接子部分係(諸如)美國專利案第9089614號及WIPO申請案第WO2015038426號中描述者。
在一些實施例中，可裂解連接子係葡萄糖醛酸苷。在一些實施例中，該可裂解連接子係酸-可裂解連接子。在一些實施例中，該酸-可裂解連接子係肼。在一些實施例中，該可裂解連接子係可還原連接子。
在一些實施例中，該連接子包含馬來醯亞胺基團。在一些實例中，該馬來醯亞胺基團亦被稱為馬來醯亞胺間隔基團。在一些實例中，該馬來醯亞胺基團進一步包含羊油酸，形成馬來醯亞胺基己醯基(mc)。在一些實例中，該連接子包含馬來醯亞胺基己醯基(mc)。在一些實例中，連接子係馬來醯亞胺基羊油酸基(mc)。在其他實例中，該馬來醯亞胺基團包含馬來醯亞胺基甲基，諸如上文描述之琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(sMCC)或磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-sMCC)。
在一些實施例中，馬來醯亞胺基團係自穩定化馬來醯亞胺。在一些實例中，該自穩定化馬來醯亞胺利用二胺基丙酸(DPR)來併入與該馬來醯亞胺相鄰之鹼性胺基以提供硫琥珀醯亞胺環水解之分子內催化，藉此通過逆邁克爾(retro-Michael)反應自經歷消除反應消除馬來醯亞胺。在一些實例中，該自穩定化馬來醯亞胺係Lyon等人，「Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates」，Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)中描述之馬來醯亞胺基團。在一些實例中，該連接子包含自穩定化馬來醯亞胺。在一些實例中，該連接子係自穩定化馬來醯亞胺。 結合化學
各種結合反應係用以結合連接子、結合部分及併入本文描述之IL-15多肽內之非天然胺基酸。此等結合反應係通常可與水性條件相容，諸如「生物正交」反應。在一些實施例中，結合反應係由化學試劑諸如觸媒、光或連接子、結合部分或非天然胺基酸上發現之反應性化學基團介導。在一些實施例中，結合反應係由酶介導。在一些實施例中，本文使用之結合反應係描述於Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123中。在一些實施例中，本文使用之結合反應係描述於Chen, X.; Wu. Y-W. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5417中。
在本文描述之一些實施例中，結合反應包括酮或醛與親核劑之反應。在一些實施例中，結合反應包括酮與胺氧基反應以形成肟之反應。在一些實施例中，結合反應包括酮與芳基或雜芳基胺基反應以形成亞胺之反應。在一些實施例中，結合反應包括醛與芳基或雜芳基胺基反應以形成亞胺之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應導致包含經由肟結合之連接子或結合部分之IL-15多肽。在一些實施例中，結合反應包括醛或酮與色胺親核劑之皮克特-施彭格勒(Pictet-Spengler)反應。在一些實施例中，結合反應包括肼基-皮克特-施彭格勒反應。在一些實施例中，結合反應包括皮克特-施彭格勒連接。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括疊氮化物及膦之反應(施陶丁格連接)。在一些實施例中，該膦係芳基膦。在一些實施例中，該芳基膦包含鄰酯基團。在一些實施例中，該膦包含結構2-(二苯基磷醯基)苯甲酸甲酯。在一些實施例中，本文描述之結合反應導致包含經由芳基醯胺結合之連接子或結合部分之IL-15多肽。在一些實施例中，本文描述之結合反應導致包含經由醯胺結合之連接子或結合部分之IL-15多肽。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括1,3-偶極環加成反應。在一些實施例中，該1,3-偶極環加成反應包含疊氮化物及膦之反應(「點擊」反應)。在一些實施例中，該結合反應係由銅催化。在一些實施例中，本文描述之結合反應導致包含經由三唑結合之連接子或結合部分之IL-15多肽。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括疊氮化物與有張力之烯烴之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括疊氮化物與有張力之炔烴之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括疊氮化物與環炔烴例如，OCT、DIFO、DIFBO、DIBO、BARAC、TMTH或其他有張力之環炔烴(其等結構顯示於Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123中)之反應。在一些實施例中，1,3-偶極環加成反應係由光(「光點擊」)催化。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括末端烯丙基與四唑及光之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括末端炔基與四唑及光之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括O-烯丙基胺基酸與四嗪及光之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括O-烯丙基酪胺酸與四嗪及光之反應。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括反電子需求之環加成反應，其包含二烯及親二烯體。在一些實施例中，該二烯包含四嗪。在一些實施例中，該親二烯體包含烯烴。在一些實施例中，該親二烯體包含炔烴。在一些實施例中，該炔烴係有張力之炔烴。在一些實施例中，該烯烴係有張力之二烯。在一些實施例中，該炔烴係反式環辛炔。在一些實施例中，該炔烴係環辛烯。在一些實施例中，該烯烴係環丙烯。在一些實施例中，該烯烴係氟環丙烯。在一些實施例中，本文描述之結合反應導致經由環中包含兩個氮原子之6員環雜環結合至連接子或結合部分之IL-15多肽之形成。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括烯烴複分解反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括烯烴及炔烴與釕觸媒之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括兩種烯烴與釕觸媒之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括兩種炔烴與釕觸媒之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括烯烴或炔烴與釕觸媒及包含烯丙基之胺基酸之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括烯烴或炔烴與釕觸媒及包含烯丙基硫醚或硒醚之胺基酸之反應。在一些實施例中，釕觸媒係霍維達-格拉布斯第2代觸媒。在一些實施例中，烯烴複分解反應包含一或多種有張力之烯烴或炔烴之反應。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括與烯烴之(4+2+環加成反應。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括交叉偶合反應。在一些實施例中，交叉偶合反應包含過渡金屬觸媒，諸如銥、金、釕、銠、鈀、鎳、鉑或其他過渡金屬觸媒及一或多種配體。在一些實施例中，過渡金屬觸媒係水溶性的。在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括鈴木-宮浦(Suzuki-Miyaura)交叉偶合反應。在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括芳基鹵化物(或三氟甲烷磺酸鹽或甲苯磺酸鹽)、芳基或烯基硼酸及鈀觸媒之反應。在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括薗頭交叉偶合(Sonogashira cross-coupling)反應。在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括芳基鹵化物(或三氟甲烷磺酸鹽或甲苯磺酸鹽)、炔烴及鈀觸媒之反應。在一些實施例中，交叉偶合反應導致連接子或結合部分經由碳碳鍵結合至IL-15多肽。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括結合前之反應基之脫保護或「釋放」反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括用光釋放反應基，接著結合反應。在一些實施例中，反應基係用包含一或多個硝基之芳烷基部分進行保護。在一些實施例中，反應基之釋放導致游離之胺、硫化物或其他反應基。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括用過渡金屬觸媒釋放反應基，接著結合反應。在一些實施例中，該過渡金屬觸媒包含鈀及一或多種配體。在一些實施例中，反應基係用烯丙基部分進行保護。在一些實施例中，反應基係用烯丙基胺基甲酸酯進行保護。在一些實施例中，反應基係用丙炔基部分進行保護。在一些實施例中，反應基係用丙炔基胺基甲酸酯進行保護。在一些實施例中，反應基係用親二烯體進行保護，其中曝露於二烯(諸如四嗪)導致該反應基之脫保護。
在本文描述之一些實施例中，本文描述之結合反應包括配體導向型反應，其中配體(視需要)結合至反應基)促進反應基與IL-15多肽之間的結合位點。在一些實施例中，該配體係在該IL-15多肽與該反應基之反應期間或之後裂解。在一些實施例中，該IL-15多肽之結合位點係天然胺基酸。在一些實施例中，該IL-15多肽之結合位點係離胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一些實施例中，該IL-15多肽之結合位點係本文描述之非天然胺基酸。在一些實施例中，該反應基包含脫離基，諸如缺電子芳基或雜芳基。在一些實施例中，該反應基包含脫離基，諸如經該IL-15多肽取代之缺電子烷基。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括自由基捕獲劑與自由基物種之反應。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括氧化自由基加成反應。在一些實施例中，自由基捕獲劑係芳基胺。在一些實施例中，自由基物種係酪胺醯基。在一些實施例中，自由基物種係由釕觸媒(諸如[Ru(bpy)3 ])及光產生。
酶促反應係視需要用於本文描述之結合反應。例示性酶促結合包括SortA介導之結合、TGs介導之結合或FGE介導之結合。在一些實施例中，本文描述之結合反應包括末端1-胺基-2-硫基與硫酯以形成醯胺鍵之天然蛋白質連接(NPL)。
本文描述各種結合反應用於使連接子或結合部分與IL-15多肽反應，其中該反應以天然(「典型」)胺基酸在該IL-15多肽中發生。在一些實施例中，於結合位置處發現之天然胺基酸係在野生型序列中發現，或或者該位置已經突變。在一些實施例中，結合反應包括於IL-15殘基處之雙硫鍵之形成。在一些實施例中，結合反應包括半胱胺酸或離胺酸之1,4邁克爾加成反應。在一些實施例中，結合反應包括IL-15之氰基苯并噻唑連接。在一些實施例中，結合反應包括與丙酮部分交聯，諸如1,3-二氯-2-丙酮(1,3-dichloro-2-propionone)。在一些實施例中，結合反應包括對藉由半胱胺酸與O-三甲苯磺醯基羥胺之反應形成之脫氫丙胺酸之1,4邁克爾加成。在一些實施例中，結合反應包括酪胺酸與三唑啉二酮(TAD)或TAD衍生物之反應。在一些實施例中，結合反應包括色胺酸與銠類碳烯之反應。 使用方法 增殖性疾病或病症
在一些實施例中，本文描述治療有此需要之個體之增殖性疾病或病症之方法，其包括向該個體投與治療有效量之本文描述之IL-15結合物。在一些實施例中，該IL-15結合物包含經分離及純化之IL-15多肽及結合部分，其中相對於野生型IL-15多肽，該IL-15結合物對IL-15受體α (IL-15Rα)亞單元具有減小之親和力。在一些實施例中，該IL-15結合物包含經分離及純化之IL-15多肽；及於選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、T27、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、A39、K41、L44、L45、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114之胺基酸位置處結合至經分離及純化之IL-15多肽之結合部分，其中該等胺基酸殘基之編號對應於SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，該IL-15結合物包含經分離及純化之IL-15多肽；及於選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114之胺基酸位置處結合至經分離及純化之IL-15多肽之結合部分。
在一些實施例中，IL-15結合物優先與IL-15Rβ及IL-15Rβγ亞單元相互作用以形成IL-15/IL-15Rβγ複合物。在一些實施例中，該IL-15/IL-15Rβγ複合物刺激及/或增強Teff細胞(例如，CD8+ Teff細胞)及/或NK細胞之擴增。在另外實例中，Teff細胞之擴增使Teff:Treg比率偏向Teff群體。
在一些實施例中，增殖性疾病或病症係癌症。在一些實施例中，該癌症係實性瘤。在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物係向有此需要之個體投與，用於治療實性瘤。在此等實例中，該個體患有膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療膀胱癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療乳癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療結腸直腸癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療食道癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療頭頸癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療腎癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療肺癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療黑色素瘤。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療卵巢癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療胰腺癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療前列腺癌。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療轉移性癌症。在另外實例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療復發或難治性癌症。
在一些實施例中，該癌症係血液學惡性腫瘤。在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物係向有此需要之個體投與，用於治療血液學惡性腫瘤。在一些實施例中，該個體患有慢性淋巴細胞白血病(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、華氏巨球蛋白血症、多發性骨髓瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結邊緣區B細胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、非伯奇氏高級別B細胞淋巴瘤、原發性縱膈B細胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤或淋巴瘤樣肉芽腫。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療CLL。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療SLL。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療FL。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療DLBCL。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療MCL。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療華氏巨球蛋白血症。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療多發性骨髓瘤。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療伯奇氏淋巴瘤。在一些實施例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療轉移性血液學惡性腫瘤。在另外實例中，該IL-15結合物係向個體投與用於治療復發或難治性血液學惡性腫瘤。
在一些實施例中，另外治療劑係進一步向個體投與。在一些實施例中，該另外治療劑係與IL-15結合物同時投與。在其他實例中，該另外治療劑及該IL-15結合物係依序投與，例如，該IL-15結合物係在該另外治療劑之前投與或該IL-15結合物係在投與該另外治療劑之後投與。
在一些實施例中，另外治療劑包含化學治療劑、免疫治療劑、靶向治療、放射治療或其組合。說明性另外治療劑包括(但不限於)烷化劑，諸如六甲蜜胺、白消安、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪、洛莫司汀、黴法蘭、奧沙利鉑、替莫唑胺或噻替哌；抗代謝物，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達拉濱、吉西他濱、羥基脲、胺甲喋呤或培美曲塞；蒽環類，諸如柔紅黴素、多柔比星、表柔比星或伊達比星；拓撲異構酶I抑制劑，諸如拓撲替康或伊立替康(CPT-11)；拓撲異構酶II抑制劑，諸如依託泊苷(VP-16)、替尼泊苷或米托蒽醌；有絲分裂抑制劑，諸如多西他賽、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、長春鹼、長春新鹼或長春瑞濱；或皮質類固醇，諸如強的松、甲潑尼龍或地塞米松。
在一些實例中，另外治療劑包含一線治療。如本文使用，「一線治療」包含用於患有癌症之個體之初級治療。在一些實例中，該癌症係原發性或局部癌症。在其他實例中，該癌症係轉移性或復發性癌症。在一些實例中，該一線治療包含化學治療。在其他實例中，該一線治療包含免疫治療、靶向治療或放射治療。熟習技工將容易瞭解不同之一線治療可適用於不同類型之癌症。
在一些實施例中，IL-15結合物係與選自以下之另外治療劑一起投與：烷化劑，諸如六甲蜜胺、白消安、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪、洛莫司汀、黴法蘭、奧沙利鉑、替莫唑胺或噻替哌；抗代謝物，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達拉濱、吉西他濱、羥基脲、胺甲喋呤或培美曲塞；蒽環類，諸如柔紅黴素、多柔比星、表柔比星或伊達比星；拓撲異構酶I抑制劑，諸如拓撲替康或伊立替康(CPT-11)；拓撲異構酶II抑制劑，諸如依託泊苷(VP-16)、替尼泊苷或米托蒽醌；有絲分裂抑制劑，諸如多西他賽、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、長春鹼、長春新鹼或長春瑞濱；或皮質類固醇，諸如強的松、甲潑尼龍或地塞米松。
在一些實例中，本文描述之IL-15結合物係與酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)之抑制劑一起投與。例示性PARP抑制劑包括(但不限於)奧拉帕尼(olaparib) (AZD-2281，Lynparza®，來自Astra Zeneca)、盧卡帕尼(rucaparib) (PF-01367338，Rubraca®，來自Clovis Oncology)、尼拉帕利(niraparib) (MK-4827，Zejula®，來自Tesaro)、他唑巴厘布(talazoparib) (BMN-673，來自BioMarin Pharmaceutical Inc.)、維利帕利(veliparib) (ABT-888，來自AbbVie)、CK-102 (原CEP 9722，來自Teva Pharmaceutical Industries Ltd.)、E7016 (來自Eisai)、伊尼帕利布(iniparib) (BSI 201，來自Sanofi)及帕米帕利(pamiparib) (BGB-290，來自BeiGene)。在一些實例中，該IL-15結合物係與PARP抑制劑諸如奧拉帕尼、盧卡帕尼、尼拉帕利、他唑巴厘布、維利帕利、CK-102、E7016、伊尼帕利布或帕米帕利組合投與。
在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物係與酪胺酸激酶抑制劑(TKI)一起投與。例示性TKIs包括(但不限於)阿法替尼(afatinib)、阿立替尼(alectinib)、阿西替尼(axitinib)、博斯替尼(bosutinib)、卡巴坦尼(cabozantinib)、西替尼替布(ceritinib)、柯比美替尼(cobimetinib)、克唑替尼(crizotinib)、達布非尼(dabrafenib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊布魯蒂尼(ibrutinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、侖伐替尼(lenvatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、硝替尼布(nintedanib)、奧西丁尼(osimertinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、帕那替尼(ponatinib)、雷格列尼(regorafenib)、盧梭利替尼(ruxolitinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、妥昔替尼(tofacitinib)及萬乃他尼(vandetanib)。
在一些實例中，本文描述之IL-15結合物係與免疫核查點調節劑一起投與。例示性核查點調節劑包括：
PD-L1調節劑，諸如Genentech之MPDL3280A (RG7446)、來自Merck/Pfizer之阿維魯單抗(Avelumab) (Bavencio)、來自AstraZeneca之德瓦魯單抗(durvalumab) (Imfinzi)、來自BioXcell之抗小鼠PD-L1抗體純系10F.9G2 (Cat # BE0101)、抗PD-L1單株抗體MDX-1105 (BMS-936559)、來自Bristol-Meyer之Squibb之BMS-935559及BMS-986192、MSB0010718C、小鼠抗PD-L1純系29E.2A3、來自XytomX Therapeutics之CX-072、來自Novartis Pharmaceuticals之FAZ053、來自3D Medicine之KN035、來自Eli Lilly之LY3300054及AstraZeneca之MEDI4736；
PD-L2調節劑，諸如GlaxoSmithKline之AMP-224 (Amplimmune)及rHIgM12B7；
PD-1調節劑，諸如來自BioXcell之抗小鼠PD-1抗體純系J43 (Cat # BE0033-2)、來自BioXcell之抗小鼠PD-1抗體純系RMP1-14 (Cat # BE0146)、小鼠抗PD-1抗體純系EH12、Merck之MK-3475抗小鼠PD-1抗體(可瑞達(Keytruda)、彭布利單抗(pembrolizumab)、蘭布利單抗(lambrolizumab))、被稱為ANB011之AnaptysBio之抗PD-1抗體、抗體MDX-1 106 (ONO-4538)、Bristol-Myers Squibb之人類IgG4單株抗體尼沃單抗(nivolumab) (Opdivo®、BMS-936558、MDX1106)、AstraZeneca之AMP-514及AMP-224、來自Eli Lilly/Innovent Biologics之辛替利單抗(sintilimab) (IBI-308)、來自Agenus之AGEN 2034、來自BeiGene之BGB-A317、來自Boehringer-Ingelheim Pharmaceuticals之Bl-754091、來自CBT Pharmaceuticals之CBT-501 (傑諾單抗(genolimzumab))、來自Incyte之INCSHR1210、來自Janssen Research & Development之JNJ-63723283、來自MedImmune之MEDI0680、來自Novartis Pharmaceuticals之PDR001、來自Pfizer之PF-06801591、來自Regeneron Pharmaceuticals之REGN2810及來自CureTech Ltd之匹利珠單抗(Pidilizumab) (CT-011)；
CTLA-4調節劑，諸如Bristol Meyers Squibb之抗CTLA-4抗體易普利姆瑪(ipilimumab) (亦稱為Yervoy®，MDX-010、BMS-734016及MDX-101)、來自Millipore之抗CTLA4抗體純系9H10、Pfizer之曲美莫單抗(tremelimumab) (CP-675,206，替昔單抗(ticilimumab))、來自Agenus之AGEN 1884及來自Abcam之抗CTLA4抗體純系BNI3；
LAG3調節劑，諸如來自eBioscience之抗Lag-3抗體純系eBioC9B7W (C9B7W)、來自LifeSpan Biosciences之抗Lag3抗體LS-B2237、來自Novartis Pharmaceuticals之IMP701及LAG525、來自Immutep之IMP321 (ImmuFact)、抗Lag3抗體BMS-986016、來自Bristol-Myers Squibb之BMS-986016、來自Regeneron Pharmaceuticals之REGN3767及LAG-3嵌合抗體A9H12；
B7-H3調節劑，諸如MGA271；
KIR調節劑，諸如來自Bristol-Myers Squibb之利魯單抗(Lirilumab) (IPH2101)；
CD137調節劑，諸如烏洛單抗(urelumab) (BMS-663513，Bristol-Myers Squibb)、PF-05082566 (抗4-1BB、PF-2566，Pfizer)或XmAb-5592 (Xencor)；
PS調節劑，諸如貝伐昔單抗(Bavituximab)；
OX40調節劑，諸如來自Bristol-Myers Squibb之BMS-986178、來自GlaxoSmithKline之GSK3174998、來自Agenus之INCAGN1949、來自MedImmune之MEDI0562、來自Pfizer之PF-04518600或來自Genentech之RG7888；
GITR調節劑，諸如來自Novartis Pharmaceuticals之GWN323、來自Agenus之INCAGN1876或來自Leap Therapeutics之TRX518；
TIM3調節劑，諸如來自Novartis Pharmaceuticals之MBG453或來自TESARO之TSR-042；
及調節劑，諸如抗體或其片段(例如，單株抗體、人類、人類化或嵌合抗體)、RNAi分子或對CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、ICOS、BTLA (CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM之小分子。
在一些實例中，IL-15結合物係與彭布利單抗、尼沃單抗、曲美莫單抗或易普利姆瑪組合投與。
在一些實例中，本文描述之IL-15結合物係與抗體諸如阿侖單抗(alemtuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、伊布替莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、本妥昔單抗(brentuximab vedotin)、阿多曲妥珠單抗(ado-trastuzumab emtansine)或布裡單抗(blinatumomab)一起投與。
在一些實例中，IL-15結合物係與選自抗VEGFR抗體之另外治療劑一起投與。例示性抗VEGFR抗體包括(但不限於)貝伐單抗(bevacizumab)或拉莫魯單抗(ramucirumab)。在一些實例中，該IL-15結合物增強該另外治療劑之ADCC效應。
在一些實例中，IL-15結合物係與選自西妥昔單抗(cetuximab)、伊馬曲單抗(imgatuzumab)、馬妥單抗(matuzumab) (EMD 72000)、妥莫妥昔單抗(tomuzotuximab)或帕尼單抗(panitumumab)之另外治療劑一起投與。在一些實例中，該IL-15結合物增強該另外治療劑之ADCC效應。
在一些實例中，IL-15結合物係與選自另外之細胞介素(例如，天然細胞介素或經改造之細胞介素，諸如聚乙二醇化及/或融合細胞介素)之另外治療劑一起投與。在一些實例中，該另外之細胞介素增強及/或協同加強T效應細胞擴增及/或增殖。在一些實例中，該另外之細胞介素包含IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21或TNFα。在一些實例中，該另外之細胞介素係IL-2。在一些實例中，該另外之細胞介素係IL-21。在一些實例中，該另外之細胞介素係IL-10。在一些實例中，該另外之細胞介素係TNFα。
在一些實例中，IL-15結合物係與選自受體促效劑之另外治療劑一起投與。在一些實例中，該受體促效劑包含鐸樣受體(TLR)配體。在一些實例中，該TLR配體包含TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9。在一些實例中，該TLR配體包含合成配體，諸如，例如，Pam3Cys、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1、Hib-OMPC、聚I:C、聚A:U、AGP、MPL A、RC-529、MDF2β、CFA或鞭毛蛋白。在一些實例中，該IL-21結合物係與選自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9之一或多種TLR促效劑一起投與。在一些實例中，該IL-15結合物係與選自Pam3Cys、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1、Hib-OMPC、聚I:C、聚A:U、AGP、MPL A、RC-529、MDF2β、CFA及鞭毛蛋白之一或多種TLR促效劑一起投與。
在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物係結合過繼性T細胞轉移(ACT)治療使用。在一項實施例中，ACT涉及識別具有(例如)抗腫瘤活性之個體中之自體T淋巴細胞，自體T淋巴細胞活體外擴增，及接著將該等經擴增之T淋巴細胞再輸注至該個體內。在另一實施例中，ACT包括使用具有(例如)抗腫瘤活性之同種異體T淋巴細胞，該等T淋巴細胞活體外擴增，及接著將該等經擴增之同種異體T淋巴細胞輸注至有此需要之個體內。在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物係結合自體T淋巴細胞作為ACT治療之一部分使用。在其他實例中，本文描述之IL-15結合物係結合同種異體T淋巴細胞作為ACT治療之一部分使用。在一些實施例中，該IL-15結合物係與該ACT治療同時向有此需要之個體投與。在其他實例中，該IL-15結合物係與該ACT治療依序向有此需要之個體投與。
在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物係用於自體及/或同種異體T細胞轉移之離體活化及/或擴增。在此等實例中，該IL-15結合物係用以活化及/或擴增包含自體及/或同種異體T細胞之樣本及該IL-15結合物係視需要移除自該樣本，然後將該樣本投與至有此需要之個體。
在一些實施例中，本文描述之IL-15結合物係與疫苗一起投與。在一些實例中，IL-21結合物係與溶瘤細胞病毒組合利用。在此等實例中，該IL-21結合物充當刺激劑以調節免疫反應。在一些實例中，該IL-21結合物係與溶瘤細胞病毒一起作為輔助治療之一部分使用。例示性溶瘤細胞病毒包括T-Vec (Amgen)、G47Δ (Todo等人)、JX-594 (Sillajen)、CG0070 (Cold Genesys)及Reolysin (Oncolytics Biotech)。在一些實例中，該IL-21結合物係與溶瘤細胞病毒組合使用，諸如T-Vec、G47Δ、JX-594、CG0070或Reolysin。
在一些實施例中，IL-15結合物係與放射治療組合投與。 細胞群體擴增之方法
在一些實施例中，本文另外描述擴增淋巴細胞群體例如效應T (Teff)細胞、T記憶細胞及/或自然殺手(NK)細胞群體之方法。在一些實施例中，該方法包括使細胞與本文描述之細胞介素結合物接觸，並使該細胞介素與細胞介素受體相互作用以形成複合物，其中該複合物刺激不同之淋巴細胞群體之擴增。
在一些實施例中，擴增效應T (Teff)細胞、T記憶細胞及/或自然殺手(NK)細胞群體之方法包括：(a)使細胞與經修飾之IL-15多肽或IL-15結合物接觸；並使該IL-15與IL-15Rβ及IL-15Rγ亞單元相互作用以形成IL-15/IL-15Rβγ複合物；其中該IL-15結合物對IL-15Rα亞單元具有減小之親和力，且其中該IL-15/IL-15Rβγ複合物刺激Teff、T記憶及NK細胞之擴增。如本文描述，在一些實施例中，該經修飾之IL-15多肽於選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、T27、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、A39、K41、L44、L45、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114之殘基位置處包含至少一種經轉譯後修飾之非天然胺基酸，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該殘基位置係選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該殘基位置係選自E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、S51、L52、S54、G55、D56、A57、S58、H60、V63、I67、N71、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、L91、E92、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101及F110。在一些實施例中，該殘基位置係選自D14、Q17、S18、K41、S51、L52、G55、D56、A57、S58、S75、S76、N77、N79、V80、T81、S83、G84、E92、K94、N95、K97及E98。在一些實施例中，該殘基位置係選自N1、N4、S7、D8、K11、D61、T62、E64、N65、I68、L69及N72。在一些實施例中，該殘基位置係選自V3、I6、K10、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該殘基位置係選自D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90及E93。在一些實施例中，該殘基位置係選自Y26、E46、V49、E53及L25。在一些實施例中，該殘基位置係選自V3、K10、S29、D30、H32、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該殘基位置係選自N4、S7、K11及D61。在一些實施例中，該殘基位置係選自L25、E53、N77及S83。在一些實施例中，該殘基位置係選自L25及E53。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53、T24、N4、K11、N65、L69、S18、H20及S83。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46、V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自Y26、V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46及Y26。在一些實施例中，該殘基位置係E46。在一些實施例中，該殘基位置係L25。在一些實施例中，該殘基位置係Y26。在一些實施例中，該殘基位置係V49。在一些實施例中，該殘基位置係E53。在一些實施例中，該殘基位置係T24。在一些實施例中，該殘基位置係N77。在一些實施例中，該殘基位置係S83。
如本文描述，在一些實施例中，擴增效應T (Teff)細胞、T記憶細胞及/或自然殺手(NK)細胞群體之方法包括使細胞與IL-15結合物接觸。如本文描述，在一些實施例中，介白素15 (IL-15)結合物包含：經分離及純化之IL-15多肽；及於選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、T27、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、A39、K41、L44、L45、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114之胺基酸位置處結合至經分離及純化之IL-15多肽之結合部分，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO: 1中所述之位置。在一些實施例中，該殘基位置係選自N1、W2、V3、N4、I6、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該殘基位置係選自E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、I21、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、S51、L52、S54、G55、D56、A57、S58、H60、V63、I67、N71、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、L91、E92、K94、N95、I96、K97、E98、L100、Q101及F110。在一些實施例中，該殘基位置係選自D14、Q17、S18、K41、S51、L52、G55、D56、A57、S58、S75、S76、N77、N79、V80、T81、S83、G84、E92、K94、N95、K97及E98。在一些實施例中，該殘基位置係選自N1、N4、S7、D8、K11、D61、T62、E64、N65、I68、L69及N72。在一些實施例中，該殘基位置係選自V3、I6、K10、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S102、V104、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該殘基位置係選自D22、A23、T24、L25、Y26、L44、E46、Q48、V49、E53、E89、E90及E93。在一些實施例中，該殘基位置係選自Y26、E46、V49、E53及L25。在一些實施例中，該殘基位置係選自V3、K10、S29、D30、H32、H105、Q108、M109、I111、N112、T113及S114。在一些實施例中，該殘基位置係選自N4、S7、K11及D61。在一些實施例中，該殘基位置係選自L25、E53、N77及S83。在一些實施例中，該殘基位置係選自L25及E53。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53、T24、N4、K11、N65、L69、S18、H20及S83。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46、Y26、V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46、V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自Y26、V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自V49、E53及T24。在一些實施例中，該殘基位置係選自E46及Y26。在一些實施例中，該殘基位置係E46。在一些實施例中，該殘基位置係L25。在一些實施例中，該殘基位置係Y26。在一些實施例中，該殘基位置係V49。在一些實施例中，該殘基位置係E53。在一些實施例中，該殘基位置係T24。在一些實施例中，該殘基位置係N77。在一些實施例中，該殘基位置係S83。 IL-15多肽產生
在一些實施例中，含有天然胺基酸突變或非天然胺基酸突變之本文描述之IL-15多肽係經重組產生或經化學合成。在一些實施例中，本文描述之IL-15多肽係(例如)由宿主細胞系統或在無細胞系統中重組產生。
在一些實施例中，IL-15多肽係通過宿主細胞系統重組產生。在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞)、原核細胞(例如，革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌)或古細胞。在一些實例中，真核宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。在一些實例中，哺乳動物宿主細胞係穩定之細胞系或已將受關注之基因材料併入其自身之基因組內且有能力在許多代細胞分裂之後表現該基因材料之產物之細胞系。在其他實例中，哺乳動物宿主細胞係瞬時細胞系或未將受關注之基因材料併入其自身之基因組內且不具有能力在許多代細胞分裂之後表現該基因材料之產物之細胞系。
例示性哺乳動物宿主細胞包括293T細胞系、293A細胞系、293FT細胞系、293F細胞、293 H細胞、A549細胞、MDCK細胞、CHO DG44細胞、CHO-S細胞、CHO-K1細胞、Expi293F™細胞、Flp-In™ T-REx™ 293細胞系、Flp-In™-293細胞系、Flp-In™-3T3細胞系、Flp-In™-BHK細胞系、Flp-In™-CHO細胞系、Flp-In™-CV-1細胞系、Flp-In™-Jurkat細胞系、FreeStyle™ 293-F細胞、FreeStyle™ CHO-S細胞、GripTite™ 293 MSR細胞系、GS-CHO細胞系、HepaRG™細胞、T-REx™ Jurkat細胞系、Per.C6細胞、T-REx™-293細胞系、T-REx™-CHO細胞系及T-REx™-HeLa細胞系。
在一些實施例中，真核宿主細胞係昆蟲宿主細胞。例示性昆蟲宿主細胞包括果蠅S2細胞、Sf9細胞、Sf21細胞、High Five™細胞及expresSF+®細胞。
在一些實施例中，真核宿主細胞係酵母宿主細胞。例示性酵母宿主細胞包括畢赤酵母(Pichia pastoris )酵母菌株，諸如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H及X-33；及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )酵母菌株，諸如INVSc1。
在一些實施例中，真核宿主細胞係植物宿主細胞。在一些實施例中，該等植物細胞包含來自藻類之細胞。例示性植物細胞系包括來自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 137c或細長聚球藻(Synechococcus elongatus) PPC 7942之品系。
在一些實施例中，宿主細胞係原核宿主細胞。例示性原核宿主細胞包括BL21、Mach1™、DH10B™、TOP10、DH5α、DH10Bac™、OmniMax™、MegaX™、DH12S™、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2™、Stbl3™或Stbl4™。
在一些實施例中，適用於產生本文描述之IL-15多肽之多核酸分子或載體包括衍生自真核或原核來源之任何合適之載體。例示性多核酸分子或載體包括來自細菌(例如，大腸桿菌)、昆蟲、酵母(例如，畢赤酵母)、藻類或哺乳動物來源之載體。細菌載體包括(例如) pACYC177、pASK75、pBAD載體系列、pBADM載體系列、pET載體系列、pETM載體系列、pGEX載體系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE載體系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆蟲載體包括(例如) pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG載體(諸如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT 2)或MAT載體(諸如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2)。
酵母載體包括(例如) Gateway® pDEST™ 14載體、Gateway® pDEST™ 15載體、Gateway® pDEST™ 17載體、Gateway® pDEST™ 24載體、Gateway® pYES-DEST52載體、pBAD-DEST49 Gateway® 目的載體、pAO815畢赤酵母載體、pFLD1畢赤酵母載體、pGAPZA、B及C畢赤酵母載體、pPIC3.5K畢赤酵母載體、pPIC6 A、B及C畢赤酵母載體、pPIC9K畢赤酵母載體、pTEF1/Zeo、pYES2酵母載體、pYES2/CT酵母載體、pYES2/NT A、B及C酵母載體或pYES3/CT酵母載體。
藻類載體包括(例如) pChlamy-4載體或MCS載體。
哺乳動物載體包括(例如)瞬時表現載體或穩定之表現載體。例示性哺乳動物瞬時表現載體包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。例示性哺乳動物穩定之表現載體包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些實施例中，無細胞系統係用於產生本文描述之IL-15多肽。在一些實施例中，無細胞系統包含來自細胞之細胞質及/或細胞核組分之混合物(例如，包含經完全純化之重組組分或經部分純化之組分)且適用於活體外核酸合成。在一些實例中，無細胞系統利用原核細胞組分。在其他實例中，無細胞系統利用真核細胞組分。核酸合成係在基於(例如)果蠅細胞、爪蟾(Xenopus)蛋、古細菌或HeLa細胞之無細胞系統中獲得。例示性無細胞系統包括大腸桿菌S30提取系統、大腸桿菌T7 S30系統或PURExpress®、XpressCF及XpressCF+。
無細胞轉譯系統不同地包含組分諸如質粒、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、釋放因子、核糖體、伴護蛋白、轉譯起始及延伸因子、天然及/或非天然胺基酸及/或用於蛋白質表現之其他組分。此等組分係視需要經修飾以改良產率、增加合成速率、增加蛋白質產品保真度或併入非天然胺基酸。在一些實施例中，本文描述之細胞介素係使用US 8,778,631；US 2017/0283469；US 2018/0051065；US 2014/0315245；或US 8,778,631中描述之無細胞轉譯系統合成。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含經改良之釋放因子，或甚至自該系統移除一或多個釋放因子。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含減小之蛋白酶濃度。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含經修飾之tRNA及用以編碼非天然胺基酸之重新分配之密碼子。在一些實施例中，用於併入非天然胺基酸之本文描述之合成酶係用於無細胞轉譯系統中。在一些實施例中，tRNA係使用酶促或化學方法在被添加至無細胞轉譯系統之前預先裝載非天然胺基酸。在一些實施例中，用於無細胞轉譯系統之組分係獲得自經修飾之生物體諸如經修飾之細菌、酵母或其他生物體。
在一些實施例中，IL-15多肽係作為循環排列形式，經由表現宿主系統或通過無細胞系統產生。 包含非天然胺基酸之IL-15多肽之產生
正交或經擴增之基因編碼可用於本發明中，其中IL-15多肽之核酸序列中存在之一或多個特異性密碼子係經分配以編碼非天然胺基酸使得其可藉由使用正交tRNA合成酶/tRNA對而經基因併入該IL-15內。該正交tRNA合成酶/tRNA對可用非天然胺基酸使tRNA帶電且可應密碼子將該非天然胺基酸併入多肽鏈內。
在一些實施例中，密碼子係密碼子琥珀、赭石、蛋白石或四聯組密碼子。在一些實例中，該密碼子對應於將用以攜載非天然胺基酸之正交tRNA。在一些實例中，該密碼子係琥珀。在其他實例中，該密碼子係正交密碼子。
在一些實例中，密碼子係四聯組密碼子，其可由正交核糖體ribo-Q1解碼。在一些實例中，該四聯組密碼子係如Neumann等人，「Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome」，Nature, 464(7287): 441-444 (2010)中闡述。
在一些實例中，用於本發明中之密碼子係重新編碼之密碼子，例如，經替代密碼子置換之同義密碼子或稀有密碼子。在一些實例中，該重新編碼之密碼子係如Napolitano等人，「Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli」，PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016)中描述。在一些實例中，該重新編碼之密碼子係如Ostrov等人，「Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome」，Science 353(6301): 819-822 (2016)中描述。
在一些實施例中，利用非天然核酸導致將一或多個非天然胺基酸併入IL-15內。例示性非天然核酸包括(但不限於)尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)、2-胺基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧碇、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧碇、8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤，5-鹵基，特定言之，5-溴、5-三氟甲基及其他5-經取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤及7-脫氮雜腺嘌呤及3-脫氮雜鳥嘌呤及3-脫氮雜腺嘌呤。某些非天然核酸諸如5-經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2經取代之嘌呤、N-6經取代之嘌呤、O-6經取代之嘌呤、2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、彼等增加二聚體形成之穩定性者、通用核酸、疏水性核酸、混雜核酸、經尺寸擴增之核酸、氟化核酸、5-經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、6-甲基、腺嘌呤及鳥嘌呤之其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧碇、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3 )尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、嘧啶核酸之其他炔基衍生物、6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶、6-偶氮基胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧碇、8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基，特定言之5-溴、5-三氟甲基、其他5-經取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-胺基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜腺嘌呤、3-脫氮雜鳥嘌呤、3-脫氮雜腺嘌呤、三環嘧啶、吩噁嗪胞苷([5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻嗉-2(3H)-酮)、G-clamps、吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-胺基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、哢唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)、彼等其中嘌呤或嘧啶鹼基係經其他雜環置換者、7-脫氮雜-腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤核苷、2-胺基吡啶、2-吡啶酮、氮雜胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、環胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯醣苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5,6-二氫胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羥基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶及5-碘尿嘧啶、2-胺基-腺嘌呤、6-硫-鳥嘌呤、2-硫-胸腺嘧啶、4-硫-胸腺嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、7-脫氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、5-羥基胞嘧啶、2'-去氧尿苷、2-胺基-2'-去氧腺苷及彼等描述於以下中者：美國專利案第3,687,808；4,845,205；4,910,300；4,948,882；5,093,232；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653及6,005,096號；WO 99/62923；Kandimalla等人，(2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I.編，John Wiley & Sons, 1990, 858- 859；Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991, 30, 613；及Sanghvi，第15章，Antisense Research and Applications, Crookeand Lebleu編，CRC Press, 1993, 273-288。另外之鹼基修飾可參見(例如)美國專利案第3,687,808號；Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991, 30, 613；及Sanghvi，第15章，Antisense Research and Applications，第289至302頁，Crooke及Lebleu編，CRC Press, 1993。
包含各種雜環鹼基及各種糖部分(及糖類似物)之非天然核酸可用於本領域中，且在一些實例中，該等核酸包括除天然生成之核酸之主要五種鹼基組分外之一或數種雜環鹼基。例如，在一些實例中，該雜環鹼基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4-胺基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中該等嘌呤係經由9-位置結合至該核酸之糖部分，該等嘧啶經由1-位置，該等吡咯并嘧啶經由7-位置及該等吡唑并嘧啶經由1-位置。
在一些實施例中，核苷酸類似物係亦於磷酸鹽部分處經修飾。經修飾之磷酸鹽部分包括(但不限於)彼等於兩個核苷酸之間的鍵聯處經修飾且含有(例如)硫磷酸酯、掌性硫磷酸酯、二硫磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯，甲基及其他烷基膦酸鹽，包括3’-伸烷基膦酸鹽及掌性膦酸鹽、次膦酸鹽，磷醯胺酯，包括3’-胺基磷醯胺酯及胺基烷基磷醯胺酯、硫羰基磷醯胺酯、硫羰基烷基膦酸鹽、硫羰基烷基磷酸三酯及硼磷酸鹽。應瞭解兩個核苷酸之間的此等磷酸鹽或經修飾之磷酸鹽鍵聯係通過3’-5’鍵聯或2’-5’鍵聯，及該鍵聯含有經反轉之極性，諸如3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。各種鹽，經混合之鹽及游離酸形式係亦包括於本文中。許多美國專利案教示如何製造及使用含有經修飾之磷酸鹽之核苷酸且包括(但不限於) 3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；及5,625,050。
在一些實施例中，非天然核酸包括2’,3’-雙脫氧-2’,3’-雙脫氫-核苷(PCT/US2002/006460)、5’-經取代之DNA及RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人，J. Org Chem., 1995, 60, 788-789；Wang等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890；及Mikhailov等人，Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343；Leonid等人，1995, 14(3-5), 901-905；及Eppacher等人，Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560)或以具有經修飾之鹼基之單磷酸鹽製得之5’-經取代之單體(Wang等人，nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337)。
在一些實施例中，非天然核酸包括於糖環之5’-位置及2’-位置之修飾(PCT/US94/02993)，諸如5’-CH2 -經取代之2’-O-保護之核苷(Wu等人，Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143及Wu等人，Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924)。在一些實例中，非天然核酸包括醯胺連接之核苷二聚體，其等已經製備用於併入寡核苷酸內，其中該二聚體中3’連接之核苷(5’至3’)包含2’-OCH3 及5’-(S)-CH3 (Mesmaeker等人，Synlett, 1997, 1287-1290)。非天然核酸可包括2’-經取代之5’-CH2 (或O)修飾之核苷(PCT/US92/01020)。非天然核酸可包括5’-亞甲基膦酸鹽DNA及RNA單體，及二聚體(Bohringer等人，Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726；Collingwood等人，Synlett, 1995, 7, 703-705；及Hutter等人，Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806)。非天然核酸可包括具有2’-取代之5’-膦酸鹽單體(US2006/0074035)及其他經修飾之5’-膦酸鹽單體(WO1997/35869)。非天然核酸可包括5’-經修飾之亞甲基膦酸鹽單體(EP614907及EP629633)。非天然核酸可包括於5’及/或6’-位置包含羥基之5’或6’-膦酸鹽核糖核苷之類似物(Chen等人，Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786；Jung等人，Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509；Gallier等人，Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933；及Hampton等人，J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033)。非天然核酸可包括5’-膦酸鹽脫氧核糖核苷單體及具有5’-磷酸鹽基團之二聚體(Nawrot等人，Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82)。非天然核酸可包括具有6’-膦酸鹽基團之核苷，其中5’或/及6’-位置係未經取代或經硫第三丁基(SC(CH3 )3 )(及其類似物)；亞甲基胺基(CH2 NH2 ) (及其類似物)或氰基(CN) (及其類似物)取代(Fairhurst等人，Synlett, 2001, 4, 467-472；Kappler等人，J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038；Kappler等人，J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184；Vrudhula等人，J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894；Hampton等人，J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377；Geze等人，J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640；及Hampton等人，J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414)。
在一些實施例中，非天然核酸亦包括糖部分之修飾。在一些實例中，核酸含有一或多個核苷，其中該糖基團已經修飾。此等經糖修飾之核苷可賦予提高之核酸酶穩定性、增加之結合親和力或一些其他有利之生物性質。在某些實施例中，核酸包含化學修飾型呋喃核糖環部分。化學修飾型呋喃核糖環之實例包括(但不限於)添加取代基(包括5’及/或2’取代基；橋接兩個環原子以形成雙環核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1 )(R2 ) (R = H、C1 -C12 烷基或保護基)置換核糖基環氧原子；及其組合。化學修飾型糖之實例可參見WO2008/101157、US2005/0130923及WO2007/134181。
在一些實例中，經修飾之核酸包含經修飾之糖或糖類似物。因此，除核糖及脫氧核糖外，該糖部分可係戊糖、脫氧戊糖、己糖、脫氧己糖、葡萄糖、樹膠醛糖、木糖、來蘇糖或糖「類似物」環戊基。該糖可以吡喃糖基或呋喃糖基形式。該糖部分可係核糖、脫氧核糖、樹膠醛糖或2’-O-烷基核糖之呋喃糖苷，及該糖可結合至個別雜環鹼基，以[α]或[β]異頭物構型。糖修飾包括(但不限於) 2’-烷氧基-RNA類似物、2’-胺基-RNA類似物、2’-氟-DNA及2’-烷氧基-或胺基-RNA/DNA嵌合體。例如，糖修飾可包括2’-O-甲基-尿苷或2’-O-甲基-胞苷。糖修飾包括2’-O-烷基-取代之脫氧核糖核苷及2’-O-乙二醇樣核糖核苷。其中此等糖或類似物係結合至雜環鹼基(核酸鹼基)之此等糖或糖類似物及個別「核苷」之製備係已知的。亦可作出糖修飾並與其他修飾組合。
對糖部分之修飾包括核糖及脫氧核糖之天然修飾及非天然修飾。糖修飾包括(但不限於)於2’位置之下列修飾：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1 至C10 烷基或C2 至C10 烯基及炔基。2’糖修飾亦包括(但不限於)-O[(CH2 )n O]m CH3 、-O(CH2 )n OCH3 、-O(CH2 )n NH2 、-O(CH2 )n CH3 、-O(CH2 )n ONH2 及-O(CH2 )n ON[(CH2 )n CH3 )]2 ，其中n及m係自1至約10。
於2’位置之其他修飾包括(但不限於)：C1 至C10 低碳數烷基、經取代之低碳數烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3 、OCN、Cl、Br、CN、CF3 、OCF3 、SOCH3 、SO2 CH3 、ONO2 、NO2 、N3 、NH2 、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽基、RNA裂解基團、資訊基團、嵌入劑、用於改良寡核苷酸之藥物動力學性質之基團或用於改良寡核苷酸之藥效動力學性質之基團及具有相似性質之其他取代基。亦可於糖上之其他位置作出類似修飾，特定言之，3’末端核苷酸上之糖之3’位置或於2’-5’連接之寡核苷酸中及5’末端核苷酸之5’位置。經修飾之糖亦包括彼等於橋接環氧處含有修飾者，諸如CH2 及S。核苷酸糖類似物亦可具有糖模擬物，諸如替代呋喃戊糖基糖之環丁基部分。許多美國專利案教示此等經修飾之糖結構之製法且詳述並描述一定範圍之鹼基修飾，諸如美國專利案第4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121, 5,596,091；5,614,617；5,681,941；及5,700,920號，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。
具有經修飾之糖部分之核酸之實例包括(但不限於)包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3 及2’-O(CH2 )2 OCH3 取代基之核酸。2’位置之取代基亦可選自烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烯丙基、O-(C1 -C10 烷基)、OCF3 、O(CH2 )2 SCH3 、O(CH2 )2 -O-N(Rm )(Rn )及O-CH2 -C(=O)-N(Rm )(Rn )，其中各Rm 及Rn 係獨立地H或經取代或未經取代之C1 -C10 烷基。
在某些實施例中，本文描述之核酸包括一或多種雙環核酸。在某些此等實施例中，該雙環核酸包含在4’與2’核糖基環原子之間的橋。在某些實施例中，本文提供之核酸包括一或多種雙環核酸，其中該橋包含4’至2’雙環核酸。此等4’至2’雙環核酸之實例包括(但不限於)下式中之一者：4’-(CH2 )-O-2’ (LNA)；4’-(CH2 )-S-2’；4’-(CH2 )2 -O-2’ (ENA)；4’-CH(CH3 )-O-2’及4’-CH(CH2 OCH3 )-O-2’，及其類似物(參見，美國專利案第7,399,845號)；4’-C(CH3 )(CH3 )-O-2’及其類似物，(參見，WO2009/006478、WO2008/150729、US2004/0171570、美國專利案第7,427,672號、Chattopadhyaya等人，J. Org. Chem., 209, 74, 118-134及WO2008/154401)。亦參見，例如：Singh等人，Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin等人，Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Wahlestedt等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638；Kumar等人，Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；Singh等人，J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；Srivastava等人，J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379；Elayadi等人，Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561；Braasch等人，Chem. Biol, 2001, 8, 1-7；或Oram等人，Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；美國專利案第4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802；7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；6,670,461；及7,399,845號；國際公開案第WO2004/106356、WO1994/14226、WO2005/021570、WO2007/090071及WO2007/134181號；美國專利公開案第US2004/0171570、US2007/0287831及US2008/0039618號；美國臨時申請案第60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787及61/099,844號；及國際申請案第PCT/US2008/064591、PCT US2008/066154、PCT US2008/068922及PCT/DK98/00393號。
在某些實施例中，核酸包含連接之核酸。核酸可使用任何核酸間鍵聯連接在一起。核酸間連接基團之兩種主要類別係由磷原子之存在或缺乏定義。代表性含磷核酸間鍵聯包括(但不限於)磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸鹽、磷醯胺酯及硫磷酸酯(P=S)。代表性含非磷核酸間連接基團包括(但不限於)亞甲基甲基亞胺基(-CH2 -N(CH3 )-O-CH2 -)、硫二酯(-O-C(O)-S-)、硫羰基胺甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；矽氧烷(-O-Si(H)2 -O-)；及N,N*-二甲基肼(-CH2 -N(CH3 )-N(CH3 ))。在某些實施例中，具有掌性原子之核酸間鍵聯可呈外消旋混合物，呈不同對映異構物，例如，烷基膦酸鹽及硫磷酸酯製備。非天然核酸可含有單一修飾。非天然核酸可於該等部分中之一者內或在不同部分之間含有多種修飾。
對核酸之主鏈磷酸鹽修飾包括(但不限於)甲基膦酸鹽、硫磷酸酯、磷醯胺酯(橋接或非橋接)、磷酸三酯、二硫磷酸酯、二硫磷酸酯及硼磷酸鹽，且可以任何組合使用。其他非磷酸鹽鍵聯亦可使用。
在一些實施例中，主鏈修飾(例如，甲基膦酸鹽、硫磷酸酯、磷醯胺酯及二硫磷酸酯核苷酸間鍵聯)可賦予經修飾之核酸免疫調節活性及/或活體內增強其等穩定性。
在一些實例中，磷衍生物(或經修飾之磷酸鹽基團)係結合至糖或糖類似物部分且可係單磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、烷基膦酸鹽、硫磷酸酯、二硫磷酸酯、磷醯胺酯或類似物。含有經修飾之磷酸鹽鍵聯或非磷酸鹽鍵聯之例示性聚核苷酸可參見Peyrottes等人，1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848；Chaturvedi等人，1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323；及Schultz等人，(1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973；Matteucci, 1997, 「Oligonucleotide Analogs: an Overview」 in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick及Cardew編) John Wiley and Sons, New York, NY; Zon, 1993, 「Oligonucleoside Phosphorothioates」 in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190；Miller等人，1971, JACS 93:6657-6665；Jager等人，1988, Biochem. 27:7247-7246；Nelson等人，1997, JOC 62:7278-7287；美國專利案第5,453,496號；及Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179。
在一些實例中，主鏈修飾包括用替代部分諸如陰離子、中性或陽離子基團置換磷酸二酯鍵聯。此等修飾之實例包括：陰離子核苷間鍵聯；N3’至P5’磷醯胺酯修飾；硼磷酸鹽DNA；前寡核苷酸；中性核苷間鍵聯諸如甲基膦酸鹽；醯胺連接之DNA；亞甲基(甲基亞胺基)鍵聯；甲縮醛和硫甲縮醛鍵聯；含有磺醯基之主鏈；嗎啡寡聚物；肽核酸(PNA)；及帶正電荷之脫氧核糖核酸胍(DNG)寡聚物(Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179)。經修飾之核酸可包含嵌合或混合主鏈，其包含一或多種修飾，例如，磷酸鹽鍵聯之組合，諸如磷酸二酯及硫磷酸酯鍵聯之組合。
用於磷酸鹽之替代物包括(例如)短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、經混合之雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵聯，或一或多種短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯。此等包括彼等具有嗎啉基鍵聯(部分形成自核苷之糖部分)；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫甲醯基主鏈；亞甲基甲縮醛及硫甲縮醛主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸鹽及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及其他具有經混合之N、O、S及CH2 組分部分者。許多美國專利案揭示如何製造及使用此等類型之磷酸鹽替代物且包括(但不限於)美國專利案第5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；及5,677,439號。亦瞭解在核苷酸替代物中，該核苷酸之糖及磷酸鹽部分均可經(例如)醯胺型鍵聯(胺乙基甘胺酸) (PNA)置換。美國專利案第5,539,082；5,714,331；及5,719,262號教示如何製造及使用PNA分子，其等中之各者係以引用之方式併入本文中。亦參見Nielsen等人，Science, 1991, 254, 1497-1500。亦可能將其他類型之分子(結合物)連接至核苷酸或核苷酸類似物以提高(例如)細胞攝取。結合物可化學連接至該核苷酸或核苷酸類似物。此等結合物包括(但不限於)脂質部分諸如膽固醇部分(Letsinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、膽酸(Manoharan等人，Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan等人，Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪鏈，例如，十二烷二醇或十一基殘基(Saison-Behmoaras等人，EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk等人，Biochimie, 1993, 75, 49-54)、磷脂，例如，二-十六基-外消旋-甘油或l-二-O-十六基-外消旋-甘油基-S-H-膦酸三乙基銨(Manoharan等人，Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea等人，Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra等人，Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)，或十八基胺或己基胺基-羰基-氧基膽固醇部分(Crooke等人，J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)。許多美國專利案教示此等結合物之製法且包括(但不限於)美國專利案第4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203, 5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928及5,688,941號。
在一些實施例中，非天然核酸進一步形成非天然鹼基對。可在活體內條件下形成非天然DNA或RNA鹼基對(UBP)之例示性非天然核苷酸包括(但不限於) 5SICS、d5SICS、NAM、dNaM、TPT3TP、dTPT3TP及其組合。在一些實施例中，非天然核苷酸包括： 。
在一些實施例中，非天然鹼基對產生Dumas等人，「Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology」，Chemical Science, 6: 50-69 (2015)中描述之非天然胺基酸。
其中引入本文揭示之構築體或載體之宿主細胞係經培養或維持於合適之培養基中使得產生tRNA、tRNA合成酶及受關注之蛋白質。該培養基亦包含非天然胺基酸使得受關注之蛋白質併入非天然胺基酸。
正交tRNA合成酶/tRNA對用非天然胺基酸使tRNA帶電並應密碼子將非天然胺基酸併入多肽鏈內。例示性aaRS-tRNA對包括(但不限於)詹氏甲烷球菌(Mj-Tyr) aaRS/tRNA對、大腸桿菌TyrRS (Ec-Tyr)/嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNACUA 對、大腸桿菌LeuRS (Ec-Leu)/嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNACUA 對及吡咯離胺醯-tRNA對。
包含非天然胺基酸之IL-15多肽係藉由將本文描述之包含tRNA及tRNA合成酶且包含具有一或多個框內正交(停止)密碼子之受關注之核酸序列之核酸構築體併入宿主細胞內進行製備。使該宿主細胞曝露於包含該(等)非天然胺基酸之生理溶液，及然後使該等宿主細胞維持在允許表現受關注之編碼序列之蛋白質之條件下。應密碼子將該(等)非天然胺基酸併入多肽鏈內。例如，將一或多種非天然胺基酸併入IL-15多肽內。或者，可兩個或更多個非天然胺基酸併入IL-15多肽蛋白質內之兩個或更多個位點。
當將多個非天然胺基酸併入IL-15多肽內時，應瞭解需將多個密碼子併入編碼核酸序列內的所需位置使得tRNA合成酶/tRNA對可應該(等)密碼子引導該等非天然胺基酸之併入。可將至少1、2、3、4或更多個編碼核酸之密碼子併入受關注之核酸序列內。
當需將多於一種類型之非天然胺基酸併入受關注之蛋白質併入單一蛋白質內時，可使用第二或另一正交tRNA-tRNA合成酶對以併入該第二或另一非天然胺基酸；適當地，該第二或另一正交tRNA-tRNA合成酶對識別編碼受關注之蛋白質之核酸中之不同密碼子使得可在單一製造步驟中將該等兩種或更多種非天然胺基酸特定地併入該蛋白質中之不同指定位點內。在某些實施例中，因此可使用兩個或更多個正交tRNA-tRNA合成酶對。
倘若併入非天然胺基酸之IL-15多肽已於宿主細胞中產生，則其可藉由此項技術中已知的各種技術自宿主細胞中提取，該等技術包括酶促、化學及/或滲透溶解及物理破壞。IL-15多肽可藉由此項技術中已知的標準技術諸如製備型層析術、親和純化或任何其他合適之技術進行純化。
合適之宿主細胞可包括細菌細胞(例如，大腸桿菌)，但最合適的宿主細胞係真核細胞，例如，昆蟲細胞(例如，果蠅(Drosophila)，諸如黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))；酵母細胞，線蟲類(nematodes)(例如，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans))；小鼠(例如，小家鼠(Mus musculus))；或哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞、人類293T細胞、HeLa細胞、NIH 3T3細胞及小鼠紅白血病(MEL)細胞)或人類細胞或其他真核細胞。其他合適之宿主細胞係為熟習此項技術者已知。適當地，該宿主細胞係哺乳動物細胞，諸如人類細胞或昆蟲細胞。
一般可用於本發明之實施例中之其他合適之宿主細胞係彼等在實例部分中提及者。載體DNA可經由習知轉形或轉染技術引入宿主細胞內。如本文使用，術語「轉形」及「轉染」意欲係指用於將外源核酸分子(例如，DNA)引入宿主細胞內之各種公認技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、脂質體轉染或電穿孔。適用於轉形或轉染宿主細胞之方法係為此項技術中熟知。
當產生細胞系時，一般較佳地是製備穩定之細胞系。就例如哺乳動物細胞之穩定轉染而言，已知取決於使用之表現載體及轉染技術，僅一小部分細胞可將外源DNA整合至其等基因組內。為識別及選擇此等整合體，一般將編碼可選擇之標誌物(例如，抵抗抗生素)之基因與受關注之基因一起引入宿主細胞內。較佳之可選擇之標誌物包括彼等賦予耐藥性者，諸如G418、潮黴素或胺甲喋呤。可將編碼可選擇之標誌物子核酸分子於相同載體上併入宿主細胞內或可於個別載體上併入。經引入之核酸分子穩定轉染之細胞可藉由藥物選擇(例如，已併入可選擇之標誌物基因之細胞將存活，而其他細胞死亡)進行識別。
在一項實施例中，將本文描述之構築體整合至宿主細胞之基因組內。穩定整合之優點係達成個別細胞或純系之間的均勻性。另一優點係可進行最佳生產商之選擇。因此，需產生穩定之細胞系。在另一實施例中，將本文描述之構築體轉染至宿主細胞內。將該等構築體轉染至該宿主細胞內之優點係蛋白質產率可經最大化。在一項態樣中，其中描述包含本文描述之核酸構築體或載體之細胞。 醫藥組合物及調配物
在一些實施例中，本文描述之醫藥組合物及調配物係藉由多種投與途徑包括(但不限於)非經腸、經口或經皮投與途徑向個體投與。在一些實例中，非經腸投與包含靜脈內、皮下、肌內、大腦內、鼻內、動脈內、關節內、皮內、玻璃體內、骨內輸注、腹膜內或鞘內投與。在一些實例中，該醫藥組合物係經調配用於局部投與。在其他實例中，該醫藥組合物係經調配用於全身投與。
在一些實施例中，醫藥調配物包括(但不限於)水性液體分散液、自乳化分散液、脂質體分散液、氣霧劑、即釋調配物、控釋調配物、延遲釋放調配物、延長釋放調配物、脈動釋放調配物及經混合之即釋及控釋調配物。
在一些實施例中，醫藥調配物包括基於與本文揭示之組合物之相容性及所需劑型之釋放曲線性質選擇之載劑或載劑材料。例示性載劑材料包括(例如)黏合劑、表面活性劑、增溶劑、穩定劑、潤滑劑、潤濕劑、稀釋劑及類似物。醫藥上可相容之載劑材料包括(但不限於)阿拉伯樹膠、明膠、膠體二氧化矽、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、麥芽糊精、甘油、矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、膽固醇、膽固醇酯、酪蛋白鈉、大豆卵磷脂、牛磺膽酸、磷脂醯膽鹼、氯化鈉、磷酸三鈣、磷酸氫二鉀、纖維素及纖維素結合物、糖類硬脂醯乳酸鈉、角叉菜膠、單酸甘油酯、雙甘油酯、預膠化澱粉及類似物。參見，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth編(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A.及Lachman, L.編，Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh編(Lippincott Williams & Wilkins1999)。
在一些實例中，將醫藥組合物調配為免疫脂質體，其包含直接或間接結合至脂質體之脂質雙層之複數個IL-15結合物。例示性脂質包括(但不限於)脂肪酸；磷脂；固醇，諸如膽固醇；神經鞘脂質，諸如神經鞘磷脂；醣神經鞘脂質，諸如神經節甘脂、紅細胞糖苷脂及腦苷脂；表面活性劑胺，諸如硬脂醯胺、油醯胺及亞油醯胺。在一些實例中，該脂質包含陽離子脂質。在一些實例中，該脂質包含磷脂。例示性磷脂包括(但不限於)磷脂酸(「PA」)、磷脂醯膽鹼(「PC」)、磷脂醯甘油(「PG」)、磷脂醯乙醇胺(「PE」)、磷脂醯肌醇(「PI」)及磷脂醯絲胺酸(「PS」)、神經鞘磷脂(包括腦神經鞘磷脂)、卵磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、腦苷脂、雙花生醯磷脂醯膽鹼(「DAPC」)、二癸醯基-L-α-磷脂醯膽鹼(「DDPC」)、二反油醯磷脂醯膽鹼(「DEPC」)、二月桂醯磷脂醯膽鹼(「DLPC」)、二亞油醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(「DMPC」)、二油醯基磷脂醯膽鹼(「DOPC」)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(「DPPC」)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(「DSPC」)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼(「POPC」)、雙花生醯磷脂醯甘油(「DAPG」)、二癸醯基-L-α-磷脂醯甘油(「DDPG」)、二反油醯磷脂醯甘油(「DEPG」)、二月桂醯磷脂醯甘油(「DLPG」)、二亞油醯磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油(「DMPG」)、二油醯基磷脂醯甘油(「DOPG」)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(「DPPG」)、二硬脂醯磷脂醯甘油(「DSPG」)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯甘油(「POPG」)、雙花生醯磷脂醯乙醇胺(「DAPE」)、二癸醯基-L-α-磷脂醯乙醇胺(「DDPE」)、二反油醯磷脂醯乙醇胺(「DEPE」)、二月桂醯磷脂醯乙醇胺(「DLPE」)、二亞油醯磷脂醯乙醇胺、二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺(「DMPE」)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(「DOPE」)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(「DPPE」)、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(「DSPE」)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(「POPE」)、雙花生醯磷脂醯肌醇(「DAPI」)、二癸醯基-L-α-磷脂醯肌醇(「DDPI」)、二反油醯磷脂醯肌醇(「DEPI」)、二月桂醯磷脂醯肌醇(「DLPI」)、二亞油醯磷脂醯肌醇、二肉豆蔻醯磷脂醯肌醇(「DMPI」)、二油醯基磷脂醯肌醇(「DOPI」)、二棕櫚醯基磷脂醯肌醇(「DPPI」)、二硬脂醯磷脂醯肌醇(「DSPI」)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯肌醇(「POPI」)、雙花生醯磷脂醯絲胺酸(「DAPS」)、二癸醯基-L-α-磷脂醯絲胺酸(「DDPS」)、二反油醯磷脂醯絲胺酸(「DEPS」)、二月桂醯磷脂醯絲胺酸(「DLPS」)、二亞油醯磷脂醯絲胺酸、二肉豆蔻醯磷脂醯絲胺酸(「DMPS」)、二油醯基磷脂醯絲胺酸(「DOPS」)、二棕櫚醯基磷脂醯絲胺酸(「DPPS」)、二硬脂醯磷脂醯絲胺酸(「DSPS」)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯絲胺酸(「POPS」)、雙花生醯神經鞘磷脂、二癸醯基神經鞘磷脂、二反油醯神經鞘磷脂、二月桂醯神經鞘磷脂、二亞油醯神經鞘磷脂、二肉豆蔻醯神經鞘磷脂、神經鞘磷脂、二油醯基神經鞘磷脂、二棕櫚醯基神經鞘磷脂、二硬脂醯神經鞘磷脂及1-棕櫚醯基-2-油醯基-神經鞘磷脂。
在一些實施例中，醫藥調配物進一步包括pH調節劑或緩衝液，其等包括酸，諸如乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸及鹽酸；鹼，諸如氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉及參羥基甲基胺基甲烷；及緩衝液，諸如檸檬酸鹽/右旋糖、碳酸氫鈉及氯化銨。此等酸、鹼及緩衝液係以維持該組合物之pH所需之量以可接受之範圍包括於醫藥調配物中。
在一些實例中，醫藥調配物包括一或多種鹽，其量使組合物之重量滲透濃度達到可接受之範圍內。此等鹽包括彼等具有鈉、鉀或銨陽離子及氯、檸檬酸根、抗壞血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子者，合適之鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及硫酸銨。
在一些實施例中，醫藥調配物包括(但不限於)糖諸如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖、葡萄糖，或鹽諸如磷酸鉀、檸檬酸鈉、硫酸銨及/或其他藥劑諸如肝素以增加多肽之溶解性及活體內穩定性。
在一些實施例中，醫藥調配物進一步包括稀釋劑，其用以穩定化合物，因為其等可提供更穩定之環境。溶解於緩衝溶液中之鹽(其亦可提供pH控制或維持)係用作此項技術中之稀釋劑，包括(但不限於)磷酸鹽緩衝鹽溶液。
穩定劑包括諸如以下之化合物：任何抗氧化劑、緩衝液、酸、防腐劑及類似物。例示性穩定劑包括L-精胺酸鹽酸鹽、胺丁三醇(tromethamine)、白蛋白(人類)、檸檬酸、苯甲醇、苯酚、二水合磷酸二鈉、丙二醇、間甲酚或間甲苯酚、乙酸鋅、聚山梨醇酯-20或Tween® 20或胺丁三醇(trometamol)。
表面活性劑包括諸如以下之化合物：月桂基硫酸鈉、多庫酯鈉(sodium docusate)、Tween 60或80、三乙酸甘油酯、維生素E TPGS、山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomers)、膽鹽、單硬脂酸甘油酯、環氧乙烷及環氧丙烷之共聚物，例如，Pluronic® (BASF)及類似物。另外之表面活性劑包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯及植物油，例如，聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油及聚氧乙烯烷基醚及烷基苯基醚，例如，辛苯聚醇10、辛苯聚醇40。有時，亦包括表面活性劑以增強物理穩定性或用於其他目的。 治療方案
在一些實施例中，投與本文描述之醫藥組合物用於治療應用。在一些實施例中，該醫藥組合物係每天一次、每天兩次、每天三次或更多次投與。該醫藥組合物係每日、每天、每隔一天、每週五天、每週一次、每隔一週、每月兩週、每月三週、每月一次、每月兩次、每月三次或更多次投與。醫藥組合物係投與至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、18個月、2年、3年或更多。
在其中病患之狀態確實改良之情況下，根據醫生之判斷，組合物之投與係連續不斷地給予，或者，投與中之組合物之劑量係暫時減少或暫時暫停一段時間(即，「休藥期」)。在一些實施例中，休藥期之長度在2天與1年之間變化，包括，僅以實例說明之，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。休藥期期間之劑量減少係自10%至100%，包括，僅以實例說明之，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
倘若病患之病症出現改良，則視需要投與維持劑量。接著，投與之劑量或頻率或兩者均可減少，隨症狀而變化，減少至保持經改良之疾病、失調症或病症之程度。
在一些實施例中，對應於此量之給定藥劑之量取決於諸如以下之因素變化：特定化合物、疾病之嚴重性、需要治療之個體或宿主之特性(例如，重量)，然而係以此項技術中已知的方式根據圍繞該實例之特定情況進行例行確定，包括，例如，投與中之特定藥劑、投與途徑及治療中之個體或宿主。在一些實施例中，所需劑量係便利地以單一劑量或以同時(或經較短之時間週期)或以適當間隔例如以每天兩次、三次、四次或更多次子劑量投與之分開劑量投與。
前述範圍係僅提示性的，因為關於個別治療方案之變量之數量很大，且來自此等建議值之相當大之偏差並不罕見。此等劑量係取決於許多變量改變，不限於使用之化合物之活性、欲治療之疾病或病症、投與模式、個別個體之需求、治療中之疾病或病症之嚴重性及執業醫師之判斷。
在一些實施例中，此等治療方案之毒性及治療效用係藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中進行測定，包括(但不限於) LD50 (50%群體致死之劑量)及ED50 (在50%群體中治療有效之劑量)之測定。毒性與治療效應之間的劑量比率係治療指數且其表示為LD50與ED50之間的比率。以顯示高治療指數之化合物較佳。獲得自細胞培養分析及動物研究之資料係用以調配一定範圍之劑量以用於人類中。此等化合物之劑量較佳位於包括具有最小毒性之ED50之循環濃度之範圍內。該劑量取決於採用之劑型及利用之投與途徑而於此範圍內變化。 套組/製品
在某些實施例中，本文揭示用於與本文描述之一或多種方法及組合物一起使用之套組及製品。此等套組包括載劑、包裝或容器，其經分隔以容納一或多個容器諸如小瓶、管及類似物，各容器包含欲用於本文描述之方法中之分離元件中之一者。合適之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及試管。在一項實施例中，該等容器係形成自各種材料諸如玻璃或塑膠。
本文提供之製品含有包裝材料。醫藥包裝材料之實例包括(但不限於)泡鼓包裝、瓶子、管、袋、容器、瓶子及適用於所選調配物及預期投與及治療模式之任何包裝材料。
例如，該(等)容器包括如本文揭示之IL-15多肽或IL-15結合物中之一或多者，及視需要一或多種本文描述之醫藥賦形劑以促進IL-15多肽或IL-15結合物之遞送。此等套組另外視需要包括涉及其在本文描述之方法中之用途之識別描述或標籤或說明書。
套組通常包括列表內容物之標籤及/或使用說明書，及具有使用說明書之包裝內頁。一組說明書通常亦將包括於其中。
在一項實施例中，標籤係於容器上或與容器相關聯。在一項實施例中，當形成標籤之字母、數字或其他字元係經附著、模塑或蝕刻至容器本身內時，則標籤係於容器上，當標籤係存在於亦持有該容器之貯藏器或載劑內時，則標籤係與容器相關聯，例如，作為包裝內頁。在一項實施例中，標籤係用以指示內容物欲用於特定治療應用。該標籤亦指示使用該等內容物之用法說明書，諸如在本文描述之方法中。
在某些實施例中，醫藥組合物係呈現於包裝或分配器裝置中，包裝或分配器裝置含有一或多個含有本文提供之化合物之單位劑型。包裝例如含有金屬或塑膠薄片，諸如泡鼓包裝。在一項實施例中，該包裝或分配器裝置係附有針對投與之使用說明書。在一項實施例中，該包裝或分配器亦附有與呈由監管藥物之製造、使用或銷售之政府機構規定之形式之容器相關聯之通知，該通知反映經用於人類或獸醫投與之藥物之形式之機構批准。此通知例如係由美國食品及藥物管理局針對藥物批准之標籤，或經批准之產品內頁。在一項實施例中，含有本文提供之化合物調配於可相容之醫藥載劑中之組合物亦經製備，放置於適當之容器中，並針對治療經指示之病症進行標記。 特定術語
除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與本發明主張之標的所屬領域之技術者通常瞭解之含義相同之含義。應瞭解詳細說明係例示性及僅解釋性的且不限於本發明主張之任何標的。在本申請案中，除非另有明確規定，否則單數之用途包括複數。必須指出如本說明書中使用，除非內文另有明確指示，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個參考物。在本申請案中，除非另有規定，否則「或」之用途意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」及其他形式諸如「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(included)」係不受限制的。
儘管本發明之各種特徵可描述於單一實施例之內文中，但該等特徵亦可分別提供或以任何合適之組合提供。相反地，儘管為清晰起見，本發明可在本文中描述於不同實施例之內文中，但本發明亦可在單一實施例中實現。
本說明書中對「一些實施例」、「一實施例」、「一項實施例」或「其他實施例」之提及意謂與該等實施例相關描述之特定特徵、結構或特性係包括於本發明之至少一些實施例中，但不一定括於所有實施例中。
如本文使用，範圍及量可表示為「約」特定值或範圍。約亦包括精確量。因此「約5 µL」意謂「約5 µL」及亦「5 µL」。一般而言，術語「約」包括預期將於實驗誤差內之量。
本文使用之章節標題係僅用於組織目的且不應視為對本文描述之標的之限制。
如本文使用，術語「個體(individual)」、「個體(subject)」及「病患(patient)」意謂任何哺乳動物。在一些實施例中，該哺乳動物係人類。在一些實施例中，該哺乳動物係非人類。該等術語中無任何一者需要或限制於以衛生保健工作者(例如，醫生、註冊護士、從業護士、醫師助理、有序或善終工作者)之監督(例如，恆定或間歇)為特徵之情況。
如本文使用，關於受體結合之術語「顯著」及「顯著地」意謂足以影響IL-15多肽對靶受體之結合之變化。在一些實例中，該術語係指至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多之變化。在一些實例中，該術語意謂至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多倍之變化。
在一些實例中，關於一或多個細胞群體經由細胞介素傳訊複合物之活化之術語「顯著地」意謂足以活化該細胞群體之變化。在一些實例中，活化該細胞群體之變化係以受體傳訊效力來衡量。在此等實例中，可提供EC50值。在其他實例中，可提供ED50值。在另外實例中，可提供細胞介素之濃度或劑量。
如本文使用，術語「效力」係指產生目標效應所需之細胞介素(例如，IL-15多肽)之量。在一些實例中，術語「效力」係指活化靶細胞介素受體(例如，IL-15受體)所需之細胞介素(例如，IL-15多肽)之量。在其他實例中，術語「效力」係指活化靶細胞群體所需之細胞介素(例如，IL-15多肽)之量。在一些實例中，效力係以ED50 (有效劑量50)，或產生50%最大效應所需之劑量來衡量。在其他實例中，效力係以EC50 (有效濃度50)，或在50%群體中產生目標效應所需之劑量來衡量。
如本文使用，術語「腫瘤浸潤免疫細胞」係指已浸潤至包含腫瘤細胞之區域內(例如，在腫瘤微環境中)之免疫細胞。在一些實例中，該等腫瘤浸潤免疫細胞係與腫瘤細胞破壞、腫瘤細胞增殖之降低、腫瘤負荷之減小或其組合相關聯。在一些實例中，該等腫瘤浸潤免疫細胞包含腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。在一些實例中，該等腫瘤浸潤免疫細胞包含T細胞、B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞或嗜鹼性粒細胞。在一些實例中，該等腫瘤浸潤免疫細胞包含CD4+或CD8+ T細胞。實例
此等實例僅出於說明目的提供且不限制本文提供之申請專利範圍之範圍。 實例1.
經修飾之IL-15多肽之表現
經修飾之IL-16多肽係在37℃下生長，250 rpm並誘導5小時。培養基組分係如表2中闡述。 表2：
當表現培養物達成OD600 0.85至0.9時，該培養物係用NaMTP (以250 μM之最終濃度)、TPT3TP (以25 μM之最終濃度)及疊氮基-離胺酸(以15 mM之最終濃度)預先裝載。在預先裝載核糖核苷酸及胺基酸後約15至20分鐘，添加IPTG並使蛋白質表現約5小時。
包涵體
細胞集結粒一經收集，則進一步處理該等集結粒以用於包涵體。簡而言之，將1 L細胞集結粒重懸浮於10 ml裂解緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH 8.0；150 mM NaCl；1 mM DTT；及蛋白酶抑制劑(1個集結粒/50 ml))中。重懸浮後，用裂解緩衝液將1 L集結粒之體積增加至45 ml並運行通過微射流機2x次。然後將樣本轉移至50 ml離心管並在16k rpm下在4℃下離心20分鐘。接著，將該集結粒重懸浮於5 ml裂解緩衝液中並用裂解緩衝液將總體積增加至30 ml。將約10% Triton X-100添加至0.5 %之最終濃度。然後使該溶液在16k rpm下在4℃下離心20分鐘，及然後收集集結粒並用30 ml裂解緩衝液清洗3x次。使用具有針之5 ml注射器以每次清洗完全重懸浮。在最終旋轉後，廢棄上清液並快速冷凍該集結粒以在-80℃下儲存。
增溶及重折疊
將約5 ml增溶緩衝液添加至包涵體集結粒。重懸浮後，在增溶緩衝液中將該體積增加至30 ml。接著，在4℃下將該樣本培養30至60分鐘。然後，將該樣本轉移至2 x 50 ml離心管(15 ml/管)並向各管添加15 ml稀釋緩衝液。然後，使該樣本接著在4℃下在緩衝液A1中透析整夜，接著A2透析緩衝液，A3透析緩衝液，A4透析緩衝液及A5透析緩衝液。透析後，該樣本係在4000 rpm下在4℃下離心30分鐘並濃縮至約5 ml。
表3闡述增溶緩衝液。
純化
樣本首先係於具有1x PBS溶析緩衝液之GE HiLoad 16/600 Superdex 200 pg凝膠過濾管柱上，接著GE HiTrapQ陰離子交換管柱以移除游離之PEG，及然後逆相層析術以20管柱體積的30%至70%溶析緩衝液之梯度溶析來純化。
表4闡述用於陰離子交換層析術之緩衝液。表5闡述用於逆相層析術之緩衝液。 表4 表5
圖4顯示例示性陰離子交換層析術之運行。
圖5顯示例示性逆相層析術之運行。 實例2
針對用於識別具有天然或無IL-15Rα參與之聚乙二醇化IL-15化合物之基於細胞之篩選
使用IL-15/異源三聚體受體傳訊複合物(PDB:4GS7)之結構資料以引導nAA-聚乙二醇化位點之設計以保留與該異源三聚體受體之天然相互作用或具體言之消除IL-15及IL-15受體α亞單元(IL-15Rα)之相互作用。例示性IL-15結合物係經功能分析：S18、A23、T24、L25、Y26、E46、V49、L52、E53、N77、S83、E89、E90。該等IL-15結合物係於大腸桿菌中表現為包涵體，使用標準程序純化及重折疊，然後使用DBCO介導之無銅點擊化學位點特異性聚乙二醇化該IL-15產物以將穩定之共價mPEG部分結合至AzK。使用比色CTLL2增殖分析針對功能活性篩選IL-15結合物係。CTLL2係表現所有三個IL-15受體亞單元且需IL-2/IL-15用於生長之小鼠T細胞之子純系。進行初步實驗以測定最佳細胞密度、IL-15標準物或IL-15結合物之範圍以獲得充足之劑量-反應曲線及培養時間。將內部重組人類IL-15 (rHuIL-15)與市售IL-15標準物(R&D, catalog # 247-IL)比較。在規定條件下，市售IL-15標準物之EC50係約10.7 pM及內部rHuIL-15為9.7 pM。
表6顯示經設計用於保留與異源三聚體IL-15受體之天然相互作用之30 kDa直鏈聚乙二醇化IL-15結合物之EC50資料。括號間指示平均值中包括之值之數量。結果顯示相較於天然IL-15，與30 kDa PEG之生物結合不干擾在三聚體受體的效力且具有小於5倍減小之EC50。 表6
表7顯示經設計以特異性消除IL-15與IL-15受體α亞單元(IL-15Rα)之相互作用之30 kDa直鏈及40 kDa分支鏈聚乙二醇化IL-15結合物之EC50資料。括號間指示平均值中包括之值之數量。結果顯示相較於天然IL-15，與30 kDa PEG之生物結合減小在三聚體受體的效力。相較於rHuIL-15，直鏈PEG 30 kDa或分支鏈40 kDa PEG與V49之生物結合適度地減小對三聚體受體之效力(分別~6至8倍，814.4 pg/mL至1,029 pg/mL相較於124.62 pg/mL)。另外，相對於rHuIL-15，L25 PEG39之效力係更強力地減小(分別~54倍，6,827 pg/mL相較於124.62 pg/mL)。 表7
圖6闡述在CTLL2增殖分析中具有天然效力之例示性IL-15結合物之EC50值。將結果繪製為反應之百分率。
圖7闡述例示性IL-15結合物之EC50值。如此處顯示，位點特異性聚乙二醇化有助於活體外藥理學。將結果繪製為反應之百分率。
圖8闡述結合至不同PEG尺寸之例示性IL-15之EC50值。將結果繪製為反應之百分率。 實例3
聚乙二醇化IL-15與人類IL-15受體亞單元之生物化學相互作用
與人類IL-15受體亞單元相互作用之聚乙二醇化IL-15化合物之動力學係使用表面電漿子共振(SPR)在Biofizik (San Diego, CA)下量測。就此等研究而言，於經Biacore蛋白A塗佈之CM3或CM4感測器晶片之表面上捕獲人類IgG1 Fc-融合之IL-15 Rα (Sino Biological #18366-H02H, R&D # 7194-IR)及IL-2 Rβ (Sino Biological #10696-H02H)細胞外域。蛋白A係藉由胺偶合以約1500 RU之密度在CM3晶片上在25℃下偶合。使用4分鐘接觸時間，接著20分鐘等待時間，然後分析物注射捕獲約400 RU之IL15Rα-Fc融合體。注射物之間的表面之再生係使用100 mM磷酸進行達成。新鮮受體係在再生後各週期捕獲。此等表面係一式三份在25℃下探測。在典型實驗中，注射具有500 nM之最高濃度之10個劑量之分析物。在一些實例中，需要高濃度範圍及在其他實例中，更高之劑量係自分析中省略。
由於化合物對IL2Rβ之結合較弱，因此無需再生且在無再生步驟之情況下進行正交結合研究。使用原液於運行緩衝液中之1/100稀釋液之1至2分鐘接觸時間捕獲約600-700 RU之IL2Rβ Fc融合體。就測試化合物而言，注射具有1000 nM之最高濃度之10個劑量之分析物。原始資料係使用Scrubber2程式使用雙重參考程式分析，其中化合物信號係經修正至空白表面並將緩衝液注射至蛋白質表面。參見表8至10。 表8：rHuIL-15及IL-15聚乙二醇化化合物IL-15Rα亞單元表面之動力學參數。 表9：對IL-15Rα亞單元表面具有減少之結合之rHuIL-15及IL-15聚乙二醇化化合物之動力學參數。 表10：具有IL-2Rβ亞單元表面之rHuIL-15及IL-15聚乙二醇化化合物之動力學參數。
在含有固定化IL-15Rα、天然IL-15 (rHuIL-15及來自R&D之市售IL-15)之感測器表面上顯示快速結合及非常緩慢之解離動力學，證實非常高之親和力結合(圖9A)。經設計以延長半衰期而不阻斷與IL-15受體之相互作用之IL-15聚乙二醇化變體顯示與天然IL-15相似之結合動力學。在亞單元之化合物之間觀察到之KD 之適度之差異(就IL-15 N77PEG30及IL-15 S83PEG30而言，分別為~10-及~3倍減小之KD )係由於結合IL-15之化合物相對於rHuIL-15之結合率減小，預期自聚乙二醇化化合物之較低擴散係數及大PEG部分於遠處結合表面上之非特異性遮罩效應(圖9B)。相比之下，IL-15 E46PEG30以緩慢結合及緩慢解離與IL-15 Rα相互作用，而IL-15 E53PEG30由於PEG部分於IL-15Rα結合表面上之特異性定位顯示快結合及快解離(圖9C)。
含有固定化IL-2 Rβ之表面顯示與天然IL-15及經設計用於半衰期延長之具有天然受體參與之化合物相當之結合及解離反應。其中PEG部分係定位於IL-15Rα結合表面之化合物對IL-2Rβ表面顯示不同之結合動力學。儘管IL-15 E46PEG30及IL-15 L25PEG對此等表面顯示~10-及~30倍減小之結合，但IL-15 E53PEG30對IL-2Rβ保留「天然」結合。此等結果表明PEG部分之特異性定位可賦予IL-15與其受體相互作用之不同形式。
圖9A至圖9C顯示rHuIL-15 (結合至L-15Rα之IL-15結合化合物)之反應單元(RU，Y軸)相對於時間(s，X軸)。結合動力學分析證實位點特異性聚乙二醇化調節與IL-15Rα之相互作用。
圖10顯示rHuIL-15 (結合至IL-15Rα及IL-2Rβ之IL-15 N77PEG30)之反應單元(RU，Y軸)相對於時間(s，X軸)。結合動力學分析證實於位置N77之位點特異性聚乙二醇化保留與IL-15Rα及IL-2Rβ之天然相互作用。
圖11顯示rHuIL-15 (結合至IL-15Rα及IL-2Rβ之IL-15 E53PEG30)之反應單元(RU，Y軸)相對於時間(s，X軸)。結合動力學分析證實於位置E53之位點特異性聚乙二醇化減少結合至IL-15Rα同時保留與IL-2Rβ之天然相互作用。 實例4
IL-15 PEG結合物於原發性人類白細胞減少系統(LRS)衍生之PBMC樣本中之離體免疫反應曲線
為確定IL-15 PEG結合物之不同受體特異性如何影響原代免疫細胞子群體之活化，人類LRS衍生之外周血單核細胞(PBMC)樣本中之淋巴細胞活化之濃度-反應曲線係使用多色流動式細胞測量術進行。此等研究係於PrimityBio LLC (Fremont, CA)下進行。用rHuIL-15或不同IL-15聚乙二醇化化合物以5倍稀釋系列起始自30 µg/mL之最高濃度處理新鮮LRS衍生之樣本。在37℃下將經處理之細胞群體培養45分鐘，然後添加BD Lyse/Fix緩衝液並用表11中顯示之螢光抗體組染色。使用多色流動式細胞測量術以偵測及定量不同T細胞及NK細胞子集中之pSTAT5活化。以濃度-反應模式分析流動式細胞測量術資料之不同T及NK細胞子集之活化，在用rHuIL-15或IL-15聚乙二醇化化合物處理後，讀取pSTAT5聚集。 表11：用於LRS衍生之PBMC樣本之流動式細胞測量術研究之染色組
在NK及效應T細胞(CD3+ CD8+)群體中，相對於rHuIL-15，IL-15 N77PEG30及IL-15 S83PEG30保留效力，且針對pSTAT5產生之EC50值位於天然細胞介素之2倍內。相比之下，相較於rHuIL-15，IL-15 L25PEG30於CD8+ T及NK細胞群體中之pSTAT5誘導之EC50值係分別減小~14及~18倍。IL-15 L25PEG30之EC50 之大幅增加指示於此位置之IL-15之聚乙二醇化減小IL-15受體之促效作用。相較於rHuIL-15，IL-15 E53PEG30於CD8+ T及NK細胞群體中之pSTAT5誘導之EC50值係僅減小~2倍。考慮到此化合物顯示對IL-15Rα之快結合及快解離結合動力學。
表12顯示STAT5傳訊(EC50 )在用rHuIL-15或IL-15結合物處理之人類LRS樣本中之劑量反應。
圖12A至圖12D闡述一經以例示性IL-15 PEG結合物刺激即於NK及CD8+ T細胞上之STAT5磷酸化。 實例5
例示性IL-15結合物之活體內藥理學研究
天然(E3826-U1821) C57BL/6小鼠中之PK研究
以0.3 mg/Kg對小鼠投予rHuIL-15及IL-15結合物S83-PEG 30kDa、V49-PEG 30kDa、L25-PEG 30kDa或N77-PEG 30kDa。在下列時間點下抽血：0.25、0.5、2、8、24、48、72、96,120、144及192小時。
表13顯示實驗裝置。各小鼠接受單一IV劑量的媒劑、rHuIL-15或三種IL-15結合物中之一者。
rHuIL-15、IL-15聚乙二醇化化合物及源自血漿之樣本中之內部標準物之濃度係使用ELISA分析測定。PK資料分析係於NW Solutions (Seattle, WA)進行。將PK資料導入Phoenix WinNonlin v6.4 (Certara/Pharsight, Princeton, NJ)內用於分析。組平均血漿濃度相對於時間資料係用3隔室方法使用IV推注投與模型進行分析。
表14顯示相對於rHuIL-15，IL-15結合物在小鼠中之延長之半衰期。
圖13顯示rHuIL-15、IL-15 S83PEG30、IL-15 V49PEG30、IL-15 N77PEG30及IL-15 L25 PEG30在0.3 mg/kg下之血漿濃度曲線。
如預期，相對於rHuIL-15，聚乙二醇化化合物顯示絕佳之PK曲線，如表14中匯總。MRT (平均滯留時間)表示測試物件分子留在體內之平均時間並考慮整個PK曲線。相較於rHuIL-15，聚乙二醇化化合物顯示MRT之~5倍增加。相較於rHuIL-15，IL-15 S18PEG30證實~15倍延長之β t1/2 (15.8 h相比於1.08 h)及約59倍減小之CL2 (5.68相比於333 mL/h/Kg)。聚乙二醇化化合物之分佈體積相對於rHuIL_15減小，此表明聚乙二醇化化合物係主要分佈於體循環內。 實例6
外周血室中之藥效動力學觀察結果
天然(E3826-U1821) C57BL/6小鼠中之PD研究
以0.1、0.3或1 mg/Kg對小鼠投予rHuIL-15、IL-15結合物S18-PEG 30kDa、IL-15結合物V49-PEG 30kDa或IL-15結合物S83-PEG 30kDa (表10)。在下列時間點下抽血：0.25、0.5、2、8、24、48、72、96、120、144及192小時。考慮到已知短半衰期，針對rHuIL-15包括另外0.13時間點。PD資料解析包括針對所有時間點之細胞內pSTAT5監測，及CD8+ T細胞之表現型分析。
表15顯示實驗裝置。各小鼠接受單一IV劑量的媒劑、rHuIL-15或三種IL-15結合物中之一者。
細胞增殖(早起分子標誌物Ki-67及細胞計數)之STAT5磷酸化及誘導係用作藥效動力學資料解析以評估IL-15 S18PEG30、IL-15 V49PEG30及IL-15 L25 PEG30之藥理學曲線。儘管在投予聚乙二醇化化合物之小鼠中可見pSTAT5之較低或相似之評估，但STAT5磷酸化轉化為NK細胞及CD8+效應及記憶T細胞之較高增殖並持續(投藥後第1至7天)但非Treg細胞。(圖14至17)。
圖14A至圖14D顯示不同外周血細胞群體中之% pSTAT5。
圖15A至圖15D顯示早期增殖分析標誌物Ki67於CD8+ T、CD8+ Tmem及NK細胞但非Treg細胞中在投予聚乙二醇化化合物之小鼠中之增加之表現。
圖16A至圖16C顯示在投予聚乙二醇化化合物之小鼠中之強健外周CD8+ T、CD8+ Tmem及NK細胞但非Treg細胞。
圖17A至圖17B顯示在小鼠中隨著IL-15 L25PEG30化合物之劑量增加，CD8+ T及NK細胞中之Ki67表現增加。
儘管本文已顯示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應明瞭此等實施例係僅藉助於實例提供。在不背離本發明之情況下，熟習此項技術者現將想到許多變更、變化及替代。應瞭解可採用對本文描述之本發明之實施例之各種替代以實踐本發明。下列申請專利範圍旨在定義本發明之範圍且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範圍內之方法及結構。
本發明之各種態樣係以特殊性闡述於隨附申請專利範圍中。對本發明之特徵及優點之較佳瞭解將藉由參考闡述說明性實施例之下列詳細說明獲得，其中利用本發明之原理，及本發明之隨附圖式：
圖1闡述例示性非天然胺基酸。此圖係改編自Young等人，「Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon」，J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010)之圖2；
圖2A至圖2B闡述例示性非天然胺基酸。圖2A闡述例示性離胺酸衍生物。圖2B闡述例示性苯丙胺酸衍生物。
圖3A至圖3D闡述例示性非天然胺基酸。此等非天然胺基酸(UAA)已經基因編碼於蛋白質中(圖3A：UAA #1-42；圖3B：UAA # 43-89；圖3C：UAA # 90-128；圖3D – UAA # 129-167)。圖3A至圖3D係獲取自Dumas等人，Chemical Science 2015, 6, 50-69之表1。
圖4闡述陰離子交換層析術之圖；
圖5闡述逆相層析術之圖。
圖6闡述在CTLL2增殖分析中具有天然效力之例示性IL-15結合物之EC50值。將結果繪製為反應之百分率。
圖7闡述在CTLL2增殖分析中具有減小之效力之例示性IL-15結合物之EC50值。如此處顯示，位點特異性聚乙二醇化有助於活體外藥理學。將結果繪製為反應之百分率。
圖8闡述結合至不同PEG尺寸之例示性IL-15之EC50值。將結果繪製為反應之百分率。
圖9A至圖9C顯示rHuIL-15 (結合至IL-15Rα之IL-15結合化合物)之反應單元(RU，Y軸)相對於時間(s，X軸)。圖9A：rHuIL-15；圖9B：IL15結合物N77PEG30及S83PEG30；及圖9C：IL15結合物E46PEG30及E53PEG30。
圖10顯示rHuIL-15 (結合至IL-15Rα及IL-2Rβ之IL-15 N77PEG30)之反應單元(RU，Y軸)相對於時間(s，X軸)。
圖11顯示rHuIL-15 (結合至IL-15Rα及IL-2Rβ之IL-15 E53PEG30)之反應單元(RU，Y軸)相對於時間(s，X軸)。
圖12A至圖12D闡述一經用例示性IL-15 PEG結合物刺激後即於NK及CD8+ T細胞上發生STAT5磷酸化。圖12A及圖12C：半衰期延長(S83PEG30及N77PEG30)；圖12B及圖12D：與IL-15Rα (V49PEG30、E53PEG30及L25PEG30)之經調節之相互作用。
圖13顯示rHuIL-15、IL-15 S83PEG30、IL-15 V49PEG30 IL-15 L25 PEG30及IL-15 N77 PEG30在0.3 mg/kg下之血漿濃度曲線。
圖14A至圖14D顯示在投予rHuIL-15或聚乙二醇化化合物之小鼠中，STAT5磷酸化於CD8+ T細胞(圖14A)、CD8記憶細胞(圖14B)、NK細胞(圖14C)及Treg細胞(圖14D)中之百分率。
圖15A至圖15D顯示在投予聚乙二醇化化合物之小鼠中，早期增殖分子標誌物Ki67於CD8+ T (圖15A)、NK細胞(圖15B)、CD8+ Tmem (圖15C)但非Treg細胞(圖15D)中之表現增加。
圖16A至圖16C顯示CD8+ T細胞(圖16A)、NK細胞(圖16B)及CD8記憶T細胞(圖16C)之增殖之誘導。
圖17A至圖17B顯示在小鼠中，隨著IL-15 L25PEG30化合物之劑量增加，NK細胞(圖17A)及CD8+ T (圖17B)中之Ki67表現增加。
<110> 美商新爍克斯公司(Synthorx.Inc.)
<120> IL-15結合物及其用途
<130> 46085-713.601
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<141> 2019-02-26
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<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 108106584-A0305-02-0148-1
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 108106584-A0305-02-0148-3
Figure 108106584-A0305-02-0149-4
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 除Pro外之任何胺基酸
<400> 3
Figure 108106584-A0305-02-0149-5
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 4
Figure 108106584-A0305-02-0149-6
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成肽
<400> 5
Figure 108106584-A0305-02-0150-7

Claims (46)

  1. 一種經修飾之介白素15(IL-15)多肽，其包含至少一個非天然胺基酸及共價結合至該至少一個非天然胺基酸之結合部分，其中該結合部分包含水溶性聚合物；其中該至少一個非天然胺基酸包含疊氮基；其中該經修飾之IL-15多肽包含與SEQ ID NO：1之至少80%序列一致性；且其中：(a)該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自L25、N77、V49及S83，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO：1中所述之位置，且其中該至少一個非天然胺基酸係位於該多肽上提高半衰期之一位置，其中該提高之半衰期係與野生型IL-15蛋白之半衰期比較；或(b)該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自L25、E46及E53，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO：1中所述之位置，且其中該至少一個非天然胺基酸係位於該多肽上之一位置，其減小該經修飾之IL-15多肽與介白素15受體α(IL-15Rα)之間的結合但保留與介白素15受體βγ(IL-15Rβγ)傳訊複合物之顯著結合以形成IL-15/IL-15Rβγ複合物，其中對IL-15Rα之該減小之結合係與在野生型IL-15多肽與IL-15Rα之間的結合比較。
  2. 如請求項1之經修飾之IL-15多肽，其中一個胺基酸被至少一個非天然胺基酸置換。
  3. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該經修飾之IL-15多肽包含與SEQ ID NO：1之至少90%序列一致性。
  4. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自L25、N77、V49及S83，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO：1中所述之位置，且其中該至少一個非天然胺基酸係位於該多肽上提高半衰期之一位置，其中該提高之半衰期係與野生型IL-15蛋白之半衰期比較。
  5. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該至少一個非天然胺基酸之殘基位置係選自L25、E46及E53，其中該等殘基位置對應於如SEQ ID NO：1中所述之位置，且其中該至少一個非天然胺基酸係位於該多肽上之一位置，其減小該經修飾之IL-15多肽與介白素15受體α(IL-15Rα)之間的結合但保留與介白素15受體βγ(IL-15Rβγ)傳訊複合物之顯著結合以形成IL-15/IL-15Rβγ複合物，其中對IL-15Rα之該減小之結合係與在野生型IL-15多肽與IL-15Rα之間的結合比較。
  6. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該至少一個非天然胺基酸：係離胺酸類似物；或包含芳族側鏈。
  7. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該至少一個非天然胺基酸 包含N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)、對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)或對疊氮基-L-苯丙胺酸。
  8. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該水溶性聚合物包含聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧乙化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)或其組合。
  9. 如請求項8之經修飾之IL-15多肽，其中該水溶性聚合物包含PEG。
  10. 如請求項8之經修飾之IL-15多肽，其中該PEG係直鏈PEG。
  11. 如請求項9之經修飾之IL-15多肽，其中該PEG具有自20kDa至85kDa之重量平均分子量。
  12. 如請求項11之經修飾之IL-15多肽，其中該PEG具有20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa之重量平均分子量。
  13. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該結合部分係通過連接子結合至該經修飾之IL-15多肽之至少一個非天然胺基酸。
  14. 如請求項13之經修飾之IL-15多肽，其中該連接子包含同雙官能連接 子、異雙官能連接子、可裂解或非可裂解二肽連接子、間隔基團或其組合。
  15. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中經修飾之IL-15多肽包含自該N端刪除前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基之N端刪除，其中該等殘基位置係參考SEQ ID NO：1中之位置。
  16. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該經修飾之IL-15多肽可擴增CD8+效應初始細胞、CD8+效應記憶細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T(NKT)細胞群體或其組合。
  17. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該結合部分或該至少一個非天然胺基酸損害或阻斷該經修飾之IL-15多肽與IL-15Rα之結合。
  18. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該經修飾之IL-15多肽之提高之半衰期係至少90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、48小時、3天、4天、5天、6天、7天或長於野生型IL-15多肽之血漿半衰期。
  19. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中該經修飾之IL-15多肽之提高之半衰期係90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小 時、48小時、3天、4天、5天、6天或7天。
  20. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中相對於野生型IL-15多肽，經由藉由經修飾之IL-15多肽所形成之IL-15Rβγ複合物活化CD8+效應初始細胞、CD8+效應記憶細胞、自然殺手(NK)細胞或自然殺手T(NKT)細胞群體會保留該細胞群體之顯著活化效力。
  21. 如請求項20之經修飾之IL-15多肽，其中該經修飾之IL-15多肽對該IL-15Rβγ複合物之受體傳訊效力係低於野生型IL-15多肽對該IL-15Rβγ複合物之受體傳訊效力。
  22. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中相對於野生型IL-15多肽，該經修飾之IL-15多肽具有對IL-15Rβ之減小之結合親和力。
  23. 如請求項1或2之經修飾之IL-15多肽，其中相對於野生型IL-15多肽，該經修飾之IL-15多肽具有對IL-15Rγ之減小之結合親和力。
  24. 一種醫藥組合物，其包含：如請求項1至23中任一項之經修飾之IL-15多肽；及醫藥上可接受之賦形劑。
  25. 如請求項24之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係經調配用於非經腸投與。
  26. 一種如請求項1至23中任一項之經修飾之IL-15多肽之用途，其供製造用於治療有此需要之個體之增殖性疾病或病症之藥劑。
  27. 如請求項26之用途，其中該增殖性疾病或病症係癌症。
  28. 如請求項27之用途，其中該癌症係實性瘤癌症。
  29. 如請求項28之用途，其中該實性瘤癌症係膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。
  30. 如請求項27之用途，其中該癌症係血液學惡性腫瘤。
  31. 如請求項30之用途，其中該血液學惡性腫瘤係慢性淋巴細胞白血病(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、多發性骨髓瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結邊緣區B細胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、非伯奇氏高級別B細胞淋巴瘤(non-Burkitt high grade B cell lymphoma)、原發性縱膈B細胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋 巴瘤、原發性積液淋巴瘤或淋巴瘤樣肉芽腫。
  32. 如請求項26至31中任一項之用途，其中該藥劑係用於與另外治療劑組合投與。
  33. 如請求項32之用途，其中該藥劑係用於與該另外治療劑同時投與。
  34. 如請求項32之用途，其中該藥劑係用於與該另外治療劑依序投與。
  35. 如請求項34之用途，其中該藥劑係用於在投與該另外治療劑之前投與。
  36. 如請求項34之用途，其中該藥劑係用於在投與該另外治療劑之後投與。
  37. 如請求項26至31中任一項之用途，其中該個體係人類。
  38. 一種活體外或離體擴增效應T(Teff)細胞、T記憶細胞及自然殺手(NK)細胞群體之方法，其包括：使細胞與如請求項1至23中任一項之經修飾之IL-15多肽接觸；及使該經修飾之IL-15多肽與IL-15Rβ及IL-15Rγ亞單元相互作用以形成IL-15/IL-15Rβγ複合物；其中相對於野生型IL-15多肽，該經修飾之IL-15多肽對IL-15Rα亞單 元具有減小之親和力，且其中該IL-15/IL-15Rβγ複合物刺激Teff、T記憶及NK細胞之擴增。
  39. 如請求項38之方法，其中該細胞係真核細胞。
  40. 如請求項38之方法，其中該細胞係哺乳動物細胞。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，其中該細胞係人類細胞。
  42. 如請求項38至40中任一項之方法，其中相對於野生型IL-15多肽，該減小之親和力係對IL-15Rα之結合親和力之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%減小。
  43. 如請求項38至40中任一項之方法，其中相對於野生型IL-15多肽，對IL-15Rα之該減小之親和力係1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
  44. 如請求項38至40中任一項之方法，其中該結合部分損害或阻斷該經修飾之IL-15多肽與IL-15Rα之結合。
  45. 一種套組，其包含如請求項1至23中任一項之經修飾之IL-15多肽。
  46. 一種套組，其包含編碼如請求項1至23中任一項之經修飾之IL-15多 肽之多核苷酸。
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