RU2815891C2

RU2815891C2 - Конъюгаты интерлейкина 10 и варианты их применения

Info

Publication number: RU2815891C2
Application number: RU2021115678A
Authority: RU
Inventors: Каролина Е. КАФФАРО; Джерод Птацин; Маркос МИЛЛА
Original assignee: Синторкс, Инк.
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2024-03-25

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгатам интерлейкина 10 (IL-10), и может быть использовано в медицине для лечения рака. Предложен модифицированный полипептид IL-10, содержащий в аминокислотном положении, которое соответствует аминокислотному положению, выбранному из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130 и Q132, указанному в SEQ ID NO: 1, азид - производное лизина, связанное с конъюгируемым фрагментом, который представляет собой растворимый в воде полимер, липид, белок или пептид. Изобретение обеспечивает получение модифицированного IL-10 с улучшенными терапевтическими характеристиками, а именно способного стимулировать провоспалительную активность с одновременным проявлением противоопухолевых эффектов. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 2 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА

[1] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/757690, поданной 8 ноября 2018 года, и предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/911036, поданной 4 октября 2019 года, обе из которых тем самым выключены в данный документе посредством ссылки в полном своем объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[2] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и тем самым выключен в данный документе посредством ссылки в полном своем объеме. Указанная копия ASCII, созданная 4 ноября 2019 года, имеет название 46085-727_851_SL.txt, и ее размер составляет 4157 байт.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[3] Отдельные популяции Т-клеток модулируют иммунную систему для поддержания иммунного гомеостаза и толерантности. Например, регуляторные Т-клетки (Treg) предупреждают неадекватные ответы иммунной системы за счет предупреждения патологической аутореактивности, в то время как цитотоксические Т-клетки нацеливаются на инфицированные клетки и/или раковые клетки и разрушают их. В некоторых случаях модуляция различных популяций Т-клеток обеспечивает возможность осуществления лечения, проводимого в отношении заболевания или по показанию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[4] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты конъюгаты интерлейкина 10 (IL-10) и варианты их применения в лечении, проводимом по одному или нескольким показаниям. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты конъюгаты IL-10 для лечения рака. В дополнительных случаях в данном документе раскрыты фармацевтические композиции и наборы, которые содержат конъюгат IL-10, описанный в данном документе.

[5] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты модифицированные полипептиды интерлейкина 10 (IL-10), содержащие аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, связанную с по меньшей мере одним конъюгируемым фрагментом, где аминокислотная последовательность является на 99,0% идентичной аминокислотам 33-158 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность является на по меньшей мере 95,0% идентичной аминокислотам 1-160 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность является на по меньшей мере 97,0% идентичной аминокислотам 1-160 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность является на по меньшей мере 98,0% идентичной аминокислотам 1-160 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит 13 аминокислотных остатков лизина. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота расположена в аминокислотном положении, выбранном из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130 или Q132 в пределах SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79 или N82, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79 и 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K88, K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q70, E74, N82, K88, N126, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 70, 74, 82, 88, 126, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к N-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны N-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к C-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны С-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота a) представляет собой аналог лизина; b) содержит ароматическую боковую цепь; c) содержит азидогруппу; d) содержит алкиновую группу или e) содержит альдегидную или кетоновую группу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота не содержит ароматическую боковую цепь. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборненлизин, TCO-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, O-аллилтирозин, O-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту или селеноцистеин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-10 с помощью ортогональной пары tRNA-синтетаза/tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA из ортогональной пары синтетаза/tRNA содержит по меньшей мере одно не встречающееся в природе нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется со вторым модифицированным полипептидом IL-10 с образованием тем самым димера IL-10, содержащего две не встречающиеся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота модифицированного полипептида IL-10 расположена в положении остатка, которое отличается от положения не встречающейся в природе аминокислоты второго модифицированного полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления обе не встречающиеся в природе аминокислоты расположены в одном и том же положении остатка в соответствующих полипептидах IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер, липид, белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает молекулу полиэтиленгликоля (PEG). В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгилколя и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный многоатомный спирт), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает молекулу PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полисахарид. В некоторых вариантах осуществления полисахарид предусматривает декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления липид предусматривает жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота содержит от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает альбумин, трансферрин или транстиретин. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты предусматривают Fc-часть антитела. В некоторых вариантах осуществления пептид предусматривает пептид XTEN, богатый глицином гомоаминокислотный полимер (HAP), полипептид PAS, подобный эластину полипептид (ELP), пептид CTP или полимер на основе желатиноподобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой модифицированного IL-10 с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 представляет собой a) функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-10; b) рекомбинантный полипептид IL-10 или c) рекомбинантный полипептид человеческого IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию, С-концевую делецию или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления N-концевая делеция предусматривает делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, или 30 остатков со стороны N-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления С-концевая делеция предусматривает делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков со стороны С-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 характеризуется приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 связывается с IL-10R с образованием комплекса IL-10/IL-10R. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет приблизительно 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты по сути не влияет на димеризацию полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не влияет на связывание димера IL-10 с IL-10R. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не нарушает передачу сигнала IL-10R, что определяется способностью клетки фосфорилировать Stat3 и/или активировать передачу сигнала IL-10R. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 является выделенным и очищенным. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 составлен в виде фармацевтического состава, содержащего фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав составлен для системной доставки.

[6] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты модифицированные гомодимеры IL-10, содержащие два модифицированных полипептида IL-10 по п. 1.

[7] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты композиции, содержащие комплекс модифицированного гомодимера по настоящему изобретению, связанного с рецептором IL-10 (IL-10R).

[8] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты способы лечения пролиферативного заболевания или состояния у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающие введение субъекту терапевтически эффективного количества модифицированного полипептида IL-10 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак в виде солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак в виде солидной опухоли представляет собой рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы.

[9] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированный полипептид IL-10 по настоящему изобретению.

[10] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

[11] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт выделенный и модифицированный полипептид интерлейкина 10 (IL-10), содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту в определенном положении в полипептиде, которая обеспечивает увеличение периода полужизни в плазме крови без существенного изменения взаимодействия с рецептором IL-10, где увеличенный период полужизни в плазме крови сравнивают с периодом полужизни белка IL-10 дикого типа в плазме крови. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в экспонированном на поверхности местоположении в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79 или N82, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79 и 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K88, K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q70, E74, N82, K88, N126, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 70, 74, 82, 88, 126, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность является на по меньшей мере или на приблизительно 99,0% идентичной аминокислотам 33-158 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков лизина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в одном или нескольких из K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 of K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к N-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны N-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к C-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны С-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота a) представляет собой аналог лизина; b) содержит ароматическую боковую цепь; c) содержит азидогруппу; d) содержит алкиновую группу или e) содержит альдегидную или кетоновую группу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота не содержит ароматическую боковую цепь. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборненлизин, TCO-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, O-аллилтирозин, O-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту или селеноцистеин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-10 с помощью ортогональной пары tRNA-синтетаза/tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA из ортогональной пары синтетаза/tRNA содержит по меньшей мере одно не встречающееся в природе нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется со вторым модифицированным полипептидом IL-10 с образованием тем самым димера IL-10, содержащего две не встречающиеся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота модифицированного полипептида IL-10 расположена в положении остатка, которое отличается от положения не встречающейся в природе аминокислоты второго модифицированного полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления обе не встречающиеся в природе аминокислоты расположены в одном и том же положении остатка в соответствующих полипептидах IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 ковалентно присоединен к конъюгируемому фрагменту с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер, липид, белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгилколя и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный многоатомный спирт), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает молекулу PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полисахарид. В некоторых вариантах осуществления полисахарид предусматривает декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления липид предусматривает жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота содержит от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает альбумин, трансферрин или транстиретин. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты предусматривают Fc-часть антитела. В некоторых вариантах осуществления пептид предусматривает пептид XTEN, богатый глицином гомоаминокислотный полимер (HAP), полипептид PAS, подобный эластину полипептид (ELP), пептид CTP или полимер на основе желатиноподобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой модифицированного IL-10 с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 представляет собой a) функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-10; b) рекомбинантный полипептид IL-10 или c) рекомбинантный полипептид человеческого IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию, С-концевую делецию или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления N-концевая делеция предусматривает делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, или 30 остатков со стороны N-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления С-концевая делеция предусматривает делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков со стороны С-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 характеризуется приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 связывается с IL-10R с образованием комплекса IL-10/IL-10R. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет приблизительно 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты по сути не влияет на димеризацию полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не влияет на связывание димера IL-10 с IL-10R. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не нарушает передачу сигнала IL-10R, что определяется способностью клетки фосфорилировать Stat3 и/или активировать передачу сигнала IL-10R.

[12] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыто положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты, выбранное из N82, K88, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 88, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82 или N129, где положения остатков соответствуют положениям 82 и 129, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, где положения остатков соответствуют положениям 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N129, где положения остатков соответствуют положениям 129, указанным в SEQ ID NO: 1.

[13] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыта по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота, предусматривающая N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[14] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыто положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты, выбранное из N82, K88, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 88, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82 или N129, где положения остатков соответствуют положениям 82 и 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, где положения остатков соответствуют положениям 82, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N129, где положения остатков соответствуют положениям 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[15] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыто положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты, выбранное из N82, N129 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, N129 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 82, 129, 132, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[16] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыто положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты, выбранное из N82 или N129, где положения остатков соответствуют положениям 82 и 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82 или N129, где положения остатков соответствуют положениям 82 и 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82 или N129, где положения остатков соответствуют положениям 82 и 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82 или N129, где положения остатков соответствуют положениям 82 и 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82 или N129, где положения остатков соответствуют положениям 82 и 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[17] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыто положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты, выбранное из N82, где положения остатков соответствуют положениям 82, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, где положения остатков соответствуют положениям 82, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, где положения остатков соответствуют положениям 82, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, где положения остатков соответствуют положениям 82, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82, где положения остатков соответствуют положениям 82, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[18] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыто положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты, выбранное из N129, где положения остатков соответствуют положениям 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N129, где положения остатков соответствуют положениям 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK). В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N129, где положения остатков соответствуют положениям 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N129, где положения остатков соответствуют положениям 129, указанным в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[19] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт модифицированный полипептид IL-10, ковалентно присоединенный к конъюгируемому фрагменту с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер, липид, белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгилколя и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный многоатомный спирт), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию.

[20] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт модифицированный полипептид IL-10, ковалентно присоединенный к молекуле PEG с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления средневесовая молекулярная масса PEG составляет от приблизительно 100 дальтон до приблизительно 150000 дальтон. Иллюстративные диапазоны включают, например, значения средневесовой молекулярной массы в диапазоне от более чем 5000 дальтон до приблизительно 100000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 6000 дальтон до приблизительно 90000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 10000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от более чем 10000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 20000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 53000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 25000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 29000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 35000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон и в диапазоне от приблизительно 40000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон. Иллюстративные значения средневесовой молекулярной массы для PEG включают приблизительно 100 дальтон, приблизительно 200 дальтон, приблизительно 300 дальтон, приблизительно 400 дальтон, приблизительно 500 дальтон, приблизительно 600 дальтон, приблизительно 700 дальтон, приблизительно 750 дальтон, приблизительно 800 дальтон, приблизительно 900 дальтон, приблизительно 1000 дальтон, приблизительно 1500 дальтон, приблизительно 2000 дальтон, приблизительно 2200 дальтон, приблизительно 2500 дальтон, приблизительно 3000 дальтон, приблизительно 4000 дальтон, приблизительно 4400 дальтон, приблизительно 4500 дальтон, приблизительно 5000 дальтон, приблизительно 5500 дальтон, приблизительно 6000 дальтон, приблизительно 7000 дальтон, приблизительно 7500 дальтон, приблизительно 8000 дальтон, приблизительно 9000 дальтон, приблизительно 10000 дальтон, приблизительно 11000 дальтон, приблизительно 12000 дальтон, приблизительно 13000 дальтон, приблизительно 14000 дальтон, приблизительно 15000 дальтон, приблизительно 20000 дальтон, приблизительно 22500 дальтон, приблизительно 25000 дальтон, приблизительно 30000 дальтон, приблизительно 35000 дальтон, приблизительно 40000 дальтон, приблизительно 45000 дальтон, приблизительно 50000 дальтон, приблизительно 55000 дальтон, приблизительно 60000 дальтон, приблизительно 65000 дальтон, приблизительно 70000 дальтон и приблизительно 75000 дальтон. Также могут применяться разветвленные версии PEG (например, разветвленный PEG 40000 дальтон, состоящий из двух полимеров по 20000 дальтон), имеющие суммарную молекулярную массу любого из упомянутых выше. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 7500 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 8000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 9000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 10000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 11000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 12000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 13000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 14000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 15000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 16000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 17000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 18000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 19000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 20000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 21000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 22000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 23000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 25000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 30000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 50000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 60000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 70000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 80000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 90000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 100000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 120000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 130000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 140000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 150000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 175000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно 200000 дальтон.

[21] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт модифицированный полипептид IL-10, ковалентно присоединенный к моносахариду или полисахариду. В определенных вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 ковалентно присоединен к моносахариду. В определенных вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 ковалентно присоединен к полисахариду. В определенных вариантах осуществления моносахарид или полисахарид связаны с полипептидом IL-10 с помощью линкера через цистеиновый или аспарагиновый остаток в полипептиде. В определенных вариантах осуществления моносахарид или полисахарид связаны с полипептидом IL-10 с помощью линкера через цистеиновый остаток в полипептиде. В определенных вариантах осуществления моносахарид или полисахарид связаны с полипептидом IL-10 с помощью линкера через аспарагиновый остаток в полипептиде.

[22] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт модифицированный полипептид IL-10, ковалентно присоединенный к молекуле PEG с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты и ковалентно присоединенный к моносахариду или полисахариду с помощью другой аминокислоты в полипептиде. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. В определенных вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 ковалентно присоединен к молекуле PEG с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты и ковалентно присоединен к моносахариду с помощью другой аминокислоты в полипептиде. В определенных вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 ковалентно присоединен к молекуле PEG с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты и ковалентно присоединен к полисахариду с помощью другой аминокислоты в полипептиде. В определенных вариантах осуществления моносахарид или полисахарид связаны с полипептидом IL-10 с помощью линкера через цистеиновый или аспарагиновый остаток в полипептиде. В определенных вариантах осуществления моносахарид или полисахарид связаны с полипептидом IL-10 с помощью линкера через цистеиновый остаток в полипептиде. В определенных вариантах осуществления моносахарид или полисахарид связаны с полипептидом IL-10 с помощью линкера через аспарагиновый остаток в полипептиде.

[23] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт выделенный и модифицированный полипептид интерлейкина 10 (IL-10), содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, где выделенный и модифицированный полипептид IL-10 представляет собой биологически активный полипептид IL-10, который связывается с рецептором IL-10 (IL-10R) с образованием комплекса IL-10/IL-10R. В некоторых вариантах осуществления биологически активный полипептид IL-10 характеризуется существенно увеличенным периодом полужизни в плазме крови по сравнению с периодом полужизни белка IL-10 дикого типа в плазме крови. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в экспонированном на поверхности местоположении в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79 или N82, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79 и 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K88, K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q70, E74, N82, K88, N126, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 70, 74, 82, 88, 126, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность является на по меньшей мере или на приблизительно 99,0% идентичной аминокислотам 33-158 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков лизина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в одном или нескольких из K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 of K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к N-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны N-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к C-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны С-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота a) представляет собой аналог лизина; b) содержит ароматическую боковую цепь; c) содержит азидогруппу; d) содержит алкиновую группу или e) содержит альдегидную или кетоновую группу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота не содержит ароматическую боковую цепь. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборненлизин, TCO-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, O-аллилтирозин, O-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту или селеноцистеин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-10 с помощью ортогональной пары tRNA-синтетаза/tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA из ортогональной пары синтетаза/tRNA содержит по меньшей мере одно не встречающееся в природе нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется со вторым модифицированным полипептидом IL-10 с образованием тем самым димера IL-10, содержащего две не встречающиеся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота модифицированного полипептида IL-10 расположена в положении остатка, которое отличается от положения не встречающейся в природе аминокислоты второго модифицированного полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления обе не встречающиеся в природе аминокислоты расположены в одном и том же положении остатка в соответствующих полипептидах IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 ковалентно присоединен к конъюгируемому фрагменту с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер, липид, белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгилколя и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный многоатомный спирт), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает молекулу PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полисахарид. В некоторых вариантах осуществления полисахарид предусматривает декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления липид предусматривает жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота содержит от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает альбумин, трансферрин или транстиретин. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты предусматривают Fc-часть антитела. В некоторых вариантах осуществления пептид предусматривает пептид XTEN, богатый глицином гомоаминокислотный полимер (HAP), полипептид PAS, подобный эластину полипептид (ELP), пептид CTP или полимер на основе желатиноподобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой модифицированного IL-10 с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 представляет собой a) функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-10; b) рекомбинантный полипептид IL-10 или c) рекомбинантный полипептид человеческого IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию, С-концевую делецию или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления N-концевая делеция предусматривает делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, или 30 остатков со стороны N-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления С-концевая делеция предусматривает делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков со стороны С-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 характеризуется приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 связывается с IL-10R с образованием комплекса IL-10/IL-10R. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет приблизительно 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты по сути не влияет на димеризацию полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не влияет на связывание димера IL-10 с IL-10R. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не нарушает передачу сигнала IL-10R.

[24] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт выделенный и модифицированный полипептид интерлейкина 10 (IL-10), содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту в определенном положении в полипептиде, которая усиливает воздействие на совокупность опухолевых клеток инфильтрирующих опухоль иммунных клеток, где усиленное воздействие на совокупность опухолевых клеток сравнивают с воздействием на совокупность опухолевых клеток в присутствии белка IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления также в данном документе описан выделенный и модифицированный полипептид интерлейкина 10 (IL-10), содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту в определенном положении в полипептиде, которая усиливает и/или поддерживает цитотоксичность и/или клональное размножение инфильтрирующих опухоль иммунных клеток, где усиленные цитотоксичность и клональное размножение сравнивают с воздействием инфильтрирующих опухоль иммунных клеток, обусловленным равной дозой белка IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в экспонированном на поверхности местоположении в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79 или N82, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79 и 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K88, K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q70, E74, N82, K88, N126, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 70, 74, 82, 88, 126, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность является на по меньшей мере или на приблизительно 99,0% идентичной аминокислотам 33-158 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, или 13 остатков лизина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в одном или нескольких из K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 из K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты расположено проксимально по отношению к N-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны N-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к C-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны С-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота a) представляет собой аналог лизина; b) содержит ароматическую боковую цепь; c) содержит азидогруппу; d) содержит алкиновую группу или e) содержит альдегидную или кетоновую группу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота не содержит ароматическую боковую цепь. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборненлизин, TCO-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, O-аллилтирозин, O-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту или селеноцистеин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-10 с помощью ортогональной пары tRNA-синтетаза/tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA из ортогональной пары синтетаза/tRNA содержит по меньшей мере одно не встречающееся в природе нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется со вторым модифицированным полипептидом IL-10 с образованием тем самым димера IL-10, содержащего две не встречающиеся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота модифицированного полипептида IL-10 расположена в положении остатка, которое отличается от положения не встречающейся в природе аминокислоты второго модифицированного полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления обе не встречающиеся в природе аминокислоты расположены в одном и том же положении остатка в соответствующих полипептидах IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 ковалентно присоединен к конъюгируемому фрагменту с помощью по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер, липид, белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгилколя и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный многоатомный спирт), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает молекулу PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. В некоторых вариантах осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полисахарид. В некоторых вариантах осуществления полисахарид предусматривает декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления липид предусматривает жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота содержит от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает альбумин, трансферрин или транстиретин. В некоторых вариантах осуществления белок предусматривает антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты предусматривают Fc-часть антитела. В некоторых вариантах осуществления пептид предусматривает пептид XTEN, богатый глицином гомоаминокислотный полимер (HAP), полипептид PAS, подобный эластину полипептид (ELP), пептид CTP или полимер на основе желатиноподобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой модифицированного IL-10 с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 представляет собой a) функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-10; b) рекомбинантный полипептид IL-10 или c) рекомбинантный полипептид человеческого IL-10. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию, С-концевую делецию или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления N-концевая делеция предусматривает делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или 30 остатков со стороны N-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления С-концевая делеция предусматривает делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков со стороны С-конца, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-10 характеризуется приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 связывается с IL-10R с образованием комплекса IL-10/IL-10R. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет приблизительно 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты по сути не влияет на димеризацию полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не влияет на связывание димера IL-10 с IL-10R. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не нарушает передачу сигнала IL-10R. В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты не нарушает передачу сигнала IL-10R, что измеряется с помощью фосфорилирования Stat3 и/или с помощью активации передачи сигнала IL-10R.

[25] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт полимер на основе полинуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный полипептид IL-10, описанный в данном документе.

[26] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт вектор, содержащий полимер на основе полинуклеиновой кислоты, описанный в данном документе.

[27] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт конъюгат интерлейкина 10 (IL-10), содержащий полипептид IL-10, содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, и конъюгируемый фрагмент, связанный с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент непосредственно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в экспонированном на поверхности местоположении в спирали C, D или E. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79 или N82, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79 и 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K88, K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q70, E74, N82, K88, N126, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 70, 74, 82, 88, 126, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность является на по меньшей мере или на приблизительно 99,0% идентичной аминокислотам 33-158 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков лизина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в одном или нескольких из K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 из K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит лизин дикого типа в K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, и K157. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к N-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны N-конца. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к C-концу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны С-конца. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 содержит две или более не встречающихся в природе аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 димеризуется со вторым полипептидом IL-10, содержащим по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 димеризуется со вторым полипептидом IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 содержит два или более конъюгируемых фрагмента, где каждый из двух или более конъюгируемых фрагментов связан с не встречающейся в природе аминокислотой, расположенной в одном и том же положении остатка в пределах соответствующего мономера IL-10. В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 содержит два или более конъюгируемых фрагмента, где каждый из двух или более конъюгируемых фрагментов связан с не встречающейся в природе аминокислотой, расположенной в отличающемся положении остатка в пределах димера IL-10. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, где увеличенный период полужизни в плазме крови сравнивают с периодом полужизни белка IL-10 дикого типа в плазме крови. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 представляет собой биологически активный полипептид IL-10, который связывается с рецептором IL-10 (IL-10R) с образованием комплекса IL-10/IL-10R и активирует сигнальный путь IL-10R.

[28] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт комплекс IL-10/IL-10R, содержащий модифицированный димер IL-10, содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, и IL-10R, где модифицированный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови по сравнению с периодом полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления модифицированный димер IL-10 дополнительно содержит конъюгируемый фрагмент, ковалентно присоединенный по меньшей мере к одной не встречающейся в природе аминокислоте.

[29] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая выделенный и модифицированный полипептид IL-10, описанный в данном документе, или конъюгат IL-10, описанный в данном документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для системной доставки. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для парентерального введения.

[30] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ лечения пролиферативного заболевания или состояния у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенного и модифицированного полипептида IL-10, описанного в данном документе, конъюгата IL-10, описанного в данном документе, или фармацевтической композиции, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак в виде солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак в виде солидной опухоли представляет собой рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную B-крупноклеточную лимфому (DLBCL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), макроглобулинемию Вальденстрема, множественную миелому, экстранодальную B-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, узловую B-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому Беркитта, неберкиттскую В-клеточную лимфому высокой степени злокачественности, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому (PMBL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, B-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки, плазмаклеточную миелому, плазмацитому, медиастинальную (тимическую) В-крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную эффузионную лимфому или лимфоматоидный гранулематоз. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает введение дополнительного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгат IL-10, описанный в данном документе; или фармацевтическую композицию, описанную в данном документе, и дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно или составляют совместно. В некоторых вариантах осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгат IL-10, описанный в данном документе; или фармацевтическую композицию, описанную в данном документе, и дополнительное терапевтическое средство вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгат IL-10, описанный в данном документе; или фармацевтическую композицию, описанную в данном документе, вводят до введения дополнительного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгат IL-10, описанный в данном документе; или фармацевтическую композицию, описанную в данном документе, вводят после введения дополнительного терапевтического средства.

[31] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт набор, содержащий выделенный и модифицированный полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгат IL-10, описанный в данном документе, или фармацевтическую композицию, описанную в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[32] Различные аспекты настоящего изобретения детально изложены в прилагаемой формуле изобретения. Признаки и преимущества настоящего изобретения станут более понятны при обращении к следующему подробному описанию, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы настоящего изобретения, и к прилагаемым графическим материалам.

[33] На фиг. 1 показаны иллюстративные не встречающиеся в природе аминокислоты. Данная фигура основана на фиг. 2 из Young et al. “Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon,” J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010).

[34] На фиг. 2A - фиг. 2B показаны иллюстративные не встречающиеся в природе аминокислоты. На фиг. 2A показаны иллюстративные производные лизина. На фиг. 2B показаны иллюстративные производные фенилаланина.

[35] На фиг. 3A - фиг. 3D показаны иллюстративные не встречающиеся в природе аминокислоты. Эти не встречающиеся в природе аминокислоты (UAA) были генетически закодированы с обеспечением включения в белки (фиг. 3A - UAA №№ 1-42; фиг. 3B - UAA №№ 43-89; фиг. 3C - UAA №№ 90-128; фиг. 3D - UAA №№ 129-167). Фиг. 3A - 3D основаны на таблице 1 из Dumas et al. Chemical Science 2015, 6, 50-69.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[36] Цитокины представляют собой семейство сигнальных белков клетки, таких как хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины, факторы некроза опухоли и другие факторы роста, играющие ряд ролей в клеточном гомеостазе врожденной и адаптивной иммунных систем. Цитокины продуцируются иммунными клетками, такими как макрофаги, В-лимфоциты, Т-лимфоциты и тучные клетки, эндотелиальными клетками, фибробластами и различными стромальными клетками. В некоторых случаях цитокины модулируют баланс между гуморальными и клеточными иммунными ответами.

[37] Интерлейкины представляют собой сигнальные белки, которые модулируют развитие и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, клеток моноцитарной линии дифференцировки, нейтрофилов, базофилов, эозинофилов, мегакариоцитов и гемопоэтических клеток. Интерлейкины продуцируются хелперными CD4 T- и B-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, эндотелиальными клетками и другими резидентными в тканях клетками. В некоторых случаях присутствует приблизительно 15 интерлейкинов, интерлейкины 1-13, интерлейкин 15 и интерлейкин 17.

[38] IL-10 обеспечивает иммунный ответ в отношении опухоли путем активации инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток, клеточной пролиферации CD8+ Т-клеток, индукции IFN-γ, что приводит к увеличению количества MHC класса I на опухолевых клетках и MHC класса II на макрофагах, и индукции цитотоксических белков, опосредующих лизис клеток-мишеней. Повышенная стимуляция Т-клеточного рецептора на CD8+ Т-клетках обеспечивает противоапоптотические сигналы и сигналы пролиферации. Неожиданная роль IL-10 в микроокружении опухоли (TME) заключается в подавлении провоспалительных клеток Th17 и цитокинов, ответственных за воспаление, связанное с опухолью, что приводит к супрессии противоопухолевых ответов эффекторных клеток. Доклинические исследования показали, что дефицит IL-10 увеличивает частоту развития опухолей и снижает иммунный надзор. Кроме того, обработка трансгенных мышей Her2 пегилированным IL-10 приводила к отторжению опухоли, однако при этом требовалось наличие экспрессии IFN-γ и экспрессирующих гранзим CD8+ Т-клеток, что сопровождалось значительным увеличением количества CD8a/b+ T-клеток в опухоли.

[39] В организме IL-10 характеризуется относительно коротким периодом полужизни в сыворотке крови. По сути, время полужизни у мышей, измеренное с помощью биоанализа in vitro или по эффективности в модельной системе септического шока [см. Smith et al. Cellular Immunology 173:207-214 (1996)] составляет от приблизительно 2 до 6 часов.

[40] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыт модифицированный полипептид IL-10, который характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови. В некоторых вариантах осуществления также в данном документе описан модифицированный полипептид IL-10, который при димеризация усиливает воздействие инфильтрирующих опухоль иммунных клеток на совокупность опухолевых клеток. В других вариантах осуществления в данном документе дополнительно описан модифицированный полипептид IL-10, который образует биологически активный димер IL-10.

[41] В том числе дополнительно описаны конъюгаты полипептида IL-10, фармацевтические композиции, содержащие один или несколько модифицированных полипептидов IL-10, и способы лечения, проводимого в отношении заболевания или по показанию.

Модифицированные полипептиды IL-10

[42] В некоторых вариантах осуществления в данном документе описан полипептид IL-10, модифицированный по аминокислотному положению. В некоторых случаях модификация предусматривает встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых случаях модификация предусматривает не встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых случаях в данном документе описан выделенный и модифицированный полипептид IL-10, который содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых случаях полипептид IL-10 представляет собой выделенный и очищенный IL-10 млекопитающего, например, белок IL-10 грызуна или белок IL-10 человека. В некоторых случаях полипептид IL-10 представляет собой белок IL-10 человека. В некоторых случаях полипептид IL-10 характеризуется приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях полипептид IL-10 содержит последовательность под SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях полипептид IL-10 состоит из последовательности под SEQ ID NO: 1. В дополнительных случаях полипептид IL-10 характеризуется приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2. В дополнительных случаях полипептид IL-10 содержит последовательность под SEQ ID NO: 2. В дополнительных случаях полипептид IL-10 состоит из последовательности под SEQ ID NO: 2.

[43] В некоторых случаях полипептид IL-10 представляет собой усеченный вариант. В некоторых случаях усечение представляет собой N-концевую делецию. В других случаях усечение представляет собой С-концевую делецию. В дополнительных случаях усечение предусматривает как N-концевую, так и С-концевую делеции. Например, усечение может представлять собой делецию по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков либо с N-конца, либо с C-конца, либо с обоих концов. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 2 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 3 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 4 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 5 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 6 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 7 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 8 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 9 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-10 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 10 остатков.

[44] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 представляет собой функционально активный фрагмент. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 5-160, 10-160, 15-160, 20-160, 1-155, 5-155, 10-155, 15-155, 20-155, 1-150, 5-150, 10-150, 15-150, или 20-150, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 5-160, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 10-160, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 15-160, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 20-160, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 1-155, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 5-155, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 10-155, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 15-155, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 20-155, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 1-150, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 5-150, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 10-150, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 15-150, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент предусматривает область IL-10 20-150, где положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1.

[45] В некоторых вариантах осуществления в данном документе описан полипептид IL-10, который содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в спирали C, D или E. В некоторых случаях спираль C содержит остатки L60-N82, положения которых относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях спираль D содержит остатки I87-C108, положения которых относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях спираль E содержит остатки S118-L131, положения которых относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в экспонированном на поверхности местоположении в спирали C, D или E.

[46] В некоторых вариантах осуществления в данном документе описан полипептид IL-10, который содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту в положении, выбранном из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67, Q70, E74, E75, Q79 или N82, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79 и 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K88, K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q70, E74, N82, K88, N126, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 70, 74, 82, 88, 126, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E67. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q70. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E74. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из E75. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q79. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N82. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K88. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K125. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N126. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из N129. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из K130. В некоторых случаях положение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты выбрано из Q132.

[47] В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к N-концу. Как используется в данном документе, "проксимально" относится к остатку, расположенному на расстоянии от по меньшей мере 1 остатка от N-концевого остатка до приблизительно 50 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 20 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 30 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 40 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 50 остатков от N-концевого остатка.

[48] В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N-концевой остаток.

[49] В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к C-концу. Как используется в данном документе, "проксимально" относится к остатку, расположенному на расстоянии от по меньшей мере 1 остатка от С-концевого остатка до приблизительно 50 остатков от С-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков от С-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 10 остатков от С-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 20 остатков от С-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 30 остатков от С-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 40 остатков от С-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в пределах первых 50 остатков от С-концевого остатка.

[50] В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой С-концевой остаток.

[51] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 представляет собой функционально активный мономер, который способен связываться с IL-10R и активирует сигнальный путь. В некоторых случаях функционально активный мономер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови сравнивают с периодом полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови полипептида IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови белка IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови полипептида IL-10 составляет приблизительно 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней по сравнению с периодом полужизни в плазме крови белка IL-10 дикого типа.

[52] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 образует димер IL-10, например, биологически активный димер. В некоторых случаях димер IL-10 (например, биологически активный димер IL-10) содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту. В других случаях димер IL-10 (например, биологически активный димер IL-10) содержит по меньшей мере две или более не встречающихся в природе аминокислот. В дополнительных случаях димер IL-10 (например, биологически активный димер IL-10) содержит по меньшей мере три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или более не встречающихся в природе аминокислот.

[53] В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 (например, биологически активный димер IL-10) содержит две не встречающиеся в природе аминокислоты. В некоторых случаях обе не встречающиеся в природе аминокислоты расположены в одном и том же полипептиде IL-10. В других случаях каждый полипептид IL-10 содержит одну не встречающуюся в природе аминокислоту. В таких случаях каждая из не встречающихся в природе аминокислот расположена в отличающемся местоположении остатка в полипептиде IL-10 (т.e. одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в первом местоположении остатка в одном полипептиде IL-10, а вторая не встречающаяся в природе аминокислота расположена во втором местоположении остатка в другом полипептиде IL-10, и второе местоположение остатка отличается от первого местоположения остатка). В дополнительных случаях каждая не встречающаяся в природе аминокислота расположена в одном и том же местоположении остатка в соответствующих полипептидах IL-10.

[54] В некоторых вариантах осуществления димер IL-10 (например, биологически активный димер IL-10) содержит одну не встречающуюся в природе аминокислоту. В таких случаях модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых случаях полипептид IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты, содержит мутацию встречающейся в природе аминокислоты. В других случаях полипептид IL-10, который не содержит не встречающейся в природе аминокислоты, представляет собой вариант IL-10, например, усеченный белок IL-10. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-10 димеризуется с полипептидом IL-10 дикого типа.

[55] В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты по сути не влияет на димеризацию полипептида IL-10.

[56] В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты, кроме того, существенно не влияет на связывание димера IL-10 с IL-10R.

[57] В некоторых вариантах осуществления местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 80%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 70%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 60%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 50%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 40%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 30%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 20%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 10%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 5%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 2%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 1%. В некоторых случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты существенно не нарушает передачу сигнала IL-10R. В дополнительных случаях местоположение по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислоты не нарушает передачу сигнала IL-10R.

[58] В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови сравнивают с периодом полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 2 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 3 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 4 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 5 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 6 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 10 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 12 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 18 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 24 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 36 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 48 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 3 дня или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 4 дня или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 5 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 6 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 7 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 10 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 12 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 14 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 21 день или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 28 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови димера IL-10 составляет по меньшей мере 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа.

[59] В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 90 минут. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 2 часа. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 3 часа. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 4 часа. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 5 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 6 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 7 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 8 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 9 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 10 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 11 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 12 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 18 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 24 часа. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 36 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 48 часов. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 3 дня. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 4 дня. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 5 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 6 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 7 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 10 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 12 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 14 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 21 день. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 28 дней. В некоторых случаях биологически активный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови, составляющим приблизительно 30 дней.

Конъюгаты IL-10

[60] В определенных вариантах осуществления в данном документе описан конъюгат IL-10. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10 содержит полипептид IL-10, содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, и конъюгируемый фрагмент, связанный с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент непосредственно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой. В других случаях конъюгируемый фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной не встречающейся в природе аминокислотой с помощью линкера, описанного ниже.

[61] Как описано выше, по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота необязательно расположена в спирали C, D или E, например, в положении открытого остатка на поверхности. В некоторых случаях остатки предусматривают E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях остатки предусматривают E67, Q70, E74, E75, Q79 или N82, где положения остатков соответствуют положениям 67, 70, 74, 75, 79 и 82, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях остаток предусматривает K88, K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 88, 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях остаток предусматривает K125, N126, N129, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 125, 126, 129, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях остаток предусматривает Q70, E74, N82, K88, N126, K130 или Q132, где положения остатков соответствуют положениям 70, 74, 82, 88, 126, 130 и 132, указанным в SEQ ID NO: 1.

[62] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к N-концу (например, проксимально по отношению к N-концевому остатку). Например, по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена необязательно в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны N-конца. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена на N-конце (т.e. по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N-концевой остаток полипептида IL-10).

[63] В других вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена проксимально по отношению к C-концу (например, проксимально по отношению к С-концевому остатку). Например, по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена необязательно в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков со стороны С-конца. В некоторых случаях по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена на С-конце (т. e. по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой С-концевой остаток полипептида IL-10).

[64] В некоторых случаях конъюгат IL-10 содержит один конъюгируемый фрагмент, связанный с не встречающейся в природе аминокислотой.

[65] В некоторых случаях конъюгат IL-10 содержит мономер IL-10, который способен активировать сигнальный путь IL-10R. В других случаях конъюгат IL-10 содержит димер IL-10, который является функционально активным.

[66] В некоторых случаях конъюгат IL-10 содержит два или более конъюгируемых фрагмента, где каждый из двух или более конъюгируемых фрагментов связан с отличающейся не встречающейся в природе аминокислотой. В некоторых случаях два или более конъюгируемых фрагмента конъюгированы с одним и тем же полипептидом IL-10 (например, представленным либо в виде функционально активного мономера IL-10, либо в виде функционально активного димера IL-10). В других случаях каждый из двух или более конъюгируемых фрагментов конъюгирован с отличающимся полипептидом IL-10 в пределах димера IL-10. В дополнительных случаях конъюгат IL-10 содержит три, четыре, пять, шесть или более конъюгируемых фрагментов, где каждый из конъюгируемых фрагментов связан с отличающейся не встречающейся в природе аминокислотой. В таких случаях два полипептида IL-10 в пределах димера характеризуются неравномерным распределением конъюгируемых фрагментов, например, один полипептид IL-10 имеет один конъюгируемый фрагмент, тогда как другой полипептид IL-10 имеет два или более конъюгируемых фрагмента.

[67] В некоторых случаях конъюгат IL-10 содержит два или более конъюгируемых фрагмента. В некоторых случаях каждый из двух или более конъюгируемых фрагментов связан с не встречающейся в природе аминокислотой в одном и том же положении остатка в пределах соответствующего мономера IL-10. В других случаях каждый из двух или более конъюгируемых фрагментов связан с не встречающейся в природе аминокислотой, расположенной в отличающемся положении остатка в пределах димера IL-10.

[68] В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента по сути не влияет на димеризацию полипептида IL-10.

[69] В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента, кроме того, существенно не влияет на связывание димера IL-10 с IL-10R.

[70] В некоторых вариантах осуществления местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 80%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 70%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 60%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 50%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 40%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 30%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 20%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 10%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 5%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 2%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента нарушает передачу сигнала IL-10R на менее чем 1%. В некоторых случаях местоположение конъюгируемого фрагмента существенно не нарушает передачу сигнала IL-10R. В дополнительных случаях местоположение конъюгируемого фрагмента не нарушает передачу сигнала IL-10R.

[71] В некоторых случаях конъюгат IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови сравнивают с периодом полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 90 минут или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 2 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 3 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 4 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 5 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 6 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 10 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 12 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 18 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 24 часа или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 36 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 48 часов или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 3 дня или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 4 дня или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 5 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 6 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 7 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 10 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 12 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 14 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 21 день или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 28 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа. В некоторых случаях увеличенный период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 составляет по меньшей мере 30 дней или является более продолжительным, чем период полужизни в плазме крови конъюгата IL-10 дикого типа.

[72] В некоторых вариантах осуществления также в данном документе описан комплекс IL-10/IL-10R, содержащий модифицированный димер IL-10, содержащий по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, и IL-10R, где модифицированный димер IL-10 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме крови по сравнению с периодом полужизни в плазме крови димера IL-10 дикого типа. В некоторых случаях модифицированный димер IL-10 дополнительно содержит конъюгируемый фрагмент, ковалентно присоединенный по меньшей мере к одной не встречающейся в природе аминокислоте.

Предшественники конъюгата IL-10

[73] В данном документе описаны предшественники конъюгата IL-10, содержащие модифицированный полипептид IL-10, где одна или несколько аминокислот были подвергнуты мутации по отношению к аминокислоте дикого типа. Такие предшественники часто применяют в сочетании со способами, описанными в данном документе, для лечения заболеваний или состояний. В некоторых вариантах осуществления предшественник IL-10 не является конъюгированным. Такие мутации различным образом предусматривают добавления, делеции или замены.

Встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе аминокислоты

[74] В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток, описанный в данном документе (например, в пределах полипептида IL-10), подвергнут мутации с заменой на лизин, цистеин, гистидин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, серин, треонин или тирозин перед связыванием с (или реагированием с) конъюгируемым фрагментом. Например, боковая цепь лизина, цистеина, гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина или тирозина может связываться с конъюгируемым фрагментом, описанным в данном документе. В некоторых случаях аминокислотный остаток подвергнут мутации с заменой на цистеин, лизин или гистидин. В некоторых случаях аминокислотный остаток подвергнут мутации с заменой на цистеин. В некоторых случаях аминокислотный остаток подвергнут мутации с заменой на лизин. В некоторых случаях аминокислотный остаток подвергнут мутации с заменой на гистидин. В некоторых случаях аминокислотный остаток подвергнут мутации с заменой на тирозин. В некоторых случаях аминокислотный остаток подвергнут мутации с заменой на триптофан. В некоторых случаях аминокислотный остаток расположен проксимально по отношению к N- или C-концу, на N- или C-конце или во внутреннем положении остатка. В некоторых случаях аминокислотный остаток представляет собой N- или С-концевой остаток, а мутация обеспечивает замену на цистеин или лизин. В некоторых случаях аминокислотный остаток расположен проксимально по отношению к N- или С-концевому остатку (например, в пределах 50, 40, 30, 20 или 10 остатков от N- или С-концевого остатка), а мутация обеспечивает замену на цистеин или лизин.

[75] В некоторых случаях аминокислотный остаток добавляют к N- или С-концевому остатку, т.e. полипептид IL-10 содержит дополнительный аминокислотный остаток либо на N-, либо на C-конце, и дополнительный аминокислотный остаток представляет собой цистеин или лизин. В некоторых случаях дополнительный аминокислотный остаток представляет собой цистеин. В некоторых случаях дополнительная аминокислота конъюгирована с конъюгируемым фрагментом.

[76] В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток, описанный в данном документе (например, в пределах полипептида IL-10), подвергнут мутации с заменой на не встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота не конъюгирована с конъюгируемым фрагментом. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10, описанный в данном документе, содержит не встречающуюся в природе аминокислоту, где IL-10 конъюгирован с белком, при этом точка присоединения не является не встречающейся в природе аминокислотой.

[77] В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток, описанный в данном документе (например, в пределах полипептида IL-10), подвергнут мутации с заменой на не встречающуюся в природе аминокислоту до связывания с конъюгируемым фрагментом. В некоторых случаях мутация с заменой на не встречающуюся в природе аминокислоту предупреждает или минимизирует эндоантигенный ответ иммунной системы. Используемые в данном документе термин "не встречающаяся в природе аминокислота" относится к аминокислоте, отличной от 20 аминокислот, которые в природе встречаются в белке. Неограничивающие примеры не встречающихся в природе аминокислот включают п-ацетил-L-фенилаланин, п-йод-L-фенилаланин, п-метоксифенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-боронофенилаланин, O-пропаргилтирозин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, селеноцистеин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), не встречающийся в природе аналог аминокислоты, представляющей собой тирозин; не встречающийся в природе аналог аминокислоты, представляющей собой глутамин; не встречающийся в природе аналог аминокислоты, представляющей собой фенилаланин; не встречающийся в природе аналог аминокислоты, представляющей собой серин; не встречающийся в природе аналог аминокислоты, представляющей собой треонин; замещенную алкилом, арилом, ацилом, азидо, циано, галогеном, гидразином, гидразидом, гидроксилом, алкенилом, алкинилом, простым эфиром, тиолом, сульфонилом, селено, сложным эфиром, тиокислотой, боратом, боронатом, фосфо, фосфоно, фосфином, гетероциклом, эноном, имином, альдегидом, гидроксиламином, кето- или аминогруппой аминокислоту или их комбинацию; аминокислоту с фотоактивируемым кросс-линкером; спин-меченую аминокислоту; флуоресцентную аминокислоту; связывающую металл аминокислоту; содержащую металл аминокислоту; радиоактивную аминокислоту; имеющую фотолабильную временную защиту и/или фотоизомеризуемую аминокислоту; содержащую биотин или аналог биотина аминокислоту; содержащую кетогруппу аминокислоту; аминокислоту, содержащую полиэтиленгликоль или полиэфир; замещенную тяжелым атомом аминокислоту; химически расщепляемую или фоторасщепляемую аминокислоту; аминокислоту с удлиненной боковой цепью; аминокислоту, содержащую токсичную группу; замещенную сахаром аминокислоту; аминокислоту, содержащую сахар, присоединенный через атом углерода; редокс-активную аминокислоту; содержащую гидроксильную группу в альфа-положении кислоту; аминотиокислоту; α,α-дизамещенную аминокислоту; β-аминокислоту; циклическую аминокислоту, отличную от пролина или гистидина, и ароматическую аминокислоту, отличную от фенилаланина, тирозина или триптофана.

[78] Другие примеры не встречающихся в природе аминокислот включают N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин и N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[79] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота содержит селективную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу для сайт-селективного мечения целевого полипептида. В некоторых случаях химические превращения представляют собой биортогональную реакцию (например, биосовместимые и селективные реакции). В некоторых случаях химические превращения представляет собой катализируемую Cu(I) или “безмедную” приводящую к образованию триазола реакцию алкинов с азидами, лигирование Штаудингера, реакцию Дильса-Алдера с обращенными электронными требованиями (IEDDA), “фотоклик”-химические превращения или опосредованный металлами процесс, такой как метатезис олефинов и перекрестное сочетание Сузуки-Мияуры или Соногаширы.

[80] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота содержит фотореактивную группу, которая подвергается сшиванию при облучении, например, УФ.

[81] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает имеющую фотолабильную временную защиту аминокислоту.

[82] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота является пара-замещенным, мета-замещенным или орто-замещенным производным аминокислоты.

[83] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-метоксифенилаланин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин или изопропил-L-фенилаланин.

[84] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 3-аминотирозин, 3-нитротирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин или 3-йодтирозин.

[85] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой фенилселеноцистеин.

[86] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой содержащее бензофенон, кетон, йодид, метокси, ацетил, бензоил или азид производное фенилаланина.

[87] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой содержащее бензофенон, кетон, йодид, метокси, ацетил, бензоил или азид производное лизина.

[88] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит ароматическую боковую цепь.

[89] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота не содержит ароматической боковой цепи.

[90] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит азидогруппу.

[91] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[92] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит группу-акцептор Михаэля. В некоторых случаях группы-акцепторы Михаэля предусматривают ненасыщенный фрагмент, способный образовывать ковалентную связь посредством реакции 1,2-добавления. В некоторых случаях группы-акцепторы Михаэля предусматривают алкены или алкины с дефицитом электронов. В некоторых случаях группы-акцепторы Михаэля включают без ограничения альфа, бета-ненасыщенные: кетоны, альдегиды, сульфоксиды, сульфоны, нитрилы, имины или ароматические группы.

[93] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой дегидроаланин.

[94] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит альдегидную или кетоновую группу.

[95] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее альдегидную или кетоновую группу.

[96] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее один или несколько атомов O, N, Se или S в бета-, гамма- или дельта-положении. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее атомы O, N, Se или S в гамма-положении.

[97] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное лизина, где атом N в эпсилон-положении заменен на атом кислорода.

[98] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное лизина, которое представляет собой не встречающийся в природе посттрансляционно модифицированный лизин.

[99] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, где шестой атом от альфа-положения предусматривает наличие карбонильной группы. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, где шестой атом от альфа-положения предусматривает наличие карбонильной группы, а пятый атом от альфа-положения представляет собой азот. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, где седьмой атом от альфа-положения представляет атом кислорода.

[100] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное серина, содержащее селен. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой селеносерин (2-амино-3-гидроселенопропановую кислоту). В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит селен, где окисление селена приводит к образованию не встречающейся в природе аминокислоты, содержащей алкен.

[101] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит циклооктинильную группу.

[102] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит транс-циклоктенильную группу.

[103] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит норборненильную группу.

[104] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит циклопропенильную группу.

[105] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит диазириновую группу.

[106] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота содержит тетразиновую группу.

[107] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное лизина, где азот боковой цепи является карбамилированным. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой производное лизина, где азот боковой цепи является ацилированным. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(трет-бутокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(трет-бутокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-Boc-N6-метиллизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-ацетиллизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой пирролизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-трифторацетиллизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(бензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(п-йодбензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(п-нитробензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-пролиллизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(циклопентилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(циклопентанкарбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(тетрагидрофуран-2-карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(3-этинилтетрагидрофуран-2-карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((проп-2-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-азидоциклопентилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-нитробензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-циклооктинилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(2-аминобут-3-иноил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-6-((2-аминобут-3-иноил)окси)гексановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(аллилоксикарбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(бутенил-4-оксикарбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(пентенил-5-оксикарбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((бут-3-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((пент-4-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(тиазолидин-4-карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-8-оксононановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-8-оксооктановую кислоту. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(2-оксоацетил)лизин.

[108] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-пропиониллизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-бутириллизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(бут-2-еноил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((спиро[2.3]гекс-1-ен-5-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-(((4-(1-(трифторметил)циклопроп-2-ен-1-ил)бензил)окси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой цистеиниллизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((1-(6-нитробензо[d][1,3]диоксол-5-ил)этокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((2-(3-метил-3H-диазирин-3-ил)этокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((3-(3-метил-3H-диазирин-3-ил)пропокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((мета-нитробензилокси)N6-метилкарбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой N6-((циклогепт-3-ен-1-илокси)карбонил)-L-лизин.

[109] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой 2-амино-3-(((((бензилокси)карбонил)амино)метил)селанил)пропановую кислоту.

[110] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью перепрофилированного стоп-кодона "янтарь", "опал" или "охра".

[111] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью кодона из 4 оснований.

[112] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью перепрофилированного редко используемого смыслового кодона.

[113] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью синтетического кодона, содержащего не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту.

[114] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота включена в IL-10 с помощью ортогональной пары модифицированная синтетаза/tRNA. Такие ортогональные пары содержат не встречающуюся в природе синтетазу, которая способна загружать не встречающуюся в природе tRNA не встречающейся в природе аминокислотой, минимизируя при этом загрузку а) не встречающейся в природе tRNA другими эндогенными аминокислотам и b) других эндогенных tRNA не встречающимися в природе аминокислотами. Такие ортогональные пары содержат tRNA, которые способны подвергаться загрузке посредством не встречающихся в природе синтетаз, при этом избегая загрузки другими эндогенными аминокислотами посредством эндогенных синтетаз. В некоторых вариантах осуществления такие пары идентифицированы как полученные из различных организмов, как например источники, представленные бактериями, дрожжами, археями или людьми. В некоторых вариантах осуществления ортогональная пара синтетаза/tRNA содержит компоненты из одного организма. В некоторых вариантах осуществления ортогональная пара синтетаза/tRNA содержит компоненты из двух разных организмов. В некоторых вариантах осуществления ортогональная пара синтетаза/tRNA содержит компоненты, которые перед модификацией обеспечивают трансляцию двух разных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аланинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аргининсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аспарагинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аспартатсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную цистеинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную глутаминсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную глутаматсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аланин-глицинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную гистидинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную лейцинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную изолейцинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную лизинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную метионинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную фенилаланинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную пролинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную серинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную треонинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную триптофансинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную тирозинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную валинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную фосфосеринсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную аланиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную аргининовую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную аспарагиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную tRNA аспарагиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную цистеиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную глутаминовую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную tRNA глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную аланин-глициновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную гистидиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную лейциновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную изолейциновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную лизиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную метиониновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную фенилаланиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную пролиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную сериновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную треониновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную триптофановую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную тирозиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную валиновую tRNA. В некоторых вариантах осуществления ортогональная tRNA представляет собой модифицированную фосфосериновую tRNA.

[115] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью пары, предусматривающей аминоацил-tRNA-синтетазу (aaRS или RS) и tRNA. Иллюстративные пары aaRS-tRNA включают без ограничения пары aaRS/tRNA Methanococcus jannaschii (Mj-Tyr), пары TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/tRNA_CUA B. stearothermophilus, пары LeuRS E. coli (Ec-Leu)/tRNA_CUA B. stearothermophilus и пары пирролизил-tRNA. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота включена в цитокин (например, полипептид IL) с помощью пары Mj-TyrRS/tRNA. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены с помощью пары Mj-TyrRS/tRNA, включают без ограничения пара-замещенные производные фенилаланина, такие как п-аминофенилаланин и п-метоксифенилаланин, мета-замещенные производные тирозина, такие как 3-аминотирозин, 3-нитротирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин и 3-йодтирозин, фенилселеноцистеин, п-боронофенилаланин и o-нитробензилтирозин.

[116] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью пары Ec-Tyr/tRNA_CUA или Ec-Leu/tRNA_CUA. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены с помощью пары Ec-Tyr/tRNA_CUA или Ec-Leu/tRNA_CUA, включают без ограничения производные фенилаланина, содержащие бензофеноновые, кетоновые, йодидные или азидные заместители; O-пропаргилтирозин; α-аминокаприловую кислоту, O-метилтирозин, O-нитробензилцистеин и 3-(нафталин-2-иламино)-2-аминопропановую кислоту.

[117] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью пары пирролизил-tRNA. В некоторых случаях PylRS получена из археобактерий, например, из метаногенных археобактерий. В некоторых случаях PylRS получена из Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei или Methanosarcina acetivorans. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены с помощью пары пирролизил-tRNA, включают без ограничения замещенные амидом и карбаматом разновидности лизина, такие как 2-амино-6-((R)-тетрагидрофуран-2-карбоксамидо)гексановая кислота, N-ε-_D-пролил-_L-лизин и N-ε-циклопентилоксикарбонил-_L-лизин, N-ε-акрилоил-_L-лизин, N-ε-[(1-(6-нитробензо[d][1,3]диоксол-5-ил)этокси)карбонил]-_L-лизин и N-ε-(1-метилциклопро-2-енекарбоксамидо)лизин. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты IL-10, раскрытые в данном документе, могут быть получены путем применения tRNA M. mazei, которая селективна загружена не встречающейся в природе аминокислотой, такой как N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), с помощью пирролизил-tRNA-синтетазы (Mb PylRS) M. barkeri. Специалистам в данной области известны другие способы, такие как описанные в Zhang et al. Nature 2017, 551(7682): 644-647. Другие примеры не встречающихся в природе аминокислот, которые можно применять, включают без ограничения N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин.

[118] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью синтетазы, раскрытой в US 9988619 и US 9938516. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены с помощью таких синтетаз, включают пара-метилазидо-L-фенилаланин, не встречающиеся в природе аминокислоты, содержащие аралкил, гетероциклил, гетероаралкил, и другие. В некоторых вариантах осуществления такие UAA содержат пиридил, пиразинил, пиразолил, триазолил, оксазолил, тиазолил, тиофенил или другой гетероцикл. Такие аминокислоты в некоторых вариантах осуществления содержат азиды, тетразины или другую химическую группу, способную к конъюгации с партнером по сочетанию, таким как растворимый в воде фрагмент. В некоторых вариантах осуществления такие синтетазы экспрессируются и применяются для включения UAA в цитокины in-vivo. В некоторых вариантах осуществления такие синтетазы применяют для включения UAA в цитокины с использованием бесклеточной системы трансляции.

[119] Клетку-хозяина, в которую вводят конструкции или векторы, раскрытые в данном документе, культивируют или поддерживают в подходящей среде, вследствие чего продуцируются представляющие интерес tRNA, tRNA-синтетаза и белок. Среда также содержит не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы), вследствие чего представляющий интерес белок содержит не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы). В некоторых вариантах осуществления в клетке-хозяине также присутствует транспортер нуклеозидтрифосфата (NTT), происходящий из бактерии, растения или водоросли. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты конъюгаты IL-10, полученные путем применения клетки-хозяина, которая экспрессирует NTT. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидный транспортер нуклеозидтрифосфата, применяемый в клетке-хозяина, может быть выбран из TpNTT1, TpNTT2, TpNTT3, TpNTT4, TpNTT5, TpNTT6, TpNTT7, TpNTT8 (T. pseudonana), PtNTT1, PtNTT2, PtNTT3, PtNTT4, PtNTT5, PtNTT6 (P. tricornutum), GsNTT (Galdieria sulphuraria), AtNTT1, AtNTT2 (Arabidopsis thaliana), CtNTT1, CtNTT2 (Chlamydia trachomatis), PamNTT1, PamNTT2 (Protochlamydia amoebophila), CcNTT (Caedibacter caryophilus), RpNTT1 (Rickettsia prowazekii). В некоторых вариантах осуществления NTT выбран из PtNTT1, PtNTT2, PtNTT3, PtNTT4, PtNTT5 и PtNTT6. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT1. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT2. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT3. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT4. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT5. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT6. Другие NTT, которые могут быть применимы, раскрыты в Zhang et al. Nature 2017, 551(7682): 644-647; Malyshev et al. Nature 2014 (509(7500), 385-388; и Zhang et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114:1317-1322.

[120] В некоторых вариантах осуществления представлены способы получения конъюгатов IL-10, раскрытых в данном документе, в клеточной системе, которая экспрессирует NTT и tRNA-синтетазу. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, NTT выбран из PtNTT1, PtNTT2, PtNTT3, PtNTT4, PtNTT5 и PtNTT6, и tRNA-синтетаза выбрана из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus и M. mazei. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT1, и tRNA-синтетаза получена из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus или M. mazei. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT2, и tRNA-синтетаза получена из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus или M. mazei. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT3, и tRNA-синтетаза получена из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus или M. mazei. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT3, и tRNA-синтетаза получена из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus или M. mazei. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT4, и tRNA-синтетаза получена из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus или M. mazei. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT5, и tRNA-синтетаза получена из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus или M. mazei. В некоторых вариантах осуществления NTT представляет собой PtNTT6, и tRNA-синтетаза получена из Methanococcus jannaschii, TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus или M. mazei.

[121] В некоторых вариантах осуществления конъюгаты IL-10, раскрытые в данном документе, могут быть получены в клетке, такой как E. coli, содержащей (a) транспортер нуклеотидтрифосфата PtNTT2 (включая усеченный вариант, в котором первые 65 аминокислотных остатков полноразмерного белка делетированы), (b) плазмиду, содержащую двухнитевой олигонуклеотид, который кодирует вариант IL-10, имеющий требуемую аминокислотную последовательность, и который содержит не встречающуюся в природе пару оснований, предусматривающую первый не встречающийся в природе нуклеотид и второй не встречающийся в природе нуклеотид с целью обеспечения наличия кодона в требуемом положении, в которое будет включена не встречающаяся в природе аминокислота, такая как N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, (c) плазмиду, кодирующую tRNA, которая получена из M. mazei и которая содержит не встречающийся в природе нуклеотид с целью обеспечения распознаваемого антикодона (для кодона варианта IL-10) вместо ее нативной последовательности, и (d) плазмиду, кодирующую полученную из M. barkeri пирролизил-tRNA-синтетазу (Mb PylRS), которая может являться той же плазмидой, которая кодирует tRNA, или другой плазмидой. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно обеспечивается дезоксириботрифосфатами, предусматривающими одно или несколько не встречающихся в природе оснований. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно обеспечивается риботрифосфатами, предусматривающими одно или несколько не встречающихся в природе оснований. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно обеспечивается одной или несколькими не встречающимися в природе аминокислотами, такими как N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK), N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления двухнитевой олигонуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность требуемого варианта IL-10, содержит кодон AXC, например, в положении 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130 или 132 последовательности, которая кодирует белок, характеризующийся SEQ ID NO: 1, где X представляет собой не встречающийся в природе нуклеотид, как например раскрытые в данном документе, например NaM. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит плазмиду, которая может представлять собой плазмиду экспрессии белка или другую плазмиду, которая кодирует ген ортогональной tRNA из M. mazei, которая содержит соответствующий AXC антикодон GYT вместо своей нативной последовательности, где Y представляет собой не встречающийся в природе нуклеотид, раскрытый в данном документе, такой как TPT3, который является комплементарным и может быть таким же как не встречающийся в природе нуклеотид в кодоне или может отличаться от него. В некоторых вариантах осуществления не встречающийся в природе нуклеотид в кодоне отличается от не встречающегося в природе нуклеотида в антикодоне и комплементарен ему. В некоторых вариантах осуществления не встречающийся в природе нуклеотид в кодоне является таким же, как не встречающийся в природе нуклеотид в антикодоне. В некоторых вариантах осуществления первый и второй не встречающиеся в природе нуклеотиды, содержащие не встречающуюся в природе пару оснований в двухнитевом олигонуклеотиде, могут быть получены из и .

В некоторых вариантах осуществления первый и второй не встречающиеся в природе нуклеотиды, содержащие не встречающуюся в природе пару оснований в двухнитевом олигонуклеотиде, могут быть получены из и .

В некоторых вариантах осуществления трифосфаты первого и второго не встречающихся в природе нуклеотидов включают и или их соли.

В некоторых вариантах осуществления mRNA, полученная из двухнитевого олигонуклеотида, содержащего первый не встречающийся в природе нуклеотид и второй не встречающийся в природе нуклеотид, может содержать кодон, содержащий не встречающийся в природе нуклеотид, полученный из , и .

В некоторых вариантах осуществления tRNA M. mazei может содержать антикодон, содержащий не встречающийся в природе нуклеотид, который распознает кодон, содержащий не встречающийся в природе нуклеотид mRNA. Антикодон в tRNA M. mazei может содержать не встречающийся в природе нуклеотид, полученный из , и .

В некоторых вариантах осуществления mRNA содержит не встречающийся в природе нуклеотид, полученный из .

В некоторых вариантах осуществления tRNA содержит не встречающийся в природе нуклеотид, полученный из .

В некоторых вариантах осуществления mRNA содержит не встречающийся в природе нуклеотид, полученный из , а tRNA содержит не встречающийся в природе нуклеотид, полученный из .

Клетку-хозяина культивируют в среде, содержащей подходящие питательные вещества и дополненной (a) трифосфатами дезоксиксирибонуклеозидов, предусматривающими одно или несколько не встречающихся в природе оснований, которые необходимы для репликации плазмиды(плазмид), кодирующей(-их) ген цитокина, несущий кодон, (b) трифосфатами рибонуклеозидов, содержащими одно или несколько не встречающихся в природе оснований, необходимых для обеспечения транскрипции (i) mRNA, соответствующей кодирующей последовательности цитокина и содержащей кодон, содержащий одно или несколько не встречающихся в природе оснований, и (ii) tRNA, содержащей антикодон, содержащий одно или несколько не встречающихся в природе оснований, и (c) не встречающейся(-имися) в природе аминокислотой(-ами), подлежащей(-ими) включению в полипептидную последовательность представляющего интерес цитокина. Затем клетки-хозяева поддерживаются в условиях, которые обеспечивают экспрессию представляющего интерес белка.

[122] Полученный белок, содержащий одну или несколько не встречающихся в природе аминокислот, например, AzK, N6-(пропаргилэтокси)-L-лизин (PraK), N6-(((2-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, N6-(((3-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин или N6-(((4-азидобензил)окси)карбонил)-L-лизин, который экспрессируется, может быть очищен способами, известными специалистам в данной области, а затем может быть обеспечено его реагирование с алкином, таким как DBCO, содержащим цепь PEG, имеющую требуемую среднюю молекулярную массу, раскрытую в данном документе, в условиях, известных специалистам в данной области, с получением конъюгатов IL-10, раскрытых в данном документе. Специалистам в данной области известны другие способы, такие как описанные в Zhang et al. Nature 2017, 551(7682): 644-647; WO 2015157555, WO 2015021432, WO 2016115168, WO 2017106767, WO 2017223528, WO 2019014262, WO 2019014267, WO 2019028419 и WO2019/028425.

[123] В качестве альтернативы, полипептид цитокина (например, IL-10), содержащий не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы), получают путем введения в клетку-хозяина конструкций на основе нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе, предусматривающих tRNA и аминоацил-tRNA-синтетазу и предусматривающих представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты с одним или несколькими ортогональными (стоп-)кодонами, находящимися в пределах рамки считывания. Клетку-хозяина культивируют в среде, содержащей подходящие питательные вещества и дополненной (a) трифосфатами дезоксиксирибонуклеозидов, предусматривающими одно или несколько не встречающихся в природе оснований, необходимых для репликации плазмиды (плазмид), кодирующей(-их) ген цитокина, несущий новый кодон и антикодон, (b) трифосфатами рибонуклеозидов, необходимых для транскрипции mRNA, соответствующей (i) последовательности цитокина, содержащей кодон, и (ii) ортогональной tRNA, содержащей антикодон, и (c) не встречающейся(-имися) в природе аминокислотой(-ами). Затем клетки-хозяева поддерживаются в условиях, которые обеспечивают экспрессию представляющего интерес белка. Не встречающаяся(-иеся) в природе аминокислота(-ы) включается(-ются) в полипептидную цепь в ответ на не встречающийся в природе кодон. Например, одна или несколько не встречающихся в природе аминокислот включены в полипептид цитокина (например, IL-10). В качестве альтернативы, две или более не встречающихся в природе аминокислот могут быть включены в полипептид цитокина (например, IL-10) в двух или более сайтах в белке.

[124] После продуцирования в клетке-хозяине полипептида цитокина (например, IL-10), содержащего не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы), он может быть экстрагирован из нее различными методиками, известными в уровне техники, включая ферментативный, химический и/или осмотический лизис и физическое разрушение. Полипептид цитокина (например, IL-10) можно очищать посредством стандартных методик, известных в уровне техники, таких как препаративная ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография, или любой другой подходящей методики, известной специалистам в данной области.

[125] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью встречающейся в природе синтетазы. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота включена в цитокин с помощью организма, который ауксотрофен по одной или нескольким аминокислотам. В некоторых вариантах осуществления синтетазы, соответствующие аминокислоте, по которой имеется ауксотрофность, способны загружать соответствующую tRNA не встречающейся в природе аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой селеноцистеин или его производное. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой селенометионин или его производное. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой ароматическую аминокислоту, где ароматическая аминокислота содержит арилгалогенид, такой как йодид. В определенных вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота структурно подобна аминокислоте, по которой имеется ауксотрофность.

[126] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает не встречающуюся в природе аминокислоту, показанную на фиг. 1.

[127] В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает производное или аналог лизина или фенилаланина. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает производное лизина или аналог лизина. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает пирролизин (Pyl). В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает производное фенилаланина или аналог фенилаланина. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой не встречающуюся в природе аминокислоту, описанную в Wan et al. “Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool,” Biochim Biophys Acta 1844(6): 1059-4070 (2014). В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает не встречающуюся в природе аминокислоту, показанную на фиг. 2 (например, фиг. 2A и фиг. 2B).

[128] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает не встречающуюся в природе аминокислоту, показанную на фиг. 3A - фиг. 3D (на основе таблицы 1 из Dumas et al. Chemical Science 2015, 6, 50-69).

[129] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота, включенная в полипептид IL-10, раскрыта в US 9840493, US 9682934, US 2017/0260137, US 9938516 или US 2018/0086734. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены с помощью таких синтетаз, включают пара-метилазидо-L-фенилаланин, не встречающиеся в природе аминокислоты, содержащие, аралкил, гетероциклил и гетероаралкил, и производное лизина. В некоторых вариантах осуществления такие UAA содержат пиридил, пиразинил, пиразолил, триазолил, оксазолил, тиазолил, тиофенил или другой гетероцикл. Такие аминокислоты в некоторых вариантах осуществления содержат азиды, тетразины или другую химическую группу, способную к конъюгации с партнером по сочетанию, таким как растворимый в воде фрагмент. В некоторых вариантах осуществления UAA содержит азид, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством алкильного линкера. В некоторых вариантах осуществления алкильный линкер представляет собой линкер C₁-C₁₀. В некоторых вариантах осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством алкильного линкера. В некоторых вариантах осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством аминогруппы. В некоторых вариантах осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством алкиламиногруппы. В некоторых вариантах осуществления UAA содержит азид, присоединенный к концевому азоту (например, N6 производного лизина или N5, N4 или N3 производного, содержащего более короткую алкильную боковую цепь) боковой цепи аминокислоты посредством алкильной цепи. В некоторых вариантах осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к концевому азоту боковой цепи аминокислоты посредством алкильной цепи. В некоторых вариантах осуществления UAA содержит азид или тетразин, присоединенные к амиду посредством алкильного линкера. В некоторых вариантах осуществления UAA представляет собой азид- или тетразинсодержащий карбамат или амид 3-аминоаланина, серина, лизина или их производного. В некоторых вариантах осуществления такие UAA включены в цитокины in-vivo. В некоторых вариантах осуществления такие UAA включены в цитокины в бесклеточной системе.

Конъюгируемые фрагменты

[130] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты конъюгируемые фрагменты, которые связаны с полипептидом IL-10, описанным выше. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент представляет собой молекулу, которая нарушает взаимодействие IL-10 с его рецептором. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент представляет собой любую молекулу, которая при связывании с IL-10 позволяет конъюгату IL-10 модулировать иммунный ответ. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент связан с IL-10 посредством ковалентной связи. В некоторых случаях IL-10, описанный в данном документе, присоединен к конъюгируемому фрагменту с помощью триазольной группы. В некоторых случаях IL-10, описанный в данном документе, присоединен к конъюгируемому фрагменту с помощью дигидропиридазиновой или пиридазиновой группы. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер. В других случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает белок или его связывающий фрагмент. В дополнительных случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает пептид. В дополнительных случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает нуклеиновую кислоту. В дополнительных случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает малую молекулу. В дополнительных случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает биоконъюгат (например, агонист TLR, такой как агонист TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, или TLR9, или синтетический лиганд, такой как Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, Poly I:C, poly A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA, или флагеллин). В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент увеличивает период полужизни в сыворотке крови и/или улучшает стабильность. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент снижает взаимодействие цитокина с одним или несколькими доменами или субъединицами рецептора цитокина. В дополнительных случаях конъюгируемый фрагмент блокирует взаимодействие IL-10 с одним или несколькими доменами или субъединицами IL-10 с его когнатным(-и) рецептором(-ами). В некоторых вариантах осуществления конъюгаты IL-10, описанные в данном документе, содержат несколько конъюгируемых фрагментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент присоединен к не встречающейся в природе или встречающейся в природе аминокислоте в полипептиде IL-10. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10 содержит конъюгируемый фрагмент, присоединенный к встречающейся в природе аминокислоте. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10 присоединен к не встречающейся в природе аминокислоте в пептиде цитокина. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент присоединен к N- или C-концевой аминокислоте полипептида IL-10. В данном документе раскрыты различные комбинации сайтов, например, первый конъюгируемый фрагмент присоединен к не встречающейся в природе или встречающейся в природе аминокислоте в полипептиде IL-10, а второй конъюгируемый фрагмент присоединен к N- или C-концевой аминокислоте полипептида IL-10. В некоторых вариантах осуществления один конъюгируемый фрагмент присоединен к нескольким остаткам полипептида IL-10 (например, в виде скобки). В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент присоединен как к N-концевой, так и к C-концевой аминокислотам полипептида IL-10.

Растворимые в воде полимеры

[131] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой растворимый в воде полимер. В некоторых случаях растворимый в воде полимер является не относящимся к пептидам, нетоксичным и биосовместимым. Как используется в данном документе, вещество считается биосовместимым, если положительные эффекты, связанные с применением этого вещества отдельно или с другим веществом (например, активным средством, таким как фрагмент IL-10) в сочетании с живыми тканями (например, при введении пациенту), превосходят любые вредные эффекты согласно оценке клинициста, например, врача, токсиколога или специалиста по клиническим разработкам. В некоторых случаях растворимый в воде полимер, кроме того, является неиммуногенным. В некоторых случаях вещество считается неиммуногенным, если предполагаемое применение вещества in vivo не вызывает нежелательного иммунного ответа (например, образования антител) или, если развивается иммунный ответ, такой ответ не считается клинически значимым или важным согласно оценке клинициста, например, врача, токсиколога или специалиста по клинической разработке.

[132] В некоторых случаях водорастворимый полимер характеризуется наличием от приблизительно 2 до приблизительно 300 концов. Иллюстративные растворимые в воде полимеры включают без ограничения поли(алкиленгликоли), такие как полиэтиленгликоль (“PEG”), поли(пропиленгликоль) (“PPG”), сополимеры этиленгилколя и пропиленгликоля и т. п., поли(оксиэтилированный многоатомный спирт), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт) (PVA), полиакриламид (PAAm), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламид) (PHPMA), полидиметилакриламид (PDAAm), полифосфазен, полиоксазолины (“POZ”) (которые описаны в WO 2008/106186), поли(N-акрилоилморфолин) и комбинации любых упомянутых выше.

[133] В некоторых случаях растворимый в воде полимер не ограничивается конкретной структурой. В некоторых случаях растворимый в воде полимер является линейным (например, с блокированными концевыми группами, например, алкокси-PEG или бифункциональный PEG), разветвленным или многоцепочечным (например, вильчато-разветвленный PEG или PEG, присоединенный к ядру в виде многоатомного спирта), дендритным (или звездообразным) применительно к своей структуре, причем каждый с одной или несколькими способными к разрыву связями или без них. Более того, внутренняя структура растворимого в воде полимера может быть организована в виде любого количества различных повторяющихся паттернов и может быть выбрана из группы, состоящей из гомополимера, чередующегося сополимера, статистического сополимера, блок-сополимера, чередующегося триполимера, статистического триполимера и блок-триполимера.

[134] В некоторых вариантах осуществления средневесовая молекулярная масса растворимого в воде полимера в конъюгате IL-10 составляет от приблизительно 100 дальтон до приблизительно 150000 дальтон. Иллюстративные диапазоны включают, например, значения средневесовой молекулярной массы в диапазоне от более чем 5000 дальтон до приблизительно 100000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 6000 дальтон до приблизительно 90000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 10000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от более чем 10000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 20000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 53000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 25000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 29000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 35000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон и в диапазоне от приблизительно 40000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон.

[135] Иллюстративные значения средневесовой молекулярной массы растворимого в воде полимера включают приблизительно 100 дальтон, приблизительно 200 дальтон, приблизительно 300 дальтон, приблизительно 400 дальтон, приблизительно 500 дальтон, приблизительно 600 дальтон, приблизительно 700 дальтон, приблизительно 750 дальтон, приблизительно 800 дальтон, приблизительно 900 дальтон, приблизительно 1000 дальтон, приблизительно 1500 дальтон, приблизительно 2000 дальтон, приблизительно 2200 дальтон, приблизительно 2500 дальтон, приблизительно 3000 дальтон, приблизительно 4000 дальтон, приблизительно 4400 дальтон, приблизительно 4500 дальтон, приблизительно 5000 дальтон, приблизительно 5500 дальтон, приблизительно 6000 дальтон, приблизительно 7000 дальтон, приблизительно 7500 дальтон, приблизительно 8000 дальтон, приблизительно 9000 дальтон, приблизительно 10000 дальтон, приблизительно 11000 дальтон, приблизительно 12000 дальтон, приблизительно 13000 дальтон, приблизительно 14000 дальтон, приблизительно 15000 дальтон, приблизительно 20000 дальтон, приблизительно 22500 дальтон, приблизительно 25000 дальтон, приблизительно 30000 дальтон, приблизительно 35000 дальтон, приблизительно 40000 дальтон, приблизительно 45000 дальтон, приблизительно 50000 дальтон, приблизительно 55000 дальтон, приблизительно 60000 дальтон, приблизительно 65000 дальтон, приблизительно 70000 дальтон и приблизительно 75000 дальтон. Также могут применяться разветвленные версии растворимого в воде полимера (например, разветвленный растворимый в воде полимер 40000 дальтон, состоящий из двух полимеров по 20000 дальтон), имеющие суммарную молекулярную массу любого из упомянутых выше. В одном или нескольких вариантах осуществления конъюгат не будет иметь каких-либо фрагментов PEG, присоединенных либо непосредственно, либо опосредованно к PEG, имеющему средневесовую молекулярную массу менее чем приблизительно 6000 дальтон.

[136] PEG, как правило, будут содержать ряд мономеров (OCH₂CH₂) [или мономеров (CH₂CH₂O) в зависимости от того, как определяется PEG]. Как используется в данном документе, число повторяющихся звеньев обозначается подстрочным индексом “n” в “(OCH₂CH₂)_n”. Таким образом, значение (n), как правило, попадает в один или несколько из следующих диапазонов: от 2 до приблизительно 3400, от приблизительно 100 до приблизительно 2300, от приблизительно 100 до приблизительно 2270, от приблизительно 136 до приблизительно 2050, от приблизительно 225 до приблизительно 1930, от приблизительно 450 до приблизительно 1930, от приблизительно 1200 до приблизительно 1930, от приблизительно 568 до приблизительно 2727, от приблизительно 660 до приблизительно 2730, от приблизительно 795 до приблизительно 2730, от приблизительно 795 до приблизительно 2730, от приблизительно 909 до приблизительно 2730 и от приблизительно 1200 до приблизительно 1900. Для любого данного полимера, молекулярная масса которого известна, имеется возможность определения количества повторяющихся звеньев (т.е. "n") путем деления общей средневесовой молекулярной массы полимера на молекулярную массу повторяющегося мономера.

[137] В некоторых случаях растворимый в воде полимер представляет собой полимер с блокированными концевыми группами, то есть полимер, имеющий по меньшей мере один конец, подвергнутый блокированию с помощью относительно инертной группы, такой как низшая C_1-6алкоксигруппа или гидроксильная группа. Если полимер представляет собой PEG, например, можно использовать метокси-PEG (обычно обозначаемый как mPEG), который представляет собой линейную форму PEG, где один конец полимера представляет собой метоксигруппу (-OCH₃), тогда как другой конец представляет собой гидроксильную или другую функциональную группу, которая необязательно может быть химически модифицирована.

[138] В некоторых вариантах осуществления иллюстративные растворимые в воде полимеры включают без ограничения линейный или разветвленный дискретный PEG (dPEG) от Quanta Biodesign, Ltd.; линейные, разветвленные или вильчато-разветвленные PEG от Nektar Therapeutics; линейные, разветвленные или Y-образные производные PEG от JenKem Technology.

[139] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгирован с растворимым в воде полимером, выбранным из поли(алкиленгликолей), таких как полиэтиленгликоль (“PEG”), поли(пропиленгликоль) (“PPG”), сополимеры этиленгилколя и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный многоатомный спирт), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислота), поли(виниловый спирт) (PVA), полиакриламид (PAAm), полидиметилакриламид (PDAAm), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламид) (PHPMA), полифосфазен, полиоксазолины (“POZ”), поли(N-акрилоилморфолин) и их комбинация. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с PEG (например, пегилирован). В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с PPG. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с POZ. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с PVP.

[140] В некоторых случаях растворимый в воде полимер предусматривает полиглицерин (PG). В некоторых случаях полиглицерин представляет сбой гиперразветвленный PG (HPG) (например, описанный в Imran et al. “Influence of architecture of high molecular weight linear and branched polyglycerols on their biocompatibility and biodistribution,” Biomaterials 33:9135-9147 (2012)). В других случаях полиглицерин представляет собой линейный PG (LPG). В дополнительных случаях полиглицерин представляет собой среднефункциональный PG, линейный гиперразветвленный блоксополимер PG (например, описанный в Wurm et al. “Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library of linear and hyperbranched poly(glycerol)-protein conjugates,” Biomacromolecules 13:1161-1171 (2012)) или PG с функциональными группами в боковой цепи (например, описанный в Li et al. “Synthesis of linear polyether polyol derivatives as new materials for bioconjugation,” Bioconjugate Chem. 20:780-789 (2009).

[141] В некоторых случаях полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгирован с PG, например, HPG, LPG, среднефункциональным PG, линейным гиперразветвленным блоксополимером PG или PG с функциональными группами в боковой цепи.

[142] В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер является альтернативой для разлагаемого синтетического PEG. Иллюстративные альтернативы для разлагаемого синтетического PEG включают без ограничения поли[олиго(этиленгилколь)метилметакрилат] (POEGMA), производные PEG с модификацией основной цепи, созданные путем полимеризации телехелевых или функционализированных по двум концам макромономеров на основе PEG, производные PEG, содержащие сомономеры, содержащие разлагаемую связь, такие как поли[(этиленоксид)-ко-(метиленэтиленоксид)][P(EO-ко-MEO)], циклические кетенацетали, такие как 5,6-бензо-2-метилен-1,3-диоксепан (BMDO), 2-метилен-1,3-диоксепан (MDO) и 2-метилен-4-фенил-1,3-диоксолан (MPDL), сополимеризированный с OEGMA, или поли-(ε-капролактон)-привитый-поли(этиленоксид) (PCL-g-PEO).

[143] В некоторых случаях полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгирован с альтернативой для разлагаемого синтетического PEG, такой как например, POEGM; производные PEG с модификацией основной цепи, созданные путем полимеризации телехелевых или функционализированных по двум концам макромономеров на основе PEG; P(EO-ко-MEO), циклические кетенацетали, такие как BMDO, MDO и MPDL, сополимеризированный с OEGMA; или PCL-g-PEO.

[144] В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает поли(цвиттер-ионы). Иллюстративные поли(цвиттер-ионы) включают без ограничения поли(сульфобетаинметакрилат) (PSBMA), поли(карбоксибетаинметакрилат) (PCBMA) и поли(2-метилакрилоилоксиэтилфосфорилхолин) (PMPC). В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с поли(цвиттер-ионом), таким как PSBMA, PCBMA или PMPC.

[145] В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает поликарбонат. Иллюстративные поликарбонаты включают без ограничения пентафторфенил-5-метил-2-оксо-1,3-диоксан-5-карбоксилат (MTC-OC₆F₅). В некоторых случаях полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгирован с поликарбонатом, таким как MTC-OC₆F₅.

[146] В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полимерный гибрид, такой как, например, полимерный гибрид поликарбонат/PEG, конъюгат пептид/белок-полимер или содержащий гидроксил и/или цвиттер-ионный дериватизированный полимер (например, содержащий гидроксил и/или цвиттер-ионный дериватизированный PEG-полимер). В некоторых случаях полипептид IL-10, описанный в данном документе, конъюгирован с полимерным гибридом, таким как полимерный гибрид поликарбонат/PEG, конъюгат пептид/белок-полимер или содержащий гидроксил и/или цвиттер-ионный дериватизированный полимер (например, содержащий гидроксил и/или цвиттер-ионный дериватизированный PEG-полимер).

[147] В некоторых случаях растворимый в воде полимер предусматривает полисахарид. Иллюстративные полисахариды включают без ограничения декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с полисахаридом. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с декстраном. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с PSA. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с HA. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с амилозой. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с гепарином. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с HS. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с декстрином. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с HES.

[148] В некоторых случаях растворимый в воде полимер предусматривает гликан. Иллюстративные классы гликанов включают N-связанные гликаны, O-связанные гликаны, гликолипиды, O-GlcNAc и гликозаминогликаны. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с гликаном. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с N-связанными гликанами. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с O-связанными гликанами. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с гликолипидами. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с O-GlcNAc. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с гликозаминогликанами.

[149] В некоторых вариантах осуществления растворимый в воде полимер предусматривает полиоксазолиновый полимер. Полиоксазолиновый полимер представляет собой линейный синтетического полимер и, подобно PEG, характеризуется низкой полидисперсностью. В некоторых случаях полиоксазолиновый полимер представляет собой полидисперсный полиоксазолиновый полимер, характеризующийся средней молекулярной массой. В некоторых случаях средняя молекулярная масса полиоксазолинового полимера составляет, например, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, или 500,000 Да. В некоторых случаях полиоксазолиновый полимер предусматривает поли(2-метил-2-оксазолин) (PMOZ), поли(2-этил-2-оксазолин) (PEOZ) или поли(2-пропил-2-оксазолин) (PPOZ). В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с полиоксазолиновым полимером. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с PMOZ. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с PEOZ. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с PPOZ.

[150] В некоторых случаях растворимый в воде полимер предусматривает полимер на основе полиакриловой кислоты. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с полимером на основе полиакриловой кислоты.

[151] В некоторых случаях растворимый в воде полимер предусматривает полиамин. Полиамин является органическим полимером, содержащим две или более первичных аминогрупп. В некоторых вариантах осуществления полиамин предусматривает разветвленный полиамин, линейный полиамин или циклический полиамин. В некоторых случаях полиамин является низкомолекулярным линейным полиамином. Иллюстративные полиамины включают путресцин, кадаверин, спермидин, спермин, этилендиамин, 1,3-диаминопропан, гексаметилендиамин, тетраэтилметилендиамин и пиперазин. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с полиамином. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с путресцином, кадаверином, спермидином, спермином, этилендиамином, 1,3-диаминопропаном, гексаметилендиамином, тетраэтилметилендиамином и пиперазином.

[152] В некоторых случаях растворимый в воде полимер описан в патентах США №№ 7744861, 8273833 и 7803777. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с линкером, описанным в патентах США №№ 7744861, 8273833 или 7803777.

Липиды

[153] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой липид. В некоторых случаях липид представляет собой жирную кислоту. В некоторых случаях жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. В других случаях жирная кислота представляет собой ненасыщенную жирную кислоту. Иллюстративные жирные кислоты включают без ограничения жирные кислоты, содержащие от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых случаях липид связывается с одним или несколькими сывороточными белками с повышением тем самым стабильности в сыворотке крови и/или периода полужизни в сыворотке крови.

[154] В некоторых вариантах осуществления липид конъюгирован с полипептидом IL-10, описанным в данном документе. В некоторых случаях липид представляет собой жирную кислоту, например, насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту. В некоторых случаях жирная кислота содержит от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых случаях жирная кислота составляет приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, или 26 атомов углерода в длину. В некоторых случаях жирная кислота предусматривает капроновую кислоту (гексановую кислоту), энантовую кислоту (гептановую кислоту), каприловую кислоту (октановую кислоту), пеларгоновую кислоту (нонановую кислоту), каприновую кислоту (декановую кислоту), ундециловую кислоту (ундекановую кислоту), лауриновую кислоту (додекановую кислоту), тридециловую кислоту (тридекановую кислоту), миристиновую кислоту (тетрадекановую кислоту), пентадециловую кислоту (пентадекановую кислоту), пальмитиновую кислоту (гексадекановую кислоту), маргариновую кислоту (гептадекановую кислоту), стеариновую кислоту (октадекановую кислоту), нонадециловую кислоту (нонадекановую кислоту), арахидиновую кислоту (эйкозановую кислоту), генейкозиловую кислоту (геникозановую кислоту), бегеновую кислоту (докозановую кислоту), трикозиловую кислоту (трикозановую кислоту), лигноцериновую кислоту (тетракозановую кислоту), пентакозиловую кислоту (пентакозановую кислоту) или церотиновую кислоту (гексакозановую кислоту).

[155] В некоторых вариантах осуществления липидный конъюгат IL-10 повышает стабильность в сыворотке крови и/или период полужизни в сыворотке крови.

Белки

[156] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой белок или его связывающий фрагмент. Иллюстративные белки предусматривают альбумин, трансферрин или транстиретин. В некоторых случаях белок или его связывающий фрагмент предусматривают антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых случаях конъюгат IL-10 предусматривает белок или его связывающий фрагмент. В некоторых случаях конъюгат IL-10, содержащий белок или его связывающий фрагмент, характеризуется повышенными периодом полужизни и/или стабильностью в сыворотке крови. В некоторых случаях конъюгат IL-10, содержащий белок или его связывающий фрагмент, характеризуется пониженным взаимодействием IL-10 с одной или несколькими субъединицами IL-10R. В дополнительных случаях белок или его связывающий фрагмент блокируют взаимодействие IL-10 с одной или несколькими субъединицами IL-10R.

[157] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент представляет собой альбумин. Альбумин принадлежит к семейству растворимых в воде глобулярных белков. Обычно он обнаруживается в плазме крови, составляя приблизительно 55-60% всех белков плазмы крови. Сывороточный альбумин человека (HSA) представляет собой полипептид из 585 аминокислот, третичная структура которого разделена на три домена: домен I (аминокислотные остатки 1-195), домен II (аминокислотные остатки 196-383) и домен III (аминокислотные остатки 384-585). Каждый домен дополнительно содержит сайт связывания, который может обратимо или необратимо взаимодействовать с эндогенными лигандами, такими как длинноцепочечные и среднецепочечные жирные кислоты, билирубин или гемин, или с экзогенными соединениями, такими как гетероциклические или ароматические соединения.

[158] В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с альбумином. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с сывороточным альбумином человека (HSA). В дополнительных случаях полипептид IL-10 конъюгирован с функциональным фрагментом альбумина.

[159] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент представляет собой трансферрин. Трансферрин представляет собой полипептид из 679 аминокислот, который имеет размер приблизительно 80 кДа и содержит два сайта связывания Fe³⁺, один из которых находится в N-концевом домене, а другой находится в C-концевом домене. В некоторых случаях трансферрин человека характеризуется периодом полужизни, составляющим приблизительно 7-12 дней.

[160] В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с трансферрином. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с трансферрином человека. В дополнительных случаях полипептид IL-10 конъюгирован с функциональным фрагментом трансферрина.

[161] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент представляет собой транстиретин (TTR). Транстиретин является транспортным белком, расположенным в сыворотке крови и спинномозговой жидкости, который осуществляет транспорт тиреоидного гормона тироксина (T₄) и ретинол-связывающего белка, связанного с ретинолом.

[162] В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с транстиретином (через один из его концов или через внутреннюю шарнирную область). В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с функциональным фрагментом транстиретина.

[163] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент представляет собой антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты предусматривают гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, мышиное антитело или его связывающий фрагмент, химерное антитело или его связывающий фрагмент, моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, моновалентный Fab’, дивалентный Fab₂, F(ab)'₃-фрагменты, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), бис-scFv, (scFv)₂, диатело, минитело, нанотело, триатело, тетратело, Humabody, стабилизированный дисульфидными связями Fv-белок (dsFv), однодоменное антитело (sdAb), Ig NAR, верблюжье антитело или его связывающий фрагмент, биспецифическое антитело или его связывающий фрагмент или их химически модифицированное производное.

[164] В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает scFv, бис-scFv, (scFv)₂, dsFv или sdAb. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает scFv. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает бис-scFv. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает (scFv)₂. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает dsFv. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает sdAb.

[165] В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает Fc-часть антитела, например, IgG, IgA, IgM, IgE или IgD. В некоторых случаях фрагмент предусматривает Fc-часть IgG (например, IgG₁, IgG₃ или IgG₄).

[166] В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с гуманизированным антителом или его связывающим фрагментом, мышиным антителом или его связывающим фрагментом, химерным антителом или его связывающим фрагментом, моноклональным антителом или его связывающим фрагментом, моновалентным Fab’, дивалентным Fab₂, F(ab)'₃-фрагментами, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), бис-scFv, (scFv)₂, диателом, минителом, нанотелом, триателом, тетрателом, Humabody, стабилизированным дисульфидными связями Fv-белком (dsFv), однодоменным антителом (sdAb), Ig NAR, верблюжьим антителом или его связывающим фрагментом, биспецифическим антителом или его связывающим фрагментом или их химически модифицированным производным. В дополнительных случаях полипептид IL-10 конъюгирован с Fc-частью антитела. В дополнительных случаях полипептид IL-10 конъюгирован с Fc-частью IgG (например, IgG₁, IgG₃ или IgG₄).

[167] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 конъюгирован с растворимым в воде полимером (например, PEG) и антителом или его связывающим фрагментом. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты предусматривают гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, мышиное антитело или его связывающий фрагмент, химерное антитело или его связывающий фрагмент, моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, моновалентный Fab’, дивалентный Fab₂, F(ab)'₃-фрагменты, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), бис-scFv, (scFv)₂, диатело, минитело, нанотело, триатело, тетратело, Humabody, стабилизированный дисульфидными связями Fv-белок (dsFv), однодоменное антитело (sdAb), Ig NAR, верблюжье антитело или его связывающий фрагмент, биспецифическое антитело или его связывающий фрагмент или их химически модифицированное производное. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты предусматривают scFv, бис-scFv, (scFv)₂, dsFv или sdAb. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты предусматривают scFv. В некоторых случаях антитело или его связывающий фрагмент направляют конъюгат IL-10 к представляющей интерес клетке-мишени, а растворимый в воде полимер увеличивает стабильность и/или период полужизни в сыворотке крови.

[168] В некоторых случаях один или несколько конъюгатов полипептида IL-10 с растворимым в воде полимером (например, PEG) дополнительно связываются с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях отношение конъюгата IL-10 к антителу составляет приблизительно 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, или 12:1. В некоторых случаях отношение конъюгата IL-10 к антителу составляет приблизительно 1:1. В других случаях отношение конъюгата IL-10 к антителу составляет приблизительно 2:1, 3:1 или 4:1. В дополнительных случаях отношение конъюгата IL-10 к антителу составляет приблизительно 6:1 или больше.

[169] В некоторых вариантах осуществления один или несколько конъюгатов полипептида IL-10 с растворимым в воде полимером (например, PEG) непосредственно связаны с антителом или его связывающими фрагментами. В других случаях конъюгат IL-10 опосредованно связан с антителом или его связывающими фрагментами с помощью линкера. Иллюстративные линкеры включают гомобифункциональные линкеры, гетеробифункциональные линкеры, линкеры на основе малеимида, линкеры нулевой длины, саморасщепляющиеся линкеры, спейсеры и т.п.

[170] В некоторых вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты связаны либо непосредственно, либо опосредованно с частью, представляющей собой полипептид IL-10, в конъюгате полипептида IL-10 с растворимым в воде полимером (например, PEG). В таких случаях сайт конъюгации антитела с полипептидом IL-10 представляет собой сайт, который не будет препятствовать связыванию полипептида IL-10 с IL-10R. В дополнительных случаях сайт конъюгации антитела с полипептидом IL-10 представляет собой сайт, который частично блокирует связывание полипептида IL-10 с IL-10R. В других вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты связаны либо непосредственно, либо опосредованно с частью, представляющей собой растворимый в воде полимер, в конъюгате полипептида IL-10 с растворимым в воде полимером (например, PEG).

Пептиды

[171] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой пептид. В некоторых случаях пептид представляет собой неструктурированный пептид. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с пептидом. В некоторых случаях конъюгат IL-10, содержащий пептид, характеризуется повышенными периодом полужизни и/или стабильностью в сыворотке крови. В некоторых случаях конъюгат IL-10, содержащий пептид, характеризуется пониженным взаимодействием IL-10 с одной или несколькими субъединицами IL-10R. В дополнительных случаях пептид блокирует взаимодействие IL-10 с одной или несколькими субъединицами IL-10R.

[172] В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент представляет собой пептид XTEN™ (Amunix Operating Inc.), а модификация обозначается как XTENилирование. XTENилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид XTEN™ (Amunix Operating Inc.), представляющий собой длинный неструктурированный гидрофильный пептид, характеризующийся различным процентным содержанием шести аминокислот: Ala, Glu, Gly, Ser и Thr. В некоторых случаях пептид XTEN™ выбран на основании таких свойств, как экспрессия, генетическая стабильность, растворимость, устойчивость к агрегации, увеличенный период полужизни, повышенная эффективность и/или повышенная активность in vitro в комбинации с представляющим интерес полипептидом. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с пептидом XTEN.

[173] В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент представляет собой богатый глицином гомоаминокислотный полимер (HAP), а модификация называется HAPилированием. HAPилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей богатый глицином гомоаминокислотный полимер (HAP). В некоторых случаях полимер HAP содержит повторяющийся мотив (Gly₄Ser)_n (SEQ ID NO: 3) и иногда составляет приблизительно 50, 100, 150, 200, 250, 300 или более остатков в длину. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с HAP.

[174] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент представляет собой полипептид PAS, а модификация называется PASилированием. PASилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид PAS. Полипептид PAS представляет собой гидрофильный незаряженный полипептид, состоящий из остатков Pro, Ala и Ser. В некоторых случаях длина полипептид PAS составляет по меньшей мере приблизительно 100, 200, 300, 400, 500 или 600 аминокислот. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с полипептидом PAS.

[175] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент представляет собой подобный эластину полипептид (ELP), а модификация называется ELPилированием. ELPилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей подобный эластину полипептид (ELP). ELP содержит повторяющийся мотив VPGxG (SEQ ID NO: 4), в котором x представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с ELP.

[176] В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент представляет собой пептид CTP. Пептид CTP содержит пептид из 31 аминокислотного остатка FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ (SEQ ID NO: 5), в котором S* обозначает сайты O-гликозилирования (OPKO). В некоторых случаях пептид CTP является генетически слитым с полипептидом IL-10. В некоторых случаях полипептид IL-10 конъюгирован с пептидом CTP.

[177] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 модифицирован путем глутамилирования. Глутамилирование (или полиглутамилирование) представляет собой обратимую посттрансляционную модификацию глутамата, при которой γ-карбоксигруппа глутамата образует пептидоподобную связь с аминогруппой свободного глутамата, в котором посредством α-карбоксигруппы происходит удлинение полиглутаматной цепи.

[178] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 модифицирован полимером на основе желатиноподобного белка (GLK). В некоторых случаях полимер на основе GLK содержит несколько повторов Gly-Xaa-Yaa, где Xaa и Yaa главным образом предусматривают пролин и 4-гидроксипролин соответственно. В некоторых случаях полимер на основе GLK дополнительно содержит аминокислотные остатки Pro, Gly, Glu, Gln, Asn, Ser и Lys. В некоторых случаях длина полимера на основе GLK составляет приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150 остатков или больше.

Дополнительные конъюгируемые фрагменты

[179] В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает внеклеточный биомаркер. В некоторых случаях внеклеточный биомаркер представляет собой опухолевый антиген. В некоторых случаях иллюстративный внеклеточный биомаркер предусматривает CD19, PSMA, B7-H3, B7-H6, CD70, CEA, CSPG4, EGFRvIII, EphA3, EpCAM, EGFR, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, антиген Y системы Льюис, мезотелин, Muc1, Muc 16, ROR1, TAG72, VEGFR2, CD11, Gr-1, CD204, CD16, CD49b, CD3, CD4, CD8 и B220. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент связан или конъюгирован с IL-10. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент является генетически слитым, например, с N-концом или C-концом IL-10.

[180] В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент предусматривает молекулу посттрансляционной модификации. В некоторых случаях примеры посттрансляционной модификации включают миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование (или пренилирование) (например, фарнезилирование или геранилгеранилирование), глипирование, ацилирование (например, O-ацилирование, N-ацилирование, S-ацилирование), алкилирование (например, добавление алкильных групп, таких как метильные или этильные группы), амидирование, гликозилирование, гидроксилирование, йодирование, добавление нуклеотидов, окисление, фосфорилирование, сукцинилирование, сульфатирование, гликирование, карбамилирование, глутамилирование или дезамидирование. В некоторых случаях IL-10 модифицирован путем посттрансляционной модификации, такой как миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование (или пренилирование) (например, фарнезилирование или геранилгеранилирование), глипирование, ацилирование (например, O-ацилирование, N-ацилирование, S-ацилирование), алкилирование (например, добавление алкильных групп, таких как метильные или этильные группы), амидирование, гликозилирование, гидроксилирование, йодирование, добавление нуклеотидов, окисление, фосфорилирование, сукцинилирование, сульфатирование, гликирование, карбамилирование, глутамилирование или дезамидирование.

Конъюгация

Линкеры

[181] В некоторых вариантах осуществления применимые функциональные реакционноспособные группы для конъюгирования или связывания конъюгируемого фрагмента с полипептидом IL-10, описанным в данном документе, предусматривают, например, нулевые линкеры или линкеры более высокого порядка. В некоторых случаях не встречающаяся в природе аминокислота, включенная в интерлейкин, описанный в данном документе, содержит функциональную реакционноспособную группу. В некоторых случаях линкер содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с не встречающейся в природе аминокислотой, включенной в интерлейкин, описанный в данном документе. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с не встречающейся в природе аминокислотой, включенной в интерлейкин, описанный в данном документе. В некоторых случаях конъюгируемый фрагмент содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с линкером (необязательно предварительно присоединенным к пептиду цитокина), описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит реакционноспособную группу, которая реагирует со встречающейся в природе аминокислотой в полипептиде IL-10, описанном в данном документе. В некоторых случаях линкеры более высокого порядка предусматривают бифункциональные линкеры, такие как гомобифункциональные линкеры или гетеробифункциональные линкеры. Иллюстративные гомобифункциональные линкеры включают без ограничения реагент Ломанта дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N, N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидат (DMA), диметилпимелимидат (DMP), диметилсуберимидат (DMS), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (BMH), содержащее арилгалогенид соединение (DFDNB), такое как, например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, простой 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, o-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксиленсульфоновую кислоту, N, N'-этилен-бис(йодацетамид) или N, N'-гексаметилен-бис(йодацетамид).

[182] В некоторых вариантах осуществления бифункциональный линкер предусматривает гетеробифункциональный линкер. Иллюстративный гетеробифункциональный линкер включает без ограничения реакционноспособные в отношении аминогрупп и сульфгидрильные сшивающие линкеры, такие как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), растворимый в воде длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), сложный м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBs), сложный м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир (сульфо-MBs), N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (sIAB), сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-sMPB), сложный N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимидный эфир (GMBs), сложный N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-(((йодацетил)амино)гексаноил)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), реакционноспособные в отношении карбонильных групп и реакционноспособные в отношении сульфгидрильных групп сшивающие линкеры, такие как гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (MPBH), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксил-гидразид-8 (M₂C₂H), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), реакционноспособные в отношении аминогрупп и фотореакционноспособные сшивающие линкеры, такие как N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (NHs-AsA), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламидо)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB), N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-o-нитробензамидо)-этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4(4-азидофенил)1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил 4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-sAMCA), п-нитрофенилдиазопируват (ρNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), реакционноспособные в отношении сульфгидрильных групп и фотореакционноспособные сшивающие линкеры, такие как 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, бензофенон-4-малеимид, реакционноспособные в отношении карбонильных групп и фотореакционноспособные сшивающие линкеры, такие как п-азидобензоилгидразид (ABH), реакционноспособные в отношении карбоксилатных групп и фотореакционноспособные сшивающие линкеры, такие как 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA), и реакционноспособные в отношении аргинина и фотореакционноспособные сшивающие линкеры, такие как п-азидофенилглиоксаль (APG).

[183] В некоторых случаях реакционноспособная функциональная группа предусматривает нуклеофильную группу, которая является реакционноспособной по отношению к электрофильной группе, присутствующей в связываемом фрагменте (например, в конъюгируемом фрагменте или в IL-10). Иллюстративные электрофильные группы включают карбонильные группы, такие как альдегида, кетона, карбоновой кислоты, сложного эфира, амида, энона, ацилгалогенида или ангидрида кислоты. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная функциональная группа представляет собой альдегид. Иллюстративные нуклеофильные группы включают гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразид. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота, включенная в интерлейкин, описанный в данном документе, содержит электрофильную группу.

[184] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер является дипептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления дипептидный линкер представляет собой валин-цитруллин (Val-Cit), фенилаланин-лизин (Phe-Lys), валин-аланин (Val-Ala) и валин-лизин (Val-Lys). В некоторых вариантах осуществления дипептидный линкер представляет собой валин-цитруллин.

[185] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой пептидный линкер, содержащий, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более аминокислот. В некоторых случаях пептидный линкер содержит не более чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или меньше аминокислот. В дополнительных случаях пептидный линкер содержит приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50 аминокислот.

[186] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает саморасщепляющийся линкерный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляющийся линкерный фрагмент предусматривает п-аминобензиловый спирт (PAB), п-аминобензилоксикарбонил (PABC) или их производные или аналоги. В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает дипептидный линкерный фрагмент и саморасщепляющийся линкерный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляющийся линкерный фрагмент является таким, как описанный в патенте США № 9089614 и заявке WIPO № WO2015038426.

[187] В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой глюкуронид. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой расщепляемый кислотой линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый кислотой линкер представляет собой гидразин. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой восстанавливаемый линкер.

[188] В некоторых вариантах осуществления линкер предусматривает малеимидную группу. В некоторых случаях малеимидная группа также обозначается как малеимидный спейсер. В некоторых случаях малеимидная группа дополнительно предусматривает капроновую кислоту, образующую малеимидокапроил (mc). В некоторых случаях линкер предусматривает малеимидокапроил (mc). В некоторых случаях линкер представляет собой малеимидокапроил (mc). В других случаях малеимидная группа предусматривает малеимидометильную группу, такую как сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC) или сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), описанные выше.

[189] В некоторых вариантах осуществления малеимидная группа представляет собой самостабилизирующийся малеимид. В некоторых случаях самостабилизирующийся малеимид задействует диаминопропионовую кислоту (DPR) для включения основной аминогруппы, смежной с малеимидом, для обеспечения внутримолекулярного катализа гидролиза тиосукцинимидного кольца с исключением тем самым участия малеимида в реакции элиминирования посредством обратной реакции Михаэля. В некоторых случаях самостабилизирующийся малеимид представляет собой малеимидную группу, описанную в Lyon et al. “Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates,” Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014). В некоторых случаях линкер предусматривает самостабилизирующийся малеимид. В некоторых случаях линкер представляет собой самостабилизирующийся малеимид.

Химические превращения, связанные с конъюгацией

[190] Различные реакции конъюгации применяют для конъюгации линкеров, конъюгируемых фрагментов и не встречающихся в природе аминокислот, включенных в полипептиды IL-10, описанные в данном документе. Такие реакции конъюгации часто совместимы с водными условиями, как например “биоортогональные” реакции. В некоторых вариантах осуществления реакции конъюгации опосредуются химическими реагентами, такими как катализаторы, свет или реакционноспособные химические группы, содержащиеся в линкерах, конъюгируемых фрагментах или не встречающихся в природе аминокислотах. В некоторых вариантах осуществления реакции конъюгации опосредуются ферментами. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, применяемая в данном документе, описана в Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, применяемая в данном документе, описана в Chen, X.; Wu. Y-W. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5417.

[191] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации предусматривает реакцию кетона или альдегида с нуклеофилом. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию кетона с аминоксигруппой с образованием оксима. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию кетона с арильной или гетероариламиногруппой с образованием имина. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию альдегида с арильной или гетероариламиногруппой с образованием имина. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, приводит к получению полипептида IL-10, содержащего линкер или конъюгируемый фрагмент, присоединенный посредством оксима. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию Пикте-Шпенглера, в ходе которой альдегид или кетон реагирует с триптаминовым нуклеофилом. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию гидразино-Пикте-Шпенглера. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает лигирование Пикте-Шпенглера.

[192] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию азида и фосфина (лигирование Штаудингера). В некоторых вариантах осуществления фосфин представляет собой арилфосфин. В некоторых вариантах осуществления арилфосфин содержит группу сложного ортоэфира. В некоторых вариантах осуществления фосфин предусматривает структуру, представляющую собой метил-2-(дифенилфосфанил)бензоат. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, приводит к получению полипептида IL-10, содержащего линкер или конъюгируемый фрагмент, присоединенный посредством ариламида. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, приводит к получению полипептида IL-10, содержащего линкер или конъюгируемый фрагмент, присоединенный посредством амида.

[193] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения. В некоторых вариантах осуществления реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения предусматривает реакцию азида и фосфина (“клик”-реакцию). В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации катализируется медью. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, приводит к получению полипептида IL-10, содержащего линкер или конъюгируемый фрагмент, присоединенный посредством триазола. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию азида с напряженным олефином. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию азида с напряженным алкином. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию азида с циклоалкином, например, OCT, DIFO, DIFBO, DIBO, BARAC, TMTH, или другим напряженным циклоалкином, структуры которых показаны в Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. В некоторых вариантах осуществления реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения катализируется светом (“фотоклик”). В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию концевой аллильной группы с тетразолом и светом. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию концевой алкинильной группы с тетразолом и светом. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию O-аллиламинокислоты с тетразином и светом. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию O-аллилтирозина с тетразином и светом.

[194] В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию азида с циклоалкином, например DBCO. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает ,

где X представляет собой положение в конъюгате IL-10, в котором находится не встречающаяся в природе аминокислота. В некоторых вариантах осуществления конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа предусматривает алкин или азид. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает

, где X представляет собой положение в конъюгате IL-10, в котором находится не встречающаяся в природе аминокислота. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает

,

где X представляет собой положение в конъюгате IL-10, в котором находится не встречающаяся в природе аминокислота.

[195] В результате реакций конъюгации, таких как клик-реакция, описанная в данном документе, могут образовываться отдельный региоизомер или смесь региоизомеров. В некоторых случаях отношение региоизомеров составляет приблизительно 1:1. В некоторых случаях отношение региоизомеров составляет приблизительно 2:1. В некоторых случаях отношение региоизомеров составляет приблизительно 1,5:1. В некоторых случаях отношение региоизомеров составляет приблизительно 1,2:1. В некоторых случаях отношение региоизомеров составляет приблизительно 1,1:1. В некоторых случаях отношение региоизомеров составляет более чем 1:1.

[196] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию циклоприсоединения с обратными электронными требованиями, предусматривающую диен и диенофил. В некоторых вариантах осуществления диен предусматривает тетразин. В некоторых вариантах осуществления диенофил предусматривает алкен. В некоторых вариантах осуществления диенофил предусматривает алкин. В некоторых вариантах осуществления алкин является напряженным алкином. В некоторых вариантах осуществления алкен является напряженным диеном. В некоторых вариантах осуществления алкин представляет собой транс-циклооктин. В некоторых вариантах осуществления алкин представляет собой циклооктен. В некоторых вариантах осуществления алкин представляет собой циклопропен. В некоторых вариантах осуществления алкин представляет собой фторциклопропен. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, приводит к образованию полипептида IL-10, присоединенного к линкеру или конъюгируемому фрагменту посредством 6-членного кольцевого гетероцикла, содержащего два атома азота в кольце.

[197] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию олефинового метатезиса. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию алкена и алкина с рутениевым катализатором. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию двух алкенов с рутениевым катализатором. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию двух алкинов с рутениевым катализатором. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию алкена или алкина с рутениевым катализатором и аминокислотой, содержащей аллильную группу. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию алкена или алкина с рутениевым катализатором и аминокислотой, содержащей аллилсульфид или селенид. В некоторых вариантах осуществления рутениевый катализатор представляет собой катализатор Ховейда-Граббса 2-го поколения. В некоторых вариантах осуществления реакция олефинового метатезиса предусматривает реакцию одного или нескольких напряженных алкенов или алкинов.

[198] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию кросс-сочетания. В некоторых вариантах осуществления реакции кросс-сочетания предусматривают катализаторы на основе переходного металла, как например, на основе иридия, золота, рутения, родия, палладия, никеля, платины или другой катализатор на основе переходного металла, и один или несколько лигандов. В некоторых вариантах осуществления катализаторы на основе переходного металла являются растворимыми в воде. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию кросс-сочетания Сузуки-Мияуры. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию арилгалогенида (или трифлата, или тозилата), арил- или алкенилбороновой кислоты и палладиевого катализатора. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию кросс-сочетания Соногаширы. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию арилгалогенида (или трифлата, или тозилата), алкина и палладиевого катализатора. В некоторых вариантах осуществления реакции кросс-сочетания приводят к присоединению линкера или конъюгируемого фрагмента к полипептиду IL-10 посредством углерод-углеродной связи.

[199] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию снятия защиты или “освобождения” реакционноспособной группы перед конъюгацией. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает освобождение реакционноспособной группы с помощью света с последующей реакцией конъюгации. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена аралкильным фрагментом, содержащим одну или несколько нитрогрупп. В некоторых вариантах осуществления освобождение реакционноспособной группы приводит к получению свободного амина, сульфида или другой реакционноспособной группы. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает освобождение реакционноспособной группы с помощью катализатора на основе переходного металла с последующей реакцией конъюгации. В некоторых вариантах осуществления катализатор на основе переходного металла предусматривает палладий и один или несколько лигандов. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена аллильным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена аллильным карбаматом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена пропаргильным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена пропаргилкарбаматом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена диенофилом, где воздействие диена (такого как тетразин) приводит к снятию защиты с реакционноспособной группы.

[200] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает лиганд-направленную реакцию, где лиганд, (необязательно) присоединенный к реакционноспособной группе, обеспечивает сайт конъюгации между реакционноспособной группой и полипептидом IL-10. В некоторых вариантах осуществления лиганд расщепляется в ходе или после реакции полипептида IL-10 с реакционноспособной группой. В некоторых вариантах осуществления сайт конъюгации полипептида IL-10 представляет собой встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления сайт конъюгации полипептида IL-10 представляет собой лизин, цистеин или серин. В некоторых вариантах осуществления сайт конъюгации полипептида IL-10 представляет собой не встречающуюся в природе аминокислоту, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа предусматривает уходящую группу, такую как обедненная электронами арильная или гетероарильная группа. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа предусматривает уходящую группу, такую как обедненная электронами алкильная группа, которая замещается на полипептид IL-10. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию улавливающего радикалы средства с радикальной формой. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает реакцию добавления окислительного радикала. В некоторых вариантах осуществления улавливающее радикалы средство представляет собой ариламин. В некоторых вариантах осуществления радикальная форма представляет собой тирозильный радикал. В некоторых вариантах осуществления радикальные формы генерируются с помощью рутениевого катализатора (такого как [Ru(bpy)₃]) и света.

[201] Необязательно применяют ферментативные реакции для проведения реакций конъюгации, описанных в данном документе. Иллюстративные виды ферментативной конъюгации включают SortA-опосредованную конъюгацию, TGs-опосредованную конъюгацию или FGE-опосредованную конъюгацию. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации, описанная в данном документе, предусматривает лигирование нативного белка (NPL), в ходе которого концевая 1-амино-2-тиогруппа реагирует со сложным тиоэфиром с образованием амидной связи.

[202] В данном документе описаны различные реакции конъюгации для проведения реакции линкера или конъюгируемого фрагмента с полипептидом IL-10, где реакция происходит с участием встречающейся в природе (“канонической”) аминокислоты в полипептиде IL-10. В некоторых вариантах осуществления встречающаяся в природе аминокислота находится в положении конъюгации, обнаруживаемом в последовательности дикого типа, или, в качестве альтернативы, положение было подвергнуто мутации. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает образование дисульфидной связи при остатке IL-10. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию 1,4-присоединения Михаэля с участием цистеина или лизина. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает цианобензотиазольное лигирование IL-10. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает сшивание с ацетоновым фрагментом, таким как 1,3-дихлор-2-пропионон. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает 1,4-присоединение Михаэля, осуществляемое по отношению к дегидроаланину, образованному при реакции цистеина с O-мезитиленсульфонилгидроксиламином. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию тирозина с тиазолиндионом (TAD) или производным TAD. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации предусматривает реакцию триптофана с карбеноидом родия.

Способы применения

[203] Пролиферативные заболевания или состояния

[204] В некоторых вариантах осуществления в данном документе описан способ лечения пролиферативного заболевания или состояния у субъекта, нуждающегося в этом, который предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата IL-10, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых случаях рак представляет собой солидную опухоль. Иллюстративные солидные опухоли включают без ограничения рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. В некоторых случаях солидная опухоль представляет собой метастатический рак. В некоторых случаях солидная опухоль представляет собой рецидивный или рефрактерный рак после предыдущего лечения.

[205] В некоторых случаях конъюгат IL-10, описанный в данном документе, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, для лечения солидной опухоли. В таких случаях у субъекта имеется рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки (или почечно-клеточная карциному), рак легкого, меланома, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака мочевого пузыря. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака молочной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения колоректального. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака пищевода. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака головы и шеи. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака почки (или почечно-клеточной карциномы или RCC). В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака легкого. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения меланомы. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака яичника. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака поджелудочной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения рака предстательной железы. В некоторых случаях рак представляет собой метастатический рак. В других случаях рак представляет собой рецидивный рак. В дополнительных случаях рак представляет собой рефрактерный рак.

[206] В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой не подвергавшийся лечению рак. В таких случаях не подвергавшийся лечению рак представляет собой рак, в отношении которого не проводили лечение с помощью средства терапии. В некоторых случаях не подвергавшийся лечению рак представляет собой солидную опухоль, такую как рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки (или RCC), рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления в данном документе описан способ лечения не подвергавшейся лечению солидной опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, который предусматривает введение субъекту конъюгата IL-10, описанного в данном документе.

[207] В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых случаях конъюгат IL-10, описанный в данном документе, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, для лечения гематологического злокачественного новообразования. В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование предусматривает лейкоз, лимфому или миелому. В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой T-клеточное злокачественное новообразование. В других случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой В-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой метастатическое гематологическое злокачественное новообразование. В других случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой рецидивное гематологическое злокачественное новообразование. В дополнительных случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой рефрактерное гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется T-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется В-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL), фолликулярная лимфома (FL), диффузная B-крупноклеточная лимфома (DLBCL), лимфома из клеток мантийной зоны (MCL), макроглобулинемия Вальденстрема, множественная миелома, экстранодальная B-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны, узловая B-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны, лимфома Беркитта, неберкиттская В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома (PMBL), иммунобластная крупноклеточная лимфома, B-лимфобластная лимфома из клеток-предшественников, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарная лимфома, лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки, плазмаклеточная миелома, плазмацитома, медиастинальная (тимическая) В-крупноклеточная лимфома, внутрисосудистая В-крупноклеточная лимфома, первичная эффузионная лимфома или лимфоматоидный гранулематоз. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения CLL. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения SLL. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения FL. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения DLBCL. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения MCL. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения макроглобулинемии Вальденстрема. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения множественной миеломы. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят субъекту для лечения лимфомы Беркитта.

Дополнительные терапевтические средства

[208] В некоторых вариантах осуществления субъекту дополнительно вводят дополнительное терапевтическое средство. В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно с конъюгатом IL-10 и/или составляют совместно. В других случаях дополнительное терапевтическое средство и конъюгат IL-10 вводят последовательно, например, конъюгат IL-10 вводят до введения дополнительного терапевтического средства или конъюгат IL-10 вводят после введения дополнительного терапевтического средства.

[209] В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство предусматривает химиотерапевтическое средство, иммунотерапевтическое средство, направленную терапию, лучевую терапию или их комбинацию. Иллюстративные дополнительные терапевтические средства включают без ограничения алкилирующие средства, такие как альтретамин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, ломустин, мелфалан, оксалаплатин, темозоломид или тиотепа; антиметаболиты, такие как 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-MP), капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат или пеметрексед; антрациклины, такие как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин; ингибиторы топоизомеразы I, такие как топотекан или иринотекан (СРТ-11); ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид (VP-16), тенипозид или митоксантрон; ингибиторы митоза, такие как доцетаксел, эстрамустин, иксабепилон, паклитаксел, винбластин, винкристин или винорелбин; или кортикостероиды, такие как преднизон, метилпреднизолон или дексаметазон.

[210] В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство предусматривает средство терапии первой линии. Как используется в данном документе, “средство терапии первой линии” предусматривает средство первичного лечения для субъекта, страдающего раком. В некоторых случаях рак представляет собой первичный или локальный рак. В других случаях рак представляет собой метастатический или рецидивирующий рак. В некоторых случаях средство терапии первой линии предусматривает химиотерапию. В других случаях средство лечения первой линии предусматривает иммунотерапию, направленную терапию или лучевую терапию. Специалист сможет легко понять, что разные средства лечения первой линии могут быть применимы к разным типам рака.

[211] В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из алкилирующего средства, такого как альтретамин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, ломустин, мелфалан, оксалаплатин, темозоломид или тиотепа; антиметаболита, такого как 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-MP), капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат или пеметрексед; антрациклина, такого как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин; ингибитора топоизомеразы I, такого как топотекан или иринотекан (СРТ-11); ингибитора топоизомеразы II, такого как этопозид (VP-16), тенипозид или митоксантрон; ингибитора митоза, такого как доцетаксел, эстрамустин, иксабепилон, паклитаксел, винбластин, винкристин или винорелбин; или кортикостероида, такого как преднизон, метилпреднизолон или дексаметазон.

[212] В некоторых случаях конъюгат IL-10, описанный в данном документе, вводят с ингибитором фермента поли-(АДФ-рибоза)-полимераза (PARP). Иллюстративные ингибиторы PARP включают без ограничения олапариб (AZD-2281, Lynparza®, от Astra Zeneca), рукапариб (PF-01367338, Rubraca®, от Clovis Oncology), нирапариб (MK-4827, Zejula®, от Tesaro), талазопариб (BMN-673, от BioMarin Pharmaceutical Inc.), велипариб (ABT-888, от AbbVie), CK-102 (ранее CEP 9722, от Teva Pharmaceutical Industries Ltd.), E7016 (от Eisai), инипариб (BSI 201, от Sanofi) и памипариб (BGB-290, от BeiGene). В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят в комбинации с ингибитором PARP, таким как олапариб, рукапариб, нирапариб, талазопариб, велипариб, СК-102, E7016, инициариб или памипариб.

[213] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10, описанный в данном документе, вводят с ингибитором тирозинкиназы (TKI). Иллюстративные TKI включают без ограничения афатиниб, алектиниб, акситиниб, босутиниб, кабозантиниб, церитиниб, кобиметиниб, кризотиниб, дабрафениб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, ибрутиниб, иматиниб, лапатиниб, ленватиниб, нилотиниб, нинтеданиб, осимертиниб, пазопаниб, понатиниб, регорафениб, руксолитиниб, сорафениб, сунитиниб, тофацитиниб и вандетаниб.

[214] В некоторых случаях конъюгат IL-10, описанный в данном документе, вводят с ингибитором иммунной контрольной точки. Иллюстративные ингибиторы контрольной точки включают

[215] ингибиторы PD-L1, такие как дурвалумаб (Imfinzi) от AstraZeneca, атезолизумаб (MPDL3280A) от Genentech, авелумаб от EMD Serono/Pfizer, CX-072 от CytomX Therapeutics, FAZ053 от Novartis Pharmaceuticals, KN035 от 3D Medicine/Alphamab, LY3300054 от Eli Lilly или M7824 (антитело против PD-L1/ловушка TGF-бета) от EMD Serono;

[216] ингибиторы PD-L2, такие как AMP-224 от GlaxoSmithKline (Amplimmune) и rHIgM12B7;

[217] ингибиторы PD-1, такие как ниволумаб (Opdivo) от Bristol-Myers Squibb, пембролизумаб (Keytruda) от Merck, AGEN 2034 от Agenus, BGB-A317 от BeiGene, Bl-754091 от Boehringer-Ingelheim Pharmaceuticals, CBT-501 (генолимзумаб) от CBT Pharmaceuticals, INCSHR1210 от Incyte, JNJ-63723283 от Janssen Research & Development, MEDI0680 от MedImmune, MGA 012 от MacroGenics, PDR001 от Novartis Pharmaceuticals, PF-06801591 от Pfizer, REGN2810 (SAR439684) от Regeneron Pharmaceuticals/Sanofi или TSR-042 от TESARO;

[218] ингибиторы CTLA-4, такие как ипилимумаб (также известный как Yervoy®, MDX-010, BMS-734016 и MDX-101) от Bristol Meyers Squibb, тремелимумаб (CP-675,206, тицилимумаб) от Pfizer или AGEN 1884 от Agenus;

[219] ингибиторы LAG3, такие как BMS-986016 от Bristol-Myers Squibb, IMP701 от Novartis Pharmaceuticals, LAG525 от Novartis Pharmaceuticals или REGN3767 от Regeneron Pharmaceuticals;

[220] ингибиторы B7-H3, такие как эноблитузумаб (MGA271) от MacroGenics;

[221] ингибиторы KIR, такие как лирилумаб (IPH2101; BMS-986015) от Innate Pharma;

[222] ингибиторы CD137, такие как урелумаб (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), PF-05082566 (антитело против 4-1BB, PF-2566, Pfizer) или XmAb-5592 (Xencor);

[223] ингибиторы PS, такие как бавитуксимаб;

[224] а также ингибиторы, такие как антитело (например, моноклональное антитело, человеческое, гуманизированное или химерное антитело) или его фрагменты, молекулы RNAi или малые молекулы, связывающие TIM3, CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, OX40, GITR, ICOS, BTLA (CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2, или SLAM.

[225] В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят в комбинации с пембролизумабом, ниволумабом, тремелимумабом или ипилимумабом.

[226] В некоторых случаях конъюгат IL-10, описанный в данном документе, вводят с антителом, таким как алемтузумаб, трастузумаб, ибритумомаб тиуксетан, брентуксимаб ведотин, адо-трастузумаб эмтанзин или блинатумомаб.

[227] В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят с дополнительным терапевтическим средством выбранным из дополнительного цитокина. В некоторых случаях дополнительный цитокин усиливает и/или оказывает синергетическое действие на размножение и/или пролиферацию эффекторных Т-клеток. В некоторых случаях дополнительное цитокин предусматривает IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 или TNFα. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-7. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-15. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-21. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой TNFα.

[228] В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят с дополнительным терапевтическим средством выбранным из агониста рецептора. В некоторых случаях агонист рецептора предусматривает лиганд Toll-подобного рецептора (TLR). В некоторых случаях лиганд TLR предусматривает TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, или TLR9. В некоторых случаях лиганд TLR предусматривает синтетический лиганд, такой как, например, Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, Poly I:C, poly A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA или флагеллин. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят с одним или несколькими агонистами TLR, выбранными из TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, и TLR9. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят с одним или несколькими агонистами TLR, выбранными из Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, Poly I:C, poly A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA и флагеллина.

[229] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10 применяют в сочетании с терапией адоптивного переноса Т-клеток (ACT). В одном варианте осуществления ACT предусматривает идентификацию аутологичных Т-лимфоцитов у субъекта, например, с противоопухолевой активностью, размножение аутологичных Т-лимфоцитов in vitro и последующую реинфузию размноженных Т-лимфоцитов субъекту. В другом варианте осуществления ACT предусматривает применение аллогенных Т-лимфоцитов, например, с противоопухолевой активностью, размножение Т-лимфоцитов in vitro и последующую инфузию размноженных аллогенных Т-лимфоцитов субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых случаях конъюгат IL-10, описанный в данном документе, применяют в сочетании с аутологичными Т-лимфоцитами в качестве компонента терапии ACT. В других случаях конъюгат IL-10, описанный в данном документе, применяют в сочетании с аллогенными Т-лимфоцитами в качестве компонента терапии ACT. В некоторых случаях конъюгат IL-10 вводят одновременно со средством терапии ACT субъекту, нуждающемуся в этом. В других случаях конъюгат IL-10 вводят последовательно со средством терапии ACT субъекту, нуждающегося в этом.

[230] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10 применяют для ex vivo активации и/или размножения при переносе аутологичных и/или аллогенных T-клеток. В таких случаях конъюгат IL-10 применяют для активации и/или размножения образца, содержащего аутологичные и/или аллогенные T-клетки, и конъюгат IL-10 необязательно удаляют из образца перед введением образца субъекту, нуждающемуся в этом.

[231] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10 вводят с вакциной. В некоторых случаях конъюгат IL-10 используют в комбинации с онколитическим вирусом. В таких случаях конъюгат IL-10 действует в качестве стимулирующего средства для модулирования иммунного ответа. В некоторых случаях конъюгат IL-10 применяют с онколитическим вирусом в качестве компонента вспомогательной терапии. Иллюстративные онколитические вирусы включают T-Vec (Amgen), G47Δ (Todo et al.), JX-594 (Sillajen), CG0070 (Cold Genesys) и Reolysin (Oncolytics Biotech). В некоторых случаях конъюгат IL-10 применяют в комбинации с онколитическим вирусом, таким как T-Vec, G47Δ, JX-594, CG0070 или Reolysin.

[232] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-10 вводят в комбинации с применением лучевой терапии.

Получение полипептида IL-10

[233] В некоторых случаях полипептиды IL-10, описанные в данном документе, содержащие либо мутацию встречающейся в природе аминокислоты, либо мутацию не встречающейся в природе аминокислоты, получают рекомбинантно или синтезируют химическим путем. В некоторых случаях полипептиды IL-10, описанные в данном документе, получают рекомбинантно, например, либо с помощью системы клеток-хозяев, либо с помощью бесклеточной системы.

[234] В некоторых случаях полипептиды IL-10 получают рекомбинантно посредством системы клеток-хозяев. В некоторых случаях клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку (например, клетку млекопитающего, клетки насекомых, дрожжевые клетки или растительную клетку), прокариотическую клетку (например, грамположительную бактерию или грамотрицательную бактерию) или клетку археи. В некоторых случаях эукариотическая клетка-хозяин является клеткой-хозяином млекопитающего. В некоторых случаях клетка-хозяин млекопитающего представляет собой стабильную клеточную линию или клеточную линию, которая содержит представляющий интерес генетический материал, включенный в ее собственный геном, и обладает способностью экспрессировать продукт генетического материала после множества поколений клеточного деления. В других случаях клетка-хозяин млекопитающего представляет собой транзиентную клеточную линию или клеточную линию, которая не содержит представляющий интерес генетический материал, включенный в ее свой собственный геном, и не обладает способностью экспрессировать продукт генетического материала после множества поколений клеточного деления.

[235] Иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих включают клеточную линию 293T, клеточную линию 293A, клеточную линию 293FT, клетки 293F, клетки 293 H, клетки A549, клетки MDCK, клетки CHO DG44, клетки CHO-S, клетки CHO-K1, клетки Expi293F™, клеточную линию Flp-In™ T-REx™ 293, клеточную линию Flp-In™-293, клеточную линию Flp-In™-3T3, клеточную линию Flp-In™-BHK, клеточную линию Flp-In™-CHO, клеточную линию Flp-In™-CV-1, клеточную линию Flp-In™-Jurkat, клетки FreeStyle™ 293-F, клетки FreeStyle™ CHO-S, клеточную линию GripTite™ 293 MSR, клеточную линию GS-CHO, клетки HepaRG™, клеточную линию T-REx™ Jurkat, клетки Per.C6, клеточную линию T-REx™-293, клеточную линию T-REx™-CHO и клеточную линию T-REx™-HeLa.

[236] В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин является клеткой-хозяином насекомого. Иллюстративная клетка-хозяин насекомого включает клетки Drosophila S2, клетки Sf9, клетки Sf21, клетки High Five™ и клетки expresSF+®.

[237] В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин является дрожжевой клеткой-хозяином. Иллюстративные дрожжевые клетки-хозяева включают штаммы дрожжей Pichia pastoris, такие как GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H, и X-33, и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, такой как INVSc1.

[238] В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин является растительной клеткой-хозяином. В некоторых случаях растительные клетки предусматривают клетку водоросли. Иллюстративные линии растительных клеток включают штаммы из Chlamydomonas reinhardtii 137c или Synechococcus elongatus PPC 7942.

[239] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является прокариотической клеткой-хозяином. Иллюстративные прокариотические клетки-хозяева включают BL21, Mach1™, DH10B™, TOP10, DH5α, DH10Bac™, OmniMax™, MegaX™, DH12S™, INV110, TOP10F’, INVαF, TOP10/P3, ccdB Survival, PIR1, PIR2, Stbl2™, Stbl3™ или Stbl4™.

[240] В некоторых случаях подходящие молекулы полинуклеиновой кислоты или векторы для продуцирования полипептида IL-10, описанного в данном документе, предусматривают любые подходящие векторы, полученные либо из эукариотического, либо из прокариотического источника. Иллюстративные молекулы полинуклеиновой кислоты или векторы включают векторы, полученные из источника, относящегося к бактериям (например, E. coli), насекомым, дрожжам (например, Pichia pastoris), водорослям или млекопитающему. Векторы для экспрессии в бактериях включают, например, pACYC177, pASK75, серию векторов pBAD, серию векторов pBADM, серию векторов pET, серию векторов pETM, серию векторов pGEX, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, серию векторов pQE, pRSET A, pRSET B, pRSET C, серию pTrcHis2, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC или pTAC-MAT-2.

[241] Векторы для экспрессии в насекомых включают, например, pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M30b, pFastBac, векторы M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, FLAG, такие как pPolh-FLAG1 или pPolh-MAT 2, или векторы MAT, такие как pPolh-MAT1 или pPolh-MAT2.

[242] Векторы для экспрессии в дрожжах включают, например, вектор Gateway^® pDEST^™ 14, вектор Gateway^® pDEST^™ 15, вектор Gateway^® pDEST^™ 17, вектор Gateway^® pDEST^™ 24, вектор Gateway^® pYES-DEST52, вектор назначения pBAD-DEST49 Gateway^®, вектор pAO815 Pichia, вектор pFLD1 Pichi pastoris, вектор pGAPZA, B и C Pichia pastoris, вектор pPIC3.5K Pichia, вектор pPIC6 A, B и C Pichia, вектор pPIC9K Pichia, pTEF1/Zeo, вектор для экспрессии в дрожжах pYES2, вектор для экспрессии в дрожжах pYES2/CT, вектор для экспрессии в дрожжах pYES2/NT A, B и C или вектор для экспрессии в дрожжах pYES3/CT.

[243] Векторы для экспрессии в водорослях включают, например, вектор pChlamy-4 или вектор MCS.

[244] Векторы для экспрессии в млекопитающих включают, например, векторы для транзиентной экспрессии или векторы для стабильной экспрессии. Иллюстративные векторы для транзиентной экспрессии в млекопитающих включают p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a, b,c, pFLAG-CMV 5,1, pFLAG-CMV 5a, b,c, p3xFLAG-CMV 7,1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP-CMV 3, или pBICEP-CMV 4. Иллюстративные векторы для стабильной экспрессии в млекопитающих включают pFLAG-CMV 3, p3xFLAG-CMV 9, p3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, p3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc-CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1, или pBICEP-CMV 2.

[245] В некоторых случаях применяют бесклеточную систему для получения полипептида IL-10, описанного в данном документе. В некоторых случаях бесклеточная система предусматривает смесь цитоплазматических и/или ядерных компонентов клетки (например, состоящую из полностью очищенных рекомбинантных компонентов или частично очищенных компонентов) и является подходящей для синтеза нуклеиновых кислот in vitro. В некоторых случаях бесклеточная система предусматривает использование компонентов прокариотических клеток. В других случаях бесклеточная система предусматривает использование компонентов эукариотических клеток. Синтез нуклеиновых кислот выполняют в бесклеточной системе, например, на основе клетки представителя рода Drosophila, яйца представителя рода Xenopus, представителя рода Archaea или клеток HeLa. Иллюстративные бесклеточные системы включают систему, представляющую собой экстракт E. coli S30, E. coli T7 S30 или PURExpress® XpressCF и XpressCF+.

[246] Бесклеточные системы трансляции различным образом предусматривают компоненты, такие как плазмиды, mRNA, ДНК, tRNA, синтетазы, факторы высвобождения, рибосомы, белки-шапероны, факторы инициации трансляции и элонгации, встречающиеся в природе и/или не встречающиеся в природе аминокислоты и/или другие компоненты, используемые для экспрессии белка. Такие компоненты необязательно модифицированы для повышения выхода, увеличения скорости синтеза, повышения соответствия белкового продукта или включения не встречающихся в природе аминокислот. В некоторых вариантах осуществления цитокины, описанные в данном документе, синтезируют с использованием бесклеточных систем трансляции, описанных в US 8778631, US 2017/0283469, US 2018/0051065, US 2014/0315245 или US 8778631. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные системы трансляции предусматривают модифицированные факторы высвобождения или даже удаление одного или нескольких факторов высвобождения из системы. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные системы трансляции предусматривают пониженную концентрацию протеазы. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные системы трансляции содержат модифицированные tRNA с переназначенными кодонами, используемыми для кодирования не встречающихся в природе аминокислот. В некоторых вариантах осуществления синтетазы, описанные в данном документе, применяют для включения не встречающихся в природе аминокислот в бесклеточных системах трансляции. В некоторых вариантах осуществления tRNA предварительно загружают не встречающимися в природе аминокислотами с использованием ферментативных или химических способов перед добавлением в бесклеточную систему трансляции. В некоторых вариантах осуществления компоненты для бесклеточной системы трансляции получают из модифицированных организмов, таких как модифицированные бактерии, дрожжи или другой организм.

[247] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-10 получают в виде формы с круговыми перестановками либо посредством системы экспрессии хозяина, либо посредством бесклеточной системы.

Получение полипептида IL-10, содержащего не встречающуюся в природе аминокислоту

[248] В настоящем изобретении может использоваться ортогональный или расширенный генетический код, в котором один или несколько конкретных кодонов, присутствующих в последовательности нуклеиновой кислоты полипептида IL-10, предназначены для кодирования не встречающейся в природе аминокислоты, чтобы ее можно было генетически включить в IL-10 с использованием ортогональной пары tRNA-синтетаза/tRNA. Ортогональная пара tRNA-синтетаза/tRNA способна загружать tRNA не встречающейся в природе аминокислотой и способна включать эту не встречающуюся в природе аминокислоту в полипептидную цепь в ответ на взаимодействие с кодоном.

[249] В некоторых случаях кодон представляет собой кодон "янтарь", "опал", "охра" или квадруплетный кодон. В некоторых случаях кодон соответствует ортогональной tRNA, которая будет использоваться для переноса не встречающейся в природе аминокислоты. В некоторых случаях кодон представляет собой "янтарь". В других случаях кодон является ортогональным кодоном.

[250] В некоторых случаях кодон представляет собой квадруплетный кодон, который может быть декодирован ортогональной рибосомой ribo-Q1. В некоторых случаях квадруплетный кодон проиллюстрирован в Neumann et al. “Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome,” Nature, 464(7287): 441-444 (2010).

[251] В некоторых случаях кодон, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой рекодированный кодон, например, синонимичный кодон или редко используемый кодон, который заменяется на альтернативный кодон. В некоторых случаях рекодированный кодон описан в Napolitano et al. “Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli,” PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016). В некоторых случаях рекодированный кодон описан в Ostrov et al. “Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome,” Science 353(6301): 819-822 (2016).

[252] В некоторых случаях используют не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, что приводит к включению одной или нескольких не встречающихся в природе аминокислот в IL-10. Иллюстративные не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты включают без ограничения урацил-5-ил, гипоксантин-9-ил (I), 2-аминоаденин-9-ил, 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности 5-бром-, 5-трифторметил-, и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-дезазагуанин и 7-деазааденин, а также 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Некоторые не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, такие как 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-замещенные пурины, N-6-замещенные пурины, O-6-замещенные пурины, 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 5-метилцитозин, те, которые усиливают стабильность образующегося дуплекса, универсальные нуклеиновые кислоты, гидрофобные нуклеиновые кислоты, промискуитентные нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты увеличенного размера, фторированные нуклеиновые кислоты, 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и 0-6-замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин, 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 5-пропинил- (-C≡C-CH₃) урацил, 5-пропинилцитозин, другие алкинильные производные пиримидиновых нуклеиновых кислот, 6-азоурацил, 6-азоцитозин, 6-азотимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности 5-бром-, 5-трифторметил-, другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин, 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин, 8-азааденин, 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 3-деазагуанин, 3-деазааденин, трициклические пиримидины, феноксазинцитидин ([5,4-b][l,4]бензоксазин-2(3H)-он), фенотиазинцитидин (1H-пиримидо[5,4-b][l,4]бензотиазин-2(3H)-он), G-фиксирующие основания, феноксазинцитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-H-пиримидо[5,4-b][l,4]бензоксазин-2(3H)-он), карбазолцитидин (2H-пиримидо[4,5-b]индол-2-он), пиридоиндолцитидин (H-пиридо[3’,2’:4,5]пирроло[2,3-d]пиримидин-2-он), те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание замещено другими гетероциклами, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин, 2-пиридон, азацитозин, 5-бромцитозин, бромурацил, 5-хлорцитозин, хлорированный цитозин, циклоцитозин, цитозинарабинозид, 5-фторцитозин, фторпиримидин, фторурацил, 5,6-дигидроцитозин, 5-йодцитозин, гидроксимочевина, йодурацил, 5-нитроцитозин, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-фторурацил и 5-йодурацил, 2-аминоаденин, 6-тиогуанин, 2-тиотимин, 4-тиотимин, 5-пропинилурацил, 4-тиоурацил, N4-этилцитозин, 7-деазагуанин, 7-деаза-8-азагуанин, 5-гидроксицитозин, 2’-деоксиуридин, 2-амино-2’-деоксиаденозин, а также описанные в патентах США №№ 3687808; 4845205; 4910300; 4948882; 5093232; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 5681941; 5750692; 5763588; 5830653 и 6005096; WO 99/62923; Kandimalla et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858- 859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; и Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crookeand Lebleu Eds., CRC Press, 1993, 273-288. Дополнительные модификации оснований можно найти, например, в патенте США № 3687808; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; и Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke and Lebleu ed., CRC Press, 1993.

[253] В данной области доступны не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, содержащие различные гетероциклические основания и различные фрагменты сахаров (и аналоги сахаров), и нуклеиновые кислоты в некоторых случаях предусматривают одно или несколько гетероциклических оснований, отличных от основных пяти оснований, являющихся компонентами встречающихся в природе нуклеиновых кислот. Например, гетероциклическое основание предусматривает в некоторых случаях урацил-5-ильную, цитозин-5-ильную, аденин-7-ильную, аденин-8-ильную, гуанин-7-ильную, гуанин-8-ильную, 4-аминопирроло[2.3-d]пиримидин-5-ильную, 2-амино-4-оксопирроло[2,3-d]пиримидин-5-ильную, 2-амино-4-оксопирроло[2.3-d]пиримидин-3-ильную группы, где пурины присоединены к фрагменту сахара в нуклеиновой кислоте через 9-положение, пиримидины присоединены через 1-положение, пирролопиримидины присоединены через 7-положение, а пиразолопиримидины присоединены через 1-положение.

[254] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные аналоги также модифицированы по фосфатному фрагменту. Модифицированные по фосфату фрагменты включают без ограничения фрагменты с модификацией по связи между двумя нуклеотидами и предусматривают, например, фосфоротиоат, хиральный фосфоротиоат, фосфородитиоат, сложный фосфотриэфир, сложный аминоалкилфосфотриэфир, метил- и другие алкилфосфонаты, в том числе 3’-алкиленфосфонат и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3’-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты. Следует понимать, что эта фосфатная или модифицированная фосфатная связь между двумя нуклеотидами представляет собой 3’-5’-связь или 2’-5’-связь, и связь характеризуется обратной ориентацией, например, 3’-5’ к 5’-3’ или 2’-5’ к 5’-2’. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот. В многочисленных патентах Соединенных Штатов Америки раскрываются способы получения и применения нуклеотидов, содержащих модифицированные фосфаты, и включают без ограничения 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050.

[255] В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты включают 2’,3’-дидеокси-2’,3’-дидегидронуклеозиды (PCT/US2002/006460), 5’-замещенные производные ДНК и РНК (PCT/US2011/033961; Saha et al. J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; и Mikhailov et al. Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343; Leonid et al., 1995, 14(3-5), 901-905; и Eppacher et al. Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020; PCT/JP2000/004720; PCT/JP2003/002342; PCT/JP2004/013216; PCT/JP2005/020435; PCT/JP2006/315479; PCT/JP2006/324484; PCT/JP2009/056718; PCT/JP2010/067560) или 5’-замещенные мономеры, полученные в виде монофосфата с модифицированными основаниями (Wang et al. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337).

[256] В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты предусматривают модификации по 5’-положению и 2’-положению сахарного кольца (PCT/US94/02993), такие как 5’-CH₂-замещенные 2’-O-защищенные нуклеозиды (Wu et al. Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 и Wu et al. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924). В некоторых случаях не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты предусматривают амидсвязанные нуклеозидные димеры, полученные для включения в олигонуклеотиды, где 3’-связанный нуклеозид в димере (5’-3’) предусматривает 2’-OCH₃ и 5’-(S)-CH₃ (Mesmaeker et al. Synlett, 1997, 1287-1290). Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут предусматривать 2’-замещенные 5’-CH₂- (или O-) модифицированные нуклеозиды (PCT/US92/01020). Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут предусматривать 5’-метиленфосфонатные мономеры и димеры ДНК и РНК (Bohringer et al. Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al. Synlett, 1995, 7, 703-705; и Hutter et al. Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут предусматривать 5’-фосфонатные мономеры с 2’-заменой (US2006/0074035) и другие модифицированные 5’-фосфонатные мономеры (WO1997/35869). Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут предусматривать 5’-модифицированные метиленфосфонатные мономеры (EP614907 и EP629633). Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут предусматривать аналоги 5’- или 6’-фосфонатрибонуклеозидов, содержащие гидроксильную группу в 5’- и/или 6’-положении (Chen et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al. Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509; Gallier et al. Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933; и Hampton et al. J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут предусматривать 5’-фосфонатдезоксирибонуклеозидные мономеры и димеры с 5’-фосфатной группой (Nawrot et al. Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82). Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут предусматривать нуклеозиды с 6’-фосфонатной группой, где 5’ или/и 6’-положение является незамещенным или замещенным тио-трет-бутильной группой (SC(CH₃)₃) (и ее аналогами); метиленаминогруппой (CH₂NH₂) (и ее аналогами) или цианогруппой (CN) (и ее аналогами) (Fairhurst et al. Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al. J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038; Kappler et al. J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184; Vrudhula et al. J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al. J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377; Geze et al. J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640; и Hampton et al. J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414).

[257] В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты также предусматривают модификации фрагмента сахара. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты содержат один или несколько нуклеозидов, в которых сахарная группа была модифицирована. Такие модифицированные по сахару нуклеозиды могут обеспечивать повышенную стабильность по отношению к нуклеазе, повышенную аффинность связывания или некоторое другое полезное биологическое свойство. В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты содержат химически модифицированный рибофуранозный кольцевой фрагмент. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают без ограничения добавление групп-заместителей (в том числе 5’- и/или 2’-групп-заместителей, мостиковая связь двух кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA), замена атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или C(R₁)(R₂) (R=H, C₁-C₁₂алкил или защитная группа) и их комбинации). Примеры химически модифицированных сахаров можно найти в WO2008/101157, US2005/0130923 и WO2007/134181.

[258] В некоторых случаях модифицированная нуклеиновая кислота содержит модифицированные сахара или аналоги сахаров. Таким образом, в дополнение к рибозе и дезоксирибозе сахарный фрагмент может быть пентозой, дезоксипентозой, гексозой, дезоксигексозой, глюкозой, арабинозой, ксилозой, ликсозой или циклопентильной группой в качестве “аналога” сахара. Сахар может быть в форме пиранозила или фуранозила. Фрагмент сахара может быть фуранозидом рибозы, дезоксирибозы, арабинозы или 2’-O-алкилрибозы, и сахар может быть присоединен к соответствующим гетероциклическим основаниям либо в альфа-, либо в бета-аномерной конфигурации. Модификации сахара включают без ограничения аналоги 2’-алкокси-РНК, аналоги 2’-амино-РНК, 2’-фтор-ДНК и химерные формы 2’-алкокси- или амино-РНК/ДНК. Например, модификация сахара может предусматривать 2’-O-метил-уридин или 2’-O-метил-цитидин. Модификации сахара предусматривают 2’-O-алкил-замещенные дезоксирибонуклеозиды и 2’-O-этиленгликоль-подобные рибонуклеозиды. Известно получение таких сахаров или аналогов сахаров и соответствующих “нуклеозидов”, в которых такие сахара или аналоги присоединены к гетероциклическому основанию (основанию нуклеиновой кислоты). Модификации сахара также могут быть выполнены и объединены с другими модификациями.

[259] Модификации фрагмента сахара включают встречающиеся в природе модификации рибозы и дезоксирибозы, а также не встречающиеся в природе модификации. Модификации сахара включают без ограничения следующие модификации по 2’-положению: OH; F; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенные или незамещенные C₁-C₁₀-алкил или C₂-C₁₀-алкенил и -алкинил. 2’-Модификации сахара также включают без ограничения -O[(CH₂)_nO]_m CH₃, -O(CH₂)_nOCH₃, -O(CH₂)_nNH₂, -O(CH₂)_nCH₃, -O(CH₂)_nONH₂, и -O(CH₂)_nON[(CH₂)n CH₃)]₂, где n и m составляют от 1 до приблизительно 10.

[260] Другие модификации в 2’-положении включают без ограничения C₁-C₁₀-низший-алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, O-алкарил, O-аралкил, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂ CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида и другие заместители, обладающие подобными свойствами. Подобные модификации также могут быть выполнены в других положениях в сахаре, в частности в 3’-положении сахара в 3’-концевом нуклеотиде или в 2’-5’-связанных олигонуклеотидах и в 5’-положении 5’-концевого нуклеотида. Модифицированные сахара также включают сахара, которые содержат модификации по мостиковому кислороду в кольце, такие как CH₂ и S. Аналоги нуклеотидных сахаров также могут предусматривать миметики сахаров, такие как циклобутильные фрагменты вместо пентофуранозильного сахара. Существует множество патентов Соединенных Штатов Америки, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур и в которых подробно изложен и описан диапазон модификаций оснований, как например патенты США №№ 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5681941 и 5700920, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном своем объеме.

[261] Примеры нуклеиновых кислот, имеющих модифицированные фрагменты сахара, включают без ограничения нуклеиновые кислоты содержащие группы-заместители, представляющие собой 5’-винил, 5’-метил (R или S), 4’-S, 2’-F, 2’-OCH₃ и 2’-O(CH₂)₂OCH₃. Заместитель в 2’-положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-allyl, O-(C₁-C_1O alkyl), OCF₃, O(CH₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), и O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), где каждый R_m и R_n независимо представляет собой H или замещенный или незамещенной C₁-C₁₀алкил.

[262] В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, предусматривают одну или несколько бициклических нуклеиновых кислот. В таких определенных вариантах осуществления бициклическая нуклеиновая кислота содержит мостиковую связь между 4’- и 2’-атомами рибозильного кольца. В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, представленные в данном документе, предусматривают одну или несколько бициклических нуклеиновых кислот, где наличие мостиковой связи предусматривается 4’-2’-бициклической нуклеиновой кислотой. Примеры таких 4’-2’-бициклических нуклеиновых кислот включают без ограничения характеризующиеся любой из формул 4’-(CH₂)-O-2’ (LNA); 4’-(CH₂)-S-2’; 4’-(CH₂)₂-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH₃)-O-2’ и 4’-CH(CH₂OCH₃)-O-2’ и их аналоги (см. патент США № 7399845), 4’-C(CH₃)(CH₃)-O-2’ и ее аналоги (см. WO2009/006478, WO2008/150729, US2004/0171570, патент США № 7427672, Chattopadhyaya et al. J. Org. Chem., 209, 74, 118-134 и WO2008/154401). Также см., например, Singh et al. Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al. Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al. J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al. Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al. Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al. Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №№ 4849513; 5015733; 5118800; 5118802; 7053207; 6268490; 6770748; 6794499; 7034133; 6525191; 6670461 и 7399845; международные публикации №№ WO2004/106356, WO1994/14226, WO2005/021570, WO2007/090071 и WO2007/134181; публикации патентов США №№ US2004/0171570, US2007/0287831 и US2008/0039618; предварительные заявки на патенты США №№ 60/989574, 61/026995, 61/026998, 61/056564, 61/086231, 61/097787 и 61/099844, а также международные заявки №№ PCT/US2008/064591, PCT US2008/066154, PCT US2008/068922 и PCT/DK98/00393.

[263] В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты предусматривают связанные нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть связаны друг с другом с использованием любой связи между нуклеиновыми кислотами. Два основных класса групп, обеспечивающих связь между нуклеиновыми кислотами, определяются наличием или отсутствием атома фосфора. Типичные фосфорсодержащие связи между нуклеиновыми кислотами включают без ограничения сложные фосфодиэфиры, сложные фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидат и фосфоротиоаты (P=S). Типичные не содержащие фосфора группы, обеспечивающие связь между нуклеиновыми кислотами, включают без ограничения метиленметилимино (-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-), сложный тиодиэфир (-O-C(O)-S-), тионокарбамат (-O-C(O)(NH)-S-); силоксан (-O-Si(H)₂-O-) и N, N*-диметилгидразин (-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)). В определенных вариантах осуществления связи между нуклеиновыми кислотами, характеризующиеся наличием хирального атома, могут быть получены в виде рацемической смеси, в виде отдельных энантиомеров, например алкилфосфонатов и фосфоротиоатов. Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут содержать одну модификацию. Не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты могут содержать несколько модификаций в пределах одного из фрагментов или между разными фрагментами.

[264] Фосфатные модификации основной цепи нуклеиновой кислоты включают без ограничения метилфосфонат, фосфоротиоат, фосфорамидат (мостиковый или немостиковый), сложный фосфотриэфир, фосфородитиоат, фосфодитиоат и боранофосфат и могут быть применимы в любой комбинации. Также могут быть применимы другие нефосфатные связи.

[265] В некоторых вариантах осуществления модификации основной цепи (например, метилфосфонатные, фосфоротиоатные, фосфороамидантные и фосфородитиоатные межнуклеотидные связи) могут обеспечивать иммуномодулирующую активность для модифицированной нуклеиновой кислоты и/или повышать их стабильность in vivo.

[266] В некоторых случаях фосфорное производное (или модифицированная фосфатная группа) присоединено к фрагменту сахара или аналога сахара и может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфонат, фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфорамидат и т.п. Иллюстративные полинуклеотиды, содержащие модифицированные фосфатные связи или нефосфатные связи, можно найти в Peyrottes et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; и Schultz et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci, 1997, “Oligonucleotide Analogs: an Overview” в Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick and Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY; Zon, 1993, “Oligonucleoside Phosphorothioates” в Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190; Miller et al., 1971, JACS 93:6657-6665; Jager et al., 1988, Biochem. 27:7247-7246; Nelson et al., 1997, JOC 62:7278-7287; патенте США № 5453496 и Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179.

[267] В некоторых случаях модификация основной цепи предусматривает замещение фосфодиэфирной связи альтернативным фрагментом, таким как анионная, нейтральная или катионная группа. Примеры таких модификаций включают анионную межнуклеозидную связь; N3’-P5’ фосфорамидатную модификацию; боранофосфатная ДНК; проолигонуклеотиды; нейтральные межнуклеозидные связи, такие как метилфосфонатные; амид-связанную ДНК; метилен(метилиминовые) связи; формацетальные и тиоформацетальные связи; основные цепи, содержащие сульфонильные группы; морфолиноолигонуклеотиды; пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) и положительно заряженные дезоксирибонуклеиновые гуанидиновые (DNG) олигонуклеотиды (Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179). Модифицированная нуклеиновая кислота может содержать химерную или смешанную основную цепь, содержащую одну или несколько модификаций, например, комбинацию фосфатных связей, такую как комбинация фосфодиэфирных и фосфоротиоатный связей.

[268] Заместители фосфата включают, например, короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные межнуклеозидные связи, смешанные гетероатомные и алкильные или циклоалкильные межнуклеозидные связи или одну или несколько короткоцепочечных гетероатомных или гетероциклических межнуклеозидных связей. К ним относятся такие, которые предусматривают морфолиновые связи (частично образованные из сахарной части нуклеозида); силоксановые основные цепи; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые основные цепи; формацетиловые и тиоформацетиловые основные цепи; метиленформацетиловые и тиоформацетиловые основные цепи; алкенсодержащие основные цепи; сульфаматные основные цепи; метилениминовые и метиленгидразиновые основные цепи; сульфонатные и сульфонамидные основные цепи; амидные основные цепи и другие, имеющие смешанные составные части N, O, S и CH₂. В многочисленных патентах Соединенных Штатов Америки раскрывается получение и применение таких типов фосфатных замещений, и они включают без ограничения патенты США №№ 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439. В случае нуклеотидного заместителя также следует понимать, что как сахарный, так и фосфатные фрагменты нуклеотида могут быть заменены, например, связью амидного типа (аминоэтилглицин) (PNA). В патентах США №№ 5539082; 5714331 и 5719262 раскрыто получение и применение молекул PNA, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. См. также Nielsen et al. Science, 1991, 254, 1497-1500. Также можно связывать другие типы молекул (конъюгатов) с нуклеотидами или нуклеотидными аналогами для усиление, например, поглощения клеткой. Конъюгаты могут быть химически связаны с нуклеотидом или нуклеотидными аналогами. Такие конъюгаты включают без ограничения липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), холевую кислоту (Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al. Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al. Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), алифатическую цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al. EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al. FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al. Biochimie, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтиламмония l-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-S-H-фосфонат (Manoharan et al. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), полиаминовую или полиэтиленгликолевую цепь (Manoharan et al. Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al. Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент (Crooke et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937). В многочисленных патентах Соединенных Штатов Америки раскрывается получение таких конъюгатов, и они включают без ограничения патенты США №№ 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717; 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241; 5391723; 5416203; 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.

[269] В некоторых случаях не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты дополнительно образуют не встречающиеся в природе пары оснований. Иллюстративные не встречающиеся в природе нуклеотиды, способные образовывать не встречающуюся в природе пару оснований (UBP) ДНК или РНК в условиях in vivo, включают без ограничения 5SICS, d5SICS, NAM, dNaM и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе нуклеотиды предусматривают

[270] В некоторых случаях не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты дополнительно образуют не встречающиеся в природе пары оснований. Иллюстративные не встречающиеся в природе нуклеотиды, способные образовывать не встречающуюся в природе пару оснований (UBP) ДНК или РНК в условиях in vivo, включают без ограничения TPT3, dTPT3, 5SICS, d5SICS, NaM, dNaM, CNMO, dCNMO и их комбинации. Другие примеры не встречающихся в природе нуклеотидов, способных образовывать не встречающиеся в природе UBP, которые можно применять для получения конъюгатов IL-10, раскрытых в данном документе, можно найти в Dien et al. J Am Chem Soc., 2018, 140:16115-16123; Feldman et al. J Am Chem Soc, 2017, 139:11427-11433; Ledbetter et al. J Am Chem Soc., 2018, 140:758-765; Dhami et al. Nucleic Acids Res. 2014, 42:10235-10244; Malyshev et al. Nature, 2014, 509:385-388; Betz et al. J Am Chem Soc., 2013, 135:18637-18643; Lavergne et al. J Am Chem Soc. 2013, 135:5408-5419; и Malyshev et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:12005-12010.

[271] В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе нуклеотиды, которые можно применять для получения конъюгатов IL-10, раскрытых в данном документе, можно получить из соединения формулы

где R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, алкенила, алкинила, метокси, метантиола, метанселено, галогена, циано и азидо; а

волнистой линией показана связь с рибозилом или 2’-дезоксирибозилом, при этом 5’-гидроксигруппа рибозильного или 2’-дезоксирибозильного фрагмента находится в свободной форме или необязательно связана с монофосфатной, дифосфатной или трифосфатной группой.

[272] В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе нуклеотиды, которые можно применять для получения конъюгатов IL-10, раскрытых в данном документе, можно получить из , , , , и .

В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе нуклеотиды, которые можно применять для получения конъюгатов IL-10, раскрытых в данном документе, включают , , , , и или их соли.

[273] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид IL-10 с помощью пары синтетический кодон/антикодон, включающей пары, перечисленные ниже.

Кодон (mRNA)	Антикодон (tRNA)
UUX	YAA или XAA
UGX	YCA или XCA
CGX	YCG или XCG
AGX	YCU или XCU
GAX	YUC или XUC
CAX	YUG или XUG
GXU	AYC
CXU	AYG
GXG	CYC
AXG	CYU
GXC	GYC
AXC	GYU
GXA	UYC
CXC	GYG
UXC	GYA
AUX	YAU или XAU
CUX	XAG или YAG
GUX	XAC или YAC
UAX	XUA или YUA
GGX	XCC или YCC

При этом X и Y предусматривают не встречающееся в природе основание, раскрытое в данном документе. Например, X может представлять собой нуклеотид, полученный из , а Y может представлять собой нуклеотид, полученный из .

[274] В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе пара оснований обуславливает не встречающуюся в природе аминокислоту, описанную в Dumas et al. “Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology,” Chemical Science, 6: 50-69 (2015).

[275] Клетку-хозяина, в которую вводят конструкции или векторы, раскрытые в данном документе, культивируют или поддерживают в подходящей среде, вследствие чего продуцируются представляющие интерес tRNA, tRNA-синтетаза и белок. Среда также содержит не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы), вследствие чего представляющий интерес белок содержит не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы).

[276] Ортогональная пара tRNA-синтетаза/tRNA загружает tRNA не встречающейся в природе аминокислотой и включает не встречающуюся в природе аминокислоту в полипептидную цепь в ответ на взаимодействие с кодоном. Иллюстративные пары aaRS-tRNA вкючают без ограничения пары aaRS/tRNA Methanococcus jannaschii (Mj-Tyr), пары TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/tRNA_CUA B. stearothermophilus, пары LeuRS E. coli (Ec-Leu)/tRNA_CUA B. stearothermophilus и пары пирролизил-tRNA.

[277] Полипептид IL-10, содержащий не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы), получают путем введения в клетку-хозяина конструкций на основе нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе, предусматривающих tRNA и tRNA-синтетазу и предусматривающих представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты с одним или несколькими ортогональными (стоп-) кодонами, находящимися в пределах рамки считывания. Клетку-хозяина подвергают воздействию физиологического раствора, содержащего не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы), а затем клетки-хозяева поддерживают в условиях, которые обеспечивают экспрессию кодирующей представляющий интерес белок последовательности. Не встречающаяся(-иеся) в природе аминокислота(-ы) включается(-ются) в полипептидную цепь в ответ на кодон. Например, одна или несколько не встречающихся в природе аминокислот включены в полипептид IL-10. В качестве альтернативы, две или более не встречающихся в природе аминокислот могут быть включены в полипептид IL-10 в двух или более сайтах в белке.

[278] Если несколько не встречающихся в природе аминокислот подлежат включению в полипептид IL-10, будет понятно, что несколько кодонов необходимо будет включить в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты в требуемых положениях, чтобы пары tRNA-синтетаза/tRNA могли осуществлять направленное включение не встречающихся в природе аминокислот в ответ на взаимодействие с кодоном(-ами). По меньшей мере 1, 2, 3, 4 или более кодирующих кодон нуклеиновых кислот могут быть включены в представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты.

[279] Если необходимо включить более чем один тип не встречающейся в природе аминокислоты в один белок, являющийся представляющим интерес белком, может быть использована вторая или дополнительная ортогональная пара tRNA/tRNA-синтетаза для включения второй или дополнительной не встречающейся в природе аминокислоты; в подходящем случае указанная вторая или дополнительная ортогональная пара tRNA/tRNA-синтетаза распознает отличающийся кодон в нуклеиновой кислоте, кодирующей представляющий интерес белок, вследствие чего две или более не встречающихся в природе аминокислот могут быть специфически включены в различные определенные сайты в белке на одной стадии получения. В определенных вариантах осуществления, таким образом, могут применяться две или более ортогональные пары tRNA/tRNA-синтетаза.

[280] После продуцирования в клетке-хозяине полипептида IL-10, содержащего не встречающуюся(-иеся) в природе аминокислоту(-ы), он может быть экстрагирован из нее посредством ряда различных методик, известных в уровне техники, включая ферментативный, химический и/или осмотический лизис и физическое разрушение. Полипептид IL-10 может быть очищен посредством стандартных методик, известных в уровне техники, таких как препаративная хроматография, аффинная очистка или любая другая подходящая методика.

[281] Подходящие клетки-хозяева могут включать бактериальные клетки (например, E. coli), но в наиболее подходящем случае клетки-хозяева являются эукариотическими клетками, например, клетками насекомых (например, представителя рода Drosophila, такого как Drosophila melanogaster), дрожжевыми клетками, клетками нематод (например, Caenorhabditis elegans), мышей (например, Mus musculus) или млекопитающих (такими как клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки COS, клетки человека 293T, клетки HeLa, клетки NIH 3T3 и клетки эритролейкоза мыши (MEL)), или клетками человека или другими эукариотическими клетками. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области. В подходящем случае клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека, или клетку насекомого.

[282] Подходящие клетки-хозяева могут включать бактериальные клетки (например, E. coli, BL21(DE3)), но в наиболее подходящем случае клетки-хозяева являются эукариотическими клетками, например, клетками насекомых (например, представителя рода Drosophila, такого как Drosophila melanogaster), дрожжевыми клетками, клетками нематод (например, C. elegans), мышей (например Mus musculus) или млекопитающих (такими как клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки COS, клетки человека 293T, клетки HeLa, клетки NIH 3T3 и клетки эритролейкоза мыши (MEL)), или клетками человека или другими эукариотическими клетками. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области. В подходящем случае клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека, или клетку насекомого. В некоторых вариантах осуществления подходящие клетки-хозяева предусматривают E. coli.

[283] Другими подходящими клетками-хозяевами, которые обычно можно применять в вариантах осуществления настоящего изобретения, являются клетки, упомянутые в разделе примеров. Векторная ДНК может быть введена в клетки-хозяева с помощью традиционных методик трансформации или трансфекции. Используемые в данном документе термины "трансформация" и "трансфекция" предназначены для обозначения ряда различных хорошо известных методик введения чужеродной молекулы нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, в том числе совместное осаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекция, опосредованная DEAE-декстраном, липофекция или электропорация. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев хорошо известны в уровне техники.

[284] При создании клеточных линий предпочтительным обычно является получение стабильных клеточных линий. Известно, что, например, для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, в зависимости от используемых вектора экспрессии и методики трансфекции, только небольшая часть клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Для идентификации и отбора этих интегрантов ген, который кодирует селектируемый маркер (например, устойчивости к антибиотикам), обычно вводят в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном. Предпочтительные селектируемые маркеры предусматривают маркеры, которые обеспечивают устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие селектируемые маркер, могут быть введены в клетку-хозяина в составе одного и того же вектора или могут быть введены в составе отдельных векторов. Клетки, стабильно трансфицированные введенной молекулой нуклеиновой кислоты, можно идентифицировать путем отбора в отношении чувствительности к лекарственному средству (например, клетки, в которые произошло включение гена селектируемого маркера, выживут, в то время как другие клетки погибнут).

[285] В одном варианте осуществления конструкции, описанные в данном документе, интегрируют в геном клетки-хозяина. Преимущество стабильной интеграции состоит в том, что достигается однородность между отдельными клетками или клонами. Другое преимущество заключается в возможности осуществления отбора наилучших продуцентов. Соответственно, желательным является создание стабильных клеточных линий. В другом варианте осуществления конструкциями, описанными в данном документе, трансфицируют клетку-хозяина. Преимущество трансфекции конструкциями клетки-хозяина состоит в том, что показатели выхода белка могут быть максимизированы. В одном аспекте описана клетка, содержащая конструкцию на основе нуклеиновой кислоты или вектор, описанный в данном документе.

Фармацевтические композиции и составы

[286] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции и составы, описанные в данном документе, вводят субъекту несколькими путями введения, включая без ограничения парентеральный, пероральный или трансдермальный пути введения. В некоторых случаях парентеральное введение включает внутривенное, подкожное, внутримышечное, внутримозговое, интраназальное, внутриартериальное, внутрисуставное, внутрикожное, интравитреальное, внутрикостное вливание, внутрибрюшинное или интратекальное введение. В некоторых случаях фармацевтическая композиция составлена для локального введения. В других случаях фармацевтическая композиция составлена для системного введения.

[287] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы включают без ограничения водные жидкие дисперсии, самоэмульгирующиеся дисперсии, липосомальные дисперсии, аэрозоли, составы с немедленным высвобождением, составы с контролируемым высвобождением, составы с замедленным высвобождением, составы с пролонгированным высвобождением, составы с пульсирующим высвобождением и смешанные составы с немедленным и контролируемым высвобождением.

[288] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы содержат носитель или материалы носителя, выбранные на основании совместимости с композицией, раскрытой в данном документе, и свойств профиля высвобождения требуемой лекарственной формы. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980, и Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999).

[289] В некоторых случаях фармацевтическая композиция составлена в виде иммунолипосомы, которая содержит совокупность конъюгатов IL-10, непосредственно или опосредованно связанных с липидным бислоем липосом. Иллюстративные липиды включают без ограничения жирные кислоты; фосфолипиды; стеролы, такие как холестерины; сфинголипиды, такие как сфингомиелин; гликосфинголипиды, такие как ганглиозиды, глобозиды и цереброзиды; амины поверхностно-активных веществ, такие как стеарил-, олеил- и линолеиламины. В некоторых случаях липид предусматривает катионный липид. В некоторых случаях липид предусматривает фосфолипид. Иллюстративные фосфолипиды включают без ограничения фосфатидную кислоту (“PA”), фосфатидилхолин (“PC”), фосфатидилглицерин (“PG”), фосфатидилэтаноламин (“PE”), фосфатидилинозитол (“PI”) и фосфатидилсерин (“PS”), сфингомиелин (в том числе сфингомиелин головного мозга), лецитин, лизолецитин, лизофосфатидилэтаноламин, цереброзиды, диарахидоилфосфатидилхолин (“DAPC”), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилхолин (“DDPC”), диэлаидоилфосфатидилхолин (“DEPC”), дилауроилфосфатидилхолин (“DLPC”), дилинолеоилфосфатидилхолин, димиристоилфосфатидилхолин (“DMPC”), диолеоилфосфатидилхолин (“DOPC”), дипальмитоилфосфатидилхолин (“DPPC”), дистеароилфосфатидилхолин (“DSPC”), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин (“POPC”), диарахидоилфосфатидилглицерин (“DAPG”), дидеканоил-L-альфафосфатидилглицерин (“DDPG”), диэлаидоилфосфатидилглицерин (“DEPG”), дилауроилфосфатидилглицерин (“DLPG”), дилинолеоилфосфатидилглицерин, димиристоилфосфатидилглицерин (“DMPG”), диолеоилфосфатидилглицерин (“DOPG”), дипальмитоилфосфатидилглицерин (“DPPG”), дистеароилфосфатидилглицерин (“DSPG”), 1-пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилглицерин (“POPG”), диарахидоилфосфатидилэтаноламин (“DAPE”), дидеканоил-L-альфафосфатидилэтаноламин (“DDPE”), диэлаидоилфосфатидилэтаноламин (“DEPE”), дилауроилфосфатидилэтаноламин (“DLPE”), дилинолеоилфосфатидилэтаноламин, димиристоилфосфатидилэтаноламин (“DMPE”), диолеоилфосфатидилэтаноламин (“DOPE”), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (“DPPE”), дистеароилфосфатидилэтаноламин (“DSPE”), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин (“POPE”), диарахидоилфосфатидилинозитол (“DAPI”), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилинозитол (“DDPI”), диэлаидоилфосфатидилинозитол (“DEPI”), дилауроилфосфатидилинозитол (“DLPI”), дилинолеоилфосфатидилинозитол, димиристоилфосфатидилинозитол (“DMPI”), диолеоилфосфатидилинозитол (“DOPI”), дипальмитоилфосфатидилинозитол (“DPPI”), дистеароилфосфатидилинозитол (“DSPI”), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилинозитол (“POPI”), диарахидоилфосфатидилсерин (“DAPS”), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилсерин (“DDPS”), диэлаидоилфосфатидилсерин (“DEPS”), дилауроилфосфатидилсерин (“DLPS”), дилинолеоилфосфатидилсерин, димиристоилфосфатидилсерин (“DMPS”), диолеоилфосфатидилсерин (“DOPS”), дипальмитоилфосфатидилсерин (“DPPS”), дистеароилфосфатидилсерин (“DSPS”), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилсерин (“POPS”), диарахидоилсфингомиелин, дидеканоилсфингомиелин, диэлаидоилсфингомиелин, дилауроилсфингомиелин, дилинолеоилсфингомиелин, димиристоилсфингомиелин, сфингомиелин, диолеоилсфингомиелин, дипальмитоилсфингомиелин, дистеароилсфингомиелин и 1-пальмитоил-2-олеоилсфингомиелин.

[290] В некоторых случаях фармацевтические составы дополнительно содержат регулирующие pH средства или буферные средства, которые включают кислоты, такие как уксусная, борная, лимонная, молочная, фосфорная и соляная кислоты, основания, такие как гидроксид натрия, фосфат натрия, борат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, лактат натрия и трис-гидроксиметиламинометан, и буферы, такие как цитрат/декстроза, бикарбонат натрия и хлорид аммония. Такие кислоты, основания и буферы содержатся в количестве, необходимом для поддержания pH композиции в приемлемом диапазоне.

[291] В некоторых случаях фармацевтический состав содержит одну или несколько солей в количестве, необходимом для доведения осмоляльности композиции до приемлемого диапазона значений. Такие соли включают соли, характеризующиеся катионами натрия, калия или аммония и анионами хлорида, цитрата, аскорбата, бората, фосфата, бикарбоната, сульфата, тиосульфата или бисульфита, при этом подходящие соли включают хлорид натрия, хлорид калия, тиосульфат натрия, бисульфит натрия и сульфат аммония.

[292] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы содержат без ограничения сахара, такие как трегалоза, сахароза, маннит, сорбит, мальтоза, глюкоза, или соли, такие как фосфат калия, цитрат натрия, сульфат аммония, и/или другие средства, такие как гепарин, для увеличения растворимости и стабильности полипептидов in vivo.

[293] В некоторых случаях фармацевтические составы дополнительно содержат разбавители, которые используют для стабилизации соединений, поскольку они могут обеспечивать более стабильную среду. Соли, растворенные в забуференных растворах (которые также могут обеспечивать контроль или поддержание pH), используют в качестве разбавителей в уровне техники, в том числе без ограничения забуференный фосфатом физиологический раствор.

[294] Стабилизаторы включают такие соединения, как любые антиоксидантные средства, буферы, кислоты, консерванты и т. п. Иллюстративные стабилизаторы включают гидрохлорид L-аргинина, трометамин, альбумин (человеческий), лимонную кислоту, бензиловый спирт, фенол, дигидрат бифосфата натрия, пропиленгликоль, метакрезол или м-крезол, ацетат цинка, полисорбат-20 или Tween® 20, или трометамол.

[295] Поверхностно-активные вещества включают такие соединения, как лаурилсульфат натрия, докузат натрия, Tween 60 или 80, триацетин, витамин E TPGS, моноолеат сорбитана, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбаты, полоксамеры, соли желчных кислот, глицерилмоностеарат, сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, например, Pluronic^® (BASF), и т.п. Дополнительные поверхностно-активные вещества включают полиоксиэтиленовые глицериды жирных кислот и растительные масла, например, полиоксиэтиленовое (60) гидрогенизированное касторовое масло, а также алкиловые эфиры и алкилфениловые эфиры полиоксиэтилена, например, октоксинол 10, октоксинол 40. Иногда поверхностно-активные вещества включают для повышения физической стабильности или для других целей.

Терапевтические режимы

[296] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, описанные в данном документе, вводят для терапевтических вариантов применения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят ежедневно, каждый день, через день, пять дней в неделю, один раз в неделю, каждую вторую неделю, две недели в месяц, три недели в месяц, один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц или чаще. Фармацевтическую композицию вводят в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 2 лет, 3 лет и дольше.

[297] В случае, когда состояние пациента действительно улучшается, по усмотрению врача введение композиции осуществляется непрерывно, в качестве альтернативы, дозу вводимой композиции временно снижают или ее введение временно приостанавливают на определенный период времени (т.е. “период отдыха от лекарственного средства”). В некоторых случаях продолжительность периода отдыха от лекарственного средства варьируется от 2 дней до 1 года, в том числе составляет, исключительно в качестве примера, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 15 дней, 20 дней, 28 дней, 35 дней, 50 дней, 70 дней, 100 дней, 120 дней, 150 дней, 180 дней, 200 дней, 250 дней, 280 дней, 300 дней, 320 дней, 350 дней или 365 дней. Снижение дозы во время периода отдыха от лекарственного средства составляет от 10% до 100%, в том числе составляет, исключительно в качестве примера, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%.

[298] После улучшения состояния пациента при необходимости вводят поддерживающую дозу. Впоследствии дозировка, или частота введения, или и то и другое могут быть уменьшены в зависимости от симптомов до уровня, при котором сохраняется улучшение в отношении течения заболевания, расстройства или состояния.

[299] В некоторых вариантах осуществления количество данного средства, которое соответствует такому количеству, варьируется в зависимости от таких факторов, как конкретное соединение, тяжесть заболевания, индивидуальные характеристики (например, вес) субъекта или реципиента, нуждающегося в лечении, но тем не менее, обычно определяется способом, известным в уровне техники, в соответствии с конкретными обстоятельствами, сопровождающими случай, в том числе, например, конкретное средство, подлежащее введению, путь введения и субъект или реципиент, подлежащий лечению. В некоторых случаях требуемую дозу удобно представлять в виде однократной дозы или в виде разделенных доз, вводимых одновременно (или в течение короткого периода времени) или с подходящими интервалами, например, в виде двух, трех, четырех или более субдоз в день.

[300] Указанные выше диапазоны являются исключительно предположительными, поскольку количество переменных в отношении индивидуального режима лечения является большим, а значительные отклонения от этих рекомендуемых значений не являются редкостью. Такие дозировки изменяют в зависимости от ряда переменных, предусматривающих без ограничения активность применяемого соединения, заболевания или состояния, подлежащего лечению, способ введения, потребности отдельного субъекта, тяжесть заболевания или состояния, подлежащего лечению, и суждение практикующего специалиста.

[301] В некоторых вариантах осуществления токсичность и терапевтическую эффективность таких терапевтических режимов определяют стандартными фармацевтическими процедурами, выполняемыми на культурах клеток или экспериментальных животных, в том числе без ограничения определение LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение доз между обуславливающей токсичность и обеспечивающей терапевтические эффекты дозами является терапевтическим индексом, и он выражается как отношение LD50 к ED50. Соединения, демонстрирующие высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Данные, полученные в анализах на клеточных культурах и исследованиях на животных, используют для определения диапазона доз для применения у человека. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, который предусматривает ED50 с минимальной токсичностью. Дозировка варьируется в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения.

Наборы/готовое изделие

[302] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты наборы и готовые изделия для применения с одним или несколькими способами и композициями, описанными в данном документе. Такие наборы содержат носитель, упаковку или контейнер, который разделен на отсеки для размещения одного или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т. п., где каждый из контейнеров содержит один из отдельных элементов, подлежащих применению в способе, описанном в данном документе. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. В одном варианте осуществления контейнеры изготовлены из ряда различных материалов, таких как стекло или пластик.

[303] Готовые изделия, представленные в данном документе, содержат упаковочные материалы. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают без ограничения блистерные упаковки, бутылки, пробирки, пакеты, контейнеры, бутылки и любой упаковочный материал, подходящий для выбранного состава и предполагаемого способа введения и лечения.

[304] Например, контейнер(-ы) содержит(-ат) один или несколько полипептидов или конъюгатов IL-10, раскрытых в данном документе, и необязательно одно или несколько фармацевтических вспомогательных веществ, описанных в данном документе, для облегчения доставки полипептидов или конъюгатов IL-10. Такие наборы дополнительно необязательно предусматривают идентифицирующее описание, или этикетку, или инструкции, связанные с их применением в способах, описанных в данном документе.

[305] Набор, как правило, предусматривает этикетки с указанием содержимого и/или инструкций по применению, а также листки-вкладыши с инструкциями по применению. Также обычно предусматривают набор инструкций.

[306] В одном варианте осуществления этикетка находится на контейнере или связана с ним. В одном варианте осуществления этикетка находится на контейнере, при этом буквы, числа или другие символы, составляющие этикетку, прикреплены, отформованы или вытравлены на самом контейнере, этикетка связана с контейнером, при этом она находится внутри емкости или носителя, в котором также размещен контейнер, например, в виде листка-вкладыша. В одном варианте осуществления этикетку применяют для указания того, что содержимое должно использоваться для конкретного терапевтического применения. На этикетке также представлены указания по применению содержимого, как например в способах, описанных в данном документе.

[307] В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которые содержат одну или несколько единичных лекарственных форм, содержащих соединение, представленное в данном документе. Упаковка, например, содержит металлическую фольгу или пластиковую пленку, как например блистерная упаковка. В одном варианте осуществления к упаковке или дозирующему устройству прилагаются инструкции по введению. В одном варианте осуществления упаковка или дозатор также сопровождается уведомлением, связанным с контейнером, в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов, при этом уведомление отражает одобрение органом формы лекарственного средства для введения человеку или животному. Такое уведомление, например, является маркировкой, одобренной Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, или вкладышем в одобренный продукт. В одном варианте осуществления композиции, содержащие соединение, представленное в настоящем документе, составленные в совместимом фармацевтическом носителе, также получают, помещают в подходящий контейнер и маркируют для лечения указанного состояния.

Некоторые термины

[308] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой принадлежит заявляемый объект изобретения. Следует учитывать, что подробное описание является исключительно иллюстративным и пояснительным и не ограничивает какой-либо заявляемый объект изобретения. В настоящей заявке применение единственного числа предусматривает множественное число, если специально не указано иное. Следует отметить, что при использовании в описании формы единственного числа предусматриваются объекты ссылки во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. В настоящей заявке использование “или” означает “и/или”, если не указано иное. Кроме того, использование термина “включающий”, а также другие формы, такие как “включать”, “включает” и “включенный”, не является ограничивающим.

[309] Хотя различные признаки настоящего изобретения могут быть описаны в контексте одного варианта осуществления, эти признаки также могут быть представлены отдельно или в любой подходящей комбинации. И наоборот, хотя настоящее изобретение может быть описано в данном документе в контексте отдельных вариантов осуществления для ясности, настоящее изобретение также может быть представлено в одном варианте осуществления.

[310] Ссылка в настоящем описании на “некоторые варианты осуществления”, “вариант осуществления”, “один вариант осуществления” или “другие варианты осуществления” означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантами осуществления, включены в по меньшей мере некоторые варианты осуществления, но не обязательно все варианты осуществления настоящего изобретения.

[311] Используемые в данном документе диапазоны и количества могут быть выражены в форме "приблизительно" определенного значения или диапазона. "Приблизительно" также предусматривает точное количество. Следовательно, “приблизительно 5 мкл” означает “приблизительно 5 мкл”, а также “5 мкл”. Как правило, термин “приблизительно” предусматривает количество, которое, как ожидается, находится в пределах экспериментальной ошибки, как например, в пределах 15%, 10% или 5%.

[312] Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены исключительно для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие описываемый объект изобретения.

[313] Используемые в данном документе термины “индивидуум(-ы)”, “субъект(-ы)” и “пациент(-ы)” означают любое млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является отличным от человека. Ни один из этих терминов не требует ситуаций или не ограничивается ситуациями, характеризующимися наблюдением (например, постоянным или периодическим), осуществляемым медицинским работником (например, врачом, дипломированной медсестрой, практикующей медсестрой, помощником врача, санитаром или работником хосписа).

[314] Используемые в данном документе термины “значительный” и “значительно”в отношении связывания с рецептором означают изменение, достаточное для оказания влияния на связывание полипептида IL-10 с рецептором-мишенью. В некоторых случаях данный термин относится к изменению на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше. В некоторых случаях данный термин означает изменение в по меньшей мере 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз, 500 раз, 1000 раз или больше.

[315] В некоторых случаях термин “по сути” в отношении димеризации означает изменение, достаточное для предупреждения образования димера IL-10.

[316] Используемый в данном документе термин “инфильтрующая(-ие) опухоль иммунная(-ые) клетка(-и)” относится к иммунным клеткам, которые проникли в область, содержащую опухолевые клетки (например, в микроокружение опухоли). В некоторых случаях инфильтрующие опухоль иммунные клетки связаны с разрушением опухолевых клеток, уменьшением пролиферации опухолевых клеток, уменьшением опухолевой нагрузки или их комбинациями. В некоторых случаях инфильтрующие опухоль иммунные клетки предусматривают инфильтрующие опухоль лимфоциты (TIL). В некоторых случаях инфильтрующие опухоль иммунные клетки предусматривают Т-клетки, В-клетки, натуральные клетки-киллеры, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы или базофилы. В некоторых случаях инфильтрующие опухоль иммунные клетки предусматривают CD4+ или CD8+ T-клетки.

ПРИМЕРЫ

[317] Данные примеры представлены исключительно для иллюстративных целей и не ограничивают объем формулы изобретения, представленной в данном документе.

ПРИМЕР 1

[318] Биохимические взаимодействия пегилированного IL-10 с рецептором IL-10 человека

[319] Кинетические и равновесные константы диссоциации для взаимодействия пегилированного соединения IL-10 с рецептором IL-10 человека измеряли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) посредством Biosensor Tools LLC. Для этих исследований внеклеточный домен IL-10R, слитый с Fc IgG1 человека, фиксировали на поверхности покрытого белком А биосенсорного чипа CM4. Поверхность зондировали в двух повторностях с помощью серии двукратных разбавлений, начиная с 2 мкМ, либо нативного IL-10, либо мутеинов IL-10 с использованием Biacore 2000 или подобного прибора для SPR. Тестовые образцы вводили в течение 60 с или больше для обеспечения измерения ассоциации до достижения плато, после чего применяли только буфер (отмывка) в течение 30 с или больше для измерения диссоциации. Единицы ответа (RU, ось Y) наносили на график в зависимости от времени (с, ось X).

[320] Ex-vivo определение профиля иммунного ответа для мутеина IL-10 в образцах PBMC, полученных из системы удаления первичных лейкоцитов человека (LRS)

[321] Чтобы определить то, каким образом дифференциальная рецепторная специфичность мутеина IL-10 влияет на активацию субпопуляций первичных иммунных клеток, с использованием многоцветной проточной цитометрии выполняли определение профиля зависимости ответа от концентрации при активации лимфоцитов в образцах мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека, полученных из LRS. Эти исследования выполняли посредством PrimityBio LLC (Фримонт, Калифорния). Свежие образцы, полученные из LRS, обрабатывали либо нативным IL-10, либо мутеином IL-10 в серии 5-кратных разбавлений, начиная с максимальной концентрации 30 мкг/мл. После 45 минут инкубации образцы фиксировали и окрашивали антителами для выявления фосфорилированной формы фактора транскрипции STAT3 (pSTAT3), являющейся маркером восходящего взаимодействия и активации сигнальных комплексов рецептора IL-10, и панели поверхностных маркеров (таблица 1) для отслеживания образования pSTAT3 в субпопуляциях специфических Т-клеток и естественных киллеров (NK).

Таблица 1. Панель окрашивания для исследования посредством проточной цитометрии образцов PBMC, полученных из LRS

Тип клеток	Маркерный профиль
Эффекторные T-клетки (Teff)	CD3+, CD4+, CD8+, CD127+
NK-клетки	CD3-, CD16+
Регуляторные T-клетки (Treg)	CD3+, CD4+, CD8-, IL-2Rα+, CD127-

ПРИМЕР 2

[322] Таблица 2. Последовательности IL-10, описанные в данном документе

Название	Последовательность	SEQ ID NO:
IL-10 (homo sapiens) (зрелая форма)	SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN	1
IL-10 (homo sapiens) (предшественник) № доступа в NCBI: NP_000563.1	MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN	2

Хотя в данном документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, для специалистов в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления представлены исключительно в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены без отклонения от описания теперь будут очевидны для специалистов в данной области. Следует понимать, что различные альтернативы вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения. Подразумевается, что следующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения и тем самым охватывает способы и структуры в пределах объема данной формулы изобретения, а также их эквиваленты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SYNTHORX, INC.

<120> КОНЪЮГАТЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА 10 И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 46085-727.601

<140>

<141>

<150> 62/911,036

<151> 2019-10-04

<150> 62/757,690

<151> 2018-11-08

<160> 5

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 160

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

145 150 155 160

<210> 2

<211> 178

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175

Arg Asn

<210> 3

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Любая аминокислота, за исключением пролина

<400> 4

Val Pro Gly Xaa Gly

1 5

<210> 5

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 5

Phe Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro

1 5 10 15

Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25 30

<---

Claims

1. Модифицированный полипептид интерлейкина 10 (IL-10) для лечения рака, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, связанную с по меньшей мере одним конъюгируемым фрагментом, где аминокислотная последовательность является на 99,0% идентичной аминокислотам 33-158 из SEQ ID NO: 1, где по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота представляет собой содержащее азид - производное лизина, и где по меньшей мере один конъюгируемый фрагмент предусматривает растворимый в воде полимер, липид, белок или пептид, и где по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота расположена в аминокислотном положении, выбранном из E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130 и Q132, указанном в SEQ ID NO: 1.

2. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где аминокислотная последовательность является на по меньшей мере 95,0% идентичной аминокислотам 1-160 из SEQ ID NO: 1.

3. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где аминокислотная последовательность является на по меньшей мере 97,0% идентичной аминокислотам 1-160 из SEQ ID NO: 1.

4. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где аминокислотная последовательность является на по меньшей мере 98,0% идентичной аминокислотам 1-160 из SEQ ID NO: 1.

5. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где аминокислотная последовательность содержит 13 аминокислотных остатков лизина.

6. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где аминокислотная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO: 1, в которой модифицированное аминокислотное положение предусматривает не встречающуюся в природе аминокислоту, связанную с конъюгируемым фрагментом.

7. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где по меньшей мере одна не встречающаяся в природе аминокислота предусматривает N6-((2-азидоэтокси)-карбонил)-L-лизин (AzK).

8. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где растворимый в воде полимер предусматривает молекулу полиэтиленгликоля (PEG).

9. Модифицированный полипептид IL-10 по п. 1, где полипептид IL-10 является выделенным и очищенным.

10. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая эффективное количество модифицированного полипептида IL-10 по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, где фармацевтическая композиция составлена для системной доставки.

12. Модифицированный гомодимер IL-10 для лечения рака, содержащий два из модифицированных полипептидов IL-10 по любому из пп. 1-9.

13. Композиция для лечения рака, содержащая эффективное количество комплекса модифицированного гомодимера IL-10 по п. 12, связанного с рецептором IL-10 (IL-10R).

14. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества модифицированного полипептида IL-10 по любому из пп. 1-9 или фармацевтической композиции по п. 10 или 11.

15. Способ по п. 14, где рак представляет собой рак в виде солидной опухоли.

16. Способ по п. 15, где рак в виде солидной опухоли представляет собой рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы.

17. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотную последовательность модифицированного полипептида IL-10 по любому из пп. 1-9.

18. Вектор для экспрессии модифицированного полипептида IL-10, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 17.