KR101404374B1 - 핵산의 복제방법 및 신규한 인공 염기쌍 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 핵산의 복제방법 및 신규한 인공 염기쌍에 관한 것이다. 본 발명의 핵산의 복제반응은, 복제반응에 있어서, 아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 기질로서 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 신규한 인공 염기쌍은, 7-(2-티에닐)-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds) 또는 그 유사체와, 피롤-2-카르발데히드(Pa) 또는 그 유사체가, 염기쌍을 형성하고 있는 것을 특징으로 한다.
핵산, 복제방법, 인공 염기쌍, 데옥시리보뉴클레오사이드, 5'-삼인산

Description

핵산의 복제방법 및 신규한 인공 염기쌍{METHOD FOR REPLICATION OF NUCLEIC ACID AND NOVEL ARTIFICIAL BASE PAIR}
본 출원은, 2005년 12월 9일에 제출된 일본 특허출원 제2005-356883호 및 2006년 7월 10일에 제출된 일본 특허출원 제2006-189806에 근거하는 우선권을 주장하고, 그 전체 내용은 본 명세서 중에 포함된다.
본 발명은, 핵산의 복제방법 및 신규한 인공 염기쌍에 관한 것이다.
핵산은, A-T(U) 및 G-C 염기쌍의 상보성에 의해 증폭하고, 그리고 촉매 및 리간드로서 기능한다. 그렇지만, 천연형의 단백질에 있어서의 20개인 다른 아미노산과 비교해서, 천연형의 핵산에 있어서는 불과 4개의 다른 염기로 이루어지는 뉴클레오타이드로 형성되어 있는 수의 제한이, DNA 및 RNA 분자의 기능을 한정하고 있다. 비천연형 염기쌍 시스템은, 핵산의 염기의 종류를 늘려 유전정보를 확장할 수 있으므로, 이 문제의 해결법이 된다(비특허문헌 1-5). 비천연형 염기쌍으로서는, 폴리머라제(polymerase) 촉매반응에 의해, DNA 및 RNA에 특별한 뉴클레오타이드 유사체의 부위 특이적 도입을 가능하게 하는 높은 특이적 상보성이 요구된다. 이것이 가능하게 되면, 천연에 존재하는 염기의 수에 의해 제한되는 현재의 유전자공학이, 비천연형 염기쌍 시스템을 사용하는 신규한 기술에 의해 바뀔 수 있다.
비천연형 염기쌍을 작성하는 최초의 시도는, Benner 등에 의해 행해졌다(비특허문헌 6-7). 그들은, 천연형 염기쌍의 수소결합 패턴과는 다른 수소결합 패턴으로, 이소구아닌-이소사이토신(isoG-isoC) 및 크산토신-디아미노피리미딘과 같은, 몇개의 비천연형 염기쌍을 개발했다. 최근 이들 비천연형 염기쌍이, 상기 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 PCR 증폭(비특허문헌 8-9), 및 서열 분석(비특허문헌 10)에 적용되었다. 그렇지만, 충실도는 비교적 높지는 않고, 그리고/또는 번거로운 방법이 필요하게 된다. 이들 문제에 더하여, isoC 및 디아미노피리미딘과 같은 2-아미노피리미딘 유사체는, T7RNA 폴리머라제에 의해 기질로서 인식되지 않는다. 따라서 이들 염기쌍의 사용은 제한되어 있다.
이어서, Kool 등은, 천연형 염기와 유사한 형태를 가지지만, 염기쌍합(鹽基對合)에 있어서 수소결합을 형성하는 능력이 부족한 소수성 염기를 합성했다(비특허문헌 11-12). 이들 소수성 염기는, DNA 폴리머라제에 의해 선택적으로 인식된 것으로부터, 복제에 있어서는, 수소결합 상호작용보다 오히려 염기쌍간의 기하학적인 형태의 상보성이 중요하다는 것이 시사되었다. 최근, 일련의 소수성 염기쌍이 Romesberg 등에 의해 개발되고, 그리고 대장균 유래의 DNA 폴리머라제I의 클레노우프레그먼트(Klenow fragment)에 의해, 이들 염기쌍이 DNA 중에 상보적으로 도입되었다(비특허문헌 13-15). 그렇지만, 소수 염기는, 복제에 있어서, 형태의 상보성에 따르지 않고, 소수성 염기간에 효소반응에 의해 비선택적 도입이 생겼다(비특허문헌 14). 또한, 전사에 있어서 기능하는 이들의 소수성 염기쌍은 보고되어 있지 않다.
수소결합 패턴 및 형태의 상보성의 개념을 조합시킨 것에 의해, 본 발명자들 은, 2-아미노-6-(2-티에닐)퓨린(s)과 2-옥소피리딘(y)의 사이(비특허문헌 16-17), 및 2-아미노-6-(2-티아졸릴)퓨린(ｖ)과 y의 사이(비특허문헌 18)의, 비천연형 염기쌍을 개발했다. s 및 ｖ의 6위치가 큰 치환기는, 천연형 염기와의 바람직하지 않은 염기쌍(non-cognate　pairing)을 효율적으로 억제하고, 그리고, T7RNA 폴리머라제에 의해, 주형 중의 s 또는ｖ에 상보하고, y 및 수식 y 염기의 기질(뉴클레오사이드 5'-3인산)이 부위 특이적으로 RNA 중에 도입되었다. 이 특이적 전사는, 기능성의 RNA 분자를 개발하는 방법으로서 실용화가 가능하지만(비특허문헌 19-21), 복제에 있어서의 s-y 및 ｖ-y 염기쌍의 선택성은, 전사에 있어서의 선택성과 비교하여 그렇게 높아지지는 않는다(비특허문헌 16, 18).
상기 문제해결을 위해서, 복제와 전사(기능성 핵산의 창제), 혹은, 복제·전사·번역의 모두(기능성 단백질의 창제)에 있어서, 효율, 선택성이 뛰어난 신규한 인공 염기쌍이 희구된다.
이하의 문헌은, 참고문헌으로서 그 전체 내용이 본 명세서 중에 원용된다.
Figure 112008048856036-pct00001
Figure 112008048856036-pct00002
Figure 112008048856036-pct00003
Figure 112008048856036-pct00004
Figure 112008048856036-pct00005
Figure 112008048856036-pct00006
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본원 발명은, 이하의 태양 1~27을 제공하는 것을 목적으로 한다.
태양 1:　핵산의 복제방법으로서, 복제반응에 있어서 아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 기질로서(바람직하게는 이를 통상의 기질과 조합시켜서) 이용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
태양 2:　상기 치환기가, 아미노기인, 태양 1의 기재의 방법.
태양 3:　복제반응에 있어서, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 폴리머라제를 이용하는, 태양 1 또는 2에 기재된 방법.
태양 4:　엑소뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제가, 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는, 클레노우프레그먼트, T4　DNA 폴리머라제 및 호열균(好熱菌) 유래의 DNA　폴리머라제(예를 들면, Thermococcus　litoralis 유래의 Vent　DNA　폴리머라제 등)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 태양 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 방법.
태양 5:　기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이, 비천연형의 염기를 가지는, 태양 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법.
태양 6:　기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이, 천연형의 염기를 가지는, 태양 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법.
태양 7:　기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이, 이하의 식 1:
[화학식 1]
Figure 112008048856036-pct00007
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며, 그리고
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산인, 태양 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
태양 8:　기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이, 이하의 식 2:
[화학식 2]
Figure 112008048856036-pct00008
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이고, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산인, 태양 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
태양 9:　아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
태양 10:　아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있고, 또한, 비천연형의 염기를 가지는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
태양 11:　아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있고, 또한 천연형의 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
태양 12:　아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산의, 태양 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 핵산의 복제를 위한 방법에 있어서, 기질로서의 사용.
태양 13:　이하의 식 1:
[화학식 3]
Figure 112008048856036-pct00009
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고,
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드와,
이하의 식 2:
[화학식 4]
Figure 112008048856036-pct00010
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이고, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드가, 염기쌍을 형성하고 있는 핵산.
태양 14:　식 1의 염기가, 이하의
A1) 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A2) 7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A3) 7-(1H-2-이미다졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A4) 5-아미노-7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A5) 5-아미노-7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A6) 5-아미노-7-(1H-2-이미다졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A7) 4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기;
A8) 4-(2-티아졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기;
A-9) 4-(1H-2-이미다졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기:
A-10) 6-아미노-4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기;
A-11) 6-아미노-4-(2-티아졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기; 및
A-12) 6-아미노-4-(1H-2-이미다졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기
로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 태양 13에 기재된 핵산.
태양 15:　식 2의 염기가, 이하의
B1) 2-포르밀-1H-피롤-1-일기
B2) 2-포르밀-4-요오도-1H-피롤-1-일기;
B3) 2-포르밀-4-메틸-1H-피롤-1-일기;
B4) 2-포르밀-4-(1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
B5) 2-포르밀-4-(2-치환아미노비닐)-1H-피롤-1-일기;
B6) 2-포르밀-4-(3-치환아미노-1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
B7) 2-니트로-1H-피롤-1-일기;
B8) 2-니트로-4-요오도-1H-피롤-1-일기;
B9) 2-니트로-4-메틸-1H-피롤-1-일기;
B10) 2-니트로-4-(1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
B11) 2-니트로-4-(2-치환아미노비닐)-1H-피롤-1-일기; 및
B12) 2-니트로-4-(3-치환아미노-1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기
로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 태양 13에 기재된 핵산.
태양 16:　전사, 역전사, 복제 또는 번역의 공정에서, 염기쌍을 형성하고 있는, 태양 13 내지 15 중 어느 한 항에 기재된 핵산.
태양 17:　이하의 식 1:
[화학식 5]
Figure 112008048856036-pct00011
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 조제하는 방법으로서,
이하의 식 2:
[화학식 6]
Figure 112008048856036-pct00012
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 주형으로 하여 전사, 역전사 또는 복제를 실시하여, 상기식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 상보적 위치에, 상기식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 도입(組入)하는
것을 포함하는, 상기 조제방법.
태양 18:　이하의 식 2:
[화학식 7]
Figure 112008048856036-pct00013
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이고, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 조제하는 방법으로서,
이하의 식 1:
[화학식 8]
Figure 112008048856036-pct00014
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 주형으로 하여 전사, 역전사 또는 복제를 실시하여, 상기식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 상보적 위치에, 상기식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 도입하는
것을 포함하는, 상기 조제방법.
태양 19:　태양 17 또는 18에 기재된 방법에 따라 조제된, 식 1 및/또는 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산.
태양 20:　tRNA, mRNA, 안티센스 DNA 혹은 RNA, 리보자임, 아프타머 또는 siRNA인, 태양 19에 기재된 핵산.
태양 21:　이하의 식 1:
[화학식 9]
Figure 112008048856036-pct00015
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며, 그리고,
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
태양 22:　이하의 식 2:
[화학식 10]
Figure 112008048856036-pct00016
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이고, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
태양 23:　이하의 식 3:
[화학식 11]
Figure 112008048856036-pct00017
[여기에 있어서,
R5는, 수소 또는 치환아미노기이고,
R6은, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고
A는 N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드.
태양 24:　이하의 식 4:
[화학식 12]
Figure 112008048856036-pct00018
[여기에 있어서,
R7은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이고, 그리고,
R8은, 포르밀기 또는 니트로기이며,
단, R7이 수소 또는 1-프로피닐기이고, R8이 포르밀기인 경우는 제외한다.]
로 표시되는 염기를 가지는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드.
태양 25:　태양 18에 기재된 방법에 따라 조제된, 식 2로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산으로서, 식 2의 치환기 R3이, 바이오틴 또는 형광분자로 치환된 C1-C3알킬기, C2-C3알케닐기, 또는 C2-C3알키닐기인, 상기 핵산.
태양 26:　태양 22에 기재된 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산으로서, R3이, 바이오틴 또는 형광분자로 치환된 C1-C3알킬기, C2-C3알케닐기, 또는 C2-C3알키닐기인, 상기 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
태양 27:　태양 24에 기재된 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드로서, R7이, 바이오틴 또는 형광분자로 치환된 C1-C3알킬기, C2-C3알케닐기, 또는 C2-C3알키닐기인, 상기 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은, 상기 문제해결을 위해서 예의연구로 노력한 결과, 본 발명에 이르렀다.
본 발명의 비천연형 염기쌍 시스템의 개발의 경위
본 발명자는, 복제와 전사의 반응에 있어서, 효율 및 선택성이 뛰어난 인공 염기쌍을 얻기 위해서, 본 발명자들이 개발한 몇가지의 비천연형 염기쌍을 조합시킨 것에 의해 구축되는 염기쌍을 연구했다.
　본 발명자는, 2-아미노-6-(2-티에닐)퓨린-9-일(s)(비특허문헌 17, 33)과 2-포르밀-1H-피롤-1-일(Pa)(비특허문헌 26)의 조합을, 전사에 있어서 고도한 선택성 및 효율을 나타내는 것을 밝혀내었다(특허문헌 4:미공개). 그리고, 본 발명에 있어서 또한, s의 퓨린환 중의 6원환의 2개의 N원자 중 1개를 CH로 치환하여 2위치의 아미노기를 수소로 바꾼, 즉, 데아자, 데아미노화한 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds)를 작성하여, Ds와 Pa의 인공 염기쌍의 적합을 조사했다. 그 결과, Ds와 Pa의 인공 염기쌍은, 복제와 전사에 있어서, 어느 것이 주형, 또는 기질이 되어도 고도한 선택성 및 효율을 나타내는 것을 밝혀내어, 본 발명에 이르렀다.
구체적으로는, 7-(2-티에닐)-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds) 및 피롤-2-카르발데히드(Pa) 사이, 및 Ds 및 4-프로피닐피롤2-카르발데히드(Pa')(도 1a) 사이의 소수성 염기쌍이 in　ｖitro에서의 복제 및 전사에 있어서 높은 선택성을 나타내는 것이 견출되었다(도 1c). 복제에 있어서, 본 발명자들은, 통상의 5'-삼인산과 수식 5'-삼인산인 5'-γ-아미드삼인산(도 1b)의 기질을 조합시키고, 또한 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제를 이용하는 것에 의해, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 PCR 증폭을 가능하게 하는 높은 선택성을 달성했다. 또한, 이들 비천연형 염기는, T7RNA 폴리머라제에 의한 통상의 전사로 RNA 중에 상보적으로 도입되었다.
보다 상세하게는, 본 발명자들은, 이하의 두가지 개념을 고려하는 것에 의해 Ds-Pa염기쌍을 설계하였다; 1) 염기쌍의 선택성을 높이기 위해서, 천연형 염기와는 다른 형태의 소수성 염기를 채용하고(비특허문헌 12, 22), 2) 폴리머라제의 상호작용에 필요한(비특허문헌 23-25), 프로톤 수용기, 예를 들면, Ds의 4위치의 질소(A 및 G의 3위치에 대응) 및 Pa의 알데히드기(C 및 T의 2위치의 케토기에 대응)를 추가했다(도 1a).
소수성 염기쌍의 치명적인 문제는, 염기의 형태의 상보성에 따르지 않는 소수성 염기-소수성 염기간의 염기쌍(예를 들면, Ds-Ds 쌍합)이 효율좋게 형성되어 버리는 것이다(비특허문헌 14, 29). 복제에 있어서의 Ds-Pa 염기쌍의 선택성을 시험하기 위해서, 본 발명자들은, 엑소뉴클레아제 활성이 부족한 클레노우프레그먼트(KF　exo-)를 사용한 1뉴클레오타이드 삽입실험에 의해, 기질과 주형간의 염기쌍 형성능을 조사했다(도 2a)(비특허문헌 30-32).
실험에 이용하는 기질(dDsTP 및 dPaTP)과 Ds 또는 Pa를 포함하는 주형 DNA는, 화학적으로 합성되었다(실시예 I 및 II). 실험의 결과는, Ds-Pa 염기쌍 형성 및 A-T 염기쌍 형성의 각각의 선택성이 그 이외의 조합시킨 염기간의 쌍합(對合)의 선택성보다도 높은 것으로 나타났다(도 2b 및 표 1 및 2).
표 1 클레노우프레그먼트에 의한 주형 DNA로의 1뉴클레오타이드 도입 실험.
[표 1]
Figure 112008048856036-pct00019
a.　엣세이를, 50mM　Tris-HCl(pH7.5), 10mM　MgCl2, 1mM　DTT 및 0.05mg/ml 우형(bovine) 혈청알부민을 함유하는 용액(10㎕) 중에서, 5μM　주형-프라이머 이본쇄(二本鎖), 5~50nM　효소, 및 0.3~1500μM　뉴클레오사이드 5'-삼인산을 이용하고, 37℃에서 1~35분간 행하였다. 각 변수는 3 내지 8의 데이터세트로 평균화되었다.
b. 표준편차를 괄호 중에 나타낸다.
c. 1500μM 뉴클레오사이드 5'-삼인산 및 50nM 효소로 20분간 인큐베이션한 후에 있어서도 산물은, 거의 검출되지 않았다(＜2혼합물 중에).
d. 이 용어의 단위는, 혼합물 중에분-1M-1이다.
표 2 클레노우프레그먼트에 의한 주형 DNA로의 1뉴클레오타이드 도입 실험.
[표 2-1]
a. 엣세이를, 50mM　Tris-HCl(pH7.5), 10mM　MgCl2, 1mM　DTT 및 0.05mg/ml 우형 혈청알부민을 함유하는 용액(10㎕) 중에서, 5μM　주형-프라이머 이본쇄, 5~50nM　효소, 및 0.3~1500μM 뉴클레오사이드 5'-삼인산을 이용하여, 37℃에서 1~35분간 행하였다. 각 데이터는 3 내지 8의 데이터세트로 평균화되었다.
b. 표준편차를 괄호 중에 나타낸다.
c. 1500μM 뉴클레오사이드 5'-삼인산 및 50nM 효소로 20분간 인큐베이션한 후에 있어서도 산물은, 거의 검출되지 않았다(＜2혼합물 중에).
d. 단위는, 혼합물 중에분-1M-1이다.
그렇지만, 주형 중의 Ds에 대해서 dDsTP(Vmax/KM=2.0×105)가 효율좋게 도입되어 버려서, Ds에 대한 dPaTP의 도입 효율(Vmax/KM=6.2×104)보다도 높은 효율이었다. 이 Ds-Ds쌍은, 문제가 되는 염기의 형태의 상보성에 따르지 않는 소수성 염기-소수성 염기간의 염기쌍 형성이기 때문에, B형 DNA 구조를 변형시켜 버린다. 그 결과, 주형 중의 Ds에 대해서 dDsTP가 도입되면, 그 후의 복제의 신장이 정지하여 버린다. 예를 들면, Ds를 포함하는 주형 DNA를 이용하여, dPaTP와 dDsTP의 양 기질을 포함하는 용액 중에서 프라이머 신장 반응을 실시하면, dDsTP의 증가와 동시에(dPaTP의 0.5 또는 1몰 등량) 주형 중의 Ds에 대하여 dDsTP가 취입되어 버리므로, 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는 클레노우프레그먼트(KF　exo＋)에 의한 프라이머 신장은 저해되었다(도 2d, 레인 3 및 4).
그래서, 복제에 있어서의 이 소수 염기쌍의 본질적인 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 또한, 기질로서 Ds의 수식 5'-삼인산인 5'-γ-아미드삼인산(도 1b)(dDsTPN으로 표시한다)을 채용했다. 본 발명자들은, 주형 중의 Ds에 대하여 dDsTPN의 도입 효율(Vmax/KM=9.9×103)이 유의하게 감소하는 것을 발견했다. 그러나, 다른 문제는, 주형 중의 Pa에 대한 dDsTPN의 도입 효율(Vmax/KM=6.7×104)이, 주형 중의 Pa에 대한 A의 도입 효율(Vmax/KM=4.3×104)에 가까운 레벨에까지 저하해 버리는 것이었다. 이 문제는, A의 5'-γ-아미드삼인산(dATPN)을 사용함으로써 해결할 수 있었다. dATP 대신에 dATPN를 이용하는 것에 의해, 주형 Pa에 대한 dDsTPN의 도입 효율은, 주형 Pa에 대한 dATPN의 도입 효율(Vmax/KM=1.8×103)보다도 37배 높아져, Pa-Ds 염기쌍의 높은 선택성을 유지할 수 있었다.
따라서, 본 발명자들은, 통상의 5'-삼인산인 dPaTP, dGTP, dCTP 및 dTTP와 5'-γ-아미드삼인산인 dDsTPN 및 dATPN를 조합시켜서 사용함으로써, 복제에 있어서 비천연형 염기쌍의 높은 상보적인 선택성을 달성했다(도 2c).
수식기질 dDsTPN의 존재하에서는, 주형 Ds에 대한 Pa의 도입 후의 프라이머 신장 반응은, 저해되는 일없이 진행되었다(도 2d, 레인 5 및 6). 또한, 주형 Pa에 대한 dDsTPN의 도입, 또는 주형 T에 대한 dATPN의 도입 후의 프라이머 신장도 효율적으로 진행했다(도 2e, 레인 2 및 도 2e, 레인 14). 흥미롭게도, 주형 Pa에 대해서 dATP가 잘못 도입된 경우의 그 후의 신장 반응보다도, 주형 Pa에 대한 dATPN이 잘못 도입된 후의 신장 반응 쪽이 현저하게 그 반응 효율이 저하했다(도 2e, 레인 4 및 5).
비천연형 염기쌍의 선택성을 더욱 개선하기 위해서, 본 발명자들은, 본 시스템에 있어서 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제를 사용했다. KF　exo＋를 이용함으로써, 바람직하지 않은 A-Pa 및 Ds-T 염기쌍이 형성된 후의 프라이머 신장 반응의 효율은 현저하게 저하하고, 프라이머 신장은 비천연형 염기 위치 주변에서 중단되었다(도 2d 레인 1, 및 도 2e 레인 9, 10, 17 및 18).
따라서, 본 발명자들은 바람직하게는, 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제에 통상의 5'-삼인산 기질과 수식 5'-삼인산 기질을 조합시키고, 복제에 있어서, A-T 및 G-C 염기쌍과 동시에 기능하는 특이적 비천연형 염기쌍 시스템을 작성했다.
비천연형 염기쌍은, 염기간의 특이적인 형태의 상보성으로 형성되지만, 양자간의 수소결합의 상호작용이 부족하다. 복제에 있어서, 바람직하게는 실용 레벨에서 높은 충실도로 PCR 증폭을 가능하게 하는 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는(exonuclease-proficient) DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 통상의 5'-삼인산과 수식 5'-삼인산인 5'-γ-아미드삼인산의 조합에 의해서, 이 비천연형 염기쌍은 특히 높은 선택성을 나타낸다. 비천연형 염기를 함유하는 DNA 단편의 서열은, 비천연형 염기의 기질을 더한 디데옥시뉴클레오타이드쇄 종결법에 의한 시퀀싱에 의해 확인 가능하다. 또한, 비천연형 염기쌍의 상보성은, 통상의 T7 전사에 의한 RNA로의 이들 염기의 도입도 중개할 수 있다.
본 발명은, 이하의 1)-3) 중 어느 하나가, 혹은 이들의 조합을 이용한, 신규한 핵산 증폭시스템을 제공한다.
1) 복제반응에 있어서 아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 기질로서 사용한다;
2) 복제반응에 있어서, 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제를 이용한다; 그리고,
3) 후술의 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드와 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 인공 염기쌍을 이용한다.
이상, 본 발명의 이해를 위해서 본 발명에 도달하기에 이르는 경위를 설명 했지만, 본 발명의 범위는 상기 설명으로 한정되지 않고, 청구의 범위의 기재에 의해서 정해진다.
핵산의 복제방법
본 발명은, 1태양에 있어서 핵산의 신규한 복제방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 복제반응에 있어서 아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 기질로서 이용하는 것을 특징으로 한다.
복제반응에 있어서 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산의 γ-위치의 인산의 수산기를 상기의 치환기로 치환하는 것에 의해, 복제반응의 선택성이 더 향상한다. 이러한 수식 5'-삼인산의 이용에 의해, 기질의 취입효율이 무치환의 것과 비교하여 저하하는 경우더라도, 선택성의 향상에 의해, 인공 염기쌍을 도입한 복제반응이 실질적으로 이용가능하도록 진행한다.
바람직하게는, 상기 치환기는 아미노기이다.
데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산의 γ-위치의 인산의 수산기의 수식 방법은 특별히 한정이 없고, 공지의 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 실시예 I-3-(15) 및 (16)은, 치환기가 아미노기인 경우의 대응하는 뉴클레오사이드로부터의 합성예를 개시한다. 혹은, 비특허문헌 47도, γ-아미드화뉴클레오타이드의 합성 방법을 개시하고 있다.
치환기가 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기, 플루오로기 등, 아미노기 이외의 경우도 마찬가지로, 당업자가 공지의 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다.
복제반응은, 상기 기질의 사용 이외에는 특별히 한정하지 않고, 공지의 방법에 따라서 실시하는 것이 가능하다. 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 복제반응에 있어서 바람직하지 않은 비특이적인 염기쌍 형성을 막기 위해서, 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제를 이용하는 것이 바람직하다. 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제는, 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는, 클레노우프레그먼트, T4 DNA 폴리머라제, 및 호열균 유래의 DNA　폴리머라제(예를 들면, Thermococcus　litoralis 유래의 Vent　DNA　폴리머라제)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 1태양으로서, 비천연형의 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 기질로서 사용할 수 있다. 최근, 천연형 염기쌍과 다른 수소 양식을 가지고, 또한 입체장해에 의해서 천연형 염기와의 쌍합을 배제할 수 있는 염기쌍의 창출의 연구를 실시하여, 몇개의 인공 염기쌍이 보고되고 있다. 인공 염기쌍은 염기간의 수소결합을 이용한 조합이나 염기의 소수성을 이용한 조합 등이 알려져 있다. 본 발명은, 이들 비천연형 염기를 가지는 핵산에 있어서, γ-위치의 인산의 수산기를 수식하는 것에 의해서, 전사, 복제 및/또는 번역 반응에 있어서의 선택성, 효율을 상승시키는 것을 가능하게 했다.
본 발명에 있어서의 비천연형 염기의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 하기의 공지의 임의의 비천연형 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오타이드의 이용이 포함된다.
2-아미노-6-디메틸아미노퓨린(x)과 2-아미노-6-티에닐퓨린(s)(비특허문헌 33)
2-아미노-6-(2-티에닐)-9H-퓨린-9-일기(s)와 2-옥소-(1H)피리딘-3-일기(y)(특허문헌 1, 비특허문헌 17)
2-아미노-6-(2-티아졸릴)퓨린-9-일기(ｖ)와 2-옥소-(1H)피리딘-3-일기(y)(특허문헌 3, 비특허문헌 18)
피롤-2-카르발데히드(Pa)와 7-메틸-이미다조[4,5-b]피리딘(Q)(비특허문헌 26, 비특허문헌 34)
본 발명자는 또한, 신규한 인공 염기쌍을 고안하고, 2005년 8월 4일에 특허출원을 실시했다(일본 특허출원 제2005-226492호). 상기 출원은, 피롤-2-카르발데히드(Pa)와 2-아미노-6-(2-티에닐)-9H-퓨린-9-일기(s)와의 인공 염기쌍에 관한 것이다. 상기 염기쌍은, 특히 Pa를 주형으로 하여 s를 기질로 하는 전사 반응에 있어서 뛰어난 선택성을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 있어서, 새로운 신규한 인공 염기쌍을 제공한다. 상기 신규한 인공 염기쌍도 본 발명의 복제반응에 유효하게 사용할 수 있다. 따라서, 한정되는 것은 아니지만, 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산은, 이하의 식 1:
[화학식 13]
Figure 112008048856036-pct00021
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고
A는, N 또는 CH이다.]
으로 표시되는 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이다.
혹은, 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산은, 이하의 식 2:
[화학식 14]
Figure 112008048856036-pct00022
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이다.
식 1의 염기 및 식 2의 염기는 모두, 기질, 주형의 어느 것으로서 사용된 경우에 있어서도 복제반응에 있어서 뛰어난 선택성, 효율을 나타낸다. 또한, 전사 반응에 있어서도 뛰어난 선택성, 효율을 나타낸다.
본 발명에 있어서 제공되는 식 1의 염기와 식 2의 염기와의 신규한 인공 염기쌍에 있어서는, 「본 발명의 인공 염기쌍을 기본으로 하는 핵산」의 항목에 대해서 상술한다.
또는, 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산은, 천연형의 염기를 가지는 것이어도 좋다. 데옥시리보뉴클레오사이드의 천연형의 염기는, 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 및 티민(T)의 4종류가 알려져 있다. 이들 천연형의 염기의 경우도 비천연형의 염기의 경우와 같이, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산도, 기질로서 핵산의 복제반응에 유효하게 사용할 수 있다.
데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인 산
본 발명은 또한, 아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 제공한다.
본 발명의 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산은, 비천연형의 염기를 가지는 것이어도, 천연형의 염기를 가지는 것이어도 좋다. 「비천연형의 염기」, 및 「천연형의 염기」에 대해서는, 핵산의 복제방법에 관해서 상술한 바와 같다.
본 발명의 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산은, 상술한 본 발명의 핵산의 복제방법에 있어서의, 기질로서 사용할 수 있다.
본 발명의 인공 염기쌍을 기본으로 하는 핵산
본 발명자는, 복제, 전사 및 번역의 모든 반응에 있어서, 효율 및 선택성이 뛰어난 인공 염기쌍을 얻기 위해서, 본 발명자들이 개발한 몇개의 비천연형 염기쌍을 조합시킨 것에 의해 구축되는 염기쌍을 연구했다. 그 결과, 2-아미노-6-(2-티에닐)퓨린-9-일(s)(비특허문헌 17, 33)과 2-포르밀-1H-피롤-1-일(Pa)(비특허문헌 26)의 조합이, 전사에 있어서 고도한 선택성 및 효율을 나타내는 것을 밝혀내었다(특허문헌 4: 미공개).
그리고, 본 발명에 있어서 또한, s의 퓨린환 중의 6원환의 2개의 N원자 중 하나를 CH로 치환하여 2위치의 아미노기를 수소로 바꾼, 즉, 데아자, 데아미노화한 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds)를 작성하고, Ds와 Pa의 인공 염기쌍의 적합을 조사했다. 그 결과, Ds와 Pa의 인공 염기쌍은, 복제와 전사에 있어서, 어느 것이 주형, 또는 기질이 되어도 고도한 선택성 및 효율을 나타내는 것을 밝혀내고, 본 발명에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 그 1태양에 있어서, 이하의 식 1:
[화학식 15]
Figure 112008048856036-pct00023
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고,
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드와,
이하의 식 2:
[화학식 16]
Figure 112008048856036-pct00024
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드가, 염기쌍을 형성하고 있는 핵산을 제공한다.
본 발명에 있어서 「뉴클레오사이드」란, 핵산염기와 당의 환원기가 글리코시드 결합에 의해서 결합한 배당체 화합물을 의미한다. 또한, 「핵산염기」는, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 우라실, 및 이들 염기의 유도체도 포함한 개념이다. 「유도체」의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체적으로는, 예를 들면, 상기식 1로 표시되는 염기, 식 2로 표시되는 염기, 등을 들 수 있다. 「뉴클레오타이드」는, 상기 뉴클레오사이드의 당부분이, 인산과 에스테르를 만들고 있는 화합물을 말한다. 보다 바람직하게는, 일, 이, 또는 삼인산 에스테르이다. 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 당부분은 리보푸라노실, 2'-데옥시리보푸라노실, 혹은 할로겐 등의 치환기를 2'위치에 가지는 2'-치환 리보푸라노실이어도 좋다. 한정되는 것은 아니지만, 인산 부분은, 아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는 것이 바람직하다. 당부분 및 인산 부분은, 공지의 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 혹은 이들의 유도체에서 볼 수 있는 구성을 취하고 있으면 좋다. 당부분이 리보푸라노실인 리보누클레오타이드는 RNA의 구성성분이 되고, 데옥시리보푸라노실인 데옥시리보뉴클레오타이드는 DNA의 구성성분이 된다.
식 1의 염기에 있어서, R2의 티에닐기, 티아졸릴기 또는 이미다졸릴기는, 무 치환이든지 혹은, 4위치 및/또는 5위치가, 메틸기, 아미노기, 니트로기 및 히드록시기로 이루어지는 군에서 독립하여 선택되는 하나 또는 그보다 많은 기로 치환되어 있어도 좋다.
본 발명의 식 1의 염기 중, R2가 치환된 또는 무치환된 2-티에닐기의 것을, 본 명세서에 있어서 문맥에 의해, 「Ds」또는 「Ds 유사체」라고 호칭한다. 본 발명의 식 1의 염기 중, R2가 치환된 또는 무치환된 2-티아졸릴기의 것을, 본 명세서에 있어서 문맥에 의해, 「Dv」 또는 「Dv유사체」로 호칭한다. 본 발명의 식 1의 염기 중, R2가 치환된 또는 무치환된 1H-2-이미다졸릴기의 것을, 본 명세서에 있어서 문맥에 의해, 「Dm」 또는 「Dm 유사체」라고 호칭한다.
식 1의 R1은, 본 명세서에 있어서는, 예를 들면, 「Ds」인 경우, R1이 수소 혹은 아미노기의 어느 것인 경우도 포함한다. 이것에 대해서, 선행기술 문헌에서는, 예를 들면, R1이 아미노기의 경우에 「s」, 수소의 경우에는 「s'」로, R1의 태양에 따라 구별하여 기재하고 있는 경우도 있다.
A는, N이어도 CH이어도 좋다. N의 경우 데아자체, 예를 들면, 「Ds」「Dv」「Dm」로 표현한다. CH의 경우, 예를 들면, 「DDs」「DDv」「DDm」로 표현한다. 본원 명세서에 있어서 예를 들면, 「Ds 유사체」는 「DDs」 등을 포함한다. 또한, 문맥에 의해, 「DDs」, 「Ds 유사체」를 총칭하여 「Ds」로 표현하는 경우도 있다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 식 1의 염기는 이하의
A1) 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds);
A2) 7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Dv);
A3) 7-(1H-2-이미다졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A4) 5-아미노-7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds);
A5) 5-아미노-7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Dv);
A6) 5-아미노-7-(1H-2-이미다졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
A7) 4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기(DDs);
A8) 4-(2-티아졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기(DDv);
A-9) 4-(1H-2-이미다졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기;
A-10) 6-아미노-4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기(DDs);
A-11) 6-아미노-4-(2-티아졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기(DDv); 및
A-12) 6-아미노-4-(1H-2-이미다졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기
로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
상기 염기 중, A1과 A4는 Ds, A7과 A10은 DDs이다. A2와 A5는 Dv, A8과 A11은 DDv이다. A3과 A6은, 「Dm」, A9와 A12는, 「DDm」이다.
보다 바람직하게는, A1) 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds), A2) 7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Dv), A4) 5-아미노-7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds), 또는 A5) 5-아미노-7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Dv)이다. 가장 바람직하게는 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds)(실시예 I의 화합물 10 또는 14)이다.
본 발명의 식 1의 염기, 및 이를 포함하는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드는, 공지의 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 구체적으로는 예를 들면, 본원 명세서의 실시예 I-3에서는, 2-아미노-3-니트로-4-클로로피리딘(실시예 I의 화합물 1)(비특허문헌 41)으로부터, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기(Ds)의 뉴클레오사이드 5'-삼인산 및 5'-γ-아미드삼인산(실시예 I의 화합물 10 또는 14)을 합성하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 실시예 II-1은, 7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5]피리딘(실시예 II의 화합물 4)(Dv)의 뉴클레오사이드 5'-삼인산을 합성하는 방법을 개시하고 있다.
또한, 실시예 II-3은, 4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(DDs) 및 4-(2-티아졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(DDv)의 뉴클레오사이드 5'-삼인산을 합성하는 방법을 개시하고 있다.
또한, 그 외의 본 발명의 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 5'-γ-아미드삼인산도, 본원 명세서에 구체적으로 개시와 같은 방법 및/또는 당업자에 기지의 방법을 이용하여 합성할 수 있다.
본 발명의 식 2의 염기에 있어서, R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이다.
상기 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기 등은, 또한, 저급 알킬기, 할로겐기, 히드록실기, 아미노기, 알킬아미노기, 및 방향족복소환으로 이루어지는 군으로부터 독립하여 선택되는 하나 또는 그보다 많은 기로 치환되어 있어도 좋다.
혹은, 상기 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기 등은, 또한, 바이오틴 또는 형광분자로 치환되어 있어도 좋다.
바이오틴은 보효소(補酵素) R로도 불리고, 비타민 B군의 1종이다. 바이오틴은, 난백 중에 포함되는 당단백질인 아비딘과 특이적으로 결합하여, 복합체를 형성하는 것이 알려져 있다. 따라서, 치환기로서 바이오틴을 가지는 뉴클레오사이드 등은, 아비딘 단백질에 특이적으로 결합한다. 이 때문에, 바이오틴이 결합한 뉴클레오사이드 등을 포함하는 핵산은, 아비딘을 결합한 단체와 결합시킬 수 있으므로, 핵산을 고정화, 분리할 수 있고, 특정의 분자에 결합하는 핵산(아프타머 등)을 고정화하면, 예를 들면, 특정물질의 검출이나 단리에, 또한, 진단 시약으로서 이용할 수 있다. 식 2의 염기에 있어서의 R3의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기 등에 바이오틴을 도입하기 위해서는, 아미노기를 개재하여 바이오틴을 직접 결합시켜도 좋고, 링커를 개재하여 결합시켜도 좋다.
형광분자는, 공지의 형광분자를 이용 가능하지만, 바람직하게는, 5-카르복시플루오레세인(5-FAM), 6-카르복시플루오레세인(6-FAM), 5-카르복시테트라메틸로다민(5-TAMRA), 6-카르복시테트라메틸로다민(6-TAMRA), 5-디메틸아미노나프탈렌-1-술폰산(DANSYL), 5-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인(5-HEX), 6-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인(6-HEX), 5-카르복시-2',4,7,7'-테트라클로로플루오레세인(5-TET), 6-카르복시-2',4,7,7'-테트라클로로플루오레세인(6-TET), 5-카르복시-X-로다민(5-ROX), 6-카르복시-X-로다민(6-ROX), 및 그들 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 플루오레세인 및 로다민은, 일반적으로 개환형 및 스피로형의 두가지로 표기된다.
예를 들면, FAM의 흡수극대파장은 493nm, 형광극대파장은 522nm이다. 또한, TAMRA의 흡수극대파장은 553nm, 형광극대파장은 578nm이다. DANSYL의 흡수극대파장은 335nm, 형광극대파장은 518nm이다. HEX의 흡수극대파장은 535nm, 형광극대파장은 556nm이다. TET의 흡수극대파장은 521nm, 형광극대파장은 536nm이다. 5-ROX의 흡수극대파장은 567nm, 형광극대파장은 591nm이다. 6-ROX의 흡수극대파장은 570nm, 형광극대파장은 590nm이다. 형광분자로 치환되어 있는 R3를 가지는 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는, 형광분자의 종류에 따라 핵산의 검출을 실시하는 것이 가능하다. 따라서, 식 2의 염기에 있어서의 R3의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기 등이 형광분자로 치환된 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산은, 표지 핵산으로서 상기 핵산과 상호작용하는 물질 검출의 프로브로 사용될 수 있다. 또한, 각 형광분자에 의해서 형광색이 다르기 때문에, 다중 염색에 사용하는 것도 가능하다. 식 2의 염기에 있어서의 R3의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기 등에 형광분자를 도입하기 위해서는, 아미노기를 개재하여 형광분자를 직접결합시켜도 좋고, 링커를 개재하여 결합시켜도 좋다.
또한, 식 2의 염기에 있어서의 R3의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기 등에 링커를 개재하여 바이오틴 또는 형광분자를 결합시키는 경우, 링커의 종류는 특별히 한정이 없고, 당업자는 적당 채용가능하다. 링커는 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 하기의 화학식 I 및 II:
[화학식 17]
Figure 112008048856036-pct00025
[식 I중, n은 1 내지 5의 정수로부터 선택된다]
및
[화학식 18]
Figure 112008048856036-pct00026
[식 II중, m 및 l은, 1 내지 5의 정수로부터 각각 독립적으로 선택된다]
로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다. 식 2의 염기에 있어서, R4가 포르밀기인 경우, 본 명세서에 있어서 문맥에 의해, 「Pa」또는 「Pa 유사체」라고 호칭한다. R4가 니트로기인 경우, 본 명세서에 있어서 문맥에 의해, 「Pn」 또는 「Pn 유사체」라고 호칭한다. 「Pa」, 「Pa 유사체」, 「Pn」, 「Pn 유사체」등을 총칭하여, 「Pa]라고 호칭하는 경우도 있다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 식 2의 염기는 이하의
B1) 2-포르밀-1H-피롤-1-일기(Pa)
B2) 2-포르밀-4-요오도-1H-피롤-1-일기;
B3) 2-포르밀-4-메틸-1H-피롤-1-일기;
B4) 2-포르밀-4-(1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
B5) 2-포르밀-4-(2-치환아미노비닐)-1H-피롤-1-일기;
B6) 2-포르밀-4-(3-치환아미노-1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
B7) 2-니트로-1H-피롤-1-일기(Pn);
B8) 2-니트로-4-요오도-1H-피롤-1-일기;
B9) 2-니트로-4-메틸-1H-피롤-1-일기;
B10) 2-니트로-4-(1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
B11) 2-니트로-4-(2-치환아미노비닐)-1H-피롤-1-일기; 및
B12) 2-니트로-4-(3-치환아미노-1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기
로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
상기 염기 중, B1-B6는 「Pa] 또는 「Pa 유도체」이고, B7-B12는 「Pn] 또는 「Pn 유도체」이다.
보다 바람직하게는,　B1) 2-포르밀-1H-피롤-1-일기(Pa)(실시예 I의 화합물 19), 또는 B4) 2-포르밀-4-(1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기(실시예 I의 화합물 20)이다.
본 발명의 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드는, 공지의 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 예를 들면, Pa는, 그 출발 원료인 예를 들면, 피롤-2-카르보알데히드는, 예를 들면, Aldrich사　[1003-29-8], Merck사 [807574]로부터 구입할 수 있다. 또한, Pa 유도체는, 기본적으로 Pa로부터 유도하는 것에 의해서 합성할 수 있다. 예를 들면, Pa의 4위치에 프로핀을 도입한 유도체는, Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, p.4515-4518(2003)(비특허문헌 28)에 기재되어 있다.
본 명세서의 실시예 I에서는, 실시예 I-3-(12)에 있어서, 피롤-2-카르보알데히드로부터 1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드(화합물 17)를 합성했다. 또한, (13)에 있어서, 4-프로피닐2-피롤카르보알데히드(화합물 16)(비특허문헌 40)로부터, 4-프로피닐-1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드(화합물 18)를 합성했다. 또한, 이들 뉴클레오사이드 5'-삼인산 및 5'-γ-아미드삼인산이 합성되었다(화합물 19 및 20).
또한, 본 명세서의 실시예 II-2에서는, 2-니트로피롤(화합물 1)(비특허문헌 49)로부터, 2-니트로피롤(화합물 1)(Pn)의 뉴클레오사이드 5'-삼인산이 합성되었다.
본 발명은, 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드와, 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드가 염기쌍을 형성하고 있는, 핵산을 제공한다. 본 명세서에 있어서 「핵산」이란, 1보다 많은 뉴클레오타이드가, 5'→3'의 방향으로 결합한 핵산쇄의 분자를 의미한다. 본 발명의 핵산은, 일본쇄 또는 이본쇄의 RNA 또는 DNA를 포함한다. 이본쇄는, DNA/DNA, RNA/RNA, 또는 DNA/RNA이어도 좋다. 또한, DNA에는, RNA를 주형으로 하여 역전사해서 이루어지는 cDNA도 포함된다. 혹은, 핵산은 삼본쇄, 사본쇄 등도 형성할 수 있다.
본 발명자들은, 핵산의 새로운 기능확장을 목표로 하여, 비천연형 염기를 가지는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 창제에 임했다. 새롭게 개발된 인공 염기쌍의 태양으로서, 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드와, 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드와의 염기쌍이 포함된다. 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드 및 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드는, 모두, 복제와 전사 어떤 메커니즘에 있어서도, 기질로 해도 주형으로 해도 고효율 및/또는 고선택성을 가지고 기능한다.
식 1의 염기와 식 2의 염기의 사이, 예를 들면, Ds 및 Pa사이에서는 유의한 수소결합 상호작용이 존재하지 않음에도 불구하고(비수소결합 Ds-Pa 염기쌍), Ds-Pa 염기쌍 형성의 효율 및 선택성은, 천연형의 염기쌍 형성의 그것과 동일한 정도로 높은 것이다. 이 Ds-Pa 염기쌍은, 먼저 개발된 친수성 s-z 염기쌍보다도 높은 효율을 나타낸다. Ds 및 Pa의 상보적인 형상은 서로 적합하지만, 천연형의 퓨린류 및 피리미딘류의 형상과는 상이하다. 이 특이적 입체화학적 적합은, 천연형 염기와의 바람직하지 않은 염기쌍합을 배제하고, 그 결과, 복제와 전사에 있어서 Ds-Pa의 높은 선택성을 얻을 수 있다고 생각할 수 있다. 이와 같이, 형상-상보성은 복제나 전사에 있어서의 특이적인 염기쌍 형성에 중요한 역할을 완수한다.
본 발명의, 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드와 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드란, 다른 2개의 핵산 상에 존재하여 염기쌍에 의해 이본쇄를 형성할 수 있다. 혹은, 양 뉴클레오타이드는 동일한 단일의 핵산 상에 존재해도 좋다. 이 경우, 염기쌍에 의해, 일본쇄는 루프구조를 형성해도 좋다.
본 발명의 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드 및 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드는, 복제, 전사 또는 역전사 반응에 의해, DNA 또는 RNA 등의 핵산에 취입하는 것이 가능하다. 혹은, 천연형 염기를 가지는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드와 같이, 화학합성에 의해서 DNA 또는 RNA에 취입해도 좋다.
복제, 전사 또는 역전사 반응은 공지의 방법에 따라서 실시하는 것이 가능하다. 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 전사 반응은 T7　RNA 폴리머라제(Takara 등), 복제반응은, 클레노우프레그먼트(KF), 역전사 반응은 AMV　Reverse　Transcriptase　XL (AMV-RT)(Life　Science사)를 사용하는 것이 가능하다.
한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 핵산은 1태양에 있어서, 핵산의 복제, 전사, 또는 역전사의 공정에서, 염기쌍을 형성하고 있다. 본 발명의 핵산이, 전사 공정에서 염기쌍을 형성하고 있는 경우, 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드가 DNA의 일부이며, 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드가 RNA의 일부이어도 좋고, 혹은 그 반대로 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드가 DNA의 일부이며, 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드가 RNA의 일부이어도 좋다.
본 발명의 비천연형 염기쌍 시스템의 개요를 도 1c에 나타냈다. 본 발명의 시스템의 복제에 있어서의 효과는, 예를 들면, 도 2b-e, 도 3b-i, 도 8~도 20에 나타내져 있다. 본 발명의 시스템의 전사에 있어서의 효과는, 예를 들면, 도 4c-e, 도 5a-c에 나타내져 있다.
핵산의 조제방법
본 발명은 또한, 이하의 식 1:
[화학식 19]
Figure 112008048856036-pct00027
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 조제하는 방법으로서,
이하의 식 2:
[화학식 20]
Figure 112008048856036-pct00028
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 주형으로 하여 전사, 역전사 또는 복제를 실시하여, 상기식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 상보적인 위치에, 상기식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 도입하는
것을 포함하는, 상기 조제방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 이하의 식 2:
[화학식 21]
Figure 112008048856036-pct00029
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 조제하는 방법으로서,
이하의 식 1:
[화학식 22]
Figure 112008048856036-pct00030
여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며, 그리고
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 주형으로 하여 전사, 역전사 또는 복제를 실시하여, 상기식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 상보적인 위치에, 상기식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 도입하는
것을 포함하는, 상기 조제방법을 제공한다.
식 1로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드, 및 식 2로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 정의에 대해서는, 본 명세서의 「본 발명의 인공 염기쌍을 기본으로 하는 핵산」의 항목에 있어서 상술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 방법에 따라 조제된, 식 1 및/또는 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 뉴클레오타이드가 도입된 핵산은, tRNA, mRNA, 안티센스 DNA 혹은 RNA, 리보자임 또는 아프타머로서 사용될 수 있다. 안티센스 DNA 혹은 RNA란, 어떤 특정한 유전자의 발현을 억제하는 DNA 또는 RNA이다. 표적으로 하는 유전자서열(센스쇄)의 전체 길이 또는 부분 서열에 대해서 상보적이라는 의미로 명칭되었다. 인위적으로 유전자발현을 조절하는 방법으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드가 도입된 안티센스 DNA 또는 RNA는, 비천연형 염기를 포함하기 때문에 표적에 대한 상보성이 천연형 염기만을 사용했을 경우와 비교하여 다른 것을 창제할 수 있다. 리보자임은, RNA를 구성성분으로 하는 촉매의 총칭이다. 아프타머는, in　vitro 셀렉션법에 따라 얻을 수 있는, 단백질 등의 특정한 분자에 결합하는 기능을 가지는 핵산이다
또한, 본 발명의, 뉴클레오타이드가 도입된 핵산(DNA 또는 RNA)(예를 들면, mRNA, 합성 RNA)은, 단백질, 펩타이드의 전체 또는 일부를 코드하는 것이어도 좋다. 본 발명의 핵산은 유전자 단편이나 프로브 등으로 하여 사용될 수 있다. 천연의 유전자의 일부 또는 전부를 본 발명의 핵산으로 치환한 태양, 천연의 유전자에 본 발명의 뉴클레오타이드를 1개 또는 그보다 많이 부가한 것, 또는 이들을 조합 시킨 것도 본 발명에 포함된다.
게다가 또한, 본 발명의 비천연형 염기를 가지는 뉴클레오타이드가 도입된 핵산은, RNA간섭(RNA　interference, RNAi)에 있어서도 이용 가능하다. RNA 간섭은, 이본쇄 RNA(dsRNA)에 의해서 그 서열 특이적으로 mRNA가 분해되고, 그 결과 유전자의 발현이 억제되는 현상이다. RNA 간섭의 전형적인 예로서는, dsRNA는, RNaseIII 패밀리에 속하는 다이서(Dicer)에 의해, 3'말단측에 2염기 정도의 오버행을 가지는 약 21염기~23염기의 siRNA(short　interfering　RNA)에 프로세싱된다. siRNA는 RISC로 불리는 siRNA-단백질 복합체에 취입되어, 서열특이적으로 mRNA를 분해한다. RNA 간섭은, 포유동물(인간, 마우스 등 ), 선충, 식물, 초파리, 균류 등의 광범위한 생물종간에 보존되어 있는 현상인 것으로 나타나고 있다. 본 발명의 비천연형 염기를 가지는 뉴클레오타이드가 도입된 핵산은, RNA 간섭에 있어서의 siRNA로서, 또는 분해를 받는 mRNA의 일부로서 이용가능하다.
리보뉴클레오사이드 5'-삼인산
본 발명은, 또한 이하의 식 1:
[화학식 23]
Figure 112008048856036-pct00031
[여기에 있어서,
R1은, 수소 또는 아미노기이고,
R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고
A는, N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 제공한다.
치환기 등의 식 1의 구조에 대해서, 데옥시리보뉴클레오타이드에 대해서 상술한 바와 같다.
본 발명은 게다가 또한, 이하의 식 2:
[화학식 24]
Figure 112008048856036-pct00032
[여기에 있어서,
R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 제공한다.
치환기 등의 식 2의 구조에 대해서, 데옥시리보뉴클레오타이드에 대해서 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 이하의 식 3:
[화학식 25]
Figure 112008048856036-pct00033
[여기에 있어서,
R5는, 수소 또는 치환아미노기이고,
R6은, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
그리고
A는 N 또는 CH이다.]
로 표시되는 염기를 가지는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드를 제공한다.
R5의 치환 아미노기는, 메틸기, 이소부티릴기, 벤조일기 등으로 치환된 아미노기를 포함한다.
R6은, 식 1의 R2와 같다.
식 3에 포함되는 화합물의 예로서, 실시예 I에서 화합물 8을 합성했다.
식 3의 화합물은, 예를 들면, 복제 및 전사에 있어서의 DNA 주형의 화학합성에 있어서의 원료로서 유용하다.
게다가 또한, 이하의 식 4:
[화학식 26]
Figure 112008048856036-pct00034
[여기에 있어서,
R7은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
R8은, 포르밀기 또는 니트로기이며,
단, R7이 수소 또는 1-프로피닐기이고, R8이 포르밀기인 경우를 제외한다.]
로 표시되는 염기를 가지는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드를 제공한다.
R7은, 식 2의 R3와 같다.
R8은, 식 2의 R4와 같다.
식 4의 화합물은, 예를 들면, 복제 및 전사에 있어서의 DNA 주형의 화학합성에 있어서의 원료로서 유용하다.
[도 1a]　도 1a-c는, 특이적 복제 및 전사를 가능하게 하는 비천연형 염기쌍 시스템에 대해서 나타낸다. 도 1a는, 비천연형 Ds-Pa 염기쌍 및 천연형 염기쌍을 나타낸다.
[도 1b]　도 1a-c는, 특이적 복제 및 전사를 가능하게 하는 비천연형 염기쌍 시스템에 대해서 나타낸다. 도 1b는, PCR 및 프라이머 신장을 위한 기질로서의 비수식 5'-삼인산(dNTP) 및 수식 5'-γ-아미드삼인산의 구조를 나타낸다.
[도 1c]　도 1a-c는, 특이적 복제 및 전사를 가능하게 하는 비천연형 염기쌍 시스템에 대해서 나타낸다. 도 1c는, PCR 증폭, 프라이머 신장, DNA 시퀀싱, 및 T7 전사에 있어서 기능하는 비천연형 염기쌍 시스템을 나타낸다.
[도 2a]　도 2a-e는, Ds-Pa 염기쌍을 사용한 비천연형 염기쌍 시스템의 1뉴클레오타이드 삽입 및 프라이머 신장 실험에 대해서 나타낸다. 도 2a는, 1뉴클레오타이드 삽입실험을 위한 주형 프라이머 이본쇄의 서열이다.
[도 2b]　도 2a-e는, Ds-Pa 염기쌍을 사용한 비천연형 염기쌍 시스템의 1뉴클레오타이드 삽입 및 프라이머 신장 실험에 대해서 나타낸다. 도 2b는, KF　exo-에 의한 각 주형 염기에 대한 각 비수식기질(dN'TP)의 도입 효율을 나타낸다.
[도 2c]　도 2a-e는, Ds-Pa 염기쌍을 사용한 비천연형 염기쌍 시스템의 1뉴클레오타이드 삽입 및 프라이머 신장 실험에 대해서 나타낸다. 도 2c는, KF　exo-에 의한 각 주형 염기에 대한 각 기질(비수식기질 dN'TP, N=Pa, G, C, 및 T, 및 수식 기질 dN'TPN, N=Ds 및 A)의 도입 효율을 나타낸다.
[도 2d]　도 2a-e는, Ds-Pa 염기쌍을 사용한 비천연형 염기쌍 시스템의 1뉴클레오타이드 삽입 및 프라이머 신장 실험에 대해서 나타낸다. 도 2d는, dDsTP 또는 dDsTPN의 존재 또는 비존재에 있어서, dPaTP 및 천연형 기질과 Ds를 함유하는 주형을 이용하여, KF　exo＋에 의해 5분간의 프라이머 신장 반응을 실시한 결과를 나타낸다.
[도 2e]　도 2a-e는, Ds-Pa 염기쌍을 사용한 비천연형 염기쌍 시스템의 1뉴클레오타이드 삽입 및 프라이머 신장 실험에 대해서 나타낸다. 도 2e는, KF　exo- 또는 exo＋에 의한 일련의 기질(DSN=dDsTPN 및 AN=dATPN)을 가하여, Pa를 포함한 주형, 혹은, 천연형의 주형을 이용한 3분간의 프라이머 신장. dGTP가 각 반응에 존재하지 않기 때문에, 전체 길이 산물은 주로 33-mer가 된다.
[도 3a]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3a는, 실험의 스킴을 나타낸다. 이본쇄 DNA 단편(150-mer, DNA1)을, Ds 및 Pa를 함유하는 화학적으로 합성된 DNA 단편(91-mer 및 81-mer)을 이용하여 프라이머 신장에 의해 조제했다.
[도 3b]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3b는, 초기의 DNA 단편(0사이클) 및 5 및 10사이클의 후의 PCR 산물의 아가로스겔 분석을 나타낸다. DNA1은, PCR을 사이클(94℃, 0.5분; 45℃, 0.5분; 65℃, 4분)에서 0.04유닛/㎕　VENT　DNA 폴리머라제를 이용하여 증폭되었다. 천연형 염기만을 함유하는 DNAcont1은, PCR을 사이클(94℃, 0.5분; 45℃, 0.5분; 72℃, 1분)에서 0.01유닛/㎕　VENT　DNA 폴리머라제를 이용하여 증폭되었다.
[도 3c]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3c-i는, 도 3a 및 b에 관하여 설명한 요령에 따라서 PCR 및 서열결정을 실시한 결과를 나타낸다. 비천연형 염기쌍 시스템을 이용한 10(d, g), 및 10＋10(e, h) 사이클 PCR 후의, 또는 천연형 기질만의 10사이클 PCR(f) 후의, PCR 전의 DNA1(c, g) 및 PCR 산물의, dPa'TP의 존재하(c-f) 또는 비존재하(g-i)에서의 시퀀싱.
도 3c는, PCR 전(0사이클)의 dPa'TP의 존재하에서의 시퀀싱의 결과이다. 40번째의 염기는, 주형의 Ds의 상보적인 위치에 대응하는 염기이고, 시퀀싱 반응에서는 이 위치에 Pa'가 도입된다. 따라서, 이 부위만 A, G, C, T의 어떤 피크도 소실한다.
[도 3d]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3c-i는, 도 3a 및 b에 관해서 설명한 요령에 따라서 PCR 및 서열결정을 실시한 결과를 나타낸다. 도 3d는, 10사이클 PCR 후의 dPa'TP의 존재하에서의 시퀀싱의 결과이다. 40번째의 염기는, 주형의 Ds의 상보적 위치에 대응하는 염기이고, 시퀀싱 반응에서는 이 위치에 Pa'가 도입된다. 따라서, 이 부위만 A, G, C, T의 어떤 피크도 소실한다.
[도 3e]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3c-i는, 도 3a 및 b에 관해서 설명한 요령에 따라서 PCR 및 서열결정을 실시한 결과를 나타낸다. 도 3e는, 10＋10사이클 PCR 후의 dPa'TP의 존재하에서의 시퀀싱의 결과이다. 40번째의 염기는, 주형의 Ds의 상보적 위치에 대응하는 염기이고, 시퀀싱 반응에서는 이 위치에 Pa'가 도입된다. 따라서, 이 부위만 A, G, C, T의 어떤 피크도 소실한다.
[도 3f]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3c-i는, 도 3a 및 b에 관해서 설명한 요령에 따라서 PCR 및 서열결정을 실시한 결과를 나타낸다. 도 3f는, 천연형 기질만으로 Ds 및 Pa 기질이 존재하지 않는 조건하에서의 PCR(10사이클) 후의 dPa'TP의 존재하에서의 시퀀싱의 결과이다. 40번째의 염기에 상당하는, 주형의 DNA1 중의 Ds-Pa 염기쌍은, 완전히 A-T 염기쌍으로 치환되어 있다(40번째의 염기 T).
[도 3g]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3c-i는, 도 3a 및 b에 관해서 설명한 요령에 따라서 PCR 및 서열결정을 실시한 결과를 나타낸다. 도 3g는, PCR 전(0사이클)의 dPa'TP의 비존재하에서의 시퀀싱의 결과이다. 40번째의 염기는, 주형의 Ds의 상보적인 위치에 대응하는 염기이지만, Ds와 특이적인 염기쌍을 형성하는 염기가 존재하지 않기 때문에, 이 위치 이후의 피크는 거의 소멸한다.
[도 3h]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3c-i는, 도 3a 및 b에 관해서 설명한 요령에 따라 서 PCR 및 서열결정을 실시한 결과를 나타낸다. 도 3h는, 10사이클 PCR 후의 dPa'TP의 비존재하에서의 시퀀싱의 결과이다. 40번째의 염기는, 주형의 Ds의 상보적 위치에 대응하는 염기이지만, Ds와 특이적인 염기쌍을 형성하는 염기가 존재하지 않기 때문에, 이 위치이후의 피크는 거의 소멸한다. 다만, 염기의 비특이적인 취입(독과(讀過))도 관찰된다. 이 독과의 피크는, PCR 증폭이 중요한 사이클수의 증가에 의해 약간 커졌다.
[도 3i]　도 3a-i는, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 DNA 시퀀싱 및 PCR 증폭에 대해서 나타낸다. 도 3c-i는, 도 3a 및 b에 관해서 설명한 요령에 따라서 PCR 및 서열결정을 실시한 결과를 나타낸다. 도 3i는, 10＋10사이클 PCR 후의 dPa'TP의 비존재하에서의 시퀀싱의 결과이다. 40번째의 염기는, 주형의 Ds의 상보적인 위치에 대응하는 염기이지만, Ds와 특이적인 염기쌍을 형성하는 염기가 존재하지 않기 때문에, 이 위치 이후의 피크는 거의 소멸한다. 다만, 염기의 비특이적인 취입(독과)도 관찰된다. 이 독과의 피크는, PCR 증폭이 중요한 사이클수의 증가에 의해 약간 커졌다.
[도 4a]　도 4는, Ds-Pa 염기쌍에 의해 중개되는 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 4a 및 도 4b는, 실험의 스킴이다.
[도 4b]　도 4는, Ds-Pa 염기쌍에 의해 중개되는 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 4a 및 도 4b는, 실험의 스킴이다.
[도 4c]　도 4는, Ds-Pa 염기쌍에 의해 중개되는 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 4c는, PaTP, Pa'TP 또는 DsTP의 존재하(1mM) 또는 비존재하에 있어서의 천 연형 NTP(1mM)와 주형(N=Ds, Pa, Pa', A 또는 C)을 이용한 전사물의 겔전기영동법을 나타낸다. 전사물을 [γ-32P]GTP로 표지했다. 각 전사물의 수율을, 천연형 염기로 이루어지는 주형(N=A 또는 C)로부터의 천연형 전사물의 비교에 의해 결정했다. 각각의 전사 효율(수율)은, 3개의 데이터세트로부터 평균화되었다.
[도 4d]　도 4는, Ds-Pa 염기쌍에 의해 중개되는 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 4d 및 도 4e는, 전사물(17-mer)의 뉴클레아제 소화로부터 얻어진 표지 리보누클레오시드 3'-인산의 2D-TLC 해석의 결과를 나타낸다.
[도 4e]　도 4는, Ds-Pa 염기쌍에 의해 중개되는 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 4d 및 도 4e는, 전사물(17-mer)의 뉴클레아제 소화로부터 얻어진 표지 리보누클레오시드 3'-인산의 2D-TLC 해석의 결과를 나타낸다.
[도 5a]　도 5는, 비천연형 안티코돈을 함유하는 tRNA 분자의 특이적 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 5a는, Pa'TP(3mM) 또는 DsTP(2mM)의 존재하에 있어서의, 천연형 NTP(2 또는 3mM)의 주형(DNA11-14 및 DNAcont4)을 이용한 tRNA 전사물의 겔전기영동의 결과를 나타낸다. 전사물을, 내부에 [α-32P]GTP로 표지했다. 각 전사물의 수율은, DNAcont4로부터의 억제 유전자(서프레서)-tRNACUA 전사물과의 비교에 의해 결정했다. 각각의 전사 효율(수율)은, 3개의 데이터세트로부터 평균화되었다.
[도 5b]　도 5는, 비천연형 안티코돈을 함유하는 tRNA 분자의 특이적 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 5b 및 도 5c는, tRNACPa'A 및 tRNACUDs의 전사물의 뉴클레아 제 소화로부터 얻어진 표지 리보뉴클레오사이드 3'-일인산의 2D-TLC 해석의 결과를 나타낸다.
[도 5c]　도 5는, 비천연형 안티코돈을 함유하는 tRNA 분자의 특이적 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 5b 및 도 5c는, tRNACPa'A 및 tRNACUDs의 전사물의 뉴클레아제 소화로부터 얻어진 표지 리보뉴클레오사이드 3'-일인산의 2D-TLC 해석의 결과를 나타낸다.
[도 5d]　도 5는, 비천연형 안티코돈을 함유하는 tRNA 분자의 특이적 T7 전사에 대해서 나타낸다. 도 5d는, 대장균 무세포 시스템(RTS-100, Roche)에 있어서의 tRNA 전사물의 아미노아실화에 대해서 나타낸다. [α-32P]GTP로 내부표지된 tRNA 전사물을, 무세포 시스템 중에서 30℃에서 30분 인큐베이션하여, 아미노아실화된 tRNA를 0.2M　Tris-아세트산(pH4.75) 및 3mM　EDTA를 함유하는 10혼합물 중에폴리아크릴아미드겔로 전기영동하여 분석했다.
[도 6]　도 6은, PCR, 시퀀싱 및 전사의 실험을 위한 DNA 단편의 서열을 나타낸다.
[도 7a]　도 7은, 화학합성된 DNA 단편의 서열을 나타낸다.
[도 7b]　도 7은, 화학합성된 DNA 단편의 서열을 나타낸다.
[도 8]　도 8은, 0~10%의 DNAcont1을 함유하는 DNA1의, dPa'TP비존재하에서의 색소 터미네이터 시퀀싱을 나타낸다. 이 피크 패턴과 Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편 PCR의 피크 패턴을 비교함으로써 Ds-Pa 염기쌍의 PCR에 있어서의 충실도를 조사할 수 있다.
[도 9]　도 9는, 300μM의 dDSTPN, dPaTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 DNA1로부터의 PCR 산물의 다이터미네이터시퀀싱을 나타낸다. DNA1의 10사이클(b, e) 또는 10＋10사이클(c, f)의 후의, 초기의 DNA1(a, d) 및 PCR 산물의, dPa'TP의 존재하(a-c) 또는 비존재하(d-f)에 있어서의 시퀀싱. dATPN 대신에, dATP를 사용하여 PCR을 실시하면, 충실도는 유의하게 감소했다(e, f).
[도 10]　도 10은, 32P-표지　5'-　혹은 3'-프라이머를 이용한 PCR 산물의 오토라디오그래프를 나타낸다.　32P-표지 5'- 및 비표지 3'-프라이머, 또는 32P-표지 3'- 및 비표지 5'-프라이머를 이용하여 DNA1(a) 또는 DNAcont1(b)를 포함하는 Vent　DNA 폴리머라제를 위한 완충용액(100㎕) 중에서 PCR을 실시했다. 1, 3, 5, 10 및 15회의 PCR 사이클의 후의 각 반응용액으로부터, 그 일부(10㎕)를 10% 폴리아크릴 아미드-7M 요소겔 상에서 분석했다. 바이오 영상분석기(bio image analyzer)를 이용하여, 겔 상의 산물을 분석하고, 정량했다. 각 사이클 당의 효율(Y)을, 이하의 일반 곡선 피트를 이용한 카레이더그래프(Kaleida Graph)에 의해서 계산했다. Nf=N0×(1＋Y)n[여기에서, n은, PCR 사이클의 수(n=1, 3, 5 및 10)이며, N0은 최초의 카피(copy)수이고, 그리고, Nf는, n사이클 후의 산물의 카피수이다.]　Nf는, 이하의 식으로부터 결정했다. Nf=N0＋P0×(Ifull/Itotal)[여기서,　P0는, 32P-표지 프라이머의 수이며, Ifull은, 전체 길이 산물에 상당하는 밴드의 카운트이고, 그리고 Itotal은, 레인 중의 밴드의 총 카운트이다.]　결정된 Y값을 이하의 표에 나타낸다.
[표 2-2]
Figure 112008048856036-pct00035
[도 11]　도 11은, Ds 및 Pa를 함유하는 화학적으로 합성된 단편이 다른 시료(a-d)로부터 조제된 DNA2 및 4단편의 PCR 산물의, dPa'TP비존재하에서의 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다. 이 결과로부터, 화학합성한 Ds-Pa 염기쌍을 포함하는 DNA 단편의 순도가, PCR 후의 피크 패턴에 영향을 미치는 것을 알았다.
즉, 먼저 구한 PCR에 있어서의 Ds-Pa 염기쌍의 충실도(99.8%)는, 화학합성 한 DNA 단편의 순도에 의존하고 있으므로, 그 충실도는 99.8% 보다 더 높다고 생각된다.
[도 12]　도 12는, DNA1, DNA3-10 및 DNAcont1로부터의 PCR 산물의 아가로스겔 전기영동에 의해 결정된, 증폭 효율에 대해서 나타낸다. PCR 산물을, 4%아가로스겔 상에서 검출하여 에티듐브로마이드에 의해 염색했다. 그리고, Molecular　Imager　FX　Pro 시스템 및 Quantity　One 소프트웨어(Bio-Rad)를 이용하여 염색된 밴드의 강도를 정량했다. 이하의 식을 이용하여 증폭 효율을 결정했다. (PCR 산물의 강도)/(PCR을 위한 인풋 DNA의 강도겔전기 효율은, 3-4데이터세트로부터 평균화했다. 표준편차는 괄호에 나타내고 있다.
[도 13]　도 13은, 프라이머 2를 이용했을 경우의 DNA2로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 14]　도 14는, 프라이머 2를 이용했을 경우의 DNA3으로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 15]　도 15는, 프라이머 2를 이용했을 경우의 DNA4로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 16]　도 16은, 프라이머 1을 이용했을 경우의 DNA5로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 17]　도 17은, 프라이머 1을 이용했을 경우의 DNA6으로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 18]　도 18은, 프라이머 2를 이용했을 경우의 DNA7로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 19]　도 19는, 프라이머 2를 이용했을 경우의 DNA8로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 20]　도 20은, 프라이머 2를 이용했을 경우의 DNA9로부터의 PCR 산물의, 다이터미네이터시퀀싱의 결과를 나타낸다.
[도 21]　도 21은, 대장균 유래의 무세포 번역시스템에 있어서의 비천연형 안티코돈을 함유하는 tRNA의 아미노아실화의 스킴을 나타낸다.
[도 22]　도 22는, 7-(2-티에닐겔전기-3H-이미다조[4,5-b]피리딘의 뉴클레오사이드 유도체를 위한 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　(a)겔전기디클로로비스(트리페닐포스핀겔전기팔라듐, 2-(트리부틸스태닐)티오펜, DMF;　(b)팔라듐 탄소, 붕화수소나트륨, 에탄올, 아세트산에틸;　(c)포름산;　(d)NaH, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노실클로라이드, CH3CN;　(e)NH3, 메탄올;　(f) 및 (l)4,4'-디메톡시트리틸클로라이드, 피리딘;　(g)2-시아노에틸테트라이소프로필포스포로디아미다이트, 테트라졸, CH3CN;　(h) 및 (m)수 아세트산, 피리딘, 이어서 디클로로아세트산, 디클로로메탄;　(i) 및 (n)2-클로로-4H-1,3,2,-벤조디옥사포스포린-4-온, 디옥산, 피리딘, 트리부틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로인산, DMF, 이어서 I2/피리딘, 물, NH4OH(5'-삼인산의 경우), I2/피리딘, NH4OH(5'-γ-아미드삼인산의 경우);　(j)테트라-O-아세틸-β-D-리보푸라노오즈, 클로로아세트산;　(k)암모니아 포화 메탄올. Tol:톨루오일, DMT:4,4'-디메톡시트리틸, Ac:아세틸
[도 23]　도 23은, 피롤-2-카르보알데히드, 4-프로피닐피롤2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드 유도체, 및 6-아미노-9-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)퓨린　5'-γ-아미드삼인산의 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　(a)NaH, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-에리스로-펜토푸라노실클로라이드, CH3CN;　(b)암모니아 포화 메탄올;　(c)4,4'-디메톡시트리틸클로라이드, 피리딘;　(d)2-시아노에틸-N,N'-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트, 디이소프로필에틸아민, THF;　(e)프로톤스펀 지, POCl3, 트리메틸인산, 이어서, 트리부틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로인산, DMF;　(f)NaH, CH3CN, 이어서, 2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실클로라이드; (g)BBr3, 디클로로메탄;　(h)2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온, 디옥산, 피리딘, 트리부틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로인산, DMF, 이어서, I2/피리딘, 물, NH4OH(5'-γ-아미드삼인산의 경우); Tol:톨루오일, DMT:4,4'-디메톡시트리틸, Ac:아세틸
[도 24a]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24a는, 화합물 6 및 11의 1H　NMR(270MHz, DMSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 24b]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24b는, 화합물 6 및 11의 1H　NMR(270MHz, DMOSO-d6) 스펙트럼(7.0-9.0ppm)이다.
[도 24c]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24c는, 화합물 6의 1D　NOE 스펙트럼(DMOSO-d6중)이다.
[도 24d]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24d는, 화합물 11의 1D　NOE 스펙트 럼(DMOSO-d6중)이다.
[도 24e]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24e는, 화합물 6의 13C　NMR(75MHz, DMOSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 24f]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24f는, 화합물 6의 2D COSY 스펙트럼이다.
[도 24g]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24g는, 화합물 6의 2D　NOESY 스펙트럼이다.
[도 24h]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24h는, 화합물 6의 2D　HSQC 스펙트럼이다.
[도 24i]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24i는, 화합물 6의 2D　HMBC 스펙트럼이다.
[도 24j]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24j는, 화합물 6의 2D　HMBC 스펙트럼(확대)이다.
[도 24k]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24k는, 화합물 11의 13C　NMR(75MHz, DMOSO- d6) 스펙트럼이다.
[도 24l]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24l은, 화합물 11의 2D COSY 스펙트럼이다.
[도 24m]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24m은, 화합물 11의 2D　NOESY 스펙트럼이다.
[도 24n]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24n은, 화합물 11의 2D　HSQC 스펙트럼이다.
[도 24o]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24o는, 화합물 11의 2D　HMBC 스펙트럼이다.
[도 24p]　도 24는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 24p는, 화합물 11의 2D　HMBC 스펙트럼(확대)이다.
[도 25a]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25a는, 화합물 17의 1H　NMR(300MHz, DMOSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 25b]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데 히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25b는, 화합물 17의 13C　NMR(75MHz, DMOSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 25c]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25c는, 화합물 17의 2D COSY 스펙트럼이다.
[도 25d]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25d는, 화합물 17의 2D　HSQC 스펙트럼이다.
[도 25e]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25e는, 화합물 17의 2D　HMBC 스펙트럼이다.
[도 25f]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25f는, 화합물 17의 2D　NOESY 스펙트럼이다.
[도 25g]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25g는, 화합물 18의 1H　NMR(300MHz, DMOSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 25h]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데 히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25 h는, 화합물 18의 13C　NMR(75MHz, DMOSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 25i]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25i는, 화합물 18의 2D COSY 스펙트럼이다.
[도 25j]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25j는, 화합물 18의 2D　NOESY 스펙트럼 스펙트럼이다.
[도 25k]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25k는, 화합물 18의 2D　HSQC 스펙트럼이다.
[도 25l]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25l은, 화합물 18의 2D　HMBC 스펙트럼이다.
[도 25m]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25m은, 화합물 17의 1D　NOE 스펙트럼(DMOSO-d6 중)이다.
[도 25n]　도 25는, 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 25n은, 화합물 18의 1D　 NOE 스펙트럼(DMOSO-d6 중)이다.
[도 26]　도 26은, 데옥시아데노신　5'-γ-아미드삼인산의 DEAE 세파덱스 이온교환컬럼 용출패턴을 나타낸다. 흰색동그라미는 260nm의 결과, 검은색동그라미는 280nm의 결과이다.
[도 27]　도 27은, 데옥시아데노신　5'-γ-아미드삼인산의 ESI-질량스펙트럼이다.
[도 28a]　도 28a는, 데옥시아데노신　5'-γ-아미드삼인산의 1H　NMR(270MHz, D2O) 스펙트럼이다.
[도 28b]　도 28b는, 데옥시아데노신　5'-γ-아미드삼인산의 1P　NMR(109MHz, D2O) 스펙트럼이다.
[도 29a]　도 29a는, 7-(2-티에닐)-3-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)3H-이미다조[4,5-b]피리딘5'-γ-아미드삼인산(상단)과 5'-삼인산(하단)의 1H　NMR(270MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 29b]　도 29b는, 7-(2-티에닐)-3-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)3H-이미다조[4,5-b]피리딘5'-γ-아미드삼인산(상단)과 5'-삼인산(하단)의 1P　NMR(109MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 30a]　도 30a는, 7-(2-티에닐)-3-(β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5- b]피리딘5'-삼인산(화합물 14)의 1H　NMR(300MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 30b]　도 30b는, 1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(화합물 19)의 1H　NMR(270MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 30c]　도 30c는, 4-프로피닐-1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(화합물 20)의 1H　NMR(270MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 31a]　도 31a는, 7-(2-티에닐)-3-(β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘5'-삼인산(화합물 14)의 31P　NMR(109MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 31b]　도 31b는, 1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(화합물 19)의 31P　NMR(109MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 31c]　도 31c는, 4-프로피닐 1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(화합물 20)의 31P　NMR(109MHz, D2O) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 32]　도 32는, C35H40O17P2S의 일렉트로스프레이 이온화 질량스펙트럼(ESI-MS)의 결과를 나타낸다. C35H40O17P2S:　계산값: 924.17(1-); 461.58(2-) 측정값: 924.02(1-); 461.70(2-)
[도 33]　도 33은, 7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘의 뉴클레오사 이드 유도체를 위한 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　(a)디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐, 2-(트리부틸스태닐)티아졸, DMF;　(b)팔라듐 탄소, 붕화수소나트륨, 에탄올, 아세트산에틸;　(c)포름산;　(d)NaH, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노실클로라이드, CH3CN; (e)암모니아 포화 메탄올;　(f)4,4'-디메톡시트리틸클로라이드, 피리딘;　(g)2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트, 디이소프로필에틸아민, THF;　(h)무수 아세트산, 피리딘, 이어서 디클로로아세트산, 디클로로메탄;　(i)2-클로로-4H-1,3,2,-벤조디옥사포스포린-4-온, 디옥산, 피리딘, 트리-n-부틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로인산, I2/피리딘, 물, NH4OH. Tol:톨루오일, DMT:4,4'-디메톡시트리틸, Ac:아세틸
[도 34]　도 34는, 2-니트로피롤(화합물 1)의 뉴클레오사이드 유도체의 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　겔전기NaH, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노실클로라이드, CH3CN;　(b)암모니아 포화 메탄올;　(c)4,4'-디메톡시트리틸클로라이드, 피리딘;　(d)2-시아노에틸-N,N'-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트, 디이소프로필에틸아민, THF; (e)무수 아세트산, 피리딘, 이어서, 디클로로아세트산, 디클로로메탄;　(f)2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온, 디옥산, 피리딘, 트리-n-부틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로인산, I2/피리딘, 물, NH4OH.　Tol:톨루오일, DMT:4,4'-디메톡시트리틸, Ac:아세틸
[도 35]　도 35는, 4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(DDs) 및 4-(2-티에 닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(DDv)의 뉴클레오사이드 유도체를 위한 합성스킴을 나타낸다.　시약 및 약어　(a)mCPBA, EtOAc, 이어서, 메탄술포닐클로라이드, DMF;　(b)NaI, CH3COCl, CH3CN;　(c)NaH, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노실클로라이드, CH3CN;　(d)디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐, 2-(트리부틸스태닐) 티오펜 또는 2-(트리부틸스태닐)티아졸, DMF;　(e)암모니아 포화 메탄올; (f) 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드, 피리딘;　(g)2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트, 디이소프로필에틸아민, THF;　(h)무수 아세트산, 피리딘, 이어서 디클로로아세트산, 디클로로메탄;　(i)2-클로로-4H-1,3,2,-벤조디옥사포스포린-4-온, 디옥산, 피리딘, 트리-n-부틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로인산, I2/피리딘, 물, NH4OH.　Tol:톨루오일, DMT:4,4'-디메톡시트리틸, Ac:아세틸
[도 36]　도 36은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 28)를 위한 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　(a)NaH, CH3CN, 이어서 2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실클로라이드;　(b)BBr3, 디클로로메탄;　(c)3-(디클로로아세트아미드)-1-프로핀, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐, CuI, 트리에틸아민, DMF;　(d)4,4'-디메틸트리틸클로라이드, 피리딘;　(e)무수 아세트산, 피리딘, 이어서, 디클로로아세트산, 디클로로메탄;　(f) 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온, 디옥산, 피리딘, 트리-n-부 틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로포스페이트, DMF, 이어서, I2/피리딘, 물, NH4OH;　(g)바이오틴-N-히드록시숙신이미드, DMF, 탄산나트륨 완충액(pH8.6), 이어서 NH4OH. DMTr:4,4'-디메톡시트리틸, Ac:아세틸.
[도 37]　도 37은, 4-요오도피롤-2-카르발데히드의 리보뉴클레오사이드의 1H　NMR(500MHz, DMSO-d6) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 38a]　도 38은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 38a는, 화합물 24의 1H　NMR(300MHz, DMSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 38b]　도 38은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 38b는, 화합물 24의 13C　NMR(75MHz, DMSO-d6) 스펙트럼이다.
[도 38c]　도 38은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 38c는, 화합물 24의 2D COSY 스펙트럼이다.
[도 38d]　도 38은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 38d는, 화합물 24의 2D　NOESY 스펙트럼이다.
[도 38e]　도 38은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 38e는, 화합물 24의 2D　HMQC 스펙트럼이다.
[도 38f]　도 38은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 38f는, 화합물 24의 2D　HMBC 스펙트럼이다.
[도 38g]　도 38은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 38g는, 화합물 24의 2D　HMBC 스펙트럼(확대)이다.
[도 39]　도 39는, 1-[5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 25)의 1H　NMR(500MHz, DMSO-d6) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 40]　도 40은, 1-(2,3-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 26)의 1H　NMR(500MHz, DMSO-d6) 스펙트럼을 나타낸다.
[도 41]　도 41은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-아미노-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 27) 및 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 28)의 DEAE 세파덱스 이온교환컬럼에 의한 용출패턴을 나타낸다.
[도 42]　도 42는, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-아미노-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 27:위의 스펙트럼) 및 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 28:아래의 스펙트럼)의 ESI 질량스펙트럼을 나타낸다.
[도 43a]　도 43은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 28)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 43a는, 화합물 28의 1H　NMR(300MHz, D2O) 스펙트럼이다.
[도 43b]　도 43은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 28)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 43b는, 화합물 28의 2D COSY 스펙트럼이다.
[도 43c]　도 43은, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 28)의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 43c는, 화합물 28의 31P　NMR(109MHz, D2O) 스펙트럼이다.
[도 44a]　도 44a는, 바이오틴화된 PaTP(Bio-PaTP:화합물 28)의 화학구조를 나타낸다.
[도 44b]　도 44b는, Ds-Pa 염기쌍을 이용한 T7 전사에 의한 RNA 분자의 부위 특이적 바이오틴화에 있어서의, 전사 및 전사물 해석의 실험 스킴을 나타낸다.
[도 44c]　도 44c는, Ds-Pa 염기쌍을 이용한 T7 전사에 의한 RNA 분자의 부 위 특이적 바이오틴화 실험에서 얻어진 전사물의 겔전기영동법의 사진이다. 레인 1~4는 라이게이션에 의해 얻어진 주형, 레인 5~12는 PCR 증폭된 주형을 이용했을 경우의 결과이다. 주형으로서는, DNA6(레인 1, 2, 5, 6, 9, 10) 및 대조로서 DNAcont2(레인 3, 4, 7, 8, 11, 12)를 이용하고, Bio-PaTP의 존재하(2mM) 또는 비존재하에서, 천연형 NTPs(2mM)와 함께 전사반응을 실시했다. 전사물은 [γ-32P]GTP로 표지했다.
[도 44d]　도 44d는, 바이오틴화 전사물의 분석을 위한 겔시프트 엣세이의 결과를 나타내는 사진이다. 라이게이션에 의해 얻어진 주형인 DNA6 및 PCR 증폭(20사이클)된 주형인 DNAcont2로부터, Bio-PaTP를 이용하여 전사된 152-mer　RNA, 및, 라이게이션에 의해 얻어진 주형인 DNAcont5 및 DNAcont6로부터, 바이오틴화된 UTP(Bio-UTP)를 이용하여 전사된, 152-mer　RNA를 스트렙트아비딘과 혼합했다. 바이오틴화 RNA-스트렙트아비딘 복합체와 RNA 단체는, 7% 폴리아크릴아미드-7M　요소겔 상에서 분리되고, 그리고 복합체의 비율(수율)을 밴드의 강도로부터 결정했다.
[도 44e]　도 44e는, Bio-Pa 또는 A를 59위치에 포함하는 152-mer 전사물의 서열 분석의 결과를 나타내는 사진이다. 5'말단을 32P로 표지된 전사물을, RNase　T1(T1) 또는 알칼리(AL)로 부분소화했다. 알칼리 부분소화한 전사물의 일부를 스트렙트아비딘 자기(磁氣)비즈로 처리하고, Bio-Pa를 포함하는 RNA 단편(AL＋SA)을 포착하여, 그 나머지를 전기영동했다. 각각의 소화한 단편은 10% 폴리아크릴아미드-7M　요소겔 상에서 분석했다.
[도 45]　도 45는, 2-니트로피롤의 4위치 수식 뉴클레오사이드 유도체의 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　(a)N-요오도숙신이미드, CH3CN;　(b)프로피닐-1-트리부틸틴, Pd(PPh3)2Cl2, DMF 또는 N-(2-프로피닐)-디클로로아세토아미도, Pd(PPh3)4, CuI, 트리에틸아민, DMF;　(c)4,4'-디메톡시트리틸클로라이드, 피리딘;　(d)2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트, 디이소프로필에틸아민, THF;　(e)무수 아세트산, 피리딘, 이어서 디클로로아세트산, 디클로로메탄;　(f)2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온, 디옥산, 피리딘, 트리-n-부틸아민, 비스(트리부틸암모늄)피로인산, I2/피리딘, 물, NH4OH.　DMTr:　4,4'-디메톡시트리틸,　Ac:　아세틸.
[도 46] 도 46은, NH2-hx-dPnTP, ROX-hx-dPnTP 및 FAM-hx-dPnTP의 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　(a)CuI,　Pd[P(C6H5 )3]4, DMF, 트리에틸아민, 실온, 이어서, N-(2-프로피닐)-6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드;　(b)DMTr-Cl, 피리딘, 실온;　(c)무수 아세트산, 피리딘, 실온, 이어서, 디클로로아세트산, 디클로로메탄, 0℃;　(d)2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온/디옥산, 피리딘, 트리-n-부틸아민, 비스(트리-n-부틸암모늄)피로인산, DMF, 이어서, I2/피리딘, 물, NH4OH, 실온;　(e)R-N-히드록시숙신이미딜에스테르(R=FAM 또는 ROX)/DMF,　0.1M　NaHCO3-Na2CO3 완충액(pH8.5), 실온, 8시간, 이어서, NH4OH.
[도 47]
도 47은, NH2-hx-PaTP, FAM-hx-PaTP 및 TAMRA-hx-PaTP의 합성스킴을 나타낸다. 시약 및 약어　(a)CuI,　Pd[P(C6H5)3]4, DMF, 트리에틸아민, 실온, 이어서, N-(2-프로피닐)-6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드;　(b)DMTr-Cl, 피리딘, 실온; (c)무수 아세트산, 피리딘, 실온, 이어서, 디클로로아세트산, 디클로로메탄, 0℃;　(d)2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온/디옥산, 피리딘, 트리-n-부틸아민, 비스(트리-n-부틸암모늄)피로인산, DMF, 이어서, I2/피리딘, 물, NH4OH, 실온;　(e)R-N-히드록시숙신이미딜에스테르(R=FAM 또는 TAMRA)/DMF,　0.1M　NaHCO3-Na2CO3 완충액(pH8.5), 실온, 8시간, 이어서, NH4OH.
[도 48]
도 48은, 클레노우프레그먼트를 이용한 복제에 의한, 아미노기나 형광색소를 결합한 기질 Pn의 DNA(55-mer) 중으로의 도입의 스킴 및 그 결과를 나타낸다.
[도 49]
도 49는, T7　RNA 폴리머라제를 이용한 전사에 의한, 형광색소를 결합한 기질 Pa의 RNA(17-mer) 중으로의 도입의 스킴 및 그 결과를 나타낸다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 기술적 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 근거하여 용이하게 본 발명에 수식·변경할 수 있고, 그들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 I　화학합성-1
1. 일반적인 방법 및 재료
시약 및 용매는, 표준적인 공급업자로부터 구입하였고, 더이상 정제하지 않고 사용했다. 박층크로마토그래피(TLC)는, 254nm 형광지시약(Merck)을 포함하는 0.25mm 실리카겔 60플레이트를 이용하여, 전사 반응을 모니터했다. 1H　NMR, 13C　NMR 및 31P NMR 스펙트럼은, JEOL　EX270 및 BRUKER 핵자기공명 스펙트로미터(300MHz 및 600MHz) 상에 기록했다. 분취용 C18컬럼(Waters　Microbond　Sphere, 150×19mm)를 갖춘 Gilson　HPLC 시스템 상에서, 뉴클레오사이드 정제를 실시했다. DEAE-세파덱스　A-25컬럼(300×15mm) 및 분석용 C18컬럼(Synchropak　RPP, 250×4.6mm, Eichrom　Technologies)으로, 삼인산 유도체를 정제했다.
고분해능 질량스펙트럼(HRMS) 및 일렉트로스프레이 이온화 질량스펙트럼(ESI-MS)을, 각각 Waters2690　LC 시스템을 구비한 JEOL　HX-110 혹은 JM700 질량분석계 및 Waters 마이크로 매스 ZMD4000 상에 기록했다. 형광측정법은, FP-6500스펙트럼 형광계(JASCO)로 실시하였다.
피롤-2-카르보알데히드(비특허문헌 39) 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드(비특허문헌 40)는, 선행문헌에 기재된 것과 같이 합성했다.
2. 화합물의 합성의 설명
7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘의 합성은, 도 22에 기재된 반응에 따라 실시하였다. 구체적으로는, 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 4)은, 2-아미노-3-니트로-4-클로로피리딘(화합물 1)(비특허문헌 41)으로 3공정으로 합성했다(72%). 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘의 데옥시리보뉴클레오사이드(화합물 6)는, 1-클로로-2-데옥시-3,5-디-O-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노스(비특허문헌 42)와 화합물 4의 나트륨염과의 반응, 계속해서, 메탄올 암모늄을 이용한 화합물 5로부터의, 톨루오일기의 탈보호에 의해서, 화합물 4로부터 단일산물로서 수율 61%로 얻어졌다.
7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘의 리보뉴클레오사이드(화합물 11)는, 200℃에서, 촉매량의 클로로아세트산을 이용하여, 테트라-O-아세틸-β-D-리보푸라노오즈와 4의 반응에 의해 합성되었다. 화합물 11은, 암모니아 포화 메탄올에 의한 탈보호 및 RP-HPLC에 의한 정제 후, 수율 29%로 얻어졌다.
NMR 및 고분해능 질량분석법에 의해서, 뉴클레오사이드 6 및 11의 구조를 확인했다(1. 「일반적인 방법 및 재료」의 항목에 있어서의 화합물 6 및 11의 NMR 스펙트럼). 화합물 6과 화합물 11의 방향족 프로톤 피크는, 동일한 화학시프트를 나타냈다. 또한, 화합물 6과 화합물 11의 HMBC 및 HSQC는, 당C1'과, 이미다조[4,5-b]피리딘 염기 부분의 N-3위치와의 사이에 N-글리코시드 결합이 형성되어 있는 것을 나타냈다. 또한, 본 발명자들은, 2D　NOESY 및 2D　HMBC 스펙트럼에 의해서, 화합물 6 및 11의 티에닐 부분은, 이미다조[4,5-b]피리딘환의 7위치에서 결합하고 있는 것을 확인했다. 화합물 6 및 11의 아노머(anomer) 구조는, 2D　NOESY 및 1D　NOE에 의해 β체인 것이 확인되었다. 1D　NOE 실험의 주요한 결과는, H1'프로톤의 조사는, 화합물 6 및 11에 있어서 각각, H4'시그널의 2% 및 3% 증강, 및, H2 시그널의 8% 및 9%증강을 준다는 것이다. 단계별(差次的-differential) NOE 실험에 있어서, H2 프로톤을 조사했을 경우, H1'시그널의 9% 및 10%증강, H2' 및 H3'시그널의 3~5%증강이 얻어졌다. 따라서, NOE 실험에 근거하여, 화합물 6 및 11의 아노머 구조는, β-구조로 정해졌다. 화합물 6은, 정법에 따라 아미다이트로 변환되고, 그리고, Tp(6)pT의 삼량체는, 일렉트로스프레이 이온화 질량분광계(ESI-MS)로 그 생성을 확인했다. 「피롤-2-카르보알데히드, 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드의 뉴클레오사이드 유도체, 및 6-아미노-9-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실) 퓨린5'-γ-아미드삼인산」에 있어서의 삼량체의 질량스펙트럼을 참조). 화합물 10 및 14의 뉴클레오사이드 5'-삼인산은, 효소반응의 기질로서, 정법(定法)(비특허문헌 43)으로 합성했다.
피롤-2-카르보알데히드(화합물 15) 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드(화합물 16)의 뉴클레오사이드 유도체의 합성은, 도 23에 기재된 반응에 의해서 달성되었다. 화합물 15 및 16의 데옥시뉴클레오사이드 유도체의 합성은, 보고되어 있다(비특허문헌 39 및 40). 화합물 15 및 16의 리보뉴클레오사이드는, 2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실클로라이드(비특허문헌 44)와 화합물 15 또는 16의 나트륨 염과의 반응, 계속해서, BBr3로의 처리에 의한 벤질기의 탈보호에 의해서 합성되었다. 이것에 의해, 2공정으로 각각 화합물 17(수율 15%) 및 화합물 18(수율 7%)의 리보뉴클레오사이드가 얻어졌다.
NMR(도 25에 있어서의 화합물 17 및 18의 NMR 스펙트럼을 참조) 및 고분해능 질량분석법에 의해서 화합물 17 및 18의 구조를 확인했다. 화합물 17 및 18의 HMBC 및 HSQC 스펙트럼은, C1'탄소에 있어서, 당과 피롤 염기 부분의 사이에 N-글리코시드 결합이 형성되어 있는 것을 나타냈다. 화합물 17 및 18의 아노머 구조는, NOE 실험(단계별 NOE 및 NOESY 스펙트럼)에 의해서 확인되었다.
단계별 NOESY 스펙트럼 실험의 주요한 결과는 이하와 같다. H1'프로톤의 조사는, H4'시그널의 3~4%증강을 부여했다. H2'(및/또는 H3') 프로톤이 조사된 경우는, H5 시그널의 9~10%증강이 얻어졌다. 화합물 17 및 18의 NOESY 스펙트럼은, H1'와 H4'의 사이, H1'와 CHO 프로톤의 사이, 및 H5와 H2'(및/또는 H3')의 사이에, 크로스 피크를 나타냈다. 따라서, 화합물 17 및 18의 아노머 구조는, NOE　NMR에 근거하여, β-구조가 정해졌다. 화합물 17 및 18의 리보뉴클레오사이드는, 정법(비특허문헌 45)에 의해서, 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산으로 변환되었다.
뉴클레오사이드 5'-삼인산은, 선행기술문헌(비특허문헌 43 및 45)에 개시된 방법에 따라서 합성했다. 5'-γ-아미드삼인산의 합성은, 정법(비특허문헌 43)을 변경하여 실시하였다. 화합물 9 및 21의 보호된 뉴클레오사이드를 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온에 의해, 아인산화했다. 보호된 뉴클레오사이드 아인산 유도체를, 피로인산염으로의 처리에 의해서, P2, P3-디옥소-P1-5'-뉴클레옥시딜시클로삼인산으로 변환시켰다. 요오드/물로 처리 후, 얻어진 5'-트리메타인산을 진한 암모니아수로 처리하여, 뉴클레오사이드　5'-γ-아미드삼인산을 부여했다.
5'-γ-아미드삼인산의 정제는, 음이온 교환 DEAE 세파덱스 컬럼크로마토그래피 및 RP-HPLC에 의해서 행해졌다. 데옥시아데노신　5'-γ-아미드삼인산의 DEAE 컬럼 용출패턴 및 일렉트로스프레이 이온화 질량스펙트럼은, (도 26 및 27)에 나타냈다.
5'-γ-아미드삼인산의 합성에 있어서, 데옥시아데노신의 5'-삼인산도 형성되고, 그리고, 분획의 흡광도의 계산값으로부터, 5'-γ-아미드삼인산과 5'-삼인산의 비율은, 4.8:1이었다. 화합물 22는, 데옥시아데노신의 5'-인산(dATP)과 비교하여 빠르게 용출되어, DEAE 컬럼 정제에 의해서 분리되었다. 5'-γ-아미드삼인산의 분자량을, ESI-MS 스펙트럼에 의해서 확인했다. 화합물 22와 dATP의 차이는, 1m/z였다. HPLC에 의한 최후정제 후, 뉴클레오사이드 5'-γ-아미드삼인산을 트리에틸암모늄염으로서 얻었다. 그리고 NMR 분석법(1H 및 31P　NMR)에 의해서 그 구조를 확인했다. 데옥시아데노신　5'-γ-아미드삼인산 및 화합물 6의 γ-인산시그널은, 화합물 6, 11, 17 및 18의 5'-인산의 그것과 비교하여, 저자장 시프트 했다(-0.50 및 -0.52p.p.m). 이 현상은, 구아노신의 5'-γ-아미드삼인산에서도 관찰되었다.
3. 합성의 구체적인 설명
(1) 2-아미노-3-니트로-4-(2-티에닐)피리딘(화합물 2)
DMF(50ml) 중의 2-아미노-3-니트로-4-클로로피리딘(화합물 1)(비특허문헌 41)(1.74g, 10mmol) 및 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)(350mg, 0.50mmol)의 용액에, 아르곤 분위기하에서 2-(트리부틸스태닐티오펜(3.82㎖, 12mmol)를 가했 다. 얻어진 혼합물을 100℃에서 4시간 교반했다. 혼합물을 물(250㎖)에 따르고, 그리고, 아세트산에틸(250㎖×3)로 추출했다. Na2SO4상에서 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류제거했다. 잔사를, 염화메틸렌:아세트산에틸(100:1에서 49:1)을 용출제로서 이용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 충전(charge)했다. 2.07g의 화합물 2(염화메틸렌:아세트산에틸=19:1상에서 Rf0.30)이 93%의 수율로 얻어졌다.
Figure 112008048856036-pct00036
(2) 2,3-디아미노-4-(2-티에닐)피리딘(화합물 3)
130㎖ 에탄올과 65㎖의 아세트산에틸 중의, 화합물 2(2.06g, 9.3mmol)와 466mg　팔라듐 탄소(10중량%)와의 혼합물에, 28㎖의 1M　붕화수소나트륨 수용액을 0℃에서 가했다. 얻어진 혼합물을 0℃에서 1시간 교반했다. 혼합물에 43㎖의 5% 염화암모늄 수용액을 가했다. 혼합물을, 셀라이트로 여과했다. 여과물에 500㎖의 물을 가했다. 에탄올 및 아세트산에틸을 증발시킨 후, 혼합물을 아세트산에틸로 추출했다(250㎖×3). Na2SO4상에서 건조시킨 후, 용매를 증류제거했다. 잔사를, 염화메틸렌:아세트산에틸(19:1에서 93:7)을 용출용매로 하여 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제했다. 1.46g의 화합물 3(염화메틸렌:아세트산에틸=9:1상에서 Rf0.24)가 82%의 수율로 얻어졌다.
Figure 112008048856036-pct00037
(3) 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 4)
화합물 3(956mg, 5.0mmol)의 포름산 용액(15㎖)을, 12시간, 환류했다. 반응 혼합물 중에, 빙냉욕(氷冷浴) 상에서, 24㎖의 28% NH4OH를 가했다. 얻어진 침전물을 여과하여, H2O 및 에틸에테르로 세정하고, 그리고 60℃에서 12시간 건조시켜 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(970mg, 96%)을 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00038
HRMS(FAB, 3-NBA 매트릭스)
C10H8N3S (M+1): 계산값 202.0439; 관측값 202.0444.
(4) 7-(2-티에닐)-3-[2-데옥시-3,5-디-O-(톨루오일)-β-D-리보푸라노실]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 5)
화합물 4(403mg, 2.0mmol)의 CH3CN 용액(32㎖)에, NaH(96mg, 2.4mmol, 광유 중 60%분산액)를 가했다. 얻어진 혼합물을 실온에서 1시간 교반했다. 혼합물에, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노실클로라이드(933mg, 2.4mmol)(비특허문헌 42)를 가했다. 실온하에서 2.5시간 교반한 후, 반응 혼합물을 아세트산에틸과 물에 의해서 분리했다. 유기층을 포화 식염수로 3회 세정하여, Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 감압하에서 증류제거했다. 실리카겔 컬럼크로마토그래피(CH2Cl2 중, 0.5%메탄올)에 의해서 산물을 정제하여, 화합물 5를 얻었다(714mg, 65%).
Figure 112008048856036-pct00039
(5) 7-(2-티에닐)-3-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 6)
1.33g(2.40mmol)의 화합물 5에, 0℃에서 암모니아 포화 메탄올(120㎖)을 가했다. 용액을 실온에서 2시간 교반했다. 반응 후, 용매를 증류제거하여, 잔사를, 염화메틸렌:에탄올(97:3에서 93:7)을 용출용매로 하여 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제했다. 717mg의 화합물 6이 94%의 수율로 얻어졌다.
Figure 112008048856036-pct00040
UV: λmax, 311nm;
ε=2.04×104 25mM 인산나트륨 완충액 pH 6.8 중
(6) 7-(2-티에닐)-3-[2-데옥시-5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 7)
화합물 6의 317mg(1.0mmol) 부분을, 건조 피리딘으로 3회 공비(共沸-azeotropy)시켰다. 이것에, 5.0㎖의 무수 피리딘을 가하고, 또한 디메톡시트리틸클로라이드(356mg, 1.1mmol)를 가했다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 물(50㎖)에 따르고, 염화메틸렌(50㎖×3)으로 추출했다. Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류제거했다. 잔사를, 염화메틸렌:아세트산에틸(9:1에서 13:7)을 용출용매로 하여 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제했다. 550mg의 화합물 7을 89%의 수율로 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00041
(7) 7-(2-티에닐)-3-[2-데옥시-5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트(화합물 8)
화합물 7(425mg, 0.69mmol)를, 무수 피리딘으로 3회, 이어서, 무수 아세토니트릴로 3회, 공비시켰다. 이를 무수 아세토니트릴(4.6㎖) 중에 용해하여, 262㎕(0.82mmol)의 2-시아노에틸테트라이소프로필포스포로디아미다이트, 및 0.45M　테트라졸의 아세토니트릴 용액(1.68㎖)을 가했다. 이 혼합물을 1시간 실온에서 교반했다. 혼합물에 90㎕의 무수 메탄올을 가한 후, 혼합물을 물(50㎖)에 따르고, 1% 트리에틸아민(v/v)을 포함하는 염화메틸렌(50㎖×3)으로 추출했다. Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류제거했다. 잔사를, 2% 트리에틸아민(v/v)을 포함하는, 헥산:아세트산에틸(4:1에서 3:2)을 용출용매로 하여 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제했다. 490mg의 화합물 8을 87%의 수율로 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00042
(8) 7-(2-티에닐)-3-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 9)
화합물 7(124mg, 0.20mmol)을 무수 피리딘으로 3회, 공비했다. 이를 무수 피 리딘(2.0㎖)에 용해하고, 38㎕(0.40mmol)의 무수 아세트산을 더 가했다. 얻어진 혼합물을, 실온에서 2일간 교반했다. 혼합물을 물(50㎖)에 따르고, 염화메틸렌(50㎖×3)으로 추출했다. Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류제거했다. 잔사를 20㎖의 무수 염화메틸렌에 용해하고, 이에 0℃에서 200㎕의 디클로로아세트산을 가했다. 혼합물을 2℃에서 15분간 교반한 후, 8㎖의 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따르고, 여기에 42㎖의 물을 가하여, 염화메틸렌(50㎖×3)으로 추출했다. Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류제거했다. 잔사를, 염화메틸렌:아세트산에틸(9:1에서 3:2)을 용출용매로 하여 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제했다. 65mg의 화합물 9를 88%의 수율로 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00043
(9) 7-(2-티에닐)-3-(β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 11)
화합물 4(80mg, 0.4mmol), 테트라-O-아세틸-β-D-리보푸라노오즈(130mg, 0.4mmol) 및 클로로아세트산(2mg)의 혼합액을 200℃에서 5분간 가열했다. 얻어진 암색의 시럽에 메탄올 암모니아(40㎖)를 가하여, 실온에서 18시간 처리했다. 용매를 감압하에서 증류제거하고, 잔사에 30% CH3CN 수용액을 더하고, 그리고, 산물을 역상 HPLC에 의해서 정제하여 화합물 11을 얻었다(39mg, 29%, 2공정).
Figure 112008048856036-pct00044
(10) 7-(2-티에닐)-3-[5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 12)
　화합물 11(99mg, 0.29mmol)을 무수 피리딘으로 3회, 공비하고, 그리고 피리딘(3.0㎖) 중에 용해했다. 이 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(106mg, 0.31mmol)를 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 교반했다. 반응 혼합물을 5% NaHCO3 수용액에 따르고, 그리고 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 3회 세정하여, Na2SO4로 건조시키고, 그리고 용매를 감압하에서 증류제거했다. 산물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(1% 메탄올-CH2Cl2)로 정제하여, 화합물 12를 얻었다(131mg, 71%).
Figure 112008048856036-pct00045
(11) 7-(2-티에닐)-3-(2,3-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 13)
화합물 12(120mg, 0.19mmol)를 무수 피리딘으로 3회, 공비했다. 이를 무수 피리딘(1.9㎖)에 용해하고, 72㎕(0.76mmol)의 무수 아세트산을 더 가했다. 이 혼합물을, 실온에서 7시간 교반했다. 혼합물을 5% NaHCO3(50㎖) 및 아세트산에틸(50㎖)에 따랐다. 유기층을 포화 식염수로 1회 세정했다. Na2SO4로 유기층을 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류제거했다. 잔사를 톨루엔으로 2회 공비한 후, CH2Cl2(19㎖)에 용해하고, 190㎕의 디클로로아세트산을 0℃에서 가했다. 이 반응 혼합물을 0℃ 에서 15분간 교반했다. 혼합물을 5% NaHCO3에 따르고, CH2Cl2로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 1회 세정하고, 그리고, Na2SO4로 유기층을 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류제거했다. 산물을, 2% 메탄올-염화메틸렌 용액을 용매로 하여 플래시 실리카겔 크로마토그래피로 정제했다. 77mg의 화합물 13을 93%의 수율로 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00046
(12) 1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드(화합물 17)
피롤-2-카르보알데히드(330mg, 3.5mmol)의 CH3CN 용액(18㎖)에, NaH(60% 유분산액, 152mg, 3.8mmol)를 가하여, 실온에서 45분간 교반했다. 이어서, 이에 2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실클로라이드(3.1mmol)(비특허문헌 44)의 CH3CN 용 액(18㎖)을 가했다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 교반했다. 산물을 아세트산에틸 및 물로 분리하고, 그리고, 유기층을 포화 식염수로 3회 세정하여, Na2SO4로 건조시킨 후, 감압하에서 용매를 증류제거했다. 잔사를, 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중의 20% 아세트산에틸에 의해서 용출)로 정제하여, 조(粗)1-(2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실)피롤-2-카르복시알데히드(506mg)를 얻었다. 조1-(2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실)피롤-2-카르복시알데히드(506mg, 1.0mmol)를 톨루엔으로 공비한 후, 잔사에 CH2Cl2(17㎖)를 가했다. 이 용액에, -78℃에서 BBr3(1M 용액, 3.0㎖)를 가하여, 2.5시간 교반하고, 이어서 50% 메탄올-CH2Cl2 용액(25㎖)을 가했다. 용액을-78℃에서 10분간 교반한 후, 28%의 NH4OH(0.5㎖)를 가했다. 이어서, 반응 혼합물을, 실온에 이를 때까지 교반했다. 산물을, CH2Cl2 및 H2O에 의해서 분리하고, 그리고 수층을 CH2Cl2로 3회 세정하여, 감압하에서 용매를 증류제거했다. 산물을 역상 C18　HPLC로 정제하여, 1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드를 얻었다(108mg, 15%, 2공정).
Figure 112008048856036-pct00047
(13) 4-프로피닐 1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드(화합물 18)
4-프로피닐-1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드(화합물 18)는, 화합물 17의 합성방법과 같이, 4-프로피닐-2-피롤카르보알데히드(화합물 16)(비특허문헌 40)(266mg, 2.0mmol)로부터 합성되었다. RP-HPLC로 정제하여, 화합물 18이 얻어졌다(39mg, 7%, 2공정).
Figure 112008048856036-pct00048
(14) 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘의 뉴클레오사이드 5'-삼인산의 합성
보호된 뉴클레오사이드(0.1mmol, 화합물 9 또는 13)을 피리딘으로 공비하여 건조시켰다. 잔사를 피리딘(100㎕)-디옥산(300㎕) 혼합용매 중에서 용해했다. 여기에, 1M　2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온-디옥산용액(110㎕, 0.11mmol)을 가했다. 10분 후, 0.5M　비스(트리부틸암모늄)피로인산-트리부틸아민(10㎕):DMF(300㎕, 0.15mmol) 혼합용액을 반응 혼합물에 빠르게 가했다. 이 혼합액을 실온에서 10분간 교반했다. 이어서, 여기에 1% 요오드-피리딘:물(98/2, v/v)(2.0㎖) 혼합용액을 가했다. 15분 후, 150㎕의 5% NaHSO3 수성 용액을 가하고, 이어서 5.0㎖의 물을 여기에 가했다. 용액을 실온에서 30분간 교반한 후, 20㎖의 진한 암모니아수를 더하고, 실온에서 2시간, 암모놀리시스(ammonolysis)를 실시했다. 용매를 감압하에서 증류제거하여, 산물을 DEAE 세파덱스(A-25) 컬럼크로마토그래피(50mM에서 1M　TEAB의 직선 구배에 따라 용출)에서 정제하고, 이어서 C18-HPLC 컬럼(0%에서 30%의 CH3CN-100mM　아세트산 트리에틸암모늄 용액의 직선 농도 구배에 따라 용출)으로 정제하여, 뉴클레오사이드 5'-삼인산을 얻었다.
7-(2-티에닐)-3-(2-데옥시-β-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘5'-삼인산(화합물 10)
Figure 112008048856036-pct00049
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00050
7-(2-티에닐)-3-(β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘5'-삼인산(화합물 14)
Figure 112008048856036-pct00051
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00052
(15) 아데닌 또는 7-(2-티에닐)-이미다조[4,5-b]피리딘(비특허문헌 43, 47, 48)의 뉴클레오사이드　5'-γ-아미드삼인산의 합성
보호된 뉴클레오사이드(0.1mmol, 화합물 21(비특허문헌 46) 또는 화합물 9)를 피리딘으로 공비하여 건조시켰다. 잔사를 피리딘(100㎕)-디옥산(300㎕) 혼합용액 중에 용해했다. 여기에 1M　2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온의 디옥산용액(110㎕, 0.11mmol)을 가했다. 10분 후, 0.5M　비스(트리부틸암모늄)피로인산(300㎕, 0.15mmol)-트리부틸아민(10㎕)의 DMF용액을, 반응 혼합물에 빠르게 가하고, 실온에서 10분간 교반했다. 이어서, 1% 요오드-피리딘/물(98/2, v/v) 혼합용액(2.0㎖)을 가했다. 15분 후, 150㎕의 5% NaHSO3 수성용액을 가했다. 용매를 감압하에서 증류제거한 후, 잔사에 20㎖의 28% 암모니아수를 가했다. 60℃에서 5시간(데옥시아데노신의 5'-γ-아미드삼인산의 경우), 또는 실온에서 2시간(화합물 6의 5'-γ-아미드삼인산의 경우), 암모놀리시스를 실시했다. 용매를 감압하에서 증류제거한 후, 산물을 DEAE 세파덱스(A-25) 컬럼크로마토그래피(50mM에서 1M　TEAB의 직선 농도 구배에 따라 용출)에서 정제하고, 이어서 C18-HPLC 컬럼(0%에서 30%의 CH3CN-100mM　아세트산트리에틸암모늄 용액의 직선 농도 구배에 따라 용출)으로 정제하여, 뉴클레오사이드　5'-γ-아미드삼인산을 얻었다.
6-아미노-9-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)퓨린5'-γ-아미드삼인산(화합물 22)
Figure 112008048856036-pct00053
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00054
7-(2-티에닐)-3-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘5'-γ-아미드삼인산(화합물 10의γ-아미드삼인산)
Figure 112008048856036-pct00055
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00056
(16) 피롤-2-카르보알데히드 및 4-프로피닐피롤-2-카르보알데히드(비특허문헌 45)의 뉴클레오사이드 5'-삼인산
1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드(0.1mmol)(화합물 17) 또는 4-프로피닐-1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드(0.1mmol)(화합물 18)와 프로톤 스펀지(33mg, 0.15mmol)를 포함하는 트리메틸인산용액(500㎕)에, 0℃에서 POCl3(12㎕, 0.13mmol)를 가하여, 0℃에서 2시간 교반했다. 반응 혼합물에 트리-n-부틸아민(120㎕, 0.5mmol)를 가하고, 이어서, 여기에, 0.5M　비스(트리부틸암모늄)피로인산(1.0㎖, 0.5mmol)의 DMF 용액을 가했다. 5분 후, 0.5M　탄산수소트리에틸암모늄 수용액(TEAB, 500㎕)을 가하여, 반응을 종료했다. 얻어진 조산물을, DEAE 세파덱스(A-25) 컬럼크로마토그래피(1.5cm×30cm, 50mM에서 1M　TEAB의 직선 구배 에 따라 용출)로 정제하고, 이어서 C18-HPLC 컬럼(Synchropak　RPP, Eichrom　Technologies, 0%에서 30%의 CH3CN-100mM　아세트산트리에틸암모늄 용액의 구배에 따라 용출)으로 정제했다.
1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(화합물 19)
Figure 112008048856036-pct00057
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00058
4-프로피닐-1-(β-D-리보푸라노실)피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(화합물 20)
Figure 112008048856036-pct00059
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00060
실시예 II 　화학합성-2
1.　7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(화합물 4)(Dv)의 뉴클레오사이드 유도체의 합성(도 33)
티아졸릴기의 도입의 반응(a)에 2-(트리부틸스태닐)티아졸을 이용한 이외에는, 도 22에 나타낸　7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘(실시예 I의 화합물 4)(Ds)의 뉴클레오사이드 유도체의 합성과 같이 실시하였다.
다만, 아미다이트 합성(g)에 있어서는, 실시예 I-3(7)의 7-(2-티에닐)-3-[2-데옥시-5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트(화합물 8)의 합성에서, 2-시아노에틸테트라이소프로필포스포로디아미다이트, 및 0.45M　테트라졸의 아세토니트릴 용액을 이용했지만, 본 실시예에서는, 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노클로로 포스포로아미다이트, 디이소프로필에틸아민, THF를 이용했다. 시약은 다르지만, 생성 하는 아미다이트는 같다.
2.　2-니트로피롤(화합물 1)(Pn)의 뉴클레오사이드 유도체의 합성(도 34)
(1) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(화합물 3)의 합성
2-니트로피롤(화합물 1)(비특허문헌 49)(224mg, 2.0mmol)를 아세토니트릴(20㎖)에 용해시키고, NaH(80mg, 60% 유분산액, 2.0mmol)를 가했다. 실온에서 30분간 교반한 후, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노실클로라이드(855mg, 2.2mmol)를 가하여 실온에서 2시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 물로 세정하고, 유기층을 물과 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하고, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 2를 722mg(78%) 얻었다. 화합물 2(722mg)에 메타놀릭암모니아(50㎖)를 가하여 톨루오일기의 탈보호를 실온에서 12시간 동안 실시하고, 실리카겔 컬럼으로 정제 후, 최종 정제를 HPLC로 실시하여 화합물 3을 291mg(82%) 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00061
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00062
(2) 1-[2-데옥시-5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-2-니트로피롤　2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트(화합물 5)의 합성
화합물 3(228mg, 1.0mmol)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(10㎖)을 가하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(373mg, 1.1mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5%　NaHCO3 수용액으로 세정하여, 유기층을 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하고, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 4를 493mg(93%) 얻었다.
화합물 4(265mg, 0.5mmol)를 피리딘으로 공비한 후, THF(2.5㎖)와 디이소프로필에틸아민(131㎕, 0.75mmol)를 가한 용액에, 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트(123㎕, 0.55mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액에 메탄올(50㎕)을 가하고 아세트산에틸:트리에틸아민(20:1, v/v)로 희석하고 5% NaHCO3 수용액을 가하여 세정했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하여, 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼으로 정제하여, 화합물 5를 315mg(86%) 얻었다.
(3) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤5'-삼인산(화합물 7)의 합성
화합물 4(159mg, 0.3mmol)를 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(3㎖)을 가하고, 무수 아세트산(57㎕, 0.6mmol)를 가하여 반응용액을 실온에서 12시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5% NaHCO3로 세정하고, 5% NaHCO3 수용액으로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여 톨루엔으로 공비한 후, 염화메틸렌 30㎖에 용해시켰다. 이 반응용액에 디클로로아세트산(300㎕)을 0℃에서 가하여 15분간, 0℃에서 교반했다. 5% NaHCO3 수용액을 반응용액에 가하고 세정하여, 유기층을 5%　NaHCO3로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 6을 73mg(91%) 얻었다.
화합물 6(41mg, 0.15mmol)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(150㎕)과 디옥산(450㎕)을 가한 후, 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온(180㎕, 1M　디옥산용액)을 가하여 10분간 실온에서 교반했다. 트리-n-부틸아민(150㎕)과 비스(트리부틸암모늄)피로인산(450㎕, 0.5M　DMF 용액)을 반응용액에 가하여 10분간 교반했다. 피리딘:H2O(98:2, v/v, 3.0ml) 중 1% 요오드를 가하여 15분간 교반 후, 5% NaHSO3 수용액(225㎕)을 가하여 반응용액을 농축했다. H2O(7.5㎖)를 가하여 실온에서 30분간 교반 후, 28% 암모니아수를 30㎖ 가하여 실온에서 2시간 교반했다. 반응용액을 농축, 동결건조한 후 DEAE　Sephadex　A-25로 정제(50mM부터 1.0M　TEAB 직선 구배)하고, HPLC로 최종 정제를 실시하여 목적으로 하는 화합물 7을 얻었다.
화합물 7:
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00063
3. 4-(티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(DDs) 및 4-(티에닐)-1H-피롤로[2,3- b]피리딘(DDv)의 뉴클레오사이드 유도체의 합성(도 35)
(1) 4-요오도-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(화합물 3)의 합성
1H-피롤로[2,3-b]피리딘(화합물 1)(5.3g, 45mmol)을 아세트산에틸(45㎖)에 용해하고, 아세트산에틸(30㎖)에 용해한 메타-클로로과벤조산(14g, 54mmol) 용액을 0℃에서 교반하면서 1시간에 걸쳐 적하하여 가했다. 적하후 실온에서 3시간 교반 한 후, 0℃에서 정치했다. 결정을 여과하고, 아세트산에틸로 세정한 후, 감압하에서 건조했다. 이를 물(30㎖)에 용해 후, 30% K2CO3를 pH10이 될 때까지 가하고, 실온에서 1시간, 0℃에서 1시간 정치한 후, 침전을 여과, 에테르로 세정하여 N-옥사이드를 3.5g(58%)얻었다. N-옥사이드(3.0g, 22mmol)를 DMF(16㎖)에 용해하여 50℃에서 가열했다. 메탄술포닐클로라이드(4.7㎖, 60mmol)의 DMF(6.4㎖) 용액을 70℃에서 적하하고, 이 반응용액을 75℃에서 2시간 교반했다. 반응용액을 얼음에 가한 후, 0℃에서 10N의 NaOH를 이용해 중화했다. 실온에서 1시간 교반하고, 생성한 침전을 여과하여 물로 세정한 후, 60℃에서 감압 건조하여 목적으로 하는 화합물 2를 2.7g(80%) 얻었다.
화합물 2(2.7g, 18mmol), NaI(13g, 88mmol)를 아세토니트릴(28㎖)에 용해하여, 실온에서 교반하면서 CH3COCl(3.5㎖, 50mmol)를 가했다. 반응용액을 85℃에서 12시간 가열했다. 반응용액을 실온으로 돌린 후, 10%　Na2CO3 수용액(28㎖)과 10%　NaHSO3 수용액(28㎖)을 순서대로 가하여 실온에서 15분간 교반했다. 아세트산에틸을 가하여 세정하고, 유기층을 포화 식염수로 더 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨 으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼으로 정제하고, 4-요오도-1-N-아세틸피롤로[2,3-b]피리딘(2.0g) 및 4-요오도-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(화합물 3)(2.3g)를 얻었다. 4-요오도-1-N-아세틸피롤로[2,3-b]피리딘(2.0g, 7.0mmol)은, 에탄올(70㎖)에 용해하고, 메탄올 중의 28% 나트륨메톡사이드(1.4㎖, 7.0mmol)를 가하여 1시간 가열환류했다. 반응용액을 농축 후, 아세트산에틸과 포화 암모늄클로라이드 수용액으로 분액하고, 유기층을 포화 암모늄클로라이드 수용액으로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 먼저 얻어진 화합물 3(2.3g)을 합쳐 에탄올로 재결정하여 화합물 3(4.0g, 92%)을 얻었다.
(2) 1-[2-데옥시-3,5-디-O-(톨루오일)-β-D-리보푸라노실]-4-요오도피롤로[2,3-b]피리딘(화합물 4)의 합성
화합물 3(950mg, 3.9mmol)의 아세토니트릴(39㎖) 용액에, NaH(156mg, 60% 유분산액, 3.9mmol)를 가했다. 실온에서 1시간 교반한 후, 2-데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-에리스로-펜토푸라노실클로라이드(1.8g, 1.2당량)를 가하여 실온에서 1.5시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 포화 암모늄클로라이드 수용액으로 세정하고, 유기층을 포화 암모늄클로라이드 수용액과 포화 식염수로 분액했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 4를 1.8 g(77%) 얻었다.
(3) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(2-티에닐)-피롤로[2,3-b]피리딘(화합물 7) 및 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(2-티아졸릴)-피롤로[2,3-b]피리딘(화합물 8)의 합성
화합물 4(715mg, 1.2mmol)와 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(42mg, 0.06mmol)의 DMF(12㎖) 용액에 2-(트리부틸스태닐)티오펜(60㎕, 1.8mmol)을 가하여 100℃에서 1시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 물로 분액하여, 유기층을 물, 이어서, 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하고, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 5를 586mg(88%) 얻었다.
화합물 5(580mg)에 암모니아 포화 메탄올(50㎖)을 가하여 톨루오일기의 탈보호를 실온 12시간에서 실시하고, 실리카겔 컬럼으로 정제 후, 최종 정제를 HPLC로 실시하여 화합물 7을 304mg(91%) 얻었다.
화합물 6 및 화합물 8의 합성은, 2-(트리부틸스태닐)티아졸을 이용한 이외에는 마찬가지로 실시하였다. 합성은, 화합물 4(600mg, 1.0mmol)로부터 합성하여, 화합물 6(449mg, 81%), 화합물 8(245mg, 97%)을 얻었다.
　
Figure 112008048856036-pct00064
(4) 1-[2-데옥시-5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-4-(2-티에닐)-피롤로[2,3-b]피리딘2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트(화합물 11) 및 1-[2-데옥시-5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-4-(2-티아졸릴)-피롤로[2,3-b]피리딘2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트(화합물 12)의 합성
화합물 7(300mg, 0.9mmol)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(9㎖)을 가하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(386mg, 1.1mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5%　NaHCO3 수용액으로 분액하고, 유기층을 포화 식 염수로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하고, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 9를 570mg(97%) 얻었다.
화합물 9(290mg, 0.47mmol)를 피리딘으로 공비한 후, THF(2.4㎖)와 디이소프로필에틸아민(123㎕, 0.7mmol)을 가한 용액에,
2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트(115㎕, 0.52mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액에 메탄올(50㎕)을 가하고 아세트산에틸:트리에틸아민(20:1, v/v)으로 희석하고 5% NaHCO3 수용액을 가하여 분액했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하여, 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 11을 345mg(90%) 얻었다.
마찬가지로 화합물 10 및 화합물 12의 합성은, 화합물 8(220mg, 0.7mmol)로부터 합성하여, 화합물 10(424mg, 99%), 화합물 12(227mg, 86%)를 얻었다.
(5) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(2-티에닐)-피롤로[2,3-b]피리딘5'-삼인산(화합물 15) 및 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(2-티아졸릴)-피롤로[2,3-b]피리딘5'-삼인산(화합물 16)의 합성
화합물 9(247mg, 0.4mmol)를 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(4㎖)을 가하고, 무수 아세트산(75㎕, 0.8mmol)를 가하여 반응용액을 실온에서 12시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5% NaHCO3 수용액으로 분액하고, 유기층을 5% NaHCO3 수용액으로 세정했다. 이 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여 톨루엔으로 공비한 후, 잔사를 염화메틸렌 40㎖에 용해시켰다. 이 반응용액에 디클로로아세트 산(400㎕)을 0℃에서 가하여 15분간, 0℃에서 교반했다. 5% NaHCO3 수용액을 반응용액에 가하고 분액하여, 유기층을 5% NaHCO3 수용액으로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 13을 125mg(87%) 얻었다.
화합물 13(36mg, 0.1mmol)를 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(100㎕)과 디옥산(300㎕)을 가한 후, 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스핀-4-온(110㎕, 1M　디옥산용액)을 가하여 10분간 실온에서 교반했다. 트리-n-부틸아민(100㎕)과 비스(트리부틸암모늄)피로인산(300㎕, 0.5M　DMF 용액)을 반응용액에 가하여 10분간 교반했다. 피리딘/H2O(98:2, v/v, 2.0ml) 중 1% 요오드를 가하여 15분간 교반 후, 5% NaHSO3 수용액(150㎕)을 가하여 반응용액을 농축했다. H2O(5㎖)를 가하여 실온에서 30분 교반 후, 28% 암모니아수를 20㎖ 가하여 실온에서 2시간 교반했다. 반응용액을 농축, 동결건조한 후 DEAE　Sephadex　A-25로 정제(50mM부터 1.0mM　TEAB　직선 구배)하고, HPLC로 최종 정제를 실시하여 목적으로 하는 화합물 15를 얻었다.
마찬가지로 화합물 14 및 화합물 16의 합성은, 화합물 10(210mg, 0.34mmol)로부터 합성하여, 화합물 14(108mg, 89%), 화합물 16(0.1mmol　합성 스케일)을 얻었다.
화합물 15:
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
C16H18O12N2P3S: 계산값, 554.98(M-H)-; 측정값, 554.73(M-H)-
화합물 16:
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00065
실시예 III 　생물학적 실험
1. 방법
본 실시예에서는, 별도로 특별히 명기하지 않는 한 이하의 방법을 사용했다.
KF　exo - 를 이용한 1뉴클레오타이드 삽입실험
1뉴클레오타이드 삽입실험을, 문헌에 따라 실시하였다(비특허문헌 30-32). 5'-말단을 6-카르복실플루오로세인으로 표지한 프라이머(20-mer)를 주형 DNA(35-mer)와, 20mM　MgCl2 , 2mM　DTT, 및 0.1mg/ml 우형 혈청알부민을 함유하는 100mM　Tris-HCl(pH7.5) 완충액 중에서, 95℃의 가온과 완만한 4℃로의 냉각에 의해 어닐 했다. 프라이머-주형 이본쇄 용액(10μM, 5㎕)을 엑소뉴클레아제 활성을 뺀 클레노우프레그먼트(KF　exo-, Amersham　USB)의 효소 용액(2㎕)과 혼합했다. 혼합물을 2분간 인큐베이트하고, 이어서, 각 dNTP 용액(3㎕)을 이 용액에 가하고, 37℃에서 반응을 개시했다. 사용한 효소의 양(5-50nM), 반응시간(1-35분), 및 dNTP의 구배 농도(0.3-1500μM)를 조절하고, 25% 이하의 생성물을 부여하는 조건으로 측정을 실 시했다. 반응을 10㎕의 정지용액(95% 포름아미드 및 20mM　EDTA)으로 정지하고, 그리고 혼합물을 즉시 75℃에서 3분간 가열했다. 희석산물을 GeneScan 소프트웨어(버전 3.0)을 장비한 자동 ABI377DNA 시퀀서로 분석했다(비특허문헌 32). 비속도(ｖ0)를 반응의 범위를 반응시간으로 나누어 계산하고, 그리고 사용한 여러가지 효소 농도에 대해서 효소 농도를 표준화했다(20nM). 동력학 변수(KM 및 Vmax)를[dNTP]에 대한 [dNTP]/v0의 하네스-울프 플롯으로부터 얻었다. 각 변수를, 3 내지 8의 데이터세트로부터 평균화했다.
KF 를 이용한 프라이머 신장 반응
5'-32P-표지 프라이머(23-mer) 및 주형 DNA(35-mer)의 이본쇄를, 14mM　MgCl2 및 0.2mM　DTT를 함유하는 20mM　Tris-HCl(pH7.5) 완충 중에서 어닐했다. 이본쇄 용액(400nM, 5㎕)을 빙상에서 5xdNTP 용액(2㎕)과 혼합하고, 이어서, 이것에, KF　exo-(1유닛) 또는 KF　exo＋(1유닛)(TAKARA)를 함유하는 효소 용액(3㎕)을 가하는 것으로 반응을 개시했다. 반응용액을 37℃에서 3 또는 5분간 인큐베이트하고, 그리고 89mM　Tris-붕산염, 2mM　EDTA, 10M　요소, 및 0.05% BPB를 포함하는 색소용액(10㎕)을 가하는 것으로써, 반응을 종결시켰다. 이 용액을 즉시 75℃ 에서 3분간 가열하고, 이어서 15% 폴리아크릴아미드-7M 요소겔로 전기영동했다. 겔 상의 산물을, 바이오 영상분석기(모델　BAS2500, Fuji)로 분석했다.
DNA 시퀀싱
디데옥시싸이클 시퀀싱 반응(20㎕)을, 1nmol　dPa'TP의 존재 또는 비존재하에서, 0.3pmol 주형 및 4pmol 프라이머 1 또는 프라이머 2를 함유하는 8㎕의 Ready Reaction　Mix(BigDye1.1, Applied　Biosystems)로, PTC-100　Program　Thermal　Controller(MJ　Reseach) 상에서 실시했다. 25사이클의 PCR(96℃, 10초;50℃, 5초;60℃, 4분)의 후에, 잔재하는 색소 터미네이터를 Centri-SeqTM 스핀 컬럼(Applied　Biosystems)으로 반응용액으로부터 제거한 후, 이 용액을 55℃에서 감압하에서 건조했다. 잔재물을 포름아미드 용액(4㎕)으로 재현탁하고, 그리고 6% 폴리아크릴아미드-6M 요소겔을 장착한 ABI　377　DNA 시퀀서로 해석했다. 서열 데이터를, Applied　Biosystems　PRISM 시퀀싱 해석 ｖ3.2소프트웨어로 해석했다.
PCR 증폭
PTC-100　Controller를 이용하여, 반응을, 10mM　KCl,　10mM　(NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1%　Triton　X-100, 0.3mM　각 dNTP(N=Pa, G, C, 및 T) 및 dNTPN(N=Ds 및 A), 1μM　각 프라이머 1 및 프라이머 2, 2.3nM　이본쇄 DNA 단편, 및 0.04유닛/㎕ Vent　DNA 폴리머라제(New　England　BioLabs)의 20mM　Tris-HCl 완충액(pH8.8)내에서 실시했다. PCR 사이클은, 94℃, 0.5분;45℃, 0.5분;65℃, 4분으로 실시하였다. 대조(컨트롤)의 PCR로는, 0.2mM 각 천연형 dNTP 및 0.01유닛/㎕의 Vent　DNA 폴리머라제를 사용하고, 그리고 신장 반응의 스텝을 72℃에서 1분간으로 실시하였다. PCR 산물을 4% 아가로스겔 상에서 에티듐브로마이드에 의해 염색하고, 염색된 밴드의 강도를 Molecular　Imager　FX　Pro　system 및 Quantity　One 소프트웨 어(Bio-Rad)를 사용하여 정량화했다. 시퀀싱 분석을 위해서, PCR 산물은, 미리, 겔전기영동(7% 폴리아크릴아미드-7M 요소겔) 또는 여과(Microcon　YM-30 및 Micropure-EZ)에 의해 정제되었다.
T7 전사
전사(20㎕)를, 24mM　MgCl2, 2mM　스퍼미딘, 5mM　DTT, 0.01%　Triton　X-100, 1-3mM 각 천연형 NTP, 0-3mM　Pa'TP, 0-3mM　DsTP, 10mM　GMP, 2μM　주형 DNA(17-mer 전사물의 합성을 위한 것) 또는 0.5μM　주형 DNA(tRNA 전사물 합성을 위한 것), 및 2.5유닛/㎕　T7　RNA 폴리머라제(TAKARA)를 함유하는 40mM　Tris-HCl 완충액(pH8.0) 중에서 실행했다. 전사 효율을 조사하기 위해서, 17-mer 전사물의 합성에서는, 2μCi[γ-32P]GTP(PerkinElmer, GMP 대신), tRNA 전사물의 합성에서는, [α-32P]GTP(Amersham)를 각각 가하여 전사를 실시했다. 37℃에서, 3시간(17-mer 합성의 경우) 또는 6시간(tRNA 합성의 경우) 인큐베이션 후에, 요소를 포함하는 색소용액을 가하여 반응을 정지했다. 이 용액을, 75℃에서 3분간 가열하고, 그리고 15 또는 20%(17-mer) 또는 10%(tRNA) 폴리아크릴아미드-7M 요소겔 전기영동에 의해, 산물을, 바이오 영상분석기로 분석했다. 전사 산물 중의 뉴클레오타이드의 조성해석시에는(비특허문헌 17, 33), 전사물을, 2μCi[α-32P]UTP 또는 [α-32P]ATP(Amersham)로 내부 표지했다. 전사 후, 산물을, 10㎕의 15mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.5) 중에서, 37℃에서 2시간, 0.75유닛의 RNase　T2에 의해 소화했다. 17-mer의 해석에서는, 0.05A260 유닛의 대장균 tRNA(Sigma)를 소화반응용액 중에 가하였다. 소화 산물을 2D-TLC(HPTLC 플레이트, 100x100mm, Merck)에 의해 해석했다. 1차원째의 전개 용매는, 이소부티르산-암모니아-물(66:1:33　v/v/v), 2차원째의 전개용매는, 이소프로필알코올-HCl-물(70:15:15　v/v/v 또는 Pa'전사물을 위한 75:15:10　v/v/v)을 각각 이용했다. TLC 플레이트 상의 표지 뉴클레오타이드의 스팟을 바이오 영상분석기에 의해 분석했다.
DNA2 -9의 PCR 증폭 산물의 디데옥시싸이클 시퀀싱
각각의 DNA의 PCR은, PTC-100컨트롤러를 이용하여, 10mM　KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2mM　MgSO4, 0.1%　Triton　X-100, 0.3mM의 각 dNTP(N=Pa, G, C 및 T) 및 dNTPN(N=Ds 및 A), 1μM의 각 프라이머 1 및 프라이머 2, 2.3M의 이본쇄 DNA 단편(DNA2-9), 및 0.04단위/㎕의 Vent　DNA 폴리머라제(New　England　BioLabs)를 포함하는, Tris-HCl 완충액(pH8.8) 중에서 실시했다. PCR의 사이클은, 94℃, 0.5분;45℃, 0.5분;65℃, 4분에 실시하였다. 시퀀싱을 위해서, PCR 산물을 겔전기영동(7% 폴리아크릴아미드-7M 요소겔) 또는 여과(Microcon　YM-30 및 Micropure-EZ)에 의해서 미리 정제했다. dPa'TP 존재하, 혹은, 비존재하에서 시퀀싱을 실시하여, 6% 폴리아크릴아미드-6M 요소겔을 장착한 ABI377DNA 시퀀서로, 서열을 결정했다.
DNA 단편 중의 비천연형 염기의 위치는, dPa'TP의 존재하 및 비존재하에서의 시퀀싱으로부터 얻어진 쌍방의 피크 패턴을 비교하는 것에 의해서 확인할 수 있다.
대장균 무세포 번역시스템에 있어서의 비천연형 안티코돈을 함유하는 tRNA 의 아미노아실화
tRNA 전사 산물의 아미노아실화는, 마이너체인지를 가한 제조업자의 프로토콜에 따른 신속 번역시스템(RTS-100, 로슈) 중에서 조사했다. [α-32P]로 분자내 표지된 tRNA 전사 산물(0.4μM)을, 30℃에서 30분간, 시스템(25㎕) 중에서 인큐베이트 했다. 아세트산나트륨(pH4.5)으로 포화시킨 페놀로, tRNA를 추출하고, 그리고, 0.2M　Tris-아세트산(pH4.75) 중, 4℃에서 10% 폴리아크릴아미드겔을 이용한 전기영동으로 분석했다(도 5d, 도 21).
2. Ds를 함유하는 DNA 단편의 시퀀싱
수식 Pa인 4-프로피닐피롤-2-카르발데히드(Pa')뉴클레오사이드의 삼인산 유도체(dPa'TP)(비특허문헌 34)를 가한 디데옥시뉴클레오타이드 쇄종결에 의한 시퀀싱법(비특허문헌 33)에 의해, DNA 단편 중의 Ds-Pa 염기쌍의 위치를 확인했다. KF　exo-에 의한 주형 중의 Ds에 대한 dPa'TP의 도입 효율(Vmax/KM=2.2×105)은, 주형 중의 Ds에 대한 dPaTP의 도입 효율(Vmax/KM=5.7×104)에 비해 3.9배 높아졌다(표 1 및 2). 따라서, Ds함유 쇄의 시퀀싱은, dPa'TP를 가하고, Taq　DNA 폴리머라제의 시퀀싱킷트인 BigDye1.1(applied　Biosystems)를 이용하여 행해졌다. 시퀀싱 및 그 후의 실험을 위해서, Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 이본쇄 DNA 단편(150-mer 및 174-mer, DNA1-14)은, 화학적으로 합성된 DNA 단편을 프라이머 신장 또는 연결하는 것에 의해 조제했다(도 6).
5'-CDsA/3'-GPaT를 함유하는 DNA1의 시퀀싱에서는, 0.05mM　dPa'TP를 가하는 것에 의해 주형 중의 Ds에 대해서 천연형 염기의 색소 터미네이터가 도입되지 않게 되므로, 주형 중의 Ds에 대응하는 부위만 A, G, C, T의 어떤 피크도 소실한다(도 3c). 즉, 이 시퀀싱으로 피크가 나타나지 않고 갭이 확인된 위치가 비천연형 염기의 위치를 나타내고 있다.
DNA1 이외의 비천연형 염기 주변이 다른 서열을 포함하는 DNA에서는, dPa'TP 존재하에서의 시퀀싱으로, 분명한 갭 패턴을 나타내지 않았던 것도 있었다(도 13-20). 그러나, dPa'TP 비존재하에서의 시퀀싱으로는, 주형 Ds의 위치 이후의 피크는 거의 소멸하므로(도 3g), dPa'TP 존재하 및 비존재하에서의 각각의 시퀀싱의 피크 패턴을 비교함으로써, DNA중의 비천연형 염기의 위치를 확인할 수 있었다(예를 들면, 도 3c 및 3g).
3. Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA 단편의 PCR 증폭
Ds-Pa 염기쌍을 함유하는 DNA1-14(도 6)(150-mer 또는 174-mer, 2.3nM)의 PCR 증폭을, 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는 호열성 DNA 폴리머라제(0.04유닛/㎕, VENT　DNA 폴리머라제, New　England　BioLabs) 및 dDsTPN, dPaTP, dATPN, dGTP, dCTP, 및 dTTP의 기질 혼합물(각 0.3mM)을 사용하여 실시했다. PCR 사이클은, 94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 및 65℃에서 4분 실시하였다.
본 발명자들은, 초기 DNA1의 증폭의 선택성 및 효율성을 시험했다(도 3a). 10사이클의 PCR의 후(도 3b), 산물을 dPa'TP 공존하, 혹은 비공존하에서의 시퀀싱 에 의해 해석했다(도 3d 및 3h). 게다가, 또한 10사이클의 PCR(전체로 10＋10사이클)을 10사이클 PCR 산물의 일부를 사용하여 실시하였다(도 3e 및 3i). 10사이클 및 10＋10사이클의 PCR 산물의 dPa'TP 존재하에서의 시퀀싱은, 초기의 DNA1의 시퀀싱과 유사한 피크 패턴을 부여하였다. dPa'TP 비공존하에서의 시퀀싱에 있어서(도 3g-3i), DNA1 중의 비천연형 염기의 위치에 계속되는 독과(read-through) 피크는, PCR 사이클수의 증가에 의해 약간 커졌다. 따라서, 독과 피크의 높이는, PCR 증폭에 의해 Ds-Pa 염기쌍으로부터 천연형 염기쌍으로의 변이율을 결정하기 위해서 사용할 수 있다. 변이율은, Ds-Pa 염기쌍 대신에 1-10%의 A-T를 함유하는 컨트롤 DNA 단편의 dPa'TP 비공존하에서의 시퀀싱에 의해 얻어진 독과 피크의 높이(도 8)와 PCR 산물의 독과 피크의 높이(도 3g-3i)를, 비교함으로써 결정되었다. 10사이클 및 10＋10사이클의 후의 DNA1 중의 Ds-Pa 염기쌍의 변이율은, 각각 ~1% 및 3-4%였다. 이 방법을 이용하여, A의 γ-아미드삼인산의 사용이, PCR에 있어서의 Ds-Pa 염기쌍의 선택성을 증가시키고 있는 것도 알았다. dATPN을 사용하지 않고, dDsTPN, dPaTP 및 천연형 dNTP를 사용한 DNA1의 PCR 증폭은, 변이율이 상승했다. 10 및 10＋10사이클의 후에, Ds-Pa 염기쌍의 변이율은, 각각 ~5% 및 ~10%였다(도 9). 또한, dDsTPN 및 dPaTP의 비존재하에서의 10사이클의 PCR에 있어서, DNA1 중의 Ds-Pa 염기쌍은, 완전히 A-T 염기쌍으로 치환되어 있었다(도 3f).
DNA1의 증폭 효율은, 겔 상의 PCR 산물을 색소로 염색하거나, 혹은, 각 표지 프라이머를 사용한 산물의 오토라디오그래프에 의해, 그들 밴드의 강도로부터 평가 했다. 그 결과(도 3b), DNA1은 10사이클의 PCR로 15배로 증폭되고, 천연형 DNA 단편(DNAcont1)은 10사이클의 PCR로 37배로 증폭되었다. 보다 정확한 효율은, 5'-또는 3'-32P 표지 프라이머를 사용하여 PCR 산물의 오토라디오그래프에 의해 얻어졌다(도 10). 식 Nf=N0(1＋Y)n을 이용하여 사이클마다의 신장 효율(Y)을 결정했다. 여기서, Nf는 산물의 최종 카피수이고, N0은 초기의 카피수이며, 그리고 n은 PCR 사이클의 수이다(비특허문헌 35). DNA1을 이용한 1에서 10사이클의 PCR의 효율(Y)은, 5'프라이머로부터의 신장에 대해서는 0.38이며, 3'프라이머로부터의 신장에 대해서는 0.29였다. 그리고 DNAcont1을 통상의 조건하에서 PCR 증폭했을 경우에는, Y값은 각각 0.43 및 0.35였다. 따라서, 비천연형 염기쌍 시스템에 있어서의 PCR의 사이클 마다의 효율은, 종래의 천연형 염기쌍 시스템에 있어서의 약 76-88%이다. 이상에서 얻어진 PCR 산물의 증폭 효율 및 DNA 시퀀싱으로부터 결정된 Ds-Pa 염기쌍의 변이율로부터, DNA1 중의 Ds-Pa 염기쌍의 PCR에 있어서의 충실도(DNA1이 2배로 증폭된 것)는, 99.8% 이상으로 계산된다. 그렇지만, 이 충실도는, PCR 증폭에 있어서의 Ds-Pa 염기쌍의 선택성보다 오히려, 화학적으로 합성된 초기의 DNA 단편의 순도에 의존하는 것을 알 수 있었다(도 11). 따라서, 비천연형 염기쌍 시스템의 선택성은 99.8%보다 상당히 높은 것으로 생각된다.
본 발명자들은, Ds-Pa 염기쌍 주변의 다른 서열을 포함하는 다른 DNA 단편(DNA2-14)의 증폭도 검토했다. 10사이클의 PCR의 후, 각 DNA 단편은 16에서 30배 로 증폭되고(도 12), 각 DNA의 Ds-Pa 염기쌍의 변이율은 1-3%였다(도 13-도 20). 예외는, 5'-X(A)n-3'서열을 함유하는 DNA10-14의 증폭이었다. 여기서 X=Ds 또는 Pa이며, 그리고 n=2이다. 이들 DNA 단편의 10사이클의 PCR의 후의 증폭 효율은 5배 미만이었다. 이 낮은 효율은, A의 γ-아미드삼인산 취입에 이어, Ds 또는 Pa의 기질을 연속하여 취입하는 경우에 일어난다. 따라서, 5'-DsAA-3' 및 5'PaAA-3'서열을 제외하고, 비천연형 염기를 함유하는 모든 서열은, DNA 증폭에 사용 가능하다.
4. Ds-Pa 염기쌍에 중개되는 T7 전사
Ds-Pa 및 Ds-Pa' 염기쌍은, T7RNA 폴리머라제에 의한 DsTP, PaTP 및 Pa'TP의 RNA로의 부위 특이적 도입을 상보적으로 중개했다. Ds, Pa 또는 Pa'를 함유하는 주형 DNA(35-mer)를 사용하여, 전사를 검토했다(도 4a 및 4b). 비천연형 염기의 리보뉴클레오사이드 삼인산을 가하여 3시간의 전사를 실시한 후, 32P로 표지된 전사물을 겔 상에서 분석했다(도 4c). 각 Pa, Pa' 및 Ds를 함유하는 전체 길이의 전사물(17-mer)의 수율은, 천연형 염기로 이루어지는 주형 DNA를 이용한 천연형 염기만의 전사물의 것(도 4c 레인 9)과 비교해서 28-91%였다(도 4c 레인 1, 2, 5, 및 7). 비천연형 염기를 포함하는 주형 DNA의 전사에 있어서, 비천연형 염기의 기질을 더하지 않았던 경우의 전사물의 수율은 유의하게 감소했다(도 4c 레인 3, 6 및 8).
T7 전사에 있어서 Ds-Pa 및 Ds-Pa' 염기쌍의 높은 선택성을, 내부 32P 표지 전사물의 뉴클레오타이드 조성을 해석(비특허문헌 17, 33)함으로써 확인했다(도 4d 및 4e, 및 표 3).
표 3.　T7 전사물의 뉴클레오타이드 조성 분석
[표 3a]
Figure 112008048856036-pct00066
[표 3b]
Figure 112008048856036-pct00067
a:　도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, A(엔트리 1-13 및 24-31) 또는 U(엔트리 14-23 및 32-39)의 5'말단측에 취입된 뉴클레오타이드의 조성물
b:　Np=Pap, Pa'p, 또는 Dsp
c:　수치는 이하의 식을 이용하여 결정했다.
[화학식 27]
(각 뉴클레오타이드의 방사활성)/[전체의 뉴클레오타이드(3'-일인산)의 전체 방사활성]×([α-32P]NTP의 5'근방의 뉴클레오타이드의 총수)
d:　각 뉴클레오타이드의 이론값을 괄호내에 기재함.
e:　표준편차는 둥근괄호내에 나타내고 있음.
f:　검출되지 않음.
내부 32P 표지된 전사물을 RNaseT2에 의해 소화하여, 생성된 표지 뉴클레오사이드 3'-일인산을 2D 박층크로마토그래피(2D-TLC)에 의해 분석했다. 비천연형 염기를 함유하는 주형을 사용하는 전사물에 있어서, Ds 및 Pa에 대응하는 각 스팟이 2D-TLC 상에 현상하고, 그리고 비천연형 염기의 형상과 유사한 천연형 기질이 잘못된 도입(예를 들면, PaTP에 대한 CTP 및 UTP, 및 DsTP에 대한 ATP 및 GTP)에 대응하는 스팟은 어떤 것도 관찰되지 않았다(도 4d, N=Ds 및 도 4e, N=Pa). 완전히 천연형 염기로 이루어지는 주형을 사용하는 전사물에 있어서, Pa 또는 Ds에 대응하는 스팟은 관찰되지 않았다(도 4d, N=A 및 G, 및 도 4e, N=T 및 C). 2D-TLC상의 각 뉴클레오타이드의 스팟의 정량값은, 산물 서열로부터 예측되는 이론값에 극히 근사하여(표 3, 엔트리 1-23), 그 결과로부터 전사에 있어서의 Ds-Pa 또는 Ds-Pa' 염기쌍의 선택성은 95% 이상으로 평가되었다.
본 발명자들은, 응용예로서, 비천연형 안티코돈인 CUPa', CPa'A, CUDs, 및 CDsA를 함유하는 tRNA 분자(85-mer)를 T7 전사에 의해 조제했다. 여기에서는, 대장 균 억제 tRNATyr의 서열을 채용했다.
PaTP 또는 Pa'TP의 17-mer 전사물로의 전사 효율은 비교적 낮았지만, Pa'를 함유하는 보다 긴 tRNA(85-mer)의 전사는 높은 효율을 나타내었고; 85-mer의 수율은, CUA 안티코돈을 가지는 tRNA 전사물의 것과 비교하여 88-93%였다(도 5a).뉴클레오타이드 조성 분석을 위해서, 전사물을[α-32P]ATP 또는[α-32P]UTP로 내부표지했다. 비천연형 뉴클레오타이드가 A의 5'말단측에 위치하고 있으므로, 각 비천연형 뉴클레오타이드의 3'-일인산은 [α-32P]ATP만으로 표지된다. 따라서, 전사물이[α-32P]ATP로 표지 되었을 경우에만, 비천연형 뉴클레오타이드에 대응하는 스팟이 2D-TLC에 의해 검출된다(도 5b 및 5c). 주형 중의 Ds에 대한 Pa', 및 주형 중의 Pa에 대한 Ds의 도입의 선택성은, 96% 이상이었다(표 3, 엔트리 24-39).
얻어진 tRNA 전사물을 사용하여, 본 발명자들은, 대장균 추출액 중에서의 아미노아실화를 검토했다(RTS　100　E.coli　HY　kit, Roche　Diagnostics). CPa'A 및 CDsA 안티코돈을 가지는 tRNA는, 전혀 아미노아실화 되지않고, 대장균 유래의 아미노아실 tRNA 합성효소의 인식을 배제하는 것을 알았다(도 5d 레인 7-10). 또한, CUPa' 및 CUDs 안티코돈을 가지는 tRNA는 아미노아실화 되었다(도 5d 레인 1-4). 이들 비천연형 안티코돈을 가지는 tRNA의 아미노아실화의 선택성은, 대장균 tRNATyr 및 그 티로실 tRNA 합성효소간의 인식의 선택성(비특허문헌 36, 37)과 잘 일치한다. 이상의 결과는, 비천연형 염기의 tRNA에의 부위 특이적 도입을 확인하는 것이기도 하다.
실시예 IV 　 바이오틴화된 PaTP 의 합성
바이오틴화된 PaTP(1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트: 화합물 28, Bio-PaTP)는, 도 36에 나타내는 스킴에 의해서 합성하였다.
(1) 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 24)의 합성(도 36의 스킴에 있어서의 반응(a)-(c)):
2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노오즈(1.0g, 2.3mmol) 및 CCl4(344㎕, 3.6mmol)를 포함하는 THF 용액(4.6㎖)에, 헥사메틸포스포로스트리아미드(562㎕, 3.0mmol)를 -78℃에서 가했다. 상기 용액을, -78℃에서 2시간, 그리고 실온에서 30분간, 교반했다(용액 A). CH3CN(25㎖) 중, 4-요오도-피롤-2-카르복시알데히드(화합물 23)(830mg, 3.7mmol)에, NaH(60% 오일디스퍼젼, 150mg, 3.7mmol)를 가했다. 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반했다. 이어서, THF중의 2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실클로라이드(용액 A)를 가했다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 교반했다. 생성물을 아세트산에틸 및 물로 분액했다. 유기층은 포화 NH4Cl로 3회 세정하여, Na2SO4로 건조시키고, 그리고 감압하에서 농축했다. 생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄 중 1% 메탄올로 용출)로 정제하고, 1-(2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실)-4-요오도피롤-2-카르발데히드를 얻었다.
1-(2,3,5-트리-O-벤질-D-리보푸라노실)-4-요오도피롤-2-카르발데히드의 디클 로로메탄(15㎖) 용액에, BBr3(1M　용액, 8.5㎖)를 -78℃에서 가했다. 반응 혼합물을 2시간 교반하고, 그리고 CH2Cl2 중의 50% 메탄올(30㎖)을 가했다. 해당 용액을 -78℃에서 10분간 교반한 후, 28%　NH4OH(4㎖)를 가하고, 그리고 반응 혼합물을 실온이 될 때까지 교반했다. 용액을 CH2Cl2 및 H2O에 가했다. 수층은 CH2Cl2로 3회, 분액 및 세정하고, 그리고 잔사를 감압하에서 농축했다. 생성물을 역상 C18　HPLC로 정제하여, 1-(β-D-리보푸라노실)-4-요오도피롤-2-카르발데히드(330mg)를 얻었다.
1-(β-D-리보푸라노실)-4-요오도피롤-2-카르발데히드(176mg, 0.5mmol, α아노머를 함유한다)를 피리딘 및 톨루엔으로 공비시켰다. 1-(β-D-리보푸라노실)-4-요오도피롤-2-카르발데히드(176mg), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(29mg, 0.025mmol), CuI(15mg, 0.08mmol), 및 트리에틸아민(105㎕, 0.75mmol)의 DMF(1.8㎖) 용액에, 3-(디클로로아세토아미도)-1-프로핀(0.75mmol)의 1M　DMF 용액(750㎕)을 가했다. 반응물을 실온에서 12시간 교반했다. 생성물을 EtOAc/H2O로 분액하고, 유기층을 Na2SO4로 건조시켜, 감압하에서 농축했다. 생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄 중 10% 메탄올), 및 RP-HPLC로 정제하여, 화합물 24를 β-이성체로서 얻었다(123mg, 26%, 3단계의 전체 수율). 화합물 24의 구조는, NMR(도 38) 및 고분해능 질량분석에 의해 확인했다. 화합물 24의 HMQC 스펙트럼(도 38e) 및 HMBC 스펙트럼(도 38f 및 도 38g)은, N-글리코시드 결합이, C1'탄소에 있어서 당 및 피롤 염기 부위의 사이에 형성된 것을 나타냈다. 또한, 화합물 24의 NOESY 스펙트럼(도 38d)의 크로스 피크는, 화합물 18(도 25j)의 그것과 유사하고, 그리고 H1' 및 H4'프로톤의 사이의 크로스 피크를 나타냈기 때문에, 화합물 24의 방향족의 입체 배치는 β로 동정되었다.
화합물 24:
Figure 112008048856036-pct00068
(2) 1-(2,3-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-[(3-디클로로아세토아미도)-1-프로피닐]피롤-2-카르발데히드(화합물 26)의 합성(도 36의 스킴에 있어서의 반응(d)-(e)).
화합물 24(118mg, 0.3mmol)를 피리딘으로 3회 공비했다. 피리딘(3.0㎖) 중의 잔사에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(113mg, 0.33mmol)를 가했다. 혼합물을 실 온에서 1시간 교반하고, 그리고 EtOAc 및 5% NaHCO3에 가했다. 유기층을 포화 NaCl로 세정하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 그리고 감압하에서 농축했다. 생성물을 실리카겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중, 1% 메탄올)로 정제하여 197mg의 화합물 25를 수율 95%로 얻었다.
화합물 25(188mg, 0.27mmol)를 피리딘으로 3회 공비시켰다. 피리딘(2.7㎖) 중의 잔사에 무수 아세트산(103㎕, 1.1mmol)을 가했다. 혼합물을 실온에서 12시간 교반하고, 그리고 EtOAc 및 5% NaHCO3에 가했다. 유기층은 포화 NaCl로 세정하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 그리고 감압하에서 농축했다. 디클로로메탄(27㎖) 중의 잔사에 디클로로아세트산(270㎕)을 0℃에서 가했다. 혼합물을 0℃에서 15분간 교반하고, 5% 수성 탄산수소나트륨 수용액에 따르고, 디클로로메탄으로 추출했다. Na2SO4상에서 건조시킨 후, 용액을 감압하에서 농축했다. 생성물을 실리카겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중, 1% 메탄올)로 정제하고, 118mg의 화합물 26을 수율 92%로 얻었다.
화합물 25:
Figure 112008048856036-pct00069
화합물 26:
Figure 112008048856036-pct00070
(3) 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-바이오틴아미드-1-프로피닐)]피롤-2-카르발데히드5'-트리포스페이트(화합물 28)의 합성(도 36의 스킴에 있어서의 반응(f)-(g)).
보호된 뉴클레오사이드 26(47mg, 0.1mmol)을 피리딘에 용해하고, 감압하에서 농축했다. 잔사를 피리딘(100㎕) 및 디옥산(300㎕)에 용해했다. 디옥산 중의 2-클 로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온의 1M　용액(110㎕, 0.11mmol)를 가했다. 10분 후, 트리-n-부틸아민(100㎕) 및 DMF 중 0.5M　비스(트리부틸암모늄)피로포스페이트(300㎕, 0.15mmol)를 반응 혼합물에 재빠르게 가했다. 혼합물을 실온에서 10분간 교반했다. 이어서, 피리딘/물(98/2, v/v) 중의 1% 요오드용액(2.0㎖)을 가했다. 15분 후, NaHSO3의 5% 수성용액(150㎕)을 가했다. 휘발성의 성분을 증발농축으로 제거하고, 그리고 이어서 물(5.0㎖)을 잔사에 가했다. 혼합물을 실온에서 30분간 교반하고, 그리고 이어서, 진한 암모니아(20㎖)로 실온에서, 12시간 처리했다. 용액을 감압하에서 농축하고, 그리고 생성물을 DEAE　Sephadex(A-25) 컬럼크로마토그래피(50mM에서 1M　TEAB의 리니어 그래디언트(gradient)에서 용출했다)에서 정제하고, 그리고 이어서, C18-HPLC(100mM　아세트산 트리에틸암모늄 중 0%에서 30% CH3CN의 그래디언트에 의해 용출했다)에 의해 정제하고, 뉴클레오사이드5'-트리포스페이트 27을 얻었다.
동결건조 후, 0.1M　NaHCO3-Na2CO3 완충액(5㎖, pH8.6) 중의 화합물 27을, 바이오틴-N-히드록시숙신이미드(900㎕, DMF 용액 중 0.14 M)와 실온에서 3시간 반응시켰다. 혼합물을 28%　NH4OH(2㎖)에서 1시간 처리했다. 생성물을 DEAE　Sephadex(A-25) 컬럼크로마토그래피(50mM에서 1M　TEAB에의 리니어 그래디언트에 의해 용출했다), 및 이어서 C18-HPLC(100mM　아세트산트리에틸암모늄 중, 0%에서 30% CH3CN의 그래디언트에 의해 용출했다)에 의해 정제하고, 뉴클레오사이드5'-트리 포스페이트 28을, 화합물 26으로부터 14%의 수율로 얻었다. 화합물 28의 구조는, 1H　NMR(도 43a 및 b), 31P　NMR(도 43c), 및 질량분석(도 42)에 의해 확인했다. 화합물 28의 바이오틴 부분의 프로톤 시그널은, 이전에 합성한 바이오틴화 yTP의 그것과 동일하고, D2O 중의 31P　NMR 스펙트럼은, 뉴클레오타이드 5'-트리포스페이트에 대응하는 전형적인 인의 시그널을 나타냈다.
화합물 27:
일렉트로스프레이 이온화-질량분석법(ESI-MS)
C13H19O14N2P3:　계산값, 519.00(M-H)-;　실측값, 518.98(M-H)-.
화합물 28:
Figure 112008048856036-pct00071
일렉트로스프레이 이온화-질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00072
UV-가시광 스펙트럼(10mM　인산나트륨 완충액 중, pH7.0),
λmax=258nm(ε=1.1×104), 308nm(ε=9.5×103).
실시예 V　 Ds - Pa 인공 염기쌍을 개재한 T7 전사에 의한 RNA 의 부위 특이적 바이오틴화
전사 및 PCR 증폭의 쌍방에 있어서의 Ds-Pa인공 염기쌍의 선택성 및 가능성에 대하여 보다 상세하게 시험하기 위해서, 152-mer　RNA 분자의 부위 특이적 바이오틴화를 실시했다.
RNA 의 부위 특이적 바이오틴화(152- mer )
전사(20㎕)는, 3μCi[γ-32P]GTP, 2mM　각 천연형 NTP, 0~4mM　Bio-PaTP(바이오틴화된 Pa의 기질: 실시예 IV에 기재한 바와 같이 화학합성한 것), 및 30nM　주형(DNA6 및 DNAcont2(도 6참조), 각각에 대하여, 라이게이션에 의해 얻어진 주형 및 PCR 증폭한 주형을 이용했다)를 이용하여, 6시간 37℃에서 실시하였다.
라이게이션에 의해 얻어진 DNAcont5 및 DNAcont6(도 6참조)를 이용한 대조 반응에 있어서는, 전사는, 2mM　Bio-UTP(바이오틴-16-우리딘-5'-트리포스페이트, 로슈·아프라이드·사이언스)의 존재하 또는 비존재하에서, 2mM　ATP, GTP 및 CTP만 가지고 실시하였다. 생성물을, 7~10% 폴리아크릴아미드-7M　요소겔 상에서 분석 및 정제했다.
바이오틴화 RNA 전사물은, 스트렙트아비딘을 이용한 겔시프트 엣세이에 의해서 검출했다. 2pmol의 32P-표지한 전사물 및 100pmol의 스트렙트아비딘(Promega)의 혼합물(10㎕)을, 50mM　NaCl 및 10mM　EDTA를 포함하는 10mM　Tris-HCl 완충액(pH7.6) 중에서, 20℃에서 1시간 인큐베이트 했다. 바이오틴화 RNA-스트렙트아비딘 복합체를, 7% 폴리아크릴아미드-7M　요소겔 상의 전기영동에 의해 분석했다. Bio-Pa 도입 위치를 결정하기 위해서, 각 RNA(152-mer)를, 송아지장유래 알칼리포스파타아제(Takara)로 5'-말단을 탈인산화한 후, [γ-32P]ATP(퍼킨·엘머)로 표지했다. 표지된 RNA를, RNase　T1으로, 4.7M 요소, 0.7mM　EDTA, 및 0.17mg/ml　대장균 tRNA를 포함하는 13.3mM　구연산나트륨 완충액(pH5.0) 중, 55℃에서 12분간, 및, 알칼리에서, 0.6mM　EDTA를 포함하는 32mM 탄산나트륨 완충액(pH9.1) 중, 90℃에서 15분간, 부분 소화했다. 알칼리 소화한 RNA 용액(9㎕)을, 150mM　NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH7.6)(11㎕)과 혼합하고, 그리고 혼합물(10㎕)을 스트렙트아비딘 자기 비즈(0.4mg)(New　England　BioLabs)와 함께 5분간, 실온에서 인큐베이트 하고, 바이오틴화된 RNA를 포착했다. 상청의 일부(5㎕)를, 다른 소화한 시료와 함께 10% 폴리아크릴아미드-7M　요소겔 상에서 분석했다.
결과
바이오틴이 연결된 Pa(Bio-Pa)는, 라이게이션에 의해 얻어진 주형 및 PCR 증폭한 주형을 이용하여, Ds-Pa 염기쌍을 개입시킨 T7 전사에 의해서 RNA에 도입되었 다. RNA 분자(152-mer)로의 Bio-Pa의 도입을 분석하기 위해서, DNA6 및 DNAcont2 주형(도 6참조)을 이용하여, 천연형 기질 NTP(2mM) 및 Bio-PaTP(2 또는 4mM) 존재하에서 T7 전사를 실시했다. Ds-Pa 염기쌍에 따른 전사 효율은, 천연형 염기만을 포함하는 DNA 단편인 DNAcont2를 이용했을 경우(도 44c, 레인 3, 7 및 11)와 비교하여, 47~85%였다(도 44c, 레인 2, 6 및 10). 라이게이션에 의해 얻어진 DNA6 주형 및 PCR 증폭한 DNA6 주형을 이용한 전사에서는, Bio-PaTP의 비존재하에 있어서, 완전한 길이 산물의 양이 유의하게 저하했다(도 44c, 레인 1, 5 및 9). 이들의 결과는, DNA6를 PCR 증폭했을 때에, Ds-Pa 염기쌍의 천연형 염기쌍에서의 치환이 거의 일어나지 않았던 것을 나타낸다.
RNA로의 Bio-Pa 도입 선택성을, 스트렙트아비딘을 사용하여, 바이오틴화 전사물의 겔시프트 엣세이에 따라 평가했다. 스트렙트아비딘과 바이오틴과의 결합은 매우 강하고, 특이적인 것이기 때문에 겔시프트한 전사물의 비율은, 전사에 의한 바이오틴 도입율(즉, 바이오틴화 전사물의 수율)과 거의 같다고 생각된다. 천연형의 기질과 등량인 2mM　Bio-PaTP, 및 라이게이션에 의해 얻어진 DNA6 주형을 이용한 전사에 있어서, 90%의 전사물이 바이오틴화되고(도 44d, 레인 2), 그리고 Bio-PaTP 농도를 증가시키면(4mM) 도입율이 96%로 향상했다(도 44d, 레인 4). 천연형 염기에 대한 Bio-PaTP가 잘못 도입된 것에 대해서는, 2 또는 4mM　Bio-PaTP의 존재하에서 DNAcont2를 주형으로서 이용한 전사 실험으로 평가한 바, 바이오틴화 전사물의 수율은 각각 9 및 16%였다(도 44d, 레인 6 및 7). 이들 잘못된 도입은, 152-mer 전사물의 하나의 염기의 위치 당 겨우 0.06%(전체로 9%), 및 0.12%(전체로 16%)로 개산되었다. PCR 증폭(20사이클)된 주형을 이용한 전사에 있어서, Bio-Pa의 도입율은, 3-4% 정도 감소했다(도 44d, 레인 9 및 11). 이 값은, 서열해석(도 3i)에 의해서 추측한 Ds-Pa 염기쌍 부위의 변이율(3-4%)과 일치했다. 흥미로운 것으로, 천연형 염기에 대한 Bio-Pa가 잘못 도입된 것은, 천연형 및 인공 염기의 기질의 존재하에서 PCR 증폭(20사이클)된 DNAcont2 주형을 이용한 전사에 있어서, 증가하지 않았다(도 44d, 레인 13 및 14). 따라서, 천연형 염기에 대한 Ds 및 Pa의 잘못된 도입은, PCR 증폭사이에서 매우 낮다고 생각되었다.
또한, Ds-Pa 염기쌍의 T7 전사에 있어서의 선택성과, 천연형의 A-T(U) 염기쌍의 선택성을 비교했다. 주형쇄 중의 염기 G, C 및 T에 대한 Bio-UTP의 잘못된 도입을 평가하기 위해서, 주형쇄의 코드 영역에, A를 1개만 포함하는 대조 DNA(DNAcont5) 및 A를 포함하지 않는 대조 DNA(DNAcont6)를 합성했다(도 6참조). DNAcont5 및 DNAcont6를 주형으로 이용하는 전사에서는, 0 또는 2mM　Bio-UTP 및 다른 천연형 기질(2mM　ATP, GTP 및 CTP)을 이용하는 이외는, Ds-Pa 염기쌍의 계와 같은 조건으로 실시하였다. DNAcont5의 전사에 있어서는, A에 대한 Bio-U의 도입에 의해, 전사물은 완전히 바이오틴화 되었다(도 44d, 레인 16). 그렇지만, DNAcont6의 전사에 있어서, 주형쇄 중의 염기 G, C 및 T에 대한 Bio-U의 잘못된 도입에 의해서 21%의 전사물이 바이오틴화 되었다(도 44d, 레인 18). 따라서, 천연형 염기에 대해서 Bio-PaTP가 잘못 도입된 비율(9% 및 16%, 각각 도 44d, 레인 6 및 7)은, 천연형 염기에 대하여 바이오틴을 연결한 UTP(Bio-UTP)가 잘못 도입되는 비율(21%)보다 낮은 것으로 밝혀졌다. 이 Bio-U가 잘못 도입된 비율(21%)이, 천연형 기질에 대 해서 Bio-PaTP가 2mol 등량 존재하는 조건에 있어서조차도, Bio-Pa가 천연형 염기에 대해서 잘못 도입되는 비율(16%)보다도 높았던 것은 강조되어야 할 것이다. 따라서, Ds에 대한 Bio-Pa의 도입은 A에 대한 Bio-U의 도입보다 약간의 차이로 효율이 나쁘지만, T7 전사에 있어서, 주형쇄 중의 천연형 염기 부위에 대한 Bio-Pa의 잘못된 도입을 배제하는 선택성은, 주형쇄 중의 염기 G, T 및 C의 부위에 대한 Bio-U의 잘못된 도입을 배제하는 선택성보다도 높다.
전사물에 있어서의 Bio-Pa의 도입 부위를 결정하기 위해서, 바이오틴화 전사물의 서열을 해석했다. Bio-Pa가 주형 중의 Ds에 대해서 정확하게 전사물에 도입된 것이면, 전사물의 59위치는 바이오틴화되어 있다. 5'말단이 32P로 표지된 전사물을 알칼리 또는 RNase　T1으로 부분소화하고, 전기영동으로 그 산물을 해석했다. Bio-Pa를 포함하는 전사물의 서열 래더에 있어서, 59-mer보다 큰 단편에 대응하는 밴드가 시프트했다(도 44e, 레인 2 및 8). 또한, 알칼리 소화한 단편을 스트렙트아비딘으로 처리하여 바이오틴화 단편을 포착하고, 그 나머지를 전기영동 했을 경우, 59-mer보다 큰 단편은 거의 소실했다(도 44e, 레인 2 및 9). 이들 결과는, 전사물의 59위치에 있어서의 부위 특이적인 Bio-Pa의 도입을 나타내는 것이다. 또한, PCR 증폭(20사이클)된 주형을 이용한 전사물(도 44e, 레인 7-12)은, 라이게이션에 의해 얻어진 주형을 이용하여 얻어진 전사물(도 44e, 레인 1-6)과 같은 패턴을 생성했다.
따라서, 이 방법에 따른 RNA의 부위 특이적 바이오틴화는, RNA의 활성을 손 실하는 일 없이, RNA 분자를 고정하는데 유용하다. 바이오틴과 같은 큰 잔기로 수식된 인공 염기 Pa가 RNA에 효율좋게 도입되었으므로, 플루오로포어를 연결한 Pa 등, 일련의 기능성 4-수식 Pa 염기도 또한, RNA에 도입할 수 있다.
실시예VI 　2- 니트로피롤의 4위치 수식 뉴클레오사이드 유도체의 합성
2-니트로피롤의 4위치 수식 뉴클레오사이드 유도체는, 도 45에 나타내는 스킴에 의해 합성했다.
(1) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오도-2-니트로피롤(도 45의 화합물 1)의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(700mg, 3.1mmol)을 CH3CN(12㎖)에 용해하고, N-요오드숙신이미드(1.38g, 6.1mmol)를 가하여, 실온에서 12시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 물로 분액하고, 유기층을 물로 2회 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여 실리카겔 컬럼(CH2Cl2:MeOH=50:1, v/v) 및 HPLC(25%~40%　CH3CN, 10분, 40%~50%　CH3CN, 5분)으로 정제하여 화합물 1을 607mg(56%) 얻었다. 미반응 회수 원료 219mg(31%).
화합물 1
Figure 112008048856036-pct00073
(2) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤(화합물 2)의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오도-2-니트로피롤(화합물 1)(280mg, 0.79mmol), Pd(PPh3)2Cl2(56mg, 0.08mmol)를 DMF(7.9㎖)에 용해하고, 트리부틸(1-프로피닐)주석(481㎕, 1.6mmol)를 가했다. 반응용액을 100℃에서 1.5시간 가열하고, 용액을 농축 후 실리카겔 컬럼(CH2Cl2:MeOH, 50:1, v/v) 및 HPLC　(34%~35%　CH3CN, 13분)으로 정제하여 화합물 2를 125mg(60%) 얻었다.
화합물 2:
Figure 112008048856036-pct00074
(3) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(디클로로아세토아미도-1-프로피닐)-2-니트로피롤(화합물 3)의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오도-2-니트로피롤(화합물 1)(354mg, 1.0mmol), Pd(PPh3)4(58mg, 0.05mmol), CuI(30mg, 0.16mmol), 트리에틸아민(209㎕, 1.5mmol)을 DMF(3.5㎖)에 용해하고, N-(2-프로피닐)-디클로로아세토아미도의 1M　DMF 용액(1.5㎖, 1.5mmol)을 가하여 실온에서 12시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 물로 분액하고, 유기층을 물로 3회 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여, 실리카겔 컬럼(CH2Cl2:MeOH, 20:1, v/v) 및 HPLC(34%~35%　CH3CN, 12분 )로 정제하여 화합물 3을 317mg(81%) 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00075
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00076
(4) 1-[2-데옥시-5-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]-4-프로피닐 2-니트로피롤2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트(화합물 6)의 합성
화합물 2(200mg, 0.75mmol)를 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(7.5㎖)을 가하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(280mg, 0.83mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5%　NaHCO3로 분액하고, 유기층을 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여, 실리카겔 컬럼으로 정제(CH2Cl2:MeOH,　200:1, v/v)하여 화합물 4를 365mg(86%)얻었다. 화합물 4(190mg, 0.33mmol)를 피리딘으로 공비한 후, THF(1.7㎖)와 디이소프로필에틸아민(87㎕, 1.5당량)을 가한 용액에, 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노클로로포스포로아미다이트(82㎕, 0.37mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액에 메탄올(50㎕)을 가하여 아세트산에틸:트리에틸아민(20:1, v/v)로 희석하고 5%　NaHCO3를 가하여 분액했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼(CH2Cl2:헥산, 1:4, v/v,　2%　트리에틸아민)으로 정제하여 화합물 6을 223mg(87%) 얻었다.
화합물 4:
Figure 112008048856036-pct00077
화합물 6:
Figure 112008048856036-pct00078
(5) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐2-니트로피롤5'-삼인산(화합물 9)의 합성
화합물 4(160mg, 0.28mmol)를 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(2.8㎖)을 가하고 무수 아세트산(53㎕, 0.56mmol)을 가하여 반응용액을 실온에서 12시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5%　NaHCO3로 분액하고, 5%　NaHCO3로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여 톨루엔으로 공비한 후, 염화메틸렌 28㎖에 용해시켰다. 이 반응용액에 디클로로아세트산(280㎕)을 0℃에서 가하여 15분, 0℃에서 교반했다. 5%　NaHCO3를 반응용액에 가하여 분액하고, 유기층을 5%　NaHCO3로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 7을 78mg(90%, 2공정)얻었다. 화합물 7(31mg, 0.1mmol)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(100㎕)과 디옥산(300㎕)을 가한 후, 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온(110㎕, 디옥산의 1M　용액)을 가하여 10분간 실온에서 교반했다. 트리-n-부틸아민(100㎕)과 비스(트리부틸암모늄)피로인산(300㎕, DMF 중의 0.5M　용액)을 반응용액에 가하여 10분간 교반했다. 피리딘/물(98:2, v/v, 2.0ml) 중 1% 요오드를 가하여 15분간 교반 후, 5%　NaHSO3(150㎕)를 가하여 반응용액을 농축했다. H2O(5.0㎖)를 가하여 실온에서 30분간 교반 후, 28% 암모니아수를 20㎖ 가하여 실온에서 2시간 교반했다. 반응용액을 농축, 동결건조한 후, DEAE　Sephadex　A-25로 정제(50mM-1.0M　TEAB　직선 구배)하여, 목적으로 하는 화합물 9를 얻었다.
화합물 7:
Figure 112008048856036-pct00079
화합물 9:
일렉트로스프레이 이온화 질량분석법(ESI-MS)
Figure 112008048856036-pct00080
(6) 1-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-(디클로로아세토아미도 1-프로피닐)-2-니트로피롤(화합물 8)의 합성
화합물 3(305mg, 0.78mmol)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(7.8㎖)을 가하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(291mg, 0.86mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5%　NaHCO3로 분액하여, 유기층을 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하고, 실리카겔 컬럼(CH2Cl2:EtOAc, 9:1, v/v)으로 정제하여 화합물 5를 526mg(97%) 얻었다. 화합물 5(515mg, 0.74mmol)를 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(7.4㎖)을 가하고, 무수 아세트산(280㎕, 3.0mmol)을 가하여 반응용액을 실온에서 12시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸과 5%　NaHCO3로 분액하고, 5%　NaHCO3로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 농축하여 톨루엔으로 공비한 후, 염화메틸렌 74㎖에 용해 시켰다. 이 반응용액에 디클로로아세트산(740㎕)을 0℃에서 가하여 15분간, 0℃에서 교반했다. 5%　NaHCO3를 반응용액에 가하여 분액하고, 유기층을 5%　NaHCO3로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조, 농축 후, 실리카겔 컬럼(CH2Cl2:MeOH, 50:1, v/v)으로 정제하여 화합물 8을 289mg(90%, 2공정) 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00081
Figure 112008048856036-pct00082
실시예 VII 　 NH2 - hx - dPnTP , ROX - hx - dPnTP , FAM - hx - dPnTP 의 합성
본 실시예에서는, dPnTP에 관한 유도체로서, NH2-hx-dPnTP, ROX-hx-dPnTP, FAM-hx-dPnTP를, 도 46에 나타내는 합성스킴에 따라서 합성했다. 이들 유도체는, 예를 들면 복제(PCR이나 프라이머 신장)로 DNA중에 도입하는 것이 가능하다. 아미노기의 유도체는, 도입 후의 DNA의 수식에 이용할 수 있고, 그 이외의 형광기를 결합한 각 유도체는, DNA의 형광 표지, 및, FRET 등에 응용이 가능하다.
(1) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤　(도 46의 공정(a))
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오도-2-니트로피롤(354mg, 1mmol, α아노머를 함유)을 50㎖ 둥근바닥 플라스크 중에서, 무수아세토니트릴로 공비를 2회 실시하였다. 요오드화구리(31mg, 160μmol)), 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(0)(58mg, 50μmol)를 가하고, 이것들을 무수 DMF(5㎖)에 용해시켜, 실온에서 교반시키면서 트리에틸아민(210㎕, 1.5mmol)을 가하여, 차광하 실온에서 교반했다. 여기에 N-(2-프로피닐)-6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드(396mg, 1.5mmol)의 DMF(4㎖) 용액을 적하하고, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응용액을 감압하에서 농축하여, 얻어진 조생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(5~10%　CH3OH, CH2Cl2 중) 및 C18-HPLC(39~41%　CH3CN, H2O 중, 15분)로 정제하고, 목적물을 무정형(amorphous)상 물질(408mg, 수율 83%)로서 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00083
(2) 1-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-트리플루오로아세토아미드헥산아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(공정(b), (c))
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(394mg, 803μmol)을 50㎖ 둥근바닥 플라스크 중에서, 무수피리딘으로 공비를 3회 실시하였다. 이를 무수 피리딘(4㎖)에 용해시켜, 염화 디메톡시트리틸(286mg, 844μmol)을 가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸/물 중에 가하여, 수층을 제거했다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 증류제거했다. 얻어진 조생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(0-0.5%　CH3OH, CH2Cl2 중)에서 정제하고, 트리틸화체를 무정형상 물질(543mg)로서 얻었다. 1-(2-데옥시-5-O-디메톡시트리틸-β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-트리플루오로아세토아미드헥산아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(542mg, 684μmol)을 30㎖ 둥근바닥 플라스크 중에서, 무수피 리딘으로 공비를 3회 실시하였다. 이를 무수 피리딘(7㎖)에 용해시키고, 무수아세트산(169㎕, 1.79mmol)을 가하여, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸로 희석하고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 세정하여, 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후, 용매를 증류제거했다. 얻어진 조생성물을 무수 디클로로메탄(68㎖)에 용해시키고, 0℃에서 교반시키면서 디클로로아세트산(680㎕)을 가하여, 15분간 교반했다. 반응용액을 포화 탄산수소나트륨 수용액에 가하여, 수층을 디클로로메탄으로 추출하고, 합한 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후, 용매를 증류제거했다. 얻어진 유상물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(2%　CH3OH, CH2Cl2 중)로 정제하고, 목적물을 무정형상 물질(328mg, 77%, 2 단계 수율)로서 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00084
(3) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-아미노헥산아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤5'-삼인산(NH2-hx-dPnTP)(공정(d))
1-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-트리플루오로아세토아미드헥산아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(53mg, 100μmol)을 10㎖　둥근바닥 플라스크 중에서, 무수피리딘으로 공비를 3회 실시한 후, 반응 용기를 아르곤가스로 채웠다. 여기에 무수 피리딘(100㎕) 및 무수 디옥산(300㎕)을 가하여 용해시키고, 2-클로로-4H-1,2,3-디옥산포스포린-4-온의 1M　디옥산용액(110㎕, 110μmol)을 가하여 실온에서 10분간 교반한 후에, 트리-n-부틸아민(100㎕) 및 비스(트리 n-부틸암모늄)피로인산의 0.5M　DMF 용액(300㎕)을 가하여 10분간 교반했다. 1% 요오드/물/피리딘 용액(2㎖)을 가하여, 실온에서 15분간 교반하고, 5%　아황산 수소 나트륨 수용액(150㎕)을 가한 후에 반응용액을 감압 농축했다. 얻어진 유상물질에 물(5㎖)을 가하여, 실온에서 30분간 교반한 후에 진한 암모니아수(20㎖)를 가하여 8시간 교반했다. 이를 DEAE　Sephadex　A-25컬럼크로마토그래피(1.5x30cm, 농도직선구배;TEAB의 50mM-1M 용액) 및 C18-HPLC(아세토니트릴의 0.1M　아세트산 트리에틸암모늄 완충액, pH7.0)로 정제하여, 목적물을 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00085
(4) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[3-[6-(플루오레세인-5-카르복사미드)헥산아미드]-1-프로피닐]-2-니트로피롤5'-삼인산(FAM-hx-dPnTP)(공정(e))
NH2-hx-dPnTP(6μmol)를 0.1M　탄산수소나트륨 수용액(pH8.5, 0.72㎖)에 용해시키고, 5-카르복시플루오레세인N-히드록시숙신이미딜에스테르(FAM-SE)(3.7mg, 7.8μmol)의 DMF 용액(500㎕)을 가하고, 가끔 진탕시키면서 차광하 실온에서 8시간 반응시켰다. 여기에 진한 암모니아수(0.5㎖)를 가하여, 가끔 진탕시키면서 5분간 반응시켰다. 이를 동결건조시킨 후, DEAE　Sephadex　A-25컬럼크로마토그래피(1.5x30cm, 농도직선구배;TEAB의 50mM-1M　용액) 및 C18-HPLC(농도구배; 0%-50%아세토니트릴의 0.1M　아세트산트리에틸암모늄 완충액, pH7.0)로 정제하여, 목적물을 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00086
(5) 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[3-[6-(로다민-X-5-카르복사미드)헥산아미드]-1-프로피닐]-2-니트로피롤5'-삼인산(ROX-hx-dPnTP)(공정(e))
NH2-hx-dPnTP(6μmol)를 0.1M　탄산수소나트륨 수용액(pH8.5, 0.85㎖)에 용해시키고, 5-카르복시-X-로다민N-히드록시숙신이미딜에스테르(ROX-SE)(5mg, 7.92μmol)의 DMF 용액(1㎖)을 가하여, 가끔 진탕시키면서 차광하 실온에서 18시간 반응시켰다. 여기에 진한 암모니아수(0.5㎖)를 가하여, 가끔 진탕시키면서 5분간 반응시켰다. 이를 동결건조시킨 후, DEAE　Sephadex　A-25컬럼크로마토그래피(1.5x30cm, 농도직선구배;TEAB의 50mM-1M　용액) 및 C18-HPLC(농도구배;12.5%-50%　아세토니트릴의 0.1M　아세트산트리에틸암모늄 완충액, pH7.0)로 정제하여, 목적물을 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00087
실시예 VIII 　 NH2 - hx - PaTP , FAM - hx - PaTP , TAMRA - hx - PaTP 의 합성
본 실시예에서는, rPaTP에 관한 유도체로서, NH2-hx-PaTP, FAM-hx-PaTP, TAMRA-hx-PaTP를 도 47에 나타낸 합성스킴에 따라서 합성했다. 이들 유도체는, 예 를 들면 전사로 RNA 중에 도입하는 것이 가능하다. 아미노기의 유도체는, 도입 후의 RNA의 수식에 이용할 수 있고, 그 이외의 형광기를 결합한 각 유도체는, RNA의 형광 표지, 및 FRET 등에 응용이 가능하다.
(1) 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-(6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드)-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드　(도 47의 공정(a))
1-(β-D-리보푸라노실)-4-요오도피롤-2-카르보알데히드(177mg, 500μmol, α아노머를 포함한다)를 10㎖ 둥근바닥 플라스크 중에, 무수 아세토니트릴로 공비를 2회 실시하였다. 요오드화구리(15mg, 80μmol)), 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(0)(29mg, 25μmol)을 가하여, 이를 무수 DMF(2.5㎖)에 용해시키고, 실온에서 교반시키면서 트리에틸아민(105㎕, 750μmol)을 가하여, 차광하 실온에서 교반했다. 여기에 N-(2-프로피닐)-6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드(198mg, 750μmol)의 DMF(2㎖) 용액을 적하하여, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응용액을 감압하에서 농축하여, 얻어진 조생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10%　CH3OH, CH2Cl2 중) 및 C18-HPLC(22~24%　CH3CN, H2O 중, 15분)로 정제하고, 목적물을 무정형상 물질(126mg, 수율 51%)로서 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00088
(2) 1-(2,3-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-[(3-(6-트리플루오로아세토아미드헥산아미드)-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드(공정(b), (c))
1-(β-D-리보푸라노실)-4-[(3-(6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드)-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드(122mg, 250μmol)를 10㎖ 둥근바닥 플라스크 중에서, 무수피리딘으로 공비를 3회 실시하였다. 이를 무수 피리딘(4㎖)에 용해시키고, 염화 디메톡시트리틸(89mg, 263μmol)을 가하여, 실온에서 2시간반 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸/수중에 가하여, 수층을 제거했다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하여, 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 증류제거했다. 얻어진 조생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(0-0.5%　CH3OH, CH2Cl2 중)에서 정제하고, 트리틸화체를 무정형상 물질(150mg)로서 얻었다. 1-(5-O-디메톡시트리틸-β-D-리보푸라노실)-4-[(3-(6-트리플루오로아세토아미도헥산아미드)-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드(149mg, 188μmol)를 10㎖ 둥근바닥 플라스크 중에서, 무수피 리딘으로 공비를 3회 실시하였다. 이를 무수 피리딘(2㎖)에 용해시키고, 무수아세트산(53㎕, 565μmol)을 가하여, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응용액을 아세트산에틸로 희석하고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 세정하여, 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후, 용매를 증류제거했다. 얻어진 조생성물을 무수 디클로로메탄(19㎖)에 용해시키고, 0℃에서 교반시키면서 디클로로아세트산(280㎕)을 가하여, 15분간 교반했다. 반응용액을 포화 탄산수소나트륨 수용액에 가하여, 수층을 디클로로메탄으로 추출하고, 합한 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후, 용매를 증류제거했다. 얻어진 유상물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(1-2.5% CH3OH, CH2Cl2 중)에서 정제하고, 목적물을 무정형상 물질(90mg, 63%, 2 단계 수율)로서 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00089
(3) 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-아미노헥산아미드)-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(NH2-hx-PaTP)　(공정(d))
1-(2,3-디-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-[(3-(6-트리플루오로아세토아미도 헥산아미드)-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드(57mg, 100μmol)를 10㎖　둥근바닥 플라스크 중에서, 무수피리딘으로 공비를 3회 행한 후, 반응 용기를 아르곤가스로 채웠다. 여기에 무수 피리딘(100㎕) 및 무수 디옥산(300㎕)을 가하여 용해시키고, 2-클로로-4H-1,2,3-디옥산포스포린-4-온의 1M　디옥산용액(110㎕, 110μmol)을 가하여 실온에서 10분간 교반한 후에, 트리-n-부틸아민(100㎕) 및 비스(트리-n-부틸암모늄)피로인산의 0.5M　DMF 용액(300㎕)을 가하여 10분간 교반했다. 1% 요오드/물/피리딘 용액(2㎖)을 가하여, 실온에서 15분간 교반하고, 5%　아황산수소나트륨 수용액(150㎕)을 가한 후에 반응용액을 감압농축했다. 얻어진 유상물질에 물(5㎖)을 가하여, 실온에서 30분간 교반한 후에 진한 암모니아수(20㎖)를 가하여 8시간 교반했다. 이를 DEAE　Sephadex　A-25컬럼크로마토그래피(1.5x30cm, 농도직선구배;TEAB의 50mM-1M　용액) 및 C18-HPLC(농도구배;0%-50%　아세토니트릴의 0.1M　아세트산트리에틸암모늄 완충액,　pH7.0)로 정제하여, 목적물을 얻었다.
MS　(ESI)
Figure 112008048856036-pct00090
(4) 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-(플루오레세인-5-카르복사미드)헥산아미드]-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(FAM-hx-PaTP)(공정(e))
상기에서 합성한 NH2-hx-PaTP의 1/3량을 0.1M　탄산수소나트륨 수용액(pH8.5, 2.5㎖)에 용해시키고, 5-카르복시플루오레세인N-히드록시숙신이미딜에스 테르(9mg, 19μmol)의 DMF 용액(200㎕)을 가하고, 가끔 진탕시키면서 차광하 실온에서 9시간 반응시켰다. 여기에 진한 암모니아수(1㎖)를 가하여, 가끔 진탕시키면서 1시간 반응시켰다. 이를 동결건조시킨 후, DEAE　Sephadex　A-25컬럼크로마토그래피(1.5x30cm, 농도직선구배;TEAB의 50mM-1M　용액) 및 C18-HPLC(농도구배; 0%-50%　아세토니트릴의 0.1M　아세트산트리에틸암모늄 완충액, pH7.0)로 정제하여, 목적물을 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00091
(5) 1-(β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-(테트라메틸로다민-5-카르복사미드)헥산아미드]-1-프로피닐]피롤-2-카르보알데히드5'-삼인산(TAMRA-hx-PaTP)(공정(e))
상기에서 합성한 NH2-hx-PaTP의 1/3량을 0.1M　탄산수소나트륨 수용액(pH8.5, 2.5㎖)에 용해시키고, 5-카르복시테트라메틸로다민N-히드록시숙신이미딜에스테르(TAMRA-SE)(10mg, 19μmol)의 DMF 용액(1㎖)을 가하고, 가끔 진탕시키면서 차광하 실온에서 9시간 반응시켰다. 여기에 진한 암모니아수(1㎖)를 가하며, 가끔 진탕시키면서 8시간 반응시켰다. 이를 동결건조시킨 후, DEAE　Sephadex　A-25컬럼크로마토그래피(1.5x30cm, 농도직선구배;TEAB의 50mM-1M　용액) 및 C18-HPLC(농도구배;12.5%-50% 아세토니트릴의 0.1M　아세트산트리에틸암모늄 완충액, pH7.0)에서 정제하여, 목적물을 얻었다.
Figure 112008048856036-pct00092
실시예IX 　 클레노우프레그먼트를 이용한 복제에 의한, 아미노기나 형광색소를 결합한 기질 Pn 의 DNA (55- mer ) 중으로의 도입
본 실시예에서는, 링커를 개재시켜 아미노기나 형광색소(FAM)를 결합한 기질 Pn(NH2-hx-dPnTP, FAM-hx-dPnTP)(실시예 VII에서 작성)를 이용하여, 복제에 의한 이들 기질의 DNA 중으로의 취입을 조사했다.
구체적으로는, 이하와 같은 실험방법을 채용했다. 여러 가지의 위치에 Ds를 포함하는 주형쇄 DNA(Template, 55-mer;1Ds, 2Ds, 3Ds, 4Ds, 5Ds(서열 번호 33~37) 또는 대조(서열 번호 38))와 플루오레세인으로 형광표지된 프라이머(Primer, 20-mer)로 이루어지는 이본쇄를 포함하는 용액(10㎕)에, 멸균수로 희석된 데옥시뉴클레오사이드삼인산 용액(5㎕)과 3'-5'엑소뉴클레아제 활성을 결실한 클레노우프레그먼트(2U, 5㎕)를 혼합하여, 프라이머 신장 반응을 실시했다(20㎕ 스케일). 반응은, 50mM　Tris-HCl(pH7.5), 10mM　MgCl2, 1mM　DTT, 0.05mg/ml　BSA중에서, 200nM Template-Primer, 100μM 또는 200μM　dNTPs(N=A, G, C, T), 10μM　NH2-hx-dPnTP 혹은 FAM-hx-dPnTP, 0.1U/㎕ 클레노우프레그먼트(GE헬스케어)를 이용하여 실시했다. 37℃에서 5분간 반응을 실시한 후, 이 용액에 10M　요소(20㎕)를 가하여 반응을 정지시켰다. 그 용액을 75℃에서 3분간 가열한 후, 반응 산물을 10% 폴리아크릴아미드-7M　요소겔에 의한 전기영동으로 분석했다. 반응 산물의 밴드를 형광 이미지 분석기(Molecular　Imager, 바이오래드, FAM 검출 모드)에 의해 검출했다.
결과를 도 48 B 및 C에 나타낸다. Pn의 수식기질의 비존재하와 비교하여, NH2-hx-dPnTP(도 48 B 및 C) 또는 FAM-hx-dPnTP(도 48 C)의 존재하에서 전체 길이의 산물양이 증가한 것으로부터, 주형쇄 DNA 중의 Ds에 상보하여, DNA 중에 이들 수식 dPnTP가 도입되는 것을 알았다.
실시예 X　 T7 　 RNA 폴리머라제를 이용한 전사에 의한, 형광색소를 결합한 기질 Pa 의 RNA (17- mer ) 중으로의 도입
본 실시예에서는, 형광색소(FAM 혹은 TAMRA)를 링커를 개재하여 결합한 기질 Pa(FAM-hx-PaTP, TAMRA-hx-PaTP)(실시예 VIII에서 작성)를 이용하여, 전사에 의한 이들 기질의 RNA 중으로의 취입을 조사했다.
구체적으로는, 이하와 같은 실험방법을 채용했다. 10mM　NaCl을 포함하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH7.6) 중에서, 주형 DNA(35-mer, 10μM)와 그 프로모터 부분의 상보연쇄 DNA(21-mer, 10μM)의 어닐링을 실시했다. 전사 반응은, 40mM　Tris-HCl 완충액(pH8.0), 24mM　MgCl2, 2mM　스퍼미딘, 5mM　DTT, 0.01%　TritonX-100 중에서, 2μCi[γ-32P]GTP, 1mM　NTPs, 1mM　FAM-, 또는 TAMRA-hx-PaTP, 2μM　주형 DNA, 및 50단위　T7　RNA　폴리머라제(Takara)를 이용하여 실시했다. 37℃에서 3시간 반응을 실시한 후, 이 용액에 10M　요소(20㎕)를 가하여 반응을 정지시켰다. 그 용액을 75℃에서 3분간 가열한 후, 전사물을 20%　폴리아크릴아미드-7M　요소겔에 의한 전기영동으로 해석했다.
결과를 도 49에 나타낸다. Ds를 포함하는 주형 DNA를 이용했을 경우에만, 전기영동 상에서 전사물(17-mer)의 밴드의 이동도가 늦어지는 것으로부터, 주형 중의 Ds에 상보하여, RNA 중에 이들 수식 PaTP가 도입된 것을 알았다. 전사 효율은, 천연형만의 컨트롤 실험(도 49 중 우측의 None의 레인)과 비교하여, FAM-hx-PaTP는 14%, TAMRA-hx-PaTP는 10%였다.
본 발명자들은, 복제 및 전사로 실용 레벨의 높은 선택성을 가지는 비천연형 염기쌍 시스템을 개발하고, 이에 의해 유전 알파벳을 확장한 새로운 생명공학의 창출이 가능하게 된다. 소수성 Ds-Pa 염기쌍은, 이를 포함한 DNA 단편을 PCR 증폭 할 수 있다. 또한, Ds-Pa 염기쌍에 의해, 통상의 T7 전사로 Ds 및 Pa를 부위 특이적으로 RNA중에 도입할 수도 있다. 따라서, 상기 시스템은, 새로운 기능성의 인공 DNA 및 RNA를 작성하기 위한 신규 기술을 제공한다. 이에 더하여, 수식기질 및 소수성 염기쌍은, 복제 및 전사의 메커니즘의 새로운 해명에 있어서도 과학적으로 중요하다.
복제에 있어서, 본 발명자들은, Ds-Ds, 천연형-비천연형 염기쌍과 같은 바람직하지 않은 염기쌍합을 방지하기 위해서, 5'-γ-아미드삼인산 및 통상의 5'-삼인산을 조합시키는 것에 의해 비천연형 염기쌍합의 높은 선택성을 달성했다. 5'-γ-아미드삼인산은, 쌍합 염기간의 올바른 상보성을 인식하기 위한 DNA 폴리머라제 기질로서 유용하다. 최근, 다른 5'-γ-수식삼인산인, 5'-γ-P-아미노나프탈렌-5-술포네이트삼인산이, 역전사의 충실도를 개선하는 것으로 보고 되었다(비특허문헌 38). 이들의 발견은, DNA 폴리머라제의γ-수식삼인산의 인식은, 통상의 삼인산 기질의 기하학적 적합보다도 쌍합 염기 사이의 정확한 기하학적 적합을 필요로 하는 것을 시사한다. 5'-γ-아미드삼인산 및 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제의 조합은, 다른 비천연형 염기쌍에도 적용이 가능하다.
Ds-Pa 염기쌍은, 소수성 염기쌍이 전사에 있어서 기능하는 최초의 예를 제공하고, 이것은 이미 복제에서 나타낸 바와 같이, 소수성의 염기쌍이 전사에 있어서도 쌍합 염기간의 형태의 상보성이 중요하다는 것을 시사한다.
Ds-Pa 염기쌍 시스템은, 신규 기능성 RNA 분자를 만들어 내기 위해서 매우 유용하다. 4-프로피닐피롤-2-카르발데히드(Pa')도, 주형 중의 Ds에 대해서 상보적 으로 RNA에 부위 특이적으로 도입되므로, 4위치를 수식한 일련의 Pa 염기 유도체도 RNA 중으로 도입하는 것도 가능하다. 그 때에 주형 DNA는, Ds-Pa 염기쌍을 포함하는 DNA 단편의 PCR에 의해 증폭할 수 있다. 따라서, Ds-Pa 염기쌍 시스템은, 임의의 위치에 기능성인 인공 컴퍼넌트를 도입한 핵산을 작성하기 위한 강력한 도구가 된다.
<110> University of Tokyo <110> Riken <120> Method for replicating nucleic acids and novel unnatural base pairs <130> PC/R-6-10 <150> JP2005-356883 <151> 2005-12-09 <160> 41 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized primer for replication <400> 1 actcactata gggagcttct 20 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> n means any one of the followings: 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl, 2-formyl-4-(1-propynyl)-1H-pyrrol-1-yl, adenine, guanine, thymine cytosine <220> <223> Synthesized template strand for replication <400> 2 tcgaganaga agctccctat agtgagtcgt attat 35 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized primer for replication <400> 1 actcactata gggaggaaga 20 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> n means any one of the followings: 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl, adenine, guanine, thymine cytosine <220> <223> Synthesized template strand for replication <400> 4 agctctntct tcctccctat agtgagtcgt attat 35 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized primer for replication <400> 5 actataggga gcttct 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized primer for replication <400> 6 actataggga ggaaga 16 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized primer for replication <400> 7 ataatacgac tcactatagg gag 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized non-template strand for transcription <400> 8 ataatacgac tcactatagg g 21 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> n means any one of the followings: 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl, adenine, guanine <220> <223> Synthesized template strand for transcription <400> 9 cactnctcgg gattccctat agtgagtcgt attat 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> n means any one of the followings: 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl, 2-formyl-4-(1-propynyl)-1H-pyrrol-1-yl, thymine cytosine <220> <223> Synthesized template strand for transcription <400> 10 ctcanaggga agctccctat agtgagtcgt attat 35 <210> 11 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> n means any one of the followings: 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl, 2-formyl-4-(1-propynyl)-1H-pyrrol-1-yl, uracil cytosine <220> <223> RNA transcript <400> 11 gggaaucccg agnagug 17 <210> 12 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> n means any one of the followings: 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl, adenine, guanine <220> <223> RNA transcript <400> 12 gggagcuucc cunugag 17 <210> 13 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 79...83 <223> nnnnn means any one of the followings: cytosine- 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - adenine - guanine - thymine, cytosine - thymine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - guanine - thymine, cytosine - thymine - adenine - guanine - thymine, <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 13 gaaattaata cgactcacta tagggttaac tttaagaagg agatatacca tgggctccaa 60 gaagccggtc cccatcatnn nnngcaaccg c 91 <210> 14 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 68...72 <223> nnnnn means any one of the followings: adenine - cytosine - thymine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - guanine adenine - cytosine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - adenine - guanine adenine - cytosine - thymine - adenine - guanine <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 14 tttcacacag gaaacagcta tgacccgggt tattacatgc gctggcactt gcccgtacgg 60 cggttgcnnn nnatgatggg g 81 <210> 15 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 15 gaaattaata cgactcacta tagggttaac tttaagaagg agatatacca tgggctccaa 60 gaagcc 66 <210> 16 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 13...17 <223> nnnnn means any one of the followings: cytosine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - adenine - guanine - thymine, cytosine - thymine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - guanine - thymine, cytosine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - adenine - guanine - thymine, cytosine - thymine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - guanine - thymine, cytosine - adenine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - cytosine - thymine, cytosine - guanine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - thymine - thymine, cytosine - guanine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - thymine - cytosine, thymine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - adenine - guanine - thymine, cytosine - thymine - adenine - guanine - thymine, cytosine - thymine - adenine - cytosine - thymine <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 16 ggtccccatc atnnnnngca accgccgtac gggcaagacg cagcgcg 47 <210> 17 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 17 ggggttctca tcatcatcat catcattaat aacccgggtc atagctgttt cctgtgtgaa 60 a 61 <210> 18 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 18 tttcacacag gaaacagcta tgacccgggt tattaatgat gatgatgatg atgagaaccc 60 ccgcgctgcg t 71 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 21...25 <223> nnnnn means any one of the followings: adenine - cytosine - thymine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - guanine, adenine - cytosine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - adenine - guanine, adenine - cytosine - thymine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - guanine, adenine - cytosine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - adenine - guanine, adenine - guanine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - thymine - guanine, adenine - adenine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - cytosine - guanine, guanine - adenine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - cytosine - guanine, adenine - cytosine - thymine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - adenine, adenine - cytosine - thymine - adenine - guanine, adenine - guanine - thymine - adenine - guanine <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 19 cttgcccgta cggcggttgc nnnnnatgat ggggaccggc ttcttggagc 50 <210> 20 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 20 ccatggtata tctccttctt aaagttaacc ctatagtgag tcgtattaat ttc 53 <210> 21 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 54...58 <223> nnnnn means any one of the followings: cytosine - thymine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - adenine - adenine, cytosine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl -adenine - adenine - adenine, cytosine - thymine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - adenine - adenine, cytosine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl -adenine - adenine - adenine, cytosine - thymine - adenine - adenine - adenine <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 21 gataatacga ctcactatag gtggggttcc cgagcggcca aagggagcag actnnnnntc 60 tgccgtc 67 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> n means tm <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> n means gm <220> <221> misc_feature <222> 47...51 <223> nnnnn means any one of the followings: thymine - thymine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - adenine - guanine, thymine - thymine - thymine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - guanine, thymine - thymine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - adenine - guanine, thymine - thymine - thymine - 2-formyl-1H-pyrrol-1-yl - guanine, thymine - thymine - thymine - adenine - guanine <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 22 nngtggtggg ggaaggattc gaaccttcga agtctgtgac ggcagannnn nagtctgctc 60 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized primer for PCR and sequencing <400> 23 gaaattaata cgactcacta taggg 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized primer for PCR and sequencing <400> 24 tttcacacag gaaacagcta tgac 24 <210> 25 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 35...37 <223> nnn means any one of the followings: cytosine - uracil - 2-formyl-4-(1-propynyl)-1H-pyrrol-1-yl, cytosine - 2-formyl-4-(1-propynyl)-1H-pyrrol-1-yl - adenine, cytosine - uracil - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl, cytosine - 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl - adenine, cytosine - uracil - adenine <220> <223> RNA transcript <400> 25 ggugggguuc ccgagcggcc aaagggagca gacunnnaau cugccguca ucgacuucga 60 agguucgaau ccuuccccca ccacca 86 <210> 26 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 26 gaaattaata cgactcacta tagggccaac cagaagaagg agacagacca agggcaccaa 60 gaagcc 66 <210> 27 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 27 ggaccccaac aacaygagca accgccgaac gggcaagacg cagcgcg 47 <210> 28 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 28 ggggaacaca acagcaccaa cagcaccaac aacccgggac aaagcagcaa ccagggagaa 60 a 61 <210> 29 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 29 ccttggtctg tctccttctt ctggttggcc ctatagtgag tcgtattaat ttc 53 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 30 cttgcccgtt cggcggttgc tcrtgttgtt ggggtccggc ttcttggtgc 50 <210> 31 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for PCR, sequencing and transcription <400> 31 tttctccctg gttgctgctt tgtcccgggt tgttggtgct gttggtgctg ttgtgttccc 60 ccgcgctgcg t 71 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for replication <400> 32 gataatacga ctcactatag <210> 33 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> n means 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl <220> <223> Synthesized DNA fragment for replication <400> 33 gcagtgaaga attcgcttag atgtggancc attccctata gtgagtcgta ttatc 55 <210> 34 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 25 <223> n means 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl <220> <223> Synthesized DNA fragment for replication <400> 34 gcagtgaaga attcgcttag atgtngatcc attccctata gtgagtcgta ttatc 55 <210> 35 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> n means 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl <220> <223> Synthesized DNA fragment for replication <400> 35 gcagtgaaga attcgcttag angtggatcc attccctata gtgagtcgta ttatc 55 <210> 36 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 31 <223> n means 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl <220> <223> Synthesized DNA fragment for replication <400> 36 gcagtgaaga attcgcttag atgtggatcc nttccctata gtgagtcgta ttatc 55 <210> 37 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 34 <223> n means 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl <220> <223> Synthesized DNA fragment for replication <400> 37 gcagtgaaga attcgcttag atgtggatcc attncctata gtgagtcgta ttatc 55 <210> 38 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for replication <400> 38 gcagtgaaga attcgcttag atgtggatcc attccctata gtgagtcgta ttatc 55 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized DNA fragment for transcription <400> 39 ataatacgac tcactatagg g 21 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> n means 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl or adenine <220> <223> Synthesized DNA fragment for transcription <400> 40 cactnctcgg gattccctat agtgagtcgt attat 35 <210> 41 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> n means any one of the followings: 2-formyl-4-[3-[6-(fluorescein-5-carboxamido)hexanamido]-1-propynyl]-1H-pyrrol-1-yl, 2-formyl-4-[3-[6-(tetramethylrhodamine-5-carboxamido)hexanamido]-1-propynyl]-1H-pyrrol-1-yl, <400> 41 gggaaucccg agnagug 17

Claims (31)

  1. 핵산의 복제방법으로서, 복제반응에 있어서, 아미노기, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산을 기질로서 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 치환기가 아미노기인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 복제반응에 있어서, 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제를 이용하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제가, 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지는, 클레노우프레그먼트, T4　DNA 폴리머라제 및 호열균 유래의 DNA　폴리머라제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이 비천연형의 염기를 가지는 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이 천연형의 염기를 가지는 방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이, 이하의 식 1:
    Figure 112013106442162-pct00093
    [여기에 있어서,
    R1은, 수소 또는 아미노기이고,
    R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
    그리고
    A는, N 또는 CH이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산인 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 기질이 되는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이, 이하의 식 2:
    Figure 112013106442162-pct00094
    [여기에 있어서,
    R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
    R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산인 방법.
  9. 아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
  10. 아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있고, 또한 비천연형의 염기를 가지는, 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
  11. 아미노기, 디메틸아미노기, 멜캅토기 및 플루오로기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있고, 또한 천연형의 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
  12. 삭제
  13. 이하의 식 1:
    Figure 112013106442162-pct00095
    [여기에 있어서,
    R1은, 수소 또는 아미노기이고,
    R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
    그리고,
    A는, N 또는 CH이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드와,
    이하의 식 2:
    Figure 112013106442162-pct00096
    [여기에 있어서,
    R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
    R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드가, 염기쌍을 형성하고 있는 핵산.
  14. 제 13항에 있어서,
    식 1의 염기가, 이하의
    A1) 7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
    A2) 7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
    A3) 7-(1H-2-이미다졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
    A4) 5-아미노-7-(2-티에닐)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
    A5) 5-아미노-7-(2-티아졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
    A6) 5-아미노-7-(1H-2-이미다졸릴)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘-3-일기;
    A7) 4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기;
    A8) 4-(2-티아졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기;
    A-9) 4-(1H-2-이미다졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기:
    A-10) 6-아미노-4-(2-티에닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기;
    A-11) 6-아미노-4-(2-티아졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기; 및
    A-12) 6-아미노-4-(1H-2-이미다졸릴)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일기
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 핵산.
  15. 제 13항에 있어서,
    식 2의 염기가, 이하의
    B1) 2-포르밀-1H-피롤-1-일기
    B2) 2-포르밀-4-요오도-1H-피롤-1-일기;
    B3) 2-포르밀-4-메틸-1H-피롤-1-일기;
    B4) 2-포르밀-4-(1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
    B5) 2-포르밀-4-(2-치환아미노비닐)-1H-피롤-1-일기;
    B6) 2-포르밀-4-(3-치환아미노-1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
    B7) 2-니트로-1H-피롤-1-일기;
    B8) 2-니트로-4-요오도-1H-피롤-1-일기;
    B9) 2-니트로-4-메틸-1H-피롤-1-일기;
    B10) 2-니트로-4-(1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기;
    B11) 2-니트로-4-(2-치환아미노비닐)-1H-피롤-1-일기; 및
    B12) 2-니트로-4-(3-치환아미노-1-프로핀-1-일)-1H-피롤-1-일기
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 핵산.
  16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 전사, 역전사, 복제 또는 번역의 공정에서, 염기쌍을 형성하고 있는 핵산.
  17. 이하의 식 1:
    Figure 112013106442162-pct00097
    [여기에 있어서,
    R1은, 수소 또는 아미노기이고,
    R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
    그리고
    A는, N 또는 CH이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 조제하는 방법으로서,
    이하의 식 2:
    Figure 112013106442162-pct00098
    [여기에 있어서,
    R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
    R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 주형으로 하여 전사, 역전사 또는 복제를 실시하고, 상기 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 상보적인 위치에, 상기 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 도입하는
    것을 포함하는, 상기 조제방법.
  18. 이하의 식 2:
    Figure 112013106442162-pct00099
    [여기에 있어서,
    R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
    R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 조제하는 방법으로서,
    이하의 식 1:
    Figure 112013106442162-pct00100
    [여기에 있어서,
    R1은, 수소 또는 아미노기이고,
    R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며, 그리고
    A는, N 또는 CH이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 주형으로 하여 전사, 역전사 또는 복제를 실시하고, 상기 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드의 상보적 위치에, 상기 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 취입하는 것을 포함하는, 상기 조제방법.
  19. 제 17항에 기재된 방법에 따라 조제된, 식 1의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산.
  20. 제 19항에 있어서, tRNA, mRNA, 안티센스 DNA 혹은 RNA, 리보자임, 아프타머 또는 siRNA인, 핵산.
  21. 이하의 식 1:
    Figure 112013106442162-pct00101
    [여기에 있어서,
    R1은, 수소 또는 아미노기이고,
    R2는, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며, 그리고
    A는, N 또는 CH이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
  22. 제 18항에 기재된 핵산을 조제하는 방법에 있어서,
    이하의 식 2:
    Figure 112013106442162-pct00102
    [여기에 있어서,
    R3은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
    R4는, 포르밀기 또는 니트로기이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이 전사의 기질로서 사용되는 방법.
  23. 이하의 식 3:
    Figure 112013106442162-pct00103
    [여기에 있어서,
    R5는, 수소 또는 치환아미노기이고,
    R6은, 치환된 혹은 무치환된 2-티에닐기, 치환된 혹은 무치환된 2-티아졸릴기, 또는 치환된 혹은 무치환된 1H-2-이미다졸릴기이며,
    그리고
    A는 N 또는 CH이다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드.
  24. 제 17항에 기재된 핵산을 조제하는 방법에 있어서,
    이하의 식 4:
    Figure 112013106442162-pct00104
    [여기에 있어서,
    R7은, 수소, 요오드기, 치환된 혹은 무치환된 C1-C3알킬기, 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알케닐기, 또는 치환된 혹은 무치환된 C2-C3알키닐기로부터 선택되는 기이며, 그리고,
    R8은, 포르밀기 또는 니트로기이며,
    다만, R7이 수소 또는 1-프로피닐기이고, R8이 포르밀기인 경우를 제외한다.]
    로 표시되는 염기를 가지는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드가 전사 또는 복제에 있어서의 주형의 화학합성, 및 DNA의 화학합성에 있어서의 원료로서 사용되는 방법.
  25. 제 18항에 기재된 방법에 따라 조제된, 식 2로 표시되는 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산으로서, 식 2의 치환기 R3이, 바이오틴 또는 형광분자로 치환된 C1-C3알킬기, C2-C3알케닐기, 또는 C2-C3알키닐기인, 상기 핵산.
  26. 제 22항에 있어서, 식 2의 R3이, 바이오틴 또는 형광분자로 치환된 C1-C3알킬기, C2-C3알케닐기, 또는 C2-C3알키닐기인, 리보뉴클레오사이드 5'-삼인산이 전사의 기질로써 사용되는 방법.
  27. 제 24항에 있어서, 식 4의 R7이, 바이오틴 또는 형광분자로 치환된 C1-C3알킬기, C2-C3알케닐기, 또는 C2-C3알키닐기인, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸N,N-디이소프로필포스포로아미다이트)데옥시리보뉴클레오사이드가 전사 또는 복제에 있어서의 주형의 화학합성, 및 DNA의 화학합성에 있어서의 원료로서 사용되는 방법.
  28. 제 9항에 있어서, 디메틸아미노기 및 멜캅토기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로, γ-위치의 인산의 수산기가 치환되어 있는 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
  29. 제 11항에 있어서, 천연형의 염기는 아데닌인 데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산.
  30. 제 18항에 기재된 방법에 의해 조제된, 식 2의 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산.
  31. 제 30항에 있어서, tRNA, mRNA, 안티센스 DNA 혹은 RNA, 리보자임, 아프타머 또는 siRNA인 핵산.
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