WO2005026187A1

WO2005026187A1 - 非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用

Info

Publication number: WO2005026187A1
Application number: PCT/JP2004/013216
Authority: WO
Inventors: Ichiro Hirao; Shigeyuki Yokoyama
Original assignee: Riken; Toudai Tlo, Ltd.
Priority date: 2003-09-10
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2005-03-24
Also published as: JP4956802B2; JPWO2005026187A1; US20110087015A1

Abstract

　本発明は、非天然型塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体を提供することを目的とする。本発明のヌクレオシド等は、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有することを特徴とする。

Description

明細書

非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用技術分野

[0001] 本発明は、 2003年 9月 10日に提出された日本国特許出願 2003— 318801に基づく優先権を主張する。

[0002] 本発明は、非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用に関する。

背景技術

[0003] 生体高分子である核酸 (DNA, RNA)は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か 4種類の塩基の組合せ力もなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を铸型として DNAポリメラーゼにより自己複製し、さらに RNAポリメラーゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、 DNAから DNAへ、 DNA から RNAへ、 RNAからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成 (A · TZU、 G · C)のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、 in vitr oセレクション法によって、アブタマ一やリボザィムの機能を有する新規核酸力これまでに多数見つ力つてきたこともその一つである。

[0004] しかし、 20種類のアミノ酸力もなるタンパク質に比べて、天然の核酸には 4種類の塩基 (2種類の塩基対)しかな、と、う事実は、核酸の化学的 ·物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中の tRNA、 rRNA、 mRNA等の機能性 RNAは自分自身の構造を安定ィ匕したり RNA · RNA間、 RNA ·タンパク質問相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基 (対)のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。

[0005] 核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われて、る。核酸に修飾塩基 (もしくは非天然型塩基）を導入する手法として、 1)化学合成により直接導入する方法、 2)核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。 1)の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。 2)の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅 '調製が可能となるが、そのような基質や塩基対 (非天然型ヌクレオチド)も未だ開発途中である。

[0006] 新たな人工塩基を転写により RNA中に部位特異的に導入することができれば、新規機能性核酸の開発が可能になるとともに、人工塩基による遺伝暗号の拡張により、非天然型アミノ酸をタンパク質中に取り込ませた人工タンパク質を作り出すことも可能になる。本発明者らは、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出するための研究を行い、これまで種々の人工塩基対を開発してきた。特に、プリンの 6位にかさ高い置換基を導入した 2 アミノー 6—ジメチルァミノプリン (X)と 2 アミノー 6 チエ-ルブリン（s) 、そしてそのかさ高!、置換基に相補する部位に水素原子をもったピリジン 2—オン (y )をデザインし、この x'y、 s'y塩基対形成を Klenowフラグメントによる DNA中への取り込み効率および T7RNAポリメラーゼによる RNA中への取り込み効率により調べた

[0007] その結果、立体障害を利用した人工塩基対 s— yは、転写で非常に高い選択性を示した（図 2)。この s— y塩基対は、 T7RNAポリメラーゼを用いた転写で、铸型 DNA中の sに相補して、 RNA中に基質 yが部位特異的に取り込まれた。そして、この s— y塩基対を用いて、遺伝暗号を拡張し、非天然型アミノ酸に対応する新たなコドン -アンチコドンをつくり、 _s y塩基対の転写と細胞抽出液力の翻訳系を組み合わせることにより、試験管内で非天然型アミノ酸を部位特異的に含むタンパク質の合成に成功している（図 2)。また、光架橋反応基であるョードや固相担体上のアビジンと結合するピオチンの誘導体を塩基 yの 5位に結合することにより、この修飾された yの基質を転写により RNA中に導入することにより、新たな機能性 RNAの創製を可能とした (特願 2002— 208568 (2002年 7月 17曰）、 PCTZJP03Z02342 (2003年 2月 28曰）

、未公開)。このように、 s-y塩基対は、転写で高!ヽ選択性を示した。しカゝしながら、铸型 DNA 中の sに対する基質 yの取り込みの転写効率は、天然型塩基対の転写効率と比較すると 50— 60%程度に低下する（図 3)。この理由の 1つは、 sの 6位に結合するチェ- ル基の配向が 2種類存在し、チェニル基の C Hが塩基対を形成する側に位置した場合、これと yとの間に立体障害が生じ、 yの取り込みを妨げる可能性があることにある（図 4)。高い選択性のみならず、高い取り込み効率を有する非天然型塩基が開発されれば、機能性 RNAやタンパク質の大量供給が可能になり、これらのバイオポリマ一を実用化することができる。

特許文献 1 :米国特許第 5, 432, 272号

特許文献 2 :米国特許第 6, 001, 983号

特許文献 3 :米国特許第 6, 037, 120号

特許文献 4:国際公開第 01Z005801号パンフレット

非特許文献 l : Piceirilli, J. A. , Krauch, T. , Morney, S. E. and Benner , S. A. (1990) Enzymatic incorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet. Nature, 343, 33—3 7.

非特許文献 2 : Piceirilli, J. A. , Moroney, S. E. , and Benner, S. A. ( 1991) A C— nucleotide base pair: methylpseudouridine— directed inc orporation of formycin triphosphate into RNA catalyzed by T7 R NA polymerase. Biochemistry, 30, 10350—10356.

非特許文献 3 : Switzer, C. Y. , Morney, S. E. and Benner, SA. (1993 ) Enzymatic recognition of the base pair between isocytidine and isoguanosine. Biochemistry, 32, 10489—10496.

非特許文献 4: Morales, J. C. and Kool, E. T. (1999) Minor groove in teractions between polymerase and DNA: More essential to replic ation than Watson— Crick hydrogen bonds？ J. Am. Chem. Soc. , 121 , 2323-2324.

非特許文献 5 : Nagatsugi, F. , Uemura, K. , Nakashima, S. , Maed a, M.， and Sasaki, S.， Tetrahedron, 53， 3035—3044， 1997 非特許文献 6 :Wu， Υ·， Ogawa, A. X.， Berger, M.， MeMinn, D. L.， Schultz, P. G. and Romesberg, F. E. (2000) Efforts toward expans ion of the genetic alphabet： Optimization of interbase hydrophobic interactions. J. Am. Chem. Soc.， 122, 7621-7632.

非特許文献 7 :Tae， E. L.， Wu, Y.， Xia, G.， Schultz, P. G. and Rom esberg, F. E. (2001) Efforts toward expansion of the genetic alph abet: Replication of RNA with three base pairs. J. Am. Chem. Soc .， 123, 7439-7440.

非特許文献 8 :Ishikawa， M.， Hirao, I. and Yokoyama, S. (2000) Syn thesis of 3— (2— deoxy— β—D— ribofuranosyl) pyridine— 2— one and 2— am ino— 6— (N， N— dime thy lamino )—9— (2— deoxy— β—D— ribofuranosyl) purine derivatives for an unnatural base pair. Tetrahedron Letters, 41，

3931-3934.

非特許文献 9 : Hirao, I.， Ohtsuki, Τ·， Fujiwara, Τ·， Mitsui, Τ·， Yok ogawa, T.， Okuni, T.， Nakayama, H.， Takio, K.， Yabuki, T.， K igawa, T，， Kodama, K.， Yokogawa, T.， Nishikawa, K.， and Yoko yama, S. (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins. Nature Biotechnology, 20, 177—182. 非特言午文献 10 : Fujiwara, Τ·， Kimoto, M.， Sugiyama, Η·， Hirao, Ι· and Yokoyama, . (2001J Synthesis oi o— (2— thienyl) purine nuel eoside derivatives that form unnatural base pairs with pyridin— 2— o ne nucleosides. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11， 2 221-2223.

非特許文献 11 : Ohtsuki, Τ·， Kimoto, M.， Ishikawa, M.， Mitsui, T. ， Hirao, I. and Yokoyama, S. (2001) Unnatural base pairs for sp ecific transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98， 4922—4925. 非特許文献 12 : Goodman, M. F.， Creighton, S.， Bloom, L. B.， P etruska, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. , 28, 83—126 (1993) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明は、 2—アミノー 6— (2 チアゾリル）プリン 9ーィル基、又は、 2 アミノー 6— (2 ーォキサゾリル)プリン 9ーィル基、ここにおいて、チアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z又は 5位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオシド、ヌクレォチド又はそれらの誘導体 (以下、本明細書中、「ヌクレオシド等」と記載する場合がある。 )を提供することを目的とする。

[0010] 本発明のヌクレオチド等は、好ましくはチアゾリル基の 4位及び Z又は 5位は置換されて、てもよ、、 2 アミノー 6—（2 チアゾリル)プリン 9 ィル基を塩基として有する。

[0011] 本発明はまた、前記ヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供することを目的とする。

本発明の核酸は、好ましくは、前記ヌクレオチドと、 5位置換若しくは非置換- 2-ォキソ（ 1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している。

[0012] 本発明はさらに、 5位置換若しくは非置換 2—才キソ（1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法であって、本発明のヌクレオチドを含む核酸を铸型として転写、複製又は逆転写を行い、本発明のヌクレオチドの相補的な位置に、 5位置換若しくは非置換- 2-ォキソ（1H) -ピリジン- 3- ィル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込むことを含む方法、を提供することを目的とする。

[0013] 本発明はさらにまた、本発明のヌクレオチドを含む核酸、並びに、 5位置換若しくは非置換 2 ォキソ（ 1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含むキット、を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明者らは、上記問題の解決のために、 2 アミノー 6 チェニルプリン（s)中のチェ-ル基の代わりにチアゾリル基を用いた新たな塩基 2 アミノー 6— (2 チアゾリル）プリン (V)をデザインした（図 4)。この Vのチアゾリル基も sのチェ-ル基の場合と同様に 2つの配向性が存在する力どちらの配向をとつても、塩基対面には硫黄原子又は窒素原子のいずれかが位置する。よって、 sのチェ-ルにおける C H基のような立体的に突出する置換基がないので、 yとの塩基対形成に立体障害を及ぼさない。さらに、この塩基 Vのヌクレオシド誘導体を合成し、複製や翻訳における V y塩基対の選択性と効率を調べた。その結果、 Vを導入した铸型 DNAを用いた転写で、 yが効率よく RNA中に導入されることを見出し、本発明を想到した（図 3)。

[0015] 2—ァミノ— 6— (2 チアゾリル）プリン 9ーィル某、又は、 2—ァミノ— 6— (2—ォキサゾリル)プリン 9ーィル某、を塩某として有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘 m

本発明は、 2—ァミノ— 6— (2 チアゾリル）プリン 9ーィル基、又は、 2—ァミノ— 6— (2 ーォキサゾリル)プリン 9ーィル基、を塩基として有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体を提供する。塩基中のチアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z 又は 5位は置換されていてもよい。本発明のヌクレオシド等は、典型的には、図 1に記載された構造を有する。本発明のヌクレオシド等は、塩基中のチアゾリル基又はォキサゾリル基には 2つの配向性が存在する力どちらの配向をとつても、 sのチェニルにおける C H基のような立体的に突出する置換基がないので、 yとの塩基対形成に立体障害を及ぼさない、という利点を有する。

[0016] 本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によつて結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、了ザニン、グ了ニン、シトシン、チミン、ゥラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記塩基の「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば 2—アミノー 6— (2 チアゾリル)プリン 9ーィル基に相当する塩基、又は、 2 アミノー 6— (2—才キサゾリル)プリン 9ーィル基に相当する塩基などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分力リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、 1ないし 3リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、 2—デォキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を 2位に有する 2—置換リボフラノシルであってもよぐまた、リン酸部分は、チォリン酸であってもよい。つまり、糖部分およびリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとつて、ればよ、。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドは RNAの構成成分となり、デォキシリボフラノシルであるデォキシリボヌクレオチドは DNAの構成成分となる。

[0017] 本発明のヌクレオシド等は典型的には図 1に示すような構造を有する。塩基中のチァゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び/又は 5位（図 1の R¹及び又は R²)は水素であるか、あるいは以下の

1)低級アルキル基；

2)ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；

3)アルケニル基、アルキ-ル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；

4)ピオチン又はその誘導体；ある!/ヽは

5)フルォレセイン、 6—カルボキシフルォレセイン、テトラメチルー 6—カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子

力なるグループ力も選択される置換基によって置換されて、てもよ、。好ましくは、 4位又は 5位の片方のみが置換される。好ましくは、置換基は低級アルキル基である

[0018] 1)低級アルキル基とは、 C1から C4の直鎖または分岐鎖を有するアルキル基で、二つのアルキル基で環を形成することもあり得る。好ましくはメチル基である。

[0019] 2)ヨウ素、臭素から選択される光反応性基は、光照射することによりラジカルを発生させ、隣接する分子を共有結合する。これにより、本発明のヌクレオチドを含む核酸と他分子 (好ましくは生体分子）との多量体を形成させることも可能である。

[0020] 3)置換基として、アルケニル基、アルキ-ル基若しくはアミノ基、又はその誘導体を有することも可能である。ァルケニル、アルキ -ル、アミノ基、又はその誘導体は、他分子と疎水的あるいは親水的な相互作用に役立ち、例えば、アブタマ一とそのターゲットとなる分子との間の相互作用を強めることができる。また、リボザィムの場合には、新たな活性部位を創製することが出来る。さらに、ァミノ基の誘導体は、このものからビォチンや蛍光色素の結合した誘導体の合成中間体にもなる。

[0021] ァルケ-ル基又はアルキ-ル基は、好ましくは、炭素数 2ないし 5、より好ましくは、炭素数 2ないし 3である。誘導体としては、例えば、 C≡CC H 、一 C≡CCH NH 、

6 5

_CH = CH— CH—NHが含まれる。好ましくは、 C≡CC H (2—フエ-ルェチュル

2 2 6 5 基)である。

[0022] 4)ピオチンは補酵素 Rとも呼ばれ、ビタミン B群の 1種である。ピオチンは、卵白中に含まれる糖タンパク質であるアビジンと特異的に結合し、複合体を形成することが知られている。よって、置換基としてピオチンを有するヌクレオシド等は、アビジンタンパク質に特異的に結合する。このため、ピオチンが結合したヌクレオシド等を含む核酸は、アビジンを結合した担体と結合させることができるので、核酸を固定ィ匕することができ、特定の分子に結合する核酸 (アブタマ一など）を固定ィ匕すれば、例えば、特定物質の検出や単離に、また、診断試薬として利用できる。なお、本発明のヌクレオシド等の置換基としてピオチンを導入するためには、ピオチンを直接導入してもよヽ力アミノアルキル基、アミノアルケニル基、アミノアルキ-ル基等力選択されるリンカーを介することが好ましい。本明細書において「ピオチン誘導体」とは、このようにヌクレオシド又はヌクレオチドに導入するために、リンカ一を結合させたピオチンを含む

[0023] 5)置換基として、フルォレセイン、 6 カルボキシフルォレセイン、テトラメチルー 6— カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子を有する場合、蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、蛍光分子を有する本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。限定されるわけではないが、例えば、フルォレセインの吸収極大波長は 513nm、蛍光極大波長は 532nmである。また、 6 カルボキシフルォレセインの吸収極大波長は 495nm、蛍光極大波長は 521nm、テトラメチルー 6 カルボキシローダミンの吸収極大波長は 55 5nm、蛍光極大波長は 580nmである。それぞれの物質によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。

本明細書において、「2 アミノー 6— (2 チアゾリル)プリン 9ーィル基」及び「2—ァミノ — 6-(2-ォキサゾリル)プリン- 9-ィル基」とは、特に明記しない限り、塩基中のチアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z又は 5位は置換されている態様を含みうる

[0024] 本発明のヌクレオシド等は、好ましくは、 2 アミノー 6—（2 チアゾリル)プリン 9ーィル基、 2 アミノー 6— (4—メチルー 2 チアゾリル）プリン 9 ィル基又は 2—アミノー 6— (5 -メチルー 2-チアゾリル)プリン -9-ィル基を塩基として有する。

[0025] 具体的には、以下の

i) 2—アミノー 6— (2 チアゾリル) 9— (2—デォキシー β—D リボフラノシル）プリン； ii) 2—ァミノ— 6— (2—チアゾリル)— 9— ( j8— D—リボフラノシル）プリン；

iii) 2—ァミノ— 6— (2 チアゾリル)— 9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル）プリンリン酸エステル；

iv) 2—ァミノ— 6— (2 チアゾリル)—9— ( β D—リボフラノシル）プリンリン酸エステル；

V) 2—ァミノ— 6— (4—メチルー 2 チアゾリル)— 9— (2—デォキシー β—D—リボフラノシル）プリン；

vi) 2—アミノー 6— (4—メチルー 2 チアゾリル) 9— ( β D—リボフラノシル）プリン； vii) 2—アミノー 6— (4—メチルー 2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー β—D—リボフラノシル）プリンリン酸エステル；

viii) 2—ァミノ— 6— (4—メチル—2 チアゾリル)—9— ( β—D リボフラノシル）プリンリン酸エステル；

ix) 2—ァミノ— 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー β—D—リボフラノシル）プリン；

X) 2—アミノー 6— (5—メチルー 2 チアゾリル) 9— ( β D—リボフラノシル）プリン； xi) 2—ァミノ— 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー β—D—リボフラノシル）プリンリン酸エステル;及び

xii) 2—ァミノ一 6— (5—メチルー 2 チアゾリル) 9— ( β—D リボフラノシル）プリンリン酸エステル

を含む。本明細書において、「2 アミノー 6— (2 チアゾリル)」と記載した場合、「2—ァミノー 6— (4ーメチルー 2 チアゾリル）」及び「2 アミノー 6—（5—メチルー 2 チアゾリル）」に関する説明も包含しうる。

[0026] 本発明の 2 アミノー 6—（ 2 チアゾリル）プリン 9 ィル基又は 2 アミノー 6—（ 2—ォキサゾリル)プリン 9 ィル基を有するヌクレオシド等は、特に限定されることなく公知の方法を用いて合成することができる。例えば、非限定的に、本明細書中の実施例 1では、先ず、チアゾール基として 2 トリブチルスズチアゾール（図 5の化合物 3a)を合成し、これを公知の 2—ァミノ— 6—トシルォキシー 9— (2—デォキシー 3, 5—ジー O— tert—ブチルジメチルシリル β D—リボフラノシル）プリン（図 5の化合物 4) (Nagatsugi, F . , Uemura, K. , Nakashima, ¾. , Maeda, Μ. , and ¾asaki, ¾. , Tetrahedron, 53, 3035—3044, 1997)【こ導人した。次!/ヽで、デォキシリボース基上の保護基 tert プチルジメチルシリル基を遊離させることによって、本発明のヌクレオシドが得られた。

[0027] 本発明のヌクレオシド等の合成経路としては、その他、 2 アミノー 6—トシルォキシー 9— (2—デォキシー 3、 5—ジー O— tert—ブチルジメチルシリル β D—リボフラノシル）プリン（図 5の化合物 4)の 6位トシルォキシ基の代わりにアルキルスルホ -ルォキシ基または他のァリールスルホ-ルォキシ基を用いることが可能である。また 2 アミノー 6— トシルォキシプリンより 2—ァミノ— 6— (2—チアゾリル）プリンを合成し、デォキシリボース誘導体またはリボース誘導体と反応させることにより目的化合物を合成することも可能である。

[0028] 本発明のヌクレオシド等は、ヌクレオシド又はヌクレオチドの「誘導体」も含む。これらの誘導体には、例えば、ホスホロアミダイト誘導体、 Η ホスホナート誘導体が含まれる。

[0029] ホスホロアミダイト誘導体は、核酸の化学合成に使用するためにヌクレオシド中の 1 またはそれより多くの箇所において置換基が保護基で修飾されている態様である（例は、 Sambrook et al. , Molecular Cloning： A Laboratory Manual,第 3 版， Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク州コーノレド 'スプリング'ノヽ一バー（2001)、 10. 42-10. 46)。具体的には、（デォキシ）リボース残基の 5，一水酸基は、ジメトキシトリチル基 (DMT)、モノメトキシトリチル基、レブリニル基などの核酸合成に用いられる 5'位保護基で保護されうる。これは、 5'—水酸基が核酸の化学合成の際に投入されるホスホロアミダイトヌクレオシドと反応するのを防止するためである。また、投入されるホスホロアミダイトヌクレオシド上の（デォキシ）リボース残基に結合した三価のリン酸基は、ジイソプロピルアミノ基等で保護されうる。これは、結合の際に、テトラゾール等によって活性ィ匕されるためである。この三価のリン酸基はまた、シァノエチル、メトキシ等も結合する。これは、側鎖の反応を抑制するためである。さらに、塩基のプリン環のアミノ基は、フエノキシァセチル基、イソプチリル基等で保護されうる。これは、環外ァミノ基の求核機能を保護するためである。本発明のホスホロァミダイト誘導体は、これらの保護基が 1またはそれより多くの箇所において導入されている。好ましくは、上述した全ての箇所において保護基が導入されている。本発明のホスホロアミダイト誘導体の例として、 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (2—チアゾリル )—9— [2—デォキシー 5— O—ジメトキシトリチルー 3— O— (N, N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフオルァミジル)― β D—リボフラノシル]プリン（図 6の化合物 9a)、 2- フエノキシァセチルァミノ— 6— (4—メチルー 2—チアゾリル)— 9— [2—デォキシ— 5 O— ジメトキシトリチル— 3— O— (N, N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフオルアミジル)— j8— D—リボフラノシル]プリン（図 6の化合物 9b)、及び、 2—フエノキシァセチルァミノ— 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)— 9— [2—デォキシー 5— O—ジメトキシトリチルー 3 -0- (N, N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフオルァミジル) - β D—リボフラノシル]プリン（図 6の化合物 9c)が含まれる。

[0030] 本発明のヌクレオチが組み认まれた核酸

本発明はまた、 2 アミノー 6— (2—チアゾリル）プリン 9ーィル基、又は、 2 アミノー 6— (2—ォキサゾリル)プリン 9ーィル基、ここにおいて、チアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z又は 5位は置換されて、てもよ、、を塩基として有するヌクレオチドが、 1又はそれより多く組み込まれた核酸を提供する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖の RNA又は DNAを含む。二本鎖は、 DNA/DNA、 RNA/RNA,又は DN AZRNAであってもよい。また、 DNAには、 RNAを铸型として逆転写してなる cDN Aも含まれる。あるいは、核酸は 3本鎖、 4本鎖等も形成しうる。

[0031] 本発明のヌクレオシド等は、 5位置換若しくは非置換 2—ォキソ（1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドと塩基対を形成することが可能である。本発明の 2—ァミノ— 6— (2—チアゾリル）プリン— 9ーィル基、又は、 2—ァミノ— 6— (2 ォキサゾリル)プリン 9 ィル基は、図 4に例示したように、 2 アミノー 6 チエ-ルブリン（s)と同様に、 5位置換若しくは非置換 2—才キソ（1H) ピリジン 3—ィルと、 2箇所で水素結合を生じる。

[0032] 本発明の 2—アミノー 6— (2—チアゾリル）プリン 9ーィル基、又は、 2—アミノー 6— (2— ォキサゾリル)プリン 9ーィル基、ここにおいて、チアゾリル基又はォキサゾリル基の 4 位及び Z又は 5位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、 DNA又は RNA等の核酸に取り込むことが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によって DNA又は RNAに取り込んでもよ!/、。

[0033] 転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応は T7 RNAポリメラーゼ (Takara等）、複製反応は、タレノウフラグメント（KF)、逆転写反応は AMV Reverse Transcriptase XL (AMV-RT) (Life Science社）を使用することが可能である。複製反応は、反応中に 6位置換された 2 アミノープリン 9 ィル基を有するヌクレオチドが除去されてしまうのを防ぐために、例えば、 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ活性をもたない Taq D NAポリメラーゼ（Takara Taq™)を用いて vを含むプライマーによる铸型 DNAの P CR増幅も可能である。

本発明のヌクレオシド等は、塩基中のチアゾリル基又はォキサゾリル基には 2つの配向性が存在するが、どちらの配向をとつても、 sのチェ-ルにおける C H基のような立体的に突出する置換基がないので、 yとの塩基対形成に立体障害を及ぼさない、という利点を有する。そのため、表 1及び図 9に示されたように、本発明のヌクレオチド V に対する yの 1塩基取り込み効率は、 VmaxZKm= l. 4xl0⁵であり、天然塩基の A ZT間の取り込み効率と同程度の高さであった。また、 sに対する yの取り込み効率よりも、約 4倍高カゝつた。よって、本発明のヌクレオシドは効率よく yと塩基対を形成することが示されている。また、選択性に関しては、 Vに対する yの取り込み効率は、 Cの取り込みの約 3倍、 Tの取り込みの 20倍以上であった。

[0034] また、伸長反応中の yの選択的導入についても、 s— y塩基対よりも V— y塩基対の方 1S 複製の効率が高いことが示さされた（図 12)。さらに、非天然型塩基が铸型中に 2 個またはそれより多く連続する場合も、本発明のヌクレオチドを含む核酸は有用である。図 13に示されたように、対照の sを 2つ並べて導入した铸型 DNAを用いた場合、 yはほとんど取り込まれず伸長産物は実質的に得られない。これに対し本発明のヌクレオチド Vは 2つ並んで、ても複製が進行し、 2つの基質 yが相補鎖 DNA中に取り込まれた産物が得られる。

[0035] さらに、本発明のヌクレオチドは転写反応においても有用である。具体的には図 15 に示されたように、対照の sを含む铸型に対する基質 yの RNA中への取り込み効率は、天然型塩基対 (AT)の場合に比べて 50— 60%程度であった。これに対し、本発明の Vを含む铸型に対する基質 yの取り込み効率は 96%であり、天然型塩基対とほぼ同程度の高さである。また、複製の場合と同様に転写においても、铸型に非天然型塩基が铸型中に 2またはそれより多く連続する場合も本発明のヌクレオチドを含む核酸は有用である。铸型中に対象 sを 2つ並べた場合 (NN = ss)、 2つの yが取り込まれた RNAは得られなかった。これに対し、铸型中に Vが 2つ並んでいる場合 (NN=v V)は転写が進行し、その効率は 30%程度であった力 2つの基質 yが RNA中に取り込まれた（図 16)。

[0036] このように、塩基 sの代わりに Vを利用することにより、期待されたとおりに、複製、転写ともに基質 yの取り込み効率を向上させることができる。さらに、従来不可能であつた、非天然型塩基 yが 2つ又はそれより多く連続して配置される DNA及び RNAの作成も可能である。これは、人工塩基対を介して、機能性コンポーネントを RNA中に導入した新規機能性 RNAやタンパク質の開発とそれらの大量調製を初めて可能とし、これらの新規バイオポリマーの商業ィ匕に大きく貢献する。

[0037] 本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、 tRNA、 mRNA、アンチセンス DN A若しくは RNA、リボザィム又はァプタマ一として使用されうる。アンチセンス DNA若しくは RNAとは、ある特定の遺伝子の発現を抑える DNA又は RNAである。標的とする遺伝子配列 (センス鎖)の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレォチドが組み込まれたアンチセンス DNA又は RNAは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるもの^ ilj製しうる。リボザィムは、 RNAを構成成分とする触媒の総称である。ァプタマ一は、 in vit roセレクション法によって得られた、タンパク質等の特定の分子に結合する機能を有する核酸である

また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた DNA又は RNA (例えば、 mRNA、合成 RNA)は、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。本発明の核酸は遺伝子断片やプローブなどとして使用されうる。天然の遺伝子の一部又は全部を本発明の核酸で置換した態様、天然の遺伝子に本発明のヌクレォチドを 1個又はそれより多く付加したもの、又はこれらを組み合わせたものも本発明に包含される。このような本発明の核酸 (ヌクレオチド)を含む非天然型の遺伝子は、従来の天然型の遺伝子の改変と同様な方法又は従来の方法に準じた方法により行うことができる。従って、従来の天然型の遺伝子と同様に、本発明の核酸を含む非天然型の遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞を形質転換することによって、発現させることが可能である。

[0038] また、本発明のヌクレオチドを含む新たなコドンを設計することが可能である。本発明のヌクレオチドの一態様として、塩基 2 アミノー 6—（2 チアゾリル)プリンを含むヌクレオチド (V)を例に説明する。前述したように、铸型中に本発明のヌクレオチドが 2つまたはそれ以上連続して存在する場合でも、複製反応及び転写反応は進行し、相補的な位置に 5位置換若しくは非置換 2 ォキソ（ 1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチド (y)が取り込まれる。よって、本発明の方法により従来不可能であった、非天然型塩基 yが 2つ又はそれより多く隣接して配置される DNA及び RNA の作成が可能である。よって、 yを 3つ含むコドン (yyy)、 yを 2つ含むコドン (例えば、 yyA、 Gyy、 yGy)、 yを 1つ含むコドン (例えば、 yAG、 CyT、 AGy)を設計することができる。また Vを含むコドンの作成も可能である。新たなコドンは、天然型のアミノ酸をコードさせることもできるし、また、非天然型のアミノ酸をコードさせることもできる。さらに、転写や輸送などの機能をコードさせることもできる。このように、本発明は新規な非天然型人工塩基を提供するのみならず、本発明のヌクレオチドを含む新たなコドンの設計による、全く新しい遺伝暗号の設計を可能とするものであり、新たな遺伝暗号の世界を提供するものである。

[0039] さらに、本発明の新たなコドンに応じた tRNA系を設計することにより、非常に多くのアミノ酸を利用可能とする新たなタンパク質合成システムを設計することができる。利用可能なアミノ酸はリボソームにおけるタンパク質合成酵素系で利用できるものであればよい。従って、本発明は前記本発明のコドンを用いた新たなタンパク質合成システムを提供する。本発明のタンパク質合成システムによれば、所望の位置のコドンの核酸を本発明の核酸に効率よく置換又は導入することにより、所望の非天然型のアミノ酸を含有するタンパク質の製造が可能となる。

[0040] さらにまた、本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、 RNA干渉（RNA interference, RNAi)においても利用可能である。 RNA干渉は、二本鎖 RNA(dsRNA)によってその配列特異的に mRNAが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象である。 RNA干渉の典型的な例としては、 dsRNA は、 RNaselllファミリーに属するダイサー（Dicer)により、 3'末端の側に 2塩基程度のオーバーハングを有する約 21塩基 23塩基の siRNA (short interfering RN A)にプロセッシングされる。 siRNAは RISCと呼ばれる siRNA 蛋白質複合体に取り込まれ、配列特異的に mRNAを分解する。 RNA干渉は、哺乳動物（ヒト、マウス等 )、線虫、植物、ショウジヨウバエ、菌類などの広範な生物種間で保存されている現象であることが示されて、る。本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、 RNA干渉における siRNAとして、または分解を受ける mRNAの一部として利用可能である。

[0041] 非天然型有するヌクレオチドがみ认まれた核酸調製する方法

本発明はさら〖こ、 5位置換若しくは非置換 2—才キソ（1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法を提供する。本発明の方法は、本発明のヌクレオチドを含む核酸を铸型として転写、複製又は逆転写を行い、本発明のヌクレオチドの相補的な位置に、 5位置換若しくは非置換 2—ォキソ（ 1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込むことを含む。

[0042] 前述したように、铸型中に本発明のヌクレオチドが 2つまたはそれ以上連続して存在する場合でも、複製反応及び転写反応は進行し、相補的な位置に 5位置換若しくは非置換 2—ォキソ（1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドが取り込まれる。よって、本発明の方法により従来不可能であった、非天然型塩基 yが 2つ又はそれより多く隣接して配置される DNA及び RNAの作成も可能となった。 [0043] 本発明はさらにまた、前記方法に使用するためのキットも提供する。本発明のキットは、本発明のヌクレオチドを含む核酸、並びに、 5位置換若しくは非置換 2—才キソ（ 1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチド、を含む。キット中の本発明のヌクレオチドを含む核酸は、本発明の方法の転写、複製又は逆転写反応における铸型として利用されうる。

図面の簡単な説明

[0044] [図 1]図 1は、本発明のヌクレオシド及びヌクレオチドの態様の構造を示す。

[図 2]図 2は、 2—ァミノ— 6—チエ-ルブリン（s)とピリジン 2 オン (y)の人工塩基対、並びにそれを利用したタンパク質合成のスキームを示す。

[図 3]図 3は、 2—ァミノ— 6—チエ-ルブリン（s)とピリジン 2 オン (y)の人工塩基対、並びに、 2 アミノー 6— (2 チアゾリル)プリン (V)と yの人工塩基対を利用した転写反応の選択性及び効率を示す。

[図 4]図 4は、 2—ァミノ— 6—チエ-ルブリン（s)とピリジン 2 オン (y)の人工塩基対、並びに、 2 アミノー 6— (2 チアゾリル)プリン (V)と yの人工塩基対の配向と立体障害を示す。

[図 5]図 5は、本発明のヌクレオシド、 2 アミノー 6—（2—チァゾリル)ー9ー（2—デォキシ - β D—リボフラノシル）プリンの合成スキームを示す。

[0045] 図 5中、 R=t—ブチルージメチリシリル; Ts =トシルである。 aシリーズは、 R^{1 =}R² = H ； bシリーズは、 R^{1 =} CH , R² = H ;cシリーズは、 Ι^ = Η, R² = CHである。

3 3

[図 6]図 6は、本発明のヌクレオシド誘導体、 2—フエノキシァセチルアミノー 6— (2 チアゾリル)— 9— [2—デォキシ— 5 O—ジメトキシトリチルー 3— 0—(N, N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフオルァミジル) - β—D リボフラノシル]プリンの合成スキームを示す。

[0046] 図 6中、 Pac =フエノキシァセチル； DMT=4, 4，ージメトキシトリチルである。 aシリーズは、！^=1^ = 11 ;1)シリーズは、 R^{1 =} CH , R² = H ;cシリーズは、 Ι^ = Η, R² = C

3

Hである。

3

[図 7]図 7は、本発明のヌクレオチド、 2 アミノー 6—（2 チアゾリル )ー9ー（2—デォキシ - β D—リボフラノシル）プリン 5，一三リン酸の合成スキームを示す。 [0047] 図 7中、 PPP =トリホスフェートである。 aシリーズは、 R¹:!^:!! ;!)シリーズは、 R¹ =CH , R² = H ;cシリーズは、 Ι^ = Η, R² = CHである。

3 3

[図 8]図 8は、 Klenowフラグメントによる 1ヌクレオチド挿入反応に使用したプライマー及び铸型の塩基配列、並びに、反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。

[図 9]図 9は、 Klenowフラグメントによる 1ヌクレオチド挿入反応における反応速度の解析結果を示す。

[図 10]図 10は、 Klenowフラグメントによる 1ヌクレオチド挿入反応における反応速度の解析に使用したプライマー及び铸型の塩基配列を示す。

[図 11]図 11は、 Klenowフラグメントによる伸長反応に使用したプライマー及び铸型の塩基配列を示す。

[図 12]図 12は、 Klenowフラグメントによる伸長反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。

[図 13]図 13は、 Klenowフラグメントによる伸長反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。

[図 14]図 14は、転写反応のスキームを示す。

[図 15]図 15は、 temp 35 N— 1を用いた転写反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。転写効率はレーン 5を 100%とすると、レーン 1、 2、 3及び 4は、各々23%、 96%、 24%及び 60%であった。

[図 16]図 16は、 temp 35 N— 2を用いた転写反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。転写効率はレーン 5を 100%とすると、レーン 1、 2、 3及び 4は、各々2%、 35%、 1%及び 6%であった。

実施例

[0048] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではな、。当業者は本明細書の記載に基づ、て容易に本発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

[0049] 実施例 1 2 アミノ一 6— ( 2 チアゾリル) 9— ( 2—デォキシー β— D—リボフラノシル) プリン謙：の ( 5— 7)

ί ) 2 トリプチルスズチアゾール ( )3a)の Hfe ( 5) アルゴン雰囲気下、 78°Cに冷却したジェチルエーテル（25ml)に n—ブチルリチウム（へキサン中、 1. 57M, 3. 2ml, 5. Ommol)を加え、続いて 2—ブロモチアゾール (化合物 1) (450 1, 5. Ommol)を滴下し 78°Cで 30分撹拌した。この溶液に塩ィ匕トリブチルスズ（1. 5ml, 5. 5mmol)を 78°Cで滴下し、液温が室温になるまで撹拌しながら自然に昇温した（30分)。

[0050] この反応溶液を飽和食塩水で 3回洗浄した後、有機層を MgSOで乾燥後、溶媒を

4

減圧下で留去して 2—トリプチルスズチアゾール (ィ匕合物 3a) (2. lg,黄色の液体)を得た。 2—トリプチルスズチアゾールは、さらなる精製を行わずに、そのまま次の反応に用いた。

[0051] 2) 2 アミノ一 6— ( 2 チアゾリル) 9— ( 2—デォキシー β— D—リボフラノシル）プリン（イ^^ 6a)の^ ^ (阅 5)

2—ァミノ— 6—トシルォキシー 9— ( 2—デォキシー 3 , 5—ジー O tert—ブチルジメチルシリル β—D リボフラノシル）プリン（化合物 4)を、 Nagatsugiら（Nagatsugi, F. ,

Uemura, K. , NaKashima, ¾. , Maeda, Μ. , and ¾asaki, S. , Tetrahedron, 53, 3035—3044, 1997)に従って合成した。ィ匕合物 4 (490m g, 0. 75mmol)と Pd (PPh ) (44mg, 0. 04mmol)と LiCl (64mg, 1. 5mmol)に

3 4

ジォキサン（9. 4ml)をカ卩え、 15分間撹拌しながらアルゴンでパブリングした。この溶液に、 1)で合成した 2—トリブチルスズチアゾール（ィ匕合物 3a) (1. 4g, 3. 8mmol)を加え、さらに 15分間、アルゴンでパブリングを行った後、オイルバス上で 3時間環流した。反応溶液を濃縮した後、残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（5% MeOH 、 CH C1中で溶出）で精製した。得られた 2 アミノー 6— (2 チアゾリル) 9 (2—デ

2 2

ォキシ 3, 5—ジー O— tert—ブチルジメチルシリル β D—リボフラノシル）プリン（ィ匕合物 5a) (430mg,粗精製物）を THF (7. 5ml)に溶解し、 TBAF (1M THF溶液， 2. 3ml)を加えて室温で 15分撹拌した。反応溶液を濃縮した後、残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（5% MeOH, CH CI中で溶出）で精製した。

2 2

[0052] 最終的に、 RP—HPLC ( 19x150mm,水 μ bond sphere 5 ^ C18 100 ^ , 流速： lOmlZ分， H O中、 10%— 50% CH CN, 15分，直線勾配)で精製し

2 3

、目的とする 2—ァミノ一 6— (2 チアゾリル) 9— (2—デォキシー —D リボフラノシル）プリン (化合物 6a) (155mg, 64%, 2工程の収率，黄色固体)を得た。

[0053] iH—NMR (270MHz, DMSO—d) δ 2. 26 (m, 1Η), 2.65 (m, 1H), 3.

6

55 (m, 2H), 3.84 (m, 1H), 4. 38 (m, 1H), 4. 96 (t, 1H, J = 5.4Hz), 5. 30 (d, 1H, J=4.0Hz), 6. 29 (t, 1H, J = 6. 5Hz), 6. 74 (s, 2H), 8 .00 (d, 1H, J = 3. 2Hz), 8. 12(d, 1H, J = 3. 2), 8.41 (s, 1H)；

1³C-NMR(68MHz, DMSO-d ) δ 39. 32, 61. 55, 70. 58, 82. 52, 8

6

7. 57, 122. 66, 123. 93, 141.68, 144.66, 147. 36, 154. 78, 159.68, 164.03;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 335.

13 15 6 3

0926, 測定値 335.0922; UV— vis (EtOH中） λ max=360nm( ε =8030) , 298nm( ε =8620), 231nm( ε =18080), λ min=326nm( ε =4240) , 265nm( ε =3450), 215nm( ε =9660); TLC Rf=0. 12(CHC1： Me

2 2

[0054] 3) 2 フエノキシァセチルアミノ— 6— (2 チアゾリル)—9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル)プリン (化合物 7a)の合成 (阅6)

2)で合成した 2 アミノー 6—（2 チアゾリル)ー9 （2—デォキシー β D リボフラノシノレ）プリン（ィ匕合物 6a) (150mg, 0.45mmol)をピリジン（2. 2ml)に溶解し、塩ィ匕トリメチルシリル (TMS— C1) (423 μ 1, 3. 3mmol)をカ卩えて室温で 25分撹拌した（溶液 A)。これとは別に、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT) (108mg, 0.8mmol) にピリジン（221 1)とァセトニトリル（221 1)を 0°Cで冷却し、この溶液に塩化フエノキシァセチル（Pac—Cl) (92 1, 0. 67mmol)を加えて 0°Cで 5分撹拌した（溶液 B)

[0055] 溶液 Bに 0°Cに冷却した溶液 Aを氷冷下で加え、室温で 12時間撹拌した。反応溶液を 0°Cに氷冷した後、濃アンモニア水 (220 1)と H O (220 μ 1)を加えて 0°Cで 10

2

分間撹拌した。反応溶液に酢酸ェチルと水を加えて分液し、有機層を Na SOで乾

2 4 燥後、溶媒を減圧下で留去した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（5% M eOH、 CH C1中で溶出）で精製し、目的とする 2—フエノキシァセチルアミノー 6—（2—

2 2

チアゾリル )ー9ー（2—デォキシー j8— D—リボフラノシル）プリン（ィ匕合物 7a) (200mg, 9 5%)を得た。

[0056] ^H—NMR (270MHz, DMSO—d) δ 2.34 (m, 1H), 2.78 (m, 1H), 3

6

.57 (m, 2H), 3.88 (m, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.93 (t, 1H, J= 5.3Hz ), 5.12(s, 2H), 5.34 (d, 1H, J=4.0Hz), 6.42 (t, 1H, J = 6.6Hz), 6.95 (m, 3H), 7.30 (t, 2H, J = 7.5), 8.12(d, 1H, J = 3.1Hz), 8.21 (d, 1H, J = 3.1), 8.79 (s, 1H), 10.96 (s, 1H)；

1³C-NMR(68MHz, DMSO-d ) 645.67, 61.46, 67.33, 70.49,

6

83.28, 87.91, 114.34, 120.71, 125.14, 126.01, 129.30, 145.13, 145.28, 146.85, 151.89, 153.77, 157.75, 162.75 , 167.55;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 469.1

21 21 6 5

294, 測定値 469.1300; TLC Rf=0.25(CH CI： MeOH =9:1, vZv)。

2 2

[0057] 4) 2 フエノキシァセチルアミノ— 6— (2 チアゾリル)—9— (2—デォキシー 5— O—ジメ卜キシトリチルー R D リボフラノシル)プリン (化 )8a)の ( 6)

3)で合成した 2—フエノキシァセチルアミノー 6— (2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー j8—D リボフラノシル）プリン（ィ匕合物 7a) (94mg, 0.20mmol)をピリジンで 3回共沸乾燥した。次いで、 4, 4'ージメトキシトリチル塩ィ匕物（75mg, 1.1モル等量）とピリジン（2.0ml)をカ卩えて室温で 20時間撹拌した。反応溶液に酢酸ェチルと 5% Na HCOを加え分液した後、有機層を飽和食塩水で 2回洗浄した。有機層は Na SO

3 2 4 で乾燥、濃縮した後、残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH C1： EtOAc

2 2

= 1:1, vZvで溶出）で精製し、目的とする 2-フエノキシァセチルァミノ- 6— (2-チアゾリル)—9— (2—デォキシ— 5— O—ジメトキシトリチルー β D—リボフラノシル）プリン（ 1 33mg, 86%) (ィ匕合物 8a)を得た。

[0058] 'H-NMR (270MHz, CDC1 ) δ 2.39 (d, 1Η, J = 3.8), 2.64 (m, 1H),

3

2.89 (m, 1H), 3.33—3.48 (m, 2H), 3.72(s, 6H), 4.17(m, 1H), 4 .43 (bs, 2H), 4.88 (m, 1H), 6.55 (t, 1H, J = 6.4Hz), 6.74 (dd, 4H , J = 2.4, 9.0), 7.03 (d, 2H, J = 8.7), 7.08-7.37 (m, 12H), 7.64 (d, 1H, J = 3.1Hz), 8.21(d, 1H, J = 3.1), 8.29 (s, 1H) ; 13

C-NMR (68MHz, CDC1 ) 6 41. 08, 55. 16, 64. 06, 67. 76, 72.

3

58, 84. 27, 86. 38, 86. 91, 113. 01, 114. 83, 122. 33, 123. 6 0, 126. 75, 127. 17, 127. 73, 127. 98, 129. 71, 129. 85, 129 . 89, 133. 53, 135. 61, 144. 39, 144. 66, 145. 71, 148. 03, 1 51. 19, 153. 71, 156. 74, 158. 26, 163. 42, 166. 30 ;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 771.

42 239 6 7

2601, 測定値 771. 2633 ; TLC Rf=0. 22 (CH CI： MeOH = 20 : l, v/v)

2 2

[0059] 5) 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (2 チアゾリル)—9—「2—デォキシー 5— O—ジメトキシトリチルー 3— O— (N. N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフオルァミジル) - 8 D リボフラノシル Ίプリン (化合物 9a)の合成 (阅 6)

4)で合成した 2—フエノキシァセチルアミノー 6— (2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー 5— O—ジメトキシトリチルー j8— D リボフラノシル）プリン（ィ匕合物 8a) (130mg, 0. 17 mmol)をピリジンで 3回、 THFで 3回共沸乾燥した。次いで、 THF (850 μ 1)、ジイソプロピルェチルァミン（DIEA) (44 μ 1, 1. 5モル等量）をカ卩えた。この溶液に 2—シァノエチルー Ν, Ν—ジイソプロピルアミノクロロホスフルアミダイト（41 1, 1. 1モル等量 )を室温で撹拌しながら加えた。

[0060] 反応溶液は、室温で 1. 5時間撹拌した後、メタノール (50 μ 1)を加えた。この溶液に酢酸ェチル.トリェチルァミンの混合溶液（EtOAc :ΤΕΑ= 20： 1, v/v, 10ml) と 5% NaHCO (10ml)をカ卩えて分液し、有機層を飽和食塩水で 3回洗浄した。有

3

機層は Na SOで乾燥、濃縮した後、残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィーお

2 4

11じ1 :へキサン= 2 : 3, v/v, 2% TEAで溶出）で精製し、目的とする 2—フエノ

2 2

キシァセチルァミノ— 6— (2 チアゾリル)—9— (2—デォキシー 5— O—ジメトキシトリチル -3-0- (N, N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフオルァミジル)― 13 D リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 9a) (133mg, 81%, 白色泡状物）を得た。

[0061] 'H-NMR (270MHz, CDC1 ) δ 1. 09—1. 18 (m, 12H) , 2. 44 (t, 1H, J =

3

6. 6) , 2. 62 (t, 1H, J = 6. 6) , 2. 75 (m, 1H) , 2. 89 (m, 1H) , 3. 35— 3. 85 (m, 12H) , 4. 30 (m, 1H) , 4. 82 (m, 3H) , 6. 52 (t, 1H, J = 6. 4) , 6.74 (m, 4H), 7.03-7.37 (m, 14H), 7.64(d, d, 1H, J = 3.1), 8 .21(d, 1H, J = 3.1), 8.33, 8.34 (s, s, 1H)；

3¹P-NMR( 109MHz, CDC1 ) δ 149.57;

3

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O SP (M+ 1)として、計算値 97

51 56 8 8

1.3679, 測定値 971.3696; TLC Rf=0.20及び 0.26 (ジァステレオ異性体）（じ11じ1 :へキサン=3:2, v/v, 2% TEA)。

2 2

[0062] 6) 2—ァミノ一 6— (2 チアゾリル) 9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル）プリン 5，一三リン酸エステル (化合物 10a)の合成 (図 7)

2)で合成した 2 アミノー 6—（2 チアゾリル)ー9 （2—デォキシー β D リボフラノシル）プリン (ィ匕合物 6a) (33mg, 0. lOmmol)をトルエンで 3回共沸乾燥した。次いで、これにプロトンスポンジ（32mg, 0.15mmol)とトリメチルリン酸（500/zl)をカ卩えた。この溶液を氷冷下で撹拌し、 POC1 (12 1, 0. 13mmol)を滴下しながらカ卩えた。

3

[0063] 0°Cで 2時間撹拌した後、トリー n—ブチルァミン（BuN) (120 1, 0.5mmol)とビス

3

—トリブチルアンモ -ゥムピロリン酸（（BuNH) HP O ) (DMF溶液中 0.5M, 1.0

3 2 2 7

ml, 0.5mmol)を加え、 0° Cで 10分間撹拌した。この溶液に重炭酸トリェチルアンモ-ゥム（0.5M溶液， 500 1)を加えた後、 5mlの H Oを加えて DEAE Sephade

2

X A— 25カラムクロマトグラフィー（1.5x30cm, 50mM— 1.5M TEAB, 直線勾配）で精製した（粗精製物 32mg)。最終的に、 RP— HPLC (4.6x250mm, M ICRA Scientific Inc. Synchropak RPP, 流速： lmlZmin, 0%— 30% CHCN lOOmM TEAA中， 10分間，直線勾配）で精製し、目的とする 2—ァミノ

3

—6— (2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル）プリン 5，一三リン酸エステル (ィ匕合物 10a)を得た。

[0064] NMR (270MHz, DO) δ 1. ll(t, 27H, J = 7.3 Hz), 2.42 (m, 1

2

H), 2.77 (m, 1H), 3.03 (q, 18H, J = 7.3Hz), 4.09 (m, 3H), 4.28 ( m, 1H), 6.34(t, 1H, J = 6.5Hz), 7.76 (d, 1H, J = 2.5Hz), 7.99 (d, 1H, J = 2.5), 8.36 (s, 1H)；

3¹P— NMR (109MHz, DO) δ— 22.52 (t, 1H, J= 19.8 Hz) , -10.65 (

2

d, 1H, J = 20.7Hz), -9.69 (d, 1H, J= 18.3Hz) ; ESI— MS C H N O P S (M— 1)として、計算値 572. 98, 測定値 572. 94。

13 16 6 12 3

[0065] 実施例 2 複製における非天然型塩某の位置選択的導入 Klenowフラグメントによる 1ヌクレオチド揷入実験（図 8)

本実施例では、 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ活性が欠損した大腸菌由来の DNAポリメラーゼ I、 Klenowフラグメント（KF exo— )を用い、複製（2—ォキソ一（1H)ピリジン（ y)の DNA中への取り込み）における V y塩基対 (本発明）による 1ヌクレオチド取り込み効率を、 s - y塩基対 (対照)のそれと比較した。

[0066] 具体的には、 Amersham USB社の Large fragment of DNA polymerase

Exonuclease— free Klenow enzyme (Cloned)と添付の 10 X反応緩衝液 (50 OmM Tris-HCl pH 7. 5, lOOmM MgCl、 lOmM DTT, 0. 5mg/ml

2

BSA)を使用した。 KF exo—の酵素濃度は，購入したロット毎に BioRad社の Bio— R ad Protein Assayキットにより決定した。

[0067] また，反応に用いたプライマーとしては、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用した。

[0068] 5 ' -actcactatagggaggaaga-3 ' (配歹幡号 1、図 8)

反応用プライマーは T4 polynucleotide kinase (TaKaRa)と [ a - ²P] ATPを用いて、予め 5 '末端を標識し、ゲル電気泳動により精製した。

[0069] また、铸型 DNAとしては、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用した。

[0070] 5 ' -ttctctntcttcctccctatagtgagtcgtattat-3 ' (n=a又はv) (配列番号

2、図 8)

あるいは、

5 — agctctntcttcctccctatagtgagtcgtattat— 3 (n = s) (目 ΰ列番号 3、図 8)

反応条件：铸型鎖 DNA (20 Μ) 1 1、 5 '末端が³² Ρで標識されたプライマー（5 μ Μ) 4 1、および 10 X反応緩衝液 1 μ 1を混合した溶液を、 95°Cで 3分加温後、急冷してアニーリングを行い、铸型 DNAとプライマーの二本鎖を形成させた。酵素希釈用緩衝液（50mM リン酸緩衝液 pH7、 50%グリセロール、 ImM DTT)で希釈した Klenowフラグメント溶液（1 M)を 2 1カ卩えて 37°Cで 2分間インキュベーションした後、 dNTP溶液（図 7に示した A、 G、 C、 T又は yのうちの 1種）（100 M)を 2 1カ卩えて反応を開始した。 37°Cで 2分間インキュベーションした後、 10 1の 10M尿素を含む TBE溶液を加え、 75°Cで 3分間加温することで反応を終了した。反応条件はまとめると以下の通りである：铸型 Zプライマー KF exo" 200nM ; d NTP 20 /z M ;反応 37°C 2分間。

[0071] 反応溶液の一部を 20%ポリアクリルアミドー 7 M尿素ゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー（BAS2500,富士フィルム）で反応産物を解析した。結果を図 7に示す。本発明のヌクレオチド Vを含む核酸を铸型とした場合の、相補鎖 DNA中の Vに対応する位置への 1塩基取り込み実験において、 yが選択的に取り込まれた。ただし、 Cもわずかに取り込まれた。本発明の Vの yの取り込み選択性は、 sの選択性と同様であった。

[0072] ¾施例 3 複製における非天然型の位置撰択的人 Klenowフラグメントによる ίヌクレオチド揷人 ]^の ]^谏度定数の解析 (阅 9 10)

本実施例では、実施例 2と同様の Klenowフラグメントによる 1ヌクレオチド挿入反応における、反応速度定数を解析した。

[0073] 具体的には、反応プライマーとしては、 5'末端が 6— FAMで蛍光標識されたプライマー（配列番号 1、図 10)を用いた。 5'末端が蛍光標識されたプライマーは、 GeneS can用カスタム蛍光プライマーとして Applied Biosystemsから巿販されて、るものを購入し、ゲル電気泳動で精製した。反応産物の解析は DNAシークェンサ一 (App lied Bio systems ; model ABI377)で行った。

[0074] 反応条件： 2 X反応緩衝液（lOOmM Tris— HC1 pH7. 5, 20mM MgCl , 2

2 mM DTT, lOO ^ g/ml BSA)に溶かした铸型鎖 DNA (配列番号 2又は 3) (1 0 M)と蛍光標識されたプライマー（10 μ Μ)を 95°Cで 3分加温後急冷してァニーリングし、铸型鎖とプライマーの二本鎖を形成させた。この二本鎖 DNA溶液を 5 1ずつ分注した後，酵素希釈用緩衝液で希釈した KF exo—溶液（15— 250nM)を 2 μ 1 カロえて、 37°Cで 2分間インキュベートし、 DNA'酵素複合体を形成させた。その溶液に 3 1の dNTP溶液 (A、 G、じ、丁又はのぅち1種）（100 /z M— 7mM)をカ卩えて、 37 °Cで酵素反応（1. 5— 20分間）を行った。反応の終了は、 10 /z lの 20mM EDTAを含む 95%ホルムアミド溶液 (停止溶液）をカ卩えて 75°Cで 3分加温することで行った。

[0075] 反応条件をまとめると以下の通りである。溶液（10 1)中、 5 /z M 铸型ープライマー二本鎖、 3—50nM 酵素及び 30— 2100 μ M dNTPを使用。溶液（10 μ 1)は、 50 mM Tris-HCl (pH7. 5)、 10mM MgCl、 ImM DTT及び 0. 05mg/ml BS

2

Aを含む。反応は、 37°Cで 1. 5—20分間。

[0076] 反応溶液の一部を停止溶液で希釈した 50倍希釈した後、その希釈反応液 0. 5 μ 1 をローデイング溶液（脱イオンホルムアミド： 25mM EDTAを含む 50mg/mLブルーデキストラン溶液 = 5： 1) 3 1と混合し、 90°Cで 2分加熱し、氷上に置ヽて急冷した。そのうちの約 0. 5 1を 1レーンおきにシークェンスゲルにロードし電気泳動を行つた。シークェンスゲル（36cm WTR)の組成は、 6M 尿素、 8%ポリアクリノレアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド = 19 : 1)、 0. 5 XTBEである。泳動用緩衝液は， 0. 5 XTBEを用いた。 Run Moduleは、 GS Run 36C— 2400である。泳動時間は約 1時間とし、反応産物のピークパターンの解析及び定量は、 GeneScan Softwar e (Version 3. 0)を用、て行われた。

[0077] 未反応のプライマー断片，および一ヌクレオチド挿入された DNA断片のピークの高さを用いて、 1ヌクレオチド伸長されたプライマーの割合を定量し、 Hanes-Woolf plot (Goodman, M. F. , Creighton, S. , Bloom, L. B. , Petruska , J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. , 28, 83— 126 (1993) )により酵素学的パラメーター K , V を算出した。結果を表 1及び図 9に示す。

m max

[0078] [表 1]

nucleoside

efficiency template (N) triphosphdte Km ia fi Vmaxf½ miti"'V

(Vmax/Km) (N，）

V y 290 (180)» 40 (21) 1.4 x 10⁵

V T 390 (200) 2.0 (0.7) 5.1 x 10³

V c 540 (60) 22 (5) 4.1 10⁴

V G n.d.' n.d *

V A 110 (10) 0.36 (0.08) 3.3 x 10³ s y 260 (70) 9.4 (2.5) 3.6 x 10* s T 320 (30) 3.0 (0.3) 9.4 x 10³ s c 590 (230) 15 (5) 2.5 x 10⁴ s G n.d.» n.d.*

s A 86 (12) 0.26 (0.06) 3.0 X 10³

a= 標準偏差を括弧内に示した。

[0079] b= 測定されな力つた。反応は非常に非効率的であり正確な測定値は得られなかつ 7こ。

[0080] c= この値は、使用された種々の酵素濃度に対して酵素濃度（20nM)に標準化された。

[0081] d=この用語の単位は、％ min— ¹である。

[0082] 表 1及び図 9に示されたように、 Vに対する yの取り込み効率は、 VmaxZKm= l. 4 xlO⁵であった。これは、天然塩基の AZT間の取り込み効率と同程度である。また、 s に対する yの取り込み効率 (VmaxZKm= 3. 6xl0⁴)よりも、約 4倍高かった。また、選択性に関しては、 Vに対する yの取り込み効率は、 cの取り込み (VmaxZKm = 4. 1 X 10⁴)の約 3倍、 tの取り込み（VmaxZKm= 5. 1 X 10³)の 20倍以上であった。

[0083] 実施例 4 複製における非天然型塩某の位置選択的導入 Klenowフラグメントによる伸長反応（図 11-13)

本実施例では、 1塩基取り込みではなぐ Klenowフラグメント伸長反応中における相補鎖 DNA中の V対応位置への yの選択的導入にっ、て調べた。反応プライマー DNA及び铸型 DNAとしては下記のものを使用した。 [0084] プライマー

5 '— ataatacgactcactatagggag— 3 ' (酉己列番号 4、図 11)

铸型 DNA

5 — ttctcnntcttcctccctatagtgagtcgtattat— 、nn=ta、 tv、 ts, vv又は ss) (配列番号 5、図 11)

プライマーは、実施例 2と同様に [ α -³²Ρ]ΑΤΡを用いて、予め 5 '末端を標識し、ゲル電気泳動により精製した。実験 2および 3ではプライマーからの伸長の 1塩基目として y塩基が取り込まれる。これに対し、本実験では、プライマーカ伸長した数塩基先の対応する部分に铸型の Vが存在するため、伸長反応中における相補鎖 DNA中の V対応位置へ yの導入が調べられる。

[0085] 2 X反応緩衝液（20mM Tris— HC1 pH 7. 5, 14mM MgCl , 0. 2mM

2

DTT)中に溶力した铸型鎖 DNA (400nM)と 5，末端力 S³²Pで標識されたプライマー（図 11) (400nM)を 95°Cで 3分加温後急冷してアニーリングを行い、二本鎖を形成させた。この二本鎖 DNA溶液を 5 1ずつ分注した後、 dNTP溶液（図 12又は 13の各レーン中に示した組み合わせ）（50 μ Μ) 2 μ 1と水で希釈した Klenowフラグメント（K F exo+ ； TaKaRaから購入したシークェンス用 Cloned Klenow Fragment (L arge Fragment E. coli DNA Polymerase 1) 3 ^ 1 (0. 15単位）をカロえて、 3 7°Cで酵素反応を開始した。 3分間インキュベートした後、 10 1の 10 M尿素を含む TBE溶液を加えて 75°Cで 3分加温して酵素反応を終了させた。反応条件をまとめると以下の通りである：铸型/プライマー 200nM ; KF exo— 0. 015U/ μ \ ; dN TPs 10 /z M ;反応 37°C 3分間。

[0086] 反応溶液の一部を 15%ポリアクリルアミドー 7 M尿素ゲルで電気泳動して、バイオイメージングアナライザー（BAS2500, 富士フィルム）で反応産物を解析した。結果を図 12及び 13に示す。図 12において、 NN=vTにおける基質 A, G, yのレーンと、 NN= sTにおける基質 A, G, yのレーンを比較すると、 35— merのバンドの濃さから、複製の伸長反応でも、 s-y塩基対よりも v-y塩基対の方が、複製の効率が高いことがわかる。さらに、本発明の Vまたは対照の sを 2つ並べた場合の複製効率を調べた (図 13)。図 13に示されたように、 sを 2つ並べて導入した铸型 DNAを用いた場合、その部分で 2つの基質 yが取り込まれる効率は著しく低下し、 35— merの産物はほとんど得られなかった（NN = ss、 A, G, yのレーン）。これに対し、 vの場合は、これが 2 つ並んで!/、ても複製は進行し、 2つの基質 yが相補鎖 DNA中に取り込まれた産物が得られることがわかった（NN =w、 A, G, yのレーン）。

[0087] 実施例 5 転写による RNA中への rvTPの位置選択的導入（図 14—16)

本実施例では、 RNAへの転写反応による ryTPの位置選択的導入を調べた。具体的には、 Vおよび sを含む DNA (temp35N— 1と temp35N— 2 ;各 35— mer) (各々、配列番号 2及び 5)を铸型に用いて T7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行った。転写反応に必要な DNAプライマーは以下の配列のものを使用した。

[0088] T7prim21； 21—マー

5 ' -ataatacgactcactataggg-3 ' (配歹幡号 6 図 14)

铸型鎖と T7prim21 を 10mM NaClを含む 10mM Tris— HCl (pH7. 6)中で混合し，アニーリング操作により二本鎖とし，転写反応に用いた（図 14)。 T7転写反応は、 TAKARA SHUZO CO. , LTD の酵素を用いて、 20 1のスケールで行つた [T. Ohtsuki et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 4922—492 5 (2001) ]。具体的に ίま、 40mM Tris-HCl pH8. 0, 5mM DTT, 24mM MgCl , 2mM スぺノレミジン， 0. 01 % TritonX— 100, lOmM GMP, lm

2

M NTPs (図 15及び 16に示されたように、 N = G, C, U,これに ryTPを含むまたは含まない）， 2 ^ ϋί [ α -³²Ρ]ΑΤΡ, 2 μ Μ 二本鎖 DNA (铸型鎖と T7prim21) , 2 . 5U/ μ 1 Τ7 RNA ポリメラーゼ (TaKaRa)を含む反応液中で、 37°Cで 3時間ィンキュベーシヨンし、転写反応を行った。転写反応が完全に進行すれば、以下の全長配列を有する RNA産物が得られる。

[0089] 5 ' -gggaggaaganngagaa-3 ' (nn=ua、 ya又は yy) (配列番号 7 図 14) 反応液に等量の 10M尿素を含む BPBdye溶液を添加し、 75°Cで 3分加温して反応を終了させた後、 20%ポリアクリルアミドー 7 M尿素ゲルで電気泳動を行い、転写反応生成物の確認をした。 [ α—³² P]ATPによりラベルされた反応産物をバイオィメ一ジングアナライザー（BAS2500,富士フィルム）で解析した。結果を、図 15及び 1 6に示す。 T7 RNAポリメラーゼによる転写（図 14)での sTを含む铸型に対する基質 yの RNA中への取り込み効率は、天然型塩基対 (AT)の場合に比べて 50— 60% 程度であった。これに対し vTを含む铸型に対する基質 yの取り込み効率は 96%であり、天然型塩基対とほぼ同程度の高い転写効率を示した（図 15)。

[0090] また、铸型中に sを 2つ並べた場合（NN = ss)、 2つの yが取り込まれた RNA中は得れな力つた。これに対し、铸型中に Vが 2つ並んでいる場合 (NN=w)は転写が進行し、その効率は 30%程度であった力 2つの基質 yが RNA中に取り込まれた（図 16)

[0091] 実施例 6 2—ァミノ— 6 (4—メチルー 2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー β D リボフ

。、ノ誘導体の合成 (闵5— 7)

1) 2—トリブチルスズー 4ーメチルチアゾール（化合物 3b)の合成（図 5) アルゴン雰囲気中—78°Cに冷却したジェチルエーテル（25ml)に 4ーメチルチアゾール（ィ匕合物 2b) (455 1, 5. Ommol)をカ卩えた後、 n ブチルリチウム（へキサン中 1. 58M, 3. 2ml, 5. Ommol)を滴下し 78。Cで 30分携枠した。この溶液に塩ィ匕トリブチルスズ（1. 5ml, 5. 5mmol)を 78°Cで滴下し室温まで撹拌しながら自然に昇温した（30分)。この反応溶液を飽和食塩水で 3回洗浄した後、有機層を MgSOで

4 乾燥後、溶媒を除去して 2 トリプチルスズー 4ーメチルチアゾール (ィ匕合物 3b) (黄色の液体)を得た。化合物 3bは、さらなる精製は行わずに、そのまま次の反応に用いた

[0092] 2) 2—ァミノ一 6— (4—メチルー 2—チアゾリル) 9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル)プリン (化合物 6b)の合成（図 5)

1)で合成した 2 トリブチルスズー 4ーメチルチアゾール (化合物 3b)と 2 アミノー 6—トシルォキシー9 ( 2—デォキシー3 , 5—ジ—O—tert—ブチルジメチルシリル β—D—リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 4)から実施例 1の化合物 6aの合成と同様にして目的物 6bを得た。 2工程の収率 78%。

[0093] NMR (270MHz, DMSO— d ) δ 2. 27 (m, 1H) , 2. 49 (s, 3H) , 2. 65

6

(m, 1H) , 3. 56 (m, 2H) , 3. 85 (m, 1H) , 4. 39 (m, 1H) , 4. 96 (br s, 1H) , 5. 30 (br s, 1H) , 6. 30 (t, 1H, J = 6. 8Hz) , 6. 73 (br s, 2H) , 7. 57 (s, 1H ) , 8. 40 (s, 1H)； ¹³C—NMR (68MHz, DMSO—d) δ 17.08, 61.55, 70.58, 82.56,

6

87.57, 118.76, 122.64, 141.51, 147.31, 154.02, 154.69, 159.70, 162.79;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 349.1

14 17 6 3

083, 測定値 349.1063;

UV— vis(EtOH中） max= 232nm( ε =17600), 311nm( ε =8260), 361nm( ε =9020), min= 267nm( ε =2750), 334nm( ε =6740)； TLC Rf=0.20 (CH CI： MeOH = 9:l, v/v)₀

2 2

[0094] 3) 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (4—メチルー 2—チアゾリル)— 9— (2—デォキシ - β D リボフラノシル)プリン (化合物 7b)の合成（図 6)

2)で合成した 2 アミノー 6— (4 メチル—2 チアゾリル)—9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 6b)から実施例 1の化合物 7aの合成と同様にして目的物 7bを得た。収率 95%。

[0095] ^Η— NMR (300MHz, DMSO—d ) δ 2.35 (m, 1Η), 2.51 (s, 3H), 2.

6

80 (m, 1H), 3.59 (m, 2H), 3.89 (m, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.92 (t, 1 H, J = 5.4Hz), 5. 12 (s, 2H), 5.35 (d, 1H, J=4.1Hz), 6.43 (t, 1H, J =6.7Hz), 6.97 (m, 3H), 7.31 (t, 2H, J = 7.5Hz), 7.70 (s, 1H), 8 .78 (s, 1H), 10.96 (s, 1H)；

1³C-NMR(75MHz, DMSO—d) δ 17.01, 61.49, 67.33, 70.54,

6

83.38, 87.99, 114.46, 120.13, 120.85, 126.13, 129.44, 145.31, 147.03, 152.09, 153.84, 154.75, 157.95, 161.77 , 167.65;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H NOS (M+ 1)として、計算値 483.

22 23 6 5

1451, 測定値 483.1414;

TLC Rf=0.23 (CH CI： MeOH = 9:l, v/v)₀

2 2

[0096] 4) 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (4—メチルー 2—チアゾリル)— 9— (2—デォキシ —5— O—ジメトキシトリチルー β D—リボフラノシル）プリン (化合物 8b)の合成（図 6) 3)で合成した 2—フエノキシァセチルアミノー 6— (4ーメチルー 2 チアゾリル)ー9 （2— デォキシー β D リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 7b)から実施例 1の化合物 8aの合成と同様にして目的物 8bを得た。収率 99%。

[0097] NMR (270MHz, CDC1 ) δ 2.65 (s, m, 3H, 1H), 2.86 (m, 1H),

3

3.34-3.47 (m, 2H), 3.72 (s, 6H), 4.18 (m, 1H), 4.69 (br s, 2H) , 4.87 (m, 1H), 6.59 (t, 1H, J = 6.3Hz), 6.74 (dd, 4H, J = 2.0, 8.9 Hz), 7.00-7.38 (m, 15H), 8.28 (s, 1H), 9.12 (br s, 1H) ;

¹³C-NMR(68MHz, CDC1 ) δ 17.73, 40.49, 55.21, 60.41, 63.

3

98, 67.90, 72.47, 84.43, 86.35, 86.49, 113.07, 114.86, 119.27, 122.26, 123.63, 126.79, 127.31, 127.74, 127.9 9, 129.72, 129.89, 135.57, 135.61, 144.41, 148.27, 149 .72, 151.39, 153.40, 155.90, 156.92, 158.35, 162.02, 1 66.11;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 785.2

43 41 6 7

757, 測定値 785.2715;

TLC Rf =0.48 (CH CI： MeOH = 9:l, vZv)。

2 2

[0098] 5) 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (4—メチルー 2—チアゾリル)— 9— [2—デォキシ —5— O—ジメトキシトリチルー 3— O— (N, N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフォルァミジル) j8— D—リボフラノシル]プリン (ィ匕合物 9b)の合成（図 6)

4)で合成した 2—フエノキシァセチルアミノー 6— (4ーメチルー 2 チアゾリル)ー9 （2— デォキシー 5— O—ジメトキシトリチルー β D リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 8b)から実施例 1の化合物 9aの合成と同様にして目的物 9bを得た。収率 81%。

[0099] 'H-NMR (300MHz, CDC1) δ 1.09—1.13 (m, 12H), 2.38 (t, 1H, J = 6

3

.5Hz), 2.57(t, 1H, J = 6.5Hz), 2.60 (s, 3H), 2.70 (m, 1H), 2.8 Km, 1H), 3.34 (dd, 2H, J=4.1, 13.6Hz), 3.68 (s, 6H), 3.49—3. 83 (m, 4H) , 4.24 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.74 (br s, 2H), 6.46 (t , 1H, J = 6.4Hz), 6.69 (m, 4H), 6.96—7.33 (m, 15H), 8.25, 8.2 7(s, s, 1H), 8.94 (br s, 1H)；

31

P-NMR(121MHz, CDC1 ) δ 149.09;

3 HRMS(FAB, 3-NBA matrix) C H N O PS (M+ 1)として、計算値 985.

52 58 8 8

3836, 測定値 985. 3973;

TLC Rf=0. 38及び 0. 25 (ジァステレオ異性体）（CH C1： hexane = 3:2, v/

2 2

[0100] 実施例 7 2—ァミノ— 6 (5—メチルー 2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー β D リボフ

。、ノ誘導体の合成 (闵5— 7)

1) 2—トリブチルスズー 5—メチルチアゾール（化合物 3c)の合成（図 5)

5—メチルチアゾール (ィ匕合物 2c)から実施例 6の化合物 3bの合成と同様にして目的物 3cを得、さらなる精製は行わずに、そのまま次の反応に用いた。

[0101] 2) 2—ァミノ一 6— (5—メチルー 2—チアゾリル) 9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル)プリン (化合物 6c)の合成（図 5)

1)で合成した 2 トリブチルスズー 5—メチルチアゾール (化合物 3c)と 2 アミノー 6—トシルォキシー9 ( 2—デォキシー3 , 5—ジ—O—tert—ブチルジメチルシリル β—D—リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 4)から実施例 1の化合物 6aの合成と同様にして目的物 6cを得た。 2工程の収率 81%。

[0102] iH—NMR (270MHz, DMSO— d ) δ 2. 26 (m, 1H), 2. 54 (s, 3H), 2. 6

6

4(m, 1H), 3. 55 (m, 2H), 3.84 (m, 1H), 4. 38 (m, 1H), 4. 96 (t, 1 H, J = 5. 5Hz), 5. 30 (d, 1H, J=4.0Hz), 6. 29 (t, 1H, J = 6. 8Hz), 6. 68 (br s, 2H), 7.80 (s, 1H), 8. 38 (s, 1H)；

1³C— NMR(68MHz, DMSO— d) δ 11. 78, 61. 57, 70.61, 82. 52,

6

87. 57, 122. 52, 138.00, 141.44, 142.88, 147. 57, 154.61, 159.65, 162.03;

HRMS (FAB, 3-NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 349. 1

14 17 6 3

083, 測定値 349. 1125;

UV— vis(EtOH中） lmax= 232nm( ε =17040), 307nm( ε =11100) , 361nm( ε =10430), min= 267nm( ε =3980), 333nm( ε =742 0);

TLC Rf=0. 15 (CH CI： MeOH = 9:l, v/v)₀

2 2 [0103] 3) 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)— 9— (2—デォキシ - β D リボフラノシル)プリン (化合物 7c)の合成（図 6)

2)で合成した 2—ァミノ— 6— (5 メチル—2 チアゾリル)—9— (2—デォキシー β D—リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 6c)から実施例 1の化合物 7aの合成と同様にして目的物 7cを得た。収率 95%。

[0104] 'H-NMR (300MHz, DMSO— d ) δ 2.35 (m, 1H), 2.59 (s, 3H), 2.7

6

9(m, 1H), 3.59 (m, 2H), 3.89 (m, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.93 (t, 1 H, J = 5.4Hz), 5. 14 (s, 2H), 5.35 (d, 1H, J = 3.9Hz), 6.43 (t, 1H, J =6.7Hz), 6.97 (m, 3H), 7.31 (t, 2H, J = 7.8Hz), 7.92 (s, 1H), 8 .77 (s, 1H), 10.91 (s, 1H)；

1³C-NMR(75MHz, DMSO— d ) δ 11.76, 61.49, 67.40, 70.55,

6

83.32, 87.98, 114.48, 120.83, 125.93, 129.43, 139.52, 143.61, 145.20, 147. 17, 152.05, 153.81, 157.95, 160.95 , 167.80;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 483.1

22 23 6 5

451, 測定値 483.1489;

TLC Rf=0. 18 (CH CI： MeOH = 9:l, v/v)₀

2 2

[0105] 4) 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)— 9— (2—デォキシ —5— O—ジメトキシトリチルー β D—リボフラノシル）プリン (化合物 8c)の合成（図 6)

3)で合成した 2—フエノキシァセチルアミノー 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)—9— (2— デォキシー β D リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 7c)から実施例 1の化合物 8aの合成と同様にして目的物 8cを得た。収率 94%。

[0106] 'H-NMR (300MHz, CDC1 ) δ 2.54 (s, 3Η), 2.58 (m, 1H), 2.83 (m

3

, 1H), 3.28-3.42 (m, 2H), 3.67(s, 6H), 4.12 (m, 1H), 4.68 (bs , 2H), 4.82 (m, 1H), 6.52(t, 1H, J = 6.3Hz), 6.69 (dd, 4H, J = 2.5 , 8.8Hz), 6.96-7.32 (m, 14H), 7.81 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.96 (br s, 1H)；

13

C-NMR (75MHz, CDC1 ) δ 12.28, 40.43, 55.18, 60.39, 64

3 .00, 67.98, 72.56, 84.40, 86.39, 86.54, 113. 15, 114.98 , 122.36, 123.72, 126.90, 127.10, 127.85, 128. 10, 129. 83, 129.98, 130.00, 135.69, 135.73, 135.94, 139.39, 14 4. 17, 144.45, 144.53, 148.59, 149.86, 151.44, 153.54, 157.15, 158.51, 161.71;

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O S (M+ 1)として、計算値 785.2

43 41 6 7

757, 測定値 785.2794;

TLC Rf=0.35 (CH CI： MeOH = 9:l, v/v)₀

2 2

[0107] 5) 2 フエノキシァセチルァミノ— 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)— 9— [2—デォキシ —5— O—ジメトキシトリチルー 3— O— (N, N—ジイソプロピル 2—シァノエチルホスフォルァミジル)— j8— D—リボフラノシル]プリン (ィ匕合物 9c)の合成（図 6)

4)で合成した 2—フエノキシァセチルアミノー 6—（5—メチルー 2 チアゾリル)ー9 （2— デォキシー 5— O—ジメトキシトリチルー β D リボフラノシル)プリン (ィ匕合物 8c)力も実施例 1の化合物 9aの合成と同様にして目的物 9cを得た。収率 74%。

[0108] 'H-NMR (300MHz, CDC1 ) δ 1.10—1.12(m, 12H), 2.38 (t, 1H, J =

3

6.5Hz), 2.54 (s, 3H), 2.56 (t, 1H, J = 6.5Hz), 2.68 (m, 1H), 2. 83 (m, 1H), 3.32 (m, 2H), 3.67(s, 6H), 3.47—3.83 (m, 4H), 4.2 4(m, 1H), 4.70 (m, 1H), 4.76 (br s, 2H), 6.45 (t, 1H, J = 6.6Hz) , 6.69 (m, 4H), 6.96—7.33 (m, 14H), 7.80 (s, 1H), 8.24, 8.25 (s, s, 1H), 8.83 (br s, 1H)；

3¹P-NMR(121MHz, CDC1 ) δ 149.03;

3

HRMS (FAB, 3— NBA matrix) C H N O PS (M+ 1)として、計算値 985.

52 58 8 8

3836, 測定値 985.3972;

TLC Rf=0. 19及び 0.12(ジァステレオ異性体）（CH C1： hexane = 3:2, v/

2 2

v, 2%TEA) .

Claims

請求の範囲

[1] 2 アミノー 6— (2 チアゾリル）プリン 9ーィル基、又は、 2 アミノー 6— (2—ォキサ：ル）プリン 9ーィル基、ここにおいて、チアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z 又は 5位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

[2] チアゾリル基の 4位及び Z又は 5位は置換されていてもよい、 2 アミノー 6— (2 チアゾリル)プリン 9 ィル基を塩基として有する、請求項 1に記載のヌクレオシド、ヌクレォチド又はそれらの誘導体。

[3] チアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z又は 5位が低級アルキル基で置換されている、請求項 1又は 2に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

[4] 2—ァミノ— 6— (2 チアゾリル）プリン 9ーィル基、 2—ァミノ— 6— (4—メチルー 2 チアゾリル）プリン— 9 ィル基又はアミノー 6— (5—メチル—2 チアゾリル）プリン 9ーィル基を塩基として有する、請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載のヌクレオシド、ヌクレォチド又はそれらの誘導体。

[5] 以下の

viii) 2—ァミノ— 6— (4—メチル—2 チアゾリル)—9— ( β—D リボフラノシル）プリンリン酸エステル； ix) 2—ァミノ— 6— (5—メチルー 2—チアゾリル)—9— (2—デォキシー β—D—リボフラノシル）プリン；

力なるグループ力も選択される、請求項 1ないし 4のいずれ力 1項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

[6] ホスホロアミダイト誘導体である、請求項 1ないし 5のいずれ力 1項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。

[7] 請求項 1な、し 6の、ずれか 1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸。

[8] 請求項 1ないし 6のいずれ力 1項に記載のヌクレオチドと、 5位置換若しくは非置換 2 ォキソ（1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項 7に記載の核酸。

[9] tRNA、 mRNA、アンチセンス DNA若しくは RNA、リボザィム又はァプタマ一として使用される、請求項 7に記載の核酸。

[10] タンパク質、ペプチド全体又は一部をコードする、請求項 7に記載の核酸。

[11] 5位置換若しくは非置換 2 ォキソ（ 1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法であって、

2—ァミノ— 6— (2 チアゾリル）プリン 9ーィル基、又は、 2—ァミノ— 6— (2 ォキサゾリル）プリン 9ーィル基、ここにおいて、チアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z 又は 5位は置換されてヽてもよヽ、を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を铸型として転写、複製又は逆転写を行い、前記 2 アミノー 6— (2 チアゾリル)プリン 9ーィル基、又は、 2 アミノー 6—（2—才キサゾリル)プリン 9ーィル基、を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、 5位置換若しくは非置換- 2-ォキソ（1H)-ピリジン- 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込む

ことを含む、前記方法。

[12] 铸型にお!、て、前記 2 アミノー 6— (2 チアゾリル)プリン 9ーィル基、又は、 2 アミノー 6— (2—ォキサゾリル)プリン 9 ィル基を有するヌクレオチド力 2又はそれより多く隣接して配置される、請求項 11に記載の方法。

[13] 2—ァミノ— 6— (2 チアゾリル）プリン 9ーィル基、又は、 2—ァミノ— 6— (2 ォキサゾリル）プリン 9ーィル基、ここにおいて、チアゾリル基又はォキサゾリル基の 4位及び Z 又は 5位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、並びに

5位置換若しくは非置換 2 ォキソ（ 1H) ピリジン 3 ィル基を塩基として有するヌクレ才チド

を含む、請求項 11又は 12の方法に使用するためのキット。