JPH11507950A

JPH11507950A - 置換核酸模倣体

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Publication number: JPH11507950A
Application number: JP9531960A
Authority: JP
Inventors: ニールセン，ペーター・エー; クリステンセン，レイフ; ハンセン，ヘンリク・フリュデンルン
Original assignee: ペーター・エー・ニールセン
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 1999-07-13
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: AU2072397A; US7825215B1; WO1997032888A1; JP3452584B2; EP0885238A4; EP0885238A1; US7569659B1

Abstract

(57)【要約】核酸の核酸模倣体による決定のための組成物および方法が提供される。本組成物および方法は疾患状態へ関係するとされているタンパク質をコードする核酸の調節を通して疾患の診断および処置に使用されるであろう。好適な態様に従うと、模倣体は修飾されたヘテロ環式塩基が結合された天然には存在しない主鎖を含んでいる。そのような塩基は好適には主鎖への結合部位から１、２または３原子離れて立体的にかさばった置換基を持っている。

Description

【発明の詳細な説明】置換核酸模倣体発明の分野本発明は三重鎖形成を少なくするまたは防止するために化学基で置換された一つまたはそれ以上のヘテロ環式塩基残基を含む核酸模倣体の合成および使用に関する。この効果は三重鎖形成を避けるアンチセンスまたはプローブ試薬の設計に使用できる。背景技術本分野において、核酸模倣体の塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含み、核酸に結合する能力を持つ、天然に存在するリボ核酸またはデオキシリボ核酸主鎖以外の主鎖に結合した核酸塩基を含んでいるいくつかの核酸模倣体が知られている。これらの内、例えばＷＯ９２／２０７０２に記載されているようなペプチド核酸（ＰＮＡ）のみが、治療および診断試薬としての使用の可能性が示されている。このことは相補的核酸塩基配列の核酸（ＮＡ）へ、対応する野生型核酸により示されるよりも高い親和性で結合するそれらの能力によるものであろう。ＰＮＡの独特の特性の一つは対応するＰＮＡ−ＮＡ二重鎖よりも安定なＰＮＡ₂ −ＮＡ三重鎖を形成する能力である。この能力はＰＣＲクランピング（ＷＯ９３／２５７０６）を含む種々の目的には利点として使用できる。しかしながら、配列選択は三重鎖形成配列に偏らせるであろうので、そのような選択を必要とする応用においてはいくつかの欠点が存在する。発明の目的核酸と三重鎖を優先的に形成しない置換核酸模倣体を提供するのが本発明の目的である。核酸の配列選択的決定のための方法を提供するのも本発明の更なる目的である。疾患状態の存在を起こすまたは示すと疑われるタンパク質をコードしている核酸の発現を調節できる治療、診断および研究試薬を提供するのも本発明のまた更なる目的である。発明の簡単な説明本発明に従うと、主鎖に結合されている塩基原子から１、２または３原子離れている位置が立体的にかさばった置換基により置換されている一つまたはそれ以上のヘテロ環式塩基を含む核酸模倣体が提供される。核酸鎖および核酸鎖に相補的な塩基配列を持つ核酸模倣体の二つの鎖からなる三重鎖構造の形成を避けるための方法もさらに提供される。そのような方法は、核酸／核酸模倣体二重鎖の形成に適した条件下、核酸および核酸模倣体の混合物をインキュベートすることを含んでいる。もし三重鎖で核酸へ結合されたならばお互いにきわめて接近した場所に位置する、立体的にかさばった置換基を核酸模倣体上に提供することにより三重鎖の形成が避けられる。本発明に従うと、主鎖に結合されている塩基原子から１、２または３原子離れている位置が置換されている核酸模倣体を提供することにより核酸の決定のための方法が提供される。該核酸模倣体は、核酸模倣体および核酸間の二重鎖の形成に適した条件下、核酸とインキュベートされる。二重鎖の発生は核酸の同一性または存在に関連している。哺乳類において疾患状態を引き起こすことが疑われるタンパク質をコードしている核酸の発現を調節するための核酸模倣体を本発明は提供する。本発明の核酸模倣体は治療用、診断用および研究用試薬として使用できる。本発明の一つの好ましい特色は、本明細書に記載したように置換された核酸模倣体が対応する非置換核酸模倣体に比較して良好な効率および識別力を持ちながら二重鎖を形成する能力を実質的に保持していることである。図の簡単な説明図１はＮ⁴位が置換されたシトシンを含むＰＮＡ単量体の代表的な合成の概要図である。図２はＰＮＡのＮ⁴置換シトシンおよびＤＮＡのグアノシン間のワトソン−クリック塩基対生成の概要図である。発明の詳細な説明本発明に従うと、核酸との三重鎖形成を避けるのに有用な新規化合物が提供される。本発明に従った核酸模倣体は天然には存在しない主鎖に結合された修飾ヘテロ環式塩基（好適には天然に存在する塩基、例えば、”野生型”核酸に見出されるもの）の配列を持つ分子である。核酸模倣体は相補的塩基配列を持つ核酸を塩基対により結合する。好適な核酸模倣体は、塩基残基が主鎖のアミン窒素原子を通して主鎖へ結合されている分子である。核酸模倣体に好適な主鎖構造はＷＯ９２／２０７０２、１９９３年４月２６日に出願された米国特許出願番号第０８／０５４，３６３号、１９９４年１２月２８日に出願された米国特許出願番号第０８／３６６，２３１号に記載されている。上に参照した開示は本明細書において援用される。本発明の核酸模倣体のヘテロ環式塩基は水素結合により核酸の核酸塩基と塩基対を形成できるヘテロ環式基である。三重鎖形成の場合においては、２種類の相互作用が含まれている：ワトソン−クリック結合およびフーグスティーン結合。ＰＮＡおよびＮＡ間の三重鎖形成はＷＯ９５／０１３７０に記載されている。用語”ヘテロ環式基”または”ヘテロ環式塩基”には天然に存在するプリンおよびピリミジン核酸塩基が含まれる。本発明の目的には、用語”ピリミジン”はその置換基に関わりなく任意の１，３−ジアジンを示している。天然に存在するピリミジン核酸塩基はシトシン、チミンおよびウラシルである。天然に存在するプリン核酸塩基はアデニンおよびグアニンを含んでいる。用語”ヘテロ環式基” または”ヘテロ環式塩基”はまた天然には存在しない核酸塩基も含んでいる。天然には存在しない塩基の例は、核酸塩基の任意の環原子が別の原子で置き換えられている塩基である。例えば、ＣＨはＮで置き換えられていてもよく、逆もまた同様である。天然には存在しない塩基の別の例は、天然に存在する塩基の２−および４−置換基が逆になっている塩基である。天然に存在するおよび天然には存在しないピリミジン塩基の構造が以下に示されている（左から三番目の構造はプソイド−イソシトシンとして知られている天然には存在しないピリミジン塩基の構造である）：本発明において、ヘテロ環式基はヘテロ環の特定の環位置で主鎖に結合されている。置換された天然に存在する核酸塩基の場合、この位置は好適には窒素原子により占められている。本発明に従うと、主鎖へのヘテロ環式基の結合位置から１、２または３原子離れている位置で、ヘテロ環式基へ立体的にかさばった置換基を結合できる。ピリミジン塩基の場合、環位置４、５および６と通常番号付けがなされている位置が好適である。かさばった置換基の結合には４−位が最も好適である。置換基が５−および６−位に結合されている場合、三重鎖形成にいくらかの影響も生じるであろうが、この場合、置換基は４位に位置している置換基よりも立体的によりかさばっていなければならない。天然には存在しない塩基の場合、空間的配向においてビリミジン４、５および６位に対応する位置がまた好適である。天然には存在しない塩基の５位での置換の場合、シトシンのような天然に存在する塩基と同じように三重鎖形成はｐＨ依存性である。二重鎖形成はどの場合もｐＨにより影響されないようである。上に示したのはＲで示された置換基を持つヘテロ環式塩基の構造である。各々のＲは独立してＨ、−ＮＯ、−ＮＯ₂、−ＳＯ₃、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＰＯ₃ ^2- 、−ＣＯＯＨ、−Ｒ’、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｏ−Ｒ’、−Ｓ− Ｒ’、−Ｎ（Ｒ’）₂、−Ｃ（Ｒ’）₃、−Ｃ（＝Ｘ）（Ｒ’）、Ｃ（＝Ｘ）（− Ｙ−Ｒ’）、Ｓ（＝Ｚ）_1-2（−Ｙ−Ｒ’）であり、式中、ＺはＯであり、ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり、およびＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、少なくとも一つのＲは立体的にかさばった基である。好適なかさばった基は３つの非水素原子またはそれ以上を含んでおり、最も好適なかさばった基は６つの非水素原子またはそれ以上を含んでおり、好適には環式および／または芳香族基である。これらの好適の定義は少なくとも一つの置換基が水素と異なっている場合に適用されることが本発明の説明から明らかになるであろう。２またはそれ以上のＲ基がかさばっている場合、阻害を達成するための空間的要求性は減少するであろう（例えば、６原子から３原子へ）。Ｒ基はアシル基、特に芳香族アシル基であるのが望ましい。アシル基がピリミジン塩基の４位の窒素原子に結合されていることが特に望ましい。特に好適なアシル基はベンゾイル基である。Ｒ’は好適にはＨ；アルキル、アルケニルまたはアルキニル（各々１−５０のＣ原子を持っている）；アリール、ナフチル、ビフェニルまたはトリル（各々６ −５０のＣ原子を持っている）から選択される。これらの基は直鎖または分岐鎖、対称または非対称、キラルまたはアキラルでもよく、およびＮ、ＮＨ、Ｓ、およびＯから選択される一つまたはそれ以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、および縮合芳香環系でもよい。Ｒ’はピリジル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリル、アクリジニル、イミダゾリル、ピロリル、フラニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリルまたはビオチニルから選択されるヘテロ環式基であり、任意の利用可能な位置に結合または融合されているであろう。Ｒ’は、三重鎖阻害効果を促進するまたはそれに有用である一つまたはそれ以上の低級有機残基（１０炭素原子まで）またはその誘導体で好適には置換されているであろう。これらはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ナフチル、ビフェニル、トリル、ベンジルのような基、および−ＮＯ、−ＮＯ₂、−ＳＯ₃、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＰＯ₃ ^2-、−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉのような基である。本発明の化合物はＷＯ９２／２０７０２に記載されている方法に従って都合よく製造できる。特に好適な合成法は、第一工程において、立体的にかさばった置換基（好適には結合された反応性基および／または単量体主鎖ユニットへの修飾塩基の結合のためのリンカー基、例えば保護Ｎ−アミノエチルグリシン、も持っている）により置換された塩基の合成を使用する。第二工程において、前もって形成されたおよび保護された単量体主鎖ユニットの窒素原子へリンカー基を通して塩基が結合される。第三工程において、塩基含有単量体が他の塩基含有単量体主鎖ユニットとのオリゴマー化のために準備される、例えば、主鎖ユニットの一つの末端での保護基の切断および／またはオリゴマー化のためのこの末端の活性化。第四工程において、塩基含有単量体は、相補的核酸との二重鎖形成の相補性のための配列要求性に依存してオリゴマー化される。単量体主鎖の合成の間、活性基に適した保護基で保護されるであろう好適な単量体主鎖ユニットは下記の一般式の化合物である：式中：Ｒ¹は−ＣＯＯＰ¹、−ＮＨＰ¹、−〇Ｐ¹またはＳＰ¹（式中、Ｐ¹は水素または保護基である）で置換されたＣ₁−Ｃ₄アルキルであり；Ｒ²は−ＣＯＯＰ²、−ＮＨＰ²、−ＯＰ²またはＳＰ²（式中、Ｐ²は水素または保護基である）で置換されたＣ₁−Ｃ₄アルキルであり；Ｍはリンカーにより窒素に結合されている、天然に存在するまたは天然には存在しないヘテロ環式基であり、該リンカーは１−３原子の長さである；およびＲ³は少なくとも３またはそれ以上の非水素原子を含む立体的にかさばった置換基である。Ｒ³で置換されていない単量体はＷＯ９２／２０７０２に記載されている。好適な場合、Ｒ¹は基−ＣＯＯＰ¹を含んでおり、およびＲ²は基−ＮＨＰ²を含んでおり、ここで保護基（Ｐ¹およびＰ²）はお互いに異なった反応条件下で切断可能である。例えば、ある好適な態様において、ペプチド核酸主鎖が用いられる。そのような主鎖は一般式（Ｉ）を持っている：式中：ｎは少なくとも２であり、Ｌ¹−Ｌⁿの各々は独立して水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に存在する核酸塩基、天然には存在しない核酸塩基、芳香族残基、ＤＮＡインターカレーター、核酸塩基結合基、ヘテロ環式基およびレポーターリガンドから成る群より選択され、Ｌ¹−Ｌⁿの少なくとも一つは本明細書で説明したような立体的にかさばった置換基で置換された天然に存在するまたは天然には存在しない核酸塩基であり；Ｃ¹−Ｃⁿの各々は（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり、式中、Ｒ⁶は水素でありおよびＲ⁷は天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖から成る群より選択され、またはＲ⁶およびＲ⁷は独立して水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴およびＳＲ⁵から成る群より選択され（式中、Ｒ³およびＲ⁴は前に定義した通りであり、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−またはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである）、またはＲ⁶およびＲ⁷は一緒になって脂環式またはヘテロ環式系を完成し；Ｄ¹−Ｄⁿの各々は（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は前に定義した通りである；ｙおよびｚの各々はゼロまたは１から１０までの整数であり、ｙ＋ｚの合計は２より大きいが１０より大きくはなく；Ｇ¹−Ｇ^n-1は−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり（両方の配向で）、式中Ｒ³は前に定義した通りである；Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿの各々の対は：（ａ）Ａは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）または（ＩＩｃ）の群であり、およびＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺である；または（ｂ）Ａは式（ＩＩｄ）の群であり、およびＢはＣＨであるように選択され；式中：ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり；Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり；ｐおよびｑの各々はゼロまたは１から５までの整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０を超えない；ｒおよびｓの各々はゼロまたは１から５までの整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０を超えない；Ｒ¹およびＲ²の各々は独立して水素、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−で置換されている（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから成る群より選択され；Ｇ¹−Ｇ^n-1の各々は−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−または− ＮＲ³ＳＯ₂−であり（両方の配向で）、式中Ｒ³は前に定義した通りである；Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ’’、−ＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ’’、または−Ｃ〇₂Ｈまたは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；およびＩは−ＮＨＲ’’’Ｒ’’’’または−ＮＲ’’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’’であり、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は独立して水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭化水素、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチドおよび可溶性および不溶性ポリマーから成る群より選択される。ある態様において、少なくとも一つのＡは式（ＩＩｃ）の基であり、およびＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺である。別の態様において、Ａは式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の基であり、ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺であり、およびｙまたはｚの少なくとも一つは１または２ではない。いくつかの好適なペプチド核酸は一般式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を持っている：式中：各々のＬは独立して、水素、フェニル、立体的にかさばった置換基で置換されたものを含むヘテロ環式塩基残基、または天然に存在する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基の群からなる群より選択され；各々のＲ⁷'は水素および天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖から成る群より選択され；ｎは１から６０の整数であり；ｋ、ｌおよびｍの各々は独立してゼロまたは１から５までの整数であり；ｐはゼロまたは１であり、Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；およびＲ¹はＨまたはＣＯＣＨ₃である。特に好適であるのは式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を持つ化合物であり、式中、各々のＬは独立して核酸塩基チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）から成る群より選択され、特にその一つまたはそれ以上は本発明に従って立体的にかさばった置換基で修飾されており、ｋおよびｍはゼロまたは１であり、およびｎは１から３０、特に４から２０までの整数である。本発明のペプチド核酸は、液相または固相の両方で標準ペプチド合成法を適用することにより合成できる。使用されたシントンは特に標準保護基で保護された単量体アミノ酸またはそれらの活性化誘導体である。オリゴヌクレオチド類似体もまた対応する二酸および二アミンを用いることにより合成できる従って、前記の式のＰＮＡ内へ取り込むために有用な単量体シントンには、下記の一般式を持つアミノ酸、二酸および二アミンから成る群より選択されるシントンが含まれる：式中、Ｌ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは前に定義したとおりであるが、ただしそれらの中のアミノ基はアミノ保護基により保護されているであろう；ＥはＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ＯＨまたはそれらの活性化誘導体であり；およびＦはＮＨＲ³またはＮＰｇＲ³であり、式中Ｒ³は前に定義したとおりであり、およびＰｇはアミノ保護基である。本発明に従った好適な単量体シントンは式（ＶＩＩＩａ）−（ＶＩＩＩｃ）：を持つもの、またはそれらのアミノ保護および／または酸末端活性化誘導体を含んでおり、式中Ｌは水素、フェニル、ヘテロ環式基、天然に存在する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基から成る群より選択され；およびＲ⁷'は水素および天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖から成る群より選択される。キラルなＰＮＡ主鎖もまた本発明で有用である。そのような主鎖は好適には二つまたはそれ以上の単量体（少なくともその一つは脂肪族環式構造を含んでいる）から誘導される。そのような単量体の代表的なものは下記の式を持っている：式中：Ｂは本発明に従って立体的にかさばった置換基で置換されている天然に存在するまたは天然には存在しない核酸塩基であり；ＣαおよびＣβの少なくとも一つはＳ立体配置であり；およびｎは０、１、２または３である。好適な態様において、ＣαおよびＣβはＳ立体配置である。本発明のさらに好適な態様において、Ｂはアデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルである。より好適な態様において、ｎは２である。さらに好適な態様において、ペプチド核酸オリゴマーは、主鎖のエチル部分のキラル中心を含む（２−アミノエチル）グリシン主鎖を持つ少なくとも一つのペプチド核酸単量体を含んでいる。単量体はペプチド核酸オリゴマー内の標的分子中の変異性の領域に対応する位置に取り込まれる。一つの核酸模倣体は、一つまたはそれ以上の前記のように修飾された核酸塩基を含むことができる。一つの核酸模倣体内の立体的にかさばった置換基を含む核酸塩基の数を増加させると、二重鎖形成能力を保持したまま三重鎖形成を阻害することが観察された。三重鎖形成の阻害を達成するために、立体的にかさばった置換基が結合されるヘテロ環式塩基が核酸に結合された場合に（三重鎖の形成）お互いに近接して位置されるように核酸模倣体および立体的にかさばった置換基の結合位置が選択される。好適には核酸模倣体上の置換塩基は、仮定の三重鎖において同じ側に位置していなければならない、すなわち、核酸鎖の同じ核酸塩基との塩基対形成。模倣体の置換塩基が核酸鎖上の同一の塩基と塩基対形成する場合は”妨害した”と呼ばれるであろう。立体的にかさばった置換基の使用により阻害される様式でのみ三重鎖形成を起こすことができるように模倣体の塩基配列および配向を選ぶことにより、置換された塩基は核酸鎖上の前もって決められた塩基との塩基対生成を達成できる。本発明の化合物は核酸決定のための方法に使用でき、主鎖に結合されている塩基の原子から１、２または３原子離れている位置が置換されている核酸模倣体を含み、該核酸模倣体および該核酸間の二重鎖形成に適した条件下で該核酸模倣体および該核酸をインキュベートし、該核酸の存在の尺度として該二重鎖の存在を決定する。これらの方法は従来の技術で使用された化合物を本明細書に記載した化合物に置き換えることによりＷＯ９２／２０７０３（本明細書において援用される）に記載された原理に従って機能すると信じられる。核酸模倣体の末端の一つが、または主鎖または塩基部分の任意の位置がレポーター基で標識されている核酸模倣体を使用するのが特に好適である。合致するレポーター基は検出可能な基（例えば、フルオレセインのような蛍光基）、または続いての工程でレポーター基に結合されるさらに別の化合物により検出可能な基である。例えば、もし立体的にかさばった置換基がビオチン基またはビオチン基を含む基であるならば、核酸模倣体およびそれにより核酸が、ハイブリッドに検出可能なストレプタビジンを加えることにより決定できる。このインキュベーションに先だって、過剰のビオチン標識核酸模倣体を除去しておくことが望まれる。続いてレポーター基は当業者には知られた手段により検出される。本発明は、疾患状態を持つ患者からの細胞または組織試料中の疾患の原因となるタンパク質発現の検出に適している。本発明を用いたタンパク質発現の阻害に多くのアッセイが処方されるであろうが、そのようなアッセイは一般に、そのような阻害の検出、および通常は定量を可能にするように選択された条件下、細胞または組織試料と本発明の核酸模倣体を接触させることを含んでいるであろう。以下に記載するように、フルオレセイン標識核酸模倣体を製造し、疾患の原因となるタンパク質の発現が疑われる細胞または組織試料と接触させる。次に試料を洗浄して非結合核酸模倣体を除去する。試料中に残存する蛍光は（蛍光定量法により検出および定量される）結合した核酸模倣体を示している（それは順に疾患の原因となるタンパク質をコードしている核酸の存在を示している）。本発明の化合物は標的分子への結合に有用である。本発明の標的分子は種々の生物学的に重要な分子を含むことができる。そのような標的分子は、哺乳類における疾患状態の原因となるおよび／または維持するのに関係するであろうタンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの重要な領域のような核酸鎖であろう。そのような別の標的分子は転写因子である。標的分子は炭化水素、糖タンパク質または他のタンパク質でもよい。いくつかの好適な態様において、標的分子は免疫グロブリン、受容体、受容体結合リガンド、抗原または酵素のようなタンパク質であろうし、より明確にはホスホリパーゼ、腫瘍壊死因子、内毒素、インターロイキン、プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインキナーゼ、細胞接着分子、リポキシゲナーゼ、加水分解酵素またはアシル基転移酵素であろう。本発明の別の態様において、標的分子はヒト免疫不全ウイルス、カンジダ、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、リノウイルス、肝炎ウイルスまたはインフルエンザウイルスの重要な部分であろう。本発明のさらに別の態様において、標的分子は癌遺伝子の領域であろう。以下の実施例は本発明をさらに例示しているが、それらに制限されることを意図しているものではない。実施例実施例１Ａ．典型的な一般合成ホスホロアミデートはＣｒｕａｃｈｅｍ（ＵＫ）から購入され、ＤＮＡオリゴマーはＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７００ＤＮＡ合成機で組み立てられた。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴＰＮＡ単量体はＢｉｏｓｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から購入された。Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンはＢｉｏｓｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から購入された。すべてのＰＮＡオリゴマーは改良メリーフィールド法（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｒ．，Ｇｉｌｄｅａ，Ｂ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｂ．ａｎｄＣｏｕｌｌ，Ｊ．（１９９４），ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓａｎｄＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ Sｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒ．Ｅｐｔｏｎ，Ｅｄ．，ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，（１９９５），Ｊ．Ｐｅｐ．Ｓｃｉ．，３，１７５）により、注文製作されたＰＮＡ合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）で合成され、逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＰＮＡオリゴマーはＦＡＢ⁺ＭＳにより確認された。Ｂ．Ｔ_m測定ＧｕｉｌｆｏｒｄＲｅｓｐｏｎｓｅ分光光度計を用い、２６０ｎｍで温度に対する吸光度が測定された。加熱速度は５−９０℃で０．５℃／分であった。ＰＮＡオリゴマーは１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭＥＤＴＡを含み、必要に応じて５、７または９にｐＨを調節した媒質塩緩衝液中で相補的ＤＮＡ配列とハイブリダイズされた。試料はＴ_m測定に先立って９０℃に５分間加熱され、徐々に２０℃まで冷却され、４℃で３０分放置された。Ｃ．修飾シトシン単量体の合成（ｉ）ベンゾイルシトシン−１−イルアセテート（１）図１を参照し、４００ｍＬのＤＭＦに溶解したシトシン（２０ｇ，０．１８ｍｏｌ）に７．２ｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＮａＨ（油分散液、６０％）が加えられた。混合物は５０℃に加熱し、窒素雰囲気下で２時間攪拌した。室温まで冷却後、２時間以上かけて２９ｍＬ（１．１当量）のブロモ酢酸ベンジルを加えた。一夜攪拌後、黒ずんだ懸濁液を濾過し、濾液を冷ＤＭＦおよび０．２Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した。生成物（１）はエタノールから結晶化させた。収量：３７ｇ（７９％）。¹ＨＮＭＲ（ｄ₆−ＤＭＳＯ）：δ ４．５６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂Ｏ），５．２４（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂Ｏ），５．７７（ｄ，１Ｈ，Ｈ₅），７．２０（ｄｄ，２Ｈ，ＮＨ₂），７．４５（ｍ，５Ｈ，芳香族），７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｈ₆）。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ２６０（Ｍ＋Ｈ）⁺（計算値２６０）。（ｉｉ）（Ｎ⁴−（ベンゾイル）シトシン−１イル）酢酸（２）（１）のピリジン（１０ｍＬ）溶液に６．６ｇ（４７ｍｍｏｌ）のベンゾイルクロリドを加え、室温で一夜攪拌した。減圧下で溶液を蒸発させた。残渣は１ＭＫＯＨに溶解して３時間攪拌した後、濃ＨＣｌでｐＨを２に調整した。目的化合物（２）が沈澱した。収量：９．３ｇ（９０％）。¹ＨＮＭＲ（ｄ₆−ＤＭＳＯ）：δ ４．５９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂Ｏ），７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｈ₅），７．５−８．２（７Ｈ，芳香族，ＮＨ，Ｈ₆）。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ２７３（Ｍ＋Ｈ）⁺（計算値２７３）。（ｉｉｉ）Ｎ−（Ｎ⁴−（ベンゾイル）シトシン−１−イル）アセチル）−Ｎ −（２−Ｂｏｃアミノエチル）グリシン（３）４．８ｇ（２２ｍｍｏｌ）のメチルＮ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシネート（２）、２．４ｇ（１４．７ｍｍｏｌ）のベンジルオキシカルボニルクロリド、２．９ｇ（１４．９ｍｍｏｌ）のＤＣＣおよび２．４ｇ（１４．７ｍｍｏｌ）のＤｈＢｔＯＨを５０ｍＬのＤＭＦに溶解し、室温で４時間攪拌した。ジクロロメタン（１００ｍＬ）を加え、混合物は３ｘ０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム、２ｘ１Ｍ硫酸水素ナトリウムおよび食塩水で抽出した。有機相は硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で蒸発乾固させた。残渣を２ＭＫＯＨに溶解し、１時間攪拌した後、１ＭＨＣｌでｐＨを２に調整すると目的化合物が沈澱した。生成物（３）はメタノール：酢酸エチル：ヘキサン（１：２：２）から結晶化した。収量：４．２ｇ（６０％）。¹ＨＮＭＲ（ｄ₆−ＤＭＳＯ）：δ １．４５および１．４７（ｄ，９Ｈ，Ｂｏｃ），３．２８−３．５３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂ ），４．０８および４．３１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＯ），４．７５および４．９５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＯ），６．８３および７．０３（ｍ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ），７．３８（ｍ，１Ｈ，Ｈ₅），７．５７−８．１０（ｍ，６Ｈ，芳香族およびＨ₆）。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ４７４（Ｍ＋Ｈ）⁺（計算値４７４）。実施例２三重鎖阻害ホモピリミジンペプチド核酸のハイブリダイゼーション特性に対するベンゾイル化シトシン（Ｃ^Bz）の効果が研究された。ＰＮＡ１、Ｈ−ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ₂が合成され、６位にＣ^Bz（ＰＮＡ２）または６および８位（ＰＮＡ３）または５および６位（ＰＮＡ４）に二つのＣ^Bz基を含んでいる。これらのＰＮＡは相補的オリゴヌクレオチドと平行（ＯＤＮ１）または逆平行（ＯＤＮ２）コンフィギュレーションでハイブリダイズされ、生じた複合体の熱安定性（Ｔ_m）がｐＨ５、７および９で決定された。結果は表１に示されている。温度に対する吸光度の曲線は１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭＥＤＴＡ中、２６０ｎｍで測定された。加熱速度：５−９０℃で０．５℃／分。括弧内のＴ_mは２６０ｎｍでの吸光度を測定しながら９０℃から１０℃へ冷却することにより得られた。オリゴデオキシヌクレオチド： ODN1= 5'-AAAAGGAGAG-3'；配列ＩＤ番号：１ ODN2= 5'-GAGAGGAAAA-3'；配列ＩＤ番号：２核酸模倣体： PNA1= H-TTTTCCTCTC-LysNH₂；配列ＩＤ番号：３ PNA2= H-TTTTCC^BzTCTC-LysNH₂；配列ＩＤ番号：４、式中C^BzはNである PNA3= H-TTTTCC^BzTCTC^Bz-LysNH₂；配列ＩＤ番号：５、式中C^BzはNである PNA4= H-TTTTC^BzC^BzTCTC-LysNH₂；配列ＩＤ番号：６、式中C^BzはNである。非修飾ＰＮＡ１は期待された挙動を示した。第一に、シトシンプロトン化を必要とするＰＮＡ₂−ＤＮＡ三重鎖形成と一致する明白なｐＨ依存性が観察された。第二に平行複合体はｐＨ５および７で最も高い安定性を示したが、ｐＨ９では示さなかった。これらの結果は、ｐＨ５および７では三重鎖が最も安定な複合体であるが、一方、ｐＨ９では（逆平行）二重鎖がより安定であることを示唆している。ｐＨ７での三重鎖形成は、このｐＨで観察された明白なヒステレシス（〜２７℃）とも一致している。一つのＣ^Bz残基を含んでいるＰＮＡ２はヒステレシスにより判断されるようにｐＨ５では明らかにまた三重鎖を形成するが、Ｔ_mはＰＮＡ１複合体よりも低かった（〜３０℃）。従って、ベンゾイル基は本当に効率がいい三重鎖形成を妨害しているように思われる。この効果は特にｐＨ７で明白である。わずかなヒステレシスのみしか観察されず、特に逆平行複合体はより高い安定性を示し、それはよりアルカリ性条件（ｐＨ９）でも減少しなかった。これらの結果は、このＰＮＡに対してはｐＨ７で最も安定な複合体である二重鎖が有利であることを強く主張している。ＰＮＡ１およびＰＮＡ２との複合体はｐＨ９で等しい熱安定性を示し（即ち二重鎖に対して）、従って、Ｃ^Bz残基はＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中のワトソン−クリック塩基対形成を妨害しないことを示している。この結論はＰＮＡオリゴマーＨ −ＡＧＴＣＡＣＣＴＡＣ−ＬｙｓＮＨ₂（ＰＮＡ５）およびＨ−ＡＧＴＣ^Bz ＣＴＡＣ−ＬｙｓＮＨ₂（ＰＮＡ６）を用いる混合プリン／ピリミジン配列を含むＣ^Bzによる実験により支持され、それは表２に示されている。温度に対する吸光度の曲線は１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７中で、２６０ｎｍにて測定された。加熱速度：５− ９０℃で０．５℃／分。括弧内のＴ_mは２６０ｎｍでの吸光度を測定しながら９０℃から１０℃へ冷却することにより得られた。系のヒステレシスはＴ_m（１０ −９０°）およびＴ_m（９０−１０°）間の相違である。オリゴデオキシヌクレオチド：ＯＤＮ３＝５’−ＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴ−３’；配列ＩＤ番号：７ＯＤＮ４＝５’−ＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴ−３’；配列ＩＤ番号：８核酸模倣体：ＰＮＡ５＝Ｈ−ＡＧＴＣＡＣＣＴＡＣ−ＬｙｓＮＨ₂；配列ＩＤ番号：９ＰＮＡ６＝Ｈ−ＡＧＴＣＡＣ^BzＣＴＡＣ−ＬｙｓＮＨ₂；配列ＩＤ番号：１０、式中Ｃ^BzはＮである。これらの両方のオリゴマーともそれらの逆平行オリゴヌクレオチド標的と高度に安定な二重鎖を形成する。これらの複合体の化学量論はジョブ−プロットにより両方の場合とも１：１複合体であることが決定された。ＰＮＡ５およびＰＮＡ６とＯＤＮ３間の複合体のＴ_mにおける有意ではない相違は実験誤差範囲内であり、図２に示された構造の証拠として解釈でき、それによるとベンゾイル基はワトソン−クリック塩基対形成を妨害しない主グルーブ内に位置している。このことはＤＮＡ鎖中のシトシンの反対側に位置している（Ｇ→Ａ）不適正がＰＮＡ５およびＰＮＡ６両方に対してＴ_mの１５−１６°の低下を生じさせることとも完全に一致している。実験条件下、三重鎖と二重鎖を区別する重要な特色は、高い温度から低い温度へ行く場合に二重鎖で得られた非常に小さなヒステレシス（２ °未満）であり、それに対しＰＮＡ：ＤＮＡ三重鎖は明白なヒステレシスを典型的には２０−３０°の範囲で示した（表２）。このことはＰＮＡ６とＯＤＮ３またはＯＤＮ４間の複合体についても明らかであり、１−２℃のヒステレシスが観察された。ＰＮＡ６で得られた小さなヒステレシスはまた、ベンゾイル基は結合速度論を有意に妨害しないことも示している。実施例３フルオレセインへの核酸模倣体の結合遊離アミノ残基を持つ核酸模倣体をＴＨＦ：Ｈ₂Ｏに溶解して０．１Ｍの核酸模倣体の溶液を調製する。核酸模倣体溶液にフルオレセインイソチオシアネートを加えて、０．１−１．０Ｍのフルオレセインイソチオシアネート溶液とする。得られた反応混合物は０．１−２時間攪拌し、減圧下で濃縮する。残渣は分取用ＨＰＬＣにより精製する。実施例４突然変異体β−アミロイド前駆体タンパク質遺伝子発現（βＡＰＰ）の検出 β−アミロイドをコードする遺伝子の点突然変異は家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）に関係するとされている。核酸模倣体は前記実施例３に例示したように、フルオレセインまたは他の蛍光性標識で標識される。蛍光性標識核酸模倣体は、異常βＡＰＰをコードする核酸に対する核酸模倣体の特異的ハイブリダイゼーションに適した条件下、異常βＡＰＰ発現が疑われる細胞または組織試料と接触させる。次に試料を洗浄して非結合核酸模倣体を除去する。試料中に残存する標識は結合核酸を示しており、それは蛍光光度計、蛍光顕微鏡または他の通常の手段により定量される。 βＡＰＰ遺伝子中の点突然変異を発現していると疑われる細胞または組織の第一の試料は、βＡＰＰｍＲＮＡの突然変異体コドン７１７、コドン６７０またはコドン６７１を標的とするフルオレセイン標識核酸模倣体とインキュベートされる。細胞または組織の第二の同一の試料は、特異的ハイブリダイゼーションが起こりうる条件下、正常βＡＰＰｍＲＮＡの同一の領域を標的とする第二の標識核酸模倣体とインキュベートする。次に試料を洗浄して非結合核酸模倣体を除去する。試料中に残存する標識は結合核酸を示しており、それは蛍光光度計または他の通常の手段を用いて定量される。もし第一の試料が標識核酸模倣体を保持し、第二の試料が標識核酸模倣体を保持しないならば、突然変異体βＡＰＰの存在が示される。実施例５突然変異体Ｈ−ｒａｓ遺伝子発現の検出Ｈ−ｒａｓ遺伝子中の点突然変異はｒａｓ経路の多くの異常に関係するとされている。核酸模倣体は前記実施例３に例示したように、フルオレセインまたは他の蛍光性標識で標識される。標識核酸模倣体は、特異的ハイブリダイゼーションが起こりうる条件下、異常ｒａｓ発現が疑われる細胞または組織試料と接触させる。次に試料を洗浄して非結合核酸模倣体を除去する。試料中に残存する標識は結合核酸（すなわち、突然変異体ｒａｓをコードしているもの）を示しており、それは蛍光光度計、蛍光顕微鏡または他の通常の手段により定量される。Ｈ−ｒａｓ遺伝子中の点突然変異を発現していると疑われる第一の細胞または組織試料は、突然変異体Ｈ−ｒａｓｍＲＮＡのコドン１２、コドン１３またはコドン６１を標的とするフルオレセイン標識核酸模倣体とインキュベートされる。細胞または組織の第二の同一の試料は、特異的ハイブリダイゼーションが起こりうる条件下、正常Ｈ−ｒａｓｍＲＮＡの同一の領域を標的とする第二の蛍光性標識核酸模倣体とインキュベートする。次に試料を洗浄して非結合核酸模倣体を除去する。試料中に残存する標識は結合核酸を示しており、それは蛍光光度計または他の通常の手段を用いて定量される。もし第一の試料が蛍光を示し、第二の試料が蛍光を示さないならば、突然変異体Ｈ−ｒａｓの存在が示される。実施例６核酸模倣体による遺伝子発現の阻害パピローマウイルスのＥ２ｍＲＮＡの発現を阻害する核酸模倣体の能力を試験する好適なアッセイはよく知られているＥ２のトランス活性化特性に基づいている。Ｓｐａｌｈｏｌｔｚｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１，２１２８（１９８７）。レポータープラスミド（Ｅ２ＲＥ１ＣＡＴ）は、Ｅ２依存性エンハンサーとして機能するＥ２応答性要素を含むように構築される。Ｅ２ＲＥ１ＣＡＴはまたＳＶ４０初期プロモーター、初期ポリアデニル化シグナルおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子も含んでいる。このプラスミドの文脈において、ＣＡＴ発現はＥ２の発現に依存している。Ｅ２の存在に依存するＣＡＴ発現の依存は、ＢＰＶ−１で形質転換したＣ１２７細胞、非感染Ｃ１２７細胞およびＥ２ＲＥ１ＣＡＴおよびＥ２発現ベクターで同時トランスフェクトした細胞内へのこのプラスミドのトランスフェクションにより試験された。Ａ．ＢＰＶ−１Ｅ２発現の阻害：ＢＰＶ−２形質転換Ｃ１２７細胞を１２ウェルプレートに播種する。Ｅ２ＲＥ１ＣＡＴでのトランスフェクションに先だつ２４時間前に、細胞を最終濃度５、１５および３０ｍＭになるように増殖培地に相補的核酸模倣体を加えることにより前処理する。次の日、細胞をリン酸カルシウム沈澱により１０μｇのＥ２ＲＥ１ＣＡＴでトランスフェクトする。Ｅ２ＲＥ１ＣＡＴ（１０μｇ）および坦体ＤＮＡ（ＰＵＣ１９、１０μｇ）を６２μＬの２ＭＣａＣｌ₂と混合して最終容量を２５０μＬのＨ₂Ｏとし、続いて２５０μ Ｌの２ｘＨＢＳＰ（１．５ｍＭＮａ₂ＰＯ₄、１０ｍＭＫＣｌ、２８０ｍＭＮａＣｌ、１２ｍＭグルコースおよび５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）を加え、室温で３０分間インキュベートする。この溶液（１００μＬ）を各々の試験ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートする。インキュベーション後、室温で１分間、１５％グリセロールを含む０．７５ｍＭＮａ₂ＰＯ₄、５ｍＭＫＣｌ、１４０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭグルコースおよび２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、で細胞にグリセロールショックを与える。ショックを与えた後、細胞は無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、１０％ウシ胎児血清および本来の濃度の核酸模倣体を含有ＤＭＥＭで再給餌した。トランスフェクションして４８時間後、細胞を採取し、ＣＡＴ活性をアッセイする。ＣＡＴ活性の決定のため、細胞をリン酸緩衝化塩溶液で２回洗浄し、かき取りにより集める。細胞は１００μＬの２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、３回凍結−融解させて破壊する。この細胞抽出液（２５μＬ）を各々のアッセイに使用する。各々のアッセイのため、下記のものを１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内で一緒に混合し、１時間３７℃でインキュベートする：２５μＬの細胞抽出液、５ μＬの４ｍＭアセチル補酵素Ａ、１８μＬのＨ₂Ｏおよび１μＬの¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール、４０−６０ｍＣｉ／ｍＭ。インキュベーション後、クロラムフェニコール（アセチル化および非アセチル化型）を酢酸エチルで抽出し、蒸発乾固する。試料は２５μＬの酢酸エチルに再懸濁し、ｔｌｃプレートにスポットしてクロロホルム：メタノール（１９：１）でクロマトグラフィーを行う。クロマトグラムはオートラジオグラフィーにより分析する。アセチル化および非アセチル化¹⁴Ｃ−クロラムフェニコールに対応するスポットをｔｌｃプレートから切り出し、ＣＡＴ活性の定量のため液体シンチレーションにより計数する。核酸模倣体は用量応答様式でＣＡＴ活性を低下させ、陽性の効果を持っていると考えられる。Ｂ．ＨＰＶＥ２発現の阻害：核酸模倣体によるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２阻害のためのアッセイは本質的にＢＰＶ−１Ｅ２のためのアッセイと同じである。ＨＰＶアッセイのためには、適当なＨＰＶを前記のようなリン酸カルシウム法を用いてＰＳＶ２ＮＥＯとともにＣＶ−１かまたはＡ４３１細胞内へ同時トランスフェクトする。ＤＮＡを取り込んだ細胞は、抗生物質Ｇ４１８を含む培地中での培養により選択する。Ｇ４１８耐性細胞は次にＨＰＶＤＮＡおよびＲＮＡを分析する。Ｅ２を発現している細胞が相補性研究の標的細胞として使用される。各々の核酸模倣体に対し、細胞は前記のように調製され、Ｅ２ＲＥ１ＣＡＴでトランスフェクトされて前記のようにＣＡＴ活性が分析される。核酸模倣体は、もしそれらが用量応答様式でＣＡＴ活性を低下できるなら陽性効果を持つと考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月８日【補正内容】請求の範囲１．転写因子、炭水化物およびタンパク質からなる群より選択される少なくとも一つの標的分子核酸との混合物中の核酸模倣体であって、前記模倣体は複数のヘテロ環式塩基が結合された天然には存在しない主鎖構造を含み、前記塩基の少なくとも一つは、前記塩基の主鎖への結合の位置から１、２または３原子離れた位置において少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で置換されていることを特徴とする核酸模倣体。２．前記立体的にかさばった置換基が、−Ｒ’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）₂、-Ｃ（Ｒ’）₃、-Ｃ（＝Ｘ）（Ｒ’）、−Ｃ（＝Ｘ）（−Ｙ−Ｒ’）またはＳ（＝Ｏ）_1-2（−Ｙ−Ｒ’）：［式中、ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり；そしてＲ’は少なくとも３原子を含み、かつＨ、Ｃ₁−Ｃ₅₀−アルキル、Ｃ₂−Ｃ₅₀−アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₅₀−アルキニル、Ｃ₇−Ｃ₅₀−アルキル−アリール、Ｃ₆−Ｃ₅ ₀ −アリール、Ｃ₁₀−Ｃ₅₀−ナフチル、Ｃ₁₂−Ｃ₅₀−ビフェニル、Ｃ₇−Ｃ₅₀−アリール−アルキル、ピリジル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリル、アクリジニル、ピロリル、フラニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリルまたはビオチニルであり、ここでＲ’は、一つまたはそれ以上の−ＮＯ、−ＮＯ₂、−ＳＯ₃−、−ＣＮ、− ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＰＯ₃ ^2-、−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび −Ｉで置換されていてもよい］である、請求項１記載の核酸模倣体。３．前記塩基が天然に存在するまたは天然には存在しないピリミジン塩基である、請求項１記載の核酸模倣体。４．前記立体的にかさばった置換基が、前記天然に存在するピリミジン塩基のＣ−６、Ｃ−５またはＮ−４に結合されている、請求項３記載の核酸模倣体。５．前記立体的にかさばった置換基が、前記天然に存在するピリミジン塩基のＮ−４に結合されている、請求項４記載の核酸模倣体。６．前記天然に存在するピリミジン塩基がシトシンである、請求項５記載の核酸模倣体。７．前記立体的にかさばった置換基が、（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ”［式中、Ｒ”はＣ₁ −Ｃ₂₀−アルキルまたはＣ₆−Ｃ₁₈−アリールである］である、請求項５記載の核酸模倣体。８．前記立体的にかさばった置換基が、（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ₆Ｈ₅である、請求項７記載の核酸模倣体。９．核酸の決定のための方法であって、核酸模倣体を提供し；前記核酸模倣体および前記核酸を、前記核酸模倣体と前記核酸との間の二重鎖の形成に適した条件下でインキュベートし；そして前記核酸の存在の指標として前記二重鎖の存在を決定する；の各工程を含み、前記核酸模倣体は、複数のヘテロ環式塩基が結合された天然には存在しない主鎖構造を含み、前記塩基の少なくとも一つは、主鎖への前記塩基の結合位置から１、２または３原子離れた位置が少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で置換されていることを特徴とする方法。１０．一般式：式中、Ｒ¹は、少なくとも一つの−ＣＯＯＰ¹、−ＮＨＰ¹、−ＯＰ¹または−ＳＰ¹基を有するＣ₁−Ｃ₄−アルキルであり；Ｐ¹は水素または保護基であり；Ｒ²は、−ＣＯＯＰ²、−ＮＨＰ²、−ＯＰ²または−ＳＰ²で置換されたＣ₁−Ｃ₄ アルキルであり、ここで、Ｐ²は水素または保護基であり；Ｍは、炭素数１−３個のリンカーによりＮに結合されている、天然に存在するまたは天然には存在しないヘテロ環式基であり；そしてＲ³は、３個またはそれ以上の非水素原子を含む立体的にかさばった置換基である］を有する、核酸模倣体を製造するための化合物。１１．式（Ｉ）：［式中、ｎは少なくとも２であり、Ｌ¹−Ｌⁿの各々は、独立して、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に存在する核酸塩基、天然には存在しない核酸塩基、芳香族残基、ＤＮＡインターカレーター、核酸塩基結合基、ヘテロ環式基、およびレポーターリガンドからなる群より選択され、Ｌ¹−Ｌⁿの少なくとも一つは、少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で置換された前記塩基であり；Ｃ¹−Ｃⁿの各々は、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_y（ここで、Ｒ⁶は水素であり、Ｒ⁷は、天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶およびＲ⁷ は、独立して、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴およびＳＲ⁵からなる群より選択され、ここで、Ｒ³およびＲ⁴は上で定義したとおりであり、Ｒ⁵は、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、あるいはＲ⁶およびＲ⁷は、一緒になって脂環式系またはヘテロ環式系を完成し；Ｄ¹−Ｄⁿの各々は、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_z（ここで、Ｒ⁶およびＲ⁷は上で定義したとおりである）であり；ｙおよびｚの各々は０または１から１０までの整数であり、ｙ＋ｚの合計は２より大きいが１０より大きくはなく；Ｇ¹−Ｇ^n-1の各々は、いずれの向きでもよい、−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、 −ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり、ここでＲ³は上で定義したとおりであり；Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿの各々の対は、（ａ）Ａは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）または（ＩＩｃ）の基であり、かつＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺であり；または（ｂ）Ａは式（ＩＩｄ）の基でありかつＢはＣＨである；であるように選択され：Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり；Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり；ｐおよびｑの各々は、０または１から５までの整数であり；ｒおよびｓの各々は０または１から５までの整数であり；Ｒ¹およびＲ²の各々は、独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選択され；Ｇ¹−Ｇ^n-1の各々は、いずれの向きでもよい、−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、 −ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり、ここでＲ³は上で定義したとおりであり；Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ''、−ＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ''、または−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そしてＩは、−ＮＨＲ'''Ｒ''''または−ＮＲ'''Ｃ（Ｏ）Ｒ''''、ここで、Ｒ'、Ｒ'' 、Ｒ'''およびＲ''''は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチドおよび可溶性および不溶性ポリマーからなる群より選択される］を有する、請求項１記載の核酸模倣体。１２．前記標的分子が核酸である、請求項１１記載の核酸模倣体。１３．前記立体的にかさばった置換基が、−Ｒ’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）₂、−Ｃ（Ｒ’）₃、−Ｃ（＝Ｘ）（Ｒ’）、−Ｃ（＝Ｘ）（−Ｙ−Ｒ’ ）またはＳ（＝Ｏ）_1-2（−Ｙ−Ｒ’）：［式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；Ｙは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；そしてＲ’は少なくとも３原子を含み、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₅₀−アルキル、Ｃ₂−Ｃ₅₀−アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₅₀−アルキニル、Ｃ₇−Ｃ₅₀−アルキルーアリール、Ｃ₆−Ｃ₅₀− アリール、Ｃ₁₀−Ｃ₅₀−ナフチル、Ｃ₁₂−Ｃ₅₀−ビフェニル、Ｃ₇−Ｃ₅₀−アリール−アルキル、ピリジル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリル、アクリジニル、ピロリル、フラニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリルまたはビオチニルであり、ここで、Ｒ’は、一つまたはそれ以上の、−ＮＯ、−ＮＯ₂、−ＳＯ₃-、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、− ＰＯ₃ ^2-、−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉで置換されていてもよい］である、請求項１１記載の核酸模倣体。１４．前記塩基が天然に存在するまたは天然には存在しないピリミジン塩基である、請求項１１記載の核酸模倣体。１５．前記立体的にかさばった置換基が、前記天然に存在するピリミジン塩基のＣ−６、Ｃ−５またはＮ−４に結合されている、請求項１４記載の核酸模倣体。１６．前記立体的にかさばった置換基が、前記天然に存在するピリミジン塩基のＮ−４に結合されている、請求項１５記載の核酸模倣体。１７．前記天然に存在するピリミジン塩基がシトシンである、請求項１６記載の核酸模倣体。１８．前記立体的にかさばった置換基が（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ”（式中Ｒ”はＣ₁− Ｃ₂₀−アルキルまたはＣ₆−Ｃ₁₈−アリールである）である、請求項１６記載の核酸模倣体。１９．前記立体的にかさばった置換基が（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ₆Ｈ₅である、請求項１８記載の核酸模倣体。２０．式（ＩＩＩａ）：［式中、各々のＬは、独立して、立体的にかさばった一つまたはそれ以上の基で置換されているものを含む、水素、フェニルおよびヘテロ環式塩基残基、ならびに、天然に存在する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基からなる群より選択され、少なくとも一つのＬは、少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で置換されている前記塩基であり；各々のＲ⁷'は、独立して、水素および天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖からなる群より選択され；ｎは、１から６０までの整数であり；ｋ、ｌおよびｍの各々は、独立して、０または１から５までの整数であり；ｐは、０または１であり；Ｒ^hは、ＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そしてＲⁱは、ＨまたはＣＯＣＨ₃である］を有する請求項１１記載の核酸模倣体。２１．式（ＩＩＩｂ）：［式中、各々のＬは、独立して、立体的にかさばった一つまたはそれ以上の基により置換されているものを含む水素、フェニルおよびヘテロ環式塩基残基、ならびに天然に存在する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基からなる群より選択され、少なくとも一つのＬは、少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で置換されている前記塩基であり；各々のＲ⁷'は、独立して、水素および天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖からなる群より選択され；ｎは１から６０までの整数であり；ｋ、ｌおよびｍの各々は、独立して、０または１から５までの整数であり；ｐは０または１であり；Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そしてＲⁱはＨまたはＣＯＣＨ₃である］を有する、請求項１１記載の核酸模倣体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．複数のヘテロ環式塩基が結合された天然には存在しない主鎖構造を含む核酸模倣体であって、該塩基の少なくとも一つは、主鎖への該塩基の結合位置から１、２または３原子離れた位置が少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で置換されていることを特徴とする核酸模倣体。２．該立体的にかさばった置換基が−Ｒ’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ ’）₂、−Ｃ（Ｒ’）₃、−Ｃ（＝Ｘ）（Ｒ’）、−Ｃ（＝Ｘ）（−Ｙ−Ｒ’）またはＳ（＝Ｏ）_1-2（−Ｙ−Ｒ’）であり、式中：ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり；および式中Ｒ’は少なくとも３原子を含んでおり、およびＨ、Ｃ₁−Ｃ₅₀−アルキル、Ｃ₂−Ｃ₅₀−アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₅₀−アルキニル、Ｃ₇−Ｃ₅₀−アルキル−アリール、Ｃ₆−Ｃ₅₀−アリール、Ｃ₁₀−Ｃ₅₀−ナフチル、Ｃ₁₂−Ｃ₅₀−ビフェニル、Ｃ₇−Ｃ₅₀−アリール−アルキル、ピリジル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリル、アクリジニル、ピロリル、フラニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリルまたはビオチニルであり、式中Ｒ’は一つまたはそれ以上の−ＮＯ、−ＮＯ₂、−ＳＯ₃ ^-、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ₂、 −ＳＨ、−ＰＯ₃ ^2-、−ＣＯＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉで置換可能である請求項第１項に記載の核酸模倣体。３．該塩基が天然に存在するまたは天然には存在しないピリミジン塩基である請求項第１項に記載の核酸模倣体。４．該立体的にかさばった置換基が該天然に存在するピリミジン塩基のＣ− ６、Ｃ−５またはＮ−４に結合されている請求項第３項に記載の核酸模倣体。５．該立体的にかさばった置換基が該天然に存在するピリミジン塩基のＮ− ４に結合されている請求項第４項に記載の核酸模倣体。６．該天然に存在するピリミジン塩基がシトシンである請求項第５項に記載の核酸模倣体。７．該立体的にかさばった置換基が（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ’’（式中、Ｒ’’はＣ₁ −Ｃ₂₀−アルキルまたはＣ₆−Ｃ₁₈−アリールである）である請求項第５項に記載の核酸模倣体。８．該立体的にかさばった置換基が（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ₆Ｈ₅である請求項第７項に記載の核酸模倣体。９．核酸決定のための方法であって、核酸模倣体を提供し；該核酸模倣体および該核酸間の二重鎖の形成に適した条件下、該核酸模倣体および該核酸をインキュベートし；該核酸の存在の尺度として該二重鎖の存在を決定する；の各工程を含み、該核酸模倣体は複数のヘテロ環式塩基が結合された天然には存在しない主鎖構造を含んでおり、該塩基の少なくとも一つは、主鎖への該塩基の結合位置から１、２または３原子離れた位置が少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で置換されていることを特徴とする方法。１０．一般式：式中：Ｒ¹は少なくとも一つの−Ｃ〇〇Ｐ¹、−ＮＨＰ¹、−ＯＰ¹または−ＳＰ¹基を持つＣ₁−Ｃ₄アルキルであり；Ｐ¹は水素または保護基である；Ｒ²は−ＣＯＯＰ²、−ＮＨＰ²、−ＯＰ²または−ＳＰ²で置換されたＣ₁−Ｃ₄アルキルであり、式中、Ｐ²は水素または保護基である；Ｍは１から３の炭素リンカーによりＮに結合されている、天然に存在するまたは天然には存在しないヘテロ環式基であり；およびＲ³は３またはそれ以上の非水素原子を含む立体的にかさばった置換基である；を有する、核酸模倣体製造のための化合物。