JPH02502283A - ヌクレオチド・プローブのアクリジニウムエステル標識および精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオチド・プローブのアクリジニウムエステル標識および精製これは、１９ ８７年ｌＯ月５日に提出された出願番号第１０５０８０号の一部継続出願である 。

発明の分野 この発明は、診断用試薬に検出可能な標識を結合させる方法および組成物に関す るものである。さらに詳しくは、この発明は、診断用ハイブリダイゼーシヨン・ アッセイで使用される化学発光性アクリジニウムエステルによるヌクレオチド・ プローブの標識および精製に関するものである。

λ肌且背員 先行技術 この２０年間、広範な種類の薬剤が臨床診断および研究アッセイにおいて標識と して使用されてきた。さらに最近では、特有のポリヌクレオチド配列の存在を高 感度で検出するための）＼イブリダイゼーション・アッセイが開発されている。

一般にそれらのアッセイでは、容易に検出され得る原子または基によりヌクレオ チド多量体（プローブ）を標識する。

ハイブリダイゼーション条件下、標的ヌクレオチド配列を含む疑のある試料に標 識プローブを暴露すると１．標的は前記標識プローブとハイブリッド形成する。

試料中の標的配列の存在は、通常ハイブリッド形成および非ハイブリッド形成プ ローブを分離し、次いでプローブハイブリッド中の標識の存在を測定するか、ま たは非ハイブリッド形成プローブ中の標識ｌを測定して、ハイブリッド形成した 標識プローブの量を測定することにより、定性的または定量的に測定することが できる。

歴史的には放射性標識が用いられた。しかし、健康上の危険性および取り扱い上 の難点から、後になって非放射性標識が開発された。

このような標識には、存在の測定が直接的に為されるものも間接的に為されるも のも含まれる。直接標識の例としては、化学発光、蛍光または分光的測定が可能 な標識が含まれる。間接標識の例としては、ビオチンのような化合物および適当 な検出可能標識とコンジュゲートした蛋白により検出できる様々な抗原が含まれ る。

ヌクレオチド多量体プローブに標識を導入する好ましい一方法は、酵素的または 化学的合成プローブにリンカー−アームを導入することであった。例えば、４− チオ−ＵＴＰ（Ｈ，エシャフプア等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、７巻 、１４８５頁、１９７９）をＤＮＡフラグメントの３゛−末端に結合し、続いて その求核性スルフヒドリル部分において標識した。チェノによるＰＣＴ出願（国 際出願第ＷＯ３６１０００７４号、１９８６年１月３日公開）に開示されている 別の方法は、ピリミジン塩基ヌクレオチドを脱ピリミジン化し、生成する糖源を 開いて、そこにアミン担持部分を結合させる技術を示している。

さらに、Ｐ、Ｒ，ランガー等（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシーズＵＳＡ、７８巻、６６３３頁、１９８１年）に より開示された５−アリルアミンウリジントリ燐酸類似体の前駆体は、標識部位 を提供するヌクレオチド多量体プローブへの求核性アミンの取り込みに使用され 得る。

標識の化学的方法も提案されたが、これはヌクレオチド多量体中の若干のヌクレ オチドに標識を結合させるものである。その一方法としては、核酸プローブのシ トシン残基のＣ−４位におけるエチレンジアミンによる重亜硫酸触媒アミノ基転 移がある（Ｒ，Ｐ、ビシジ等、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオロジー、 ２３巻、３１１頁、１９８６）、ヌクレオチド多量体、代表的にはオリゴヌクレ オチドの５°−ま几は３゛−末端に１個の標識のみを結合する他の技術も報告さ れている。例えば、固相オリゴヌクレオチド合成における最終段階としてリンカ ー−アーム結合させる末端標識方法が開示されている。このリンカー−アームは 、次に標識結合に使用される。

例えば、Ｂ、Ａ、コノリー、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１３巻、４４ ８５頁（１９８５年）、Ｓ、アグラワル等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ 、１５巻、３１３１頁（１９８７年）参照。

また、標準自動的合成方法中における合成オリゴヌクレオチドの選択された位置 での第１級アミン修飾ヌクレオチドの挿入に使用され得る化合物が報告されてい る。このような化合物には、デオキシチミジンおよびデオキシアデニン、デオキ シグアニンなどの類似体がある（Ｇ、Ｂ、ドライヤー等、プロシーディングズ・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズｔＪｉｓＡ、８２巻 、９６８頁、１９８５、Ｊ、Ｌ、ルス、ＰＣＴ出願第ＵＳ　８４１０　Ｏ２７９ 号、公開番号ＷＯ３４１０３２８５，１９８４年８月３０日公開）。さらに、ヌ クレオチド結合燐酸基のアルキルアミン誘導体も報告されており、そのアミノ官 能基は続いて標識され得る（Ｒ，Ｌ、レットシンガーおよびＭ、Ｅ　、ショット 、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、１０３巻、７ ３９４頁、１９８１年、Ｎ、極零による特開昭６ｌ−４４３５３（１９８６年３ 月４日付）、６ｌ−５７５９５（１９８６年３月２４日付）、６ｌ−４４３５２ （１９８６年３月４日付））。理論的には、これらの化合物は、標識ヌクレオチ ドを配列に沿った幾つかの部位に配置させ得るものであるため、多重標識の使用 により検出感度が高められ得る。しかしながら、リンカー−アーム部位には、特 に多重標識が存在するとき、標的配列により形成されたハイブリッドの安定性を 減じ得る場合もあるため、リンカー−アーム位置の選択には注意を要する。

上記リンカー−アームに加えて、°非ヌクレオチドに基づくリンカー−アーム試 薬を設計したが、これらはアーノルド等による２つの継続中の特許出願、すなわ ち「ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド結合試薬」と題するアメリカ合衆国 出願番号第０９９０５０号（１９８７年９月２１日付）および「オリゴヌクレオ チド末端置換用非ヌクレオチド試薬」と題するアメリカ合東国出願番号第１０４ ３３０号（１９８７年１０月２日付）に記載されている。これらのリンカー−ア ーム試薬は、他の先行技術による試薬の限界を克服するものであり、多様な部位 におけるリンカー−アームの結合およびヌクレオチド／、非ヌクレオチドポリマ ーの構蘂を可能にする。

既知非同位体標識の中で最も高感度な種類の一つは、免疫診断アッセイで使用さ れる蛋白質およびホルモンへのアクリジニウムエステルの結合に関する、キャン ベル等（イギリス国特許第２１１２７７９Ｂ号、１９８６年ｌＯ月１５日）およ びリチャードソン等（「標識抗原として使用されるプロゲステロン−アクリジニ ウムエステルによる、血しょうプロゲステロンの化学発光免疫測定法」、クリニ カル・ケミストリー、３１巻、１６６４−１６６８頁、１９８５年）により記載 された化学発光性アクリジニウムエステルである。ヌクレオチドプローブ多量体 へのアクリジニウムエステルの結合は、蛋白質に関して記載された標識および精 製方法を用いても容易には達成されない。アクリジニウムエステルによるヌクレ オチド多量体プローブの標識は以前に提案されている。しかしながら、それらの 提案は、標識およ゛び精製方法（ヤブサキ等、アメリカ合東国特許第４５９９３ ０３号）を何等提供するものではないか、ま几は記載された方法の場合、ハイブ リダイゼーション・アッセイで使用するには標識の範囲が狭く、標識プローブの 精製度合は不充分である（モック等、１９８６年８月１５日付ＥＰＡ出願第８６ ３０６３０５．３号、公開番号第０２１２９５１号）。例えば、モックおよびセ プテツクにより記載された方法は、蛋白質の標識および精製に関する手順（ウイ ークス等）と類似した手順を示している。それらの方法は、アミン末端リンカー −アームを含むオリゴヌクレオチドプローブを顕著な程度に（６１０％）標識す るには不充分であることが見出された。

さらに、アクリジニウムエステル標識蛋白質の精製に使用されるゲルろ過方法は 、標識および非標識プローブを分離せず、非コンジュゲート標識の充分な除去も しない。ハイブリダイゼーション診断アッセイで使用する場合、ハイブリダイゼ ーション反応において非標識プローブは標識プローブと鏡台するため、顕著な量 の非標識プローブが存在しないこと、また非コンジュゲート標識は、分離支持体 に結合し、診断アッセイの感度を大きく減する高い化学発光基底値を生ずるため 、精製試料は１％を越える非コンジュゲート標識を含まないことが必要である。

要望されているのは、ヌクレオチド多量体の標識手段および標識された多量体を 本質的に純粋な形態で精製する手段である。ここに記載している発明は、それら の手段を提供するものである。

聚匪盆亘蝮 この発明の一目的は、アクリジニウムエステルによりプローブを標識し、標識さ れた前記プローブを高純度に精製することである。

（１）アクリジニウムエステルによるヌクレオチドプローブの標識および前記標 識プローブの精製、および（２）アクリジニウムエステルによる蛋白質の標識お よび前記標識蛋白質の精製に関する先行技術のシステムは、この目的にとって不 満足なものであることが判った。

特に、この先行技術は、低マイクロモル濃度範囲でのアクリジニウムエステル試 薬を用いたヌクレオチドプローブの標識および通常のゲルろ過技術を用いた精製 を開示している。それらのマイクロモル濃度範囲は低い程度（１０％またはそれ 未満）のヌクレオチドプローブの標識にのみ有用である。同じく、ゲルろ過を含 む先行技術による分離技術は、アクリジニウムエステル標識プローブへの適用の 場合実行不可能である。凝集した遊離アクリジニウムエステル標識は、アクリジ ニウムエステル標識プローブとボイドボリューム中において共溶離することが見 出された。さらに、遊離アクリジニウムエステル標識は、プローブと非共有的に 結合し、カラム中のアクリジニウムエステル標識プローブと共に移動した。結局 、当業界で既知の方法は、非標識プローブからのアクリジニウムエステル標識プ ローブの分離には不満足なものであった。

従って、この発明の目的には、高い効率でのアクリジニウムエステルによる核酸 プローブの標識方法が含まれる。この発明の別の目的は、未反応並びに凝集およ び非共育結合したアクリジニウムエステルから前記標識プローブを高純度に分離 する方法である。この発明のさらに別の目的は、非標識プローブおよび標識プロ ーブの分解生成物から前記標識プローブを分離する方法である。この発明のさら に別の目的は、大量の高純度アクリジニウムエステル標識オリゴマーを生産する ことにより、診断アッセイに有用な前記標識プローブを製造し得る効果的で迅速 で再生可能な方法である。

聚更二！豊 アクリジニウムエステル、４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル ）フェニル−ＩＯ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート・フルオロス ルホネートは、アミン反応性スクシンイミジル基を含む高度化学発光性化合物で ある。この化合物および類似化合物と第１級アミン含有核酸プローブとの反応に より、化学発光性標識プローブが生成される。また関連反応系においては、チオ ール含有核酸プローブ並びに他のアミンおよびチオール・コンジュケーション・ パートナ−もアクリジニウムエステルと反応して化学発光性標識プローブを生成 し得る。この発明は、アクリジニウムエステルによる第１級アミン含有プローブ の構築、標識および後続の精製方法であって、第１級アミン１個に対し１個のア クリジニウムエステルを有するプローブの製法を述べている。また、アクリジニ ウムエステルによるチオール基含有プローブの構築、標識および後続の精製に関 連したシステムについても記載している。

低マイクロモル濃度範囲のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル標識試 薬を用いてプローブを標識するのは困難である。さらに、ヌクレオチド・プロー ブのアクリジニウムエステル標識は、一旦プローブに結合されると、アクリジニ ウムエステルが特に不安定になるという事実があるため面倒である。この発明は 、プローブを含むアミンまｈは水硫基へのアクリジニウムエステルの新規結合方 法を開示している。これらの部分、特にアミンは、プローブの陰性荷電燐酸基と 相互作用するため、アクリジニウムエステルにより標識しにくい。

この発明によるアクリジニウムエステルのプローブへの結合方法は、高アクリジ ニウムエステル濃度（０，１〜５０ミリモル）の使用を要する。これらの高濃度 は、全反応容量の２０％〜８０％の濃度における有機溶媒の使用により達成され 得る。また、高いｐＨを用ン・パートナ−の有効濃度を高めることができる。プ ローブの好ましい標識方法は、有機溶媒による１−１０ミリモル濃度のアクリジ ニウムエステルの使用である。そのような標識方法は、溶液中、またはアクリジ ニウムエステルまたはプローブのいずれか一方を溶液に懸濁させた状態で実施さ れ得る。

すなわち構築された標識プローブは、この明細書に開示されている本発明方法を 用いて精製され得る。非標識プローブおよび遊離アクリジニウムエステルからの アクリジニウムエステル標識プローブの精製または分離は、まず遊離アクリジニ ウムエステル標識の大部分をプローブから除去し、次いで実質的に残り全部の遊 離標識をプローブから除去し、最後に標識プローブ、非標識プローブおよび標識 プローブ分解生成物を分離することにより行なわれる。これらの段階は連続的ま たは同時に行なわれ得る。

プローブからの遊離標識の大部分の好ましい除去方法は、核酸沈澱、イオン交換 ＨＰＬＣおよび逆相ＨＰＬＣを含む急速な分離技術であるが、これらに限定され る訳ではない。残存する痕跡量のアクリジニウムエステルをプローブから除去し 、標識プローブと非標識プローブを同時に分離する好ましい方法には、イオン交 換、逆相または水酸化リン灰石ＨＰＬＣの特異的適用が含まれる。

この方法により、核酸プローブは、アクリジニウムエステルにより標識され高純 度に精製され得る。次に、これらの標識および精製プローブは、診断アッセイ領 域における少量の特異標的物質の検出に使用され得る。また、アクリジニウムエ ステル標識プローブの検出に使用される試薬およびアッセイ・システムおよびキ ットもこの発明に含まれる。

図面の簡単な記載 第２図は、アクリジニウムエステルにより内部標識され几プローブを図示しｆこ ものである。

第３図は、アクリジニウムエステルによるプローブ標識におけるコンジュゲーシ ョン・パートナ−および反応生成物および条件を要約しに表である 第４図は、アクリジニウムエステル標識プローブのイオン交換（４Ａ）および逆 相（４Ｂ）ＨＰＬＣプロフィールを図示したものである。

第５図は、アクリジニウムエステル標識プローブの検出を図示したものである。

この明細書（請求の範囲を含む）において使用されている下記の語の定義を行う 。

アクリジニウムエステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル： ４価窪素中心を有し、９位が誘導体化されてフェニルエステル部分が形成された アクリジニンの誘導体、具体的には、４−（２−スクシンイミジルオキシカルボ ニルエチル）フェニル−１Ｏ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート・ フルオロスルホネート。

アクリジニウムエステルメトキシイミデートアクリジニウムエステル二　下記の 一般的タイブの部分ＲＩ＝アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置 換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシであるか、またはＸ ＝ハロゲンの場合は存在しない。

Ｒｔ＝Ｈ，アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、 置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ（Ｘ＝Ｎの場合のみあるとすれば） 。

ＲＩ＝Ｈ，アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミノ、アミド 、アセチル、アルキル、アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、 置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ。

Ｒ，＝アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換 アリール。

ｘ＝０、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換燐、置換硫黄、置換はう素または置換ひ素。

Ｙ＝０、ＳまたはＮＨｏ Ｒ３および／またはＲ２および／またはＲ８および／またはＲ４は化学的コンジ ュゲーションを可能にする反応性部位を有する。

ヌクレオチド：燐酸基、５炭素糖およびを素含有塩基から成る核酸のサブユニッ ト。ＲＮＡにおいて、５炭素糖はリボースである。

ＤＮＡＪこおいて、それは２−デオキシリボースである。この語はまたそれらの サブユニットの類似体を包含する。

ヌクレオチド多量体：ホスホジエステル結合により結合されたヌクレオチドまた はその類似体の鎖。

オリゴヌクレオチドニ一般に約１０〜約１００長のヌクレオチドを有するが、長 さが１００を越えるヌクレオチドの場合もあり得るヌクレオチド多量体。それら は通常、ヌクレオチドモノマーから合成されると考えられるが、酵素的手段によ っても生成され得る。

デオキシリボリボヌクレオチド：デオキシリボヌクレオチド・モノマーから成る オリゴヌクレオチド。

ポリヌクレオチドニ一般に長さ約１００ヌクレオチドま乙はそれ以上のヌクレオ チド多量体。これらは、通常生物に由来するか、または酵素的手段により得られ る。

ヌクレオチド多量体プローブ：第２ヌクレオチド多量体、通常ポリヌクレオチド 内に含まれる標的ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を存するヌクレ オチド多量体。通常、標的配列の対応する塩基に完全に相補的であるプローブが 選択される。しかし、プローブ中の１個またはそれ以上のヌクレオチドが標的配 列の対応する塩基に相補的でなくても適切またはさらに望ましい場合もあり得る 。一般的には、プローブは標識される。全体を通じて簡略表示の「プローブ」は 、この明細書て定義されているヌクレオチド多量体プローブを指すものとする。

ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー：ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモ ノマ一単位から成るポリマー。プローブとして使用される場合、一般的には標識 される。

ハイブリッド：相補的塩基間のワトソンークリック塩基対形成により２つのヌク レオチド多量体間に形成されに複合体。

懸濁液：　液体の混合物または液体内における固体の非沈澱粒子の混合物。粒子 （含有）液体、粒子は分散相であり、懸濁媒質は連続相である。

アクリジニウムエステル化学作用は、ウイークス等、「免疫検定における高比活 性標識としてのアクリジニウムエステル」、クリニカル・ケミストリー、２９１ ８．１４７４−１４７９頁（１９８３年）に概説されている。簡単に述べると、 アクリジニウムエステルは、それらの対応する塩基と平衡した状態で存在する。

塩基形成は高ｐＨが好ましい。４価窒素類の形成は低ｐＨが好ましい。化学発光 反応は、電子的に励起したＮ−メチルアクリドンの形成をもたらす、アクリジニ ウム類のヒドロキシベルオキンド・イオンによる攻撃を伴う。この反応は、添付 図面の第１図に図示されている。

１、アクリジニウムエステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−エステルによ る標識。

ａ、プローブの選択 好ましい態様では、標識されるべきプローブは第１級アミンを含む。５°−末端 が修飾（５゛−アミノエチルホスフェート、「末端アミンリンカー−アーム」） 、内部修飾：非ヌクレオチドＺこ基づく「内部ア照）、２型（特許出願第０９９ ０５０号）Ｌ３参照）、Ｌ２、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７またはＬ８、塩基置換ま たは塩基間挿入として使用されている］またはアミン修飾塩基内部付加［アミノ （１２）ｄ　　ｔＪＴＰ１カルビオケム、サンディエゴ、゛カリフォルニア〕ま たはプローブの３゛−末端が修飾（５−アリルアミンＵＴＰ）されたアミンリン カー−アームにより、この方法は有効に実践された。さらに、この発明は、例え ば燐酸バプクボーンおよび糖残基の標識に使用され得る。この発明により、この 明細書の先行技術の部分で述べたアミン・リンカ−・アーム・プローブ、チオー ルホスフェート含有プローブおよびチオールウリジン含有プローブを含む（ただ し、これらＺこ限定されない）、先行技術において既知の他の修飾ヌクレオチド ・プローブの使用も考えられる。添付図面の第２図は、アクリジニウムエステル により内部標識されたプローブを示す。

ｂ、プローブの標識 １．９Ｈの選択 これはある程度アミン・リンカ−・アームにより異なるが、この化学反応に最適 のｐＨは約８である。

２、緩衝液の選択 最適ＰＨにおいて良好な緩衝液であることを要する。ＨＥＰＥＳ１燐酸、重炭酸 の緩衝液が選択され得るが、これらに限定される訳ではない。

３、有機溶媒の選択 最終反応カクテルにおいて２０％〜８０％の範囲で使用されるべきである。選択 範囲には、ＤＭＳＯＳＣＨ，ＣＮ、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、アセト ン、メタノールが含まれるが、これらに限定される訳ではない、選択の必要条件 は、プローブおよびアクリジニウムエステルは選択された溶媒に高い可溶性を示 さなければならないこと、並びにアクリジニウムエステルおよびプローブは溶媒 により過度に減成されないことである。

４、アクリジニウムエステル濃度 選ばれん化学条件により異なるが、０．１ミリモル〜５０ミリモルが許容され得 る範囲である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル・エステル・コンジュゲーショ ン・パートナ−の最適範囲は、使用されるアミン・リンカー−アーム化学作用に より異なるが、約１−１０１１１Ｍのアクリジニウムエステルである。反応の経 過中における多重付加により、最終的な標識程度は高められるが、精製はさらに 困難なものとなる。

５、温度 １５−４０℃が最適である。

６、反応の持続性 これは、リンカ−アーム化学作用および他の反応パラメーターに左右されるため 、タイム−ポイント・アリコート分析により測定すべきである。この分析では、 標識の程度対アクリジニウムエステル−プローブ分解生成物の出現を考察する。

７、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−アクリジニウムエステルの未反応親電子 性コンジュゲーション・パートナ−のクヱンチング。

同じ反応条件下でコンジニゲーション・パートナ−求核剤の簡単な類似体を加え るべきである。

第３図は、アミン、チオールを含む核酸プローブおよびそれらの各コンジ二ゲー ション・パートナ−に対するこの発明の反応生成物および条件を要約したもので ある。

Ｃ８標識されたプローブの精製。

２段階方法が一般的にはさらに効果的である。まず、迅速で簡単な方法を用いて 遊離標識の大部分を除去すべきである。これには、例えば沈澱、水酸化リン灰石 、パイオービーズ５Ｍ−２、セブーパックまたは遊離標識は結合するが標識プロ ーブは結合しない（またはその逆）他の固体支持体への遊離標識の結合、急速ゲ ルろ過、有機相への遊離標識の抽出、ろ過（例、セントリコン）、急速イオン交 換クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃを含む）まには急速逆相クロマトグラフィ ー（ＨＰ　Ｌ　Ｃを含む）があるが、これらに限定される訳ではない。

次に、プローブに非共有結合しているアクリジニウムエステルを含む残りの遊離 標識および非標識プローブから標識プローブを非常に高い純度まで分離しなけれ ばならない。この場合の選択はかなり制限されている。最も速く最も有効な方法 は、イオン交換、逆相および水酸化リン灰石によるＨＰＬＣであるが、これらに 限定される訳ではない。ＨＰＬＣはどではないにせよ適度に機能はするが、さら に冗長で時間のかかる別の方法は、有機溶媒の存在下におけるゲルろ過（代表的 にはホルムアミド中バイオゲルＰ−１００またはＰ−２００を使用）である。

また、精製は、ＨＰＬＣを用い、精製すべき量が充分少量である場合には有機溶 媒中でのゲルろ過を用いる１段階方法で達成され得る。この１段階方法は、一般 に上記２段階方法はど有効ではない。

実施例 実施例１ エタノール沈澱、次いでイオン交換ＨＰＬＣによる様々なアミン・リンカ−・ア ーム・プローブの標識および精製。

Ａ、アミン・リンカ−・アーム・プローブの合成および精製。

様々なアミン・リンカ−・アーム化学による様々なデオキシオリゴヌクレオチド ・プローブに対する本明細書記載の方法および手順の有効な適用性を立証する几 めに、次のアミン・リンカ−・アーム・プローブを製造した。

１．５゛−アミン・リンカー−アーム・プローブ５゛−アミン・リンカ−・アー ムをプローブに結合するｆ二めに、２つの方法が採ろれ几。一方は、アプライド ・バイオシステムズ、インコーホレイテッドにより市販されている試薬「アミノ リンク」の使用による方法であった。他方は下記化合物の使用による方法であっ この化合物については、末端アミン・リンカ−・アーム試薬と称する。この試薬 を次の要領で合成した。６−アミノヘキサノールを、無水酢酸エチル中Ｓ−二チ ルトリフルオロチオアセテートと反応させた。反応生成物を石油エーテルにより 沈澱させ、１０％ピリジン（水中）混合物で１０分間処理することにより、形成 され１こ可能性のある０−トリフルオロアセチルを加水分解し、ガム形態て濃縮 乾固した。次いで、この化合物を文献内の標準プロトコルに従って（ヌ４年）参 照）ホスフィチル化することにより、所望の化合物、すなわち末端アミン・リン カ−・アーム試薬（１）が生成された。

５°−アミン・リンカ−・アーム（アミノリンクまｋは末端アミン・リンカ−・ アーム）を含むプローブについては、次の要領で合成した。アプライド・バイオ システムズ、インコーホレイテッドのモデル３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザー を用いて、所望のヌクレオチド配列のプローブを、３°−末端から５°−末端へ プローブを構築する標準ホスファ−アミダイト化学作用により製造した。所望の 配列が完成後、別のホスファ−アミダイト・ヌクレオシドの結合に関する場合と 同じ方法で末端アミン・リンカ−・アーム試薬を使用するか、または製造会社が 記載した手順を用いてアミノリンクを使用することにより、アミン・リンカ−・ アームを自動的にプローブの５゛−ヒドロキシル基に結合させた。幽準プロトコ ルを用いて、次にこのプローブを固体支持体から開裂し、Ｎ　Ｈ−ＯＨを用いて 脱保護し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いでセファデックスＧ−２５ク ロマトグラフイーにより精製した。

この手順を用いて次のプローブを合成および精製した。

］１ ［式中、ＮＨｚ（ＣＨｔ）。−〇−Ｐ−０−はアミン・リンカ−・アーム■ 〇− 〇 ［式中、ＮＨｔ　　（ＣＨｔ）ｔ−０−Ｐ　　Ｏ−はアミノリンクを表すコ２、 内部アミノ・リンカ−・アーム・プローブ。

アミン・リンカ−・アームをブ占−ブの内部に取り込ませるため、アーノルドら によるアメリカ合衆国特許出願第０９９０５０号（１９８７年９月２１日提出、 名称「ヌクレアーゼ・プローブ用非ヌクレオチド結合試薬」）に記載されている 内部アミン・リンカ−・アーム試薬、ｌ型または？型を用いた。同様に、標準ホ スファ−アミダイト化学を用いてプローブを合成し、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動およびセファデックスＧ−２５クロマトグラフイーを用いて精製した。

この方法により次のプローブを合成した。

１、）エシェリヒア・コリに由来する１６ＳサブユニツトのｒＲＮＡに相補的な ３０間体。配列の１８位のアデニン残基が内部アミン・リンカ−・アーム１型に より置換されている。

また、チミジン、シチジンまたはグアノシン残基を内部リンカ−・アームｌ型に より置換する形でプローブを合成しＬ０２、）クラミジア・トラコマティス？こ 由来する１６ｓサブユニツトのｒＲＮＡに相補的な３３間体。配列の２１位のア デニン残基を内部アミン・リンカ−・アーム１型により置換または残基２１およ び２２の間にこれを挿入している。

３、）クラミジア・トラコマティスに由来する２３ＳサブユニツトのｒＲＮＡに 相補的な２４間体。残基１５および１６間に内部リンカ−・アームＬ７型が挿入 されている。

ＣＴＣＣＴＡ　ＴＣＧ　ＴＴＣＣＡＴ　　ＡＧＴ　ＣＡＣＣＣＴＢ、アクリジニ ウムエステルのＮＨＳエステルによるアミン・リンカ−・アーム・プローブの標 識および後続の精製。

ＮＨＳエステルまたはアクリジニウムエステルの２５ｍＭストック溶液を蒸留Ｄ ＭＳＯ中で調製した。所望量のプローブ（上ｇ２Ａ項において標識された種々の プローブのリスト参照）を１．５ｉｇ円錐形ポリプロピレン管において濃縮乾固 した。下記成分を順に加えることにより、下記カクテルを構築した。

３マイクロリツトルの８２０ １マイクロリツトルのＩＭ　　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）４マイクロリツトルの ＤＭＳＯ（蒸留）２マイクロリツトルの２５ｍＭアクリジニウムエステルのＮＨ Ｓエステル（蒸留ＤＭＳＯ中）。

混合物を渦状に回し、２秒間小型遠心分離器中で回転させ（管の底に内容物を集 めるため）、３７℃で２０分間インキュベーションした。次いで、下記成分を列 挙した順に反応カクテルに加えた。

３．０マイクロリツトルの２５ｍＭアクリジニウムエステルのＮＨＳエステル（ 蒸留ＤＭＳＯ中） １．５マイクロリツトルのＨ７Ｏ ０，５マイクロリツトルのＩＭ　　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）再びカクテルを渦 状に回し、回転させ、３７℃でさらに２０分間インキュベーションしに。ｏ、１ Ｍ　　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）、５０％ＤＭＳＯ中０．１２５Ｍ　　リジン５ マイクロリツトルを加えることにより５倍過剰のリジンを用いて未反応標識をク エンチングし、室温で５分間インキコベーションした。

次いで、次の方法を用いてアクリジニウムエステル標識プローブを精製した。未 反応標識の大部分を除去するたぬ、プローブを次の要領でエタノール沈澱させに 。２０マイクロリツトルのクエンチングされた反応混合物に、３０マイクロリツ トルの３Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ（ｐＨ５、０）、２４０マイクロリツトルのＨｔＯお よび５マイクロリツトルのグリコーゲンを担体として加え１こ（グリコーゲンを 前処理することにより、ヌクレアーゼ活性を全て除去しん）。試料を短時間渦状 に回し、６４０マイクロリツトルの無水ＥｔＯＨを加えた。試料を短時間渦状に 回し、氷上で５−１０分間インキユベーンヨンし、次いで５分間小型遠心分離器 中１５００　Ｏｒｐｍで遠心８分離した。上清を注意深く除去し、沈澱物を２０ マイクロリツトルのＱ、ＩＭＮａＯＡｅ（ｐＨ５、０）、０．１％ＳＤＳに再溶 解しに０次いで、下記の２つのＨＰＬＣシステムの一方法を用いることにより、 残存遊離標識、非標識プローブおよびＡＥ標識プローブの分解生成物からＡ。

Ｅ標識プローブを分離した。

イオン交換ＨＰＬＣ ＩＢＭ９５３３ＨＰＬＣシステムに搭載されたヌクレオーゲンーＤＥＡＥ６０− フイオン交換ＨＰＬＣカラムに２０マイクロリツトルの再溶解沈澱物を注入した 。ＨＰＬＣ用水、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ　）および酢酸ナトリウム（Ｎａ ＯＡｃＸフィッシャー・サイエンティフィックから）並びに試薬用水酢酸（ＨＯ ，ＡＣ）およびＬｉＣ１により全ての緩衝液を調製した。使用前に全緩衝液を０ ．４５マイクロモル孔サイズのナイロン−６６フイルターによりろ過した。０゜ ５ｍ（１／分の流速で２５分間５５％の緩衝液Ａ１４５％の緩衝液Ｂから３０％ の緩衝液Ａ１７０％の緩衝液Ｂへの一次勾配により溶出を行った。流出中、２６ ０ｎｍでの吸光度をモニターし１こ。視野の範囲は１光学密度単位に等しかった 。チャート速度は２０ｃｘ１時であつた。０　、５　ｘＱのフラクションを１． ５πＣのスクリュー・キャップ式エッペンドルフ管に集めた。結果を第４Ａ図に 示す（この場合、プローブは、上記Ａ項記載の末端アミン・リンカ−・アーム含 有２６ｊ１体であっに。他のプローブは全て酷似しＬプロフィールを示°した。

）ｅ流出直後、５マイクロリツトルの１０％ＳＤＳを容管に加え、次いで容管を 渦状に回した（これは、アクリジニウムエステル標識プローブが管壁に付着して いないことを確実にするにめに行なっｆ二）。

０．５マイクロリツトルのアリコートをフラクション２１−４２から除去し、１ ２Ｘ７Ｓｘｉ管中２００マイクロリツトルの水に加えγこ（各アリコートに対し て分離ピペット・チップを用いることにより、持ち越し問題を回避した）。次い で、ベルトールド・クリニルマットにおいて、２００マイクロリツトルの０　、 ２０　Ｎ　　ＨＮ　Ｏｓ、０゜１％Ｈ，Ｏ，，１秒遅れで２００マイクロリツト ルのＩＮ　　ＮａＯＨを自動的に注入し、続いて１０秒間化学発光アウトプット を読み取ることにより、各アリコートの化学発光度を測定しｆ０次に、フラクシ ョン６４−６８を次の要領でＥｔＯＨ沈澱させた。

各々５マイクロリツトルのグリコーゲンに加え、渦状に回し、１ｒｆｆのＥｔＯ Ｈを加え、渦状に回し、氷上で５−１０分間インキュベーションし、小型遠心分 離器中Ｉ５ＱＯＯｒｐｍで５分間遠心分離しに。

Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ、ｐＨ５，０，１％ＳＤＳに再溶解し、フラクションをまた、 アクリジニウムエステル標識プローブを概ね上記手順に従い精製した。例外とし て、バイダックＣ４逆相カラムを使用し、緩衝液Ａは０．１Ｍ酢酸トリエチルア ンモニウム（アプライド・バイオシステムズ、インコーホレイテッド、フォスタ ー・シティ−、カリフォルニア）であり、緩衝液ＢはＣ１（３ＣＮであった。流 速１！Ｑ／分で２５分間１０−’１５％溶媒Ｂか°らの一次勾配を用いて標識プ ローブを溶離した。吸光度を２６０ｎｍでモニターした。０　、５　ｘＱのフラ クションを集めた。次いで、主たる化学発光ピークを確認し、上記の要領で後処 理した（ただし、ＥｔＯＨ沈澱前に４５マイクロリフドルの３Ｍ　　Ｎａ０Ａｅ を各フラクションに加えた）。添付図面の第４Ｂ図は、上記Ａ項記載の２４量体 プローブ（内部リンカ−・アーム、Ｌ７型）の溶離プロフィールを示す。他のプ ローブも全て非常に似・たプローブを示した。

これらの手順の両方を用いることにより、この明細書に記載されている全てのリ ンカ−・アーム化学作用について本質的に同等の結果で高純度アクリジニウムエ ステル標識プローブが得られた。これらのプローブの比活性は、プローブ１ピコ モル当たり一般的に５−１０ｘｌＯ’化・学発光カウント（ベルトールド・クリ ニルマット）であった。添付図面の第５図は、一旦精製されにそれらのプローブ が検出され得る感度を示す。

Ｃ，アクリジニウムエステルのメトキシイミデート誘導体によるアミン・リンカ −・アームプローブの標識および後続の精製。

この手順は概ね上記Ｂ項記載の手順に従い行ったが、異なる点は次の通りであっ た。乾燥プローブを５０マイクロリツトルの０．５モルｐＪ　ａ　ＣＯｓ　、Ｐ 　Ｈ９および２５マイクロリツトルのジメチルホルムアミドに再溶解した。次に 、０．２Ｈのメトキシイミンアクリジニウムエステル（Ｍｔ−ＡＥ）４加え、混 合物を渦状に回し、室温で３０分間反応させた。さらに０．２π９のＭｌ−ＡＥ を加え、室温でさらに３０分間反応を続行したう未反応標識を０．５Ｍ　　Ｎａ ＨＣＯ３、ｐＨ９中５０ｍＭリジン１００マイクロリットル？二よりクエンチン グした（室温で１０分間インキュベージタン）。

次いでアクリジニウムエステル標識プローブを上記Ａ項の記載に従いエタノール 沈澱させたが、ただし、４０マイクロリツトルの３Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ（ｐＨ５， ０）、１０５マイクロリツトルのＨｔ　Ｏおよび７５０マイクロリツトルの無水 ＥｔＯＨを使用した。次いで、Ｂ項の記載に従いイオン交換ＨＰＬＣを用いてプ ローブをさらに精製した。

実施例２ アクリジニウムエステル標識プローブを用いた臨床環境における標的ポリヌクレ オチド配列の希釈系列の検出。

下記手順に従い、アクリジニウムエステルにより内部標識し１ニブローブ（３３ ｊ１体、内部リンカー−アーム、ｌ型、アデノシン置換、実施例１参照）を、そ の標的ｒＲＮＡ（この場合、クラミジア・トラコマティス）とハイブリッド形成 させた。

ハイブリダイゼーション混合物 １６マイクロリツトルの咽喉のスワブ（綿棒で採取した試料）、３％ラウリル硫 酸リチウム、３０＠Ｍ燐酸緩衝液（ＰＢ）Ｉ）Ｈ６，８，１ミリモルＥＤＴＡ、 １ミリモルＥＧＴＡ中。

２マイクロリツトルの４．８モルＰＢ、ｐＨ４，７１マイクロリットルのｒＲＮ Ａ（１０−”、１Ｏ−８，１０−′または０゜３３マイクログラム） １マイクロリツトルのプローブ（０，３３ピコモル）対照混合物は、ｒＲＮＡの 代わりに水を含むこと以外、ハイブリダイゼーション混合物と同じであった。混 合物を６０℃で６０分間インキュベージタンした。次いで、次の要領で水酸化リ ン灰石（ＨＡＰ）を用いて非ハイブリッド形成プローブからハイブリッドを分離 した。各ハイブリッドおよび対照混合物に、１５０マイクロリツトルの０．１４ モルＰＢ、ｐＨ６，８（２％ＨＡＰ含有）を加えた。生成した混合物を各々５秒 間渦状に回し、６０℃で５分間インキュベーションし、２０秒間渦状に回し、次 いで小型遠心分離器中１５００Ｏｒｐｍで３０秒間遠心分離した。上清を除去し 、１５０マイクロリツトルの０．１４モルＰＢＳｐＨ６，８をＨＡＰ沈澱物に加 え、混合物を１０秒間渦状に回し、次いで、小型遠心分離器中１５０００ｒｐｍ で３０秒間遠心分離した。上清を除去し、この洗浄処理を正確に同じやり方でも う２回反復した。残りのＨＡＰ沈澱物を１５０マイクロリツトルの０１１４モル ＰＢ１ｐＨ６，８に再懸濁し、実施例１の記載と全く同様に化学発光度を直接読 み取った。

結果二 シグナル　Ｓ：Ｂ 対照（ｒＲＮＡ無し）　　　　　　　　　　　　　　１８　−１０−３マイクロ グラムのｒＲＮＡ　　　　　　　　　２７　　１．５１Ｏ−２マイクログラムの ｒＲＮＡ　　　　　　　　１１７　　６．５１Ｏ−１マイクログラムのｒＲＮＡ 　　　　　　　　９３３　５２０．３３マイクログラムのｒＲＮＡ　　　　　　 ２７５６　１５３結果はデュブリケイト値の平均を表す。シグナルは数百の相対 光単位（ｒｌｕ’　ｓ）として与えられた。対照シグナルは、約０．１％のイン プラ）ｒｌｕを表す。Ｓ：Ｂは、シグナル対基底値の比、すなわち特定ｒＲＮＡ 濃度での化学発光度を対照の化学発光度で除した値である。

これらのデータは、この明細書の記載に従いアクリジニウムエステル標識および 精製されたプローブを用いることにより、標的ポリヌクレオチド配列を高感度で 特異的に検出することができることを立証している。

アクリジ＋７ムニステルの反成゛弐 Ｆ７Ｇ、　／。

ＦＩＧ、２゜ ＦＩＧ、３゜ アクソジ′ウムエステｌしに！−る７９０−　゛の肺弐アクリジ゛ウムエステル 橡＜７’ローフ゛の）ＩＰＬＣ７°ロフ１−ルＦＩＧ、　４σ。

”ＡＬｆｌ、　　（２６０ｎｍ） アクソダニウムエステＩしｒ七に７°ロブパの♂処ハＦＩＧ、５゜ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第２コンジュゲーション部分を有するアクリジニウムエステル標識試薬に よる、第１コンジュゲーション部分を有する核酸プローブの標識方法であって、 前記標識議案および前記核酸プローブを合わせることにより、約０．１−５０ｍ Ｍの標識試薬濃度を実現させ、高収率でアクリジニウムエステル標識核酸プロー ブを生成させる工程を含む方法。 （２）工程をｐＨ７−９の範囲で行なう、請求項１記載の方法。 （３）工程を１５−４０℃の温度範囲で行なう、請求項２記載の方法。 （４）工程を溶液中で行なう、請求項１または２または３記載の方法。 （５）工程を、核酸プローブを含む溶液により行ない、標識試薬を溶液に懸濁さ せる、請求項１または２または３記載の方法。 （６）工程を、標識試薬を含む溶液により行い、核酸プローブを溶液に懸濁させ る、請求項１または２または３記載の方法。 （７）第２コンジュゲーション部分を有するアクリジニウムエステル標識試薬に よる、第１コンジュゲーション部分を有する核酸プローブの標識方法であって、 前記標識試薬および前記核酸プローブを合わせることにより、約０．１−５０ｍ Ｍの標識試薬濃度および約２０％〜８０％（体積）の有機溶媒濃度を実現させ、 高収率でアクリジニウムエステル標識核酸プローブを生成させる工程を含む方法 。 （８）工程を７−９のｐＨ範囲で行う、請求項７記載の方法。 （９）工程を１５−４０℃の温度範囲で行う、請求項７記載の方法。 （１０）工程を溶液中で行う、請求項７または８または９記載の方法。 （１１）工程を、核酸プローブを含む溶液により行い、標識試薬を溶液に懸濁さ せる、請求項７または８または９記載の方法。 （１２）工程を、標識試薬を含む溶液により行い、核酸プローブを溶液に懸濁さ せる、請求項７または８または９記載の方法。 （１３）有機溶媒が、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ジメチルホルムアミド、ジオキサ ン、アセトンおよびメタノールから成る群から選ばれる、請求項７記載の方法。 （１４）第２コンジュゲーション部分を有するアクリジニウムエステル標識試薬 による、第１コンジュゲーション部分を有する核酸プロープの標識方法であって 、 約０．１−５０ｍＭの濃度の標識試薬を、約２０％〜８０％（体積）の濃度の有 機溶媒と合わせて、高収率でアクリジニウムエステル標識核酸プローブを生成さ せ、 未反応標識試薬をクェンチングする 工程を含む方法。 （１５）第２コンジュゲーション部分を有するアクリジニウムエステル標識試薬 による、第１コンジュゲーション部分を有する核酸プロープの標識方法であって 、 約０．１−５０ｍＭの濃度の標識試薬を、約２０％〜８０％（体積）の濃度の有 機溶媒と合わせて、高収率でアクリジニウムエステル標識核酸プローブを生成さ せる工程を含み、前記第１および第２コンジュゲーション部分が、各々下記のも ので構成される対から成る群がら運ばれる方法。 （１）−ＮＨ２，▲数式、化学式、表等があります▼ｐＨ範囲７−９（２）−Ｎ Ｈ２，▲数式、化学式、表等があります▼ｐＨ範囲８−１０（３）−ＮＨ２，▲ 数式、化学式、表等があります▼ｐＨ範囲７−９（４）−ＮＨ２，▲数式、化学 式、表等があります▼ｐＨ範囲７−９（５）−ＮＨ２，▲数式、化学式、表等が あります▼ｐＨ範囲７−９（６）−ＮＨ２，▲数式、化学式、表等があります▼ ｐＨ範囲７−９（７）−ＳＨ，▲数式、化学式、表等があります▼ｐＨ範囲６− ８（８）−ＳＨ，▲数式、化学式、表等があります▼ｐＨ範囲６−８（９）−Ｓ Ｈ，▲数式、化学式、表等があります▼ｐＨ範囲６−９（１０）−ＳＨ，▲数式 、化学式、表等があります▼ｐＨ範囲５−９（１６）Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミド−アクリジニウムエステル標識試薬による、第１コンジュゲーション部分を 有する核酸プローブの標識方法であって、約１−１０ｍＭ濃度の標識試薬を約２ ０％〜８０体積％の濃度の有機溶媒と合わせることにより、アクリジニウムエス テル標識核酸プローブを高収率で生成させる方法。 （１７）アクリジニウムエステルーメトキシイミデート標識試薬による、第１コ ンジニゲーション部分を有する核酸プローブの標識方法であって、約１−１０ｍ Ｍ濃度の標識試薬を約２０％〜８０体積％の濃度の有機溶媒と合わせることによ り、アクリジニウムエステル標識核酸プローブを高収率で生成させる方法。 （１８）アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プローブおよび遊離アク リジニウムエステル標識から高純度で分離する方法であって、 第１緩衝液中、イオン交換、逆相および水酸化リン灰石から成る群から選ばれる ＨＰＬＣカラムに前記標識プローブを結合させ、ＨＰＬＣカラムを第２緩衝液と 接触または第１緩衝液および第２緩衝液の勾配に接触させることにより、標識プ ローブ、非標識プローブおよび遊離アクリジニウムエステル標識の分別溶離を実 現させる ことを含む方法。 （１９）カラムがイオン交換であり、第１緩衝液が２０ミリモルＮａＯＡｃ、ｐ Ｈ５．５、２０％ＣＨ３ＣＮであり、第２緩衝液が２０ミリモルＮａＯＡｃ、ｐ Ｈ５．５、２０％ＣＨ３ＣＮ、１モルＬｉＣｌである、請求項１８記載の方法。 （２０）カラムがイオン交換であり、２０ミリモルＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２ ０％ＣＨ３ＣＮ、０．４５モルＬｉＣｌから成る第１緩衝液から２０ミリモルＮ ａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ３ＣＮ、０．７モルＬｉＣｌから成る第２緩 衝液への勾配が使用される、請求項１８記載の方法。 （２１）カラムが逆相であり、第１緩衝液が０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウ ム、ｐＨ７．０であり、第２緩衝液がＣＨ３ＣＮである、請求項１８記載の方法 。 （２２）カラムが逆相であり、０．１モル酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７ ．０、１０％ＣＨ３ＣＮから成る第１緩衝液から０．１モル酢酸トリエチルアン モニウム、ｐＨ７．０、５０％ＣＨ３ＣＮから成る第２緩衝液への勾配が使用さ れる、請求項１８記載の方法。 （２３）アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プローブおよび遊離アク リジニウムエステル標識から高純度で分離する方法であって、 急速な分離手段を用いて標識プローブから遊離アクリジニウムエステル標識の大 部分を除去し、 残存している実質的に全部の遊離アクリジニウムエステル標識をプローブから除 去し、イオン交換、逆相または水酸化リン灰石から成る群から選ばれるＨＰＬＣ を用いて標識プローブを非標識プロープから分離する ことを含む方法。 （２４）急速な選択手段が、 （１）核酸沈澱、 （２）水酸化リン灰石、バイオービーズＳＭ２、ゼブーパックまたは標識が結合 し遊離標識プローブが結合しないか、または標識プローブが結合し遊離標識が結 合しない固体支持体に、遊離標識を結合、 （３）急速ゲルろ過、 （４）有機相への遊離アクリジニウムエステル標識の抽出、（５）ろ過、 （６）急速イオン交換クロマトグラフィー、（７）イオン交換ＨＰＬＣ、および （８）逆格ＨＰＬＣ から成る群から選択される、請求項２３記載の方法。 （２５）急速分離手段がエタノール沈澱であり、ＨＰＬＣがイオン交換であり、 除去および分離が、２０ミリモルＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ３ＣＮ、 ０．４５モルＬｉＣｌから成る第１緩衝液から２０ミリモルＮａＯＡｃ、ｐＨ５ ．５、２０％ＣＨ３ＣＮ、０．７モルＬｉＣｌから成る第２緩衝液への勾配の使 用により達成される、請求項２３記載の方法。 （２６）急速分離手段がエタノール沈澱であり、ＨＰＬＣが逆相であり、除去お よび分離が、０．１モル酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０、１０％ＣＨ ３ＣＮから成る第１緩衝液から０．１モル酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７ ．０、５０％ＣＨ３ＣＮから成る第２緩衝液への勾配の使用により達成される、 請求項２３記載の方法。