CN109852669A - 一种吖啶酯标记核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种吖啶酯标记核酸的方法；所述方法包括以下步骤：(1)DNA探针5’端、3’端保护；(2)吖啶酯标记：25mM NHS吖啶酯溶解于DMSO中，配置1M HEPES缓冲液(PH＝8.0)，按照摩尔比核酸探针：NHS吖啶酯＝1:5的条件，加入到HEPES缓冲液中，37℃反应1h；(3)HPLC纯化；有益效果：普通的方法一个核酸探针上只能在5’端标记一个吖啶酯，本发明方法创造性的在两端都标记了吖啶酯，在灵敏度上直接提升了1倍。

Description

一种吖啶酯标记核酸的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种吖啶酯标记核酸的方法。

背景技术

吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)，黄色粉末，CAS号:194357-64-7，是一种重要的化学发光试剂，具有较高的量子产率，其化学发光效率较高，通常是鲁米诺的五倍或五倍以上。除此之外，吖啶酯的化学发光过程反应迅速，本底低，在氢氧化钠和过氧化氢的存在下即可发光。在氧化反应过程中，结合物被分解，不影响游离吖啶酯的发光；另外，吖啶酯类化学发光试剂具有较好的稳定性，易于储存。

吖啶酯除了在免疫测定中的应用之外，还可以标记寡核苷酸片段探针应用于基因测定或微生物测定。吖啶酯化合物很适合于标记DNA链以制造化学发光DNA探针。现代医学研究成果表明，许多疾病如癌症和遗传疾病的发生都与DNA的突变有关，且许多传染性疾病是由环境中的病毒、病菌或寄生虫引起的，对病毒特定序列DNA的分析有利于疫情的控制。对DNA序列以及其链中碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病早期诊断和治疗、病原基因测定方面具有十分深远的意义。

在核酸杂交分析中，制备特异性强、灵敏度高的标记探针是核酸杂交分析成功的关键，吖啶酯衍生物可以直接标记在核酸探针上，不需催化剂且发光量子产率不受影响；另外，在一定条件下，未杂交的单链DNA上标记的吖啶酯被水解破坏，只有杂交形成的双链保护的吖啶酯才能产生化学发光，不需分离即可监测整个杂交过程。

目前的标记方法只能在5’端标记一个吖啶酯，存在灵敏度不够的情况。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种吖啶酯标记核酸的方法，该方法标记的探针检测灵敏度高。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种吖啶酯标记核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)DNA探针5’端、3’端保护；

(2)吖啶酯标记：25mM NHS吖啶酯溶解于DMSO中，配置1M HEPES缓冲液(PH＝8.0)，按照摩尔比核酸探针：NHS吖啶酯＝1:5的条件，加入到HEPES缓冲液中，37℃反应1h；

(3)HPLC纯化。

进一步的，所述步骤(1)中DNA探针5’端、3’端保护具体包括：采用三氟硫代乙酸S-乙酯，对5’端-NH₂进行保护；采用三氟硫代乙酸S-乙酯，对3’端-NH₂进行保护。

进一步的，所述步骤(1)中DNA探针5’端、3’端保护具体包括以下步骤：

(1)10mol己二胺+10mol EDC+1mol DNA探针，TE缓冲液，37℃反应过夜，HPLC纯化；

(2)加入5mol三氟硫代乙酸S-乙酯，对5’端-NH₂进行保护；

(3)加入10mol 6-氨基己烷磷酸，180℃加热反应30min，在3’端引入C臂，HPLC纯化；

(4)加入5mol三氟硫代乙酸S-乙酯，对3’端-NH2进行保护。

进一步的，所述步骤(3)中HPLC纯化的条件为：

柱子：Vydac C4反相柱；

缓冲液A：0.1M三乙基乙酸铵缓冲液；

缓冲液B：乙腈；

先用缓冲液A冲洗反向柱，标记的DNA探针用10％-15％的溶剂B来洗脱，流速设定1mL/min，洗脱时间25min，吸收度设定在260nm处。

采用本发明的技术方案的有益效果是：

本发明中利用NHS ester反应原理在于羧酸在NHS的活化下与伯胺反应，伯胺是指NH₂与sp3碳链连接的基团，而碱基单体(ACG)上的胺基属于苯胺类别，NH₂与Sp2碳相连。苯胺与伯胺相比反应活性大大降低，不足以与NHS反应。碱基T上的NH已经不属于胺，属于酰酯类别，与NHS不反应。普通的方法一个核酸探针上只能在5’端标记一个吖啶酯，本发明方法创造性的在两端都标记了吖啶酯，在灵敏度上直接提升了1倍。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施方式中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。

一种吖啶酯标记核酸的方法，包括以下步骤：

(1)DNA探针5’端、3’端保护；采用三氟硫代乙酸S-乙酯，对5’端-NH₂进行保护；采用三氟硫代乙酸S-乙酯，对3’端-NH₂进行保护，具体包括：

①10mol己二胺+10mol EDC+1mol DNA探针，TE缓冲液，37℃反应过夜，HPLC纯化；

②加入5mol三氟硫代乙酸S-乙酯，对5’端-NH₂进行保护；

③加入10mol 6-氨基己烷磷酸，180℃加热反应30min，在3’端引入C臂，HPLC纯化；

④加入5mol三氟硫代乙酸S-乙酯，对3’端-NH2进行保护。

(2)吖啶酯标记：25mM NHS吖啶酯溶解于DMSO中，配置1M HEPES缓冲液(PH＝8.0)，按照摩尔比核酸探针：NHS吖啶酯＝1:5的条件，加入到HEPES缓冲液中，37℃反应1h；

(3)HPLC纯化：HPLC纯化的条件为：

柱子：Vydac C4反相柱；

缓冲液A：0.1M三乙基乙酸铵缓冲液；

缓冲液B：乙腈；

先用缓冲液A冲洗反向柱，标记的DNA探针用10％-15％的溶剂B来洗脱，流速设定1mL/min，洗脱时间25min，吸收度设定在260nm处。

吖啶酯核酸标记原理：

(1)5’端通过磷酸基与己二胺反应引入伯胺，

(2)3‘端通过-OH与6-氨基己烷磷酸反应引入伯胺，

加入NHS活化的吖啶酯，从而获得5’和3‘两端都带吖啶酯的核酸探针：

5’-吖啶酯-NH2C6-ATCCTCAGCAACCTCAGCAGCG-NH2C6-吖啶酯-3’应用案例：

利用化学发光杂交保护分析的原理检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、大肠杆菌O157和金黄色葡萄球菌4种致病菌特异性RNA序列，这种方法无需物理分离，利用吖啶酯标记DNA探针，通过核酸杂交保护分析法，即应用人工合成的靶DNA保守区的寡核苷酸，在合成时引入一个烷氨基的手臂，经活化后接上吖啶酯，制成化学发光探针。

杂交后无需分离步骤，而是利用差分水解来鉴别，即加入碱性溶液，游离的发光探针遇碱水解失去发光特性，而与特异性目的片段结合的探针形成DNA-RNA杂交体，由于吖啶酯是平面结构很容易进入双螺旋的内部而获得杂交保护，水解速度缓慢(半衰期达10分钟以上)，仍有发光性能，可以在发光仪检测仪上显示化学发光信号，从而实现对病原菌的检测。

E.coliO157:H7检测：原理用特异性的DNA探针进行E.coliO157:H7核糖体RNA(rRNA)的检测。待检样品经前增菌、选择性增菌和后增菌后，溶解细菌。加入标记好的E.coliO157:H7异性的DNA探针用于液相杂交。

探针序列：

5'-GAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCCATAAGCGTAAGCAGAAAC-3'，

通过上述方法进行吖啶酯标记：

对照组：5'-吖啶酯

-GAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCCATAAGCGTAAGCAGAAAC-3'，

实验组：5'-吖啶酯

-GAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCCATAAGCGTAAGCAGAAAC-吖啶酯-3'，

E.coliO157:H7标准菌株培养，进行检测：

由上表检测数据可知，实验组的灵敏度要显著高于对照组，所以本发明具有显著提高检测灵敏度的作用。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (4)

1.一种吖啶酯标记核酸的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)DNA探针5’端、3’端保护；

(2)吖啶酯标记：25mM NHS吖啶酯溶解于DMSO中，配置1M HEPES缓冲液(PH＝8.0)，按照摩尔比核酸探针：NHS吖啶酯＝1:5的条件，加入到HEPES缓冲液中，37℃反应1h；

(3)HPLC纯化。

2.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记核酸的方法，其特征在于：所述步骤(1)中DNA探针5’端、3’端保护具体包括：采用三氟硫代乙酸S-乙酯，对5’端-NH₂进行保护；采用三氟硫代乙酸S-乙酯，对3’端-NH₂进行保护。

3.根据权利要求2所述的一种吖啶酯标记核酸的方法，其特征在于：所述步骤(1)中DNA探针5’端、3’端保护具体包括以下步骤：

(1)10mol己二胺+10mol EDC+1mol DNA探针，TE缓冲液，37℃反应过夜，HPLC纯化；

(2)加入5mol三氟硫代乙酸S-乙酯，对5’端-NH₂进行保护；

(3)加入10mol 6-氨基己烷磷酸，180℃加热反应30min，在3’端引入C臂，HPLC纯化；

(4)加入5mol三氟硫代乙酸S-乙酯，对3’端-NH2进行保护。

4.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记核酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中HPLC纯化的条件为：

柱子：Vydac C4反相柱；

缓冲液A：0.1M三乙基乙酸铵缓冲液；

缓冲液B：乙腈；

先用缓冲液A冲洗反向柱，标记的DNA探针用10％-15％的溶剂B来洗脱，流速设定1mL/min，洗脱时间25min，吸收度设定在260nm处。