JP2000350598A - 均一保護検定用組成物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 均一フォーマットを用いて標的核酸配列を感
度良く検出するための組成物を提供する。 【解決手段】 化学的に結合したラベルを有する第１ポ
リヌクレオチド塩基配列、及び第２ポリヌクレオチド塩
基配列からなり、該第１の塩基配列が第２の塩基配列の
近接または隣接する部位にハイブリッドを形成すること
ができ、該ハイブリッド中に存在する該ラベルの安定性
がハイブリッド化しないものの該ラベルの安定性と異な
ることを特徴とするポリヌクレオチド組成物。
度良く検出するための組成物を提供する。 【解決手段】 化学的に結合したラベルを有する第１ポ
リヌクレオチド塩基配列、及び第２ポリヌクレオチド塩
基配列からなり、該第１の塩基配列が第２の塩基配列の
近接または隣接する部位にハイブリッドを形成すること
ができ、該ハイブリッド中に存在する該ラベルの安定性
がハイブリッド化しないものの該ラベルの安定性と異な
ることを特徴とするポリヌクレオチド組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は診断方法および微少
量の有機化合物を検知し、定量する技術の分野のもので
ある。さらに詳しくは、本発明は、その非結合形と対立
するものとしての結合形におけるラベルの安定性に差が
ある均一診断検定に関する。本発明はラベルがその非複
合または非結合形と比べて、複合または結合形では異な
って分解する診断検定システム用の環境の構成に関す
る。
量の有機化合物を検知し、定量する技術の分野のもので
ある。さらに詳しくは、本発明は、その非結合形と対立
するものとしての結合形におけるラベルの安定性に差が
ある均一診断検定に関する。本発明はラベルがその非複
合または非結合形と比べて、複合または結合形では異な
って分解する診断検定システム用の環境の構成に関す
る。
【０００２】診断検定はラベルされた結合試薬を用いて
生物学的物質を検出し、位置を定め、または定量する一
般的な分析技術である。ついで、ラベルされた試薬の存
在を種々の公知の方法を用いて検出できる。本発明は直
接結合検定およびコンペティションアッセイおよび逐次
飽和（sequential saturation）を含め、制限なしに全
ての公知の診断検定のフォーマットに適用できる。一つ
の具体的な診断検定は核酸のハイブリッド化検定であ
る。ハイブリッド化検定システムは一本鎖核酸（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）が適当な環境の下で相補的一本鎖核酸に
よりハイブリッド化または組換えされる事実に基づくも
のである。容易に検出できるラベルで相補的プローブ核
酸をラベルすることにより、一本鎖核酸配列を含むテス
ト試料中の目的とする標的ポリヌクレオチド配列の存在
を検出することが可能である。検定システムは広範に
は、不均一（heterogeneous）または均一（homogeneou
s）として特徴づけられる。検定システムに適用される
「不均一」なる語は検出すべきラベルされない物質から
ラベルされた物質の分離を必要とする特異結合検定のシ
ステムを意味する。一方、均一検定システムは何等、物
理的分離工程を包含しない。均一検定システムは取扱い
工程数が最小なので、一般に、不均一検定システムより
も便利で、使用が容易である。
生物学的物質を検出し、位置を定め、または定量する一
般的な分析技術である。ついで、ラベルされた試薬の存
在を種々の公知の方法を用いて検出できる。本発明は直
接結合検定およびコンペティションアッセイおよび逐次
飽和（sequential saturation）を含め、制限なしに全
ての公知の診断検定のフォーマットに適用できる。一つ
の具体的な診断検定は核酸のハイブリッド化検定であ
る。ハイブリッド化検定システムは一本鎖核酸（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）が適当な環境の下で相補的一本鎖核酸に
よりハイブリッド化または組換えされる事実に基づくも
のである。容易に検出できるラベルで相補的プローブ核
酸をラベルすることにより、一本鎖核酸配列を含むテス
ト試料中の目的とする標的ポリヌクレオチド配列の存在
を検出することが可能である。検定システムは広範に
は、不均一（heterogeneous）または均一（homogeneou
s）として特徴づけられる。検定システムに適用される
「不均一」なる語は検出すべきラベルされない物質から
ラベルされた物質の分離を必要とする特異結合検定のシ
ステムを意味する。一方、均一検定システムは何等、物
理的分離工程を包含しない。均一検定システムは取扱い
工程数が最小なので、一般に、不均一検定システムより
も便利で、使用が容易である。
【０００３】例えば、典型的なサンドイッチイムノアッ
セイは固定化抗体をテスト媒体と共にインキュベイショ
ンすることを包含する。もし、抗原が媒体中にあれば、
抗体と結合する。インキュベイション後、分離工程で非
結合抗原を除去する。ラベルされた抗体溶液との第２も
しくは同時インキュベイションの後、結合抗原は固定化
抗体とラベルされた抗体の間で「サンドイッチ」され
る。第２の分離工程の後、培地中の抗原の量として、ラ
ベルされた抗体の量を測定できる。このシステムは一連
のインキュベイションおよび分離工程を包含するので時
間がかかる。診断検定に於ける従来の技術における努力
の焦点は均一検定と、非結合の目的物質に対立するもの
としての結合した物質の量のわずかな差を区別できるラ
ベルの開発に向けられている。本発明の一つの目的はラ
ベル自体が、例えば、非結合のときに対して化学ルミネ
センスの能力に検出できる変化を受ける検定システムで
ある。本発明のもう一つの目的はラベルがその結合もし
くは非結合形のいずれかで実質的に分解もしくは破壊さ
れ、それにより、目的とする反応を同定し、定量するす
ぐ使用できる手段を提供する検定システムである。
セイは固定化抗体をテスト媒体と共にインキュベイショ
ンすることを包含する。もし、抗原が媒体中にあれば、
抗体と結合する。インキュベイション後、分離工程で非
結合抗原を除去する。ラベルされた抗体溶液との第２も
しくは同時インキュベイションの後、結合抗原は固定化
抗体とラベルされた抗体の間で「サンドイッチ」され
る。第２の分離工程の後、培地中の抗原の量として、ラ
ベルされた抗体の量を測定できる。このシステムは一連
のインキュベイションおよび分離工程を包含するので時
間がかかる。診断検定に於ける従来の技術における努力
の焦点は均一検定と、非結合の目的物質に対立するもの
としての結合した物質の量のわずかな差を区別できるラ
ベルの開発に向けられている。本発明の一つの目的はラ
ベル自体が、例えば、非結合のときに対して化学ルミネ
センスの能力に検出できる変化を受ける検定システムで
ある。本発明のもう一つの目的はラベルがその結合もし
くは非結合形のいずれかで実質的に分解もしくは破壊さ
れ、それにより、目的とする反応を同定し、定量するす
ぐ使用できる手段を提供する検定システムである。
【０００４】
【従来の技術】従来技術には複雑さの異なる種々の均一
検定がある。幾つかのシステムでは、例えば、ラベル
は、他の成分の存在下に化学反応に関与できる触媒、例
えば、酵素、補酵素およびコファクターである。関連す
るシステムであるが、他においては、ラベルは化学的も
しくは生化学的反応の基質である。これらのシステムで
は、特異的な容易に検出できる物質、例えば、グルコー
ス、ラクテートまたはアルコールを用いて標的反応をモ
ニターし、測定する。他の検定システムでは、ラベルが
独特の物理的性質を有し、直接それを検出可能にしてい
る。これらのラベルの例には、金属、ヘモグロビンおよ
びクロロフィルが包含される。
検定がある。幾つかのシステムでは、例えば、ラベル
は、他の成分の存在下に化学反応に関与できる触媒、例
えば、酵素、補酵素およびコファクターである。関連す
るシステムであるが、他においては、ラベルは化学的も
しくは生化学的反応の基質である。これらのシステムで
は、特異的な容易に検出できる物質、例えば、グルコー
ス、ラクテートまたはアルコールを用いて標的反応をモ
ニターし、測定する。他の検定システムでは、ラベルが
独特の物理的性質を有し、直接それを検出可能にしてい
る。これらのラベルの例には、金属、ヘモグロビンおよ
びクロロフィルが包含される。
【０００５】また、他の均一検定システムは酵素がカッ
プリングした特異結合反応に基づくもので、分析物は特
異結合反応のリガンドとなる。分析物が存在する場合、
それは、特異的結合相手およびラベル物質からなる抱合
体（conjugate）との特異的結合反応を受ける。同時あ
るいは続いて、ラベルと相互反応する他の物質を加え
る。ラベルの活性は、ラベルがその一つの成分である抱
合体が複合形と非複合形の場合で異なる。このようなシ
ステムは典型的にはラベル試薬として酵素を、また、比
色定量、蛍光定量または化学ルミネセント終点を生ずる
基質を用いている。均一エンザイムイムノアッセイの例
には、米国特許第３６５４０９０号、第３８１７８３７
号および第４１９０４９６号が包含される。蛍光発光物
質（fluorescer）／蛍光消光物質ペアを生じる発色団の
使用を包含する均一検定の他の例は米国特許第４１９９
５５９号、第４１７１３８４号および第４３１８７０７
号に見られる。しかし、幾つかのシステムでは、ラベル
は酵素以外の物質、例えば、ビタミン、ＮＡＤ、ＦＡＤ
またはビオチンであり、にもかかわらず、これらは「モ
ニター」反応に連結できる。このタイプの例は米国特許
第４３８３０３１号である。これらのシステムでは、モ
ニター反応はラベルの活性を変化させる構造的変化に基
づく。
プリングした特異結合反応に基づくもので、分析物は特
異結合反応のリガンドとなる。分析物が存在する場合、
それは、特異的結合相手およびラベル物質からなる抱合
体（conjugate）との特異的結合反応を受ける。同時あ
るいは続いて、ラベルと相互反応する他の物質を加え
る。ラベルの活性は、ラベルがその一つの成分である抱
合体が複合形と非複合形の場合で異なる。このようなシ
ステムは典型的にはラベル試薬として酵素を、また、比
色定量、蛍光定量または化学ルミネセント終点を生ずる
基質を用いている。均一エンザイムイムノアッセイの例
には、米国特許第３６５４０９０号、第３８１７８３７
号および第４１９０４９６号が包含される。蛍光発光物
質（fluorescer）／蛍光消光物質ペアを生じる発色団の
使用を包含する均一検定の他の例は米国特許第４１９９
５５９号、第４１７１３８４号および第４３１８７０７
号に見られる。しかし、幾つかのシステムでは、ラベル
は酵素以外の物質、例えば、ビタミン、ＮＡＤ、ＦＡＤ
またはビオチンであり、にもかかわらず、これらは「モ
ニター」反応に連結できる。このタイプの例は米国特許
第４３８３０３１号である。これらのシステムでは、モ
ニター反応はラベルの活性を変化させる構造的変化に基
づく。
【０００６】他の均一検定システムは偏光蛍光の技術を
包含する。ここでは、分析物が低分子量蛍光抱合体と、
高分子量の結合相手に対する結合を争う。蛍光の偏光は
小さい分子が大きい分子の表面からずれるときに変化す
るので、溶液中の分析物の量を測定するのが可能であ
る。このタイプの検定システムの例は米国特許第４６６
８６４０号である。
包含する。ここでは、分析物が低分子量蛍光抱合体と、
高分子量の結合相手に対する結合を争う。蛍光の偏光は
小さい分子が大きい分子の表面からずれるときに変化す
るので、溶液中の分析物の量を測定するのが可能であ
る。このタイプの検定システムの例は米国特許第４６６
８６４０号である。
【０００７】均一検定システムのさらに他のタイプには
非輻射性エネルギー転移を包含する。これらのシステム
では、二つの分子が接近したときの一つの分子からの光
の他への吸収をモニター反応として用いる。一般に、こ
れらの方法は二通りに記載されている。一つの方法で
は、第１の分子が化学ルミネセントで、励起されると、
発生した電磁気エネルギーの一部が、接近しているべき
第２の「吸収体」分子に転移される。第２の分子がエネ
ルギーを吸収し、異なる波長で発光すると、光の一部
が、吸収体分子に接近している化学ルミネセント分子の
数に比例したスペクトルシフトを示す。他のタイプの非
輻射性エネルギー検定システムでは、第１の分子が蛍光
体で、外部の光の「吸収体」となる。第２の蛍光分子の
存在下、エネルギーの一部が転移し、異なる波長で発光
する。該発光は互いに接近した「吸収体」および「発光
体」分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。ダブ
ル・プローブ検定システムの別のタイプが米国特許第４
６７０３７９号に見られる。第１のプローブは触媒でラ
ベルされており、第２はアポ発光体（apoluminescer）
でラベルされている。両方のプローブとも標的核酸配列
の隣合う区域を目標とする。両方のプローブが一旦標的
とハイブリッド化したら、基質を加える。触媒は基質を
転換ラジカルに変え、これは順次、第２のプローブ上の
アポ発光体を発光体（luminescer）に変える。これはハ
イブリッド化が起こったときだけ生ずる。これらの原理
を用いて、共通の分析物に同時に結合する二つのラベル
された物質に基づく検定が開発されている。
非輻射性エネルギー転移を包含する。これらのシステム
では、二つの分子が接近したときの一つの分子からの光
の他への吸収をモニター反応として用いる。一般に、こ
れらの方法は二通りに記載されている。一つの方法で
は、第１の分子が化学ルミネセントで、励起されると、
発生した電磁気エネルギーの一部が、接近しているべき
第２の「吸収体」分子に転移される。第２の分子がエネ
ルギーを吸収し、異なる波長で発光すると、光の一部
が、吸収体分子に接近している化学ルミネセント分子の
数に比例したスペクトルシフトを示す。他のタイプの非
輻射性エネルギー検定システムでは、第１の分子が蛍光
体で、外部の光の「吸収体」となる。第２の蛍光分子の
存在下、エネルギーの一部が転移し、異なる波長で発光
する。該発光は互いに接近した「吸収体」および「発光
体」分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。ダブ
ル・プローブ検定システムの別のタイプが米国特許第４
６７０３７９号に見られる。第１のプローブは触媒でラ
ベルされており、第２はアポ発光体（apoluminescer）
でラベルされている。両方のプローブとも標的核酸配列
の隣合う区域を目標とする。両方のプローブが一旦標的
とハイブリッド化したら、基質を加える。触媒は基質を
転換ラジカルに変え、これは順次、第２のプローブ上の
アポ発光体を発光体（luminescer）に変える。これはハ
イブリッド化が起こったときだけ生ずる。これらの原理
を用いて、共通の分析物に同時に結合する二つのラベル
された物質に基づく検定が開発されている。
【０００８】このエネルギー転移検定システムのタイプ
の具体例は１９８５年１０月３０日に発行されたイレイ
ザーら（Elazar et al）のヨーロッパ特許出願第８５１
０５１３０.０号（公開番号第０１５９７１９号）であ
り、標的遺伝子物質の同一または対立鎖を相補する二つ
の一本鎖核酸プローブの使用を開示している。各プロー
ブは二つのラベルが集まったときだけシグナルを発生で
きる部分でラベルされている。本発明と異なり、イレイ
ザーらダブル・ハイブリッドまたはマルチ・ハイブリッ
ドの形成および検出を包含する。同様に、１９８３年１
月２６日に発行されたヘラーら（Heller et al）のヨー
ロッパ特許出願第８２３０３６９９.１号（公開番号第
００７０６８５号）および同日の関連するモリソンら
（Morrisonet al）のヨーロッパ特許出願第８２３０３
７００.７号（公開番号第００７０６８６号）は二つの
発光体プローブを用いる均一検定システムを開示してい
る。光ラベルの少なくとも一つが吸収体／発光体タイプ
のもので、二つのプローブが標的とハイブリッド形成す
ると、二つラベルの間でエネルギー転移が起こるように
なっている。第２の発光がハイブリッド形成を検出す
る。このタイプの抗原検定は前記モリソンらに開示され
ている。
の具体例は１９８５年１０月３０日に発行されたイレイ
ザーら（Elazar et al）のヨーロッパ特許出願第８５１
０５１３０.０号（公開番号第０１５９７１９号）であ
り、標的遺伝子物質の同一または対立鎖を相補する二つ
の一本鎖核酸プローブの使用を開示している。各プロー
ブは二つのラベルが集まったときだけシグナルを発生で
きる部分でラベルされている。本発明と異なり、イレイ
ザーらダブル・ハイブリッドまたはマルチ・ハイブリッ
ドの形成および検出を包含する。同様に、１９８３年１
月２６日に発行されたヘラーら（Heller et al）のヨー
ロッパ特許出願第８２３０３６９９.１号（公開番号第
００７０６８５号）および同日の関連するモリソンら
（Morrisonet al）のヨーロッパ特許出願第８２３０３
７００.７号（公開番号第００７０６８６号）は二つの
発光体プローブを用いる均一検定システムを開示してい
る。光ラベルの少なくとも一つが吸収体／発光体タイプ
のもので、二つのプローブが標的とハイブリッド形成す
ると、二つラベルの間でエネルギー転移が起こるように
なっている。第２の発光がハイブリッド形成を検出す
る。このタイプの抗原検定は前記モリソンらに開示され
ている。
【０００９】大部分の生物学的物質はいずれの合理的な
感度レベルでは容易に直接検出できず、あるタイプの結
合反応が必要である。前記したところから明らかなよう
に、従来技術は、結合および非結合ラベルの間を有意に
区別できない。かかる検定は高濃度で存在する分析物の
検出、例えば、血液御呼び尿中種々の薬剤のモニターの
み有用である。臨床診断の分野においては、二つの結合
相手のラベルの安定性を変える能力、例えば、結合また
は非結合形におけるラベルの選択的除去または破壊に基
づく直接検出均一検定を必要としている。ヒルシェフィ
ールド（hirshefield）はフルオレセンス・バックグラ
ウンド・ディスクリミネイション・バイ・プレブリーチ
ング（Fluorescence Background Discrimination by Pr
ebleaching）、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー
・アンド・シトケミストリー（J. Histochemistry and
Cytochemistry）、２７／１、９６ー１０１（１９７
９）はラベル分子または少なくともそれらの蛍光を破壊
しうる光化学ブリーチングを包含する幾分関連した電子
光学技術を開示しているが、本発明は光化学ブリーチン
グまたは診断検定におけるラベルの選択的除去または破
壊をおこなう他の技術の使用を教示または示唆するもの
ではない。本発明は従来技術よりも感度が数オーダー良
好なので診断検定における現在の要求を満たすものであ
る。従来技術の感度範囲は１０ -13モルの範囲より良く
はないが、本発明は１０-16モル範囲の感度である。
感度レベルでは容易に直接検出できず、あるタイプの結
合反応が必要である。前記したところから明らかなよう
に、従来技術は、結合および非結合ラベルの間を有意に
区別できない。かかる検定は高濃度で存在する分析物の
検出、例えば、血液御呼び尿中種々の薬剤のモニターの
み有用である。臨床診断の分野においては、二つの結合
相手のラベルの安定性を変える能力、例えば、結合また
は非結合形におけるラベルの選択的除去または破壊に基
づく直接検出均一検定を必要としている。ヒルシェフィ
ールド（hirshefield）はフルオレセンス・バックグラ
ウンド・ディスクリミネイション・バイ・プレブリーチ
ング（Fluorescence Background Discrimination by Pr
ebleaching）、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー
・アンド・シトケミストリー（J. Histochemistry and
Cytochemistry）、２７／１、９６ー１０１（１９７
９）はラベル分子または少なくともそれらの蛍光を破壊
しうる光化学ブリーチングを包含する幾分関連した電子
光学技術を開示しているが、本発明は光化学ブリーチン
グまたは診断検定におけるラベルの選択的除去または破
壊をおこなう他の技術の使用を教示または示唆するもの
ではない。本発明は従来技術よりも感度が数オーダー良
好なので診断検定における現在の要求を満たすものであ
る。従来技術の感度範囲は１０ -13モルの範囲より良く
はないが、本発明は１０-16モル範囲の感度である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は均一検定フォ
ーマットを用いる分析物を感度良く検出する改良法なら
びにそのための組成物を開示することを目的とする。ま
た、本発明は本明細書に開示した均一法と他の分離法を
組み合わせて非特異的バックグラウンドを減少させる分
離を包含する検定の感度を増加させる改良法の提供も目
的とする。本発明の原理はラベルの化学的もしくは生化
学的試薬に対する安定性の差に基づく。本発明者は、あ
る種のラベルは結合相手と結合するときはいつも、該結
合相手がそれに対する結合物質と結合するときに該ラベ
ルの安定性が変化する、もしくは、しうることを見出し
た。また、本発明は該ラベル安定性の差を、均一診断検
定システムを用いる分析物の感度良好な検出に採用でき
る方法を開示することを目的とする。本発明のさらにも
う一つの目的は相補的標的ポリヌクレオチド配列の存在
の感度良好な検出用の該均一診断検定における化学ルミ
ネセント、アクリジニウムエステル−ラベルＤＮＡプロ
ーブの使用を開示することである。
ーマットを用いる分析物を感度良く検出する改良法なら
びにそのための組成物を開示することを目的とする。ま
た、本発明は本明細書に開示した均一法と他の分離法を
組み合わせて非特異的バックグラウンドを減少させる分
離を包含する検定の感度を増加させる改良法の提供も目
的とする。本発明の原理はラベルの化学的もしくは生化
学的試薬に対する安定性の差に基づく。本発明者は、あ
る種のラベルは結合相手と結合するときはいつも、該結
合相手がそれに対する結合物質と結合するときに該ラベ
ルの安定性が変化する、もしくは、しうることを見出し
た。また、本発明は該ラベル安定性の差を、均一診断検
定システムを用いる分析物の感度良好な検出に採用でき
る方法を開示することを目的とする。本発明のさらにも
う一つの目的は相補的標的ポリヌクレオチド配列の存在
の感度良好な検出用の該均一診断検定における化学ルミ
ネセント、アクリジニウムエステル−ラベルＤＮＡプロ
ーブの使用を開示することである。
【００１１】
【課題を解決するするための手段および発明の実施の形
態】要約すると、本発明は診断検定御および方法からな
る。該方法は媒体中の分析物の検出に使用でき、該分析
物は特異的結合ペアの一部である。分析物を含有すると
思われる媒体を結合相手と合すると、結合相手に結合し
ているラベル物質は、分析物が該特異的結合相手と結合
するたびに安定性の検出できる変化または相違する分解
を受ける。具体例においては、一本鎖核酸プローブがそ
の上の実質的にいずれの所望の部分または場所にラベル
を含むように修飾されている。プローブラベルは標的核
酸配列がプローブとハイブリッド形成するか否かにより
安定性の異なるものまたは相違する分解に感受性のもの
である。特に、本発明は結合プローブ上のラベルが非結
合プローブに関して安定化されている検出システムから
なる。この安定化は挿入（intercalation）によって促
進される。アクリジニウムエステルを含め、ＤＮＡ挿入
化合物は特に、しかし、専らではなく、本発明の検定シ
ステムに使用するのに適している。ＤＮＡ挿入物は二本
鎖ＤＮＡと非共有的に結合することが知られており、Ｄ
ＮＡの二重螺旋の塩基対間に挿入しうる特徴的な偏平分
子である。本発明者らは、アクリジニウムエステル類が
アデニンとチミジンの塩基対に富む領域に好んで挿入さ
れるという証拠を持っている。
態】要約すると、本発明は診断検定御および方法からな
る。該方法は媒体中の分析物の検出に使用でき、該分析
物は特異的結合ペアの一部である。分析物を含有すると
思われる媒体を結合相手と合すると、結合相手に結合し
ているラベル物質は、分析物が該特異的結合相手と結合
するたびに安定性の検出できる変化または相違する分解
を受ける。具体例においては、一本鎖核酸プローブがそ
の上の実質的にいずれの所望の部分または場所にラベル
を含むように修飾されている。プローブラベルは標的核
酸配列がプローブとハイブリッド形成するか否かにより
安定性の異なるものまたは相違する分解に感受性のもの
である。特に、本発明は結合プローブ上のラベルが非結
合プローブに関して安定化されている検出システムから
なる。この安定化は挿入（intercalation）によって促
進される。アクリジニウムエステルを含め、ＤＮＡ挿入
化合物は特に、しかし、専らではなく、本発明の検定シ
ステムに使用するのに適している。ＤＮＡ挿入物は二本
鎖ＤＮＡと非共有的に結合することが知られており、Ｄ
ＮＡの二重螺旋の塩基対間に挿入しうる特徴的な偏平分
子である。本発明者らは、アクリジニウムエステル類が
アデニンとチミジンの塩基対に富む領域に好んで挿入さ
れるという証拠を持っている。
【００１２】以下、特にアクリジニウムエステルでラベ
ルされたプローブを参照して本発明を記載するが、本発
明はラベルが成分である抱合体に結合する場合に相違す
る分解または安定性の変化に感受性な均等なラベルおよ
び検定フォーマットの使用も意図していると理解される
べきである。本明細書にさらに詳しく説明するように、
他の適当なラベル化合物には核酸に存在するアミン、特
に、非ハイブリッド化プローブ上のラベルの近傍のアミ
ンにより不安定化される物質を包含する。さらに、疎水
性環境と相互作用できる、例えば、塩基対の間への挿入
によるラベル物質も使用できる。本発明は一般に、結合
形と非結合抱合体形を比較したときに、ラベルの選択的
な実質的な分解を包含するいずれのシステムにも適用で
きる。さらに、いずれの分離または洗浄工程も含まず、
検定システムが比較的単純な故に、従来のシステムより
も迅速で、経費が少ない。ラベルの結合および非結合抱
合体形間の安定性に大きな差異がある場合、残余または
非結合ラベル抱合体は実質的に全て破壊され、そのた
め、検出されないので、該システムは従来のシステムよ
りさらに感度が良くなる。最後に、該システムは非常に
融通性があり、単独でも、また、他の分離方法と組み合
わせても使用でき、非常に低いバックグラウンドノイズ
を達成できる。本発明は感染症、遺伝的およびウイルス
病の検出および癌診断を含むプローブ診断に有用であ
る。
ルされたプローブを参照して本発明を記載するが、本発
明はラベルが成分である抱合体に結合する場合に相違す
る分解または安定性の変化に感受性な均等なラベルおよ
び検定フォーマットの使用も意図していると理解される
べきである。本明細書にさらに詳しく説明するように、
他の適当なラベル化合物には核酸に存在するアミン、特
に、非ハイブリッド化プローブ上のラベルの近傍のアミ
ンにより不安定化される物質を包含する。さらに、疎水
性環境と相互作用できる、例えば、塩基対の間への挿入
によるラベル物質も使用できる。本発明は一般に、結合
形と非結合抱合体形を比較したときに、ラベルの選択的
な実質的な分解を包含するいずれのシステムにも適用で
きる。さらに、いずれの分離または洗浄工程も含まず、
検定システムが比較的単純な故に、従来のシステムより
も迅速で、経費が少ない。ラベルの結合および非結合抱
合体形間の安定性に大きな差異がある場合、残余または
非結合ラベル抱合体は実質的に全て破壊され、そのた
め、検出されないので、該システムは従来のシステムよ
りさらに感度が良くなる。最後に、該システムは非常に
融通性があり、単独でも、また、他の分離方法と組み合
わせても使用でき、非常に低いバックグラウンドノイズ
を達成できる。本発明は感染症、遺伝的およびウイルス
病の検出および癌診断を含むプローブ診断に有用であ
る。
【００１３】本記載では以下の定義を用いる。 １．アクリジニウムエステル：第４級窒素中心を有し、
その９−位で誘導体化され、不安定なフェニルエステル
基を生じるアクリジンの誘導体、具体的には、４−（２
−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル
−１０−メチルアクリジアイニウム ９−カルボキシレ
ート フルオロサルフェート:
その９−位で誘導体化され、不安定なフェニルエステル
基を生じるアクリジンの誘導体、具体的には、４−（２
−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル
−１０−メチルアクリジアイニウム ９−カルボキシレ
ート フルオロサルフェート:
【化１】
【００１４】２．アクリジニウムエステル類：次の一般
式の部分：
式の部分：
【化２】 Ｒ1＝アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキ
ル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリ
ールオキシまたはＸ＝ハロゲンの場合はなし。Ｒ2＝
Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、
置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリール
オキシ、もし、そしてＸ＝Ｎのときだけ。Ｒ3＝Ｈ、ア
ミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミ
ノ、アミド、アセチル、アルキル、アルケニル、アリー
ル、置換アセチル、置換アルキル、置換アルケニル、置
換アリール、アルコキシ、アリールオキシ。Ｒ4＝アル
キル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アル
ケニル、置換アリール。Ｘ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置
換リン、置換硫黄、置換ホウ素または置換ヒ素。Ｙ＝
Ｏ、ＳまたはＮＨ。Ｒ1および／またはＲ2および／また
はＲ3および／またはＲ4は化学的抱合を可能にする反応
性部位を有する。
ル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリ
ールオキシまたはＸ＝ハロゲンの場合はなし。Ｒ2＝
Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、
置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリール
オキシ、もし、そしてＸ＝Ｎのときだけ。Ｒ3＝Ｈ、ア
ミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミ
ノ、アミド、アセチル、アルキル、アルケニル、アリー
ル、置換アセチル、置換アルキル、置換アルケニル、置
換アリール、アルコキシ、アリールオキシ。Ｒ4＝アル
キル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アル
ケニル、置換アリール。Ｘ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置
換リン、置換硫黄、置換ホウ素または置換ヒ素。Ｙ＝
Ｏ、ＳまたはＮＨ。Ｒ1および／またはＲ2および／また
はＲ3および／またはＲ4は化学的抱合を可能にする反応
性部位を有する。
【００１５】３．分析物−特に制限するものではない
が、抗原およびそれに対する抗体、ハプテンおよびそれ
に対する抗体、ホルモン、医薬、代謝物、ビタミン、補
酵素および受容体を含むその結合相手、ポリヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドのハイブリッドおよびそれらに対する抗
体および結合物質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドおよびそれらとハイブリッド形成するポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド、金属およびそれに
対するキレート剤を包含する一つ以上の特異的結合相手
と結合反応する能力のあるあらゆる物質、特に、標的核
酸含有配列。
が、抗原およびそれに対する抗体、ハプテンおよびそれ
に対する抗体、ホルモン、医薬、代謝物、ビタミン、補
酵素および受容体を含むその結合相手、ポリヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドのハイブリッドおよびそれらに対する抗
体および結合物質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドおよびそれらとハイブリッド形成するポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド、金属およびそれに
対するキレート剤を包含する一つ以上の特異的結合相手
と結合反応する能力のあるあらゆる物質、特に、標的核
酸含有配列。
【００１６】４．結合相手（結合パートナー）−分析物
と特異的結合反応することのできるあらゆる分子または
物質、特に、核酸プローブ。
と特異的結合反応することのできるあらゆる分子または
物質、特に、核酸プローブ。
【００１７】５．二本鎖構造：二つの相補一本鎖核酸分
子のアニーリングにより形成される二本鎖複合体。
子のアニーリングにより形成される二本鎖複合体。
【００１８】６．ハイブリッド化：二つの相補一本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ分子間またはＤＮＡと相補ＲＮＡ分子
間の安定な二本鎖構造の形成。二本鎖構造形成は相補的
塩基対に特異なものであり、それにより、ハイブリッド
化した特定の遺伝子の遺伝コードが再生される。
ＮＡまたはＲＮＡ分子間またはＤＮＡと相補ＲＮＡ分子
間の安定な二本鎖構造の形成。二本鎖構造形成は相補的
塩基対に特異なものであり、それにより、ハイブリッド
化した特定の遺伝子の遺伝コードが再生される。
【００１９】７．結合：結合相互作用が分子とその特異
結合相手の間で生ずる条件。
結合相手の間で生ずる条件。
【００２０】８．安定な：化学的または生化学的崩壊、
反応、分解、置換または修飾に対する耐性のある。
反応、分解、置換または修飾に対する耐性のある。
【００２１】９．安定性：化学的または生化学的崩壊、
反応、分解、置換または修飾に対する物質の耐性。
反応、分解、置換または修飾に対する物質の耐性。
【００２２】アクリジニウムエステル類は溶液中で対応
する塩基と平衡して存在することが知られている。高い
pHにおいて、塩基形成が優性であり、第４級窒素種は低
いpHで再形成される。化学ルミネセンス反応が塩基、特
に、過酸化水素を含む水酸化ナトリウム水溶液の添加に
より影響されることも知られている。化学ルミネセンス
はアクリジニウム種に対するヒドロペルオキサイドイオ
ンによる攻撃を包含し、電子的に励起したＮ−メチルア
クリドンを生成する。総括的に、ウイークス（Weeks）
ら、「イムノアッセイにおける高特異的活性ラベルとし
てのアクリジニウムエステル類」、クリニカル・ケミス
トリー（Clin. Chem.）、２９１８、１４７４ー１４７
９（１９８３）参照。該反応を以下に図式化する。
する塩基と平衡して存在することが知られている。高い
pHにおいて、塩基形成が優性であり、第４級窒素種は低
いpHで再形成される。化学ルミネセンス反応が塩基、特
に、過酸化水素を含む水酸化ナトリウム水溶液の添加に
より影響されることも知られている。化学ルミネセンス
はアクリジニウム種に対するヒドロペルオキサイドイオ
ンによる攻撃を包含し、電子的に励起したＮ−メチルア
クリドンを生成する。総括的に、ウイークス（Weeks）
ら、「イムノアッセイにおける高特異的活性ラベルとし
てのアクリジニウムエステル類」、クリニカル・ケミス
トリー（Clin. Chem.）、２９１８、１４７４ー１４７
９（１９８３）参照。該反応を以下に図式化する。
【００２３】アクリジニウムエステル反応図
【化３】
【００２４】本発明は以下のように実施することができ
る。第１に、実施される検定用の結合物質と１以上の結
合パートナーとからなる結合パートナーを選択する。こ
れらの対は、抗原とその抗体；ハプテンとその抗体；ホ
ルモン、薬剤、代謝産物、ビタミン、補酵素と受容体を
包含するその結合パートナー；ポリヌクレオチド、オリ
ゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチドのハイブリッドと抗体およびその結合物質；
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとそのハイ
ブリッド化しうるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド；金属とそのキレート化剤である。第２に、用い
られる検定フォーマットを選択する。これらは、直接結
合検定、競合検定、配列飽和法(sequential saturation
methods)およびサンドイッチ検定からなるフォーマッ
トから選択することができる。第３に、実施される検定
用のラベルを選択する。これは、直接または間接的に比
色定量法、蛍光分析法、化学ルミネッセンス法またはバ
イオルミネッセンス法により検出できるラベルであれば
よい。加えて、該ラベルは、その能力を修正し、検出さ
れるように、化学的または生物学的に減成しうる特性を
有し、かかる減成は、ラベル化結合パートナーとその結
合物質および反応に関与するかもしれない他の結合パー
トナーとその結合物質の間の結合に悪影響を及ぼさない
条件下にて可能である。好ましいラベルは、酸、塩基ま
たはパーオキジデートまたは酵素のような選択的酸化剤
を照射した後、その能力に影響を及ぼし、検出されるも
のである。第４に、当業者に公知の化学方法を用い、化
学または生物学的減成に対するラベル感受性が、ラベル
化結合パートナーとその特異結合物質(類)との相互作用
を修正するその部位にて、ラベルを結合物質に付着させ
る。ある場合には、複数の異なる部位をラベル結合につ
いて試験し、最も特異的な減成を与える部位を用いるこ
とができる。第５に、その結合物質と共に、またはなし
でラベル化結合パートナーの最適検出識別を付与する化
学的または生物学的減成条件を最大限に活用する。最後
に、予め選択した検定フォーマットを用いて検定系の能
力を試験し、一般に： ａ．インキュベートし、 ｂ．選択的に減成し、 ｃ．検出するか、または ａ．インキュベートと選択的減成を同時に行い、 ｂ．検出する の工程を用い、分析物を定性的にまたは定量的に検出す
る。
る。第１に、実施される検定用の結合物質と１以上の結
合パートナーとからなる結合パートナーを選択する。こ
れらの対は、抗原とその抗体；ハプテンとその抗体；ホ
ルモン、薬剤、代謝産物、ビタミン、補酵素と受容体を
包含するその結合パートナー；ポリヌクレオチド、オリ
ゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチドのハイブリッドと抗体およびその結合物質；
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとそのハイ
ブリッド化しうるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド；金属とそのキレート化剤である。第２に、用い
られる検定フォーマットを選択する。これらは、直接結
合検定、競合検定、配列飽和法(sequential saturation
methods)およびサンドイッチ検定からなるフォーマッ
トから選択することができる。第３に、実施される検定
用のラベルを選択する。これは、直接または間接的に比
色定量法、蛍光分析法、化学ルミネッセンス法またはバ
イオルミネッセンス法により検出できるラベルであれば
よい。加えて、該ラベルは、その能力を修正し、検出さ
れるように、化学的または生物学的に減成しうる特性を
有し、かかる減成は、ラベル化結合パートナーとその結
合物質および反応に関与するかもしれない他の結合パー
トナーとその結合物質の間の結合に悪影響を及ぼさない
条件下にて可能である。好ましいラベルは、酸、塩基ま
たはパーオキジデートまたは酵素のような選択的酸化剤
を照射した後、その能力に影響を及ぼし、検出されるも
のである。第４に、当業者に公知の化学方法を用い、化
学または生物学的減成に対するラベル感受性が、ラベル
化結合パートナーとその特異結合物質(類)との相互作用
を修正するその部位にて、ラベルを結合物質に付着させ
る。ある場合には、複数の異なる部位をラベル結合につ
いて試験し、最も特異的な減成を与える部位を用いるこ
とができる。第５に、その結合物質と共に、またはなし
でラベル化結合パートナーの最適検出識別を付与する化
学的または生物学的減成条件を最大限に活用する。最後
に、予め選択した検定フォーマットを用いて検定系の能
力を試験し、一般に： ａ．インキュベートし、 ｂ．選択的に減成し、 ｃ．検出するか、または ａ．インキュベートと選択的減成を同時に行い、 ｂ．検出する の工程を用い、分析物を定性的にまたは定量的に検出す
る。
【００２５】本発明を用いる場合、化学ルミネッセンス
のアクリジニウムエステルでラベル化したオリゴヌクレ
オチドプローブが、ハイブリダイゼーションを介する特
異的ポリヌクレオチド配列の検出用に特に有用である。
アクリジニウムエステルを、１９８７年９月２１日出願
の米国特許出願(まだ番号が付与されていない)、アーノ
ルドら(Ａrnold, et al.)による「ヌクレオチドプロー
ブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているよう
に、ＤＮＡプローブおよび／または混合ヌクレオチド／
非ヌクレオチドポリマー上の多くの異なる部位にて付着
させてもよい。これは、ヌクレオチド塩基、リン酸塩バ
ックボーン、糖残基、オリゴヌクレオチドの３’末端お
よび５’末端ならびに混合ヌクレオチド／非ヌクレオチ
ドポリマーの非ヌクレオチドモノマー単位をラベル化す
る能力を包含する。かかるアクリジニウムエステルラベ
ル化プローブは、それらがハイブリッド化された場合と
比較して、それらが付着するプローブが溶液中にてフリ
ーである場合には、有意な異なる化学安定性を示しう
る。この異なる安定性は、プローブにおけるアクリジニ
ウムエステル、アクリジニウムエステルラベル付近のヌ
クレオチド残基の位置およびターゲットポリヌクレオチ
ドと安定したハイブリッド物を形成する他のプローブ分
子の存在に依存している。グラフ表示を以下に示す。
のアクリジニウムエステルでラベル化したオリゴヌクレ
オチドプローブが、ハイブリダイゼーションを介する特
異的ポリヌクレオチド配列の検出用に特に有用である。
アクリジニウムエステルを、１９８７年９月２１日出願
の米国特許出願(まだ番号が付与されていない)、アーノ
ルドら(Ａrnold, et al.)による「ヌクレオチドプロー
ブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているよう
に、ＤＮＡプローブおよび／または混合ヌクレオチド／
非ヌクレオチドポリマー上の多くの異なる部位にて付着
させてもよい。これは、ヌクレオチド塩基、リン酸塩バ
ックボーン、糖残基、オリゴヌクレオチドの３’末端お
よび５’末端ならびに混合ヌクレオチド／非ヌクレオチ
ドポリマーの非ヌクレオチドモノマー単位をラベル化す
る能力を包含する。かかるアクリジニウムエステルラベ
ル化プローブは、それらがハイブリッド化された場合と
比較して、それらが付着するプローブが溶液中にてフリ
ーである場合には、有意な異なる化学安定性を示しう
る。この異なる安定性は、プローブにおけるアクリジニ
ウムエステル、アクリジニウムエステルラベル付近のヌ
クレオチド残基の位置およびターゲットポリヌクレオチ
ドと安定したハイブリッド物を形成する他のプローブ分
子の存在に依存している。グラフ表示を以下に示す。
【化４】
【００２６】ＤＮＡプローブ分子におけるアクリジニウ
ムエステルの異なる安定性に寄与する因子を測定する方
法において、非ハイブリッド化プローブ(ヌクレオチド
および混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドの両方)の塩
基上の遊離アミンが、特にアルカリ性雰囲気下にてアク
リジニウムエステルを不安定にすることが判明した。同
時に、アクリジニウムエステルがプローブの末端に隣接
している場合、いったんハイブリッド化が起こると、そ
れはターゲット配列により寄与されたアミンによってア
ルカリに対して不安定となりうる。プローブが特異ポリ
ヌクレオチド(結合物質)配列とハイブリッドを形成する
場合、プローブアミンは相補性ヌクレオチドと対をなす
塩基と関係し、特にアルカリ性条件下、アクリジニウム
エステルを不安定にする能力は制限される。同時に、ハ
イブリッド・デュプレックス(hybrid duplex)、特に、
アデニン／チミジン塩基対密度の部位に挿入することに
より、アクリジニウムエステルはさらに減成に対して安
定化することが判明した。以下のセクションにおいて説
明されているように、多くの他の挿入部位もまた、良好
な種々の加水分解を提供することが判明した。
ムエステルの異なる安定性に寄与する因子を測定する方
法において、非ハイブリッド化プローブ(ヌクレオチド
および混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドの両方)の塩
基上の遊離アミンが、特にアルカリ性雰囲気下にてアク
リジニウムエステルを不安定にすることが判明した。同
時に、アクリジニウムエステルがプローブの末端に隣接
している場合、いったんハイブリッド化が起こると、そ
れはターゲット配列により寄与されたアミンによってア
ルカリに対して不安定となりうる。プローブが特異ポリ
ヌクレオチド(結合物質)配列とハイブリッドを形成する
場合、プローブアミンは相補性ヌクレオチドと対をなす
塩基と関係し、特にアルカリ性条件下、アクリジニウム
エステルを不安定にする能力は制限される。同時に、ハ
イブリッド・デュプレックス(hybrid duplex)、特に、
アデニン／チミジン塩基対密度の部位に挿入することに
より、アクリジニウムエステルはさらに減成に対して安
定化することが判明した。以下のセクションにおいて説
明されているように、多くの他の挿入部位もまた、良好
な種々の加水分解を提供することが判明した。
【００２７】本発明をハイブリダイゼーションに適用す
ることができるいくつかの態様がある。これらは限定す
るものではない。 １．アクリジニウムエステルをプローブの中心部位およ
びアデニン／チミジン塩基対の隣接部位に付着させる。
好ましい方法は、１９８７年９月２１日出願の米国特許
出願(まだ番号が付与されていない)、アーノルドら(Ａr
nold, et al.)による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌ
クレオチド結合試薬」に記載されているように、アクリ
ジニウムエステルを非ヌクレオチドモノマー単位に付着
させ、すなわち、ターゲットポリヌクレオチド配列のす
ぐ隣くにあるヌクレオチドに対して相補的であるヌクレ
オチドモノマー単位に挿入し、付着させることである。
かかる配置は、アクリジニウムエステルの両端における
ヌクレオチド塩基のアミンを制限し、挿入用部位を提供
するのに役立つ。
ることができるいくつかの態様がある。これらは限定す
るものではない。 １．アクリジニウムエステルをプローブの中心部位およ
びアデニン／チミジン塩基対の隣接部位に付着させる。
好ましい方法は、１９８７年９月２１日出願の米国特許
出願(まだ番号が付与されていない)、アーノルドら(Ａr
nold, et al.)による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌ
クレオチド結合試薬」に記載されているように、アクリ
ジニウムエステルを非ヌクレオチドモノマー単位に付着
させ、すなわち、ターゲットポリヌクレオチド配列のす
ぐ隣くにあるヌクレオチドに対して相補的であるヌクレ
オチドモノマー単位に挿入し、付着させることである。
かかる配置は、アクリジニウムエステルの両端における
ヌクレオチド塩基のアミンを制限し、挿入用部位を提供
するのに役立つ。
【００２８】２．アクリジニウムエステルをプローブの
３’または５’末端のいずれかに付着させ、第２のプロ
ーブとのターゲットポリヌクレオチドにより寄与された
アミンの付近の作用を制限し、第１のプローブの付近を
ハイブリッド化する。該第２プローブが、デュプレック
ス形成に基づくＡ／Ｔ塩基対に富んだ部位をクリエート
する場合、それもまた望ましいことである。たとえこの
ダブルプローブまたはサンドイッチ系が、１つだけでは
なく、２つのデュプレックスの形成に依存しているとし
ても、非常に短いプローブ、すなわち、長さが約５〜１
５ヌクレオチドのプローブにより識別することができる
マイナーな塩基対変化を敏感に検出する方法を提供す
る。正常な状況下、かかる短いプローブは、適当なハイ
ブリダイゼーション条件下にて単一のミスマッチを識別
する能力を有する。しかしながら、それらは常套手段と
しては用いられていない。すなわち、該短いプローブ
は、存在する多数の複合ＤＮＡまたはＲＮＡ配列内に含
まれる複数の特異部位とハイブリッド形成するかもしれ
ない。２つの異なるプローブが、すぐ隣のポリヌクレオ
チド部位とハイブリッド形成しなければならないという
条件下では、かかる部位は特異的にターゲットとされ、
同定することができる。したがって、短プローブ識別の
利点は、両方のプローブによりスパンされた部位の特異
性を維持しながら利用できることである。
３’または５’末端のいずれかに付着させ、第２のプロ
ーブとのターゲットポリヌクレオチドにより寄与された
アミンの付近の作用を制限し、第１のプローブの付近を
ハイブリッド化する。該第２プローブが、デュプレック
ス形成に基づくＡ／Ｔ塩基対に富んだ部位をクリエート
する場合、それもまた望ましいことである。たとえこの
ダブルプローブまたはサンドイッチ系が、１つだけでは
なく、２つのデュプレックスの形成に依存しているとし
ても、非常に短いプローブ、すなわち、長さが約５〜１
５ヌクレオチドのプローブにより識別することができる
マイナーな塩基対変化を敏感に検出する方法を提供す
る。正常な状況下、かかる短いプローブは、適当なハイ
ブリダイゼーション条件下にて単一のミスマッチを識別
する能力を有する。しかしながら、それらは常套手段と
しては用いられていない。すなわち、該短いプローブ
は、存在する多数の複合ＤＮＡまたはＲＮＡ配列内に含
まれる複数の特異部位とハイブリッド形成するかもしれ
ない。２つの異なるプローブが、すぐ隣のポリヌクレオ
チド部位とハイブリッド形成しなければならないという
条件下では、かかる部位は特異的にターゲットとされ、
同定することができる。したがって、短プローブ識別の
利点は、両方のプローブによりスパンされた部位の特異
性を維持しながら利用できることである。
【００２９】３．アクリジニウムエステルを、所望のタ
ーゲットポリヌクレオチドでないポリヌクレオチド配列
とのミスマッチ部位にて、または付近にて付着させる。
このように、ミスマッチ部位のまわりのデュプレックス
域は有意に不安定化され、アクリジニウムエステル(仮
にそれがこの部位にて、または付近にて付着している場
合)は減成に対して影響されやすくなるため、わずか１
つのヌクレオチドだけが異なるポリヌクレオチド配列の
間の識別をも達成することができる。
ーゲットポリヌクレオチドでないポリヌクレオチド配列
とのミスマッチ部位にて、または付近にて付着させる。
このように、ミスマッチ部位のまわりのデュプレックス
域は有意に不安定化され、アクリジニウムエステル(仮
にそれがこの部位にて、または付近にて付着している場
合)は減成に対して影響されやすくなるため、わずか１
つのヌクレオチドだけが異なるポリヌクレオチド配列の
間の識別をも達成することができる。
【００３０】４．プローブがターゲットとするハイブリ
ッドの局所的な安定性をモニターするために、プローブ
のある部位にアクリジニウムエステルを付着させる。こ
のように、アクリジニウムエステルは、全体がハイブリ
ッド２本鎖を形成するのではなく局所的なハイブリッド
部位が部分的に会合する条件下での、局所的なハイブリ
ッドの安定性を着実にモニターするのに役立つ。
ッドの局所的な安定性をモニターするために、プローブ
のある部位にアクリジニウムエステルを付着させる。こ
のように、アクリジニウムエステルは、全体がハイブリ
ッド２本鎖を形成するのではなく局所的なハイブリッド
部位が部分的に会合する条件下での、局所的なハイブリ
ッドの安定性を着実にモニターするのに役立つ。
【００３１】上記３つのフォーマットについて１つの好
ましい態様は、ハイブリダイゼーション工程と同じ温
度、典型的には５０〜７０℃にて、異なる加水分解工程
を行なうことである。別の態様は、別の異なる加水分解
工程を室温にて行なうことである。これは、１０〜１１
の範囲のpＨを用い、ハイブリッド化と非ハイブリッド
化アクリジニウムエステルラベル化プローブの間の加水
分解速度に、より大きな差異をもたらす。
ましい態様は、ハイブリダイゼーション工程と同じ温
度、典型的には５０〜７０℃にて、異なる加水分解工程
を行なうことである。別の態様は、別の異なる加水分解
工程を室温にて行なうことである。これは、１０〜１１
の範囲のpＨを用い、ハイブリッド化と非ハイブリッド
化アクリジニウムエステルラベル化プローブの間の加水
分解速度に、より大きな差異をもたらす。
【００３２】実験法および物質 以下の実施例は、例示であり、限定されるものではな
い。これらの実施例は、一般に利用可能なデーターおよ
び最も適当な現象の説明に基づくものである。他の因子
および方法が、さらなる研究により明らかになるかもし
れない。本発明はアクリジニウムエステルラベルを用い
る例示および実施例により詳細に記載されているが、あ
る変形および修正を請求の範囲内で行なってもよく、他
のラベル系もまた請求の範囲内で用いてもよい。
い。これらの実施例は、一般に利用可能なデーターおよ
び最も適当な現象の説明に基づくものである。他の因子
および方法が、さらなる研究により明らかになるかもし
れない。本発明はアクリジニウムエステルラベルを用い
る例示および実施例により詳細に記載されているが、あ
る変形および修正を請求の範囲内で行なってもよく、他
のラベル系もまた請求の範囲内で用いてもよい。
【００３３】
【実施例】実施例１ アクリジニウムエステル-ラベル化プローブの組立て Ａ．アミンリンカー-アームプローブの合成および精製 デオキシオリゴヌクレオチドプローブを、プローブ内部
の５’-末端、ポリリン酸鎖に沿ったある予め選択した
位置のいずれかに位置する、または１つのヌクレオチド
塩基に付着するアミンリンカーアーム(すなわち、アク
リジニウムエステルでラベル化する第１級アミンにて終
止するもの)を有するように合成した。 (i)５’-アミンリンカー-アームをプローブに付着させ
るのに、以下の化合物を用いた：
の５’-末端、ポリリン酸鎖に沿ったある予め選択した
位置のいずれかに位置する、または１つのヌクレオチド
塩基に付着するアミンリンカーアーム(すなわち、アク
リジニウムエステルでラベル化する第１級アミンにて終
止するもの)を有するように合成した。 (i)５’-アミンリンカー-アームをプローブに付着させ
るのに、以下の化合物を用いた：
【化５】 (１)この化合物は、これまで、末端アミンリンカー-ア
ーム試薬と称されている。この試薬を以下のように合成
した：無水酢酸エチル中、６-アミノヘキサノールをＳ-
エチルトリフルオロチオアセテートと反応させた。反応
精製物が石油エーテル中にて沈澱し、水中１０％ピリジ
ン混合物で１０分間処理し、形成したＯ-トリフルオロ
アセチルを加水分解し、ガム状形に蒸発乾固した。つい
で、この化合物を、文献（ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ（Nucleic Acids Research），１２（１１），４
５３９（１９８４）参照）に記載されている標準的プロ
トコルに従ってホスフィチレート(phosphitylate)し、
所望の化合物、すなわち、末端アミンリンカー-アーム
試薬(１)を得た。５’-アミンリンカー-アームを有する
プローブを以下のように合成した。アプライド・バイオ
システムズ・インコーポレイション(Ａpplied Ｂiosyst
ems,Ｉnc.)のモデル・３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー
を用い、標準的ホスホルアミジト(phosphoramidite)化
学に従い、所望のヌクレオチド配列のプローブを得、
３’末端から５’末端のプローブを形成した。所望の配
列が完了した後、アミンリンカー-アームは、別のホス
ホルアミジトヌクレオシドがカップリングするのと同じ
ように、末端アミンリンカー-アーム試薬を用いて自動
的にプローブの５’-ヒドロキシル基にカップリングし
た。標準的プロトコルを用い、ついで該プローブを固体
担体から切断し、ＮＨ4ＯＨを用いて脱保護し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動、つづいてセファデックス
(Ｓephadex)Ｇ-２５クロマトグラフィーにより精製し
た。以下のプローブを合成し、この操作に従い精製し
た：
ーム試薬と称されている。この試薬を以下のように合成
した：無水酢酸エチル中、６-アミノヘキサノールをＳ-
エチルトリフルオロチオアセテートと反応させた。反応
精製物が石油エーテル中にて沈澱し、水中１０％ピリジ
ン混合物で１０分間処理し、形成したＯ-トリフルオロ
アセチルを加水分解し、ガム状形に蒸発乾固した。つい
で、この化合物を、文献（ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ（Nucleic Acids Research），１２（１１），４
５３９（１９８４）参照）に記載されている標準的プロ
トコルに従ってホスフィチレート(phosphitylate)し、
所望の化合物、すなわち、末端アミンリンカー-アーム
試薬(１)を得た。５’-アミンリンカー-アームを有する
プローブを以下のように合成した。アプライド・バイオ
システムズ・インコーポレイション(Ａpplied Ｂiosyst
ems,Ｉnc.)のモデル・３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー
を用い、標準的ホスホルアミジト(phosphoramidite)化
学に従い、所望のヌクレオチド配列のプローブを得、
３’末端から５’末端のプローブを形成した。所望の配
列が完了した後、アミンリンカー-アームは、別のホス
ホルアミジトヌクレオシドがカップリングするのと同じ
ように、末端アミンリンカー-アーム試薬を用いて自動
的にプローブの５’-ヒドロキシル基にカップリングし
た。標準的プロトコルを用い、ついで該プローブを固体
担体から切断し、ＮＨ4ＯＨを用いて脱保護し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動、つづいてセファデックス
(Ｓephadex)Ｇ-２５クロマトグラフィーにより精製し
た。以下のプローブを合成し、この操作に従い精製し
た：
【化６】 (ＮＨ2-(ＣＨ2)6はアミンリンカー-アームを示す） (ii)アミンリンカー-アームをプローブの内部に組入る
ため、内部アミンリンカー-アーム試薬、タイプ１（４
原子スペーサ、下記引用特許出願中のＬ１参照）または
タイプ２（２原子スペーサ、下記引用特許出願中のＬ３
参照）またはタイプ７（９原子スペーサ、下記引用特許
出願中のＬ７参照）を、１９８７年９月２１日出願の米
国特許出願番号第０９９０５０号（特表平２−５０３１
４６号）、アーノルドらによる「ヌクレオチドプローブ
用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように
用いた。再度、プローブを標準的ホスホルアミジト化学
を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およ
びセファデックスＧ２５クロマトグラフィーを用いて精
製した。以下のプローブはこの操作に従い合成した： １．)イー・コリー(Ｅ.Ｃoli)からの１６Ｓサブユニッ
トｒＲＮＡに対する３０merコンプレメンタリーは、内
部アミンリンカー-アーム、タイプ１で、配列中の１８
位のアデニン残基を置き換える:
ため、内部アミンリンカー-アーム試薬、タイプ１（４
原子スペーサ、下記引用特許出願中のＬ１参照）または
タイプ２（２原子スペーサ、下記引用特許出願中のＬ３
参照）またはタイプ７（９原子スペーサ、下記引用特許
出願中のＬ７参照）を、１９８７年９月２１日出願の米
国特許出願番号第０９９０５０号（特表平２−５０３１
４６号）、アーノルドらによる「ヌクレオチドプローブ
用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように
用いた。再度、プローブを標準的ホスホルアミジト化学
を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およ
びセファデックスＧ２５クロマトグラフィーを用いて精
製した。以下のプローブはこの操作に従い合成した： １．)イー・コリー(Ｅ.Ｃoli)からの１６Ｓサブユニッ
トｒＲＮＡに対する３０merコンプレメンタリーは、内
部アミンリンカー-アーム、タイプ１で、配列中の１８
位のアデニン残基を置き換える:
【化７】 ２．)クラミディア・トラコマティス(Ｃhlamydia trach
omatis)からの１６Ｓサブユニットに対する３３merコン
プレメンタリーは、内部アミンリンカー-アーム、タイ
プ１で、配列中の２１位のアデニン残基を置き換える
か、
omatis)からの１６Ｓサブユニットに対する３３merコン
プレメンタリーは、内部アミンリンカー-アーム、タイ
プ１で、配列中の２１位のアデニン残基を置き換える
か、
【化８】 または残基２１と２２の間に挿入する：
【化９】 (iii)アミンリンカー-アームを有するヌクレオチド塩基
を、以下のようにプローブに挿入した。以下の配列を有
する鋳型およびプライマーオリゴヌクレオチドを合成し
た： 鋳型３’− ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＴＡ ＣＧＧ ＧＴＴ ＴＡＴ ＡＧＣ ＧＧ−５’ プライマー５’−ＣＧＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＴ−３’ (プライマーおよび伸長プライマーはシィ・トラコマテ
ィスの１６Ｓサブユニットに対して相補的である。) クレノー(Ｋlenow)フラグメントを用いるプライマー伸
長は、ＢＳＡが１０×ニック・トランスレーション・バ
ファーから省略することを除いて、マニアティス（モレ
キュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュア
ル、ティー・マニアティス、１９８２、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリーズ、パブリッシング(M
olecular Cloning, A laboratory Manual, T. Maniati
s, 1982,Cold Spring Harbor Laboratories, Pubs.)）
に記載されているように行ない、アミンリンカー-アー
ム修正塩基アミノ(１２)ｄＵＴＰ(カルバイオケム、カ
リフォルニア)(Ｃalbiochem,Ｃalifornia)を挿入した。
したがって、得られたオリゴマーの配列は：ＣＧＴ Ｔ
ＡＣ ＴＣＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＴＡ(アミノ-１
２-Ｕ)ＣＧＣＣである。プライマー伸長複合体の精製
は、ＮＥＮＳＯＲＢ-２０カートリッジ(デュポン)(Ｄu
Ｐont)を用い、製造業者の奨励する方法に従い実施し
た。(プライマー伸長反応体は、カラムに充填する前
に、ＮＥＮＳＯＲＢ試薬Ａ９００μｌを加えて希釈し
た。該精製オリゴマーを５０％メタノールで溶出し、つ
いでスピード-バク(speed-vac.)にて取り出した)。 Ｂ．アクリジニウムエステルを用いるアミノリンカー-
アームプローブのラベル化および精製 アクリジニウムエステルの２５mＭストック溶液を、蒸
留ＤＭＳＯ中にて調製した。所望量のプローブ(前記セ
クションＡにおけるラベル化した種々のプローブのリス
ト参照)を、１.５ｍｌの円錐形ポリプロピレン管にて蒸
発乾固した。カクテルは以下の成分を列挙した順序にて
加えることにより構成した： ３μｌ 水 １μｌ １Ｍ ＨＥＰＥＳ(pＨ８.０) ４μｌ ＤＭＳＯ(蒸留) ２μｌ ＤＭＳＯ(蒸留)中、２５mＭアクリジニウムエ
ステル 混合物を撹拌し、マイクロ遠心分離機において２秒間ス
ピンに付し(内容物を管の底に集中させる)、３７℃にて
２０分間インキュベーションした。ついで、以下の成分
を、列挙した順序にて反応カクテルに加えた： ３.０μｌ ＤＭＳＯ(蒸留)中、２５mＭアクリジニウム
エステル １.５μｌ 水 ０.５μｌ １Ｍ ＨＥＰＥＳ(pＨ８.０) カクテルを再度撹拌し、スピンし、３７℃にてさらに２
０分間インキュベーションした。未反応ラベルは、５倍
過剰のリシンを用い、０.１Ｍ ＨＥＰＥＳ(pＨ８.０)、
５０％ＤＭＳＯ中、０.１２５Ｍリシンを加えることに
よりクエンチし、室温にて５分間インキュベートした。
ついで、アクリジニウムエステル-ラベル化オリゴマー
を、以下の方法を用いて精製した。クエンチした反応混
合物２０μｌに、担体として３Ｍ ＮaＯＡc(pＨ５.０)
３０μｌ、水２０μｌおよびグリコゲン５μｌ加えた
(グリコゲンは予め処理し、いずれのヌクレアーゼ活性
も除去した)。試料を簡単に撹拌し、無水エタノール６
４０μｌを加えた。該試料を簡単に撹拌し、氷上にて５
〜１０分間インキュベートし、ついでマイクロ遠心分離
機において１５０００rpmにて５分間遠心分離に付し
た。上澄液を注意して除去し、ペレットを０.１Ｍ Ｎa
ＯＡc(pＨ５.０)２０μｌ、０.１％ＳＤＳに再度溶かし
た。ついで、試料を以下に記載のように高速液体クロマ
トグラフィー(ＨＰＬＣ)により精製した。 (i)５’および内部アミンリンカー-アームを有するＡＥ
-ラベル化プローブを以下のように精製した：再度溶解
したペレットを、ＩＢＭR９５３３ＨＰＬＣ系に取り付
けたヌクレオゲン-ＤＥＡＥ６０−７イオン交換ＨＰＬ
Ｃカラムに注入した。すべてのバファーは、フィッシャ
ー・サイエンティフィック(Ｆisher Ｓcientific)から
のＨＰＬＣグレード水、アセトニトリル(ＣＨ3ＣＮ)お
よび酢酸ナトリウム(ＮaＯＡc)、試薬グレードの氷酢酸
(ＨＯＡc)およびＬiＣｌで調製した。すべてのバファー
は、使用前に０.４５μｍ孔径のナイロン-６６フィルタ
ーを介して濾過した。試料を、第１図の記載(この場
合、プローブは前記セクションＡにおいて記載された２
６ｍｅｒを含有する５’-アミンリンカー-アームであっ
た)のように溶出した。実験の直後、１０％ＳＤＳ５μ
ｌを各試験管に加え、つづいて各試験管を撹拌した(こ
れにより、アクリジニウムエステルラベル化プローブ
を、試験管壁にこびりつけないようにした)。フラクシ
ョン２１〜４２から０.５μｌ部を取り出し、１２×７
５ｍｍ試験管の水２００μｌに加えた(各部において分
離ピペットチップを用い、キャリーオーバーの問題を回
避した)。ついで、各部の化学ルミネッセンスを、次の
自動注入および読み配列を用いるバートホルド・クリニ
ルマット(Ｂerthold Ｃlinilumat)において測定した：
０.２５Ｎ ＨＮＯ3２００μｌ、０.１％Ｈ2Ｏ2の注入；
１秒後；１Ｎ ＮaＯＨ２００μｌの注入；１０秒間化学
ルミネッセンス出力の読み。ついで、フラクション２９
〜３３を以下のようにＥtＯＨ沈澱させた：各フラクシ
ョンにグリコゲン５μｌを加え、撹拌し、ＥtＯＨ１ｍ
ｌを加え、撹拌し、氷上にて５〜１０分間インキュベー
ションし、マイクロ遠心分離機中、１５０００rpmにて
５分間遠心分離に付した。各上澄液を注意して除去し、
ペレットを０.１Ｍ ＮaＯＡc２０μｌ、pＨ５、０.１％
ＳＤＳに再度溶かし、フラクションをプールした。この
ようにして、高純度のアクリジニウムエステルラベル化
プローブを得た。かかるプローブの特異活性は、典型的
には、オリゴマー１ピコモル当たり、５〜１０×１０7
化学ルミネッセンス光数(バートホルド・クリニルマッ
ト)であった。 （ii）アミンリンカー-アーム修正塩基（アミノ-１２-
Ｕ）を有するＡＥ-ラベル化プローブを、一般に、以下
のことを除いて、前記のように精製した：バイダック
（Ｖydac）Ｃ４逆相カラムをもちいた；緩衝液Ａは０.
１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（アプライド・バイオ
システムズ、インコーポレイション、カリフォルニア
州、ホスター・シティー(Ｆoster Ｃity))、緩衝液Ｂは
ＣＨ3ＣＮであった；ラベル化プローブは、１ｍｌ／分
の流速にて２５分間において１０〜１５％溶媒Ｂの直線
勾配を用い、ハイブリッドとして溶出した。ついで、主
な化学ルミネッセンスピークを同定し、前記のように後
処理した。一般に、前記ディスカッションは、アクリジ
ニウムエステルでプローブを合成し、ラベル化する方法
を記載している。個々の実施例において、プローブは、
末端および内部ラベル化、ならびにヌクレオチド塩基に
てラベル化されている。
を、以下のようにプローブに挿入した。以下の配列を有
する鋳型およびプライマーオリゴヌクレオチドを合成し
た： 鋳型３’− ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＴＡ ＣＧＧ ＧＴＴ ＴＡＴ ＡＧＣ ＧＧ−５’ プライマー５’−ＣＧＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＴ−３’ (プライマーおよび伸長プライマーはシィ・トラコマテ
ィスの１６Ｓサブユニットに対して相補的である。) クレノー(Ｋlenow)フラグメントを用いるプライマー伸
長は、ＢＳＡが１０×ニック・トランスレーション・バ
ファーから省略することを除いて、マニアティス（モレ
キュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュア
ル、ティー・マニアティス、１９８２、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリーズ、パブリッシング(M
olecular Cloning, A laboratory Manual, T. Maniati
s, 1982,Cold Spring Harbor Laboratories, Pubs.)）
に記載されているように行ない、アミンリンカー-アー
ム修正塩基アミノ(１２)ｄＵＴＰ(カルバイオケム、カ
リフォルニア)(Ｃalbiochem,Ｃalifornia)を挿入した。
したがって、得られたオリゴマーの配列は：ＣＧＴ Ｔ
ＡＣ ＴＣＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＴＡ(アミノ-１
２-Ｕ)ＣＧＣＣである。プライマー伸長複合体の精製
は、ＮＥＮＳＯＲＢ-２０カートリッジ(デュポン)(Ｄu
Ｐont)を用い、製造業者の奨励する方法に従い実施し
た。(プライマー伸長反応体は、カラムに充填する前
に、ＮＥＮＳＯＲＢ試薬Ａ９００μｌを加えて希釈し
た。該精製オリゴマーを５０％メタノールで溶出し、つ
いでスピード-バク(speed-vac.)にて取り出した)。 Ｂ．アクリジニウムエステルを用いるアミノリンカー-
アームプローブのラベル化および精製 アクリジニウムエステルの２５mＭストック溶液を、蒸
留ＤＭＳＯ中にて調製した。所望量のプローブ(前記セ
クションＡにおけるラベル化した種々のプローブのリス
ト参照)を、１.５ｍｌの円錐形ポリプロピレン管にて蒸
発乾固した。カクテルは以下の成分を列挙した順序にて
加えることにより構成した： ３μｌ 水 １μｌ １Ｍ ＨＥＰＥＳ(pＨ８.０) ４μｌ ＤＭＳＯ(蒸留) ２μｌ ＤＭＳＯ(蒸留)中、２５mＭアクリジニウムエ
ステル 混合物を撹拌し、マイクロ遠心分離機において２秒間ス
ピンに付し(内容物を管の底に集中させる)、３７℃にて
２０分間インキュベーションした。ついで、以下の成分
を、列挙した順序にて反応カクテルに加えた： ３.０μｌ ＤＭＳＯ(蒸留)中、２５mＭアクリジニウム
エステル １.５μｌ 水 ０.５μｌ １Ｍ ＨＥＰＥＳ(pＨ８.０) カクテルを再度撹拌し、スピンし、３７℃にてさらに２
０分間インキュベーションした。未反応ラベルは、５倍
過剰のリシンを用い、０.１Ｍ ＨＥＰＥＳ(pＨ８.０)、
５０％ＤＭＳＯ中、０.１２５Ｍリシンを加えることに
よりクエンチし、室温にて５分間インキュベートした。
ついで、アクリジニウムエステル-ラベル化オリゴマー
を、以下の方法を用いて精製した。クエンチした反応混
合物２０μｌに、担体として３Ｍ ＮaＯＡc(pＨ５.０)
３０μｌ、水２０μｌおよびグリコゲン５μｌ加えた
(グリコゲンは予め処理し、いずれのヌクレアーゼ活性
も除去した)。試料を簡単に撹拌し、無水エタノール６
４０μｌを加えた。該試料を簡単に撹拌し、氷上にて５
〜１０分間インキュベートし、ついでマイクロ遠心分離
機において１５０００rpmにて５分間遠心分離に付し
た。上澄液を注意して除去し、ペレットを０.１Ｍ Ｎa
ＯＡc(pＨ５.０)２０μｌ、０.１％ＳＤＳに再度溶かし
た。ついで、試料を以下に記載のように高速液体クロマ
トグラフィー(ＨＰＬＣ)により精製した。 (i)５’および内部アミンリンカー-アームを有するＡＥ
-ラベル化プローブを以下のように精製した：再度溶解
したペレットを、ＩＢＭR９５３３ＨＰＬＣ系に取り付
けたヌクレオゲン-ＤＥＡＥ６０−７イオン交換ＨＰＬ
Ｃカラムに注入した。すべてのバファーは、フィッシャ
ー・サイエンティフィック(Ｆisher Ｓcientific)から
のＨＰＬＣグレード水、アセトニトリル(ＣＨ3ＣＮ)お
よび酢酸ナトリウム(ＮaＯＡc)、試薬グレードの氷酢酸
(ＨＯＡc)およびＬiＣｌで調製した。すべてのバファー
は、使用前に０.４５μｍ孔径のナイロン-６６フィルタ
ーを介して濾過した。試料を、第１図の記載(この場
合、プローブは前記セクションＡにおいて記載された２
６ｍｅｒを含有する５’-アミンリンカー-アームであっ
た)のように溶出した。実験の直後、１０％ＳＤＳ５μ
ｌを各試験管に加え、つづいて各試験管を撹拌した(こ
れにより、アクリジニウムエステルラベル化プローブ
を、試験管壁にこびりつけないようにした)。フラクシ
ョン２１〜４２から０.５μｌ部を取り出し、１２×７
５ｍｍ試験管の水２００μｌに加えた(各部において分
離ピペットチップを用い、キャリーオーバーの問題を回
避した)。ついで、各部の化学ルミネッセンスを、次の
自動注入および読み配列を用いるバートホルド・クリニ
ルマット(Ｂerthold Ｃlinilumat)において測定した：
０.２５Ｎ ＨＮＯ3２００μｌ、０.１％Ｈ2Ｏ2の注入；
１秒後；１Ｎ ＮaＯＨ２００μｌの注入；１０秒間化学
ルミネッセンス出力の読み。ついで、フラクション２９
〜３３を以下のようにＥtＯＨ沈澱させた：各フラクシ
ョンにグリコゲン５μｌを加え、撹拌し、ＥtＯＨ１ｍ
ｌを加え、撹拌し、氷上にて５〜１０分間インキュベー
ションし、マイクロ遠心分離機中、１５０００rpmにて
５分間遠心分離に付した。各上澄液を注意して除去し、
ペレットを０.１Ｍ ＮaＯＡc２０μｌ、pＨ５、０.１％
ＳＤＳに再度溶かし、フラクションをプールした。この
ようにして、高純度のアクリジニウムエステルラベル化
プローブを得た。かかるプローブの特異活性は、典型的
には、オリゴマー１ピコモル当たり、５〜１０×１０7
化学ルミネッセンス光数(バートホルド・クリニルマッ
ト)であった。 （ii）アミンリンカー-アーム修正塩基（アミノ-１２-
Ｕ）を有するＡＥ-ラベル化プローブを、一般に、以下
のことを除いて、前記のように精製した：バイダック
（Ｖydac）Ｃ４逆相カラムをもちいた；緩衝液Ａは０.
１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（アプライド・バイオ
システムズ、インコーポレイション、カリフォルニア
州、ホスター・シティー(Ｆoster Ｃity))、緩衝液Ｂは
ＣＨ3ＣＮであった；ラベル化プローブは、１ｍｌ／分
の流速にて２５分間において１０〜１５％溶媒Ｂの直線
勾配を用い、ハイブリッドとして溶出した。ついで、主
な化学ルミネッセンスピークを同定し、前記のように後
処理した。一般に、前記ディスカッションは、アクリジ
ニウムエステルでプローブを合成し、ラベル化する方法
を記載している。個々の実施例において、プローブは、
末端および内部ラベル化、ならびにヌクレオチド塩基に
てラベル化されている。
【００３４】実施例２ アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド
化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのｐＨ６に
おける安定性 クラミジア・トラコーマティス(Chlamydia trachomati
s)に対して特異的な内部標識化３３ｍｅｒプローブを前
記したごとく調製した（アデニン置換、タイプ１リンカ
ー−アーム）。以下の手法に従い該プローブをそのター
ゲットｒＲＮＡ（この場合はクラミジア・トラコーマテ
ィス）でハイブリッド化した。 ハイブリダイゼーション混合物 ２μｌＡＥ−プローブ（０.５ピコモル） ０.３μｌ ４％（重量：容量）ＳＤＳ ５.８μｌ １Ｍ ＰＢ、ｐＨ５ ４.４μｌ シイ・トラコーマティス ｒＲＮＡ（２μ
ｇ）、または対照については４.４μｌ水 該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃に
て４０分間インキュベートし、その時点で、以下のごと
くに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を用い、各混合
物を、パーゼントハイブリダイゼーションについて分析
した。ハイブリッドまたは対照混合物の０.１μｌ分
を、２％ＨＡＰを含有する０.１４Ｍ ＰＢ、ｐＨ６.
８、２００μｌに添加した。得られた各混合物を５秒間
攪拌し、６０℃にて５分間インキュベートし、２０秒間
攪拌し、次いで１５０００ｒｐｍにてミクロ遠心機で３
０秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、０.１４Ｍ
ＰＢ、ｐＨ６.８、２００μｌをＨＡＰペレットに添
加し、混合物を１０秒間攪拌し、次いで１５０００ｒｐ
ｍにてミクロ遠心機で３０秒間遠心した。上澄みを除去
し、保存し、ペレットを０.１４Ｍ ＰＢ、ｐＨ６.８、
２００μｌに再懸濁した。再懸濁ＨＡＰの５０μｌおよ
び２の上澄みの各々を以下に記載するごとく化学ルミネ
ッセンスについて分析し、パーセントハイブリッド化プ
ローブ、すなわちＨＡＰに伴うパーセント化学ルミネッ
センス信号を計算した。ハイブリッド化プローブおよび
非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性
を以下の手順に従ってｐＨ６にて試験した。 安定性試
験混合物 １２.３μｌ 前記からのハイブリッドまたは対照 ５０μｌ １Ｍ ＰＢ、ｐＨ６ ２.５μｌ ４％ ＳＤＳ ６５μｌ 水 これらの混合物を軽く攪拌し、直ちに５μｌを取り出し
（ｔ０）、以下に記載するごとく化学ルミネッセンスに
ついて分析した。混合物の残りを６０℃でインキュベー
トし、各時間（後記参照）において５μｌを取り出し、
直ちに化学ルミネッセンスについて分析した。各試料の
化学ルミネッセンスは、試料の一部を１２ｘ７５ｍｍ試
験管中の水２００μｌに添加し、クリニルマート(Clini
lumat)（０.２５Ｎ ＨＮＯ3 ２００μｌ、０.１％Ｈ2
Ｏ2を自動注入、１秒遅れて２Ｍ ＰＢカリウム２００
μｌ、ｐＨ１３.２を自動注入、１０秒間の化学ルミネ
ッセンスの読み取り）にて化学ルミネッセンスを測定す
ることによって測定した。 結果： １．パーゼントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ハイブリッド−９６％ 対照−１.３％（非特異的結合） ２．安定性時間経緯 第２図参照 これらの結果は、ハイブリッド化プローブは分解および
続いての化学ルミネッセンスの喪失に対してよく保護さ
れているが（化学ルミネッセンスの喪失の半減期は３３
７０分に等しい）、非ハイブリッド化プローブは分解お
よび化学ルミネッセンスの喪失に対して非常に敏感であ
る（半減期は２９.２分に等しく、従って、ハイブリッ
ド化および非ハイブリッド化の差は１１５倍に等しい）
ことを示す。これらのデータは、本明細書中に記載する
均一検定が、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリ
ッド化プローブ間に異なる安定性を付与し、それを測定
することによって、ターゲットＤＮＡ配列の位置を決め
る能力を証明するものである。
化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのｐＨ６に
おける安定性 クラミジア・トラコーマティス(Chlamydia trachomati
s)に対して特異的な内部標識化３３ｍｅｒプローブを前
記したごとく調製した（アデニン置換、タイプ１リンカ
ー−アーム）。以下の手法に従い該プローブをそのター
ゲットｒＲＮＡ（この場合はクラミジア・トラコーマテ
ィス）でハイブリッド化した。 ハイブリダイゼーション混合物 ２μｌＡＥ−プローブ（０.５ピコモル） ０.３μｌ ４％（重量：容量）ＳＤＳ ５.８μｌ １Ｍ ＰＢ、ｐＨ５ ４.４μｌ シイ・トラコーマティス ｒＲＮＡ（２μ
ｇ）、または対照については４.４μｌ水 該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃に
て４０分間インキュベートし、その時点で、以下のごと
くに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を用い、各混合
物を、パーゼントハイブリダイゼーションについて分析
した。ハイブリッドまたは対照混合物の０.１μｌ分
を、２％ＨＡＰを含有する０.１４Ｍ ＰＢ、ｐＨ６.
８、２００μｌに添加した。得られた各混合物を５秒間
攪拌し、６０℃にて５分間インキュベートし、２０秒間
攪拌し、次いで１５０００ｒｐｍにてミクロ遠心機で３
０秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、０.１４Ｍ
ＰＢ、ｐＨ６.８、２００μｌをＨＡＰペレットに添
加し、混合物を１０秒間攪拌し、次いで１５０００ｒｐ
ｍにてミクロ遠心機で３０秒間遠心した。上澄みを除去
し、保存し、ペレットを０.１４Ｍ ＰＢ、ｐＨ６.８、
２００μｌに再懸濁した。再懸濁ＨＡＰの５０μｌおよ
び２の上澄みの各々を以下に記載するごとく化学ルミネ
ッセンスについて分析し、パーセントハイブリッド化プ
ローブ、すなわちＨＡＰに伴うパーセント化学ルミネッ
センス信号を計算した。ハイブリッド化プローブおよび
非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性
を以下の手順に従ってｐＨ６にて試験した。 安定性試
験混合物 １２.３μｌ 前記からのハイブリッドまたは対照 ５０μｌ １Ｍ ＰＢ、ｐＨ６ ２.５μｌ ４％ ＳＤＳ ６５μｌ 水 これらの混合物を軽く攪拌し、直ちに５μｌを取り出し
（ｔ０）、以下に記載するごとく化学ルミネッセンスに
ついて分析した。混合物の残りを６０℃でインキュベー
トし、各時間（後記参照）において５μｌを取り出し、
直ちに化学ルミネッセンスについて分析した。各試料の
化学ルミネッセンスは、試料の一部を１２ｘ７５ｍｍ試
験管中の水２００μｌに添加し、クリニルマート(Clini
lumat)（０.２５Ｎ ＨＮＯ3 ２００μｌ、０.１％Ｈ2
Ｏ2を自動注入、１秒遅れて２Ｍ ＰＢカリウム２００
μｌ、ｐＨ１３.２を自動注入、１０秒間の化学ルミネ
ッセンスの読み取り）にて化学ルミネッセンスを測定す
ることによって測定した。 結果： １．パーゼントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ハイブリッド−９６％ 対照−１.３％（非特異的結合） ２．安定性時間経緯 第２図参照 これらの結果は、ハイブリッド化プローブは分解および
続いての化学ルミネッセンスの喪失に対してよく保護さ
れているが（化学ルミネッセンスの喪失の半減期は３３
７０分に等しい）、非ハイブリッド化プローブは分解お
よび化学ルミネッセンスの喪失に対して非常に敏感であ
る（半減期は２９.２分に等しく、従って、ハイブリッ
ド化および非ハイブリッド化の差は１１５倍に等しい）
ことを示す。これらのデータは、本明細書中に記載する
均一検定が、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリ
ッド化プローブ間に異なる安定性を付与し、それを測定
することによって、ターゲットＤＮＡ配列の位置を決め
る能力を証明するものである。
【００３５】実施例３ アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド
化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのｐＨ９に
おける安定性 内部標識化プローブ（実施例１に記載したすべての３つ
の内部標識化３３ｍｅｒプローブを試験した）をそのタ
ーゲットｒＲＮＡ（この場合はクラミジア・トラコーマ
ティス）でハイブリッド化し、実施例２に記載したごと
くにパーセントハイブリダイゼーションについて分析し
た。ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プ
ローブ（すなわち、対照）の安定性を以下のプロトコル
に従ってｐＨ９にて試験した。 安定性試験混合物 ５μｌ 前記からのハイブリッドまたは対照 ４５μｌ ０.２Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９ 次いで、混合物をシンキュベートし、サンプリングし、
実施例２に記載したごとくに化学ルミネッセンスについ
て分析した。 結果： １．パーゼントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ａ．アデニン置換、タイプ１リンカー−アーム ハイブリッド−９５％ 対照−０.５％（非特異的結合） ｂ．挿入、タイプ１リンカー−アーム ハイブリッド−９８％ 対照−０.３％ ｃ．挿入、タイプ２リンカー−アーム ハイブリッド−９８％ 対照−０.２％ ２．安定性時間経緯 第３〜第５図参照。第３図はアデニン置換、タイプ１リ
ンカー−アームについてのグラフであり；第４図は挿
入、タイプ１リンカー−アームについてのグラフであ
り；第５図は挿入、タイプ２リンカー−アームについて
のグラフである。実施例２におけるごとく、ハイブリッ
ド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド
化プローブは保護されない。これは、内部標識化プロー
ブのすべての３つのタイプについて当てはまる。本実施
例においては、高いｐＨにおけるホウ酸ナトリウムが、
ハイブリッド化プローブと非ハイブリッド化プローブと
の間にまだ異なる分解特性を保持しつつ、（実施例２と
比較して）この過程を加速することが示される。
化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのｐＨ９に
おける安定性 内部標識化プローブ（実施例１に記載したすべての３つ
の内部標識化３３ｍｅｒプローブを試験した）をそのタ
ーゲットｒＲＮＡ（この場合はクラミジア・トラコーマ
ティス）でハイブリッド化し、実施例２に記載したごと
くにパーセントハイブリダイゼーションについて分析し
た。ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プ
ローブ（すなわち、対照）の安定性を以下のプロトコル
に従ってｐＨ９にて試験した。 安定性試験混合物 ５μｌ 前記からのハイブリッドまたは対照 ４５μｌ ０.２Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９ 次いで、混合物をシンキュベートし、サンプリングし、
実施例２に記載したごとくに化学ルミネッセンスについ
て分析した。 結果： １．パーゼントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ａ．アデニン置換、タイプ１リンカー−アーム ハイブリッド−９５％ 対照−０.５％（非特異的結合） ｂ．挿入、タイプ１リンカー−アーム ハイブリッド−９８％ 対照−０.３％ ｃ．挿入、タイプ２リンカー−アーム ハイブリッド−９８％ 対照−０.２％ ２．安定性時間経緯 第３〜第５図参照。第３図はアデニン置換、タイプ１リ
ンカー−アームについてのグラフであり；第４図は挿
入、タイプ１リンカー−アームについてのグラフであ
り；第５図は挿入、タイプ２リンカー−アームについて
のグラフである。実施例２におけるごとく、ハイブリッ
ド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド
化プローブは保護されない。これは、内部標識化プロー
ブのすべての３つのタイプについて当てはまる。本実施
例においては、高いｐＨにおけるホウ酸ナトリウムが、
ハイブリッド化プローブと非ハイブリッド化プローブと
の間にまだ異なる分解特性を保持しつつ、（実施例２と
比較して）この過程を加速することが示される。
【００３６】実施例４ 隣接プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウ
ムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリ
ッドのｐＨ６における安定性本実施例は、本実施例で用
いるＡＥ−標識プローブ（後記参照）の５’末端にすぐ
隣接するイー・コリ(E. coli)ｒＲＮＡにハイブリダイ
ズし、それによってアクリジニウムエステル標識に近接
するターゲットｒＲＮＡ中のすべてのアミンの「キャッ
プ除去」に導く（標準的なホスホルアミデイト化学を用
いて調製した）配列５’−ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＧＣ Ｔ
ＧＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＧＧ ＡＴＡ ＡＧＧ ＧＴ
Ｔ ＧＣ−３’のプローブの使用を含む。アクリジニウ
ムエステルで標識化したプローブ末端（実施例１に記載
した調製）（以下、ＡＥ−プローブという）および前記
した隣接プローブを以下の手順に従ってハイブリダイズ
した。 ハイブリダイゼーション混合物 対照混合物 １μｌ ＡＥ−プローブ １μｌＡＥ−プローブ （.２５ピコモル） （.２５ピコモル） ２μｌ イー・コリ ｒＲＮＡ ５.４μｌ水 (２μｌｇ） ４.３μｌ隣接プローブ ５.８μｌ１ＭＰＢ、ｐＨ５ （１２ピ コモル） ０.３μｌ４％ＳＤＳ ０.３μｌ４％ＳＤＳ ７.５μｌ１Ｍ、ｐＨ５ 該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃に
て４０分間インキュベートし、次いで、実施例２に記載
したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーセント
ハイブリダイゼーションについて分析した。隣接プロー
ブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド
化プローブ（すなわち、対照）の安定性を実施例２に記
載したごとくにｐＨ６にて正確に試験した。 結果： １．パーセントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ハイブリッド−９３.５％ 対照−２.７％（非特異的結合） ２．安定性時間経緯 第６図参照 実施例２におけるごとく、ハイブリッド化ＡＥ−プロー
ブ（この場合はやはりハイブリッド化した隣接プローブ
をもつ）は分解から保護されたが、非ハイブリッド化プ
ローブは保護されなかった。該保護は実施例２と同じ程
度良好であった。何故なら、１つの代わりに２つのハイ
ブリダイゼーションに依存するからである。
ムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリ
ッドのｐＨ６における安定性本実施例は、本実施例で用
いるＡＥ−標識プローブ（後記参照）の５’末端にすぐ
隣接するイー・コリ(E. coli)ｒＲＮＡにハイブリダイ
ズし、それによってアクリジニウムエステル標識に近接
するターゲットｒＲＮＡ中のすべてのアミンの「キャッ
プ除去」に導く（標準的なホスホルアミデイト化学を用
いて調製した）配列５’−ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＧＣ Ｔ
ＧＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＧＧ ＡＴＡ ＡＧＧ ＧＴ
Ｔ ＧＣ−３’のプローブの使用を含む。アクリジニウ
ムエステルで標識化したプローブ末端（実施例１に記載
した調製）（以下、ＡＥ−プローブという）および前記
した隣接プローブを以下の手順に従ってハイブリダイズ
した。 ハイブリダイゼーション混合物 対照混合物 １μｌ ＡＥ−プローブ １μｌＡＥ−プローブ （.２５ピコモル） （.２５ピコモル） ２μｌ イー・コリ ｒＲＮＡ ５.４μｌ水 (２μｌｇ） ４.３μｌ隣接プローブ ５.８μｌ１ＭＰＢ、ｐＨ５ （１２ピ コモル） ０.３μｌ４％ＳＤＳ ０.３μｌ４％ＳＤＳ ７.５μｌ１Ｍ、ｐＨ５ 該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃に
て４０分間インキュベートし、次いで、実施例２に記載
したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーセント
ハイブリダイゼーションについて分析した。隣接プロー
ブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド
化プローブ（すなわち、対照）の安定性を実施例２に記
載したごとくにｐＨ６にて正確に試験した。 結果： １．パーセントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ハイブリッド−９３.５％ 対照−２.７％（非特異的結合） ２．安定性時間経緯 第６図参照 実施例２におけるごとく、ハイブリッド化ＡＥ−プロー
ブ（この場合はやはりハイブリッド化した隣接プローブ
をもつ）は分解から保護されたが、非ハイブリッド化プ
ローブは保護されなかった。該保護は実施例２と同じ程
度良好であった。何故なら、１つの代わりに２つのハイ
ブリダイゼーションに依存するからである。
【００３７】実施例５ 「隣接」プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジ
ニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイ
ブリッドのｐＨ９における安定性 実施例４に記載したごとくにハイブリダイゼーションを
正確に行った。以下に示す安定性試験混合物の組成以外
は、実施例２に記載したごとくに、隣接プローブをもつ
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プロー
ブ（すなわち、対照）の安定性をｐＨ９において正確に
行った。５μｌハイブリッドまたは対照 ５０μｌ０.２Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.０ （やはりハイブリッド化された）隣接プローブをもつハ
イブリッド化ＡＥ−プローブは再び分解から保護された
が、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。実
施例３におけるごとく、高い ｐＨでのホウ酸ナトリウ
ムは、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化
プローブ間に異なる分解特性をなお保持しつつ、過程を
加速した。これらの結果をグラフで示したものは第７図
を参照されたい。
ニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイ
ブリッドのｐＨ９における安定性 実施例４に記載したごとくにハイブリダイゼーションを
正確に行った。以下に示す安定性試験混合物の組成以外
は、実施例２に記載したごとくに、隣接プローブをもつ
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プロー
ブ（すなわち、対照）の安定性をｐＨ９において正確に
行った。５μｌハイブリッドまたは対照 ５０μｌ０.２Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９.０ （やはりハイブリッド化された）隣接プローブをもつハ
イブリッド化ＡＥ−プローブは再び分解から保護された
が、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。実
施例３におけるごとく、高い ｐＨでのホウ酸ナトリウ
ムは、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化
プローブ間に異なる分解特性をなお保持しつつ、過程を
加速した。これらの結果をグラフで示したものは第７図
を参照されたい。
【００３８】実施例６ ハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化
したプローブ末端および非ハイブリッドのｐＨ６におけ
る安定性 以下の手順に従ってプローブをそのターゲットｒＲＮＡ
（この場合はコー・コリ）にハイブリダイズした。 ハイブリダイゼーション混合物 対照混合物 １μｌ ＡＥ−プローブ １μｌＡＥ−プローブ （.２５ピコモル） （.２５ピコモル） ２μｌイー・コリ ｒＲＮＡ ５.４μｌ水 （２μｇ） ５.８μｌ１Ｍ ＰＢ、ｐＨ５ ５.８μｌ１Ｍ ＰＢ、ｐＨ５ ０.３μｌ４％ＳＤＳ ０.３μｌ４％ＳＤＳ ３.４μｌ水 該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃に
て４０分間インキュベートし、次いで、実施例２に記載
したごとくヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハ
イブリダイゼーションについて分析した。ハイブリッド
化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわ
ち、対照）の安定性を実施例２に記載したごとくにｐＨ
６にて正確に試験した。 結果： １．パーセントハイブリダイゼーション ハイブリッド−９４％ 対照−２.７％（非特異的結合） ２．安定性時間経緯 第８図参照。 非ハイブリダイズ化プローブは、これまでの実施例にお
けるほど分解の差は大きくなかったが、再び、ハイブリ
ッド化プローブと比較してかなり分解した。これは、ア
ミンの一部のみがアクリジニウムエステル標識の近接で
「キャップ除去」されたからである。事実、これは、さ
らに、ハイブリッド化隣接プローブの存在下におけると
非存在下におけるハイブリッド化末端−標識化プローブ
間とを区別する能力を証明する。
したプローブ末端および非ハイブリッドのｐＨ６におけ
る安定性 以下の手順に従ってプローブをそのターゲットｒＲＮＡ
（この場合はコー・コリ）にハイブリダイズした。 ハイブリダイゼーション混合物 対照混合物 １μｌ ＡＥ−プローブ １μｌＡＥ−プローブ （.２５ピコモル） （.２５ピコモル） ２μｌイー・コリ ｒＲＮＡ ５.４μｌ水 （２μｇ） ５.８μｌ１Ｍ ＰＢ、ｐＨ５ ５.８μｌ１Ｍ ＰＢ、ｐＨ５ ０.３μｌ４％ＳＤＳ ０.３μｌ４％ＳＤＳ ３.４μｌ水 該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃に
て４０分間インキュベートし、次いで、実施例２に記載
したごとくヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハ
イブリダイゼーションについて分析した。ハイブリッド
化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわ
ち、対照）の安定性を実施例２に記載したごとくにｐＨ
６にて正確に試験した。 結果： １．パーセントハイブリダイゼーション ハイブリッド−９４％ 対照−２.７％（非特異的結合） ２．安定性時間経緯 第８図参照。 非ハイブリダイズ化プローブは、これまでの実施例にお
けるほど分解の差は大きくなかったが、再び、ハイブリ
ッド化プローブと比較してかなり分解した。これは、ア
ミンの一部のみがアクリジニウムエステル標識の近接で
「キャップ除去」されたからである。事実、これは、さ
らに、ハイブリッド化隣接プローブの存在下におけると
非存在下におけるハイブリッド化末端−標識化プローブ
間とを区別する能力を証明する。
【００３９】実施例７ アクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基に標識化し
たハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プロ
ーブのｐＨ７.６における安定性実施例１に記載したア
クリジニウムエステルでヌクレオチド塩基（アミノ−１
２−Ｕ）に標識化したプローブを、以下の手順に従っ
て、そのターゲットｒＲＮＡ（この場合はシイ・トラコ
ーマティス）にハイブリダイスした。 ハイブリダイゼーション混合物 ０.１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ５.４ １０％ラウリル硫酸リチウム ２μｇ （０．１ピコモルＡＥプローブ）シイ・トラコ
ーマティスｒＲＮＡまたは対照用水 合計容量−３０μｌ ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を８０℃にて
５分間、続いて６０℃にて６０分間インキュベートし
た。得られた溶液を、０.１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ
５.４、１０％ラウリル硫酸リチウムで各々３００μｌ
まで希釈し、実施例２に記載したごとくにヒドロキシア
パタイトを用いてパーゼントハイブリダイゼーションに
ついて分析した。ハイブリッド化プローブおよび非ハイ
ブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性を、以
下のプロトコルに従い、いくつかの同一に調製した試料
とともにｐＨ７.６で試験した。 安定性試験混合物 １５μｌ 前記からのハイブリッドまたは対照 １００μｌ ０.２％テトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ７.
６、５％トリトン(Triton)Ｘ−１００ 次いで、これらの混合物を６０℃にてインキュベート
し、試料を種々の時点で取り出し、０.１Ｍ Ｈ2Ｏ2 ２
００μｌの自動注入、１秒遅れての１Ｎ ＮａＯＨ ２
００μｌの自動注入、および５秒間の化学ルミネッセン
スの読み取りを使用するGen-Probe LeaderＴＭ Ｉ ルミ
ノメーター（Luminometer)を用いて化学ルミネッセンス
を測定した。これらのデータより、加水分解速度を回帰
分析によって決定した。 結果： １．パーセントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ハイブリッド−５３.８％ 対照−０.５％ ２．安定性 エステル加水分解の半減期（分） 半減期の比 ハイブリッド 対照 （ハイブリッド／対照） １３.６ １.３ １０.５ これまでの実施例におけるごとく、これらのデータは、
ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハ
イブリッド化プローブ（この場合はプローブの塩基に付
着した標識をもつ）は保護されないことを示す。これ
は、ＡＥ付着について本明細書中にて記載する均一保護
検定で使用できる原理を示す。
たハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プロ
ーブのｐＨ７.６における安定性実施例１に記載したア
クリジニウムエステルでヌクレオチド塩基（アミノ−１
２−Ｕ）に標識化したプローブを、以下の手順に従っ
て、そのターゲットｒＲＮＡ（この場合はシイ・トラコ
ーマティス）にハイブリダイスした。 ハイブリダイゼーション混合物 ０.１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ５.４ １０％ラウリル硫酸リチウム ２μｇ （０．１ピコモルＡＥプローブ）シイ・トラコ
ーマティスｒＲＮＡまたは対照用水 合計容量−３０μｌ ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を８０℃にて
５分間、続いて６０℃にて６０分間インキュベートし
た。得られた溶液を、０.１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ
５.４、１０％ラウリル硫酸リチウムで各々３００μｌ
まで希釈し、実施例２に記載したごとくにヒドロキシア
パタイトを用いてパーゼントハイブリダイゼーションに
ついて分析した。ハイブリッド化プローブおよび非ハイ
ブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性を、以
下のプロトコルに従い、いくつかの同一に調製した試料
とともにｐＨ７.６で試験した。 安定性試験混合物 １５μｌ 前記からのハイブリッドまたは対照 １００μｌ ０.２％テトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ７.
６、５％トリトン(Triton)Ｘ−１００ 次いで、これらの混合物を６０℃にてインキュベート
し、試料を種々の時点で取り出し、０.１Ｍ Ｈ2Ｏ2 ２
００μｌの自動注入、１秒遅れての１Ｎ ＮａＯＨ ２
００μｌの自動注入、および５秒間の化学ルミネッセン
スの読み取りを使用するGen-Probe LeaderＴＭ Ｉ ルミ
ノメーター（Luminometer)を用いて化学ルミネッセンス
を測定した。これらのデータより、加水分解速度を回帰
分析によって決定した。 結果： １．パーセントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析） ハイブリッド−５３.８％ 対照−０.５％ ２．安定性 エステル加水分解の半減期（分） 半減期の比 ハイブリッド 対照 （ハイブリッド／対照） １３.６ １.３ １０.５ これまでの実施例におけるごとく、これらのデータは、
ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハ
イブリッド化プローブ（この場合はプローブの塩基に付
着した標識をもつ）は保護されないことを示す。これ
は、ＡＥ付着について本明細書中にて記載する均一保護
検定で使用できる原理を示す。
【００４０】実施例８ ｒＲＮＡおよびＤＮＡターゲットをともに用い各種配列
ダイマー部位にてアクリジニウムエステルで内部標識化
したハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの
ｐＨ７.６における安定性 種々の配列ダイマー部位（以下、参照）に挿入した内部
リンカー−アーム、タイプ「Ｌ７」を含有するプローブ
を合成し、ＡＥで標識化し、実施例１に記載したごとく
に精製した。これらのプローブの配列およびリンカー−
アームの位置は以下のとおりである。 プローブＮｏ． 配列；リンカー−アーム位置（＃） １ 5’-GCT CGC TGC GGA CTT#AAA CCA ACA T-3’ ２ 5’-AGG TCG GTC T#TT CTC TCC TTT CGT CTA CG-3’ ３ 5’-CAA TCG TCG AAA CCA TT#G CTC CGT TCG A-3’ ４ 5’-CCG CTA#CCC GGT ACG TT-3’ ５ 5’-TTG CCC ACA CCG A#CG GCG-3’ ６ 5’-TTG CCC ACA CCG C#CG GCG-3’ ８０℃インキュベーション工程を省略し、かつ用いるタ
ーゲット核酸が以下のものである以外は実施例７に記載
したごとくにこれらのプローブをハイブリダイズした。 プローブ＃ ターゲット核酸 １ イー・コリｒＲＮＡの１μｇ ２および３ シイ・トラコーマティス(C. trachomatis)ｒＲＮＡの１μｇ ４ エヌ・ゴンドロエア(N. gondrrhoeae)ｒＲＮＡの１μｇ ５および６ 正確な合成ＤＮＡ補体の１.２ピコモル 実施例７に記載したごとく、ハイブリッド化プローブお
よび非ハイブリッド化プローブの安定性をｐＨ７.６に
て試験した。 結果： 安定性 半減期の比 エステル加水分解の半減期（分） ハイブリッド／対照 プローブ＃ ハイブリッド 対照 １ ４１.２ ０.９４ ４３.７ ２ ２４.２ ０.７１ ３４.５ ３ ４０.７ ０.９６ ４２.４ ４ １５.７ １.２ １３.１ ５ １１.１ １.０ １１.１ ６ ２２.６ ０.７４ ３０.５ これらのデータは、リンカー−アーム（および、従って
該ＡＥ）が広範囲の配列ダイマー部位に挿入でき、ハイ
ブリッド化形態においてもエステル加水分解からなお実
質的に保護されることを示す。さらに、本実施例は、こ
れらの均一検定フォーマットで用いた場合、ＤＮＡター
ゲットがハイブリッド化ＡＥ−プローブの良好な保護を
提供することを示す。また、本実施例は、ここで用いた
長い（９原子）リンカー−アームが、広範囲のリンカー
−アーム長が本明細書中に記載するＨＰＡフォーマット
で用いることができることを確立したこの特許で前で引
用した他のリンカー−アームと実質的に同等の微分加水
分解比を生じることも示す。
ダイマー部位にてアクリジニウムエステルで内部標識化
したハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの
ｐＨ７.６における安定性 種々の配列ダイマー部位（以下、参照）に挿入した内部
リンカー−アーム、タイプ「Ｌ７」を含有するプローブ
を合成し、ＡＥで標識化し、実施例１に記載したごとく
に精製した。これらのプローブの配列およびリンカー−
アームの位置は以下のとおりである。 プローブＮｏ． 配列；リンカー−アーム位置（＃） １ 5’-GCT CGC TGC GGA CTT#AAA CCA ACA T-3’ ２ 5’-AGG TCG GTC T#TT CTC TCC TTT CGT CTA CG-3’ ３ 5’-CAA TCG TCG AAA CCA TT#G CTC CGT TCG A-3’ ４ 5’-CCG CTA#CCC GGT ACG TT-3’ ５ 5’-TTG CCC ACA CCG A#CG GCG-3’ ６ 5’-TTG CCC ACA CCG C#CG GCG-3’ ８０℃インキュベーション工程を省略し、かつ用いるタ
ーゲット核酸が以下のものである以外は実施例７に記載
したごとくにこれらのプローブをハイブリダイズした。 プローブ＃ ターゲット核酸 １ イー・コリｒＲＮＡの１μｇ ２および３ シイ・トラコーマティス(C. trachomatis)ｒＲＮＡの１μｇ ４ エヌ・ゴンドロエア(N. gondrrhoeae)ｒＲＮＡの１μｇ ５および６ 正確な合成ＤＮＡ補体の１.２ピコモル 実施例７に記載したごとく、ハイブリッド化プローブお
よび非ハイブリッド化プローブの安定性をｐＨ７.６に
て試験した。 結果： 安定性 半減期の比 エステル加水分解の半減期（分） ハイブリッド／対照 プローブ＃ ハイブリッド 対照 １ ４１.２ ０.９４ ４３.７ ２ ２４.２ ０.７１ ３４.５ ３ ４０.７ ０.９６ ４２.４ ４ １５.７ １.２ １３.１ ５ １１.１ １.０ １１.１ ６ ２２.６ ０.７４ ３０.５ これらのデータは、リンカー−アーム（および、従って
該ＡＥ）が広範囲の配列ダイマー部位に挿入でき、ハイ
ブリッド化形態においてもエステル加水分解からなお実
質的に保護されることを示す。さらに、本実施例は、こ
れらの均一検定フォーマットで用いた場合、ＤＮＡター
ゲットがハイブリッド化ＡＥ−プローブの良好な保護を
提供することを示す。また、本実施例は、ここで用いた
長い（９原子）リンカー−アームが、広範囲のリンカー
−アーム長が本明細書中に記載するＨＰＡフォーマット
で用いることができることを確立したこの特許で前で引
用した他のリンカー−アームと実質的に同等の微分加水
分解比を生じることも示す。
【００４１】実施例９ 完全に対合するターゲットでハイブリッド化したおよび
単一のミス対合のターゲットでハイブリッド化した内部
標識化ＡＥ−プローブのｐＨ７.６における安定性 残基６および７の間に挿入された内部アミンリンカー−
アーム、タイプ「Ｌ７」を有するイー・コリからのｒＲ
ＮＡの１６Ｓサブユニットに相補的な２４ｍｅｒプロー
ブを合成した。次いで、実施例１に記載したごとくに該
プローブをアクリジニウムエステルで標識化し、精製し
た。その配列は以下のとおりである（＃＝リンカー−ア
ーム位置）。 5’-CAA GCT# TGC CAG TAT CAG ATG CAG-3’ このプローブはシイ・ディベルシウス(C.diversius)の
１６Ｓサブユニットとともに、位置６（プローブストラ
ンドの５’末端からの番号）に単一のＴ−Ｇミス対合を
有する。実施例８に記載した手順に従って、該プローブ
をターゲットｒＲＮＡ（この場合はコー・コリまたはシ
イ・ディベルシウスいずれか）でハイブリダイズした。
得られたハイブリッド化プローブならびに非ハイブリッ
ド化プローブの試料の安定性を実施例７に記載したごと
くにｐＨ７.６にて試験した。 安定性 半減期の比 エステル加水分解の半減期（分） ハイブリッド／対照 ターゲット ハイブリッド 対照 イー・コリ １８.６ ０.８ ２３.３ シイ・ディ １.１＊ ０.８ １.４ ベルシウス ＊ （実施例２において記載したごとき）ＨＡＰ分析が
７３％ハイブリダイゼーションを示すように、エステル
加水分解の低い半減期は低いハイブリダイゼーション程
度のためではない。 これらのデータは、完全に対合するターゲットでのハイ
ブリッドの場合においても該ＡＥ−プローブは（これま
での実施例に記載したごとく）エステル加水分解から保
護されるが、単一の塩基のミス対合を含むターゲットで
のハイブリッドはほとんど保護されないことを示す。こ
れは完全なターゲットと単一部位ミス対合ターゲットの
間でＡＥ−プローブの加水分解速度に１７倍の差を生じ
させる。従って、本明細書中にて記載する方法は単一の
塩基の差を含む核酸ターゲット間を容易に識別区別でき
る。
単一のミス対合のターゲットでハイブリッド化した内部
標識化ＡＥ−プローブのｐＨ７.６における安定性 残基６および７の間に挿入された内部アミンリンカー−
アーム、タイプ「Ｌ７」を有するイー・コリからのｒＲ
ＮＡの１６Ｓサブユニットに相補的な２４ｍｅｒプロー
ブを合成した。次いで、実施例１に記載したごとくに該
プローブをアクリジニウムエステルで標識化し、精製し
た。その配列は以下のとおりである（＃＝リンカー−ア
ーム位置）。 5’-CAA GCT# TGC CAG TAT CAG ATG CAG-3’ このプローブはシイ・ディベルシウス(C.diversius)の
１６Ｓサブユニットとともに、位置６（プローブストラ
ンドの５’末端からの番号）に単一のＴ−Ｇミス対合を
有する。実施例８に記載した手順に従って、該プローブ
をターゲットｒＲＮＡ（この場合はコー・コリまたはシ
イ・ディベルシウスいずれか）でハイブリダイズした。
得られたハイブリッド化プローブならびに非ハイブリッ
ド化プローブの試料の安定性を実施例７に記載したごと
くにｐＨ７.６にて試験した。 安定性 半減期の比 エステル加水分解の半減期（分） ハイブリッド／対照 ターゲット ハイブリッド 対照 イー・コリ １８.６ ０.８ ２３.３ シイ・ディ １.１＊ ０.８ １.４ ベルシウス ＊ （実施例２において記載したごとき）ＨＡＰ分析が
７３％ハイブリダイゼーションを示すように、エステル
加水分解の低い半減期は低いハイブリダイゼーション程
度のためではない。 これらのデータは、完全に対合するターゲットでのハイ
ブリッドの場合においても該ＡＥ−プローブは（これま
での実施例に記載したごとく）エステル加水分解から保
護されるが、単一の塩基のミス対合を含むターゲットで
のハイブリッドはほとんど保護されないことを示す。こ
れは完全なターゲットと単一部位ミス対合ターゲットの
間でＡＥ−プローブの加水分解速度に１７倍の差を生じ
させる。従って、本明細書中にて記載する方法は単一の
塩基の差を含む核酸ターゲット間を容易に識別区別でき
る。
【００４２】実施例１０ 種々の条件下、室温におけるアクリジニウムエステルで
内部ラベル化されたハイブリッド化および非ハイブリッ
ド化プローブの安定性 内部ラベル化されたプローブ(挿入、タイプ１、実施例
１参照)を実施例８に記載のシー・トラコーマティス(C.
trachomatis) rＲＮＡ１μgでハイブリッド化した。実
施例７に記載の方法により、種々の試薬およびpＨ条件
(「結果」参照)下、室温でハイブリッド化および非ハイ
ブリッド化プローブの安定性を測定した。 結果: 緩衝液 pＨ 温度 ハイブリッド 対照 比率 0.2Mホウ酸塩 7.6 60℃ 34.13 0.89 38.08 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 7.6 40℃ 272 7.5 36.26 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 7.6 室温 2307.7 61 60.87 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 9.0 室温 468.75 7.7 60.87 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 10.0 室温 98.36 1.3 73.78 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 11.0 室温 5.6 0.79 7.08 5%トリトン 50mMフィチン 10.0 室温 145.48(fast)* 2.18 66.73(fast)* 酸、0.05%SDS 398.55(slow)* 182.82(slow)* 50mMフィチン 11.0 室温 175.44 1.31 133.92 酸、0.05%SDS *:フィチン酸系において、加水分解のカイネチックは２
相的である。「fast」は加水分解の初期の速い相を意味
し、「slow」は加水分解の後期の遅い相を意味する。 これらのデータにより、広範囲の検定条件に適合できれ
ば、ここに記載の均一保護検定が機能する種々の条件が
存在することが示される。さらに、ホウ酸塩以外のフィ
チン酸塩系も可能であり、例えば、非常に高い半減期比
が得られる室温でのフィチン酸系が挙げられる。
内部ラベル化されたハイブリッド化および非ハイブリッ
ド化プローブの安定性 内部ラベル化されたプローブ(挿入、タイプ１、実施例
１参照)を実施例８に記載のシー・トラコーマティス(C.
trachomatis) rＲＮＡ１μgでハイブリッド化した。実
施例７に記載の方法により、種々の試薬およびpＨ条件
(「結果」参照)下、室温でハイブリッド化および非ハイ
ブリッド化プローブの安定性を測定した。 結果: 緩衝液 pＨ 温度 ハイブリッド 対照 比率 0.2Mホウ酸塩 7.6 60℃ 34.13 0.89 38.08 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 7.6 40℃ 272 7.5 36.26 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 7.6 室温 2307.7 61 60.87 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 9.0 室温 468.75 7.7 60.87 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 10.0 室温 98.36 1.3 73.78 5%トリトン 0.2Mホウ酸塩 11.0 室温 5.6 0.79 7.08 5%トリトン 50mMフィチン 10.0 室温 145.48(fast)* 2.18 66.73(fast)* 酸、0.05%SDS 398.55(slow)* 182.82(slow)* 50mMフィチン 11.0 室温 175.44 1.31 133.92 酸、0.05%SDS *:フィチン酸系において、加水分解のカイネチックは２
相的である。「fast」は加水分解の初期の速い相を意味
し、「slow」は加水分解の後期の遅い相を意味する。 これらのデータにより、広範囲の検定条件に適合できれ
ば、ここに記載の均一保護検定が機能する種々の条件が
存在することが示される。さらに、ホウ酸塩以外のフィ
チン酸塩系も可能であり、例えば、非常に高い半減期比
が得られる室温でのフィチン酸系が挙げられる。
【００４３】実施例１１ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブ
を用いた緩衝液中のクラミジア(chlamydia)rＲＮＡの希
釈系列の検出 以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ(実施
例２と同様の)をハイブリッド化し、その標的rＲＮＡ
(この場合、クラミジア・トラコーマティス)の量を減少
させた。 ハイブリッド化混合物 ０.５μl プローブ(１２.５fmol) １μl ＲＮＡ(１０-2、１０-3、１０-4または１０-5μ
g) ２μl ２０％ ＳＤＳ １.７μl Ｈ2Ｏ ４.８μl １Ｍ ＰＢ、pＨ６.８ 対照混合物はrＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハ
イブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物
はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と
同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベー
トした。ハイブリッド化後、pＨ９の０.２Ｍボレート９
０μlを各サンプルに添加し、６０℃で１４分間インキ
ュベートした。ついで、インジェクション１が０.１％
Ｈ2Ｏ2のみであり、インジェクション２のpＨが１３.２
の代わりに１３.８であり、読み取り時間が１０秒の代
わりに７秒である以外は実施例２に記載のようにケミル
ミネッセンスを読み取った。 試薬ブランクおよび対照は３回平均を表し、その他はす
べて２回平均を表す。これらの結果により、ここに記載
の発明は純粋の緩衝液系において約１０-4μgの感度限
界まで標的rＲＮＡの線希釈系列を検出できた。
を用いた緩衝液中のクラミジア(chlamydia)rＲＮＡの希
釈系列の検出 以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ(実施
例２と同様の)をハイブリッド化し、その標的rＲＮＡ
(この場合、クラミジア・トラコーマティス)の量を減少
させた。 ハイブリッド化混合物 ０.５μl プローブ(１２.５fmol) １μl ＲＮＡ(１０-2、１０-3、１０-4または１０-5μ
g) ２μl ２０％ ＳＤＳ １.７μl Ｈ2Ｏ ４.８μl １Ｍ ＰＢ、pＨ６.８ 対照混合物はrＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハ
イブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物
はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と
同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベー
トした。ハイブリッド化後、pＨ９の０.２Ｍボレート９
０μlを各サンプルに添加し、６０℃で１４分間インキ
ュベートした。ついで、インジェクション１が０.１％
Ｈ2Ｏ2のみであり、インジェクション２のpＨが１３.２
の代わりに１３.８であり、読み取り時間が１０秒の代
わりに７秒である以外は実施例２に記載のようにケミル
ミネッセンスを読み取った。 試薬ブランクおよび対照は３回平均を表し、その他はす
べて２回平均を表す。これらの結果により、ここに記載
の発明は純粋の緩衝液系において約１０-4μgの感度限
界まで標的rＲＮＡの線希釈系列を検出できた。
【００４４】実施例１２ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブ
を用いた臨床培地中のクラミジアrＲＮＡの希釈系列の
検出以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ
(実施例２のような)を臨床試料中でハイブリッド化し、
その標的rＲＮＡ(この場合、クラミジア・トラコマチ
ス)の量を減少させた。 ハイブリッド化混合物 ５０μlスロート・スワブ(throat swab) ６μl ４.８Ｍ ＰＢ、pＨ４.７ ２μl rＲＮＡ(３×１０-4、３×１０-3、３×１０-2ま
たは３×１０-1μg) ２μl プローブ(１pmol) 対照混合物はrＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハ
イブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物
はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と
同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベー
トした。ハイブリッド化後、各混合物の１／３(２０μ
l)を最終pＨ９の ０.２Ｍボレート５０μlに添加し(ハ
イブリッド化混合物した混合物の添加後)、６０℃で４
０分間インキュベートした。ついで、各サンプルについ
て、実施例１１に記載のようにケミルミネッセンスを読
み取った。 結果: 試薬ブランク…１６３rlu 対照…６５６０rlu 負対照 １０-3μg rＲＮＡ…８５３５rlu １９７５rlu １０-2μg rＲＮＡ…２７３０６rlu ２０７４６rlu １０-1μg rＲＮＡ…２５８１９４rlu ２５１６３４rlu データは２回測定値の平均を表す。これらのデータによ
り、ここに記載の発明は臨床培地を含有する系において
約１０-3μgの感度限界まで標的rＲＮＡの線希釈系列を
検出できた。
を用いた臨床培地中のクラミジアrＲＮＡの希釈系列の
検出以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ
(実施例２のような)を臨床試料中でハイブリッド化し、
その標的rＲＮＡ(この場合、クラミジア・トラコマチ
ス)の量を減少させた。 ハイブリッド化混合物 ５０μlスロート・スワブ(throat swab) ６μl ４.８Ｍ ＰＢ、pＨ４.７ ２μl rＲＮＡ(３×１０-4、３×１０-3、３×１０-2ま
たは３×１０-1μg) ２μl プローブ(１pmol) 対照混合物はrＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハ
イブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物
はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と
同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベー
トした。ハイブリッド化後、各混合物の１／３(２０μ
l)を最終pＨ９の ０.２Ｍボレート５０μlに添加し(ハ
イブリッド化混合物した混合物の添加後)、６０℃で４
０分間インキュベートした。ついで、各サンプルについ
て、実施例１１に記載のようにケミルミネッセンスを読
み取った。 結果: 試薬ブランク…１６３rlu 対照…６５６０rlu 負対照 １０-3μg rＲＮＡ…８５３５rlu １９７５rlu １０-2μg rＲＮＡ…２７３０６rlu ２０７４６rlu １０-1μg rＲＮＡ…２５８１９４rlu ２５１６３４rlu データは２回測定値の平均を表す。これらのデータによ
り、ここに記載の発明は臨床培地を含有する系において
約１０-3μgの感度限界まで標的rＲＮＡの線希釈系列を
検出できた。
【００４５】実施例１３ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブ
を用いた尿中の細菌rＲＮＡの希釈系列の検出内部ラベ
ル化されたイー・コリ(Ｅ.coli)に対して特異的な３０
merプローブ(実施例２と同様の)を前記のように調製
した(アデニン置換、タイプ１のリンカー・アーム)。以
下の方法により、該プローブを尿中でハイブリッド化
し、その標的rＲＮＡ(この場合、イー・コリ)の量を減
少させた。 ハイブリッド化混合物 ７９.６μl 尿 ０.４μl ０.２５Ｍ ＥＤＴＡ、０.２５Ｍ ＥＧＴＡ １０μl、４.８ＰＢ、pＨ６.８ ５μl ２０％ ＳＤＳ ５μl プローブ(０.１２５ pmol) １μl ＲＮＡ(１０-3、１０-2または１０-1μg) 対照混合物はrＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハ
イブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物
はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と
同じであった。混合物は６０℃で３０分間インキュベー
トした。ハイブリッド化後、各サンプルにpＨ９の０.２
Ｍホウ酸塩３００μlを添加し、６０℃で１６分間イン
キュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例
１１に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。 結果: 試薬ブランク…６８４５rlu 対照…９２５０rlu 負対照 １０-3μg rＲＮＡ…９３５８rlu ８rlu １０-2μg rＲＮＡ…１４０５５rlu ４８０５rlu １０-1μg rＲＮＡ…６１８００rlu ５２５５０rlu 結果は２回測定値の平均を表す。これらの結果により、
ここに記載の発明は尿を含有する系において約５×１０
-3μgの感度限界まで標的rＲＮＡの線希釈系列を検出で
きた。
を用いた尿中の細菌rＲＮＡの希釈系列の検出内部ラベ
ル化されたイー・コリ(Ｅ.coli)に対して特異的な３０
merプローブ(実施例２と同様の)を前記のように調製
した(アデニン置換、タイプ１のリンカー・アーム)。以
下の方法により、該プローブを尿中でハイブリッド化
し、その標的rＲＮＡ(この場合、イー・コリ)の量を減
少させた。 ハイブリッド化混合物 ７９.６μl 尿 ０.４μl ０.２５Ｍ ＥＤＴＡ、０.２５Ｍ ＥＧＴＡ １０μl、４.８ＰＢ、pＨ６.８ ５μl ２０％ ＳＤＳ ５μl プローブ(０.１２５ pmol) １μl ＲＮＡ(１０-3、１０-2または１０-1μg) 対照混合物はrＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハ
イブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物
はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と
同じであった。混合物は６０℃で３０分間インキュベー
トした。ハイブリッド化後、各サンプルにpＨ９の０.２
Ｍホウ酸塩３００μlを添加し、６０℃で１６分間イン
キュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例
１１に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。 結果: 試薬ブランク…６８４５rlu 対照…９２５０rlu 負対照 １０-3μg rＲＮＡ…９３５８rlu ８rlu １０-2μg rＲＮＡ…１４０５５rlu ４８０５rlu １０-1μg rＲＮＡ…６１８００rlu ５２５５０rlu 結果は２回測定値の平均を表す。これらの結果により、
ここに記載の発明は尿を含有する系において約５×１０
-3μgの感度限界まで標的rＲＮＡの線希釈系列を検出で
きた。
【００４６】実施例１４ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブ
を用いた臨床培地中のクラミジアrＲＭＡの希釈系列の
検出のための分離工程と組み合わせて用いる選択的分解 内部ラベル化されたプローブ(実施例２のような)を、対
照およびブランク混合物を含む実施例８に記載するよう
な臨床試料(スロート・スラブ)中でハイブリッド化し
た。ハイブリッド化後、各サンプルの１／３を取り除
き、実施例８に記載のように正確に選択的分解に付し、
一方、１／３を単純に取り除き、室温で保持した(すな
わち、選択的分解を行わなかった)。すなわち、選択的
分解を行ったサンプルと、行わなかったサンプルの両方
を、以下の点で異なる以外は実施例２に記載のようにＨ
ＡＰを用いて非ハイブリッド化プローブから分離した: a．１mlのＨＡＰ溶液を用いた(２００μlの代わりに)、 b．１mlの洗浄液を用いた(２００μlの代わりに)、 c．３回洗浄した(１回の代わりに)、 d．最終のＨＡＰペレットを洗浄液１００μl中で再懸濁
させ、その全体について、ケミルミネッセンスを測定し
た(実施例２に記載のように)。 結果: 選択的分解 負 Ｓ:Ｂ 正 Ｓ:Ｂ 対照(rＲＮＡなし) １８ − ４.７ − １０-3μg rＲＮＡ ２７ １.５ １０ ２.１ １０-2μg rＲＮＡ １１７ ６.５ ７０ １５ １０-1μg rＲＮＡ ９３３ ５２ ５９１ １２６ ０.３３ μg rＲＮＡ ２７５６ １５３ １７９５ ３７３ 結果はすでに差し引いた試薬ブランクでを用いての２回
測定値の平均を表す。Ｓ:Ｂはシグナルとバックグラウ
ンドの比であり、すなわち、対照のケミルミネッセンス
により分割された特定のrＲＮＡ濃度でのケミルミネッ
センスである。これらのデータにより、分離前の選択的
デグラデーションの付加によって高いシグナル−バック
グラウンド比をもたらす低バックグラウンドとなるた
め、感受性を改良する。
を用いた臨床培地中のクラミジアrＲＭＡの希釈系列の
検出のための分離工程と組み合わせて用いる選択的分解 内部ラベル化されたプローブ(実施例２のような)を、対
照およびブランク混合物を含む実施例８に記載するよう
な臨床試料(スロート・スラブ)中でハイブリッド化し
た。ハイブリッド化後、各サンプルの１／３を取り除
き、実施例８に記載のように正確に選択的分解に付し、
一方、１／３を単純に取り除き、室温で保持した(すな
わち、選択的分解を行わなかった)。すなわち、選択的
分解を行ったサンプルと、行わなかったサンプルの両方
を、以下の点で異なる以外は実施例２に記載のようにＨ
ＡＰを用いて非ハイブリッド化プローブから分離した: a．１mlのＨＡＰ溶液を用いた(２００μlの代わりに)、 b．１mlの洗浄液を用いた(２００μlの代わりに)、 c．３回洗浄した(１回の代わりに)、 d．最終のＨＡＰペレットを洗浄液１００μl中で再懸濁
させ、その全体について、ケミルミネッセンスを測定し
た(実施例２に記載のように)。 結果: 選択的分解 負 Ｓ:Ｂ 正 Ｓ:Ｂ 対照(rＲＮＡなし) １８ − ４.７ − １０-3μg rＲＮＡ ２７ １.５ １０ ２.１ １０-2μg rＲＮＡ １１７ ６.５ ７０ １５ １０-1μg rＲＮＡ ９３３ ５２ ５９１ １２６ ０.３３ μg rＲＮＡ ２７５６ １５３ １７９５ ３７３ 結果はすでに差し引いた試薬ブランクでを用いての２回
測定値の平均を表す。Ｓ:Ｂはシグナルとバックグラウ
ンドの比であり、すなわち、対照のケミルミネッセンス
により分割された特定のrＲＮＡ濃度でのケミルミネッ
センスである。これらのデータにより、分離前の選択的
デグラデーションの付加によって高いシグナル−バック
グラウンド比をもたらす低バックグラウンドとなるた
め、感受性を改良する。
【００４７】実施例１５ 示差加水分解を用いる改良されたストリンジェンシー 以下のプローブをタイプ「Ｌ７」(以下の記号＃によっ
て示される挿入位置)の内部リンカー・アームを含有す
るように構成させ、実施例１に記載のようにアクリジニ
ウムエステルでラベル化し、そして精製した:このプロ
ーブはナイセリア・ゴノルホエーエ(Neisseria gonorrh
o-eae)の１６Ｓサブユニットに正確に相補的である。し
かしながら、それはエヌ・メニンギチディス(N.meningi
tidis)と密接に関係し、実施例２および８で引用したハ
イブリッド化ストリンジェンシー条件下で交叉反応が典
型的に観察される。実施例８に記載のように(２００μl
フォーマット中である以外は)、エヌ・メニンギティデ
イス０.５μgを用いてこのプローブをハイブリッド化
し、pＨ７.６の ０.２Ｍ四ホウ酸塩ナトリウム、５％
トリトン Ｘ−１００ １ml中、６０℃で１０分間インキ
ュベートして示差加水分解(＋Ｄ.Ｈ.)を行うか、または
これらの示差加水分解条件(−Ｄ.Ｈ.)に付さなかった。
得られたハイブリッドを磁気マイクロスフェア上で分離
し、以下に記載のようにケミルミネッセンスを測定し
た。磁気アミンマイクロスフェア(米国マサチューセッ
ツ州、ケンブリッジのアドバンスド・マグネチックス社
製バイオマグ Ｍ４１００(BioMag M1400, AdvancedMagn
etics, Inc., Cambridge, Mass.))１５０μgを含有する
pＨ６.０の０.４ＭＰＢ１mlを添加する。１０秒間撹拌
する。６０℃で５分間インキュベートする。１０秒間撹
拌する。ペース・メート(Pace-Mte)(登録商標)磁気分離
ラック(米国カリフォルニア州、サンディエゴのゲン・
プローブ社(Gen-Probe, Tnc., SanDiego, CA)を用いて
溶液から球体を磁気的に分離する。液体を廃棄する。p
Ｈ６.０の０.３Ｍ ＰＢ １mlを添加し、１０秒間撹拌
し、磁気的に分離し、液体を廃棄することにより該球体
を洗浄する。合計３回、洗浄を繰り返す。pＨ６.０の
０.２Ｍ ＰＢ ３００μlおよび５０％ホルムアミドを添
加し、１０秒間撹拌し、６０℃で５分間インキュベート
し、１０秒間撹拌し、ついで溶液から球体を磁気的に分
離することによりハイブリッドを溶離する。該溶液をク
リニルマット・チューブ(Clinilumat tube)に移し、実
施例７に記載のようにケミルミネッセンスを測定する。 結果: 条件 ケミルミネッセンス* −Ｄ.Ｈ. １７８.０３４ ＋Ｄ.Ｈ. ７４８ *:相対的光単位(rlu)で示されるハイブリッドシグナル
から対照シグナル(すなわち、rＲＮＡなし)を差し引い
たもの。このフォーマット中の正確な標的(すなわち、
エヌ・ゴノルホエーエ)からのシグナルは典型的に７〜
１０×１０6 rluである。 結論として、ここに記載の付加的なストリンジェンシー
識別工程としての示差加水分解技術の適用により、所望
でない交叉反応配列からのシグナルを非常に減少する。
本実施例においては、エヌ・ゴルノホエーエ・プローブ
とエヌ・メニンギティディスの交叉反応は２００フォル
ド(fold)以上に低下した。示差加水分解工程は、非ハイ
ブリッド化形態にある場合にプローブのケミルミネッセ
ンスを絶えず減少させ(加水分解により)ることにより、
非ハイブリッド化されたプローブと平衡にある不安定な
ハイブリッドに対する感受性を増大させ、したがって、
交叉反応によるケミルミネッセンスを低下させる。
て示される挿入位置)の内部リンカー・アームを含有す
るように構成させ、実施例１に記載のようにアクリジニ
ウムエステルでラベル化し、そして精製した:このプロ
ーブはナイセリア・ゴノルホエーエ(Neisseria gonorrh
o-eae)の１６Ｓサブユニットに正確に相補的である。し
かしながら、それはエヌ・メニンギチディス(N.meningi
tidis)と密接に関係し、実施例２および８で引用したハ
イブリッド化ストリンジェンシー条件下で交叉反応が典
型的に観察される。実施例８に記載のように(２００μl
フォーマット中である以外は)、エヌ・メニンギティデ
イス０.５μgを用いてこのプローブをハイブリッド化
し、pＨ７.６の ０.２Ｍ四ホウ酸塩ナトリウム、５％
トリトン Ｘ−１００ １ml中、６０℃で１０分間インキ
ュベートして示差加水分解(＋Ｄ.Ｈ.)を行うか、または
これらの示差加水分解条件(−Ｄ.Ｈ.)に付さなかった。
得られたハイブリッドを磁気マイクロスフェア上で分離
し、以下に記載のようにケミルミネッセンスを測定し
た。磁気アミンマイクロスフェア(米国マサチューセッ
ツ州、ケンブリッジのアドバンスド・マグネチックス社
製バイオマグ Ｍ４１００(BioMag M1400, AdvancedMagn
etics, Inc., Cambridge, Mass.))１５０μgを含有する
pＨ６.０の０.４ＭＰＢ１mlを添加する。１０秒間撹拌
する。６０℃で５分間インキュベートする。１０秒間撹
拌する。ペース・メート(Pace-Mte)(登録商標)磁気分離
ラック(米国カリフォルニア州、サンディエゴのゲン・
プローブ社(Gen-Probe, Tnc., SanDiego, CA)を用いて
溶液から球体を磁気的に分離する。液体を廃棄する。p
Ｈ６.０の０.３Ｍ ＰＢ １mlを添加し、１０秒間撹拌
し、磁気的に分離し、液体を廃棄することにより該球体
を洗浄する。合計３回、洗浄を繰り返す。pＨ６.０の
０.２Ｍ ＰＢ ３００μlおよび５０％ホルムアミドを添
加し、１０秒間撹拌し、６０℃で５分間インキュベート
し、１０秒間撹拌し、ついで溶液から球体を磁気的に分
離することによりハイブリッドを溶離する。該溶液をク
リニルマット・チューブ(Clinilumat tube)に移し、実
施例７に記載のようにケミルミネッセンスを測定する。 結果: 条件 ケミルミネッセンス* −Ｄ.Ｈ. １７８.０３４ ＋Ｄ.Ｈ. ７４８ *:相対的光単位(rlu)で示されるハイブリッドシグナル
から対照シグナル(すなわち、rＲＮＡなし)を差し引い
たもの。このフォーマット中の正確な標的(すなわち、
エヌ・ゴノルホエーエ)からのシグナルは典型的に７〜
１０×１０6 rluである。 結論として、ここに記載の付加的なストリンジェンシー
識別工程としての示差加水分解技術の適用により、所望
でない交叉反応配列からのシグナルを非常に減少する。
本実施例においては、エヌ・ゴルノホエーエ・プローブ
とエヌ・メニンギティディスの交叉反応は２００フォル
ド(fold)以上に低下した。示差加水分解工程は、非ハイ
ブリッド化形態にある場合にプローブのケミルミネッセ
ンスを絶えず減少させ(加水分解により)ることにより、
非ハイブリッド化されたプローブと平衡にある不安定な
ハイブリッドに対する感受性を増大させ、したがって、
交叉反応によるケミルミネッセンスを低下させる。
【００４８】実施例１６ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブ
を用いた慢性骨髄性白血病と合したキメラ標的配列の検
出 以下のように挿入したタイプ「Ｌ７」の内部リンカー・
アームを含有する２４merのプローブ(以上に示す配列)
を、実施例１に記載のようにＡＥでラベル化し、精製し
た:このプローブは慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)と合した
キメラmＲＮＡ転写(コモン・ブレーク)に相補的であ
り、bcr／abl プローブと呼ばれている。このキメラmＲ
ＮＡは、abl遺伝子の部位をbcr遺伝子を含有する他の染
色体の部位に転座することにより形成されるキメラ遺伝
子の産物である。bcr／abl標的の切断個所接合部位を表
す合成ＤＮＡ ６０mer標的および同じ部位中の正常bcr
およびabl標的は、実施例１に記載のように合成された
(以下の配列)。また、mＲＮＡ標的は、切断個所の中央
付近に位置するキメラbcr／abl遺伝子の４５０ ヌクレ
オチド断片を含有するpＧＥＭクローンの転写によって
生成させる。プローブ・センス(probe sense)中の同様
の４５０ヌクレオチド断片の mＲＮＡ転写を陰性対照
として生成した。ＢＣＲ／ＡＢＬプローブ配列
を用いた慢性骨髄性白血病と合したキメラ標的配列の検
出 以下のように挿入したタイプ「Ｌ７」の内部リンカー・
アームを含有する２４merのプローブ(以上に示す配列)
を、実施例１に記載のようにＡＥでラベル化し、精製し
た:このプローブは慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)と合した
キメラmＲＮＡ転写(コモン・ブレーク)に相補的であ
り、bcr／abl プローブと呼ばれている。このキメラmＲ
ＮＡは、abl遺伝子の部位をbcr遺伝子を含有する他の染
色体の部位に転座することにより形成されるキメラ遺伝
子の産物である。bcr／abl標的の切断個所接合部位を表
す合成ＤＮＡ ６０mer標的および同じ部位中の正常bcr
およびabl標的は、実施例１に記載のように合成された
(以下の配列)。また、mＲＮＡ標的は、切断個所の中央
付近に位置するキメラbcr／abl遺伝子の４５０ ヌクレ
オチド断片を含有するpＧＥＭクローンの転写によって
生成させる。プローブ・センス(probe sense)中の同様
の４５０ヌクレオチド断片の mＲＮＡ転写を陰性対照
として生成した。ＢＣＲ／ＡＢＬプローブ配列
【化１０】 合成標的配列ＢＣＲ／ＡＢＬ標的
【化１１】 ＡＢＬ標的
【化１２】 前記のように挿入された星印(＊)はアクリジニウムエス
テル付加のためのリンカー・アーム挿入位置を示し、下
線部分はabl配列を示す。実施例８に記載のように、前
記の各標的約１pmolでbcr/ablプローブをハイブリッド
化し、実施例７に記載のようにpＨ７.６でこれらのハイ
ブリッドおよび非ハイブリッド化されたプローブの安定
性を試験した。 結果: 半減期(分) 比率* 標的: bcr／abl mＲＮＡ ２７.７ ３９.６ bcr／abl ＤＮＡ １５.０ ２１.４ 対照: プローブ・センス mＲＮＡ ０.７ １ abl ＤＮＡ ０.７ １ bcr ＤＮＡ ０.７ １ 非ハイブリッド化プローブ ０.７ − *:標的または対照の半減期／非ハイブリッド化プローブ
の半減期 これらのデータにより、ＣＭＬと合したキメラbcr／abl
mＲＮＡ転写の切断個所接合部位をつなぐために設計さ
れたＡＥラベル化プルーブが、ここに記載のＨＰＡ技術
によってキメラ標的と正常の配列(および非ハイブリッ
ド化プローブ)を識別できることが示された。これは、
正常な非キメラ核酸の存在下、特にキメラ標的(典型的
には遺伝子疾患と合した)を検出するのに使用できる証
拠である。さらに本実施例により、rＲＮＡ以外の標的
(この場合、mＲＮＡおよびＤＮＡ)は、ＡＥラベル化プ
ローブにハイブリッド化された場合、ＡＥ加水分解に対
する保護を与えることが示された。
テル付加のためのリンカー・アーム挿入位置を示し、下
線部分はabl配列を示す。実施例８に記載のように、前
記の各標的約１pmolでbcr/ablプローブをハイブリッド
化し、実施例７に記載のようにpＨ７.６でこれらのハイ
ブリッドおよび非ハイブリッド化されたプローブの安定
性を試験した。 結果: 半減期(分) 比率* 標的: bcr／abl mＲＮＡ ２７.７ ３９.６ bcr／abl ＤＮＡ １５.０ ２１.４ 対照: プローブ・センス mＲＮＡ ０.７ １ abl ＤＮＡ ０.７ １ bcr ＤＮＡ ０.７ １ 非ハイブリッド化プローブ ０.７ − *:標的または対照の半減期／非ハイブリッド化プローブ
の半減期 これらのデータにより、ＣＭＬと合したキメラbcr／abl
mＲＮＡ転写の切断個所接合部位をつなぐために設計さ
れたＡＥラベル化プルーブが、ここに記載のＨＰＡ技術
によってキメラ標的と正常の配列(および非ハイブリッ
ド化プローブ)を識別できることが示された。これは、
正常な非キメラ核酸の存在下、特にキメラ標的(典型的
には遺伝子疾患と合した)を検出するのに使用できる証
拠である。さらに本実施例により、rＲＮＡ以外の標的
(この場合、mＲＮＡおよびＤＮＡ)は、ＡＥラベル化プ
ローブにハイブリッド化された場合、ＡＥ加水分解に対
する保護を与えることが示された。
【００４９】
【発明の効果】本発明により、均一フォーマットを用い
て標的核酸配列を感度良く検出するための組成物が提供
される。
て標的核酸配列を感度良く検出するための組成物が提供
される。
【図１】 アクリジニウムエステルーラベルプローブの
ＨＰＬＣ精製を示すグラフである。
ＨＰＬＣ精製を示すグラフである。
【図２】 実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】 実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】 実施例３の結果を示すグラフである。
【図５】 実施例３の結果を示すグラフである。
【図６】 実施例４の結果を示すグラフである。
【図７】 実施例５の結果を示すグラフである。
【図８】 実施例６の結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ノーマン・シー・ネルソン アメリカ合衆国92111カリフォルニア、サ ンディエゴ、マーレスタ・ドライブ3639番
Claims (21)
- 【請求項１】 標的核酸含有配列と該標的核酸含有配列
の核酸プローブからなる複合体において、該複合体がさ
らに該標的核酸含有配列又は該核酸プローブのいずれか
に化学的に結合したラベルを含有し、該ラベルの安定性
が複合体の一部である場合と、該複合体の一部ではない
場合と異なることを特徴とする標的核酸含有配列と標的
核酸含有配列の核酸プローブからなる複合体。 - 【請求項２】 複合体において、ラベルがアクリジニウ
ムエステルまたはその誘導体からなることを特徴とする
請求項１に記載の複合体。 - 【請求項３】 該ラベルが比色、蛍光、化学ルミネッセ
ンスまたは生物ルミネッセンスのいずれかの方法により
検出されるものである請求項１に記載の複合体。 - 【請求項４】 化学的に結合したラベルを有する第１ポ
リヌクレオチド塩基配列、及び第２ポリヌクレオチド塩
基配列からなり、該第１の塩基配列が第２の塩基配列の
近接または隣接する部位にハイブリッドを形成すること
ができ、該ハイブリッド中に存在する該ラベルの安定性
がハイブリッド化しないものの該ラベルの安定性と異な
ることを特徴とするポリヌクレオチド組成物。 - 【請求項５】 さらに、第３ポリヌクレオチド塩基配列
を含有し、ハイブリダイズ可能な第１または第２の塩基
配列がハイブリッド化し得る部位に近接または隣接した
部位において該第３塩基配列がハイブリッド化すること
が可能であることを特徴とする請求項４に記載の組成
物。 - 【請求項６】 ラベルがアクリジニウムエステルまたは
その誘導体からなることを特徴とする請求項４または５
に記載の組成物。 - 【請求項７】 アクリジニウムエステルまたはその誘導
体からなるラベルが化学的に結合している第１ポリヌク
レオチド塩基配列と、第２ポリヌクレオチド塩基配列か
らなり、該ラベルを含有する第１ポリヌクレオチド塩基
配列の近接または隣接する部位に該第２塩基配列をハイ
ブリッド化させることと、該ラベルが化学ルミネッセン
スにより検出され得ることを特徴とする組成物。 - 【請求項８】 電子的に励起されたアクリドン類を形成
することを化学反応により引き起こされる化学ルミネッ
センスにより検出され得る化学的に結合したラベルを含
有する第１ポリヌクレオチド塩基配列と、第２ポリヌク
レオチド塩基配列からなり、該ラベルを含有する該第１
ポリヌクレオチド塩基配列の近接または隣接する部位に
該第２ポリヌクレオチド塩基配列がハイブリッド化され
ることを特徴とする組成物。 - 【請求項９】 以下のもの：結合したラベルを含む第１
ポリヌクレオチド塩基配列、および第２ポリヌクレオチ
ド塩基配列からなる組成物であって、該第１配列および
該第２配列がハイブリッドを形成しうるものであり、該
ハイブリッドが完全には相補的でなく、該ハイブリッド
中において該ラベルが、該第２配列と完全には相補的で
ないヌクレオシド塩基またはその付近において該第１配
列上に配置されることによって、該第１配列に対して完
全に相補的な該第２配列の一部分に向かい合うように該
ヌクレオシド塩基が配置された場合よりも、安定性の変
化に対する該ラベルの感受性がより高いものである組成
物。 - 【請求項１０】 該ラベルが、該ハイブリッド中に存在
するミスマッチに隣接した位置において該第１配列上に
置かれているものである請求項９記載の組成物。 - 【請求項１１】 該ラベルが比色、蛍光、化学ルミネッ
セント、または生物ルミネッセントのいずれかの手段に
より検出されうるものである請求項１０記載の組成物。 - 【請求項１２】 該ラベルが蛍光または化学ルミネッセ
ント手段により検出されうるものである請求項１１記載
の組成物。 - 【請求項１３】 該ラベルがアクリジニウムエステルま
たはその誘導体からなるものである請求項１０記載の組
成物。 - 【請求項１４】 該ラベルがアクリジニウムエステルま
たはその誘導体である請求項１３記載の組成物。 - 【請求項１５】 アクリジニウム種に作用して電子的に
励起されたアクリドン種を生成させる化学反応により誘
導された化学ルミネッセンスによって該ラベルが検出さ
れるものである請求項１０記載の組成物。 - 【請求項１６】 以下のもの：第１ポリヌクレオチド塩
基配列（その３’または５’末端もしくはそれらの付近
にラベルを含む）、 第２ポリヌクレオチド塩基配列、および標的領域を含む
第３ポリヌクレオチド塩基配列からなる組成物であっ
て、該第１配列および該第２配列が両方とも、隣接領域
において該標的領域とハイブリッドを形成でき、その結
果、該第１配列、該第２配列および該標的領域からなる
ハイブリッド形成複合体の存在下における該ラベルの安
定性が、該第１配列上（該第１配列は１本鎖であるか、
あるいは該第２配列不存在下で該標的領域とハイブリッ
ド形成する）に存在する場合の該ラベルの安定性よりも
高いものである組成物。 - 【請求項１７】 該ラベルが比色、蛍光、化学ルミネッ
セント、または生物ルミネッセントのいずれかの手段に
より検出されうるものである請求項１６記載の組成物。 - 【請求項１８】 該ラベルが蛍光または化学ルミネッセ
ント手段により検出されうるものである請求項１７記載
の組成物。 - 【請求項１９】 該ラベルがアクリジニウムエステルま
たはその誘導体からなるものである請求項１６記載の組
成物。 - 【請求項２０】 該ラベルがアクリジニウムエステルま
たはその誘導体である請求項１９記載の組成物。 - 【請求項２１】 アクリジニウム種に作用して電子的に
励起されたアクリドン種を生成させる化学反応により誘
導された化学ルミネッセンスによって該ラベルが検出さ
れるものである請求項１６記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9939287A | 1987-09-21 | 1987-09-21 | |
| US099,392 | 1987-09-21 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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Family Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP50849088A Expired - Lifetime JP3787352B2 (ja) | 1987-09-21 | 1988-09-21 | ハイブリダイゼーション保護検定 |
| JP2000133493A Expired - Lifetime JP3483829B2 (ja) | 1987-09-21 | 2000-05-02 | 均一保護検定用組成物 |
| JP2000133506A Expired - Lifetime JP3587762B2 (ja) | 1987-09-21 | 2000-05-02 | 均一保護検定方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50849088A Expired - Lifetime JP3787352B2 (ja) | 1987-09-21 | 1988-09-21 | ハイブリダイゼーション保護検定 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000133506A Expired - Lifetime JP3587762B2 (ja) | 1987-09-21 | 2000-05-02 | 均一保護検定方法 |
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