NO892043L - Fremgangsmaate og preparat for diagnose. - Google Patents

Description

Beskrivelse

Homogen beskyttelsesbestemmelse

Dette er en "continuation-in-part" av Arnold, L.J., Jr. og Nelson, N.C. App. Ser. Nr. 099.392, innsendt 21. september 1987.

Bakgrunn

Den foreliggende oppfinnelse vedrører diagnostiske prosedyrer og teknikker for å påvise og bestemme svært små mengder av organiske forbindelser.

Mer spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse homogene diagnostiske bestemmelser hvori der er en forskjell i stabilitet for markøren i dens bundne former, i motsetning til dens ubundne former. Oppfinnelsen vedrører oppbygningen av forhold for diagnostiske bestemmelsessystemer hvori en markør nedbrytes forskjellig i enten sin kompleksdannede bundne form sammenlignet med dens ikke-kompleksdannede eller ubundne form.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Diagnostiske bestemmelser er vanlige analytiske teknikker for påvisning, lokalisering eller kvantifisering av biologiske substanser ved anvendelse av merkede bindingsreagenser. Tilstedeværelsen av det merkede reagens kan deretter påvises ved anvendelse av en rekke forskjellige kjente metoder. Den foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved alle kjente diagnostiske bestemmelsesformater, omfattende uten begrensning, direkte binding og konkurransebestemmelser og sekvensmetning. En spesiell type diagnostisk bestemmelse er nukleinsyrehybri-diseringbestemmelsen. Hybridiseringsbestemmelsessystemet er basert på det faktum at enkelkjedede nukleinsyrer (DNA eller RNA) vil hybridisere eller rekombinere, under passendebetin-gelser, med komplementære enkelkjedede nukleinsyrer. Ved å

merke den komplementære probe-nukleinsyren med en lett påvisbar markør, er det mulig å påvise tilstedeværelsen av target-

polynukleotidsekvensen av interesse i en testprøve inneholdende enkelkjedede nukleinsyresekvenser.

Bestemmelsessystemer kan stort sett karakateriseres som heterogene eller homogene. Uttrykket "heterogen" anvendt for bestemmelsessystemer, betyr de spesifikke bindingsbestemmelser som krever seperasjon av den merkede substans fra den umerkede substans som skal påvises. Homogene bestemmelsessystemer omfatter på den annen side ikke noen fysiske seperasjonstrinn. Fordi homogene bestemmelsessystemer involverer et minimalt antall behandlingstrinn er de generelt mer passende og lettere å anvende enn heterogene bestemmelsessystemer.

Et typisk sandwich-immunoassay kan f. eks omfatte inkubering av et immobilisert antistoff med et testmedium. Antigener, dersom de er tilstede i mediumet, vil bindes til antistoffet. Etter inkubering, fjernes ubundet antigen i et seperasjonstrinn. Etter en andre eller samtidig inkubering med en løs-ning av merket antistoff, blir det bundne antigen "sand-wiched" mellom det immobiliserte antistoff og det merkede antistoff. Etter et andre seperasjonstrinn, kan mengden merket antistoff bestemmes som et mål på antigenet i mediumet. Dette system er tidskrevende fordi det involverer en rekke inkubasjons- og seperasjonstrinn.

På bakgrunn av den tidligere kjente teknikk når det gjelder diagnostiske bestemmelser, har man nå forsøkt å utvikle homogene bestemmelser og markører som kan diskriminere mellom mindre forskjeller i mengden av bundne substanser i motsetning til ubundne substanser av interesse. Et av formålene med den foreliggende oppfinnelse er et bestemmelsessystem hvori selve markøren gjennomgår en påvisbar forandring som f. eks kan være dens evne til kjemiluminescens, når den er i bundet form i motsetning til ubundet form. Et annet formål for oppfinnelsen er et bestemmelsessystem hvori markøren nedbrytes eller ødelegges i vesentlig grad i enten sin bundne eller ubundne form, og tilveiebringer derved straks midler for identifisering og kvantifisering av reaksjonen av interesse. Et formål for den foreliggende oppfinnelse er oppnåelse av en forbedret metode for å sensitivt påvise analytter ved anvendelse av et homogent bestemmelsesformat. Det er også et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe forbedrede metoder for å øke sensitiviteten av bestemmelser som involverer separasjon, ved kombinering av den homogene metode angitt heri med andre separasjonsmetoder for å redusere ikke-spesifikk bakgrunn. Prinsippet for den foreliggende oppfinnelse er basert på den forskjellige stabilitet av en markør overfor kjemiske eller biokjemiske reagenser. Når spesielle markører er konjugert til bindingspartnere, har man funnet at stabiliteten av nevnte markører endres eller kan endres når nevnte bindingspartner er bundet til en bindingssubstans av nevnte bindingspartner. Den foreliggende oppfinnelse omfatter også en metode hvorved nevnte forskjellige markørstabilitet kan anvendes for en sensitiv påvisning av en anlytt ved anvendelse av et homogent diagnostisk bestemmelsessystem. Et ytterligere formål for oppfinnelsen er anvendelsen av kjemiluminescens-akridiniumester-merket DNA-prober i nevnte homogene diagnostiske bestemmelser for sensitiv påvisning av tilstedeværelsen av komplementære target-polynukleotidsekvenser.

Beskrivelse av kjent teknikk

Det er en rekke homogene bestemmelser i den kjente teknikk som varierer i kompleksitet. I noen systemer er f. eks markøren en katalysator som kan delta i en kjemisk reaksjon i nærvær av andre komponenter, f. eks enzymer, koenzymer og kofaktorer. I andre, om enn relaterte systemer, er markøren et substrat for en kjemisk eller biokjemisk reaksjon. Disse systemer, anvendes dannelsen av en spesifikk lett påvisbar substans, f. eks glukose, laktat eller alkohol for å undersøke og måle target-reaksjonen. I andre bestemmelsessystemer, har markøren enestående fysikalske egenskaper som gjør at den kan påvises direkte. Eksempler på slike typer markører omfatter metaller, hemoglobin og klorofyll.

Ytterligere andre homogene bestemmelsessystemer er basert på enzym-koblede spesifikke bindingsreaksjoner, hvori analytten er en ligand for en spesifikk bindingsreaksjon. Når analytten er tilstede, gjennomgår den en spesifikk bindingsreaksjon med et konjugat som omfatter en spesifikk bindingspartner og en merkesubstans. Enten samtidig eller påfølgende, tilsettes andre substituenter som virker sammen med markøren. Aktivi-teten av markøren er forskjellig når konjugatet, av hvilket markøren er en komponent, er i en kompleksdannet form i motsetning til en ikke-kompleksdannet form. Slike systemer har typisk anvendt enzymer som merkingsreagens og substrater som danner et kolorimetrisk, fluorimetrisk eller kjemiluminescerende endepunkt. Eksempler på homogene enzym-immunoassays omfatter US patent nr 3.654.090, 3.817.837 og 4.190.496. Andre eksempler på homogene bestemmelser som omfatter anvendelsen av kromoforer som utgjør fluorescerende/utsluknings-par finnes i US patent nr 4.199.559, 4.174.384 og 4.318.707. I noen systemer har imidlertid markøren vært en substans som ikke er et enzym, f. eks vitaminer, NAD, FAD eller biotin, som likevel kan kobles til en "overvåknings" reaksjon. Et eksempel på denne type er US patent nr 4.383.031. I disse systemer er overvåkningsreaksjonen basert på en strukturell forandring som modifiserer markørens aktivitet.

Andre homogene bestemmelsessystemer involverer teknikken med polariserings fluorescens. Her konkurrerer analytten med et fluorescerende konjugat med lav molekylvekt for binding til en spesifikk bindingspartner med høy molekylvekt. Da polariseringen av fluorescensen forandrer seg når små molekyler fortrenges fra overflaten av det store molekyl, er det mulig å bestemme mengden analytt i løsning. Et eksempel på denne type bestemmelsessystem er US patent nr 4.668.640.

En ytterligere type homogent bestemmelsessystem involverer ikke-strålingsenergi-overføring. I disse systemer, anvendes lysabsorpsjonen fra et molekyl til et annet, når de to molekylene kommer i umiddelbar nærhet av hverandre som overvåkningsreaksjon. Disse metoder er generelt beskrevet på to måter. I en metode, er det første molekyl kjemiluminescerende og ved eksitasjon overføres en del av den dannede elektromagnetiske energi til et annet "absorpsjons" molekyl som må være i umiddelbar nærhet. Dersom energien absorberes av det andre molekyl og emitteres ved en annen bølgelengde, vil en del av lyset vise en spektral forskyvning som er proporsjonal med antall kjemiluminescerende molekyler i umiddelbar nærhet av absorpsjonsmolekylene.

I annen type ikke-strålingsenergibestemmelsessystemer, er det første molekyl fluorescerende og tjener som et "absorpsjons-middel" av eksternt lys. I nærvær av et annet fluorescerende molekyl overføres en del av energien og lys emitteres ved en annen bølgelengde. Det emitterte lys viser en sprektral forskyvning som er proporsjonal med antall "absorpsjons" og "emitter" molekyler i umiddelbar nærhet av hverandre.

En annen type dobbelt probe-bestemmelsessystemer ses i US patent nr 4.670.379. Den første probe er merket med en katalysator; den andre med en apoluminescerer. Begge prober "target"-naboområder på nukleinsyresekvensen. Når begge prober er hybridisert sammen med targeten, tilsette substratet. Katalysatoren omdanner substratet til et transforma-sjonsradikal som i sin tur omdanner apoluminescereren på den andre proben til en luminescerer. Dette skjer bare dersom hybridisering har funnet sted. Ved anvendelse av disse prinsipper, har bestemmelser blitt utviklet basert på to merkede substanser som samtidig binder en felles analytt.

Et spesifikt eksempel på denne type energioverføringsbestem-melsessystem er Elazar et al., EP patentansøkning nr 85.105.130.0, publikasjonsnummer 0.159.719, publisert 30. oktober 1985, som omfatter anvendelse av to enkelkjedede nuk-leinsyreprober som er komplementære til de samme eller mot-satte kjeder av de target-genetiske materialer. Hver probe er merket med en rest som bare er i stand til å gi et signal når de to markørene bringes sammen. Til forskjell fra den foreliggende oppfinnelse, omfatter Elazar et al. dannelse og påvisning av doble hybrider eller multihybrider. Likeledes omfatter Heller et al., EPO patentansøkning nr 82.303.699.1, publikasjonsnummer 0.070.685, datert 26. januar 1983 og relaterte Morrison et al., EPO patentansøkning nr 82.303.700.7, publikasjonsnummer 0.070.686 med samme dato, homogene bestemmelsessystemer ved anvendelse av to luminescerende prober. Minst en av lys-markørene er av absorpsjons-/emisjonstypen slik at når de to prober hybridiseres til targeten, skjer energioverføringen mellom de to markører. Dette fører til at absorpsjons-/emisjonssubstansen re-emitterer ved en annen bølgelengde. Den andre emisjon påviser hybridisering. En antigenbestemmelse av denne typen er gitt i Morrison et al supra.

De fleste biologiske substanser kan ikke lett påvises direkte ved et rimelig sensitivitetsnivå og krever en bindingsreaksjon av en eller annen type. Som det går fram fra det som er nevnt over, baserer den tidligere kjente teknikk se på påvisning av mindre svekkelser mellom bundet og ubundet markør. Systemene i henhold til kjent teknikk er ikke i stand til signifikant diskriminering mellom bundet og ubundet markør. Slike bestemmelser er funnet å kunne anvendes for påvisning av analytter som kun er tilstede i høye konsentra-sjoner, f. eks ved overvåkningen av forskjellige legemidler i blod og urin.

Innen klinisk diagnostisering er det et behov for en homogen bestemmelse for direkte påvisning som er basert på den evnen som to bindingspartnere har til å modifisere stabiliteten av markøren, som f. eks resulterer i selektiv fjerning eller ødeleggelse av markøren i enten den bundne eller den ubundne form. Hirschfield , i Fluorescence Background Discrimination by Prebleaching, J. Histochemistry and Cytochemistry, 27/1, 96 - 101 (1979) beskriver en noe relatert elektroforese teknikk som involverer fotokjemisk avfarging som kan ødelegge markørmolekyler, eller i det minste deres fluorescens. Oppfinnelsen angitt heri lærer eller forslår ikke anvendelse av fotokjemisk avfarging eller noen annen teknikk for selektiv fjerning eller ødeleggelse av en markør i en diagnosktisk bestemmelse. Den foreliggende oppfinnelse oppfyller et nåværende behov i diagnostiske bestemmelser da den i størrelsesorden er mye mer sensitiv enn tidligere kjent teknikk. Sensitivitetsområdet for den tidligere kjente teknikk er ikke bedre enn i området lO<-1>^ mol, mens den — 16 foreliggende oppfinnelse er sensitiv i området 10 mol.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører diagnostiske bestemmelser og metoder. Metoden kan anvendes for å påvise en analytt i et medium, idet nevnte analytt er del av et spesifikt bindingspar. Når mediumet som antas inneholde analytten kombi-neres med en bindingspartner, er en markørsubstans som er festet til bindingspartnere i stand til å gjennomgå en påvisbar forandring når det gjelder stabilitet eller differensiell nedbryting hver gang analytten bindes til den spesifikke bindingspartner. I en spesifikk utførelsesform, er enkeltkjedet-nukleinsyreprobe modifisert til å inneholde markører i prak-tisk talt enhver ønsket posisjon eller sted på proben. Probe-markørene har forskjellig stabilitet eller er mottagelige for differensiell nedbryting avhengig av om target-nukeleinsyre-sekvensen er hybridisert til proben.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter særlig bestemmelsessystemer hvor markøren på den bundne probe er stabilisert i forhold til den ubundne probe. Denne stabilisering kan være avhjulpet ved interkalering. DNA-interkaleringsforbindelser, omfattende akridiniumester, er særlig, men ikke utelukkende, passende for anvendelse i bestemmelsessystemet i henhold til oppfinnelsen. DNA-interkalatorer er kjent å binde ikke-kovalent til duplex-DNA og er karakteristiske flate molekyler som kan innskytes mellom baseparene i dobbelhelixens DNA. Man har bevis som indikerer at akridiniumestere foretrekkker å gå inn i områder som er rike på adenin og tymidin-basepar.

Det skal forstås at mens den foreliggende oppfinnelse heretter beskrives med spesiell referanse til akridiumester-merkede prober, ser den foreliggende oppfinnelse på anvendelse av ekvivalente markører og bestemmelsesformater som er mottagelige for differensiell nedbrytning eller stabilitets-forandring når konjugatet, hvortil markøren er en komponent, er bundet. Som det vil bli forklart mer detaljert heri, in-kluderer andre passende markørforbindelser substanser som destabiliseres ved hjelp av aminene som er tilstede på nukleinsyrene, særlig dem i nærheten av markøren på uhybridiserte prober. Dessuten kan markørsubstanser som kan virke sammen med hydrofobe omgivelser, f. eks ved interkalering mellom basepar, også anvendes.

Den foreliggende oppfinnelse kan generelt anvendes i ethvert system som involverer vesentlig selektiv nedbrytning av mar-køren når man sammenligner dens bundne og ubundne konjugerte former. Videre, pga den relative enkelhet av bestemmelsessystemet, som ikke involverer noen separasjons- eller vaske-trinn, er det både raskere og billigere enn konvensjonelle systemer. Systemet kan være mer sensitivt enn konvensjonelle systemer i de tilfeller hvori der er store forskjeller i stabilitet mellom de bundne og ubundne konjugerte former av mar-køren fordi alt det resterende eller ubundne markørkonjugat er ødelagt og derfor ikke påvist. Videre er systemet svært allsidig og kan enten anvendes alene eller i kombinasjon med andre separasjonsmetoder og gir svært liten bakgrunnstøy. Den foreliggende oppfinnelse kan anvendes i probediagnostika, omfattende påvisning av infeksjon og genetisk og virale sykdommer og for diagnostisering av cancer.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er en grafisk fremstilling av HPLC-rensing av en

akridiniumester-merket probe.

Fig. 2 er en grafisk fremstilling av resultatene som er

gitt i eksempel 2.

Fig. 3 - 5 er grafiske fremstillinger av resultatene gitt i

eksempel 3.

Fig. 6 er en grafisk fremstilling av resultatene gitt i

eksempel 4.

Fig. 7 er en grafisk fremstilling av resultatene gitt i eksempel 5. Fig. 8 er en grafisk fremstilling av resultatene gitt i

eksempel 6.

Beste type og detaljert beskrivelse av foretrukne utførelses-former

Følgende definisjoner anvendes i den forliggende beskrivelse: 1. Akridiniumester: akridinderivat med et kvaternært nitrogensentrum og som er derivatisert i 9-stillingen til å gi en labil fenylesterrest, særlig 4,2-succin-imidyloksykarbonyletyl)-fenyl-10-metylakridinium-9-karboksylatfluorsulfonat:

2. Akridiniumester: rester av den følgende generelle type:

R-L = ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT AL KYL, SUBSTITUERT ALKENYL, SUBSTITUERT ARYL, ALKOKSY,

ARYLOKSY ELLER ER FRAVÆRENDE NÅR X = HALOGEN.

R2= H, ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT ALKYL,

SUBSTITUERT ALKENYL, SUBSTITUERT ARYL, ALKOKSY,

ARYLOKSY, DERSOM OG KUN DERSOM X = N.

R3= H, AMINO, HYDROKSY, TIOL, HALOGEN, NITRO, AMINO,

AMIDO, ACETYL, ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT ACETYL, SUBSTITUERT ALKYL, SUBSTITUERT ALKENYL,

SUBSTITUERT ARYL, ALKOKSY, ARYLOKSY.

R4= ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT ALKYL, SUBSTITUERT ALKENYL, SUBSTITUERT ARYL.

X = 0, N, S, HALOGEN, SUBSTITUERT FOSFOR, SUBSTITUERT

SVOVEL, SUBSTITUERT BOR ELLER SUBSTITUERT ARSEN.

Y = 0, S ELLER NH.

Ri OG/ELLER R2OG/ELLER R3OG/ELLER R4HAR ET REAKTIVT SETE

SOM TILLATER KONJUGERING.

3. Analytt - enhver substans som kan gjennomgå en bindingsreaksjon med en eller flere spesifikke bindingspartnere, omfattende, uten begrensning, antigener og antistoffer dertil, haptener og antistoffer dertil; hormoner, legemidler, metabolitter, vitaminer, koenzymer og deres bindingspartner, omfattende reseptorer; polynukleotider, oligonukleotider og hybrider av polynukleotider eller oligonukleotider og antistoffer og bindingssubstanser dertil; polynukleotider eller oligonukleotider og hybridiserbare polynukleotider eller oligonukleotider

dertil; metaller og chelatdannere dertil.

4. Bindingspartner - ethvert molekyl eller substans som er i stand til å gjennomgå en spesifikk bindingsreaksjon med en analytt. 5. Duplex: dobbelkjedet kompleks dannet ved basepartil-pasning av to komplementære, enkelkjedede nukleinsyre-molekyler. 6. Hybridisering: dannelsen av stabile duplexer mellom to komplementære enkeltkjedede DNA eller RNA molekyler eller et DNA og komplementært RNA-molekyl. Duplexdannelse er spesifikk for komplementære basepar, idet den genetiske kode for det hybridserte spesifikke gen

derved reproduseres.

7. Bundet: tilstand hvorved en bindingsinteraksjon er dannet mellom et molekyl og dets spesifikke bindingspartner . 8. Stabil: resistent overfor kjemisk eller biokjemisk nedbrytning, reaksjon, spalting, deplassering eller

modifisering.

9. Stabilitet: resistens for en substans overfor kjemisk eller biokjemisk nedbryting, reaksjon, spalting, deplassering eller modifisering.

Det er kjent at i løsning er akridiniumesterne i likevekt med deres tilsvarende baser. Ved høy pH, favoriseres base-dannelse; de kvaternære nitrogentyper igjendannes ved lav pH. Det er også kjent av kjemiluminescensreaksjon kan påvirkes ved tilsetning av base, særlig en vandig løsning av natrium-hydroksyd inneholdende hydrogenperoksyd. Kjemiluminescens involverer angrep av hydroperoksydioner på akridiniumforbin-delsene, som resulterer i dannelsen av N-metylakridon med eksiterte elektroner. Se generelt Weeks et al., Acridinium Esters as High-Specific Activity Labels in Immunoassay, Clin. Chem. 2918, 1474 - 1479 (1983). Reaksjonen er vist skjematisk under.

Den foreliggende oppfinnelse kan gjennomføres som følger. Først velges bindingspartnere omfattende en bindingssubstans og en eller flere bindingspartnere for den bestemmelse skal utføres. Disse parene kan være antigener og antistoffer dertil; haptener og antistoffer dertil; hormoner, medika- menter, metabolitter, vitaminer, koenzymer og deres bindingspartnere, omfattende reseptorer; polynukleotider, oligonukleotider, og hybrider av polynukleotider eller oligonukleotider og antistoffer og bindingssubstanser dertil; polynukleotider eller oligonukleotider, og hybridiserbare polynukleotider eller oligonukleotider dertil; metaller og chelatdannere derfor.

Deretter velges bestemmelsestypen som skal anvendes. Disse kan velges fra typer omfattende direkte bindingsbestemmelser, konkurrerende bestemmelser, sekvensielle metningsmetoder og "sandwich"-bestemmelser.

For det tredje velges en markør for den bestemmelse som skal utføres. Dette kan være en markør som kan påvises direkte eller indirekte ved kolorimetriske, fluorimetriske, kjemiluminescerende eller bioluminescerende anordninger. Markøren skal ytterligere ha den egenskap at den kan nedbrytes kjemisk eller biokjemisk slik at dens evne til å påvises modifiseres, idet nevnte nedbrytning er mulig under betingelser som ikke skadelig påvirker bindingen mellom den merkede bindingspartner og dens bindingssubstans og andre bindingspartnere og bindingssubstanser som deltar i reaksjonen. Foretrukne markø-rer er dem som, etter at de er utsatt for syrer, baser eller selektive oksydasjonsmidler slik som peroksydat, eller enzymer blir påvirket med hensyn til deres evne til å bli påvist.

For det fjerde, anvendes kjemiske metoder som er kjent innen teknikkens stand, idet markøren festes til bindingssubstansen i et bindingssete slik at markørens sensitivitet overfor kjemiske og biokjemisk nedbrytning modifiseres ved interak-sjon av den merkede bindingspartner med dens spesifikke bindingssubstans(er). I noen tilfeller kan flere forskjellige seter testes for markørfesting og det sted som gir den beste differensielle nedbrytning kan anvendes.

For det femte optimaliseres nedbrytningsbetingelsene, enten de er kjemiske eller biokjemiske, til å gi den beste påvisningsdiskriminering for den merkede bindingspartner i nærvær og fravær av dens bindingssubstans.

Til slutt, for anvendelse av de valge typer bestemmelser, testes bestemelsessystemets evne til å påvise kvantitativt eller kvalitativt analytten, idet man generelt anvender trinnene:

a. Inkubering

b. Selektiv nebrytning

c. Påvisning eller

a. Samtidig inkubering og selektiv nedbrytning b. Påvisning.

Ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelse, er oligo-nukleotidprober merket med kjemiluminescerende akridiniumestere særlig anvendbare for påvisning av sekvens-spesifikke polynukleotider gjennom hybridisering. Akridiniumestere kan bindes, gjennom en rekke forskjellige bindingsseter, på DNA-prober og/eller blandede nukleotid/ikke-nukleotid polymerer som beskrevet i US patentansøkning, serienummer (ikke tildelt foreløpelig), innsendt 21. september 1987 med tittelen "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotided Probes" av Arnold, et al. Denne omfatter evnen til å merke nukleotidbasene, fosfat-hovedkjeden, 3'-terminalen og 5<1->terminalen av oligonukleotider såvel som de ikke-nukleotide monomerenheter av blandede nukleotid/ikke-nukleotid polymerer.

Slike akridiniumester-merkede prober kan vises betydelig forskjellig kjemisk stabilitet når probene, hvortil esterne er bundet, er frie i løsning sammenlignet med når de er hybridisert. Denne forskjellige stabilitet avhenger av den stilling akridiniumesteren har i proben, nukleotidresten i umiddelbar nærhet av akridiumester-markøren og tilstedeværelsen av andre probemolekyler som danner stabile hybrider med target-polynukleotidet. En skjematisk fremstilling er vist i det følgende.

Under bestemmelse av faktorene som bidrar til den differensielle stabilitet av akridiniumesteren på DNA-probemolekyler, har man funnet at de frie aminer på basene av ikke-hybridiserte prober (både nukleotid og blandet nukleotid/ikke-nukleotid) destabiliserte akridiniumesteren, særlig i et alkalisk miljø. Samtidig, dersom akridiniumesteren er i nærheten av probens termiale ende, kan den også alkali-destabiliseres ved hjelp av aminer som kommer fra target-sekvenser når hybridisering skjer. Når proben hybridiserer med et sekvens-spesifikt polynukleotid (bindingssubstans) deltar probeaminene i baseparing med komplementære nukleotider og er begrenset i deres evne til å destabilisere akridiniumesteren, særlig i et alkalisk miljø. Samtidig, har man funnet at akridiniumesteren ytterligere ble stabilisert med hensyn til nedbrytning ved interkalering inn i hybrid-duplexen, særlig i områder med adenin/tymidin-basepartetthet. Man har funnet at en rekke andre innskytningsområder også gir god differensiell hydrolyse, som forklart i den følgende del. Det finnes en rekke måter hvorved den foreliggende opp-

finnelse kan anvendes i hybridisering. Disse omfatter uten begrensning: 1. Binding av akridiniumesteren til det sentrale området av proben og nær et område med adenin/tymidin-basepar. En foretrukket metode er å binde en akridiniumester til en ikke-nukleotid-monomerenhet som gitt i US patentan-

søkning, serienummer (ikke tildelt ennå) innsendt 21. september 1987, med tittel "Non-nucleotide Linking Reagens for Nucleotide Probes" av Arnold et al, som er bundet som en innskutt del til nukleotid-monomerenhetene som er komplementære til umiddelbart nærliggende nukleotider i target-polynukleotidsekvensen. En slik anbringelse tjener til å begrense aminene i nukleotidbasene på begge sider av akridiniumesteren og tilveiebringe et sete for interkalering.

2. Festing av akridiniumesteren til enten 3'- eller 5'-terminalen av proben og begrense virkningene av nærliggende amin som kommer fra target-polynukleotidet med en annen probe som hybridiserer i nabostilling til den første. Dette vil også være ønskelig dersom den nevnte annen probe danner et A/T baseparrikt område ved duplexdannelse. Selv om dette dobbeltprobe- eller sandwichsystem er avhengig av dannelsen av to duplexer istedet for bare en, kan det tilveiebringe en metode for sensitiv påvisning av mindre baseparforandringer som kan skjelnes ved svært korte prober, dvs prober med en

lengde på omtrent 5-15 nukleotider.

3. Binding av akridiniumesteren i eller nær setet for en mistilpasning med en polynukleotidsekvens som ikke er det ønskede target-polynukleotid. På denne måte kan diskriminering mellom polynukleotidsekvenser som bare skiller seg fra hverandre med et nukleotid, oppnås, da området av duplexen rundt et mistilpasningssete er tilstrekkelig destabilisert til å gjøre acridinium-esteren (dersom den er festet i eller nær dette sete) mottagelig for nedbrytning.

En foretrukket fremgangsmåte for de ovennevnte tre typer er å gjennomføre det differensielle hydrolysetrinn ved samme temperatur som hybridiseringstrinnet, typisk fra 50 - 70°C.

En annen fremgangsmåte er å gjennomføre et annet differen-sielt hydrolysetrinn ved romtemperatur. Dette tillater anvendelse av pH i området fra 10 - 11, noe som gir endog større forskjeller i graden av hydrolyse mellom hybridisert og ikke-hybridisert akridiniumester-merket probe.

Under normale omstendigheter har slike korte prober evnen til å diskriminere enkle mistilpasninger under passende hybridi-seringsbetingelser. Av praktiske grunner anvendes de imidlertid ikke fordi de ikke er tilstrekkelig spesifikke for enkle polynukleotidseter. Dvs at den korte probe vil hybridisere en rekke spesifikke seter inneholdt i et stort antall tilstedeværende komplekse DNA eller RNA sekvenser. Med det tilføyde krav, at to forskjellige prober må hybridiseres umiddelbart til nærliggende polynukleotidområder, kan slike områder targetiseres spesifikt og indentifiseres. Således kan fordelene med kort-probe-diskriminering anvendes mens man opprettholder spesifisiteten av området som begge prober spenner over.

Eksperimentelle metoder og materialer

Følgende eksempler er gitt for å illustrere den foreliggende oppfinnelse og ikke for å begrense oppfinnelsen. Eksemplene er basert på for tiden tilgjengelige data og på de mest sannsynlige forklaringer av fenomenet. Andre faktorer og metoder kan fremkomme med ytterligere forskning. Skjønt oppfinnelsen er beskrevet detaljert ved hjelp av illustra-sjoner og eksempler ved anvendelse av akridiniumester-markører, kan visse forandringer og modifikasjoner gjennom-føres innen rammen for oppfinnelsen og andre markørsystemer kan anvendes innen rammen for oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Oppbygning av akridiniumester-merkede prober.

A. Syntese og rensing av amin linker-arm prober. Deoksyoligonukleotidprober ble syntetisert til å inneholde en amin linker-arm (dvs en som slutter med primært amin for merking med akridiniumester) lokalisert enten på den 5'-terminale ende, på et forhåndsutvalgt sted langs polyfosfat-kjeden, i den indre del av proben eller bundet til en av nukleotidbasene.

(i)

For å binde en 5'-amin linker-arm til en probe, ble følgende forbindelse anvendt:

Denne forbindelse vil i det følgende omtales som det terminale amin linker-arm reagens. Dette reagens ble syntetisert som følger: 6-aminoheksanol ble omsatt med S-etyltrifluor-tioacetat i vannfri etylacetat. Reaksjonsproduktet ble presipitert i petroleumeter, behandlet med en blanding av 10 % pyridin i vann i 10 minutter for å hydrolysere det 0-trifluoracetyl som er dannet, og avdampet til tørrhet i form av en gummi. Denne forbindelse ble deretter fosfittylert i henhold til standard prosedyrer innen litteraturen til å gi den ønskede forbindelse, nemlig terminal amin linker-arm reagens (1).

Prober inneholdende en 5'-amin linker-arm ble syntetisert som følger. Ved anvendelse av en Applied Biosystems, Inc. Model 3 80A DNA-syntesizer, ble prober med ønsket nukleotidsekvens fremstilt ved anvendelse av standard fosforamidittkjemi, i det probene ble bygget fra 3'-enden til 5'-enden. Etterat den ønskede sekvens var fullstendig, ble amin linker-armen automatisk koblet til 5<1->hydroksylgruppen i proben ved anvendelse av det terminale amin linker-arm reagens på samme måte som et annet fosforamidittnukleosid ville blitt koblet. Ved anvendelse av standard prosedyrer, ble proben deretter spaltet fra den faste bærer, avbeskyttet og renset ved polyakrylamidgelelektroforese etterfulgt av Sephadex G-25 kromatografi.

Følgende probe ble syntetisert og renset ved anvendelse av denne prosedyre:

5'~NH2-(CH2)6-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3'

hvori NH2-(CH2)g representerer amin linker-armen.

(ii)

For å innlemme en amin linker-arm i den indre del av en probe, ble indre amin linker-arm reagens, type 1 eller type 2, anvendt som beskrevet i US patentansøkning med serienummer 099.050 med tittel "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" innsendt 21. september 1987, av Arnold et al. Igjen ble prober syntetisert ved anvendelse av standard fosforamidittkjemi og renset ved anvendelse av polyakrylamid-gel-elektroforese og Sephadex G25 kromatografi.

Følgende prober ble syntetisert ved anvendelse av denne prosedyre: 1. ) En 30mer komplementær til 16S subenheten i rRNA for E. coli, med en intern amin linker-arm, type 1, som erstatter en adeninrest i 18-stillingen i sekvensen: Erstattet med en intern amin linker- arm, type 1

5'-CCA CTG CTG CCT CCC GT© GGA GTC TGG GCC-3'.

2. ) En 33mer komplementær til 16S subenheten av rRNA fra Chlamydia trachomatis, med en intern amin linker-arm, type 1, som erstatter en adeninrest i 21-stillingen i sekvensen,

Erstattet med en intern amin linker- arm, type 1

5"-CGT TAC TCG GAT GCC CAA AT@TTCG CCA CAT TCG-3' ,

eller innskutt mellom 21 og 22-restene,

En intern amin linker- arm, type 1 eller type 2, innskutt her

5'-CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA^TCG CCA CAT TCG-3'.

(iii)

Nukleotidbaser inneholdende amin linker-arm ble innlemmet i en probe som følger. Templat og primer oligonukleotider med følgende sekvenser ble syntetisert:

(Primeren og utvidede primersekvenser er komplementære til 16S subenheten av C. trachomatis.)

Primer-utvidelse ved anvendelse av Klenow-fragmentet ble gjennomført som beskrevet i Maniatis (ref.), med det unntak at BSA ble utelatt fra 10X nick-translationsbufferen, for å innlemme amin linker-arm modifisert base-amino (12) dUTP (Calbiochem, California).

Sekvensen av oppnådd oligomer er derfor:

Rensing av det primer-utvidede kompleks ble oppnådd ved anvendelse av en NENSORB-20 kolonne (DuPont) og ifølge av prosedyren som er gitt av leverandøren. (Primerutvidelses-reaksjonen ble fortynnet ved tilsetning av 900 ul NENSORB-reagens A før påføring på kolonnen. De rensede oligomerer ble fortynnet med 50 % metanol som deretter ble fjernet i en "speed-vac".

B. Merking av amin linker-arm probe med akridiniumester og påfølgende rensing.

En 25 mM stamløsning av akridiniumester ble fremstilt i destillert DMSO. Ønsket mengde probe (se en fortegnelse over de forskjellige prober merket i del A over) ble avdampet til tørrhet i et konisk polypropylenrør på 1,5 ml. Følgende væskeblanding ble dannet ved tilsetning av følgende bestand-deler og i angitt rekkefølge:

3 ul H20

1 ul 1 M HEPES (pH 8,0)

4 ul DMSO (destillert)

2 pl 25 mM akridiniumester i DMSO (destillert)

Blandingen ble vortex-blandet, sentrifugert i en mikrosentrifuge i 2 sekunder (for å bringe innholdende til bunnen av røret) og inkubert ved 37°C i 20 minutter. Følgende komponenter ble deretter tilsatt til reaksjons-væskeblandingen i angitt rekkefølge: 3,0 |il 25 mM akridiniumester i DMSO (destillert)1,5ul H20

0,5 Ul 1 M HEPES (pH 8,0)

Væskeblandingen ble vortex-blandet på nytt, sentrifugert og inkubert ytterligere 20 minutter ved 37°C. Ureagert markør ble undertrykt ved anvendelse av et 5-ganger overskudd av lysin ved tilsetning av 5 ul 0,125 M lysin i 0,1 M HEPES (pH 8,0), 50 % DMSO, og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur.

Den akridiniumester-merkede oligomer ble deretter renset ved anvendelse av følgende metode. Til 20 ul av den undertrykte reaksjonsblanding ble 30 ul NaOAc (pH 5,0), 245 ul H2° 0<3 5 ul glykogen tilsatt som en bærer (glykogen var forbehandlet for å fjerne enhver nukleaseaktivitet). Prøven ble deretter vortex-blandet forsiktig og 640 ul absolutt EtOH ble tilsatt. Prøven ble vortex-blandet forsiktig og inkubert på is i 5-10 minutter, deretter sentrifugert 5 minutter ved 15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Supernatanten ble forsiktig fjernet og pelleten ble oppløst pånytt i 20 ul 0,1 M NaOAc (pH 5,0), 0,1 % SDS. Prøvene ble deretter renset ved høytrykk-væske-kromatografi (HPLC) som beskrevet under.

(i)

De AE-merkede prober inneholdende 5' og interne amin linker-armer ble renset som følger: 20 ul gjenoppløst pellet ble injisert på en Nukleogen-DEAE 60-7 ionebytte-HPLC-kolonne montert i et IBM® 9533 HPLC-system. Alle bufferne ble fremstilt med HPLC kvalitetsbestemt vann, acetonitril (CH3CN) og natriumacetat (NaOAc) fra Fisher Scientific, og iseddik (HoAc) og LiCl med reagensrenhet. Alle buffere ble filtrert gjennom nylon-66-filtere med porestørrelse 0,45 um f®r anvendelse. Prøven ble eluert som beskrevet i fig. 1 på tegningen (i dette tilfellet var proben 5'-amin linker-armen inneholdende 26mer beskrevet i del A over). Umiddelbart etter gjennomkjøring, ble 5 ul 10 % SDS tilsatt til hvert rør etterfulgt av vortex-blandinger av hvert rør (dette ble gjort for å sikre at den akridiniumester-merkede probe ikke klebet til rørveggen). En 0,5 ul prøve ble fjernet fra fraksjonene 21 - 42 og tilsatt til 200 yl vann i et 12 x 75 mm rør (en separat pipettespiss ble anvendt for hver prøve for å unngå overføringsproblemet). Kjemiluminscensen for hver prøve ble deretter bestemt i en Berthold Clinilumat ved anvendelse av følgende automatiske injeksjon og avlesningssekvens: injeksjon av 200 pl 0,25 N HN03, 0,1 % H202, et opphold på 1 sekund, injeksjon av 200 pl 1 N NaOH; den kjemiluminscerende mengde ble avlest i 10 sekunder.

Fraksjonene 29 - 33 ble deretter presipitert med EtOH som følger: til hver fraksjon tilsettes 5 pl glykogen, man vortex-blander, tilsetter 1 ml EtOH, vortex-blander, inkuberer 5-10 minutter på is og sentrifugerer 5 minutter ved 15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Hver supernatant ble forsiktig fjernet, pelleten ble gjenoppløst i 20 pl 0,1 M NaOAc, pH 5, 0,1 % SDS og fraksjonene ble samlet.

På denne måte ble svært rene akridiniumester-merkede prober oppnådd. Den spesifikke aktivitet for slike prober var typisk 5-10 • 10^ kjemiluminescerende lysimpulstall (Berthold Clinilumat) pr picomol oligomer.

(ii)

Den AE-merkede probe som inneholder den amin linker-arm-modifiserte base (amino-12-U) ble generelt renset som beskrevet over, med følgende unntak: en Vydac C4 revers-fase-kolonne ble anvendt; buffer A var 0,1 M trietylammoniumacetat (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) og buffer B var CH3CN; den merkede probe ble eluert som et hybrid ved anvendelse av en lineær gradient for 10 - 15 % løsningsmiddel B i 25 minutter ved en strømningshastighet på 1 ml/min. Den største kjemiluminescerende topp ble deretter identifisert og

fremkalt som beskrevet over.

Diskusjonen i det foregående beskriver generelt hvordan man fremstiller og merker prober med akridiniumester. I det spesifikke eksempel heri, ble prober merket på enden og inne 1 probene, såvel som merket i en nukleotidbase.

EKSEMPEL 2

Stabilitet ved pH 6 av hybridisert probe sammenlignet med ikke-hybridisert probe som var indre merket ved akridiniumester

En indre merket 33mer probe som var spesifikk for Chlamydia trachomatis ble fremstilt som beskrevet over (adenin-erstatning, type 1 linker-arm). Proben ble hybridisert med dens target rRNA (i dette tilfelle Chlamydia trachomatis) i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hvbridiseringsblandina

2 ul AE-probe (0,5 pmol)

0,3 pl 4 % (vekt:vol) SDS

5,8 ul 1 M PB, pH 5

4,4 pl C. trachomatis rRNA (2 pg), eller 4,4 pl H2O for kontroll

Hybridiserings- og kontrollblandingene ble inkubert i 40 minutter ved 60°C, hvorpå hver blanding ble analysert for prosent hybridisering ved anvendelse av hydroksyapatitt (HAP) som følger. En 0,1 pl prøve av hybridet eller kontrollblandingen ble tilsatt til 200 pl 0,14 M PB, pH 6,8, inneholdende 2 % HAP. Hver oppnådde blanding ble vortex-blandet i fem sekunder, inkubert i fem minutter ved 60°C, vortex-blandet i

20 sekunder, og deretter sentrifugert i 30 sekunder i en mikrosentrifuge ved 15.000 rpm. Supernatanten ble fjernet og bevart, 200 pl 0,14 M PB, pH 6,8, ble tilsatt til HAP-pelleten, blandingen ble vortex-blandet i ti sekunder og deretter sentrifugert i 30 sekunder i en mikrosentrifuge ved 15.000 rpm. Supernatanten ble fjernet og bevart og pelleten ble resuspendert i 200 pl 0,14 M PB, pH 6,8. En 50 pl prøve av det resuspenderte HAP og hver av de to supernatantene ble analysert for kjemiluminescens som beskrevet over, og prosent hybridisert probe, dvs prosent kjemiluminescerende signaler assosiert med HAP, ble beregnet.

Stabiliteten av den hybridiserte probe sammenlignet med den ikke-hybridiserte probe (dvs kontroll) ble testet ved pH 6 i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Stabilitetstestblanding

12,3 pl hybrid eller kontroll fra over

50 pl 1 M PB, pH 6

2,5 pl 4 % SDS

65 pl H20

Disse blandingene ble vortex-blandet forsiktig, og 5 pl prøve ble fjernet umiddelbart (tø) og analysert for kjemiluminescens som beskrevet under. Resten av blandingen ble inkubert ved 60°C, og 5 pl prøve ble fjernet ved forskjellige tidspunkter (se under) og analysert umiddelbart for kjemiluminescens .

Kjemiluminescensen for hver prøve ble målt ved å tilsette en prøvemengde til 200 pl H2O i et 12 • 25 mm rør og kjemiluminescens måles i en clinilumat (automatisk injeksjon av 200 pl 0,25 HNO3, 0,1 % H202og etter et sekund opphold, autoinjeksjon av 20 0 pl 2 M kalium PB, pH 13,2, hvorpå kjemiluminescens ble avlest i ti sekunder).

RESULTATER

1. Prosent hybridisering (HAP-analyse)

Hybrid - 96 %

Kontroll - 1,3 % (ikke-spesifikk binding)

2. Forløpet for stabilitetstid

Se fig. 2 i tegningen.

Disse resultater viser at den hybridiserte probe er godt beskyttet mot nedbrytning og påfølgende tap av kjemiluminescens (halveringstiden for kjemiluminescens-tap er lik 3.370 minutter), mens uhybridisert prøve er svært mottagelig for nedbrytning og tap av kjemiluminescens (halveringstid lik 29,2 minutter; diskriminering mellom hybridisert og uhybridisert probe er derfor lik 115 - ganger). Disse data viser evnen som den homogene bestemmelse beskrevet heri har til å lokalisere target-DNA-sekvenser ved å bibringe differensiell stabilitet mellom hybridisert og uhybridisert probe og måle den samme.

EKSEMPEL 3

Stabilitet ved pH 9.for hybridisert probe sammenlignet med uhybridisert probe merket internt med akridiniumester. Internt merket probe (alle tre internt merkede 3 3mer prober som er beskrevet i eksempel 1 ble testet) ble hybridisert med dens target rRNA (i dette tilfelle Chlamydia trachomatis) og analysert for prosent hybridisering som beskrevet i eksempel 2.

Stabiliteten av hybridisert probe sammenlignet med uhybridisert probe (dvs kontroll) ble testet ved pH 9 i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Stabilitets- testblanding

5 yl hybrid eller kontroll fra over

4 5 yl 0,2 M natriumborat, pH 9

Blandingene ble deretter inkubert, og prøver ble tatt ut og analysert for kjemiluminescens som beskrevet i eksempel 2.

RESULTATER

1. Prosent hybridisering (HAP-analyse)

a. Adenin-erstatning, type 1 linker-arm

Hybrid - 95 %

Kontroll - 0,5 % (ikke-spesifikk binding)

b. Innskyting, type 1 linker-arm

Hybrid - 98 %

Kontroll -0,3%

c. Innskyting, type 2 linker-arm

Hybrid - 98 %

Kontroll -0,2%

2. Forløp for stabilitetstid

Se fig. 3 - 5 i tegningen. Fig. 3 er en kurve for adeniner-statning, type 1 linker-arm; fig. 4 er en kurve for innskyting, type 1 linker-arm; fig. 5 er en kurve for innskyting, type 2 linker-arm.

Som i eksempel 2, er hybridisert probe beskyttet fra nedbrytning mens uhybridisert probe ikke er beskyttet. Dette er tilfellet for alle tre typer internt merkede prober. I dette eksempel, har man vist at natriumborat ved forhøyet pH akselererer prosessen (sammenlignet med eksempel 2) mens de differensielle nedbrytningsegenskaper fremdeles opprettholdes mellom hybridisert og uhybridiserte prober.

EKSEMPEL 4

Stabilitet ved pH 6 for probe som er endemerket med akridiniumester som hybrid med nærliggende probe sammenlignet med ikke-hybrid.

Dette eksempel involverer anvendelse av en probe med sekvens 5'-CCG GAC CGC TGG CAA CAA AGG ATA AGG GTT GC-3' (fremstilt ved anvendelse av standard forforamiditt-kjemi) som hybridiserer til E. coli rRNA umiddelbart nær 5<1->enden av den AE-merkede probe anvendt i dette eksempel (se under), noe som dermed fører til "capping off" av alle aminene i target rRNA i nærheten av akridiniumester-markøren.

Probe som er endemerket med akridiniumester (fremstilling beskrevet i eksempel 1) (heretter omtalt som AE-probe) og den nærliggende probe beskrevet over ble hybridisert i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hybridiserings- og kontrollblandingene ble inkubert i 40 minutter ved 60°C, og deretter analysert for prosent hybridisering ved anvendelse av hydroksyapatitt som beskrevet i eksempel 2.

Stabiliteten av den hybridiserte probe med nærliggende probe sammenlignet med uhybridisert probe (dvs kontroll) ble testet ved pH 6 nøyaktig som beskrevet i eksempel 2.

RESULTATER:

1. Prosent hybridisering (HAP-analyse)

Hybrid - 93,5 %

Kontroll - 2,7 % (ikke-spesifikk binding)

2. Forløp for stabilitetstid

Se fig. 6 i tegningen.

Som i eksempel 2, var hybridisert AE-probe, i dette tilfelle med en nærliggende probe som også er hybridisert, beskyttet fra nedbrytning mens uhybridisert probe ikke var beskyttet. Beskyttelsen var like god som i eksempel 2, fordi den er avhengig av to hybridiseringer istedet for en.

EKSEMPEL 5

Stabilitet ved pH 9 av probe som var endemerket med akridiniumester som hybrid med "nærliggende" probe sammenlignet med ikke-hybrid.

Hybridisering ble gjennomført nøyaktig som beskrevet i eksempel 4. Stabilitet av hybridisert probe med nærliggende probe sammenlignet med uhybridisert probe (dvs kontroll) ble testet ved pH 9'nøyaktig som beskrevet i eksempel 2, med unntak av sammensetningen av stabilitetstestblandingen, som var som følger:

5 ul hybrid eller kontroll

50 ul 0,2 M natriumborat, pH 9,0

Hybridisert AE-probe med en nærliggende probe (også hybridisert) var igjen beskyttet fra nedbrytning mens uhybridisert probe ikke var beskyttet fra nedbrytning. Som i eksempel 3, akselererte natriumborat ved forhøyet pH prosessen mens man fremdeles opprettholdt de differensielle nedbrytningsegenskaper mellom hybridisert og uhybridisert probe. For en grafisk fremstilling av disse resultater, se fig. 7.

EKSEMPEL 6

Stabilitet ved pH 6 av probe som var endemerket med akridiniumester som hybrid sammenlignet med ikke-hybrid.

Proben ble hybridisert til dens target rRNA (i dette tilfellet E. coli) i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hybridiserings- og kontrollblandingene ble inkubert i 40 minutter ved 60°C, og deretter analysert for prosent hybridisering ved anvendelse av hydroksyapatitt som beskrevet i eksempel 2.

Stabiliteten av den hybridiserte probe sammenlignet med uhybridisert probe (dvs kontroll) ble testet ved pH 6, nøyaktig som beskrevet i eksempel 2.

RESULTATER:

1. Prosent hybridisering

Hybrid - 94 %

Kontroll - 2,7 % (ikke-spesifikk binding)

2. Forløp av stabilitetstid

Se fig. 8 av tegningene.

Uhybridisert probe ble igjen fortrinnsvis nedbrutt sammenlignet med hybridisert probe, skjønt forskjellen i nedbrytning ikke er så stor som i de tidligere eksempler. Grunnen til dette er at bare en del av aminene ble "capped off" i nærheten av akridiniumester-markøren. Dette viser ytterligere evnen til å diskriminerer mellom hybridisert ende-merket probe i nærvær og fravær av hybridisert nærliggende probe.

EKSEMPEL 7

Stabilitet ved pH 7,6 av hybridisert probe sammenlignet med uhybridisert probe merket på en nukleotidbase med akridiniumester

Proben merket på en nukleotidbase (amino-12-U) med akridiniumester beskrevet i eksempel 1, ble hybridisert med sin target rRNA (i dette tilfelle C. trachomatis) i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hvbridiserinqsblandinq

0,1 M litiumsuccinat, pH 5,4

10 % litiumlaurylsulfat

2 ug 1,3 pmol AE-probe

Totalt volum - 30 pl

Hybridisering- og kontrollblandingen ble inkubert i fem minutter ved 80°C, og deretter 60 minutter ved 60°C. De oppnådde løsninger ble hver fortynnet til 300 ul med 0,1 M litiumsuccinat, pH 5,4, 10 % litiumlaurylsulfat og analysert for prosent hybridisering ved anvendelse av hydroksyapatitt som beskrevet i eksempel 2.

Stabiliteten av hybridisert probe sammenlignet med uhybridisert probe (dvs kontroll) ble testet ved pH 7,6 med en rekke identisk fremstilte prøver i overenstemmelse med følgende prosedyre:

Stabilitetstestblanding

15 pl hybrid eller kontroll fra over

100 pl 0,2 % natriumtetraborat, pH 7,6, 5 % Triton X-100

Disse blandinger ble deretter inkubert ved 60°C, og prøver ble fjernet ved forskjellige tidspunkter og kjemiluminescens ble bestemt ved anvendelse av en gen-probe Leader™ I Luminometer ved anvendelse av autmatisk injeksjon av 200 ] il 0,1 M H2O2, deretter opphold i et sekund, med påfølgende automatiske injeksjon av 200 ul 1 N NaOH, og kjemiluminescens ble avlest i fem sekunder. Fra disse data ble hydrolysegraden bestemt ved hjelp av regresjonsanalyser.

RESULTATER

1. Prosent hybridisering (HAP-analyse)

Hybrid - 53,8 %

Kontroll - 0,5%

2. Stabilitet

Halveringstid av ester- Forhold mellom hydrolyse (min) halveringstid

Som i de foregående eksempler, viser disse data at hybridisert probe er beskyttet mot nedbrytning mens uhybridisert probe ikke er beskyttet, i dette tilfellet med markøren bundet til en base i proben. Dette viser det prinsipp at-multiple seter for AE-binding er akseptable for anvendelse i den homogene beskyttelsesbestemmelse som er beskrevet heri.

EKSEMPEL 8

Stabilitet ved pH 7,6 av hybridisert probe sammenlignet med uhybridisert probe internt merket med akridiniumester i en rekke sekvens-dimer-seter ved anvendelse av både rRNA og DNA targeter.

Prober inneholdende den interne linker-arm, type "X", innskutt på en rekke sekvens-dimer-seter (se under) ble syntetisert, merket med AE, og renset som beskrevet i eksempel 1. Sekvensen og linker-arm plasseringer av disse prober er som følger:

Disse prober ble hybridisert som beskrevet i eksempel 7 med det unntak at inkubasjonstrinnet ved 80°C var utelatt, og de anvendte mengder og typer target-nukleinsyrer var som følger:

Stabiliteten av hybridisert probe sammenlignet med uhybridisert probe ble testet ved pH 7,6 som beskrevet i eksempel 7.

RESULTATER

Stabilitet

Forhold mellom halveringstider

Disse data viser at linker-armen (og derfor AE) kan innskytes på en rekke sekvens-dimer-seter og fremdeles være vesentlig beskyttet mot esterhydrolyse i den hybridiserte form. Videre viser dette eksempel at DNA-targeter tilveiebringer god beskyttelse av hybridiserte AE-prober når de anvendes med disse homogene bestemmelsestyper. Dette eksempel viser også at den lange (9 atomer) linker-arm anvendt heri gir forskjellige hydrolyseforhold som i alt vesentlig er ekvivalente med de andre linker-armene som er angitt tidligere i foreliggende patentansøkning, og etablerer at en rekke lengder av linker-armer kan anvendes i HPA-formatet beskrevet heri.

EKSEMPEL 9

Stabilitet ved pH 7,6 av internt merket AE-probe hybridisert med perfekt matchet target sammenlignet med target med en enkel mistilpasning.

En 24mer probe komplementær til 16S subenheten av rRNA fra

E. coli, med en intern amin linker-arm, type "X", innskutt mellom restene 6 og 7, ble syntetisert. Proben ble deretter merket med akridiniumester og renset som beskrevet i eksempel 1. Sekvensen er som følger (# = linker-arm stilling):

5<*->CAA GCT# TGC CAG TAT CAG ATG CAG-3'

Denne probe har en enkel T-G mistilpasning i stilling 6 (nummerert fra 5'-enden av probekjeden) med 16S subenheten av C. diversius.

Proben ble hybridisert med dens target rRNA (i dette tilfellet enten E. coli eller C.diversius) i overensstemmelse med pro-sedyren som er beskrevet i eksempel 8. Stabiliteten av de oppnådde hybridiserte prober, såvel som en prøve av uhybridisert probe ble testet ved pH = 7,6 som beskrevet i eksempel 7.

Stabilitet

Forhold mellom halveringstider

<*>Den lave halveringstid av esterhydrolyse skyldes ikke en liten grad av hybridisering, da HAP-analyse (som beskrevet i eksempel 2) viste 73 % hybridisering.

Disse data viser at i tilfellet med hybrid med perfekt matchet target, er AE-proben beskyttet fra esterhydrolyse

(som beskrevet i de tidligere eksempler), mens i hybridet hvori targeten inneholdende en enkelt base-mistilpasning, er AE-proben dårlig beskyttet. Dette fremkaller en 17-ganger

forskjell i hydrolysegrad for AE-proben mellom den perfekte target og en target med en enkelt sete-mistilpasning. Derfor er metoden som er beskrevet heri lett i stand til å skjelne mellom nukleinsyre-targeter inneholdende enkle basefor-skj eller.

EKSEMPEL 10

Stabilitet ved romtemperatur under forskjellige betingelser for hybridisert probe sammenlignet med uhybridisert probe internt merket med akridiniumester.

Intern merket probe (innskyting, type 1; se eksempel 1) ble hybridisert med 1 ug C. trachomatis rRNA som beskrevet i eksempel 8. Stabiliteten av den hybridiserte probe sammenlignet med den uhybridiserte probe ble målt ved romtemperatur under en rekke forskjellige reagens- og pH-betingelser (se "resultater") i overensstemmelse med prosedyren som er beskrevet i eksempel 7.

RESULTATER:

Disse data viser at det finnes en rekke forhold hvorunder den homogene beskyttelsesbestemmelse som er beskrevet heri vil fungere, noe som gjør at den kan tilpasses en rekke bestem-melsesforhold. Videre er andre systemer enn borat akksepter-bare, f. eks fytinsyresystemer ved romtemperatur hvor svært høye halveringstidforhold oppnås.

EKSEMPEL 11

Påvisning av en fortynningsserie av Chlamydia rRNA i buffer ved anvendelse av probe internt merket med akridiniumester. Internt merket probe (som i eks. 2) ble hybridisert til avtagende mengder av dens target rRNA (i dette tilfelle Chlamydia trachomatis) i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hvbridiseringsblandinq

0,5 pl probe (12,5 fmol)

1 pl RNA (IO-<2>,10~<3>, IO-<4>eller IO"<5>ug)

2 pl 20 % SDS

1.7 pl H20

4.8 pl 1 M PB, pH 6,8

Kontrollblandingen var den samme som hybridiseringsblandingen med det unntak at de inneholdt vann istedet for rRNA, og reagens-blindprøveblandingen var den samme som kontrollblandingen med unntak av at den inneholdt vann istedet for probe. Blandingene ble inkubert i 20 minutter ved 60°C.

Etter hybridisering, ble 90 pl 0,2 M borat, pH 9 tilsatt til hver prøve, etterfulgt av inkubasjon ved 60°C i 14 minutter. Hver prøve ble deretter avlest med hensyn på kjemiluminescens som beskrevet i eksempel 2, med unntak av at injeksjon 1 kun var 0,1 % H2O2, injeksjon 2 hadde pH 13,8 istedet for 13,2 og avlesningstiden var 7 sekunder istedet for 10 sekunder.

RESULTATER:

Reagens-blindprøve - 116 rlu

Kontroll - 124 rlu

Reagens-blindprøve og kontroll representerte gjennomsnittet av tre prøver; alle andre representerte gjennomsnittet av to prøver.

Disse resultater viser at oppfinnelsen som er beskrevet heri var istand til å påvise en lineær fortynningsserie av target rRNA til en sensitivitetsgrense på omtrent IO<-4>ug i et rent buffersystem.

EKSEMPEL 12

Påvisning av en fortynningsserie av Chlamydia rRNA i klinisk medium ved anvendelse av probe internt merket med akridiniumester.

Internt merket probe (som i eksempel 2) ble hybridisert i en klinisk prøve (halssekret) til avtagende mengder av dens target rRNA (i dette tilfelle Chlamydia trachomatis) i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hvbridiserinasblanding

50 ul halssekret

6 ul 4,8 PB, pH 4,7

2 pl rRNA (3 x 10~<4>, 3 x 10~<3>, 3 x 10~<2>eller 3 x 10"<1>ug)

2 ul probe (1 pmol)

Kontrollblandingen var den samme som hybridiseringsblandingen med det unntak av at den inneholdt vann istedet for rRNA, og reagens-blindprøveblandingen var den samme som kontrollblandingen med unntak av at den inneholdt vann istedet for probe. Blandingen ble inkubert i 60 minutter ved 60°C.

Etter hybridisering, ble en tredjedel av hver blanding (20 UD tilsatt til 50 ul 0,2 M borat, endelig pH = 9 (etter tilsetning av hybridiseringsblandingene), etterfulgt av inkubering ved 60°C i 40 minutter. Hver prøve ble deretter avlest for•kjemiluminescens som beskrevet i eksempel 11.

RESULTATER:

Reagens-blindprøve - 163 rlu

Kontroll - 6560 rlu

Dataene representerer gjennomsnittet av to verdier.

Disse data viser at oppfinnelsen som beskrevet heri er istand til å påvise en lineær fortynningsserie av target rRNA til en sensitivitetsgrense på omtrent IO<-3>ug i et system inneholdende et klinisk medium.

EKSEMPEL 13

Påvisning av en fortynningsserie av bakteriell rRNA i urin ved anvendelse av probe som er internt merket med akridiniumester

En internt merket 30mer probe spesifikk for E. coli ble fremstilt som beskrevet tidligere (adenin-erstatning, type 1, linker-arm). Proben ble hybridisert i urin til avtagende mengder av dens target rRNA (i dette tilfelle E. coli) i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hvbridiserinasblanding

79,6 yl urin

0,4 yl 0,25 M EDTA, 0,25 M EGTA

10 yl 4,8 M PB, pH 6,8

5 yl 20 % SDS

5 yl probe (0,125 pmol)

1 yl RNA (10~<3>, IO-<2>eller 10_<1>yg)

Kontrollblandingen var den samme som hybridiseringsblandingen med unntak av at den inneholdt vann istedet for rRNA, og reagens-blindprøveblandingen var den samme som kontrollblandingen med unntak av at den inneholdt vann istedet for probe. Blandingene ble inkubert 30 minutter ved 60°C.

Etter hybridisering, ble 300 ul 0,2 M borat, pH 9, tilsatt til hver prøve, hvorpå prøvene ble inkubert ved 60°C i 16 minutter. Hver prøve ble deretter avlest med hensyn på kjemiluminescens som beskrevet i eksempel 11.

RESULTATER:

Reagens-blindprøve - 684 5 rlu

Kontroll - 9250 rlu

Resultatene representerer gjennomsnittet av to verdier.

Disse data viser at oppfinnelsen som er beskrevet heri er istand til å påvise en lineær fortynningsserie av target rRNA til en sensitivitetsgrense på omtrent 5 x IO<-3>ug rRNA i et system inneholdende urin.

EKSEMPEL 14

Selektiv nedbrytning anvendt i kombinasjon med et seperasjonstrinn for påvisning av en fortynningsserie av Chlamydia rRNA i klinisk medium ved anvendelse av probe som er internt merket med akridiniumester

Internt merket probe (som i eksempel 2) ble hybridisert i en klinisk prøve (halssekret) som beskrevet i eksempel 8, omfattende kontroll og blindprøveblandinger. Etter hybridisering, ble en tredjedel av hver blanding fjernet og underkastet selektiv nedbrytning nøyaktig som beskrevet i eksempel 8, mens en tredjedel simpelthen ble fjernet og fikk stå ved romtemperatur (dvs ingen selektiv nedbrytning). Begge prøvesett, med og uten selektiv nedbrytning, ble deretter underkastet separasjon av hybridisert probe fra uhybridisert probe ved anvendelse av HAP som beskrevet i eksempel 2 med følgende unntak: a. 1 ml HAP-løsning ble anvendt (istedet for 200 ul) b. 1 ml vaskeløsning ble anvendt (istedet for 200 ul), c. 3 vaskinger ble gjennomført (istedet for 1) d. de endelige HAP-pelleter ble resuspendert i 100 ul vaskeløsning, som hele ble målt for kjemiluminescens (som beskrevet i eksempel 2).

RESULTATER:

Selektiv nedbrytning

Resultatene representerer gjennomsnittet av to verdier med reagens-blindprøve allerede fratrukket. S:B = forholdet mellom signal og bakgrunn, dvs kjemiluminescens ved en spesiell rRNA-konsentrasjon dividert med kjemiluminescens av kontroll.

Disse data viser at selektiv nedbrytning før separasjon resulterer i mindre bakgrunn noe som fører til høyere forhold mellom signal og bakgrunn, og derfor forbedret sensitivitet.

EKSEMPEL 15

Forbedret stringens ved anvendelse av differensiell hydrolyse Følgende probe ble oppbygd til å inneholde en intern linker-arm, type "X" (stilling for innskyting indikert ved # under), merket med akridiniumester, og renset som beskrevet i eksempel 1:

Denne probe er eksakt komplementær til 16S subenheten av Neisseria gonorrhoeae. Den er imidlertid også nær beslektet med N. meningitidis, og en kryssreaksjon observeres typisk under hybridiseringsstringensbetingelser som er gitt i eksemplene 2 og 8. Denne probe ble hybridisert med 0,5 ug N. meningitidis som beskrevet i eksempel 8, (unntatt i et 200 ul format) og inkubert i 10 minutter ved 60°C i 1 ml 0,2 M natriumtetraborat, pH 7,6, 5 % Triton X-100 for effektuering av differensiell hydrolyse (+ D.H.), eller den ble ikke underkastet disse differensielle hydrolysebetingelser (-D.H.). De oppnådde hybrider ble deretter separert på magnetiske mikrokuler og målt for kjemiluminescens som beskrevet under. 1 ml 0,4 M PB, pH 6,0, inneholdende 150 ug magnetiske aminmikrokuler tilsettes (BioMag M4100, Advanced Magnetics, Inc, Cambridge, Mass.). Vortex-bland i 10 sekunder. Inkuberes ved 60°C i fem minutter. Vortex-bland i 10 sekunder. Separer kulene magnetisk fra løsningen ved anvendelse av Pace-Mate™ magnetisk separasjonsstativ (gen-probe, Inc, San Diego, CA). Fjern væsken. Vask kulene ved tilsetning av 1 ml 0,3 M PB, pH 6,0, votex-blanding 10 sekunder, separer magnetisk og fjern væsken. Gjenta til totalt tre vaskinger. Eluer hybridet ved tilsetning av 300 ul 0,2 M PB, pH 6,0, 50 % formamid, vortex-bland i i 10 sekunder, inkuberer 60°C i fem minutter, vortex-bland i 10 sekunder og separer magnetisk kuler fra løsningen. Overfør løsningen til et Clinilumatrør og mål kjemiluminescens som beskrevet i eksempel 7.

RESULTATER:

<*>Hybridsignal - kontrollsignal (dvs intet rRNA), gitt i relative lysenheter (rlu). Signal fra den eksakte target (dvs N. gonorrhoeae) i dette format er typisk 7-10 X 10 rlu.

Som en konklusjon, ser man at anvendelse av den differensielle hydrolyseteknikk som er beskrevet heri som et ytterligere stringensdiskrimineringstrinn i stor grad reduserer signal fra uønskede, kryssreagerende sekvenser. I dette eksempel ble kryssreaksjon av en N. gonorrhoeae-probe med N. meningitidis nedsatt mer enn 200 ganger. Det differensielle hydrolysetrinn øker sensitivitet til ustabile hybrider, som er i likevekt med uhybridisert probe, ved å konstant redusere kjemiluminescensen (via hydrolyse) av proben når den er i den uhybridiserte form, og nedsetter således kjemiluminescens som skyldes kryssreaksjon.

EKSEMPEL 16

Påvisning av en chimerisk targetsekvens assosiert med kronisk myelogen leukemi med anvendelse av en probe internt merket med akridiniumester

En 24mer probe (sekvens gitt under) med en indre linker-arm, type "X", innskutt som indikert ble syntetisert, merket med AE og renset som beskrevet i eksempel 1. Denne probe er komplementær til det chimeriske mRNA transkript (vanlig kutt) asso-siert med kronisk milogen leukemi (CML) og kalles bcr/- abl-proben. Denne chimeriske mRNA er et produkt av det chimeriske gen dannet ved translokering av et område av abl-genet inn i et område av et annet kromosom inneholdende bcr-genet.

Syntetisk DNA 60mer targeter som representerer kuttpunkt-forbindelsesområdet for den bcr/abl chimerisk target, såvel som de normale ber- og abl-targeter i det samme område, ble syntetisert som beskrevet i eksempel 1 (sekvensene gitt under). En mRNA-target ble også fremstilt ved transkripsjon av et pGEM-klon inneholdende et 450 nukleotidsegment av det chimeriske bcr/abl-gen sentrert rundt kuttpunktet. Et mRNA-transkript av det samme 450 nukleotidsegment i probesammen-heng ble også fremstilt som, en negativ kontroll.

BCR/ABL PROBE SEQUENCE

Stjernen innskutt over betegner et linker-arminnskytingssete for akridiniumesterbinding og understrekingen indikerer abl-sekvenser.

bcr/abl-proben ble hybridisert med omtrent 1 pmol av hver av targetene som er gitt over som beskrevet i eksempel 8, og stabiliteten av disse hybrider og den uhybridiserte probe ble testet ved pH 7,6 som beskrevet i eksempel 7.

RESULTATER:

Disse data viser at en AE-merket probe designert til å spenne over kuttpunkt-forbindelsesområdet for det chimeriske bcr/abl-mRNA transkript assosiert med CML var istand til å diskriminerer mellom chimerisk target og normale sekvenser (såvel som uhybridisert probe) ved anvendelse av HPA-teknologien som er beskrevet heri. Dette er en demonstrasjon som viser at fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for spesifikt å påvise chimeriske targeter (typisk assosiert med genetiske forstyrrelser) i nærvær av normale, ikke-chimeriske komponentnukleinsyrer.

Dette eksempel viser ytterligere at targeter forskjellig fra rRNA, i dette tilfelle både mRNA og DNA, gir beskyttelse mot AE-hydrolyse når de er hybridisert til en AE-merket probe.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen eller mengden av en analytt i et medium som kombinerer med en bindingspartner til å danne et bindingspar,karakterisert vedtrinnene: a) man kombinerer, med nevnte medium eller en del av dette, (1) en rest omfattende bindingspartneren, analytten eller en analog av analytten som danner et bindingspar med bindingspartneren, idet nevnte rest er konjugert til en substans hvis stabilitet er forskjellig når resten er et medlem av et biningspar sammenlignet med dens stabilitet i en ubundet form; og (2) dersom nevnte rest er nevnte analytt eller analogen, kombinering av nevnte bindingspartner i mediumet; b) selektiv degradering av den mindre stabile form av substansen; og c) relatering av mengden intakt substans som blir igjen etter nevnte substansnedbrytning til tilstedeværelsen eller mengden analytt i mediumet.

2. Fremgangsmåte for å bestemme, i et medium, tilstedeværelsen eller mengden av en analytt som kombinerer med en bindingspartner for å danne et bindingspar,karakterisert vedtrinnene: a) man kombinerer, med nevnte medium eller en del av dette, nevnte bindingspartner som er konjugert til en substans hvis stabilitet er forskjellig når nevnte bindingspartner er et medlem av et bindingspar, sammenlignet med dens stabilitet i en ubundet form; b) selektiv nedbrytning av den mindre stabile form av substansen; og c) relatering av mengden av intakt substans som blir igjen etter nevnte substansnedbrytning til tilstedeværelsen eller mengden analytt i mediumet.

3. Fremgangsmåte for-å bestemme, i et medium, tilstedeværelsen eller mengden av en analytt som kombinerer med en bindingspartner til å danne et bindingspar,karakterisert vedtrinnene: a) man kombinerer, med nevnte medium eller en del av dette, (1) en rest omfattende analytten eller en analog av analytten som danner et bindingspar med bindingspartneren, idet nevnte rest er konjugert til en substans hvis stabilitet er forskjellig når resten er et medlem av et bindingpar sammenlignet med dens stabilitet i en ubundet form; og (2) nevnte bindingspartner; b) selektiv degradering av den mindre stabile form av substansen; og c) relatering av mengden av intakt substans som blir igjen etter nevnte substansnedbrytning til tilstedeværelsen eller mengden av analytt i mediumet.

4. Fremgangsmåte for å bestemme, i et medium, tilstedeværelsen eller mengden av en analytt som kombinerer med en bindingspartner til å dannet et bindingspar,karakterisert vedtrinnene: a) man kombinerer, med nevnte medium eller en del av dette, (1) en første bindingspartner til nevnte analytt, idet nevnte første bindingspartner er konjugert til en substans hvis stabilitet er forskjellig når nevnte første bindingspartner er et medlem av et bindingspar sammenlignet med dens stabilitet i en ubundet form; og (2) en annen bindingspartner til nevnte analytt som er forskjellig fra nevnte første bindingspartner; b) selektiv nedbryting av den midre stabile form av substansen; og c) relatering av mengden av intakt substans som blir igjen etter nevnte substansnedbrytning til tilstedeværelsen eller mengden av analytt i mediumet.

5. Fremgangsmåte for å påvise en nukleotidsekvens i et medium, karakterisert vedtrinnene: a) man kombinerer, med nevnte medium eller en del av dette, nevnte nukleotidsekvens og en probe som ialt vesentlig er komplementær dertil, idet nevnte probe er konjugert til en substans hvis stabilitet er forskjellig når nevnte probe er hybridisert til nevnte nukleotidsekvens sammenlignet med dens stabilitet i en uhybridisert form; b) selektiv degradering av den mindre stabile form av substansen; og c) relatering av mengden av intakt substans som blir igjen etter nevnte substansnedbrytning til tilstedeværelsen eller mengden av nukleotidsekvens i et medium.

6. Fremgangsmåte som for å bestemme, i et medium, tilstedeværelsen eller mengden av en analytt som kombinerer med en bindingspartner til å danne et bindingspar,karakterisert vedtrinnene: a) man kombinerer, med nevnte medium eller en del av dette, (1) en rest omfattende en første bindingspartner til nevnte analytt, eller en analog av nevnte første bindingspartner som danner et bindingspar som deltar i en bindingsreaksjon, idet nevnte rest er konjugert til en substans hvis stabilitet er forskjellig når resten er et medlem av et bindingspar sammenlignet med dens stabilitet i en ubundet form; og (2) en annen bindingspartner til nevnte analytt som er forskjellig fra nevnte første bindingspartner i nevnte bindingsreaksjon; b) selektiv degradering av den mindre stabile form av substansen; og c) relatering av mengden av intakt substans som blir igjen etter nevnte substansnedbrytning til tilstedeværelsen eller mengden av analytt i mediumet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-6,karakterisert vedat substansen er en akridiniumester.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 6,karakterisert vedat substansen er et medlem valgt fra gruppen bestående av:

hvori X er valgt fra gruppen bestående av 0, N, S, halogen, substituert fosfor, substituert svovel, substituert bor eller substituert arsen; Y er valgt fra gruppen bestående av 0, S eller NH; Ri er valgt fra gruppen bestående av alkyl, alkenyl, aryl, substituert alkyl, substituert alkenyl, substituert aryl, alkoksy, aryloksy, eller er fraværende når X er et halogen; R 2 er valgt fra gruppen bestående av H, alkyl, alkenyl, aryl, substituert alkenyl, substituert, aryl, alkoksy eller aryloksy dersom, og kun dersom X er N; R 3 er valgt fra gruppen bestående av H, amino, hydroksy, tiol, halogen, nitro, amido, acetyl, alkyl, alkenyl, aryl substituert acetyl, substituert alkyl, substituert alkenyl, substituert aryl, alkoksy eller aryloksy; R4er valgt fra gruppen bestående av alkyl, alkenyl, aryl, substituert alkyl, substituert alkenyl eller substituert aryl; og minst en av R^, R2, R3eller R4inneholder et reaktivt sete som tillater kjemisk konjugering.