KR100276679B1 - 다중 특이적 핵산 서열의 동시 검출 및 정량을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
다중 특이적 핵산 서열의 동시 검출 및 정량을 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상이한 화학발광성 표지화 시약에 커플링된 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 활용하여 단일 매질 중에 있는 여러 개의 핵산 분석물을 동시적으로 또는 순차적으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 이질, 균질 또는 비균질 분석 시스템에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드 프로브에 커플링되었을 때 다중 핵산 분석물의 검출을 위한 방법에 사용하기에 적절한 화학발광성 표지화 시약의 특이적인 조합에 관한 것이다. 본 발명은 이들 방법에 유용한 키트도 고려한다.
Description
제1도는 본 발명에서 표지화 시약의 바람직한 실시태양으로서 사용된 대표적인 아크리디늄 에스테르 유도체의 구조를 보여준다. 1－ 또는 3－me－AE, 1－ 또는 3－me－o－F－AE, 및 1－ 또는 3－me－m－diF－AE의 구조에 있어서, 메틸기를 아크리디늄 고리의 2 위치 부근에 나타내었는데, 이것은 메틸기가 1 또는 3 위치 중 하나에 부착될 수 있음을 지시한다.
제2(a)도 및 2(b)도는 본 발명의 다중 분석물 분석법에 함께 사용될 수 있는 아크리디늄 에스테르 유도체의 예상 쌍들을 나타내는 표를 제공한다. "Y"는 두 시약이 본 발명에서 상용성 쌍이라고 예상된다는 것을 표시하고, "N"은 두 화합물이 이 분석법에서 상용법이 아니라고 예상될 것임을 표시한다. 표의 왼쪽 열에서 숫자 1 내지 3은 분석 시스템의 유형을 표시한다: 1은 균질 단일상 분석 시스템을 나타내고, 2는 수상에서의 차별적 가수분해 및 혼성화한 올리고뉴클레오티드 프로브:표적 복합체의 물리적인 분리를 표시하며, 3은 차별적 가수분해가 일어나지 않고, 혼성화한 프로브:표적 복합체를 물리적으로 분리하지 않는 분석 시스템을 표시한다. 각각 거명된 아크리디늄 에스테르 유도체 아래의 사선으로 분리된 숫자는 각각 피크 시간 및 반응지속시간이다. 이 선 아래의 숫자는 혼성화하지 않은 올리고뉴클레오티드 프로브에 커플링되었을 때의 각 표지화 시약의 가수분해 반감기이다. 마지막으로, 이 표의 근거가 되는 선택 기준은 도면의 상단에 표시하였다.
제3도는 본 발명의 다중 pH 방식에서 두 가지 표지화 시약을 사용한 실시에를 그래프로 표시한 것이다. 제3(a)도 내지 3(c)도의 각각에서, 촉발 시약을 대략 간격 5에서 용액에 가하고, 그래프의 X축으로 표시된 시간 간격 90 정도에서 반응 혼합물을 대략 pH 12.1에서 대략 pH 13.0으로 변화시켰다. 제3(a)도는 표준 AE만을 함유한 이러한 반응 혼합물에서 방출된 광을 보여준다. 제3(b)도는 o－F－AE를 단독으로 함유한 반응물에서 방출된 광을 보여준다. 제3(c)도는 표준 AE와 o－F－AE 모두를 함유한 반응 혼합물에서 방출된 광을 보여준다.
제4도는 시간을 두고 화학발광성 표지화 시약의 5 가지 상이한 조압에서 얻어진 중첩되는 특징적 광 방출 프로필을 도시한 것이다. 촉발 시약을 각 반응 혼합물에 시간 0에 첨가하였다. 이 도면에서 사용된 표지화 시약은 o－diBr－AE, 2,7－diMe－AE, o－MeO(신나밀)－AE, o－Me－AE 및 o－diMe－AE였다.
제5도는 시간을 두고 화학발광성 표지화 시약의 5 가지 상이한 조압에서 얻어진 중첩되는 특징적 광 방출 프로필을 도시한 것이다. 촉발 시약을 각 반응 혼합물에 시간 0에 첨가하였다. 이 도면에서 사용된 표지화 시약은 o－diBr－AE, 1－Me－AE, 3－Me－AE의 혼합물, o－AE, o－Me－AE 및 o－diMe－AE였다.
제6도는 시간을 두고 7 가지 상이한 화학발광성 표지화 시약에서 얻어진 중첩되는 특징적 광 방출 프로필을 도시한 것이다. 촉발 시약을 각 반응 혼합물에 시간 0에 첨가하였다. 이 도면에서 사용된 표지화 시약은 o－diBr－AE, 2,7－diMe－AE, 1－Me－AE와 3－Me－AE의 혼합물, o－AE, o－MeO(신나밀)－AE, o－Me－AE 및 o－diMe－AE였다.
제7도는 시간에 걸친 다중 pH 분석 방식에서 4 가지 화학발광성 표지화 시약의 특징적 광 방출 프로필을 중첩시킨 것이다. 이 도면은 다중 방식 분석 시스템에서 4 가지 분석물을 검출하는 본 발명의 분석법의 능력을 예증한다.
제8(a)도 내지 8(i)도는 조합된 화학발광성 표지화 시약의 기대되는 광 방출 프로필과 얻어진 실제 광 방출 프로필 사이의 상관관계를 그래프로 보여준다. 사용된 화학발광성 표지화 시약은 o－diBr－AE, o－F－AE, 표준 AE 및 o－MeO－AE였다. 화학 발광 반응은 동일한 조건 하에서 다중 pH 분석 시스템에서 실시하였다.
제9(a)도 내지 9(d)도는 두 가지 아크리디늄 에스테르 유도체의 화학발광 스펙트럼으로, 제9(a)도 및 9(b)도는 2,7－o－diBr－AE 및 표준 AE의 개별 스펙트럼을 각각 보여준다. 제9(c)도는 컴퓨터를 이용하여 얻어진 각 스펙트럼의 중첩상을 하나의 그래프에서 보여준다. 제9(d)도는 컴퓨터로 만들어낸 두 스펙트럼의 시뮬레이션을 보여준다.
바람직한 실시태양의 상세한 설명
본 발명은 하나의 시료 중에 있는 다수의 상이한 분석물, 바람직하게는 핵산의 특이적인 검출을 위한 조성물 및 방법으로 이루어진다. 따라서, 바람직한 실시 태양에서 본 발명은 시료 또는 임상 표본에서 2 가지 이상의 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 이러한 핵산 서열이 특정한 질환 상태 또는 감염을 지시할 수도 있다.
정의
달리 명시적으로 '표시되지 않는 한 하기 용어는 본 출원에서 하기한 의미를 가진다.
"핵산 분석물"은 시료 중에 존재할 때 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 한개의 표지화 시약을 사용하여 그 존재 및(또는) 양을 검출하려고 하는 하나 이상의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 부위를 뜻한다. 이 분석물은 하나 이상의 구별되는 표적 부위를 갖는 한 개의 핵산 분자일 수도 있고, 각각이 하나 이상의 구별되는표적 부위를 갖는 하나 이상의 상이한 분자일 수도 있다. 이와 다르게는 분석물이 한개의 핵산 내에 함유된 특정한 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 그에 따라 한 개의 핵산이 둘 이상의 핵산 분석물을 함유할 수도 있다. 그러나, 본 출원인은 동일하거나 상이한 핵산 분자들이나, 또는 둘 모두에 있는 둘 이상의 표적 부위가 동일한 프로브 표지을 사용하여 검출되는 것이 때때로 바람직할 수도 있다고 여긴다. 이것은 예를 들면 한 유기체의 염색체 r－DNA 및 리보솜 RNA 모두를 한 가지 표지를 보유한 1종 이상의 프로브를 사용하여 표적화하고, 다른 한 유기체의 염색체 r－DNA와 리보솜 RNA를 다른 표지를 보유한 1종 이상의 프로브로 표적화할 수 있다. 이러한 경우, 첫 번째 분석물은 첫 번째 유기체의 핵산 중 모든 표적화된 뉴클레오티드 서열 부위로 이루어지고, 두 번째 분석물은 두 번째 유기체의 핵산 중 모든 표적화된 뉴클레오티드 서열 부위로 이루어진다.
"표적 부위" 또는 "표적 뉴클레오티드 서열"은 분석물 분자 중 주어진 프로브 또는 프로브류에 결합하는 부분을 뜻한다. 분석물이 하나 이상의 핵산 분자일 때, 표적 부위는 표적이 아닌 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 영역에 대한 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브의 혼성화에 유리하지 않은 혼성화 조건 하에서 상기 프로브에 특이적으로 결합하는 부위에 있는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 특정한 표적 부위는 동일한 핵산 분자와 다른 핵산 분자 중 어느쪽에 함유되어 있는지 다른 표적 부위로부터 완전히 떨어져 있을 수 있다. 이와 다르게는, 주어진 표적 부위는, 제한 없이, 또다른 표적 부위와 동일한 핵산 분자에 함유되고 하나 이상의 뉴클레오티드만큼 그 다른 표적 부위에 겹칠 수도 있고, 하나 이상의 뉴클레오티드만큼 그 다른 표적 부위에 의해 겹쳐질 수 있으며, 완전히 또다른 표적 뉴클레오티드 서열 내에 함유될 수도 있다.
"프로브", '핵산 프로브", "혼성화 프로브", 또는 "올리고뉴클레오티드 프로브"는 핵산 분석물을 구성하고 있는 표적 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적이어서 고도로 엄격한 혼성화 조건 하에서 올리고뉴클레오티드가 거기에 혼성화하는 것을 허용하는 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 뜻한다. "프로브"라는 낱말을 사용할 때에는, 당업계의 숙련자는 이 용어가 표적 핵산 부위에 특이적으로 혼성화하도록 설계, 선별되고(되거나) 달리 혼성화할 수 있는 동일하거나 동일하지 않은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 분자에 적용된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에서 정의되는 프로브는 동일한 핵산 분석물의 하나 이상의 표적 부위를 표적으로한 상이한 올리고뉴클레오티드 분자의 집합으로 이루어질 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 "프로브'라는 용어는 단수형 또는 복수형 중 하나를 뜻할 수 있으며 이러한 의미는 본 명세서에서 사용되는 문맥에 의해 명백해질 것이다. 정의에 의해 이 용어는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드 사이인 올리고뉴클레오티드에 우선적으로 적용된다.
"비표적 핵산"은 본 발명의 방법 또는 조성물을 사용하여 주어진 분석에서 검출하고자 하는 것이 아닌 핵산을 뜻한다.
"시료" 또는 "시험 시료"는 1종 이상의 핵산 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 임의의 수성 또는 수혼화성 용액, 혼탁액 또는 에멀젼을 뜻한다. 이러한 시료에는 제한 없이 정제되거나 정제되지 않은 핵산, 바이러스 입자 및(또는) 식물, 동물, 원생동물 또는 세균 세포가 포함될 수 있으며, 실험실, 환경, 농업, 식료, 사람, 동물, 배출 또는 분비 출처에서 유래한 것일 수 있다. 시료는 이전의 시료를 균질화, 농축, 현탁, 추출, 가용화, 소화, 세포 용해, 희석 또는 분쇄시켜 존재한다면 추측되는 핵산 분석물을 물을 함유한 환경에 두는 것과 같은, 이전의 시료의 전처리의 결과로 만들어질 수 있다.
"화학발광성 표지"는 또다른 화학적 실체 또는 화합물에 커플링될 수 있는 임의의 화학적 실체 또는 화합물로서, 고에너지 화학적 중간체를 거쳐 광의 방출을 초래하는 화학적으로 매개되는 반응에 참여할 수 있는 것을 뜻한다. 본 발명의 바람직한 화학발광성 표지는 아크리디늄 유도체이고, 가장 바람직하게는 아크리디늄 에스테르 유도체이다.
"커플링된"은 두 개 이상의 화학적 일체 또는 화합물이 화학적 결합 또는 회합을 통해 연결된 것을 뜻한다. 따라서, 이 용어는 공유 결합뿐 아니라 아비딘과 비오틴 사이, 또는 킬레이팅제와 하나 이상의 착이온 사이 등에 형성되는 것과 같은 강한 비공유 결합을 포함하기로 한다.
"표적화된"은 특정한 화학적, 물리적, 또는 생물학적 실체를 동정하고자 하는 것을 뜻한다. 이렇게 정의되므로, 화학적 실체에는 핵산의 한 뉴클레오티드 서열 부위와 같이 더 큰 실체의 일부분이 포함될 수 있다. 이런 정의 하에서 생물학적 실체에는 하나 이상의 종, 속, 강, 과 등과 같은 유기체의 일단이 포함될 수 있다.
"광 방출 반응"은 하나 이상의 반응물에 의한 광의 검출가능한 생산을 초래하는 촉발할 수 있는 화학 반응을 뜻한다. 촉발할 수 있다는 것은 그 화학 반응이 반응 혼합물로의 반응물 또는 에너지 (예, 전하)의 첨가에 의해 개시된다는 것, 또는 반응 동력학이 온도 또는 pH와 같은 한 가지 이상의 반응 조건의 조정에 의해 더 유리하게 된다는 것을 뜻하려는 것이다.
"충분히 구별되는"이란 두 가지 이상의 상이한 화학발광성 표지들의 광 방출의 파장(들), 피크까지의 시간, 반응 지속시간 또는 다른 반응 특성이 이들이 반응 혼합물에 합쳐져 있고 촉발할 수 있는 광 방출 반응에서 광을 방출하게 만들어졌을 때 구별될 수 있다는 것을 뜻한다.
"특이적으로 혼성화하다"는 단일 가닥 핵산이 그 단일 가닥 핵산과 비표적 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 부위 사이의 안정한 이중 가닥 이중체의 형성에 유리하지 않은 혼성화 조건 하에서 표적 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 부위와안정한 수소 결합 이중체를 형성할 수 있다는 것을 뜻한다.
"비슷한 정도로 보호되는"은 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링된 상이한 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬 소실의 속도가 그 프로브가 표적 헥산 또는 뉴클레오티드 서열 부위에 혼성화했는가에 따라 감소되고, 상기 소실의 속도가 바람직하게는 동일한 조건 하에서 서로에 대해 최대 약 250 배수 이내인 것을 뜻한다.
"비슷한 정도로 감수성인"은 불안정화제에 대한 노출에 의한, 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링된 상이한 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬소실의 속도가 동일한 조건 하에서 서로에 대해 약 50 배수 이내인 것을 뜻한다.
"화학발광 포텐샬"은 주어진 화학발광성 표지가 촉발할 수 있는 광 방출 반응에서 반응하는 능력을 뜻한다. 화학발관 포텐샬의 소실은 이러한 화학발광성 표지가 화학적으로 분해되거나 비화학발광성 화합물로 전환되었을 때 일어난다.
"반응 pH 최적치" 또는 "반응 pH 최적치들"은 주어진 화학발광성 표지가 관계된 화학발광성 반응이 규정된 조건 하에서 광이 최고로 방출되면서 진행되는 pH 값을 뜻한다. 동일한 반응 혼합물에 둘 이상의 화학발광성 화합물이 존재한다면 그 화학발광성 반응 혼삽물에 대해서는 둘 이상의 pH 최적치들이 있을 수 있다. 광방출의 수율 (pH의 함수로서)은 최적 pH에 가까워짐에 따라 급격히 상승할 수 있고, 그래서 주어진 화학발광성 표지가 처음 pH에서는 광을 거의 방출하지 않는 반면 동일한 표지가 처음 pH와는 1.0 내지 0.5 pH 단위만큼 다른 pH값에서는 훨씬 많은 광을 방출할 수도 있다.
"개시"는 광 방출 반응이 시작되게 만들, 화학발광성 반응물을 함유한 반응 혼합물에 대한 에너지, 촉매 또는 하나 이상의 반응물의 첨가를 뜻한다.
"아크리디늄 유도체"는 아크리디늄 고리에 기초한 화학발광성 화합물군 중 어느 하나를 뜻한다.
"아크리디늄 에스테르 유도체"는 아크리디늄 고리에 기초하고 C－9 위치에서 에스테르 연결기를 가진 화학발광성 화합물군 중 어느 하나를 뜻한다.
"반응 동력학"은 시간의 함수로서, 주어진 시간 간격에 반응에 참여하는 화학발광성 화합물 또는 화합물들에 의해 방출되는 광의 양에 의해 측정되는, 광 방출 반응의 속도를 뜻한다. "반응 동력학"이라는 용어는 이와 같이 주어진 반응 혼합물에서 화학발광 반응의 개시와 광 방출의 최대치 사이의 시간의 양 (피크 시간) 뿐 아니라 개시에 뒤이은 광 방출의 지속기에 대한 언급을 포함하려는 것이다. 주어진 화학발광성 표지를 함유한 반응 혼합물의 반응 동력학은 주어진 시간 간격에 방출되는 광의 양 대 시간으로 도시될 수 있으며, 이렇게 하여 얻어진 곡선은 동일한 반응 조건 항세서 주어진 화학발광성 반응물에 대해 재현성있고 특징적이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 사용되는 반응물은 아크리디늄 유도체, 바람직하게는 아크리디늄 페닐 에스테르 유도체이다. 제1도는 대표적인 아크리디늄 페닐에스테르 유도체의 예를 보여준다. 다른 아크리디늄 유도체를 포함하여 다른 적절한 화학발광성 시약 및 아크리디늄 에스테르 유도체가 본 발명의 개시에 비추어 일상적인 선별을 통해 본 발명에 사용하기에 적절한 것으로 밝혀질 수 있음을 이해할 것이다. 아크리디늄 페닐 에스테르 화합물은 4급 질소 중심을 가지며 9 위치에서 유도체화하여 페닐 에스테르 잔기를 갖게 된 아크리딘의 유도체이다. 본 발명에 유용한 아크리디늄 유도체들은 페닐 에스테르이든 아니든 과산화수소와 반응하여 아크리디늄 고리의 C－9 탄소를 포함하는 일시적인 디옥세탄 고리를 형성하고, 이어서 여기된 아크리돈을 형성하는 성질을 공유한다. 여기된 아크리돈의 방사성 이와은광의 생산을 초래한다. '아크리디늄 에스테르의 합성 및 화학발광성 표지화 시약으로서 그의 용도에 대한 일반적인 설명이 앞서 언급하였고 이제 본 명세서에 참고로 포함시키는 문헌[Weeks et al., Acridinium Esters as High Specific Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem. 29:1474－1478 (1984)]에 기재되어 있다.
바람직한 실시태양에서, 아크리디늄 에스테르는 표준 화학 기술을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 과정에서 이어지는 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입되거나 올리고뉴클레오티드의 말단 위치에 자리한, 아크리디늄 에스테르 잔기에 결합하는데 쓸 수 있는 일급 아민 "링커 암"을 가진 비뉴클레오티드 단량체 단위에 부착시킬 수 있다. 본 발명과 소유자가 공통되고 이제 본 명세서에 참고로 포함시키는 아놀드(Arnold) 등의 유럽 특허 공개 제313219호 [Non－Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes]를 참조한다. 이와 같이, 표지가 부착될 링커 암잔기는 올리고뉴클레오티드 내의 미리정해진 위치에 놓인다. 표적 핵산의 적어도 일부분에 충분히 상보적이어서 엄격한 혼성화 조건 하에서 거기에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드 사이의 삽입체 또는 그에 대한 치환체로 놓일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 고상 합성은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌[Brown & Brown, Oligonucleotides and Analogues－A Practiced Approach 중 Modem Machine－Aided Methods of Oligonucleotide Synthesis, (1991)]에 기재되어 있다.
아크리디늄 에스테르 유도체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 링커 암:혼성화 프로브 복합체에 연결시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 출원인은 앞서 본 명세서에 참고로 포함시킨 유럽 특허공개 제313219호 문헌 [Nelson et al., Non－Isotopic Probe Techniques 중 Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence(Academic Press, 1992)]에 기재된 방법을 사용하였다.
따라서, 이러한 바람직한 한 방법에서는, 아크리디늄의 N－히드록시－숙신이미드 (NHS) 에스테르 (예, 4－(2－숙신이미딜옥시카르보닐 에틸)페닐－1－메틸아크리디늄 9－카르복실레이트 플루오로술포네이트)를 앞서 참고로 포함시킨 윅스(Weeks) 등의 상게서에 기재된 대로 합성하였다. 링커 암:혼성화 프로브 접합체의 일급 아민과 선별된 NHS－아크리디늄 에스테르와의 반응은 다음과 같이 수행하였다. 상기한 바와 같이 합성한 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브:링커 암 접합체를 Savant Speed－VacTM건조 장치에서 진공 건조시킨 다음 50 부피% DMSO 중의 0.125 MHEPES 완충액 (pH 8.0) 8 μl에 용해시켰다. 이 용액에 25mM 목적 NHS－아크리디늄 에스테르 2 μl를 가하였다. 용액을 혼합하고 37℃에서 20 분 동안 인큐베이션 하였다.
DMSO 중 25mM NHS－아크리디늄 에스테르 3 μl를 추가로 용액에 가한 후 온화하게 혼합한 다음 0.1 M HEPES 완충액 (pH 8.0) 2 μl를 가하고, 혼합한 후 튜브를 37℃에서 추가로 20분 동안 인큐베이션시켰다. 용액 속으로 온화하게 혼합시킨, DMSO 중 0.1 M HEPES 완충액 (pH 8.0) 중의 0.125 M 라이신 5 μl의 첨가로 반응을 중지시켰다.
3 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0) 30 μl,물 245 μl 및 40 mg/ml 글리코겐 5 μl를 첨가하여 표지된 올리고뉴클레오티드를 용액으로부터 회수하였다. 차가운 100% 에탄올 640 μl를 튜브에 가하고, 튜브를 드라이 아이스 상에 5 내지 10 분 동안 고정시켰다. 침전된 표지된 핵산을 내장된 마이크로원심분리기에서 표준 로터헤드를 사용하여 15,000 rpm으로 침강시켰다. 상징액을 흡입제거하고, 펠렛을 0.1%(w/v) 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 함유한 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 5.0) 20 μl에 재용해시켰다.
표지된 올리고머를 이어서 필요 및 희망에 따라 정제할 수 있으며, 표지된 올리고뉴클레오티드의 정제를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제 5,185,439호 (본 출원과 소유권이 공통되며, 본 명세서에 참고로 포함시킴) [Arnold et al., Acridinium Ester Labeling and Purification of Nuleotide Probes]에 기재된 바람직한 방법에서는 올리고머를 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP－HPLC)를 사용하여 정제한다. 시료를 Vydac C4 역상 HPLC컬럼에 가하고, 완충액 B 10%에서 15%까지의 선형 구배로 25분만에 용출시켰다. 여기서 완충액 A는 HPLC용 물중의 0.1% (w/v) 트리에틸암모늄 아세테이트 (pH 7.0)이고, 완충액 B는 100% 아세토니트릴이다. 얻어진 용출액의 흡광도를 260nm에서 조사하면서 0.5 ml 분획을 수집하였다. 분획을 이어서 화학발광에 대해 분석하고, 주 활성 피크에 해당하는 분획을 에탄올로 침전시키고, 표지된 프로브를 0.1% SDS를 함유한 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 5.0)에 재현탁시켰다.
본 발명의 조성물 및 방법은 바람직하게는 본 명세서에 참고로 포함시킨 문헌[Nelson et al., Non－Isotopic Probe Techniques 중 Detection of Acridimium Esters by Chemiluminescence (Academic Press 1992)] 및 아놀드 등의 미국 특허 제5,283,174호에 설명된 혼성화 보호 분석 (HPA)과 연계하여 사용한다. 이 분석 형식에서는, 아크리디늄 에스테르 표지화 시약은 혼성화하지 않은 프로브에 결합되었을 때에는 가수분해에 감수성이지만 혼성화한 프로브에 결합되었을 때에는 가수분해로부터 보호된다. 이 시스템의 차별적 가수분해 특성이 표적에 대한 프로브의 혼성화, 혼성화한 프로브와 혼성화하지 않은 프로브 사이의 구별, 및 표지된 혼성화한 포로브의 검출 및(또는) 정량이 한 개의 시험관에서 수행될 수 있는 균질, 단일상 분석을 가능하게 한다. 그러나, 차별적 가수분해는 혼성화한 프로브와 혼성화하지 않은 프로브가 구별될 수 있는 유일한 방법은 아니며, 합체 형성과 같은 화학발광성 표지의 다른 화학적 수식이 혼성화한 프로브와 혼성화하지 않은 프로브에 커플링된 화학발광성 표지들을 차별화할 수 있거나, 있을 지도 모른다. 또한, 본 명세서에 설명된 분석 형식은 균질 및 이질 분석의 요소들이 혼합된 분석 형식도 따른다.
하기 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며, 어떤 방식으로도 본 명세서를 끝맺는 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: 각종 아크리디늄 에스테르 유도체의 초기 시험 및 검색
AE 표지화 시약의 합성
아크리디늄 에스테르 (AE) 유도체의 N－히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 표지화 시약은 일반적으로 앞서 참고로 포함시킨 윅스 등의 상게서에 기재된 대로 합성하였다. 이들 합성을 위해, 시판되는 것 중 최고 순도의 재료 및 시약을 Aldrich, Lancaster Synthesis 및 Fisher Scientific으로부터 입수하였다. 9－아크리딘카르복실산 (ACA), 또는 아래에 설명된 바와 같이 제조한 메틸 또는 디메틸 치환 유도체를 티오닐 클로라이드 중에서 4 시간 동안 환류시킴으로써 대응하는 아크리딘산 염화물로 전환시켰다. 시판되는 히드록시페닐－ 또는 히드록시나프틸산－－즉, 3－(4－히드록시페닐)프로피온산, 3－(4－히드록시－3－메톡시페닐)프로피온산, 4－히드록시－3－메톡시신남산, 및 6－히드록시－2－나프토산－－을, 그의 칼륨염을 약 3 시간 동안 환류 조건 하의 95% 에탄올(EtOH) 용액 중에서 벤질 브로마이드로 처리함으로써 벤질 (Bz) 에스테르로 전환시켰다. 이들 벤질 에스테르를 이어서 실온에서 약 4 시간 동안 무수 피리딘 중에서 아크리딘산 염화물과 반응하도록 하여 아크리딘 에스테르를 얻었다. 이 아크리딘 에스테르를 60℃에서 약 4 시간 동안 아세트산(HOAc)중의 30 중량% 브롬화수소(HBr)로 처리함으로써 벤질 에스테르 보호기를 가수분해하였다. 생성된 산을 무수 테트라히드로푸란(THF) 중에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 촉매작용을 이용하여 N－히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 시약으로 전환시켰다. 최종적으로, 메틸 아크리디늄 표지화 시약으로의 변형은 실온에서 5 내지 24 시간 동안 무수 메틸렌 클로라이드 중의 과량의 메틸 트리플루오로메탄술포네이트 (메틸 트리플레이트)를 사용한 처리에 의한 아크리딘의 메틸화로 이루어졌다. 표준－AE, 나프틸－AE, o－MeO－AE 및 o－MeO－(신나밀)－AE를 위해 사용된 NHS－에스테르 표지화 시약은 이런 방식으로 제조하였다. 4,5－diMe－AE, 2,7－diMe－AE 및 1－Me－AE와 3－Me－AE의 혼합물을 위해 사용된 NHS－에스테르 표지화 시약은 아래에 설명된 바와 같은 메틸 및 디메틸 치환된 ACA의 합성을 필요로 하였다.
9－아크리딘카르복실산(ACA)의 4,5－ 및 2,7－디메틸 치환 유도체는 핵심적으로는 문헌[M.S. Newman & W.H. Powell, J. Org. Chem. 26 (1961):812－815]에서 4,5－디메틸아크리딘－9－카르복실산에 대해 설명된 대로 옥살릴 클로라이드와 디메틸 치환된 디페닐아민의 반응으로 이사틴 중간체를 얻고, 이어서 재배열로 대응하는 치환 아크리딘을 생성시키는 것으로 제조하였다. 먼저, 24 시간 동안 200℃에서 니트로벤젠 중에서 무수 탄산나트륨 및 미량의 구리가 존재하는 가운데 2－ 또는 4－메틸포름아닐리드를 각각 약간 과량의 2－ 또는 4－브로모톨루엔과 반응시킴으로써 2,2′－디메틸디페닐아민 및 4,4′－디메틸디페닐아민을 제조하였다. 생성된 N,N－디페닐포름아미드의 가수분해는 이들을 아세트산(HOAc) 중 진한 염산의 1:1 (v/v) 혼합물 중에서 5 시간 동안 환류시킴으로써 이루어져 실리카 상에서의 정제 후 좋은 수율로 디메틸디페닐아민을 제공하였다. 이사틴을 거친 디메틸 치환된 아크리딘카르복실산의 제조는 다음으로 약 3 시간 동안 환류 이황화탄소 중에서 위에서 제조된 2,2′－디메틸디페닐아민 또는 4,4′－디메틸디페닐아민을 옥살릴 클로라이드와 반응시킴으로써 진행되었다. 용매 및 과량의 반응물을 증발시킨 후, 황색의 잔류물을 새로운 이황화탄소에 용해시키고 약 30 분의 기간 동안 염화알루미늄으로 처리하고, 4 시간 동안 환류시킨 후 실온에서 하룻밤 방치하였다. 용매를 증발시킨 다음 잔류물을 메틸렌 클로라이드와 차가운 10% (v/v) 진한 염산 사이에 분배시켰다. 오렌지색 이사틴은 유기층에서 회수되었다. 마지막으로, 이사틴을 환류 하에서 12 시간 동안 10% (w/v) 수산화칼륨(KOH)으로 처리한 결과 각각 4,5－디메틸아크리딘－9－카르복실산 (4,5－diMe－ACA) 및 2,7－디메틸아크리딘－9－카르복실산 (2,7－diMe－ACA)가 형성되었다. 비슷한 방법으로, 3－메틸디페닐아민을 옥살릴 클로라이드 및 염화알루미늄으로 처리하여 위에 설명된 바와 같은 KOH 처리에 의한 재배열 후면 1－ 및 3－메틸아크리딘－9－카르복실산 (1－ 및 3－Me－ACA)의 혼합물을 생성시키게 되는 메틸페닐이사틴의 혼합물을 얻을 수 있었다. 4,5－diMe－ACA, 2,7－diMe－ACA, 또는 1－ 및 3－Me－ACA의 혼합물을 3－(4－히드록시페닐)프로피온산의 벤질 에스테르로 에스테르화시키고 후속적으로 위에 설명된 반응들을 통해 각각 4,5－diMe－AE, 2,7－diMe－AE 또는 1－ 및 3－Me－AE의 혼합물을 위해 사용되는 NHS 에스테르 표지화 시약을 얻을 수 있었다.
시판되지 않는 몇 가지 치환 히드록시페닐프로피온산 유도체는 통상적인 방법으로 제조하였다. 3－(4－히드록시－3,5－디브로모페닐)프로피온산은 빙초산(HOAc) 중에서 3－(4－히드록시페닐)프로피온산을 브롬으로 브롬화시켜 제조하였다. 3－(2－히드록시페닐)프로피온산은 무수 에탄올(EtOH) 중에서 2－히드록시신남산을 탄소상 팔라듐 위에서 수소화시킴으로써 제조하였다. 다음에는 아크리디늄 에스테르(AE) 제조는 ACA를 위에 표시된 바와 같이 상기 산의 벤질 에스테르와 커플링시킴으로써 진행되어 o－diBr－AE 및 오르토－AE를 위해 사용되는 NHS－에스테르 표지화 시약을 제공한다.
또한, 몇몇 치환 페놀－－즉, 2－메틸페놀, 2,6－디메틸페놀, 3,5－디메틸페놀, 2－플루오로페놀 및 3,5－디플루오로페놀－－의 프로피오니트릴 유도체는 아크릴로니트릴과 페놀의 염화알루미늄 촉매 축합을 통한 시아노에틸화 및 대응하는 치환 4－히드록시페닐프로피오니트릴의 단리에 의해 제조하였다. 이들 히드록시페닐프로피오니트릴 유도체를 다음으로 아크리딘산 염화물과 반응시키고, 생성된 에스테르 화합물을 염산으로 처리하여 니트릴을, 위에 설명된 바와 같이 후속 처리되어 대응하는 AE－NHS 표지화 시약을 얻을 수 있는 대응 프로피온산 유도체로 가수분해하였다. 별법으로는, 프로피오니트릴을 먼저 대응하는 프로피온산 유도체로 가수분해하고 벤질 에스테르를 거쳐 합성을 진행할 수도 있을 것이다. AE－NHS 시약을 생성시키는 최종 단계는 위에 표시한 것과 동일하였다. 이런 방식으로 o－diMe－AE, m－diMe－AE, o－Me－AE, o－F－AE, 1－ 또는 3－Me－o－F－AE, 및 1－ 또는 3－Me－m－diF－AE를 위해 사용되는 NHS－에스테르 표지화 시약을 제조하였다.
당업계의 숙련자에게는 이들 합성 계획이 이하에 개시된 바와 같은 특성파악 및 검색을 위한 또다른 상이한 아크리디늄 에스테르 유도체를 제조하는 데 보다 일반적으로 활용될 수 있다는 점이 명확할 것이다.
AE 유도체의 특성파악 및 검색
상기 유도체들의 화학발광 및 가수분해 특성을 표준 AE (4－(2－숙신이미딜옥시카르보닐에틸)페닐－10－메틸아크리디늄 9－카르복실레이트 플루오로술포네이트)의 경우와 비교하였다.
본 발명을 예증하기 위해 사용된 예시적 AE 유도체는 나프틸－AE, o－diBr－AE, 1－ 및 3－Me－AE의 혼합물, 4,5－diMe－AE, 2,7－diMe－AE, o－diMe－AE, o－Me－AE, m－diMe－AE, o－MeO(신나밀)－AE, o－MeO－AE, o－AE (핵산 커플링 링커 암이 페닐 고리의 오르토 위치에 부착되어 있는 아크리디늄 에스테르 유도체), o－F－AE, 1－ 및 3－Me－o－F－AE의 혼합물, 표준 AE, 및 1－ 및 3－Me－m－diF－AE의 혼합물이다 (제1도 참조). 1－Me－AE, 1－Me－o－F－AE 및 1－Me－m－diF－AE는 이들의 3－메틸 이성질체와의 혼합물에만 존재하였으며, 본 출원에서 사용될 때에는 이들 명칭은 해당 1－ 및 3－메틸 유도체의 혼합물을 뜻하는 것으로 이해될 것이다. 제1도에 보이는 바와 같이, 이들 화합물을 사용하여 혼성화 프로브로 사용될 각종 올리고뉴클레오티드를 표지하였다. 당업계의 숙련자들은 본 발명이 어느 한 특정한 프로브－표적 조합의 사용에 의존하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 분석법과 함께 사용하기 위해 두 가지 이상의 상호 배타적인 프로브－표적 조합을 선택하는 것은 본 발명의 개시 내용에 비추어 일상적이라고 할 것이다.
올리고뉴클레오티드는 Biosearch 8750 또는 ABI 380A DNA 합성기를 사용하여 표준 고상 포르포르아미다이트 반응을 이용해 포스포디에스테르 결합을 포함하도록 합성하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용해 정제하였는데, 올리고뉴클레오티드 합성 및 겔 정제 기술은 당업계에 공지되어 있다 (예, 앞서 참고로 포함시킨 Sambrook et al., 상게서 참조). 여러 가지 천연에 존재하지 않는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 포스포로티오에이트 연결기와 같은 변형된 뉴클레오티드간 연결기를 갖는 것 또는 당 또는 염기 수식을 갖는 것 역시 당업계에 공지되어 있으며 일부 용도에서 안정성 증가와 같은 이점을 가질 수 있는데, 이들 핵산 유사체 역시 본 발명의 일부분으로 사용되는 것으로 간주된다.
앞서 언급된 바와 같이, 일급 아민으로 종결되는 링커 암을 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 내의 소정의 위치에서 각 올리고뉴클레오티드의 구조 내로 도입시켜 서열에 있는 뉴클레오티드들 사이의 삽입을 이루게 하였다. 앞서 본 명세서에 참고로 포함시킨 아놀드 등의 상게서 (Non－Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes) 등 참조. AE 유도체를 역시 위에서 상술된 바와 같이 링커암의 일급 아민을 통해 올리고뉴클레오티드에 연결시켰다. 표지된 프로브의 특성을 파악하고 그의 화학발광, 혼성화 및 차별적 가수분해 성질에 관해 비교하였다.
표지된 프로브 10 μl 분주량을 12 × 75 폴리스티렌 튜브에 옮겨담고 LEADER?50 광도계 (Gen－Probe Incorporated, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 에서 0.1% H2O2및 0.4 N HCl 용액 200 μl 자동 주입, 0.1 내지 2 초 지연, 1 N NaOH 200 μl 자동 주입, 및 5 초 동안 화학발광 측정에 의해 측정하였다. 최종 pH는 대략 13이었다.
본 명세서에 설명된 특정한 광도계는 파장 300 내지 650mm 사이의 광을 측정하는데, 본 발명의 방법 및 조성물에 유용하기 위해 광도계가 이 범위의 파장에서 방출된 광을 검출할 필요는 없다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 사실상, 본 방법의 일부 방식에서, 예를 들면 다중 파장 방식에서는 광도계가 본 명세서에 설명된 것보다 더 넓거나 좁은 범위의 파장에 걸쳐, 또는 독립적으로 동시적으로 둘 이상의 좁은 파장에 걸쳐 방출된 광을 측정하는 것이 유용하거나 필수적일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 실시예에서 계측되는 파장의 폭은 예시적인 것으로 이해되어야 하며 본 발명의 범위에 대한 제한이 아니다.
화학발광 반응 특성은 반응하는 아크리디늄 에스테르 유도체에 의해 방출되는 광을 측정함으로써 확정하였다. 방출된 광은, 주어진 파장 또는 파장 대역에서 시료에 의해 방출된 광자의 상대적인 수를 표시하는 측정 단위인 상대 광 단위(RLU)를 사용하여 광도로 정량하였다. 광은 5 초의 측정 기간 동안 여러 시점에서 검출하였다. 이들 데이터로부터 각 표지된 올리고뉴클레오티드가 피크 광 방출에 도달하는 데 요구되는 시간의 길이 ("피크 시간") 및 광 방출의 지속기를 계산하였다. "지속기"는 피크 방출이 일어난 후 RLU가 기선의 10%에 도달하는 데 요구되는 시간을 뜻하는 것으로 임의로 정의한다. 이들 데이터를 아래 표 1에 제시하였다.
[표 1]
또한, 각 표지된 프로브가 최대량의 광을 방출하는 데 필요한 pH 역시 산정하고 "최적 pH"로 정의하였다. 이 측정에서, 반응은 첫 번째 반응 용액이 0.4 N HCl 이 아닌 0.1 N NCl을 함유하고, NaOH를 사용하지 않고 두 번째 반응 용액이 여러 pH값으로 적정한 0.24 M 붕산나트륨 완충액이었다는 것을 제외하고는 위에서 설명된 대로 개시되었다. 최적 pH에서 각 표지된 프로브에 대해 "피크 시간" 및 지속기를 계산하였다. 이들 데이터 역시 표 1에서 찾아볼 수 있다.
표지된 올리고뉴클레오티드의 화학발광 반응 동력학을 측정한 후, 각 올리고뉴클레오티드의 혼성화 및 가수분해 특성을 조사하였다. 각 혼성화한 표지된 올리고뉴클레오티드 및 혼성화하지 않은 표지된 올리고뉴클레오티드에 대한 AE 가수분해 특성을 앞서 본 명세서에 참고로 포함시킨 넬슨(Nelson) 등의 상게서에 기재되고 다음 실시예에서 간단히 요약한 대로 여러 온도 및 pH값에서 측정하였다.
실시예 2: 아크리디늄 에스테르 유도체의 가수분해 특성의 측정
이 실시예는 개별 화학발광성 표지를 검색하여 혼성화 분석 프로브에 커플링 되었을 때의 가수분해 속도와 같은 가수분해 특성을 측정하는 바람직한 방법을 설명한다. 특히, 이 방법은 다중 분석물 분석 시스템에 사용하는 데 있어 하나 이상의 아크리디늄 에스테르 유도체의 적합성을 예비 결정하는 데 유용하다. 이 방법이 혼성화한 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼성화하지 않은 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브로부터 화학적으로 rnuf하는 바람직한 방법을 예시하는 것이기는 하나, 단일 가닥 핵산을 전체적 또는 부분적으로 이중가닥인 핵산으로부터 화학적으로 또는 물리적으로 분리하는 다른 방법, 예를 들면 히드록시아파타이트 흡착, 겔 여과, 또는 역상 크로마토그래피도 당업계에 공지되어 있다.
유리 프로브의 가수분해를 측정하는 일반적 과정
일반적으로, 각 후보 아크리디늄 에스테르를 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링시키고 프로브:AE 에스테르를 위에 설명한 바와 같이 정제한다. PSB (10 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.2), 0.1% 리튬 라우릴 술페이트)에 용해시킨 각 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브 10 μl를 12 ×75mm 폴리스티렌 시험관에 가하였다. 시험할 각 표지된 프로브에 대해 여러 개의 똑같은 튜브를 만드는데, 본 출원인은 통상 각 표지된 튜브에 대해 13 개의 동일한 튜브를 사용하였으며, 그 중 셋은 "시간 0" (T0) 대조물로 사용하였다. T0대조물을 실온의 시험관 꽂이에 두었다. 이들 튜브의 각각에 0.4 N HCl 및 0.1 부피% H2O2200 μl를 가하고, 이어서 가수분해 완충액(0.13－0.19 M Na2B4O7(pH 7.6－9.5) 및 2－5 부피% 폴리옥시에틸렌 에테르 (미국 미주리주 세인트루이스 소재 Sigma Chemical Co.에서 상품명 TRITON?X－100으로 시판하는 것))을 가하였다. 본 출원인은 이 단게에서 첨가의 순서가 중요하다는 것을 발견하였다. 시약 블랭크 (음성 대조물)는 PSB 10 μL만을 함유하며 이어서 T0대조물과 마찬가지로 처리하였다.
시험관 꽂이에 있는 10 개의 남은 동일한 튜브 각각에 가수분해 완충액 100 μl를 넣고 꽂이를 흔들어 혼합하였다. 시험관 꽂이를 즉시 60℃ (또는 임의의 다른 희망 시험 온도)의 순환 수조에 넣고 시간 측정을 개시하였다.
희망하는 시점 (예, 1, 2, 4, 7, 10, 20, 30, 40 및 50 분)에 0.4 N HCl, 0.1 부피% H2O2용액 200 μl를 각 세트 중의 한 튜브에 가하고, 그 튜브를 수조에서 실온으로 즉시 꺼내고 혼합하였다. 튜브를 실온에서 1 분 이상 정치시켰다.
각 시료의 화학발광을 광도계에서 1 N NaOH를 함유한 용액의 1 회 주입 및 5 초 동안의 화학발광 측정에 의해 측정하였다. 음성 대조물의 평균 RLU를 실험 RLU에서 감산하였다. 다음으로 각 시료에 대한 순 RLU를 평균 T0RLU로 나누고 100을 곱할 수 있으며, 이렇게 하여 %T0값을 얻고, 이 데이터를 log (%T0)를 y축으로 하고 시간을 x축으로 하여 작도할 수 있다
차별적 가수분해 (DH) 비 측정
다음은 혼성화한 올리고뉴클레오티드 프로브에 커플링된 화학발광성 표지의 가수분해를 표적 핵산에 혼성화하지 않은 동일한 프로브에 동일한 방식으로 커플링된 동일한 표지의 가수분해에 비교했을 때의 비율을 측정하는 일반화된 과정이다.
표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화는 다음과 같이 이루어진다. 시험할 각 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브에 대해 다음 시약을 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에서 합친다: 0.05－0.1pmol의 AE－표지된 프로브를 함유한 PSB의 용액 15μl (계산된 총 RLU 포텐샬이 약 4－5 ×106), 표적 뉴클레오티드 서열 0.5－1.0 pmol 당량 (예, 표적 뉴클레오티드 서열이 두 개씩 있는 핵산 0.25－0.5 pmol), 및 표적 핵산에 대한 프로브의 혼성화를 돕기 위한 임의의 희망하는 헬퍼 프로브 각각 5－10 pmol. 헬퍼 올리고뉴클레오티드로도 불리는 헬퍼 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 있는 표적 핵산의 이차 구조를 붕괴시킴으로써 혼성화 속도를 증가시키기 위해 사용되는 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드이다 (본 출원과 소유권이 공통되며 본 명세서에 참고로 포함시키는 호간(Hogan) 등의 미국 특허 제5,030,557호 참조). 그러나, 헬퍼 프로브의 사용이 본 발명의 작옹에 핵심적인 것은 아니다.
마이크로원심분리 튜브에 2 x 혼성화 완충액 (200 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.2), 17% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 3 mM EDTA 및 3mM EGTA([에틸렌비스(옥시에틸레니트릴로)]－테트라아세트산)) 15 μl를 또한 가하였다. 튜브를 프로브:표적 이중가닥의 Tm보다 약 5℃ 이상 아래인 온도에서 30 분 이상 인큐베이션한 다음 1 x 혼성화 완충액 270 μl를 가하였다. 각 화학발광성 표지:프로브 조합에 대해 별개의 튜브를 준비해야 하는데, 각 세트 중 한 튜브 ("하이브리드"로 표시)는 표지된 프로브, 표적 핵산 및 시약을 함유해야 하고 또다른 튜브 ("대조"로 표시)는 표적 핵산 없이 동일한 프로브 및 시약으로 만들어져야 한다. 최종적으로, 각 실험에 대해 표지된 프로브 또는 표적 핵산이 없이 혼성화 시약을 사용하여 내용이 같은 튜브로 된 "블랭크" 세트를 만들어야 한다.
각 튜브의 10 μl 분주량을 12 x 75 mm 폴리스티렌 튜브에 피펫으로 옮겨넣었으며 이러한 튜브의 수는 분석할 시점의 수에 위에 설명한 바와 같이 T0측정을 위한 세 튜브를 더한 것과 같았다.
세 개의 T0복제 튜브에 0.4 N HCl, 0.1 부피% H2O2200 μl를 넣고 이어서 가수분해 완충액 100 μl를 가하였다. 다음으로 1 N NaOH의 일회 주입을 이용해 5초의 기간 동안 튜브들을 광도계에서 판독하였다. 10 μl의 PSB만을 함유한 시약 "블랭크" 대조물을 3 내지 6 튜브의 세트로 제조하고 T0대조물과 동일한 방식으로 처리하였다.
"하이브리드" 및 "대조" 튜브들에도 가수분해 완충액 100 μl를 넣고, 혼합하고, 원하는 온도, 예를 들면 60℃의 순환 수조에 넣었다. 타이머를 켰다.
원하는 시점에서, 각 세트 중 한 튜브에 0.4 N HCl, 0.1 부피% H2O2200 μl를 넣고 수조에서 커낸 후 혼합하였다. 튜브들을 실온에 1 분 이상 정치하였다.
각 튜브 세트에서 얻는 시점 시료의 화학발광을 1 N NaOH 주입을 이용하여 광도계에서 측정하였다. 방출된 광을 5초 동안 측정하였다.
데이터를 위에 설명한 바와 같이 분석하였다. 분으로 표시한 반감기 (T1/2)로 표현되는 하이브리드 가수분해 속도를 대조 가수분해 속도로 나누어 차별적 가수분해 (DH) 비율을 얻었다. 그 결과를 아래 표 2에 요약하였다.
[표 2]
표 1에 제시된 데이터로부터 그 구성원이 동일 튜브 중의 2종 이상의 분석물의 동시 검출을 위한 표지화 시약으로 사용되기에 충분히 구별되는 화학발광 성질을 갖는 화합물 세트를 선별할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 놀랍게도, 표 2에 나타난 바와 같이 본 출원인은 이들 세트의 일부는 비슷한 가수분해 특성을 가진 구성원 화합물을 함유하기도 한다는 것, 즉 혼성화한 AE 표지가 혼성화하지 않은 표지에 비교할 때 가수분해로부터 우선적으로 보호될 뿐만 아니라 특정한 잠재적인 세트 내에서 구성원들의 가수분해 속도가 실질적으로 비슷하다는 것을 발견하였다. 제2(a)도 및 제2(b)도는 이러한 구성원 화합물 쌍으로 이루어진 세트의 예를 나열하고 있다. 여기에 언급된 예는 본 발명을 이들 실시태양으로 한정하려는 것은 전혀 아니다. 이들 도면이 합쳐진 표지화 시약쌍으로서 AE 유도체의 잠재적인 적용가능성을 설명하기는 하지만 이들 도면 및 본 명세서에 열거된 선별 기준을 이용하여 둘보다 많은 구성원 화합물로 된 세트를 설계할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 더구나, 특정한 구성원 화합물들이 함께 한 세트로 분류된다는 사실이 어떤 방식으로도 이것이 이들 특정한 화합물의 최적 또는 유일한 조합이라거나 다른 화합물들은 표시된 바와 같은 작용을 하지 못할 것이라는 의미로 여겨져서는 안 된다. 본 발명은 오로지 청구의 범위에 의해서 한정된다. 제2(a)도 및 2(b)도에 열거된 아크리디늄 에스테르 세트는 본 발명의 적어도 한 방식에 사용하기 위한 후보이다.
실시예 3: 방식 1: 일정 pH, 동시 반응 개시
본 발명에 따라 한 개의 시료 튜브 중의 두 가지 이상의 핵산 분석물을 검출하기 위해 표지화 시약의 화학발광성 시그널을 사용하는 방식은 몇 가지 있다. 이 실시예 및 이어지는 실시예는 이러한 방식을 설명하는 것이다. 그러나, 이들 실시예를 통해 본 출원인은 가능한 분석 방식의 수 또는 내용, 또는 본 발명에 사용하기 위한 표지화 시약의 조성 또는 조합을 제한하려는 것은 아니다.
첫 번째 실험은 표적 핵산이 없는 가운데 단일 단락 올리고뉴클레오티드에 커플링된 AE 표지화 시약의 화학발광 특성을 시험하였다. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 대장균 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)에서 유래한 RNA 표적에 상보적이 되도록 설계하였다. 올리고뉴클레오티드를 위에 설명된 바와 같이 표지하였는데, o－diBr－AE 유도체는 대장균 표적 RNA에 특이적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드에 커플링시킨 반면 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물은 클라미디아 트라코마티스 표적 RNA에 특이적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드를 표지하는 데 사용하였다. 표지된 올리고뉴클레오티드를 10 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.0) 및 0.1% (w/v) 리튬 라우딜 술페이트에 희석시켜 그 결과 얻어진 용액 10 μl가 약 200,000 RLU (대략 0.002 pmol)의 각 올리고뉴클레오티드를 함유하도록 하였다. 별개의 튜브에서 각 올리고뉴클레오티드 10μl를 10 μl의 동일한 희석 완충액과 합치고, 그 밖에도 각 표지된 올리고뉴클레오티드 10 μl를 한 개의 튜브에 모았다. 0.1 N HCl, 0.1% H2O2를 함유한 용액 200 μl를 튜브에 넣고, 이어서 0.19 M NaB4O7(pH 7.6) 및 5% (v/v) TRITON X－100을 함유한 용액 100 μl를 가하였다. 얻어진 용액을 LEADER 50 광도계에 넣고, 시료 용액에 1N NaOH 200 μl를 주입한 후 여러 가지 간격으로 화학발광을 측정하였다. 실험하는 동안 광도계는 "동력학 분석" 모드에 두었는데, 이에 따라 화학발광 반응의 개시 후 소정의 시간 간격으로 RLU 데이터점을 수집할 수 있었다.
다른 한 실험에서, 동일한 표지된 올리고뉴클레오티드를 앞서 본 명세서에 참고로 포함시킨 넬슨 등의 상게서에 기재된 바와 같이 각각 그들의 개별 표적 RNA 과량과 혼성화시켰다. 혼성화는 반응 부피를 50 μl로 하여 행하였으며 55℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 혼성화를 위한 최종 용액은 100 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.2), 8.5% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 1.5mM EDTA 및 1.5mM EGTA를 함유하였다. 각각의 개별 프로브:표적 혼성화 혼합물 단독, 또는 두 가지 혼성화 혼합물의 조합을 50 μl 함유한 튜브에 5.0% (v/v) TRITON X－100 중의 0.19 M 소듐 테트라보레이트 (pH 7.6) 150 μl를 가하였다. 각 표지된 올리고뉴클레오티드의 최종량은 각 실험 튜브에 약 0.002 pmol이었다. 시료를 LEADER 50 광도계에 넣고, 1 mM HNO3중의 0.1% (v/v) H2O2200 μl에 이어 0.1 내지 2 초가 지난 후에 1 N NaOH 200 μl를 자동 주입시켜 화학발광을 개시시켰다. 다양한 시간동안 화학발광을 측정하였다. 여기서도, 실험하는 동안 광도계는 "동력학 분석" 모드에 두었는데, 이에 따라 화학발광 반응의 개시 후 소정의 시간 간격으로 RLU 데이터점을 수집할 수 있었다.
혼성화하지 않은 표지된 올리고뉴클레오티드에 대해 모아진 데이터를 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
이 실험에서 화학발광은 0.04 초 간격으로 판독하면서 총 2 초 동안 측정하였다. 결과는 o－diBr－AE 표지가 화학발광 반응의 개시 후 매우 신속히 일어나는 예리한 광 방출 피크를 가진다는 것을 보여준다. 상기 조건 하에서의 광 방출의 피크는 구간 4에서, 즉 개시 후 약 0.16초에서이며 그 다음에는 시그널이 급격히 감쇠한다. 이와 대조적으로, 1－ 및 3－Me－AE 유도체의 혼합물에 의해 방출된 광은 약 구간 8 (개시 후 0.32초)에서 절정을 이루고 그 이후로 서서히 감쇠한다. 또한, 이후의 구간 (구간 14－50, 특히 구간 41－50)에서는 o－diBr－AE 유도체로부터의 시그널은 거의 0인 반면 1－ 및 3－Me－AE 유도체의 혼합물로부터의 시그널은 여전히 배경보다 유의하게 크다. 두 가지 표지 모두를 함유한 시료에서 얻어진 데이터는 각 지점에서 두 개의 개별 데이터 집합의 합에 근사한 값이다.
두 표지된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 시료에 관련된 실험에서 얻어진 데이터를 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
시간 간격은 표 3에서와 동일하였다. 이번 경우, 두 표지의 방출 특성 사이의 차이는 앞의 실험에서보다 훨씬 더 명확히 구별할 수 있었다. 즉, 대장균에 혼성화한 o－diBr－AE의 피크는 여기서도 약 구간 4에서 발생하고, 클라미디아 트라코마티스에 혼성화한 1－Me－AE에 대한 피크는 대략 구간 14에 있다. 여기서도, 나중에 있는 구간 (특히 구간 41－50)에서 o－diBr－AE 유도체에서 얻어지는 시그널은 거의 사라졌으나 1－Me－AE 유도체에서 나오는 시거널은 여전히 유의하였다. 여기서도 두 가지 혼성화한 표지의 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 함유한 시료의 프로필은 각 지점에서 두 개의 개별 시료 프로필의 합에 근사한 값이다.
상기 데이터는 본 발명의 방법 및 조성물의 한 방식의 적용성 및 활용성을 증명한다. 이 실시예에 열거된 바와 같은 특정한 AE 유도체로 표지된 두 가지 상이한 올리고뉴클레오티드를 함유한 단일 시험관에서 얻어진 시그널은 명확히 두 성분으로 만들어지는데, 하나는 신속히 반응하고, 신속히 감쇠하는 화학종 (예, o－diBr－AE)이 기여하는 부분이고, 다른 하나는 반응 및 감쇠가 더 느린 화학종 (예, 1－ 및 3－ Me－AE 혼합물)이 기여하는 것이다. 분석을 위해 두 개의 검출 시구간, 즉 신속 반응 화학종과 연결된 분석물의 검출을 위한 빠른 것 하나 (예, 구간 1－6; 0.04－0.24초)와 지연 반응 화학종과 연결된 분석물의 검출을 위한 늦은 것 하나 (예, 구간 41－50: 1.64－2.0초)를 설계함으로써 본 발명의 방법 및 시약은 단일 시료 중의 상이한 핵산 서열의 거의 동시적인 검출을 허용한다.
이번 실험에서 얻어진 원 데이터를 다음과 같은 반복적 데이터 분석법을 사용하여 후속 처리하였다. 표지된 프로브 하나만을 함유한 시료를 데이터 분석의 표준으로 사용하였다. 각 표준에 대해, 구간 1－10에서 얻어진 RLU 값의 합계와 구간 41－50에서 얻어진 RLU 값의 합계 사이의 비율을 산출하였는데 (Σ RLU 41－50/Σ RLU 1－10); o－diBr－AE의 경우 이 비율을 0.00267이고 1－Me－AE의 경우 이 비율은 0.645였다. 구간 41－50에서 측정된 화학발광 시그널 (RLU로 표시)을 함께 합한 다음, 1－ 및 3－ Me－AE 표준에 대해 얻어진 비율인 0.645로 나누었다. 여기서 얻어진 수가 1－ 및 3－ Me－AE 표지된 프로브가 구간 1－10에서 기여한 RLU의 양이다. 이 양을 구간 1－10에서의 총 RLU에서 빼면 이 구간에서 o－diBr－AE이 기여한 RLU의 양이 나온다. 이 수자를 0.00267 (o－diBr－AE 경우의 비율)로 곱하면 o－diBr－AE 표지된 프로브가 기여한 구간 41－50에서의 RLU를 얻게 된다. 이 수치를 구간 41－50에서의 총 RLU에서 빼면, 이 구간에서 1－Me－AE가 기여한 RLU에 대한 보정된 값이 얻어진다. 이 수치를 사용하여 구간 41－50에서 o－diBr－AE가 기여한 RLU가 선택된 유효 숫자 범위 내에서 변하지 않을 때까지 위에 설명한 계산을 반복한다. 표 5의 원 데이터에 적용한 경우의 이 방법의 예시를 아래에 나타내었다.
[표 5]
개인용 컴퓨터를 이 계산을 수행하도록 프로그래밍하였다. 원 데이터를 광도계에서 기기의 RS－232 포트를 이용하여 컴퓨터로 직접 공급하였으며, 데이터는 위에 설명한 대로 처리되었다. 위의 분석에 사용된 간격은 선택된 표지화 시약에 따라 다를 수 있으며, 앞서 또는 이하의 실시에에서 예시된 특정한 간격을 사용하는 것이 강제적인 것은 아니다. 또한 이 실시예에 개시된 데이터 분석 방법은 두 가지 화학발광성 화합물을 사용한 실험에서 얻어진 데이터에 대해 행해졌으나 이들 동일한 방법이 각 화합물의 반응 특성이 다른 것들과 충분히 상이하다고 할 때 세 가지 이상의 그러한 화합물에서 얻어진 데이터를 처리하는 데 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 4: 방식 2: 상이한 pH 값에서의 순차적 반응
본 발명의 시약 및 방법은 다른 한 방식에서는 상이한 pH 값에서 화학발광 반응을 개시함으로써 시료중에 있는 2종 이상의 분석물을 검출 및 측정하는 데 사용할 수도 있다. 첫 번째 pH에서는, 적절한 완충액에 든 과산화나트륨 및 염기의 첨가에 의해서 등으로 화학발광 반응을 개시하여 표지화 시약 중 한 가지 이상은 측정할 수 있는 광을 방출하는 반면 한 가지 이상의 또다른 표지화 시약은 그 pH에서 인식할 만한 정도까지 반응하지 않도록 할 수 있다. 첫 번째 pH에서 방출된 광의 양은 광도계에서 측정할 수 있다. 또한, 방출된 광은 어떤 기간의 시간에 걸쳐 측정할 수 있으며, 이 시구간은 반응의 동력학적 분석을 위해 위에 설명한 대로 구간으로 분할할 수 있다. 주어진 pH에서 측정한 후에, 시험 용액의 pH는 한 가지 이상의 다른 화학발광성 표지화 시약이 반응할 수 있는 값으로 조정될 수 있다.
여기에 제시된 데이터가 두 AE 유도체를 사용하여 본 발명의 이 방식을 설명하고 있으나, 이 개시 내용에 비추어 본 발명의 방법에 세 가지 이상의 pH 값을 사용할 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 또한, 이 개시 내용에 비추어 본 명세서에 설명된 각종 방식의 특징들을 단일 분석 시스템에서 결합할 수 있다는 것 역시 당업자에게는 명백할 것이다. 예를 들면, 본 실시에에 설명된 "다중 pH" 방식의 각 pH 값에서, 동력학적으로 구별되는 표지 세트를 앞서의 실시예에 따른 방식으로 검출할 수도 있다. 이러한 시스템은 따라서 동일한 시료 튜브에서 세 가지 이상의 분석물의 검출을 가능하게 할 것이다. 명시적으로 언급되지 않은 다른 조합들 역시 당업자에게는 자명할 것이다. 모든 이러한 조합은 본 명세서에서 명시적으로 언급되었는지 여부에 관계없이 본 발명의 범위에 속하는 것으로 보아야 한다.
각각이 화학발광 반응을 위한 최적 pH가 상이한 AE 유도체로 표지된 두 올리고뉴클레오티드를 10 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.0) 및 0.1% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트를 함유한 용액에 하나로 희석시켰다. 클라미디아 트라코마티스 16S rRNA에 특이적인 첫 번째 올리고뉴클레오티드는 링커 암을 통해 표준 AE에 커플링시켰다. 클라미디아 트라코마티스 23S rRNA에 특이적인 두 번째 올리고뉴클레오티드는 링커 암을 통해 o－F－AE에 커플링시켰다. 각 올리고뉴클레오티드 10 μl (dir 0.002 pmol)를 별개의 튜브에서 동일한 희석 완충액 10 μl와 합하고, 그 밖에도 각 표지된 올리고뉴클레오티드 10 μl를 한 개의 튜브에 합하였다. 각 튜브에 0.4 N HCl 40 μl, 물 60 μl 및 1.0mM HNO3및 0.1% H2O2를 함유한 용액 200 μl를 가하였다. 튜브를 LEADER 50 광도계 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 Gen－Probe Incorporated)에 넣고, 0.24 M 붕산 (NaOH를 사용하여 pH 12.9로 조정된 것)의 자동 주입으로 화학발광을 측정하였다. 이 시점에서 용액의 대략적인 pH는 12.1이었다. 화학발광을 8 초 동안 측정한 다음 0.75 N NaOH 200 μl를 다시 자동 주입하여 대략적인 최종 pH를 13.0으로하였다. 여기서 일어나는 화학발광을 10초 동안 측정하였다. 화학발광의 측정시 데이터는 0.1 초 간격으로 수집하였으며, 즉시 IBM 호환 PC 컴퓨터로 보내어졌다. 그 다음 데이터를 RLU 대 시간 (구간 번호)의 그래프로 만들었다.
그 결과를 제3도에 나타내었다. 이들 데이터는 올리고뉴클레오티드에 커플링된 두 가지 이상의 화학발광성 표지화 시약은 반응을 위한 그들의 최적 pH를 근거로 하여 선택된 이러한 표지화 시약 세트의 구성원으로서 검출될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 5: 균질 분석 형식에서 클라미디아 트라코마티스 및 네이세리아 고노로애(Neisseria gonorrgoeae) 핵산의 동시적 검출
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 기지량의 표적 핵산을 탄 단일 시료에서 클라미디아 트라코마티스 (Ctr) 및 네이세리아 고노로애(Ngo)에서 유래한 핵산의 존재를 동시적으로 검출하였다. 이 실시예에서는, 표지된 분석물/프로브 합체의 형성, 선별, 및 검출을 액상에서만 진행하였다.
편의상, Ctr 및 Ngo－특이적 프로브는 Gen－Probe에서 시판하는 PACE 2 분석법 (Gen－Probe Incorporated)에 사용되는 것들로 하였다. 시판되는 분석법에서는 Ctr 및 Ngo 프로브는 각각 표준 AE (제1도 참조)로 표지되고 개별적으로 분석된다. 이와 대조적으로, 본 명세서에 설명된 실시예에서는 시판되는 Ctr 프로브를 1－ 및 3－ Me－AE로 표지된 동일한 프로브로 대체하였으며, 표준 Nho 프로브는 1－ 및 3－ Me－m－diF－AE의 혼합물로 표지된 동일한 프로브로 대체하였다. 또한, 시판되는 PACE 2 분석법에서와 같이, 표지된 프로브를, 형성된 하이브리드 핵산의 혼성화 속도 및 안정성을 촉진하도록 고안된 다른 표지되지 않은 헬퍼 프로브와의 "프로브 믹스"에 함께 사용하였다. 헬퍼 프로브의 사용은 상기 및 미국 특허 제5,030,557호에 설명되어 있다. 위에 논의된 바와 같이, 헬퍼 프로브는 특정한 표지된 혼성화 프로브의 사용과 함께 필요할 수도 있으나, 본 발명의 실시에 필수적인 것은 아니다. 또한, 위에 논의된 바와 같이, 본 발명은 핵산 분석물 또는 혼성화 분석 프로브의 특정한 뉴클레오티드 서열에 의존하지 않으며, 따라서 이들 실시예에 사용된 구체적 올리고뉴클레오티드 프로브는 본 발명의 핵심적인 특징은 아니다. 본 발명의 방법 및 조성물은 상호 배타적인 안정한 이중가닥 하이브리드를 형성하는 두 가지 이상의 핵산 분석물/혼성화 프로브쌍의 어떤 세트와도 사용될 수 있다.
시료는 3% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 30 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.8), 1mM EDTA, 1mM EGTA를 함유한 용액에 상이한 양의 Ctr 및 Ngo 리보솜 RNA 표적을 가하여 최종 부피를 50 μl로 함으로써 분석할 준비를 하였다. 프로브 시약은 200 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.1), 17% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 3mM EDTA, 3mM EGTA를 함유한 용액에서 1－Me－AE 표지된 Ctr 프로브를 1－Me－m－diF－AE 표지된 Ngo 프로브와 합하는 것으로 제조하였다. AE 유도체 각각으로 표지된 프로브의 총량은 약 0.2 pmol이었다.
각 혼성화 반응 혼합물을 표적 핵산 50 μl (또는 대조 실험에서는 표적 없음)와 프로브 시약 50 μl를 함유하였다. 각 반응 혼합물을 55℃에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 0.15 M 소듐 테트라보레이트 (pH 8.5), 2% (v/v) TRITON X－100 300 μl를 각 시료에 가하고, 시료를 55℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 각 시료의 화학발광은 LEADER 50 광도계에서 0.1% H2021mM HNO3를 함유한 용액 200 μl를 주입하고, 2 초가 흐른 후에 다시 한 번 1 N NaOH, 2% (w/v) Zwittergent3－14 (N－테트라데실－N,N－디메틸－3－암모니오－1－프로판－술포네이트; Zwittergent는 미국 캘리포니아주 라졸라 소재 CalBiochem사의 등록 상표임)를 주입하여 측정하였다. 각 시료의 화학발광은 광도계의 동력학 모드를 이용하고 0.04 초 간격으로 2 초 동안 계측하였다. 데이터는 광도계에서 개인용 컴퓨터로 직접 전송되고 상기 실시예 3에 설명된 것과 유사한 계산법을 사용하여 분석되었다. 이들 계산에 사용된 시간 구간은 구간 1－6 및 41－50이었다. 각각의 상이한 표지에 대한 두 개의 표준값을 평균하였는데, 프로프 또는 표적 핵산을 전혀 함유하지 않은 두 개의 블랭크 시료도 마찬가지였다. 각 시간 구간에서 평균을 낸 블랭크 표준의 경우 에 얻어진 RLU 값을 해당 구간에서 계산 전에 모든 다른 시료의 경우에 얻어진 RLU 값에서 빼었다. 각 시료는 중복 실험하였으며, 표시된 값은 두 개의 중복된 반응 혼합물의 평균이다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
이들 데이터는 본 발명의 다중 분석물 방법 및 시약을 사용하여 적어도 두 분석물 (이 실시예에서는 Ctr과 Ngo 리보솜 RNA)을 단독으로, 또는 한 시료에서 함께 동정할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 6: 혼합 균질/이질 분석 형식에서 클라미디아 트라코마티스 및 네이세리아 고노로애 핵산의 동시적 검출
본 발명의 방법을 다시 사용하여 "순계(pure system)" (즉, 임상 검체가 존재하지 않음)에서 Ctr 및 Ngo의 존재를 동시에 검출하였는데, 이번에는 혼합 균질/이질 분석 시스템에서였다. 이 실시예에 사용된 분석법은 여기에 설명된 대로 변경한 PACE 2 형식 (Gen－Probe Incorporated에서 시판됨)이었다. 이 분석에 사용된 프로브는 실시예 5에 사용된 것들과 동일하였으며 헬퍼 프로브와의 프로브 믹스로 사용하였다.
분석을 위해, 상이한 양의 Ngo 또는 Ctr 리보솜 RNA, 또는 둘 모두를 각 튜브에 넣는데, 표적의 양은 0과 12.5 fmol 사이에서 다르게 하였다. 각 표적 핵산 희석물의 최종 부피는 100μl인데, 부피의 차이는 30mM, 1 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.8), 3% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA로 된 용액으로 보충하였다. 프로브 시약은 1－Me－AE 프로브 믹스와 1－Me－m－diF－AE 프로브 믹스를 등량 혼합하여 제조하였으며, 앞서의 실험에서와 같이 프로브 시약에는 헬퍼프로브도 함유되었다. 프로브 믹스는 190 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.1), 17% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 3 mM EDTA, 3mM EGTA를 함유하였으며, 이것 100 μl를 표적 핵산 희석물에 가햐어 최종 부피가 200 μl가 되게 하였다. 튜브를 흔들어 혼합하고 60℃에서 90 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 수조에서 꺼내고 50 μl의 0.02% (w/v) 소듐 아지드 중의 Biomag 4100 자성 입자 (매사추세츠주 캠브리지 소재 PerSeptive Biosystems) 1.25% (w/v) 현탁액과 1 mM EDTA를 함유한 190 mM 소듐 테트라보레이트 (pH 7.6), 6.89% (v/v) TRITON X－102 및 0.01% (w/v) 젤라틴의 용액 1 ml를 가하였다. 튜브를 60℃에서 추가로 10분 동안 인큐베이션한 다음 수조에서 꺼내고, 랙을 즉시 자기 분리대에 놓고 실온에서 5 분 동안 정시킨 다음 용액을 기울여 따라 결합하지 않은 프로브를 자성 비이드에 결합한 혼성화한 프로브로부터 분리하였다. 본 발명과 소유권이 공통되고 본 명세서에 참고로 포함시키는 아놀드 등의 유럽 특허 공개 제281390호 참조. 비이드와 흡착된 혼성화한 프로브를 20 mM 소듐 테트라보레이트 (pH 10.4), 0.1% (w/v) Zwittergent3－14의 용액에 한 번 세척한 다음 5% (v/v) TRITON X－100 300 ml에 재현탁시켰다.
다음으로 각 시료를 LEADER 50 광도계에 넣었다. 화학발광 반응은 0.1% H2O2, 1 mM HNO3를 함유한 용액 200 ml를 주입하고, 2 초가 흐른 후에 다시 한번 0.7 N NaOH, 0.5% (v/v) Zwittergent3－14를 함유한 용액 200 ml를 주입하여 개시하였다. 각 시료의 화학발광은 광도계의 동력학 모드를 이용하고 0.04초 간격으로 2초 동안 계측하였다. 데이터는 광도계에서 개인용 컴퓨터로 직접 전송하고 상기 실시예 3에 설명된 것과 유사한 계산법을 사용하여 분석되었다. 이들 계산에 사용된 시간 창은 구간 1－7 및 34－50이었다. 각각의 상이한 표지에 대한 두 개의 표준값을 평균하였는데 (Ngo 대조용으로는 5 fmol의 리보솜 RNA, 그리고 Ctr 대조용으로는 1.5 fmol의 리보솜 RNA를 사용), 프로브 또는 표적 핵산을 전혀 함유하지 않은 두 개의 블랭크 시료도 마찬가지였다. 각 시간 구간에서 평균을 낸 블랭크 표준의 경우에 얻어진 RLU 값을 해당 구간에서 계산 전에 모든 다른 시료의 경우에 얻어진 RLU 값에서 빼었다. 각 시료는 중복 실험하였으며, 표시된 값은 두 개의 중복된 반응 혼합물의 평균이다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
[표 7]
이들 데이터는 본 발명의 조성물 및 방법을 사용함으로써 2종 이상의 분석물(이 실시예에서는 Ctr과 Ngo 리보솜 RNA)을 단독으로, 또는 동일한 시료 튜브에 모아서 명확히 동정할 수 있다는 것을 증명한다. 또한, 본 발명의 표지화 시약을 함유한 프로브를 동일한 시료 튜브에 합치면, 본 발명을 이용한 2종 이상의 분석물의 거의 동시적인 동정에는 이 동일한 시료 부피가 충분하다. 이렇게 되면 남을 수 있는 시료를 다른 목적 (예, 다른 분석)을 위해 절약할 수 있고, 그에 따라 주어진 부피의 시료를 사용하여 행할 수 있는 분석의 수가 증가한다. 또한, 위에 열거된 데이터는 본 발명의 이 실시태양에 따라 행해진 분석이 높은 감도를 가져, 이 실험에서 감도 한계가 Ngo에 대해서는 0.125 fmol 이상이고 Ctr에 대해서는 0.035 fmol 이상이다. 그러나, 이 실시예에 이 데이터를 제시함으로써 본 출원인이 이것이 임의의 실험 조건의 조합 하에서 얻을 수 있는 감도의 하한선이라는 것을 의미하려는 것은 아니다.
실시예 7: 임상 표본에서 클라미디아 트라코마티스 및 네이세리아 고노로애 리보솜 RNA의 동시적 검출
본 발명의 방법 및 시약을 사용하여 임상 표본에서 Ctr 및 Ngo 리보솜 RNA의 존재를 동시에 검출하였다. 분석 형식은 다음 차이를 제외하면 실시예 6에 사용된 것과 동일하였다.
각 시료는 원하는 양의 리보솜 RNA를 경부내 면봉채집 임상 표본을 모은것 100 μl에 가하여 제조하였으며, 각 면봉채집물은 원래 Gen－Probe PACE 2 전달배지 (Gen－Probe Incorporated의 STD Transport Kit의 구성요소로 입수할 수 있음) 1 ml에 현탁시켰던 것이다. 이들 표본은 사전에 Ctr 및 Ngo에 대해 음성인 것으로 검사되었다. 원래의 임상 시료가 Ctr 또는 Ngo 세포를 함유했다면, 이들 세포를 용해시키고 그 핵산 (리보솜 RNA 포함)을 전달 배지의 구성분의 작용에 의해 용액 내로 방출시켰을 것이다.
혼성화는 실시예 5에서와 같이 수행되었으나 2.5 시간으로 연장되었다. 혼성화에 뒤이어, 다음 변경 사항을 제외하고는 실시예 6에 설명된 대로 화학발광을 측정하였다. 0.7 N NaOH, 0.5% (v/v) Zwittergent3－14를 0.5 N NaOH, 0.5% (v/v) Zwittergent3－14로 대체하고, Ngo 및 Ctr 리보솜 RNA 표준은 각각 1.25 fmol 및 0.35 fmol이었고, 시간 창을 위해 선택된 구간은 구간 1－5 및 41－50이었다. 분석 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
[표 8]
이들 데이터는 단일 시료 중의 2종 이상의 분석물의 검출 및 정량화를 허용하는 본 발명의 방법 및 시약의 능력이 임상 표본 모음에 존재하는 물질에 의해 무력해지지 않음을 증명한다.
실시예 8: HIV DNA의 gag 및 pol 영역의 검출
본 발명의 방법을 사용하여 사람 면역결핍증 바이러스 (HIV) 게놈의 gag 및 pol 영역을 동시에 검출하였다. HIV의 동정에 있어서 본 발명의 다중 분석물 검출 특징의 이점은 두 개의 동시적인 잘못된 양성 분석 지시가 동일한 분석에서 일어날 가능성이 더 작기 때문에 HIV 게놈의 두 번째 영역 (gag 또는 pol)의 존재의 검출을 진단 분석에서 바이러스의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있다는 것이다. 또한, 동일한 핵산 분석물에 있는 둘 이상의 구별되는 뉴클레오티드 서열의 검출은 한 표적 뉴클레오티드 서열이 변동 또는 변이된 경우에서 바이러스 또는 세포의 검출을 보장하는 데 도움이 될 수 있다.
이 실시예에서, gag 및 pol 영역 모두를 함유하는 HIV 게놈 영역을 아래 설명한 바와 같이 먼저 증폭시켰다. 그 다음 혼성화 보호 분석(HPA) 형석에서 gag 및 pol 뉴클레오티드 서열 영역을 본 발명의 방법 및 시약을 사용하여 동시에 검출하였다.
HIV－1 게놈의 gag 및 pol 영역에 상보적인 프로브를 합성하였다. 역시 위에 설명된 바와 같이, 합성 과정에서 올리고뉴클레오티드의 일부로 도입된 비뉴클레오티드 링커 암을 사용하여 표지를 프로브에 연결시켜서 gag－특이적 프로브 (SEQ. ID. NO: 11)를 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물로 표지하고 pol－특이적 프로브 (SEQ. ID. NO: 5)를 o－diBr－AE로 표지하였다. 두 표적 서열 영역을 모두 함유한 클로닝된 HIV－1 DNA 단편을 케이시안(Kacia) 등의 국제 특허 공개 제91/01384호에 설명 된 바와 같이 100 μl 부피에서 증폭시켰다. pol 영역을 증폭시키는 데 사용된 증폭 프라이머는 뉴클레오티드 서열이 SEQ. ID. NO:1 내지 4였다. 프로브 및 gag 영역을 증폭시키는 데 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 SEQ. ID. NO:5 내지 10이다.
HIV－1 DNA의 증폭에 뒤이어, 0.2 M 리튬 숙시네이트 (pH 5.1), 17% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA 중에 5.5 fmol의 1－Me－AE 표지된 gag 프로브 및 16 fmol의 o－diBr－AE 표지된 pol 프로브를 함유한 용액 100 μl를 증폭 반응 혼합물에 가하여 프로브를 gag 및 pol 표적 핵산 영역에 혼성화 시켰다. SEQ. ID. NO:6의 표지되지 않은 헬퍼 올리고뉴클레오티드 역시 pol 표적 영역의 증폭을 보조하는 데 사용하였다. 반응 혼합물을 이어서 60℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 혼성화하지 않은 프로브 상의 아크리디늄 유도체의 가수분해는 0.13 M Na2B4O7(pH 7.6), 2% (v/v) TRITON X－100 및 13 mM 요오도아세트산의 용액 300 μl를 가하고 혼합물을 60℃에서 20 분 동안 인큐베이션함으로써 이루어졌다. 이 pH에서 요오도아세트산은 화학발광 반응에서 반응성이 없는 아크리디늄 에스테르 부착물의 형성을 방지하기 위해 반응 혼합물에 첨가하였다.
화학발광은 LEADER 50 광도계에서 측정하였다. 각 시료를 광도계에 넣고, 0.1% H2O2, 1 mM HNO3를 함유한 용액 200 μl를 주입하고, 2 초가 흐른 후에 1.5 N NaOH를 자동 주입하여 화학발광 반응을 개시하였다. 각 시료의 화학발광은 광도계의 동력학 모드를 이용하고 0.04초 간격으로 2 초 동안 계측하였다. 데이터는 광도계에서 개인용 컴퓨터로 직접 전송되었고, 원 데이타는 상기 실시예 3에 설명된 것과 유사한 계산법을 사용하여 분석되었다. 이들 계산에 사용된 시간 구간은 구간 1－6 및 41－50이었다. 이번 경우에, 각각의 표지에 대한 두 개의 표준 (gag 단독이든 pol 단독이든 각 표적의 뉴클레오티드 서열을 함유한 정제된 핵산으로 이루어짐) 및 다른 시료와 동일하게 처리되지만 표적 핵산 또는 프로브를 전혀 함유하지 않은 두 개의 음성 대조물을 사용하였다. 두 개의 중복된 표준 시료에서 얻어진 데이터를 평균하고, 모든 시료는 위에 설명한 대로 배경에 대해 보정하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 이 실험에서, 음성 분석 결과는 10,000 미만의 RLU를 나타낸다. gag 및 pol 표적 핵산 서열을 사용한 모든 실험에서 (상기한 대조용 제외), gag 및 pol 표적은 각 표적 핵산 분자에 한 번 함유되어 있다.
[표 9]
이 데이터는 본 발명의 방법이 HIV－1의 gag 및 pol 영역에 해당하는 서열을 가진 핵산의 존재를 동시에 검출할 수 있다는 것을 보여준다. 열거된 주형 핵산 개체의 수는 평균값이며, 물론 투입 주형 개체의 수는 정수이며 분수가 아니다. 실제로, 데이터는 일부 시료가, 주형 개체수 2.5 및 1.25에 해당하는 반응 세트 모두에서 얻어지는 10,000 미만의 RLU 값에서 알 수 있듯이 주형을 하나도 함유하지 않은 것을 보여준다. 핵산 증폭을 본 발명의 조성물 및 방법과 결합시킨 이 분석의 감도는 각 표적 핵산 서열 대략 1 내지 2 개체이다.
실시예 9: 임상 표본을 함유한 시료에서 HIV DNA의 gag 및 pol 영역의 검출
본 발명의 방법을 사용하여 사람 혈액 세포용해물 중에서 사람 면역결핍증 바이러스 (HIV)의 gag 및 pol 영역을 모두 동시에 검출하였다. 사전에 HIV 음성으로 밝혀진 전혈을 세포용해시키고, 백혈구를 수집하고, 세척한 후 라이더(Ryder)의 국제 특허 공개 제93/25710호에 기재된 대로 세포용해시켰다. 백혈구 용해물 50 μl를 각 실험 튜브레 사용하였다. HIV의 gag 및 pol 영역을 함유한 플라스미드 DNA (상기 실시예 8 참조)을 세포용해물에 가하고, 가해진 핵산을 증폭시키고, 혼성화시킨 다음 실시예 8에 설명된 대로 차별적 가수분해를 행하였다. 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
[표 10]
실시예 10: 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)
PCR은 당업계에 공지되고 일상적으로 사용되는 핵산 증폭 기술이며 (American Society for Microbiology, Diagnostic Molecular Biology:Principles and Applications 56－70 (1993) 등 참조), 뉴저지주 뉴틀리 소재 Hoffman－LaRoche, Inc. 가 소유 및 라이센스하는 특허 기술이다.
핵산의 PCR 증폭을 위한 일반적 절차는 샘브룩(Sambrook) 등의 상게서에 교시되어 있다. 이렇게 제공된 과정에서는 다음 내용물을 멸균 0.5 ml 마이크로원심분리 튜브에서 혼합한다: 멸균수 30 μl, 10 X 증폭 완충액 10 μl (10 X 증폭 완충액 = 500 mM KCl, 100 mM Tris－Cl (pH 8.3), 15 mM MgCl, 0.1% (w/v) 젤라틴), 1.25 mM 각 dNTP, 100 pmol 각 프라이머, 최대 2 μg의 주형 DNA, 및 최종 부피 100 μl까지의 물. 반응 혼합물을 94℃로 5 분 동안 가열하였다. Taq DNA 폴리머라아제 (Perkin－Elmer Corporation) 5 유닛/μl 제제 5 μl를 반응 혼합물에 가하였다. 다음에는 반응 혼합물에 가벼운 광유 100 μl를 가하고, 94℃에서 5 분 동안 인큐베이션하여 수소결합된 핵산을 변성시키고, 이어서 50℃에서 2 분 동안 인큐베이션하여 단일 가닥인 표적 핵산에 대한 프라이머의 어닐링을 허용한 후 72℃에서 3 분 동안 인큐베이션하여 프라이머를 연장시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 94℃ 1 분, 50℃ 2 분 및 72℃ 3 분으로 이 순서대로 20 사이클 순차적으로 인큐베이션하였다. 최종 사이클의 최종 단계에서 시료를 72℃에서 10 분 동안 인큐베이션한 다음 사용을 위해 －20℃에 보관하였다.
실시예 11: PCR 증폭에 뒤이은 HIV DNA의 gag 및 pol 영역의 검출
본 발명의 방법을 사용하여 HIV DNA의 gag 및 pol 영역 모두의 존재를 동시에 검출하였다. 이 실험에서는 검출에 앞서 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)을 이용해 바이러스 DNA를 증폭시켰다.
사용된 프로브는 실시예 8에 사용된 것과 동일하였다. HIV－1 DNA를 PCR을 이용해 증폭시켰는데, PCR로 pol 영역을 증폭시키는 데 사용된 프라이머쌍의 뉴클레오티드 서열은 SEQ. ID. NO:2 및 4이고, gag 영역을 증폭시키는 데 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 SEQ. ID. NO:7 및 10이었다.
증폭 후, 핵산 혼성화는 20 μl의 PCR 반응 혼합물과 80 μl의 물을 혼합한 다음 실시예 8에 설명된 프로브 혼합물 100 μl를 갛여 행하였다. 프로브 및 표적 핵산을 60℃에서 30 분 동안 함께 인큐베이션하였다. 차별적 가수분해, 화학발광의 측정 및 결과의 계산은 실시예 8에 설명된 대로 행하였다. 분석 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
[표 11]
이들 데이터는 본 발명의 다중 분석물 분석법이 HIV－1 서열이 PCR을 이용하여 증폭된 것일 때 HIV－1의 gag 및 pol 영역에 해당하는 서열을 가진 상이한 핵산 분자의 존재를 동시에 검출할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 12: 단일 시료 중의 3종 이상의 분석물의 동시적 검출
단일 시료 중의 3종 이상의 분석물의 검출의 용이성을 예시하기 위해 다음 실험을 수행하였다.
위에 개시된 대로 다음 AE 유도체를 개별적으로 커플링시켜 올리고뉴클레오티드 프로브를 분리하였다: diBr－AE, 2,7－diMe－AE, o－MeO(신나밀)－AE, o－Me－AE 및 o－diMe－AE. 표지 당 1.5 μl 부피에 든 각각의 지시된 커플링된 화학발광성 표지 대략 0.003 pmol을 하기 표 12에 나타낸 바와 같이 튜브에 가한 다음, 0.4 N HCl, 0.1% H2O2를 함유한 용액 200 μl를 가하였다. 각 튜브를 LEADER 50 광도계에 넣고, 1 N NaOH를 자동 주입한 다음 그 결과 방출된 광을 0.1 초 간격으로 10 초의 기간에 걸쳐 측정하였다.
[표 12]
이들 실험에서 얻어진 광 방출 프로필을 보여주는 그래프가 제4도에 나타나 있다. x축의 단위는 구간 번호로 주어지고, y축의 단위는 RLU로 주어지며, 방출 프로필은 한 개의 덧씌운 그래프에 나타내었다. 이 도면은 시료 중의 각 반응하는 화학발광성 화합물의 붕괴가 각각의 다른 반응하는 화학발광성 화합물과 충분히 상이하여 각 화합물을 다른 것들로부터 구별할 수 있다는 것을 명확히 보여준다. 예를 들면 튜브 1 (o－diBr－AE 및 2,7－diMe－AE)의 광 방출은 대략 구간 50 (5.0 초)에서 기선에 도달한다. 따라서 구간 46－100에서 방출된 광은 튜브 2, 3 및 4에 의해 방출된 것의 합이라고 간주할 수 있다. (튜브 1은 o－diBr－AE와 2,7－diMe－AE를 모두 함유하였는데, 당업계의 숙련자는 o－diBr－AE의 광 방출이 대략 구간 10에서 기선에 도달하므로 o－diBr－AE는 이 실험에 사용된 다른 AE 유도체들 및 특히 2,7－diMe－AE로부터, 이들 모든 화합물을 함유한 혼합물에서, 명확히 구별될 수 있다는 것을 숙지할 것이다). 마찬가지로, 튜브 2에 함유된 화학발광성 화합물 (o－diBr－AE, 2,7－diMe－AE 및 o－MeO(신나밀)－AE)에 의해 방출된 광은 약 구간 80(8.0 초)에서 기선에 도달하므로, 구간 69－100에서 방출된 광은 튜브 3 및 4에 함유된 화학발광성 화합물에 의해 방출된 광의 합이라고 간주할 수 있다. 마지막으로, 튜브 3 (o－diBr－AE, 2,7－diMe－AE, o－MeO(신나밀)－AE 및 o－Me－AE) 중의 화합물에 의해 방출된 광은 구간 100 이후의 어떤 점에서 기선에 도달한다. 이 도면에는 보이지 않지만, 이 늦은 시간에서 튜브 4의 성분들은 여전히 측정가능한 광을 방출하고 있다.
따라서, 각 튜브 중의 화합물에 의해 방출되는 광을 측정할 기간을 선별함으로써, 위의 실시예 3에 사용된 것과 유사한 반복적 평균법을 사용하여 각 화합물에 의해 방출되는 광을 구별하여 두 가지 화학발광성 표지를 구별할 수 있다. 이 실시예에 개시된 내용을 지침으로 하면, 당업계의 숙련자는 올리고뉴클레오티드 프로브에 커플링된 o－diBr－AE, 2,7－diMe－AE, o－MeO(신나밀)－AE, o－Me－AE 및 o－diMe－AE가 상기 반응 조건 하에서 구별될 수 있다고 합리적으로 기대할 것이다. 또한, 당업게의 숙련자는 이 능력이 프로브가 표적 핵산에 혼성화하였을 때에 무력해지지 않을 것이라고 합리적으로 기대할 것이다.
실시예 13: 다중 분석물 분석에서의 사용을 위한 다른 화학발광성 시약의 평가
다음의 프로브－커플링된 화학발광성 시약의 평가를, 방출된 광을 0.1초의 시간 간격으로 총 10초 동안 측정하고, 각 화학발광성 시약을 실시예 12에서와 같은 혼합물 중에서가 아니라 개별적으로 평가한 것을 제외하고는 앞서의 실시예에 설명된 바와 같이 행하였다. 제5도는 1) o－diBr－AE와 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물 조합, 2) 1)과 동일한 것 + o－AE, 3) 2)와 동일한 것 + o－Me－AE, 및 4) 3)과 동일한 것 + o－diMe－AE의 개별적으로 분석한 광 방출의 덧씌운 도면을 보여준다. 이 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, o－diBr－AE/1 및 3－Me－AE 혼합물은 신속히 반응하고, 다른 AE 유도체들이 여전히 광을 방출하는 시간인 대략 구간 40 이후에는 광을 거의 방출하지 않는다 o－AE는 약 구간 80 이후에는 광을 거의 방출하지 않는다. 이 도면이 o－Me－AE 유도체의 기선 분리를 보여주지는 않지만, 또다른 실험에서 이 유도체의 광 방출 감쇠가 나머지 AE－유도체, 즉 o－diMe－AE의 반응의 경우보다 항상 더 신속하게 진행한다는 것을 확인하였다. 이들 뒤쪽 두 화합물에 대한 곡선의 외삽 결과는 이들 유도체의 동력학적 프로필을 이 도면에 나타난 것보다 더 늦은 시간 구간에서는 구별할 수 있으리라는 것을 시사한다.
이 실험에서는 커플링된 o－diBr－AE 와 1－ 및 3－ Me－AE 표지를 합쳤지만, o－diBr－AE와 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물이 그들의 특징적인 반응 동력학 (실시예 3 등 참조)에 근거하여 구별될 수 있다는 것이 이미 증명되었다.
상기 데이터는 두 화학발광성 표지를 구별하기 위해 위 실시예 3에 사용된 동일한 반복적 평균법을 사용하면, 모든 구성원 화합물이 관련된 광 방출 반응을 동시에 개시하고, 방출된 광을 적절한 기간에 걸쳐 검출할 때 이 커플링된 화학발광성 표지 세트 중의 각 구성원 화합물에 대한 시그널이 단일 시료에서 구별될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 14: 다중 분석물 분석에서의 동시 사용을 위한 7 종의 화학발광성 표지의 평가
7 종의 상이한 화학발광성 표지 (o－diBr－AE, 2,7－diMe－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물, o－링커－AE, o－MeO(신나밀)－AE, o－Me－AE 및 o－diMe－AE)의 반응 동력학을 화학발광 반응의 개시에 뒤이어 각 화합물에 의해 방출되는 광을 개별적으로 측정함으로써 평가하였다. 각 화학발광성 표지는 상이한 올리고뉴클레오티드에 커플링시켰다. 실험 조건은 여기에 표시된 것을 제외하고는 실시예 12에서와 동일하였다. 방출된 광은 0.1 초 간격으로 총 7 초에 걸쳐 측정하였으며, 광도계를 사용하여 검출 및 측정하였다.
제6도는 이들 화합물에서 얻어진 광 방출 특성을 각 화학발광성 화합물에 대한 개별 도면이 겹쳐진, 컴퓨터로 작성한 단일 도면으로 보여준다. 이 도면이 명확하게 보여주는 바와 같이, 각 반응 화합물에 의해 방출된 광의 감쇠는 다른 각 화학발광성 화합물의 경우와 충분히 다르고 구별되어 반응을 동시에 개시하면 단일 시료에서 각각을 개별적으로 검출 및 측정할 수 있다. 당업자는 본 이러한 개시 내용에 비추어 이 실시예가 각 구성원 화합물에 대해 개별적으로 모아진 데이터를 제시하고 있으나 방출된 광의 반응 동력학 및 감쇠는 이들 화합물이 단일 시료에 합쳐졌을 때에서 실질적으로 다르지 않으리라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 당업계의 숙련자는 이 실시예가 본 발명의 조성물 및 방법에 따라 7 가지 핵산 분석물의분석을 위해 단일 분석에서 동시에 사용될 수 있는 7 가지 화학발광성 시약으로 된 세트를 제공한다는 것을 인식할 것이다.
실시예 15: 다중 방식, 다중 분석물 분석 시스템을 위한 화학발광성 시약의 평가
다음 화학발광성 시약을 4 분석물, 2－pH 분석 시스템에서의 사용에 대해 평가하였다: o－diBr－AE, o－F－AE, 표준 AE, 및 o－MeO(신나밀)－AE. 앞의 실시예에서와 같이, 각 화학발광성을 상이한 올리고뉴클레오티드에 커플링시켰다. 실험 조건은 H2O2의 첨가 전에 올리고뉴클레오티드에 74 μl 0.4 N HCl + 26 μl H2O를 가한 것을 제외하고는 실시예 4 에서와 동일하였다. 각 화학발광성 시약을 개별적으로 평가하였다.
제7도는 보다 명확성을 기하기 위해 각 화학발광성 시약에 대해 얻어진 데이터를 겹쳐 놓은, 컴퓨터로 작성한 단일 도면에 모아진 각 실험의 결과를 보여준다. 여기서 볼 수 있는 바와 같이, o－diBr－AE과 o－F－AE가 첫 번째 pH에서 화학발광성 반응에 참여한다. 또한, 이들 두 시약은, o－diBr－AE에 의해 방출된 광이 대략 구간 25에서 이미 기선까지 붕괴해버려 서로 서로 명확히 구별할 수 있다. 구간 25와 75 사이에 방출된 광은 o－F－AE 시약의 기여분을 나타낸다. 표준 AE 및 o－MeO(신나밀)－AE가 이 pH에서의 반응에는 비교적 저항성이며, 구간 0과 대략 85 사이에서는 소량의 광만이 각 화합물에 의해 방출된다.
대략 구간 85에 대응하는 시각에 반응 혼합물의 pH를 13으로 조정하였다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 이 pH 이동으로 대부분 반응하지 않던 표준 AE 및 o－MeO(신나밀)－AE가 o－diBr－AE 및 o－F－AE 유도체의 실질적으로 전부가 이전의 pH에서 이미 반응해버린 시각에 광을 방출할 수 있었다. 이 새로운 pH 값에서 반응하는 두 시약 역시 각 화합물이 완전히 반응하는 데 필요한 시간에 기초해 명확하게 구별될 수 있으니, 표준 AE는 구간 120에 이르면 거의 완전히 반응이 완료되는데 반해 o－MeO(신나밀)－AE는 구간 120과 대략 175 사이에서 여전히 광을 방출하고 있다.
이 실시예는 본 발명의 조성물 및 방법의 다양성을 예증한다. 여기서 에증된 바와 같이, 본 발명의 두 가지 이상의 방식을 결합하여 둘 이상의 핵산 분석물의 검출을 가능하게 할 수 있다. 당업게의 숙련자에게는 여기에 제시된 데이터가 별개의 반응 혼합물에서 평가된 화합물로부터 모아졌지만, 이들 화합물이 단일 반응 혼합물에 모아졌을 때 실질적으로 마찬가지 반응 특성을 가질 것으로 합리적으로 예상되리라는 것이 명백할 것이다 (실시예 16 등 참조). 당업자는 또한 이들이 커플링된 올리고뉴클레오티드가 상보적인 핵산 가닥에 혼성화했을 때 이들 화합물의 반응 특성이 심각하게 변하지 않을 것임을 이해할 것이다.
실시예 16: 합쳐진 화학발광성 시약의 예상 및 실제 반응 특성 사이의 상관 관계
잎서의 실시예에서 예시된 바람직한 아크리디늄 에스테르 유도체의 반응 특성이 개별적으로 분석한 화학발광성 시약에서 얻어진 도면을 컴퓨터를 통해 겹쳐놓은 것에 의해 정확히예측된다는 것을 것을 증명하기 위해, 다음 실험을 행하였다. 개별 반응 혼합물은 실시예 15의 프로토콜에 따라 제조하였다. 각 튜브는 다음 아크리디늄 에스테르 중 하나를 함유하였다: o－diBr－AE, o－F－AE, 표준 AE, 및 o－MeO(신나밀)－AE. 그 밖에도, 동일한 양의 각 화합물을 한 개의 튜브에 모은 것을 사용하여 다음과 같이 개별 튜브를 만들었다: o－diBr－AE와 o－F－AE, 표준 AE와 o－MeO－AE, 및 o－diBr－AE와 o－F－AE와 표준 AE와 o－MeO(신나밀)－AE. 화학발광성 시약 모두는 앞의 실시예에서와 같이 별개의 올리고뉴클레오티드에 커플링시켰다. 실시예 15에서와 같이 반응을 개시하고 측정하였다. 그 결과를 제8(a)도－제8(i)도에 나타내었다.
제8(a)도는 개별적으로 분석한 o－diBr－AE와 o－F－AE에 의해 방출된 광의 컴퓨터로 작성한 겹침 도면을 보여준다. 제8(b)도는 두 시약에 의해 방출되는 합쳐진 광의 컴퓨터로 작성한 도면인데, 이 도면은 제8(a)도의 개별 도면의 합이며 두 시약을 모두 함유한 단일 반응 혼합물의 반응 특성의 예상을 제시한다. 제8(c)도는 단일 튜브 중의 이들 두 화합물의 혼합물의 실제 반응 특성을 보여준다. 이들 데이터는 광 방출의 감쇠가 제8(b)도 (예상 곡선)과 제8(c)도 (실제 곡선)에 대해 동일할 뿐 아니라 동력학적 곡선 역시 실질적으로 동일하다는 것을 명확히 증명한다.
제8(d)도는 개별적으로 분석한 표준 AE와 o－MeO(신나밀)－AE에 의해 방출된 광의 컴퓨터로 작성한 겹침 도면을 보여준다. 제8(a)도는 이들 겹쳐진 도면의 컴퓨터로 작성한 합을 보여주고 제8(f)도는 화학발광 반응의 개시에 뒤이어 이들 두 화합물의 혼합물에 의해 방출되는 실제 광을 보여준다. 제8(a)도와 8(f)도를 비교하면 표준 AE와 o－MeO(신나밀)－AE의 혼합물의 반응 특성이 두 개의 개별적으로 분석한 AE 유도체에서 얻어진 곡선들을 더함으로써 정확히 예상된다는 것이 드러난다.
마지막으로, 제8(g)도는 상기 개별적으로 분석한 아크리디늄 에스테르 유도체 4가지 전부에 의해 방출된 광의 겹침 도면을 보여준다. 제8(h)도는 제8(g)도의 그래프들의 컴퓨터로 작성한 합이고, 제8(i)도는 이들 화합물 4 가지 모두의 혼합물의 시간에 따른 광 방출 특성을 보여준다. 따라서, 제8(h)도는 4 가지 화합물의 예상 광 방출 특성을 보여주며, 제8(i)도는 실제 결과를 보여준다. 여기서도, 제8(h)도의 "에상" 곡선과 제8(i)도의 "실제" 곡선 사이에 일치에 가까운 상관관계가 존재한다.
이 실험은 각 AE 표지의 특징적인 반응 동력학이 이들이 단일 반응 혼합물에서 다른 AE 표지와 혼합되었을 때 유의할 정도로 다르지 않다는 것을 증명한다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하는 것으로 개시된 AE 표지는 다중 분석물 분석 시스템에 확실히 적합하다.
실시예 17: 방식 3: 다중 파장, 동시 개시
본 발명의 또다른 실시태양에서는 각각의 다른 표지와는 상이한 파장에서 광을 방출하는 상이한 화학발광성 표지로 각각이 표지된 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 다중 분석물을 단일 시료에서 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 이 방식의 한 예로서, 다음 변경을 가하여 기본적으로 실시예 6에서 같이 분석을 수행할 수 있다. 혼성화 후, 각 튜브에 0.02% (w/v) 소듐 아지드 중 BIOMAG 4100 자성 입자의 1.25% (w/v) 현탁액 50 μl와 1mM EDTA를 함유한, 60mM 소듐 테트라보레이트 (pH 8.9), 6.89% (v/v) TRITON X－102와 0.1% (w/v) 젤라틴으로 된 용액 1ml를 가한다. 인큐베이션 및 세척 단계는 실시예 6에 있는 대로다.
광도계에 4 개의 광전 증배관 (PMT)을 장치하는데, 하나는 300 nm 내지 700nm 파장 범위에서 방출된 광을 계측하고, 하나는 375nm 내지 415 nm 컷 오프 필터를 가지며, 하나는 400nm 내지 435 nm 컷 오프 필터를 가지고, 하나는 500 내지 575 nm 컷 오프 필터를 가진 것이다. 각 표지의 표준을 광고계에 장전하고 광을 방출하도록 한 다음 방출된 광을 각 PMT로 계측하였다. 각 파장 창에서의 화학발광의 비율을 각 표지에 대해 실시예 3의 계산법에 예시한 바와 같이 산출하였다. 제9(a)도 및 제9(b)도는 2,7－diMe－AE와 표준 AE의 화학발광 스펙트럼을 보여주는데, 이들 스펙트럼의 음영 부분은 상기 언급된 파장 창을 나타낸다. 제9(c)도는 제9(a)도 및 제9(b)도의 스펙트럼의 컴퓨터로 작성한 겹침도면이다. 여기서 볼 수 있는 바와 같이, 각 표지에 대해 최대 파장 방출이 상이하며, 각 표지는 둘의 혼합물에서 구별될 수 있다. 제9(d)도는 두 개별 파장 방출 프로필의 컴퓨터로 작성한 합이다.
사용할 특정한 화학발광성 표지에 대한 파장 방출의 표준 비율을 측정하였으므로, 각 실험 시료를 광도계에 올리고 광 방출 반응을 개시하고, 그 결과 방출된 광을 표준에 대한 것과 완전히 동일한 방식으로 계측하였다. 그 다음 실시예 3의 반복적 계산법을 사용하여 결과를 산출할 수 있다.
상기 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 그 밖의 실시태양은 이하의 청구의 범위에 주어져 있다.
Claims (38)
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물로서, (a) 각각 상기 시료 중에 있는 것으로 추측되는 1종 이상의 핵산 분석물의 특정한 상이한 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, (b) 각각 링커에 의해 상기 혼성화 프로브 중 1종 이상에 커플링된 복수의 상이한 화학발광성 표지(여기서, 2종 이상의 핵산 분석물이 상기 화학발광성표지 중 상이한 것에 커플링된 혼성화 분석 프로브에 의해 각각 표적화됨)를 포함하며, 상기 혼성화 프로브는 각각 비표적 핵산에 대한 상기 프로브의 혼성화 유리하지 않은 조건 하에 상기 시료 중에 존재하는 경우의 1종 이상의 분석물에 특이적으로 혼성화할 것이고, 상기 화학발광성 표지는 표적 핵산에 혼성화한 혼성화 프로브에 커플링되는 경우 화학발광 포텐샬의 소실로부터 비슷한 정도로 보호받고, 상기 화학발광성 표지는 혼성화하지 않은 프로브에 커플링되는 경우 화학발광 포텐샬의 소실에 비슷한 정도로 감수성이며, 광 방출 반응을 개시하고 표지된 혼성화한 프로브를 선택적으로 검출한 후 상기 화학발광성 표지 각각이 상기 화학발광성 표지의 서로 다른 것의 광 방출 파장과는 충분히 구별되는 하나 이상의 파장에서 광을 방출하여 방출된 광을 상기 파장들에서 동시에 검출하면 상기 화학발광성 표지들을 상기 시료 중에 있는 핵산 분석물 각각의 존재에 대한 지시자로서 독립적으로 검출할 수 있는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물.
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물로서, (a) 각각 상기 시료 중에 있는 것으로 추측되는 1종 이상의 핵산 분석물의 특정한 상이한 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, (b) 각각 링커에 의해 상기 혼성화 프로브 중 1종 이상에 커플링된 복수의 상이한 화학발광성 표지(여기서, 2종 이상의 핵산 분석물이 상기 화학발광성 표지 중 상이한 것에 커플링된 혼성화 분석 프로브에 의해 각각 표적화됨)를 포함하며, 상기 혼성화 프로브는 각각 비표적 핵산에 대한 상기 프로브의 혼성화에 유리하지 않은 조건 하에 상기 시료 중에 존재하는 경우의 상기 핵산 분석물에 특이적으로 혼성화할 것이고, 상기 화학발광성 표지는 표적 핵산에 혼성화한 혼성화 프로브에 커플링되는 경우 화학발광 포텐샬의 소실로부터 비슷한 정도로 보호받고, 상기 화학발광성 표지는 혼성화하지 않은 프로브에 커플링되는 경우 화학발광 포텐샬의 소실에 비슷한 정도로 감수성이며, 처음 특정 pH 값에서 촉발할 수 있는(triggerable) 광 방출 반응을 개시하면 상기 커플링된 화학발광성 표지 중 하나 이상은 상기 pH 값에서 상기 반응에 참여할 것이고, 상기 커플링된 화학발광성 표지 중 다른 하나 이상은 반응 혼합물의 pH가 하나 이상의 상이한 pH 값으로 변경될 때 광 방출 반응에서 반응할 것이고 상기 조성물은 그에 따라 시료 중에 있는 상기 핵산 분석물의 존재에 대한 지시자로서 단일 시료 중의 2종 이상의 화학발광성 표지들의 개별적인 동정을 허용하는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 검출가능한 광 방출 반응에서 반응하는 커플링된 화학발광성 표지의 반응 pH 최적치가 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지의 경우보다 약 0.5 pH 단위 이상 다른 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 검출가능한 광 방출 반응에서 반응하는 커플링된 화학발광성 표지의 반응 pH 최적치가 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지의 경우보다 약 0.7 pH 단위 이상 다른 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 검출가능한 광 방출 반응에서 반응하는 커플링된 화학발광성 표지의 반응 pH 최적치가 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지의 경우보다 약 1.0 pH 단위 이상 다른 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 검출가능한 광 방출 반응에서 반응하는 커플링된 화학발광성 표지의 반응 pH 최적치가 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지의 경우보다 약 1.5 pH 단위 이상 다른 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 검출가능한 광 방출 반응에서 반응하는 커플링된 화학발광성 표지의 반응 pH 최적치가 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지의 경우보다 약 2.0 pH 단위 이상 다른 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 광 방출 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 o－F－AE로 이루어지고, 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물, o－MeO(신나밀)－AE 및 표준 AE로 이루어진 군에서 선택된 화학발광성 시약으로 이루어지는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 광 방출 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－ 및 3－ Me－m－diF－AE로 이루어지고, 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물 및 o－MeO(신나밀)－AE로 이루어진 군에서 선택된 화학발광성 시약으로 이루어지는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 광 방출 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1,7－diMe－AE로 이루어지고, 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 o－Me－AE로 이루어진 군에서 선택된 화학발광성 시약으로 이루어지는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 광 방출 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 나프틸－AE로 이루어지고, 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 표준 AE로 이루어진 군에서 선택된 화학발광성 시약으로 이루어지는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 광 방출 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 o－diBr－AE로 이루어지고, 상기 하나 이상의 상이한 pH값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물 및 o－MeO(신나밀)－AE로 이루어진 군에서 선택된 화학발광성 시약으로 이루어지는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 광 방출 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 o－F－AE, 1－Me－diF－AE, 3－Me－m－diF－AE, 1－Me－m－diF－AE와 3－Me－m－diF－AE의 혼합물, 2,7－diMe－AE, 나프틸－AE 및 o－diBr－AE로 이루어진 군에서 선택된 제1 화학발광성 시약으로 이루어지고, 상기 하나 이상의 상이한 pH 값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물, o－MeO(신나밀)－AE, 표준 AE 및 o－Me－AE로 이루어진 군에서 선택된 제2 화학발광성 시약으로 이루어지는 조성물.
- 제13항에 있어서, 3종 이상의 상이한 커플링된 화학발광성 표지를 함유한 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 처음 pH 값에서 상기 광 방출 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 o－F－AE, 1－Me－diF－AE, 3－Me－m－diF－AE, 1－Me－m－diF－AE와 3－Me－m－diF－AE의 혼합물, 2,7－diMe－AE, 나프틸－AE 및 o－diBr－AE로 이루어진 군에서 선택된 제1 화학발광성 시약으로 이루어지고, 상기 하나 이상의 상이한 pH 값에서 반응하는 상기 커플링된 다른 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물, o－MeO(신나밀)－AE, 표준 AE 및 o－Me－AE로 이루어진 군에서 선택된 제2 화학발광성 시약으로 이루어지는, 3종 이상의 화학발광성 표지를 함유한 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 커플링된 화학발광성 표지 중 2종 이상은 상기 광 방출 반응의 개시 후 단일 pH 값에서 광을 방출하고, 상기 2종 이상의 화학발광성 표지의 광 방출 파장은 충분히 구별되어 방출된 광을 상기 구별되는 각각의 파장에서 측정하면 그 pH 값에서 반응하는 화학발광성 표지의 개별적인 동정이 가능한 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 커플링된 화학발광성 표지 중 2종 이상은 상기 광 방출 반응의 개시 후 단일 pH 값에서 광을 방출하고, 상기 2종 이상의 화학발광성 표지의 광 방출의 피크 도달 시간 특성, 반응 지속시간 및(또는) 파장은 충분히 구별되어 광 방출 반응의 개시 후에 하나 이상의 파장에 걸쳐 소정의 시간 간격으로 광을 측정하면 상기 화학발광성 표지들의 개별적 검출이 가능함으로써 그 pH 값에서 반응하는 화학발광성 표지의 개별적인 동정이 가능한 조성물.
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물로서, (a) 각각 상기 시료 중에 있는 것으로 추측되는 1종 이상의 핵산 분석물의 특정한 상이한 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, (b) 각각 링커에 의해 상기 혼성화 프로브 중 1종 이상에 커플링된 복수의 상이한 화학발광성 표지(여기서, 2종 이상의 핵산 분석물이 상기 화학발광성 표지 중 상이한 것에 커플링된 혼성화 분석 프로브에 의해 각각 표적화됨)를 포함하며, 상기 혼성화 프로브는 각각 비표적 핵산에 대한 상기 프로브의 혼성화에 유리하지 않은 조건 하에서 상기 시료 중에 존재하는 경우의 1종 이상의 핵산 분석물에 특이적으로 혼성화할 것이고, 상기 화학발광성 표지는 표적 핵산에 혼성화한 혼성화 프로브에 커플링되는 경우 화학발광 포텐샬의 소실로부터 비슷한 정도로 보호받고, 상기 화학발광성 표지는 혼성화하지 않은 프로브에 커플링되는 경우 화학발광 포텐샬의 소실에 비슷한 정도로 감수성이며, 광 방출 반응이 개시되면 적어도 하나의 반응하는 화학발광성 표지의 피크 도달 시간 및(또는) 반응 지속시간 값들이 적어도 하나의 다른 반응하는 화학발광성 표지의 경우와 충분히 상이하여 상기 개시 사건 후 소정의 시간 간격으로 광 방출을 검출 또는 측정하면 동일한 시료 중에 있는 상기 반응하는 화학발광성 표지를 상기 분석물 각각의 지시자로서 개별적으로 검출할 수 있는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 하나는 o－diBr－AE로 이루어지고, 상기 다른 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물 및 o－MeO(신나밀)－AE로 이루어진 군에서 선택된 아크리디늄 에스테르 유도체로 이루어지는 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 하나는 나프틸－AE로 이루어지고, 상기 다른 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 표준 AE로 이루어지는 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 하나는 2,7－diMe－AE로 이루어지고, 상기 다른 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 o－Me－AE로 이루어지는 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 하나는 o－F－AE로 이루어지고, 상기 다른 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물, o－MeO(신나밀)－AE 및 표준 AE로 이루어진 군에서 선택된 아크리디늄 에스테르 유도체로 이루어지는 조성물.
- 제18항에 있어서, 하나의 반응하는 커플링된 화학발광성 표지는 1－Me－m－diF－AE, 3－Me－m－diF－AE, 및 1－ 및 3－ Me－m－diF－AE의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 아크리디늄 에스테르 유도체로 이루어지고, 상기 다른 반응하는 커플링된 화학발광성 표지 중 적어도 하나는 1－Me－AE, 3－Me－AE, 1－ 및 3－Me－AE의 혼합물 및 o－MeO(신나밀)－AE로 이루어진 군에서 선택된 아크리디늄 에스테르 유도체로 이루어지는 조성물.
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물로서, (a) o－diBr－AE, (b) 2,7－diMe－AE, (c) o－MeO(신나밀)－AE, (d) o－Me－AE 및 (e) o－diMe－AE로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 화학발광성 표지를 포함하며, 상기 화학발광성 표지 각각은 1종 이상의 상이한 혼성화 분석 프로브에 커플링되고, 상기 프로브는 각각 1종 이상의 핵산 분석물에 함유된 표적 부위에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가져 상기 프로브와 비표적 부위 사이의 혼성화에 유리하지 않은 혼성화 조건 하에서 표적 부위에 결합하며, 촉발할 수 있는 광 방출 반응의 개시 후에 상기 화학발광성 표지 각각의 반응 동력학, 광 방출 파장 및(또는) 최적 pH 특성이 상기 표지 중 서로 다른 것의 경우와는 충분히 구별되어 상기 표지는 각각 상기 시료 중에 있는 상기 핵산 분석물 각각의 존재에 대한 지시자로서 개별적으로 검출할 수 있는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물.
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물로서, (a) o－diBr－AE, (b) 2,7－diMe－AE, (c) 1－ 및 3－ Me－AE의 혼합물, (d) o－AE, (e) o－MeO(신나밀)－AE, (f) o－Me－AE 및 (g) o－diMe－AE로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 화학발광성 표지를 포함하며, 상기 화학발광성 표지 각각은 1종 이상의 상이한 혼성화 분석 프로브에 커플링되고, 상기 프로브는 각각 1종 이상의 핵산 분석물에 함유된 표적 부위에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가져 상기 프로브와 비표적 부위 사이의 혼성화에 유리하지 않은 혼성화 조건 하에서 표적 부위에 결합하며, 촉발할 수 있는 광 방출 반응의 개시 후에 상기 화학발광성 표지 각각의 반응 동력학, 광 방출 파장 및(또는) 최적 pH 특성이 상기 표지 중 서로 다른 것의 경우와는 충분히 구별되어 상기 표지는 각각 상기 시료 중에 있는 상기 핵산 분석물 각각의 존재에 대한 지시자로서 개별적으로 검출할 수 있는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석을 위한 조성물.
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석 방법으로서, (a) (i) 각각 상기 시료 중에 있는 것으로 추측되는 핵산 분석물의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, (ii) 각각 상기 혼성화 프로브 중 1종 이상에 커플링되어 2종 이상의 핵산 분석물이 상이한 화학발광성 표지에 커플링된 적어도 하나의 혼성화 분석 프로브에 의해 각각 표적화되는 복수의 상이한 화학발광성 표지, 및 (iii) 상기 시료를 매질에 제공하는 단계, (b) 상이한 혼성화 분석 프로브가 상기 핵산 분석물에 우선적으로 혼성화하여 표지된 이중 가닥 핵산 하이브리드를 형성하게 되는 혼성화 조건－상기 조건은 상기 표지된 프로브와 비표적 핵산 사이의 이중 가닥 핵산 하이브리드의 형성에는 유리하지 않음－을 성립시키는 단계, (c) 혼성화하지 않은 프로브에 커플링된 상기 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬을 선택적으로 파괴 또는 억제하는 단계, (d) 이중 가닥 핵산 하이브리드에 포함된 화학발광성 표지가 광을 방출하도록 유도하는 단계, 및 (e) 상기 핵산 분석물 각각에 혼성화한 커플링된 화학발광성 표지에 의해 방출되는 광을, 단일 시료에서 상기 분석물들을 독립적으로 검출할 수 있게 할 만큼 서로 다른 상기 화학발광성 표지에 대한 광 방출 파장과는 충분히 구별되는 광 방출 파장에서 측정함으로서 존재하는 경우 상기 핵산 분석물 각각을 검출하는 단계를 포함하는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석 방법.
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석 방법으로서, (a) (i) 각각 상기 시료 중에 있는 것으로 추측되는 핵산 분석물의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, (ii) 각각 상기 혼성화 프로브 중 1종 이상에 커플링되어 2종 이상의 핵산 분석물이 상이한 화학발광성 표지에 커플링된 혼성화 분석 프로브에 의해 각각 표적화되는 복수의 상이한 화학발광성 표지, 및 (iii) 상기 시료를 매질에 제공하는 단계, (b) 혼성화 분석 프로브가 존재하는 경우의 상기 핵산 분석물에 우선적으로 혼성화하여 표지된 이중 가닥 핵산 하이브리드를 형성하게 되는 혼성화 조건－상기 조건은 상기 표지된 프로브와 비표적 핵산 사이의 이중 가닥 핵산 하이브리드의 형성에는 유리하지 않음－을 성립시키는 단계, (c) 혼성화하지 않은 프로브에 커플링된 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬을 선택적으로 파괴 또는 억제하는 단계, (d) 이중 가닥 핵산 하이브리드에 포함된 화학발광성 표지가 광을 방출하도록 유도하는 단계, 및 (e) 광 방출 반응이 개시되면 반응하는 화학발광성 표지의 피크 도달 시간 및(또는) 반응 지속시간 값들을 상기 개시 사건 후에 소정의 시간 간격으로 측정함으로써 각각의 혼성화한 핵산 분석물을 검출하는 단계를 포함하는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석 방법.
- 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석 방법으로서, (a) (i) 각각 상기 시료 중에 있는 것으로 추측되는 핵산 분석물의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, (ii) 각각 상기 혼성화 프로브 중 1종 이상에 커플링되어 2종 이상의 핵산 분석물이 상이한 화학발광성 표지에 커플링된 혼성화 분석 프로브에 의해 각각 표적화되는 복수의 상이한 화학발광성 표지, 및 (iii) 상기 시료를 매질에 제공하는 단계, (b) 혼성화 분석 프로브가 존재하는 경우의 상기 핵산 분석물에 혼성화하여 표지된 이중 가닥 핵산 하이브리드를 특이적으로 형성하게 되는 혼성화 조건－상기 조건은 상기 표지된 프로브와 비표적 핵산 사이의 이중 가닥 핵산 하이브리드의 형성에는 유리하지 않음－을 성립시키는 단계, (c) 혼성화하지 않은 프로브에 커플링된 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬을 선택적으로 파괴 또는 억제하는 단계, (d) 상기 이중 가닥 핵산 하이브리드에 포함된 커플링된 화학발광성 표지들 중 적어도 하나가 처음 특정 pH 값에서 광 방출 반응에 참여하도록 유도하고, 그에 따라 상기 표지에 의해 방출된 광을 측정하는 단계, (e) 분석액을 적어도 하나의 다른 pH 값으로 조정하는 단계, (f) 하나 이상의 상이한 이중 가닥 핵산 하이브리드에 포함된 적어도 하나의 커플링된 다른 화학발광성 표지가 상기 다른 pH 값(들)에서 광 방출 반응에 참여하도록 유도하는 단계, 및 (g) 상기 상이한 표지들에 의해 방출되는 광을 소정의 기간 동안 측정함으로써 단일 시료에서 표지된 혼성화 분석 프로브에 혼성화한 상이한 핵산 분석물 각각의 척도로서 상이한 커플링된 화학발광성 표지의 개별적인 동정을 허용하는 단계를 포함하는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 분석 방법.
- 각각 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링된 둘 이상의 상이한 표지로 이루어진 화학발광성 표지 세트를 포함하는, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 검출을 위한 조성물로서, 이들 커플링된 표지는 각각 광 방출 반응이 개시되면 상기 화학발광성 표지의 서로 다른 것의 광 방출 파장과는 충분히 구별되는 파장에서 광을 방출하여 방출된 광을 상기 파장들에서 검출하면 상기 화학발광성 표지들을 상기 시료 중에서 독립적으로 검출할 수 있고, 상기 표지는 각각 또한 혼성화하지 않은 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브에 커플링되었을 때에는 화학발광 포텐샬의 소실에 감수성이며, 상기 표지는 각각 적어도 하나의 상기 핵산 분석물에 혼성화한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링되었을 때에는 상기 소실에 대해 저항성인, 단일 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 검출을 위한 조성물.
- 둘 이상의 상이한 표지로 이루어진 화학발광성 표지 세트를 포함하는, 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 검출을 위한 조성물로서, 상기 상이한 표지는 각각 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링되어 있고, 이들 상이한 커플링된 표지 각각은 광 방출 반응이 개시된 후에는 소정의 시간 간격에 걸쳐서 반응하는 화학발광성 표지의 피크 도달 시간 및(또는) 반응 지속시간 값들을 측정함으로써 상기 커플링된 표지들 중 하나 이상의 다른 것과 구별가능하고, 상기 상이한 표지들 각각은 또한 혼성화하지 않은 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브에 커플링되었을 때에는 화학발광 포텐샬의 소실에 감수성이며, 상기 상이한 표지들 각각은 상기 핵산 분석물 중 하나에 혼성화한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링되었을 때에는 상기 소실에 대해 저항성인, 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 검출을 위한 조성물.
- 둘 이상의 표지로 이루어진 화학발광성 표지 세트를 포함하는, 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 검출을 위한 조성물로서, 상기 표지는 각각 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링되어 있고, 이들 커플링된 표지들 중 적어도 하나는 비슷한 반응 조건 하에서 상기 커플링된 표지들 중 하나 이상의 다른 것의 반응에 유리하지 않은 pH 값에서 광 방출 반응에 참여하며, 상기 표지들 각각은 또한 혼성화하지 않은 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브에 커플링되었을 때에는 화학발광 포텐샬의 소실에 감수성이고, 상기 표지들 각각은 상기 핵산 분석물 중 하나에 혼성화한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브에 커플링되었을 때에는 상기 소실에 대해 저항성인, 시료 중의 복수의 핵산 분석물의 검출을 위한 조성물.
- 단일 시료 중의 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 네이세리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae) 핵산의 존재 또는 양을 동시에 검출하는 방법으로서, (a) 상기 시료를 비－클라미디아 트라코마티스 핵산보다 클라미디아 트라코마티스 핵산에 우선적으로 혼성화할 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브 하나 이상 및 비－네이세리아 고노로애 핵산보다 네이세리아 고노로애 핵산에 우선적으로 혼성화할 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브 하나 이상과 접촉시키는 단계－여기서, 상기 클라미디아 트라코마티스에 특이적인 혼성화 분석 프로브는 제1 화학발광성 표지화 시약에 커플링되어 있고 상기 네이세리아 고노로애에 특이적인 혼성화 분석 프로브는 제2 화학발광성 표지화 시약에 커플링되어 있음－, (b) 상기 클라미디아 트라코마티스에 특이적인 혼성화 분석 프로브와 존재하는 경우의 클라미디아 트라코마티스 핵산 사이 및 네이세리아 고노로애에 특이적인 혼성화 분석 프로브와 존재하는 경우의 네이세리아 고노로애 핵산 사이의 혼성화를 허용하기에 충분한 혼성화 조건을 성립시키는 단계－여기서, 상기 혼성화 조건은 비표적 핵산에 대한 상기 혼성화 분석 프로브들의 비특이적 혼성화를 촉진하지 않을 것임－, (c) 혼성화하지 않은 프로브에 커플링된 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬을 선택적으로 파괴 또는 억제하는 단계, 및 (d) 혼성화한 클라미디아 트라코마티스에 특이적인 프로브에 커플링된 상기 제1 화학발광성 시약을 상기 시료 중의 클라미디아 트라코마티스 핵산의 존재에 대한 지시자로서, 그리고 혼성화한 네이세리아 고노로애에 특이적인 프로브에 커플링된 상기 제2 화학발광성 시약을 상기 시료 중의 네이세리아 고노로애 핵산의 존재에 대한 지시자로서 검출하는 단계, 를 포함하는, 단일 시료 중의 클라미디아 트라코마티스 및 네이세리아 고노로애 핵산의 존재 또는 양을 동시에 검출하는 방법.
- 시료 중의 표적 핵산에 있는 복수의 분석물의 분석 방법으로서, (a) 상기 시료를 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브와 접촉시키는 단계－여기서, 상기 상이한 프로브는 각각 상기 핵산의 상이한 표적 분석물 영역에 특이적으로 혼성화하고, 상기 상이한 프로브는 각각 상이한 화학발광성 표지에 커플링되어 있음－, (b) 상기 시료에 각각의 상기 혼성화 분석 프로브와 그의 분석물 사이의 특이적 혼성화를 허용하기에 충분한 혼성화 조건을 성립시키는 단계－여기서, 상기 혼성화 조건은 상기 핵산의 비표적 뉴클레오티드 서열 영역에 대한 상기 혼성화 분석 프로브의 혼성화를 촉진하지 않음－, (c) 혼성화하지 않은 프로브에 커플링된 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬을 선택적으로 파괴 또는 억제하는 단계, 및 (d) 상기 상이한 프로브들에 커플링된 상기 화학발광성 시약을 상기 시료 중의 상기 핵산 분석물의 존재에 대한 지시자로서 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적 핵산에 있는 복수의 분석물의 분석 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 핵산이 사람 면역결핍증 바이러스에서 유래하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 상이한 분석물이 사람 면역결핍증 바이러스 게놈의 gag 및 pol 영역을 포함하는 영역에 위치한 표적 영역으로 이루어지는 방법.
- 시료 중의 둘 이상의 핵산 분석물의 검출을 위한 키트로서, (a) 각각 상이한 핵산 표적 분석물에 혼성화할 수 있는, 둘 이상의 상이한 상이한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, (b) 상기 각각의 프로브에 커플링된 하나 이상의 상이한 화학발광성 표지－각각의 화학발광성 표지는 키트에서 광 방출 유도시에 상기 표지에 의해 방출되는 화학발광이 광 방출 파장, 화학발광 반응의 반응 동력학 또는 반응 pH를 기준으로하여 상기 다른 하나 이상의 표지에 의해 방출되는 화학발광과 별개로 구별할 수 있도록 선택되고, 상기 커플링된 표지는 표적 분석물과 함께 핵산 혼성체를 형성한 프로브에 커플링되는 경우 상기 표지의 화학발광 포텐샬의 소실로부터 비슷한 정도로 보호되고, 상기 커플링된 표지는 표적 분석물과 함께 핵산 혼성체를 형성하지 않은 프로브에 커플링될 경우에는 화학발광 포텐샬의 소실에 비슷한 정도로 감수성임－ 을 포함하는, 시료 중의 둘 이상의 핵산 분석물의 검출을 위한 키트.
- 제36항에 있어서, 혼성화하지 않은 프로브에 커플링된 상기 화학발광성 표지의 화학발광 포텐샬을 선택적으로 파괴 또는 억제하는 수단을 포함하는 분별 시약을 더 포함하는 키트.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 화학발광성 시약이 검출가능한 광을 방출하게 만드는 수단을 포함하는 검출 시약을 더 포함하는 키트.
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