JPS60201256A - 特定のポリヌクレオチド配列の検出方法、検出用試薬系及び試験キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮粟上亘剋朋分亘 本発明は、特定のポリヌクレオチド配列を検出するた吟
の核酸ハイブリッド形成分析法及び試薬系に関する。核
酸ハイブリッド形成分析法の原理は、特定のポリヌクレ
オチド塩基配列を測定し、小離する手段として組換えＤ
ＮＡの分野の研究者によって開発された。２本鎖形を変
性することによって得られるような１本鎖核酸、例えば
ＤＮＡ及びＲＮＡは、適切な条件下に、相補性１本鎖核
酸とハイブリッドを形成するか又は組換えられることが
判明した。ある種の容易に検出可能な化学基でそのよう
な相補性プローブ核酸を標識することによって、１本鎖
形の試料核酸を含む試験媒体中の問題のポリヌクレオチ
ド配列の存在を検出することが可能になった。

分析的ハイブリッド形成技術を組換えＤＮＡ分野に加え
て、ヒト及び獣医学、農業並びに殊に食品科学の分野で
重要なポリヌクレオチドの検出に適用することができる
。特に、病原体、例えば細菌及びウィルスの検出及び同
定、抗生物質耐性菌のスクリーニング、遺伝病、例えば
鎌型赤血球貧血症及び地中海貧血症の診断の補助及び癌
細胞の検出に前記技術を使用することができる。この技
術の概要並びにその現在及び未来における意義は、バイ
オチクノロシイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　（
１９８３年８月）、４７１〜４７８頁に記載されている
。

従来■吸肛 下記の情報は、本発明に関係あると出願人の考える情報
を開示する目的で示すものである。下記の情報のいずれ
かが本発明に対し先行技術を構成することを、必ずしも
認めるものではなく、また解説するものでもない。

現在の技術水準の核酸ハイブリッド形成分析技術は、一
般に、ハイブリッドを形成した標識プローブ及びハイプ
リントを形成していない標識プローブの分離を含む。こ
の必要な分離工程は、通常、固体担持物質上に試料核酸
又は核酸プローブを固定することによって促進される。

一般に、試料核酸中の問題の特定の塩基配列又は遺伝子
と標識形のプローブ核酸との間でのハイブリッド形成は
、固体担持物質を未ハイブリッド形成プローブを含む残
りの反応混合物から分離し、次いで、固体担持物質上の
標識を検出することによって検出される。

核酸ハイブリッド形成分析を実施するための分析操作を
簡易化する努力が続けられている。これらの努力の第一
の目標は、臨床的実験室で簡便にかり密性で実施しうる
点まで操作の複雑さを軽減することである。分離工程の
必要は、これらの努力の進歩を苛酷に妨げる。分離工程
は、分析的に再現可能に実施するためには相当の熟練を
要し、容易には自動化又は高容量試験に適合されない物
理的操作である。

更に、試料核酸の固定を含む従来法では、二つの重要な
困難に遭遇する。第一に、固定を実施するのに必要な操
作は、一般に、時間を浪費し、臨床的実験室でこの技術
の富用には不所望な別の工程を付加する。第二に、特に
臨床試料の場合に、不均質試料中の蛋白質及び他の物質
が、固定操作を妨害することがある。

試料核酸を固定し、標識プローブを添加する代わりに、
固定されたプローブを使用し、試料核酸をその場で標識
するか、又は２種のプローブ（一方は固定され、他方は
標識されている）を必要とする二重ハイブリッド形成技
術を使用することができる。しかし、前者は、試料核酸
のその場での標識に、臨床技術者に普通とは認められな
い高度の技術的熟練を必要とし、標識率を監視する簡単
で、信頼性のある方法がない（標識媒体が標識反応の抑
制因子を種々の量で含む場合に重要な問題となろうる）
ので、あまり望ましくない。二重ハイブリッド形成技術
は、付加的試薬及び静置工程を必要とするという欠点を
有し、ハイブリッド形成反応の速度は遅く、効率的でな
い。２つのプローブの試料配列との相補性が変動する場
合には、分析の精度も変動することがある。

前記の問題の若干は、固定されたＲＮＡプローブを使用
し、生成する固定されたＤＮＡ　−ＲＮＡ又はＲＮＡ　
−ＲＮＡハイブリッドを標識付き特異的抗−ハイブリッ
ド抗体で検出することによって解決される（１９８４年
６月１日に出願された米国特許出願６１６．１３２号明
細書参照〕。この技術はなお分離工程を必要とし、従っ
て前記の分離工程を必要とするすべてのハイブリッド形
成技術に共通の欠点を有する。

米国特許第３．９９６．３４５号、同第４，２３３，４
０２号及び同第４，２７５，１４９号明細書には、酵素
対及びエネルギー移動反応を使用する免疫分析法によっ
て抗原を検出する分析法が記載されている。

欧州特許出願箱７０，６８５号明細書は、未ハイブリッ
ド形成プローブからハイブリッド形成プローブを物理的
に分離する必要をなくしたハイブリッド形成分析法を提
案している。問題のポリヌクレオチド配列上の隣接領域
にハイブリッドを形成する一対のプローブを使用し、一
方のプローブを化学発光触媒、例えば酵素ペルオキシダ
ーゼで標識し、他方を化学発光光線に対する吸収剤分子
で標識することが提案されている。触媒及び吸収剤標識
は、ハイブリッドを形成したときに、吸収剤分子へのエ
ネルギー移動によって化学発光の消光が観察されるよう
に、各プローブの隣接末端付近に存在しなければならな
い。このような分析を実施するには、試料核酸にハイブ
リッドを形成したときに、現実にハイブリッド形成を受
ける各標識プｏ　−７’セグメントの親和性に影響する
ことなく、各標識が消光配置に配向されるように２種の
臨界的プローブ試薬を制御可能に合成できなければなら
ない。

光肌勿■斐 ハイブリッド形成プローブに関して、未ハイブリッド形
成プローブに比べて測定可能に異なる検出可能なシグナ
ルを生じる近位反応性の、標識された対を使用すること
に基づいて核酸ハイブリッド形成分析法を工夫した。こ
の方法では、ハイブリッド形成プローブと未ハイブリッ
ド形成プローブとを分離する必要がなく、分析の実施及
び自動化を著しく促進する。更に、分析シグナルは、非
放射性同位元素であり、これにより分析に便利な別の基
準に適合し、放射能に関係しない検出系を使用する。

本発明によれば、試験試料中の特定のポリヌクレオチド
配列は、検出すべき配列と、生成するハイブリッドが２
種の異なる特異結合試薬に対する結合部位を有するよう
に、相補性配列を有する核酸プローブとの間でハイブリ
ッドを形成させることによって検出される。このような
結合試薬の一方は第一の標識を含み、他方は第二の標識
を含み、２種の標識が反応して、２種の標識付き試薬が
同じハイブリッドに結合している場合に、そのように結
合していない場合に比べて、正又は負で、測定可能に異
なる検出可能な応答を生じる。同一のハイブリッドに結
合した場合、２種の標識は相互の近位反応距離内に存在
し、これによりバルク溶液中で３ＩｆＩｉ２１ｔの拡散
可能な標識付き試薬の間で起こるあまり頻繁でない反応
に比べて、２種の標識の間のシグナルに影響する反応を
実質的に増加する。

２種の標識の間の好ましい反応は、連続反応であって、
第一の標識が第一の化学反応に関与して拡散可能な生成
物を生じ、この生成物は第二の標識との第二の化学反応
への関与物質であり、検出可能な生成物を生じる。第−
及び第二の標識が触媒、例えばそれぞれ第−及び第二の
化学反応用の酵素であるのが特に好ましい。例えば、第
一の標識がグルコースオキシダーゼであり、第二の標識
がペルオキシダーゼである場合、グルコースにグルコー
スオキシダーゼを作用させることによって製造される過
酸化水素は、適当な指示薬色素組成物の存在で光学的シ
グナルとして検出可能なペルオキシダーゼ標識へ拡散す
る。別の好ましい標識対は、螢光物質又は発光物質と第
一の標識の光の放出に対する消光物質のように、エネル
ギー移動反応に関係するものである。

使用する特異的結合試薬の性質に関しては、原則として
二つのうち少なくとも一方が未ハイブリッド形成核酸に
比べて、分析中に形成したハイブリッドに対して特異な
部位に結合しなければならない。それというのは、シグ
ナルの発生がそのようなハイブリッドの形成に左右され
なければならないからである。この場合に、このような
特異結合試薬は、分析混合物に存在する１本鎖核酸より
もこのハイブリッドに対して選択的な抗体であるのが好
ましい。以下に詳述するように、種々の第二の結合試薬
を使用することができる。

本発明は、多数の重要な利点を有することを特徴とする
。分離工程を省いたという根本的利点とともに、試料又
はプローブ核酸を固定（一般に使用されるハイブリッド
形成技術で非特異的結合及び再現性の問題を起こす）す
る必要がない。更に、ハイブリッド形成速度は、固定さ
れたハイブリッド形成可能な対の１本鎖を用いる系に比
べて溶液中で著しく早い。洗浄工程なく、分析を実施し
うろことは付加的利点である。不溶性担持物質を洗浄す
る必要なく、ハイブリッド形成媒体に分析試薬を連続的
に添加することができる。

本発明の重要な特徴は、更に、２本鎖デユーブレックス
（ｄｕｐｌｅｘ）が第−及び第二の標識付き試薬に対し
て多数の結合部位を含むことができるので、使用する検
出系が特に効率的であることである。その結果、ハイブ
リッド形成プローブ１単位当たり多量の第−及び第二の
標識が相互に反応する立体配置に集成される。ＲＮＡ　
−ＤＮＡ又はＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドに対する抗
体を考慮すると、一方の標識付き抗体はそれぞれ約１０
塩基対のハイブリッドに結合することができる。プロー
ブが、例えば塩基５００１１１ｉ１の長さである場合、
４０〜５０個の抗体が結合することができる。標識付き
結合蛋白質によって認識されるリガンドを塩基５〜２０
ＩＩＩｉ１当たり１個のりガントの水準でプローブ中に
導入することができる。低濃度のハイブリッドを検出し
なければならない場合には、ハイブリッド上に多数の結
合部位の存在を有利に使用することができる。

好皿卸田１悲関皿 分析手段としての核酸ハイブリッド形成の使用は、基本
的には、ＤＮＡの２本鎖デユープレックス構造に基づく
。２重鎮ＤＮＡにおける各鎖のプリン塩基とピリミジン
塩基との間の水素結合は、可逆的に破壊されうる。ＤＮ
Ａのこの”融解”又はパ変性”から生しるＤＮＡの２種
の相補性１本鎖は会合して（しばしば、再アニール又は
ハイブリッド形成と言われる）、デユープレックス構造
を再形成するであろう。現在では周知のとおり、適切な
条件下で第二の１本鎖核酸に対して充分に相補的な（即
ち第二の１本鎖核酸と″相同な”）塩基配列を含む第一
の１本鎖核酸、即ちＤＮＡ又はＲＮ　Ａを接触させると
、場合によりＤＮＡ　−ＤＮＡ、ＲＮＡ・ＤＮＡ又はＲ
ＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドを形成する。

プローブ プローブは検出すべき配列と実質的に相補的又は相同な
１本鎖塩基配列を少なくとも１種含む。

しかし、このような塩基配列は一本の連続的ポリヌクレ
オチド断片である必要はなく、非相同配列によって遮断
された２以上の個々の断片から成っていてもよい。これ
らの非相同配列は線状であるか、又は自己相補的で、ヘ
アピンループを形成することができる。更に、プローブ
の相同領域は、非相同配列、例えば相同配列が増殖のた
め挿入されたベクターのＤＮＡ又はＲＮＡを含む配列に
よって３′−末端及び５′−末端でフランキング（ｆｌ
ａｎｋｉｎｇ）されていてもよい。いずれにしても、分
析試薬として提供されたプローブは、１以上の点で問題
の試料核酸と検出可能なハイブリッド形成を示すであろ
う。線状又は環状１本鎖ポリヌクレオチドをプローブ沃
素として使用することができ、大部分又は小部分は相補
性ポリヌクレオチド鎮と重複しているが、臨界相同断片
は１本鎖の形で存在し、試料ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブ
リッド形成に利用することができる。一般に、実質的に
１本鎖の形で存在するプローブを使用するのが好ましい
。特定の分析に適当なプローブの調製は、常法で行われ
る。

標識対 本発明の原理によれば、問題のポルヌクレオチド配列の
存在に依存してハイブリッドを形成し、ハイブリッドに
標識付き試薬を結合すると、２種の標識は、それらの反
応によって生じるシグナルがバルク分析媒体に簡単に拡
散する間に遭遇物質（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ　）によって
製造されるものとは測定可能に異なるように一定の距離
内に一緒にもたらされる。種々の反応現象を本発明に適
用することができる。反応は化学的、物理的又は電気的
であるか、或いはこれらの力の組合せであってよい。

ハイブリッドを形成し、形成したハイブリッドに標識付
き試薬を結合させたときに生じる標識の環境（結合され
たハイブリッドの環境と言う）は、少なくとも一つの重
要な点でバルク媒体とは明らかに異なっていなければな
らない。ハイブリッド形成は、バルク相に比べて極在化
したハイブリッド環境を生じる標識の割合を測定するの
で、生じるシグナル応答は、分析媒体中で測定されるべ
き配列の存在に左右される。

２種の標識の好ましい反応は、一方の標識が第一の反応
に関与して拡散可能な媒介生成物を生じ、その媒介生成
物は第二の標識と第二の反応に関与して検出可能の生成
物を生じる２種の化学反応を含む。結合したハイブリッ
ドの微少環境は、バルク溶液より高度に極在化した濃度
の媒介生成物を含み、シグナルを生じる第二の標識の反
応速度を増加する。２種の標識は、それぞれ反応体とし
て又は好ましくは、触媒として反応に関与する。関係す
る触媒反応は、酵素によるものか又は酵素によらないも
のでもよい。

本発明に種々の酵素及び触媒を適用することができ、そ
の選択はこの分野の当業者が自由に選択できるであろう
。第一の反応に有用な酵素は、オキシドレダクターゼ、
特にヌクレオチド類、例えばニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）又はその還元型（ＮＡＤＨ）又
はアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）を補助因子と
して使用する酵素、又は過酸化水素若しくは他の少量の
拡散可能の生成物を生じる酵素である。若干の例を挙げ
れば、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒ
ドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ、グルコース−６−ボスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、グルコースオキシダーゼ及びウリカーゼがある
。他の種類の酵素、例えばヒドロラーゼ、トランスフェ
ラーゼ、リアーゼ及びイソメラーゼを使用することもで
きる。第二の標識が酵素であり、第一の酵素反応の生成
物が第二の酵素に対する基質又は補助因子であって、結
合したハイブリッドの環境において迅速な酵素反応を起
こすのが特に好ましい。例えば、第一の酵素が生成物と
して過酸化水素を生成するオキシドレダクターゼである
場合、第二の酵素はペルオキシダーゼであってよい。有
用な酵素の詳細なリスト及び説明は、米国特許第４．２
３３，４０２号及び同第４，２７５，１４９号明細書に
あり、これらを参上として本明細書に含める。他の有用
な系は、第一の標識として、アポ酵素又はプロ酵素に対
する補欠分子団を生成する反応を触媒する酵素を含む。

非酵素触媒は前記のように標識として作用することもで
きる。例えば、米国特許第４，１６０，６４５号明細書
参照。

標識間の好ましい反応は、更にエネルギー移動反応であ
る。第一の標識は光放出性物質、例えば螢光物質又は発
光物質であり、前者は照射したときに発光し、後者は化
学反応で発光する。光の放出は、第二の標識によって吸
収されて発光を消光するか又は吸収性標識が螢光物質自
体である場合のように第二の発光を生じる。この作用に
有用な化合物の対合は、米国特許第４，２７５，１４９
号及び同第４，３１８，９８１号明細書に詳細に記載さ
れている。

若干の好ましい螢光物質／消光物質対は、ナフタリン／
アントラセン、α−ナフチルアミン／ダンシル、トリプ
トファン／ダンシル、ダンシル／フルオレセイン、フル
オレセイン／ローダミン、トリプトファン／フルオレセ
イン、Ｎ−（ｐ−（２−ベンズオキサシリル）フェニル
コマレイミド（ＢＰＭ）／チオクローム、ＢＰＭ／８−
アニリノ−１−ナフタリンスルボネート（ＡＮＳ）　、
チオクローム／Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジ
ニトロフェニル）マレイミド（ＤＤＰＭ）及びＡＮＳ／
ＤＤＰＭである。好ましい発光物質／消光物質対はルミ
ノールとフルオレセイン、エオシン又はローダミンＳで
ある。

本発明の範囲を逸脱することなく、必要に応じて種々に
変性した標識付き試薬を使用することができる。一つの
変形では、一方の標識付き試薬が固相を含み、その固相
に結合物質及び別に標識を結合させる。固相は、反応容
器の壁又は分散された固体、例えばポリアクリルアミド
又はアガロースビードであってよい。また、結合物質を
結合可能なリガンド、例えばハプテン又はビオチンで修
飾し、ハイブリッド形成反応前又は後に標識付き抗−ハ
ブテン抗体又は標識付きアビジンの添加により標識を導
入することができる。従って、標識を直接又は中間成分
を介して間接的に結合物質に結合させうろことが判る。

結合試薬 本発明の重要な点は、プローブと問題のポリヌクレオチ
ド配列との間で、２種の特異結合試薬に対して結合部位
を有するハイブリッドを形成させることである。分析の
原理は、プローブと所望の配列とのハイブリッドを形成
させて、標識が相互の近位反応距離内に来るように２種
の結合試薬に対する各結合部位を一緒にする。２種の標
識付き試薬の少なくとも１種に対して、ハイブリッドに
特異的な結合部位を生じる系を使用することができる。

これにより、標識対の所望の極在化は、ハイブリッドを
形成したときにのみ起こることが確認されるであろう。

標識付き試薬とハイブリッドとの結合は、種々の生物学
的に誘導される物質、特に結合蛋白質、例えば免疫グロ
ブリンの特性であるように、通富、高度に特異的な非共
有結合であろう。種々の結合物質を使用して、１本鎖核
酸、例えば未ハイブリッド形成プローブ及び未ハイブリ
ッド形成試料核酸に対する結合親和性の少ないハイブリ
ッドに対して特異的結合親和性を有する結合試薬を少な
くとも１種牛じることができる。

特に好ましい結合物質は、抗−ハイブリッド結合活性を
有する抗体試薬であり、完全抗体又はその断片、又は品
用の多クローン性又は化クローン性の凝集物又は接合体
であってよい。好ましい抗体試薬は、（ｉ）ＤＮＡ・Ｒ
ＮＡ又はＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッド又は（ｉｉ　）
挿入複合体の結合に対して選択的な試薬である。１本鎖
核酸よりもＤＮＡ　−ＲＮＡ又はＲＮＡ　−ＲＮＡハイ
ブリッドに対して選択的な抗体を刺激することは現在知
られており、ＤＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドの場合には
そのような選択性を生じることは現在不可能であると占
えられている。将来、選択的ＤＮＡ　−ＤＮＡ抗体が開
発されれば、それらを明らかに本発明に適用することが
できるであろう。プローブがＲＮＡであり、試料核酸が
ＤＮＡ又はＲＮＡであるか、又はプローブがＤＮＡであ
り、試料がＲＮＡである場合、ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドに対する抗体を使用することが
できる。

更に、抗−ＤＮＡ−ＲＮＡ又は抗−ＲＮＡ　−ＲＮＡ試
薬と共に使用されるＲＮＡプローブに関して、プローブ
に含まれるすべてのヌクレオチドがリボヌクレオチド、
即ち２′−ヒドロキシ基を有するりポヌクレオチドであ
るわけではない。使用するＲＮＡプローブの基本的特徴
は、このようなハイブリッドを形成する個々の１本鎖と
分析的に有意義な程度に交差反応しないＲＮＡプローブ
を含むＤＮＡ・ＲＮＡ又はＲＮＡ・ＲＮＡハイブリッド
に対する抗体を刺激するには充分に非−ＤＮＡ性質であ
ることである。従って、プローブに含まれるヌクレオチ
ド上の２°−位の１個以上がデオキシ形で存在すること
ができるが、本発明の分析の実施に必要な抗体結合特性
は実質的に保持される。同様に、このような限定された
２゛−デオキシ修飾に加えて又はその代わりに、ＲＮＡ
プローブはそのリボースホスフェート骨格に沿って他の
２“−修飾又は一般に他の任意の修飾を有するヌクレオ
チドを含んでいてよいが、明々の１本鎖に比べて２本鎖
ハイブリッド形成生成物に対する抗体の特異性を実質的
に妨害しない。

ＲＮＡプローブにこのような修飾が存在する場合、抗体
試薬を調製するため使用する免疫原は、実質的に対応す
る修飾を有する鎖と、試料ＲＮＡを検出するか、試料Ｄ
ＮＡを検出する力〈によって実質的に未修飾のＲＮＡ又
はＤＮＡである他方の鎖とを含むのが好ましい。免疫原
における修飾された鎖が、ＲＮＡプローブ中の修飾され
た鎖と同一であるのが好ましい。免疫原は、例えばハイ
ブリッドであるポリ　（２’　−０−メチルアデニル酸
）・ポリ　（２°−デオキシチミジル酸）である。更に
、ポリ　（２’−０−エチルイノシン酸）・ポリ（リボ
シチジル酸）も免疫原である。下記のものは、ＲＮ　Ａ
プローブに含まれいてよい修飾ヌクレオチドの例である
：　２　’−ｏ−メチルリボヌクレオチド、２−０−エ
チルリボヌクレオチド、２１−アジドデオキシリボヌク
レオチド、２′−クロロデオキシリボヌクレオチド、２
′−Ｏ−アセチルリボヌクレオチド及びリボヌクレオチ
ド若しくはデオキシリボヌクレオチドのメチルホスホネ
ート若しくはホスホロチオレートである。修飾ヌクレオ
チドは、鋳型からプローブの酵素合成の間に導入の結果
としてＲＮＡプローブ中に現れうる。

例えば、アデノシン５　’　−０−（１−チオトリホス
フェート）（ＡＴＰαＳ）及びｄＡＴＰαＳは、それぞ
れＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラー
ゼに対する基質である。また、プローブを製造した後、
化学的修飾を誘導することもできる。例えば、ＲＮＡプ
ローブを水性溶剤中で緩和な条件下に酢酸無水物で２°
−０−アセチル化することができる。

ＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗体を
刺激する免疫原は、ホモポリマー又はヘテロポリマーの
ポリヌクレオチドデユープレックスを含んでいてもよい
。可能なホモポリマーデユープレックスのうち、ポリ　
（ｒＡ）　・ポリ　（ｄＴ）が特に好ましい〔北用及び
ストマー（Ｓｔｏｌｌａｒ　）（１９８２）　：　Ｍｏ
１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９　；　４１３）　、しかし
ながら、一般にヘテロポリマーデユーブレ・ノクスを使
用するのが好ましく、ＲＮＡポリメラーゼによるφＸ１
７４ウィルス粒子ＤＮＡの転写〔中里（１９８０）著；
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９　：　２８３５）を含めて製造
することができる。選択したＲＮＡ　−ＤＮＡデユープ
レックスをメチル化蛋白質に吸着させるか又は常用の免
疫原性担持物質、例えばウシ血清アルブミンに結合させ
、所望の宿主動物に注射する〔ストマー（１９８０）　
、Ｍａｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７０　：　７０も参
照〕。ＲＮＡ　−ＲＮＡデユープレックスに対する抗体
は、ウィルス、例えばレオウィルス又は殊にサトウキビ
に感染するフィシ（Ｆｉｊｉ）病ウィルス由来の２本鎖
ＲＮＡに対して調製することができる。更に、ホモポリ
マーデユープレックス、例えばポリ　（ｒｌ）　・ポリ
　（ｒＣ）又は殊にポリ　（ｒ＾）・ポリ　（ｒＵ）を
前記のように免疫するために使用することができる。Ｒ
ＮＡ　−ＤＮＡ及びＲＮＡ・ＲＮＡハイブリッドに対す
る抗体に関する情報は更に、１９８４年６月１日に出願
された米国特許出願第６１６．１３２号明細書に記載さ
れている。

挿入複合体に対する抗体を、通常、カチオン性蛋白質又
は蛋白質誘導体（例えば、メチル化ウシ血清アルブミン
）とアニオン性挿入物質−核酸複合体との間のイオン性
複合体を含む免疫原に対して製造することができる。理
想的には、挿入物質を２本鎮核酸に共有結合させる。或
いは、挿入物質−核酸接合体を担体蛋白質に共有結合さ
せることもできる。免疫原の核酸部分は、抗体の特異性
が一般に関係する特定の塩基配列←左右されないので、
分析ハイブリッドに見られる特定の対合配列を含むか又
は他の任意の所望の配列を含んでいてもよい。挿入複合
体に対する抗体に関する情報は、更に、１９８３年１２
月１２日に出願された米国特許第５６０．４２９号明細
書に記載されている。

前記のように、抗体試薬は完全な抗体、抗体断片、多官
能性抗体凝集物又は一般に抗体由来の１個以上の特異結
合部位を含む任意の物質から成る。

完全抗体の形である場合、これは公知の免疫グロブリン
、例えばＩｇＧ　、　ＩｇＭ等の類及び小分類に属する
ことができる。ハイブリッド形成プローブに対する特異
結合親和性を保有するこのような抗体の断片、例えば、
従来Ｆａｂ、Ｐ　（ａｂ’　）及びＦ　（ａｂ’　＞２
として知られているｔｇｃの断片を使用することもでき
る。更に、免疫グロブリン又はその断片の凝集物、ポリ
マー、誘導体及び接合体を必要に応じて使用することが
できる。

抗体試薬に対する免疫グロブリン源は、任意の利用可能
な方法、例えば音用の抗血清法及び単クローン法で得ら
れる。動物、例えばマウス、ウサギ、モルモット又はヤ
ギを適切な免疫原で免疫することを含む周知の技術によ
って抗血清を得ることができる。また、体細胞ハイブリ
ッド形成技術（一般に、単クローン性抗体と言われるも
のを生じる）によって、適切な免疫原を使用して、免疫
グロブリンを得ることができる。

挿入複合体に対して選択的な抗体試薬を結合試薬の一つ
として使用する場合には、種々の挿入化合物を使用する
ことができる。一般に、挿入化合物は低分子量で、平面
的で、通常、芳香族であるが、しばしば多環式の、通常
、塩基対の間に挿入することによって２重鎮核酸、例え
ばＤＮＡ・ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ・ＲＮＡ
デユープレックスと結合しうる分子であるのが好ましい
と言うことができる。−次結合のメカニズムは、通常、
非共有結合であり、共有結合は、挿入物質が挿入される
デユーブレックス鎖の一方又は両方上で隣接化学基と共
有結合を形成する反応性又は活性化可能な化学基を有す
る場合に、第二工程として起こる。挿入の結果、隣接塩
基対を正常な分離距離の約２倍に広げ、デユープレック
スの分子長を増加する。更に、挿入物質を適応させるに
は、約１２〜３６度の二重らせんの巻き戻しが起こらな
ければならない。一般的概要及びそれ以上の情報は、レ
ーマン（Ｌｅｒｍａｎ）　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、３　：１　Ｂ　（１９６１）　；ブルームフィールド
（Ｂｌｏｏｍｆ　１ｅｌｄ）ら、“フィジカル・ケミス
トリイ・オブ・ニュークリイク・アシッド（Ｐｈｙｓｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　）″、７章４２９〜４７６頁、ハーバ−嗜ア
ンドｅロウｅ（Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗｅ　）、
ニューヨーク（１９７４）　；ワーリング（Ｗａｒｉｎ
ｇ）ネイヂ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　２１９　：　１３２
０　（１９６Ｂ）　；　ハートマン（ｌｌａｒｔｍａｎ
ｎ）ら、＾ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、、ｕｎｇ＋、口ｄ。

７　：　６９３　（１９６８）　；リパート（Ｌｉｐｐ
ａｒｄ　）、＾ｃｃｔｓ、　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ、　１
１：２１１　（１９７Ｂ）　；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏ
ｎ）　、インターカレイション・ケミストリイ（Ｉｎｔ
ｅｒｃａｌａｔｉｏｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　（１
９Ｂ２）　４４５；及びベルマン（Ｂｅｒｍａｎｎ　）
ら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　１０　：　８７　
（１９８１）　ｉ並びに前記米国特許出願第５６０，４
２９号明細書から得ることができる。挿入物質は、例え
ばアクリジン染料、例えばアクリジンオレンジ、フエナ
ントリジン類、例えばエチジウム、フェナジン類、フロ
クマリン類、フェノチアジン類及びキノリン類である。

挿入複合体は、ハイブリッドを形成すると、挿入複合体
が形成するように、挿入物質を化学的に結合して有する
相補性１重鎮領域で修飾されたプローブを使用すること
によってハイブリッド形成の間に分析媒体中で形成され
る。このような結合を達成するため、本質的に任意の便
利な方法を使用することができる。通常、反応性、好ま
しくは光反応性挿入物質を用いて挿入を行い、次いで結
合反応を行うことによって結合が形成される。特に有用
な方法はアジド挿入物質に関係する。長波長紫外線又は
可視光線に曝すと、反応性ナイトレンが容易に発生する
。アリールアジドのナイトレンは転位生成物よりも挿入
反応生成物を優先する〔ホワイト　（Ｗｈｉｔｅ　）　
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

４６　：　６４４　（１９７７）参照〕。代表的アジド
挿入物質は３−アジドアクリジン、９−アジドアクリジ
ン、エチジウムモノアジド、エチジウムジアジド、エチ
ジウムダイマーアジド〔旧ｔｃｈｅｌｌら、ＪＡＣ３１
０４：　４２６５　（１９Ｂ２）　）　、４−アジド−
７−クロロキノリン及び２−アジドフルオレンである。

他の有用な光反応可能な挿入物質は、ピリミジン基を有
する（２＋２）環状付加物を形成するフロクマリンであ
る。アルキル化剤、例えばビス−クロロエチルアミン類
及びエポキシド類又はアジリジン類、例えばアフラトキ
シン類、多環式炭化水素エポキシド、マイトマイシン及
びノルフィリンＡを使用することもできる。次いで、挿
入物質修飾デユープレックスを修飾して、修飾１本鎮プ
ローブを生成する。

前記の操作を反復すると、少なくとも１種の結合試薬は
前記の型を有していなければならないが、所望の効果を
達成するため、ハイブリッドと他の核酸（プローブ及び
試料材料を含めて）のを区別する必要はないので、他の
結合試薬については大きい選択範囲がある。従って、第
二の結合試薬が前記の試薬に使用されるのと同一である
場合には、もちろん、第二の標識で標識することにより
分析試薬としては究極的に異なることを除い゛ζ前記の
試薬に使用するのと同−又は異なる結合試薬であフてよ
い。両方の結合試薬のための挿入複合体の結合に対して
選択的な抗体試薬を使用する場合には、通富、可溶性化
合物として添加するのとは反対に、プローブに化学的に
結合した挿入物質を有するように修飾されたプローブを
使用するのが好ましい。

また、第二の結合試薬はプローブを結合する任意の物質
であってよい。従って、これは核酸に非特異的に結合す
る抗体試薬、例えば抗−ＤＮＡ・ＤＮＡであってよい。

別の実施態様では、特異結合リガンド部分を含むプロー
ブをこのようなりガント部分に対する結合相手である非
特異結合試薬と共に使用する。このような場合には、リ
ガンド部分／結合相手対を、ハプテン／抗体、抗原／抗
体、ビオチン／アビジン、レクチン／多糖類、ホルモン
／受容体蛋白質等のような公知物質から選択することが
できる。この点については、英国特許第２，０１９，４
０８号明細書、欧州特許出願第６３，８７９号及び同第
９７，３７３号明細書並びにＰＣＴ公開出願第８３−１
４５９号及び８３−２２８６号公報を参照する。

結合したハイブリッドの臨界的微少環境が試料／プロー
ブニ重鎖のハイブリッド形成相補性領域の一部分又は全
体において作られるのが一般に好ましいが、原則として
、このような微少環境はそのような相補性領域及びフラ
ンキング（ｆ　ｌａｎｋｉｎｇ）領域の境界でも起こり
うる。このことは、前記のような結合試薬を使用して起
こりうる。更に、非特異的結合試薬としてプローブの２
本鎮フランキング領域上の結合部位に対する結合物質を
使用することができる。このような結合部位／結合相手
対は、例えばプロモーター配列（例えば、１ａｃ−プロ
モーター、ｔｒｐ−プロモーター及びバタテリオファー
ジと会合したプロモーター）／ポリメラーゼ；ｌａｃオ
ペレーター／Ｉａｃ　リプレッサー蛋白質；及び抗原性
ヌクレオチド及び配列（例えばＺ−ＤＮＡ及び微量ヌク
レオチド、例えば５−ハロデオキシウリジン）／これに
対する抗体である。

次に、図面及び実施例に基づいて、本発明の分析法の若
干の実施態様を説明する。

第１図に示した方法は、問題の試料配列がＲＮＡである
か、又は試料配列がＤＮＡであり、プローブがＲＮＡで
ある場合に、ＲＮＡ又はＤＮＡである未修飾ポリヌクレ
オチドプローブを使用したものである。結合試薬は、場
合によりＲＮＡ　−ＤＮＡ又はＲＮＡ・ＲＮＡハイブリ
ッドに対して選択的な同−又は異なる抗体試薬（＾ｂ）
である。一方の抗体試薬はグルコースオキシダーゼ（Ｃ
ＯＤ）で標識され、他方はペルオキシダーゼ（Ｐ　ＯＤ
）で標識されている。グルコース及び過酸化水素に対す
る発色指示薬の存在で、発色の速度は惹起するハイブリ
ッド形成の程度に左右される。結合したハイブリッドに
おいては、グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダー
ゼは、距離ａの範囲にもたらされて、ペルオキシダーゼ
に対して過酸化水素の拡散が速いため発色速度が増加す
る。バルク媒体において、過酸化水素は、著しく異なる
速度で現れる発色を起こすためには、平均して距ｆｉｉ
ｔｂだけ拡散しなければならない。場合により、カタラ
ーゼは、バンクグラウンドの色形成を減少させるために
結合したハイブリッドの微少環境から拡散して出る過酸
化水素をすべて有効に破壊するのに充分な濃度でバルク
溶液中に含まれていてもよい。

ビオチン（Ｂｉｏ　）を代表的リガンドとして選択して
、リガンド修飾プローブの使用を第２図に示す。この場
合、ＣＯＤ標識結合試薬は、場合によりＲＮＡ　−ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ・ＲＮＡに対する抗体であり、他方の結合
試薬はＰＯＤ標識アビジン（Ａｖ）である。方法Ａの場
合と同様に発色を読み取る。

第３図に示した方法では、プローブは、方法Ｂにおける
ようなビオチン及び化学的に結合する挿入物質（１）で
二重に修飾されている。■を含む挿入複合体に対する抗
体を螢光物質（Ｆ）で標識し、アビジンを消光物質（Ｑ
）で標識する。螢光物質及び消光物質標識は、第一の波
長の光で照射（ｈｖ＋　）されると、放射されたエネル
ギー（ｈｖ２）が消光物質に吸収され、検出されなくな
るように、結合ハイブリッドにおけるエネルギー移動距
離ａに来る。他方、バルク熔液中の螢光物質標識抗体は
、平均して、消光物質からｂの距離にとどまり（有効に
エネルギー移動を起こすほど充分には近くない）、螢光
が観察される。検出されるｈｖ２光の量は、惹起するハ
イブリッド形成の量に逆比例する。

反応混合物 分析すべき試験試料は、問題となる任意の媒体であって
よく、通常、医学、獣医学、環境、栄養又は工業上重要
な液体試料である。尿、血液（血清又は血漿）、羊水、
乳、脳を髄液、唾液、排泄物、肺アスピレー）　（ａｓ
ｐｉｒａｔｅｓ　）　、喉スワブ（ｓｗａｂ）　、生殖
器スワブ及び浸出物、直腸スワブ並びに鼻咽頭アスピレ
ートを含めて、ヒト及び動物の標本及び体液を特に、本
発明方法により分析することができる。試験すべき患者
又は他の源から得られる試験試料が、例えば細胞に含ま
れるような２重鎮核酸を主として含む場合、試料を処理
して核酸を変性し、必要に応じてまず、細胞から核酸を
放出させる。核酸の変性は、沸騰水中での加熱又はアル
カリ処理（例えば０．ＩＮ水酸化ナトリウム）によって
達成するのが好ましく、この処理を必要に応じ、同時に
細胞を溶解するため使用することができる。また、核酸
の放出は、例えば機械的破壊（凍結／解凍、研磨、音波
処理）、物理／化学的破壊〔洗浄剤、例えばトライトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）　、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　、ド
デシル硫酸ナトリウム、アルカリ処理、浸透圧シヨツク
又は熱〕、又は酵素溶解（リゾチーム、プロテイナーゼ
Ｋ、ペプシン）によって得られる。生じる試験媒体は本
発明のハイブリッド形成法により分析することのできる
１本鎖の形で核酸を含む。これらの状況下で、ＲＮＡ　
−ＤＮＡハイブリ、ノドを標識付き抗体試薬を用いて検
出する場合、試料中のｍＲＮＡ及びｒＲＮＡを常法で、
例えばアルカリ条件、例えば試料中の核酸を変性するた
め使用するのと同じ条件で処理することによって、結合
反応に関与しないようにすることができる。

公知のように、分析には種々のハイブリッド形成条件を
使用することができる。代表的には、ハイブリッド形成
は、温度をわずかに高めて、例えば約３５〜７５℃で、
通常的６５℃で、ｐＨ約６〜８の緩衝剤を含む、適切な
イオン濃度を有する溶液（例えばｌＸ５ＳＣ＝０．１５
Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム
の場合５ＸＳＳ　Ｃ，ｐＨ７、０）中で進行する。低い
ハイブリッド形成温度が望ましい場合、水素結合試薬、
例えばジメチルスルホキシド及びホルムアミドが含まれ
ていてもよい。ハイブリッドを形成させるのに必要な試
料鎖とプローブ鎮との間の相補性の程度は、条件の厳密
さに左右される。厳密さを決定するファクターは公知で
ある。

通席、ハイブリッド形成のため選択される温度条件は、
形成されるハイブリッドへの抗−へイブリッド試薬の結
合及び標識応答の検出とは矛盾するであろう。従って、
抗−ハイブリッド結合工程及び標識検出工程は、ハイブ
リッド形成工程の完了後に行う。反応混合物を通常、約
り℃〜約４０℃の範囲の温度にし、結合及び検出工程を
実施する。塩及び／又はボルムアミド濃度が充分に高く
て抗体結合反応を著しく妨害する場合には、抗体試薬の
添加前にハイブリッド形成混合物を希釈するのが望まし
い。

試薬系 本発明は、更に試薬系、即ぢ、所望の分析法を実施する
のに必要な必須成分をすべて含む試薬組成物又は手段を
提供するものである。試薬系は、工業的に包装された形
で、試薬が相溶性である場合には組成物又は混合物とし
て、試験具構造、或いは更に普通には試験キット、例え
ば必要な試薬を保持し、通常、分析を実施するための指
示文書を含む１１１１以上の容器、装置等の組合せ包装
物としセ提供される。本発明の試薬系は、本明細書に記
載する種々のハイブリッド形成法を実施するためのすべ
ての構造体及び組成物を含む。

すべての場合、試薬系は（１）本明細書に記載する核酸
プローブ並びに（２）第−及び第二の標識付き結合試薬
を含む。試薬系の試験キットは、更に、補助的化学薬品
、例えばハイブリッド形成溶液の成分及び試験試料中の
２重鎮核酸を１重鎮形に変換しうる変性剤を含んでいて
よい。試料から１重鎮核酸を放出させるため試料を処理
するため、化学的熔解剤及び変性剤、例えばアルカリを
含むのが好ましい。

次に、実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明は
これに限定されるものではない。

実施例ｌ ＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドに対する標識付き抗体で
監視する細菌ＲＮＡのハイブリッド形成分析Ａ、ステユ
アート（５ｔｕａｒｔ）らの方法（（１９８１）ＰＮＡ
Ｓ　７Ｂ　、３７５１）によって、１（ＮＡ　−ＤＮＡ
ハイブリッドに対する単クローン性抗体を産生せしめる
。抗体は、ニューシャーシー州ピスカタウェイのファル
マシア・ファイン・ケミカルス（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｉ
ａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ　）から入手しうる蛋
白質Ａセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）上での親
和性クロマトグラフィーによって腹水から単離する。

蛋白質Ａセファロース１ｍｌ当たり腹水的Ｌｍｌをカラ
ムに施し、カラムをｐｕｓ、ｏの５０ｍＭとシン緩衝液
、０．１５　Ｍ　ＮａＣ１で２８０ｎｍでの流出液の吸
光度が０．０５未満になるまで洗浄する。結合した抗体
をｐｕａ、ｏの０．１　Ｍグリシン緩衝液で熔離し、２
８０ｎｍで吸光度を測定することによって抗体を検出す
る。抗体プールをｐＨ８，５のＩＭビシン緩衝液の添加
によりｐＨ５，０以上に調節する。

抗体を、ブレイクスリー（Ｂｌａｋｅｓｌｅｅ　）及び
バインス（Ｂａｉｎｅｓ）　（１９７６）　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ。

１３　：　３０５の方法によって５−　（４，６−シク
ロロトリアジンー２−イル）−アミノフルオレセイン（
ＤＴＡＦ）（オレゴン州ジャンクション・シイティのモ
レキュラー・ブローブス社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏ
ｂｅｓ、　Ｉｎｃ、）　）で軽く標識する。硼酸塩緩衝
液３６１μｌ中にＤＴＡＦを１．４４マイクロモル含む
溶液を０．０１４ｍＭ抗体２．４ｍｌに添加し、２５℃
で１時間反応させる。反応混合物をｌＸ２５ｃＩ１１の
バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ−６０Ｇ　（カリフォ
ルニア州すソチモンドのバイオランド・ラボラトリイズ
（Ｂｉｏｌ？ａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）
上で、溶離剤としてｐ１１７．０の０．１Ｍ燐酸ナトリ
ウム緩衝液、０．ＩＭＮａＣｌを用いてクロマトグラフ
ィーする。１ｍｌのフラクションの２８０　ｎｍでの吸
光度を監視し、第一のピークを含むフラクションを集め
る。ＤＴＡＦ／蛋白質のモル比を、ザ（Ｔｈｅ　）及び
フエルトカンプ（Ｐｅｌ　ｔｋａｍｐ）著（１９７０）
　、イムノミシイ（［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　１Ｂ、８
６５の方法で測定する。

Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネートと反応させ、その後、ジチオスレイトールで
緩和に還元することによって抗体中にｋＲ’ｄチオール
基を導入する〔カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ　）ら（１
９７８）著、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７３．７２３
〕。

Ｂ、グルコースオキシダーゼ抗体接合体を下記のように
して製造する。グルコースオキシダーゼ〔イリノイ州ネ
イパービルのマイルス・サイエンティフィック（Ｍｉｌ
ｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手〕に〔古式ら、
（１９７９）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１
０１．３９５（１９７９）　）に記載されているように
Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）−マレイ
ミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣ
Ｃ）との反応社よりマレイミド基を導入する。このグル
コースオキシダーゼを直ちに、２倍モル過剰の前記のチ
オール誘導体化抗体と混合する。古式らの反応条件及び
精製方法に従う。精製した接合体の酵素含有量を、酵素
活性の測定によって測定し、抗体含有量を、ザ及びフェ
ルトカンプの前掲文献に記載されているＤＴＡＦ含有量
の測定によって測定する。

Ｃ６西洋わさびペルオキシダーゼをＳＭＣＣと反応させ
、石川ら（１９８３）著、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ　４．２０９の方法によってチオール誘導体化抗体に
結合させる。

Ｄ、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）からの１６ｓ　リポソ
ームＲＮＡに関する遺伝子からの５６５塩基対断片をｐ
ＢＲ３２２ベクターの！Ｉ　ｉ　ｎ　ｔ　ｍ部位の間で
クローニングした（Ｂｒｏｓｉｕｓ　（１９７８）　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　７５　：　４８０１）　。１ｌｉｎｔｌ［［
制限酵素エンドヌクレアーゼで消化することによって断
片を摘出する。

Ｅ、１ｍｌ当たり細菌１０’個以上を含む尿標本を強化
培養液中に入れて３倍に希釈し、細胞集団が１ｍｌ当た
り約１０９個に達するまで３５°Ｃで培ｒした。培養液
の既知量を試験管に移して１試験管当たり細菌１０５〜
１０日にする。試験管を１０分間、１０．０００Ｘｇで
遠心分離し、上澄液を捨てる。ｐ１１７の１０ｍＭ）リ
ス塩酸塩緩衝液、０、１　Ｍ　ＮａＣ１及び５ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸酢酸中白リゾチーム〔ミズーリ州セ
ントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　１０■を試験管１個に２０μβ
づつ入れて細胞を溶解させる。１５分後、ホルムアミド
６０％と０．１６Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液４０％から成
る溶液８０μｍ２　、　ｐＨ６、５，１，４４Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ及び０．１％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを
加える。

ｐＨ６，５の０．２Ｍ燐酸ナトリウム緩ｉｈ液中の、Ｄ
部に記載したＤＮＡプローブを沸騰水浴中で５分間、変
性し、氷上で冷却する。各試験管に２０μｊ！　（８０
ｎｇ　ＤＮＡ）を加え、５５℃で１８時間静置する。次
に、５００μｌのペルオキシダーゼ標識抗体及びグルコ
ースオキシダーゼ標識抗体を各試験管に加え、室温で２
時間放置する。これらの酵素接合体の濃度を予備実験で
最適にし、ハックグラウンド比に対して最適のシグナル
を生じるようにする。

下記の基質試薬を製造し、３時間以内に使用する：　０
．　Ｉ　Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ６，５，０，１％ウシ
血清アルブミン、２０ｍＭ３．５−ジクロロ−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホネート、０．１Ｍグルコース、１
ｍｌ当たり０．０１単位のカタラーゼ及び０．２ｍＭ４
−アミノアンチピリン。１ｍｌの基質試薬を各試験管に
加え、３７℃で３０分静置する。

５１０ｎｍでの吸光度を記録する。１試験管当たりの細
菌の数が増加するのにしたがって、リポソームＲＮＡ　
−ＤＮＡハイブリッドの量が増加し、その結果、吸光度
が増加するであろう。

実施例２ ビオチニル化ＤＮＡプローブを使用して細菌リポソーム
ＲＮＡを検出するハイブリッド形成分析Ａ、ビオチン−
１１−ｄＵＴＰ及びストレプトアビジン−西洋わさびペ
ルオキシダーゼ接合体は、ニューヨーク州ニューコーク
のＥｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　Ｉｎｃ。

から入手しうる。

Ｂ、リポソームＲＮＡに関する５６５塩基対プローブを
ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら著、（１９８１）　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋７８　：　６
６３３の方法によってビオチン−１１−ｄｔｌＴＰで標
識する。

Ｃ０実施例１、Ｅ部に記載したようにして細菌を処理す
る。溶解物をホルムアミド６０％とｐＨ６，５のＯ，１
６Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液４０％から成る溶液８０　ｐ
　ＩＩ、　１．４４Ｍ　ＮａＣ１及び０．１％（Ｗ／■
）ドデシル硫酸ナトリウムと混合する。ビオチニル化し
たＤＮＡプローブを沸騰水浴中で５分間変性し、氷上で
冷却する。プローブを０．２　Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液
（ａｌｌ　６．５　）中に入れ、８０ｎｇのプローブを
含む液２０μｌを各抽出液に加え、６５℃で１８時間静
置する。５００μｌのペルオキシダーゼ標識ストレプト
アビジン及びＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドに対するグル
コースオキシダーゼ標識抗体を各試験管に加え、室温で
２時間放置する。これらの酵素接合体の濃度を予備実験
で最適にしてバンクグラウンドに対して最高のシグナル
比を生じるようにする。

実施例１、Ｄ部に記載した基質試薬１ｍｌの添加により
酵素反応を開始させる。これらの反応を３７℃で３０分
進行させ、次いで５１０ｎｍでの吸光度を記録する。１
試験管当たりの細菌数が増加するに従って、吸光度が増
加するであろう。

実施例３ 臭化エチジウムを挿入したプローブを使用する細菌リポ
ソームＲＮＡのハイブリッド形成分析Ａ、子牛胸腺ＤＮ
Ａ　（シグマ・ケミカル社）をプロナーゼで処理して蛋
白質汚染物を消化し、エタノール中で沈澱さセル。ＤＮ
ＡをｐＨ８，（１）２０ｍＭトリス塩酸塩緩衝剤、０．
２　Ｍ　ＮａＣｌに溶解させる。

臭化エチジウムの光反応性誘導体、即ぢ８−アジドエチ
ジウムをグレイブス（Ｇｒａｖｅｓ）ら（１９７７）著
、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａｓ　
４７９　：　９８の方法で製造する。ＤＮＡの塩基対的
１ｍＭ及び８−アジドエチジウム０．５ｍＭを含む溶液
を製造する。この溶液を２０〜３０℃に保持した水浴中
に浸漬したガラス反応容器中で攪拌し、１５０ワツトの
スポットライトから１０〜２０ｃｍのところで６０分間
光分解する。光分解に続いて、水を飽和したｎ−ブタノ
ールで抽出することにより非共有結合エチジウム誘導体
を除去する。ＤＮＡに結合したエチジウムの量を、光分
解したエチジウムアジドに関するＥ　＝　４　Ｘ　１０
３Ｍ−’ｃｍ−”の吸光係数、ＤＮＡに結合した光分解
エチジウムに関するＡ　と八　との関係（Ａ　＝　（Ａ
　Ｘ３．４）　−０，０１１３及び標識する所定のＤＮ
ＡのＤＮＡ塩基対の濃度に関するＥ　−１，３２Ｘ　１
０’　Ｍ−”ｃｍ−１を使用して算出する。

Ｂ、メチル化サイログロブリンの製造 ウシサイログロブリン（シグマ社”）１００■を無水メ
タノール１０Ｉｌ＋１及びメタノール中の２．５５Ｍ１
ＩＣ１４００μｌと混合する。この混合物を回転ミキサ
ーで室温で５日間攪拌する。沈澱を遠心分離により集め
、メタノールで２回、エタノールで２回洗浄する。次に
真空下に一夜乾燥する。乾燥粉末的８２■が得られる。

Ｃ，ＤＮＡ−エチジウム複合体をストラー（Ｓｔｏｌｌ
ｅｒ　）　（１９８０）著、メソソヅ・イン・エンツモ
ロジ４　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　）　７０　：　７０に記載されているようにメチル
化サイログロブリンと混合することによって免疫原を製
造する。フロインドアジュバント中の免疫原をマウス１
匹当たり２０〜５０μｇを注射し、最初の免疫処置後２
週間に始めて毎週ブースター注射をする。エリザ（ＥＬ
ＩＳ＾）操作によって抗体力価を測定し、ハイブリドー
マを製造し、標準操作によって抗体をスクリーニングす
る〔ガルフル（Ｇａｌｆｒｅ）及びミルスタイン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ）著（１９８１）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ。

、７３：１；ボイリア（Ｐｏｉｒｉｅｒ　）ら（１９Ｂ
２）　？、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　、７９　：　６４４３）　、１０以上の会合定
数を有するＤＮＡ−エチジウム複合体を結合するが、１
本鎮若しくは２本鎖ＤＮＡ又はエチジウム基単独を結合
しない抗体の選択操作を企画した。

ＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドに対する抗体に関して、
実施例１、Ａ部に記載したようにして抗体を腹水から単
離する。この抗体をＤＴＡＦで軽く標識し、グルコース
オキシダーゼに結合させる。

Ｄ、　ｐＫＫ　１１５プラスミドから５６５塩基対断片
をＭ１３　ｍｐ９　（メソシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）
及びビーリア（Ｖｉｅｒｉａ）著（１９８２）　Ｇｅｎ
ｅ　１９．２６９　；マサチュセソツ州ビバーリイの二
ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）から市販）の旧ｎｄ１１１
部位にクローニングする。断片を２つの方向で挿入し、
リポソームＲＮＡに対して相補的なウィルス粒子ＤＮＡ
とのクローンを更に研究のため選択する。

メリーランド州ガイサースブルクのベテスダ・リサーチ
・ラボラトリイス（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手しうる大腸菌（
Ｅ、　ｃｏｌｉ　）ＪＭ１０３　（ΔＩａｃ、　ｐｒｏ
）　ｔｈｉ　、　ｓｔｒ＾、５ｕｐＥ、、ｅｎｄ＾、５
ｂｃＢ１５、ｈｓｄＲ４、Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏ＾
Ｂ　％　１ａｃｌｑ　％ＺΔＭ１５〕中で修飾Ｍ１３　
ｍｐ９を増殖させる。ファージをポリエチレングリコー
ルで沈澱させて培養液から単離し、ウィルス粒子ＤＮＡ
をフェノール／クロロホルム抽出（マニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら著（１９８２）　、モレキュラー・ク
ローニング・ア・ラボラトリイ・マニュアル、コールド
・スプリング°ハーバ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ
＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ）　）に
よって精製する。

オリゴヌクレオチドプライマー（ＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡ
ＣＡＣＡＡＣ、ニュー・イングラントンバイオラプスか
ら入手）は、挿入されたリポソームＲＮＡプローブの５
’−ＯＨ部位で、Ｍ１３　ｍｐ９ベクターに対して相補
性である。このプライマーを使用して大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼ〔レナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片〕によって、デ
オキシヌクレオチドトリホスフェートの一定量の存在で
Ｍ　１３配列の複製を開始する。挿入されたリポソーム
ＲＮＡプローブが１本鎖のままであり、ハイブリッド形
成に利用されうる〔ヒュ（Ｈｕ）及びメソシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　）著（１９８２）　Ｇｅｎｅ１７　：　２
７１　）程度に限定される。

この修飾Ｍ１３プローブを８−アジドエチジウムと混合
し、光分解し、前記のＡ部に記載したようにして精製す
る。

Ｅ、実施例１、Ａ部に記載したようにして細胞を調製し
、溶解する。溶解物を実施例１、Ｅ部に記載したホルム
アミドハイブリッド形成溶液８０μｌと混合する。エチ
ジウム−プローブ複合体（１００ｎｇＤＮＡ）（Ｄ部＞
　２０ｔｔ１２を抽出物に添加し、６５℃で１８時間培
養し、ＲＮＡ　−ＤＮＡに対するペルオキシド標識抗体
及びエチジウムＤＮＡ複合体に対するグルコースオキシ
ダーゼ標識抗体５００μｌを各試験管に加える。混合物
を室温で２時間放置する。

この培養時間の終わりに、１．０ｍｌの基質試薬（実施
例１、Ｅ部）を加え、３７℃で３０分間培養する。■試
験管当たりの細菌数が増加するに従って、吸光度は増加
するであろう。

実施例４ 螢光物質−消光物質対で監視するサイトメガロウィルス
（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　）に対するハイブ
リッド形成分析 Ａ、サイトメガロウィルスゲノムの１５００塩基対断片
をＭ１３＋ｎｐ８ベクター中にクローニングする。

挿入された断片の相補的複製物をビオチニル化ヌクレオ
チドトリホスフェートの存在でＤＮＡポリメラーゼを用
いて試験管内で合成してビオチニル化プローブを得る。

このプローブを更に、挿入複合体としてエチジウム基の
共有結合によって修飾する。

サイトメガロウィルスＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物を調製
し、断片をプラスミドｐＡｃＹｃ１８４　（タマシロ（
Ｔａｍａｓｈｉｒｏ　）　ら著（１９８２）　Ｊ、　Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ　４２　Ｆ５４７〕中にクローニングす
る。大腸菌ＨＢＩＯＩ　ＲｅｃＡ−中でプラスミドを増
殖させ、タマシロの文献に記載されているＥｃｏＲＩ　
ｅ断片をプローブの調製ニ使用する。ＥｃｏＲＩ制限酵
素で消化することによってプラスミドから断片を除去し
、Ｍ１３　ｍｐ８ベクターにニュー・イングランド・バ
イオラプス）のＥｃｏＲ１部位中にクローニングし、こ
れを大腸菌ｋ１２ＪＭ１０１宿土中で増殖させる。ウィ
ルスをポリエチレングリコールで沈澱させて培養液から
単離し、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により
精製する。

ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ　ｅ挿入体の３’−ＯＨ末端付近
のＭ１３　ｍｐ８配列の領域に対して相補的な配列ＧＴ
ＡＡＡ八ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ　にニュー・イングラ
ンド・バイオラプス）を有する１７塩基プライマーでア
ニールする。１０ｍＭ　ＭｇＣｈを含むｐＨ８，０の２
０ｍＭ）リス塩酸塩緩衝液中のＤＮＡをモル過剰のプラ
イマーと混合し、５５℃で４５分静置する〔バンキーア
（Ｂａｎｋｉｅｒ　）及びバレル（Ｂａｒｒｅｌｌ　）
著（１９８３）　、テクニクス・イン・ニュークリック
・アシッド・バイオラプストリイ（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　）、アイルランドのエルスビイア（Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ）　）。次に、反応混合物をｄＡＴＰ、　ｄ
ＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びＢｌｏ−１１−ｄυＴＰ　（Ｅ
ｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍから入手）中で１５ｍＭにし、
最後に、ＤＮＡポリメラーゼＩのレナウ断片を添加する
。この反応混合物を２５℃で予備実験で決定した時間だ
け静置する。これらの実験で、試料を種々の時間に反応
混合物から採取し、アルカリアガロースゲル中で電気泳
動する〔マニアティスらの前掲文献〕。目的は、１Ｅｃ
ｏＲＩ　ｅ挿入体を介して延びるビオチン標識プローブ
を生じる反応条件を見つけることである。この操作では
、長さの若干具なるビオチン標識ＤＮＡを生じるであろ
う。

しかし、この目的で、ＥｃｏＲＩ　ｅ挿入体を越えてＭ
１３配列中に標ＡＱｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａを延長することも
できる。

次の工程は、挿入複合体としてのビオチン標識ＤＮＡに
エチジウム基を共有結合させることである。これは、グ
レイプスらの前掲文献の方法により製造した８−アジド
エチジウムでＤＮＡを光分解させることによって達成さ
れる。ビオチン標識ＤＮＡをフェノール／クロロボルム
で抽出し、エタノールで沈澱させる。これを０．２　Ｍ
　ＮａＣ１を含むｐＨ８，０の２０ｍＭ１−リス塩酸塩
緩衝液中に熔解させてＤＮＡ約５０μｇ／ｍｌを作り、
８−アジドエチジウムで０．５ｍＭにする。混合物を１
５０ワツトのスポットライトから１０〜２０ｃｍのとこ
ろで１時間光分解させる。混合物をこの期間の間、ガラ
ス水浴中に浸漬したガラス反応容器中で混合物を攪拌す
る。浴を２０〜３０℃の反応温度に保持する。

次に、非共有結合８−アジドエチジウム及び光分解副生
成物を水を飽和したｎ−ブタノールで連続抽出すること
によって除去する。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ト
リス緩衝液に溶解させる。

共有結合したエチジウムを実施例３、Ａ部に記載したよ
うにして分光光度系で測定する。

８−アジドエチジウムは、はとんど専ら、挿入複合体が
形成しうる２本鎖領域で、ＤＮＡに共有結合する。目的
は、塩基対１０〜５０当たり１個のエチジウム基を共有
結合することである。光分解反応は１時間でほとんど完
了するので、反応時間を現象するか、又は８−アジドエ
チジウム濃度を低下することによって挿入を減少させる
ことができる。新しい８−アジドエチジウムを用いて光
分解を繰り返すことにより挿入を増加することができる
。

最終工程は、Ｍ１３　ｍｐ８鋳型からビオチン標識プロ
ーブ／エチジウム修飾プローブを分離する工程である。

標識プローブは、Ｍ１３　ｍｐ８鋳型より実質的に小さ
く、アルカリアガロースゲル電気泳動（マニアティスら
の前掲文献）によって単離することができる。プローブ
を含むゲルをアガロースゲル平板から切断し、マニアテ
ィスの文献に記載されているようにして、電気溶離によ
って回収する。

Ｂ、エチジウム−ＤＮＡ挿入複合体に対するフルオレセ
イン標識抗体 実施例３、Ｂ部に記載されたエチジウム−ＤＮＡ複合体
に対する単クローン性抗体をｐＨ９，０の０、１　Ｍ硼
酸ナトリウム緩衝液中で透析し、抗体５■を含む０．５
ｍｌを硼酸塩緩衝液中のｌ０ｍＭ　５（４，６−シクロ
ロトリアジンー２−イル）−アミノフルオレセイン（オ
レゴン州ジャンクション・シティのモレキュラー・ブロ
ーブス社）０．５ｍｌと混合する。混合物を室温で７時
間放置し、次いでｐＨ８，０の０．　Ｉ　Ｍ　Ｆリス塩
酸塩緩衝液中でバイオゲルＰ６０Ｇ　（バイオランド・
ラボラトリーズ）のＩＸ　２６　ｃｍのカラム上でクロ
マトグラフィー処理する。１．０ｍｌのフラクションの
２８０ｎｍでの吸光度を測定し、第一の溶離ピークから
のフラクションを集める。フルオレセイン／蛋白質比を
ザ・アンド・フェルトカンプ（１９７０）　Ｉ＋ｕ＋ｕ
ｎｏｌｏｇｙ　：　１８　：８６５の方法によって分光
光度系で測定する。

Ｃ，４，５−ジメトキシ−６−カルボキシフルオレセイ
ンで標識したストレプトアビジンの製造４１．５′−ジ
メトキシ−６−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルをカーナ（Ｋｈａｎｎａ）
及びウルマン（Ｕｌｌｍａｎ）著、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　１０８　：　１５６の方法によって合成す
る。（この合成法では、実際には５−及び６−カルボキ
シフルオレセインの混合物を生じる）。

ストレプトマイセス・アビジニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓａｖｉｄｉｎｉ）から単離されたストレプトアビジ
ン〔ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ　）ら著（１９８０）　
、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、７７　：　４６６６
）を免疫グロブリンを標識するためカーナ及びウルマン
によって記載された方法により４１，５°−ジメトキシ
−６−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルで標識する。

Ｄ、尿中のサイトメガロウィルスのハイブリッド形成分
析 この方法は尿からウィルスを単離するため遠心分離を使
用し、ウィルスＤＮＡを溶液中でビオチン標識プローブ
／エチジウム修飾プローブを用いてハイブリッド化する
。次いで標識アビジン及びエチジウム−ＤＮＡ挿入複合
体に対する抗体を、形成したハイブリッドに結合させ、
フルオレセインを使用して存在するハイブリッドの量を
測定する。

尿からソルバへ〆（Ｓｏｒｖａｌｌ　）　ＧＬＣ−３遠
心分４１１ＪＱで３００Ｏｒｐｍで５分遠心分離するこ
とにより細胞物質及び粒状物質を除去する。上澄液をポ
リアロマ−（ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ　）超遠心分離管
中に入れ、ベックマン（Ｂｅｃｋａ＋ａｎ　）　Ｔｉ５
０ロータで２５．ＯＯＯｒｐｍで７５分運転する。ペレ
ットを０．１　Ｍ　ＮａＯＨに熔解し、３７℃で３０分
静置する。

１、８　Ｍ　ＮａＣ１，０，１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（Ｗ／Ｖ）及び１ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐｏ６．ｏの
０．２Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液１５０μβを添加する。

次に、ビオチン標識プローブ／エチジウム修飾プローブ
（５０■）２０μｌを添加し、ハイブリッド形成混合物
を６５°Ｃで１０時間静置する。

ハイブリッド形成反応後、標識付きアビジン及びエチジ
ウム−ＤＮＡ挿入複合体に対する抗体を含むｐＨ８，２
の０．　Ｉ　Ｍ　Ｆリス塩酸塩緩衝液６５０μβを添加
する。この試薬中の標識付き蛋白質の濃度を予備実験で
最適にしてフルオレセイン消光二バンクグラウンド比を
最大にする。蛋白質結合反応を室温で１時間進行させる
。

次いで、吸光については４９５ｎｍの光、発光について
は５１９ｎｍの光を使用して反応混合物の螢光を記録す
る。並行して、サイトメガロウィルスを含まないことの
分かっている尿を用いて対照分析を行う。この対照分析
で得られる螢光シグナルはウィルスを含む試料のそれよ
り高く、従って螢光シグナルは、ウィルス濃度が低下す
るに従って増加するであろう。

本発明の詳細な説明し、具体例で示した。本発明の思想
及び範囲から逸脱することなく、前記の他に、本発明の
多数の変化変更をなしうろことは明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は本発明の好ましい実施方法の説明図で
ある。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ 力旧ド也： １、−材輿賊料禎欧 （Ｓ） ２．７七°リヌクレオテドフ・ローフ′（Ｐ） ３、酵１孫蛾抗体 ＦＩＧ、　２ ２、ヒ゛チオン杉ト膚デネ°リヌクレオナド７０十３、
青壽素オ皺Ｑ＆イネヌグ酵素オ京自へアヒ”シンＦＩＧ
、　３ ２．押入？！Ｊ嘆／”−オテンータテ擢甲デローフ゛３
、エキ；しぞ−オタ−ｈ−＃ｑ＃）ｉ；１−ｚ−°オ歌
熾アレシン手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第２６００９８号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名　マイルス・ラボラトリーズ・インコーホレーテッ
ド４、代理人

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. （１）１重鎮核酸を含む試験試料中の特定のポリヌクレ
   オチド配列を検出するため、 （ａ）試料中の検出すべき特定のポリヌクレオチド配列
   と検出すべき配列に対して実質的に相補性の１本鎮塩基
   配列を少なくとも１種含む核酸プローブとの間で、２種
   の特異結合試薬に対して結合部位を有するハイブリッド
   を形成し、 （ｂ）形成されたハイブリッドを、一方が第一の標識を
   含み、他方が第二の標識を含む２種の特異結合試薬と接
   触させ、第一の標識と第二の標識とを反応させて２種の
   標識付き試薬が同一のハイブリッドに結合したときに、
   ２種の標識付き試薬がそのように結合されていない場合
   に比べて測定可能に異なる検出可能な応答を生じさせ、
   （Ｃ）検出可能の応答を試料中の検出すべき配列の存在
   の函数として測定する工程 から成ることを特徴とする特定のポリヌクレオチド配列
   の検出方法。
2. （２）第一の標識が第一の化学反応に関与し、その反応
   で第二の化学反応における関与物質である拡散可能な生
   成物を生じ、第二の標識との第二の化学反応で検出可能
   な応答を生ずる生成物を生ずる特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
3. （３）第−及び第二の標識がそれぞれ、第−及び第二の
   化学反応の触媒である特許請求の範囲第２項記載の方法
   。
4. （４）第−及び第二の標識が酵素である特許請求の範囲
   第３項記載の方法。
5. （５）第一の標識がグルコースオキシダーゼであり、第
   二の標識がペルオキシダーゼである特許請求の範囲第４
   項記載の方法。
6. （６）第−及び第二の標識がエネルギー移動反応に関与
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。
7. （７）第一の標識が螢光物質又は発光物質であり、第二
   の標識が消光物質である特許請求の範囲第６項記載の方
   法。
8. （８）ハイブリッド上の前記結合部位の少なくとも１個
   が実質的にこのようなハイブリッドのハイブリッド形成
   領域にのみ存在する特許請求の範囲第１項記載の方法。
9. （９）特異結合試薬の１種が抗体試薬である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
10. （１０）抗体試薬が、プローブ及び検出すべき配列の一
    方がＤＮＡであり、他方がＲＮＡであるＤＮＡ　−ＲＮ
    Ａハイブリッドの結合に対して選択的であるか、又はプ
    ローブと検出すべき配列の両方がＲＮＡであるＲＮＡ　
    −ＲＮＡハイブリッドの結合に対して選択的であるもの
    である特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）他の特異結合試薬が同一の抗体試薬を含む特許
    請求の範囲第１０項記載の方法。
12. （１２）核酸プローブが特異結合リガンド部分を含み、
    他方の特異結合試薬がこのようなリガンド部分に対する
    結合相手である特許請求の範囲第１０項記載の方法。
13. （１３）核酸プローブが蛋白質に対する結合部位を有す
    る２本鎖部分を含み、他方の特異結合試薬がそのような
    蛋白質である特許請求の範囲第１０項記載の方法。
14. （１４）２本鎖プローブ部分が挿入複合体を含み、他方
    の特異結合試薬がその複合体に対して選択的な抗体であ
    る特許請求の範囲第１３項記載の方法。
15. （１５）抗体試薬が挿入複合体の結合に対して選択的な
    ものであり、分析中に形成したデユーブレックス（ｄｕ
    ｐｌｅｘｅｓ）が挿入複合体の形で結合した核酸挿入物
    質を含む特許請求の範囲第９項記載の方法。
16. （１６）プローブが１重鎮相補性領域において化学的に
    結合された核酸挿入物質を含み、検出すべき配列とハイ
    ブリッドを形成すると、生ずるノ＼イブリッドに前記の
    挿入複合体が形成する特許請求の範囲第１５項記載の方
    法。
17. （１７）他方の特異結合試薬が同一の抗体試薬を含む特
    許請求の範囲第１６項記載の方法。
18. （１８）核酸プローブが特異結合リガンド部分を含み、
    他方の特異結合試薬がそのようなりガント部分に対する
    結合相手である特許請求の範囲第１６項記載の方法。
19. （１９）核酸プローブが蛋白質に対する結合部位を有す
    る２本鎖部分を含み、他方の特異結合試薬がそのような
    蛋白質である特許請求の範囲第１６項記載の方法。
20. （２０）試験試料が、そこに存在する核酸を放出及び変
    性する条件にさらされた生物学的試料を含む特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
21. （２１）試験試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検
    出する試薬系において、 （ａ）検出すべき配列に対して実質的に相補性の１本鎮
    塩基配列を少なくとも１種含む核酸プローブ、及び （ｂ）試料中の検出すべき配列とプローブとの間で形成
    したハイブリッドに結合しうる第−及び第二の特異結合
    試薬からなり、該結合試薬がそれぞれ、第−及び第二の
    標識を含み、これらの標識は相互に反応して、２種の標
    識付き試薬が共に同一のハイブリッドに結合したときに
    、２種の標識付き試薬がそのように結合していない場合
    に比べて測定可能に異なる検出可能な応答を生じること
    を特徴とする特定のポリヌクレオチド配列の検出用試薬
    系。
22. （２２）第一の標識が第一の化学反応に関与し、その反
    応で第二の化学反応における関与物質である拡散可能な
    生成物を生じ、第二の標識との第二の化学反応で検出可
    能な応答を生ずる生成物を生ずる特許請求の範囲第２１
    項記載の試薬系。
23. （２３）第−及び第二の標識がそれぞれ、第−及び第二
    の化学反応の触媒である特許請求の範囲第２２項記載の
    試薬系。
24. （２４）第−及び第二の標識が酵素である特許請求の範
    囲第２３項記載の試薬系。
25. （２５）第一の標識がグルコースオキシダーゼであり、
    第二の標識がペルオキシダーゼである特許請求の範囲第
    ２４項記載の試薬系。
26. （２６）第−及び第二の標識がエネルギー移動反応に関
    与する特許請求の範囲第２１項記載の試薬系。
27. （２７）第一の標識が螢光物質又は発光物質であり、第
    二の標識が消光物質である特許請求の範囲第２６項記載
    の試薬系。
28. （２８）試験試料中の２本鎖核酸を１重鎮形に変換しう
    る変性剤を付加的に含む特許請求の範囲第２１項記載の
    試薬系。
29. （２９）試験試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検
    出する試験キットにおいて、 （ａ）検出すべき配列に対して実質的に相補性の１本鎮
    塩基配列を少なくとも１種含む核酸プローブ、 （ｂ）プローブ及び検出ずべき配列の一方がＤＮＡであ
    り、他方がＲＮＡであるＤＮＡ　−ＲＮＡハイプリント
    の結合に対して選択的であるか、又はプローブ及び検出
    すべき配列の両方がＲＮＡであるＲＮＡ　−ＲＮＡハイ
    ブリッドの結合に対して選択的である抗体試薬である第
    一の特異結合試薬及び （Ｃ）プローブと検出すべき配列との間で形成されるハ
    イブリッドに結合しうる第二の特異結合試薬 から成り、そのような結合試薬がそれぞれ第−及び第二
    の標識を含み、これらの標識は相互に反応して、２種の
    標識付き試薬が共に同一のハイブリッドに結合し、それ
    によって標識が相互の近位反応距離に位置するときに、
    ２種の標識付き試薬がそのように結合していない場合に
    比べて測定可能に異なる検出可能な応答を生じることを
    特徴とする特定のポリヌクレオチド配列の検出用試験キ
    ット。
30. （３０）第二の特異結合試薬が第一の特異結合試薬と同
    じ抗体試薬を含む特許請求の範囲第２９項記載の試験キ
    ット。
31. （３１）核酸プローブが特異結合リガンド部分を含み、
    第二の特異結合試薬がこのようなリガンド部分に対する
    結合相手である特許請求の範囲第２９項記載の試験キッ
    ト。
32. （３２）核酸プローブが蛋白質に対する結合部位を有す
    る２本鎖部分を含み、第二の特異結合試薬がそのような
    蛋白質である特許請求の範囲第２９項記載の試験キット
    。
33. （３３）２本鎮プローブ部分が挿入複合体を含み、第二
    の特異結合試薬がこれに対して選択的な抗体である特許
    請求の範囲第３２項記載の試験キット。
34. （３４）試験試料中の２本鎖核酸を１本鎖の形に変換し
    うる変性剤をイ１加的に含む特許請求の範囲第２９項記
    載の試験キット。
35. （３５）試験試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検
    出する試験キットにおいて、 （ａ）検出すべき配列に対して実質的に相補性の１本鎖
    塩基配列を少なくとも１種含み、１本鎖相補性領域で化
    学的に結合した核酸挿入物質を含み、検出すべき配列と
    ハイブリッドを形成させると、生じるハイブリッドに挿
    入複合体を形成する核酸プローブ、 （ｂ）前記挿入複合体の結合に対して選択的な抗体であ
    る第一の特異結合試薬及び （Ｃ）プローブと検出すべき配列との間で形成されるハ
    イブリッドに結合しうる第二の特異結合試から成り、そ
    のような結合試薬がそれぞれ第−及び第二の標識を含み
    、これらの標識は相互に反応して、２種の標識付き試薬
    が共に同一のハイブリッドに結合し、それによって標識
    が相互の近位反応距離に位置するときに、２種の標識付
    き試薬がそのように結合していない場合に比べて測定回
    ｆｉヒに異なる検出可能な応答を生じることを特徴とす
    る特定のポリヌクレオチド配列の検出用試験キット。
36. （３６）他方の特異結合試薬が同一の抗体試薬である特
    許請求の範囲第３５項記載の試験キット。
37. （３７）核酸プローブが特異結合リガンド部分を含み、
    他方の特異結合試薬がこのようなリガンド部分に対する
    結合相手である特許請求の範囲第３５項記載の試験キッ
    ト。
38. （３８）核酸プローブが蛋白質に対する結合部位を有す
    る２本鎖部分を含み、他方の特異結合試薬がそのような
    蛋白質である特許請求の範囲第３５項記載の試験キット
    。
39. （３９）試験試料中の２本鎖核酸を１本鎖の形に変換し
    うる変性剤を付加的に含む特許請求の範囲第３５項記載
    の試験キット。