JPS60151559A - 挿入複合体に対する抗体を使用する核酸ハイブリダイゼーシヨン分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １　発明の分野 この発明は、ポリヌクレオチドの特異的な配列の検出に
用いる核酸ハイブリダイゼーション分析法、および試薬
シス′テムに関する。核酸ハイブリダイゼーション分析
の原理は、目的とする特異的なボリヌクレ゛オチドの塩
基配列を決定分離する手段として、組換えＤＮＡの分野
の研究者達によって開発された。ＤＮＡやＲＮＡの２本
鎖の形状を変性させて得られるようなりＮＡやＲＮＡの
如き１本鎖の核酸は、適当な条件下では、相補的な１本
鎖の核酸と交雑または組換えを行うことが分った。この
ような相補的検出用プローグに、何か容易に検出できる
化学基で標識をつけることによって、１本鎖の形状をし
た標本（サンプル）核酸を含む試験媒体中の対象とする
いかなるポリヌクレオチド配列の存在をも検出すること
が可能となった。

組換えＤＮＡの分野以外に、この分析用ハイブリダイゼ
ーションの技法は、中でも人間医学、獣医学、農業およ
び食物科学の分野における重畳なポリヌクレオチドの検
出に応用できる。特にこの技法は、バクテリアやウィル
スのような病因トなるものの検出や確認、耐抗生物質性
を目的としたバクテリアのスクリーニング、錐状赤血球
貧血やサラセミアのような遺伝性の障害の治療の補佐役
、およびガン細胞の検出に用いることができる。この技
法並びにその現在および将来の重要性に関する一般的論
評は、ｆ３　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８３年
８月号）のｐ４７１〜４７８に載っている。

２　先行技術の説明 従来の核酸ハイブリダイゼーション分析法は、標識をつ
けて検出するために、検出用プローグとなる核酸、また
は標本（サンプル）となる核酸を化学的に修飾する操作
を包含している。この方法は、分析使用者が、標識をつ
けたサンプル核酸を合成した！Ｄｆ＊ｆｆしたりする複
雑で金のかかる操作、または・、その場での合成操作を
包含する大規模な標識プローブを作る必要があるので、
核酸を化学的に修飾する必安土、この方法の実際の使用
は厳しく制約される。特に標識を付した生成ポリヌクレ
オチドは、その相補的サンプルまたはプローグ塩基配列
と効率的に交雑する能力を保持していなければならない
。このような散性によって、ハイブリダイゼーション分
析に用いることを目的としたポリヌクレオチドの標識修
飾に関する有用な合成法の利用価値が、厳しく制限され
る。

初期のハイグリダイゼーショ／技法では、３Ｈ１Ｐ、Ｉ
　のような放射性標識の使用を必要としていた。標識を
付したプローグは、ニツクトンンスｖ　−シヨ：ｉ、末
端標！ｌＩ！（ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）、第２鎖合
成（５ｅｃｏｎｄ　５ｔｒａｎｄ　ｇｙｎｔｈｅｓｉｓ
）、逆転写および転写のような方法によって、放射性標
識を付したヌクレオチドと−りのポリヌクレオチドから
、酵素作用で合成される。従ってこのような酵素法のも
う一つの要件は、修飾したまたは標識を伺したヌクレオ
チドが、標識を付したポリヌクレオチドのアセンブリに
包含されるＩリソラーゼ酵素の有効な基質として役立た
ねばならぬことである。ポリヌクレオチドを直接化学修
飾することも可能であるが、このような方法は、ポリヌ
クレオチドに標識を組み込むについてかなり効率がわる
く、またポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションを
受ける能力に悪影醤を与える。

放射性標識を付した物質の取扱いや貯蔵が不便なために
、有用な非放射性同位体の標識をつける研究方法を開発
すべく、がなりの努力が続けられて来た。このような標
識としては、ケイ光物質や化学ルミネセンス物質のよう
な発光分子、および相補（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ　）
バインダー（こちらの方もケイ光物質や酵素のような検
出可能の化学基の標識をつけである。）と特異的に結合
し得る配位子分子（リガンド）があった。リガンド標識
の例としては、抗体と特異的に結合するハプテン、およ
びアビノンと結合するピオチンのように、それに対して
特異的に結合する蛋白が存在するその他の低分子物質Ｘ
　′ がある。

イイリス特許第２．０１９，４０８号は、シトクローム
Ｃの結合基を介してビオチンで標識を付し、このように
して、酵素標識したアビジンによって検出できるポリヌ
クレオチドプローグについテ述べている。またビオチン
のような低分子１のリガンドでプローグに標識をつける
別のやシ方が、ヨーロッパ特許出願第６３，８７９号に
記されている。この方法では、５−アリルアミンーデオ
キシウリソン三リン酸塩（ｄＵＴＰ）誘導体を所望のリ
ガンド標識と縮合させ、このようにして修飾されたヌク
レオチドは、標準的な酵素法によって、所望のブロー１
に組みこまれる。発光標識を使用することは、ヨーロッ
パ特許出願第７０，６８５号および第７０．６８７号が
示唆している。ハイブリダイゼーション分析に関するそ
の他の特許文献の代衣的なものは、固相上でハイブリダ
イゼーションを促進するための、ある種の水溶性多糖類
の使用に関するアメリカ特許第４，３０２，２０４号、
臨床標本中の病原体の検出に関する第４，３５８，５３
５号、および合成オリゴヌクレオチドプローグを用いた
鎌状赤血球貧血の検出に関する第４．３９５．４８６号
である。

サンプルおよびプローグのポリヌクレオチド間のハイブ
リダイゼーション生成物として生じたポリヌクレオチド
ニ重鎮構造を直接検出し、これによって一方または他方
のポリヌクレオチドの化学標識を省略しようという方法
は、一般に成功しなかつ九。また１本鎖のＤＮＡに優先
して２本鎖のＤＮＡ／ＤＮＡ雑種と選択的に結合するよ
うな抗体を作り出そうという試みは失敗に終った。（ｐ
ａｒｋｅｒおよびＨａｌｌｏｒａｎ　、　”　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｉｎ−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”。

ＰｌｅｓｃｉａおよびＢｒａｕｎ　、　Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ　−ｖｅｒｌａｇ編集、ＮＹ（１９６９年）ｐ、１８
以下参照〕一方ＲＮＡ／ＤＮＡの混合雑種（ハイブリッ
ド）と結合し、１本鎖のポリヌクレオチドに対する親和
性が小さい抗体を作るのに成功した事例もいくつかある
。（Ｒｕｄｋｉｎａｎｄｓｔｏｌｌａｒ、Ｎａｔｕｒｅ
２６５　：　４７２　（１９７７）；５ｔｕａｒｔ他、
ＰＮＡ８（ＵＳＡ）７８：３７５１（１９８１）；Ｒｅ
ｄｄｙおよび８ｏｆｃｒ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　、　
Ｂ１　ｏｐｈｙｓ　、　Ｒｅｓ　、　Ｃｏｍｍｕｎ。

１０３：９５９（１９８１）、ｉおよびＮａｋａｚａｔ
ｏ　、Ｂｉｏｅｈｅｍ。

１９　：２８３５（１９８０））ｏ　しかしながら、こ
れらの方法の感度は、臨床上のハイブリダイゼーション
試験に必要な水準には達しておらず、従って全く不安定
なことがよく知られているＲＮＡプローグを用いなけれ
ばならないであろう。

従ってポリヌクレオチドの化学修飾を必要としない、ま
たは比較的簡単な標識方法を包合するハイブリダイゼー
ション検出法に対する確固たる必要性があうた。その上
この方法は種々の標Ｒ＝特に非放射性同位体型の標識の
使用を可能にしなければならない。このような利点を有
する核酸のハイブリダイゼーション分析法および試薬シ
ステムを開発することが本発明の主な目的である。

アメリカ特許第４，２５７，７７４号は、核酸と相互に
作用する種々の化合物、特に、突然変異源また拡発ガン
物質となシ得ると考えられる化合物を、かかる化合物が
アクリジンオレンジのような挿入物（１ｎｔｅｒｃａｌ
ａｔｏｒ　）が核酸と結合するのを阻止する能力を測定
することによって、検出する方法について述べている。

またｐｏｉｒｉｅｒ　、　Ｍ、Ｃ，他（（１，９８２）
ＰＮＡＳ７９：６４４３〜６４４７：ｌは遊離のシス白
金化合物および２本鎖のＤＮＡに優先して、ある種のシ
ス白金７２本鎖ＤＮＡ複合体に対して選択的な単クロー
７抗体の製造について記している。

発明の異的 核酸のハイブリダイゼーション分析において、標本（サ
ンプル）の核酸とプローグとの間に生ずるハイグリダイ
ゼーショ／は、交雑（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　）したプロ
ーグと合体して生成する挿入物複合体と結合し得る抗体
またはその適切な結合断片によって、うまい具合いに検
出できることが今回見出された。これを賛するに、交雑
したプ゛ローグおよび挿入複合体の形で２本鎖核酸と結
合した核酸挿入化合物を言むハイブリダイゼーションの
集塊または生成物を作ることによって、１本鎖の核酸を
含む試験媒体中の特定のポリヌクレオチドの塩基配列が
検出される。この抗体またはその断片は、次にハイブリ
ダイゼーション集塊中の挿入複合体を検出するのに用い
られる。

分析手段として核酸の・・イブリダイセ゛−ジョンを用
いるのは、根本的にはＤＮＡの２本鎖二重構造に基いて
いる。２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖のプリンおよびピリ
ミジン塩基間の水素結合は、可逆的にこわすことができ
る。このＤＮＡの融解（ｒｎｅｌｔｉｎｇ　）　または
変性によって生ずるＤＮＡの二つの相補的１本鎖は、合
体（リアニーリングまたはハイブリダイゼーションとも
いう。）して再び二重構造を作る。当業者によく知られ
ているように、第二の１本鎖核酸に対して充分に相補的
（即ち「相同的」）な塩基を會む第一の１本鎖核酸（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ　）が、適当な溶液状態において第二
の１本鎖の核酸に接触すると、それぞれ場合に応じて、
ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮ
Ａの雑種（）−イブリッド）が生ずる。

本発明は、ノ・イブリダイゼーショ／の部位または側面
（ｆｌａｎｋｉｎｇ　）部位に、２本鎖の核酸の免疫原
的修飾を誘発させることによって、生成した雑種の検出
を可能にする。できた生成物は、次に、特異的な抗体が
、ノ・イグリダイゼーション生成物上に生じたエピトー
プ（ｅｐｉｔｏｐｅ）または抗原決定子と結合するとい
う事実に基いた在来の分析方式によって検出することが
できる。２本鎖核酸の必要な免疫原的修飾は、主として
一つの分子１通常低分子喰の化合物を二重構造（ｄｕｐ
ｌｅｘ）に結合させることによって行なわれる。このよ
うな結合によって、１本鎖の核酸および遊離して結合し
ていないモディファイア−（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）分子か
ら２本鎖の核酸全区別する抗原決定子が作られる。好ま
しくはこの操作は、１本鎖の核酸とは実質的に結合でき
ず、また二重構造の相補鎖の正常ならせん状の関係を変
える、２本鎖核酸との結合複合体を作るモディファイア
−化合物を用いてなされる。ここに述べるようなモディ
ファイア−分子は、塩基対間の非共有結合的挿入によっ
て、正常の核酸らせん体と優先的に相互に作用する核酸
挿入物である。この好ましい相互作用においては、その
ような挿入のために、らせん体の三次元構造は、ねじれ
の戻りおよびらせん軸方向の伸長によって変化する。こ
の好寸しい挿入の相互作用の概要図は第１図（Ｆｉｇ、
１）に示しである。生成した挿入複合体の特長は、挿入
されたモディファイア−化合物、および二重構造の各々
の鎖の再配列したリン酸ジェステラーゼの背骨を包含し
ていると考えられる新らしく生成した抗原決定子を有し
ていることである。

挿入化合物は、２本鎖の核酸と挿入複合体を形成するこ
とが知られている一般に平らな芳香族有機分子の一つで
あることが好ましい。このような化合物の例としては、
後でさらに詳しく述べるように、アクリジンオレンジの
ようなアクリジン色素類、エチジウムのよう々フェナン
スリジン類、フェナジン類、フロクマリン類、フェッチ
アシ／類、キノリン類その他がある。所で本発明は以下
においては特にこのような挿入化合物に関して記述しで
あるが、本発明は前述したように、２本鎖の核酸と結合
して、二重構造中に免疫原的変化を誘発するよう表向等
のモディファイア−分子の使用をも意図していることを
明確に理解すべきである。

本発明によれば、挿入物（１ｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）
は試験媒体（被検媒体）と混合することができ、そのた
めに、別個の遊離化合物として、ノ・イブリダイゼーシ
ョン反応混合物中に存在するか及び／又は形成される２
本鎖核酸にさらされ、このような２本鎖核酸と非共有結
合的に結合して挿入複合体を形成する。また一方で、挿
入物は化学結合、好ましくは共有結合によって、検出用
プローグと適切に結合していてもよい。前者の場合は、
本発明はハイブリダイゼーションを検出するために、サ
ンプルまたは検出用プローグのヌクレオチドを化学修飾
する必要もなく、ハイブリダイゼーション分析を行なう
方法を提供する。また後者の場合では、元反応性の挿入
物を用いることによって、ポリヌクレオチドまたはハイ
ブリダイゼーション集合体に標識をつける簡単で合成上
、直接的な手段が提供される。

すべての実施態様において本発明は、抗体が、生成した
集合体中の挿入複合体と、結合するという事実に基いて
、ハイブリダイゼーションを検出する極めて用途が広く
て感度が高く、また特異的な方法を提供する。勿論後で
もつと詳しく述べるように、抗体の適当々断片や多官能
形態を用いることができ、またこの開示で使用される抗
体という用語は、別に特記しない限り、その断片形態お
よび多官能形態をも同様に意味することが理解されるで
あろう。挿入複合体に対する抗体の結合の測定は、色々
な在来の方法で行なうことができ、好ましくは酵素活性
基、ケイ元物質（ｆｌｕｏｒｅｇｃｅｒ）、ルミネセン
ス化学物質（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ　）、特異的結合性
配位子（リガンド）、または放射性同位体のような検出
可能な化学基で標識を付した抗体を使用することによっ
て行われる。

この発明はすべての在来のノ・イグリダイゼーション分
析形式に適用でき、また一般に２本鎖の核酸からなるハ
イブリダイゼーション生成物または集合体の生成を基礎
として可能などんな形式にも適用できる。特に本発明の
独特な検出方式は、溶液およヒ固相のノ・イブリダイゼ
ーション形式（後者の場合は、サンプルまたは検出用プ
ローグの核酸の固定化を伴う形式、およびサンドイッチ
形式を含む。）に用いることができる。

本発明により生成するノ・イグリダイゼーション生成物
または集合体は、交雑したプローグおよび挿入複合体（
１ｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ　）の形で２本鎖核酸と、
結合した挿入物を包含している。この挿入複合体は、サ
ンプルと検出用プローグとのノ・イグリダイゼーション
によって生じた２本鎖の領域を包含してもよい。または
その代シに、このような２本鎖の領域は、検出用プロー
ブ自体に包含されてもよく、そのような場合は、分析に
検出用プローグを用いる前に付加的に挿入してもよい。

従って検出可能な挿入複合体は、分析中にその場で生ず
るか、または試験媒体に与えられた検出用プローグの試
薬中に存在しても構わない。また挿入複合体は、挿入さ
れた二重体の鎖の一方または両方と化学的に結合しても
よい。ノ・イグリダイゼーショ／生成物が結局の所、本
発明の基底をなす抗体結合現象によって検出できる挿入
複合体を包含しているならば、一般にどんな変法に従っ
てもよい。

このように、本発明は有利な核酸ノ・イグリダイゼーシ
ョンの方法および試薬システムを提供するものである。

また挿入複合体と、結合し得る新規な抗体試薬も提供さ
れる。さらに本発明は、特定のポリヌクレオチド配列の
検出以外に、挿入物および抗〜（挿入複合体）抗体を加
え、抗体結合を測定することによって、２本鎖の核酸を
検出する一般的方法を提供する。

本発明の長所は多大で、この発明は極めて種々の非放射
性検出法に利用できる。その上核酸の標識付けは直接的
で、また容易に合成される試薬を用いる。挿入物で標識
をつけるには、高価なポリメラーゼを必要とせず、また
挿入物の標識密度は容易に調節することができる。ある
好適な実施態様は、それ以外の利点を有する。挿入物−
核酸複合体がその場（ｉｎ　５ｉｔｕ）で生ずるような
実施態様では、複合体をあらかじめ合成しておく必要が
ないので、この解決法は、検出用プローグを固体の担体
に固定化し、サンプルの核酸を含む溶液に浸すような形
式に用いることができる。挿入物が核酸と共有結合して
いる実施態様では、製造過程中に挿入物が検出用試料と
結合し、その結果、飽和の程度が抑制される。この方法
はまた使用者が挿入剤（その多くは潜在的に危険である
。）にさらされるのを最小限にくいとめる。

好適な実施態様の説明 挿入物 前述のように、挿入化合物は、通常塩基対の間に挿入す
ることによって、例えばＤＮＡ／ＤＮＡ。

ＤＮＡ／ＲＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡ二を体のような
二本鎖核酸と結合し得る好ましくは低分子量で平らな、
普通は芳香族だが、時には多環式の分子である。その王
な結合機構は、通常は非共有、結合であるが挿入物が、
挿入された二重鎖の一方または両方にある訛り合った化
学基と共有結合を作るような反応性に富む、または活性
化され得る化学基を有する場合は、共有結合は第２段階
として起る。挿入を行なった結果は、隣接する塩基対が
その正常の分離距離の約２倍迄伸び、そのために二重体
の分子の長さが増加する。また挿入物を収容するために
、二重らせんは約１２〜３６度ねじれが戻らなければな
らない。一般的論評およびそれ以外の情報は下記のもの
から得られる。

１ｅｒｒｎａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、３：１８（１
９６１）ｉＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、ｐｈｙ
ｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｔ
ｃＡｃｉｄｓ　”　、　Ｃｈａｐｔｅｒ　７　、　ｐｐ
、４２９−４７６　、　Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄＲｏｗｅ
　、ＮＹ（１９７４）；Ｗａｒｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ　
２１９　：１３２０（１９６Ｂ　）　：　Ｉ（ａｒｔｒ
ｎａｎｎ　ａｔ　ａｌ、Ａｎｇｅｗ、　（：：ｈｅｍ、
　、Ｅｎｇｌ　。

Ｅｄ、７　：　６９３　（１９６Ｂ　）　；Ｌｉｐｐａ
ｒｄ、Ａｃｃｔａ、ｌ：ｈｅｍ。

Ｒｅａ、１１：２１１（１９７Ｂ）；Ｗ目、ｓｏｎ、　
ＩｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１
９８２）　、４４５　；　ａｎｄ　Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ
　ａｌ。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙａ、１３ｉｏｅｎｇ、　
１０　：　８７　（１９８１）　。

本発明では色々の”挿入剤を用いることができる。

下表に、このような挿入剤のいくつかの分類と特殊な化
合物の例を示す。

鷹 ρ　汽 ヱ　Ｈ１￥−罎ｉ 入 ム Ｉへ ＼ 也 べ 牒ト 人へ 光　がム 本発明のいくつかの実施態様では、二重体の相補鎖の一
方また株両方に対する挿入物の化学的、例えば、共有結
合による結合が関与するが、このような結合を打力うＫ
は、本質的にはいかなる便利な方法でも使用できる。反
応性に富む、好ましくは元反応性の挿入物を用いて挿入
を行ない、次に結合反応を行なって結合を形成するのが
便利である。特に有用な方法では、アジド挿入物を使用
する。反応性に冨むナイトレンは波長の長い紫外線、ま
たは可視光線゛によって容易に発生し、アリルアソドの
ナイトレンは、その転位生成物よりも挿入反応を起し易
い。（Ｗｈｉｔｅその他、Ｍｅｔｈｏｄａｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ　、　４６　：　６４４　（１９７７）参照〕
代表的がアジド挿入物は３−アジドアクリジン、９−ア
ジドアクリジン、エチソウムモノアソド、エチソウムソ
アジド、エチソウムニ騙゛体アソド（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ
−＋の他、ＪＡＣ８１０４：　４２６５（１９８２））
、４−アソドー７−クロロキノリン、および２−アジド
フルオレンである。その他の有用な光反応性挿入物は、
ビＩＪ　ミソン残基とＣ２＋２　）環状付カロ物を作る
７０クマリンである。またビスクロロエテルアミンおよ
びエポキシドまたはアジリジン（例えばアフラトキシ、
多項式炭化水素のエポキシド、マイトマイシンおよびノ
ルフィリンＡ）のようなアルキル化剤も使用できる。

以下に詳しく述べるように、本発明においては、使用す
るハイブリダイゼーション形式に応じて、化学的に結合
した挿入複合体を色々な方法で用いることができる。こ
の複合体は、ハイブリダイゼーション反応混合物中にそ
の場で、またはその後の工程段階において形成せしめて
もよく、または標識をつけたプロニゲ或いはサンプルの
核酸合成中の一段階となってもよい。挿入がプローグ核
酸と、サンプルとなる核酸との間の相補領域で起る後者
の場合は、単結合（ｍｏｎｏ−１１ｎｋａｇｅ　）が行
なわれ、次にこの領域が変性することによって、ノ飄イ
グリダイゼーションが起ると、結合した挿入物が挿入位
置を占めるように配列された化学的に結合した挿入物を
有する１本鎖の核酸を生ずる。

ハイグリダイ、ゼーションの形式および試料プローグは
、検出すべき配列と実質的に相補的１７１ｃは相同的な
少なくとも一つの１本鎖の塩基配列を會んでいる。しか
しこのような塩基配列は、単一の連続したヌクレオチド
の断片である必要はなく、非相同配列で中断された二つ
またはそれ以上の個々の断片から成っていてもよい。こ
れらの非相向性配列は直線状でもよいし、または自己相
補性を有して、ヘヤービンループを形成してもよい。そ
の上、このプローグの相同領域の３′−および５′−末
端の側面に゛、増殖のために相同配列が挿入されている
ベクターのＤＮＡまたはＲＮＡを言むような非相同配列
があってもよい。いずれの場合でも、分析試薬として与
えられたプローグは、−９またはそれ以上の点において
、対象となるサンプル核酸と検出可能なノ）イグリ〆イ
ゼーションを起す。重要な相同の断片（セグメント）（
一つまたは複数）が１本鎖の形状をなし、サンプルのＤ
ＮＡまたはＲＮＡとのノーイグリダイゼーションにとっ
て利用できるならは、その大部分または小部分が、相補
性のポリヌクレオチド鎖（１本ｔ７’ｃは複数）と二重
構造をなしている直線状または環状の１本鎖のポリヌク
レオチドは、プローグＸ子として用いることができる。

特に好ましいのは、試料の相同配列が本質的に１本鎖だ
けの形状をしている直線状または環状の試料である。〔
詳細はＨｕ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　１７
　：　２７１〜２７７（１９８２）診照〕 下記のことから分るように、挿入物に標識をつけたプロ
ーグの使用を必要とするハイブリダイゼーション形式に
プローグを用いる場合は、そのようなプローグは、挿入
物が化学的に結合している完全に１本鎖のポリヌクレオ
チド（このためにハイブリダイゼーションの結果挿入複
合体を生ずる０）のような色々の形をとることができる
。またはその代シに、このプローグは挿入（必要に応じ
て挿入物が二重構造中の一方または両方の鎖と共有結合
して）されている２本鎖部分（一つまたは複数）を含ん
でもよい。

ハイブリダイゼーションの形式に関しては、本発明は交
雑されたプローグ、および抗体で検知できる挿入複合体
の形で二重構造に結合した挿入物から成るハイグリダイ
ゼーーション集合体の生成に焦点をおいた。従ってハイ
ブリダイゼーションの結果は、検知可能な挿入複合体と
関連している。

根本的には集合体中に生成する挿入複合体は、サンプル
とブロー１核酸間のハイブリダイゼーション領域内にあ
ってもよいし、またはハイクリダイゼーション領域よシ
遠くはなれた２本鎖領域内にあってもよい。このような
後者の場合は、分析中に挿入領域が生成してもよいし、
または分析に付した時に、例えば共有的に結合した或い
は非共有結合的に挿入された２本鎖の領域でプローグの
標識として役立つ挿入部位にあってもよい。

本分析法の実施は、どんな特殊なハイブリダイゼーショ
ン形式にも限定されず、どんな在米のハイグリダイゼー
ショ７法でも使用できる。改良が行なわれ概念的に新ら
しい形式が開発されるに従って、そのような改良や形式
は、本方法の実施に容易に適用できる。特に有用な在来
のハイブリダイゼーション形式としては、サンプルとな
る核酸ｔたはポリヌクレオチドが、固体の相体上に固定
（固相ハイブリダイゼーション）されたもの、およびポ
リヌクレオチドのサンプルがすべてｉｌ’ｆｆｌ中に存
在（溶液ハイブリダイゼーション）するものなどがある
。

固相ハイブリダイゼーション形式では、ハイブリダイゼ
ーションにあずかるポリヌクレオチドサンプルの一つは
、適当な方法でその１本鎖の形で固体担体に固着される
。有用な固体担体は技術上周知であシ、その中には共有
的または非共有的に核酸を結合させるものもある。一般
に疎水結合を伴うと見なされる非共有結合担体として杖
、フィルターまたは固体シートのような種々の形をした
ニトロセルロース、ナイロン誘導体、およびフッ素置換
したポリ炭化氷菓の如き天然または合成高分子材料など
がある。共有結合相体も有用で、これにはソクロロトリ
アジン、ジアゾベンジルオキシメチルなどのような化学
的に反応する基（一つｔｉは複数）を有し、ポリヌクレ
オチドと結合するために活性化され得る材料が含まれる
。

代表的な固相ハイグリメイゼーション法では、先づサン
プルの核酸を１本鎖の形で担体に固定させる。この最初
の手順は、実質的にサンプルの相補鎖がリアニーリング
（ｒｅａｎｎｅａｌｉｎｇ　）するのを防ぐので、検出
性を高めるために、担体上のサンプル材料を集める手段
として用いることができる。

次にポリヌクレオチドプローグを担体と接触させ、こ＼
に記すように抗体結合によってノ・イブリダイゼーショ
ンが検出される。この固体加俸は、交雑したプロー１と
合体した挿入複合体と結合する抗体を、結合しない抗体
から分ける便利な手段を提供する。

も一つの興味ある方法は、試料の相同配列の二つの互い
に排除する断片の一方を固定し、他方に標識をつけるサ
ンドイツチハイグリダイゼーショｙ法である。対象とな
るポリヌクレオチド配列が存在するために、固定された
プローグ断片および標識をつけたプローグ断片とに二重
のハイブリダイゼーションが行なわれ、同様に最終的に
は担体と合体した挿入複合体を測定する。詳細について
は、Ｍｅｔｈｏｄａ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６
５　：　４６８　（１９８０）およびｇｅｎｅ　２１　
：　７７〜８５（１９８３）診照のこと。

さらにうまく説明するためには、下記の固相ハイグリダ
イゼーショ／法が本発明に特に有用である。この基本的
な方法の模式図は図に示されている。

タイプ１の方法 第２図に示しであるこの方法では、液状の試験媒体から
採った１本鎖の核酸を、先づ固体担体上に固定する。次
にこの固定した標本核酸（Ｓ）をプローグ（Ｐ）（この
場合、相補性の１本鎖の部分の他に、挿入複合体の形で
挿入物ＣＩ）と化学的に結合している少くとも一つの２
本鎖部分を含んでいる。）と接触させて、ハイグリダイ
ゼーショｙ反応混合物を作る。プローグの特に有用な形
は、ＨｕおよびＭｅｓｓｉｎｇ　（前記）が述べたよう
な環状である。生じたハイツリメイゼーション集合体は
、共有結合によって挿入され７’Ｃ２本鎖領域を有する
プローグと交雑した対象となる固定化ポリヌクレオチド
からなる。固定された二重体を担持する固体担＋ｒｘ、
次に残シの反応混合物から優先的に分離される。好まし
くは経用可能な基で標識を付した抗体（Ａｂ）を加え、
生成する固定化抗体（集合体中の挿入複合体と結合して
いる。）を残りの反応混合物から分離する。次に担体と
結合した抗体を測定して分析を終了する。または、そう
する代りに、分離した溶液中の抗体を測定してもよい。

（尤も通常過剰の抗体が用いられるので、この方法は一
般には余り好ましくない。） この方法の変法では、上記のｔすなグローブを使用する
が、このグローブは２本鎖領域と結合した挿入物が共有
結合的に結合しておらず、挿入物を固定化集合体に加え
、その結果、グローブの２本鎖部分およびハイブリダイ
ゼーションによって生じた二重領域中に挿入複合体が生
成する。

これはサンドインチ形式で、第３図（Ｆｉｇ、３　）に
示しである。目的とする配列（Ｓ）並びに第一および第
二のグローブ（各々、目的とする配列の互いに排除的な
部分に対して相補的な塩基配列を少くとも−り包さして
いる。）をざむ試験媒体内に反応混合物を作る。上述の
タイプ１の方法と同じように、第一のプローグ（Ｐｌ）
を固体担体上に固定し、共有結合した挿入複合体で第二
のプローグ（Ｐ２）に標識をつける。生じたハイブリダ
イゼーション集合体は、固定された第一のプローグおよ
び挿入複合体で標識を付した第二のプローグと交雑した
目的とする配列を包さする。次に好ましくは標識を付し
た形で抗体を加え、生じた固定化抗体（集合体中の挿入
複合体に結合している。）を残如の反応混合物から分離
する。この結合抗体を測定して分析を終了する。

この方法にはいくつかの有用な変法がある。先づ第一に
タイプ１の方法の夏床の場合と同様に、共有結合した挿
入物を會まない試料を用い、固定化した集合体に遊離の
挿入物を加え、すべての利用できる２本鎖領域を有する
挿入物複合物を生成させてもよい。また２本鎖部分を有
する第二の試料を用いる代シに、ハイブリダイゼーショ
ンが起ると同時に挿入複合体が生成するように、挿入物
が化学的に結合した全部が１本鎖の核酸のプローグ、ま
たは二つの試料と検出すべき配列との間で生ずる二重体
の間で挿入が行なわれるように、挿入物を加えた全部が
１本鎖の核酸プローグを用いてもよい。

タイプ３の方法 第４図（Ｆｉｇ、４）はもう一つの好ましい固相の形式
を示している。サンプルの核酸と固定したプローグを接
触させ、好ましくは生じた固定化二重体を残シの反応混
合物から分離する。この形式ではプローグは１本鎖の形
状をしている。生じたハイブリダイゼーション生成物は
、目的とする配列と交雑した固定化プローグを包含して
いる。またこの形式によって、固定した集合体上で起シ
得るサンプル核酸の相補的領域間でかなシのリアニーリ
ングが可能となる。このようなリアニーリングは、続い
て行なわれる挿入に対して、さらに２本鎖の核酸を与え
るので、分析に有利に作用する。

分析の次の手順は挿入物と抗体（この場合もなるべくは
標識をつけた形で）を加えることである。

前記の形式と同様に、分離と抗体の測定を行なえは分析
は完了する。

第５図（Ｆｉｇ、５）に示しであるように、この方法で
は１本鎖のサンプル核酸と固定化プローグとを接触させ
るが、こ６場合連結した挿入物の領域中に二重体が生成
することによって、挿入複合体が生ずるように、このプ
ローグ祉化学的、例えば共有結合的に挿入物に結合して
いる。この形式ではブロー１は固定されまた標識を付し
であるので、分析の際に固定化や標識づけを行なう必要
がない唯一の既知の方法であるという点で、極めて有利
な形式である。生成する集合体は、サンプルおよヒフロ
ーフ核酸の間に生ずるハイブリダイゼーション領域およ
びリアニーリングしたすべてのサンプル領域中に共有結
合した挿入複合体を包含する。

次に抗体を加え、前述の形式と同様にして分析を終了す
る。この形式は分析者が、場合によっては潜仕的に危険
となシ得る遊離の挿入物の溶液を取扱う必要がないとい
う利点がある。この方法の簡単な変法は、標識を付した
プロー１ではなく、サンプルの核酸を固定し、普通の方
法で操作、を進めることである。この方法は余シ有利で
はないがＪ。

実用的な分析方法である。

本発明には、色々な溶液相ノ・イグリダイゼーション形
式も適用できる。このような形式の特長は、ハイブリダ
イゼーションの手順に、サンプル核酸およびプローグと
して可溶性の形状を取扱うことである。両方の鎖が溶液
中にある時は、一方が固定された場合に比べて、動力学
的に反応がずっと速いので、このようにするとノ・イグ
リダイゼーションを著るしく早めることができる。普通
はハイブリダイゼーション段階の次に、検出のために、
生成した交雑体を固定する。このような固定は色々な方
法で行なうことができる。普通はヒドロシアパタイト（
ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）やニトロセルｏ−ズ膜
のような吸着剤にさらして、二重体を選択的に固定する
ことが知られている。

溶液相のハイブリダイゼーションから生ずる交雑体を固
定するのに特に有用な解決法では、結合物質の結合部位
を包合する試料を使用する必狭がある。そしてハイブリ
ダイゼーション段階の後で、プローグ上の結合部位によ
って交雑体を効果的に結合させ固定化するような固定し
た形の結合物質を加えることができる。そのような結合
部位はプローグの１本鎖で交雑可能な部分にあってもよ
いし、またはプローグの化学修飾の結果として存在して
もよい。ヌクレオチド配列中に存在する結合部位の例と
してはプローグがプロモーター蛋白質（例えばバクテリ
オファーソプロモーター、ＲＮＡポリメシーゼ）と結合
し得るプロモーター配列（例えばラクトースプロモータ
ー、トリプトファン−プロモニター）を包含するが、リ
プレッサー蛋白質（例えばｌａｃリプレッサー）と結合
し得るオペレーター配列（例えばｌａｃオペレーター）
を包含するか、または特異的な抗体と結合し得る微吐の
抗原性ヌクレオチド或いは配列（例えば５−ブロモまた
は５−ヨードデオキシウリジン、２−ＤＮＡ　）を包含
する所がある。〔イギリス特許明細書第２，１２５，９
６４号も参照のこと。〕プローグの化学修飾によって導
入されｆｃ結合部位は特に有用で、通常特殊な結合対の
一方をプローグの核酸に連結する働きをする。選択すべ
き有用な結合対としては、ビオチン／アビジン、ハプテ
ンおよび抗ｆｆｉ／抗体、ＭＳ−１３２０−ＣＩＰ−Ｉ
Ｉ炭水化物／レクチン、酵素／阻害剤などがある。結合
対が蛋白質性の構成要素と非蛋白質性の構成要素から成
っている場合は、蛋白質性の構成要素は、プローグのハ
イグリダイゼーショ／の変性条件下では不安定であると
思われるので、非蛋白質性構成要素をプローグに結合さ
せる方がよいだろう。好適な方式では、試料をビオチン
かノ・ブテンに結合させ、それぞれ固定したアビジンま
たは抗ハプテン抗体を用いる。配位子で標識を付した有
用な試料の調製については次の文献に記載されている。

［Ｌａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ　（１９８１）Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７８：６６３３　；Ｂｒｏ
ｋｅｒ（１９７８）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、５：
３６３；５ｏｄｊａａｔ　ａｌ　（１９７８）Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄｓＲｅａ、　５：３８５　；Ｔｃｈｅｎａｔ
　ａｌ　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ
、Ｓｃｉ、８１　：３４６６）　−結合物質を固定する
には、在米の方法に従えばよい。

固体担体上に蛋白質を固定するには、多種多様な方法が
知られており、これらの方法は結合物質の固定に適用で
きる。（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
　。

Ｖｏｌ、４４　（１９７６）１Ｍ　）　例ＬＩｄ抗体ハ
、共有結合または非共有結合的吸着によって固定される
。よく用いられる非共有結合的方法は、ポリスチレンの
球体または微粒子、およびポリ塩化ビニルの表面に吸着
させることである。蛋白質を固定するには色々な共有結
合的方法が用いられ、その中には臭化シアンで活性化さ
せたアガロースおよびデキストラン：グルタルアルデヒ
ドで活性化させたナイロンおよびポリアクリルアミド；
およびアクリル系その他の担体上のエポキシドなどがあ
る。

例示した上述の方法は特に好適なものであるが、本発明
はいかなる特定のハイブリダイゼーション形式にも限定
されるものではない。検出可能な挿入複合体が、プロー
グ核酸のハイグリダイゼーショ／に関連するようになる
ものであるならば、分析に対するどんな解決法に従って
もよい。例えば前記の方法以外に、挿入複合体に対する
固相の抗体を使用して、交雑したプローグを固定するよ
うな溶液相の・ヘイプリダイゼーション形式を考案して
もよい。サンプルとプローグ核酸間のハイブリダイゼー
ション生成物中には、充分量の挿入複合体が生ずるだろ
うし、プローグ核酸は本質的に１本鎖だけの形状なので
、固相の抗体と標識をつけた抗体の両者が結合すること
ができる。次に固相と結合した標識の量が測定され、測
定すべき配列の存在と関連づけられ−る。他の有用な形
式は当業者にとって明らかであろう。

抗体試薬および検出方式 本発明の基本原理は、先づ抗体またはその断片またはそ
の他の均等物を、交雑したプローグを含むハイブリダイ
ゼーション集合体と結合させ、次にこのような抗体の結
合を検出することができるということである。上述のよ
うに、この抗体試薬は、完全な抗体、抗体の断片、多官
能性の抗体集合体、または一般に抗体から得られて挿入
複合物を特異的に結合する一つまたはそれ以上の部位を
包含するいかなる物質から成っていてもよい。完全な抗
体の形状をしている時は、それは例えばＴｇＧ。

ＩｇＭなどのような既知の免疫グロブリンのどんなりラ
スおよびサグクラスに属するものでもよい。

挿入複合体に対する特異的な結合親和性を保廟するどん
な抗体のどんな断片、例えばＦａｂ　、Ｆ　（ａ　ｂ’
）および（ａ　ｂ’）２として普通に知られているＩｇ
Ｇの断片も使用できる。その他、免疫グログリンまたは
その断片の集合体、重合体および接合体（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ　）も、適当な場合に用いることができる。

抗体試薬に用いる免疫グログリン源は、在来の抗血清や
単クローン法のような、利用できるいかなる方法によっ
ても得ることができる。抗血清はマウス、ウサギ、モル
モット、ヤギのような動物を適当な免疫源で免疫感作す
る操作を包合する充分確豆された方法で得ることができ
る。免疫源は通常、陽イオン性の蛋白質または蛋白質誘
導体（例えばメチル化したウシの血清アルグミ／）と陰
イオン性の挿入物−核酸複合体との間にイオン性の複合
体を含んでいる。理想としては、挿入物は２本鎖の核酸
と共有結合すべきであるが、その代シに挿入物−ＤＮＡ
接合体が担体の蛋白質と共有結合してもよい。免疫グロ
グリ／は、普通単りロー／性抗体と呼ばれるものを生成
する体細胞ハイグリダイゼーショ／法によっても得るこ
とができる。ハイグリドーマ生成に導く一次注射に用い
られる免疫原は、上記の如きものであろう。

抗体試薬の特長は、一般に挿入部位に一番近い特殊な塩
基配列に構わずに、選択された挿入物と２木組核酸との
間で生−じた挿入複合体と結合できることであろう。さ
らにこの抗体試薬は、本質的に１本鎖の核酸、または遊
離の挿入物とは、結合できないであろう。その結果抗体
の結合は、分析形式の適当な設計によって、交雑したプ
ローグと合体した場合のみ装置に存在する挿入複合体に
おいてだけ起る。

本方法において、ハイブリダイゼーション集合体に対す
る抗体試薬の結合は、どんな在米法によっても検出でき
る。抗体試薬自体に、検出可能な化学基の標識をつける
のが得策である。このような検出可能な化学基は、検出
可能な物理的または化学的特性を有する物質ならば、い
かなるものでもよい。免疫分析の分野では、そのような
物質は充分開発されてお）、一般にこのような方法に使
用できる大抵の標識は、本発明に適用できる。特に有用
なの龜、＃累（Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、（１９７６）２２
：１２４３参照〕、酵素基質〔イギリス特許間ｌ１ｌＩ
ＩＩ：第１．５４８，７４１号参照〕・、補＃累〔アメ
リカ特許第４．２３０．７９７号および第４，２３８，
５６５号診照〕およびｗ、素阻曹剤（アメ・リカ特許第
４，１３４，７９２号参照〕のような酵素的に活性な基
；ケイ元物質ＣＣ１１ｎ、Ｃｈａｍ、（１９７９）２５
：３５３参照〕；発色団；化学ルミネセンス発光物質お
よび生物発光物質のようなルミネセ／ス発光物質［Ｃ１
１ｎ、Ｃｈｅｍ、’（１９７９）２５：５１２および同
沓１５３１診照〕；特異的に結合可能な配位子；近接相
互作用対（ｐｒｏｘｉｍａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　
ｐａｉｒ　）　；並びに３Ｈ，３５３，３２ｐ　、　１
２６　Ｉ、および１４Ｃのような放射性同位元素である
。このような標識または標識対は、それ自身の物理的特
性（例えは、ケイ元物質、発色団および放射性同位元素
）または反応特性或いは結合特性（例えば酵素、基質、
補酵素、および阻害剤）に基いて検出される。例えば補
因子（コファクター）で標識を付した抗体は、標識がそ
の補酵素となりまた酵素の基質となるような酵素を加え
ることによって検出できる。またハプテ／または配位子
（例えばビオチ／）で標識を付した抗体は、ノ・ブチ／
に抗体を加えるか、または配位子と結合し、検出できる
分子で標識をつけた蛋白質（例えばアビソ／）を加える
ことによって検出できる。このような検知可能な分子は
、測定できる物理的特性（例えばケイ元また線吸光度）
を有するある種の分子または＃素反応の関与物（例えば
上記の表１１であってもよい。例えば基質に作用して測
定可能な物理的特性を有する生成物を生ずる酵素も使用
することができる。後者の例としては（これに限定され
ないが）β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファタ
ーゼ、ペルオキシダーゼなどがある。その場テＱ）　（
ｉｎ　ｓｉ’ｔｕ）ハイグリダイゼーショ／の研究にと
っては、最終生成物が水溶性であるのが理想的である。

免疫分析の分野で知られているような近接相互作用（ｐ
ｒｏｘｉｍａｌ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　）　標ｉＪ
Ｂまたは結合標識（Ｃｌｉｍ、Ｃｈｅｍ、２７　：　１
７９７（１９８１）並びにアメリカ特許第３，９９６，
３４５号および第４．２３３，４０２号参照〕は、二つ
の異なった抗体の個体群（一つは対の一方の栴成歎累で
標識を付し、もう一つは対の他方の構成要素で標識を伺
しである。）を用いることによって本方法に適用できる
。例えば挿入複合体に対する抗体の第一の部分をケイ元
物質で標識をつけ、第二の部分を消光剤で標識をつける
。そうすると挿入された核酸二重体にそった第−Ｍよび
第二部分の抗体の近接結合によるケイ元の消光によって
、挿入複合体の存在が指示される。

同様に一方の腫生物が他方の基質となるような第一およ
び第二の酵素標識を使用することができる。

その時は複合体の存在は、近接酵素（ｐｒｏｘｉｍａｌ
ｅｎｚｙｍｅ　）のチャ／ネル効果（ｃｈａｎｎｅｌｉ
ｎｇｅｆｆｅｃｔ　）に基つく第二の酵素による代謝回
転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ　）　の増加によって指示される
。その他の標識方式は、当業者にとって明らかであろう
。

上記の方法の代シに、抗体はそれ自身の抗原性のような
生米の特性に基いて検出することができる。第二の抗体
の標識が上記のようなどんな普通の標識でも、標識をつ
けた抗−（抗体）抗体は抗体の一次試栗と結合する。さ
らに抗体は補体結合、または標識をつけた蛋白質Ａや抗
体検出技術上知られているその他の方法を用いて検出す
ることができる。

所望により抗体に標識をつける場合は、標識部分と抗体
試業とが、共有結合を伴うような直接の化学結合または
標識をマイクロカプセル或いはリポソーム（代って抗体
に結合する。〕に包含させるような間接結合によって互
いに合体または結合する。標識の技法は技術上周知であ
り、どんな便利な方法も本発明に部用できる。

反応混合物 分析に供する被検試料（サンプル〕は、対象とするどん
な媒質でもよく、通常は医学、獣医学、積項、栄養、ま
たは工業上意義のある液状サンプルである。尿、血液（
血清または血漿）、乳、脳背髄液、唾液、糞便、肺気（
ｌｕｎｇ　ａｓｐｉｒａｔｅ　）　のどの綿球（ａｗａ
ｂｓ）生殖器の綿球および浸出液、直腸の綿球、並びに
後鼻腔の呼吸気など人間および動物のす／プル並びに体
液は、特に本方法によって分析できる。試験すべき患者
またはその他の源から得た試験す／プルが主として２本
鎖の核酸（細胞に會まれているような〕を含んでいる場
合は、標本を処理して核酸を変性し、また必要ならば先
つ細胞から核酸を遊離させる。核酸の変性は好ましくは
沸騰水中で加熱するか、またはアルカリ処理（例えば帆
ＩＮ水酸化ソーダ）によって行なわれるが、必要ならば
アルカリ処理は細胞を溶解するために同時に用いてもよ
い。また核酸の遊離は、例えば機械的分解（凍結／解氷
、研磨、音波処理）、物理的／化学的分解（’ｌ’ｒｉ
ｔｏｎ、　Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウムのよう
な洗剤、アルカリ処理、浸透ショック、または熱〕また
は酵素的溶解（リゾチーム、ブｏｆイナーゼに、ペプシ
ン）Ｋよって行なうことができる。生じた試験媒体は１
本鎖の形をした核酸を言み、次にこの・・イグリダイゼ
ーショ／法に従って分析することができる。

従来から知られているように、分析には色々なハイツリ
ダイゼーショ／条件が使用される。代表例として、ハイ
ブリダイゼーションは、少し高目の温度１例えば約３５
〜７０℃、普通は約６５℃で、−が約６〜８で適当なイ
オン強度（例えば２ｘｓｓｃ、こ＼でＩ　Ｘ５ＳＣ＝　
０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．０１５Ｍのクエン酸ソ
ーダ、ＰＨ７，０）を有する緩衝液、ウシの血清アルグ
ミ／のような蛋白質、Ｆｉｃｏｌｌ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、　Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ　。

ＮＪ　販売の蔗糖とエピクロールヒドリ／の共重合体を
表わす商標）、ポリビニルピロリドンおよび子ウシの胸
腺または鮭の精子から得られるような変性した異質のＤ
ＮＡを含む溶液中で行なわれる。

ハイグリダイゼーショ／が起るのに必要なす／プルおよ
びプローグ銀量の相補性の程度は、条件の厳密さに左右
され、またハイグリダイゼーショ／の程度と特異性は下
記の王な条件に影響される。

１、　核酸調製物の純度 ２　プローグの塩基組成−〇−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基
対よりも熱に対する安定性が大きい。それ散会１の多い
Ｇ−Ｃを扱うハイグリダイゼーシ甲／は高温でも安定で
あろう。

３、　相同塩基配列の長さ−どんなに短かい塩基配列（
例えば６塩基未満）でも、多くの核酸中に存在する確率
が高い。従ってこのような短かい配列を扱うハイブリダ
イゼーションでは、特異性が殆んど得られないが、また
は全く得られないことも有９得る。問題とするプローグ
の相同配列は少くとも１０塩基、普通は２ｏ塩基または
それ以上で、１００塩基以上が好ましい。実用的な見地
からは、プローグの相同配列は、しばしば３００〜１０
００のヌクレオチドとなる。

４　イオン強度−リアニーリングの速度は、インキュベ
ーション溶液のイオン強度と共に増加し、交雑体の熱安
定性も増大する。

５　イ／キュベーショ／温度−最適のリアニーリングは
、一定の二重体についての融解温度（Ｔｍ）よシ低い約
２５〜３０℃の温度で起る。最適温度よシ著るしく低い
温度でインキュベートすると、交雑する関連環基配列が
少くなる。

６　核酸濃度およびイ／キュベーション時１％Ｊｊ　−
普通ハイプリダイセーフ３フ反応を推進するためには、
交雑し得るサンプル核酸またはプローグ核酸の一方が過
剰に、通常１０倍またはそれ以上過剰に存在する。

７、　変性試薬−ホルムアミドや尿素のような水素結合
分裂剤の存在は、ノ・イグリダイゼーショ／の緊縮度（
βｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　）を増大させる。

８　イ／キュベーショ／時間−インキュベーション時間
が長くなる程、ノ１イグリダイゼ−７ヨ／は完全になる
。

９、　体積排除剤（Ｖｏｌｕｍｅ　ｅｘｃｌ、ｕｓｉｏ
ｎ　ａｇｅｎｔ　）−デキストラ／や硫酸デキストラ／
で例示されるように、体積排除剤の存在は、交雑してい
る構成成分の濃度を著るしく増加させ、これにより、生
起するハイグリダイゼーショ／の速度を大きくする。

通常、挿入物が遊離の化合物として加えられる形式の場
合は、抗体試薬と挿入物はハイブリダイゼーション溶液
中に存在しないが、希望する場合やハイグリダイゼーシ
ョ／の条件が抗体の結合や挿入にとって好都合な場合は
、その限シではない。

通常の場合、交雑したプローグと合体した挿入複合体は
、ハイブリダイゼーション溶液から、交雑したプローグ
を分離してから検出される。挿入物を遊離の化合物とし
て加える場合は、その濃度は通常、存在する挿入複合体
を飽和させるに充分な位に、但し著るしい例えば１０％
をこえる挿入物の自己堆積（５ｅｌｆ　−ｓｔａｃｋｉ
ｎｇ　）が起らない程度にえらばれる。挿入の条件は一
般に温和で、例えば−は約６〜８で、イオン強度は中く
らい（≦１）、室温で長時間のインキュベーションを必
要とせず、普通の場合１５分未満である。

挿入複合体を検出するには、複合体に対する抗体を過剰
に加え、申付のＰＨ（例えば６〜８）、中くらいのイオ
ン強度（≦１）および中くらいの温度（２０〜４０℃）
の条件で、検出可能な生成物を生ずるのに必要な時間（
例えば５分〜２４時間）インキュベートする。次に過剰
（結合しない〕の抗体を、同じような条件で洗浄して除
去する。

核酸−挿入物複合体の飽和を保つために、挿入物を洗＃
最階にいれることによって、上述の手順を変更すること
が必袈−１ｆｃは望ましいかも知れない。また所望なら
ば、挿入剤と抗体とを同時に加えるなど、上記の手順の
いくつかまたは全部を組合せてもよい。

試薬システム 本発明はさらに、希望する分析法を行なうのに必要なす
べての必須の要素を含む試薬システム、即ち試薬の組合
せまたは手段を提供する。この試薬システムは、商業上
包装された形で、試薬の調和性が許す場合は、組成物ま
たは混合物として、試験装置の形で、またはもつと普通
には分析キットとして、即ち必要な試薬をいれ、また通
常は分析を行なうための使用書を添えた一つまたはそれ
以上の容器、装置その他を組合わせた包装として提供さ
れる。本発明の試薬システムは、こ＼に述べた色々なハ
イブリダイゼーション形式、特に上および図面に詳しく
説明した四つの方法の型式を行なうためのすべての形状
と組成物を含んでいる。

どんな場合でも、この試薬システムは、（１）プローグ
、（２）こ＼に記したような核酸挿入物、（３）同じく
と＼に記したような、好ましくは検出可能な化学基で標
識をつけた抗体試薬を包さしている。このシステムは、
避らに試験媒質から得た１本鎖の核酸を固定化させるた
めの固体担体を包含してもよく、またはその代υに、プ
ローグ素子をこのような担体に固定して提供してもよい
。さらに挿入物は、別個の遊離した、実質的に核酸と複
合していない化合物として、試薬システム中に存在して
もよく、または試料が２本鎖の領域（任意に共有結合的
或いは化学的に鎖の一方または両方と結合している。）
を含んでいる場合は、挿入複合体の形で、または化学的
（例えば共有結合的）に１本鎖のプローグ領域と結合す
る（その結果その領域に二重体が生じて挿入複合体が生
成するようになる。）ことによって試料と結合してもよ
い。す／ドイツチ形式の場合は、前述のように、第二の
プローグがこのシステム中に含まれる。このシステムの
試験キットの形をしたものは、その他にノ飄イグリダイ
ゼーショ／溶液や、試験サンプル中の２本鎖核酸を１本
＠に変えることができる変性剤の成分のような、補助化
学薬品を含むことができる。

またサンプルから１本鎖の核酸を遊離させるために、サ
ンプルを処理する化学的溶解変性剤（例えばアルカリ）
をいれることが好ましい。

と＼で実施例によシ、本発明について詳述するが、本発
明はこれにより限定されるものではない。

実施例 Ｉ　材料 Ａ、共有結合的に挿入された２本鎖部分を有するｔｕｆ
Ａ試料の調製 核酸グローブは、ＲＦＭＩ　３　ｍｐ　９のＨｊｎｃ　
Ｉ　ＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの部位
の間に８００塩基対の挿入部（１ｎｓｅｒｔ）を含む修
飾したＭ１３ｍｐ９ベクター［：　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａ
ｎｄ　Ｖｉｅｒｉａ（１９８２）ｇｅｎｅｌｌ　９　；
　２６９、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　
。

Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ　から市販されている。）であ
る。

この８００塩基挿入物（インサート）は、Ｌｃｏｌｉか
ら得られた１、１９０塩基のｔｕｆＡ　配列の断片で、
実際にサンプル核酸と交雑するプローブ（ベクターと挿
入物（インサート）から成っている。）の一部となって
いる。これをｔｕ・ｆＡ挿入物と呼ぶことにする。修飾
されたＭ１３ｍｐ９バクテリオファージはＭ１３−１０
の記号で呼ばれ、Ａｍｅ　ｒ　１ｃ　ａｎＴｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、　Ｍ　Ｄ（ＡＴＣＣ３９４０３−Ｂｉ）から入
手できる。

Ｍ１３−１０フアージの増殖に用いられるＥ。

ｃｏｌｔ　基本微生物（ｂａｓｅ　ｏｒｇａｎｌｓｍ　
）は、Ｂｅｔｈｅ−ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍ
Ｄから市販されているＪＭ１０３［：（Δｌａｃ　ｐｒ
ｏ）。

５ｕｐＥ％ｔｈｉ、　ｓｔｒ　Ａ、　ｅｎｄ　Ａ、　ｓ
ｂｃ　Ｂ、　ｈｓｄＲ−１Ｆ’ｔｒａＤ３ｆｉ、ｐｒｏ
ＡＢ、　１ａｃＩｑＳＺΔＭ１５〕であるｏ　Ｅ。

ｃｏｌｔ　ＪＭＩ　Ｏ３はＭ１３−１０のＤＮＡで形質
転換され、従って、ＬＭ１０３株は、形質転換したＪＭ
１０３に感染せしめられる。Ｍ１３−１０の１本鎖形状
を、感染したＥ、ｃｏｌｉ　によって媒地中に排泄され
るファージ粒子から単離する。ファージ粒子を採取し、
標準的な手順［Ｍｅｓｓｉｎｇその他（１９８１）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　３０９
　）に従って、１本鎖のＭ１３−１０ＤＮＡを採取する
。

ｔｕｆＡ挿入物の５′末端上のＭ１３ｍｐ９ベクターと
相補性のあるオリゴヌクレオチドプライマー、デオキシ
ヌクレオシド三リン酸、およびＬ　ｃｏｌ　１ＤＮＡポ
リメラーゼ（フレノウフラグメント）を用いれば、第二
のＤＮＡ鎖が合成される。この二番目の鎖は、ｔｕｆＡ
挿入物迄伸長しない程度の制限量のチオキシヌクレオシ
ド三リン酸を用いて合成される。それというのもこの挿
入物（インサート）は、ハイブリダイゼーション分析に
おいて有用なプローブに対して、大体において１本鎖と
なっていなければならないからである。この方法は文献
Ｃｎｕ　ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）Ｇｅｎｅ
　１７：２７１〜２７７〕に記載されており、またオリ
ゴヌクレオチドプライマー（配列ＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡ
ＣＡＣＡＡＣ）は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ　Ａから市販されてい
る。

Ｍ１３−１０試料、中に存在する２本鎖ＤＮＡの量は、
２本目の鎖の合成に用いた放射能で標識したヌクレオシ
ド三リン酸を使用するか、またはＳ１ヌクレアーゼによ
り分解し、次に臭化エチジウムでケイ光分析を行なって
測定することができる。

上述のようにして調製したＭ１３−１０試薬の２本鎖領
域に、元の標識を付したエチジウム銹ｉ体、８−アジド
エチジウムを用い、元親和性反応で、エチジウムを挿入
し共有結合させる。この光反応性挿入物は、文献［Ｑｒ
ａｖｅｓ　その他（１９７７）、Ｂｉｏｃｈｉｍ　、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　４７９：９８〜１０４）に記
されているようにして調製単離する。２本鎖ＤＮＡに対
するその結合は、その期化合物である臭化エチジウムの
結合を模したものであることが示されている。［Ｂｏｌ
ｔｏｎ　ａｎｄ　Ｋｅａｒｎｓ　（］　９７８　）Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　５　：　４８９１　：
　Ｇａｒｌａｎｄ　その他（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　１９　：　３２２　］−我々ノ研死では、この手順
によれば３−アジドおよび８−アジドエチジウム異性体
の混合物が生ずることが分ツタ。〕〕８−アジドエチジ
ウは元反応性を有するので、分解を防止するためにその
取扱いには標準的な予防策を講じなければならない。そ
のためには赤色の写真用安全灯の下で暗所で作業するの
が得策であることが分った。８−アジドエチジウムの溶
液は凍結状態で、暗所に一７０℃で少くとも１ケ月貯蔵
できる。

可視光線で光分解させると、８−アジドエチジウム中の
アジド部分は、化学的に反応するナイトレンに変り、こ
れは利用できる核試薬と素早く反応して、共有結合的な
エチジウム付加物を作る。

［Ｋｎｏｗｌｅｓ　（１９７１）Ａｃｅ　、Ｃｈｅｍ、
Ｒｅｓ、５　：１５５］元分解が起った時に、８−アジ
ドエチジウムがＤＮＡの塩基対の間に挿入されると、Ｄ
ＮＡに対するエチジウムの共有結合が高い効率で起る。

［Ｂｏｌｔｏｎ　ａｎｄ　Ｋｅａｒｎｓ　（１９７８）
　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、５：４８９１，１ ２０ｍＭのトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（トリス−Ｈｃｉ　）、２００ｍＭの塩化ナトリウム（
ＮａＣ４）、ｐ）１．８．０　のような適轟な緩衝液中
に、約１ｍＭのＤＮＡ塩基対および０．５ｍＭの８−ア
ジドエチジウムを含む溶液の光分解によって、エチジウ
ムはＭ１３−１０の２本鎖領域に共有結合的に結合する
。光分解Ｆ１１５０ワットの戸外用ヌボットライトを用
い、光源から５〜２０ｃｍはなれた所で撹拌反応をさせ
て行なわわる。光分解反応が過熱しないように、またす
べての知波長（即ち３００　ｎｍ未′１４）の放射を防
止するために、光分解反応は温度調節装置を備えた水循
環装置に接続したガラスの水浴で囲う。適箔なインキュ
ベーション時間（例えば６０分）後、等容極の水飽和ｎ
−ブタノールを用いた一連の、例えば１０回連続の抽出
によって、ＤＮＡに共有結合的に結合しないエチジウム
基を除く。さらに８−アジドエチジウムを加え（最終濃
度は０．４ｍＭの範囲）、光分解と抽出の手順をくシ返
す。ＤＮＡと合体したエチジウムの量は、光分解したエ
チジウムアジドについてはε４９０ミ４Ｘ１０Ｍ’−鋸
　の消衰係数、光分解してＤＮＡと結合したエチジウム
についてはＡ２６０とＡ４９０の関係式ＣＡ２６０　＝
　（’Ａ４９０′×３゜４）−０，０］、１）、また標
識されている所定のＤＮＡのＤＮＡ塩基対の濃度につい
てけε２６０ミ］　、　３２　Ｘ　１０’Ｍ−”ｃｍ−
’　の消衰係数を用いて算定する。

試薬の２本鎖領域中のＤＮＡの各２対の塩基に対して、
一つのエチジウム部分が存在するように、試薬をエチジ
ウムで飽和させることが好ましい。

希望する標識密度が得られる迄、光分解反応と抽出をく
り返す。

Ｂ、サンドイッチハイブリダイゼーション形式に用いる
アテノウイルス試料の調製 サンドイッチハイブリダイゼーション形式については、
次の文献に記されている。即ちＤｕｎｎ　ａｎｄＨａａ
ｓｅｌｌ　（１９７７）　Ｃｅ１ｌ　１２：２３；Ｄｕ
ｎｎ　ａｎｄＳａｍ−ｂｒｏｏｋ　（１９８０）　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ’　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５：４
６８゜Ｒａｎｋｉ　ｅｔ　ａｌ　（１９８３）　Ｇｅｎ
ｅ　２１　ニア７　；Ｒａｎｋｉ　ｅｔａｌ　（１９８
３）　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ、　１０４　：３
０７−３１０゜この方法は二つの核酸グローブを必要と
し、その各々はサンプル中の試験されている核酸の独特
の領域に対して相補的になっている。グローブの一方は
固体担体上に固定化はれ、他方はイβＪらかの方法で標
識され、また最初はサンプルの核酸と共に溶液中にある
。これらを、それぞれ、固相プローブおよび溶液相プロ
ーブと呼ぶことにする。

同相および溶液相プローブは、Ｒａｎｋｉその他Ｃ（１
９８０）Ｇｅｎｅ　２１　：　７７−８５　）が述べて
いるように、アデノウィルス２型（Ａ部２）から得たＤ
ＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分解物から作る。

固体相のプローブは、ｐＢＲ３２２ベクター中に挿入さ
れたＡ部２　ＤＮＡのＢａｍＨＩの断片ＣｔたはＤ　〔
Ｔｏｏｚｅ　（１９８０）％Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ
　＃（２ｎｄ　ｅｄ　）Ｐａｒｔ　２　：　ＤＮＡＴｕ
ｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　ｐ
ｐ、　９３３−９３４　）から成っている。これらのプ
ローブにはそれぞれｐｋＴＨ１２０１およびｐｋＴＨ１
２０２の記号がつけられた。溶液相のプローブは、断片
がＭ１３ｍｐ７の１３ａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ
部位にショットガンクローニングされているｐｋＴ）（
１２０１のＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ制限エンドヌク
レアーゼ分解物から成っている。（Ｍｅｓｓｉｎｇその
他（１９８１）Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　
：　３０９　）挿入物（インサート）としてＡｄ２Ｃの
断片を含む修飾Ｍ１３ｍｐ７をｍｋＴＨ２３０６と呼ぶ
。

溶液プローブｍｋＴＨ］２０６は、上の第１−Ａ部に述
べたようにして部２本鎖とし、その２本鎖領域は、同じ
く上の第１−Ａ部に記したように、挿入剤（例えばエチ
ジウム）で標識する。

Ｃ，ＨＣＭＶグローブの調製 ヒトの唾液腺ウィルス（ＨＣＭＶ　）の細胞株ＡＤ１６
９から得たＥＣ０ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの０断片
ＣＴａｍａｓｈｉｒｏその他（１９８２）　Ｊ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、。

Ｍａｙ、　５４７〜５５６：Ｃｈｏ（１ａｎｄ　Ｍｅｒ
ｉｇａｎ　（１９８３）Ｎｅｗ　ｌＩＤｎｇｌ、　Ｊ、
　ｏｆ　Ｍｅｄ、　３０８　：　９２１　、：ｌを、Ｔ
ａｍａｓｈｉｒ。

その他が述べたように、Ｅ、　ｃｏｌｔ細胞株ＨＢ　１
０１をＤＮＡ感染させるのに用いるｐＢ’Ｒ３２２の誘
導体ｐＡＣＹＣ１８４中にクローニングする。挿入物（
インサート）を有する１）ＡＣＹ０１８４において増殖
精製後、制限エンドヌクレアーゼｇｃｏＲＩ　でプラス
ミドを分解し、標準手順［Ｍａｎｉａｔｉｓ　その他（
１９８２）％　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
／’　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ、　ＮＹ）に従い、０．８％のアガ四−ヌゲル中
で調製用短気泳動によって、ＨＣＭＶの０断片ｆｉ、８
ｋｂをｉ製する。

Ｄ、挿入物（ｊｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ　）で標識した
ＨＣＭＶ試料の調製 上記Ｉ−Ｃから得た精製２本鎖０断片を、次に上のＩ−
Ａに述べたように、光により変化するエチジウム誘導体
８−アジドエチジウムを用いて、エチジウムで共有結合
的に標識する。

Ｅ、挿入複合体免疫原の調製 皮下注射針を繰返し通して、子ウシの胸腺または鮭精子
のＤＮＡを切シ堆、！ｌ）、Ｓ＋ヌクレアーゼで処理し
て１本鎖領域を除きＣＭａｎｉａｔｉａ　（１９８２）
％　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　／／　、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　
ＮＹＩ　多数の標準方法の中のどれか一つの方法（例え
ばエタノール沈澱、ゲル排除クロマトグラフィー、また
はイオン交換クロマトグラフィー）を用いて、生成する
ヌクレオチドから分離する。

次に上のＩ−Ａで述べたように、精製した２本鎖ＤＮＡ
を光分解によって、元変化性のエチジウム銹導体８−ア
ジドエチジウムに共有的に結合させる。カルボン酸残基
をメチル化して担体蛋白質を作り、次にＰｏ１ｒｉｅｒ
その他［（１９８２）ＩＥ’ＮＡｓ７９　：６４４３：
］が述べているように、挿入物で標識したＤＮＡと結合
させて、静電気的に合体した核酸−蛋白質複合体を形成
せしめる。

Ｆ、挿入複合体に対する多クローン性抗血清の！Ｍｊ製 文献Ｃ５ｔｏｌｌａｒ　（１９８０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　ｇｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ７０ニア０〕に述べで
ある固定化法および計画を用いて、ウサギの中に挿入物
−ＤＮＡ複合体に対する多クローン性抗血清を誘発させ
る。例えばＬａｎｇｅその他Ｃ（１９７６）　Ｃ１１ｎ
、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

２５　：　１９１　）　；Ｐｉｓｅｔｓｋｙその他［（
１９８１）Ｊ。

Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　４１　：　１８７　］
が述べたように、単クローン性抗体に用いられるのと同
じような同相分析で抗血清をスクリーニングする。最初
のヌクリーニング規準は、挿入物−ＤＮＡ複合体に対す
る結合でおろう。

抗体を含む抗血清のＩｇＧ部分は、硫酸アンモニウム沈
澱、次にＤＥＡＥセルロースを用いたクロマトグラフィ
ーＣＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ　（１９７４）　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　３４　：　７２３　
〕によって他の血清蛋白質から単離する。

この抗血清のＩｇＧ部分は、さらにＤＮＡ−挿入物複合
体を固定化させた樹脂を含むカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって精製する。Ｃ５ｔｏｌ
ｌａｒ　（１９８０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ、
ｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ　７０　：　７０　〕ＩｇＧ部分を
カラムに作用させた後、洗浄によって非特異的に結合し
た蛋白質を除き、冷所で特異抗体を２Ｍの酢酸で溶離さ
せる（　８ｔｏｌｌａｒ　（１９８０）同書〕。

ハイブリダイゼーション分析に使えるかどうかを決定す
るために、ｆＩＩ製した抗体を寧らに充分スクリーニン
グする。抗体は高い親和性（好ましくはＫＡ≧１０１０
　Ｍ−１）で挿入物−ＤＮＡ複合体と結合しなけれはな
らない０遊離の挿入物または１本鎖ＤＮＡと交差反応を
することＶｉ訂されないが、分析形式によっては抗体の
ある程度の交差反応は許される。

Ｇ、挿入複合体に対する単クローン性抗体の調製 上記あようにして調製した挿入物−ＤＮＡ免疫原を用い
、標準的な手順（Ｇａ１ｆｒｅ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ（１９８１）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
、　７３　：　］　〕に従って挿入物−ＤＮＡ複合体に
対するマウスの単クローン性抗体が得られる。文献〔例
えはＬａｎｇｅその他（１９７６）　Ｃ１１ｔｉ）、Ｅ
ｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２５　：　１９１；Ｐｉｓ
ｃｔａｋｙその他（１９８１）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　
Ｍｅｔｈｏｄｓ４１：１８７］に記されである方法の変
法を用いて、単クローン性抗体をスクリーニングする。

ＤＮＡ−挿入物複合体を検出する分析で使用できるよう
になるためには、単クローン性抗体は高い親和性（好ま
しくはＫＡ≧１０１０Ｍ　１　）でＤＮＡ−挿入物複合
体と結合しなければならないが、１本鎖のＤＮＡまたは
遊離の挿入剤とは結合できない。

分析の形式によっては、２本鎖ＤＮＡとの交差反応は許
されるであろう。

マウスの単クローン性抗体は２段階の手順で精製される
。１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１５　ＭのＮａＣ１
、ｐＨ，８、０で平衡にしたＡｆｆｉ　−Ｇｅｌ　Ｂｌ
ｕｅＲｅｓｉｎ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）のカラムに、稀
釈しない腹水体液を作用させ、同じ緩衝液で溶離させる
。この手順によってアルブミンは除かれてカラムに保持
される。精製の最後の段階はＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａ
ｌｓ、　Ｐｔｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　）による処理
で、１０ｍＭのトリヌーＨＣ１，ｐＨ８，０から１０ｍ
ＭのトリスーＨＣ４，２００ｍＭのＮａＣ１迄の線形（
直線）勾配（１ｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　）で溶
離させるＯこの操作によって、アルブミンやトランスフ
ェリンのような汚染性の面清蛋白質を含′１ない、ｌ’
％を製きれたマウスの単クローン性抗体が得られる。

Ｈ１β−ガラクトシターゼー抗体接合体の調製β−ガラ
クトシダーゼ（３０，０００単位、等級■　、　Ｓｉｇ
ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ　Ｌｏｕｔｓ
、　Ｍ　Ｏから市販されている。）を０．１ＭのＮ’−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．０９　ＭのＮａＣ４，ｐ
Ｈ７，０から。

成る緩衝液２ｍ１Ｋ浴解した０これによって、１．８４
−中に３７．７１Ｒ９の蛋白質（７（ｌｎｍｏｌ）を含
むβ−ガラクトシダーゼ溶液が得られた。この溶液にジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）　３．５　μｍｏｌ　（５
０倍モル過剰）を加え、混合物を室温で４時間放置した
０ 上記のＨＥＰＥＳ／ＮａＣｚ　緩衝液を溶離液として用
イ、コノ混合物を５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ−Ｃｔ樹脂
（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　）の２．５Ｘ８
０ｍカラムを用いたりうマドグラフィーによって、ＤＴ
Ｔを酵素溶液から除いた０全体積が１５−になるように
、蛋白質を含む画分をプールした。弓：。＝　２０．９
　［Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　ＥｎｚｙｍｅＭａｎｕａ
ｌ　（１９７７）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｆｒｅｅｈ
ｏｌｄ、　ＮＪ　、　ｐ　、　１９５　：］を用いて、
β−ガラクトシダーゼの濃度は、９．６２１Ｗ／’ｍ／
と測定された。また酵素上の水体基の数は、Ｅｌ　１ｒ
ｎａｎ　の試薬ＣＥｌｌｍａｎ　（１９５９）　Ａｒｃ
ｈ、　Ｂｉｏｃ−ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　８２　
：、７０　〕を用いて、１１．０と測定された。代表例
としてこの報告書はβ−ガラクトシダーゼ１分子につい
て、９〜１５個の遊離の水体基を与える。

β−ガラクトシダーゼを抗体に結合させるために、異種
二価性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｏｔｉｏｎａｌ）結合
試薬、ヌクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１−カルボキシラード（ＳＭＣＣ，
Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ、　ＩＬから得られる。）を用いた。この結合
試薬は、アミン基と結合するために、水体基の部分およ
びＮ−ヒドロギシスクシンイミドエステルと選択的に反
応するマレイミド基を含んでいる。結合の手順は２段階
から成っている。即ちＳＭＣＣと抗体のアミン基を反応
させ、次にマレイミド部分をβ−ガラクトシダーゼの水
体基と反応きせることによって、その抗体誘導体をβ−
ガラクトシダーゼに結合させる。

ＳＭＣＣ５，３■を無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）２５０μｔにとかした。この溶液中の反応性
のあるマレイミド基の真の濃度は、既知量のグルタチオ
ンと反応させ、次にＥｌｌｍａｎ　（７）Ｋ薬（前記）
を用いてクルタテオンの水■基を定量することによって
測定した０例えばＨ，Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ１０．０１５Ｍ　
ＮａＣ１緩衝液で、４０　ｔｔｌのＤＭＦ溶液を３Ｔｎ
ｌにうすめ、次にこのＳＭＣＣ水溶液２５μｔをＨＥＰ
ＥＳ／ＮａＣ１緩衝液８２５μｔおよび１　ｍＭ　グル
タチオン１００μｔと混合した。室温で１５分間放置後
、Ｅｌ　１ｒｎａｎ　の試薬（前記）および適当な標準
法を用いて、反応しないクルタテオンの１を測定した。

（即ち反応しないグルタチオンおよびグルタチオンを加
えない対照）各ＳＭＣＣ溶液について数回測定を行ない
、その結果を平均した。この報告書は、上記のようにし
て作ったＳＭＣＣのＤＭＦ溶液中の反応性のあるマレイ
ミド基は、５２ｍＭであることを示している。

マウスの単クローン性抗体６．０　ｍ９　（４０ｔｔ　
ｍｏｌ）を、最終容積が５３３　ｔｔｌのＨＥＰＥＳ／
　０．１５　Ｍ　ＮａＣ１にとかした４００μｒｎｏｌ
のＳＭＣＣと混合し、３０℃で１時間反応させた。次に
反応混合物をＢｉｏ　−Ｇｅｌ　ｐ　−２樹脂（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍ−
ｏｎｄ、ＣＡ）のｌＸ２４ｃｒｎカラムに作用させ、Ｈ
ＥＰＥＳｌｏ、１５Ｍ　ＮａＣｔで溶離させた。蛋白質
を含む全面分をプールし、Ｓｅｄｍａｃｋ　ａｎｄ　Ｇ
ｒｏｓｓｂｅｒｇの方法ＣＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　７９　：　５４４（１９７７）　）を用いて蛋白質
濃度を測定し、また上述のようにしてマレイミド基の数
を測定した。これらの測定の結果、抗体の濃度は１．９
８　ｍｇ／ｍｌで、１〜２マレイミド／抗体分子である
ことが分った。

抗体−マレイミド接合体２８ｍｇをＤＴＴで処理したβ
−ガラクトシダーゼＩＯＭ＋と混合しく最終容積２．４
５μｔ）、室温で４時間反応させた。次にこの混合物を
５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６３３−Ｃ４３３−Ｃ４（Ｐｈａ
ｒ　。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　）の２．５Ｘ８０ｃｍ
カラムに作用させ、４℃でＨＥＰＥＳｌｏ、１５Ｍ　Ｎ
ａＣ’ｌで溶離させた。

流悩は４ｍｅ１時で３　ｍｌの画分を集めた。各画分に
ついて、β−ガラクトシダーゼの活性と抗体結合能力を
分析した。両分３９〜４２け両方の特性をイｊしている
のてこり、をプールした。

Ｊ、ビオチン標識した抗体の調製 文献ＣＯｉ　ｅｔ　ａｌ　（］　９８２　）　、　Ｊ、
　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ。

９３　：９８１　；　Ｈｅｉｔｚｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ
　（］　９７４　）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７１　：
３５３７　；　Ｇｒｅｅｎ（１９７５）　Ａｄｖ、　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ、　２９：８５）に記述きれて
いる方法を用い、精製した抗血清をビオチンのＮ−ヒド
ロキシヌクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯまた
はＢｔｏｓｅａｒｃｈ、　Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ　、　
ＣＡから市販されている。）で処理する。

Ｋ、放射能標識した抗体の調製 文献に示されている手順に従って、精製した抗体に放射
能標識する。放射性ヨウ素化は、Ｂｏｌｔｏｎａｎｄ　
Ｈｕｎｔｅｒ　の報告’９７　［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、　１３３：５２９（１９７’３）　〕に従って、抗体
と１２５１　で標識した３−（４−ヒドロキシフェニル
）プロピオンａ＆Ｎ−ヒドロキシヌクシンイミドエステ
ル（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓ
ｔｏｎ、　ＭＡから市販されている。）と反応させるこ
とによって達成される。こうする代りに、抗体画分を二
価性のキレート試薬と共有結合的にカップリングさせＣ
Ｙｅｈその他（１９７９）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　１００：１５２）、次に適当な放射性金属イオン
で標識してもよい。この後者の方法は、抗体画分の貯蔵
寿命が放射性同位元素の半減期によって制限されないと
いう利点を有する。

Ｌ、アルカリ性ホスファターゼ−ビチオン−アビジン複
合体の調製 アルカリ性ホスファターゼ−ビチオン−アビジン複合体
は、Ｌｅａｒｙその他［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｅｔ、ＵＳＡ８０：４０４５（１９８３）］が記述し
ティるようにして作られる。即ち子ウシの腸のアルカリ
性ホスファターゼを先づヌベリン酸ジヌクシミジルと反
応させて架橋させ、次にビオチニル−ε−アミノカプロ
ン酸のヒドロキシスクシンイミド。

エステルと結合させる。精製後、アルカリ性ホス７アタ
ーゼービオチン複合体を少レモル過剰のアビジンと化合
させて、アルカリ性ホヌファターゼーピオテン複合体を
アビジン（アビジンの１分子について四つのビオチン結
合部位を壱する。）で標識する。この最後の手順では、
アビジンまたはアビジンの細菌性類似体ヌテプトアビジ
ン［Ｈｏｆｍ−ａｎｎその他（１９８０）　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７７　：　４
６６６〜４６６８　；　Ｂａｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤから市販されている。〕を使用す
ることができる。

アルカリ性ホスファターゼ−ビオチン−アビジン複合体
に用いられる検出システムは、Ｌｅ　ａ　ｒｙその他（
前記）が述べているように、ニトロブルーテトラゾリウ
ムおよび５−プロモー４−クロロ−３−インドリルリン
酸塩から成っている。

■　方法 Ａ、尿中のクラム陰性細菌の検出−〔タイプ１の方法〕 共有結合的に挿入された２本鎖領域を有するｔｕｆＡ試
料を用い、酵素標識した抗体で検知する同相、固定化サ
ンプルハイブリダイゼーション分析（第２図参、照） Ｅ、ｃｏ’ｌｉから得たｔｕｆＡの配列は非常に保存性
がよいので、尿サンプル中のクラム陰性細菌の存在の検
出に用いることができる。臨床用の尿の標本を、小さな
遠心力（例えば５ｏｒｖａｌｌ’　ＧＬＣ−３遠心分離
機を用いて８０００ｒｐｍ　）で短時間（例えは５分）
遠心分離して清澄にする。上溝中の細菌細胞を溶解させ
、高温（６５℃）で１０分間、尿のサンプル全０．５　
Ｍにすることにより、細菌のゲノムを変性はせる。

こうする代シに尿を９０℃に加熱してこの温度に１０分
間保ってもよい。溶解変性後、等容租の２０ＸＳＳＰＥ
（３，６Ｍ　ＮａＣ４０，２ＭＮａｇＰＯ＜　、２０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ　。

ｐＨ７，７）で稀釈中和する。次にこの尿標本を静ちに
軽度の真空でニトロセルロース膜でＦ遇する。

この固定化された細菌ＤＮＡを、次に８０℃で２時間真
空中で焼いてニトロセルロース膜に固定する。固定化さ
れたサンプルＤＮＡを含むフィルターを、プリハイブリ
ダイゼーション溶液ＣＯ，１チ（Ｗ／Ｖ）各々５　Ｘ５
ＳＰＥに溶かしたＦｉ　ｃｏ　ｌ　１　（Ｐｈａｒ−ｍ
ａｃｉａ　）、ポリビニルピロリドンおよびＢ５Ａｌ０
０〜２００μ２／−変性非対応ＤＮＡ）と６５℃で１〜
３時間処理する。フィルター１０２について、５０〜１
（）０μｔのプリハイブリダイゼーション溶液を用いる
。プリハイブリダイゼーション処理後、Ｉ−Ａで述べた
ようにして作ったエチジウム標識したプローブをプリハ
イブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼー
ションを起させる。（１〜７２時間）上記の操作はすべ
て次の文献に記されている標準的な方法である。

ＣＭａｎｉａｔｉｓその他（１９８２）　ＳＳ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　／’。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＱｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　
ＮＹ）。

ハイブリダイゼーション後、フィルｐ−を洗って過剰の
ＤＮＡ試料を除く０次に挿入物−ＤＮＡ複合体に対する
β−ガラクトシダーゼ標識抗体を含む溶液にフィルター
を浸し、５分〜１２時間培養する。洗浄によって過剰の
抗体を除き、酔累のケイ元発生原（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ
＋ｃ　）基質（例えは４−メチルウンベリフェロンβ−
ガラクトシド）を加え、暫くしてからケイ元の強度を測
定して、フィルターと合体したβ−ガラクトシダーゼを
定量する。存在する酵素の童は極めて少ない傾向がある
ので、ケイ元発生原基質は、β−ガラクトシダーゼのミ
バエリス定数（Ｋｍ）よりも冒いかまたは等しい濃度で
加える。ハイブリダイゼーションヲ定量できるように、
一定量のグローブをフィルターに固定化させた標準試験
を、同時に行なうことができる。

Ｂ、アテノウィルヌの検出−〔タイプ２の方法〕共有結
合的に挿入された２本鎖領域を有し、標識されたプロー
ブを用い、酵素標識した抗体で探知するサンドイッチハ
イブリダイゼーション分析（第３図参照） この方法は臨床標本中のアナノウィルヌ２型（Ａｄ２）
ＤＮＡ検出のために、Ｒａｎ’ｋｔその他が述べている
サンドイッチハイブリダイゼーション分析に基いたもの
である。［Ｒａｎｋｉ　ｅｔ　ａｌ　（１９８３）Ｇｅ
ｎｅ　２］　ニア７；　Ｒａｎｋｉ　ｅｔ　ａｌ　（１
９８３）ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｊｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｌ
　０４゜Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　ＮＹ　ｐ
、　３０７　］。固相試料ｐＫＴＨ１２０２（上の第１
−Ｂ部参照）を変性、ニック（ｎｉ：ｋ）Ｌ、、ニトロ
セルロースのフィルターに固定化きせる。固定（８０℃
で２時間真空中で焼く。）後、フィルターをプリハイブ
リダイゼーション溶液で１時曲６５℃で処理する。臨床
サンプルから得たＤＮＡ、および挿入物標識した溶液ハ
イブリダイゼーショングローブｍｋ’ｌ’Ｈ１２０６（
上の第１−Ｂ部で述べたようにして作る。）をプリハイ
ブリダイゼーション溶液に加え、プローブとサンプルＤ
ＮＡとのハイブリダイゼーションを１〜７２時間起させ
る。ハイブリダイゼーション後、過剰の溶液グローブ（
ｍｋＴＨ１２０６）を洗浄して除く。

上のＩＩ−Ａで概設したようにして、挿入物−ＤＮＡ複
合体に対するβ−ガラクトシダーゼ標識した抗体を用い
て、ハイブリダイゼーションの程度を定量する。

Ｃ６尿中のヒトの唾液腺ウィルス（サイトメガロウィル
スの検出（方法タイプ３） 固相で固定化したプローブを用い、ビオチン標識した抗
体および酵素標識したアビジンで探知するハイブリダイ
ゼーション分析（第４図参照） この方法は臨床用の族サンプル中のヒトの唾液腺ウィル
ス（ＨＣＭＶ）の検出に用いられる。鞘・製試料（上の
Ｉ−〇で述べたようなＨＣＭＶ細胞株ＡＤ１６９のＥｃ
　ｏＲＩのＯ断片）を９０℃で１０分間熱して変性させ
、氷上で急冷（再結合を防ぐため）し、等容の２０　Ｘ
　５ＳＰＥ（３，６ＭＮａＣｔ。

０．２　Ｍ’ＮａｈＰＯ＜’　、　２０　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　、　ｐＨ７，７）と混合する。次に積率手順を用い
、１本鎖のＤＮＡ試料を固定化し、ニトロセルロース膜
に固定する。次にこの膜をグリハイブリダイゼーション
溶液（異種ＤＮＡを含まないものが好萱しい。）と処理
する。使用できるグリハイブリダイゼーション溶液の１
例については、Ｎｅｗ　Ｆ：ｊｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ
ｅａｒがそのＱｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　（商標）膜につ
いて述べておシ、この溶液は１％のＳ　Ｄ　Ｓ　、　Ｉ
　ＭＮａＣｔ、および１０％の硫酸デキストランから成
っている。この検出方式の最後の段階における抗体の非
特異的結合を防ぐために、プリハイブリダイゼーション
溶液にＢＳＡを含ませることが望ましいだろう。

試験に供する臨床用の族サンプルは、Ｃｈｏｕ　および
Ｍｅｒｉｇａｎ　ＣＮｅｗＥｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、
　３０８　：９２１（１，９８３））が述べているのと
同じような方法で作る。遠心分離によってサンプルを清
澄にし、ＨＣＭＶンアージ粒子を濃縮し、た後、この粒
子を極めて小容量の０．５　Ｍ　ＮａＯＨに再び懸濁さ
せ、１５分間放置する。極めて小容量の２０　Ｘ５ＳＰ
Ｅで中和後、１％（７）ＳＩ）Ｓ、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１、
１０％の硫酸デキストランおよび１００μ２／ｍｌの変
性した鮭の精子のＤＮＡ中においたフィルターに変性し
た臨床用サンプルを加える。６５℃で１〜７２時間ハイ
ブリダイゼーションを行なわせ、次に２ＸＳＳＰＥ中で
フィルターを洗う。

選択された挿入剤（例えばミリモル以下の濃度の臭化エ
チジウム）を含む極小容量の溶液にフィルターを浸し、
次にＤＮＡ−挿入剤複合体に対するビオチニル化した抗
体（上記のＩ−Ｊ）を加えて結合させる。（１〜２４時
間）そして過剰の抗体を洗浄して除く。状況によっては
、２本鎖ＤＮＡを飽和状態に保っておくために、挿入剤
をこの洗浄段階にいれておく必要があるだろう。

次ニストレプトアピジンービオチンーアルカリ性ホスフ
ァターゼ複合体（上の第１−Ｌ部）を加え、Ｗａｒｄ　
その他［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８０：４０４５（１９８３）］が述べているよ
うに、ＤＮＡと合体したビオチニル化抗体と結合させる
。過剰のアルカリ性ホヌファターゼ接合体を洗い流した
後、Ｗａｒｄ　（前記）が述べているように、アルカリ
性ホヌファターゼの比色基質を加えて、フィルターと合
体した接合体の存在を測定する。これは臨床用尿標本中
のＨＣＭＶ　ＤＮＡの存在を直接測定する方法である。

Ｄ、尿中のヒトの唾液腺ウィルスの検出（タイプ４の方
法） 同相で、挿入剤で標識し固定した試料を用い、挿入剤複
合体の抗体に対する放射能標識したもう一つの抗体で探
知するハイブリダイゼーション分析（第５図参照） この方法は、プローブが既に挿入剤で標識され、検出方
式の最後の段階で、同位元素で標識したもう一つの抗体
を必要とする点を除いては、上記■−Ｃの方法と同様で
ある。

上のｕ−Ｃの方法について述べたように、グローブ、７
２１１ちエチジウムで標識したＨＣＭＶのＥｃ　ｏＲＩ
断片Ｏ（上の第１−Ｄ部で記したようにして作る。）を
変性固定化させ、ニトロセルロース担体に固定する。上
記Ｈ−Ｃで記述したように（但し遊離の挿入剤を加える
必要はない。）ウィルスのＤＮＡを尿のサンプルから単
離、変性させ、固定化したプローブと交雑させる。

交雑したＤＮＡでフィルターを洗った後、挿入剤−ＤＮ
Ａ複合体に対する過剰のマウス単クローン性抗体（上記
１−Ｇ参照）を加え、交雑したＤＮＡ−挿入剤複合体と
結合させる。（３０分〜６時間）洗浄して過剰のマウス
抗体を除き、放射能標識した過剰のウサギの抗（マウス
ＩｇＧ）　（１−Ｋ）を加える。３０分〜６時間インキ
ュベート後、洗浄して再び過剰の抗体を除去する。オー
トラジオグラフィーまたはガンマ−計数ニよって、ハイ
ブリダイゼーションを定量する。

■　挿入複合体の抗原性の証明 Ａ、共有結合性エチジウム−ＤＮＡ複合体の自製 約２５０■の鮭の精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）
　を５０ｍＭのＮａＣ１４０−に浴かし、２３ゲージの
注射針に５回通して切断する。切断したＤＮＡを２５０
ｍＡ’のフラスコにいれ、１６０ｍ７！の緩衝液を加え
て稀釈する。１　ｍｌについて２００，０００単位のＳ
、−ヌクレアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）１４５μｔを加え、この混合物を３７℃で５０分
インキュベートする。

次に反応混合物をフェノール：クロロホルムテ２回、ク
ロロホルムで１回抽出し、エタノールで２回ＤＮＡを沈
澱させる。［Ｍａｎｉａｔｉｓ　その他（１９８２）’
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　／ｌ、Ｃｏ１
ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）
最後の沈澱物を２０ｍＭのトリスＨＣｔ緩衝液（ｐＨ８
，０）　７０−に溶かす。

このＤＮＡを次の条件下で８−アジドエチジウムと反応
させる。即ち反応混合物は、２．７■ＤＮＡ／−を３３
ｍｅ、　４．９５　ｍＭの８−アジドエチジウム１３．
５７．０．２Ｍ）リスーＨＣｔ緩衝液（ｐＨ８，０、０
，２Ｍ　ＮａＣ４）　Ｉ　Ｌ５　ｍｌおよび水７６ｒｎ
ｌｔｌ−用いて調製する。２２℃に保った水套を有する
２５〇−ビーカーにこの混合物をいれ、撹拌して１０ｍ
の距離から１５０ワツトのヌポットライトを６０分照射
する。同じ反応混合物について、この光分解をくり返す
。

光分解した反応混合物を一緒にして、２．０ｍＭトリフ
ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，０、０，２Ｍ　ＮａＣ１）で飽
和した等容のｎ−ブタノールで１０回抽出し、抽出した
ＤＮＡ溶液を２３ｍの４．９５ｍＭ５−アジドエチジウ
ムおよび７７−の２０ｍＭトリスＨＣｔ緩衝液（ｐＨ８
，０、０，２Ｍ　ＮａＣ１）と混ぜる。コノ溶液を水套
を備えたビーカー中で撹拌し、９０分間元分解する。反
応生成物を前述のようにして緩衝液で飽和したブタノー
ルで１０回抽出し、エタノールでＤＮＡを沈澱させる。

沈澱物を１０ｍＭのトリス”　ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，
０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に浴かし、２６０および４．９
０　ｎｍにおける吸光度を記録する。上の実施例ＩＡで
述べたようにして計算した結果、ＤＮＡの４．５塩基対
について、一つのエチジウム残基が組みこまれているこ
とが分った。

Ｂ、メチル化テログロブリンの調製 １００■のウシのテログロブリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ）　を
１０ｍ６の無水メタノール、および２．５５　ＭのＨＣ
１ｋ溶かした４００μｔのメタノールと混合する。この
混合物を室温で５日間回転ミキサーで撹拌する。遠心分
離して沈澱物を集め、メタノールで２回、エタノールで
２回洗浄する。次にこわを真空で一夜乾燥すると、約８
２岬の乾燥粉末が得らり、る。

Ｃ９共有結合したエチジウム−ＤＮＡ−メチル化チログ
ロブリン複合体の調製 ５５Ｗのメチル化チログロブリンを１０ｍ１の水に浴か
し、これに２．２〜／−の共有結合したエチジウムＤＮ
ＡΔ液１１．３ｔｄを加えると、直ちに沈澱が生ずるの
でこの懸濁液を５．０−の１．５　Ｍ　ＮａＣｔと２４
．６−の水でうすめる。

Ｄ、ウサギの免疫感作 ２．５　ｍｌの共有結合したエチジウム−ＤＮＡメチル
化チログロブリン複合体、２．５　ｒｎｌの０．１５Ｍ
生理的食塩水および５．０ｍｌの完全フロインドアジュ
バントから成る混合液２−を、ニューシーラントシロウ
サギの４箇所の皮下部位に注射する。３週間後、不完全
７０インドアジユバントを用いて同じように免疫感作を
施し、続いて４週間間隔で、さらに免役感作を行う。最
初の免疫感作後１４週間たってから、抗血清を調製する
ために血液を集める。

Ｅ、エチジウム−ＤＮＡに対する抗体の力価側共有結合
するエチジウム−ＤＮＡに対する抗血清は、酵素標識免
疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ　ｌａｂｅｌｉｍｍｕｎｏｓ
Ｏｒｂａｎｔ　ａｓｓａｙ　）によって力価が測定され
る。即ちポリスチレンの微量滴定装置（ｍｉｃｒｏｔｉ
ｔｅｒ）のプレートのウェル（ｗｅｌｌ）にポリヌクレ
オチドを吸着させ、次にウサギの抗体を結合させる。最
後にペルオキシダーゼで標識したヤギの抗ウサギＩｇＧ
で抗体を検出する。

１５ｍＭのりｘ　、７酸ソーダ（ｐＨ７，０、Ｏ，’１
５ＭＮａＣ１）に溶かして、１　ｍｌについて５μ２の
ポリヌクレオチドを含む溶液の５０μを分別量を、ｌ　
ｍｍｕｌｏｎ　ＩＩ微量滴定装置のプレート（Ｄｙｎａ
ｔｅｋ　。

Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ　）　のウェルにいれ、
室温で２時間ゆつ〈９振とうする０次にウェルを空にし
、１０ｍＭのリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７，４、０，１
５ＭＮａＣ４）、０．５％のウシ血清アルブミン、およ
び０．５％のＴｗｅｅｎ　２０　（ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔ
ｗｅｅｎ　）で洗　・浄する。

ウサギの抗血清を１０ｒｒ＋Ｒ４のリン酸ソーダ（ｐＨ
７，４、０，１５ＭのＮａＣ１）、０．５％のＢＳＡに
いれてうすめ、その５０μｔの分別量をウェルにいねで
３０分間放置する。ＰＢＳ／ＢＳＡ／’ｌ″ｗｅ　ｅ　
ｎで３回ウェルを洗浄する。ヤギー抗ウサギＩｇＧ（Ｃ
ａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏｃｈｒ
ａｎｖｉｌｌｅ、　ＰＡ）と共有結合したペルオキシダ
ーゼを、１０　ｍ　Ｍ（７）　ＩＪン酸ソーダ（ｐＨ７
，４、０，１５ＭＮａＣｔ）、０．５％ＢＳＡにいｈて
５００倍にうすめ、各ウェルに５０μｔの分別量を加え
る。この溶液をウェルにいれたま＼室温で３０分間放置
してから、ウェルをＰ　Ｂ　Ｓ／　Ｂ　Ｓ　Ａ／　Ｔｗ
ｅｅｎ　Ｔ　３回洗浄スル。

１００μＭの臭化エチジウムを非共有結合性のエチジウ
ム−ＤＮＡ複合体を含むウェルの稀釈さｈた抗血清、お
よびエチジウム対照試験のウェルにいれる。これらのウ
ェルを処理するための上記のすべての洗浄溶液と試薬は
、］ＯｎμＭのエチジウムを含んでいる。

ペルオキシダーゼの基質溶液は下記のもので調製する。

２０〜０−フェニレンジアミン １２ｍ／　０．１Ｍクエン酸ソーダ １３ｔｎ１．水 ２０μｍ　３０％過酸化水素 ウェル毎に７５μｔの基質溶液を加え、室温で１０分間
反応させる。２．５Ｍの硫酸５０μｔを加えて反応を押
さえ、次にＡｒｔｅｋのＭｏｄｅｌ　２１０　マイクロ
リットルプレート光度計（Ｄｙｎａｔｅｋ、　Ａｌｅｘ
−ａｎｄｒｉａ、　ＶＡ　）　で４８８　ｎｍにおける
吸光度を記録する。対照として正常なウサギ血清を用い
、ウサギの抗血清について述べたと同じようにして処理
する。

Ｆ、結果 Ａ表に結果が示しであるが、これより対照となるウサギ
血清中の抗体は、被餉（塗布）したまたは被覆（塗布）
しないウェルのどれともかなりの程度で結合しないこと
が分る。これは１本＠　ＤＮＡに対する抗体の力価が小
さいものと思わｈる。

共有結合性のエチジウム−ＤＮＡに対する抗血清は、共
有結合性のエチジウム−ＤＮＡに対して極めて高い力価
を有する。これらの抗体の一部は、恐らくリボースリン
酸塩の鎖と共有結合しているエチジウム残基と結合して
いるのであろう。この結論は、非共有結合性エチジウム
−ＤＮＡ複合体に対する力価がすっと小さい（Ａ表診照
）という観察結果に基いている。

これらの結果は、抗体が生米の１本鎖または２本鎖の核
酸と甚しくは交差反応しないエチジウム−ＤＮＡ挿入挿
入体合体で増大され得ることを証明している。

本発明は上記のように詳細に記述例示したが、本発明の
精神と範囲から逸脱せずに、発明の色々の他の変形や変
更ができることは明らかである。

【図面の簡単な説明】

前に述べたように、第１図は挿入物と２本鎖核酸との間
の好ましい相互作用（その結果抗体で検出できる挿入複
合体が生ずる。）の概要図である。 第２〜第５図は本発明で用いられる四つの好適なハイブ
リダイゼーション形式の概要図である。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３ ト／＼７（Ｐ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１本鎖の核酸を含む試験媒体中の特定のポリヌクレ
   オチド塩基配列を検出する方法であって、次に示す手順
   、すなわち、 （ａｌ　試験媒体を、（１）検出すべき塩基配列と、プ
   ローグ中の相補的配列間のハイグリダイゼーショ／に対
   して、実質的に相補的な１本鎖の塩基配列を少くとも一
   つ含んでいる核酸プローグおよび（ＩＩ）挿入複合体の
   形で２本鎖核酸と結合し得る核酸挿入剤と混合し、（ｂ
   ）　手順（ａｌから生ずるハイブリダイゼーション生成
   物中の挿入複合体と結合し得る抗体またはその断片を加
   えることによって交雑したプローグを検出し、この複合
   体に結合するようになった抗体またはその断片を測定す
   る１、ことを特徴とする検出方法。 ２　挿入物を別個の遊離の化合物として試験媒体と混合
   し、非共有結合的に２本鎖核酸と結合式せて挿入複合体
   を形成せしめる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　挿入物がプローグの１本鎖相補領域においてプロ
   ーグと化学的に結合し、それによシ、ハイブリダイゼー
   ションが起った場合に前記挿入複合体がこの領域中に生
   ずる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４　抗体ま友はその断片が、検出可能な化学基で標識さ
   れている特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５　検出可能な化学基が、酢素的に活性な基、ケイ光発
   光物質、発色団、ルミネセンス発光物質、特異的に結合
   し得る配位子（リガンド）、または放射性同位体である
   特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、　プローグおよび試験媒体からの１本鎖核酸のうち
   の一つが固体担体上に固定化され、該固体担体と合体し
   た抗体が測定される固相ハイブリダイゼーション技法に
   よる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７　各々、検出すべき配列の互いに排除する部分に対し
   て実質的に相補的な１本鎖の塩基配列を少くとも一つ含
   んでいる第一および第二の核酸プローグと試験媒体とを
   混合し、これらのプローブの一方が固体担体に同定化さ
   れるか、または結合物質に対する結合部位を含み、その
   彼、固定化された形のかかる結合物質の存在によって固
   定化される固相サンドイッチハイブリダイゼーション法
   による特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８　プローグが結合物質に灯する結合部位を含み、ハイ
   ブリダイゼーション工程後に、固定化された形のかかる
   結合物質が加えられる、溶液相ハイブリダイゼーション
   法による特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、プローグがビオチンまたは−・ブテン部分を會み、
   結合物質が、それぞれ、アビノンまたは抗ハブテン抗体
   である特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０　試料が、手順（ａ）　において別個の遊離の化合
   物として挿入剤を加えたときに前記挿入複合体を生成す
   る２本鎖部分をさらに含んでいる特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １１、挿入剤が、アクリジン色素類、フェナンスリジン
   類、フェナジン類、７０クマリン類、フェノチアジン類
   およびキノリン類から選択される特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １２１本鎖の核酸を會んでいる液状試験媒体中の特定の
   ポリヌクレオチド塩基配列を検出するための固相ハイブ
   リダイゼーション法であって、次に示す手順、すなわち
   、 （ａ）検出すべき配列に対して実質的に相補的な１本鎖
   塩基対を少くとも一つ含んでいる核酸プローグと、液状
   の試験媒体とを接触式せ、その際、該プローブおよび試
   験媒体からの１本鎖核酸のうちの一方を固体担体上に固
   定化させておき、この接触を、検出すべき配列と相補的
   なプローグの配列間のハイブリダイゼーションに対して
   好適な条件下で行うことによシ反応混合物を自製し、（
   ｂ）　生成した固定化二重体（デュプレックス）を担持
   している固体担体を、核酸挿入剤、および挿入剤と複合
   体を形成している２本鎖核酸からなる挿入複合体と結合
   し得る抗体またはその断片とを接触させ、 （ｃｌ　生成した固定化抗体またはその断片を担持する
   固体担体を残余の反応混合物から分離し、 （ｄ）液状試験媒体中の検出すべき塩基配列の存在を指
   示するものとして、分離した抗体またはその断片を測定
   する、手順からなることを特徴とする検出方法。 １３、手順（ｂ）の前に、手順（ａ）から生成する固定
   化二重体を担持する同体担体を、残余の反応混合物から
   分離する特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４　抗体またはその断片が、検出可能な化学基で標識
   され、また、手順（ｄｉにおいて、検出すべき塩基配列
   の存在を指示するものとして、固体担体上のこのような
   検出可能な基を測定する特許請求の範囲第１２項記載の
   方法。 １５、プローグが、さらに、手順（ｂ）で挿入剤が加え
   られたときに、抗体またはその断片と結合し得る、前記
   挿入複合体を作る２本鎖領域を少くとも一つ含んでいる
   特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １６、液状試験媒体が、その中に存在する核酸を遊離し
   変性させる条件にさらされた生物学的サンプルからなる
   特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １７．１本鎖の核酸を含んでいる液状試験媒体中の特定
   のポリヌクレオチド塩基配列を検出するための固相ノ・
   イブリダイゼーション法であって、 次の手順、す々わち、 （８Ｌ）液状試験媒体を核酸プローブと接触させて反応
   混合物を形成せしめるが、この際、該プローブは、検出
   すべき配列に対して実質的に相補的である１本鎖の塩基
   配列を少くとも一つ廿んでおシ、また、該プローグは、
   その１本鎖相補性領域において核酸挿入剤と化学的に結
   合していて、この結合した挿入剤を有するそのような領
   域に二重体が生成すると、挿入複合体が生じるようにな
   っておシ、該プローグおよび試験媒体中の１本鎖の核酸
   の中の一方が固体担体上に固定化されており、かかる接
   触が検出すべき配列とプローグの相補的配列間のノ・イ
   グリダイゼーションに対して好適な条件下で行われ、 （ｂ）　挿入剤と複合している２本鎖核酸からなる挿入
   複合体と結合し得る抗体、またはそ゛　の断片を、反応
   混合物に加え、 （Ｑ）　挿入剤と結合したプローグおよび検出すべき塩
   基配列間に生じた挿入複合体に結合している生成した固
   定化抗体、またはその断片を担持する固体担体を、残余
   の反応混合物から分離し、 （山　液状試験媒体中の検出すべき塩基配列の存在を指
   示するものとして、固体担体上の分離された抗体または
   その断片を測定する、手順からなることを特徴とする方
   法。 １８、抗体またはその断片が、検出可能な化学基で標識
   されており、また、手順（ｄ）において、検出すべき配
   列の存在を指示するものとして、固体担体上のそのよう
   な検出可能な基を測定する特許請求の範囲第１７項記載
   の方法。 １９、液状試験媒体か、その中に存在する核酸を遊離し
   変性させる条件にさらされた生物学的Ｖ／プルからなる
   特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０．１本鎖の核酸を官む液状試験媒体中の特定のポリ
   ヌクレオチド塩基配列を検出するための溶液相ノ・イブ
   リダイゼーション法であって、次の手順、すなわち、 （ａ）　検出すべき配列に対して実質的に相補的な１本
   鎖塩基対を少くとも一つ含んでいる核酸プローグと、液
   体の試験媒体とを接触させることにより反応混合物を形
   成せしめるが、この際、該プローグが結合物質に対する
   結合部位を會んでおジ、かかる接触力玉検出すべき配列
   とプローグの相補的配列間のハイグリダイゼーショ／に
   対して好適な条件下で行われ、 （ｂ）反応混合物に対して、（１）核酸挿入剤、（Ｉｎ
   挿入剤と複合している２本鎖核酸からなる挿入複合体と
   結合し得る抗体またはその断片及びＩｎ）該プローグに
   対する画定化した形の結合物質を、同時にｔｆｃは別々
   の段階で加え、 （ｃｌ　固定化した挿入複合体と結合している抗体また
   はその断片からなる生成した固定化相を、残余の反応混
   合物から分離し、 （ｄ）　液状試験媒体中の検出すべき配列の存在を指示
   するものとして、分離された固定化抗体ま７１ｃ線その
   断片を測定する、 手順からなることを特徴とする方法。 ２１、抗体まｆｃ探その断片が検出可能な化学基で標識
   され、また、手順（ｄ）において、検出すべき配列の存
   在を指示するものとして、固定化した相の中のそのよう
   な検出可能な基が測定される特許請求の範囲第２０項記
   載の方法。 ２２、プローグがピオチンまたはハブテン部分を含み、
   固定化された結合物質が、それぞれ、アビジンまたは抗
   ハプテン抗体である特許請求の範囲第２０項記載の方法
   。 ２３、液状試験媒体が、その中に存在する核酸を遊離し
   変性させる条件にさらされた生物学的サンプルからなる
   特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２４　試験媒体中の特定のポリヌクレオチド塩基配列を
   検出するための試薬システムであって、（１）検出すべ
   き配列に対して実質的に相補的な１本鎖の塩基配列を少
   くとも一つ含んでいる核酸プローブ （２）核酸挿入剤 および （３）挿入剤と複合している２本鎖の核酸からなる挿入
   複合体と結合し得る抗体、またはその断片 からなることを特徴とする試験システム。 ２５、抗体またはその断片が、検出可能な化学基で標識
   されている特許請求の範囲第２４項記載の試薬システム
   。 ２６、検出可能な化学基が、酵素的に活性な基、クイ光
   発光物質、発色団、ルミネセンス発光物質、特異的に結
   合し得る配位子（リガンド）、または放射性同位体であ
   る特許請求の範囲第２５項記載の試薬システム。 ２７、検出可能な化学基が、酵素である特許請求の範囲
   第２５項記載の試薬システム。 ２８　試験媒体中の１本鎖核酸を固定化する固体担体を
   さらに宮んでいる特許請求の範囲第２４項記載の試楽シ
   ステム。 ２９、プローブが固体担体上に固定化されている特許請
   求の範囲第２４項記載の試薬システム。 ３０　プローグが結合物質に対する結合部位を含み、ま
   た試薬システムがさらに、固定化された形のそのような
   結合物質を富んでいる特許請求の範囲第２４項記載の試
   薬システム。 ３１、プローグがビオチンまたはハプテン部分を含み、
   また固定化された結合物質が、それぞれ、アビジ／また
   は抗ハブテン抗体である特許請求の範囲第３０項記載の
   試薬システム。 ３２　挿入剤が、実質的に核酸と複合していない、別個
   の遊離の化合物である時許卵求の範囲第２４項記載の試
   薬システム。 ３３、試料がさらに、少くとも一つの２本鎖領域を含ん
   でいる特許請求の範囲第３２項記載の試薬システム。 ３４　挿入剤が試料の１本鎖領域と化学的に一合してい
   て、そのような領域に二重体が生成する結果、挿入複合
   体を生じるようになっている特許請求の範囲第２４項記
   載の試薬システム０ ３５、もう一つ（第二）の核酸プロー／を含み、第一お
   よび第二のプローグが、それぞれ、検出すべき配列の互
   いに排除する部分に対して実質的に相補的な１本鎖の塩
   基配列を、少くとも一つ含んでいる、サンドイッチハイ
   ブリダイゼーション方式用の特許請求の範囲第２４項記
   載の試薬システム。 ３６、グローブの一方が検出可能な化学基で標識され、
   他方が固定化されている特許請求の範囲第３５項記載の
   試楽システム。 ３７、プローブの一方が検出可能な化学基で標識され、
   他方が結合物質に対する結合部位を含んでおり、ま庭、
   試薬システムが、さらに、固定化された形のそのような
   結合物質を含んでいる特許請求の範囲第３５項記載の試
   薬システム。 ３８、挿入剤が、アクリジン色素類、フェナンスリジン
   類、フェナジン類、フロクマリン類、フエノチアノン類
   およびキノリン類から選択される特許請求の範囲第２４
   項記載の試薬システム。 ３９、試験サンプル中の２本鎖核酸を１本鎖の形状に変
   換することができる変性剤をさらに含んでいる特許請求
   の範囲第２４項記載の試薬システム。 ４０　液状媒体中の２本鎖核酸を検出する方法であって
   、 次の手順、すなわち、 （ａ）　該媒体に対し、（１）核酸挿入剤および（１１
   ）挿入剤と複合している２本鎖の核酸からなる挿入複合
   体と結合し得る抗体またはその断片を加え、 （ｂ）　前記複合体に対する前記の抗体、咬たはその断
   片の結合を検出する、 手順からなることを特徴とする方法。 ４１、抗体またはその断片が、検出７ｆＱ能な化学基で
   標識されている特許請求の範囲第４０項記載の方法。 ４２、検出可能な基が、酵素的に活性な基、クイ光発光
   物質、発色団、ルミネセンス発光物質、特異的に結合可
   能な配位子（リガンド）、または放射性同位体である特
   許請求の範囲第４１項記載の方法。 ４３、挿入剤が、アクリジン色素類、フェナンスリソ７
   類、フェナジン類、７０クマリン類、フエノテアレフ類
   およびキノリン類から選択される特許請求の範囲第４０
   項記載の方法。