JPH03247300A - ヒト白血球抗原の型判定法 - Google Patents

ヒト白血球抗原の型判定法

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JPH03247300A
JPH03247300A JP2043814A JP4381490A JPH03247300A JP H03247300 A JPH03247300 A JP H03247300A JP 2043814 A JP2043814 A JP 2043814A JP 4381490 A JP4381490 A JP 4381490A JP H03247300 A JPH03247300 A JP H03247300A
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Kyoichi Matsubara
亨一 松原
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は臓器等の移植や自己免疫疾患あるいは薬剤感受
性の診断等に重要であるヒトの組織適合性抗原であるＨ
　Ｌ　Ａ　（ｈｕｍａｎ　Ｉｃｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔ
ｉｇｃｎ：白血球抗原）の型判定法に関するものである
。
［従来の技術］ ＨＬＡの型判定法は、クラスＩ抗原であるＡ・Ｂ−Ｃに
ついては従来より血清学的方法により行なわれてきてお
り、抗血清の改良により、かなり詳細な型判定が可能と
なっている（Ｂ、　Ｄｕｐｏｕｎ　ｅｔ。
ａｌ、、　Ｔｅｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
ＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＷｏｒｋｓｈｏ
ｐ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　２　（１９８７））　ｏ　
これに対し、溶液中は抗原間の差異が小さいため、血清
学的方法では十分な型判定は不可能であった。
近年、遺伝子増幅法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉ
ｎ　ｒｅａｃ−ｔｉｏｎ；以下−ＰＣＲ法”と略す。）
の発明（Ｒ，Ｋ。
５ａｉｋｉ　ｅｔ、　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３
９．４８７−４９１　（１９８８））により、特定のＧ
　ｅｎｏｍｉｃ　　Ｄ　Ｎ　Ａの増幅が可能となった。
これによりクラス■遺伝子の超可変域を含む領域を増幅
し、増幅した遺伝子を３２Ｐラベルプローブによるドツ
トプロットや制限酵素での特異的切断により評価する方
法等、遺伝子レベルでの型判定が試みられている（蛋白
質・核酸・酵素。
３４、１９８９−２００２．　　（１９８９）　　；Ｈ
ｕｍａｎ　１ｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ。
２１、２３９−２４８．　（１９８９）参照）。
［発明が解決しようとする課題］ 溶液中の型判定は、血清学的には不可能であることから
、遺伝子レベルで行なう必要性がある。
ＰＣＲ法の開発により特定の遺伝子のみを簡便に増幅で
きることから、この分野の研究は多く試みられてきたが
、前述したドツトプロット法は一塩基の差異を見分ける
分解能がなく、 又制限酵素により見分ける方法は酵素の認識部位に条里
性がなければならない。さらに現行法ではＧ　ｅｎｏｍ
ｉｃ　　Ｄ　Ｎ　Ａを直接増幅するため、偽遺伝子の存
在するＤＲ抗原においては正確な型判定が不可能である
など、どの検出系においても多くの問題点があるのが現
状であった。
［課題を解決するための手段］ 本発明者は、これらの問題点を解決して、−塩基の差異
も識別できるＨＬＡ抗原の型判定法を開発すべく鋭意研
究を重ねた結果、試料から抽出したｍＲＮＡを材料とし
、アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブを用い
ることによって、従来の方法に比較して飛躍的に正確性
と簡便性を高め、さらに検出時間を大幅に短縮すること
ができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完
成した。
本発明の一方法は一般式（Ｉ）に示すリンカ−アームを
介して、一般式（ＩＩ）に示すアクリジニウムエステル
が標識されている標識プローブを用いるＨＬＡの型判定
法である。すなわち、［一般式（■）： １ （（Ｒ）　　−Ｃ−Ｃ）　　−Ｘ　　−Ｒ１−Ｙ　　（
Ｉ）２ｍ　　　　　　ｎ　　　１ （式中、ＸｌはＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式ＩＩ （Ｒ）　　　−Ｃ−Ｃ−はＸｌの保護基を示す。但ｍ し、ｍはＲ２がとり得る１〜３の整数を示し、Ｒは、（
Ｒ）　　−Ｃ−がＸｌを保護するよう２　　　　　　　
２ｍ な電子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原
子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいは
これらの組合せである。又、ｎは１又は２を示すが、Ｘ
ｌがＳ原子である時はｎは１を示し、Ｘｌがアミノ基で
ある時はｎは１又は２を示す。Ｘ２はハロゲン原子又は
置換基を有するアミノ基を、Ｘ３はハロゲン原子、アミ
ノ基又は−〇−を、Ｒ３はそれぞれ置換されていてもよ
い低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリルオキシ
基を、Ｒ４は低級アルキル基、低級アルコキシ基を示す
か、Ｘ３が一〇−の時は水素原子を示す。）で表される
リンカ−アームを介して般式（■）：５ Ｃ＝Ｏ（ＩＩ） （式中、Ｒ５はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルケニル基、又はアリル基を、Ｒ，、Ｒ
７は同−又は異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、
チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、置換されていて
もよいアセチル基、置換されていてもよい低級アルキル
基、置換されていてもよい低級アルケニル基、置換され
ていてもよいアリル基、低級アルコキシ基又はアリルオ
キシ基を、Ｒ８は ０　　　　０ を示す。ｐは０〜１０の整数を示す。）が標識されてい
る構造を有する標識プローブを、試料中のｍＲＮＡから
作成したｃＤＮＡにハイブリダイズさせ、次いでハイブ
リダイズしていないプローブ定法。」である。
本発明の他の一方法は次の通りである。
「一般式（Ｉ）で表されるリンカ−アームを結合させた
プローブに、一般式（ＩＩ）で表されるアクリジニウム
エステルを標識させた標識プローブと、試料中のｍ　Ｒ
Ｎ　Ａから作成したｃＤＮＡをハイブリダイズさせ、次
いでハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリダ
イズしているが、その交雑において一塩基以上のミスマ
ツチを有するプローブを選択的に分解させることを特徴
とするＨＬＡの型判定法。」である。
本発明の更に別の方法は次の通りである。
「以下の工程からなることを特徴とするＨＬＡＯ型判定
法。
（ａ）　　試料からｍＲＮＡを抽出する工程；（ｂ）　
　抽出したｍＲＮＡを逆転写させて、ｃＤＮＡを作成す
る工程； （ｃ）　　該ｃＤＮＡを増幅させる工程；（ｄ）　　ア
クリジニウムエステルでラベルされたプローブを、増幅
されたｃＤＮＡとハイブリダイズ条件下で、ハイブリダ
イズさせる工程；（ｅ）　　ハイブリダイズしていない
プローブ及びハ分解させる工程； （ｆ）　　残存している化学発光量を測定することによ
り試料中のＨＬＡの型を判別する工程。」以下、本発明
によるＨＬＡの型判定法について詳細に説明する。
本発明において、型判定のターゲットとなるＨＬＡは、
ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣのクラスＩ抗原及びＨＬＡ−ＤＲ
，ＤＱ及びＤＰの溶液中のいずれのタイプでも用いるこ
とができ、下記表１に示す、第１０回国際ワークショッ
プ（１９８７年）で公認されたどの特異性に対しても適
用することができる。このうち、偽遺伝子が存在し、そ
の型判定が特に困難なＨＬＡ−ＤＲ抗原（ＤＲＢＩ）に
ついて、第１図〜第３図に示す如く、その特異性と遺伝
子の塩基配列を示した。
ｍＲＮＡの抽出は、例えば（１）Ｎ　Ｐ　−４０などの
界面活性剤で細胞を破壊した後、フェノール等で抽出す
る方法（Ｓ、　Ｌ、　Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ　１５２．２２７−２３
４．　（１９８７））、（２）グアニジンチオシアネー
トを用いる方法（Ｐ、　Ｃｈｏｍｃｙｎｓｋｉ　ａｎｄ
Ｎ、　５ａｃｃｈｉ、　Ａｎａ＋ｙｔｉｃａ　Ｂ１０ｅ
ｈＯＩＯｉＳｔＯｒＶ、　１６２゜１５６−１５９．　
（１９８７））、　（３）超遠心を用いる方法（Ｆ、　
Ｍ、　Ａｕ５ｂｅｌ　ａｔ、　ａｌ、、　Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　１）等、一般的な方法で行える。
またｍＲＮＡはその後増幅されるので、抽出効率は問題
とされない。
抽出したｍ　ＲＮ　Ａを逆転写させ、ｃＤＮＡを作成す
る工程は、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素やＭ−ＭＬＶ逆転
写酵素等の逆転写酵素により行うことができる。
ｃＤＮＡを増幅させる方法としては、ｍ　ＲＮ　Ａをオ
リゴｄＴもしくはランダムプライマーをプライマーとし
、逆転写酵素により、−水路のＤＮＡ（ｓｓｃＤ　Ｎ　
Ａ　）とした後、この５ｓｃＤ　Ｎ　Ａを特異的に増幅
するＰＣＲ法や、Ｔ７ポリメラーゼと逆転写酵素を用い
る方法等があげられる。このＴ７ポリメラーゼと逆転写
酵素を用いる方法とは、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性さ
せ、プライマー（増幅させるＤＮＡ領域を挟んで、十鎖
、−鎖に相補的な配列とＴ７プロモーター領域に相補的
な配列を合わせ持つオリゴヌクレオチド）を結合させリ
ボヌクレオチド３リン酸、デオキシリボヌクレオチド３
リン酸、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ及び酵素に必要
な塩を含む緩衝液を加える。次いで、３７℃で数分間イ
ンキュベートし、高温（約９５℃）で変性した後、室温
に戻し、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーセ及びＲＮａｓｅ
Ｈを含む緩衝液を加え、さらに３７℃で数時間インキュ
ベートする方法である。
一方、検出用のプローブは核酸合成機（アプライド　パ
イオンステム社製、モデル３８０Ｂ）により合成できる
。プローブは超可変部が中心になるようにデザインし、
その中心にアミノ基をもったリンカ−を挿入する。合成
したオリゴヌクレオチドは、定法により精製を行い、ジ
メチルスルホキシド及びへペス等の緩衝液を含む反応液
中で、有機溶媒に溶解した活性エステルを持つＡＥと混
合する。その結果活性エステルが、リンカ−のアミノ基
と反応し、オリゴヌクレオチドのＡＥラベルが行える。
実際の検出では、増幅させたターゲットを高温またはア
ルカリ処理で一本鎖にした後、プローブと混合し、定法
によりハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼ
ーションは酸性緩衝液中で行い、反応時間を短縮するた
めには、リチウム塩を含む酸性緩衝液中で行い、温度は
５０〜７０℃、時間は１〜数十分の間で行う。ハイブリ
ダイゼーション後は、界面活性剤を含む弱アルカリ液を
加え、ターゲットとプローブの塩基配列が完全に一致す
る場合は、アクリジニウムエステルは加水分解されない
が、不一致があると加水分解を受け、化学発光量が減衰
する。
又、本発明で用いられる一般式（Ｉ）で示されるリンカ
−アームは、例えば欧州特許公開ＥＰ０３１０３１２号
に開示されており、一般式（ＩＩ）で示されるＡＥは例
えば国際特許出願公開ＷＯ３９１０２４７Ｂに開示され
ている。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するがこれ
らの記載は本発明を限定するものではない。この実施例
においては、本発明方法の顕著な効果を裏付けるために
、特に−塩基だけ違うＤＲ抗原遺伝子を選んでＨＬＡの
型判定を行なった。
［実　施　例コ ａ）プローブの作成 表１に示すように、血清学的ＤＲ４と判定されるＤＲ抗
原は、遺伝子レベルでさらにＤｗ４ＤｗｌＯＤｙＩ３　
ＤｙＩ３　ＤｙＩ３　ＤＫＴ２？ニスブリットすること
が知られている。われわれは、この中のＤｗ４　　Ｄｗ
ｌＯＤｙＩ３を用いて検定を行った。Ｄｗ４とＤ　ｗ１
４の塩基配列の違いは、−塩基だけであり、この差異を
簡便に判定できれば、すべての型判定に応用可能である
。
プローブは、下記に示すように、塩基の変異のある近傍
に一般式（Ｉ）で示されるリンカ−アームとしてアミノ
リンカ−（Ａｖ＋ｉｎｏ　ＭｏｄｉｆｉｅｒＩＩ　。
ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ
、社製）を挿入するようにデザインした核酸合成機（ア
プライド　バイオシステムズ社、モデル３８０Ｂ）で合
成した。
Ｐｉ　　３ＧＡＣＣＴＣＧＴＣＴ＊ＴＣＧＣＣＣＧＧ　
ＣＧ　５Ｐ２　　”　ＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＧ　＊ＣＴＣ
ＧＣＣＣＧＧ　ＣＯ５Ｐ３　３ＧＡＣＣＴＣＧＴＣＴＣ
Ｉ：ＣＧＣＣＣＧＧ　ＣＧ　５＊ニアミノリンカ− 合成後、１５％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、目的
のバンドで切り出し、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、ＩＩ
ＩＭ　　ＥＤＴＡで一晩抽出した。抽出後、５ｅｐ−ｐ
ａｋ　Ｃ１８カラムで精製した。精製したオリゴヌクレ
オチドは、エッペンドルフチューブに約０．５０Ｄずつ
分注し、真空乾燥後、水４μｍ２．ＩＭＨＥＰＥＳ　（
ｐＨ８）１μｆｆ、ＤＭＳ０３μｇおよびＡ　Ｅ　２７
ｍｍｏＲ（０，ｈｇ／　５０μＮＤ　Ｍ　Ｓ　Ｏ）を加
え、３７℃で２０分、遮光して反応させた。再度、水１
．５μｇ。
ＩＭ　　ＨＥＰＥＳ　０．５μｇおよびＡＥ　　３μｇ
加え、上記同様に３７℃で２０分反応させた。続いて未
反応のＡＥをブロックするため、１２５μＭ　　Ｌｙｓ
ｉｎｅ。
０．１Ｍ　　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓおよび５０％ＤＭＳＯを
含む混合液を加え、室温で５分放置した。これをエタノ
ール沈殿させてフリーのＡＥを除去した。
エタノール沈殿したプローブに水１００μＱ加え、その
全量をＴＳＫ　ｇｅｌ　ｏｌｉｇｏ　　ＤＮＡ　　ＲＰ
カラム（東ソー社製、　４．６ｍｍ　Ｉ　Ｄ　Ｘ　１５
ｃｍ　Ｌ　）に注入した。第４図にＨＰＬＣクロマトダ
ラムを示した。
また、０．５分間隔で溶出液を分取し、各フラクション
の化学発光ｆｆ１（ＲＬＵ）を測定し、オリゴヌクレオ
チドがＡＥラベルが正確に行われているか確認した。
なお、このときのＨＰＬＣ条件は次の通りであった。
溶離液Ａ：５０ｄ　　ＴＥＡＡ　（酢酸トリエチルアン
モニウム） Ｂ　：　ＣＨ３ＣＮ ＣＨ３ＣＮの濃度勾配０→４０％、４０分流　　速　１
ｍｌ／ｍｉｎ 検出器ＵＶ　２６０μｍ ｂ）プライマーの作成 プライマーは、プローブで検出する超可変域が増幅され
るように定め、核酸合成機（アプライドバイオシステム
ズ社、モデル３８０Ｂ）で作成し、プローブと同様に精
製した。
２）ターゲットの作成及び抽出 ａ）合成オリゴヌクレオチドの作成 ターゲットの合成オリゴヌクレオチドは、それぞれＰｌ
、Ｐ２．Ｐ３と相補的になるように塩基配列を決め、核
酸合成機で合成した。合成したオリゴヌクレオチドは、
プローブと同様の方法で精製した。
ｂ）サンプルからのＲＮＡの抽出 ■　ＨＴ　Ｃ（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｔｙｐｉｎｇ　
ｅｅｌ　ｌ　：　Ｄ　Ｒ遺伝子をホモに持つ培養細胞）
からＲＮＡの抽出 細胞は、Ｄｗ４ｇｅｎｅをホモに持ツＢ　Ｍ　１４゜Ｄ
ν１０をホモに持つＦＳ、Ｄν１４をホモに持つＴＨＯ
を用いた。ＨＴＣは、１０％ウシ血清添加ＲＰＭ１１６
４０培地で培養した。５Ｘ１０６〜１０７の細胞をＰＢ
Ｓで３回洗浄した。４．５ｍｌのｈｙｐｏｔｏｎｉｅｂ
ｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　　　Ｔｒｌｓ　　−ＨＣｌ１　
　　ｐＨ７，５，ｌＯｍＭＮａＣＲ、１，５ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ　２　）にＨＴＣをサスペンドしバナジルコンプ
レックス（２００＋ａＭ）を２５０μＱ加える。１５０
μＱの１０％ＮＰ−４０を加え撹拌し、５分間４℃に静
置した。１０％ＳＤＳを１００μｇ。
０．５Ｍ　　ＥＤＴＡを４０ｔｔＱ加えた。約５ｍｌの
フェノールを加え、５分間撹拌した後遠心（３０００ｒ
ｐｍ５　ｗｉｎ）　した。さらに３回フェノール抽出を
繰り返した。上清を新しいチューブに移し、５ＭのＮａ
Ｃ，９を１００μｇおよび冷エタノールを加え、−９０
℃で一夜もしくは、ドライアイスボックスで３０分放置
した。遠心後（３０００ｒｐｍ　２０分）上清を捨てエ
タノールでリンスし真空下で乾燥した。これを６００μ
ｇの水に溶解し等ｍの４ＭＬｉＣｆＩを加え、４℃で一
夜放置した。遠心（１５０００ｒｐｍ　２０分）後、４
ＭＬｉＣ，Ｑで一回、エタノールで一回リンスし乾燥し
た。１００μＱの水に溶解し吸光度よりＲＮＡ量の算出
を行なった。
■　新鮮血リンパ球からのＲＮＡの抽出的４ｍｌの血液
（ヘパリン加）に等量の等張緩衝液を加え、ピペットで
よく撹拌した。６ｍｌのフィコール・パーク（ファルマ
シア社製、比重液）を１５ｍ１の遠心管に取り、血液を
ゆっくり重層した。
室温で遠心（４００ｇ　　４０〜５０分）した。中間層
のリンパ球を注意深くとり、約６ｍｌの等張緩衝液を加
え静かに撹拌し６０〜１００　ｇで１０分遠心した。上
清を捨てた後、ＨＴＣと同様の方法でＲＮＡの抽出を行
なった。
３）ｍＲＮＡの逆転写（ｓｓｃＤ　Ｎ　Ａの作成）と特
異的増幅 ＲＮＡを１μｇとり、　０．５Ｌ１ｇのｏｌｉｇｏ（ｄ
Ｔ）を加え、水を加えて２０μｇとした。６５℃で５分
放置後、室温に戻し１０ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘと５倍濃
度の逆転写酵素バッファーを加え、さらに１μａの２４
ｕｎｉ　ｔのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ベゼスダ・リサー
チ社製）を加え、３７℃で６０分反応させる。６５℃で
１０分間放置した後、１８０μＱのＴＥバッファーを加
え一９０℃で保存する。
５ｓｃＤ　Ｎ　ＡをＬＯｕＱに、１０倍ＰＣＲバッファ
ーを５μ（！、１０＋ａＭ　　ｄＮＴＰを１μｉ２．１
０ｐｍｏｊ２　／μｇのプライマーを５μＱずつ、水を
２４μ９、タックポリメラーゼ（宝酒造社製、商品名Ａ
畦１ｉ　Ｔａｑ）を０．５μｇ加えた。９２℃で５分変
性した後、６５℃３分９２℃２分で４５サイクル行ない
、最後に６５℃で７分放置した０これを２ｕＱ取りＨＰ
　Ａ　（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｃ−ｔｉ
ｏｎ　ａｓｓａｙ）を行なった。
４）プローブとターゲットのハイブリダイゼーション エッペンドルフチューブに２×ハイブリツドバツフアー
（注１）（２Ｘ　ｔｌｙｂｒｉｄ　Ｂｕｆｆｅｒ）１５
μ１２．２×輸送溶液（注２）（２ｘ　Ｔｒａｎｓｐｏ
ｒｔ　Ｍｅｄｉａ）　５μｇ１プローブ（１０６〜１０
７ＲＬＵ）３μｇ及びターゲットを加え、６０°Ｃで６
０分インキュベートした。
ハイブリダイゼーション後、モック・ハイブリッド・ミ
ックス（注３）（Ｍｏｃｋ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｍｉｘ）を
２７０μｇ加え、ハイブリッド溶液とした。なお、ネガ
ティブ・コントロールとして水を用いた。
（注１） ２ＸＨｙｂｒｉｄ　Ｂｕｆｆｅｒ：０．２Ｍ　Ｉｆｔｈ
ｉｕＩＩｌｓｕｃｃｊｎａｔｅ。
ｐＨ５，２１８％ｌｉｔｈｉｕｍ　Ｉａｕｒｙｌｓｕｌ
ｆａｔｅ　２ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ（注２） ２ＸＴｒａｎｓｐｏｒｔ　Ｍｅｄｉａ：６％ｌｉｔｈｉ
ｕｍ　Ｉａｕｒｙｌｓｕｌｆａｔｅ　６０ｍＭ　ｓｏｄ
ｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、　ｐＨ６，
８２ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ （注３）　Ｍｏｃｋ　ｌ１ｙｂｒｉｄ　Ｍｉｘ　　（２
０ｍｌ中）：２ＸＨｙｂｒｊｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　　　　
　　　　　１０．Ｏｍ１２ＸＴｒａｎｓｐｏｒｔ　Ｍｅ
ｄｉａ　　　　　　　　　３．３３ｍ１Ｏ，０１Ｍ　Ｎ
ａ０Ａｃ　（ｐＨ５）、　０．１％ＳＤＳ　　　　２．
Ｏｍｌ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４．６７ｍ１５）ＨＰＡ実験 ハイブリッド溶液に０．２Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ
７，６）、　　５％トリトンＸ−１００（和光紬薬社製
。
界面活性剤）からなる液（以下「Ａ液」と称する）で処
理することにより、化学的なセクションを加え、ＲＬＵ
の減衰を比較し、マツチとミスマツチを判定した。なお
、ミスマツチとはハイブリッドさせたときに１塩基以上
に差異があることを意味する。あらかじめ、チューブに
Ａ液を１００μＱずついれておき、１５μＱのハイブリ
ッド溶液を加え、６０℃で１０分インキュベートした後
、３０秒冷却し、室温で１分放置後化学発光量を測定し
た。なお、冷却したＡ液１００μＱに１５μＱの／％イ
ブリ・ンド溶液を加え、直ちに測定した化学発光量を０
分の値（１００％に相当）として残存率を計算した。
〈結果および考察〉 １）ターゲットを合成オリゴヌクレオチドとした場合の
ＨＰＡ ターゲットを合成オリゴヌクレオチドとしたＨＰＡの結
果を第５．６．７図に示した。
第５図は、ＨＬＡ　　Ｄｖ４に特異的なアクリジニウム
エステル標識プローブ（プローブＰｉ）を使用した場合
における、ＨＰ　Ａ　（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｒｏ
ｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）法によるＨＬＡ　　ＤＲ
４の塩基のマツチ、ミスマツチの相違を示したグラフで
ある。ＴＩ（Ｄｗ４）はこのプローブ配列と完全にマツ
チするものである。Ｔ２　（ＤｗｌＯ）は４塩基ミスマ
ツチ、Ｔ３　（ＤｙＩ３）は１塩基ミスマツチをそれぞ
れ有している。第５図によれば、プローブをＰｌとしハ
イブリダイゼーションを１時間行なった場合、セレクシ
ョン１０分でのＲＬＵｓの残存率は、プローブと完全に
マツチするＴ１で７５％、１塩基異なるＴ３で４１％、
４塩基異なるＴ２で１０％であった。このことは、本発
明方法のＨＬＡの１塩基の違いを正確に識別できること
を示している。
ＨＬ　Ａ　　ＤｗｌＯ，ＤｙＩ３にそれぞれ特異的なア
クリジニウムエステル標識プローブ（プローブＰ２、プ
ローブＰ３）を使用した場合もほぼ同様の傾向が得られ
た。
第６図は、ＨＬＡ　　ＤｗｌＯに特異的なアクリジニウ
ムエステル標識プローブ（プローブＰ２）を使用した場
合における、ＨＰＡ法によるＨＬＡＤＲ４の塩基のマツ
チ、ミスマツチの相違を示したグラフである。Ｔ２　（
ＤｗｌＯ）はこのプローブ配列と完全にマツチするもの
であり、ＴＩ　（Ｄｗ４）は４塩基ミスマツチ、Ｔ３　
（ＤｙＩ３）は５塩基ミスマツチをそれぞれ有している
。第６図によれば、プローブをＰ２としてハイブリダイ
ゼーションを１時間行なった場合、セレクション１０分
でのＲＬＵｓの残存率は、プローブＰ２と完全にマツチ
するＴ２で７２％、４塩基異なるＴ１で０．５％、５塩
基異なるＴ３で２％であった。このことから、プローブ
Ｐ２を用いた場合も、本発明方法がＨＬＡクラスＨのＤ
Ｒ塩基の相違を的確に識別できることがわかる。
第７図は、ＨＬＡ　　ＤｙＩ３に特異的なアクリジニウ
ムエステル標識プローブ（プローブＰ３）を使用した場
合における、ＨＰＡ法によるＨＬＡＤＲ４の塩基のマツ
チ、ミスマツチの相違を示したグラフである。Ｔ３　（
ＤｙＩ３）はこのプローブ配列と完全にマツチするもの
であり、ＴＩ（Ｄｗ４）は１塩基ミスマツチ、Ｔ２　（
ＤｗｌＯ）は５塩基ミスマツチをそれぞれ有している。
第７図によれば、プローブをＰ３としてハイブリダイゼ
ーションを１時間行なった場合、セレクション１０分で
のＲＬＵｓの残存率は、ブロー・ブＰ３と完全にマツチ
するＴ３で６６％、１塩基異なるＴ１で３８％、５塩基
異なるＴ２で１２％であった。プローブＰ３を用いた場
合も、本発明方法がＨＬＡクラス■のＤＲ塩基の相違を
正確に識別できることがわかる。
このようにＤＲ４と同じ配列を持つ合成オリゴヌクレオ
チドをターゲットとした系で、本発明方法が１塩基の違
いを明瞭に判定できることが確かめられた。
２）　Ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡをターゲットとした場
合Ｇ　ｅｎｏｍｉｃ　　Ｄ　Ｎ　ＡのＤＲの超可変領域
を含む塩基配列をＰＣＲ法で増幅した後、ＨＰＡを行な
った結果を第８図に示した。ＨＰＡの条件はプローブを
それぞれ約１０７ＲＬＵ加え、ノ・イブリダイゼーショ
ンを１時間、セレクションを１０分とした。図中、ＴＩ
、Ｔ２及びＴ３は第５〜７図の場合と同じく合成ヌクレ
オチドを、８Ｍ１４．ＦＳ及びＴＨＯはそれぞれ細胞名
を表わす。結果から分かるように、プローブ２を用いた
Ｄ　ｗｌＯの型判定の結果は明瞭であるが、プローブ１
では４塩基異なるＦＳのＲＬＵが高い値を示し、またプ
ローブ３を用いた場合は、相補的な配列を持つＴＨＯの
識別が不可能であった。このように、ＧｅｎｏｉｉｃＤ
ＮＡを用いた系では、ターゲットの種類により型判定が
不可能であり、これは、偽遺伝子の影響であると考えら
れた。
３）ｍＲＮＡをターゲットにした場合 細胞から抽出したｍＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲで増幅し
た後ＨＰＡを行なった結果を第９図に示した。ＴＩ、Ｔ
２．Ｔ３，８Ｍ１４．ＦＳ及びＴＨＯは第８図の場合と
同じ意味を表わす。結果から分かるように、Ｇ　ｃｎｏ
ＩＱｉｃ　　Ｄ　Ｎ　Ａを用いた型判定では不明瞭であ
ったＤ　ｗｌｏおよび、不可能であったＤｙＩ３の型判
定が可能となった。ｍＲＮＡをサンプルとした場合、偽
遺伝子の悪影響を排除できると考えられ、これはＲＬＵ
の残存率が純系の結果と全くパラレルになることからも
示唆される。このように、ｍＲＮＡを逆転写させて、ｃ
ＤＮＡを作成し、これを増幅させたものをターゲットと
して使用することにより、ＤＲのサブタイプの型判定を
的確に行なうことができることが確かめられた。
［発明の効果コ 上述した本発明のＨＬＡ型判定法によれば、今まで血清
学的に不可能であった、ＤＲのサブタイプの型判定が可
能となっただけではなく、現在試みられている遺伝子に
よる型判定の問題点をすべて解決できた。この方法を用
いることで、遺伝子をホモに持つＨＴＣだけではなく、
遺伝子をヘテロに持つ末梢血リンパを用いた型判定も可
能である。また、この方法は、ＤＲだけではなくＤＱ、
ＤＰなどのクラス■遺伝子や、Ａ、Ｂ、Ｃなどのクラス
Ｉ遺伝子の判定にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アミノ酸番号５〜３１に対応するＤＲＢＩ遺
伝子の塩基配列図、第２図は、アミノ酸番号３２〜６２
に対応するＤＲＢＩ遺伝子の塩基配列図、第３図は、ア
ミノ酸番号６３〜９４に対応する塩基配列図である。 第４図は、アミノリンカ−を挿入したオリゴヌクレオチ
ドからなるプローブにアクリジニウムエステルを反応さ
せた後の反応液のＨＰＬＣクロマトグラム及び化学発光
量を示すグラフである。 第５図は、ＨＬＡ　　Ｄｗ４に特異的なアクリジニウム
エステル標識プローブを用いてターゲットを合成オリゴ
ヌクレオチドとした場合のＨＰＡ法によるＨＬＡ　　Ｄ
Ｒ４の塩基のマツチ、ミスマツチの相違を示したグラフ
である。 第６図は、ＨＬＡ　　ＤｗｌＯに特異的なアクリジニウ
ムエステル標識プローブを用いてターゲットを合成オリ
ゴヌクレオチドとした場合のＨＰＡ法によるＨＬＡ　　
ＤＲ４の塩基のマツチ、ミスマツチの相違を示したグラ
フである。 第７図は、ＨＬＡ　　ＤｙＩ３に特異的なアクリジニウ
ムエステル標識プローブを用いてターゲットを合成オリ
ゴヌクレオチドとした場合のＨＰＡ法によるＨＬＡ　　
ＤＲ４の塩基のマツチ、ミスマツチの相違を示したグラ
フである。 第８図は、Ｇ　ｅｎｏｎ＋ｉｃ　　Ｄ　Ｎ　ＡのＤＲ（
７）超可変領域を含む塩基配列をＰＣＲ法で増幅した後
、ＨＰＡ法を行なって得られた各ターゲットの化学発光
量の残存率の変化を示すグラフである。 第９図は、細胞から抽出したｍ　ＲＮ　Ａを逆転写し、
ＰＣＲ法で増幅した後、ＨＰＡ法を行なって得られた各
ターゲットの化学発光量の残存率の変化を示すグラフで
ある。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ＿１はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式▲数式
    、化学式、表等があります▼又は式▲数式、化学式、表
    等があります▼を示す。 Ｒ＿１は炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素鎖を、▲数式
    、化学式、表等があります▼はＸ＿１の保護基を示す。 但 し、ｍはＲ＿２がとり得る１〜３の整数を示し、Ｒ＿２
    は、（Ｒ＿２）＿ｍ−Ｃ−がＸ＿１を保護するような電
    子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原子、
    酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいはこれ
    らの組合せである。又ｎは１又は２を示すが、Ｘ＿１が
    Ｓ原子である時はｎは１を示し、Ｘ＿１がアミノ基であ
    る時はｎは１又は２を示す。Ｘ＿２はハロゲン原子又は
    置換基を有するアミノ基を、Ｘ＿３はハロゲン原子、ア
    ミノ基又は−Ｏ−を、Ｒ￥３はそれぞれ置換されていて
    もよい低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリルオ
    キシ基を、Ｒ＿４は低級アルキル基、低級アルコキシ基
    又はアリルオキシ基を示すか、Ｘ＿３が−Ｏ−の時は水
    素原子を示す。）で表 されるリンカーアームを介して一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿５はそれぞれ置換されていてもよい低級ア
    ルキル基、低級アルケニル基、又はアリル基を、Ｒ＿６
    、Ｒ＿７は同一又は異なって、水素原子、アミノ基、水
    酸基、チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル
    基、低級アルキル基、低級アルケニル基、アリル基、置
    換アセチル基、置換低級アルキル基、置換低級アルケニ
    ル基、置換アリル基、低級アルコキシ基又はアリルオキ
    シ基を、Ｒ＿８は 式▲数式、化学式、表等があります▼又は 式▲数式、化学式、表等があります▼ を示す。ｐは０〜１０の整数を示す。）で表されるアク
    リジニウムエステルが標識されている構造を有する標識
    プローブを、試料中のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡに
    ハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしていない
    プローブ及びハイブリダイズしているが、その交雑にお
    いて一塩基以上のミスマッチを有するプローブの標識部
    分を選択的に分解させた後、化学発光量を測定すること
    から成るＨＬＡ（ヒト白血球抗原）の型判定法。 ２、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ＿１はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式▲数式
    、化学式、表等があります▼又は式▲数式、化学式、表
    等があります▼を示す。 Ｒ＿１は炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素鎖を、▲数式
    、化学式、表等があります▼はＸ＿１の保護基を示す。 但 し、ｍはＲ＿２がとり得る１〜３の整数を示し、Ｒ＿２
    は、（Ｒ＿２）＿ｍ−Ｃ−がＸ＿１を保護するような電
    子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原子、
    酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいはこれ
    らの組合せである。又ｎは１又は２を示すが、Ｘ＿１が
    Ｓ原子である時はｎは１を示し、Ｘ＿１がアミノ基であ
    る時はｎは１又は２を示す。Ｘ＿２はハロゲン原子又は
    置換基を有するアミノ基を、Ｘ＿３はハロゲン原子、ア
    ミノ基又は−Ｏ−を、Ｒ＿３はそれぞれ置換されていて
    もよい低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリルオ
    キシ基を、Ｒ＿４は低級アルキル基、低級アルコキシ基
    又はアリルオキシ基を示すか、Ｘ＿３が−Ｏ−の時は水
    素原子を示す。）で表されるリンカーアームを結合させ
    たプローブに一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿５はそれぞれ置換されていてもよい低級ア
    ルキル基、低級アルケニル基、又はアリル基を、Ｒ＿６
    、Ｒ＿７は同一又は異なって、水素原子、アミノ基、水
    酸基、チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル
    基、低級アルキル基、低級アルケニル基、アリル基、置
    換アセチル基、置換低級アルキル基、置換低級アルケニ
    ル基、置換アリル基、低級アルコキシ基又はアリルオキ
    シ基を、Ｒ＿８は 式▲数式、化学式、表等があります▼又は 式▲数式、化学式、表等があります▼ を示す。ｐは０〜１０の整数を示す。）で表されるアク
    リジニウムエステルが標識された標識プローブと、試料
    中のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡをハイブリダイズさ
    せ、次いでハイブリダイズしていないプローブ及びハイ
    ブリダイズしているが、その交雑において一塩基以上の
    ミスマッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解
    させることを特徴とするＨＬＡ（ヒト白血球抗原）の型
    判定法。 ３、溶液中に均一に行われることを特徴とする請求項１
    又は２記載の型判定法。 ４、ｃＤＮＡを増幅させることを特徴とする請求項１又
    は２記載の型判定法。 ５、ＨＬＡがクラスII抗原であることを特徴とする請求
    項１ないし４のいずれか１項に記載の型判定法。 ６、ＨＬＡクラスII抗原がＤＲ分子である請求項５記載
    の型判定法。 ７、以下の工程からなることを特徴とするＨＬＡの型判
    定法。 （ａ）試料からｍＲＮＡを抽出する工程； （ｂ）抽出したｍＲＮＡを逆転写させて、 ｃＤＮＡを作成する工程； （ｃ）該ｃＤＮＡを増幅させる工程； （ｄ）アクリジニウムエステルでラベルされたプローブ
    を、増幅されたｃＤＮＡとハイブリダイズ条件下で、ハ
    イブリダイズさせる工程； （ｅ）ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
    ダイズしているが、その交雑において一塩基以上のミス
    マッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させ
    る工程； （ｆ）残存している化学発光量を測定することにより試
    料中のＨＬＡの型を判別する工程。 ８、上記（ｄ）工程が溶液中で均一に行われることを特
    徴とする請求項７記載の型判定法。 ９、ＨＬＡがクラスII抗原であることを特徴とする請求
    項７又は８記載の型判定法。 １０、ＨＬＡクラスII抗原がＤＲ分子である請求項９記
    載の型判定法。
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