JP3089033B2 - ヒト白血球抗原の型判定法 - Google Patents
ヒト白血球抗原の型判定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は臓器等の移植や自己免疫疾患あるいは薬剤感
受性の診断等に重要であるヒトの組織適合性抗原である
HAL（human leukocyte antigen:白血球抗原）の型判定
法に関するものである。
受性の診断等に重要であるヒトの組織適合性抗原である
HAL（human leukocyte antigen:白血球抗原）の型判定
法に関するものである。
［背景の技術］ HLAの型判定法は、クラスＩ抗原であるＡ・Ｂ・Ｃに
ついては従来より血清学的方法により行なわれてきてお
り、抗血清の改良により、かなり詳細な型判定が可能と
なっている（B.Dupoun et.al.,Tenth lnternational Hi
stocompatibility Workshop Newsletter2（1987））。
これに対し、クラスII抗原は抗原間の差異が小さいた
め、血清学的方法では十分な型判定は不可能であった。
ついては従来より血清学的方法により行なわれてきてお
り、抗血清の改良により、かなり詳細な型判定が可能と
なっている（B.Dupoun et.al.,Tenth lnternational Hi
stocompatibility Workshop Newsletter2（1987））。
これに対し、クラスII抗原は抗原間の差異が小さいた
め、血清学的方法では十分な型判定は不可能であった。
近年、遺伝子増幅法（polymerase chain reaction;以
下“PCR法”と略す。）の発明（P.K.Saiki et.al.,Scie
nce239,487−491（1988））により、特定のGenomic DNA
の増幅が可能となった。これによりクラスII遺伝子の超
可変域を含む領域を増幅し、増幅した遺伝子を32Ρラベ
ルプローブによるドットブロットや制限酵素での特異的
切断により評価する方法等、遺伝子レベルでの型判定が
試みられている（蛋白質・核酸・酵素,34,1989−2002,
（1989）;Human lmmunology,21,239−248（1989）参
照）。
下“PCR法”と略す。）の発明（P.K.Saiki et.al.,Scie
nce239,487−491（1988））により、特定のGenomic DNA
の増幅が可能となった。これによりクラスII遺伝子の超
可変域を含む領域を増幅し、増幅した遺伝子を32Ρラベ
ルプローブによるドットブロットや制限酵素での特異的
切断により評価する方法等、遺伝子レベルでの型判定が
試みられている（蛋白質・核酸・酵素,34,1989−2002,
（1989）;Human lmmunology,21,239−248（1989）参
照）。
［発明の開示］ クラスII抗原の詳細な型判定は、血清学的には不可能
であることから、遺伝子レベルで行なう必要性がある。
PCR法の開発により特定の遺伝子のみを簡便に増幅でき
ることから、この分野の研究は多く試みられてきたが、
前述したドットブロット法は一塩基の差異を見分ける分
解能がなく、又制限酵素により見分ける方法は酵素の認
識部位に多型性がなければならない。さらに現行法では
Genomic DNAを直接増幅するため、偽遺伝子の存在するD
R抗原においては正確な型判定が不可能であるなど、ど
の検出系においても多くの問題点があるのが現状であっ
た。
であることから、遺伝子レベルで行なう必要性がある。
PCR法の開発により特定の遺伝子のみを簡便に増幅でき
ることから、この分野の研究は多く試みられてきたが、
前述したドットブロット法は一塩基の差異を見分ける分
解能がなく、又制限酵素により見分ける方法は酵素の認
識部位に多型性がなければならない。さらに現行法では
Genomic DNAを直接増幅するため、偽遺伝子の存在するD
R抗原においては正確な型判定が不可能であるなど、ど
の検出系においても多くの問題点があるのが現状であっ
た。
本発明者は、これらの問題点を解決して、一塩基の差
異も識別できるHLA抗原の型判定法を開発すべく鋭意研
究を重ねた結果、試料から抽出したmRNAを材料とし、ア
クリジニウムエステル（AE）標識プローブを用いること
によって、従来の方法に比較して飛躍的に正確性と簡便
性を高め、さらに検出時間を大幅に短縮することができ
ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成し
た。
異も識別できるHLA抗原の型判定法を開発すべく鋭意研
究を重ねた結果、試料から抽出したmRNAを材料とし、ア
クリジニウムエステル（AE）標識プローブを用いること
によって、従来の方法に比較して飛躍的に正確性と簡便
性を高め、さらに検出時間を大幅に短縮することができ
ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成し
た。
本発明の一方法は一般式（Ｉ）に示すリンカーアーム
を介して、一般式（II）に示すアクリジニウムエステル
が標識されている標識プローブを用いるHLAの型判定方
法である。すなわち、 「一般式（Ｉ） （式中、X1はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式 を示す。
を介して、一般式（II）に示すアクリジニウムエステル
が標識されている標識プローブを用いるHLAの型判定方
法である。すなわち、 「一般式（Ｉ） （式中、X1はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式 を示す。
R1は炭素数１〜10の脂肪族炭化水素鎖を、 はX1の保護基を示す。但し、ｍはR2がとり得る１〜３の
整数を示し、R2は、（R2）ｍ−Ｃ−がX1を保護するよう
な電子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原
子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいは
これらの組み合わせである。又ｎは１又は２を示すが、
X1がＳ原子である時はｎは１を示し、X1がアミノ基であ
る時はｎは１又は２を示す。X2ハロゲン原子又は置換基
を有するアミノ基を、X3はハロゲン原子、アミノ基又は
−Ｏ−を、R3はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R4
は低級アルキル基、低級アルコキシ基を示すか、X3が−
Ｏ−の時は水素原子を示す。）で表されるリンカーアー
ムを介して一般式（II） （式中、R5は置換されていてもよい低級アルキル基、低
級アルケニル基、又はアリール基を、R6、R7は同一又は
異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基、
ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル基、低級アルキル
基、低級アルケニル基、アリール基、置換アセチル基、
置換低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置換アリ
ール基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R8
は を示す。ｐは０〜10の整数を示す。）で表されるアクリ
ジニウムエステルが標識されている構造を有する標識DN
Aプローブであって、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、試料中のmRNAから作成したcDNAを増幅させた産
物にハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしてい
ないプローブ及びハイブリダイズしているが、その交雑
において一塩基以上のミスマッチを有するプローブの標
識部分を選択的に分解させた後、化学発光量を測定する
ことから成るHLA（ヒト白血球抗原）の型判定法。」で
ある。
整数を示し、R2は、（R2）ｍ−Ｃ−がX1を保護するよう
な電子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原
子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいは
これらの組み合わせである。又ｎは１又は２を示すが、
X1がＳ原子である時はｎは１を示し、X1がアミノ基であ
る時はｎは１又は２を示す。X2ハロゲン原子又は置換基
を有するアミノ基を、X3はハロゲン原子、アミノ基又は
−Ｏ−を、R3はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R4
は低級アルキル基、低級アルコキシ基を示すか、X3が−
Ｏ−の時は水素原子を示す。）で表されるリンカーアー
ムを介して一般式（II） （式中、R5は置換されていてもよい低級アルキル基、低
級アルケニル基、又はアリール基を、R6、R7は同一又は
異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基、
ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル基、低級アルキル
基、低級アルケニル基、アリール基、置換アセチル基、
置換低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置換アリ
ール基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R8
は を示す。ｐは０〜10の整数を示す。）で表されるアクリ
ジニウムエステルが標識されている構造を有する標識DN
Aプローブであって、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、試料中のmRNAから作成したcDNAを増幅させた産
物にハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしてい
ないプローブ及びハイブリダイズしているが、その交雑
において一塩基以上のミスマッチを有するプローブの標
識部分を選択的に分解させた後、化学発光量を測定する
ことから成るHLA（ヒト白血球抗原）の型判定法。」で
ある。
又、本発明の他の一方法は次の通りである。
「以下の工程からなることを特徴とするHLAの型判定
法。
法。
（ａ）試料からmRNAを抽出する工程； （ｂ）抽出したmRNAを逆転写させて、cDNA作成する工
程； （ｃ）該cDNAを増幅させる工程； （ｄ）アクリジニウムエステルでラベルされた標識DNA
プローブであって、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、増幅されたcDNAとハイブリダイズ条件下で、ハ
イブリダイズさせる工程； （ｅ）ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしてるが、その交雑において一塩基以上のミスマ
ッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させる
工程； （ｆ）残存している化学発光量を測定することにより試
料中のHLAの型を判別する工程。」である。
程； （ｃ）該cDNAを増幅させる工程； （ｄ）アクリジニウムエステルでラベルされた標識DNA
プローブであって、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、増幅されたcDNAとハイブリダイズ条件下で、ハ
イブリダイズさせる工程； （ｅ）ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしてるが、その交雑において一塩基以上のミスマ
ッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させる
工程； （ｆ）残存している化学発光量を測定することにより試
料中のHLAの型を判別する工程。」である。
本発明の更に別の方法は次の通りである。
「一般式（Ｉ） （式中、X1はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式 を示す。
R1は炭素数１〜10の脂肪族炭化水素鎖を、 はX1の保護基を示す。但し、ｍはR2がとり得る１〜３の
整数を示し、R2は、（R2）ｍ−Ｃ−がX1を保護するよう
な電子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原
子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいは
これらの組み合わせである。又ｎは１又は２を示すが、
X1がＳ原子である時はｎは１を示し、X1がアミノ基であ
る時はｎは１又は２を示す。X2ハロゲン原子又は置換基
を有するアミノ基を、X3はハロゲン原子、アミノ基又は
−Ｏ−を、R3はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R4
は低級アルキル基、低級アルコキシ基を示すか、X3が−
Ｏ−の時は水素原子を示す。）で表されるリンカーアー
ムを介して一般式（II） （式中、R5は置換されていてもよい低級アルキル基、低
級アルケニル基、又はアリール基を、R6、R7は同一又は
異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基、
ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル基、低級アルキル
基、低級アルケニル基、アリール基、置換アセチル基、
置換低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置換アリ
ール基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R8
は を示す。ｐは０〜10の整数を示す。）で表されるアクリ
ジニウムエステルが標識されている構造を有し、偽遺伝
子と相補的にならないような標識DNAプローブであっ
て、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、試料中のgenomicDNAを増幅させた産物にハイブ
リダイズさせ、次いでハイブリダイズしていないプロー
ブ及びハイブリダイズしているが、その交雑において一
塩基以上のミスマッチを有するプローブの標識部分を選
択的に分解させた後、化学発光量を測定することから成
るHLA（ヒト白血球抗原）の型判定法。」である。
整数を示し、R2は、（R2）ｍ−Ｃ−がX1を保護するよう
な電子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原
子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいは
これらの組み合わせである。又ｎは１又は２を示すが、
X1がＳ原子である時はｎは１を示し、X1がアミノ基であ
る時はｎは１又は２を示す。X2ハロゲン原子又は置換基
を有するアミノ基を、X3はハロゲン原子、アミノ基又は
−Ｏ−を、R3はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R4
は低級アルキル基、低級アルコキシ基を示すか、X3が−
Ｏ−の時は水素原子を示す。）で表されるリンカーアー
ムを介して一般式（II） （式中、R5は置換されていてもよい低級アルキル基、低
級アルケニル基、又はアリール基を、R6、R7は同一又は
異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基、
ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル基、低級アルキル
基、低級アルケニル基、アリール基、置換アセチル基、
置換低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置換アリ
ール基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R8
は を示す。ｐは０〜10の整数を示す。）で表されるアクリ
ジニウムエステルが標識されている構造を有し、偽遺伝
子と相補的にならないような標識DNAプローブであっ
て、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、試料中のgenomicDNAを増幅させた産物にハイブ
リダイズさせ、次いでハイブリダイズしていないプロー
ブ及びハイブリダイズしているが、その交雑において一
塩基以上のミスマッチを有するプローブの標識部分を選
択的に分解させた後、化学発光量を測定することから成
るHLA（ヒト白血球抗原）の型判定法。」である。
［図面の簡単な説明］ 第１図は、アミノ酸番号５〜31に対応するDRB1遺伝子
の塩基配列図、第２図は、アミノ酸番号32〜62に対応す
るDRB1遺伝子の塩基配列図、第３図は、アミノ酸番号63
〜94に対応する塩基配列図である。
の塩基配列図、第２図は、アミノ酸番号32〜62に対応す
るDRB1遺伝子の塩基配列図、第３図は、アミノ酸番号63
〜94に対応する塩基配列図である。
第４図は、アミノリンカーを挿入したオリゴヌクレオ
チドからなるプローブにアクリジニウムエステルを反応
させた後の反応液のHPLCクロマトグラム及び化学発光量
を示すグラフである。
チドからなるプローブにアクリジニウムエステルを反応
させた後の反応液のHPLCクロマトグラム及び化学発光量
を示すグラフである。
第５図は、HLA Dw4に特異的なアクリジニウムエステ
ル標識プローブを用いてターゲットを合成オリゴヌクレ
オチドとした場合のHPA法によるHLA DR4の塩基のマッ
チ、ミスマッチの相違を示したグラフである。
ル標識プローブを用いてターゲットを合成オリゴヌクレ
オチドとした場合のHPA法によるHLA DR4の塩基のマッ
チ、ミスマッチの相違を示したグラフである。
第６図は、HLA Dw10に特異的なアクリジニウムエス
テル標識プローブを用いてターゲットを合成オリゴヌク
レオチドとした場合のHPA法によるHLA DR4の塩基のマ
ッチ、ミスマッチの相違を示したグラフである。
テル標識プローブを用いてターゲットを合成オリゴヌク
レオチドとした場合のHPA法によるHLA DR4の塩基のマ
ッチ、ミスマッチの相違を示したグラフである。
第７図は、HLA Dw14に特異的なアクリジニウムエス
テル標識プローブを用いてターゲットを合成オリゴヌク
レオチドとした場合のHPA法によるHLA DR4の塩基のマ
ッチ、ミスマッチの相違を示したグラフである。
テル標識プローブを用いてターゲットを合成オリゴヌク
レオチドとした場合のHPA法によるHLA DR4の塩基のマ
ッチ、ミスマッチの相違を示したグラフである。
第８図は、Genomic DNAのDRの超可変領域を含む塩基
配列をPCR法で増幅した後、HPA法を行なって得られた各
ターゲットの化学発光量の残存率の変化を示すグラフで
ある。
配列をPCR法で増幅した後、HPA法を行なって得られた各
ターゲットの化学発光量の残存率の変化を示すグラフで
ある。
第９図は、細胞から抽出したmRNAを逆転写し、PCR法
で増幅した後、HPA法を行なって得られた各ターゲット
の化学発光量の残存率の変化を示すグラフである。
で増幅した後、HPA法を行なって得られた各ターゲット
の化学発光量の残存率の変化を示すグラフである。
［発明を実施するための最良の形態］ 以下、本発明によるHLAの型判定法について詳細に説
明する。
明する。
本発明において、型判定のターゲットとなるHLAは、H
LA−A,B及びＣのクラスＩ抗原及びHLA−DR,DQ及びDPの
クラスII抗原のいずれのタイプでも用いることができ、
下記表１に示す、第10回国際ワークショップ（1987年）
で公認されたどの特異性に対しても適用することができ
る。このうち、偽遺伝子が存在し、その型判定が特に困
難なHLA−DR抗原（DRB1）について、第１図〜第３図に
示す如く、その特異性と遺伝子の塩基配列を示した。
LA−A,B及びＣのクラスＩ抗原及びHLA−DR,DQ及びDPの
クラスII抗原のいずれのタイプでも用いることができ、
下記表１に示す、第10回国際ワークショップ（1987年）
で公認されたどの特異性に対しても適用することができ
る。このうち、偽遺伝子が存在し、その型判定が特に困
難なHLA−DR抗原（DRB1）について、第１図〜第３図に
示す如く、その特異性と遺伝子の塩基配列を示した。
mRNAの抽出は、例えば（１）NP−40などの界面活性剤
で細胞を破壊した後、フェノール等で抽出する方法（S.
L.Berger,Method in Enzymology 152,227−234,（198
7））、（２）グアニジンチオシアネートを用いる方法
（P.Chomcynski and N.Sacchi,Analytica Biochemistor
y,162,156−159,（1987））、（３）超遠心を用いる方
法（F.M.Ausbel et.al.,Current Protocols in Molecul
ar Biology 1）等、一般的な方法で行える。またmRNAは
その後増幅されるので、抽出効率は問題とされない。
で細胞を破壊した後、フェノール等で抽出する方法（S.
L.Berger,Method in Enzymology 152,227−234,（198
7））、（２）グアニジンチオシアネートを用いる方法
（P.Chomcynski and N.Sacchi,Analytica Biochemistor
y,162,156−159,（1987））、（３）超遠心を用いる方
法（F.M.Ausbel et.al.,Current Protocols in Molecul
ar Biology 1）等、一般的な方法で行える。またmRNAは
その後増幅されるので、抽出効率は問題とされない。
抽出したmRNAを逆転写させ、cDNAを作成する工程は、
例えば、AMV逆転写酵素やＭ−MLV逆転写酵素等の逆転写
酵素により行うことができる。
例えば、AMV逆転写酵素やＭ−MLV逆転写酵素等の逆転写
酵素により行うことができる。
cDNAを増幅させる方法としては、mRNAをオリゴdTもし
くはランダムプライマーをプライマーとし、逆転写酵素
により、一本鎖のDNA（sscDNA）とした後、このsscDNA
を特異的に増幅するPCR法や、T7ポリメラーゼと逆転写
酵素を用いる方法等があげられる。このT7ポリメラーゼ
と逆転写酵素を用いる方法とは、二本鎖DNAを一本鎖に
変性させ、プライマー（増幅させるDNA領域を挟んで、
＋鎖、−鎖に相補的な配列とT7プロモーター領域に相補
的な配列を合わせ持つオリゴヌクレオチド）を結合させ
リボヌクレオチド３リン酸、デオキシリボヌクレオチド
３リン酸、逆転写酵素、T7ポリメラーゼ及び酵素に必要
な塩を含む緩衝液を加える。次いで、37℃で数分間イン
キュベートし、高温（約95℃）で変性した後、室温に戻
し、逆転写酵素、T7ポリメラーゼ及びRNaseHを含む緩衝
液を加え、さらに37℃で数時間インキュベートする方法
である。
くはランダムプライマーをプライマーとし、逆転写酵素
により、一本鎖のDNA（sscDNA）とした後、このsscDNA
を特異的に増幅するPCR法や、T7ポリメラーゼと逆転写
酵素を用いる方法等があげられる。このT7ポリメラーゼ
と逆転写酵素を用いる方法とは、二本鎖DNAを一本鎖に
変性させ、プライマー（増幅させるDNA領域を挟んで、
＋鎖、−鎖に相補的な配列とT7プロモーター領域に相補
的な配列を合わせ持つオリゴヌクレオチド）を結合させ
リボヌクレオチド３リン酸、デオキシリボヌクレオチド
３リン酸、逆転写酵素、T7ポリメラーゼ及び酵素に必要
な塩を含む緩衝液を加える。次いで、37℃で数分間イン
キュベートし、高温（約95℃）で変性した後、室温に戻
し、逆転写酵素、T7ポリメラーゼ及びRNaseHを含む緩衝
液を加え、さらに37℃で数時間インキュベートする方法
である。
PCR法で用いるプライマーは、プローブで検出する超
可変域が増幅されるように定めたものを用いることがで
き、長さは20−25merのものが好ましい。
可変域が増幅されるように定めたものを用いることがで
き、長さは20−25merのものが好ましい。
一方、検出用のプローブは核酸合成機（アプライド
バイオシステム社製，モデル380B）により合成できる。
プローブは超可変部が中心となるようにデザインし、そ
の中心にアミノ基をもったリンカーを挿入する。合成し
たオリゴヌクレオチドは、定法により精製を行い、ジメ
チルスルホキシド及びヘペス等の緩衝液を含む反応液中
で、有機溶媒に溶解した活性エステルを持つAEと混合す
る。その結果活性エステルが、リンカーのアミノ基と反
応し、オリゴヌクレオチドのAEラベルが行える。
バイオシステム社製，モデル380B）により合成できる。
プローブは超可変部が中心となるようにデザインし、そ
の中心にアミノ基をもったリンカーを挿入する。合成し
たオリゴヌクレオチドは、定法により精製を行い、ジメ
チルスルホキシド及びヘペス等の緩衝液を含む反応液中
で、有機溶媒に溶解した活性エステルを持つAEと混合す
る。その結果活性エステルが、リンカーのアミノ基と反
応し、オリゴヌクレオチドのAEラベルが行える。
本発明で用いるプローブは、型判定の結果が偽陽性と
なることを防ぐため、一定時間加水分解を行った後の化
学発光量が、陰性のものは陰性コントロールである水の
値まで減衰し、かつ陽性であるものの化学発光量は、陰
性のものの５倍以上、好ましくは10倍以上となるものを
特に選択する必要がある。発明者は、このような性質を
もったプローブの選択について研究を重ねた結果、プロ
ーブの長さ及びTm値［（プローブ中の塩基Ｇ及びＣの個
数）×４＋（プローブ中の塩基Ａ及びＴの個数）×２］
がある一定の範囲にあるものが、HLAの型判定に特に優
れていることを発見した。すなわち、プローブの長さが
19〜28merであり、かつTm値が62〜80,好ましくは72前後
であるプローブが特に好ましく本発明に用いられる。プ
ローブの例として、その配列及びTm値を第１表に記載す
る。
なることを防ぐため、一定時間加水分解を行った後の化
学発光量が、陰性のものは陰性コントロールである水の
値まで減衰し、かつ陽性であるものの化学発光量は、陰
性のものの５倍以上、好ましくは10倍以上となるものを
特に選択する必要がある。発明者は、このような性質を
もったプローブの選択について研究を重ねた結果、プロ
ーブの長さ及びTm値［（プローブ中の塩基Ｇ及びＣの個
数）×４＋（プローブ中の塩基Ａ及びＴの個数）×２］
がある一定の範囲にあるものが、HLAの型判定に特に優
れていることを発見した。すなわち、プローブの長さが
19〜28merであり、かつTm値が62〜80,好ましくは72前後
であるプローブが特に好ましく本発明に用いられる。プ
ローブの例として、その配列及びTm値を第１表に記載す
る。
これらのプローブは第１図〜第３図に実線で囲って示
してある。その他に、これらの図に点線で囲って示した
配列を有するプローブも同様に本発明方法で用いること
ができる。
してある。その他に、これらの図に点線で囲って示した
配列を有するプローブも同様に本発明方法で用いること
ができる。
実際の検出では、増幅させたターゲットを高温または
アルカリ処理で一本鎖にした後、プローブと混合し、定
法によりハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイ
ゼーションは酸性緩衝液中で行い、反応時間を短縮する
ためには、リチウム塩を含む酸性緩衝液中で行い、温度
は50〜70℃、時間は１〜数十分の間で行う。ハイブリダ
イゼーション後は、界面活性剤を含む弱アルカリ液を加
え、ターゲットとプローブの塩基配列が完全に一致する
場合は、アクリジニウムエステルは加水分解されない
が、不一致があると加水分解を受け、化学発光量が減衰
する。
アルカリ処理で一本鎖にした後、プローブと混合し、定
法によりハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイ
ゼーションは酸性緩衝液中で行い、反応時間を短縮する
ためには、リチウム塩を含む酸性緩衝液中で行い、温度
は50〜70℃、時間は１〜数十分の間で行う。ハイブリダ
イゼーション後は、界面活性剤を含む弱アルカリ液を加
え、ターゲットとプローブの塩基配列が完全に一致する
場合は、アクリジニウムエステルは加水分解されない
が、不一致があると加水分解を受け、化学発光量が減衰
する。
又、本発明で用いられる一般式（Ｉ）で示されるリン
カーアームは、例えば欧州特許公開EP0310312号に開示
されており、一般式（II）で示されるAEは例えば国際特
許出願公開W089/02476に開示されている。
カーアームは、例えば欧州特許公開EP0310312号に開示
されており、一般式（II）で示されるAEは例えば国際特
許出願公開W089/02476に開示されている。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するがこ
れらの記載は本発明を限定するものではない。この実施
例においては、本発明方法の顕著な効果を裏付けるため
に、特に一塩基だけ違うDR抗原遺伝子を選んでHLAの型
判定を行なった。なお以下の各実施例においては、AEと
して次の構造式で示される化合物を用いた。
れらの記載は本発明を限定するものではない。この実施
例においては、本発明方法の顕著な効果を裏付けるため
に、特に一塩基だけ違うDR抗原遺伝子を選んでHLAの型
判定を行なった。なお以下の各実施例においては、AEと
して次の構造式で示される化合物を用いた。
化学名４−（２−Succinimidyloxycarbonylethyl）phen
yl−10−methylacridinium−９−carboxylatefluorosul
fonate ［実施例１］ ａ） プローブの作成 第２表に示すように、血清学的DR4と判定されるDR抗
原は、遺伝子レベルでさらにDw4 Dw10 Dw13 Dw14 D
w15 DKT2にスプリットすることが知られている。われ
われは、この内のDw4 Dw10 Dw15を用いて検定を行っ
た。Dw4とDw14の塩基配列の違いは、一塩基だけであ
り、この差異を簡便に判定できれば、すべての型判定に
応用可能である。
yl−10−methylacridinium−９−carboxylatefluorosul
fonate ［実施例１］ ａ） プローブの作成 第２表に示すように、血清学的DR4と判定されるDR抗
原は、遺伝子レベルでさらにDw4 Dw10 Dw13 Dw14 D
w15 DKT2にスプリットすることが知られている。われ
われは、この内のDw4 Dw10 Dw15を用いて検定を行っ
た。Dw4とDw14の塩基配列の違いは、一塩基だけであ
り、この差異を簡便に判定できれば、すべての型判定に
応用可能である。
プローブは、下記に示すように、塩基の変異のある近
傍に一般式（Ｉ）で示されるリンカーアームとしてアミ
ノリンカー（Amino Modifier II,CLONTECH Laboratorie
s,Inc.社製）を挿入するようにデザインした核酸合成機
（アプライト バイオシステムズ社，モデル380B）で合
成した。
傍に一般式（Ｉ）で示されるリンカーアームとしてアミ
ノリンカー（Amino Modifier II,CLONTECH Laboratorie
s,Inc.社製）を挿入するようにデザインした核酸合成機
（アプライト バイオシステムズ社，モデル380B）で合
成した。
＊：アミノリンカー 合成後、15％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、目的
のバンドで切り出し、0.5M酢酸アンモニウム、1mM EDT
Aで一晩抽出した。抽出後、Sep−pak C18カラムで精製
した。精製したオリゴヌクレオチドは、エッペンドルフ
チューブに約0.5ODずつ分注し、真空乾燥後、水４μl,1
M HEPES（pH8）１μl,DMSO3μｌおよびAE ２μｌ（0.8
mg/50μl DMSO）を加え、37℃で20分、遮光して反応さ
せた。再度、水1.5μl,1M HEPES 0.5μｌおよびAE
３μｌを加え、上記同様に37℃で20分反応させた。続い
て未反応のAEをブロックするため、125μΜ Lysine,0.
1M HEPESおよび50％DMSOを含む混合液を加え、室温で
５分放置した。これをエタノール沈殿させてフリーのAE
を除去した。
のバンドで切り出し、0.5M酢酸アンモニウム、1mM EDT
Aで一晩抽出した。抽出後、Sep−pak C18カラムで精製
した。精製したオリゴヌクレオチドは、エッペンドルフ
チューブに約0.5ODずつ分注し、真空乾燥後、水４μl,1
M HEPES（pH8）１μl,DMSO3μｌおよびAE ２μｌ（0.8
mg/50μl DMSO）を加え、37℃で20分、遮光して反応さ
せた。再度、水1.5μl,1M HEPES 0.5μｌおよびAE
３μｌを加え、上記同様に37℃で20分反応させた。続い
て未反応のAEをブロックするため、125μΜ Lysine,0.
1M HEPESおよび50％DMSOを含む混合液を加え、室温で
５分放置した。これをエタノール沈殿させてフリーのAE
を除去した。
エタノール沈殿したプローブに水100μｌ加え、その
全量をTSK gel oligo DNA RPカラム（東ソー社製,4.6
mm ID×15cmL）に注入した。第４図にHPLCクロマトグラ
ムを示した。また、0.5分間隔で溶出液を分取し、各フ
ラクションの化学発光量（RLU）を測定し、オリゴヌク
レオチドがAEラベルが正確に行われているか確認した。
全量をTSK gel oligo DNA RPカラム（東ソー社製,4.6
mm ID×15cmL）に注入した。第４図にHPLCクロマトグラ
ムを示した。また、0.5分間隔で溶出液を分取し、各フ
ラクションの化学発光量（RLU）を測定し、オリゴヌク
レオチドがAEラベルが正確に行われているか確認した。
なお、このときのHPEC条件は次の通りであった。
溶離液A:50mM TEAA（酢酸トリエチルアンモニウム） B:CH3CN CH3CNの濃度勾配 ０→40％,40分 流速 1ml/min 検出器 UV260nm ｂ） プライマーの作成 プライマーは、プローブで検出する超可変域が増幅さ
れるように定め、核酸合成機（アプライド バイオシス
テムズ社，モデル380B）で作成し、プローブと同様に精
製した。
れるように定め、核酸合成機（アプライド バイオシス
テムズ社，モデル380B）で作成し、プローブと同様に精
製した。
プライマーの配列は以下の通りである。
２） ターゲットの作成及び抽出 ａ） 合成オリゴヌクレオチドの作成 ターゲットの合成オリゴヌクレオチドは、それぞれP
1,P2,P3と相補的になるように塩基配列を決め、核酸合
成機で合成した。合成したオリゴヌクレオチドは、プロ
ーブと同様の方法で精製した。
1,P2,P3と相補的になるように塩基配列を決め、核酸合
成機で合成した。合成したオリゴヌクレオチドは、プロ
ーブと同様の方法で精製した。
ｂ） サンプルからのRNAの抽出 HTC（homozygous typing cell:DR遺伝子をホモに持
つ培養細胞）からRNAの抽出 細胞は、Dw4 geneをホモに持つBM14,Dw10をホモに持
つFS,Dw14をホモに持つTHOを用いた。HTCは、10％ウシ
血清添加PRMI1640培地で培養した。５×106〜107の細胞
をPBSで３回洗浄した。4.5mlのhypotonic buffer（10mM
Tris−HCl pH7.5,10mM NaCl,1.5mM MgCl2）にHTCをサ
スペンドしリボヌクレオシドバナジルコンプレックス
（200mM）を250μｌ加え、遠心した後上清をとり150μ
ｌの10％NP−40を加え撹拌し、５分間４℃に静置した。
10％SDSを100μl,0.5M EDTAを40μｌ加えた。約5mlのフ
ェノールを加え、５分間撹拌した後遠心（3000rpm 5mi
n）し上清をとった。さらに３回フェノール抽出を繰り
返した。上清を新しいチューブに移し、5MのNaClを100
μｌおよび3mlの冷エタノールを加え、−90℃で一夜も
しくは、ドライアイスボックスで30分放置した。遠心
後、（3000rpm20分）上清を捨てエタノールでリンスし
真空下で乾燥した。これを600μｌの水に溶解し等量の4
M LiClを加え、４℃で一夜放置した。遠心（15000rpm20
分）後、4M LiClで一回、エタノールで一回リンスし乾
燥した。100μｌの水に溶解し吸光度よりRNA量の算出を
行なった。
つ培養細胞）からRNAの抽出 細胞は、Dw4 geneをホモに持つBM14,Dw10をホモに持
つFS,Dw14をホモに持つTHOを用いた。HTCは、10％ウシ
血清添加PRMI1640培地で培養した。５×106〜107の細胞
をPBSで３回洗浄した。4.5mlのhypotonic buffer（10mM
Tris−HCl pH7.5,10mM NaCl,1.5mM MgCl2）にHTCをサ
スペンドしリボヌクレオシドバナジルコンプレックス
（200mM）を250μｌ加え、遠心した後上清をとり150μ
ｌの10％NP−40を加え撹拌し、５分間４℃に静置した。
10％SDSを100μl,0.5M EDTAを40μｌ加えた。約5mlのフ
ェノールを加え、５分間撹拌した後遠心（3000rpm 5mi
n）し上清をとった。さらに３回フェノール抽出を繰り
返した。上清を新しいチューブに移し、5MのNaClを100
μｌおよび3mlの冷エタノールを加え、−90℃で一夜も
しくは、ドライアイスボックスで30分放置した。遠心
後、（3000rpm20分）上清を捨てエタノールでリンスし
真空下で乾燥した。これを600μｌの水に溶解し等量の4
M LiClを加え、４℃で一夜放置した。遠心（15000rpm20
分）後、4M LiClで一回、エタノールで一回リンスし乾
燥した。100μｌの水に溶解し吸光度よりRNA量の算出を
行なった。
新鮮血リンパ球からのRNAの抽出 約4mlの血液（ヘパリン加）に等量の等張緩衝液を加
え、ピペットでよく撹拌した。6mlのフィコール・パー
ク（ファルマシア社製，比重液）を15mlの遠心管に取
り、血液をゆっくり重層した。室温で遠心（400g 40〜
50分）した。中間層のリンパ球を注意深くとり、約6ml
の等張緩衝液を加え静かに撹拌し60〜100gで10分遠心し
た。上清を捨てた後、HTCと同様の方法でRNAの抽出を行
なった。
え、ピペットでよく撹拌した。6mlのフィコール・パー
ク（ファルマシア社製，比重液）を15mlの遠心管に取
り、血液をゆっくり重層した。室温で遠心（400g 40〜
50分）した。中間層のリンパ球を注意深くとり、約6ml
の等張緩衝液を加え静かに撹拌し60〜100gで10分遠心し
た。上清を捨てた後、HTCと同様の方法でRNAの抽出を行
なった。
３） mRNAの逆転写（sscDNAを作成）と特異的増幅 RNAを１μｇとり、0.5μｇのoligo（dT）を加え、水
を加えて22μｌとした。65℃で５分放置後、室温に戻し
10mMのdNTPmix 1μｌと５倍濃度の逆転写酵素バッファ
ーを６μｌ加え、さらに１μｌの200unitのＭ−MLV逆転
写酵素（ベゼスダ・リサーチ社製）を加え、37℃で60分
反応させる。65℃で10分間放置した後、180μｌのTEバ
ッファーを加え−90℃で保存する。
を加えて22μｌとした。65℃で５分放置後、室温に戻し
10mMのdNTPmix 1μｌと５倍濃度の逆転写酵素バッファ
ーを６μｌ加え、さらに１μｌの200unitのＭ−MLV逆転
写酵素（ベゼスダ・リサーチ社製）を加え、37℃で60分
反応させる。65℃で10分間放置した後、180μｌのTEバ
ッファーを加え−90℃で保存する。
sscDNAを10μｌに、10倍PCRバッファーを５μｌ、10m
M dNTPを１μｌ、10pmol/μｌのプライマーを５μｌず
つ、水を24μｌ、タックポリメラーゼ（宝酒造社製，商
品名Ampli Taq）を0.5μｌ加えた。92℃で５分変性した
後、65℃３分92℃２分で45サイクル行ない、最後に65℃
で７分放置した。これを２μｌ取りHPA（homogeneuos p
rotcction assay）を行なった。
M dNTPを１μｌ、10pmol/μｌのプライマーを５μｌず
つ、水を24μｌ、タックポリメラーゼ（宝酒造社製，商
品名Ampli Taq）を0.5μｌ加えた。92℃で５分変性した
後、65℃３分92℃２分で45サイクル行ない、最後に65℃
で７分放置した。これを２μｌ取りHPA（homogeneuos p
rotcction assay）を行なった。
４） プローブとターゲットのハイブリダイゼーション エッペンドルフチューブに２×ハイブリッドバッファ
ー（注１）（２×Hybrid Buffer）15μｌ、２×輸送溶
液（注２）（２×Transport Media）５μｌ、プローブ
（106〜107RLU）３μｌ及びターゲットを加え、60℃で6
0分インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、
モック・ハイブリッド・ミックス（注３）（Mock Hybri
d Mix）を270μｌに加え、ハイブリッド溶液とした。な
お、ネガティブ・コントロールとして水を用いた。
ー（注１）（２×Hybrid Buffer）15μｌ、２×輸送溶
液（注２）（２×Transport Media）５μｌ、プローブ
（106〜107RLU）３μｌ及びターゲットを加え、60℃で6
0分インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、
モック・ハイブリッド・ミックス（注３）（Mock Hybri
d Mix）を270μｌに加え、ハイブリッド溶液とした。な
お、ネガティブ・コントロールとして水を用いた。
（注１） ２×Hybird Buffer:0.2M linthium succinate,pH5.2 18
％lithium lauryl sulfate 2mM EDTA/EGTA （注２） ２×Transport Media:6％ lithium lauryl sulfate 60m
M sodium phosphate buffer,pH6.8 2mM EDTA/EGTA （注３）Mock Hybrid Mix（20ml中）： ２×Hybird Buffer 10.0 ml ２×Transport Media 3.33ml 0.01M NaOAc（pH5）,0.1％SDS 2.0 ml 水 4.67ml ５） HPA実験 ハイブリッド溶液に、0.2M四ホウ酸ナトリウム（pH7.
6）、５％トリトンＸ−100（和光純薬社製，界面活性
剤）からなる液（以下「Ａ液」と称する）で処理するこ
とにより、化学的なセレクションを加え、RLUの減衰を
比較し、マッチとミスマッチを判定した。なお、ミスマ
ッチとはハイブリッドさせたときに１塩基以上に差異が
あることを意味する。あらかじめ、チューブにＡ液を10
0μｌずついれておき、15μｌのハイブリッド溶液を加
え、60℃で10分インキュベートした後、30秒冷却し、室
温で１分放置後化学発光量を測定した。なお、冷却した
Ａ液100μｌに15μｌのハイブリッド溶液を加え、直ち
に測定した化学発光量を０分の値（100％に相当）とし
て残存率を計算した。
％lithium lauryl sulfate 2mM EDTA/EGTA （注２） ２×Transport Media:6％ lithium lauryl sulfate 60m
M sodium phosphate buffer,pH6.8 2mM EDTA/EGTA （注３）Mock Hybrid Mix（20ml中）： ２×Hybird Buffer 10.0 ml ２×Transport Media 3.33ml 0.01M NaOAc（pH5）,0.1％SDS 2.0 ml 水 4.67ml ５） HPA実験 ハイブリッド溶液に、0.2M四ホウ酸ナトリウム（pH7.
6）、５％トリトンＸ−100（和光純薬社製，界面活性
剤）からなる液（以下「Ａ液」と称する）で処理するこ
とにより、化学的なセレクションを加え、RLUの減衰を
比較し、マッチとミスマッチを判定した。なお、ミスマ
ッチとはハイブリッドさせたときに１塩基以上に差異が
あることを意味する。あらかじめ、チューブにＡ液を10
0μｌずついれておき、15μｌのハイブリッド溶液を加
え、60℃で10分インキュベートした後、30秒冷却し、室
温で１分放置後化学発光量を測定した。なお、冷却した
Ａ液100μｌに15μｌのハイブリッド溶液を加え、直ち
に測定した化学発光量を０分の値（100％に相当）とし
て残存率を計算した。
＜結果および考察＞ １） ターゲットを合成オリゴヌクレオチドとした場合
のHPA ターゲットを合成オリゴヌクレオチドとしたHPAの結
果を第5,6,7図に示した。
のHPA ターゲットを合成オリゴヌクレオチドとしたHPAの結
果を第5,6,7図に示した。
第５図は、HLA Dw4に特異的なアクリジニウムエステ
ル標識プローブ（プローブP1）を使用したい場合におけ
る、HPA（homogeneous protection assay）法によるHLA
DR4の塩基マッチ、ミスマッチの相違を示したグラフ
である。T1（Dw4）はこのプローブ配列と完全にマッチ
するものである。T2（Dw10）は４塩基ミスマッチ、T3
（Dw14）は１塩基ミスマッチをそれぞれ有している。第
５図によれば、プローブをP1としてハイブリダイゼーシ
ョンを１時間行なった場合、セレクション10分でのRLUs
の残存率は、プローブと完全にマッチするT1で75％、１
塩基異なるT3で41％、４塩基異なるT2で10％であった。
このことは、本発明方法のHLAの１塩基の違いを正確に
識別できることを示している。
ル標識プローブ（プローブP1）を使用したい場合におけ
る、HPA（homogeneous protection assay）法によるHLA
DR4の塩基マッチ、ミスマッチの相違を示したグラフ
である。T1（Dw4）はこのプローブ配列と完全にマッチ
するものである。T2（Dw10）は４塩基ミスマッチ、T3
（Dw14）は１塩基ミスマッチをそれぞれ有している。第
５図によれば、プローブをP1としてハイブリダイゼーシ
ョンを１時間行なった場合、セレクション10分でのRLUs
の残存率は、プローブと完全にマッチするT1で75％、１
塩基異なるT3で41％、４塩基異なるT2で10％であった。
このことは、本発明方法のHLAの１塩基の違いを正確に
識別できることを示している。
HLA Dw10,Dw14にそれぞれ特異的なアクリジニウムエ
ステル標識プローブ（プローブP2,プローブP3）を使用
した場合もほぼ同様の傾向が得られた。
ステル標識プローブ（プローブP2,プローブP3）を使用
した場合もほぼ同様の傾向が得られた。
第６図は、HLA Dw10に特異的なアクリジニウムエス
テル標識プローブ（プローブP2）を使用した場合におけ
る、HPA法によるHLA DR4の塩基のマッチ、ミスマッチ
の相違を示したグラフである。T2（Dw10）はこのプロー
ブ配列と完全にマッチするものであり、T1（Dw4）は４
塩基ミスマッチ、T3（Dw14）は５塩基ミスマッチをそれ
ぞれ有している。第６図によれば、プローブをP2として
ハイブリダイゼーションを１時間行なった場合、セレク
ション10分でのRLUsの残存率は、プローブP2と完全にマ
ッチするT2で72％、４塩基異なるT1で0.5％５塩基異な
るT3で２％であった。このことから、プローブP2を用い
た場合も、本発明方法がHLAクラスIIのDR塩基の相違を
的確に識別できることがわかる。
テル標識プローブ（プローブP2）を使用した場合におけ
る、HPA法によるHLA DR4の塩基のマッチ、ミスマッチ
の相違を示したグラフである。T2（Dw10）はこのプロー
ブ配列と完全にマッチするものであり、T1（Dw4）は４
塩基ミスマッチ、T3（Dw14）は５塩基ミスマッチをそれ
ぞれ有している。第６図によれば、プローブをP2として
ハイブリダイゼーションを１時間行なった場合、セレク
ション10分でのRLUsの残存率は、プローブP2と完全にマ
ッチするT2で72％、４塩基異なるT1で0.5％５塩基異な
るT3で２％であった。このことから、プローブP2を用い
た場合も、本発明方法がHLAクラスIIのDR塩基の相違を
的確に識別できることがわかる。
第７図は、HLA Dw14に特異的なアクリジニウムエス
テル標識プローブ（プローブP3）を使用した場合におけ
る、HPA法によるHLA DR4の塩基のマッチ、ミスマッチ
の相違を示したグラフである。T3（Dw14）はこのプロー
ブ配列と完全にマッチするものであり、T1（Dw4）は１
塩基ミスマッチ、T2（Dw10）は５塩基ミスマッチをそれ
ぞれ有している。第７図によれば、プローブをP3として
ハイブリダイゼーションを１時間行なった場合、セルク
ション10分でのRLUsの残存率は、プローブP3と完全にマ
ッチするT3で66％、１塩基異なるT1で38％、５塩基異な
るT2で12％であった。プローブP3を用いた場合も、本発
明方法がHLAクラスIIのDR塩基の相違を正確に識別でき
ることがわかる。
テル標識プローブ（プローブP3）を使用した場合におけ
る、HPA法によるHLA DR4の塩基のマッチ、ミスマッチ
の相違を示したグラフである。T3（Dw14）はこのプロー
ブ配列と完全にマッチするものであり、T1（Dw4）は１
塩基ミスマッチ、T2（Dw10）は５塩基ミスマッチをそれ
ぞれ有している。第７図によれば、プローブをP3として
ハイブリダイゼーションを１時間行なった場合、セルク
ション10分でのRLUsの残存率は、プローブP3と完全にマ
ッチするT3で66％、１塩基異なるT1で38％、５塩基異な
るT2で12％であった。プローブP3を用いた場合も、本発
明方法がHLAクラスIIのDR塩基の相違を正確に識別でき
ることがわかる。
このようにDR4と同じ配列を持つ合成オリゴヌクレオ
チドをターゲットとした系で、本発明方法が１塩基の違
いを明瞭に判定できることが確かめられた。
チドをターゲットとした系で、本発明方法が１塩基の違
いを明瞭に判定できることが確かめられた。
２） Genomic DNAをターゲットとした場合 Genomic DNAのDRの超可変領域を含む塩基配列をPCR法
で増幅した後、HPAを行なった結果を第８図に示した。H
PAの条件はプローブをそれぞれ約107RLU加え、ハイブリ
ダイゼーションを１時間、セレクションを10分とした。
図中、T1,T2及びT3は第５〜７図の場合と同じく合成ヌ
クレオチドを、BM14,FS及びTHOはそれぞれ細胞名を表わ
す。結果から分かるように、プローブ２を用いたDw10の
型判定の結果は明瞭であるが、プローブ１では４塩基異
なるFSのRLUが高い値を示し、またプローブ３を用いた
場合は、相補的な配列を持つTHOの識別が不可能であっ
た。このように、Genomic DNAを用いた系では、ターゲ
ットの種類により型判定が不可能であり、これは、偽遺
伝子の影響であると考えられた。
で増幅した後、HPAを行なった結果を第８図に示した。H
PAの条件はプローブをそれぞれ約107RLU加え、ハイブリ
ダイゼーションを１時間、セレクションを10分とした。
図中、T1,T2及びT3は第５〜７図の場合と同じく合成ヌ
クレオチドを、BM14,FS及びTHOはそれぞれ細胞名を表わ
す。結果から分かるように、プローブ２を用いたDw10の
型判定の結果は明瞭であるが、プローブ１では４塩基異
なるFSのRLUが高い値を示し、またプローブ３を用いた
場合は、相補的な配列を持つTHOの識別が不可能であっ
た。このように、Genomic DNAを用いた系では、ターゲ
ットの種類により型判定が不可能であり、これは、偽遺
伝子の影響であると考えられた。
３） mRNAをターゲットにした場合 細胞から抽出したmRNAを逆転写し、PCRで増幅した後H
PAを行なった結果を第９図に示した。T1,T2,T3,BM14,FS
及びTHOは第８図の場合と同じ意味を表わす。結果から
分かるように、Genomic DNAを用いた型判定では不明瞭
であったDw10および、不可能であったDw14の型判定が可
能となった。mRNAをサンプルとした場合、偽遺伝子の悪
影響を排除できると考えられ、これはRLUの残存率が純
系の結果と全くパラレルになることからも示唆される。
このように、mRNAを逆転写させて、cDNAを作成し、これ
を増幅させたものをターゲットとして使用することによ
り、DRのサブタイプの型判定を的確に行なうことができ
ることが確かめられた。
PAを行なった結果を第９図に示した。T1,T2,T3,BM14,FS
及びTHOは第８図の場合と同じ意味を表わす。結果から
分かるように、Genomic DNAを用いた型判定では不明瞭
であったDw10および、不可能であったDw14の型判定が可
能となった。mRNAをサンプルとした場合、偽遺伝子の悪
影響を排除できると考えられ、これはRLUの残存率が純
系の結果と全くパラレルになることからも示唆される。
このように、mRNAを逆転写させて、cDNAを作成し、これ
を増幅させたものをターゲットとして使用することによ
り、DRのサブタイプの型判定を的確に行なうことができ
ることが確かめられた。
［実施例２］ 末梢血リンパ球を用いたHLA DRの型判定 １） プローブ プローブは第１図から第３図に枠内で示したプローブ
のうち、実線で囲ったP6からP17の12種のプローブ、す
なわち第１表に記載したプローブ（P6−P17）を検討に
用いた。
のうち、実線で囲ったP6からP17の12種のプローブ、す
なわち第１表に記載したプローブ（P6−P17）を検討に
用いた。
２） 末梢血リンパ球からのRNAの抽出 新鮮血は、あらかじめ、ヘパリンを入れた注射筒で5m
l採血し、Ficoll−Paqueでリンパ球を分けPBSで２回洗
浄した用いた。リンパ球に1mlのsolution D1)を加え、
２分間vortex mixer（IKEDA SCIENTIFIC Co,Ltd.,）で
撹拌した。これに0.1mlの2M CH3COONa pH4,1ml water
saturated phenol,および0.2mlのCHCl3を加えvortex m
ixerで30秒撹拌した。3000rpm（10min ４℃）で遠心
し、上清をエッペンドルフチューブに移し、等量のイソ
プロパノールを加えdeep freezer（SANYO,ULTRA LOW−1
35℃）で15分放置した。12000g（15min4℃）で遠心し沈
殿に70％エタノールを加え12000g（5min4℃）で遠心し
た。さらに100％エタノールを加え５分遠心し、乾燥し
た。100μｌのH2Oに溶解しRNA solutionとした。
l採血し、Ficoll−Paqueでリンパ球を分けPBSで２回洗
浄した用いた。リンパ球に1mlのsolution D1)を加え、
２分間vortex mixer（IKEDA SCIENTIFIC Co,Ltd.,）で
撹拌した。これに0.1mlの2M CH3COONa pH4,1ml water
saturated phenol,および0.2mlのCHCl3を加えvortex m
ixerで30秒撹拌した。3000rpm（10min ４℃）で遠心
し、上清をエッペンドルフチューブに移し、等量のイソ
プロパノールを加えdeep freezer（SANYO,ULTRA LOW−1
35℃）で15分放置した。12000g（15min4℃）で遠心し沈
殿に70％エタノールを加え12000g（5min4℃）で遠心し
た。さらに100％エタノールを加え５分遠心し、乾燥し
た。100μｌのH2Oに溶解しRNA solutionとした。
３） RNAの逆転写と増幅 10μｌのRNA solutionに逆転写用mixture2)およびH2
Oを加え90μｌとした。65℃で５分放置後室温に戻し１
μｌのＭ−MLV transcriptase（BRL;200units/μｌ）を
加え37℃で60分インキュベートした。65℃で10分放置
後、10μｌのPCR mixture3)を加えた。92℃ 2min de
nature後、92℃ 2min,55℃1.5min,72℃ 2min,で35cyc
le増幅後、8min72℃でextensionを行った。
Oを加え90μｌとした。65℃で５分放置後室温に戻し１
μｌのＭ−MLV transcriptase（BRL;200units/μｌ）を
加え37℃で60分インキュベートした。65℃で10分放置
後、10μｌのPCR mixture3)を加えた。92℃ 2min de
nature後、92℃ 2min,55℃1.5min,72℃ 2min,で35cyc
le増幅後、8min72℃でextensionを行った。
４） HPA法による検出 ファルコンチューブ（カタログNo.2053）にプローブ
液4)を50μｌ（約1000000RLUs）ずつ、壁に付かないよ
うに分注した。増幅したサンプルを95℃で３分間処理
後、氷上に戻し５μｌずつ加え撹拌した。60℃で正確に
15分間インキュベート後、selection reagent5)を200μ
ｌずつ分注し、さらに15分間インキュベートした。
液4)を50μｌ（約1000000RLUs）ずつ、壁に付かないよ
うに分注した。増幅したサンプルを95℃で３分間処理
後、氷上に戻し５μｌずつ加え撹拌した。60℃で正確に
15分間インキュベート後、selection reagent5)を200μ
ｌずつ分注し、さらに15分間インキュベートした。
（注）1)solution D;4M guanidine thiocyanate,25mM s
odium citrate pH7 0.5％ salukosyl,0.1M 2ME 2)逆転写用mixture;1μl random primer（0.5μg
/μｌ）宝酒造２μl 10mM dNTP mixture宝酒造10mM 10
×PCR Buffer（100mM Tris−HCl pH8.3,500mM KCl,25mM
MgCl2） 3)PCR mixture;2.5μl primer14（20pmol/μｌ）
［prmer−14:5′TGG GGA CAC CCG ACC ACG TTT C−
３′］2.5μl primer15（20pmol/μｌ）［primer15:5′
−CTC GCC GCT GCA CTG TGA AGC T−３′ 4.5μl dH20,
0.05μl ampli−Taq宝酒造 4)プローブ液;hybridization solutionとtranspo
rt madiaを１対１に混合しプローブを希釈したものhybr
idization solution;0.2M lith−ium succinate pH5.2
18％ lithium lauryl sulfate,2mM EDTA/EGTA tarnspo
rt media;6％ lithium laurylsulfate,60mM sodium pho
sphate buffer pH6.8,2mM EDTA/EGTA 5)selection reagent;0.2M sodium tetraborate
pH7.6,5％ Triton X−100 ＜結果および考察＞ 結果を第３表に示した。H2Oの値を陰性コントロール
として、陰性コントロールに比較して５倍以上の化学発
光量（RLUs）を示すものを陽性とした。第１図〜第３図
の配列図を参照して、第４表に推定される型を示した。
さらに比較のために従来の血清学的型判定による結果も
示した。表から分かるように、HPA法の結果は血清学的
な方法と完全に一致した。このようにHPA法を用いるこ
とで、遺伝子をヘテロに持つ末梢血リンパ球用いた型判
定も可能であることが確かめられた。また血清学的判定
はこれ以上詳しい型判定を行うことができないが、HPA
法ではさらにプローブを増やすことでより詳細な型判定
が可能である。
odium citrate pH7 0.5％ salukosyl,0.1M 2ME 2)逆転写用mixture;1μl random primer（0.5μg
/μｌ）宝酒造２μl 10mM dNTP mixture宝酒造10mM 10
×PCR Buffer（100mM Tris−HCl pH8.3,500mM KCl,25mM
MgCl2） 3)PCR mixture;2.5μl primer14（20pmol/μｌ）
［prmer−14:5′TGG GGA CAC CCG ACC ACG TTT C−
３′］2.5μl primer15（20pmol/μｌ）［primer15:5′
−CTC GCC GCT GCA CTG TGA AGC T−３′ 4.5μl dH20,
0.05μl ampli−Taq宝酒造 4)プローブ液;hybridization solutionとtranspo
rt madiaを１対１に混合しプローブを希釈したものhybr
idization solution;0.2M lith−ium succinate pH5.2
18％ lithium lauryl sulfate,2mM EDTA/EGTA tarnspo
rt media;6％ lithium laurylsulfate,60mM sodium pho
sphate buffer pH6.8,2mM EDTA/EGTA 5)selection reagent;0.2M sodium tetraborate
pH7.6,5％ Triton X−100 ＜結果および考察＞ 結果を第３表に示した。H2Oの値を陰性コントロール
として、陰性コントロールに比較して５倍以上の化学発
光量（RLUs）を示すものを陽性とした。第１図〜第３図
の配列図を参照して、第４表に推定される型を示した。
さらに比較のために従来の血清学的型判定による結果も
示した。表から分かるように、HPA法の結果は血清学的
な方法と完全に一致した。このようにHPA法を用いるこ
とで、遺伝子をヘテロに持つ末梢血リンパ球用いた型判
定も可能であることが確かめられた。また血清学的判定
はこれ以上詳しい型判定を行うことができないが、HPA
法ではさらにプローブを増やすことでより詳細な型判定
が可能である。
以上によりHPA法を用いることで従来の方法に比較し
て簡便かつ詳細な型判定が可能となった。
て簡便かつ詳細な型判定が可能となった。
［実施例３］ Genomic DNAを用いた型判定法 HLA DRの型判定を詳細に行う場合、DRB1遺伝子の第
2,第３の超可変域を検出するプローブが必要であり、こ
の領域には類似遺伝子と一致する塩基配列が多く存在す
るため、mRNAを用いる必要性があり、その事実を述べ
た。
2,第３の超可変域を検出するプローブが必要であり、こ
の領域には類似遺伝子と一致する塩基配列が多く存在す
るため、mRNAを用いる必要性があり、その事実を述べ
た。
しかし、HLA DRB1の第１超可変域やDQおよびDPの超
可変域の塩基配列は、類似遺伝子のそれとは大きく異な
っているため、この領域を対象とする場合、genomic DN
Aを用いることが可能である。
可変域の塩基配列は、類似遺伝子のそれとは大きく異な
っているため、この領域を対象とする場合、genomic DN
Aを用いることが可能である。
１） プローブの作製 HLA DRB1型判定に用いたプローブは、DR4に相補的な
P10とDR11に相補的なP11を用いた。またDQB型判定にはD
Qw7に相補的なPQ1およびDQw3（DQw7,8,9）に相補的なPQ
2を実施例１と同様に作製した。
P10とDR11に相補的なP11を用いた。またDQB型判定にはD
Qw7に相補的なPQ1およびDQw3（DQw7,8,9）に相補的なPQ
2を実施例１と同様に作製した。
（注）＊：アミノリンカー ２） Genomic DNAの抽出と増幅 検討にはDR4とDQw3をホモに持つTHOと、DR11とDQw7を
ホモに持つBM21の２種のHTCを用いた。HTCは10％FCSを
含むRPMI−1640培地で培養し、５×106〜107の細胞をPB
Sで二回洗浄し、Nucleic Acid Extractor Model 340A
（Applied Biosystems社）でgenomic DNAを抽出した。
ホモに持つBM21の２種のHTCを用いた。HTCは10％FCSを
含むRPMI−1640培地で培養し、５×106〜107の細胞をPB
Sで二回洗浄し、Nucleic Acid Extractor Model 340A
（Applied Biosystems社）でgenomic DNAを抽出した。
抽出したgenomic DNA １μｇに、下記の増幅用プラ
イマーを50pmolずつ、dNTRを20mM,10×PCR Bufferを10
μl,0.5μl Ampli−Taqに加え100μｌとした。92℃ ２
分denatureした後、92℃２分,55℃1.5分,72℃２分で35
サイクル増幅後、72℃で８分間extensionを行った。
イマーを50pmolずつ、dNTRを20mM,10×PCR Bufferを10
μl,0.5μl Ampli−Taqに加え100μｌとした。92℃ ２
分denatureした後、92℃２分,55℃1.5分,72℃２分で35
サイクル増幅後、72℃で８分間extensionを行った。
３） HPA法による検出 実施例２と同様に行った。
＜結果および考察＞ 測定結果を第５表に示す。
（注）値はRLUsを表す。
P10を用いた場合、RLUs値は完全に相補的な配列を持
つTHOでは陰性コントロール（H2O）に比べて有意に高
く、ミスマッチのあるBM21では陰性コントロール値より
低い値であった。一方、P11を用いた場合RLUs値は完全
に相補的な配列を持つBM21で高く、ミスマッチのあるTH
Oは陰性コントロール値と同様であった。
つTHOでは陰性コントロール（H2O）に比べて有意に高
く、ミスマッチのあるBM21では陰性コントロール値より
低い値であった。一方、P11を用いた場合RLUs値は完全
に相補的な配列を持つBM21で高く、ミスマッチのあるTH
Oは陰性コントロール値と同様であった。
PQ1を用いた場合は、完全に相補的な配列を持つBM21
のRLUs値は高いが、ミスマッチのあるTHOでは陰性コン
トロール値以下であった。さらに、PQ2を用いた場合は
相補的な配列を持つTHO,BM21とも陰性コントロール値に
比べて高い値を示した。
のRLUs値は高いが、ミスマッチのあるTHOでは陰性コン
トロール値以下であった。さらに、PQ2を用いた場合は
相補的な配列を持つTHO,BM21とも陰性コントロール値に
比べて高い値を示した。
以上のように、genomic DNAを用いて、DRB1の一部とD
Q,DPの型判定が可能である。
Q,DPの型判定が可能である。
本発明方法によるヒト白血球の型判定法（HPA法）と
従来の型判定法（血清学的方法および細胞学的方法）と
の比較を一覧表として第６表に示す。
従来の型判定法（血清学的方法および細胞学的方法）と
の比較を一覧表として第６表に示す。
［産業上の利用可能性］ 上述した本発明のHLA型判定法によれば、今まで血清
学的に不可能であった、DRのサブタイプの型判定が可能
となっただけではなく、現在試みられている遺伝子によ
る型判定の問題点をすべて解決できた。この方法を用い
ることで、遺伝子をホモに持つHTCだけではなく、遺伝
子をヘテロに持つ末梢血リンパを用いた型判定も可能で
ある。また、この方法は、DRだけでなくDQ,DPなどのク
ラスII遺伝子や、A,B,CなどのクラスＩ遺伝子の判定に
も応用可能である。したがって、本発明方法は臨床化学
分析の技術分野においてその利用が大いに期待される。
学的に不可能であった、DRのサブタイプの型判定が可能
となっただけではなく、現在試みられている遺伝子によ
る型判定の問題点をすべて解決できた。この方法を用い
ることで、遺伝子をホモに持つHTCだけではなく、遺伝
子をヘテロに持つ末梢血リンパを用いた型判定も可能で
ある。また、この方法は、DRだけでなくDQ,DPなどのク
ラスII遺伝子や、A,B,CなどのクラスＩ遺伝子の判定に
も応用可能である。したがって、本発明方法は臨床化学
分析の技術分野においてその利用が大いに期待される。
フロントページの続き (56)参考文献 国際公開89／2476（ＷＯ，Ａ１) 国際公開89／2933（ＷＯ，Ａ１) Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．35, Ｎｏ．８（1989）ｐ．1588−1594 Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ. 27，Ｎｏ．１（1990．Ｊａｎ．）ｐ．40 −50 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】一般式 （式中、X1はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式 を示す。 R1は炭素数１〜10の脂肪族炭化水素鎖を、 はX1の保護基を示す。但し、ｍはR2がとり得る１〜３の
整数を示し、R2は、（R2）ｍ−Ｃ−がX1を保護するよう
な電子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原
子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいは
これらの組み合わせである。又ｎは１又は２を示すが、
X1がＳ原子である時はｎは１を示し、X1がアミノ基であ
る時はｎは１又は２を示す。X2ハロゲン原子又は置換基
を有するアミノ基を、X3はハロゲン原子、アミノ基又は
−Ｏ−を、R3はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R4
は低級アルキル基、低級アルコキシ基を示すか、X3が−
Ｏ−の時は水素原子を示す。）で表されるリンカーアー
ムを介して一般式 （式中、R5は置換されていてもよい低級アルキル基、低
級アルケニル基、又はアリール基を、R6、R7は同一又は
異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基、
ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル基、低級アルキル
基、低級アルケニル基、アリール基、置換アセチル基、
置換低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置換アリ
ール基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、 R8は を示す。ｐは０〜10の整数を示す。）で表されるアクリ
ジニウムエステルが標識されている構造を有する標識DN
Aプローブであって、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、試料中のmRNAから作成したcDNAを増幅させた産
物にハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしてい
ないプローブ及びハイブリダイズしているが、その交雑
において一塩基以上のミスマッチを有するプローブの標
識部分を選択的に分解させた後、化学発光量を測定する
ことから成るHLA（ヒト白血球抗原）の型判定法。 - 【請求項２】HLAがクラスII抗原である請求項１記載の
型判定法。 - 【請求項３】HLAがクラスII抗原のDR分子である請求項
２記載の型判定法。 - 【請求項４】以下の工程からなることを特徴とするHLA
の型判定法。 （ａ）試料からmRNAを抽出する工程； （ｂ）抽出したmRNAを逆転写させて、cDNAを作成する工
程； （ｃ）該cDNAを増幅させる工程； （ｄ）アクリジニウムエステルでラベルされた標識DNA
プローブであって、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）かる成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、増幅されたcDNAとハイブリダイズ条件下で、ハ
イブリダイズさせる工程； （ｅ）ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしているが、ぞの交雑において一塩基以上のミス
マッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させ
る工程； （ｆ）残存している化学発光量を測定することにより試
料中のHLAの型を判別する工程。 - 【請求項５】一般式 （式中、X1はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式 を示す。 R1は炭素数１〜10の脂肪族炭化水素鎖を、 はX1の保護基を示す。但し、ｍはR2がとり得る１〜３の
整数を示し、R2は、（R2）ｍ−Ｃ−がX1を保護するよう
な電子吸引性を持つような、１個又は２個以上の炭素原
子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいは
これらの組み合わせである。又ｎは１又は２を示すが、
X1がＳ原子である時はｎは１を示し、X1がアミノ基であ
る時はｎは１又は２を示す。X2はハロゲン原子又は置換
基を有するアミノ基を、X3はハロゲン原子、アミノ基又
は−Ｏ−を、R3はそれぞれ置換されていてもよい低級ア
ルキル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、
R4は低級アルキル基、低級アルコキシ基を示すか、X3が
−Ｏ−の時は水素原子を示す。）で表されるリンカーア
ームを介して一般式 （式中、R5は置換されていてもよい低級アルキル基、低
級アルケニル基、又はアリール基を、R6、R7は同一又は
異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基、
ハロゲン基、ニトロ基、アセチル基、低級アルキル基、
低級アルケニル基、アリール基、置換アセチル基、置換
低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置換アリール
基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基を、R8は を示す。ｐは０〜10の整数を示す。）で表されるアクリ
ジニウムエステルが標識されている構造を有し、偽遺伝
子と相補的にならないような標識DNAプローブであっ
て、下記配列 （配列中、＃はリンカーアームを意味する。）から成る
群より選択される２個若しくはそれ以上の標識DNAプロ
ーブを、試料中のgenomicDNAを増幅させた産物にハイブ
リダイズさせ、次いでハイブリダイズしていないプロー
ブ及びハイブリダイズしているが、その交雑において一
塩基以上のミスマッチを有するプローブの標識部分を選
択的に分解させた後、化学発光量を測定することから成
るHLA（ヒト白血球抗原）の型判定法。 - 【請求項６】HLAがクラスII抗原のDR分子である請求項
５記載の型判定法。 - 【請求項７】以下のプライマー配列 を用いる請求項５記載の型判定法。
- 【請求項８】DNAプローブ長が19〜28merで、かつ該DNA
プローブのTm値が62〜80である請求項１ないし６のいず
れか１項に記載の型判定法。
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|---|---|---|---|
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| PCT/JP1991/000157 WO1991013171A1 (en) | 1990-02-23 | 1991-02-08 | Method of judging type of human leukocyte antigen |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3787352B2 (ja) * | 1987-09-21 | 2006-06-21 | ジェン−プローブ・インコーポレイテッド | ハイブリダイゼーション保護検定 |
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-
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- 1991-02-08 AU AU72111/91A patent/AU7211191A/en not_active Abandoned
- 1991-02-08 EP EP19910903283 patent/EP0519070A4/en not_active Withdrawn
- 1991-02-08 WO PCT/JP1991/000157 patent/WO1991013171A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1991-02-08 JP JP03503829A patent/JP3089033B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-22 ZA ZA911322A patent/ZA911322B/xx unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．８（１９８９）ｐ．１５８８−１５９４ |
| Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１（１９９０．Ｊａｎ．）ｐ．４０−５０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA911322B (en) | 1991-11-27 |
| WO1991013171A1 (en) | 1991-09-05 |
| AU7211191A (en) | 1991-09-18 |
| EP0519070A1 (en) | 1992-12-23 |
| EP0519070A4 (en) | 1993-03-10 |
| JPH03247300A (ja) | 1991-11-05 |
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