JPH0552842A - Ｈｌａ−ｄｐ抗原の型判定法 - Google Patents
Ｈｌａ−ｄｐ抗原の型判定法Info
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- JPH0552842A JPH0552842A JP20946491A JP20946491A JPH0552842A JP H0552842 A JPH0552842 A JP H0552842A JP 20946491 A JP20946491 A JP 20946491A JP 20946491 A JP20946491 A JP 20946491A JP H0552842 A JPH0552842 A JP H0552842A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 （ａ）試料からＤＮＡを抽出し、（ｂ）抽出
したＤＮＡを増幅させ、（ｃ）アクリジニウムエステル
でラベルされたプローブを、増幅されたＤＮＡとハイブ
リダイズ条件下でハイブリダイズさせ、（ｄ）ハイブリ
ダイズしていないプローブ及びハイブリダイズしている
が、その交雑において一塩基以上のミスマッチを有する
プローブの標識部分を選択的に分解させ、（ｅ）残存し
ている化学発光量を測定することにより試料中のヒト白
血球ＤＰ抗原の型を判定する。 【効果】 今まで一般の検査室では行うことが不可能で
あったヒト白血球ＤＰ抗原の型判定を容易にかつ短時間
に行うことができる。
したＤＮＡを増幅させ、（ｃ）アクリジニウムエステル
でラベルされたプローブを、増幅されたＤＮＡとハイブ
リダイズ条件下でハイブリダイズさせ、（ｄ）ハイブリ
ダイズしていないプローブ及びハイブリダイズしている
が、その交雑において一塩基以上のミスマッチを有する
プローブの標識部分を選択的に分解させ、（ｅ）残存し
ている化学発光量を測定することにより試料中のヒト白
血球ＤＰ抗原の型を判定する。 【効果】 今まで一般の検査室では行うことが不可能で
あったヒト白血球ＤＰ抗原の型判定を容易にかつ短時間
に行うことができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臓器等の移植や自己免疫
疾患あるいは薬剤感受性の診断等に重要であるヒトの組
織適合性抗原であるＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃ
ｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ：白血球抗原）の型判定法に関
するものである。
疾患あるいは薬剤感受性の診断等に重要であるヒトの組
織適合性抗原であるＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃ
ｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ：白血球抗原）の型判定法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＨＬＡの型判定法のうち、クラスＩ抗原
のＡ，Ｂ，ＣとクラスＩＩ抗原のＤＲ，ＤＱの各抗原に
ついては血清学的方法、すなわち特異抗体と補体による
リンパ球障害テストにより行われてきた。一方クラスＩ
Ｉ抗原のうちＤ抗原およびＤＰ抗原は各々ＭＬＣ（Ｍｉ
ｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）およ
びＰＬＴ（Ｐｒｉｍｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ）で判定される。
のＡ，Ｂ，ＣとクラスＩＩ抗原のＤＲ，ＤＱの各抗原に
ついては血清学的方法、すなわち特異抗体と補体による
リンパ球障害テストにより行われてきた。一方クラスＩ
Ｉ抗原のうちＤ抗原およびＤＰ抗原は各々ＭＬＣ（Ｍｉ
ｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）およ
びＰＬＴ（Ｐｒｉｍｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ）で判定される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の方法のうちＤＰ
抗原を判定するＰＬＴ法は、クローン化Ｔ細胞を用いた
方法で行うため、特殊性から一般の検査室で行うことが
不可能であった。一方、最近の分子生物学の進歩によ
り、ＤＰ抗原を規定する遺伝子群が明らかにされた。さ
らにこれを特異的に増幅する方法（ＰＣＲ法）も開発さ
れた。これによりＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（増幅後制限酵素
で切断する方法）やＰＣＲ−ＳＳＯ（増幅後32Ｐプロー
ブで検出する方法）が確立され、遺伝子レべルでのＤＰ
抗原の型判定が可能となった。しかしながら前者は制限
酵素による切断や電気泳動に時間がかかり、また後者は
アイソトープを使うこと、一塩基のミスマッチを見分け
ることが難しいことなどからマススクリーニングに用い
ることはできない。このように従来のＤＰ抗原検出系に
おいては、いずれも問題点があった。
抗原を判定するＰＬＴ法は、クローン化Ｔ細胞を用いた
方法で行うため、特殊性から一般の検査室で行うことが
不可能であった。一方、最近の分子生物学の進歩によ
り、ＤＰ抗原を規定する遺伝子群が明らかにされた。さ
らにこれを特異的に増幅する方法（ＰＣＲ法）も開発さ
れた。これによりＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（増幅後制限酵素
で切断する方法）やＰＣＲ−ＳＳＯ（増幅後32Ｐプロー
ブで検出する方法）が確立され、遺伝子レべルでのＤＰ
抗原の型判定が可能となった。しかしながら前者は制限
酵素による切断や電気泳動に時間がかかり、また後者は
アイソトープを使うこと、一塩基のミスマッチを見分け
ることが難しいことなどからマススクリーニングに用い
ることはできない。このように従来のＤＰ抗原検出系に
おいては、いずれも問題点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決して、一塩基の差異も識別できるＨＬＡ−
ＤＰ抗原の型判定法を開発すべく鋭意研究を重ねた結
果、試料から抽出したＤＮＡを材料とし、アクリジニウ
ムエステル（ＡＥ）標識プローブを用いることによっ
て、従来の方法に比較して飛躍的に正確性と簡便性を高
め、さらに検出時間を大幅に短縮することができること
を見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。本発
明者らの開発した方法（ＨＰＡ法：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、ア
イソトープを用いず、一塩基の識別が可能で、操作が迅
速・簡便と現状のＤＮＡアッセイ法の欠点をすべて克服
している。この方法を用いることでＤＰ抗原のマススク
リーニングが初めて可能となった。
問題点を解決して、一塩基の差異も識別できるＨＬＡ−
ＤＰ抗原の型判定法を開発すべく鋭意研究を重ねた結
果、試料から抽出したＤＮＡを材料とし、アクリジニウ
ムエステル（ＡＥ）標識プローブを用いることによっ
て、従来の方法に比較して飛躍的に正確性と簡便性を高
め、さらに検出時間を大幅に短縮することができること
を見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。本発
明者らの開発した方法（ＨＰＡ法：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）は、ア
イソトープを用いず、一塩基の識別が可能で、操作が迅
速・簡便と現状のＤＮＡアッセイ法の欠点をすべて克服
している。この方法を用いることでＤＰ抗原のマススク
リーニングが初めて可能となった。
【０００５】本発明の一方法は一般式（Ｉ）に示すリン
カーアームを介して、一般式（ＩＩ）に示すアクリジニ
ウムエステルが標識されている標識プローブを用いるＨ
ＬＡの型判定法である。すなわち、「一般式（Ｉ）： （式中、Ｘ1 はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式
カーアームを介して、一般式（ＩＩ）に示すアクリジニ
ウムエステルが標識されている標識プローブを用いるＨ
ＬＡの型判定法である。すなわち、「一般式（Ｉ）： （式中、Ｘ1 はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式
【０００６】 Ｒ1 は炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素鎖を、 の整数を示し、Ｒ2 は、（Ｒ2 ）m −Ｃ−がＸ1 を保護
するような電子吸引性を持つような、１個又は２個以上
の炭素原子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、
あるいはこれらの組合せである。又、ｎは１又は２を示
すが、Ｘ1 がＳ原子である時はｎは１を示し、Ｘ1 がア
ミノ基である時はｎは１又は２を示す。Ｘ2 はハロゲン
原子又は置換基を有するアミノ基を、Ｘ3 はハロゲン原
子、アミノ基又は−Ｏ−を、Ｒ3 はそれぞれ置換されて
いてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリ
ールオキシ基を、Ｒ4 は低級アルキル基、低級アルコキ
シ基を示すか、Ｘ3 が−Ｏ−の時は水素原子を示す。）
で表されるリンカーアームを介して一般式（ＩＩ）：
するような電子吸引性を持つような、１個又は２個以上
の炭素原子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、
あるいはこれらの組合せである。又、ｎは１又は２を示
すが、Ｘ1 がＳ原子である時はｎは１を示し、Ｘ1 がア
ミノ基である時はｎは１又は２を示す。Ｘ2 はハロゲン
原子又は置換基を有するアミノ基を、Ｘ3 はハロゲン原
子、アミノ基又は−Ｏ−を、Ｒ3 はそれぞれ置換されて
いてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリ
ールオキシ基を、Ｒ4 は低級アルキル基、低級アルコキ
シ基を示すか、Ｘ3 が−Ｏ−の時は水素原子を示す。）
で表されるリンカーアームを介して一般式（ＩＩ）：
【０００７】
【０００８】（式中、Ｒ5 はそれぞれ置換されていても
よい低級アルキル基、低級アルケニル基、又はアリール
基を、Ｒ6 ，Ｒ7 は同一又は異なって、水素原子、アミ
ノ基、水酸基、チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、
置換されていてもよいアセチル基、置換されていてもよ
い低級アルキル基、置換されていてもよい低級アルケニ
ル基、置換されていてもよいアリール基、低級アルコキ
シ基又はアリールオキシ基を、Ｒ8 は
よい低級アルキル基、低級アルケニル基、又はアリール
基を、Ｒ6 ，Ｒ7 は同一又は異なって、水素原子、アミ
ノ基、水酸基、チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、
置換されていてもよいアセチル基、置換されていてもよ
い低級アルキル基、置換されていてもよい低級アルケニ
ル基、置換されていてもよいアリール基、低級アルコキ
シ基又はアリールオキシ基を、Ｒ8 は
【０００９】
【００１０】を示す。ｐは０〜１０の整数を示す。）が
標識されている構造を有する標識プローブを、試料中の
ＤＮＡを増幅させた産物にハイブリダイズさせ、次いで
ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリダイズ
しているが、その交雑において一塩基以上のミスマッチ
を有するプローブの標識部分を選択的に分解させた後、
化学発光量を測定することから成るＨＬＡ−ＤＰ抗原の
型判定法」である。
標識されている構造を有する標識プローブを、試料中の
ＤＮＡを増幅させた産物にハイブリダイズさせ、次いで
ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリダイズ
しているが、その交雑において一塩基以上のミスマッチ
を有するプローブの標識部分を選択的に分解させた後、
化学発光量を測定することから成るＨＬＡ−ＤＰ抗原の
型判定法」である。
【００１１】本発明の他の一方法は次の通りである。
【００１２】「一般式（Ｉ）で表されるリンカーアーム
を結合させたプローブに、一般式（ＩＩ）で表されるア
クリジニウムエステルを標識させた標識プローブを、試
料中のＤＮＡを増幅させた産物にハイブリダイズさせ、
次いでハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしているが、その交雑において一塩基以上のミス
マッチを有するプローブを選択的に分解させることを特
徴とするＨＬＡ−ＤＰ抗原の型判定法」である。
を結合させたプローブに、一般式（ＩＩ）で表されるア
クリジニウムエステルを標識させた標識プローブを、試
料中のＤＮＡを増幅させた産物にハイブリダイズさせ、
次いでハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしているが、その交雑において一塩基以上のミス
マッチを有するプローブを選択的に分解させることを特
徴とするＨＬＡ−ＤＰ抗原の型判定法」である。
【００１３】本発明の更に別の方法は次の通りである。
【００１４】「以下の工程からなることを特徴とするＨ
ＬＡ−ＤＰ抗原の型判定法。
ＬＡ−ＤＰ抗原の型判定法。
【００１５】（ａ）試料からＤＮＡを抽出する工程； （ｂ）抽出したＤＮＡを増幅させる工程； （ｃ）アクリジニウムエステルでラベルされたプローブ
を、増幅されたＤＮＡとハイブリダイズ条件下で、ハイ
ブリダイズさせる工程； （ｄ）ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしているが、その交雑において一塩基以上のミス
マッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させ
る工程； （ｅ）残存している化学発光量を測定することにより試
料中のＨＬＡ−ＤＰ抗原の型を判別する工程。」 以下、本発明によるＨＬＡ−ＤＰ抗原の型判定法につい
て詳細に説明する。
を、増幅されたＤＮＡとハイブリダイズ条件下で、ハイ
ブリダイズさせる工程； （ｄ）ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしているが、その交雑において一塩基以上のミス
マッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させ
る工程； （ｅ）残存している化学発光量を測定することにより試
料中のＨＬＡ−ＤＰ抗原の型を判別する工程。」 以下、本発明によるＨＬＡ−ＤＰ抗原の型判定法につい
て詳細に説明する。
【００１６】現在までに報告されたＤＰＢ１遺伝子の２
ｎｄエクソンの塩基配列を図１〜図３に示した。ＤＰＢ
１遺伝子上の変異はこの領域に集中しており、この塩基
配列の差異を識別することでＤＰの型判定が可能であ
る。
ｎｄエクソンの塩基配列を図１〜図３に示した。ＤＰＢ
１遺伝子上の変異はこの領域に集中しており、この塩基
配列の差異を識別することでＤＰの型判定が可能であ
る。
【００１７】ＤＮＡの抽出は、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ
で細胞を破した後フェノール抽出を行う（ｍｏｌｅｃｕ
ｌｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ．ａ
ｌ．）一般的な方法で行うことができる。
で細胞を破した後フェノール抽出を行う（ｍｏｌｅｃｕ
ｌｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ．ａ
ｌ．）一般的な方法で行うことができる。
【００１８】ＤＮＡを増幅させる方法としては、ＰＣＲ
法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）や、Ｔ７ポリメラーゼと逆転写酵素を用いる方法
等を挙げることができる。このＴ７ポリメラーゼと逆転
写酵素を用いる方法とは、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性
させ、プライマー（増幅させるＤＮＡ領域を挟んで、＋
鎖、−鎖に相補的な配列とＴ７プロモーター領域に相補
的な配列を合わせ持つオリゴヌクレオチド）を結合させ
リボヌクレオチド３リン酸、デオキシリボヌクレオチド
３リン酸、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ及び酵素に必
要な塩を含む緩衝液を加える。次いで、３７℃で数分間
インキュベートし、高温（約９５℃）で変性した後、室
温に戻し、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ及びＲＮａｓ
ｅＨを含む緩衝液を加え、さらに３７℃で数時間インキ
ュベートする方法である。
法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）や、Ｔ７ポリメラーゼと逆転写酵素を用いる方法
等を挙げることができる。このＴ７ポリメラーゼと逆転
写酵素を用いる方法とは、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性
させ、プライマー（増幅させるＤＮＡ領域を挟んで、＋
鎖、−鎖に相補的な配列とＴ７プロモーター領域に相補
的な配列を合わせ持つオリゴヌクレオチド）を結合させ
リボヌクレオチド３リン酸、デオキシリボヌクレオチド
３リン酸、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ及び酵素に必
要な塩を含む緩衝液を加える。次いで、３７℃で数分間
インキュベートし、高温（約９５℃）で変性した後、室
温に戻し、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ及びＲＮａｓ
ｅＨを含む緩衝液を加え、さらに３７℃で数時間インキ
ュベートする方法である。
【００１９】ＰＣＲ法で用いるプライマーは、プローブ
で検出する超可変域が増幅されるように定めたものを用
いることができ、長さは２０−２５ｍｅｒのものが好ま
しい。
で検出する超可変域が増幅されるように定めたものを用
いることができ、長さは２０−２５ｍｅｒのものが好ま
しい。
【００２０】一方、検出用のプローブは核酸合成機（ア
プライド バイオシステム社製、モデル３８０Ｂ）によ
り合成できる。プローブは超可変部が中心になるように
デザインし、その中心にアミノ基をもったリンカーを挿
入する。合成したオリゴヌクレオチドは、定法により精
製を行い、ジメチルスルホキシド及びヘペス等の緩衝液
を含む反応液中で，有機溶媒に溶解した活性エステルを
持つＡＥと混合する。その結果活性エステルが、リンカ
ーのアミノ基と反応し、オリゴヌクレオチドのＡＥラベ
ルが行える。
プライド バイオシステム社製、モデル３８０Ｂ）によ
り合成できる。プローブは超可変部が中心になるように
デザインし、その中心にアミノ基をもったリンカーを挿
入する。合成したオリゴヌクレオチドは、定法により精
製を行い、ジメチルスルホキシド及びヘペス等の緩衝液
を含む反応液中で，有機溶媒に溶解した活性エステルを
持つＡＥと混合する。その結果活性エステルが、リンカ
ーのアミノ基と反応し、オリゴヌクレオチドのＡＥラベ
ルが行える。
【００２１】本発明で用いるプローブは、型判定の結果
が偽陽性となることを防ぐため、一定時間加水分解を行
った後の化学発光量が、陰性のものは陰性コントロール
である水の値まで減衰し、かつ陽性であるものの化学発
光量は、５，０００ＲＬＵｓ（ＲＵＬｓ：Ｒｅｌａｔｉ
ｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｍｉｔｓ，光子の数）以上、好ま
しくは１０，０００ＲＬＵｓ以上となるものを特に選択
する必要がある。発明者は、このような性質をもったプ
ローブの選択について研究を重ねた結果、プローブの長
さ及びＴｍ値〔（ブローブ中の塩基Ｇ及びＣの個数）×
４＋（プローブ中の塩基Ａ及びＴの個数）×２〕がある
一定の範囲にあるものが、ＨＬＡの型判定に特に優れて
いることを発見した。すなわち、プローブの長さが１９
〜２８ｍｅｒであり、かつＴｍ値が６２〜８０、好まし
くは７２前後であるプローブが特に好ましく本発明に用
いられる。プローブの例として、その配列及びＴｍ値を
第１表に記載する。
が偽陽性となることを防ぐため、一定時間加水分解を行
った後の化学発光量が、陰性のものは陰性コントロール
である水の値まで減衰し、かつ陽性であるものの化学発
光量は、５，０００ＲＬＵｓ（ＲＵＬｓ：Ｒｅｌａｔｉ
ｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｍｉｔｓ，光子の数）以上、好ま
しくは１０，０００ＲＬＵｓ以上となるものを特に選択
する必要がある。発明者は、このような性質をもったプ
ローブの選択について研究を重ねた結果、プローブの長
さ及びＴｍ値〔（ブローブ中の塩基Ｇ及びＣの個数）×
４＋（プローブ中の塩基Ａ及びＴの個数）×２〕がある
一定の範囲にあるものが、ＨＬＡの型判定に特に優れて
いることを発見した。すなわち、プローブの長さが１９
〜２８ｍｅｒであり、かつＴｍ値が６２〜８０、好まし
くは７２前後であるプローブが特に好ましく本発明に用
いられる。プローブの例として、その配列及びＴｍ値を
第１表に記載する。
【００２２】
【００２３】これらのプローブに対応する塩基配列は図
１〜図３上に＊印で示した。
１〜図３上に＊印で示した。
【００２４】実際の検出では、増幅させたターゲットを
高温またはアルカリ処理で一本鎖にした後、プローブと
混合し、定法によりハイブリダイゼーションを行う。ハ
イブリダイゼーションは酸性緩衝液中で行い、反応時間
を短縮するためには、リチウム塩を含む酸性緩衝液中で
行い、温度は５０〜７０℃、時間は１〜数十分の間で行
う。ハイブリダイゼーション後は、界面活性剤を含む弱
アルカリ液を加え、ターゲットとプローブの塩基配列が
完全に一致する場合は、アクリジニウムエステルは加水
分解されないが、不一致があると加水分解を受け、化学
発光量が減衰する。
高温またはアルカリ処理で一本鎖にした後、プローブと
混合し、定法によりハイブリダイゼーションを行う。ハ
イブリダイゼーションは酸性緩衝液中で行い、反応時間
を短縮するためには、リチウム塩を含む酸性緩衝液中で
行い、温度は５０〜７０℃、時間は１〜数十分の間で行
う。ハイブリダイゼーション後は、界面活性剤を含む弱
アルカリ液を加え、ターゲットとプローブの塩基配列が
完全に一致する場合は、アクリジニウムエステルは加水
分解されないが、不一致があると加水分解を受け、化学
発光量が減衰する。
【００２５】又、本発明で用いられる一般式（Ｉ）で示
されるリンカーアームは、例えば欧州特許公開ＥＰ０３
１０３１２号に開示されており、一般式（ＩＩ）で示さ
れるＡＥは例えば国際特許出願公開ＷＯ８９／０２４７
６に開示されている。
されるリンカーアームは、例えば欧州特許公開ＥＰ０３
１０３１２号に開示されており、一般式（ＩＩ）で示さ
れるＡＥは例えば国際特許出願公開ＷＯ８９／０２４７
６に開示されている。
【００２６】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するがこれらの記載は本発明を限定するものではな
い。なお、以下の各実施例においては、ＡＥとして次の
構造式で示される化合物を用いた。
明するがこれらの記載は本発明を限定するものではな
い。なお、以下の各実施例においては、ＡＥとして次の
構造式で示される化合物を用いた。
【００２７】
【００２８】化学名 ４−（２−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ
−１０−ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ−９−ｃ
ａｒｂｏｘｙｌａｔｅｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ
ｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ
−１０−ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ−９−ｃ
ａｒｂｏｘｙｌａｔｅｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ
【００２９】
１．プローブ及びプライマーの作成 図１〜図３に示したＰ１〜Ｐ７の７種のプローブを核酸
合成機（アプライドバイオシステムズ社、モデル３８０
Ｂ）で合成した。合成の途中で＃印で示した部位にアミ
ノリンカアーム（Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｉ
Ｉ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｓ）を導入した。
合成機（アプライドバイオシステムズ社、モデル３８０
Ｂ）で合成した。合成の途中で＃印で示した部位にアミ
ノリンカアーム（Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｉ
Ｉ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｓ）を導入した。
【００３０】合成したオリゴヌクレオチドは、ＯＰＣカ
ラム（アプライド社）で精製し、そのうち０．５ＯＤを
真空乾燥後、水４μｌ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）１
μｌ，ＤＭＳＯ３μｌおよびＡＥ２μｌ（０．８ｍｇ／
５０μｌ ＤＭＳＯ）を加え、３７℃で２０分、遮光し
て反応させた。再度、水１．５μｌ，１ＭＨＥＰＥＳ
０．５μｌおよびＡＥ３μｌ加え、上記同様に３７℃で
２０分反応させた。続いて未反応のＡＥをブロックする
ため、１２５μＭ Ｌｙｓｉｎｅ，０．１ＭＨＥＰＥＳ
および５０％ＤＭＳＯを含む混合液を加え、室温で５分
放置した。これをエタノール沈殿させてフリーのＡＥを
除去した。
ラム（アプライド社）で精製し、そのうち０．５ＯＤを
真空乾燥後、水４μｌ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）１
μｌ，ＤＭＳＯ３μｌおよびＡＥ２μｌ（０．８ｍｇ／
５０μｌ ＤＭＳＯ）を加え、３７℃で２０分、遮光し
て反応させた。再度、水１．５μｌ，１ＭＨＥＰＥＳ
０．５μｌおよびＡＥ３μｌ加え、上記同様に３７℃で
２０分反応させた。続いて未反応のＡＥをブロックする
ため、１２５μＭ Ｌｙｓｉｎｅ，０．１ＭＨＥＰＥＳ
および５０％ＤＭＳＯを含む混合液を加え、室温で５分
放置した。これをエタノール沈殿させてフリーのＡＥを
除去した。
【００３１】エタノール沈殿したプローブに水１００μ
ｌ加え、その全量をＴＳＫ ｇｅｌｏｌｉｇｏ ＤＮＡ
ＲＰカラム（東ソー社製、４．６ｍｍ ＩＤ×１５ｃ
ｍＬ）に注入した。また、０．５分間隔で溶出液を分取
し、各フラクションの化学発光量（ＲＬＵ）を測定し、
オリゴヌクレオチドのＡＥラベルが正確に行われている
か確認した。
ｌ加え、その全量をＴＳＫ ｇｅｌｏｌｉｇｏ ＤＮＡ
ＲＰカラム（東ソー社製、４．６ｍｍ ＩＤ×１５ｃ
ｍＬ）に注入した。また、０．５分間隔で溶出液を分取
し、各フラクションの化学発光量（ＲＬＵ）を測定し、
オリゴヌクレオチドのＡＥラベルが正確に行われている
か確認した。
【００３２】なお、このときのＨＰＬＣ条件は次の通り
であった。
であった。
【００３３】溶離液Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡＡ（酢酸トリ
エチルアンモニウム） Ｂ：ＣＨ3 ＣＮ ＣＨ3 ＣＮの濃度勾配 ０→４０％，４０分 流速 １ ｍｌ／ｍｉｎ 検出器 ＵＶ ２６０ｎｍ ｂ）プライマーの作成 プライマーは１１ｔｈ ＨＬＡ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐで公認されている配列を、核
酸合成機（既述）で作成し、プローブと同様に精製し
た。プライマーの配列は以下の通りである。
エチルアンモニウム） Ｂ：ＣＨ3 ＣＮ ＣＨ3 ＣＮの濃度勾配 ０→４０％，４０分 流速 １ ｍｌ／ｍｉｎ 検出器 ＵＶ ２６０ｎｍ ｂ）プライマーの作成 プライマーは１１ｔｈ ＨＬＡ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐで公認されている配列を、核
酸合成機（既述）で作成し、プローブと同様に精製し
た。プライマーの配列は以下の通りである。
【００３４】 プライマー ＤＰＢＡＭＰ−Ａ ５’−ＣＣＴ ＣＣＣ ＣＧＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＴＴＡ Ｃ−３’ ＤＰＢＡＭＰ−Ｂ ５’−ＡＧＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＣＴ ＣＧＧ ＣＧ−３’ ２．ＤＮＡ抽出および増幅 ＨＴＣ（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｔｙｐｉｎｇ ｃｅｌ
ｌ：ＤＲ遺伝子をホモに持つ培養細胞）からのＤＮＡの
抽出 細胞は表２に示した遺伝子を持つＨＴＣを用いた。
ｌ：ＤＲ遺伝子をホモに持つ培養細胞）からのＤＮＡの
抽出 細胞は表２に示した遺伝子を持つＨＴＣを用いた。
【００３５】
【００３６】ＨＴＣは、１０％ ＦＣＳ 加 ＲＰＭＩ
１６４０培地で培養した。５×１０6 〜１０7 の細胞を
ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＮＡ抽出機（アプライド
社）でＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８に溶解
した。次に１μｇのＤＮＡをとり、１０倍ＰＣＲバッフ
ァー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，５
００ｍＭ ＫＣｌ，２５ｍＭ ＤＴＴ）を１０μｌ、１
０ｍＭ ｄＮＴＰを２μｌ、プライマー（ＤＰＢＡＭＰ
−ＡとＤＰＢＡＭＰ−Ｂ）を各々５０ｐｍｏｌ，Ｔａｑ
ポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔを加え蒸留水で１００μｌ
にメスアップし、さらにミネラルオイルを２滴加えた。
これを９６℃で３０秒ディネーチャー後、９６℃６０秒
５５℃６０秒 ７２℃６０秒で４０サイクル反応し、
最後に７２℃５分反応を行った。
１６４０培地で培養した。５×１０6 〜１０7 の細胞を
ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＮＡ抽出機（アプライド
社）でＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８に溶解
した。次に１μｇのＤＮＡをとり、１０倍ＰＣＲバッフ
ァー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，５
００ｍＭ ＫＣｌ，２５ｍＭ ＤＴＴ）を１０μｌ、１
０ｍＭ ｄＮＴＰを２μｌ、プライマー（ＤＰＢＡＭＰ
−ＡとＤＰＢＡＭＰ−Ｂ）を各々５０ｐｍｏｌ，Ｔａｑ
ポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔを加え蒸留水で１００μｌ
にメスアップし、さらにミネラルオイルを２滴加えた。
これを９６℃で３０秒ディネーチャー後、９６℃６０秒
５５℃６０秒 ７２℃６０秒で４０サイクル反応し、
最後に７２℃５分反応を行った。
【００３７】３．ＨＰＡによる検出 ＰＣＲ産物に１／５規定の水酸化ナトリウムを１００μ
ｌ加え５分間放置後、１０μｌずつファルコンチューブ
（カタログＮｏ．２０５３）に分注した。これにプロー
ブ液*1を５０μｌ（１，０００，０００〜１，５００，
０００ＲＬＵｓ）加え、ｖｏｒｔｅｘ後６０℃で１５分
間反応した。これにｓｅｌｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ
*2を２５０μｌずつ分注しｖｏｒｔｅｘ後さらに６０℃
で１５分間反応した。これを室温に戻した後Ｌｅａｄｅ
ｒＩで化学発光量の測定を行った。
ｌ加え５分間放置後、１０μｌずつファルコンチューブ
（カタログＮｏ．２０５３）に分注した。これにプロー
ブ液*1を５０μｌ（１，０００，０００〜１，５００，
０００ＲＬＵｓ）加え、ｖｏｒｔｅｘ後６０℃で１５分
間反応した。これにｓｅｌｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ
*2を２５０μｌずつ分注しｖｏｒｔｅｘ後さらに６０℃
で１５分間反応した。これを室温に戻した後Ｌｅａｄｅ
ｒＩで化学発光量の測定を行った。
【００３８】＊１，プローブ液：プローブをＨｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒに溶かしたもの Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂ：０．１Ｍ ｌｉｔｈ
ｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐＨ５．２ ９％ ｌｉｔｈｉｕｍ ｌａｕｒｙｌｓｕｌｆａｔｅ １ｍＭ ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ ＊２，ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ： ｓｏｄｉｏｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ １８２ｍＭ ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ ６００ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％ ｐＨ ８．５
ｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒに溶かしたもの Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂ：０．１Ｍ ｌｉｔｈ
ｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐＨ５．２ ９％ ｌｉｔｈｉｕｍ ｌａｕｒｙｌｓｕｌｆａｔｅ １ｍＭ ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ ＊２，ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ： ｓｏｄｉｏｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ １８２ｍＭ ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ ６００ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％ ｐＨ ８．５
【００３９】
【結果および考察】結果を表３に示した。１０，０００
ＲＬＵｓ以上の化学発光量を示すものを陽性と判定し
た。プローブとミスマッチのあるものはすべて５０００
ＲＬＵｓ以下であった。
ＲＬＵｓ以上の化学発光量を示すものを陽性と判定し
た。プローブとミスマッチのあるものはすべて５０００
ＲＬＵｓ以下であった。
【００４０】
【００４１】次にプローブとオンプルの相補性と、ＨＰ
Ａの結果の比較を表４に示した。表から分かるようにＨ
ＰＡの結果は予想と完全に一致した。
Ａの結果の比較を表４に示した。表から分かるようにＨ
ＰＡの結果は予想と完全に一致した。
【００４２】
【００４３】
【発明の効果】以上の結果より今まで一般の検査室では
行うことが不可能であったＤＰ抗原の型判定が、本発明
のＨＬＡ型判定法によって容易に短時間に行えるように
なった。
行うことが不可能であったＤＰ抗原の型判定が、本発明
のＨＬＡ型判定法によって容易に短時間に行えるように
なった。
【００４４】この方法が、臓器移植の領域に大きく寄与
することは容易に想像しうる。
することは容易に想像しうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
【図２】
【図３】図１〜図３は、ＨＬＡ−ＤＰ抗原遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列図であり、図１は塩基番号１〜８２に対応す
る塩基配列図、図２は塩基番号８３〜１８１に対応する
塩基配列図、図３は塩基番号１８２〜２８８に対応する
塩基配列図である。
Ａ塩基配列図であり、図１は塩基番号１〜８２に対応す
る塩基配列図、図２は塩基番号８３〜１８１に対応する
塩基配列図、図３は塩基番号１８２〜２８８に対応する
塩基配列図である。
Claims (5)
- 【請求項１】 一般式 （式中、Ｘ1 はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式 Ｒ1 は炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素鎖を、 の整数を示し、Ｒ2 は、（Ｒ2 ）m −Ｃ−がＸ1 を保護
するような電子吸引性を持つような、１個又は２個以上
の炭素原子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、
あるいはこれらの組合せである。又ｎは１又は２を示す
が、Ｘ1 がＳ原子である時はｎは１を示し、Ｘ1 がアミ
ノ基である時はｎは１又は２を示す。Ｘ2 はハロゲン原
子又は置換基を有するアミノ基を、Ｘ3 はハロゲン原
子、アミノ基又は−Ｏ−を、Ｒ3 はそれぞれ置換されて
いてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリ
ールオキシ基を、Ｒ4 は低級アルキル基、低級アルコキ
シ基又はアリールオキシ基を示すか、Ｘ3 が−Ｏ−の時
は水素原子を示す。）で表されるリンカーアームを介し
て一般式 （式中、Ｒ5 はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルケニル基、又はアリール基を、Ｒ6 ，
Ｒ7 は同一又は異なって、水素原子、アミノ基、水酸
基、チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル
基、低級アルキル基、低級アルケニル基、アリール基、
置換アセチル基、置換低級アルキル基、置換低級アルケ
ニル基、置換アリール基、低級アルコキシ基又はアリー
ルオキシ基を、Ｒ8 は を示す。ｐは０〜１０の整数を示す。）で表されるアク
リジニウムエステルが標識されている構造を有する標識
プローブを、試料中のＤＮＡを増幅させた産物にハイブ
リダイズさせ、次いでハイブリダイズしていないプロー
ブ及びハイブリダイズしているが、その交雑において一
塩基以上のミスマッチを有するプローブの標識部分を選
択的に分解させた後、化学発光量を測定することから成
るＨＬＡ−ＤＰ抗原（ヒト白血球抗原）の型判定法。 - 【請求項２】 一般式 （式中、Ｘ1 はＳ原子又はアミノ基を、Ｙは式 Ｒ1 は炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素鎖を、 の整数を示し、Ｒ2 は、（Ｒ2 ）m −Ｃ−がＸ1 を保護
するような電子吸引性を持つような、１個又は２個以上
の炭素原子、酸素原子、窒素原子又はハロゲン原子か、
あるいはこれらの組合せである。又ｎは１又は２を示す
が、Ｘ1 がＳ原子である時はｎは１を示し、Ｘ1 がアミ
ノ基である時はｎは１又は２を示す。Ｘ2 はハロゲン原
子又は置換基を有するアミノ基を、Ｘ3 はハロゲン原
子、アミノ基又は−Ｏ−を、Ｒ3 はそれぞれ置換されて
いてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリ
ールオキシ基を、Ｒ4 は低級アルキル基、低級アルコキ
シ基又はアリールオキシ基を示すか、Ｘ3 が−Ｏ−の時
は水素原子を示す。）で表されるリンカーアームを結合
させたプローブに一般式 （式中、Ｒ5 はそれぞれ置換されていてもよい低級アル
キル基、低級アルケニル基、又はアリール基を、Ｒ6 ，
Ｒ7 は同一又は異なって、水素原子、アミノ基、水酸
基、チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル
基、低級アルキル基、低級アルケニル基、アリール基、
置換アセチル基、置換低級アルキル基、置換低級アルケ
ニル基、置換アリール基、低級アルコキシ基又はアリー
ルオキシ基を、Ｒ8 は を示す。ｐは０〜１０の整数を示す。）で表されるアク
リジニウムエステルが標識された標識プローブを、試料
中のＤＮＡを増幅させた産物にハイブリダイズさせ、次
いでハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリダ
イズしているが、その交雑において一塩基以上のミスマ
ッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させる
ことを特徴とするＨＬＡ−ＤＰ抗原（ヒト白血球抗原）
の型判定法。 - 【請求項３】 溶液中に均一に行われることを特徴とす
る請求項１又は２記載の型判定法。 - 【請求項４】 以下の工程からなることを特徴とするＨ
ＬＡ−ＤＰ抗原の型判定法。 （ａ）試料からＤＮＡを抽出する工程； （ｂ）抽出したＤＮＡを増幅させる工程； （ｃ）アクリジニウムエステルでラベルされたプローブ
を、増幅されたＤＮＡとハイブリダイズ条件下で、ハイ
ブリダイズさせる工程； （ｄ）ハイブリダイズしていないプローブ及びハイブリ
ダイズしているが、その交雑において一塩基以上のミス
マッチを有するプローブの標識部分を選択的に分解させ
る工程； （ｅ）残存している化学発光量を測定することにより試
料中のＨＬＡ−ＤＰ抗原の型を判別する工程。 - 【請求項５】 上記（ｃ）工程が溶液中で均一に行われ
ることを特徴とする請求項４記載の型判定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20946491A JPH0552842A (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | Ｈｌａ−ｄｐ抗原の型判定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20946491A JPH0552842A (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | Ｈｌａ−ｄｐ抗原の型判定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0552842A true JPH0552842A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=16573305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20946491A Pending JPH0552842A (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | Ｈｌａ−ｄｐ抗原の型判定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0552842A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995034812A1 (fr) * | 1994-06-16 | 1995-12-21 | Dainabot Co., Ltd. | Procede de dosage d'un anticorps d'une immunoglobuline m specifique et reactif approprie |
-
1991
- 1991-08-21 JP JP20946491A patent/JPH0552842A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995034812A1 (fr) * | 1994-06-16 | 1995-12-21 | Dainabot Co., Ltd. | Procede de dosage d'un anticorps d'une immunoglobuline m specifique et reactif approprie |
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