JPH0530999A - 慢性ｂ型肝炎ウイルスの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒト慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）−ＤＮ
Ａのｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域の点突然変異を高感度に検出
する方法を確立する。 【構成】 リンカーアームを介してアクリジニウムエス
テルを標識したプローブであって、ＨＢＶ−ＤＮＡのｐ
ｒｅ−ｃｏｒｅ領域中の塩基配列に相補的な１８−２５
塩基配列からなるプローブを、試料中のＨＢＶ−ＤＮＡ
又は試料中から抽出しＰＣＲ法によって増幅させたＨＢ
Ｖ−ＤＮＡとハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイ
ズしていないプローブ及びハイブリダイズしているがそ
の交雑において一塩基以上のミスマッチを有するプロー
ブの標識部分を選択的に分解させた後、化学発光量を測
定することによってＨＢＶ−ＤＮＡ及びその点突然変異
を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は慢性Ｂ型肝炎ウイルスの
検出方法およびそのための試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】慢性Ｂ型肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ Ｂ）は肝炎期が数ケ月〜数十年と非常に
長く続き、特にＨＢｅ抗原陽性の肝炎期が長い程、肝硬
変、肝癌等への重篤比例が多くなる。このため、慢性Ｂ
型肝炎の患者においては、ＨＢｅ抗原から抗ＨＢｅ抗体
への移行が、治療における１つの目標となっており、ま
た、効果判定の目安ともなっている。

【０００３】しかし、ＨＢｅ抗体期においても、ＨＢｅ
抗原が検出されないにもかかわらず、ＨＢＶ（ｃｈｒｏ
ｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）−ＤＮ
Ａが検出される場合があり、この点の解明について、多
くの研究がなされていた。そして最近になって、「ある
種の慢性Ｂ型肝炎患者のなかには、肝炎期において、あ
る時期を境としてＨＢｅ抗原が陰性化する場合があり、
このＨＢｅ抗原の陰性化はｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域（１８
１４−１９０１位）の１８９６位と１８９９位の点突然
変異によりおこる。」という報告がなされた（Ｗ．Ｆ．
Ｃａｒｍａｎｅｔ ａｌ．；Ｌａｎｃｅｔ，５８８−５
９０，１９８９）。この報告によると、抗ＨＢｅ抗体陽
性期のＨＢＶ−ＤＮＡのｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域の１８９
６位に点突然変異（Ｇ→Ａ）が起こることにより、スト
ップコドンＴＡＧが生じるため、ＨＢｅ抗原が消失する
と説明されている。

【０００４】また、遺伝子増幅法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋ
ｉ ｅｔ ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７
−４９１（１９８８）；以下“ＰＣＲ法”と略す）等の
遺伝子操作技術を利用して、ＨＢＶ−ＤＮＡについての
研究が種々おこなわれている（例えば、肝臓、３０巻ｓ
ｕｐｐｌ．４８頁；同３１巻 ｓｕｐｐｌ．１６０，１
６２，１６９頁を参照）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記Ｃａｒｍａｎらの
知見を利用すれば、ＨＢＶ−ＤＮＡのｐｒｅ−ｃｏｒｅ
領域の点突然変異を検出することによって慢性Ｂ型肝炎
患者のタイプ分けが可能となる。しかしながら、電気泳
動、ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ法など現存する方法を用いてｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域
の核酸配列を決定することは、非常に時間を要し、多数
の検体処理には不適当であった。簡便かつ正確であり、
しかも多数の検体処理ができる分析法はこれまで提案さ
れていなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ｐｒｅ−
ｃｏｒｅ領域の点突然変異の検出を簡便かつ正確に行う
ことができ、検出時間が少なくて済む方法を開発すべく
鋭意研究を重ねた結果、ＨＰＡ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）法を用い
ることによって、多数の検体を正確かつ簡便に処理する
ことができることを見い出し、この知見に基づいて本発
明を完成した。

【０００７】本発明は、一般式（Ｉ）に示すリンカーア
ームを介して、一般式（II)に示すアクリジニウムエス
テルが標識されている標識プローブを用いるＨＢＶ−Ｄ
ＮＡのｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域における点突然変異検出方
法に関する。すなわち、「一般式 （式中、Ｘ₁は硫黄原子又はアミノ基を、Ｙは式 化水素鎖を、 数を示し、Ｒ₂は（Ｒ₂）_m−Ｃ−Ｘ₁を保護するような電
子吸引性を持つ１個又は２個以上の炭素原子、酸素原
子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいはこれらの組
合せである。ｎは１又は２を示すが、Ｘ₁が硫黄原子で
ある時はｎは１を示し、Ｘ₁がアミノ基である時はｎは
１又は２を示す。Ｘ₂はハロゲン原子又は置換基を有す
るアミノ基を示し、Ｘ₃はハロゲン原子、アミノ基又は
−Ｏ−を示し、Ｒ₃はそれぞれ置換されていてもよい低
級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基
を示し、Ｒ₄は低級アルキル基、低級アルコキシ基又は
アリールオキシ基を示すか、Ｘ₃が−Ｏ−の時は水素原
子を示す。）で表されるリンカーアームを介して一般式

【０００８】

【０００９】（式中Ｒ₅はそれぞれ置換されていてもよ
い低級アルキル基、低級アルケニル基又はアリール基
を、Ｒ₆，Ｒ₇は同一又は異なって、水素原子、アミノ
基、水酸基、チオール基、ハロゲン原子、ニトロ基、ア
セチル基、低級アルキル基、低級アルケニル基、アリー
ル基、置換アセチル基、置換低級アルキル基、置換低級
アルケニル基、置換アリール基、低級アルコキシ基又は
アリールオキシ基を、Ｒ₈は

【００１０】

【００１１】ｐは０〜１０の整数を示す。）で表される
アクリジニウムエステルが標識されている標識プローブ
を、試料中のヒト慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮ
Ａ又は試料中から抽出し、増幅させたＨＢＶ−ＤＮＡと
ハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしていない
プローブ及びハイブリダイズしているがその交雑におい
て一塩基以上のミスマッチを有するプローブの標識部分
を選択的に分解させた後、化学発光量を測定することか
らなるＨＢＶ−ＤＮＡの検出方法。」である。

【００１２】本発明はまた、ＤＮＡ増幅試薬、一般式
（Ｉ）で表されるリンカーアームを介して一般式（II)
で表されるアクリジニウムエステルが標識されている標
識プローブを含むハイブリダイゼーション試薬、及びハ
イブリダイゼーション後の反応液に対するセレクション
試薬を包含することを特徴とする慢性Ｂ型肝炎ウイルス
検出用の試薬キットに関する。

【００１３】本発明によるＨＢＶ−ＤＮＡにおけるｐｒ
ｅ−ｃｏｒｅ領域の点突然変異の検出は、慢性Ｂ型肝炎
患者の血清からＨＢＶ−ＤＮＡを抽出し、得られたＤＮ
Ａをｓｉｎｇｌｅ ＰＣＲ法またはｄｏｕｂｌｅ ＰＣ
Ｒ法を用いて増幅し、ＡＥ（アクリジニウムエステル）
で標識した１８〜２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドをプ
ローブとし、ＨＰＡ法を行うことによって達成される。
この際、ＡＥをプローブの中心付近にある二つの隣接す
る塩基間に結合させると検出の感度が上昇する。

【００１４】以下、本発明方法について詳細に説明す
る。

【００１５】検出用のプローブは核酸合成機（アプライ
ド バイオシステム社製，モデル３８０Ｂ）により合成
できる。プローブは超可変部が中心付近になるようにデ
ザインし、その中心付近にアミノ基をもったリンカーを
挿入する。合成したオリゴヌクレオチドは、常法により
精製を行い、ジメチルスルホキシド及びヘペス等の緩衝
液を含む反応液中で、有機溶媒に溶解した活性エステル
を持つＡＥと混合する。その結果、活性エステルが、リ
ンカーのアミノ基と反応し、オリゴヌクレオチドのＡＥ
ラベルが行える。

【００１６】実際の検出では、増幅させたターゲットを
高温またはアルカリ処理で一本鎖にした後、プローブと
混合し、常法によりハイブリダイゼーションを行う。ハ
イブリダイゼーションは酸性緩衝液中で行い、反応時間
を短縮するためには、リチウム塩を含む酸性緩衝液中で
行い、温度は５０〜７０℃、時間は３〜数十分の間で行
う。ハイブリダイゼーション後は、界面活性剤を含む弱
アルカリ液を加え、ターゲットとプローブの塩基配列が
完全に一致する場合は、アクリジニウムエステルは加水
分解されないが、不一致があると加水分解を受け、化学
発光量が減衰する。

【００１７】又、本発明で用いられる一般式（Ｉ）で示
されるリンカーアームは、例えば欧州特許公開ＥＰ０３
１０３１２号に開示されており、一般式（II)で示され
るＡＥは例えば国際特許出願公開ＷＯ８９／０２４７６
に開示されている。

【００１８】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、これらの記載は本発明を限定するものではな
い。

【００１９】（実施例１） （１）プライマー、プローブの作製 一例として下記の塩基配列を有するプライマー及びプロ
ーブをそれぞれ、トリチルＯＦＦにて上記の核酸合成機
で合成後、８％ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｃ１
８セップパックカラム（ミリポア）にて精製した。

【００２０】アクリジニウムエステル化のためのリンカ
ーは、アミノモディファイヤーII（ＣＬＯＮＴＥＣ）を
用いた。エステル化反応後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２
５（１×ＳＴＥ（ｐＨ６．０））を用いたＳｐｕｎ−Ｃ
ｏｌｕｍｎ法により精製した。

【００２１】

【００２２】

【００２３】（注）ＡＥ：アクリジニウムエステル ＭＯ（野生型），Ｍ１（１塩基置換），Ｍ２ａ〜Ｍ２ｃ
（２塩基置換） 図１にＨＢＶ−ＤＮＡに対する上記プライマー及びプロ
ーブの位置関係を示す。

【００２４】なお、ＡＥ（アクリジニウムエステル）は
例えば次のように、ＭＯプローブ及びＭ１プローブにつ
いてはＨＢＶ−ＤＮＡの１８９５位と１８９６位に対応
するプローブの二つの塩基間に結合していても良い。ま
た、Ｍ２ａ，Ｍ２ｂ及びＭ２ｃプローブについても、プ
ローブの中央付近にある、上記とは異なる二つの隣接す
る塩基間にＡＥを結合させることができる。

【００２５】

【００２６】（２）プライマー及びプローブの特異性の
検討 （i）プライマーの特異性の検討は、ＨＢＶ ｄｓ Ｄ
ＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより、目的のＤＮＡ断片が増
幅されるかどうかを電気泳動により確認することによっ
て行った。ＰＣＲはｓｉｎｇｌｅ又はｄｏｕｂｌｅ Ｐ
ＣＲ法を用い、プライマーの種類、ＫＣｌの濃度及びＨ
ＢＶ患者から得られたＨＢＶを含む血清の添加量を変え
ることによって以下（３）（ii）に記すように９つの条
件を設定して検討した。

【００２７】（ii）プローブの特異性の検討は、ＨＢＶ
ｄｓ ＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲ産物、あるい
はプローブと相補的塩基配列をもつ合成オリゴヌクレオ
チドを用いて行った。ＰＣＲはＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ
１８０１／２０００を用いて１回行った。検出はＨＰＡ
法を用いた。まずＰＣＲ産物を用いて行った結果を表１
に示す。

【００２８】 [表１] Ｒ．Ｌ．Ｕ． ＭＯプロ Ｍ１プロ Ｍ２プロターゲットＤＮＡ ーブ ーブ ーブ ２０ｐｇ ＨＢＶ−ＤＮＡ→ＰＣＲ １４７４５ ２６１０ ３７６４ ２００ｐｇＨＢＶ−ＤＮＡ→ＰＣＲ ２９８８０ ２７４８ ３１５３ ２ｎｇ ＨＢＶ−ＤＮＡ→ＰＣＲ ８６６１３ ２９９０ ３０５４水（対照）→ＰＣＲ ２８０７ ２４３３ ２９９４ （注）１．Ｒ．Ｌ．Ｕ．は、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇ
ｈｔ Ｕｎｉｔの略であり、単位はない。

【００２９】２．用いたターゲットＤＮＡは点突然変異
を起こしていないものである。 以上の結果から、Ｍ０プローブは相補的塩基配列を検出
できることが分かった。またＭ０プローブの検出感度
は、突然変異を起こしていないものに対して濃度依存的
に増加することが明らかとなった。Ｍ１，Ｍ２の両プロ
ーブは、１塩基又は２塩基の点突然変異を起こした標的
ＤＮＡに相補的であり、本実験に用いたＰＣＲ産物は検
出しないことがわかった。

【００３０】次にＭ１プローブに相補的なＤＮＡを用い
た場合の検出結果を表２に示す。

【００３１】 ［表２］ Ｒ．Ｌ．Ｕ． Ｍ１に相補的なオリゴＤＮＡ量 Ｍ０プローブ Ｍ１プローブ １ｐｍｏｌ ７９３７ ２５８６０１ １０^-2ｐｍｏｌ ２６５０ １３１７２ １０^-4ｐｍｏｌ ２６９４ ２３８５ １０^-6ｐｍｏｌ ２７４０ ２５４２ 以上の結果から、Ｍ１プローブの本実験系における検出
限界は標的ＤＮＡ濃度１０^-2ｐｍｏｌであると予想され
た。１０^-2ｐｍｏｌは２００ｂｐのＤＮＡ断片に換算す
ると約１ｎｇとなった。従って、Ｍ１プローブで検出で
きる標的ＤＮＡ量は１ｎｇ以上必要であると推定され
る。

【００３２】このように、Ｍ１プローブは相補的ＤＮＡ
を検出することが分かった。また、Ｍ０プローブではＭ
１に相補的な標的ＤＮＡを検出できないことが分かっ
た。

【００３３】更に、Ｍ２プローブに相補的なＤＮＡを用
いて、検出限界試験を行った。このとき用いたプローブ
は下記のプローブである。

【００３４】

【００３５】試験結果を表３に示す。

【００３６】 表３によれば、Ｍ２プローブは相補的ＤＮＡを検出する
ことができ、その本実験系における検出限界は標的ＤＮ
Ａ濃度３．２ｆｍｏｌと推測された。３．２ｆｍｏｌは
２００ｂｐのＤＮＡ断片に換算すると約０．４２ｎｇと
なった。従って、Ｍ２プローブで検出できる標的ＤＮＡ
量は０．４２ｎｇ以上必要であると推定される。

【００３７】（３）慢性Ｂ型肝炎患者の血清よりＨＢＶ
−ＤＮＡの抽出及び増幅 （i）血清よりＨＢＶ−ＤＮＡの抽出 患者血清５０μｌに０．２Ｎ ＮａＯＨを５０μｌ加え
て混合した後、３７℃１時間加温した。次に５０μｌの
０．２Ｎ ＨＣｌを加え、Ｖｏｌｔｅｘし中和した後、
軽く（〜５０００ｒｐｍ，〜２秒）遠心し、変性した蛋
白を沈澱させた。サンプルは４℃で保存して約１週間以
内に使用した。

【００３８】（ii）抽出したＨＢＶ−ＤＮＡの増幅 上記（i）で作製したサンプル３０μｌをとり、５０μ
ｌの系でＰＣＲを行った。プライマーはＰＲ１７０１／
ＰＲ２０８０セットを用い、各々１ｐｍｏｌ／μｌとな
るように加えた。酵素はＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ／Ａ
ｍｐｔｉ Ｔａｑ^TM）を用いた。反応系の組成は、各２
００μＭ ｄＮＴＰｓ，Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣ
ｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．００１％（ｗ／ｖ）
ｇｅｌａｔｉｎ），２．５Ｕ Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ，各
１μＭプライマーで行い、ミネラルオイルでおおい、反
応を行った。温度サイクルは、９２℃３分加熱後、９２
℃２分，５５℃２分，７２℃１分の３段階の温度変化を
１サイクルとしこれを４０サイクル繰り返し、最後に７
２℃８分間加熱した。Ｄｏｕｂｌｅ ＰＣＲを行う場合
は１回目を上記反応系で行い、２回目のＰＣＲは、ＰＲ
１８０１／ＰＲ２０８０プライマーセットを用いた。２
回目のＰＣＲは、１回目のＰＣＲを終えた反応液５μｌ
を用いた。

【００３９】ＰＣＲにより増幅された断片は、８％ＰＡ
ＧＥ後、ＥｔｄＢｒ（エチジウムブロマイド）でゲルを
染色してからＵＶ下確認した。なお、上記の反応条件は
表４中に示す実験条件ａ）に相当する。

【００４０】同様にして、プライマー、ＫＣｌ量及び血
清添加量を変えることによって、ｂ）〜i）の８つの条
件で増幅を行なった。結果を表４に示す。

【００４１】

【００４２】表４によれば、ＫＣｌの濃度を低下して、
反応系から過剰のＫＣｌを除くことにより、またＨＢＶ
を含む血清の添加量を低下してやることにより、反応系
の感度を上げることができた。最終的にＫＣｌを除き、
ＨＢＶを含む血清の添加量を３０μｌ以下とすることに
よりｄｏｕｂｌｅ ＰＣＲで３ゲノム（３×１０°ｇｅ
ｎｏｍｅ）のＨＢＶ−ＤＮＡを検出できた。

【００４３】（４）ＨＰＡ法を用いた臨床サンプルで
の、ＨＢＶ ｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域の点突然変異の検出 （i）条件ａ）による検出 表４の条件ａ）によるＰＣＲ後の反応液１０μｌをと
り、９５〜１００℃で５分間加熱後、氷中で急冷し、２
０μｌのハイブリダイゼーション溶液（１５μｌの２×
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（注１），
５μｌの２×Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉａ（注
２），１μｌのＡＥラベル化プローブ）を加え、６０℃
１５分間加温した。この反応液４μｌをとり、１００μ
ｌのセレクション試薬（Ｓｅｌｅｅｔｉｏｎ Ｒｅａｇ
ｅｎｔ）を加え、６０℃１０分間加温し、氷冷後、室温
でケミルミネセッセンスを測定した。

【００４４】（注１）２×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ：０．２Ｍ ｌｉｔｈｉｕｍｓｕｃｃｉ
ｎａｔｅ；ｐＨ５．２，１８％ｌｉｔｈｉｕｍ ｌａｕ
ｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；及び２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＥＧ
ＴＡからなる。

【００４５】（注２）２×Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄ
ｉａ：６％ｌｉｔｈｉｕｍ ｌａｕｒｙｌｓｕｌｆａｔ
ｅ；６０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂ
ｕｆｆｅｒ；及びｐＨ６．８，２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＥＧ
ＴＡからなる。

【００４６】結果を表５及び表６に示す。

【００４７】 以上の群からはサンプル番号２，５，６，７，１３，１
４，１５及び１６で点突然変異の起こっていないタイプ
のウイルスのみが検出された（野生型のみ）。

【００４８】 ［表６］ Ｒ．Ｌ．Ｕ． サンプル Ｍ０プロ Ｍ１プロ Ｍ２プロ番号 ーブ ーブ ーブ タイプ １８ ３４１３ ２５２６２ ７６３３ Ｍ１ １９ ３６８０ ２９５０ ９２９４ −− ２０ ３７３５ ３９１６ ３８４３８ Ｍ２ ２１ ６１９６１ ３２５８ ６６５５ Ｍ０ ２２ ３８０９ ３０６８ ６４７２ −− ２３ ４０７７ ３０４４ ６３３２ −− ２４ ３６６６ ３０４７ ６３６８ −− ２５ ６１２４ １６５９９ ６６０９ Ｍ１ ２６ ４０７０ ３０１３ ６５６２ −− ２７ ３３８４ ２９９５ ３３４７７ Ｍ２ ２８ １０５５９７ ３２４２ ６６９６ Ｍ０ ２９ ３３２６ ２７９９ ６４０３ −− ３０ １０９４３８ ３３２５ ６４１７ Ｍ０ ３１（水→ＰＣＲ） ３１３０ ２６７８ ６２６７ −− ３２（水） ２８１５ ２２８３ ６３２４ −− ＨＢＶｄｓＤＮＡ ２２９７１ ２８４７ ６２０１ Ｍ０ →ＰＣＲ サンプル番号３１，３２及びＨＢＶｄｓＤＮＡ→ＰＣＲ
は対照として行ったものである。表６から明らかなよう
に、各サンプルのｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域の点突然変異が
検出できタイプ分けができた。すなわち、Ｍ０型がサン
プル番号２１，２８及び３０であり、Ｍ１型がサンプル
番号１８及び２５であり、Ｍ２型がサンプル番号２０及
び２７である。

【００４９】（ii）条件ｆ）による検出 （i）で用いたサンプルとは別の臨床サンプルを表４の
条件ｆ）によりＰＣＲ化した後、反応液１０μｌをと
り、以下（i）の場合と同様に処理してケミルミネッセ
ンスを測定した。結果を表７及び表８に示す。

【００５０】 [表７] Ｒ．Ｌ．Ｕ． サンプル Ｍ０プロ Ｍ１プロ Ｍ２プロ番号 ーブ ーブ ーブ タイプ ３３ ５１５１６９ ４９００１ ５９１３２ Ｍ０／Ｍ１／Ｎ２ ３４ ４１５２５１ １２２２ ７０３ Ｍ０ ３５ ５２６３７６ １７２６ １３７２ Ｍ０ ３６ ５６１２２５ ３０８２２ ３５２５９ Ｍ０／Ｍ１／Ｍ２ ３７ ５４４９８７ １６３４ １１４５ Ｍ０ ３８ ５０７１２２ １２７３ ７５０ Ｍ０ ３９ ３９０８５４ ２２４２ ５０９９ Ｍ０／Ｍ２ ４０ １２９７ ４７８１６ ５９３５９ Ｍ１／Ｍ２対照 ２５７ ８３５ ４５９ [表８] Ｒ．Ｌ．Ｕ． サンプル Ｍ０プロ Ｍ１プロ Ｍ２プロ番号 ーブ ーブ ーブ タイプ ４１ ３４４０５４ ６５５ ６５５ Ｍ０ ４２ １４８１０２ １２６８ １５６９ Ｍ０ ４３ ２６８ ７９５ ２４８００ Ｍ２ ４４ ４６０９５６ ４７３５９ ４５９６８ Ｍ０／Ｍ１／Ｍ２ ４５ ５３４２５９ ８３３ ７１２ Ｍ０ ４６ ２９０１６９ ６９８ ４５２ Ｍ０ ４７ ３４４１１９ ７３６ ４７５ Ｍ０ ４８ ３１３１５１ １１４２ １３１８ Ｍ０ ４９ １２３０７３ １１９１ １１２２ Ｍ０ ５０ ２５０１８４ ８３０ ５８５ Ｍ０ ５１ １５９５７ １２３４ ４９４ Ｍ０ ５２ ５１４２６６ １００７ １００９ Ｍ０ ５３ ２４４１９０ ６１０ ４５４ Ｍ０ ５４ ３３６９３０ ２７９３ ４７７７ Ｍ０／Ｍ２ ５５ ６３７９３ １０８８０ ９７６５ Ｍ０／Ｍ１／Ｍ２対照 １９８ ５０５ ２５３ 表７及び表８から明らかなように条件ｆ）による場合も
各サンプルのｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域の点突然変異が検出
できタイプ分けができた。すなわち、Ｍ０型がサンプル
番号３４，３５，３７，３８，４１，４２及び４５〜５
３であり、Ｍ２型がサンプル番号４３であり、Ｍ０／Ｍ
２型がサンプル番号３９及び５４であり、Ｍ１／Ｍ２型
がサンプル番号４０であり、Ｍ０／Ｍ１／Ｍ２型がサン
プル番号３３，３６，４４及び５５である。

【００５１】（iii）条件ｉ）による検出 （i），（ii）で用いたサンプルとは別の臨床サンプル
を表４の条件ｉ）によりＰＣＲ化した後、反応液１０μ
ｌをとり、以下（i）の場合と同様に処理してケミルミ
ネッセンスを測定した。結果を表９に示す。

【００５２】 [表９] Ｒ．Ｌ．Ｕ． サンプル Ｍ０プロ Ｍ１プロ Ｍ２プロ番号 ーブ ーブ ーブ タイプ ５６ １８９０３１ ２２９９ １００７ Ｍ０ ５７ １０２８ ４９８０２ １００９ Ｍ１ ５８ ７８９ １１０４１ ５４１４０ Ｍ１／Ｍ２ ５９ ５１２ ３６２２０ １５２２０ Ｍ１／Ｍ２ ６０ ４９０ ３８８８３ １８８４６ Ｍ１／Ｍ２ ６１ ２０１ ２３０７ １６４２７０ Ｍ２ ６２ ３１３５４ ２９９６ １３１１ Ｍ０ ６３ ２９３ １８７８１ ９１５５ Ｍ１／Ｍ２対照 ２０１ １９０９ ６５２ 表９から明らかなように、条件ｉ）による場合も、各サ
ンプルのｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域の点突然変異を検出でき
タイプ分けができた。すなわち、Ｍ０型がサンプル番号
５６及び６２であり、Ｍ１型がサンプル番号５７であ
り、Ｍ２型がサンプル番号６１であり、Ｍ１／Ｍ２型が
サンプル番号５８〜６０及び６３である。このように、
本発明の検出方法を臨床サンプルに適用するとＨＢＶｐ
ｒｅ−ｃｏｒｅ領域の点突然変異を高感度で検出できる
ことが裏付けられた。

【００５３】（５）ＰＣＲより増幅したＤＮＡ断片の塩
基配列の決定 上記サンプル番号１８，２０，３０の検体について、Ｐ
Ｒ２０００（２０００〜１９８１：（−）鎖）プライマ
ーを用いて電気泳動、オートラジオグラフィー等により
シークエンスを行い塩基配列を決定した。

【００５４】（i）プライマーの５’末端の³²Ｐ標識化
シークエンシンングに用いるプライマーの５’末端を³²
Ｐで標識化した。以下の反応系にて反応を行った。

【００５５】

【００５６】３７℃１５分加温後、９０℃２分間加熱し
氷中急冷した。反応液は−２０℃に貯蔵した。

【００５７】（ii）シークエンシンング反応 シークエンシンング反応はダイデオキシ（ｄｉｄｅｏｘ
ｙ）法で行った。

【００５８】０．５ｐｍｏｌ（２８０ｂｐ＝〜０．１μ
ｇ）のＰＣＲ生成物（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用
いてＳｐｕｎ−ｃｏｌｕｍｎ法により、ＰＣＲ時のプラ
イマーを除去した後、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂存在下エタ
ノール沈澱した）をとり、２ｐｍｏｌの³²Ｐ標識化プラ
イマーを加え、ＴＥを用いて全量を１２μｌにした。こ
のサンプルを９５℃５分間加熱後、氷中急冷し、氷上に
５分間放置した。その後、これをＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ各チュ
ーブに２．８μｌずつ分注し、２．５μｌのＡ，Ｃ，
Ｇ，Ｔ各ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ（シ
ークエナーゼキット）を各チューブに加え、０．４μｌ
の５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ（シークエナー
ゼキット）、０．２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、０．２μ
ｌのＳｅｑｕｅａｓｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １又は２）を
それぞれのチューブに加え、３７℃１０分間保温した。
４μｌのｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シークエナーゼ
キット）を加え、７５〜８５℃で２分間加熱し、氷中急
冷後、各レーン４μｌを電気泳動に供した。電気泳動
は、８％ポリアクリルアミドゲル（８Ｍウレア）で、２
０〜２４ｍＡ、１５００〜２０００Ｖ、約２時間半行っ
た。電気泳動後、ゲルを３ＭＭ濾紙にのせ、ゲル上をラ
ップフィルムでおおい、ゲルドライヤーにて８０℃で吸
引し乾燥した。−１００℃でコダックＸＡＲ−５フィル
ム（コダック社製）を用いてオートラジオグラフィーを
とった。なお、シークエナーゼキットは、“Ｓｅｑｅｎ
ａｓｅＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｕｓｉ
ｎｇ ７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ（ＵＳＲ）”を用い
た。

【００５９】以下に結果を示す。

【００６０】

【００６１】以上により、１８９６，１８９９の各部位
に変異が確認され、ＨＰＡ法により検出した値の信頼性
が確認された。

【００６２】上記塩基配列によりｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域
のタイピングを行うと、サンプル番号１８がＭ１型、サ
ンプル番号２０がＭ２型、サンプル番号３０がＭ０型と
なり、ＨＰＡにより行ったタイピング結果と一致した。

【００６３】慢性Ｂ型肝炎の患者の肝炎期では、ＨＢｅ
抗原陽性から抗ＨＢｅ抗体陽性への移行が見られる。Ｈ
Ｂｅ抗原の消失は、ＨＢＶ遺伝子の１８９６位のＧ→Ａ
への変異により、終止コドン（ＴＡＧ）となることによ
るという仮説が示されている（Ｗ．Ｆ． Ｃａｒｍａｎ
ｅｔ ａｌ．；Ｌａｎｃｅｔ，５８８−５９０，１９
８９）。

【００６４】しかし、病態変化とｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域
の点突然変異との関係及びＨＢｅ抗原陰性へと移行する
過程の詳細は不明である。

【００６５】今回確立したＨＰＡ法による点突然変異の
高感度検出系を用いることにより、ＨＢＶ ｐｒｅ−ｃ
ｏｒｅ領域の部分変異の検出をルーチンワークで行うこ
とが可能となり、慢性Ｂ型肝炎患者の臨床経過の多様性
とＨＢｅ抗原との関連性を知る手掛かりとなるととも
に、突然変異の有無の診断が治療における一つの目安に
なるのではないかと思われる。

【００６６】また、前記の１８９６位と１８９９位の点
突然変異の他に１９１３位と１９１５位にも変異が認め
られたが、これらは今回新たに本発明者らが発見したも
のである。これらの点突然変異と病態変化との関連性
は、今後本実験系を用いることにより明らかになると思
われる。

【００６７】（実施例２）次の薬品類からなるＨＢＶ−
ＤＮＡ検出用試薬キットを作製した。

【００６８】（１）０．２規定ＮａＯＨ ５０μｌ （２）０．２規定ＨＣｌ ５０μｌ （３）増幅試薬（２００μＭ ｄＮＴＰｓ，２００μＭ
Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ
（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭＭｇＣ
ｌ₂，０．００１％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ］，２．
５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ），各１μＭプライマーを含む。） （４）ハイブリダイゼーション試薬（１５μｌの２×Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ，５μｌの２
×Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉａ，１μｌのＡＥ標識
プローブを含む。） （５）セレクション試薬１００μｌ この試薬キットを用いて、慢性Ｂ型肝炎患者の血清を次
のようにして分析した。

【００６９】１． 患者の血清５０μｌに０．２規定Ｎ
ａＯＨを５０μｌ加え混和後、３７℃で１時間放置す
る。

【００７０】２． これに５０μｌの０．２規定ＨＣｌ
を加え混和後、〜５０００ｒｐｍで〜２秒間遠心する
（変性した蛋白は沈澱）。

【００７１】３． この試料３０μｌにミネラルオイル
５０μｌを加え混和し、９５℃で１０分間放置後水冷す
る。

【００７２】４． ５０μｌの増幅試薬を加える。

【００７３】５． ＰＣＲによる増幅を行う。最初に９
２℃で３分間加熱してＤＮＡを変性させた後、９２℃で
２分，５５℃で２分，７２℃で１分を１サイクルとし
て、これを３５〜４０サイクル繰り返し、最後に７２℃
で８分間加熱する。

【００７４】６． ２回目のＰＣＲ（ダブルＰＣＲ）も
５と同じ条件で行うが、この場合には１回目のＰＣＲを
終えた材料を５μｌ用いる。

【００７５】７． ＰＣＲ後の反応液１０μｌを取り、
９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷する。

【００７６】８． ２０μｌのハイブリダイゼーション
試薬を加え、６０℃で１５分間加温する。

【００７７】９． ハイブリダイゼーション後の反応液
４μｌを取り、これに１００μｌのセレクション試薬を
加え、６０℃で１０分間加温する。

【００７８】１０． 氷冷後室温に戻してから、化学発
光を測定する。

【００７９】なお、上記のキットはあくまでも一例であ
って、本発明方法を実施するためには、他に様々なキッ
ト化が考えられる。

【００８０】

【発明の効果】本発明に係るＨＢＶ−ＤＮＡの点突然変
異の検出方法を用いることにより、ＨＢＶ ｐｒｅ−ｃ
ｏｒｅ領域の部分変異の高感度検出をルーチンワークで
簡便に行うことが可能となった。このため、本発明方法
によれば、慢性Ｂ型肝炎患者の臨床経過を容易に診断す
ることができ、適切な治療を行うための手掛かりを提供
することを可能にした。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明方法において用いるプライマー
とプローブのＨＢＶ−ＤＮＡのｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域上
における対応関係を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平尾 彰英 東京都新宿区西新宿１−21−１ 中外製薬 株式会社内

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 （式中、Ｘ₁は硫黄原子又はアミノ基を、Ｙは式 化水素鎖を、 数を示し、Ｒ₂は（Ｒ₂）_m−Ｃ−Ｘ₁を保護するような電
   子吸引性を持つ１個又は２個以上の炭素原子、酸素原
   子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいはこれらの組
   合せである。ｎは１又は２を示すが、Ｘ₁が硫黄原子で
   ある時はｎは１を示し、Ｘ₁がアミノ基である時はｎは
   １又は２を示す。Ｘ₂はハロゲン原子又は置換基を有す
   るアミノ基を示し、Ｘ₃はハロゲン原子、アミノ基又は
   −Ｏ−を示し、Ｒ₃はそれぞれ置換されていてもよい低
   級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基
   を示し、Ｒ₄は低級アルキル基、低級アルコキシ基又は
   アリールオキシ基を示すか、Ｘ₃が−Ｏ−の時は水素原
   子を示す。）で表されるリンカーアームを介して一般式 （式中Ｒ₅はそれぞれ置換されていてもよい低級アルキ
   ル基、低級アルケニル基又はアリール基を、Ｒ₆，Ｒ₇は
   同一又は異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオ
   ール基、ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル基、低級ア
   ルキル基、低級アルケニル基、アリール基、置換アセチ
   ル基、置換低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置
   換アリール基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基
   を、Ｒ₈は ｐは０〜１０の整数を示す。）で表されるアクリジニウ
   ムエステルが標識されている標識プローブを、試料中の
   ヒト慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ又は試料中
   から抽出し、増幅させたＨＢＶ−ＤＮＡとハイブリダイ
   ズさせ、次いでハイブリダイズしていないプローブ及び
   ハイブリダイズしているがその交雑において一塩基以上
   のミスマッチを有するプローブの標識部分を選択的に分
   解させた後、化学発光量を測定することからなるＨＢＶ
   −ＤＮＡの検出方法。
2. 【請求項２】 プローブが、ＨＢＶ−ＤＮＡのｐｒｅ−
   ｃｏｒｅ領域（１８１４−１９０１位）中の塩基配列に
   相補的である請求項１記載の検出方法。
3. 【請求項３】 プローブが１８〜２５塩基配列からなる
   ことを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
4. 【請求項４】 プローブが以下の２０塩基配列からなる
   ことを特徴とする請求項３記載の検出方法。
5. 【請求項５】 標識されたアクリジニウムエステル
   が、プローブの中央付近にある二つの隣接する塩基間に
   結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか
   １項に記載の方法。
6. 【請求項６】 アクリジニウムエステルが、ＨＢＶ−Ｄ
   ＮＡの１８９５位と１８９６位又は１８９６位と１８９
   ７位に対応するプローブの二つの塩基間に結合している
   ことを特徴とする請求項４又は５に記載の検出方法。
7. 【請求項７】 ＨＢＶ−ＤＮＡの塩基配列中の１８９６
   位の塩基が、Ａ（アデニン）に突然変異したＤＮＡをタ
   ーゲットとすることを特徴とする請求項１又は２記載の
   検出方法。
8. 【請求項８】 プローブが以下の２０塩基配列からなる
   ことを特徴とする請求項７記載の検出方法。
9. 【請求項９】 アクリジニウムエステルが、ＨＢＶ−
   ＤＮＡの１８９５位と１８９６位又は１８９６位と１８
   ９７位に対応するプローブの二つの塩基間に結合してい
   ることを特徴とする請求項８記載の検出方法。
10. 【請求項１０】 ＨＢＶ−ＤＮＡの塩基配列中の１８９
    ９位の塩基が、Ａ（アデニン）に突然変異したＤＮＡを
    ターゲットとすることを特徴とする請求項１又は２記載
    の検出方法。
11. 【請求項１１】 ＨＢＶ−ＤＮＡの塩基配列中の１８９
    ６位及び１８９９位の塩基がＡ（アデニン）に突然変異
    したＤＮＡをターゲットとすることを特徴とする請求項
    １又は２記載の検出方法。
12. 【請求項１２】 プローブが１８〜２５塩基配列からな
    ることを特徴とする請求項１０又は１１記載の検出方
    法。
13. 【請求項１３】 プローブが以下の２０塩基配列からな
    ることを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
14. 【請求項１４】 アクリジニウムエステルが、ＨＢＶ
    −ＤＮＡの１８９８位と１８９９位又は１８９９位と１
    ９００位に対応するプローブの二つの塩基間に結合して
    いることを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
15. 【請求項１５】 プローブが以下の２５塩基配列からな
    ることを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
16. 【請求項１６】 アクリジニウムエステルが、ＨＢＶ
    −ＤＮＡの１８９８位と１８９９位又は１８９９位と１
    ９００位に対応するプローブの二つの塩基間に結合して
    いることを特徴とする請求項１５記載の検出方法。
17. 【請求項１７】 次の（１）〜（３）を構成要素として
    包含することを特徴とする慢性Ｂ型肝炎ウイルス検出用
    試薬キット。 （１）増幅試薬 （２）一般式 （式中、Ｘ₁は硫黄原子又はアミノ基を、Ｙは式 化水素鎖を、 数を示し、Ｒ₂は（Ｒ₂）_m−Ｃ−Ｘ₁を保護するような電
    子吸引性を持つ１個又は２個以上の炭素原子、酸素原
    子、窒素原子又はハロゲン原子か、あるいはこれらの組
    合せである。ｎは１又は２を示すが、Ｘ₁が硫黄原子で
    ある時はｎは１を示し、Ｘ₁がアミノ基である時はｎは
    １又は２を示す。Ｘ₂はハロゲン原子又は置換基を有す
    るアミノ基を示し、Ｘ₃はハロゲン原子、アミノ基又は
    −Ｏ−を示し、Ｒ₃はそれぞれ置換されていてもよい低
    級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基
    を示し、Ｒ₄は低級アルキル基、低級アルコキシ基又は
    アリールオキシ基を示すか、Ｘ₃が−Ｏ−の時は水素原
    子を示す。）で表されるリンカーアームを介して一般式 （式中Ｒ₅はそれぞれ置換されていてもよい低級アルキ
    ル基、低級アルケニル基又はアリール基を、Ｒ₆，Ｒ₇は
    同一又は異なって、水素原子、アミノ基、水酸基、チオ
    ール基、ハロゲン原子、ニトロ基、アセチル基、低級ア
    ルキル基、低級アルケニル基、アリール基、置換アセチ
    ル基、置換低級アルキル基、置換低級アルケニル基、置
    換アリール基、低級アルコキシ基又はアリールオキシ基
    を、Ｒ₈は ｐは０〜１０の整数を示す。）で表されるアクリジニウ
    ムエステルが標識されている標識プローブを含有するハ
    イブリダイゼーション試薬 （３）セレクション試薬
18. 【請求項１８】 アクリジニウムエステル標識プローブ
    として次の四種の標識プローブを含む請求項１７記載の
    慢性Ｂ型肝炎ウイルス検出用試薬キット。 （上記式中、ＡＥはアクリジニウムエステルをあらわ
    す）