WO2018180987A1 - 核酸の検出方法 - Google Patents

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WO2018180987A1
WO2018180987A1 PCT/JP2018/011703 JP2018011703W WO2018180987A1 WO 2018180987 A1 WO2018180987 A1 WO 2018180987A1 JP 2018011703 W JP2018011703 W JP 2018011703W WO 2018180987 A1 WO2018180987 A1 WO 2018180987A1
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acid probe
detection
capture
probe
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PCT/JP2018/011703
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岡本　淳
利哉 青野
Original Assignee
東洋紡株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • a technique for detecting nucleic acids is disclosed.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • detection methods agarose electrophoresis, fluorescence (so-called real-time PCR), and nucleic acid chromatography are widely known.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose a gene detection method using a real-time PCR method.
  • Patent Document 3 discloses a gene detection method using nucleic acid chromatography.
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising: (1) preparing a labeled capture nucleic acid probe that hybridizes to the target nucleic acid, and a labeled detection nucleic acid probe that hybridizes to the target nucleic acid; (2) mixing a sample containing a target nucleic acid and a capture nucleic acid probe, and hybridizing the capture nucleic acid probe to the target nucleic acid; (3) mixing a sample containing a target nucleic acid and a detection nucleic acid probe, and hybridizing the detection nucleic acid probe to the target nucleic acid; (4) adding a target nucleic acid hybridized with a capture nucleic acid probe to a reactor in which a capture antibody specifically recognizing the label of the capture nucleic acid probe is immobilized, and binding the target nucleic acid to the capture antibody; (5) washing the reactor and removing the detection nucleic acid probe that is not hybridized to the target nucleic acid; and
  • Item 2. The method according to Item 1, wherein the steps (2) to (4) are carried out in a buffer solution having a pH of 7.6 to 9.0.
  • the capture nucleic acid probe has a region complementary to the target nucleic acid (complementary region) and a nucleic acid region non-complementary to the target nucleic acid (linker region) at the end of the complementary region, and is adjacent to the complementary region of the linker region.
  • Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the end on the non-labeled side is labeled.
  • the detection nucleic acid probe has a region complementary to the target nucleic acid (complementary region) and a nucleic acid region non-complementary to the target nucleic acid (linker region) at the end of the complementary region, and is adjacent to the complementary region of the linker region.
  • Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the end on the non-labeled side is labeled.
  • Item 5. Item 5.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the Tm value of the complementary region of the capture nucleic acid probe is 45 to 75 ° C.
  • Item 8. The method according to any one of Items 1 to 7, wherein the Tm value of the complementary region of the detection nucleic acid probe is 45 to 75 ° C.
  • Item 9. The method according to any one of Items 1 to 8, wherein the label of the capture nucleic acid probe is selected from the group consisting of biotin, DIG (digoxigenin), and a fluorescent substance, and is different from the label of the detection nucleic acid probe.
  • Item 10. Item 10.
  • the label of the detection nucleic acid probe is selected from the group consisting of biotin, DIG (digoxigenin), and a fluorescent substance, and is different from the label of the capture nucleic acid probe.
  • Item 11. The method according to Item 9 or 10, wherein the fluorescent substance is selected from the group consisting of fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, cyanine and its derivatives.
  • the step (6) comprises a step of specifically recognizing the label of the detection nucleic acid probe and binding the labeled detection antibody to the detection nucleic acid probe.
  • the detection antibody label is selected from the group consisting of alkaline phosphatase (ALP) and peroxidase (HRP).
  • Item 14. The method according to Item 12 or 13, wherein the detection antibody is selected from the group consisting of a rabbit antibody, a mouse antibody, and a rat antibody.
  • Item 15. The method according to any one of Items 1 to 14, wherein the reactor to which the capture antibody is immobilized is blocked with a blocking agent selected from the group consisting of casein and Blocking Peptide Fragment (BPF).
  • BPF Blocking Peptide Fragment
  • a system for detecting a target nucleic acid comprising: A labeled capture nucleic acid probe that hybridizes to the target nucleic acid, and a labeled detection nucleic acid probe that hybridizes to the target nucleic acid, Item 16.
  • a means for efficiently detecting a target nucleic acid is provided. Efficient means simple, short time, and / or excellent detection sensitivity. In one embodiment, it is preferred that the preparation from the sample containing the target nucleic acid to the detection of the target nucleic acid is performed within 20 minutes (preferably within 15 minutes or within 10 minutes).
  • the method for detecting the target nucleic acid preferably includes the following steps (1) to (6).
  • a sample containing the target nucleic acid and the capture nucleic acid probe are mixed, and a target is prepared.
  • Step of hybridizing capture nucleic acid probe to nucleic acid (3) Mixing sample containing target nucleic acid and detection nucleic acid probe, and hybridizing detection nucleic acid probe to target nucleic acid (4) Specific recognition of capture nucleic acid probe label A target nucleic acid hybridized with a capture nucleic acid probe is added to a reactor to which a capture antibody to be immobilized is immobilized, and the target nucleic acid is bound to the capture antibody. (5) The reactor is washed and hybridized to the target nucleic acid. (6) a step of detecting a label of the detected nucleic acid probe
  • the type of target nucleic acid to be detected is not particularly limited and can be any nucleic acid.
  • the target nucleic acid include DNA, RNA, a hybrid strand of DNA and RNA, and artificial nucleic acid.
  • the target nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. In one embodiment, the nucleic acid is preferably single stranded. When the nucleic acid is double-stranded, it is preferable to perform heat treatment for dissociating into single-stranded nucleic acid.
  • the DNA can be, for example, cDNA, genomic DNA, or synthetic DNA.
  • the RNA can be, for example, rRNA, tRNA, mRNA, total RNA, hnRNA, or synthetic RNA.
  • Artificial nucleic acids include, for example, peptide nucleic acids, morpholino nucleic acids, methyl phosphonate nucleic acids, S-oligonucleic acids, and BNA (LNA).
  • the origin of the nucleic acid is also arbitrary and is not particularly limited.
  • the nucleic acid can be derived from, for example, a virus, a microorganism, a plant, or an animal. Animals include human and non-human animals.
  • the size (base length) of the target nucleic acid is arbitrary and not particularly limited.
  • the target nucleic acid can be present in any form of sample.
  • Samples include, for example, laboratory organisms, cultured cells, specimens used for clinical tests such as humans and animals (eg, urine, feces, whole blood, plasma, saliva, oral scrapings, nasal fluid, nasal wipes, vagina Wipes, urethral scrapings, etc.), specimens provided for hygiene management (eg, vomit, wipes, food materials, etc.) and specimens provided for environmental measurements (eg, river water, seawater, Soil, collected matter from the air, etc.).
  • specimens include, for example, laboratory organisms, cultured cells, specimens used for clinical tests such as humans and animals (eg, urine, feces, whole blood, plasma, saliva, oral scrapings, nasal fluid, nasal wipes, vagina Wipes, urethral scrapings, etc.), specimens provided for hygiene management (eg, vomit, wipes, food materials, etc.) and specimens provided for environmental measurements (eg, river water, seawater
  • the detection is easier as the concentration of nucleic acid in the sample is higher, but it can be detected even at a lower concentration.
  • the nucleic acid concentration in the sample is preferably 0.01 pM or more, more preferably 0.1 pM or more, and even more preferably 1 pM or more.
  • the upper limit of the concentration of the nucleic acid in the sample is arbitrary, but can be, for example, 1 ⁇ M or less, 100 nM or less, or 10 nM or less.
  • the “labeled capture nucleic acid probe that hybridizes to the target nucleic acid” preferably has a base sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid and is labeled so that it can hybridize to the target nucleic acid.
  • the structure of the capture nucleic acid probe is not particularly limited, and may be any of DNA, RNA, a mixture of DNA and RNA, PNA, BNA (LNA), and any combination thereof. These nucleic acids can be prepared (synthesized) by any method.
  • the size (base length) of the capture nucleic acid probe is arbitrary as long as it can hybridize to the target nucleic acid, and can be designed, for example, in the range of 10 to 40 bases.
  • the size of the capture nucleic acid probe is 11 bases or more, 12 bases or more, 13 bases or more, 14 bases or more, 15 bases or more, 16 bases or more, 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, or 20 It is 39 bases or less, 38 bases or less, 37 bases or less, 36 bases or less, 35 bases or less, 34 bases or less, 33 bases or less, 32 bases or less, 31 bases or less, or 30 bases or less.
  • the base sequence of the capture nucleic acid probe is arbitrary as long as it can hybridize with the target nucleic acid, and does not need to be completely complementary to the base sequence of the target nucleic acid.
  • the base sequence of the capture nucleic acid probe is preferably completely complementary to the base sequence of the target nucleic acid.
  • the region in the target nucleic acid complementary to the base sequence of the capture nucleic acid probe is preferably different (not overlapping) from the region in the target nucleic acid complementary to the base sequence of the detection nucleic acid probe.
  • the positional relationship of the regions recognized by each probe is preferably 10 bases or more away from each other, preferably 20 bases or more away from each other in order to prevent hybridization from being inhibited by steric hindrance between the labels of each probe. Is more preferable, and 30 bases or more are more preferable.
  • the type of labeling of the capture nucleic acid probe is arbitrary, and is preferably a substance through which the capture nucleic acid probe and the target nucleic acid can be immobilized in the reactor.
  • the capture nucleic acid probe label is preferably a substance (antigen) to which an antibody can bind. Examples of such substances include biotin, DIG (digoxigenin), and fluorescent substances.
  • the type of the fluorescent substance is not particularly limited, and includes, for example, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, cyanine and its derivatives, etc., which are widely known in the art.
  • the label is preferably biotin. Nucleic acid labeling using these substances can be performed by any technique.
  • the site labeled on the capture nucleic acid probe is arbitrary.
  • the capture nucleic acid probe is preferably labeled at the 3 'terminal residue or 5' terminal residue of the nucleic acid strand constituting the capture nucleic acid probe.
  • the capture nucleic acid probe is preferably labeled at its 5 'terminal residue.
  • the capture nucleic acid probe has a region complementary to the target nucleic acid (complementary region), and a nucleic acid region non-complementary to the target nucleic acid (linker region) adjacent to the end of the complementary region. It is preferably labeled. In one embodiment, the capture nucleic acid probe is preferably labeled with a terminal residue that is not adjacent to the complementary region of the linker region.
  • the linker region is preferably composed of a base that is non-complementary to the type of base at the corresponding position in the target nucleic acid and does not hybridize with the target nucleic acid.
  • the size of the linker region is not particularly limited, and is preferably 3 to 15 bases, more preferably 3 to 10 bases, and further preferably 3 to 7 bases. If the size of the linker region is 2 bases or less, hybridization may be inhibited due to steric hindrance of the labeling substance. On the other hand, when the size of the linker region is 16 bases or more, not only the cost increases, but also an unexpected secondary structure (steric structure) may be taken, and the hybridization may be inhibited.
  • the capture nucleic acid probe preferably has a Tm value of 45 ° C. or higher and 75 ° C. or lower.
  • the Tm value of the capture nucleic acid probe is preferably 50 ° C. or higher, or 55 ° C. or higher.
  • it is preferable that the Tm value of the capture nucleic acid probe is ⁇ 15 ° C. or less, 10 ° C. or less, or 5 ° C. or less, with respect to the Tm value of the detection nucleic acid probe.
  • the Tm value means a Tm value in a buffer solution for hybridizing the capture nucleic acid probe and the target nucleic acid.
  • the Tm value can be measured by any method, and can be determined, for example, by measuring the absorbance (for example, absorbance at 260 nm) of a buffer solution containing the capture nucleic acid probe and the target nucleic acid.
  • the “labeled detection nucleic acid probe that hybridizes to the target nucleic acid” has a base sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid so that it can hybridize to the target nucleic acid and can detect its presence It is preferable that it is labeled with.
  • the structure of the detection nucleic acid probe is not particularly limited, and may be any of DNA, RNA, a mixture of DNA and RNA, PNA, BNA (LNA), and any combination thereof. These nucleic acids can be prepared (synthesized) by any method.
  • the size (base length) of the detection nucleic acid probe is arbitrary as long as it can hybridize to the target nucleic acid, and can be designed, for example, in the range of 10 to 40 bases.
  • the size of the detection nucleic acid probe is 11 bases or more, 12 bases or more, 13 bases or more, 14 bases or more, 15 bases or more, 16 bases or more, 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more or 20 bases or more, 39 bases or less, 38 bases or less, 37 bases or less, 36 bases or less, 35 bases or less, 34 bases or less, 33 bases or less, 32 bases or less, 31 bases or less, or 30 bases or less.
  • the base sequence of the detection nucleic acid probe is arbitrary as long as it can hybridize with the target nucleic acid, and does not need to be completely complementary to the base sequence of the target nucleic acid.
  • the base sequence of the detection nucleic acid probe is preferably completely complementary to the base sequence of the target nucleic acid.
  • the region in the target nucleic acid complementary to the base sequence of the capture nucleic acid probe is preferably different (not overlapping) from the region in the target nucleic acid complementary to the base sequence of the detection nucleic acid probe.
  • the type of labeling of the detection nucleic acid probe is arbitrary as long as it is a substance that enables detection of the detection nucleic acid probe and the target nucleic acid via it.
  • the label of the detection nucleic acid probe is preferably a substance (antigen) to which an antibody can bind. Examples of such substances include biotin, DIG (digoxigenin), and fluorescent substances.
  • the type of the fluorescent substance is not particularly limited, and includes, for example, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, cyanine and its derivatives, etc., which are widely known in the art.
  • the label is preferably a fluorescent dye. Nucleic acid labeling using these substances can be performed by any technique.
  • the site labeled in the detection nucleic acid probe is arbitrary.
  • the detection nucleic acid probe is preferably labeled at the 3'-terminal residue or the 5'-terminal residue of the nucleic acid strand constituting the detection nucleic acid probe.
  • the detection nucleic acid probe is preferably labeled at its 5 'terminal residue.
  • the detection nucleic acid probe has a region complementary to the target nucleic acid (complementary region), and a nucleic acid region non-complementary to the target nucleic acid (linker region) adjacent to the end of the complementary region. It is preferably labeled. In one embodiment, the detection nucleic acid probe is preferably labeled with a terminal residue on the side not adjacent to the complementary region of the linker region.
  • the linker region is preferably composed of a base that is non-complementary to the type of base at the corresponding position in the target nucleic acid and does not hybridize with the target nucleic acid.
  • the size of the linker region is not particularly limited, and is preferably 3 to 15 bases, more preferably 3 to 10 bases, and further preferably 3 to 7 bases. If the size of the linker region is 2 bases or less, hybridization may be inhibited due to steric hindrance of the labeling substance. On the other hand, when the size of the linker region is 16 bases or more, not only the cost increases, but also an unexpected secondary structure (steric structure) may be taken, and the hybridization may be inhibited.
  • the detection nucleic acid probe preferably has a Tm value of 45 ° C. or higher and 75 ° C. or lower.
  • the Tm value of the detection nucleic acid probe is preferably 50 ° C. or higher, or 55 ° C. or higher.
  • the difference between the Tm value of the detection nucleic acid probe and the Tm value of the capture nucleic acid probe is preferably ⁇ 15 ° C. or less, 10 ° C. or less, or 5 ° C. or less.
  • the Tm value means a Tm value in a buffer solution for hybridizing the detection nucleic acid probe and the target nucleic acid.
  • the Tm value can be measured by any method, and can be determined by measuring the absorbance (for example, absorbance at 260 nm) of a buffer solution containing the detection nucleic acid probe and the target nucleic acid, for example.
  • the step of mixing the sample containing the target nucleic acid and the capture nucleic acid probe and hybridizing the capture nucleic acid probe to the target nucleic acid is performed by mixing the target nucleic acid and the capture nucleic acid probe and subjecting them to conditions suitable for hybridization. It can be carried out. Specifically, the target nucleic acid and the capture nucleic acid probe are mixed in a buffer suitable for hybridization, and the temperature is about 30 ° C. to 50 ° C., preferably 35 ° C. to 45 ° C. for a certain time (for example, 1 minute or more). 2 minutes or more, or 3 minutes or more, and 10 minutes or less, 9 minutes or less, 8 minutes or less, 7 minutes or less, or 6 minutes or less).
  • the buffer has a pH suitable for hybridizing the target nucleic acid and the capture nucleic acid probe.
  • the pH of the buffer solution is preferably 7.6 or more and 9.0 or less.
  • a buffer for PCR can be used.
  • any kind of buffering agent may be used as long as it has sufficient buffering capacity in the target pH range.
  • tris phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, maleic acid, succinic acid Oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, and good buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, collamine hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycinamide, and bicine).
  • Tris, phosphoric acid, and PIPES are preferable, and Tris is more preferable because it has a sufficient buffer capacity at pH 7.6 or more and 9.0 or less.
  • the concentration of the buffering agent is generally 10-fold diluted from 10 mM stock solution of about 100 mM to 1 M and is generally used from the viewpoint of hybridization.
  • the amount of probe to be added (in terms of mole) is not particularly limited as long as it is larger than the target nucleic acid amount, but is preferably 1 pM to 10 ⁇ M, more preferably 1 nM to 10 ⁇ M, and even more preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the target nucleic acid to be hybridized with the capture nucleic acid probe may be a target nucleic acid that has already hybridized with the detection nucleic acid probe, or a target nucleic acid that has not yet hybridized with the detection nucleic acid probe.
  • the step of mixing the sample containing the target nucleic acid and the detection nucleic acid probe and hybridizing the detection nucleic acid probe to the target nucleic acid is performed by mixing the target nucleic acid and the detection nucleic acid probe and subjecting them to conditions suitable for hybridization. It can be carried out. Specifically, the target nucleic acid and the detection nucleic acid probe are mixed in a buffer suitable for hybridization, and the temperature is about 30 ° C. to 50 ° C., preferably about 35 ° C. to 45 ° C. for a certain time (for example, 1 minute). 2 minutes or more, or 3 minutes or more, and 10 minutes or less, 9 minutes or less, 8 minutes or less, 7 minutes or less, or 6 minutes or less).
  • the buffer has a pH suitable for hybridizing the target nucleic acid and the detection nucleic acid probe.
  • the pH of the buffer solution is preferably 7.6 or more and 9.0 or less.
  • a buffer for PCR can be used.
  • any kind of buffering agent may be used as long as it has sufficient buffering capacity in the target pH range.
  • tris phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, maleic acid, succinic acid Oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, and good buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, collamine hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycinamide, and bicine).
  • Tris, phosphoric acid, and PIPES are preferable, and Tris is more preferable because it has a sufficient buffer capacity at pH 7.6 or more and 9.0 or less.
  • the concentration of the buffering agent is generally 10-fold diluted from 10 mM stock solution of about 100 mM to 1 M and is generally used from the viewpoint of hybridization.
  • the amount of the probe to be added is not particularly limited as long as it is larger than the amount of the target nucleic acid, but is preferably 1 pM to 10 ⁇ M, more preferably 1 nM to 10 ⁇ M, and further preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the target nucleic acid to be hybridized with the detection nucleic acid probe may be a target nucleic acid that has already hybridized with the capture nucleic acid probe or a target nucleic acid that has not yet hybridized with the capture nucleic acid probe.
  • the sample containing the target nucleic acid and the capture nucleic acid probe are mixed, the step of hybridizing the capture nucleic acid probe to the target nucleic acid, the sample containing the target nucleic acid and the detection nucleic acid probe are mixed, and the target
  • the step of hybridizing the detection nucleic acid probe to the nucleic acid is preferably performed simultaneously in a single buffer.
  • the target nucleic acid, the capture nucleic acid probe, and the detection nucleic acid probe are added to a buffer solution suitable for hybridization between the target nucleic acid, the capture nucleic acid probe, and the detection nucleic acid probe. For example, 1 minute or more, 2 minutes or more, or 3 minutes or more and 10 minutes or less, 9 minutes or less, 8 minutes or less, 7 minutes or less, or 6 minutes or less).
  • the capture antibody in the "step of adding the target nucleic acid hybridized to the capture nucleic acid probe to the reactor in which the capture antibody specifically recognizing the label of the capture nucleic acid probe is immobilized, and binding the target nucleic acid to the capture antibody";
  • the immobilization method and the type of the reactor are arbitrary as long as the target nucleic acid can be detected, and can be appropriately selected from those known in the art.
  • Representative capture antibodies and reactors are disclosed in JP-A-2001-235471.
  • the reactor preferably includes a porous filter that receives a solution containing a capture nucleic acid probe, and the capture antibody is preferably immobilized on the porous filter in such a manner that the capture nucleic acid probe can be captured.
  • the porous filter is preferably made of glass fiber that is excellent in liquid permeability and suitable for antibody immobilization. Moreover, it is preferable that the reactor is equipped with the absorption layer for accelerating
  • the reactor has its inner surface blocked with an appropriate blocking agent.
  • Blocking can be performed by any method known in the art.
  • blocking is preferably performed using a blocking solution.
  • the blocking liquid is preferably an aqueous solution containing a buffering agent and a blocking agent from the viewpoint of not affecting the blocking effect and other reactions (for example, antigen-antibody reaction, enzyme color reaction, etc.).
  • any kind of buffering agent may be used as long as it has a sufficient buffering capacity in a target pH range.
  • tris phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, maleic acid, Succinic acid, oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, and good buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, colamin hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycinamide, and bicine
  • MES ADA
  • PIPES colamin hydrochloride
  • BES TES
  • HEPES acetamidoglycine
  • Tris, phosphoric acid, and PIPES are preferable, and Tris is more preferable because it has a sufficient buffering capacity near pH 7.0.
  • the concentration of the buffer material is generally about 10 mM.
  • the blocking agent can be appropriately selected according to the type of the reactor, the presence / absence and type of the porous filter, the type of capture antibody, the type of immobilization method, and the like. Preferably it is selected from the group consisting of: In one embodiment, the blocking agent is preferably not BSA. Further, it is more preferable to add dNTPs to the blocking agent.
  • the casein and BPF act as a blocking agent for proteins, and the dNTPs act as a blocking agent for nucleic acids.
  • the concentration of the dNTPs is preferably 1 to 100 ⁇ M. If the dNTPs concentration is lower than 1 ⁇ M, a sufficient blocking effect may not be obtained.
  • the dNTPs concentration is higher than 100 ⁇ M, not only the cost increases, but the blocking effect is too high, and there is a possibility that not only the blank signal but also the signal derived from the target nucleic acid may be lowered.
  • the target nucleic acid is bound to the capture antibody by adding the target nucleic acid hybridized with the capture nucleic acid probe to the reactor and maintaining the conditions suitable for the binding between the label of the capture nucleic acid probe and the capture antibody for a certain period of time. be able to.
  • conditions suitable for the binding between the label of the capture nucleic acid probe and the capture antibody include a temperature of about 30 ° C. to 50 ° C., preferably about 35 ° C. to 45 ° C.
  • Examples of the fixed time include 3 minutes or less, preferably about 1 to 2 minutes.
  • the capture nucleic acid probe and the capture antibody can be bound in a buffer used for hybridization between the capture nucleic acid probe (or detection nucleic acid probe) and the target nucleic acid.
  • a capture antibody can be bound to the capture nucleic acid probe before the target nucleic acid and the capture nucleic acid probe are hybridized. Thereafter, the target nucleic acid can be hybridized to the capture nucleic acid probe immobilized on the reactor via the capture antibody.
  • the target nucleic acid may be hybridized with the detection nucleic acid probe or may not be hybridized with the detection nucleic acid probe. When the target nucleic acid is not hybridized with the detection nucleic acid probe, the detection nucleic acid probe can be further hybridized.
  • washing the target nucleic acid after binding the target nucleic acid to the reactor via the capture nucleic acid probe and the capture antibody and then washing the reactor to remove the detection nucleic acid probe not hybridized to the target nucleic acid is well known in the art. This can be done by any known technique.
  • the cleaning is preferably performed using a cleaning liquid.
  • the washing solution is preferably an aqueous solution containing a buffering agent and a nonionic surfactant from the viewpoint of not affecting the washing power and other reactions (for example, antigen-antibody reaction, enzyme color reaction, etc.), and detection is performed by enzyme color reaction.
  • the pH is about 7.0, which is suitable for the enzyme coloring reaction.
  • any kind of buffering agent may be used as long as it has a sufficient buffering capacity in a target pH range.
  • tris phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, maleic acid, Succinic acid, oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, and good buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, colamin hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycinamide, and bicine
  • MES ADA
  • PIPES colamin hydrochloride
  • BES TES
  • HEPES acetamidoglycine
  • Tris, phosphoric acid, and PIPES are preferable, and Tris is more preferable because it has a sufficient buffering capacity near pH 7.0.
  • the concentration of the buffer material is generally about 10 mM.
  • the nonionic surfactant include polyoxyethylene alkyl phenyl ether (Triton (registered trademark) surfactant, etc.), polyoxyethylene alkyl ether (Brij (registered trademark) surfactant, etc.), polyoxyethylene sorbitan.
  • fatty acid esters such as Tween (registered trademark) surfactants
  • polyoxyethylene fatty acid esters such as Tween (registered trademark) surfactants
  • sorbitan fatty acid esters such as Tween (registered trademark) surfactants
  • alkyl glucosides such as Tween (registered trademark) surfactants
  • the said nonionic surfactant may be used independently or may be used in combination of 2 or more type.
  • the concentration of the nonionic surfactant is preferably 0.01 wt% to 5.0 wt%, more preferably 0.05 wt% to 4.5 wt%, and still more preferably 0.1 wt% to 4.0 wt%.
  • the washing is not particularly limited. For example, washing can be performed 1 to 4 times, preferably 2 to 3 times.
  • the detection of the detection nucleic acid probe is arbitrary as long as the label can be detected, and can be appropriately selected depending on the type of the label.
  • the detection nucleic acid probe is preferably detected using a secondary detection probe that specifically recognizes the label of the detection nucleic acid probe.
  • the type of the secondary detection probe is not particularly limited as long as it can bind to the detection nucleic acid probe hybridized with the target nucleic acid and can detect the presence thereof.
  • the secondary detection probe can be a labeled antibody that specifically binds to the label of the detection nucleic acid probe.
  • the label of the detection nucleic acid probe is a fluorescent substance
  • an antibody obtained by labeling an antibody that specifically recognizes the fluorescent substance with a labeling substance different from the label of the detection nucleic acid probe may be used as the secondary detection probe. It can.
  • Such antibodies are known in the art and can be appropriately selected according to the type of detection nucleic acid probe used.
  • the antibody used as the secondary detection probe is preferably selected from the group consisting of a rabbit antibody, a mouse antibody, and a rat antibody. In other embodiments, the antibody is preferably not a sheep antibody.
  • the label of the secondary detection probe is arbitrary, and can be, for example, a fluorescent substance or an enzyme.
  • the label of the secondary detection probe is preferably an enzyme.
  • the type of enzyme used as the label is arbitrary as long as it can be used for detection, and can be appropriately selected from those known in the art. For example, alkaline phosphatase or peroxidase can be used as the enzyme. When these enzymes are used, the presence (and amount) of the target nucleic acid can be detected by adding a corresponding substrate and detecting the resulting enzyme reaction.
  • Example 1 The measurement operation was performed as follows using a small chemiluminescence immunoanalyzer POCube (manufactured by Toyobo). Each reagent was separately prepared in the specimen well and reagent wells (1) to (12) of a 13-container dedicated to POCube (FIG. 1).
  • the minimum detection sensitivity of Example 1 was 0.1 pM.
  • the minimum concentration is preferably as low as possible, and is 1 nM or less, preferably 100 pM or less, more preferably 10 pM or less, still more preferably 1 pM or less, particularly preferably 0.1 pM or less, and most preferably 0.01 pM or less.
  • the S / N ratio obtained was 150 for the labeled capture DNA probe 2, 100 for the labeled capture DNA probe 3, 40 for the labeled capture DNA probe 4, 50 for the labeled capture DNA probe 5, 80 for the labeled capture DNA probe 6. It was 180 for the capture DNA probe 7.
  • the minimum detection sensitivity is 0.1 pM for the labeled capture DNA probe 2, 0.1 pM for the labeled capture DNA probe 3, 10 pM for the labeled capture DNA probe 4, 10 pM for the labeled capture DNA probe 5, and 1 pM for the labeled capture DNA probe 6.
  • the labeled capture DNA probe 7 was 0.1 pM.
  • the S / N ratio obtained was 200 for the labeled detection DNA probe 2, 240 for the labeled detection DNA probe 3, 4.0 for the labeled detection DNA probe 4, 40 for the labeled detection DNA probe 5, and 50 for the labeled detection DNA probe 6. 80 for the labeled detection DNA probe 7 and 200 for the labeled detection DNA probe 8.
  • the minimum detection sensitivity is 0.01 pM for the labeled detection DNA probe 2, 0.01 pM for the labeled detection DNA probe 3, 100 pM for the labeled detection DNA probe 4, 10 pM for the labeled detection DNA probe 5, and 10 pM for the labeled detection DNA probe 6. 1 pM for the labeled detection DNA probe 7 and 0.01 pM for the labeled detection DNA probe 8.
  • the S / N ratio obtained was 160 for FITC antibody 2, 80 for FITC antibody 3, 90 for FITC antibody 4, 5.0 for FITC antibody 5, and 5.0 for FITC antibody 6.
  • the minimum detection sensitivity was 0.1 pM for FITC antibody 2, 1 pM for FITC antibody 3, 1 pM for FITC antibody 4, 1 nM for FITC antibody 5, and 1 nM for FITC antibody 6.
  • the S / N ratio obtained was 150 for 1% BPF / 100 ⁇ M dNTPs-TBS solution, 90 for 1% casein-TBS solution, 80 for 1% BPF-TBS, 40 for 1% BSA / 100 ⁇ M dNTPs-TBS, It was 20 for% BSA-TBS and 5.0 for TBS.
  • the minimum detection sensitivity was 0.1 pM for 1% BPF / 100 ⁇ M dNTPs-TBS solution, 1 pM for 1% casein-TBS solution, 1 pM for 1% BSA-TBS, 10 pM for 1% BSA / 100 ⁇ M dNTPs-TBS, It was 10 pM for% BSA-TBS and 1 nM for TBS.
  • the S / N ratio obtained was 80 for 1M Tris-HCl (pH 8.0), 90 for 1M Tris-HCl (pH 8.5), 130 for 1M Tris-HCl (pH 9.0), 1M Tris-HCl ( It was 15 for pH 7.0), 40 for 1M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 for 10 ⁇ PBS (pH 7.4), and 5.0 for distilled water.
  • the minimum detection sensitivity was 1 pM for 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 1 pM for 1 M Tris-HCl (pH 8.5), 0.1 pM for 1 M Tris-HCl (pH 9.0), 1 M Tris-HCl ( 1 nM for pH 7.0), 10 pM for 1M Tris-HCl (pH 7.5), 1 nM for 10 ⁇ PBS (pH 7.4), and 1 nM for distilled water.
  • Example 34 Variation of cleaning liquid The S / N ratio was measured in the same manner as in Example 1 except that TBS was used instead of the 1% Tween20-TBS solution as a cleaning solution. The obtained S / N ratio was 20. The minimum detection sensitivity was 10 pM.
  • Target DNA 1 is double-stranded DNA hybridized with complementary strands of Target DNA 1 and Target DNA 1, Target DNA 100 ⁇ L, reagent well (1) reaction buffer 12 ⁇ L, reagent well (3) mixed reagent 3 ⁇ L, The S / N ratio was measured in the same manner as in Example 1 except that 3.2 ⁇ L of distilled water in the reagent well (7) was mixed in the empty reagent well (8) and then heat-treated at 94 ° C. for 5 minutes. did. The S / N ratio obtained was 80. The minimum detection sensitivity was 1 pM.
  • Example 36 The S / N ratio was measured in the same manner as in Example 1, except that double-stranded DNA obtained by hybridizing complementary strands of Target DNA 1 and Target DNA 1 was used instead of Target DNA 1 as Target DNA. The obtained S / N ratio was 20. The minimum detection sensitivity was 10 pM.
  • TargetDNA1 5'-CACCCGTTAGGCGCAACGGGACGGAAAGACCCCGTGAAGCTTTACTGTAGCTTAATATTGATCAGGACATTATCATGTAGAGAATAGGTAGGAGCAAT-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Biotin labeled capture DNA probe 1 5'-Biotin-TTTTA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • FITC labeled detection DNA probe 1 5'-FITC-TTTTT-TCTTTCCGTCCCGTT-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Biotin labeled capture DNA probe 2 5'-Biotin-TAATT-TCCTACCTATTCTCTACATGATAATGTC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Biotin labeled capture DNA probe 3 5'-Biotin-TTTAT-TTCTCTACATGATAATGTCCTGATCA-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • FITC labeled DNA probe 2 5'-FITC-TTTTT-GTCTTTCCGTCCCGTTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • FITC-labeled detection DNA probe 3 5'-FITC-TTTTT-GGTCTTTCCGTCCCGTTGC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Biotin-labeled capture DNA probe 4 5'-Biotin-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Biotin labeled capture DNA probe 5 5'-Biotin-TA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Biotin labeled capture DNA probe 6 5'-Biotin-TTA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Biotin-labeled capture DNA probe 7 5'-Biotin-TTTTTTTTTA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • FITC labeled detection DNA probe 4 5'-FITC-TTTTA-CTTTCCGTCCCGT-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • FITC labeled detection DNA probe 6 5'-FITC-TT-TCTTTCCGTCCCGTT-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • FITC labeled detection DNA probe 7 5'-FITC-TTTT-TCTTTCCGTCCCGTT-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • FITC labeled detection DNA probe 8 5'-FITC-TTTAATTTTT-TCTTTCCGTCCCGTT-3 '(SEQ ID NO: 16)

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Abstract

効率的に核酸を検出するための新たな技術を提供すること。 標的核酸の検出方法であって、 （１）標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを準備する工程 （２）標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程 （３）標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程 （４）捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程 （５）反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去する工程、及び （６）検出核酸プローブの標識を検出する工程 を含む、方法。

Description

核酸の検出方法
　核酸を検出する技術が開示される。
　核酸を検出する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（所謂、ＰＣＲ法：polymerase　chain　reaction）を用いて標的核酸を増幅した後、前記核酸を検出する方法が広く知られている。検出方法としては、アガロース電気泳動法や、蛍光法（所謂、リアルタイムＰＣＲ法）や、核酸クロマト法が広く知られている。例えば、特許文献１及び２には、リアルタイムＰＣＲ法を用いた遺伝子の検出方法が開示されている。また、特許文献３には、核酸クロマト法を用いた遺伝子の検出方法が開示されている。
特開平５－１８４３９７ 特表平１０－５１０９８２ ＷＯ２００９－０３４８４２
　しかし、従来存在する核酸を検出する方法は種々の観点で改善の余地があった。例えば、アガロース電気泳動法は、定性評価（＋－判定）は可能なものの、定量評価は困難であった。リアルタイムＰＣＲ法は、測定感度は十分であるものの、専用の大型装置が必要であり、操作性、及び／又は測定時間等の観点で改善の余地があった。また、核酸クロマト法は、操作性、測定時間は十分であるものの、測定感度に改善の余地があった。そこで、効率的に核酸を検出するための新たな技術を提供することが１つの課題である。
　上記課題を解決する代表的な手段は下記のとおりである。
項１．
標的核酸の検出方法であって、
（１）標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを準備する工程、
（２）標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程、
（３）標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程、
（４）捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程、
（５）反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去する工程、及び
（６）検出核酸プローブの標識を検出する工程
を含む、方法。
項２．
工程（２）～工程（４）をｐＨ７．６～９．０の緩衝液中で行う、項１に記載の方法。
項３．
捕捉核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されている、項１又は２に記載の方法。
項４。
検出核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されている、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５．
捕捉核酸プローブのリンカー領域が３～１５ヌクレオチド残基からなる、項１～４のいずれかに記載の方法。
項６．
検出核酸プローブのリンカー領域が３～１５ヌクレオチド残基から成る、項１～５のいずれかに記載の方法。
項７．
捕捉核酸プローブの相補的領域のＴｍ値が４５～７５℃である、項１～６のいずれかに記載の方法。
項８．
検出核酸プローブの相補的領域の Ｔｍ値が４５～７５℃である、項１～７のいずれかに記載の方法。
項９．
捕捉核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、検出核酸プローブの標識とは異なる、項１～８のいずれかに記載の方法。
項１０．
検出核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、捕捉核酸プローブの標識とは異なる、項１～９のいずれかに記載の方法。
項１１．
蛍光物質がフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、シアニン及びその誘導体から成る群より選択される、項９または１０に記載の方法。
項１２．
工程（６）が、検出核酸プローブの標識を特異的に認識し、且つ、標識された検出抗体を、検出核酸プローブに結合させる工程を含む、項１～１１のいずれかに記載の方法。
項１３．
検出抗体の標識がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）から成る群より選択される、項１～１２のいずれかに記載の方法。
項１４．
検出抗体が、ウサギ抗体、マウス抗体、及びラット抗体から成る群より選択される、項１２又は１３に記載の方法。
項１５．
捕捉抗体が固定化された反応器がカゼイン、及びＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）から成る群より選択されるブロッキング剤でブロッキングされている、項１～１４のいずれかに記載の方法。
項１６．
ブロッキング剤が、さらにｄＮＴＰｓを含有する、項１５に記載の方法。
項１７．
標的核酸を検出するためのシステムであって、
標的核酸 にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを含み、
項１～１５のいずれかに記載の方法を用いるシステム。
　標的とする核酸を効率的に検出する手段が提供される。効率的とは、簡便、短時間、及び／又は検出感度が優れることを意味する。一実施形態において、標的核酸を含む試料の準備から標的核酸の検出までを２０分以内（好ましくは、１５分以内、又は１０分以内）で行うことが好ましい。
標的核酸及び各試薬を収容するためのカートリッジの例を示す。
　標的核酸を検出する方法は、下記の工程（１）～（６）を含むことが好ましい。
（１）標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを準備する工程
（２）標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
（４）捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程
（５）反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去する工程
（６）検出核酸プローブの標識を検出する工程
　検出対象である標的核酸の種類は特に制限されず任意の核酸であり得る。標的核酸には、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド鎖、及び人工核酸等が含まれる。標的核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。一実施形態において、核酸は一本鎖であることが好ましい。核酸が二本鎖である場合、一本鎖に解離させる熱処理を行うことが好ましい。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成ＤＮＡであり得る。ＲＮＡは、例えば、ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ又は合成ＲＮＡであり得る。人工核酸には、例えば、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ－オリゴ核酸、及びＢＮＡ（ＬＮＡ）が含まれる。核酸の由来も任意であり、特に制限されない。核酸は、例えば、ウイルス、微生物、植物、又は動物に由来し得る。動物には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。標的核酸の大きさ（塩基長）は任意であり特に制限されない。
　標的核酸は、任意の形態の試料中に存在し得る。試料は、例えば、実験生物、培養細胞、ヒトや動物などの臨床検査に供される検体（例えば、尿、糞便、全血、血漿、唾液、口腔内擦過物、鼻腔液、鼻腔ぬぐい液、膣ぬぐい液、及び尿道擦過物等）、衛生管理に供される検体（例えば、吐しゃ物、ふき取りサンプル、及び食品材料等）、並びに、環境測定に供される検体（例えば、河川水、海水、土壌、空気からの捕集物等）等であり得る。
　試料中の核酸の濃度は、高濃度であるほど検出は容易であるが、低濃度であっても検出可能である。一実施形態において試料中の核酸濃度は、０．０１ｐＭ以上が好ましく、よりこの好ましくは０．１ｐＭ以上、さらに好ましくは１ｐＭ以上である。試料中の核酸の濃度の上限は任意であるが、例えば、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下とすることができる。
　「標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ」は、標的核酸にハイブリダイズ可能であるように標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、標識されていることが好ましい。捕捉核酸プローブの構造は、特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの混合、ＰＮＡ、ＢＮＡ（ＬＮＡ）、及びこれらの任意の組み合わせ等のいずれでもよい。これらの核酸は、任意の手法で調製（合成）することができる。捕捉核酸プローブの大きさ（塩基長）は、標的核酸にハイブリダイズ出来る限り任意であり、例えば、１０塩基以上４０塩基以下の範囲で設計することができる。一実施形態において、捕捉核酸プローブの大きさは、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上又は２０塩基以上であり、３９塩基以下、３８塩基以下、３７塩基以下、３６塩基以下、３５塩基以下、３４塩基以下、３３塩基以下、３２塩基以下、３１塩基以下、又は３０塩基以下である。捕捉核酸プローブの塩基配列は、標的核酸とハイブリダイズできる限り任意であり、標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的である必要はない。一実施形態において、捕捉核酸プローブの塩基配列は標的核酸の塩基配列に完全に相補的であることが好ましい。捕捉核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域は、検出核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域と異なる（重複していない）ことが好ましい。各プローブが認識する領域の位置関係は、各プローブの標識同士の立体障害により、ハイブリダイズが阻害されることを回避するため、互いに１０塩基以上離れていること好ましく、２０塩基以上離れていることがより好ましく、３０塩基以上離れていることがさらに好ましい。
　捕捉核酸プローブの標識の種類は任意であり、それを介して捕捉核酸プローブ及び標的核酸を反応器に固定化することを可能にする物質であることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブ標識は、抗体が結合可能な物質（抗原）であることが好ましい。そのような物質としては、例えば、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、及び蛍光物質等を挙げることができる。蛍光物質の種類は特に制限されず、例えば、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにシアニン及びその誘導体等が含まれ、これらは当該技術分野において広く知られている。一実施形態において、標識は、ビオチンであることが好ましい。これらの物質を用いた核酸の標識は任意の手法で行うことができる。
　捕捉核酸プローブにおいて標識されている部位は任意である。一実施形態において、捕捉核酸プローブは、それを構成する核酸鎖の３’末端残基又は５’末端残基において標識されていることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブは、その５’末端残基が標識されていることが好ましい。
　捕捉核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に、それと隣接して標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域において標識されていることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブは、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端残基が標識されていることが好ましい。リンカー領域は、標的核酸における対応する位置の塩基の種類と非相補的な塩基で構成され、標的核酸とハイブリダイズしないことが好ましい。リンカー領域の大きさ（ヌクレオチド残基長）は特に制限されず、例えば、３～１５塩基が好ましく、３～１０塩基がより好ましく、３～７塩基がさらに好ましい。リンカー領域の大きさが２塩基以下だと標識物質の立体障害によりハイブリダイズが阻害される恐れがある。一方、リンカー領域の大きさが１６塩基以上だとコストが上がるだけでなく、予期せぬ二次構造（立体構造）をとり、かえってハイブリダイゼイズが阻害される恐れがある。
　捕捉核酸プローブは、そのＴｍ値が４５℃以上７５℃以下であることが好ましい。一実施形態において、捕捉核酸プローブのＴｍ値は５０℃以上、又は５５℃以上であることが好ましい。他の実施形態において、捕捉核酸プローブのＴｍ値は、検出核酸プローブのＴｍ値との差が±１５℃以下、１０℃以下、又は５℃以下であることが好ましい。ここで、Ｔｍ値は、捕捉核酸プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる緩衝液中でのＴｍ値を意味する。Ｔｍ値は、任意の手法で測定でき、例えば、捕捉核酸プローブと標的核酸を含む緩衝液の吸光度（例えば、２６０ｎｍにおける吸光度）を測定することによって求めることができる。
　「標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブ」は、標的核酸にハイブリダイズ可能であるように標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、その存在を検出可能な物質で標識されていることが好ましい。検出核酸プローブの構造は、特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの混合、ＰＮＡ、ＢＮＡ（ＬＮＡ）、及びこれらの任意の組み合わせ等のいずれでもよい。これらの核酸は、任意の手法で調製（合成）することができる。検出核酸プローブの大きさ（塩基長）は、標的核酸にハイブリダイズ出来る限り任意であり、例えば、１０塩基以上４０塩基以下の範囲で設計することができる。一実施形態において、検出核酸プローブの大きさは、１１塩基以上、１２塩基以以上、１３塩基以上、１４塩基以上、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上又は２０塩基以上であり、３９塩基以下、３８塩基以下、３７塩基以下、３６塩基以下、３５塩基以下、３４塩基以下、３３塩基以下、３２塩基以下、３１塩基以下、又は３０塩基以下である。検出核酸プローブの塩基配列は、標的核酸とハイブリダイズできる限り任意であり、標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的である必要はない。一実施形態において、検出核酸プローブの塩基配列は標的核酸の塩基配列に完全に相補的であることが好ましい。捕捉核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域は、検出核酸プローブの塩基配列と相補的な標的核酸における領域と異なる（重複していない）ことが好ましい。
　検出核酸プローブの標識の種類は、それを介して検出核酸プローブ及び標的核酸を検出することを可能にする物質である限り任意である。一実施形態において、検出核酸プローブの標識は、抗体が結合可能な物質（抗原）であることが好ましい。そのような物質としては、例えば、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、及び蛍光物質等を挙げることができる。蛍光物質の種類は特に制限されず、例えば、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにシアニン及びその誘導体等が含まれ、これらは当該技術分野において広く知られている。一実施形態において、標識は蛍光色素であることが好ましい。これらの物質を用いた核酸の標識は任意の手法で行うことができる。
　検出核酸プローブにおいて標識されている部位は任意である。一実施形態において、検出核酸プローブは、それを構成する核酸鎖の３’末端残基又は５’末端残基が標識されていることが好ましい。一実施形態において、検出核酸プローブは、その５’末端残基が標識されていることが好ましい。
　検出核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に、それと隣接して標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域において標識されていることが好ましい。一実施形態において、検出核酸プローブは、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端残基が標識されていることが好ましい。リンカー領域は、標的核酸における対応する位置の塩基の種類と非相補的な塩基で構成され、標的核酸とハイブリダイズしないことが好ましい。リンカー領域の大きさ（ヌクレオチド残基長）は特に制限されず、例えば、３～１５塩基が好ましく、３～１０塩基がより好ましく、３～７塩基がさらに好ましい。リンカー領域の大きさが２塩基以下だと標識物質の立体障害によりハイブリダイズが阻害される恐れがある。一方、リンカー領域の大きさが１６塩基以上だとコストが上がるだけでなく、予期せぬ二次構造（立体構造）をとり、かえってハイブリダイゼイズが阻害される恐れがある。
　検出核酸プローブは、そのＴｍ値が４５℃以上７５℃以下であることが好ましい。一実施形態において、検出核酸プローブのＴｍ値は５０℃以上、又は５５℃以上であることが好ましい。他の実施形態において、検出核酸プローブのＴｍ値は、捕捉核酸プローブのＴｍ値との差が±１５℃以下、１０℃以下、又は５℃以下であることが好ましい。ここで、Ｔｍ値は、検出核酸プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる緩衝液中でのＴｍ値を意味する。Ｔｍ値は、任意の手法で測定でき、例えば、検出核酸プローブと標的核酸を含む緩衝液の吸光度（例えば、２６０ｎｍにおける吸光度）を測定することによって求めることができる。
　「標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程」は、標的核酸及び捕捉核酸プローブを混合し、これらをハイブリダイゼーションに適した条件に供することよって行うことができる。具体的には、ハイブリダイゼーションに適した緩衝液中で標的核酸及び捕捉核酸プローブを混合し、その温度を約３０℃～５０℃、好ましくは３５℃～４５℃で一定時間（例えば、１分以上、２分以上、又は３分以上、且つ１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、又は６分以下）保持することで行うことができる。緩衝液は、標的核酸と捕捉核酸プローブとがハイブリダイズするのに適したｐＨを有することが好ましい。例えば、緩衝液のｐＨは、７．６以上９．０以下が好ましい。そのような緩衝液としては、例えば、ＰＣＲ用の緩衝液を使用することができ、例えば、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｍｇ２＋　ｆｒｅｅ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ　ＫＣｌ）（タカラバイオ社製）、１０×Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｔａｑ　Ｍｇ－ｆｒｅｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ　ＫＣｌ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社製）が挙げられる。緩衝液は、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．６以上９．０以下において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝剤の濃度は、１００ｍＭ～１Ｍ程度の１０×ストック液を１０倍希釈して使用するのがハイブリダイズの観点からも一般的である。添加するプローブの量（モル換算）は、標的核酸量よりも多ければ特に限定されないが、１ｐＭ～１０μＭが好ましく、１ｎＭ～１０μＭがより好ましく、１μＭ～１０μＭがさらに好ましい。一実施形態において、標的酢酸と捕捉プローブの比率は、モル換算で、標的核酸：プローブ＝１：１０～１０００、１：２５～５００、又は１：５０～２００であることが好ましい。捕捉核酸プローブとハイブリダイズさせる標的核酸は、既に検出核酸プローブとハイブリダイズした標的核酸であっても、検出核酸プローブと未だハイブリダイズしていない標的核酸であってもよい。
　「標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程」は、標的核酸及び検出核酸プローブを混合し、これらをハイブリダイゼーションに適した条件に供することよって行うことができる。具体的には、ハイブリダイゼーションに適した緩衝液中で標的核酸及び検出核酸プローブを混合し、その温度を約３０℃～５０℃、好ましくは約３５℃～４５℃で一定時間（例えば、１分以上、２分以上、又は３分以上、且つ１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、又は６分以下）保持することで行うことができる。緩衝液は、標的核酸と検出核酸プローブとがハイブリダイズするのに適したｐＨを有することが好ましい。例えば、緩衝液のｐＨは、７．６以上９．０以下が好ましい。そのような緩衝液としては、例えば、ＰＣＲ用の緩衝液を使用することができ、例えば、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｍｇ２＋　ｆｒｅｅ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ　ＫＣｌ）（タカラバイオ社製）、１０×Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｔａｑ　Ｍｇ－ｆｒｅｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３），５００ｍＭ　ＫＣｌ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社製）が挙げられる。緩衝液は、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．６以上９．０以下において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝剤の濃度は、１００ｍＭ～１Ｍ程度の１０×ストック液を１０倍希釈して使用するのがハイブリダイズの観点からも一般的である。添加するプローブの量は、標的核酸量よりも多ければ特に限定されないが、１ｐＭ～１０μＭが好ましく、１ｎＭ～１０μＭがより好ましく、１μＭ～１０μＭがさらに好ましい。一実施形態において、標的酢酸と検出核酸プローブの比率は、モル換算で、標的核酸：プローブ＝１：１０～１０００、１：２５～５００、又は１：５０～２００であることが好ましい。検出核酸プローブとハイブリダイズさせる標的核酸は、既に捕捉核酸プローブとハイブリダイズした標的核酸であっても、捕捉核酸プローブと未だハイブリダイズしていない標的核酸であってもよい。
　一実施形態において、作業効率の観点から、標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程と標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程は単一の緩衝液中で同時に行うことが好ましい。これは、例えば、標的核酸と捕捉核酸プローブ及び検出核酸プローブとのハイブリダイゼーションに適した緩衝液に標的核酸、捕捉核酸プローブ、及び検出核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションに適した条件の一定時間（例えば、１分以上、２分以上、又は３分以上、且つ１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、又は６分以下）保持して行うことができる。
　「捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程」における捕捉抗体、その固定化方法、及び反応器の種類は、標的核酸の検出が可能である限り任意であり、当該技術分野において知られるものから適宜選択することができる。代表的な捕捉抗体及び反応器は特開２００１－２３５４７１号公報に開示されている。例えば、反応器は、捕捉核酸プローブを含む溶液を受容する多孔質フィルタを備え、捕捉抗体は捕捉核酸プローブを捕捉可能な態様で多孔質フィルタに固定化されていることが好ましい。一実施形態において、多孔質フィルタは、通液性に優れ、抗体の固定化に適したグラスファイバーで構成されていることが好ましい。また、反応器は、多孔質フィルタの下部に液体の多孔質フィルタの通液を促進させるための吸収層を備えていることが好ましい。
　反応器は、捕捉核酸プローブ（捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を含む）以外の物質による非特異的な結合を防止するため、反応器の内側表面が適当なブロッキング剤でブロッキングされていることが好ましい。ブロッキングは、当該技術分野で知られている任意の手法で行うことができる。一実施形態においてブロッキングは、ブロッキング液を用いて行うことが好ましい。ブロッキング液は、ブロッキング効果と他の反応（例えば、抗原抗体反応、酵素発色反応等）に影響しないという観点から、緩衝剤とブロッキング剤を含む水溶液であることが好ましい。検出を酵素発色反応で行う場合は、当該水溶液は、酵素発色反応に適するｐＨ＝７．０付近であることがより好ましい。前記緩衝液としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．０付近において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝材の濃度は、１０ｍＭ程度が一般的である。ブロッキング剤は、反応器の種類、多孔質フィルタの有無及び種類、捕捉抗体の種類、及び固定化方法の種類等に応じて適宜選択することができるが、カゼイン、及びＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）から成る群より選択されることが好ましい。一実施形態においてブロッキング剤はＢＳＡでないことが好ましい。また、ブロッキング剤にはｄＮＴＰｓを添加するのがさらに好ましい。前記カゼイン、及びＢＰＦはタンパク質用のブロッキング剤として作用し、前記ｄＮＴＰｓは核酸用のブロッキング剤として作用する。前記ｄＮＴＰｓの濃度は、１～１００μＭが好ましい。ｄＮＴＰｓ濃度が１μＭより低いと、十分なブロッキング効果が得られない恐れがある。一方、ｄＮＴＰｓ濃度が１００μＭより高いと、コストが上がるだけでなく、ブロッキング効果が高すぎて、ブランクのシグナルのみならず、標的核酸由来のシグナルまで下がる恐れがある。
　標的核酸を捕捉抗体に結合させることは、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を反応器に添加し、捕捉核酸プローブの標識と捕捉抗体との結合に適した条件に一定時間維持することで行うことができる。捕捉核酸プローブの標識と捕捉抗体との結合に適した条件とは、例えば、約３０℃～５０℃、好ましくは約３５℃～４５℃の温度を挙げることができる。一定時間とは、例えば、３分以下、好ましくは約１～２分を挙げることができる。一実施形態において、捕捉核酸プローブと捕捉抗体との結合は、捕捉核酸プローブ（又は検出核酸プローブ）と標的核酸とのハイブリダイゼーションに使用する緩衝液中で行うことができる。
　他の実施形態において、標的核酸と捕捉核酸プローブとをハイブリダイズさせる前に、捕捉核酸プローブに捕捉抗体を結合させることもできる。その後、捕捉抗体を介して反応器に固定された捕捉核酸プローブに標的核酸をハイブリダイズさせることができる。ここで標的核酸は、検出核酸プローブがハイブリダイズしたものであっても、検出核酸プローブがハイブリダイズしていないものであってもよい。標的核酸が、検出核酸プローブがハイブリダイズしていないものである場合は、更に検出核酸プローブをハイブリダイズさせることができる。
　標的核酸を捕捉核酸プローブ及び捕捉抗体を介して反応器に結合させた後、反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去することが好ましい洗浄は、当該技術分野で知られている任意の手法で行うことができる。一実施形態において、洗浄は、洗浄液を用いて行うことが好ましい。洗浄液は、洗浄力と他の反応（例えば、抗原抗体反応、酵素発色反応等）に影響しないという観点から、緩衝剤とノニオン性界面活性剤を含む水溶液であることが好ましく、検出を酵素発色反応で行う場合は、酵素発色反応に適するｐＨ＝７．０付近であることがより好ましい。前記緩衝液としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、及びグッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、及びビシン）等が挙げられる。これらの中でも、ｐＨ７．０付近において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳが好ましく、トリスがより好ましい。前記緩衝材の濃度は、１０ｍＭ程度が一般的である。前記ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、及びショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。これらの中でも、洗浄力と他の反応（例えば、抗原抗体反応、酵素発色反応等）に影響しないという観点から、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）が好ましい。また、前記ノニオン性界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。前記ノニオン性界面活性剤の濃度としては、好ましくは０．０１ｗｔ％～５．０ｗｔ％、より好ましくは０．０５ｗｔ％～４．５ｗｔ％、さらに好ましくは０．１ｗｔ％～４．０ｗｔ％である。標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブが除去できる限り洗浄の解するは特に制限されない。例えば、洗浄は１～４回行うことができ、好ましくは２～３回である。
　捕捉核酸プローブ及び捕捉抗体を介して反応器に結合された標的核酸にハイブリダイズしている検出核酸プローブの標識を検出することにより、当該標的核酸を検出することが好ましい。検出核酸プローブの検出は、その標識を検出できる限り任意であり、標識の種類に応じて適宜選択することができる。
　一実施形態において、検出核酸プローブの検出は、検出核酸プローブの標識を特異的に認識する２次検出プローブを用いて検出することが好ましい。２次検出プローブの種類は、標的核酸にハイブリダイズしている検出核酸プローブに結合可能であり、且つ、その存在を検出できる限り特に制限されない。好適な一実施形態において、２次検出プローブは、検出核酸プローブの標識に特異的に結合する標識された抗体であり得る。例えば、検出核酸プローブの標識が蛍光物質である場合、２次検出プローブとして、当該蛍光物質を特異的に認識する抗体を検出核酸プローブの標識とは別の標識物質で標識した抗体を用いることができる。このような抗体は当該技術分野において知られており、使用する検出核酸プローブの種類に応じて適宜選択することができる。
　一実施形態において２次検出プローブとして利用される抗体は、ウサギ抗体、マウス抗体、及びラット抗体から成る群より選択されることが好ましい。他の実施形態において、抗体は、ヒツジ抗体でないことが好ましい。
　２次検出プローブの標識は任意であり、例えば、蛍光物質又は酵素であり得る。一実施形態において２次検出プローブの標識は酵素であることが好ましい。標識として使用される酵素の種類は、検出に利用できる限り任意であり、当該技術分野において知られるものから適宜選択して使用することができる。例えば、酵素としては、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼを利用することができる。これらの酵素を用いる場合、対応する基質を添加し、得られる酵素反応を検出することで標的核酸の存在（及び量）を検出することができる。
　以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
［実施例１］　
　測定操作は小型化学発光免疫自動分析装置ＰＯＣｕｂｅ（東洋紡社製）を用いて以下のように行った。なお、各試薬はＰＯＣｕｂｅ専用１３連容器（図１）の検体ウェルおよび試薬ウェル（１）～（１２）に別々に調製した。
検体ウェル：測定対象の１０ｎＭ　ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１（配列番号１）
試薬ウェル（１）：反応Ｂｕｆｆｅｒとして１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ＝８．８）試薬ウェル（２）：Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体１（ａｂ４９３６８、Ｒａｂｂｉｔ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ａｂｃａｍ社製）を１％ＢＳＡ－ＴＢＳ溶液で１万倍希釈した抗体試薬
試薬ウェル（３）：１μＭ　Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ１（配列番号２、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）と、１μＭ　ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ１（配列番号３、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）との混合試薬
試薬ウェル（４）：ブロッキング液として１％カゼイン／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液
試薬ウェル（５）：洗浄液として１％Ｔｗｅｅｎ２０－ＴＢＳ溶液
試薬ウェル（６）：発光基質としてＡＰＳ－５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）
試薬ウェル（７）：蒸留水
試薬ウェル（８）～（１２）：空の試薬ウェル
　初めに、検体ウェルのＴａｒｇｅｔＤＮＡ１００μＬ、試薬ウェル（１）の反応Ｂｕｆｆｅｒ１２μＬ、試薬ウェル（３）の混合試薬３μＬ、試薬ウェル（７）の蒸留水３．２μＬを、空の試薬ウェル（８）で混合し、４０℃で１０分間静置することで、ハイブリダイゼーション反応によるＢｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ／ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ／ＴａｒｇｅｔＤＮＡの３者複合体を形成した。
　次いで、前記試薬ウェル（８）の混合液を９８．５μＬと、試薬ウェル（２）の抗体試薬１．５μＬを、空の試薬ウェル（９）で混合し、４０℃で５分間静置することで、抗原－抗体反応によるＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体／Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ／ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ／ＴａｒｇｅｔＤＮＡの４者複合体を形成した。
　次いで、ＰＯＣｕｂｅ専用反応容器（抗Ｂｉｔｏｉｎ抗体を結合させたガラスフィルターを含む容器）に、試薬ウェル（４）のブロッキング液５０μＬを滴下し、４０℃で５分間静置した後、前記試薬ウェル（９）の混合液８０μＬを反応容器に滴下し、４０℃で２分間静置することで、前記４者複合体を反応容器に結合させた。
　次いで、反応容器に試薬ウェル（５）の洗浄液８０μＬを２回滴下することでＢＦ分離を行った後、試薬ウェル（６）の発光基質３０μＬを滴下し、ＰＯＣｕｂｅにて発光強度を測定した。得られた発光強度をシグナルの発光強度とし、検体ウェルに測定対象のＴａｒｇｅｔＤＮＡの代わりに蒸留水を用いる以外は同様の操作を経て得られた発光強度をノイズの発光強度とし、下式（１）よりＳ／Ｎ比で算出した。得られたＳ／Ｎ比は１６０であった。Ｓ／Ｎ比は、２以上であれば検出可能と判断でき、より高い方が好ましい。２以上が好ましく、３０以上がより好ましく、７０以上が更に好ましく、１００以上がより特に好ましく、２００以上が最も好ましい。
　Ｓ／Ｎ比＝シグナルの発光強度／ノイズの発光強度　　　　　式（１）
　また、検体ウェルの測定対象の１０ｎＭ　ＴａｒｇｅｔＤＮＡの濃度を１／１０ずつ段階的に希釈しながら上記と同様の操作を行い、Ｓ／Ｎ＝２．０以上を維持できる最小濃度を最小検出感度として求めた。実施例１の最小検出感度は、０．１ｐＭであった。最小濃度は低い程好ましく、１ｎＭ以下、好ましくは１００ｐＭ以下、より好ましくは１０ｐＭ以下、更に好ましくは１ｐＭ以下、特に好ましくは０．１ｐＭ以下、最も好ましくは０，０１ｐＭ以下である。
［実施例２～７］捕捉核酸プローブのバリエーション　
　Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ１（配列番号２、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）の代わりに、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ２（配列番号４、Ｔｍ＝６０．５℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ３（配列番号５、Ｔｍ＝６２．４℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ４（配列番号８、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ５（配列番号９、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ６（配列番号１０、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、又はＢｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ７（配列番号１１、Ｔｍ＝６１．９℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、標識捕捉ＤＮＡプローブ２について１５０、標識捕捉ＤＮＡプローブ３について１００、標識捕捉ＤＮＡプローブ４について４０、標識捕捉ＤＮＡプローブ５について５０、標識捕捉ＤＮＡプローブ６について８０、標識捕捉ＤＮＡプローブ７について１８０であった。また、最小検出感度は、標識捕捉ＤＮＡプローブ２について０．１ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ３について０．１ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ４について１０ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ５について１０ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ６について１ｐＭ、標識捕捉ＤＮＡプローブ７について０．１ｐＭであった。
［実施例８～１４］検出核酸プローブのバリエーション　
　ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ１（配列番号３、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）の代わりに、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ２（配列番号６、Ｔｍ＝６１．８℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ３（配列番号７、Ｔｍ＝６９．０℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ４（配列番号１２、Ｔｍ＝３５．０℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ５（配列番号１３、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ６（配列番号１４、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ７（配列番号１５、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）、又はＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ８（配列番号１６、Ｔｍ＝５７．４℃、ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社製）を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、標識検出ＤＮＡプローブ２について２００、標識検出ＤＮＡプローブ３について２４０、標識検出ＤＮＡプローブ４について４．０、標識検出ＤＮＡプローブ５について４０、標識検出ＤＮＡプローブ６について５０、標識検出ＤＮＡプローブ７について８０、標識検出ＤＮＡプローブ８について２００であった。また、最小検出感度は、標識検出ＤＮＡプローブ２について０．０１ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ３について０．０１ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ４について１００ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ５について１０ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ６について１０ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ７について１ｐＭ、標識検出ＤＮＡプローブ８について０．０１ｐＭであった。
［実施例１５～１９］２次検出プローブのバリエーション　
　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体１（ａｂ４９３６８、Ｒａｂｂｉｔ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ａｂｃａｍ社製）の代わりに、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体２（Ａ５７１９、Ｒａｂｂｉｔ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＳＩＧＭＡ社製）、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体３（２００－０５２－０３７、ｍｏｕｓｅ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ社製）、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体４（Ａ１８１２、ｍｏｕｓｅ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、ＳＩＧＭＡ社製）、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体５（ＮＢ１００－６４６１８、Ｓｈｅｅｐ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＮＯＶＵＳ社製）、又はＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識抗ＦＩＴＣ抗体６（６０４００／０４、Ｓｈｅｅｐ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ社製）を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、ＦＩＴＣ抗体２について１６０、ＦＩＴＣ抗体３について８０、ＦＩＴＣ抗体４について９０、ＦＩＴＣ抗体５について５．０、ＦＩＴＣ抗体６について５．０であった。また、最小検出感度は、ＦＩＴＣ抗体２について０．１ｐＭ、ＦＩＴＣ抗体３について１ｐＭ、ＦＩＴＣ抗体４について１ｐＭ、ＦＩＴＣ抗体５について１ｎＭ、ＦＩＴＣ抗体６について１ｎＭであった。
［実施例２０～２５］ブロッキング液のバリエーション　
　ブロッキング液として１％カゼイン／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液の代わりに、１％ＢＰＦ／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液、１％カゼイン－ＴＢＳ溶液、１％ＢＳＡ－ＴＢＳ、１％ＢＳＡ／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ、１％ＢＳＡ－ＴＢＳ、又はＴＢＳを用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、１％ＢＰＦ／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液について１５０、１％カゼイン－ＴＢＳ溶液について９０、１％ＢＰＦ－ＴＢＳについて８０、１％ＢＳＡ／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳについて４０、１％ＢＳＡ－ＴＢＳについて２０、ＴＢＳについて５．０であった。また、最小検出感度は、１％ＢＰＦ／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳ溶液について０．１ｐＭ、１％カゼイン－ＴＢＳ溶液について１ｐＭ、１％ＢＳＡ－ＴＢＳについて１ｐＭ、１％ＢＳＡ／１００μＭ　ｄＮＴＰｓ－ＴＢＳについて１０ｐＭ、１％ＢＳＡ－ＴＢＳについて１０ｐＭ、ＴＢＳについて１ｎＭであった。
［実施例２６～３３］反応バッファーのバリエーション　
　反応Ｂｕｆｆｅｒとして１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．８）の代わりに１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）、又は蒸留水を用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）について８０、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）について９０、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）について１３０、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）について１５、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）について４０、１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）について５．０、蒸留水について５．０であった。また、最小検出感度は、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）について１ｐＭ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）について１ｐＭ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）について０．１ｐＭ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）について１ｎＭ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）について１０ｐＭ、１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）について１ｎＭ、蒸留水について１ｎＭであった。
［実施例３４］洗浄液のバリエーション　
　洗浄液として１％Ｔｗｅｅｎ２０－ＴＢＳ溶液の代わりにＴＢＳを用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、２０であった。また、最小検出感度は、１０ｐＭであった。
［実施例３５］
　ＴａｒｇｅｔＤＮＡとしてＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の代わりに、ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１とＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の相補鎖をハイブリダイズさせた２本鎖ＤＮＡを用い、且つ検体ウェルのＴａｒｇｅｔＤＮＡ１００μＬ、試薬ウェル（１）の反応Ｂｕｆｆｅｒ１２μＬ、試薬ウェル（３）の混合試薬３μＬ、試薬ウェル（７）の蒸留水３．２μＬを、空の試薬ウェル（８）で混合した後、９４℃で５分間熱処理を行う以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、８０であった。また、最小検出感度は、１ｐＭであった。
［実施例３６］
　ＴａｒｇｅｔＤＮＡとしてＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の代わりに、ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１とＴａｒｇｅｔＤＮＡ１の相補鎖をハイブリダイズさせた２本鎖ＤＮＡを用いる以外は、実施例１と同様にして、Ｓ／Ｎ比を測定した。得られたＳ／Ｎ比は、２０であった。また、最小検出感度は、１０ｐＭであった。
　以上の試験で使用した各ＤＮＡ分子の塩基配列は下記のとおりである。
ＴａｒｇｅｔＤＮＡ１
5’-CACCCGTTAGGCGCAACGGGACGGAAAGACCCCGTGAAGCTTTACTGTAGCTTAATATTGATCAGGACATTATCATGTAGAGAATAGGTAGGAGCAAT-3’（配列番号１）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ１
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTTTA－TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号２）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ１
5’-ＦＩＴＣ－TTTTT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号３）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ２
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TAATT－TCCTACCTATTCTCTACATGATAATGTC-3’ （配列番号４）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ３
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTTAT－TTCTCTACATGATAATGTCCTGATCA-3’（配列番号５）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ２
5’-ＦＩＴＣ－TTTTT－GTCTTTCCGTCCCGTTG-3’ （配列番号６）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ３
5’-ＦＩＴＣ－TTTTT－GGTCTTTCCGTCCCGTTGC-3’ （配列番号７）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ４
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号８）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ５
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号９）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ６
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号１０）
Ｂｉｏｔｉｎ標識捕捉ＤＮＡプローブ７
5’-Ｂｉｏｔｉｎ－TTTTTTTTTA-TGCTCCTACCTATTCTCTACATGATAA-3’ （配列番号１１）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ４
5’-ＦＩＴＣ－TTTTA－CTTTCCGTCCCGT-3’ （配列番号１２）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ５
5’-ＦＩＴＣ－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１３）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ６
5’-ＦＩＴＣ－TT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１４）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ７
5’-ＦＩＴＣ－TTTT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１５）
ＦＩＴＣ標識検出ＤＮＡプローブ８
5’-ＦＩＴＣ－TTTAATTTTT－TCTTTCCGTCCCGTT-3’ （配列番号１６）

Claims (16)

  1. 標的核酸の検出方法であって、
    （１）標的核酸にハイブリダイズする標識された捕捉核酸プローブ、及び標的核酸にハイブリダイズする標識された検出核酸プローブを準備する工程
    （２）標的核酸を含む試料と捕捉核酸プローブを混合し、標的核酸に捕捉核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
    （３）標的核酸を含む試料と検出核酸プローブを混合し、標的核酸に検出核酸プローブをハイブリダイズさせる工程
    （４）捕捉核酸プローブの標識を特異的に認識する捕捉抗体が固定化された反応器に、捕捉核酸プローブがハイブリダイズした標的核酸を添加し、標的核酸を捕捉抗体に結合させる工程
    （５）反応器を洗浄し、標的核酸にハイブリダイズしていない検出核酸プローブを除去する工程、及び
    （６）検出核酸プローブの標識を検出する工程
    を含む、方法。
  2. 工程（２）～工程（４）をｐＨ７．６～９．０の緩衝液中で行う、請求項１に記載の方法。
  3. 捕捉核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されている、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 検出核酸プローブは、標的核酸に相補的な領域（相補的領域）、及び相補的領域の末端に標的核酸と非相補的な核酸領域（リンカー領域）を有し、リンカー領域の相補的領域と隣接していない側の末端が標識されている、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 捕捉核酸プローブのリンカー領域が３～１５ヌクレオチド残基からなる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 検出核酸プローブのリンカー領域が３～１５ヌクレオチド残基から成る、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 捕捉核酸プローブのＴｍ値が４５～７５℃である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 検出核酸プローブのＴｍ値が４５～７５℃である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 捕捉核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、検出核酸プローブの標識とは異なる、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 検出核酸プローブの標識がビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光物質から成る群より選択され、且つ、捕捉核酸プローブの標識とは異なる、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 蛍光物質がフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにシアニン及びその誘導体から成る群より選択される、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 工程（６）が、検出核酸プローブの標識を特異的に認識し、且つ、標識された検出抗体を、検出核酸プローブに結合させる工程を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 検出抗体の標識がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、及びペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）から成る群より選択される、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 検出抗体が、ウサギ抗体、マウス抗体、及びラット抗体から成る群より選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 捕捉抗体が固定化された反応器がカゼイン、及びＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）から成る群より選択されるブロッキング剤でブロッキングされている、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
  16. ブロッキング剤が、さらにｄＮＴＰｓを含有する、請求項１５に記載の方法。
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