JP5526337B2 - 核酸のハイブリダイゼーション方法及び一塩基多型の判定方法 - Google Patents

核酸のハイブリダイゼーション方法及び一塩基多型の判定方法 Download PDF

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Description

本発明は、核酸のハイブリダイゼーション方法及び一塩基多型の判定方法に関し、更に詳細には高い特異性を有する核酸のハイブリダイゼーション方法、及びそれを用い、医療現場等で簡便に実施可能で判定精度の高い一塩基多型の判定方法に関する。
ゲノムの全塩基配列には個体差があり、そのうち1塩基レベルの個体差(より厳密には、人口の1%以上の頻度で出現するもの)を一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms:SNP)と呼ぶ。ヒトDNAでは、約1000塩基に1つの頻度でSNPが存在すると考えられている。大多数のSNPは非翻訳領域に存在し、遺伝的な特徴の変化をもたらさないが、遺伝子や制御領域にあるSNPは、遺伝的な個体差を生じさせている可能性がある。遺伝子治療及び診断技術の向上に伴い、薬剤感受性(耐性及び副作用の有無等)、感染症への抵抗性、生活習慣病の環境要因、がん、アルツハイマー病、ペットの遺伝病等の種々の疾患の発症リスク等について、遺伝子の一塩基多型により説明可能な事例が多く発見されている。このことから、SNPの解析により、個人別のテーラーメイド医療や予測医療への可能性が広がると期待されている。
テーラーメイド医療や予測医療の実現のためには、医療現場において迅速、容易かつ安価に実施可能で、信頼性の高い一塩基多型の判定(タイピング)方法及びシステムの確立が急務である。遺伝子解析の市場は着実に広がりつつあり、多くの遺伝子配列解析技術の手法が開発されている。それらの手法は、ポリ(オリゴ)ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用するもの、核酸の伸長、連結、切断等を行う酵素による特定配列の認識効率を利用するものに大別される(例えば、非特許文献1参照)。また、近年、SNPのタイピング方法に関する研究の活発化に伴い、それに関連する特許出願も多くなされている。
特許文献1には、特定の遺伝子のSNP近傍の配列を少なくとも有し、かつ、SNPの塩基種がそれぞれ異なる4種類の検出用プローブと、同じくその遺伝子のSNP近傍の配列を少なくとも有する試料中の標的核酸とを、それぞれハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程、一本鎖核酸部位を特異的に切断する酵素等を用いて、ハイブリダイゼーション工程により形成された二本鎖核酸の非相補的な塩基対部位を切断するミスマッチ部位切断工程、ミスマッチ部位切断工程において切断された核酸のみを一本鎖に変性させる核酸変性工程、核酸変性工程後も二本鎖の状態を保持している検出用プローブを検出する塩基種検出工程を含み、DNAチップ等に適用可能なSNP判別方法が開示されている。
特許文献2には、検体中の標的核酸と固相担体上の複数種のプローブをハイブリダイゼーションさせる際に、検体を複数に分割することで、それぞれのプローブ種に複数のストリンジェンシーを与えてハイブリダイゼーションさせると共に、プローブ配列において、標的核酸に対し完全相補的な塩基配列からなるプローブとミスマッチを含む塩基配列を有するプローブを設計し、ハイブリダイゼーション結果を比較することで一塩基差まで検出することができる核酸の塩基配列解析方法が開示されている。
特許文献3には、各標的核酸に対し標的核酸の少なくとも一部に対する完全及び/又は不完全マッチプローブからなるプローブ群を準備し、複数種の標的核酸を含む試料と各プ
ローブ群とを適宜の条件で接触させ、ハイブリッド体シグナル強度を該完全及び/又は不完全マッチプローブに各々対応して測定し、完全マッチプローブ対応の 第一シグナルデータ、並びに/又は不完全マッチプローブ対応の第二シグナルデータを取得し、各プローブ群の第一及び/又は第二シグナルデータから、プローブ群に関連づけられた最適反応条件でのデータを第一及び/又は第二試験データとして抽出し、第一及び/又は第二試験データにフィルタリング処理を行い、試料核酸における標的核酸の配列を判定し、全種標的核酸の判定結果を統合する核酸配列解析方法が開示されている。
特開2007−175017号公報 特開2007−174986号公報 特開2006−6220号公報
関根光雄著「新しいDNAチップの科学と応用」、講談社サイエンティフィック、2007年7月30日、ISBN978−4−06−153864−1、p.127−139
しかしながら、ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用するSNPのタイピング方法には、ミスマッチを有するポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション(ミスハイブリダイゼーション)に起因するバックグラウンドノイズの発生、ハイブリダイゼーションの条件を厳密に設定する必要があるため条件設定に多大な労力を要する等の問題がある。また、酵素による特定配列の認識効率を利用するSNPのタイピング方法には、特殊な酵素を必要としたり、酵素が効果的に働くための条件が特殊であることが多く、やはり条件設定に多大な労力を必要としたりする等の問題がある。
特許文献1記載のSNP判別方法では、ミスマッチがあってもハイブリダイズさせる必要があるため、長いプローブ核酸を用意する必要があると共に、高価な制限酵素が必要であり、酵素処理時間のために数時間を必要とするため、迅速な判定が困難であるという問題がある。
特許文献2記載の核酸の塩基配列解析方法では、確実な判定を行うために多量のサンプルが必要となる。また、異なった条件でいくつかのプローブに対する結合の判定をおこない、それを総合的に判断する必要があることから、測定後の決定プロトコルが複雑となる。さらに異なった条件下での結合をそれぞれ測定する必要があることから多大な測定時間が必要であるという問題がある。
特許文献3記載の核酸配列解析方法では、異なった条件で複数のプローブに対するハイブリダイゼーションの判定を行い、得られた結果を総合的に判断する必要があることから、多量のサンプルが必要となる。また、測定後の決定プロトコルが複雑となる。更に、異なる条件下でのハイブリダイゼーションをそれぞれ測定する必要があることから長い測定時間が必要であると共に、高価な測定装置を必要とするという問題がある。
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、高い特異性を有する核酸のハイブリダイゼーション方法、及びそれを用い、医療現場等で簡便に実施可能で判定精度の高い一塩基多型の判定方法を提供することを目的とする。
前記目的に沿う本発明の第1の態様は、ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を含む試料を、前記標的塩基配列と相補的なプローブ塩基配列を有するプロー核酸と接触させ、前記試料中の前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる方法において、前記プローブ塩基配列の塩基数が10以上20以下であり、前記標的塩基配列よりも5’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を5’末端側に有する5’末端側ブロック核酸及び/又は前記標的塩基配列よりも3’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を3’末端側に有する3’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記5’末端側ブロック核酸及び/又は前記3’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることを特徴とする核酸のハイブリダイゼーション方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
なお、本発明において「A及び/又はB」とは、A及びBのいずれか一方又は双方と同義であり、例えば、「A及び/又はBの存在下」という表現には、(1)Aのみの存在下、(2)Bのみの存在下、並びに(3)A及びBの両者の存在下の全てが包含される。
プローブ核酸と、5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とをハイブリダイズさせることにより、標的塩基配列とプローブ塩基配列との間にミスマッチが存在する場合の非特異的なハイブリダイゼーションの効率を低下させると共に、互いに相補的な塩基配列を有するプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上させ、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができる。そのため、塩基配列中の一塩基のみの相違を高精度に検出する必要のあるSNPのタイピングに好適であると共に、複数の測定条件下で得られた複数の実験データを処理する等の煩雑な手順の実行や、それに要する労力を軽減できる。
また、ハイブリダイゼーションを利用したSNPのタイピングはもとより、特定の塩基配列を有する核酸の検出や分離の効率を向上できる。また、標的塩基配列以外の塩基配列部分において、標的核酸と、5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は2本鎖を形成する。それにより、標的核酸の高次構造の形成を抑制できるため、プローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
本発明の第1の態様に係る核酸のハイブリダイゼーション方法において、前記標的核酸中に存在する前記標的塩基配列の3’末端側末端と、前記3’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の5’末端側との間、及び/又は前記標的塩基配列と相補的な塩基配列の5’末端側末端と、前記5’末端側ブロック核酸の塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列の3’末端側との間に、1から15塩基分のギャップが存在する。
ギャップの長さ(塩基数)を上記範囲とすることにより、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを阻害することなく、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの特異性を向上させることができる。
本発明の第1の態様に係る核酸のハイブリダイゼーション方法において、前記プローブ核酸がDNAであることが好ましい。
RNA等よりも安定なDNAをプローブ核酸とすることにより、プローブ核酸の耐久性を増大させることができると共に、ハイブリダイゼーションの再現性を向上させることができる。
本発明の第1の態様に係る核酸のハイブリダイゼーション方法において、前記プローブ塩基配列の塩基数10以上20以下である。
プローブ塩基配列の塩基数を上記範囲とすることにより、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチを有する核酸とのハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドノイズを増大させることなく、塩基配列特異性を向上できる。
本発明の第2の態様は、判定の対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を、前記標的塩基配列に存在する一塩基多型(SNP)の一部又は全部のそれぞれと相補的な塩基数10以上20以下のプローブ塩基配列を含み、相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置された複数のプロー核酸と、前記標的塩基配列よりも5’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を5’末端側に有する5’末端側ブロック核酸及び/又は前記標的塩基配列よりも3’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を3’末端側に有する3’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記5’末端側ブロック核酸及び/又は前記3’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で接触させ、前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとを特異的にハイブリダイズさせる工程Aと、
前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する工程Bとを有することを特徴とする一塩基多型の判定方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
なお、本発明において「反応器」とは、標的核酸を含む溶液を充填する容器又は流通させる流路の(溶液と接触する)内壁面上の所定の位置にプローブ核酸が配置され、標的核酸とプローブ核酸を接触させ、ハイブリダイズさせるよう構成されたものをいう。
単一の容器及び流路のいずれかに全てのプローブ核酸が配置されているため、全ての一塩基多型に対応するプローブ核酸について、同一の条件下でハイブリダイゼーションさせることができる。そのため、ハイブリダイゼーション条件の相違に起因するバックグラウンドノイズの発生を抑制し、一塩基のみの相違を高精度で検出できると共に、条件設定のための労力を低減できる。したがって、複雑な条件設定のために多大な労力や熟練を要することなく、医療現場等において迅速かつ簡便に高精度なSNPのタイピングを行うことが可能となる。
本発明の第2の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記工程Aにおいて、前記標的塩基配列よりも5’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を5’末端側に有する5’末端側ブロック核酸及び/又は前記標的塩基配列よりも3’末端側に位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を3’末端側に有する3’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記5’末端側ブロック核酸及び/又は前記3’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる。
プローブ核酸と、5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とをハイブリダイズさせることにより、標的塩基配列とプローブ塩基配列との間にミスマッチが存在する場合の非特異的なハイブリダイゼーションの効率を低下させると共に、互いに相補的な塩基配列を有するプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上させ、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができる。そのため、複数の測定条件下で得られた複数の実験データを処理する等の煩雑な手順の実行や、それに要する労力を軽減できる。また、標的塩基配列以外の塩基配列部分において、標的核酸と、5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は2本鎖を形成する。それにより、標的核酸の高次構造の形成を抑制できるため、プローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
本発明の第2の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記標的核酸中に存在する前記標的塩基配列の3’末端側末端と、前記3’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の5’末端側、及び/又は前記標的塩基配列の5’末端側末端と、前記5’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列の3’末端側との間に、1から15塩基分のギャップが存在する。
ギャップの長さ(塩基数)を上記範囲とすることにより、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを阻害することなく、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの特異性を向上させることができる。
本発明の第2の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記プローブ核酸がDNAであることが好ましい。
RNA等よりも安定なDNAをプローブ核酸とすることにより、プローブ核酸の耐久性を増大させることができると共に、ハイブリダイゼーションの再現性を向上させることができる。
本発明の第2の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記プローブ塩基配列の塩基数10以上20以下である。
プローブ塩基配列の塩基数を上記範囲とすることにより、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチを有する核酸とのハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドノイズを増大させることなく、塩基配列特異性を向上できる。
本発明の第2の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記プローブ塩基配列の5’末端及び3’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれも前記プローブ塩基配列の塩基数の1/3倍よりも大きいことが好ましい。
一塩基多型に対応する塩基が、各領域の塩基数が(ほぼ)等しくなるようにプローブ塩基配列を3つの領域に分割した場合(具体例については後述する。)における中央部に位置すると、ミスマッチが存在する核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下するため、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができる。なお、プローブ塩基配列と相補的な標的塩基配列中の一塩基多型に対応する塩基の位置についても同様である。
本発明の第2の態様に係る一塩基多型の判定方法において、前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを、表面プラズモン共鳴及び金の異常反射のいずれかにより検出してもよい。
これらの方法によると、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの検出をリアルタイムに行うことができるため、SNPのタイピングに要する時間を短縮し、スループットを向上できる。また、プレートリーダー等に比べ安価な装置で位置特異的なハイブリダイゼーションの検出が可能であるため、医療現場等において簡便に一塩基多型のタイピングを行うことができる。
本発明によると、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性が高く、塩基配列中の一塩基のみの相違を高精度に検出する必要のあるSNPのタイピングや、特定の塩基配列を有する核酸の検出や分離の効率及び特異性を向上させ、これらに好適に適用できる核酸のハイブリダイゼーション方法が提供される。
また、本発明によると、複雑な条件設定のために多大な労力や熟練を要することなく、医療現場等において迅速かつ簡便に高精度なSNPのタイピングを行うことが可能な一塩基多型(SNP)の判定方法が提供される。
また、本発明によると、上記の一塩基多型の判定方法に好適に用いることができる一塩基多型判定用反応器及びそれを用いた一塩基多型判定装置が提供される。
本発明の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法及び一塩基多型の判定方法における、標的核酸と、5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸とのハイブリダイゼーションの状態を示す模式図である。 本発明の第4の実施の形態に係る一塩基多型判定装置のブロックダイアグラムである。 実施例1における、標的塩基配列の塩基長とハイブリダイゼーション効率との関係を示すグラフである。 実施例1における、標的塩基配列の塩基長とハイブリダイゼーションの塩基配列特異性との関係を示すグラフである。 実施例1における、標的塩基配列中のミスマッチの位置とハイブリダイゼーションの塩基配列特異性との関係を示すグラフである。 実施例1における、3’末端側ブロック核酸がハイブリダイゼーションの塩基配列特異性に及ぼす影響を示すグラフである。 実施例1において一塩基多型の判定に使用した標的核酸、プローブ核酸、リンカー核酸及び3’末端側ブロック核酸の塩基配列を示す図である。 実施例1における一塩基多型の判定において、各ジェノタイプに対応する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。 同ハイブリダイゼーションのパターンからジェノタイプを判定するためのアルゴリズムを示す図である。 実施例1において、被験者に由来する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。 実施例2における一塩基多型の判定において、各ジェノタイプに対応する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。 実施例2において、被験者に由来する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターン及び判定結果を示すグラフである。 実施例3における一塩基多型の判定において、各ジェノタイプに対応する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターンを示すグラフである。 実施例3において、被験者に由来する標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのパターン及び判定結果を示すグラフである。
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
(I)核酸のハイブリダイゼーション方法
図1を参照しながら、本発明の第1の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法について説明する。なお、図1において、他の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列を白又はハッチングで表し、それ以外の塩基配列を黒で表している。また、以下の説明において、塩基配列の名称の後に付したカッコ入りのアルファベットは、図1においてそれぞれの塩基配列に付したアルファベットに対応している。
本実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法は、ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を含む試料を、標的塩基配列と相補的なプローブ塩基配列を有するプロー核酸と接触させ、試料中の標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる方法であり、図1に示すように:
(A)標的塩基配列(t)よりも5’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部又は全部(a:図1では標的塩基配列(t)よりも5’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部である場合について例示しているが、5’末端までの塩基配列の全部であってもよい。)とハイブリダイズ可能な塩基配列(a’)を5’末端側に有する5’末端側ブロック核酸、及び/又は
(B)標的塩基配列(t)よりも3’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部又は全部(b:図1では標的塩基配列(t)よりも3’末端側に位置する標的核酸中の塩基配列の一部である場合について例示しているが、3’末端までの塩基配列の全部であってもよい。)とハイブリダイズ可能な塩基配列(b’)を3’末端側に有する3’末端側ブロック核酸
を標的核酸と接触させ、5’末端側ブロック核酸、及び/又は3’末端側ブロック核酸が、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる。
標的核酸と、5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は2本鎖を形成するため、標的塩基配列(t)以外の標的核酸中の塩基配列がプローブ塩基配列(p)と非特異的にハイブリダイズすることを抑制できる。また、標的核酸中の異なる位置に存在する塩基配列同士が分子内でハイブリダイズして高次構造を形成するのを抑制できるため、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
(1)標的核酸
ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列(t)を有する標的核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびその誘導体を少なくとも一つ以上含んで構成される任意のポリヌクレオチドである。なお、「ポリヌクレオチド」とは、2以上の任意の数のヌクレオチドが縮合した化合物を意味し、いわゆる「オリゴヌクレオチド」も、本発明における「ポリヌクレオチド」に含まれる。ポリヌクレオチドの具体例としては、DNA、cDNA、mRNA(メッセンジャーRNA:スプライシング前のものであってもスプライシング後のものであってもよい)、tRNA(トランスファーRNA)、或いはそれらの断片等が挙げられる。また、ポリヌクレオチド或いはそれを含む試料の起源は特に制限されず、生体(動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウィルス等の任意の生命体を意味する)試料由来のもの、生体試料由来の核酸をPCR法等により増幅及び/又は制限酵素等に(標的塩基配列を途中で切断しないものを選択する必要がある。)より断片化したもの、化学合成されたものであってよく、これらのうち2以上の混合物であってもよい。
標的核酸中に含まれる標的塩基配列(t)の位置は特に制限されず、核酸の分子鎖の中央付近であってもよく、5’末端又は3’末端の近傍であってもよい。標的塩基配列(t)の長さ、すなわち標的塩基配列(t)の塩基数は、後述するプローブ塩基配列(p)の塩基数と等しい。標的核酸塩基配列以外の塩基配列の長さについても特に制限はなく、同様に、標的核酸の総塩基数についても特に制限はない。
標的核酸を含む試料の調製には、核酸を含む試料の調製に通常用いられる任意の溶媒、緩衝剤等の添加物及び調製方法を用いることができ、標的核酸の種類及び起源、プローブ核酸とのハイブリダイゼーションの条件等に応じて適宜選択することができる。
例えば、ハイブリダイゼーションの対象となる核酸において、少なくとも標的塩基配列近傍の塩基配列が既知である場合、標的塩基配列を含む30〜1000塩基からなる塩基配列を選択し、その両端付近にハイブリダイズ可能なプライマーを設計する。プライマーの設計には、任意の公知の方法(例えば、Primer3等のプライマー設計プログラムの使用)を用いることができる。このようにして設計したプライマーを用いて、PCR法により標的核酸の増幅を行う。なお、非対称PCR法を用いて、標的核酸を1本鎖核酸として調製してもよい。
(2)5’末端側及び3’末端側ブロック核酸
標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させるために、下記の(A)に示す5’末端側ブロック核酸、及び/又は下記の(B)に示す3’末端側ブロック核酸を標的核酸と接触させ、5’末端側ブロック核酸、及び/又は3’末端側ブロック核酸が、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列(a及び/又はb)とハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる。
(A)5’末端側ブロック核酸:標的核酸中の塩基配列(a)とハイブリダイズ可能な塩基配列(a’)を5’末端側に含む核酸
(B)3’末端側ブロック核酸:標的核酸中の塩基配列(b)とハイブリダイズ可能な塩基配列(b’)を3’末端側に含む核酸
なお、以下において、5’末端側ブロック核酸及び3’末端側ブロック核酸を総称して「ブロック核酸」と略称する場合がある。
前述のように、標的核酸と、5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸とがハイブリダイズした箇所は2本鎖を形成するため、標的塩基配列(t)以外の標的核酸中の塩基配列がプローブ塩基配列(p)と非特異的にハイブリダイズすることを抑制できる。また、標的核酸中の異なる位置に存在する塩基配列同士が分子内でハイブリダイズして高次構造を形成するのを抑制できるため、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を向上できる。
図1に示すように、標的核酸中の塩基配列(a)とハイブリダイズ可能な5’末端側ブロック核酸中の塩基配列(a’)は、塩基配列(a)と完全に相補的であることが好ましいが、塩基配列(a)とハイブリダイズ可能であり、標的塩基配列とプローブ塩基配列とをハイブリダイズさせる条件下でもハイブリダイズした状態を維持できる限りにおいて、1又は複数のミスマッチを含んでいてもよい。同様に、標的核酸中の塩基配列(b)とハイブリダイズ可能な3’末端側ブロック核酸中の塩基配列(b’)は、塩基配列(b)と完全に相補的であることが好ましいが、塩基配列(b)とハイブリダイズ可能であり、標的塩基配列とプローブ塩基配列とをハイブリダイズさせる条件下でもハイブリダイズした状態を維持できる限りにおいて、1又は複数のミスマッチを含んでいてもよい。
ブロック核酸とハイブリダイズ可能な標的核酸中の塩基配列(a’及び/又はb’)の塩基数に特に制限はなく、勿論、標的塩基配列の塩基数と同一であっても異なっていてもよい。また、標的塩基配列よりも5’末端側及び3’末端側に位置するブロック核酸とハイブリダイズ可能な標的核酸中の塩基配列(a及び/又はb)の塩基数についても、同一であっても互いに異なっていてもよい。
ブロック核酸は、標的核酸中の塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列(a’及び/又はb’)のみからなるものであってもよく、標的核酸とのハイブリダイゼーションを阻害しない限りにおいて、それ以外の塩基配列を含んでいてもよい。
5’末端側ブロック核酸は、塩基配列(a)とハイブリダイズ可能な塩基配列(a’)よりも5’末端側に更に1又は複数の塩基を有していてもよいが、好ましくは、該塩基配列(a’)は5’末端に位置しており、5’末端には他の塩基を有しない。
同様に、3’末端側ブロック核酸は、塩基配列(b)とハイブリダイズ可能な塩基配列(b’)よりも3’末端側に更に1又は複数の塩基を有していてもよいが、好ましくは、該塩基配列(b’)は5’末端に位置しており、3’末端には他の塩基を有しない。
標的核酸中に存在する標的塩基配列(t)の3’末端側末端と、3’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列(b)の5’末端側、及び/又は標的塩基配列(t)の5’末端側末端と、5’末端側ブロック核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列(a)の3’末端側との間には、1から15塩基分、好ましくは1から6塩基分のギャップが存在する。ギャップが存在しないと、標的核酸とブロック核酸とがハイブリダイズして形成された2本鎖と標的塩基配列との間隔が小さくなりすぎ、立体障害によりプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下する。一方、ギャップの塩基数が15よりも大きくなると、標的塩基配列以外の標的核酸中の塩基配列とプローブ塩基配列との非特異的なハイブリダイゼーションにより、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下する。標的塩基配列よりも5’末端側及び3’末端側に存在するギャップの塩基数は同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。
(3)プローブ核酸
プローブ核酸としては、プローブ・ハイブリダイゼーション法で通常用いられる核酸をいずれも好適に使用することができる。使用することができる核酸の具体例としては、標的塩基配列に相補的なプローブ塩基配列を有するデオキシリボヌクレオチド(DNA)、リボヌクレオチド(RNA)及びその誘導体を少なくとも1以上含んで構成されるポリヌクレオチドが挙げられる。
プローブ塩基配列(p)の長さ、すなわちプローブ塩基配列(p)の塩基数は、ハイブリダイゼーションの対象となる標的核酸の塩基配列や塩基長等に依存するため一義的に決定することは困難であるが、一般に10以上20以下であり、好ましくは11以上15以下である。プローブ塩基配列(p)の塩基数が10を下回ると、統計上可能なプローブ塩基配列の総数(例えば、プローブ塩基配列の塩基数が9の場合、4=262144)が少なくなりすぎ、特異的にハイブリダイズ可能な核酸の種類が減少する。一方、プローブ塩基配列(p)の塩基数が20を上回ると、ミスマッチが存在しない標的塩基配列とプローブ塩基配列とのハイブリダイゼーションにより形成される2本鎖核酸と、1つの塩基のみがミスマッチである標的塩基配列とプローブ塩基配列とのハイブリダイゼーションにより形成される2本鎖核酸との間の熱的安定性の差が小さくなり、ハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性が低下する。
プローブ塩基配列(p)は、特に一塩基多型(SNP)の判定(タイピング)に使用される場合には、ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列(t)と完全に相補的であることが好ましいが、特定の標的核酸の種類やハイブリダイゼーションの条件において十分な塩基配列特異性を有している場合には、1又は複数のミスマッチを含んでいてもよい。
プローブ塩基配列(p)は、プローブ核酸中の任意の位置に存在していてよいが、好ましくは、5’末端側及び3’末端側のいずれかに存在していることが好ましい。ただし、ハイブリダイゼーションの容易さ(立体障害)等の観点から、固相担体上に固定されている側と反対側の末端側に存在していることがより好ましい。
プローブ塩基配列(p)よりも5’末端側又は3’末端側に更に1又は複数の塩基を有していてもよいが、好ましくは、プローブ塩基配列(p)は5’末端又は3’末端に位置しており、5’末端又は3’末端には他の塩基を有しない。
プローブ核酸としては、PCR法等で調製されたもの、化学的に合成されたもの、天然に由来する核酸をそのまま、または加工して使用したもの等どのようなものでも使用することができるが、調製の容易さから化学的に合成されたものを使用するのが好ましい。この場合、合成の容易さからポリデオキシリボヌクレオチド(DNA)、ポリリボヌクレオチド(RNA)、PNA(ペプチド核酸)等を使用するのが好ましいが、合成及び入手の容易さ並びに安定性の観点からDNAが好ましい。
プローブ核酸は、固相担体上でハイブリダイゼーションに使用されるため、ハイブリダイゼーションの前後において固相担体に結合及び吸着し続けるために、ハイブリダイゼーションを阻害しない限り任意の官能基又は分子で修飾されていてもよい。官能基又は分子は、5’末端及び3’末端側のいずれに位置していてもよい。したがって、プローブ核酸は、5’末端側及び3’末端側のいずれで固相担体上に固定されていてもよい。また、官能基又は分子は、固相担体上の表面に存在する官能基又は表面に結合させた官能基若しくは分子と結合する任意の官能基又は分子であってよく、その具体例としては、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、チオール基、スルフィド基、ビニル基、固相担体上に結合したアビジンと特異的に結合するビオチン、固相担体上に結合したポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド(標的核酸中の塩基配列及びプローブ塩基配列のいずれにも存在しない塩基配列を有するものであることが好ましく、ポリデオキシリボヌクレオチド(DNA)、ポリリボヌクレオチド(RNA)、及びPNA(ペプチド核酸)のいずれかである。)等が挙げられる。
プローブ核酸を化学合成する場合、固相担体上での固相合成法を用いて合成してもよく、液相法等の任意の方法により合成後されたプローブ核酸を固相担体上に固定してもよい。
固相担体の例としては、(1)ガラス、樹脂、セラミックス、金属(バルク材料、薄膜、微粒子等の任意の形態を取りうる)等の材質からなるマイクロタイタープレート、セル、フローセル、マイクロリアクター、チューブ、及び(2)シリカ、ポリスチレン等の材質からなるクロマトグラフィー用担体等が挙げられる。固相担体の表面への標的核酸、プローブ核酸及びブロック核酸の非特異的な吸着を避けるために、固相担体の表面を、カゼイン、ウシ血清アルブミン(BSA)等で被覆(ブロッキング)してもよい。
本実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法では、まず、標的核酸を含む試料に5’末端側ブロック核酸及び/又は3’末端側ブロック核酸を加え、これらを標的核酸と接触させ、5’末端側ブロック核酸、及び/又は3’末端側ブロック核酸を、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列(a及び/又はb)とハイブリダイズさせる。次いで、ブロック核酸とハイブリダイズした標的核酸をプローブ核酸と接触させ、これらをハイブリダイズさせる。標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが、塩基配列特異的な核酸の検出を目的とする場合には、任意の方法を用いてハイブリダイゼーションの検出を行う。また、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが、特定の塩基配列を有する核酸の単離を目的とする場合には、ハイブリダイゼーションしていない(プローブ塩基配列と相補的な塩基配列を有しない)核酸を洗浄除去後、標的核酸をプローブ核酸及びブロック核酸から解離させ、ブロック核酸と分離する。ハイブリダイズした核酸の解離及びブロック核酸の分離は、任意の方法を用いて行うことができる。
(II)一塩基多型(SNP)の判定(タイピング)方法
本発明の第2の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法は、判定の対象となる標的塩基配列(t)を有する標的核酸を、標的塩基配列(t)に存在する一塩基多型(SNP)の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列(p)を含み、相異なるプローブ塩基配列(p)を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置された複数のプロー核酸と接触させ、標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列(t)と相補的なプローブ塩基配列(p)を有するものとを特異的にハイブリダイズさせる工程Aと、標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列(t)と相補的なプローブ塩基配列(p)を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する工程Bとを有している。
なお、本発明において「反応器」とは、標的核酸を含む溶液を充填する容器又は流通させる流路の(溶液と接触する)内壁面上の所定の位置にプローブ核酸が配置され、標的核酸とプローブ核酸を接触させ、ハイブリダイズさせるよう構成されたものをいい、セル、フローセル、マイクロリアクター、チューブ等の任意の形態を取りうる。反応器の材質は特に制限されず、ハイブリダイゼーションの位置特異的な検出に用いる方法等に応じて、ガラス、樹脂、セラミックス、金属等の任意の材質を選択できる。
反応器中の容器又は流路の内壁面上には、標的塩基配列(t)に存在する一塩基多型(SNP)の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列(p)を含む(すなわち互いにプローブ塩基配列中の一塩基のみが異なる)複数種(プローブ塩基配列(p)において一塩基多型に対応する位置の塩基が、アデニン(A)、チミン(T)(又はウラシル(U))、グアニン(G)及びシトシン(C)のうち2〜4)のプローブ核酸が配置されている。ここで、相異なるプローブ塩基配列(p)を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置されている。なお、反応器の内壁面上に配置されるプローブ核酸は、単一の一塩基多型に対応する2〜4種類のもののみであってもよいが、互いにプローブ塩基配列(p)が異なっており、互いに独立してハイブリダイゼーションの検出が可能であれば、複数の一塩基多型に対応するプローブ核酸の組み合わせを単一の反応器の内壁面上に配置してもよい。
標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを単分子レベルで検出するためには、高価な検出装置を必要とするため、通常、個々の一塩基多型(SNP)に対応するプローブ核酸をそれぞれ複数用意し、反応器の内壁面上に配置する。この場合において、SNPの判定(タイピング)を行うためには、それぞれのプローブ核酸に対する特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する必要がある。そのため、同一のプローブ塩基配列を有するプローブ核酸同士を、所定の大きさ及び形状を有する所定の領域内にそれぞれ配置すると共に、それらの領域が互いに所定の距離だけ離れた位置となるように、それぞれのプローブ核酸が配置された状態で、プローブ核酸を内壁面上に固定する。プローブ核酸を内壁面上に固定する方法については、上述の第1の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法に関する説明において述べたとおりであるため、詳しい説明を省略する。また、それぞれの領域の形状、大きさ及び個々の領域間の距離は、反応器の大きさ、ハイブリダイゼーションを検出する手段の空間分解能等に応じて適宜決定することができる。
工程Aにおいて行われる標的核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させるためには、上述の第1の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法と同様、上記の(A)に示す5’末端側ブロック核酸、及び/又は上記の(B)に示す3’末端側ブロック核酸を標的核酸と接触させ、5’末端側ブロック核酸、及び/又は3’末端側ブロック核酸が、それぞれ標的核酸中のハイブリダイズ可能な塩基配列(a及び/又はb)とハイブリダイズした状態で標的核酸とプローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることが好ましい。
工程Aにおいて用いられる標的核酸及びそれを含む試料、ブロック核酸及びプローブ核酸、並びにハイブリダイゼーションの条件については、上述の第1の実施の形態に係る核酸のハイブリダイゼーション方法の場合と同様であるため、詳しい説明を省略する。なお、プローブ核酸において、プローブ塩基配列(p)の5’末端及び3’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列(p)の塩基数の1/3倍よりも大きいこと、すなわち、各領域の塩基数が(ほぼ)等しくなるようにプローブ塩基配列(p)を3つの領域に分割した場合における中央部に位置していることが好ましく、一塩基多型に対応する塩基がプローブ塩基配列(p)の中央に位置することがより好ましい。
なお、「塩基配列の中央に位置する(塩基)」とは、プローブ塩基配列(p)の塩基数がnである場合において、
(1)nが偶数の場合:5’末端側から(n/2)番目又は(n/2)+1番目
(2)nが奇数の場合:(n+1)/2番目に位置する塩基をいう。
例えば、プローブ塩基配列(p)の塩基数が13の場合、「プローブ塩基配列(p)の5’末端及び3’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列(p)の塩基数の1/3倍よりも大きい」位置とは、プローブ塩基配列の5’末端側から5〜9番目をいう。この場合、プローブ塩基配列は、5’末端側から3’末端側に向かって、塩基数がそれぞれ4、5、4である3つの領域に分割されたことになる。また、この場合におけるプローブ塩基配列(p)の「中央」とは、プローブ塩基配列の5’末端側から7番目をいう。
同様に、プローブ塩基配列(p)の塩基数が12の場合、「プローブ塩基配列(p)の5’末端及び3’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列(p)の塩基数の1/3倍よりも大きい」位置とは、プローブ塩基配列の5’末端側から5〜8番目をいい(この場合、プローブ塩基配列は、5’末端側から3’末端側に向かって、塩基数が全て4である3つの領域に分割されたことになる。)、この場合におけるプローブ塩基配列(p)の「中央」とは、プローブ塩基配列の5’末端側から6又は7番目をいう。
また、プローブ塩基配列(p)の塩基数が14の場合、「プローブ塩基配列(p)の5’末端及び3’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれもプローブ塩基配列(p)の塩基数の1/3倍よりも大きい」位置とは、プローブ塩基配列の5’末端側から5〜10番目をいい(この場合、プローブ塩基配列は、5’末端側から3’末端側に向かって、塩基数がそれぞれ4、6、4である3つの領域に分割されたことになる。)、この場合におけるプローブ塩基配列(p)の「中央」とは、プローブ塩基配列の5’末端側から7又は8番目をいう。
すなわち、プローブ塩基配列(p)を上記のように3つの領域に分割すると、塩基数が3の倍数のときは3つの領域の塩基数は全て等しくなり、3で割ると1又は2余る数のときは中央部の塩基数が両端部のそれよりもそれぞれ1又は2多くなるように分割される。
一塩基多型に対応する塩基がプローブ塩基配列(p)の中央に位置すると、ミスマッチが存在する核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下するため、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性を向上させることができ、一塩基多型(SNP)のタイピングの効率及び信頼性を向上できる。
工程Aにおけるプローブ塩基配列の長さ、3’末端側ブロック核酸及び/又は5’末端側ブロック核酸の使用の有無については、例えば下記のようにして決定できる。
(1)まず、一塩基多型に対応する塩基が中央に位置し、適当な塩基長(例えば、13塩基)のプローブ塩基配列を有するプローブ核酸を設計及び合成し、標的核酸とのハイブリダイゼーションを観測する。
(2)いずれのプローブ核酸についても共鳴信号の強度が大きく、十分な塩基配列特異性が観測されない場合は、プローブ塩基配列の塩基長を小さくし、共鳴信号の強度が小さく、ミスマッチを有するプローブ核酸に対するハイブリダイゼーション効率がより大きい等の非特異的なハイブリダイゼーションが観測される場合には、プローブ塩基配列の塩基長を大きくする。
(3)上記のようにプローブ塩基配列の塩基長を変更した結果、塩基配列特異性が改善されたが、なお不十分である場合には、3’末端側ブロック核酸及び5’末端側ブロック核酸のいずれか一方を添加し、改善が見られるか検討する。必要に応じて、他方も添加し同様に検討を行う。
プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを行う反応器中には、例えば、リン酸緩衝液、PBS(リン酸緩衝化生理食塩水)、HEPES緩衝液等のグット緩衝液、トリス緩衝液等の緩衝液を入れる。緩衝液の塩(NaCl、MgCl等)の濃度を調整することにより、プローブ核酸及び標的核酸の固相担体等への非特異的吸着を防止できる。また、緩衝液として、塩を含むHEPES緩衝液等を用いた場合も、核酸の非特異的吸着を防止できる。
上記のような緩衝液を入れた反応器中に標的核酸を含む溶液を滴下又は供給し、プローブ核酸と標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる。反応器内の温度は、例えば、ハイブリダイゼーション後、プローブ核酸及びブロック核酸と標的核酸とがハイブリダイズして形成された2本鎖のうち最もTm値の低いものが一本鎖核酸に変性しない温度にする。
工程Bでは、標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列(t)と相補的なプローブ塩基配列(p)を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する。ハイブリダイゼーションの検出には、反応器の内壁面上において、同一のプローブ塩基配列(p)を有するプローブ核酸同士が配置された個々の領域間の距離よりも空間分解能の小さな任意の方法を用いることができる。好ましい検出方法としては、ハイブリダイゼーションに伴う信号をリアルタイムかつ高感度で検出可能であり、高価な検出装置を必要としない表面プラズモン共鳴(SPR)法及び金の異常反射のいずれかが挙げられる。これらの検出法を用いる場合において、光の入射面側が透明であり、金の蒸着膜が形成された反応器が用いられる。この場合、金−チオール結合を介してプローブ核酸を表面に固定することもできる。
或いは、CMOS型FETのゲート電極の表面に、金の蒸着膜等の電極を介してプローブ核酸を固定し、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを電気的に読み出すことができるよう構成してもよい。この場合において、増幅器やマルチプレクサを集積化することにより、信号の増幅や一塩基多型の判定等の信号処理も行うことができるよう構成することも可能であり、装置の小型化、低コスト化、操作の簡便性及び信頼性の向上の観点から有利である。
(III)一塩基多形判定用反応器
本発明の第3の実施の形態に係る一塩基多型判定用反応器は、判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、標的塩基配列中に存在する一塩基多型(SNP)の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロー核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置されている。
反応器の材質及び形態、プローブ核酸の配置については、上述の第2の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法に関する説明において述べたとおりであるため、詳しい説明を省略する。
(IV)一塩基多形判定装置
図2に示すように、本発明の第4の実施の形態に係る一塩基多型判定装置10は、上述の第2の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法を実施するための装置であり、判定の対象となる標的塩基配列を有する溶液を充填する容器及び該溶液を流通させる流路のいずれか一方又は双方を有し、標的塩基配列中に存在する一塩基多型(SNP)の一部又は全部のそれぞれと相補的なプローブ塩基配列を有する複数のプロー核酸のうち相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が内壁面上のそれぞれ互いに相異なる所定の位置に配置された反応器12と、標的塩基配列を有する標的核酸とプローブ核酸のうち標的塩基配列と相補的な該プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する検出手段13とを有している。
反応器12及び検出手段13については、上述の第2の実施の形態に係る一塩基多型の判定方法及び第3の実施の形態に係る一塩基多型判定用反応器に関する説明において述べたとおりであるため、詳しい説明を省略するが、例えば、標的核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーションの検出に表面プラズモン共鳴(SPR)を用いる場合には、検出手段13は、光源(半導体レーザ等)、光学系(集光用レンズ、偏光子、プリズム、ビームスプリッタ等)、検出器(CCDカメラ、フォトダイオードアレイ等)、電子回路(差動アンプ、A/Dコンバータ等)等を有している。
或いは、反応器中12での標的核酸溶液の添加やハイブリダイゼーション等は手動で行ってもよい。
一塩基多型判定装置10は、反応器12及び検出手段13以外にも、標的核酸を含む試料を反応器12に供給する試料供給手段(ダイアフラムポンプ等)11、検出手段13からの信号を処理し、場合によっては一塩基多型の判定を行うデータ処理手段14、試料供給手段11、検出手段13及びデータ処理手段14の制御を行う制御手段15を有している。データ処理手段14及び制御手段15は、例えばパーソナルコンピュータであり、ハードディスクドライブ、ROM等の記憶装置に保存されたプログラムが中央演算処理装置(CPU)に読み込まれることにより、データ処理手段14及び制御手段15として機能する。一塩基多型判定装置10は、その他にも、反応器12の温度を調節するための図示しないヒータ等を有していてもよい。
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。これらの実施例は説明のための例示に過ぎず、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されない。また、本実施例においては、塩基配列の相補性及びミスマッチの有無を確認しやすくするために、標的核酸にハイブリダイズするプローブ核酸、リンカー核酸及びブロック核酸の塩基配列を3’末端→5’末端方向に記載する。
実施例1:モデル系アルデヒド脱水素酵素(ALDH2)によるハイブリダイゼーション検出条件の検討
飲酒により摂取されたエタノールの中間代謝産物であるアセトアルデヒドを酸化し、酢酸に変換するALDH2には遺伝子多型(一塩基多型)が存在し、遺伝子型により活性型であるALDH2*1型と不活性型であるALDH2*2型とに分けられる。ALDH2遺伝子の第12エクソンの104番目(5’末端から1035番目)の塩基が、前者においてはG(グアニン)である(以下、「G型」という。)のに対し、後者においてはA(アデニン)である(以下、「A型」という。)。その結果、ALDH2における487番目のアミノ酸が、前者においてはグルタミン酸(GAA)、後者においてはリジン(AAA)になる。遺伝子型が活性型ホモ接合体(G/G)の人は、エタノール及びアセトアルデヒド代謝が速いのに対し、ヘテロ接合体(G/A)及び不活性型ホモ接合体(A/A)の人は、アセトアルデヒド代謝が遅れるため、これらの人には顔面紅潮や不快症状(フラッシング症状)が現れる。特に後者は、酒に非常に弱く、いわゆる殆ど「飲めない」タイプである。白人や黒人では、G/Gの割合がほぼ100%であるのに対し、日本人では、G/Gの人が56%、G/Aが38%、A/Aが4%となっている。
(1)ハイブリダイゼーション検出系の構築及び表面共鳴プラズモン共鳴(SPR)法によるハイブリダイゼーションの検出
標的核酸として、G型のALDH2遺伝子の第12エクソンの104番目の塩基(下記の塩基配列中太字で示した核酸塩基)を含む30塩基からなり、下記の配列番号1で表される塩基配列を有する核酸を合成した。
上記配列番号1で表される塩基配列中、下線を付した20塩基を標的塩基配列とし、0〜3塩基のミスマッチを有するプローブ塩基配列を有するプローブ核酸として、下記の塩基配列2〜9で表される塩基配列を有する8種類の核酸を設計及び合成した。
上記配列番号2〜9で表される塩基配列中、太字で示した塩基は、配列番号1において太字で示した核酸塩基Gに対応する位置に存在する塩基(Cは相補的、Tはミスマッチ)であり、下線を付した塩基は、標的塩基配列中の対応する塩基と相補的な塩基である。また、イタリックで示した3’末端側の15塩基の配列は、後述するリンカー核酸(配列番号10)の5’末端側の15塩基の配列と相補的であり、SNP判定用チップの表面へのこれらのプローブ核酸の固定のために導入された塩基配列である。
表面プラズモン共鳴(SPR)用センサーチップを用意し、その表面にアビジンを固定した。次いで、配列番号10で表される塩基配列を有し、5’末端側でビオチンと結合した合成DNA(リンカー核酸)を含む溶液(リンカー核酸濃度2μM、0.3M NaCl含有HBS、30μL)をインジェクト後、Running Buffer(0.3M NaCl含有HBS)を15分間流し(流量5μL/分)、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を介してセンサーチップの表面に固定した。その後、50mM NaOH 8μL(4分間)を4回、次いで0.05%SDS 8μLを1回流し、リンカー核酸を洗浄し、1本鎖とした。
なお、上記塩基配列中、イタリックで示した塩基配列は、配列番号2〜9で表される塩基配列中のイタリックで示した塩基配列と相補的である。次いで、配列番号2〜9で表される塩基配列を有するプローブ核酸のいずれかを含む溶液(プローブ核酸濃度2μM、1M NaCl含有HBS)を1分間流した(流量5μL/分)。この操作により、これらのプローブ核酸のいずれかが、リンカー核酸中の配列番号10で表される塩基配列中の相補的な配列とのハイブリダイゼーションを介して表面に結合固定したセンサーチップを作製した。
上記のようにして、表面にプローブ核酸を固定したセンサーチップに、標的核酸を含む溶液(標的核酸濃度0.5μM、0〜2M NaCl含有HBS)をインジェクト後、Running Buffer(HBS、pH7.4、0.05%Tween20、1mM EDTA)を1分間流し(流量5μL/分)、表面プラズモン共鳴(SPR)測定により、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションをモニタした。ハイブリダイゼーションの前後における平衡時のセンサグラムの強度変化より、ハイブリダイゼーションによる共鳴角の変化の大きさ(共鳴信号の強度:単位はRU(共鳴単位)で表され、1000RU=0.1°である。)を求めた。次いで50mM NaOHで洗浄(5μL/分、1分間)を流して、標的核酸及びプローブ核酸を洗浄除去した。以上の操作を全てのプローブ核酸について行い、配列番号2〜9で表される塩基配列を有するプローブ核酸について、共鳴信号強度の比較を行った。
標的塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸(配列番号2)において観測された共鳴信号の強度は、NaCl濃度の増大に伴い増大する傾向にあった。一方、プローブ塩基配列が標的核酸に完全に相補的である場合とミスマッチを有する場合との信号強度の比は、NaCl濃度によらずほぼ一定であり、1塩基のミスマッチを有するもの(配列番号3、5)の約1.14倍しかなく、3塩基のミスマッチを有するもの(配列番号9)でも約1.5倍に過ぎなかった。以上のように、プローブ塩基配列の塩基長が20である場合には、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションにおいて、高い塩基配列特異性が見られなかった。
(2)標的塩基配列の塩基長がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
上の(1)の結果から、SPR法により標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを検出できることは確認できたが、標的塩基配列の塩基長が20である場合には、塩基配列特異性が十分でないため、種々の塩基長を有する標的核酸を用い、核酸塩基配列の塩基長がハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性に及ぼす影響について検討した。使用したプローブ核酸及び標的核酸は、それぞれ下記のとおりである。ここでは、配列番号11で表される塩基配列を有するプローブ核酸のみを用い、塩基長の異なる標的核酸(配列番号12〜20)を用いて検討を行った。
上記の配列番号12〜20で表される塩基配列を有する標的核酸は、配列番号11で表される塩基配列を有するプローブ塩基配列において太字で示した核酸塩基Cに相補的な核酸塩基Gを中央に有し、その両側に、前記プローブ塩基配列と相補的な3〜20塩基の塩基配列をそれぞれ有している。これらの核酸を用いて上記(1)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
結果を図3に示す。横軸は標的核酸の塩基数、縦軸は共鳴信号強度を塩基数で割ったもの(1塩基当たりの共鳴信号強度)をそれぞれ表す。塩基数が20の場合には1塩基当たりの共鳴信号強度が最大となっており、ミスマッチの有無によるハイブリダイゼーション効率の変化が現れにくくなっていると考えられる。
そこで、塩基長が24以下の標的核酸(配列番号12〜17)のものについて、配列番号11で表される塩基配列を有するものに加え、ミスマッチを含む下記の塩基配列(配列番号21、22)を有するプローブ核酸について上記(1)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
配列番号21及び22において、下線を付した塩基がミスマッチである。結果を図4に示す。標的塩基配列の塩基長が11〜15の場合に、プローブ塩基配列が標的核酸に完全に相補的である場合とミスマッチを有する場合との信号強度の比がNaCl濃度に依存し、最高(NaCl濃度が1Mの場合)で5〜100に増大することが確認された。以上の結果から、標的塩基配列(プローブ塩基配列)の塩基長が11〜15であることが好ましいことが確認された。なお、以下の操作において、塩(NaCl)濃度は、最も高い塩基配列特異性が観測された濃度である1Mとした。
(3)ミスマッチの位置がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
プローブ核酸として、上記の配列番号11(完全に相補的)及び21(1塩基のミスマッチを有するもの)で表される塩基配列を有するものを、標的核酸として下記の塩基配列を有するもの(塩基長はいずれも11である)をそれぞれ用いて上記(1)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
結果を図5に示す。棒グラフは、配列番号11(完全に相補的)及び21(1塩基のミスマッチ)で表される塩基配列を有するプローブ核酸と各標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける共鳴信号の強度を示し、折れ線グラフは、前者に対する後者の比率を%単位で表したものであり、値が小さいほど塩基配列特異性が高いことを示す。図5中の折れ線グラフより明らかなように、ミスマッチ塩基が標的塩基配列(プローブ塩基配列)の中央にある場合に塩基配列特異性が最大になることが確認された。
(4)ブロック核酸がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
標的核酸として、ALDH2遺伝子の第12エクソンの104番目の塩基を含む50塩基からなる、下記の配列番号27及び配列番号28のいずれかで表される塩基配列を有する核酸を合成した。
配列番号27及び28で表される核酸は、それぞれG型及びA型に対応している。上記配列番号1及び2で表される塩基配列中、下線を付した部分は、一塩基多型に対応する塩基及びその前後の6塩基からなる13塩基を含んでいる。これらの13塩基又は両端の1塩基ずつを除いた11塩基を標的塩基配列とし、これらに相補的な塩基配列をプローブ塩基配列とするプローブ核酸として、下記の配列番号29〜32で表される塩基配列を有する核酸を設計し、合成した。これらの核酸を用いて上記(1)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。なお、プローブ塩基配列の塩基長は、配列番号29及び31が13、30及び32が11であり、配列番号29及び30ではプローブ塩基配列が標的塩基配列に完全に相補的であり、31及び32は、一塩基多型に対応する1塩基がミスマッチである。
併せて、上記標的核酸(配列番号27、28)における標的塩基配列よりも5’末端及び3’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を有する5’末端側(配列番号33)及び3’末端側ブロック核酸(配列番号34)をそれぞれ合成し、これらのうち一方又は双方が標的核酸にハイブリダイズした状態におけるハイブリダイゼーション効率も併せて検討した。ブロック核酸の共存下で実験を行う場合には、標的核酸をインジェクト後、2倍の濃度(1μM)のブロック核酸をインジェクトし、95℃で3分間加熱後室温まで徐冷してからSPR測定を行った。
プローブ塩基配列の塩基長が11の場合(塩基配列30、32)における結果を図6に示す。いずれのプローブ核酸を用いた場合にも、3’末端側ブロック核酸を添加したときにミスマッチ/マッチ比が8〜12%と最小になることが確認された。
なお、プローブ塩基配列の塩基長が13の場合(塩基配列29、31)についても同様の結果が得られた。
(5)3’末端側ブロック核酸の添加量がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
3’末端側ブロック核酸の添加量がハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響についても検討した。結果は示さないが、いずれの標的核酸(配列番号27及び28)についても、3’末端側ブロック核酸(配列番号33)の添加量の増大につれてミスマッチ/マッチ比は低下したが、標的核酸の2倍(モル比)付近で添加効果は飽和した。したがって、3’末端側ブロック核酸は、少なくとも標的核酸の2倍(モル比)添加すれば十分に塩基配列特異性を向上させる効果が得られることが確認された。
(6)3’末端側ブロック核酸がハイブリダイズな可能な標的核酸中の塩基配列の5’末端側と標的塩基配列の3’末端側とのギャップの長さがハイブリダイゼーション効率に及ぼす影響の検討
標的核酸として配列番号27、28で表される塩基配列を有するもの、プローブ核酸として配列番号29、31で表される塩基配列を有するもの、3’末端側ブロック核酸として、下記の配列番号34〜40で表される塩基配列を有するもの(カッコ内の数字は、3’末端側ブロック核酸がハイブリダイズな可能な標的核酸中の塩基配列の5’末端側と標的塩基配列の3’末端側とのギャップの長さ(以下、「ギャップの長さ」と略称する。)を表す。負の数字は、3’末端側ブロック核酸の3’末端側に存在し、標的塩基配列とオーバーラップする余分な塩基の数を表す。)を用いて、上記(1)及び(4)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
標的塩基配列と3’末端側ブロック核酸の塩基との間にオーバーラップが存在する場合には、ハイブリダイゼーション効率が低下するがSPR法による測定は可能であった。ギャップの長さが0の場合には、ハイブリダイゼーション効率は高いものの、ミスマッチが存在する場合にもかなりのハイブリダイゼーションが観測され、最小でも10%程度のミスマッチ/マッチ比が観測された。ギャップの長さが1〜5の場合、1塩基のミスマッチが存在する場合のハイブリダイゼーションが大幅に抑制され、ミスマッチ/マッチ比は1%以下となった。
以上の結果から、ALDH2においては、プローブ塩基配列の塩基長を11〜13とし、ギャップの長さが1〜5となる3’末端側ブロック核酸を用いることで、SPR法によりS/N比(マッチ/ミスマッチ比)100以上で一塩基多型を判定できることが確認された。
(7)一塩基多型の判定
標的核酸として配列番号27で表される塩基配列を有するもののみ(G/G型に相当)、配列番号28で表される塩基配列を有するもののみ(A/A型に相当)、両者を1:1で混合したもの(G/A型に相当)のいずれか、プローブ核酸として配列番号29、31及び41で表される塩基配列を有するもの、3’末端側ブロック核酸として、配列番号34で表される塩基配列を有するものをそれぞれ用いて(図7参照:黒の台形はアビジンを、Bが書かれた五角形はビオチン分子をそれぞれ表す。)、上記(1)及び(4)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。なお、配列番号29、31及び41で表される塩基配列を有するプローブ核酸は、それぞれ一塩基多型に対応する部位における塩基がG、A及びCである標的核酸に相補的なプローブ塩基配列を有している。
結果を図8に示す。各標的核酸について、配列番号29、31及び41で表される塩基配列を有する各プローブ核酸に対する共鳴信号強度のパターンから、図9に示すようなアルゴリズムを用いて、一塩基多型の各ジェノタイプ(G/G、A/A、G/A)を判定できると考えられる。
(8)非対称PCR法による毛髪より採取したDNAからの1本鎖核酸の調製
株式会社ニッポンジーン製DNA抽出キットISOHAIRを用いて、ヒトの毛髪からDNAを抽出した。抽出したDNAをテンプレートとして、5’末端から904番目〜1332番目の塩基を含む430bpPCR増幅産物を得た。使用したプライマーは、それぞれの末端から25塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このようにして得られた430bp増幅産物をテンプレートとして、非対称PCR法により118bp増幅産物を得た。非対称PCR法の条件は下記のとおりである。
430bp増幅産物:200fg
5’末端側テンプレート(945〜964番目の塩基配列と相補的):1μM
3’末端側テンプレート(1042〜1062番目の塩基配列と相補的):20nM
サイクル:95℃5分→(94℃30秒−55℃30秒−72℃15秒)×35サイクル
サザンハイブリダイゼーション法により、得られた増幅産物が1本鎖DNAであることを確認した。上記の方法により、SNPの判定に用いることができる1本鎖DNAが得られることを確認した。
(9)非対称PCR法による毛髪より採取したDNAからの標的核酸試料の調製
13名のボランティアより採取した毛髪から上記(8)と同様の方法によりDNAを抽出し、430bpPCR増幅産物を得た。使用したプライマーは、それぞれの末端から25塩基分の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このようにして得られた430bp増幅産物をテンプレートとして、非対称PCR法により139bp増幅産物を得た。非対称PCR法の条件は下記のとおりである。
430bp増幅産物:200fg
5’末端側テンプレート(925〜949番目の塩基配列と相補的):1μM
3’末端側テンプレート(1044〜1063番目の塩基配列と相補的:配列番号34):20nM
Premix、MilliQ:25μL
サイクル:95℃5分→(94℃30秒−55℃30秒−72℃15秒)×40サイクル
このようにして得られた標的核酸試料(139bp増幅産物)をエタノール沈殿後、140μLのMilliQに溶解し、3M Buffer70μLを加えた。配列番号34で表される塩基配列を有する3’末端側ブロック核酸の0.25μM溶液1μLを加え、加熱後、急冷し、標的核酸にハイブリダイズさせた。
上記(1)において表面にリンカー核酸を固定したセンサーチップに、配列番号29、31及び41で表される塩基配列を有するプローブ核酸のいずれかを含む溶液(プローブ核酸濃度200nM、1M NaCl含有HBS)25μLを5分間流した(流量5μL/分)。この操作により、これらのプローブ核酸のいずれかが、リンカー核酸中の配列番号10で表される塩基配列中の相補的な配列とのハイブリダイゼーションを介して表面に結合固定したセンサーチップを作製した。次いで、上で調製した標的核酸を含む溶液を10分間流し(流量3μL/分)、表面プラズモン共鳴(SPR)測定により、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションをモニタした。ハイブリダイゼーションの前後における平衡時のセンサグラムの強度変化より、ハイブリダイゼーションによる共鳴角の変化の大きさ(共鳴信号の強度:単位はRU(共鳴単位)で表され、1000RU=0.1°である。)を求めた。次いで50mM NaOHで洗浄(5μL/分、1分間)を流して、標的核酸及びプローブ核酸を洗浄除去した。以上の操作を全てのプローブ核酸について行い、3種類のプローブ核酸について、共鳴信号強度の比較を行った。
結果を図10及び表1に示す。3つのプローブ核酸(配列番号29、31、41)を用いて得られた共鳴信号強度の比より、図9に示すアルゴリズムを用いてジェノタイプを判定し、従来法(DNAシークエンシング)により得られた結果と比較した。
表1に示すように、本方法により判定されたジェノタイプと従来法により判定されたジェノタイプとは完全に一致していた。
実施例2:メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)の一塩基多型の判定
MTHFRは、葉酸代謝経路の酵素のひとつで、ホモシスチンをメチオニンに変換するプロセスの律速段階を触媒する。MTHFRをコードするDNA中の677番目のCがTに変異したことに起因するこの酵素の異常は葉酸欠乏を引き起こし、高ホモシスチン血症を来す原因になるが、葉酸の投与によって改善できる。ただし、葉酸欠乏は胎児の神経管閉鎖障害の発症リスクを高めることが知られており、特に妊娠初期には葉酸の充分な摂取が必要である。したがって、診断によりTTホモだった場合は妊娠期に葉酸摂取の充分な管理が必要になる。日本人における各ジェノタイプの出現頻度は、C/C型46%、C/T型44%、T/T型10%である。
(1)モデル系を用いた最適条件の検討
標的核酸として、MTHFR遺伝子の第677番目の塩基を含む53塩基からなる、下記の配列番号42及び配列番号43のいずれかで表される塩基配列を有する核酸を合成した。プローブ核酸として、配列番号44〜47で表される塩基配列を有するもの(一塩基多型に対応する塩基を中央に有している。)、3’末端側ブロック核酸として、配列番号48で表される塩基配列を有するもの(ギャップの長さは1である。)をそれぞれ設計及び合成した。これらの核酸を用いて実施例1の(1)及び(4)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
3’末端側ブロック核酸を添加してもミスマッチ/マッチ比が10〜80%程度と大きな値となった。これは、プローブ塩基配列の塩基長が大きすぎ、ハイブリダイゼーション効率が大きすぎるためであると考えられたため、プローブ塩基配列の塩基長を11に減少させた、配列番号49〜52で表される塩基配列を有するプローブ核酸を合成した。
これらのプローブ核酸と、上で用いた標的核酸(配列番号42、43、両者の1:1混合物:それぞれC/C型、T/T型、C/T型に対応する。)及び3’末端側ブロック核酸(配列番号48)を用いて同様の実験を行った。その結果を図11に示す。この結果から、4つのプローブ核酸に対し観測された共鳴信号強度の比について、下記の基準によりジェノタイプの判定が可能であると考えられる。
(1)配列番号50>配列番号49ならばT/T型
(2)配列番号49/配列番号50>3ならばC/C型
(3)1≦配列番号49/配列番号50≦3ならばC/T型
(2)被験者の毛髪から採取したDNAを用いた一塩基多型の判定
株式会社ニッポンジーン製DNA抽出キットISOHAIRを用いて、ヒトの毛髪からDNAを抽出した。抽出したDNAをテンプレートとして、下記の配列番号53及び54で表される塩基配列を有するプライマー(前者が5’末端側、後者が3’末端側である。)を用いて、非対称PCR法により866bp増幅産物を得た。得られた増幅産物をテンプレートとして、下記の配列番号55及び56で表される塩基配列を有するプライマー(前者が5’末端側、後者が3’末端側である。)を用いて、非対称PCR法により72bp増幅産物を得た。これを標的核酸として用い、上記と同様の実験を行った。
結果を図12に示す。3つのプローブ核酸(配列番号29、31、41)を用いて得られた共鳴信号強度の比より、上述した判定基準を用いてジェノタイプを判定し、従来法(DNAシークエンシング)により得られた結果と比較したところ、すべて一致していた。
実施例3:アポリポタンパクE(apo E)の一塩基多型の判定
apo Eは、血漿中で脂質と結合しリポタンパクとなり、また、リポタンパクが細胞に認識されるときのマーカーとなるタンパク質である。apo E遺伝子にはε2、ε3、ε4の3つの対立遺伝子(アリル)(タンパク質ではE2、E3、E4のアイソフォーム)があり、E2、E3、E4の違いは、112位と158位のアミノ酸である。apo E3では112番目がシステインであるが、apo E4では112番目がアルギニンとなっている。apo E4はアルツハイマー病の危険因子として知られており、「apo E4ホモ」では3倍、「apo E4ホモ」かつ「ALDH2が不活性型」は30倍アルツハイマー病に罹患しやすいとされている。
(1)モデル系を用いた最適条件の検討
標的核酸として、apo E遺伝子の3’→5’鎖において上記一塩基多型に対応する塩基を含む57塩基からなる、下記の配列番号57及び配列番号58のいずれかで表される塩基配列を有する核酸を合成した。プローブ核酸として、配列番号59〜62で表される塩基配列を有するもの(一塩基多型に対応する塩基を中央に有している。)、3’末端側ブロック核酸として、配列番号63で表される塩基配列を有するもの(ギャップの長さは1である。)をそれぞれ設計及び合成した。これらの核酸を用いて実施例1の(1)及び(4)と同様の操作を行い、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を検討した。
いずれの標的核酸についても、3’末端側ブロック核酸の有無に関わりなく、配列番号59で表される塩基配列を有するプローブ核酸にのみハイブリダイズし、他のプローブ核酸に対しては、有意にハイブリダイゼーションしないという塩基配列非特異的なハイブリダイゼーションが観測された。これは、プローブ塩基配列の塩基長が小さすぎるためであると考えられたため、プローブ塩基配列の塩基長を15に増大させた、配列番号64〜67で表される塩基配列を有するプローブ核酸及び配列番号68で表される塩基配列を有する3’末端側ブロック核酸を合成した。これらのプローブ核酸と、上で用いた標的核酸(配列番号57、58、両者の1:1混合物:それぞれA/A型、G/G型、A/G型に対応する。)及び3’末端側ブロック核酸(配列番号68)を用いて同様の実験を行った。
プローブ塩基配列の塩基長を15に増大させた結果、一塩基多型に対応する塩基がTであるプローブ核酸(配列番号64)に対する塩基配列非特異的なハイブリダイゼーションは観測されなくなったが、配列番号58で表される塩基配列を有する標的核酸については、配列番号65〜67で表される塩基配列を有するプローブ核酸との間のハイブリダイゼーション効率が殆ど変わらないという結果が観測された。そこで、下記の配列番号69で表される塩基配列を有する5’末端側ブロック核酸を設計及び合成し、上記の標的核酸(配列番号57,58)、プローブ核酸(配列番号64〜67)、及び3’末端側ブロック核酸(配列番号68)と共に用いて同様の実験を行った。
得られた結果を図13に示す。この結果から、4つのプローブ核酸に対し観測された共鳴信号強度の比について、下記の基準によりジェノタイプの判定が可能であると考えられる。
(1)配列番号65>配列番号66ならばA/A型
(2)配列番号66/配列番号65>2ならばG/G型
(3)1≦配列番号66/配列番号65≦2ならばA/G型
(2)被験者の毛髪から採取したDNAを用いた一塩基多型の判定
株式会社ニッポンジーン製DNA抽出キットISOHAIRを用いて、ヒトの毛髪からDNAを抽出した。抽出したDNAをテンプレートとして、下記の配列番号70及び71で表される塩基配列を有するプライマー(前者が5’末端側、後者が3’末端側である。)を用いて、非対称PCR法により228bp増幅産物を得た。得られた増幅産物をテンプレートとして、下記の配列番号72及び73で表される塩基配列を有するプライマー(前者が5’末端側、後者が3’末端側である。)を用いて、非対称PCR法により125bp増幅産物を得た。これを標的核酸として用い、上記と同様の実験を行った。
結果を図14に示す。なお、被験者1、2は同一の被験者に由来する試料について再現性確認のために2回測定を行ったそれぞれの結果を示している、3つのプローブ核酸(配列番号60、61、62)を用いて得られた共鳴信号強度の比より、上述した判定基準を用いてジェノタイプを判定し、従来法(DNAシークエンシング)により得られた結果と比較したところ、すべて一致していた。
10 一塩基多型判定装置
11 試料供給手段
12 反応器
13 検出手段
14 データ処理手段
15 制御手段

Claims (6)

  1. ハイブリダイゼーションの対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を含む試料を、前記標的塩基配列と相補的なプローブ塩基配列を有するプロー核酸と接触させ、前記試料中の前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせる方法において、
    前記プローブ塩基配列の塩基数が10以上20以下であり、
    前記標的塩基配列よりも5’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を5’末端側に有する5’末端側ブロック核酸及び/又は前記標的塩基配列よりも3’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を3’末端側に有する3’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記5’末端側ブロック核酸及び/又は前記3’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で前記標的核酸と前記プローブ核酸とを特異的にハイブリダイズさせることを特徴とする核酸のハイブリダイゼーション方法。
  2. 前記プローブ核酸がDNAであることを特徴とする請求項記載の核酸のハイブリダイゼーション方法。
  3. 判定の対象となる標的塩基配列を有する標的核酸を、前記標的塩基配列に存在する一塩基多型(SNP)の一部又は全部のそれぞれと相補的な塩基数10以上20以下のプローブ塩基配列を含み、相異なる該プローブ塩基配列を有するもの同士が単一の反応器の内壁面上の互いに相異なる所定の領域に配置された複数のプロー核酸と、前記標的塩基配列よりも5’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を5’末端側に有する5’末端側ブロック核酸及び/又は前記標的塩基配列よりも3’末端側に1から15塩基分のギャップを隔てて位置する前記標的核酸中の塩基配列の一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を3’末端側に有する3’末端側ブロック核酸を前記標的核酸と接触させ、前記5’末端側ブロック核酸及び/又は前記3’末端側ブロック核酸が前記標的核酸中の前記ハイブリダイズ可能な塩基配列とハイブリダイズした状態で接触させ、前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとを特異的にハイブリダイズさせる工程Aと、
    前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な前記プローブ塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを位置特異的に検出する工程Bとを有することを特徴とする一塩基多型の判定方法。
  4. 前記プローブ核酸がDNAであることを特徴とする請求項記載の一塩基多型の判定方法。
  5. 前記プローブ核酸の各々において、前記プローブ塩基配列の5’末端及び3’末端を起点とする一塩基多型に対応する塩基の位置がいずれも前記プローブ塩基配列の塩基数の1/3倍よりも大きいことを特徴とする請求項3又は4記載の一塩基多型の判定方法。
  6. 前記標的核酸と前記プローブ核酸のうち前記標的塩基配列と相補的な塩基配列を有するものとの特異的なハイブリダイゼーションを、表面プラズモン共鳴及び金の異常反射のいずれかにより検出することを特徴とする請求項からのいずれか1項記載の一塩基多型の判定方法。
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