TW201619182A

TW201619182A - 探針、微陣列、探針群組、β地中海型貧血檢測套組、β血球蛋白基因變異檢測用套組、多態性檢測用微陣列探針對的評價方法以及基因型判別顯示程式

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Publication number: TW201619182A
Application number: TW105103897A
Authority: TW
Inventors: 外川直之
Original assignee: 三菱麗陽股份有限公司
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2016-06-01
Also published as: CN104204227B; EP2832863A4; CN105069324B; JPWO2013147320A1; TW201345919A; TWI619723B; CN104204227A; JP2017045451A; EP2832863A1; JP6269059B2; SG11201406010QA; CN105969848A; WO2013147320A1; EP3138928A1; US20190040468A1; JP6269746B2; TWI582105B; CN105069324A; SG10201601806TA; US20150184241A1

Abstract

本發明的目的在於提供一種用於檢測β血球蛋白基因的變異的微陣列，其可簡便且於短時間內檢測多個變異（樣本）。本發明提供一種用於檢測β血球蛋白基因的變異的探針群組、固定化有該探針群組的微陣列、使用該微陣列的檢測β血球蛋白基因的變異的方法、以及使用微陣列及引子的β血球蛋白基因變異檢測用套組，上述探針群組含有如下多個探針，即由序列編號3、序列編號4、序列編號7、序列編號8、序列編號11、序列編號12、序列編號17、序列編號18、序列編號25～序列編號66所示的序列各自所構成的多個基因。

Description

探針、微陣列、探針群組、β地中海型貧血檢測套組、β血球蛋白基因變異檢測用套組、多態性檢測用微陣列探針對的評價方法以及基因型判別顯示程式

本發明是有關於一種用於檢測β血球蛋白基因的變異（mutation）的探針群組、具有該探針群組的微陣列、及使用該微陣列來檢測β血球蛋白基因的變異的方法。

人類基因組（human genome）是由約30億個基因密碼（鹼基）所構成，已知於各人之間存在大量的基因密碼（鹼基序列）的差異。目前，於該些鹼基序列的差異中，單鹼基多態性（單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP））尤其備受關注。

所謂單鹼基多態性（SNP），是指脫氧核糖核酸（Deoxyribose Nucleic Acid，DNA）的鹼基序列中僅一個鹼基的差異，其是對應於酒量好或差、或者藥是否容易生效等人類特質的最小單位者。已提示了於人類基因組的30億鹼基對中，存在約300萬個（每500鹼基對～1000鹼基對為1個的比例）～1000萬個單鹼基多態性（SNP），其不生成特定的蛋白質，或生成與他人不同者，藉此帶來個體差異（體質）、人種差異等差異。於人類基因的個體差異的研究中，可謂如分析單鹼基多態性、研究對疾病的感受性或對藥物的反應而投予適於患者個人的副作用少的藥物般的定製醫療（order-made medicine）變得可行，而正不斷推進分析單鹼基多態性（SNP）的研究。

單鹼基多態性（SNP）備受關注的原因在於：因核酸分析技術的提高而可分析多個SNP，另外，疾病與SNP的關聯已明確。於疾病關聯基因、或藥劑代謝的個體差異的分析及慢性疾病等廣泛領域中，與SNP的關聯已明確。今後亦期待SNP與該等的關聯變得更加明確。

核酸分析技術要操作非常多的試樣，且包括龐大數量的操作，複雜且耗費時間，且通常要求高精度。於核酸分析技術中，作為迅速且以高精度檢測多個基因變異的方法，已知有效的是SNP檢測用DNA晶片（DNA晶片亦稱為DNA微陣列。以下只要無特別說明，則視為相同涵義）。

所謂DNA晶片，是指將核酸探針（探針）固定化於各承載物（carrier）所決定的區塊內，通常，核酸探針為使用具有對受檢核酸片段互補的鹼基序列的單鏈DNA或寡核苷酸（oligonucleotide）分子。

於SNP檢測用DNA晶片上，固定有相當於變異核酸的檢查對象部位的核酸片段的互補鏈作為核酸探針。對於變異的檢查對象部位而言，通常存在一個正常型與多個變異型，將與該等的任一個匹配（match）的核酸探針排列於區（plot）內。受檢試樣是使用藉由聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）法所代表的核酸擴增法而僅將相當於變異的檢查對象部位的核酸片段擴增所得的樣本液。

使該樣本液與SNP檢測用DNA晶片的固定有核酸探針的面接觸，於樣本核酸片段與對應的核酸探針之間引起雜交（hybridization）。繼而，以光學訊號或電化學訊號的形式來檢測由該雜交所得的結合，藉此可鑑定與核酸探針結合的樣本核酸片段，且進行定量。

此處，於核酸探針與樣本的組合為如野生型（wild type）探針與野生型樣本、或變異型探針與其所對應的變異型樣本般的完美匹配（perfect match）時，雜交完全而成為強的結合。另一方面，於核酸探針與樣本的組合為野生型探針與變異型樣本、或變異型探針與野生型樣本般的失配（mismatch）時，必然伴有未形成氫鍵的部位，故雜交不完全，成為弱的結合。

通常，為了維持高的特異性，於藉由溫度、鹽、洗劑、溶劑、離液劑（chaotropic agent）及變性劑各種的組合所達成的最嚴格的條件下進行雜交，檢測由完美匹配與失配時的雜交結合力的差異所致之訊號強度差異，藉此可識別、確定樣本中的基因型。

再者，血紅蛋白（hemoglobin）為自肺向細胞搬送氧並且自細胞向肺搬送二氧化碳的含鐵的異位複合體（allosteric complex）蛋白質。血紅蛋白A為主要的成熟血紅蛋白蛋白質，含有4個多肽（polypeptide）鏈（2個α-血球蛋白鏈及2個β血球蛋白鏈）。

一般認為大多數人的疾病是由對編碼血紅蛋白多肽鏈的1個以上的基因造成影響的基因變異所引起。此種疾病中包含鐮狀紅血球貧血（sickle cell anemia），其是因血紅蛋白β鏈中的點突變（point mutation）而產生。另外，β地中海型貧血（β-thalassemia）症狀是由因一種類型的血球蛋白鏈的不充分合成而於表現型（phenotype）變明顯的基因變異所產生的血液關聯疾病，且產生其他類型的血球蛋白鏈的過剩合成（例如參照非專利文獻1）。

另一方面，分子生物學技術最近的發展中，可對引起特定的人的疾病狀態及症狀、或者與該狀態及症狀有關聯的基因異常進行研究。聚合酶鏈反應（PCR）及其經改變的許多方法成為用於研究疾病狀態及症狀下的基因異常的特別有用的工具（例如參照非專利文獻2及非專利文獻3）。

使用PCR法的情況下，擴增特定的目標DNA或該DNA的一部分，而容易對經擴增的部分進一步賦予特徵。此種進一步的特徵賦予包括：用於確定尺寸的凝膠電泳（gel electrophoresis）、確定核苷酸序列、使用特定探針的雜交研究等（例如參照非專利文獻4）。

近年來，已進行了大量的與SNPs（單鹼基多態性）等基因型（即基因多態性）和疾病等的因果關係有關的研究，且已進行了確定基因異常是否存在於特定個體的基因組中的研究。

作為判定（檢測）SNPs等的單鹼基變異或2個以上的鹼基數的基因變異的方法，首先有聚合酶鏈反應-序列特異性引子（Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer，PCR-SSP）法。該方法於經變異的基因的鹼基序列上合成特異的引子並實施PCR，因此為了判別幾十個基因變異，需要幾十對引子。

該方法雖為分析時間短且簡便的方法，但合成此種引子時，要求細心注意與知識以及時間，故於大量的樣本分析方面有極限。此外，欲檢測變異的部位越多，PCR-SSP的數量亦變得越多，故有難以一次性處理多個樣本的缺點。

作為第2方法，可想到一直以來進行的聚合酶鏈反應-限制酶片段長度多態性法（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP法）。於共同序列部位設定引子，使其內側、即PCR產物內具有多態性而進行擴增。擴增後，藉由各種限制酶將擴增產物切斷，根據該DNA片段的大小來對基因序列的變異進行分類。

該方法雖然容易判定結果且方法亦簡單，但於限制酶可識別的部位受到限定的情形時，判別變得困難，另外，由於樣本的分離必須使用聚丙烯醯胺凝膠，故難以同時對大量的樣本或幾十個變異進行分類。進而，已報告有如下情況，即，通常於對全血樣本直接進行PCR擴增後利用限制酶進行了碎裂（fragmentation）的情形時，擴增樣本中殘存來源於全血的蛋白，而限制酶的切斷變得不完全。即，結合於DNA的蛋白質未自DNA上脫離，因此限制酶無法結合於DNA，而切斷反應未正常地進行，必須進行DNA萃取操作。

作為第3方法，有聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）法。該方法為對PCR產物添加甲醛（formaldehyde）等變性劑而變性成單鏈DNA（ssDNA）後，於非變性聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳的方法。於電泳中，ssDNA具有基於其鹼基序列的特有結構，而於電泳中顯示出固有的移動速度，各自形成不同類型的帶（band）。

該方法為利用根據鹼基序列而顯示出固有的移動速度的性質來對鹼基序列中的變異進行分類的方法，但需要複雜且難度高的技術，且其結果的分析亦需要經驗與知識。

作為第4方法，可想到聚合酶鏈反應-序列特異寡核苷酸（Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotide，PCR-SSO）法。PCR-SSO為使針對正常部位及變異部位的合成探針與以點狀散布於過濾器（有時亦使用微孔板（microplate））上的PCR產物進行雜交（hybridize），檢測有無變異的方法。另外，亦有相反地以點狀散布探針並使PCR產物進行雜交的反向點雜交（Reverse Dot Blot）法。若以抗原抗體反應為例，則為以下方法：DNA為抗原，且使對變異部位的特異抗體與對正常部位的特異抗體發揮作用，觀察DNA與哪一抗體結合。先前，於該方法的檢測中使用放射性同位素，但由於使用設施的限制等，逐漸藉由化學發光或顯色等來進行檢測。

該方法雖然簡便，但必須確保相當量的樣品量，於並未確保相當量的樣品量的情況下，反而必須導入提高感度的方法（例如參照非專利文獻5及非專利文獻6、專利文獻1）。

作為第5方法，已知有鹼基序列直接確定法。鹼基序列直接確定法為將經PCR擴增的DNA鏈作為模板，不對載體（vector）進行次選殖（subcloning）等而直接確定鹼基序列的方法。

該方法對經PCR擴增的DNA鏈進行被稱為非對稱PCR的二次PCR而進行單鏈DNA擴增，通常使用雙脫氧（dideoxy）法來確定鹼基序列。該二次PCR以一組引子中的一個為限制量（通常為1：10～1：100）來進行PCR，藉此擴增單鏈DNA。最近逐漸應用循環定序法（cycle sequencing method），從而可更簡單地進行序列反應。然而，套組（kit）的價格非常高，亦需要昂貴的裝置，實驗過程亦複雜，故為了分析大量的樣本，而耗費成本。

專利文獻1：日本專利特開平5-184398號公報非專利文獻1：維德勒（Weatherall）等人，地中海型貧血症候群（The Thalassaemia Syndromes），第3版，牛津（Oxford），布萊克威爾科學（Blackwell Scientific），1981 非專利文獻2：埃爾里奇（Erlich）等人，現代分子生物學通訊：聚合酶鏈反應（Current Communications in Molecular Biology: Polymerase Chain Reaction），冷泉港：冷泉港出版社（Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Press）（1989）非專利文獻3：伊尼斯（Innis）等人，PCR實驗指南：方法及應用指導（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications），聖地亞哥：學術出版社（San Diego: Academic Press）（1990）非專利文獻4：薩姆布魯克（Sambrook）等人，分子選殖-實驗室手冊（Molecular Cloning - A Laboratory Manual），第2版，冷泉港：冷泉港出版社（Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Press）（1989）非專利文獻5：美國人類遺傳學雜誌（Am. J. Hum. Genet.）43:095-100，1988 非專利文獻6：血液（Blood），Vol 81，No 1（一月一日（January 1））.1993：pp 239-242

如上所述，為了分析、檢測基因的變異，已採用了各種檢測方法，但該些方法的共同缺點為以下方面：同時檢測多個變異時需要極長的時間及極大的勞力，尤其於分析大量的樣本時變得更困難。

因此，本發明的主要目的在於提供一種用於檢測β血球蛋白基因的變異的微陣列，其可簡便且於短時間內檢測多個變異（樣本）。

本發明者等人鑒於現有技術的問題而反覆進行了努力研究，結果發現，藉由使用多種具有特定序列的探針，可達成上述目的，從而完成了本發明。

即，本發明是有關於一種用於檢測β血球蛋白基因的變異的探針群組、固定化有該探針群組的微陣列、以及使用該微陣列的變異的檢測方法及套組，上述探針群組含有序列編號3、序列編號4、序列編號7、序列編號8、序列編號11、序列編號12、序列編號17、序列編號18與序列編號25～序列編號66所示的基因。

根據本發明，可於不將PCR產物純化的情況下混合雜交溶液並直接與微陣列接觸、反應，故即便於使用大量的樣本的情形時，亦可於短時間內進行處理。進而，由於可一次性檢測β血球蛋白基因的25個部位的變異，故實用性、有用性優異。

以下，對本發明加以詳細說明。以下實施形態為用於說明本發明的例示，並非將本發明僅限定於該實施形態之意。本發明可於不偏離其主旨的範圍內以各種形態來實施。

再者，本說明書中引用的所有文獻及公開公報、專利公報及其他專利文獻是以參照的方式併入至本說明書中。另外，本說明書包含成為本申請案優先權主張基礎的於2012年03月29日提出申請的日本專利申請案（日本專利申請2012-077394號）的說明書及圖式中記載的內容。

另外，未特別記載的情形時，胺基酸序列是將左端作為胺基末端並將右端作為羧基末端來表示，鹼基序列是將左端作為5'末端並將右端作為3'末端來表示。

1.多態性檢測用探針

於多態性的檢測時，通常使用微陣列，但為了進行高感度的檢測，需要不易產生非特異性雜交的高性能的探針。探針的性能通常取決於探針的Tm值（若Tm值高，則容易引起非特異性雜交），Tm值是由探針的序列所決定。因此，通常探針的性能受到成為檢測對象的多態性的周邊區域的序列的限制。

然而，本發明者等人藉由對探針的序列加以不損及探針原本性能的程度的修飾，而成功地調節了探針的Tm值，提高了探針的性能。

因此，本發明提供以下的探針。

一種探針，其用於檢測具有1個以上的多態性的聚核苷酸序列，且上述探針的特徵在於：其與該序列雜交，且至少滿足以下要件的任一個：（1）其兩端各含有1個以上的與上述序列非互補的鹼基；（2）於該序列中所含的多個多態性中的非檢測目標的多態性，與其相對應的上述探針的部分為通用鹼基（universal base）；（3）與檢測目標的多態性相對應的鹼基部分位於自探針的任一末端起6個以下的位置。

於本發明中，所謂「探針」，是指可捕捉樣本中所含的檢測目標物質者，是表示脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、肽核酸（Peptide Nucleic Acid，PNA）等核酸類。該些探針可自於試管內藉由酶等所合成的DNA或經化學合成的寡核苷酸等合成市售品或生物細胞等而獲得。另外，亦可使用經限制酶或者經化學修飾或切斷的DNA片段。

探針的長度通常為10 bp～100 bp左右，較佳為10 bp～80 bp，更佳為10 bp～50 bp，進而佳為10 bp～35 bp，最佳為12 bp～28 bp。

另外，所謂作為檢測對象的「具有1個以上的多態性的聚核苷酸序列」，是指樣本中所含的聚核苷酸，且於其鹼基序列中具有1個以上、2個以上或3個以上的多態性。

作為檢測對象的聚核苷酸主要為來源於人類樣本者，但只要可進行擴增反應，則亦可使用任何生物種。

樣本可為來源於任何組織的細胞、血液、體液。樣本的具體例可列舉：來源於人類的腦、心臟、肺、脾臟、腎臟、肝臟、胰臟、膽嚢、食道、胃、腸、膀胱及骨骼肌等各種組織的細胞、血液以及體液。更詳細可列舉：血液、脊髓液、尿、痰、胸水（hydrothorax）、腹水、胃液及水皰內體液等。

作為檢測對象的聚核苷酸亦可在供於微陣列之前預先進行純化。關於聚核苷酸的純化方法，例如可採用依據馬尼亞迪斯（Maniatis）等人的記載（分子選殖-實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），冷泉港（Cold Spring Harbor），NY，pp280、281，1982）的各種技術。

特徵（1）：其兩端各含有1個以上的與上述序列非互補的鹼基

通常，鳥嘌呤（guanine，G）及胞嘧啶（cytosine，C）的含量多的「高GC含量」的聚核苷酸的Tm值高，容易引起非特異性雜交。

因此，本發明者等人發現，於用作探針的聚核苷酸含有高GC含量（GC-rich）區域的情形時，藉由使該區域的兩端含有與高GC含量序列非互補的鹼基，可使探針與檢測對象聚核苷酸之間產生失配，藉此降低探針的Tm值。

所謂「非互補的鹼基」，只要為與作為檢測對象的聚核苷酸序列上的對應鹼基產生失配的鹼基，則可為任意鹼基。例如，若作為檢測對象的聚核苷酸序列上的對應鹼基為「C」，則非互補的鹼基可為「A」、「T」、「C」的任一個。若作為檢測對象的聚核苷酸序列上的對應鹼基為「G」，則非互補的鹼基可為「A」、「T」、「G」的任一個。另外，若作為檢測對象的聚核苷酸序列上的對應鹼基為「A」，則非互補的鹼基可為「A」、「C」、「G」的任一個。進而，若作為檢測對象的聚核苷酸序列上的對應鹼基為「T」，則非互補的鹼基可為「T」、「C」、「G」的任一個。

另外，兩端所含的非互補的鹼基的個數亦可於5'末端與3'末端不同。

於本發明中，「非互補的鹼基」是含於含有檢測對象多態性的聚核苷酸序列的兩端部、或含有多態性的高GC含量序列的兩端部。例如於含有檢測對象多態性的聚核苷酸序列為「GGCGCG GCGCGG」的情形（中央粗體部為檢測對象多態性）時，具有特徵（1）的探針可為「TGCGCG GCGCGA」，亦可為「ATGCGCG GCGCGAA」，亦可為「ATGGCGCG GCGCGGAA」。

較佳為「非互補的鹼基」是於兩端部各含有1個鹼基以上、2個鹼基以上或3個鹼基以上。

於本發明中，所謂高GC含量區域，是指G及C於鹼基序列總體中所佔的含量為50%以上、55%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上或95%以上的序列區域。

特徵（2）：於作為檢測對象的含有多態性的聚核苷酸序列中所含的多個多態性中的非檢測目標的多態性，與其相對應的上述探針的部分為通用鹼基

具有該特徵的探針於以下情形時有用：於作為檢測對象的聚核苷酸序列中，除了含有作為檢測對象的第1多態性以外，還含有作為非檢測對象的第2多態性的情形。

於該情形時，探針與檢測對象聚核苷酸的結合力除了因第1多態性的組合而變化以外，亦因第2多態性的組合而變化，故對於作為原本的檢測對象的第1多態性而言，檢測感度降低。

於將該聚核苷酸序列直接用作探針的序列的情形時，可能引起以下情況：於第1多態性部分中檢測對象聚核苷酸與探針匹配，但於第2多態性部分中不匹配（失配）的情況；以及於第1多態性部分中檢測對象聚核苷酸與探針不匹配（失配），但於第2多態性部分中匹配的情況。後者儘管第1多態性不匹配，但由於與前者相同水準的結合力，探針與檢測對象聚核苷酸雜交，故產生與前者相同的陽性訊號。

因此，上述情況（case）下，無法區分前者（真陽性）與後者（假陽性）。

因此，為了消除第2多態性的影響，本發明的探針的特徵在於：於與第2多態性相對應的部分中含有通用鹼基。

於本發明中，所謂通用鹼基，是指天然的核酸鹼基，即與腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶（thymine）、胞嘧啶、尿嘧啶（uracil）均不形成鹼基對的鹼基。

此種通用鹼基的例子可列舉：5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、7-氮雜吲哚、6-甲基-7-氮雜吲哚、吡咯吡啶、咪唑並吡啶（imidazopyridine）、異喹諾酮（isocarbostyril）、丙炔基-7-氮雜吲哚（propynyl-7-azaindole）、丙炔基異喹諾酮及丙二烯基-7-氮雜吲哚（allenyl-7-azaindole），但不限定於此。

或者，通用鹼基的例子可列舉以下化合物（包括其丙炔基衍生物）的任一者以上。

8-氮雜-7-去氮雜-2'-脫氧鳥苷（8-aza-7-deaza-2'-deoxyguanosine）、8-氮雜-7-去氮雜-2'-脫氧腺苷（8-aza-7-deaza-2'-deoxyadenosine）、2'-脫氧胞苷（2'-deoxycytidine）、2'-脫氧尿苷（2'-deoxyuridine）、2'-脫氧腺苷、2'-脫氧鳥苷及吡咯并[2,3-d]嘧啶核苷（pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleoside）。

進而，通用鹼基亦可包含以下化合物（包括其衍生物）的任一者。

脫氧肌苷（deoxyinosine）（例如2'-脫氧肌苷（inosine））、7-去氮雜-2'-脫氧肌苷、2'-氮雜-2'-脫氧肌苷、3'-硝基唑、4'-硝基吲哚、5'-硝基吲哚、6'-硝基吲哚、4-硝基苯并咪唑、硝基吲唑（例如5'-硝基吲唑）、4-胺基苯并咪唑、咪唑并-4,5-二甲醯胺（imidazo-4,5-dicarboxamide）、3'-硝基咪唑、咪唑-4-甲醯胺、3-(4-硝基唑-1-基)-1,2-丙二醇及8-氮雜-7-去氮雜腺嘌呤（吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺）。

於其他例中，通用核酸鹼基亦可藉由將3-甲基-7-丙炔基（propynyl）異喹諾酮基、3-甲基異喹諾酮基、5-甲基異喹諾酮基、異喹諾酮基、苯基或芘基（pyrenyl）與核糖（ribose）或脫氧核糖進行組合而形成通用核酸鹼基。

特徵（3）：與檢測目標的多態性相對應的鹼基部分位於自探針的任一末端起6個以下的位置

另外，本發明的探針亦能以如下方式設計：檢測目標的多態性存在於自探針的任一末端起（5'末端或3'末端）6個鹼基以下的位置。

如此般設計的探針於以下方面有用。

通常，於設計單鹼基多態性檢測用的探針的情形時，將探針設計成以檢測目標的多態性的位置為中心而於5'末端、3'末端兩側具有相同程度的鹼基長。然而，若檢測目標的多態性部位的5'末端或3'末端側為極高GC含量區域、或高AT含量區域，則可能引起以下情況：於檢測目標的多態性的位置上，與探針的匹配、或失配無關而進行結合或不結合。

因此，以使用以下探針作為特徵，上述探針將檢測目標的多態性的位置設定為距末端6個鹼基以下的位置，避開高GC含量區域或高AT含量區域。於僅具有該特徵的情況下無法提高探針的特異性的情形時，亦可組合特徵（1）。

成為本發明的聚核苷酸的基礎的基因並無特別限定，例如可列舉：葡萄糖-6-磷酸去氫酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PD）基因、RAB27A（RAS癌基因家族成員）基因、闕東二氏症候群1（Chediak-Higashi Syndrome 1，CHS1）基因、亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate Reductase，MTHFR）基因、3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A裂解酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A lyase，HMGCL）基因、溶質載體家族2, 成員1（solute carrier family 2, member 1，SLC2A1）基因、己糖-6-磷酸去氫酶（Hexose-6-Phosphate Dehydrogenase，H6PD）基因等。此外，為了個別地取得資訊，只要進入可取得疾病的資訊及其原因或作為風險因子（risk factor）的基因的線上人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）資料庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）即可。

於某實施形態中，本發明的聚核苷酸是由人類β血球蛋白基因來製備。

於本發明中，具有檢測目標的多態性的聚核苷酸序列的鳥嘌呤及胞嘧啶的合計含量為63%以上（高GC含量），且具有人類β血球蛋白基因的第99號～第117號、第127號～第142號、第1402號～第1416號的核苷酸序列。

或者，具有檢測目標的多態性的聚核苷酸序列的鳥嘌呤及胞嘧啶的合計含量為45%以下（低GC含量），且具有人類β血球蛋白基因的第1378號～第1399號的核苷酸序列。

上述區域為高GC含量區域或高AT含量區域，本發明提供可檢測該部位中的多態性的探針。

更具體而言，本發明的探針具有序列編號3、序列編號4、序列編號7、序列編號8、序列編號17或序列編號18所記載的序列作為於高GC含量區域中經特殊化（specialized）者。

另一方面，本發明的探針具有序列編號11或序列編號12所記載的序列作為於低GC含量區域中經特殊化者。

另外，本發明提供一種微陣列，其具有序列編號3、序列編號4、序列編號7、序列編號8、序列編號11、序列編號12、序列編號17或序列編號18所記載的序列的至少一個。

2.探針群組

於本發明中，使用序列編號3、序列編號4、序列編號7、序列編號8、序列編號11、序列編號12、序列編號17、序列編號18及序列編號25～序列編號66所示的序列作為探針（本發明的探針群組），視需要亦可將本發明的探針群組以外的基因用作探針。

3.微陣列

（1）支撐體

為了實際使用上述探針群組，必須固定化於支撐體上。進行固定化的支撐體的種類並無限定，只要於雜交反應時探針不溶出（釋出）至反應液中，且可於反應後確定哪個探針進行了反應，則可使用任意者。

例如可列舉：過濾器、珠粒（beads）、凝膠、晶片、載玻片（slide glass）、多孔板（multiwell plate）、薄膜（membrane）及光纖等。更詳細可列舉：西方墨點法（Western Blotting）濾紙、尼龍薄膜、聚偏二氟乙烯製薄膜、硝基纖維素薄膜（皮爾斯（Pierce）公司）、親和珠（affinity beads）（住友電木（Sumitomo Bakelite）股份有限公司）、麥克羅普萊克斯（MicroPlex，商標名）微球（Microspheres）、xMAP多分析物（xMAP Multi-Analyte）LumAvidin Microspheres（路明克斯（Luminex）公司）、免疫磁珠（Dynabeads）（維爾（Veritas）股份有限公司）、DNA固定化用96孔板套組（船越（Funakoshi）公司）、DNA固定化用基板（住友電木（Sumitomo Bakelite）股份有限公司）、微陣列用塗層載玻片（松波硝子工業股份有限公司）、水凝膠滑片（hydrogel slide）（帕金艾爾瑪（Perkin Elmer）公司）、森確斯（Sentrix，註冊商標）陣列矩陣（Array Matrix）（易明達（Illumina）公司）等。

（2）固定化

關於探針的固定化，於使用過濾器、薄膜等的情形時，可直接以斑點（spot）狀散布未經修飾的探針，並藉由紫外線（Ultra Violet，UV）燈等的照射來加以固定化。另外，於使用表面經化學活化的珠粒、晶片、載玻片、多孔板、薄膜及光纖等的情形時，較佳為使用末端能以化學方式形成共價鍵者。更具體而言，使用在5'末端或3'末端導入有胺基等者。進而，於固定化於凝膠等上的情形時，使用導入有可進行共聚合反應的不飽和官能基者。藉由具有該導入基，利用與經取代的(甲基)丙烯醯胺衍生物或瓊脂糖（agarose）衍生物、及交聯劑的共聚合反應而固定於凝膠的網狀結構上。關於在核酸鏈的末端導入不飽和官能基的方法，例如可利用如國際公開第02/062817號中記載般的公知的方法來導入不飽和官能基。

於本發明中，較佳為將探針固定化於凝膠上或凝膠中。其原因在於：藉由固定化於凝膠中，可提高探針的濃度，故可提高微陣列的檢測感度。另外，於本發明中，較佳為將該凝膠保持於貫通孔中，而使用具有多個該貫通孔的貫通孔型微陣列。

貫通孔型微陣列亦可於薄片板中形成貫通孔而獲得，較佳為藉由以下方式獲得的微陣列：將固定化有探針的凝膠承載物根據其種類而分別保持於各中空纖維等管狀體的中空部內，使該所有的中空纖維等管狀體集中並加以固定後，於纖維的長度方向上反覆切斷。由此可大量生產品質穩定的微陣列。如此，可獲得於各探針為獨立的狀態（將一種探針於一個貫通孔內被固定化的狀態）下於各貫通孔內被固定化的微陣列。

以下，對貫通孔型微陣列的製造方法的一實施方式加以說明。該微陣列可經由下述（i）～（iv）的步驟來製造。

步驟（i）：將多根中空纖維以中空纖維的各纖維軸成為相同方向的方式進行三維排列，並利用樹脂將該排列固定，藉此製造中空纖維束的步驟

形成貫通孔的方法並無特別限定，例如可利用如日本專利特開2001-133453號公報中記載般的方法，即，製作使中空纖維朝同軸方向排列而成的排列體後，利用樹脂加以固定。中空纖維可使用各種材料，較佳為有機材料。

包含有機材料的中空纖維例如可列舉：尼龍6、尼龍66、芳香族聚醯胺等聚醯胺系中空纖維，聚對苯二甲酸乙二酯、聚對苯二甲酸丁二酯、聚乳酸、聚甘醇酸（polyglycolic acid）、聚碳酸酯等聚酯系中空纖維，聚丙烯腈等丙烯酸系中空纖維，聚乙烯或聚丙烯等聚烯烴系中空纖維，聚甲基丙烯酸甲酯等聚甲基丙烯酸酯系中空纖維，聚乙烯醇系中空纖維，聚偏二氯乙烯系中空纖維，聚氯乙烯系中空纖維，聚胺基甲酸酯系中空纖維，酚系中空纖維，包含聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯等的氟系中空纖維，聚伸烷基對羥基苯甲酸酯系中空纖維等。中空纖維亦可為多孔質，可藉由將熔融紡絲法或溶液紡絲法與延伸法、微相分離法、萃取法等公知的多孔化技術組合而獲得。多孔度並無特別限定，就提高纖維材料的每單位長度中被固定化的探針密度的觀點而言，理想的是以比表面積變大的方式而為高的多孔度。中空纖維的內徑可任意設定。較佳為設定為10 μm～2000 μm，更佳為設定為150 μm～1000 μm。

該中空纖維的製造方法並無限定，可利用如日本專利特開平11-108928號公報中記載般的公知方法來製造。例如較佳為熔融紡絲法，噴嘴可使用馬蹄型或C型噴嘴、雙重管噴嘴等。於本發明中，就可形成連續的均勻中空部的方面而言，較佳為使用雙重管噴嘴。

另外，視需要亦可使用在中空纖維中適量含有碳黑（carbon black）等黑色顏料者。藉由含有黑色顏料，可於檢測時減輕來源於灰塵等夾雜物的光學雜訊，或可提高樹脂的強度。顏料的含量並無限定，可根據中空纖維的尺寸或微陣列的使用目的等而適當選擇。例如可設定為0.1質量%～10質量%，較佳為0.5質量%～5質量%，更佳為1質量%～3質量%。

塊（block）體的製造可利用以下方法：以不擾亂排列體的排列的方式利用黏接劑等樹脂加以固定。例如可列舉：於黏著片等片狀物上以既定的間隔平行配置多根中空纖維，製成片狀後，將該片捲成螺旋狀的方法（參照日本專利特開平11-108928號公報）。

另外，可列舉：將以既定的間隔設有多個孔的2片多孔板以孔部一致的方式重疊，使中空纖維於該些孔部中通過，留出2片多孔板的間隔，使硬化性樹脂原料充滿2片多孔板間的中空纖維的周邊並使其硬化的方法（日本專利特開2001-133453號公報）。

硬化性樹脂原料較佳為包含聚胺基甲酸酯樹脂、環氧樹脂等有機材料者。具體而言，較佳為由包含有機高分子等的一種以上的材料所形成者。有機高分子可列舉：聚胺基甲酸酯、矽樹脂、環氧樹脂等橡膠材料，或尼龍6、尼龍66、芳香族聚醯胺等聚醯胺系樹脂，聚對苯二甲酸乙二酯、聚對苯二甲酸丁二酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚碳酸酯等聚酯系樹脂，聚丙烯腈等丙烯酸系樹脂，聚乙烯或聚丙烯等聚烯烴系樹脂，聚甲基丙烯酸甲酯等聚甲基丙烯酸酯系樹脂，聚乙烯醇系樹脂，聚偏二氯乙烯系樹脂，聚氯乙烯系樹脂，酚系樹脂，包含聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯等的氟系樹脂，聚伸烷基對羥基苯甲酸酯系樹脂等。亦可於有機高分子中適量含有碳黑等黑色顏料。藉由添加黑色顏料，可於檢測時減輕來源於灰塵等夾雜物的光學雜訊，或另外可提高樹脂的強度。顏料的含量並無限定，可根據中空纖維的尺寸或微陣列的使用目的等而適當選擇。例如可設定為0.1質量%～10質量%，較佳為0.5質量%～5質量%，更佳為1質量%～3質量%。

本發明中排列的中空纖維的根數、即斑點數並無限定，可根據目標實驗等而適當選擇。因此，中空纖維彼此的距離亦可根據微陣列的面積及所排列的中空纖維的根數等來適當選擇。

步驟（ ii ）：將含有探針群組的凝膠前驅物溶液導入至中空纖維束的各中空纖維的中空部中的步驟

向中空絲內填充的凝膠材料的種類並無特別限定，若為由天然物所得的凝膠材料，則除了瓊脂糖、海藻酸鈉等多糖類以外，還可利用明膠（gelatin）、聚賴氨酸（polylysine）等蛋白質等。作為合成高分子，例如可利用使聚丙烯醯基丁二醯亞胺（polyacryloylsuccinimide）等具有反應性官能基的聚合物與顯示出反應性的交聯劑反應所得的凝膠。除此以外，較佳為以下合成高分子凝膠，該合成高分子凝膠是將丙烯醯胺、N,N-二甲基丙烯醯胺、N-異丙基丙烯醯胺、N-丙烯醯基胺基乙氧基乙醇、N-丙烯醯基胺基丙醇、N-羥甲基丙烯醯胺、N-乙烯基吡咯啶酮、甲基丙烯酸羥乙酯、(甲基)丙烯酸及烯丙基糊精（allyl dextrin）等聚合性單體作為單體，藉由與多官能性單體、例如亞甲基雙(甲基)丙烯醯胺、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯等的共聚合而獲得。

本發明的微陣列中所用的凝膠的濃度並無特別限定，可根據所使用的探針的長度或量來適當選擇。例如，換算成單體成分的濃度，較佳為2質量%～10質量%，更佳為3質量%～7質量%，進而佳為3.5質量%～5質量%。設定為2質量%以上的原因在於：可將探針確實地進行固定化，而可高效地進行目標物質的檢測。另外，設定為10質量%以下的原因在於：即便進一步提高濃度，亦難以獲得飛躍性的效果。

於使合成高分子凝膠保持於上述貫通孔基板的微陣列中的情形時，可於上述塊中填充合成高分子的凝膠前驅物溶液後，於塊內經凝膠化並加以保持。關於將凝膠前驅物溶液填充至塊的貫通孔內的方法，例如可將上述溶液抽吸至具有微細的針的注射器（syringe）中，將針插入至各中空纖維的中空部中，藉此導入上述溶液。另外，預先將中空纖維束的經固定的端部的中空部密封，開放另一未固定的端部的中空部。繼而，製備凝膠前驅物溶液，該凝膠前驅物溶液含有於末端具有甲基丙烯酸基等聚合反應點的核酸探針，將該凝膠前驅物溶液及上述中空纖維束設置於乾燥器（desiccator）內，然後將中空纖維束的中空纖維未經固定的端部浸漬於該溶液中，將乾燥器內調整為減壓狀態後，回到常壓，藉此可自中空纖維的浸漬於溶液中的端部向中空纖維中空部中導入該溶液。

步驟（ iii ）：使導入至中空纖維束的中空部中的凝膠前驅物溶液反應，將含有探針的凝膠狀物保持於中空纖維的中空部中的步驟

藉由使導入至中空纖維的中空部中的凝膠前驅物溶液聚合，而將含有探針的凝膠狀物保持於中空纖維的中空部中。聚合條件並無特別限定，可根據所使用的凝膠前驅物的種類等而適當選擇。例如若為丙烯醯胺系單體，則可使用自由基起始劑來進行聚合，較佳為藉由利用偶氮系起始劑的熱聚合反應來進行聚合。

探針的種類或尺寸並無限定，可根據成為檢測對象的物質或化合物的種類來適當選擇。

步驟（ iv ）：將中空纖維束於與纖維的長度方向交叉的方向切斷而製成薄片的步驟

關於切斷方法，只要可製成薄片則並無限定。例如可藉由切片機（microtome）、雷射（laser）等來進行。所得的薄片的厚度並無限定，可根據實驗目的等來適當選擇。例如可設定為5 mm以下，較佳為0.1 mm～1 mm。

（ 3 ） β 血球蛋白基因的變異的檢測

於本發明中，所謂檢測β血球蛋白基因的變異，是指確定β血球蛋白基因序列中的具有變異部分的鹼基部位、序列，另外，是指自多個所確定的對立基因（oppositional gene）中判定是哪個對立基因組（二倍體的生物）。

（a）首先，只要使含有人類基因組DNA的樣本與含有核酸擴增用引子組（primer set）、核苷酸單體及DNA伸長酶（elongation enzyme）的反應溶液接觸即可。

＜樣本（成為核酸擴增的模板的核酸）＞

所謂樣本（成為核酸擴增的模板的核酸），於本發明中是指含有成為檢測目標的基因序列（即β血球蛋白基因序列）的核酸，只要含有β血球蛋白基因序列的片段，且進行以下將述的擴增反應，則可為任意形態的核酸。

關於樣本的來源，只要來源於人類且可進行擴增反應，則可使用任意者。另外，樣本亦可使用來源於任意組織的細胞、血液、體液。例如可列舉：來源於腦、心臟、肺、脾臟、腎臟、肝臟、胰臟、膽嚢、食道、胃、腸、膀胱、骨骼肌等各種組織的細胞、血液、體液。更詳細而言，例如可列舉：血液、脊髓液、尿、痰、胸水、腹水、胃液、水皰內體液等。

另外，樣本較佳為於進行後述核酸擴增之前，預先以可用於該擴增的含DNA的試樣的形式進行製備及純化。該製備及純化可依照公知的核酸萃取法來進行，例如可使用依據馬尼亞迪斯（Maniatis）等人的記載（分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），冷泉港（Cold Spring Harbor），NY，pp280、281，1982）的各種技術。

＜核酸擴增用引子組、探針位置＞

本發明是有關於一種用於檢測β血球蛋白基因的變異的探針組，對在美國國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）參考序列（Reference Sequence）: NC_000011.9（序列長為135006516個鹼基）的互補鏈序列上編碼的β血球蛋白基因序列的變異進行檢測。

通常，就檢測的方面而言，較佳為欲檢測的核酸的變異部位為預定部位。關於引子對，只要生成含有欲檢測的變異部位的擴增產物，則可設計於任意部位。例如於同時檢測外顯子（exon）1、外顯子2所含的多個變異部位的情形時，只要利用較外顯子1更靠上游的正向引子（forward primer）及外顯子2下游的反向引子（reverse primer）來進行核酸擴增，並檢測其擴增產物即可。另外，於一次性檢測多個區域的情形時，可使用多個引子對。於該情形時，較佳為預先於進行條件設定（即，於擴增的階段中是否未生成非特異性核酸片段）的階段中進行確認。一旦決定條件，則可於該條件下以良好的再現性進行檢測。

關於成為探針的寡核苷酸的鹼基序列，以含有於擴增產物序列（由引子組所夾持的區域）的內部的方式來決定探針序列。探針通常是以15個～35個核苷酸左右的長度來設定，對於所檢測的一個變異區域，通常需要1組（野生型檢測用探針與變異型檢測用探針兩種）或更多（1組以上）的探針。

為了使此後的檢測變容易，所使用的引子組可預先利用螢光物質（Cy3、Cy5等）或生物素（biotin）等事先標記其末端。標記方法並無特別限定，只要未見於擴增反應中明顯妨礙反應等的現象，則可為任意方法。反應後，亦可使與酶的複合體、例如鏈酶抗生素蛋白-鹼性磷酸酶結合物（streptavidin-alkaline phosphatase conjugate）進一步反應，並添加基質，由此進行顯色。

＜擴增反應＞

將上述成為核酸擴增的模板的核酸（樣本）作為模板，藉由核酸擴增反應，使β血球蛋白基因的變異部位中欲檢測的區域的核酸片段擴增。核酸的擴增方法可使用PCR法、環介導等溫擴增法（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）法、等溫及嵌合引子起始的核酸擴增法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，ICAN）法、轉錄逆轉錄協同反應（Transcription-Reverse transcription Concerted reaction，TRC）法、核酸序列依賴性擴增（Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA）法、探針交替連結自組反應（Probe Alternation Link Self-Assembly Reaction，PALSAR）法等各種方法。只要於核酸的檢測方面不特別產生問題，則可將任意方法用於核酸擴增反應中，該等中，就簡便性的觀點而言，較佳為PCR法。

核酸擴增反應中所用的溫度控制裝置可使用市售的熱循環機（thermal cycler）。例如可使用GeneAmp 9600或GeneAmp 9700（日本生命科技（Life Technologies Japan）股份有限公司）、T Professional系列（生物科技（Biometra）公司）等，關於傳熱性、蓋子的形狀，只要不產生問題，則可為任意樣式者。

＜擴增反應中所用的核苷酸單體＞

核苷酸單體可列舉通常的擴增反應中所用的脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate）等。其亦可與引子組同樣地使用此後的檢測變容易的衍生物，較佳為使用不妨礙擴增反應者。

＜擴增反應中所用的DNA伸長酶、其他＞

關於DNA伸長酶，可與通常的PCR法中所用者同樣地使用來源於耐熱性細菌的作為DNA聚合酶的TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等。

可使用的酶的套組可列舉：Hot StarTaq DNA聚合酶（凱傑（QIAGEN）公司製造）、PrimeStarMax DNA聚合酶（寶生物（Takara-Bio）公司）、SpeedSTAR HS DNA聚合酶（寶生物（Takara-Bio）公司）、KOD-Plus-Neo（東洋紡公司）、KAPA2G FastHotStartPCR套組（日本遺傳學（Genetics Japan）（股）公司）、AmpDirect套組（島津製作所）等，此外，若為可直接自血液（體液等）進行核酸擴增反應者，則操作變簡便，故更佳。

作為混合上述構成要素的方法，只要以酶不失活、且液體不會起泡而自管（tube）中漏出的方式混合，則可為任意的混合方法。通常只要將上述所有的構成成分分注於0.2 mL左右的大小的PCR用管中，利用旋渦混合器（vortex mixer）加以混合後，輕輕地離心（減慢轉速（spin down））以使蓋子上附著的溶液滴落即可。另外，於進行熱啟動（hot start）PCR的情形時，是於混合時不使酶活化的條件下進行混合。

繼而，（b）只要將上述（a）中所得的反應液供於核酸擴增反應即可。

於核酸擴增反應中，例如於利用PCR反應來擴增的情形時，可藉由以下方式使核酸以指數函數的形式擴增：於90℃～98℃下使酶（該酶使成為模板（template）的核酸解離）活化5分鐘左右後，反覆進行25循環～50循環的以下循環：於94℃下30秒（核酸的解離），於60℃下30秒（引子的退火（annealing）），於72℃下30秒（自引子的伸長反應起）左右。另外，於進行並非PCR反應的等溫條件下的核酸擴增反應的情形時，可藉由在40℃～65℃左右的一定溫度下培養（incubate）而獲得經擴增的核酸。

（c）繼而，使（b）中所得的核酸片段與本發明的微陣列接觸，藉此可檢測樣本中的目標核酸。

於步驟（c）中，可不將核酸擴增反應液純化而直接添加雜交溶液，而與微陣列接觸。所謂雜交溶液，是指可使擴增核酸與於微陣列上經固定化的探針進行雜交反應的溶液。

更詳細而言，上述雜交溶液為於Tris/HCl緩衝劑（buffer）等緩衝溶液中混合有NaCl溶液、MgCl₂ 溶液等混合有鹽的溶液或檸檬酸鈉緩衝液（saline sodium citrate，SSC）溶液、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）或吐溫（Tween）20等界面活性劑者。於與本發明中使用的探針進行反應的情形時，較佳為使用SDS等在冷卻時不析出界面活性劑的結晶的TNT buffer（Tris/HCl buffer溶液、NaCl溶液、Tween溶液的混合溶液）。

Tris/HCl或NaCl的濃度以最終濃度計而分別較佳為0.06 M～0.48 M，更佳為0.12 M～0.24 M。Tween以最終濃度計可設定為0.01質量%～0.2質量%，較佳為0.02質量%～0.15質量%，更佳為0.03質量%～0.12質量%。

另外，接觸時的溫度較佳為45℃～65℃，更佳為50℃～55℃，進而佳為45℃～70℃，進而更佳為50℃～65℃。關於接觸的時間，只要引起雜交反應且可檢測變異，則並無限定，為了抑制非特異性反應，接觸時間越短越佳。例如，接觸時間可設定為15分鐘～4小時，較佳為20分鐘～3小時，更佳為30分鐘～2小時。

＜核酸（擴增產物）的檢測＞

對藉由上述步驟（c）而於微陣列中的探針上捕捉的核酸進行檢測。

檢測方法只要檢測所捕捉的核酸，則並無限定，可使用公知的方法。例如可使用：使用螢光物質或發光物質作為標記基質並進行顯色測定或螢光強度測定的方法、目測的方法等。

更詳細而言，可使用氟影像分析儀（fluoro imaging analyzer）或電荷耦合元件（Charge Coupled Device，CCD）相機等來確定所捕捉的核酸的有無以及進行定量。藉由使用近年來逐漸被經常使用的PCR反應即時定量裝置等來經時監控螢光量，可進行可靠性更高的核酸的定量。

進而，亦可使用利用或不利用酶反應的顯色試劑等來進行顯色。此種方法中，可目測直接觀察或利用光學掃描儀來掃描。

本發明的核酸的檢測方法可列舉：對序列表所揭示的β血球蛋白基因的30個變異部位的分析的應用，進而亦可藉由設計、使用適當的探針，而製作針對本發明中揭示的變異部位以外的部位的檢測套組。

（ 4 ）套組

於本發明中，亦可將具有引子組及本發明的探針群組的微陣列用作用於檢測β血球蛋白基因的變異的套組。引子組可更佳地使用序列編號21所示的寡核苷酸引子及序列編號22所示的寡核苷酸引子組、或序列編號23所示的寡核苷酸引子及序列編號24所示的寡核苷酸引子組。

4. 微陣列、探針的評價方法

如上文已述般，於利用微陣列來進行多態性的檢測的情形時，較佳為所使用的探針不引起非特異性雜交。即，將不引起非特異性雜交的探針評價為性能高者。

因此，本發明提供以下方法作為定量地評價探針的性能的方法。

一種微陣列、探針的評價方法，其包括以下步驟：（1）於含有表示第1多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的Y軸、及表示第2多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的X軸的螢光座標系中，繪製以下螢光座標的步驟，上述螢光座標是使第1多態性用對照核酸、與包含第1多態性檢測用探針及第2多態性檢測用探針的多態性檢測用探針對（probe pair）雜交所得；（2）將與通過上述Y軸及X軸的交點O、及上述步驟（1）中繪製的螢光座標的直線的傾斜度成反比例的值設定為修正值C的步驟；以及（3）對多個多態性檢測用探針對進行步驟（1）及步驟（2），於各探針間比較修正值C，將修正值C最小的探針對決定為適於第1多態性檢測的探針的步驟。

於本發明中，第1多態性與第2多態性為同一多態性下的不同對立基因。即，第1多態性為第1對立基因，第2多態性為對應於上述第1對立基因的第2對立基因。

以下，對各步驟的概況加以說明。

步驟（1）：繪製步驟

首先，於步驟（1）中，將第1多態性用對照核酸與包含第1多態性檢測用探針及第2多態性檢測用探針的多態性檢測用探針對雜交所得的訊號強度繪製於螢光座標系中。於本發明的螢光座標系中，Y軸表示第1多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度，X軸表示第2多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度。此處，將Y軸與X軸的交點設定為O。另外，Y軸與X軸可正交，亦可不正交。

藉由上述繪製，可獲得表示第1多態性檢測用探針的螢光特性的螢光座標P（x₁ 、y₁ ）。

不引起非特異性雜交的理想的探針的螢光座標P成為x₁ =0、y₁ ＞0（圖1：欄（panel）A）。

然而，實際上大多數探針產生某種程度的非特異性雜交。因此，大多數探針的螢光座標P成為x₁ ＞0且y₁ ＞0（圖1：欄B）。

雜交是於雜交溶液中進行。所謂雜交溶液，是指可使對照核酸與探針進行雜交反應的溶液，更具體而言，有於Tris/HCl buffer等緩衝溶液中混合有NaCl溶液、MgCl₂ 溶液等混合有鹽的溶液或SSC溶液、SDS或Tween 20等界面活性劑者。通常於進行反應的情形時，較佳為使用SDS等在冷卻時不析出界面活性劑的結晶的TNT buffer（Tris/HCl buffer溶液、NaCl溶液、Tween溶液的混合溶液）。另外，其最終濃度較佳為0.06 M～0.48 M，更佳的最終濃度為0.12 M～0.24 M。另外，接觸時的溫度較佳為45℃～70℃，更佳為50℃～65℃。關於接觸時間，只要引起雜交反應且在可檢測的範圍內，則越短越佳。通常為15分鐘～4小時，較佳為20分鐘～3小時，更佳為30分鐘～2小時。

所謂訊號，是指將上述雜交的結果、探針上所捕捉的對照核酸的量數值化而成者。通常可藉由以下方式來獲得訊號：使螢光物質或發光物質結合於與探針雜交的核酸試樣，對自探針區域發出的螢光或顯色的強度進行測定。具體而言，訊號可使用氟影像分析儀或CCD相機等來獲得。

所謂「對應於」探針的訊號，是指訊號內可含有來源於背景（back ground）的訊號，所謂「來源於」探針的訊號，是指來源於探針原本的特異性的訊號。

步驟（2）：修正值的決定

繼而，亦可求出通過所繪製的螢光座標P及交點O的直線L，將與該直線L的傾斜度成反比例的值設定為修正值C（C＞0）。

作為具體例，修正值C亦可為與直線L和X軸所成的弧度角度α（0≦α≦π/2）成反比例者（圖1：欄C）。即，於以存在於Y軸上的方式修正螢光座標P情形時，必須使角度α擴增（π/2）÷α倍（圖1：欄D），但亦可根據該擴增度而設定為修正值C=（π/2）÷α（C≧1）。

步驟（3）：探針對的比較

通常為了檢測一個多態性，而準備多個候補探針。因此，必須對多個候補探針進行上述步驟（1）及步驟（2），設定各探針的修正值C。

藉由對如此而獲得的修正值C進行比較，可對候補探針的性能進行比較評價（圖1：欄E）。

如上文已述般，理想的探針的螢光座標P存在於Y軸上，故α=π/2。因此，理想的探針的修正值C=（π/2）÷（π/2）=1。

另一方面，產生某種程度的非特異性雜交的探針的情況下，α＜π/2，故修正值C＞1。例如於α=π/4的情形時，修正值C=2，於α=π/6的情形時，修正值C=3。

因此，於本發明的方法中，修正值C的值越小，判斷該探針的性能越高。即，將修正值C最小的探針（即角度α最大）決定為適於第1多態性檢測的探針。例如於圖1欄E的例子中，將探針對No.3決定為適於第1多態性檢測的探針。

亦可對以上所述的步驟加以各種改變。

例如亦可於步驟（1）中將對照核酸與探針的雜交重複2次以上，獲得2點以上的螢光座標（圖2：欄A：於該情形時為3點螢光座標）。於該情形時，亦可求出所獲得的2點以上的螢光座標的代表值M，且使步驟（2）中的直線L為通過交點O及代表值M的中央直線（圖2：欄B）。此處所謂代表值，是指代表多個值的值。例如可列舉平均值、中央值或經加權的平均值等，就對離群值（outlier）的穩健性（robustness）的方面而言，較佳為中央值。

進而，亦可於步驟（1）中，於通過交點O及螢光座標的各直線中（由於存在2點以上的螢光座標，故直線亦存在2條以上），選擇與上述中央直線有傾斜度差的直線，將其設定為誤差直線（於選擇傾斜度差最大的直線的情形時，將其設定為第1誤差直線）（圖2：欄B）。

於設定第1誤差直線的情形時，使步驟（2）包括以下處理：（a）求出上述中央直線與X軸之間的角度α（弧度），求出修正值C=π/2÷α（圖2：欄C）；以及（b）將上述中央直線與誤差直線（於選擇傾斜度差最大的直線的情形時，將其設定為第1誤差直線）所成的角度設定為誤差角θ（弧度），進而，設定為修正誤差角θ'（弧度）=θ（弧度）×修正值C。

誤差角視需要亦可設定為上述值的常數倍。另外，作為具有差的直線，亦可將差最大的直線設定為第1誤差直線，根據與多條具有差的直線的角度差來設定加上了信賴區間的誤差角的範圍。

另一方面，亦可使用第2多態性用對照核酸，對第2多態性檢測用探針進行相當於上述步驟（1）～步驟（3）的步驟（4）～步驟（6）。

具體而言，步驟（4）～步驟（6）如下。

（4）繪製以下螢光座標的步驟，該螢光座標是使第2多態性用對照核酸與包含第1多態性檢測用探針及第2多態性檢測用探針的多態性檢測用探針對雜交所得；

（5）將與通過交點O、及步驟（4）中繪製的螢光座標的直線的傾斜度成比例的值設定為修正值C₂ 的步驟；以及

（6）對多個多態性檢測用探針對進行步驟（4）及步驟（5），於各探針間比較修正值C₂ ，將修正值C₂ 最小的探針對決定為適於第2多態性檢測的探針的步驟。

步驟（4）：繪製步驟

於步驟（4）中，將第2多態性用對照核酸與包含第1多態性檢測用探針及第2多態性檢測用探針的多態性檢測用探針對雜交所得的訊號強度繪製於螢光座標系中。

藉由上述繪製，可獲得表示第2多態性檢測用探針的螢光特性的螢光座標P₂ （x₂ 、y₂ ）（圖3：欄A）。

步驟（5）：修正值的決定

繼而，亦可求出通過所繪製的螢光座標P₂ 及交點O的直線L₂ ，將與該直線L₂ 的傾斜度成比例的值設定為修正值C₂ （C₂ ＞0）。

作為具體例，修正值C₂ 亦可為與直線L₂ 和Y軸所成的弧度角度β（0≦β≦π/2）成反比例者（即，與L₂ 的傾斜度（π/2-β）成比例）（圖3：欄B）。於以存在於X軸上的方式修正螢光座標P₂ 的情形時，必須使角度β擴增（π/2）÷β倍（圖3：欄C），但亦可根據該擴增度來設定為修正值C₂ =（π/2）÷β（C₂ ≧1）。

步驟（6）：探針對的比較

與上述步驟（3）同樣地，必須對多個候補探針對進行上述步驟（4）及步驟（5），設定各探針的修正值C₂ 。

藉由對如此而獲得的修正值C₂ 進行比較，可對候補探針的性能進行比較評價（圖3：欄D）。

如上文已述般，理想的探針對的螢光座標P₂ 存在於X軸上，故β=π/2。因此，理想的探針的修正值C₂ =（π/2）÷（π/2）=1。

另一方面，產生某種程度的非特異性雜交的探針的情況下，β＜π/2，故修正值C₂ ＞1。例如於β=π/4的情形時，修正值C₂ =2，於β=π/6的情形時，修正值C₂ =3。

因此，修正值C₂ 的值越小，判斷該探針的性能越高。即，將修正值C₂ 最小的探針決定為適於第2多態性檢測的探針。例如於圖3欄D的例子中，將探針對No.4'決定為適於第2多態性檢測的探針。

亦可對以上所述的步驟進行各種改變。

例如，於步驟（4）中，亦可使對照核酸與探針的雜交重複2次以上，而獲得2點以上的螢光座標（圖4：欄A：該情形時為3點螢光座標）。於該情形時，亦可求出所獲得的2點以上的螢光座標的代表值M₂ ，且使步驟（2）中的直線L₂ 為通過交點O及代表值M₂ 的第2中央直線（圖4：欄B）。

此處所謂代表值，是指代表多個值的值。例如可列舉平均值、中央值或經加權的平均值等，就對離群值的穩健性的方面而言，較佳為中央值。

進而，於步驟（4）中，亦可自通過交點O及螢光座標的各直線中（由於存在2點以上的螢光座標，故直線亦存在2條以上），選擇與上述第2中央直線有傾斜度差的直線，將其設定為誤差直線（於選擇傾斜度差最大的直線的情形時，將其設定為第2誤差直線）（圖4：欄B）。

於設定第2誤差直線的情形時，使步驟（2）包括以下處理：（a）求出上述第2中央直線與Y軸之間的角度β（弧度），求出修正值C₂ =π/2÷β；以及（b）將上述第2中央直線與誤差直線（於選擇傾斜度差最大的直線的情形時，將其設定為第2誤差直線）所成的角度設定為誤差角θ₂ （弧度），進而，設定為修正誤差角θ₂ '（弧度）=θ₂ （弧度）×修正值C₂ 。

誤差角視需要亦可設定為上述值的常數倍。作為具有差的直線，亦可將差最大的直線設定為第2誤差直線，另外亦可根據與多條具有差的直線的角度差來設定加上了信賴區間的誤差角的範圍。

另外，本發明提供一種表示藉由上述方法所評價的探針的修正值C（或C₂ ）的方法，以評價探針的性能。進而，本發明亦提供一種顯示經使用修正值C（或C₂ ）加以修正的座標及加以修正的誤差範圍的方法。

利用本發明的評價方法，可容易地比較各探針間的性能，另外亦可考慮誤差範圍而判定基因型。

以下，藉由實施例對本發明加以更具體說明，但該些實施例是以例示本發明為目的，並不限定本發明。

實施例

[實施例1]

對使用DNA微陣列來一併檢測β血球蛋白基因的25個變異部位的情形進行研究。將檢測對象的變異部位示於以下的表1中。

表 1 β血球蛋白的變異部位

其中，就周圍的鹼基序列的特徵方面而言，檢測變異c.52A＞T、c.84_85insC、c.364G＞C、c.380T＞G的探針的探針設計的難度高，故先實施研究。

1. 貫通孔型 DNA 微陣列的製作

如以下般製造DNA微陣列。

＜1-1.探針的製備＞

合成作為探針的序列編號1～序列編號18記載的寡核苷酸。

以於寡核苷酸的5'末端導入有胺基己基的寡核苷酸的形式合成。合成後，使甲基丙烯酸酐與該寡核苷酸反應，進而藉由高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）進行純化、分離，而獲得具有表2的序列編號1～序列編號18所示的鹼基序列的5'末端乙烯基化寡核苷酸。作為序列的特徵，序列編號1、序列編號2為受到接近變異c.52A＞T的變異c.59A＞T之變異的影響的探針，序列編號3、序列編號4中，導入肌苷作為與接近變異c.52A＞T的變異c.59A＞T之變異雜交的通用鹼基。

同樣地，序列編號5、序列編號6為受到接近變異c.84_85insC的變異c.79G＞A之變異的影響的探針，序列編號7、序列編號8中，導入肌苷作為與接近變異c.84_85insC的變異c.79G＞A之變異雜交的通用鹼基。

另外，序列編號11、序列編號12中，用於檢測變異的不同的鹼基部位是位於距探針的3末端6個鹼基的位置，序列編號17、序列編號18於兩末端導入「AA」。

表 2 探針序列候補變異c.52A＞T 檢測用探針對候補1 12_1_c.52A＞T CTGTGGGGCAAGGTGAACG 序列編號1 12_2_c.52A＞T CTGTGGGGCTAGGTGAACG 序列編號2 變異c.52A＞T 檢測用探針對候補2 12_c.52A＞T①kai1 GGCAAGGTGAICGTGGATG 序列編號3 12_c.52A＞T②kai1 GGCTAGGTGAICGTGGATG 序列編號4 變異c.84_85insC 檢測用探針對候補1 15_1_c.84_85insC TGGTGAGGCCCTGGGCAGG 序列編號5 15_2_c.84_85insC TGGTGAGGCCCCTGGGCAG 序列編號6 變異c.84_85insC 檢測用探針對候補2 15_c.84_85insC①kai1 GTIAGGCCCTGGGCAG 序列編號7 15_c.84_85insC②kai1 TIAGGCCCCTGGGCAG 序列編號8 變異c.364G＞C 檢測用探針對候補1 26_1_c.364G＞C TTTGGCAAAGAATTCACCC 序列編號9 26_2_c.364G＞C TTTGGCAAACAATTCACCC 序列編號10 變異c.364G＞C 檢測用探針對候補2 26_c.364G＞C①kai1 CCATCACTTTGGCAAAGAATTC 序列編號11 26_c.364G＞C②kai1 CCATCACTTTGGCAAACAATTC 序列編號12 變異c.380T＞G檢測用探針對候補1 28_1_c.380T＞G ACCCCACCAGTGCAGGCTG 序列編號13 28_2_c.380T＞G ACCCCACCAGGGCAGGCTG 序列編號14 變異c.380T＞G檢測用探針對候補2 28_1_c.380T＞G_20111104 CAGTGCAGGCTGCCTATCAGA 序列編號15 28_2_c.380T＞G_20111104 CAGGGCAGGCTGCCTATCAGA 序列編號16 變異c.380T＞G檢測用探針對候補3 27_28探針①(Wt-T) AACCCACCAGTGCAGGCAA 序列編號17 27_28探針②(Wt-G) AACCCACCAGGGCAGGCAA 序列編號18

序列編號1～序列編號18記載的寡核苷酸可與人類β血球蛋白基因序列的一部分雜交。

＜1-2.DNA微陣列＞

於本實施例中，使用核酸微陣列（（季諾帕（Genopal）：註冊商標）、三菱麗陽股份有限公司），該核酸微陣列使用表1中記載的探針（序列編號1～序列編號18）及於未搭載探針的部位使用水來代替核酸探針。

2.β 血球蛋白基因的變異檢測用探針的評價

＜2-1.質體模板DNA的製作＞

於NCBI參考序列（Reference Sequence）：NC_000011.9（序列長為135006516個鹼基）的第5246730個鹼基至第5248465個鹼基的互補鏈序列上，編碼β血球蛋白基因序列。將其序列示於序列編號19中。另外，藉由與序列編號20所示的NM_000518.4｜人類血紅蛋白β（Homo sapiens hemoglobin, beta (HBB)）, mRNA的序列進行比較，來確定基因組DNA序列中的外顯子（exon）區域。（蛋白質編碼區域（coding region）：第51個鹼基～第494個鹼基，外顯子1：第1個鹼基～第142個鹼基，外顯子2：第143個鹼基～第365個鹼基，外顯子3：第366個鹼基～第626個鹼基）

序列編號19中，斜體所示的序列部位為序列編號21～序列編號24的引子序列的位置，粗體所示的序列為外顯子區域，四邊包圍的區域為非轉譯區（untranslated region，UTR）區域。

作為β血球蛋白基因的野生型模板，合成含有序列編號19所示的序列的質體而準備模板（使用BEX股份有限公司的人工基因合成服務而插入至pUC57載體（vector）中者），將濃度製備成10 ng/μl。

另外，與此相同，分別準備於上文表1所示的依據HGVS命名法的變異表述位置上發生了變異的質體DNA（25種），該等亦是將濃度製備成10 ng/μl。

引子對＜序列編號21、22、23、24＞序列編號21 擴增子（Amplicon）1F ACTCCTAAGCCAGTGCCAGA 序列編號22 Amplicon1R cy5-CACTCAGTGTGGCAAAGGTG 序列編號23 MRC-Amplicon2F GTATCATGCCTCTTTGCACCATTC 序列編號24 MRC-Amplicon2R cy5-CAGATGCTCAAGGCCCTTCATA

＜序列編號19＞＞gi|224589802:c5248465-5246730 人類染色體 11, GRCh37.p5 初級組裝(Primary Assembly) AACTCCTAAGCCAGTGCCAGA AGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG GTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTG AGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGG GTGAGTCTATGGGACGCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGATAAGTAACAGGGTACAGTTTAGAATGGGAAACAGACGAATGATTGCATCAGTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTCTTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTTTTCTTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTTCTTCTCCGCAATTTTTACTATTATACTTAATGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGGAAATATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAAAAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATTACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATTTGCATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTTTTATTTTTAATTGATACATAATCATTATACATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAATATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTC TAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATCTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTG G

＜序列編號20＞＞gi|28302128|ref|NM_000518.4 |人類血紅蛋白（Homo sapiens hemoglobin）,β(HBB), mRNA ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC

＜PCR反應＞

將野生型質體DNA及表1記載的編號10、編號13、編號21、編號23（包含變異c.52A＞T、c.84_85insC、c.364G＞C、c.380T＞G）的4種變異型質體DNA共計5種作為模板，使用序列編號21～序列編號24的2組引子對來進行PCR反應。PCR反應中，使用KOD FX Neo套組（東洋紡公司）。

＜PCR反應液組成＞質體DNA溶液（10 ng/μL） 1 μL（野生型或變異型） Amplicon1F引子（20 μM） 1 μL Amplicon1R引子（20 μM） 1 μL MRC-Amplicon2F引子（20 μM） 0.5 μL MRC-Amplicon2R引子（20 μM） 0.5 μL 2×buffer 50 μl 2 mM dNTPs 20 μl Milli-Q水 24 μl KOD FX Neo 2 μl反應容量 100 μl

於PCR反應中使用GeneAmp9700熱循環機，於最大（Max）模式下進行反應。以下示出溫度條件。

＜PCR反應溫度條件＞ 95℃ 10分鐘（94℃下30秒、68℃下30秒、72℃下30秒）×35循環 4℃ 反應結束

於反應後的反應液100 μl中添加以下的緩衝溶液，調整為200 μl。反應液 100 μl 1 M的Tris/HCl（pH值為7.5）緩衝液 48 μl 5 M的NaCl溶液 9.6 μl 0.5% Tween20水溶液 20 μlMilli-Q水 22.4 μl 合計 200 μl

其後，將該溶液200 μl放入至專用腔室（chamber）中（http://www.mrc.co.jp/genome/about/usage.html中記載），繼而放入DNA微陣列並加蓋，於55℃下培養2小時。

培養後，將晶片分別於0.24 M的TNT buffer 10 ml中於55℃下浸漬20分鐘。其後，繼續於0.24 M的TN buffer 10 ml中於55℃下浸漬10分鐘，實施清洗。清洗後實施檢測。

檢測時，使用冷卻型CCD相機方式的DNA微陣列自動檢測裝置。對DNA微陣列自孔上部以4秒鐘的曝光時間進行攝像，檢測各斑點中的cy5的螢光訊號。將微陣列上的未搭載探針的斑點作為空白斑點（blank spot），將其螢光強度的中央值作為背景值。將由所有的斑點的螢光強度減去背景（background）值所得的值作為各探針的訊號。

將野生型的序列作為第1多態性，將變異型的序列作為第2多態性，將第1多態性用對照核酸作為野生型質體，進行多次實驗，將所得的結果示於表3中。另外，將表3的結果繪製於以下螢光座標系中，將繪製所得的結果示於圖5中，上述螢光座標系含有表示第1多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的Y軸、及表示第2多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的X軸，且X軸-Y軸正交（圖5：於表示第1多態性檢測用探針、第2多態性檢測用探針的訊號強度的螢光座標系中，繪製使第1對照核酸多次雜交的結果，進而顯示了該等的代表直線的圖）。

圖5的虛線為將各探針對候補的多次（2次或3次）實驗結果的平均訊號強度、與原點連結的直線（設定為代表直線），圖表中的數式表示該些直線。

關於探針的選擇，將與代表直線的傾斜度成反比例的值設定為修正值C，對多個多態性檢測用探針對進行修正值C的設定並進行比較，選擇修正值C最小者。於該研究中，修正值C是以π/2÷代表直線與X軸所成的角度（弧度）而算出。各探針對中，作為性能良好的探針對，可自探針候補中選擇，即，作為檢測c.52A＞T的變異的探針，可自序列編號1與序列編號2的對、及序列編號3與序列編號4的對中，選擇序列編號3與序列編號4的對；作為檢測c.84_85insC的變異的探針，可自序列編號5與序列編號6的對、及序列編號7與序列編號8的對中，選擇序列編號7與序列編號8的對；作為檢測c.364G＞C的變異的探針，可自序列編號9與序列編號10的對、及序列編號11與序列編號12的對中，選擇序列編號11與序列編號12的對；作為檢測c.380T＞G的變異的探針，可自序列編號13與序列編號14的對、序列編號15與序列編號16的對、及序列編號17與序列編號18的對中，選擇序列編號17與序列編號18的對。

表 3 使用野生型質體（第1多態性用對照核酸）進行多次實驗的結果

於表3所示的探針序列中，以粗體表示的鹼基為檢測對象的多態性，以斜體表示的鹼基為進行了本發明的修飾（肌苷置換或腺嘌呤插入）的鹼基。

同樣地，將野生型的序列作為第1多態性，將變異型的序列作為第2多態性，將第2多態性用對照核酸作為變異型質體，進行多次實驗，將所得的結果示於表4中。另外，將表3及表4的結果繪製於以下螢光座標系中，將繪製所得的結果示於圖6中，上述螢光座標系含有表示第1多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的Y軸、及表示第2多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的X軸，且X軸-Y軸正交（圖6為除了圖5以外還繪製使第2對照核酸進行多次雜交的結果，進而顯示了該等的代表直線的圖）。

表 4 使用變異型質體（第2多態性用對照核酸）進行多次實驗的結果

於表4所示的探針序列中，以粗體表示的鹼基為檢測對象的多態性，以斜體表示的鹼基為進行了本發明的修飾（肌苷置換或腺嘌呤插入）的鹼基。

圖6圖表中的包含「雜交第2多態性用對照核酸」的系列為雜交變異型質體的結果。虛線或實線為將各探針對候補的多次（2次或3次）實驗結果的平均訊號強度與原點連結的代表直線。

關於該些探針的選擇，將與代表直線的傾斜度成比例的值設定為修正值C2，對多個多態性檢測用探針對進行修正值C2的設定並加以比較，選擇修正值C2最小的適於第2（變異型）多態性檢測的探針對。

於該研究中，修正值C2是以π/2÷（π/2-代表直線與X軸所成的角度（弧度））來算出。各探針對中，作為性能良好的探針對，可自探針候補中選擇，即，作為檢測c.52A＞T的變異的探針，可自序列編號1與序列編號2的對、及序列編號3與序列編號4的對中，選擇序列編號3與序列編號4的對；作為檢測c.84_85insC的變異的探針，可自序列編號5與序列編號6的對、及序列編號7與序列編號8的對中，選擇序列編號7與序列編號8的對；作為檢測c.364G＞C的變異的探針，可自序列編號9與序列編號10的對、及序列編號11與序列編號12的對中，選擇序列編號11與序列編號12的對；作為檢測c.380T＞G的變異的探針，可自序列編號13與序列編號14的對、序列編號15與序列編號16的對、及序列編號17與序列編號18的對中，選擇序列編號17與序列編號18的對。

以上，將至此為止所示出的修正值C、修正值C2的圖表示於圖7中。

繼探針的評價之後，對於基因型判定時有用的誤差範圍，如以下的表5般進行設定。根據將第1對照核酸或第2對照核酸重複雜交2次以上所得的訊號強度來算出平均值，作為該探針對所提供的代表座標。另外，將通過代表座標及原點的直線作為代表直線，將X軸與代表直線的角度作為代表座標角度，算出將各資料和原點連結的直線與代表直線的角度（弧度單位），將最大的角度作為誤差角度。另外，將使用修正值C、修正值C2、誤差角度進行修正前後的探針性能資料示於圖8中。

表 5 本發明的修正方法的具體例示使第1多態性用對照核酸與多態性檢測用探針對雜交所得的螢光使第2多態性用對照核酸與多態性檢測用探針對雜交所得的螢光

[實施例2]

為了使用DNA微陣列來一併檢測β血球蛋白基因的25個部位的變異，製作搭載有序列編號3、序列編號4、序列編號7、序列編號8、序列編號11、序列編號12、序列編號17、序列編號18及序列編號25～序列編號66所示的探針的陣列。

成為檢測對象的變異部位與實施例1的表1相同，DNA微陣列亦是與實施例1同樣地製作。

＜PCR反應＞

將表1記載的編號1～編號25的變異型質體DNA作為模板，使用序列編號21～序列編號24的2組引子對來進行PCR反應。於PCR反應中，使用Ampdirect Plus套組（島津製作所）。

＜PCR反應液組成＞質體DNA溶液（10 ng/μL） 1 μL(野生型或變異型) Amplicon1F引子（20 μM） 1 μL Amplicon1R引子（20 μM） 1 μL MRC-Amplicon2F引子（20 μM） 0.5 μL MRC-Amplicon2R引子（20 μM） 0.5 μL 2×Ampdirect Buffer 50 μl BioTaq（帶有Ampdirect Plus套組） 1 μlMilli-Q水 45 μl 合計 100 μl

於PCR反應中使用GeneAmp9700熱循環機，於Max模式下進行反應。以下示出溫度條件。

於反應後的反應液100 μl中添加以下的緩衝、溶液，調整為200 μl。反應液 100 μl 1M Tris/HCl（pH7.5）緩衝液 48 μl 5 M的NaCl溶液 9.6 μl 0.5% Tween20水溶液 20 μlMilli-Q水 22.4 μl 合計 200 μl

其後，將該溶液200 μl放入至專用腔室中（http://www.mrc.co.jp/genome/about/usage.html中記載），繼而放入DNA微陣列並加蓋，於55℃下培養2小時。

檢測時，使用冷卻型CCD相機方式的DNA微陣列自動檢測裝置。對DNA微陣列自孔上部以4秒鐘的曝光時間進行攝像，檢測各斑點中的cy5的螢光訊號。將微陣列上的未搭載探針的斑點作為空白斑點，將其螢光強度的中央值作為背景值。將由所有的斑點的螢光強度減去背景值所得的值作為各探針的訊號。

將結果示於表6中。

表 6 使用25種變異質體的檢測結果：訊號值

繼而，對各探針對算出來源於野生型探針的訊號/來源於變異型探針的訊號後，換算成弧度單位（表7左側）。其後，於25次雜交的資料中，算出野生型24資料的中央值（弧度）與標準偏差（弧度）。計算π/2÷野生型的中央值，由此對修正值C計算π/2÷（π/2-變異型），藉此算出修正值C2（表7右）。

其後，作為誤差範圍，對野生型24資料的標準偏差乘以修正值C或修正值C2，藉此算出修正後的誤差範圍（表7右端）。

將誤差範圍的上端或下端作為基因型的判定範圍，將修正前後的資料示於圖9（圖9：由來源於質體的25種樣品所得的資料的修正前、修正後）中。

表 7 由來源於質體的25種樣品所得的資料及修正值、標準偏差

與該研究不同，購入ECACC種族多樣性DNA板（Ethnic Diversity DNA Panels）（EDP-1）（西格瑪（Sigma）公司，目錄號（Catalogue No）：07020701），利用定序儀（sequencer）對1個樣品分析鹼基序列，結果得知該樣品的變異部位12為異型（hetero）。因此，繼而使用該樣品利用與實施例2所示的方法相同的方法來取得DNA晶片的資料，結果獲得了表8的訊號強度。

繼而，對各探針對計算（來源於野生型探針的訊號）/（來源於變異型探針的訊號）來算出表8的訊號強度後，換算成弧度單位，進而乘以表7中的修正值C。將結果示於表9中。另外，於圖9的修正後的圖表上疊加表9的資料（圖10：於圖9的修正後的圖表上疊加表9的資料的結果），結果僅12號的變異部位處是繪製於野生型的誤差線（error bar）與變異型的誤差線之間，可判定其為異型接合。

表 8 來源於變異部位12為異型的樣品的DNA晶片訊號值

表 9 修正表8的資料所得的資料 [產業上之可利用性]

根據本發明，可提供一種高品質的探針、具備該探針的微陣列及探針的評價方法。【序列表非關鍵詞文字（sequence list free text）】

序列編號1～序列編號18：探針序列編號21～序列編號24：引子序列編號25～序列編號66：探針

無

圖1為對本發明的修正方法加以圖示者。圖2為對本發明的修正方法加以圖示者。圖3為對本發明的修正方法加以圖示者。圖4為對本發明的修正方法加以圖示者。圖5為於表示第1多態性檢測用探針、第2多態性檢測用探針的訊號強度的螢光座標系中，繪製使第1對照核酸（control nucleic acid）多次雜交的結果，進而顯示了該等的代表直線者。圖6為除了圖5以外繪製使第2對照核酸多次雜交的結果，進而顯示了該等的代表直線者。圖7為修正值C、修正值C2的圖表。圖8為使用修正值C、修正值C2、誤差角度進行修正前後的探針性能資料。圖9為由來源於質體（plasmid）的25種樣品所得的資料（修正前、修正後）。圖10為於圖9的修正後的圖表上疊加（overlay）表9的資料所得的結果。

＜110＞三菱麗陽股份有限公司＜120＞用於檢測β血球蛋白基因的變異的微陣列及其檢測方法＜130＞ PCT13-0016 ＜160＞ 66 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 1 ctgtggggca aggtgaacg 19 ＜210＞ 2 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 2 ctgtggggct aggtgaacg 19 ＜210＞ 3 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (11)..(11) ＜223＞ n為肌苷(inosine) ＜400＞ 3 ggcaaggtga ncgtggatg 19 ＜210＞ 4 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (11)..(11) ＜223＞ n為肌苷＜400＞ 4 ggctaggtga ncgtggatg 19 ＜210＞ 5 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 5 tggtgaggcc ctgggcagg 19 ＜210＞ 6 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 6 tggtgaggcc cctgggcag 19 ＜210＞ 7 ＜211＞ 16 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3)..(3) ＜223＞ n為肌苷＜400＞ 7 gtnaggccct gggcag 16 ＜210＞ 8 ＜211＞ 16 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (2)..(2) ＜223＞ n為肌苷＜400＞ 8 tnaggcccct gggcag 16 ＜210＞ 9 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 9 tttggcaaag aattcaccc 19 ＜210＞ 10 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 10 tttggcaaac aattcaccc 19 ＜210＞ 11 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 11 ccatcacttt ggcaaagaat tc 22 ＜210＞ 12 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 12 ccatcacttt ggcaaacaat tc 22 ＜210＞ 13 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 13 accccaccag tgcaggctg 19 ＜210＞ 14 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 14 accccaccag ggcaggctg 19 ＜210＞ 15 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 15 cagtgcaggc tgcctatcag a 21 ＜210＞ 16 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 16 cagggcaggc tgcctatcag a 21 ＜210＞ 17 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 17 aacccaccag tgcaggcaa 19 ＜210＞ 18 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 18 aacccaccag ggcaggcaa 19 ＜210＞ 19 ＜211＞ 1736 ＜212＞ DNA ＜213＞現代人種(Homo sapiens) ＜400＞ 19 aactcctaag ccagtgccag aagagccaag gacaggtacg gctgtcatca cttagacctc 60 accctgtgga gccacaccct agggttggcc aatctactcc caggagcagg gagggcagga 120 gccagggctg ggcataaaag tcagggcaga gccatctatt gcttacattt gcttctgaca 180 caactgtgtt cactagcaac ctcaaacaga caccatggtg catctgactc ctgaggagaa 240 gtctgccgtt actgccctgt ggggcaaggt gaacgtggat gaagttggtg gtgaggccct 300 gggcaggttg gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa actgggcatg 360 tggagacaga gaagactctt gggtttctga taggcactga ctctctctgc ctattggtct 420 attttcccac ccttaggctg ctggtggtct acccttggac ccagaggttc tttgagtcct 480 ttggggatct gtccactcct gatgctgtta tgggcaaccc taaggtgaag gctcatggca 540 agaaagtgct cggtgccttt agtgatggcc tggctcacct ggacaacctc aagggcacct 600 ttgccacact gagtgagctg cactgtgaca agctgcacgt ggatcctgag aacttcaggg 660 tgagtctatg ggacgcttga tgttttcttt ccccttcttt tctatggtta agttcatgtc 720 ataggaaggg gataagtaac agggtacagt ttagaatggg aaacagacga atgattgcat 780 cagtgtggaa gtctcaggat cgttttagtt tcttttattt gctgttcata acaattgttt 840 tcttttgttt aattcttgct ttcttttttt ttcttctccg caatttttac tattatactt 900 aatgccttaa cattgtgtat aacaaaagga aatatctctg agatacatta agtaacttaa 960 aaaaaaactt tacacagtct gcctagtaca ttactatttg gaatatatgt gtgcttattt 1020 gcatattcat aatctcccta ctttattttc ttttattttt aattgataca taatcattat 1080 acatatttat gggttaaagt gtaatgtttt aatatgtgta cacatattga ccaaatcagg 1140 gtaattttgc atttgtaatt ttaaaaaatg ctttcttctt ttaatatact tttttgttta 1200 tcttatttct aatactttcc ctaatctctt tctttcaggg caataatgat acaatgtatc 1260 atgcctcttt gcaccattct aaagaataac agtgataatt tctgggttaa ggcaatagca 1320 atatctctgc atataaatat ttctgcatat aaattgtaac tgatgtaaga ggtttcatat 1380 tgctaatagc agctacaatc cagctaccat tctgctttta ttttatggtt gggataaggc 1440 tggattattc tgagtccaag ctaggccctt ttgctaatca tgttcatacc tcttatcttc 1500 ctcccacagc tcctgggcaa cgtgctggtc tgtgtgctgg cccatcactt tggcaaagaa 1560 ttcaccccac cagtgcaggc tgcctatcag aaagtggtgg ctggtgtggc taatgccctg 1620 gcccacaagt atcactaagc tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg 1680 ttccctaagt ccaactacta aactggggga tattatgaag ggccttgagc atctgg 1736 ＜210＞ 20 ＜211＞ 626 ＜212＞ RNA ＜213＞現代人種＜400＞ 20 acauuugcuu cugacacaac uguguucacu agcaaccuca aacagacacc auggugcauc 60 ugacuccuga ggagaagucu gccguuacug cccugugggg caaggugaac guggaugaag 120 uuggugguga ggcccugggc aggcugcugg uggucuaccc uuggacccag agguucuuug 180 aguccuuugg ggaucugucc acuccugaug cuguuauggg caacccuaag gugaaggcuc 240 auggcaagaa agugcucggu gccuuuagug auggccuggc ucaccuggac aaccucaagg 300 gcaccuuugc cacacugagu gagcugcacu gugacaagcu gcacguggau ccugagaacu 360 ucaggcuccu gggcaacgug cuggucugug ugcuggccca ucacuuuggc aaagaauuca 420 ccccaccagu gcaggcugcc uaucagaaag ugguggcugg uguggcuaau gcccuggccc 480 acaaguauca cuaagcucgc uuucuugcug uccaauuucu auuaaagguu ccuuuguucc 540 cuaaguccaa cuacuaaacu gggggauauu augaagggcc uugagcaucu ggauucugcc 600 uaauaaaaaa cauuuauuuu cauugc 626 ＜210＞ 21 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子＜400＞ 21 actcctaagc cagtgccaga 20 ＜210＞ 22 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子＜220＞＜221＞經修飾的鹼基＜222＞ (1)..(1) ＜223＞ Cy5經標記＜400＞ 22 cactcagtgt ggcaaaggtg 20 ＜210＞ 23 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子＜400＞ 23 gtatcatgcc tctttgcacc attc 24 ＜210＞ 24 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子＜220＞＜221＞經修飾的鹼基＜222＞ (1)..(1) ＜223＞ Cy5經標記＜400＞ 24 cagatgctca aggcccttca ta 22 ＜210＞ 25 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 25 gagccacacc ctagggttg 19 ＜210＞ 26 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 26 gagccacaca ctagggttg 19 ＜210＞ 27 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 27 gggctgggca taaaagtca 19 ＜210＞ 28 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 28 gggctgggcg taaaagtca 19 ＜210＞ 29 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 29 ggctgggcat aaaagtcag 19 ＜210＞ 30 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 30 ggctgggcac aaaagtcag 19 ＜210＞ 31 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 31 ctgggcataa aagtcaggg 19 ＜210＞ 32 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 32 ctgggcatag aagtcaggg 19 ＜210＞ 33 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 33 cagacaccat ggtgcatct 19 ＜210＞ 34 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 34 cagacaccag ggtgcatct 19 ＜210＞ 35 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 35 acaccatggt gcatctgac 19 ＜210＞ 36 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 36 acaccatggc gcatctgac 19 ＜210＞ 37 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 37 ctgactcctg aggagaagt 19 ＜210＞ 38 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 38 ctgactccta aggagaagt 19 ＜210＞ 39 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 39 ggagaagtct gccgttact 19 ＜210＞ 40 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 40 ggagaaggtc tgccgtta 18 ＜210＞ 41 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 41 cgttactgcc ctgtggggc 19 ＜210＞ 42 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 42 gttactgccc tgggggc 17 ＜210＞ 43 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 43 gcaaggtgaa cgtggatga 19 ＜210＞ 44 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 44 gcaaggtgag cgtggatga 19 ＜210＞ 45 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 45 aagttggtgg tgaggcc 17 ＜210＞ 46 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 46 aagttggtgg taaggcc 17 ＜210＞ 47 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 47 cctgggcagg ttggtatca 19 ＜210＞ 48 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 48 cctgggcagt ttggtatca 19 ＜210＞ 49 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 49 ggcaggttgg tatcaaggt 19 ＜210＞ 50 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 50 ggcaggttgc tatcaaggt 19 ＜210＞ 51 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 51 ggtggtctac ccttggacc 19 ＜210＞ 52 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 52 ggtggtctaa ccttggacc 19 ＜210＞ 53 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 53 ctgttatggg caaccctaa 19 ＜210＞ 54 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 54 ctgttatgga caaccctaa 19 ＜210＞ 55 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 55 cggtgccttt agtgatggc 19 ＜210＞ 56 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 56 cggtgccttt aagtgatgg 19 ＜210＞ 57 ＜211＞ 16 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 57 tcaagggcac ctttgc 16 ＜210＞ 58 ＜211＞ 16 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 58 tcaaggacac ctttgc 16 ＜210＞ 59 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 59 ctgggttaag gcaatagcaa tatc 24 ＜210＞ 60 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 60 ctgggttaag gtaatagcaa tatc 24 ＜210＞ 61 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 61 aattcacccc accagtgca 19 ＜210＞ 62 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 62 aagaattcag tgcaggctg 19 ＜210＞ 63 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 63 gtggctggtg tggctaa 17 ＜210＞ 64 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 64 gtggctgatg tggctaa 17 ＜210＞ 65 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 65 caagtatcac taagctcgc 19 ＜210＞ 66 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞探針＜400＞ 66 aagtatcaca ctaagctcg 19

Claims

一種多態性檢測用微陣列探針對的評價方法，其包括以下步驟：（1）於含有表示第1多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的Y軸、及表示第2多態性檢測用探針雜交所得的訊號強度的X軸的螢光座標系中，繪製螢光座標的步驟，上述螢光座標是使第1多態性用對照核酸與多態性檢測用探針對雜交所得；（2）將與直線的傾斜度成反比例的值設定為修正值C的步驟，上述直線通過上述Y軸和上述X軸的交點O、及上述步驟（1）中所繪製的螢光座標；（3）對多個多態性檢測用探針對進行步驟（1）及步驟（2），於各探針間比較修正值C，將修正值C最小的探針對決定為適於第一多態性檢測的探針的步驟。
如申請專利範圍第1項所述的多態性檢測用微陣列探針對的評價方法，其中上述螢光座標系中，上述Y軸與上述X軸正交。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的多態性檢測用微陣列探針對的評價方法，其中上述步驟（1）中，使上述對照核酸與上述探針進行2次以上的雜交而獲得2點以上的螢光座標，並設定各座標的代表值M，且於上述步驟（2）中，上述直線為通過上述交點O及上述代表值M的中央直線。
如申請專利範圍第3項所述的多態性檢測用微陣列探針對的評價方法，其中上述步驟（1）更包括：於通過交點O及上述2點以上的螢光座標的多條直線中，選擇與上述中央直線有傾斜度差的直線，並將其設定為誤差直線的處理；且上述步驟（2）包括：（a）根據上述中央直線與上述X軸之間的角度α（弧度）來求出修正值C=π/2÷α的處理；及（b）將上述中央直線與誤差直線所成的角度作為誤差角θ（弧度），根據上述誤差角θ（弧度）來求出修正誤差角θ'（弧度）=θ（弧度）×修正值C的處理。
如申請專利範圍第1項所述的多態性檢測用微陣列探針對的評價方法，更包括以下步驟：（4）繪製使第2多態性用對照核酸與第2多態性檢測用探針對雜交所得的螢光座標的步驟；（5）將與通過交點O及上述步驟（4）中所繪製的螢光座標的直線的傾斜度成比例的值設定為修正值C₂ 的步驟；以及（6）對多個第2多態性檢測用探針對進行上述步驟（4）及步驟（5），於各探針間比較修正值C₂ ，將修正值C₂ 最小的探針對決定為適於第2多態性檢測的探針的步驟。
如申請專利範圍第5項所述的多態性檢測用微陣列探針對的評價方法，其中上述步驟（4）中，使上述第2多態性用對照核酸與上述第2多態性檢測用探針進行2次以上的雜交而獲得2點以上的螢光座標，並設定各座標的代表值M₂ ，且於上述步驟（5）中，上述直線為通過上述交點O及上述代表值M₂ 的第2中央直線。
如申請專利範圍第6項所述的多態性檢測用微陣列探針對的評價方法，其中上述步驟（4）更包括：於通過交點O及上述2點以上的螢光座標的多條直線中，選擇與上述第2中央直線有傾斜度差的直線，並將其設定為誤差直線的處理；且上述步驟（5）包括：（c）根據上述第2中央直線與上述Y軸之間的角度β（弧度），來求出修正值C₂ =π/2÷β的處理；以及（d）將上述第2中央直線與誤差直線所成的角度作為第2誤差角θ₂ （弧度），由此求出第2修正誤差角θ₂ '（弧度）=θ₂ （弧度）×修正值C₂ 的處理。
一種基因型判別顯示程式，其利用如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的多態性檢測用微陣列探針對的評價方法。