JP6269746B2 - βグロビン遺伝子の変異を検出するためのマイクロアレイ及びその検出方法 - Google Patents
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Description
非特許文献2: Erlichら,Current Communications in Molecular Biology:Polymerase Chain Reaction,Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Press(1989)
非特許文献3: Innisら,PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.San Diego: Academic Press(1990)
非特許文献4: Sambrookら,Molecular Cloning - A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Press(1989)
非特許文献5: Am. J. Hum. Genet. 43:095-100,1988
非特許文献6: Blood, Vol81, No 1 (January 1). 1993: pp 239-242
多型の検出では、一般にマイクロアレイが用いられるが、高感度な検出を行うためには、非特異的ハイブリダイゼーションを生じにくい、高性能なプローブが求められる。プローブの性能は一般的にプローブのTm値に左右されるが(Tm値が高いと非特異的ハイブリダイゼーションが起こりやすい)、Tm値はプローブの配列によって決定される。従って、一般的には、検出対象となる多型の周辺領域の配列によりプローブの性能が制約されてしまう。
当該配列とハイブリダイズし、且つ、少なくとも以下の要件のいずれか1つを満たすことを特徴とする、プローブ。
(1)当該配列の両端または片端に、それぞれ1つ以上の非相補的な塩基が含まれること。
(2)当該配列中に含まれる複数の多型のうち、検出目的ではない多型と対応する部分がユニバーサル塩基であること。
(3)検出目的の多型が、プローブのいずれかの末端から6塩基以下の位置にあること。
一般に、グアニン(G)とシトシン(C)の含量が多い「GCリッチ」なポリヌクレオチドは、Tm値が高く、非特異的ハイブリダイゼーションを起こしやすい。
この特徴を有するプローブは、検出対象であるポリヌクレオチド配列中に、検出対象である第1の多型に加え、非検出対象である第2の多型が含まれる場合に有用である。
8-アザ-7-デアザ-2’-デオキシグアノシン、8-アザ-7-デアザ-2’-デオキシアデノシン、2’-デオキシシチジン、2’-デオキシウリジン、2’-デオキシアデノシン、2’-デオキシグアノシン、及びピロロ[2,3-d]ピリミジンヌクレオシド。
また、本発明のプローブは、検出目的の多型が、プローブのいずれかの末端(5’末端又は3’末端)から6塩基以下の位置に存在するように設計することもできる。
一般的に、一塩基多型検出用のプローブを設計する場合、検出目的の多型の位置を中心に5’末端、3’末端側両方に同程度の塩基長をもったプローブ設計する。しかしながら検出目的の多型の部位の5’末端または3’末端側が極端にGCリッチ領域である、またはATリッチ領域であると、検出目的の多型の位置でのプローブとのマッチ、またはミスマッチとは関係なく結合する、もしくは結合しない場合が起こりうる。
上記領域はGCリッチ領域またはATリッチ領域であり、この箇所における多型を検出可能なプローブを提供する。
本発明においては、配列番号3、4、7、8、11、12、17、18と配列番号25〜66に示される配列をプローブとして使用し(本発明のプローブ群)、必要に応じて、本発明のプローブ群以外の遺伝子もプローブとして使用することができる。
(1)支持体
上記プローブ群を実際に使用するためには、支持体に固定化する必要である。固定化する支持体の種類は限定されず、ハイブリダイゼーション反応時に反応液にプローブが溶出(放出)することがなく、反応後にどのプローブが反応したのか特定できるものであれば、いかなるものを用いてもよい。
ニトロセルロースメンブレン(Pierce社)、アフィニティビーズ(住友ベークライト株式会社)、MicroPlex(商標) Microspheres、xMAP Multi-Analyte LumAvidin Microspheres(Luminex社)、ダイナビーズ(株式会社ベリタス)、DNA 固定化用 96 ウェルプレートキット(フナコシ社)、DNA固定化用基板(住友ベークライト株式会社)、マイクロアレ
イ用コートスライドガラス(松波硝子工業株式会社)、ハイドロゲルスライド(パーキンエルマー社)、Sentrix(登録商標) Array Matrix(イルミナ社)等があげられる。
プローブの固定化は、フィルター、メンブレン等を用いる場合は無修飾のプローブをそのままスポットし、UVランプ等の照射により固定化することができる。また、表面が化学的に活性化されているビーズ、チップ、スライドガラス、マルチウェルプレート、メンブレンおよび光ファイバー等を用いる場合は、末端が化学的に共有結合できるものを用いることが好ましい。より具体的には、5’末端又は3’末端にアミノ基等を導入したものを用いる。さらにゲル等に固定化する場合には、共重合反応可能な不飽和官能基が導入されているものを用いる。この導入基を持つことで置換(メタ)アクリルアミド誘導体やアガロース誘導体、及び架橋剤との共重合反応により、ゲルの網目構造に固定される。核酸の鎖の末端に不飽和官能基を導入する方法に関しては、例えば、国際公開第02/062817号に記載されるような公知の方法ですることができる。
貫通孔を形成する方法に特に限定はなく、例えば、特開2001−133453号公報に記載されたような中空繊維を同軸方向に配列させた配列体を作製後、樹脂で固める方法を利用することができる。中空繊維は、種々の材料を用いることができるが、有機材料が好ましい。
中空糸内へ充填するゲル材の種類は、特に限定されず、天然物から得られるゲル材であれば、アガロース、アルギン酸ナトリウム等の多糖類の他、ゼラチン、ポリリジン等のタンパク質等が利用できる。合成高分子としては、例えば、ポリアクロイルスクシンイミド等反応性官能基を有するポリマーと、反応性を示す架橋剤を反応させて得られるゲルが利用できる。他には、アクリルアミド、N、N−ジメチルアクリルアミド、N−イソプロピルアクリルアミド、N−アクリロイルアミノエトキシエタノール、N−アクリロイルアミノプロパノール、N−メチロールアクリルアミド、N−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、(メタ)アクリル酸及びアリルデキストリン等の重合性モノマーを単量体として、多官能性単量体、例えば、メチレンビス(メタ)アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート等との共重合により得られる合成高分子ゲルが好ましい。
中空繊維の中空部に導入されたゲル前駆体溶液を重合させることにより、プローブ含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持させる。重合条件は特には限定されず、使用したゲル前駆体の種類等により適宜選択することができる。例えば、アクリルアミド系の単量体であれば、ラジカル開始剤を使用して重合することができ、好ましくは、アゾ系開始剤を利用した熱重合反応により重合させることができる。
切断方法は、薄片化することができれば限定されない。例えば、ミクロトーム、レーザー等により行うことができる。得られる薄片の厚みは限定されず、実験の目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、5mm以下、好ましくは0.1〜1mmとすることができる。
本発明において、βグロビン遺伝子の変異を検出するとは、βグロビン遺伝子配列中の変異部分を有する塩基部位、配列を特定することを意味し、また、複数の特定された対立遺伝子からどの対立遺伝子の組(二倍体の生物)であるかを判定することを意味する。
検体(核酸増幅の鋳型となる核酸)とは、本発明において検出する目的となる遺伝子配列すなわちβグロビン遺伝子配列を含む核酸をいい、βグロビン遺伝子配列の断片が含まれ、以下に述べる増幅反応が進行するものであればどのような形態の核酸でもよい。
調製及び精製しておくことが好ましい。当該調製及び精製は、公知の核酸抽出法に従って行うことができ、例えば、Maniatisらの記載(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, pp280,281, 1982)に準ずる種々の技術を用いることができ
る。
本発明はβグロビン遺伝子の変異を検出するためのプローブセットに関し、NCBI Reference Sequence: NC_000011.9(配列長135006516塩基)の相補鎖配列上にコードされているβグロビン遺伝子配列の変異を検出する。
上記核酸増幅の鋳型となる核酸(検体)を鋳型にして、核酸増幅反応により、βグロビン遺伝子の変異箇所で検出しようとする領域の核酸断片を増幅させる。核酸の増幅方法としてはPCR法、LAMP法、ICAN法、TRC法、NASBA法、PALSAR法等様々な方法を使用することができる。核酸の検出上特に問題が生じなければいずれの方法も核酸増幅反応に用いることができるが、これらの中でも簡便さの観点からPCR法が好ましい。
ヌクレオチド単体は、通常の増幅反応で用いるデオキシリボヌクレオチド三リン酸等が挙げられる。これもプライマーセットと同様、後の検出が容易になるような誘導体を用いることも可能であるが、増幅反応を阻害しないものを使用することが好ましい。
DNA伸長酵素は、通常のPCR法に用いられるものと同様に、耐熱性細菌に由来するDNAポリメラーゼであるTaqDNAポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼ等を使用することができる。
液(体液等)から核酸増幅反応ができるものであれば操作が簡便になるのでより好ましい。
上記工程(c)によりマイクロアレイ中のプローブで捕捉された核酸を検出する。
本発明において、プライマーセット及び本発明のプローブ群を有するマイクロアレイを、βグロビン遺伝子の変異を検出するためのキットとして使用することも可能である。プライマーセットとしては、配列番号21で示されるオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号22で示されるオリゴヌクレオチドプライマーのセット、又は配列番号23で示されるオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号24で示されるオリゴヌクレオチドプライマーのセットをより好適に使用することができる。
既に述べたように、マイクロアレイで多型の検出を行う場合、使用するプローブが非特異的ハイブリダイゼーションを起こさないことが好ましい。つまり、非特異的ハイブリダイゼーションを起さないプローブは、性能が高いものと評価される。
(1) 第1の多型検出用プローブがハイブリダイズして得られるシグナル強度を表すY軸と、第2の多型検出用プローブがハイブリダイズして得られるシグナル強度を表すX軸とを含む蛍光座標系において、第1の多型用コントロール核酸を、第1及び第2の多型検出用プローブからなる多型検出用プローブペアとハイブリダイズして得られた蛍光座標をプロットする工程、
(2) 前記Y軸とX軸との交点Oと、前記工程(1)でプロットされた蛍光座標とを通る直線の傾きに反比例する値を補正値Cと定める工程、
(3) 工程(1)及び(2)を複数の多型検出用プローブペアについて行い、各プローブ間で補正値Cを比較し、補正値Cが最小となるプローブペアを第1の多型検出に適したプローブとして決定する工程。
まず、工程(1)において、第1の多型用コントロール核酸が、第1及び第2の多型検出用プローブからなる多型検出用プローブペアとハイブリダイズして得られるシグナル強度を蛍光座標系にプロットする。本発明の蛍光座標系において、Y軸は第1の多型検出用プローブがハイブリダイズして得られるシグナル強度を表し、X軸は第2の多型検出用プローブがハイブリダイズして得られるシグナル強度を表す。ここでY軸とX軸の交点をOとする。また、Y軸とX軸とは直交していていもよく、直交していなくてもよい。
次に、プロットされた蛍光座標Pと交点Oとを通る直線Lを求め、この直線Lの傾きに反比例する値を補正値C(C>0)としてもよい。
通常、1つの多型を検出するためには、複数の候補のプローブが用意される。従って、複数の候補プローブについて上記工程(1)及び(2)を行い、各プローブの補正値Cを定める必要がある。
(a)前記中央直線とX軸との間の角度α(ラジアン)を求め、
補正値C=π/2÷αを求める処理(図2:パネルC)、
(b)前記中央直線と誤差直線(傾きの差が最大の直線を選択する場合は第1の誤差直線とする)とがなす角度を誤差角θ(ラジアン)と定め、
さらに、補正誤差角θ’(ラジアン)=θ(ラジアン)×補正値Cと定める処理
を含むものとする。
(4)第2の多型用コントロール核酸を、第1及び第2の多型検出用プローブからなる多型検出用プローブペアとハイブリダイズして得られた蛍光座標をプロットする工程、
(5) 交点Oと、工程(4)でプロットされた蛍光座標とを通る直線の傾きに比例する値を補正値C2と定める工程、
(6) 工程(4)及び(5)を複数の多型検出用プローブペアについて行い、各プローブ間で補正値C2を比較し、補正値C2が最小となるプローブペアを第2の多型検出に適したプローブとして決定する工程。
工程(4)において、第2の多型用コントロール核酸が、第1及び第2の多型検出用プローブからなる多型検出用プローブペアとハイブリダイズして得られるシグナル強度を蛍光座標系にプロットする。
次に、プロットされた蛍光座標P2と交点Oとを通る直線L2を求め、この直線L2の傾きに比例する値を補正値C2(C2>0)としてもよい。
上記工程(3)と同様に、複数の候補プローブペアについて上記工程(4)及び(5)を行い、各プローブの補正値C2を定める必要がある。
(a)前記第2の中央直線とY軸との間の角度β(ラジアン)を求め、
補正値C2=π/2÷βを求める処理、
(b)前記第2の中央直線と誤差直線(傾きの差が最大の直線を選択する場合は第2の誤差直線とする)とがなす角度を誤差角θ2(ラジアン)と定め、
さらに、補正誤差角θ2’(ラジアン)=θ2(ラジアン)×補正値C2と定める処理
を含むものとする。
本発明の評価方法では、各プローブ間の性能を容易に比較することができ、また誤差範囲を考慮して遺伝子型を判定することも可能である。
DNAマイクロアレイを用いてβグロビン遺伝子の25箇所の変異を一括して検出することを検討した。検出対象する変異の箇所を以下の表1に示した。
DNAマイクロアレイを以下のようにして製造した。
<1−1.プローブの調製>
プローブとなる配列番号1〜18記載のオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチドの5’末端にアミノヘキシル基が導入されたオリゴヌクレオチドとして合成した。合成後、そのオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、さらにHPLCで精製、分取することにより、表2の配列番号1〜18で示される塩基配列を有する5’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを取得した。配列の特徴として、配列番号1,2は変異c.52A>Tに近接した変異c.59A>Tの変異の影響をうけるプローブであるが、配列番号3,4は変異c.52A>Tに近接した変異c.59A>Tの変異にハイブリダイズするユニバーサル塩基としてイノシンを導入している。
本実施例では、表1に記載のプローブ(配列番号1〜18)及びプローブを搭載しない箇所については核酸プローブの代わりに水を使用した核酸マイクロアレイ(ジェノパール:登録商標)、三菱レイヨン株式会社)を用いた。
<2−1.プラスミドテンプレートDNAの作製>
NCBI Reference Sequence: NC_000011.9(配列長135006516塩基)の5246730塩基目から5248465塩基目の相補鎖配列上にβグロビン遺伝子配列がコードされている。その配列を配列番号19に示した。また、配列番号20で示すNM_000518.4| Homo sapiens hemoglobin, beta (HBB), mRNAの配列と比較することで、ゲノムDNA配列中のエキソン領域を特定した。(タンパク質コード領域51塩基目〜494塩基目、exon1:1塩基目〜142塩基目、エキソン2:143塩基目〜365塩基目、エキソン3:366塩基目〜626塩基目)
配列番号19中、斜体で示した配列箇所は配列番号21〜24のプライマー配列の位置、下線で示した配列はエキソン領域、四角で囲んだ領域はUTR領域である。
配列番号21 Amplicon1F ACTCCTAAGCCAGTGCCAGA
配列番号22 Amplicon1R cy5-CACTCAGTGTGGCAAAGGTG
配列番号23 MRC-Amplicon2F GTATCATGCCTCTTTGCACCATTC
配列番号24 MRC-Amplicon2R cy5-CAGATGCTCAAGGCCCTTCATA
<配列番号19>
>gi|224589802:c5248465-5246730 Homo sapiens chromosome 11, GRCh37.p5 Primary Assembly
AACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACGCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGATAAGTAACAGGGTACAGTTTAGAATGGGAAACAGACGAATGATTGCATCAGTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTCTTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTTTTCTTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTTCTTCTCCGCAATTTTTACTATTATACTTAATGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGGAAATATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAAAAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATTACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATTTGCATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTTTTATTTTTAATTGATACATAATCATTATACATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAATATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATCTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGG
<配列番号20>
>gi|28302128|ref|NM_000518.4| Homo sapiens hemoglobin, beta (HBB), mRNA
ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC
<PCR反応>
野生型のプラスミドDNAと表1記載の番号10、13、21、23(変異c.52A>T 、c.84_85insC 、c.364G>C、c.380T>Gを含む)の変異型プラスミドDNA4種類、計5種類を鋳型とし、
配列番号21〜24の2組のプライマー対を用いてPCR反応を行った。PCR反応にはKOD FX Neoキット(東洋紡社)を用いた。
プラスミドDNA溶液(10ng/μL) 1μL(野生型、又は変異型)
Amplicon1Fフ゜ライマー(20μM) 1μL
Amplicon1Rフ゜ライマー(20μM) 1μL
MRC-Amplicon2Fフ゜ライマー(20μM) 0.5μL
MRC-Amplicon2Rフ゜ライマー(20μM) 0.5μL
2×buffer 50μl
2mM dNTPs 20μl
ミリQ水 24μl
KOD FX Neo 2μl
反応容量 100μl
PCR反応にはGeneAmp9700サーマルサイクラーを用い、Maxモードで反応した。温度条件を以下に示した。
95℃ 10分間
(94℃30秒、68℃30秒、72℃30秒)×35サイクル
4℃ 反応終了
反応後の反応液100μlに以下のバッファー、溶液を加え200μlとした。
反応液 100μl
1M Tris/HCl(pH7.5)バッファー 48μl
5M NaCl溶液 9.6μl
0.5% Tween20水溶液 20μl
ミリQ水 22.4μl
合計 200μl
その後、この溶液200μlを専用チャンバーに入れ(http://www.mrc.co.jp/genome/about/usage.htmlに記載)、引き続いてDNAマイクロアレイを入れてふたを閉め、55℃で2時間インキュベートした。
インキュベート後、チップをそれぞれ0.24M TNT buffer 10mlに55℃、20分間浸漬した。その後、引き続いて、0.24M TN buffer 10mlに55℃、10分間浸漬して洗浄を実施した。洗浄後、検出を実施した。
c.52A>Tの変異を検出するプローブとして、配列番号1,2のペアと配列番号3,4のペアでは、配列番号3、4のペア、
c.84_85insCの変異を検出するプローブとして、配列番号5,6のペアと配列番号7,8のペアでは、配列番号7、8のペア、
c.364G>Cの変異を検出するプローブとして、配列番号9,10のペアと配列番号11,12のペアでは、配列番号11、12のペア、
c.380T>Gの変異を検出するプローブとして、配列番号13,14のペア、配列番号15,16のペア、配列番号17,18のペアでは、配列番号17、18のペア、
をプローブ候補の中から選択することができた。
c.52A>Tの変異を検出するプローブとして、配列番号1,2のペアと配列番号3,4のペアでは、配列番号3、4のペア、
c.84_85insCの変異を検出するプローブとして、配列番号5,6のペアと配列番号7,8のペアでは、配列番号7、8のペア、
c.364G>Cの変異を検出するプローブとして、配列番号9,10のペアと配列番号11,12のペアでは、配列番号11、12のペア、
c.380T>Gの変異を検出するプローブとして、配列番号13,14のペア、配列番号15,16のペア、配列番号17,18のペアでは、配列番号17、18のペア、
をプローブ候補の中から選択することができた。
DNAマイクロアレイを用いてβグロビン遺伝子の25箇所の変異を一括して検出ため、配列番号3、4、7、8、11、12、17、18と配列番号25〜66に示されるプローブを搭載したアレイを作製した。
表1記載の番号1〜25の変異型プラスミドDNAを鋳型とし、配列番号21〜24の2組のプライマー対を用いてPCR反応を行った。PCR反応にはアンプダイレクトプラスキット(島津製作所)を用いた。
プラスミドDNA溶液(10ng/μL) 1μL(野生型又は変異型)
Amplicon1Fプライマー(20μM) 1μL
Amplicon1Rプライマー(20μM) 1μL
MRC-Amplicon2Fプライマー(20μM) 0.5μL
MRC-Amplicon2Rプライマー(20μM) 0.5μL
2×アンプダイレクトバッファー 50μl
BioTaq(アンプダイレクトプラスキット付属) 1μl
ミリQ水 45μl
合計 100μl
PCR反応にはGeneAmp9700サーマルサイクラーを用い、Maxモードで反応した。温度条件を以下に示した。
95℃ 10分間
(94℃30秒、68℃30秒、72℃30秒)×35サイクル
4℃ 反応終了
反応後の反応液100μlに以下のバッファー、溶液を加え200μlとした。
反応液 100μl
1M Tris/HCl(pH7.5)バッファー 48μl
5M NaCl溶液 9.6μl
0.5% Tween20水溶液 20μl
ミリQ水 22.4μl
合計 200μl
その後、この溶液200μlを専用チャンバーに入れ(http://www.mrc.co.jp/genome/about/usage.htmlに記載)、引き続いてDNAマイクロアレイを入れてふたを閉め、55℃で2時間インキュベートした。
インキュベート後、チップをそれぞれ0.24M TNT buffer 10mlに55℃、20分間浸漬した。その後、引き続いて、0.24M TN buffer 10mlに55℃、10分間浸漬して洗浄を実施した。洗浄後、検出を実施した。
結果を表6にしめした。
誤差範囲の上端または下端を遺伝子型の判定の範囲として補正前後でのデータについて図9(図9プラスミド由来の25種類のサンプルから得られたデータの補正前、補正後)に示した。
配列番号21〜24:プライマー
配列番号25〜66:プローブ
Claims (8)
- 以下の工程:
(1) 第1の多型検出用プローブがハイブリダイズして得られるシグナル強度を表すY軸と、第2の多型検出用プローブがハイブリダイズして得られるシグナル強度を表すX軸とを含む蛍光座標系において、第1の多型用コントロール核酸を多型検出用プローブペアとハイブリダイズして得られた蛍光座標をプロットする工程、
(2) 前記Y軸とX軸との交点Oと、前記工程(1)でプロットされた蛍光座標とを通る直線の傾きに反比例する値を補正値Cと定める工程、
(3) 工程(1)及び(2)を複数の多型検出用プローブペアについて行い、各プローブ間で補正値Cを比較し、補正値Cが最小となるプローブペアを第一の多型検出に適したプローブとして決定する工程
を含む、多型検出用マイクロアレイプローブペアの評価方法であって、前記第1の多型と前記第2の多型は同一の多型における異なる対立遺伝子である、前記方法。
- 前記蛍光座標系は前記Y軸とX軸とが直交しているものである、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)は、前記コントロール核酸と、前記プローブとのハイブリダイズを2回以上行って2点以上の蛍光座標を獲得し、各座標の代表値Mを定めるものであり、かつ、
前記工程(2)において、前記直線は前記交点Oと前記代表値Mとを通る中央直線である、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記工程(1)はさらに、交点Oと前記2点以上の蛍光座標とを通る複数の直線のうち、前記中央直線との傾きの差がある直線を選択し、これを誤差直線と定める処理を含み、
前記工程(2)は、
(a)前記中央直線とX軸との間の角度α(ラジアン)から、
補正値C=π/2÷αを求める処理、
(b)前記中央直線と誤差直線とがなす角度を誤差角θ(ラジアン)から、
補正誤差角θ’(ラジアン)=θ(ラジアン)×補正値C
を求める処理、
を含むものである、
請求項2又は3に記載の方法。 - 以下の工程:
(4) 第2の多型用コントロール核酸を第2の多型検出用プローブペアとハイブリダイズして得られた蛍光座標をプロットする工程、
(5) 交点Oと、前記工程(4)でプロットされた蛍光座標とを通る直線の傾きに比例する値を補正値C2と定める工程、
(6) 工程(4)及び(5)を複数の第2の多型検出用プローブペアについて行い、各プローブ間で補正値C2を比較し、補正値C2が最小となるプローブペアを第2の多型検出に適したプローブとして決定する工程
をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記工程(4)は、前記第2の多型用コントロール核酸と、前記第2の多型検出用プローブとのハイブリダイズを2回以上行って2点以上の蛍光座標を獲得し、各座標の代表値M2を定めるものであり、かつ、
前記工程(5)において、前記直線が前記交点Oと前記代表値M2とを通る第2の中央直線である、請求項5に記載の方法。 - 前記工程(4)はさらに、交点Oと前記2点以上の蛍光座標とを通る複数の直線のうち、前記第2の中央直線との傾きの差がある直線を選択し、これを誤差直線と定める処理を含み、
前記工程(5)は、
(c)前記第2の中央直線とY軸との間の角度β(ラジアン)から、
補正値C2=π/2÷βを求める処理、及び
(d)前記第2の中央直線と誤差直線とがなす角度を第2の誤差角θ2(ラジアン)から、
第2の補正誤差角θ2’(ラジアン)=θ2(ラジアン)×補正値C2
を求める処理、
を含むものである、
請求項6に記載の方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法を利用した遺伝子型判別表示プログラム。
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