WO2023283838A1 - 用于镰刀型细胞贫血症检测的组合物、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种探针组,包括第1组探针,所述第1组探针进一步包括第一探针、第二探针和第三探针,所述第一探针核酸序列包括:5'-CAGACTTCTCCTCAGGAG-3'(SEQ ID NO:1),或者与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第二探针核酸序列包括:5'-CAGACTTCTCCACAGGA-3'(SEQ ID NO:2),或者与SEQ ID NO:2所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第三探针核酸序列包括:5'-CAGACTTCTCCTTAGGAG-3'(SEQ ID NO:3),或者与SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列。
Description
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及一种用于镰刀型细胞贫血症检测的组合物、试剂盒及应用,更具体地,涉及探针组、组合物、试剂盒、包含探针组或组合物的试剂在制备试剂盒中的用途、镰刀型细胞贫血症的检测方法以及镰刀型细胞贫血症相关基因突变型的检测方法。
镰刀型细胞贫血症又称镰状细胞贫血(SCD),是一种常染色体隐性遗传性血红蛋白病,临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象引起慢性局部缺血从而导致器官组织损害。SCD的分子学定义,包括一组疾病,其特征是存在至少一个血红蛋白S(HbS)等位基因,和第二个HBB基因的致病变异体,导致异常的血红蛋白聚合。常见的镰刀型细胞贫血症相关的HBB基因突变有以下几种,如表1所示:
表1:
根据文献报道,全球每年出生患儿约30万,携带者约500万,主要集中在非洲、印度、及非裔美国人群。在非洲许多地区,HbS、HbC、HbD和HbO镰状细胞性状的患病率高达25%-35%,估计有1500万非洲人受到SCD的影响,SCD占西非五岁以下儿童死亡的16%。镰状细胞病是美国最常见的遗传性血液疾病,大约每300-500名在美国出生的非裔美国人中就有一人患有SCD;每1000至1400名西班牙裔美国人中就有1人患有SCD。
对SCD的突变型别进行筛查和检测,是对疾病进行出生缺陷防控及尽早有效治疗的最佳手段。SCD的主要致病突变包括HbS突变型(A20T)、HbC突变型(G19A)、HbD突变型(G364C)、HbO突变型(G364A),对该4个突变位点进行检测可以达到有效的筛查和分子检测目的。
目前,对SCD的检测和筛查,主要基于等电点聚焦电泳(IEF)、高效液相色谱(HPLC)、免疫层析测定等技术,针对蛋白特性进行检测和分析,这些检测方法具有特异性差、设备昂贵、操作复杂、无法实现精准的分子分型、容易受检测人员主观判断影响准确性等缺点,因此不适合于临床应用和推广。
对单基因遗传病进行核酸分子检测的技术主要包括Sanger测序、高通量测序、芯片杂交等技术,这些检测方法具有通量低、费用高、操作步骤繁琐、周期长等缺点,不适合在不发达地区进行临床应用和推广。
因此,对SCD的致病突变的筛查和检测方法仍需要进一地开发和改进。
发明内容
本申请是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的:
基于Taqman探针的RT-qPCR是一种成熟且操作简便的荧光探针技术,基于该技术可以实现核酸基因突变的检测,但目前未见成熟的产品或服务应用于SCD检测。因此,如果能基于Taqman探针的RT-qPCR研发出一种快速准确地对SCD的致病突变进行筛查和检测的方法和产品,将对疾病进行出生缺陷防控及尽早有效治疗具有重要意义。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种用于检测镰刀型细胞贫血症的探针组。根据本发明的实施例,所述探针组包括第1组探针和第2组探针,所述第1组探针进一步包括第一探针、第二探针和第三探针,所述第2组探针进一步包括第四探针、第五探针和第六探针。
根据本发明的实施例,上述探针组还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述第一探针核酸序列包括:5’-CAGACTTCTCCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO:1),或者与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第二探针核酸序列包括:5’-CAGACTTCTCCACAGGA-3’(SEQ ID NO:2),或者与SEQ ID NO:2所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第三探针核酸序列包括:5’-CAGACTTCTCCTTAGGAG-3’(SEQ ID NO:3),或者与SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列。根据本发明的实施例,所述探针组针中的第一、二、三探针核酸序列对HBB因组序列第20位点、第19位点进行检测(本文中的HBB基因组的序列位置均参考NG_059281.1序列)。该探针组可特异性针对HbA野生型及HbS(A20T)、HbC(G19A)突变型序列进行检测,其中,第一探针针对HbA野生型;第二探针针对HbS突变型,该突变 型在基因组20位点的碱基由A变为T(A20T);第三探针针对HbC突变型,第三条探针序列可以特异性识别19位点的碱基由G突变为A后的基因组序列(G19A)。
根据本发明的实施例,所述第四探针核酸序列包括:5’-CTGGTGAATTCTTTGC-3’(SEQ ID NO:4),或者与SEQ ID NO:4所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第五探针核酸序列包括:5’-CTGGTGAATTGTTTGC-3’(SEQ ID NO:5),或者与SEQ ID NO:5所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第六探针核酸序列包括:5’-CTGGTGAATTTTTTGC-3’(SEQ ID NO:6),或者与SEQ ID NO:6所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列。根据本发明的实施例,所述探针组中的第四、五、六探针核酸序列针对HBB基因组序列第364位点进行检测。该对探针组特异性针对HbA野生型及所HbD(G364C)和HbO(G364A)突变型进行检测,其中,第四探针针对HbA野生型;第五探针针对HbD突变型,第五探针可以特异性识别364位点的碱基由G突变为C后的基因组序列(G364C);第六探针针对HbO突变型,第六探针序列可以特异性识别364位点的碱基由G突变为A后的基因组序列(G364A)。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例,所述组合物包含第一方面所述的探针组。根据本发明实施例的组合物,可用于HBB基因组序列第20位点、第19位点或HBB基因组序列第364位点进行检测。
根据本发明的实施例,上述组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,上述组合物进一步包括:第一对引物及第二对引物,其核酸序列如下所示:第一对引物上游序列:5’-GTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGT-3’(SEQ ID NO:7);第一对引物下游序列:5’-GGCAGAGCCATCTATTGCTTA-3’(SEQ ID NO:8);第二对引物上游序列:5’-AAAGGAACCTTTAATAGAAATTGGACA-3’(SEQ ID NO:9);第二对引物下游序列:5’-TGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTT-3’(SEQ ID NO:10)。根据本发明的实施例,利用第一对引物可以对HBB基因组19位点、20位点及其上下游核酸序列进行特异性扩增,利用第二对引物可以对HBB基因组364位点及其上下游核酸序列进行特异性扩增。利用第一对引物配合第一组探针可以特异性检测待检测样本品中是否含有HbA野生型、HbS突变型和HbC突变型序列,利用第二对引物配合第二组探针可以特异性检测待检测样品中是否含有HbA野生型、HbD突变型和HbO突变型基因序列。利用上述探针和引物,可以使用RT-qPCR技术简单、高效、准确地对SCD进行基因突变位点和突变类型检测。
根据本发明的实施例,所述组合物进一步包括第三对引物及第七探针,其核酸序列如下 所示:第三对引物上游序列:5’-TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA-3’(SEQ ID NO:11);第三对引物下游序列:5’-GCCGACCAACACCTAATAATG’(SEQ ID NO:12);第七探针:5’-AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG’(SEQ ID NO:13)。根据本发明的实施例,第三对引物为用于SCD检测的内参基因引物,第七探针为内参基因探针。
在本发明的第三方面,本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒可用于SCD相关的HBB基因突变位点检测,所述试剂包括在本发明第一方面所提出的探针组或第二方面提出的组合物。根据本发明实施例的试剂可以制备出高效准确检测SCD相关突变基因的试剂盒,并且所制备的试剂盒可以高效准确地利用RT-qPCR的方法检测待测样品中是否含有SCD相关的突变基因位点。
在本发明的第四方面,本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒可用于SCD检测,所述试剂包括本发明第一方面所提出的探针组或第二方面提出的组合物。根据本发明实施例的试剂可以制备出高效准确检测SCD的试剂盒,所制备的试剂盒可以高效准确地利用RT-qPCR的方法对待测样品中的HbA野生型、HbS突变型、HbC突变型、HbD突变型和HbO突变型进行有效区分,并准确判断患者所患SCD为纯合突变还是杂合突变。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种SCD相关突变的检测方法。根据本发明的实施例,所述方法包括利用在本发明第一方面所提出的探针组或第二方面提出的组合物对待测样品进行RT-qPCR检测,所述探针组中的探针进一步携带荧光基团;基于RT-qPCR荧光信号,可以确定所述待测样品中是否含有SCD相关突变。根据本发明实施例的方法,可用于诊断SCD,或用于非诊断目的,如用于科学研究,确认待测样品中是否含有SCD相关突变,如果含有SCD相关突变,可利用待测样品进一步研究SCD相关突变的信号转导机制。
根据本发明的具体实施例,检测到荧光信号,是待测样品中含有SCD相关突变的指示。所述探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团,由于荧光基团与淬灭基团距离较近,无法检测到荧光基团所发出荧光,待测基因组核酸的20位点为T时,第二探针序列可以与待测基因组核酸进行互补配对,当所述第一对引物以待测基因组核酸为模板进行合成扩增时,扩增至所述第二探针序列位置,使第二探针序列被水解,释放出荧光基团和淬灭基团,此时荧光基团与淬灭基团距离很远,荧光基团的信号被捕捉到,检测到特异性荧光信号,说明待检测样本中存在SCD相关突变中的HbS突变(A20T);待测基因组核酸的19位点为A时,第三探针序列可以与待测基因组核酸进行互补配对,当所述第一对引物以待测基因组核酸为模板进行合成扩增时,扩增至所述第三探针序列位置,使第三探针的序列被水解,释放出荧光基团和淬灭基团,此时荧光基团与淬灭基团距离很远,荧光基团的信号被捕捉到,检测到特异性荧光信号,说明待检测样本中存在SCD相关突变中的HbC突变(G19A);待测基因组核酸的364位点为C时,第五探针的序列可以与待测基因组核酸进行互补配对, 当所述第二对引物以待测基因组核酸为模板进行合成扩增时,扩增至所述第五探针的序列位置,使第五探针的序列被水解,释放出荧光基团和淬灭基团,此时荧光基团与淬灭基团距离很远,荧光基团的信号被捕捉到,检测到特异性荧光信号,说明待检测样本中存在SCD相关突变中的HbD突变(G364C);待测基因组核酸的364位点为A时,第六探针可以与待测基因组核酸进行互补配对,当所述第二对引物以待测基因组核酸为模板进行合成扩增时,扩增至所述第六探针的序列位置,使第六探针的序列被水解,释放出荧光基团和淬灭基团,此时荧光基团与淬灭基团距离很远,荧光基团的信号被捕捉到,检测到特异性荧光信号,说明待检测样本中存在SCD相关突变中的HbD突变(G364A)。
根据本发明的实施例,所述荧光基团的种类不受特别限制,只要是可以用于RT-qPCR的荧光基团都可以使用。例如,所述荧光基团可包括选自下列至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种SCD相关基因突变型检测的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:利用本发明第一方面所提出的探针组或第二方面提出的组合物对待测样品进行RT-qPCR的检测,所述探针组或组合物中的探针进一步携带荧光基团,其中,所述第一探针序列携带第一荧光基团,所述第二探针序列携带第二荧光基团,所述第三探针序列携带第三荧光基团,所述第四探针序列携带第四荧光基团,所述第五探针序列携带第五荧光基团,所述第六探针序列携带第六荧光基团;各自独立地检测第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团、第四荧光基团、第五荧光基团及第六荧光基团通道的Ct值;根据所述Ct值,获得确定所述SCD相关基因的突变型。所述探针组特异性针对HbA野生型及HbS(A20T)、HbC(G19A)、HbD(G364C)和HbO(G364A)突变型进行检测,其中,第一探针针对HbA野生型;第二探针针对HbS突变型,该突变型在基因组20位点的碱基由A突变为T(A20T);第三探针针对HbC突变型,第三探针可以特异性识别19位点的碱基由G突变为A后的基因组(G19A);第四探针针对HbA野生型;第五探针针对HbD突变型,第五探针可以特异性识别364位点的碱基由G突变为C后的基因组(G364C);第六探针针对HbO突变型,使用第六探针可以特异性识别364位点的碱基由G突变为A后的基因组(G364A)。
根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述第一荧光基团、所述第二荧光基团、所述第三荧光基团、所述第四荧光基团、所述第五荧光基团和所述第六荧光基团各自独立地选自下列至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE;其中,同一反应体系中所述第一荧光基团、所述第二荧光基团、所述第三荧光基团的荧光基团不同;同一反应体系中所述第四荧光基团、所述第五荧光基团以及第六荧光基团的荧光基团不同。根据本发 明的实施例,所述荧光基团类型不受特别限制,可以用于RT-qPCR的荧光基团都可以使用。所使用的淬灭基团为MGB,可以用于RT-qPCR的淬灭基团都可以使用。
根据本发明的实施例,反应体系1中所述第一荧光基团、所述第二荧光基团、所述第三荧光基团的荧光基团不同,可以实现在单个反应孔中同时完成HbA野生型、HbS突变型、HbC突变型及内参基因ACTB检测;反应体系2中所述第四荧光基团、所述第五荧光基团以及第六荧光基团的荧光基团不同,可以实现在单个孔内同时完成HbA野生型、HbD突变型、HbO突变型及内参基因ACTB的检测。
根据本发明的实施例,所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,所述第二荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,所述第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样品中含有HbA野生型,不含HbS突变型、不含HbC突变型的指示。
根据本发明的实施例,所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,所述第五荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,所述第六荧光基团通道大于37或NoCT时是待测样品中含有HbA野生型,不含HbO突变型,不含HbD突变型的指示。
根据本发明的实施例,所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中含HbS杂合突变型,不含HbC突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中含HbS纯合突变型,不含HbC突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,第二荧光基团通道大于37或NoCT,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中不含HbS突变型,含HbC杂合突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道大于37或NoCT,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中不含HbS突变型,含HbC纯合突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbS杂合突变型,含HbC杂合突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,第五荧光基团通道大于37或NoCT,且第六荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbO杂合突变型,不含HbD突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团 通道大于37或NoCT,且第六荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbO纯合突变型,不含HbD突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,第五荧光基团通道不大于37,且第六荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中不含HbO突变型,含HbD杂合突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道不大于37,且第六荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中不含HbO突变型,含HbD纯合突变型指示。
根据本发明的实施例,所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道不大于37,且第六荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbO杂合突变型,含HbD杂合突变型指示。
根据本发明的实施例,利用本方法对待测样品进行检测,基于RT-qPCR的Ct值信息,可以高效准确地进行SCD突变检测,并准确判断出SCD突变为纯合突变还是杂合突变。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种SCD的诊断方法。根据本发明的实施例,利用本发明第五方面所述的方法对待测样品进行检测,所述待测样品来源于待检对象;基于检测结果,确定所述待测样品中是否含有镰刀型细胞贫血症相关突变。根据本发明实施例的方法可准确的对待测样品进行是否患有SCD的诊断。
根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述待测样品中含有镰刀型细胞贫血症相关突变是待检对象患有镰刀型细胞贫血症或镰刀型细胞贫血症高风险的指示。
在本发明的第八方面,本发明提出了一种SCD相关基因突变型检测的方法。根据本发明的实施例,利用本发明第六方面所述的方法对待测样品进行检测,所述待测样品来源于待检对象;基于检测结果,确定所述待测样品中含有的镰刀型细胞贫血症相关基因的突变型。根据本发明实施例的方法可准确的对待测样品进行诊断,以判断待测样品中所含有的SCD相关基因突变型。
根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述待测样品中含有的镰刀型细胞贫血症相关基因的突变型是待检对象患有疾病的指示。
在本发明的第九方面,本发明提出了一种试剂盒,所述试剂盒用于SCD突变检测。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括本发明第一或第二方面提出的探针组或第三方面提出的组合物。根据本发明实施例制备的试剂盒可以检测待测样品是否含有SCD相关突变,高效准确的检测基因突变位点,判断SCD突变是纯合突变还是杂合突变。
根据本发明的具体实施例,所述试剂盒还可以进一步包括RT-qPCR所需的酶、缓冲液、dNTPs等试剂。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是根据本发明实施例体系1-Group 1检测已知HbS(HBB:A20T;Het)突变阳性样本的RT-qPCR扩增曲线图,其中,Het表示杂合突变,Hom表示纯合突变;
图2是根据本发明实施例体系1-Group 1检测已知HbC(HBB:G19A;Het)突变阳性样本的RT-qPCR扩增曲线图,其中,Het表示杂合突变,Hom表示纯合突变;
图3是根据本发明实施例体系1-Group Final检测已知HbS(HBB:A20T;Het)突变阳性样本的RT-qPCR扩增曲线图,其中,Het表示杂合突变,Hom表示纯合突变;
图4是根据本发明实施例体系2-Group 1检测已知HbD(HBB:G364C;Het)突变阳性样本的RT-qPCR扩增曲线图,其中,Het表示杂合突变,Hom表示纯合突变;
图5是根据本发明实施例体系2-Group 1检测已知HbO(HBB:G364A;Het)突变阳性样本的RT-qPCR扩增曲线图,其中,Het表示杂合突变,Hom表示纯合突变;
图6是根据本发明实施例体系2-Group Final检测已知HbD(HBB:G364C;Het)突变阳性样本的RT-qPCR扩增曲线图,其中,Het表示杂合突变,Hom表示纯合突变;
图7是根据本发明实施例体系1-Group Final引物探针组合和体系2-Group Final引物探针组合、试剂盒内其他组成成分、优化后的反应体系及优化后的反应程序检测已知SCD阴性样本的RT-qPCR扩增曲线图;
图8是根据本发明实施例体系1-Group Final引物探针组合和体系2-Group Final引物探针组合、试剂盒内其他组成成分、优化后的反应体系及优化后的反应程序检测已知HbS杂合突变且HbC杂合突变样本的RT-qPCR扩增曲线图;
图9是根据本发明实施例体系1-Group Final引物探针组合和体系2-Group Final引物探针组合、试剂盒内其他组成成分、优化后的反应体系及优化后的反应程序检测已知HbS纯合突变样本的RT-qPCR扩增曲线图;
图10是根据本发明实施例体系1-Group Final引物探针组合和体系2-Group Final引物探针组合、试剂盒内其他组成成分、优化后的反应体系及优化后的反应程序检测已知HbD杂合突变样本的RT-qPCR扩增曲线图;以及
图11是根据本发明实施例体系1-Group Final引物探针组合和体系2-Group Final引物探针组合、试剂盒内其他组成成分、优化后的反应体系及优化后的反应程序检测已知HbO杂合突变样本的RT-qPCR扩增曲线图。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
需要注意的是,在本文中,术语“镰刀型细胞贫血症”、“镰状细胞贫血”、“SCD”均指,临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象引起慢性局部缺血从而导致器官组织损害的一种常染色体隐性遗传血红蛋白病。
需要注意的是,在本文中,术语“HbS突变型(A20T)、HbC突变型(G19A)、HbD突变型(G364C)、HbO突变型(G364A)”分别指Genebank登录号为:NG_059281.1的HBB基因组序列的第20位碱基由A突变为T,导致血红蛋白S突变;Genebank登录号为:NG_059281.1的HBB基因组序列的第19位碱基由G突变为A,导致血红蛋白C突变;Genebank登录号为:NG_059281.1的HBB基因组序列的第364位碱基由G突变为C,导致血红蛋白D突变;Genebank登录号为:NG_059281.1的HBB基因组序列的第364位碱基由G突变为A,导致血红蛋白O突变。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种探针组,所述探针组用于SCD类型的检测。根据本发明的实施例,包括第一组探针,其核酸序列如下所示:第一探针序列:5’-CAGACTTCTCCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO:1);第二探针序列:5’-CAGACTTCTCCACAGGA-3’(SEQ ID NO:2);第三探针序列:5’-CAGACTTCTCCTTAGGAG-3’(SEQ ID NO:3)。发明人根据编码血红蛋白的HBB基因发生的突变A20T、G19A设计并筛选出上述探针,上述探针可以特异性识别并结合突变位点。
在一些实施方案中,探针的5’末端和3’末端分别具有荧光基团和淬灭基团修饰。HbA野生型探针:5’-CAGACTTCTCCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO:1)探针的5’端用FAM修饰,3’端用MGB修饰;HbS突变型探针:5’-CAGACTTCTCCACAGGA-3’(SEQ ID NO:2)探针的5’端用ROX修饰,3’端用MGB修饰;HbC突变型探针: 5’-CAGACTTCTCCTTAGGAG-3’(SEQ ID NO:3)探针的5’端用HEX修饰,3’端用MGB修饰。
在一些实施方案中,所述探针组为包括第二组探针或进一步包括第二组探针,所述第二组探针的核酸序列如下所示:第四探针序列:5’-CTGGTGAATTCTTTGC-3’(SEQ ID NO:4);第五探针序列:5’-CTGGTGAATTGTTTGC-3’(SEQ ID NO:5);第六探针序列:5’-CTGGTGAATTTTTTGC-3’(SEQ ID NO:6)。发明人根据编码血红蛋白的HBB基因发生的突变G364C、G364A设计并筛选出上述探针,上述探针可以特异性识别并结合突变位点。
在一些实施方案中,探针的5’末端和3’末端分别具有荧光基团和淬灭基团修饰。HbA野生型探针:5’-CTGGTGAATTCTTTGC-3’(SEQ ID NO:4)探针的5’端用FAM修饰,3’端用MGB修饰;HbD突变型探针:5’-CTGGTGAATTGTTTGC-3’(SEQ ID NO:5)探针的5’端用HEX修饰,3’端用MGB修饰;HbO突变型探针:5’-CTGGTGAATTTTTTGC-3’(SEQ ID NO:6)探针的5’端用ROX修饰,3’端用MGB修饰。
在一些实施方案中,所述探针组进一步包括第一对引物及第二对引物,其核酸序列如下所示:第一对引物上游序列:5’-GTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGT-3’(SEQ ID NO:7);第一对引物下游序列:5’-GGCAGAGCCATCTATTGCTTA-3’(SEQ ID NO:8);第二对引物上游序列:5’-AAAGGAACCTTTAATAGAAATTGGACA-3’(SEQ ID NO:9);第二对引物下游序列:5’-TGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTT-3’(SEQ ID NO:10)。其中第一对引物为C.19/C.20(即基因组g.5248232/g.52482323位点)引物,第二对引物为C.364(即基因组g.5246908位点)引物。
在一些实施方案中,所述探针组进一步包括第三对引物及第七探针,其核酸序列如下所示:第三对引物上游序列:5’-TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA-3’(SEQ ID NO:11);第三对引物下游序列:5’-GCCGACCAACACCTAATAATG-3’(SEQ ID NO:12);第七探针序列:5’-AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG-3’(SEQ ID NO:13)。其中,第三对引物为内参基因引物,第七探针为内参基因探针,探针两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。在一些实施方案中,第七探针5’端用CY5修饰,3’端用MGB修饰。
在一些实施方案中,使用上述探针组可以分辨SCD(确认基因组参考序列号)的20位点是否为HbS突变型,19位点是否为HbC突变型,364位点是否为HbD突变型和/或HbO突变型。通过检测位点的型别,可以区分SCD突变类型,确定患者所患SCD的严重程度,及时进行有效治疗,同时可及对SCD疾病进行出生缺陷防控。
使用本发明最终筛选出的探针组,相应型别的MGB探针检测特异性靶标位点的Ct值小,检测灵敏度高,检测特异性模板的Ct值与检测非特异性模板的Ct值差值大,特异性好。而使用本发明探针组的对比例(参照本发明实施例1和实施例2中反应体系1和体系2中 Group 1中的探针组),其探针检测特异性模板的Ct值与非特异性模板的Ct值差值也比本发明探针组小,其特异性相对较差,可能会导致错误的检测结果。
在一些实施方案中,本发明的组合物可用于RT-qPCR检测。
在一些实施方案中,所述探针组中,HbA野生型、HbS突变型、HbC突变型及内参基因ACTB的探针用不同的荧光报告基团标记,荧光报告基团的检测通道不同,故根据不同的荧光通道可以同时进行HbA野生型、HbS突变型、HbC突变型及内参基因ACTB的检测;HbA野生型、HbD突变型、HbO突变型及内参基因ACTB的探针用不同的荧光报告基团标记,荧光报告基团的检测通道不同,故根据不同的荧光通道可以同时进行HbA野生型、HbD突变型、HbO突变型及内参基因ACTB的检测。
在一些实施方案中,所述组合物还包括:用于检测的内参基因上游引物、内参基因下游引物和内参基因探针,如根据本发明实施例的第三对引物。
在一些实施方案中,荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE,但不限于此。
在一个具体的实施方案中,如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的探针的5’端的荧光报告基团分别为FAM、ROX和HEX;探针的3’末端标记的淬灭基团为MGB;还有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的探针的5’端的荧光报告基团分别为FAM、HEX和ROX;探针的3’末端标记的淬灭基团为MGB。
在一些实施方案中,实施方案中还包括了如SEQ ID NO:13所示的内参基因探针,其5’端的荧光报告基团为CY5;探针的3’末端标记的淬灭基团为MGB。
在一些实施方案中,所述组合物中引物的用量为1.6μM;所述组合物中探针的用量为1μM。
在一个具体的实施方案中,本发明组合的两组探针组合物分别存在于单独反应管中。
在一些实施方案中,本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
再一方面,本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于SCD突变类型的区分,所述试剂包括本发明所提出的探针组。
再一方面,本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于SCD的检测。所述试剂包括本发明所提出的探针组。
再一方面,本发明提出了一种SCD的检测方法。根据本发明的实施例,利用本发明第一方面所提出的探针组对待测样品进行RT-qPCR检测,本发明第一方面所提出的探针组中的探针进一步携带荧光基团;检测到所述第一组探针和第二组探针任一序列所携带的荧光基团信号,是待测样品中含有SCD核酸的指示。
在一些实施方案中,所述荧光基团选自下列至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、 HEX、5-TAMRA、TET和JOE。
再一方面,本发明提出了一种SCD的检测方法。根据本发明的实施例,利用本发明第一方面所提出的探针组对待测样品进行RT-qPCR检测,本发明第一方面所提出的探针组中的探针进一步携带荧光基团,其中,所述第一探针序列携带有第一荧光基团,所述第二探针序列携带第二荧光基团,所述第三探针序列携带有第三荧光基团,所述第四探针序列携带有第四荧光基团,所述第五探针序列携带有第五荧光基团,所述第六探针序列携带有第六荧光基团;各自独立地检测第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团、第四荧光基团、第五荧光基团及第六荧光基团通道的Ct值;根据所述Ct值,确定所述SCD相关基因的突变型。
进一步地,当所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,所述第二荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,所述第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样品中含有HbA野生型,不含HbS突变型、不含HbC突变型的指示;所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,所述第五荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,所述第六荧光基团通道大于37或NoCT时是待测样品中含有HbA野生型,不含HbO突变型,不含HbD突变型的指示。
在一些实施方案中,所述第一荧光基团和所述第二荧光基团各自独立地选自下列至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。
在一些实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)待测样本的核酸提取;
2)使用如上述本发明的探针组对步骤1)获得的核酸进行RT-qPCR扩增;
3)扩增曲线结果分析。
在本发明中,用于检测的样本类型可以是血液、组织、细胞等,但不限于此。
进一步地,所述RT-qPCR的反应条件为:
gDNA预变性:温度为95℃,时间为2~5min;第一步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为65℃,时间为20~50s,5~10次循环;第二步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为60℃,时间为20~40s,40~50次循环,收集荧光信号。在一个具体的实施方案中,提供了一种用于SCD快速鉴定方法,所述方法的具体步骤与上述突变类型检测方法相同。
再一方面,本发明提出了一种检测SCD相关的HBB基因组位点突变的方法,所述位点突变为A20T和/或G19A和/或G364C和/或G364A。根据本发明的实施例,利用本发明第一方面所提出的探针组对待测样品进行RT-qPCR检测,本发明第一方面所提出的探针组中的探针进一步携带荧光基团,其中,所述第一探针序列携带有第一荧光基团,所述第二探针序列携带第二荧光基团,所述第三探针序列携带有第三荧光基团,所述第四探针序列携 带有第四荧光基团,所述第五探针序列携带有第五荧光基团,所述第六探针序列携带有第六荧光基团;各自独立地检测第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团、第四荧光基团、第五荧光基团及第六荧光基团通道的Ct值;根据所述Ct值,判断所述位点是否发生突变。
具体地,当所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,第二荧光基团通道Ct值大于37或NoCT,且第三荧光基团通道Ct值大于37或NoCT,是待测样本中不含HbS突变型,不含HbC突变型指示;当所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中含HbS杂合突变型,不含HbC突变型指示;当所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中含HbS纯合突变型,不含HbC突变型指示;当所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,第二荧光基团通道大于37或NoCT,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中不含HbS突变型,含HbC杂合突变型指示;当所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道大于37或NoCT,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中不含HbS突变型,含HbC纯合突变型指示;当所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道Ct值不大于37,且第三荧光基团通道Ct值不大于37,是待测样本中含HbS杂合突变型,含HbC杂合突变型指示;当所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,第五荧光基团通道Ct值大于37或NoCT,且第六荧光基团通道Ct值大于37或NoCT,是待测样本中不含HbO突变型,不含HbD突变型指示;当所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,第五荧光基团通道Ct值大于37或NoCT,且第六荧光基团通道Ct值不大于37,是待测样本中含HbO杂合突变型,不含HbD突变型指示;当所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道Ct值大于37或NoCT,且第六荧光基团通道Ct值不大于37,是待测样本中含HbO纯合突变型,不含HbD突变型指示;当所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,第五荧光基团通道Ct值不大于37,且第六荧光基团通道Ct值大于37或NoCT,是待测样本中不含HbO突变型,含HbD杂合突变型指示;当所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道Ct值不大于37,且第六荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中不含HbO突变型,含HbD纯合突变型指示;当所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道Ct值不大于37,且第六荧光基团通道Ct值不大于37,是待测样本中含HbO杂合突变型,含HbD杂合突变型指示。
在一些实施方案中,所述方法包括以下步骤:
1)待测样本核酸的提取;
2)使用如上述本发明的探针组对步骤1)获得的核酸进行RT-qPCR扩增;
3)扩增曲线结果分析。
在本发明中,用于检测的样本类型可以是血液、组织、细胞等,但不限于此。
进一步地,所述RT-qPCR的反应条件为:
gDNA预变性:温度为95℃,时间为2~5min;第一步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为65℃,时间为20~50s,5~10次循环;第二步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为60℃,时间为20~40s,40~50次循环,收集荧光信号。在一个具体的实施方案中,提供了一种用于SCD的快速鉴定方法,所述方法包括以下具体步骤:
1)待测样本的核酸提取;
2)使用如上述本发明的探针组对步骤1)提取的核酸进行RT-qPCR扩增;
3)扩增曲线分析。
进一步地,所述RT-qPCR优化后的反应程序为:
gDNA预变性:温度为95℃,时间为2~5min;第一步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为65℃,时间为20~50s,5~10次循环;第二步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为60℃,时间为20~40s,40~50次循环,收集荧光信号。
最后,本发明提出了一种试剂盒,所述试剂盒用于SCD检测。根据本发明的实施例,包括本发明第一方面所提出的探针组。
进一步地,所述试剂盒还包括PCR反应液以及RT-PCR检测酶液。
常见的PCR反应液由Tris-HCl、MgCl
2、等缓冲体系及dNTPs构成。一般单个PCR反应管中总体积为10~50μL。常见的RT-PCR酶液由热启动DNA聚合酶组成。
在一个具体的实施方案中,本发明第一组探针组成的反应体系的具体成分如表2所示。
表2:
在一个具体的实施方案中,本发明第二组探针组成的反应体系的具体成分如表3所示。
表3:
进一步地,所述探针组中检测探针的反应终浓度为0.04~1μM。
进一步地,所述检测酶液的反应终浓度为0.02~1U。
下面参考具体实施例,对本发明进行描述,需要说明的是,这些实施例仅仅是描述性的,而不以任何方式限制本发明。
实施例1 引物探针序列的设计和优化
1、反应体系1的引物探针序列设计和优化
本实施例中,反应体系1作为同时检测编码血红蛋白的HBB基因的2种突变HbS(A20T)和HbC(G19A)的反应体系。
本发明过程中,考虑到该两个检测位点在基因组序列上位置距离较近,可以通过同一对引物进行目标区域的扩增。同时,针对待检测位点的序列特点,本发明通过3条不同荧光基团修饰标记的探针,分别标识野生型序列(HbA)、c.20A>T突变序列(HbS)、 c.19G>A突变序列(HbC),拟通过三条不同荧光标记探针的信号,识别判断待检测样本是否存在c.20A>T或c.19G>A突变,并判断突变的杂合性(纯合突变/杂合突变/复合杂合突变)。
(1)第一次优化
针对目标位点设计引物探针进行测试和优化,其中,第一次设计的Group1的SCD引物及探针组合物如表4所示。
表4:
引物探针名称 | 核酸序列 | 5’端修饰基团 | 3’端修饰基团 |
A/S/C引物上游序列 | GTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGT | - | - |
A/S/C引物下游序列 | GGCAGAGCCATCTATTGCTTA | - | - |
A/S/C-HbA-1探针 | GCAGACTTCTCCTCAGGA | FAM | MGB |
A/S/C-HbS-1探针 | GCAGACTTCTCCACAGGA | ROX | MGB |
A/S/C-HbC-1探针 | GCAGACTTCTCCTTAGGA | HEX | MGB |
ACTB引物上游序列 | TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA | - | - |
ACTB引物下游序列 | GCCGACCAACACCTAATAATG | - | - |
ACTB探针 | AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG | CY5 | MGB |
按表5所示反应体系配制反应液:
表5:
物料名称 | 使用量(μL) |
A/S/C引物上游序列 | 2.5 |
A/S/C引物下游序列 | 1 |
A/S/C-HbA探针 | 0.75 |
A/S/C-HbS探针 | 0.75 |
A/S/C-HbC探针 | 0.75 |
ACTB引物上游序列 | 0.3 |
ACTB引物下游序列 | 0.3 |
ACTB探针 | 0.3 |
DNA聚合酶 | 0.15 |
10×Buffer缓冲液 | 3 |
dNTP(each 2.5mM) | 2.4 |
MgSO 4(100mM) | 0.3 |
DNA模板 | 2 |
H 2O | 15.5 |
总体积 | 30 |
按照表6所示的程序进行荧光定量PCR反应。
表6:
根据表4~6所述引物探针组合物、反应体系及反应程序检测一例已知HbS(HBB:A20T;Het)突变的阳性样本,结果如图1所示,第一次设计的检测HbA野生型、HbS突变型、HbC突变型探针中该样本的A/S/C-HbA-1探针信号欠佳,可能会导致错误的检测结果。
使用表4~6所述引物探针组合物、反应体系及反应程序检测一例已知HbC(HBB:G19A;Het)突变的阳性样本进行实验,结果如图2所示,第一次设计的HbA野生型、HbS突变型、HbC突变型探针中该样本的A/S/C-HbA-1探针信号欠佳,可能会导致错误的检测结果。
根据测试样本已知变异信息,测试样本在各荧光通道的预期结果和实际测试结果如表7所示,测试结果显示,在表4~6所述的引物探针组合物、反应体系及反应程序条件下无法达到良好的检测目的。
表7:
(2)第二次优化
根据第一次优化测试的结果,对体系1中的三条探针进行第二次优化和测试筛选,最终获得良好的Group2的引物探针序列,如表8所示:
表8:
引物探针名称 | 序列 | 5’端修饰基团 | 3’端修饰基团 |
A/S/C引物上游序列 | GTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGT | - | - |
A/S/C引物上游序列 | GGCAGAGCCATCTATTGCTTA | - | - |
A/S/C-HbA探针 | CAGACTTCTCCTCAGGAG | FAM | MGB |
A/S/C-HbS探针 | CAGACTTCTCCACAGGA | ROX | MGB |
A/S/C-HbC探针 | CAGACTTCTCCTTAGGAG | HEX | MGB |
ACTB引物上游序列 | TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA | - | - |
ACTB引物下游序列 | GCCGACCAACACCTAATAATG | - | - |
ACTB探针 | AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG | CY5 | MGB |
使用表8所述引物探针组合物、表5、6所示的反应体系及反应程序检测一例已知HbS(HBB:A20T;Het)突变的阳性样本,结果如图3所示,A/S/C-HbA探针、A/S/C-HbS探针、内参基因ACTB探针均可得到良好的扩增信号,且A/S/C-HbC探针无非特异性扩增,具体检测数据如表9所示。因此,该组引物/探针序列可以更好的实现检测目的。
表9:
2、反应体系2的引物探针序列设计和优化
本实施例中,反应体系2作为同时检测编码血红蛋白的HBB基因的2种突变HbD(G364C)和HbO(G364A)的反应体系。
本技术发明过程中,因该两个检测位点在基因组序列上位置距离较近,可通过同一对引物进行目标区域的扩增。同时,针对待检测位点的序列特点,本发明通过3条不同荧光基团修饰标记的探针,分别标识野生型序列(HbA)、c.364G>C突变序列(HbD)、c.364G>A突变序列(HbO),拟通过三条不同荧光标记探针的信号,识别判断待检测样本是否存在c.364G>C或c.364G>A突变,并判断突变的杂合性(纯和突变/杂合突变/复合杂合突变)。同时,在该体系中通过一对引物和一条探针对内参基因ACTB进行扩增和信号标记,用于检测体系的质控。
(1)第一次优化
针对目标位点设计引物探针进行测试和优化。其中,第一次设计的体系2中SCD引物及探针组合物如表10所示。
表10:
引物探针名称 | 序列 | 5’端修饰基团 | 3’端修饰基团 |
A/D/O引物上游序列 | AAAGGAACCTTTAATAGAAATTGGACA | - | - |
A/D/O引物下游序列 | TGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTT | - | - |
A/D/O-HbA-1探针 | CCATCACTTTGGCAAAGAATT | FAM | MGB |
A/D/O-HbD-1探针 | CCATCACTTTGGCAAACAATT | HEX | MGB |
A/D/O-HbO-1探针 | CCATCACTTTGGCAAAAAATT | ROX | MGB |
ACTB引物上游序列 | TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA | - | - |
ACTB引物下游序列 | GCCGACCAACACCTAATAATG | - | - |
ACTB探针 | AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG | CY5 | MGB |
表11:
物料名称 | 使用量(μL) |
A/D/O引物上游序列 | 2.5 |
A/D/O引物下游序列 | 1 |
A/D/O-HbA探针 | 0.75 |
A/D/O-HbD探针 | 0.75 |
A/D/O-HbO探针 | 0.75 |
ACTB引物上游序列 | 0.3 |
ACTB引物下游序列 | 0.3 |
ACTB探针 | 0.3 |
DNA聚合酶 | 0.15 |
10×Buffer缓冲液 | 3 |
dNTP(each 2.5mM) | 2.4 |
MgSO 4(100mM) | 0.3 |
DNA模板 | 2 |
H 2O | 15.5 |
总体积 | 30 |
使用表10所述引物探针组合物、表11、6所示的反应体系及反应程序检测一例已知HbD(HBB:G364C;Het)突变的阳性样本,结果如图4所示,该样本的A/D/O-HbO-1探针有较强的非特异性扩增信号,可能会导致错误的检测结果。
使用表10所述引物探针组合物检测一例已知HbO(HBB:G364A;Het)突变的阳性样本进行实验,结果如图5所示,该样本的A/D/O-HbD-1探针有较强的非特异性扩增信号,可能会导致错误的检测结果。
根据测试样本已知变异信息,测试样本在各荧光通道的预期结果和实际测试结果如表12所示,测试结果显示,利用表8所述引物探针组合物、表11、6所示的反应体系及反应程序无法达到良好的检测目的。
表12:
(2)第二次优化
根据第一次优化测试结果,对体系2中的针对SCD型别检测的三条探针进行第二次序列优化和测试筛选,获得的探针序列表13所示。
表13
引物探针名称 | 序列 | 5’端修饰基团 | 3’端修饰基团 |
A/D/O引物上游序列 | AAAGGAACCTTTAATAGAAATTGGACA | - | - |
A/D/O引物下游序列 | TGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTT | - | - |
A/D/O-HbA探针 | CTGGTGAATTCTTTGC | FAM | MGB |
A/D/O-HbD探针 | CTGGTGAATTGTTTGC | HEX | MGB |
A/D/O-HbO探针 | CTGGTGAATTtTTTGC | ROX | MGB |
ACTB引物上游序列 | TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA | - | - |
ACTB引物下游序列 | GCCGACCAACACCTAATAATG | - | - |
ACTB探针 | AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG | CY5 | MGB |
使用表13所述引物探针组合物、表11、6所示的反应体系及反应程序检测一例已知HbD(HBB:G364C;Het)突变的阳性样本,结果如图6所示,其中A/D/O-HbA探针、A/D/O-HbD探针、ACTB探针均可得到良好的扩增信号,且A/D/O-HbO探针无非特异性扩增,具体检测结果如表14所示,因此,该组引物/探针序列可以更好的实现检测目的。
表14:
综上所述,本实施例筛选并确定了满足检测预期要求的引物探针序列,具体序列如表15所示,其荧光基团和淬灭基团可根据实际情况进行调整优化。
表15:
实施例2 反应体系及反应程序优化
本实施例结合检测目的和引物/探针的序列特点,反应体系中采用了非对称扩增的方式,通过调整上下游引物的浓度和配比,实现在有效扩增的前提下,更优势地扩增探针结合的目标链,从而实现信号方法和抑制非特异性信号干扰的目的。
试经过优化筛选,确定其中引物的终浓度优选为:上游引物的终浓度为0.5~4μM;下游引物的终浓度为0.1~1μM,荧光探针的终浓度均为0.04~1μM,MgSO
4的终浓度需为1~3mM,反应酶选择宝生物技术(北京)有限公司的TaKaRa Ex
Hot Start Version(RR006B),可以根据实际情况对体系进行优化。
反应程序优化为:gDNA预变性:温度为95℃,时间为 2~5min;第一步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为65℃,时间为20~50s,5~10次循环;第二步扩增:变性,温度为95℃,时间为15~30s;退火,温度为60℃,时间为20~40s,40~50次循环,收集荧光信号。
实施例3 SCD试剂盒快速鉴定方法
本实施例利用实施例1和实施例2所筛选出的引物探针组合物、反应体系、反应程序在阴性或阳性样本中进行RT-qPCR扩增,获得其CT值,以验证引物和探针的效果。
步骤1、样本收集:本发明检测样本为血液、组织、细胞等,可根据实际应用的样本类型,选择适配的DNA提取/纯化试剂盒提取人类基因组gDNA。
步骤2、配制qPCR反应液:
1)按照表16、表17中各物质的终浓度将引物探针组合物和检测酶液混合均匀,根据反应体系总体积分装至各反应管。分别向各反应管中加入提取后的待检测样本核酸,然后盖上PCR管盖,瞬时离心后放置于实时荧光PCR仪器中(A/S/C)。
表16:
表17:
步骤3:按表18所述循环条件进行反应和检测(荧光采集选取FAM通道、ROX通道、HEX通道和CY5通道)
表18:
步骤四:结果判读
1)目的靶检测信号为FAM、ROX和HEX;
2)基线的设置:基线一般设置为3-15个循环,具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为:选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域,起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动,终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少2个循环。阈值线的设置:设定原则以阈值线刚好超过正常空白对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。
3)反应体系1和反应体系2中CY5通道Ct值大于33则需要重新进行检测。
反应体系1扩增完成后,根据扩增曲线呈S型或类似S型及Ct值判断待检测样本HbS和HbC位点检测结果,具体详见表19。
表19:
反应体系2扩增完成后,根据扩增曲线呈S型或类似S型及Ct值判断待检测样本HbD和HbO位点检测结果,具体详见表20。
表20:
本发明适用2种国内常见的RT-qPCR仪(宏石SLAN-96S或雅睿MA-6000)。
实施例4 本发明组合物特异性检测
使用本发明实施例1中所述的组合物1和组合物2,按照实施例2所述的方法对已知HbS、HbC、HbD、HbO突变位点信息的样本进行检测,所述样本具体突变信息如表21所示,具体结果如图7-图11所示,各检测结果的Ct值见下表25。
表21:
步骤1、样本收集:本发明检测样本类型为外周血样本,选择磁珠法核酸提取试剂盒取人类基因组gDNA。
步骤2、配制qPCR反应液:
优化筛选后获得引物探针组合物如表15所示。
按照表22、表23中各物质的终浓度将引物探针组合物和检测酶液混合均匀,以总体积30μL的体积分装至各反应管。分别向各反应管中加入提取后的待检测样本核酸2μL,然后盖上PCR管盖,瞬时离心后放置于实时荧光PCR仪器中(A/S/C)。
表22:
表23:
步骤3:按表24所示循环条件进行反应和检测(荧光采集选取FAM通道、ROX通道、HEX通道和CY5通道)
表24:
步骤4:结果判读
将5个实施例样本检测数据导出,根据CT值判断检测结果,具体结果见表25。通过5个样本检测结果证明,该试剂盒可以准确检测SCD中的HbA野生型及HbS、HbC、HbD、HbO突变型,准确高效判断HBB基因的突变位。
表25:
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (17)
- 一种探针组,其特征在于,包括第1组探针,所述第1组探针进一步包括第一探针、第二探针和第三探针,所述第一探针核酸序列包括:5’-CAGACTTCTCCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO:1),或者与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第二探针核酸序列包括:5’-CAGACTTCTCCACAGGA-3’(SEQ ID NO:2),或者与SEQ ID NO:2所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第三探针核酸序列包括:5’-CAGACTTCTCCTTAGGAG-3’(SEQ ID NO:3),或者与SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列。
- 一种探针组,其特征在于,包括第2组探针,所述第2组探针进一步包括第四探针、第五探针和第六探针,所述第四探针核酸序列包括:5’-CTGGTGAATTCTTTGC-3’(SEQ ID NO:4),或者与SEQ ID NO:4所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第五探针核酸序列包括:5’-CTGGTGAATTGTTTGC-3’(SEQ ID NO:5),或者与SEQ ID NO:5所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列;所述第六探针核酸序列包括:5’-CTGGTGAATTTTTTGC-3’(SEQ ID NO:6),或者与SEQ ID NO:6所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核酸序列。
- 一种组合物,其特征在于,包括权利要求1和/或2所述的探针组。
- 根据权利要求3所述的组合物,其特征在于,进一步包括引物组。
- 根据权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述引物组包括第一对引物和/或第二对引物,其核酸序列如下所示:第一对引物上游序列:5’-GTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGT-3’(SEQ ID NO:7);第一对引物下游序列:5’-GGCAGAGCCATCTATTGCTTA-3’(SEQ ID NO:8);第二对引物上游序列:5’-AAAGGAACCTTTAATAGAAATTGGACA-3’(SEQ ID NO:9);第二对引物下游序列:5’-TGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTT-3’(SEQ ID NO:10)。
- 根据权利要求3~5任一所述的组合物,其特征在于,进一步包括第三对引物及第七探针,其核酸序列如下所示:第三对引物上游序列:5’-TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA-3’(SEQ ID NO:11);第三对引物下游序列:5’-GCCGACCAACACCTAATAATG-3’(SEQ ID NO:12);第七探针序列:5’-AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG-3’(SEQ ID NO:13)。
- 试剂在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于镰刀型细胞贫血症基因突变位点的检测,所述试剂包括权利要求1或2所述的探针组或权利要求3~6任一项所述的组合物。
- 试剂在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于镰刀型细胞贫血症的检测,所述试剂包括权利要求1或2所述的探针组或权利要求3~6任一项所述的组合物。
- 一种镰刀型细胞贫血症相关突变的检测方法,其特征在于,利用权利要求1或2所述的探针组或权利要求3~6任一项所述的组合物对待测样品进行RT-qPCR检测,所述探针组中的探针进一步携带荧光基团;基于RT-qPCR荧光信号,确定所述待测样品中是否含有镰刀型细胞贫血症相关突变;任选地,检测到荧光信号,是待测样品中含有镰刀型细胞贫血症相关突变的指示。
- 根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述荧光基团选自下列至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。
- 一种镰刀型细胞贫血症相关基因突变型的检测方法,其特征在于,包括:利用权利要求1或2所述的探针组或权利要求3~6任一项所述的组合物对待测样品进行RT-qPCR检测,所述探针组或组合物中的探针进一步携带荧光基团,其中,所述第一探针序列携带第一荧光基团,所述第二探针序列携带第二荧光基团,所述第三探针序列携带第三荧光基团,所述第四探针序列携带第四荧光基团,所述第五探针序列携带第五荧光基团,所述第六探针序列携带第六荧光基团;各自独立地检测第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团、第四荧光基团、第五荧光基团、第六荧光基团通道的Ct值;根据所述Ct值,确定所述镰刀型细胞贫血症相关基因的突变型。
- 根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述第一荧光基团、所述第二荧光基团、所述第三荧光基团、所述第四荧光基团、所述第五荧光基团以及第六荧光基团各自独立地选自下列至少之一:FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE;其中,同一反应体系中所述第一荧光基团、所述第二荧光基团、所述第三荧光基团的荧光基团不同;同一反应体系中所述第四荧光基团、所述第五荧光基团以及第六荧光基团的荧光基团不同。
- 根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,所述第二荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,所述第三荧光基团通道大于37或NoCT时,是待测样品中含有HbA野生型,不含HbS突变型、不含HbC突变型的指示;任选地,所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,所述第五荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,所述第六荧光基团通道大于37或NoCT时是待测样品中含有HbA野生型,不含HbO突变型,不含HbD突变型的指示。
- 根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中含HbS杂合突变型,不含HbC突变型指示;任选地,所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中含HbS纯合突变型,不含HbC突变型指示;任选地,所述第一荧光基团通道的Ct值不大于37,第二荧光基团通道大于37或NoCT,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中不含HbS突变型,含HbC杂合突变型指示;任选地,所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道大于37或NoCT,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中不含HbS突变型,含HbC纯合突变型指示;任选地,所述第一荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第二荧光基团通道不大于37,且第三荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbS杂合突变型,含HbC杂合突变型指示;任选地,所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,第五荧光基团通道大于37或NoCT,且第六荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbO杂合突变型,不含HbD突变型指示;任选地,所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道大于37或NoCT,且第六荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbO纯合突变型,不含HbD突变型指示;任选地,所述第四荧光基团通道的Ct值不大于37,第五荧光基团通道不大于37,且第六荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中不含HbO突变型,含HbD杂合突变型指示;任选地,所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道不大于37,且第六荧光基团通道大于37或NoCT,是待测样本中不含HbO突变型,含HbD纯合突变型指示;任选地,所述第四荧光基团通道的Ct值大于37或NoCT,第五荧光基团通道不大于37,且第六荧光基团通道不大于37,是待测样本中含HbO杂合突变型,含HbD杂合突变型指示。
- 一种镰刀型细胞贫血症的诊断方法,其特征在于,利用权利要求9或10任一项所述的方法对待测样品进行检测,所述待测样品来源于待检对象;基于检测结果,确定所述待测样品中是否含有镰刀型细胞贫血症相关突变;任选地,所述待测样品中含有镰刀型细胞贫血症相关突变是待检对象患有镰刀型细胞贫血症或镰刀型细胞贫血症高风险的指示。
- 一种镰刀型细胞贫血症相关基因突变型的诊断方法,其特征在于,利用权利要求11~14任一项所述的方法对待测样品进行检测,所述待测样品来源于待检对象;基于检测结果,确定所述待测样品中含有的镰刀型细胞贫血症相关基因的突变型;任选地,所述待测样品中含有的镰刀型细胞贫血症相关基因的突变型是待检对象患有疾病的指示。
- 一种试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的探针组或权利要求3~6任一项所述的组合物所述的探针组。
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