CN103320531A

CN103320531A - 一种可同时检测多个hbv耐药突变位点的新方法

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Publication number: CN103320531A
Application number: CN2013102494374A
Authority: CN
Inventors: 欧启水; 刘灿; 商红艳; 曾勇彬; 陈添彬
Original assignee: First Affiliated Hospital of Fujian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Fujian Medical University
Priority date: 2013-06-22
Filing date: 2013-06-22
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-22
Also published as: CN103320531B

Abstract

乙型肝炎病毒基因突变是导致病毒耐药的基础，现阶段的检测技术存在着较低的灵敏度、价格较贵、操作不够简便、数据分析工作量大或存在碱基错配等缺点。本发明提供了一种高灵敏度的COLD-PCR联合测序技术并将其应用于HBV已知和未知多个耐药突变的检测，具有高度灵敏、简便、价廉和实用的优点。

Description

一种可同时检测多个HBV耐药突变位点的新方法

技术领域

本发明涉及一种COLD-PCR联合测序技术，属于基因突变检测领域。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)由于转录过程中由于缺乏严格的校正机制，核苷酸错配率高，在抗病毒药核苷(酸)类似物(nucleot(s)ide analogues, NA)的压力选择下，HBV逆转录酶区(reverse transcriptase, rt)易发生突变，即基因型耐药突变，并导致对抗病毒药物耐药。为提高HBV的治疗效果，更好地监测及减少耐药的发生，在用药过程中有必要监测慢性乙型肝炎（CHB）患者rt区是否存在突变。

检测HBV基因突变的方法主要有测序法、反向杂交法(reverse hybridization assay) 、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、实时荧光定量PCR (real-time PCR)、限制性片段质谱多态性技术(restriction fragment mass polymorphism，RFMP)、超深度焦磷酸测序(Ultradeep Pyrosequencing, UDPS)、基因芯片(gene chip)等。PCR直接测序法(sanger测序法)因其可一次性检测多个位点、可同时检测已知和可能的未知耐药变异位点、假阳性率低等优点被认为基因型耐药检测的金标准，但其灵敏性较差，只有当变异株超过HBV准种池20%时才能被发现，容易出现假阴性结果；反向杂交的灵敏度较高，约为5％，但其价格较贵，操作不够简便，尤其在发展中国家无法全面推广；PCR-RFLP及real-time PCR只能检测已知、单一位点的变异，随着多种核苷(酸)类似物的相继问世和HBV新的耐药变异位点的不断出现，这些方法将难以胜任；一些新的技术，如RFMP、UDPS和gene chip等技术逐渐得以应用，但是这些技术存在价格昂贵、操作繁琐、数据分析工作量大、存在碱基错配等缺点，较适合于研究目的，不太适合于临床应用。因此，探索建立实用、灵敏度高的耐药突变检测方法十分必要。

低变性温度共扩增PCR(coamplification at lower denaturation temperature PCR，COLD-PCR)是2008年最先由Li(Li J, Wang LL, Mamon H, et al. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med 2008;14:579-584.)等报道的可提高sanger测序法灵敏度的一种PCR方法，其基于存在错配碱基的双链DNA熔解温度会发生改变的原理而建立的。根据突变后碱基是否使Tm温度下降可分为快速COLD-PCR(fast COLD-PCR)和完全COLD-PCR (full COLD-PCR)。由于COLD-PCR技术不需要昂贵的设备，仅通过体系条件的优化就可提高对突变株的检测灵敏度，其已广泛应用于肿瘤相关基因的突变检测，如p53、EGFR、k-ras、MPL等基因的检测，但未见用于检测HBV基因突变的报道。

发明内容

为了克服上述检测HBV基因突变方法的缺点，本发明率先建立了高度灵敏、简便、价廉和实用的COLD-PCR法联合sanger测序技术，探讨将其应用于HBV的已知和未知耐药突变检测的可行性。

本发明提供的技术方案为：

一种可同时检测多个乙型肝炎病毒耐药突变位点的检测方法，步骤为：

1）设计和合成一对引物，如SEQ ID No.1-2所示；

2）以乙型肝炎病毒DNA为模版，并以步骤1所述的一对引物为扩增引物进行扩增，测定扩增产物的熔解温度Tm；依据熔解温度Tm，通过改变扩增变性温度确定关键变性温度Tc；

3）通过Tc建立COLD-PCR反应体系条件并反应得到COLD-PCR产物；

4）将COLD-PCR产物进行sanger双向序列测定。

所述的COLD-PCR包括以下两种方式：fast COLD-PCR和full COLD-PCR。

fast COLD-PCR的反应条件为：

95℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火延伸30s，5个循环；Tc℃变性20s，56℃退火延伸30s，35个循环。

full COLD-PCR的反应条件为：

95℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火延伸30s，5个循环；95℃变性3s，70℃杂交120s，Tc℃再变性20s，56℃退火延伸30s，35个循环。

Tc为83.0℃。

本发明的优点在于：

通过条件优化后的COLD-PCR/sanger法较常规PCR(Conventional PCR)/sanger测序法有更高的灵敏度，能减少sanger测序法的基因突变漏检率，这将更有利于CHB患者合理选择用药或在临床耐药出现前及时更换治疗策略。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例 1

设计和合成一对引物，如表1所示；由上海生物工程有限公司合成引物序列。

Figure 2013102494374100002DEST_PATH_IMAGE001

收集福建医科大学附属第一医院2012年9月～2013年2月的慢性乙型肝炎患者30例（其中门诊9例，住院21例，编号为1～30），男19例，女11例，年龄20～76岁，平均38.2 ± 14.9，其中患者1～5采用Adefovir（ADV）治疗，6～15采用Lamivudine（LMV）治疗，15～22先采用拉米夫定治疗后改为Entecavir（ETV）治疗，22～30采用恩替卡韦治疗，所有患者均发生了病毒学突破（HBV DNA载量较上次检测结果上升了1 log₁₀IU/ml以上），除1、3、5、14、16、18、20、25、28、30患者外其余均发生了生物化学突破（血清丙氨酸转氨酶在治疗的过程中水平升高并超过正常值上限），经常规sanger测序均未发生HBV耐药突变。分离上述患者的血清于-80℃冻存。之后用北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司生产的病毒核酸提取试剂盒，用磁珠吸附法抽提HBV DNA。

构建质粒：

野生株来源： pUC-HBV14Kc(含全长HBV基因组DNA，长度3215 bp，GenBank序列号为AY206380.1，基因型C，血清型adr)。

突变株来源： sanger测序中发现的突变类型为rtM204I、rtA181T、rtM204V、rtL180M+rtM204V及rtL180M+rtM204I的HBV DNA(基因型C，血清型adr)。

以表1中引物为扩增引物，以上述野生株和突变株DNA为模板，扩增体系见表2，扩增条件如下：

94℃ 3 min → {94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s} 40个循环 → 72℃ 5 min；

扩增产物经如下回收、纯化、载体的连接、转化、筛选、鉴定等步骤，用分光光度计调整重组质粒DNA的初始浓度均为1.0×10⁹ IU/ml。

COLD-PCR/sanger 测序体系建立

⑴ 确定反应体系的产物熔解温度(Tm)

以野生株DNA为模板，在ABI 7500荧光定量PCR扩增仪上进行扩增，反应体系见表3，反应条件如下：

95℃ 30 s →{95℃ 10 s，56℃ 30 s} 40个循环→{95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s}1个循环。

其PCR最后一步为产物熔解曲线分析(95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s)，实验测得产物熔解温度(Tm)为82.5 ℃。

⑵ 寻找野生株产物Tc值

以野生株DNA为模板，在ABI 7500荧光定量PCR扩增仪上进行扩增，反应体系同表3，反应条件如下：

95℃ 30 s →{95℃ 10 s，56℃ 30 s} 5个循环→{Tx℃ 20 s，56℃ 30 s}35个循环。

其中Tx(待改变和摸索的温度，一般从高到低开始摸索，通过改变Tx值观察实验结果确定体系中的Tc值)是需要摸索和改变的温度，初始Tx值以高于Tm值1～2℃为宜，若反应能扩增出产物，则进一步降低Tx值，每次降低0.5～l℃为宜，直至Tx降低到PCR仪上不能检测到产物存在为止，而此Tx上的1个温度则定为此体系或产物的Tc值。

本试验的Tx从84.0℃开始，当Tx设为84.0℃时扩增曲线显示有PCR产物；进一步降低Tx为83.5℃、83.0℃时，仍有PCR产物产生；但当Tx降低到82.5℃时，扩增曲线则显示没有PCR产物产生，此时把83.0℃确定为反应体系中的Tc值。

⑶ 确定COLD-PCR反应体系条件

确定Tc值后，COLD-PCR反应体系同表3，fast COLD-PCR反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，56℃退火延伸30 s，5个循环；Tc℃变性20 s，56℃退火延伸30 s，35个循环。full COLD-PCR反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，56℃退火延伸30 s，5个循环；95℃变性3 s，70℃杂交120 s， Tc℃再变性20 s，56℃退火延伸30 s，35个循环。

经实验确认两种方式COLD-PCR反应条件分别如下：

fast COLD-PCR：

95℃ 30 s →{95℃ 10 s，56℃ 30 s} 5个循环→{83℃ 20 s，56℃ 30 s}35个循环。

full COLD-PCR：

95℃ 30 s →{95℃ 10 s，56℃ 30 s} 5个循环→{95℃3 s，70℃ 120 s，83℃ 20 s，56℃ 30 s}35个循环。

⑷ COLD-PCR产物sanger测序

将上述PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司行sanger双向序列测定。

Figure 2013102494374100002DEST_PATH_IMAGE003

COLD-PCR/sanger测序体系方法学评价

⑴ 灵敏度分析

分别将上述构建好的野生株和突变株质粒，经分光光度计调整其DNA浓度一致后，采用梯度稀释法将突变株的DNA按一定比例(1:5、l:10、l:20、l:50、l:100和1:200)混合到野生株的DNA中。将混合好的DNA分别行COLD-PCR/sanger测序，以明确方法的灵敏度。

本实验显示不同的突变类型，COLD-PCR/sanger测序的检测灵敏度有所不同：

a. 当突变类型为rtM204I(nt741 G>T)时，conventional PCR/sanger测序能检测的最低突变/野生型DNA的比例为l:10(10％)；fast COLD-PCR/Sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:100(1％)，比conventional PCR法提高了10倍；full COLD-PCR/sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:50(2％)，比Conventional PCR法提高了5倍。

b. 当突变类型为rtM204V(nt739 A>G)时，conventional PCR/sanger测序能检测的最低突变/野生型DNA的比例为l:10(10%)；fast COLD-PCR/Sanger测序检测的最低突变DNA的比例也为l:10(10%)，与conventional PCR法相当；full COLD-PCR/Sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:50(2%)，比Conventional PCR法提高了5倍。

c. 当突变类型为rtA181T(nt670 G>T)时，conventional PCR/sanger测序能检测的最低突变/野生型DNA的比例为l:10(10%)；fast COLD-PCR/sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:100(1%)，比conventional PCR法提高了10倍；full COLD-PCR/sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:50(2%)，比conventional PCR法提高了5倍。

d. 当突变类型为rtL180M(nt667 C>A)+rtM204V (nt739 A>G)时， conventional PCR/Sanger测序能检测的最低突变/野生型DNA的比例为l:10(10%)；fast COLD-PCR/sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:10(10%)，与conventional PCR法相当；full COLD-PCR/sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:100(2%)，比Conventional PCR法提高了10倍。

e. 当突变类型为rtL180M(nt667 C>A)+ rtM204I(nt741 G>T)时， conventional PCR/sanger测序能检测的最低突变/野生型DNA的比例为l:10(10%)；fast COLD-PCR/sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:200(0.5%)，比Conventional PCR法提高了20倍；full COLD-PCR/sanger测序检测的最低突变DNA的比例为l:100(1%)，比conventional PCR法提高了10倍。

⑵ 最低检出限评价

将上述混合好的DNA用dd H₂0作倍比稀释(如1:10、1:100、1:1000等)分析不同浓度的HBV DNA水平下，COLD-PCR/Sanger测序法对突变株的检测能力。

本实验显示：不同浓度的HBV DNA水平COLD-PCR对突变株的检测能力，如表4所示。fast COLD-PCR/sanger测序法对不同突变类型的检测浓度有所不同，对突变株DNA的最低检出限可从5.0 E+01 IU/ml～1.0 E+03IU/ml不等；full COLD-PCR/sanger测序法对单一突变类型的检测浓度大致相同，突变DNA浓度约≥2.0 E+02 IU/ml时即可检出，对混合突变类型时最低检出限可提高至1.0 E+02 IU/ml。

⑶ 体系重复性评价

通过重复检测（每天检测一次，连续检测20天）不同HBV浓度水平(HBV DNA10⁴、10⁵、10⁶IU/ml)、不同突变位点（rt180、rt204等位点）的突变株来考察体系的稳定性。

本实验显示：对于不同HBV浓度水平(HBV DNA10⁴、10⁵、10⁶IU/ml)、不同突变位点（rt180、rt204等位点）的突变株，20次重复检测结果均一致。

⑷ 体系特异性评价

采用其他肝炎病毒感染的临床标本行COLD-PCR法检测，已明确是否存在非特异性扩增；同时对HBV野生株质粒行COLD-PCR法检测，以明确是否出现假性突变。

本实验分别采用HCV-RNA阳性、HAV阳性及HIV阳性的患者血清提取DNA标本后行COLD-PCR/sanger 测序，均未发现非特异性扩增。同时对不同浓度(HBV DNA10⁴、10⁵、10⁶IU/ml)的野生株质粒行COLD-PCR法/sanger 测序检测，均未检出突变序列。

分别采用常规PCR及COLD-PCR/sanger测序法检测上述30例慢性乙型肝炎患者，结果如表5所示，conventional PCR/sanger测序未检出突变。COLD-PCR/sanger测序法共检出突变21例，其中fast COLD-PCR/sanger测序法检出17例突变(5例rtA181T+rtM204I，3例rtA181T，3例rtM204I，2例rtV191I，2例rtH197H，1例rtQ182Q+ rtV191I，1例rtM204I+ rtK212K)，full COLD-PCR/sanger测序法检出14例突变(4例rtM204I，2例rtV191I，1例rtA181T，1例rtH197H，2例rtS189S+ rtM204I，1例rtA181T+rtM204I，1例rtA180T+ rtM204V，1例rtQ182Q+ rtV191I，1例rtS213S)。

上述的conventional PCR的操作步骤为：以表1中引物为扩增引物，扩增体系见表3，扩增条件如下：

95℃ 30 s → {95℃ 10 s，56℃ 30 s} 40个循环。

PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司行sanger双向序列测定。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建医科大学附属第一医院

<120> 一种可同时检测多个HBV耐药突变位点的新方法

<160> 2

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 福建医科大学附属第一医院

<220>

<221> source

<222> 1..17

<223> /organism="福建医科大学附属第一医院"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 1

gcctcagtcc gtttctc 17

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 福建医科大学附属第一医院

<220>

<221> source

<222> 1..18

<223> /organism="福建医科大学附属第一医院"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 2

aaagggactc aagatgtt 18

Claims

1.一种可同时检测多个乙型肝炎病毒耐药突变位点的检测方法，步骤为：

1）设计和合成一对引物，如SEQ ID No.1-2所示；

2）提取乙型肝炎病毒DNA，并以步骤1所述的一对引物为扩增引物进行扩增，测定扩增产物的熔解温度Tm；依据熔解温度Tm，通过改变扩增变性温度确定关键变性温度Tc；

3）通过Tc建立COLD-PCR反应体系条件并反应得到COLD-PCR产物；

4）将COLD-PCR产物进行sanger双向序列测定。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的COLD-PCR包括以下两种方式：fast COLD-PCR和full COLD-PCR。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于fast COLD-PCR的反应条件为：

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于full COLD-PCR的反应条件为：

95℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火延伸30s，5个循环；95℃变性3s，70℃杂交120s， Tc℃再变性20s，56℃退火延伸30s，35个循环。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于Tc为83.0℃。