CN102181584A

CN102181584A - 一种基于基因测序法的乙型肝炎病毒基因分型试剂盒

Info

Publication number: CN102181584A
Application number: CN201110118215XA
Authority: CN
Inventors: 刘辉; 刘亚莉; 张敬磊; 周伟平
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-05-09
Also published as: CN102181584B

Abstract

本发明涉及生物技术领域。目前确定的乙型肝炎病毒基因型有A、B、C、D、E、F、G、H八种，不同的基因型致病性不同，抗药性不同，抗病毒药物治疗的效果也不同。鉴定临床患者和待检者的HBV基因型别，本发明提供一种基于基因测序法的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因分型试剂盒，涉及：(1)从血清或血浆中提取HBV DNA基因组；(2)根据HBV S区设计分型引物；(3)PCR反应扩增靶DNA片段；(4)通过基因测序仪检测靶DNA基因序列；(5)根据HBV靶DNA基因序列判断HBV基因型。本发明的试剂盒结果准确，灵敏度高，可高通量操作，便于推广使用，为乙肝患者临床治疗和合理用药提供依据。

Description

一种基于基因测序法的乙型肝炎病毒基因分型试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)不同基因亚型的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎是世界范围的严重危害人类健康的疾病，全球有约20亿人感染乙型肝炎病毒病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中3.5亿人呈慢性感染状态，是导致肝纤维化、肝衰竭和肝癌的主要原因。目前已确定的HBV基因型有A、B、C、D、E、F、G、H八种，最近又报道了2种新基因型I和J(Olinger CM，Jutavijittum P，Hubschen JM，et al.Possible new hepatitis B virus genotype，southeast Asia.Emerg Infect Dis.2008；14：1777-80)。中国人主要以基因B型和C型为主。不同基因型的HBV感染者，使用抗病毒药物治疗的效果各不相同。研究报告指出，HBV的基因特征，包括HBV基因型和基因变异与肝纤维化、肝细胞癌的发生显著相关(Yu MW，Yeh SH，Chen PJ，et al.Hepatitis B virus genotype and DNA level and hepatocellμlar carcinoma：a prospective study in men.J Natl Cancer Inst.2005；97(4)：265-72)。慢性乙型肝炎进展为肝纤维化和肝癌的患者主要由B、C基因型HBV携带者组成(Taylor Brent C，Yuan Jian-Min，Shamliyan Tatyana A，et al.Clinical outcomes in adμlts with chronic hepatitis B in association with patient and viral characteristics：a systematic review of evidence.Hepatology.2009；49：S85-S95)。和基因型B相比，HBV基因型C的患者血清HBeAg出现迟、清除慢，核酸复制力强、更易进展为肝纤维化和肝癌，并且对干扰素治疗的反应性差。因此，检测HBV基因型是选择抗病毒药治疗方案和监测治疗效果的前提和依据。

HBV基因型差异会导致抗病毒药物治疗的不同效果。检测HBV基因型能帮助医生预测患者的抗病毒治疗效果。B基因型感染患者在拉米夫定治疗时尤其是第1年中比C基因型感染者更易产生耐药性(Hsieh TH，Tseng TC，Liu CJ，et al.Hepatitis B virus genotype B has an earlier emergence of lamivudine resistance than genotype C.Antivir Ther.2009；14(8)：1157-63)。对于HBeAg阳性的亚洲人群，B基因型患者对普通干扰素和聚乙二醇干扰素为主的治疗均敏感；C基因型患者仅对聚乙二醇干扰素治疗敏感。用干扰素治疗的HBV患者，D基因型和C基因型的治疗效果比A基因型和B基因型差；并且，A基因型比B、C基因型患者更易于产生对拉米夫定的耐药性(Palumbo E.Hepatitis Bgenotypes and response to antiviral therapy：a review.Am J Ther.2007，14(3)：306-9)。

目前可用于HBV基因分型的方法有限制性片段长度多态性、型特异性探针检测、基因芯片分析、基因测序及序列比对等。限制性片段长度多态性技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断；型特异性探针操作复杂，敏感性不高；基因芯片法成本高、芯片制作繁琐；而基因测序法敏感性和特异性均高，操作相对简便，可高通量完成临床样品检测。目前利用基因测序法进行HBV基因分型的方法主要有全基因序列测定和S基因序列测定等，这些方法虽然进行HBV分型准确可靠，但耗时耗力。

目前尚无文献报道利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)不同基因亚型的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测HBV基因型的试剂盒。

本发明人在对HBV基因亚型A、B、C、D、E、F、G和H的研究发现，这些基因亚型的HBV DNA S存在差异如下：

HBV基因亚型	HBV DNA S差异区
		HBV基因亚型A(GenBank No：AF090842、X51970、X02763)	GATCAC
HBV基因亚型B(GenBank No：AF100309、D00329、AB033554)	GAACAC
		HBV基因亚型C(GenBank No：AB014381、M12906、X04615)	GAGCAC
HBV基因亚型D(GenBank No：X65259、M32138、X85254)	GAACCA
		HBV基因亚型E(GenBank No：AB032431、X75657)	GAGCTC
HBV基因亚型F(GenBank No：AF223965、AB036910、X69798)	GACTAC
		HBV基因亚型G(GenBank No：AF160501、AB064310、AF405706)	GAGTGC
HBV基因亚型H(GenBank No：AY090454、AY090457、AY090460)	TACCAG

本发明的试剂盒利用基因测序技术，设计了HBV DNA S基因引物：

HBV DNA S基因上游引物序列为：5’-CTAGGACCCCTGCTCGTGTT-3’(如SEQ ID NO：1所示)

HBV DNA S基因下游引物序列为：5’-GACAAAAGAAAATTGGTAAC-3’(如SEQ ID NO：2所示)

本发明提供了一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括HBV靶DNA扩增引物、HBV DNA提取试剂、阴性对照和标准品、PCR反应液和PCR测序试剂，其特征在于其中的HBV靶DNA扩增引物是

HBV DNA S基因上游引物序列为：5’-CTAGGACCCCTGCTCGTGTT-3’

HBV DNA S基因下游引物序列为：5’-GACAAAAGAAAATTGGTAAC-3’

其中的HBV DNA提取试剂为：pH8.0的10mmol/LTris-HCl、5mmol/LEDTA、0.5％SDS和150μg/ml蛋白酶K(提取方法参见文献：何建文，吕晴，朱启等，中华实验和临床病毒学杂志.1996；10：308-311)。

其中的阴性对照和标准品：以去离子水为阴性对照，以已知型别的含有HBV样品为标准对照。

其中的PCR反应液包括：10×PCR Premix、0.25pmol/μl的引物、2.5-4.0mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM dUTP、通常取1-2μl的模板。

其中PCR测序试剂为：4μl测序Buffer，1μl DNA模板，1μl测序引物(即HBV DNA S基因上游引物序列)。

用本发明的试剂盒检测临床待检者外周血HBV基因型，检测方法如下：首先使用DNA提取试剂得到乙型肝炎病毒DNA，利用合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用凝胶回收试剂盒进行快速凝胶回收，取回收DNA做测序反应，结束后采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，电泳前测序PCR产物在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，即可上基因测序仪测序。将HBV DNA测序结果与NCBI核酸数据库进行序列比对，得出待检者HBV基因型。

本发明试剂盒的优点和效果如下：

(1)敏感：测序检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。

(2)特异：使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。

(3)简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。

(4)快速：速度快、高通量，可在12-14小时完成。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1本发明试剂盒的制备

本发明试剂盒组成如下：

①HBV DNA提取试剂：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，5mmol/LEDTA，0.5％SDS，150μg/ml蛋白酶K。

②引物：

上述引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

③阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有HBV DNA样品为阳性对照。

④PCR反应液：10×PCR Premix、0.25pmol/μl的引物、2.5-4.0mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM dUTP、通常取1-2μl的模板。(以上所有的浓度都是指终浓度)

⑤PCR扩增程序的设定：在ABI9700仪器上通常是先95℃5min，然后95℃30s，58℃60s，72℃1min，循环40次，最后72℃10min。

⑥2％的DNA凝胶电泳后切取PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。

⑦测序反应液：4μl测序Buffer，1μl DNA模板，1μl测序引物

⑧测序反应程序的设定：在ABI9700仪器上通常先98℃变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温；

⑨采用醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，上ABI3130测序仪进行测序。

实施例2用实施例1制备的试剂盒检测HBV的基因型

以检测20例乙型肝炎患者外周血样品中HBV基因型结果为例。

检测流程：首先根据HBV核酸数据库提供的HBV RT区基因序列设计特异性引物。获取临床乙型肝炎患者外周血样品，快速提取HBV DNA；配置PCR反应液进行PCR扩增，然后回收PCR扩增产物，进行测序反应，将测序反应产物纯化后进行测序，最后在NCBI核酸数据库中进行核酸序列比对，确定所测序列HBV基因型。

具体步骤如下：

①血清HBV DNA的抽提：按DNA抽提纯化的方法抽提乙型肝炎患者和正常人外周血中HBV DNA(参见文献：何建文，吕晴，朱启等，中华实验和临床病毒学杂志.1996；10：308-311)。

②PCR扩增：PCR反应体系为20μl：含2X premix 10.0μl，引物浓度0.2μmol/L，超纯水补齐。在ABI9700PCR仪上反应：扩增条件95℃5min，然后95℃30s，58℃60s，72℃1min，循环40次，最后72℃10min。

③2％的DNA凝胶电泳后切取PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。

④测序反应液：4μl测序Buffer，1μl DNA模板，1μl测序引物，在ABI9700仪器上先98℃变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

⑤采用醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，按照ABI3130测序仪操作说明进行测序(参见文献：Stirzaker C，Song JZ，Davidson B，et al.Cancer Res.2004；64(11)：3871-7)。

⑥数据收集处理和分析：将所测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析，分析HBV亚型：

⑦结果：

标本	HBV RT区	基因型
			患者1	+	B
患者2	+	B
			患者3	+	B
患者4	-	-

患者5	+	C
			患者6	+	C
患者7	+	C
			患者8	+	C
患者9	+	C
			患者10	+	C
患者11	+	C
			患者12	+	B
患者13	+	C
			患者14	+	C
患者15	+	C
			患者16	+	B
患者16	+	B
			患者18	+	C
患者19	+	C
			患者20	+	D

实施例3本发明试剂盒检测能力评价

本实施例用作比较的“限制性片段长度多态性法”(参见文献：彭亮，丁静娟.上消化道疾病与乙肝病毒感染及其基因型的关系，复旦学报(医学版).2004；31(5)：534-537)与本试剂盒检测能力，结果发现本试剂盒敏感性、特异性及灵敏度与限制性片段长度多态性法进行分型比较，本试剂盒更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求，对比结果如下：

其中：

①特异性：100％；

②灵敏度：95％；

③阳性预测值：阳性预测值达到100％；

④阴性预测值：阴性预测值达到93％；

⑤重复性：多次重复实验结果一致；

⑥耗时：一份临床标本的检测时间约为12-14h，耗时短。

上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的基因测序法对乙型肝炎病毒进行分析，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，该试剂盒为临床乙型肝炎患者的治疗及健康管理提供了一种全新的快速简便的基因检测方法。

Claims

1.一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括HBV靶DNA扩增引物，该扩增引物是：

HBV DNA S基因上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；

HBV DNA S基因下游引物序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括HBV DNA提取试剂、阴性对照和标准品、PCR反应液和PCR测序试剂。

3.根据权利要求2所述的一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，其特征在于其中的HBV DNA提取试剂为：pH8.0的10mmol/LTris-HCl、5mmol/L EDTA、0.5％SDS和150μg/ml蛋白酶K。

4.根据权利要求1或2所述的一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，其特征在于其中的阴性对照和标准品为：以去离子水为阴性对照，以已知型别的HBV样品为标准品。

5.根据权利要求1或2所述的一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，其特征在于其中的PCR反应液为：10×PCR Premix、0.25pmol/μl的引物、2.5-4.0mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM dUTP、通常取1-2μl的模板。

6.根据权利要求1或2所述的一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，其特征在于其中PCR测序试剂为：4μl测序Buffer，1μl DNA模板，1μl测序引物。