CN102286644A

CN102286644A - 一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒

Info

Publication number: CN102286644A
Application number: CN2011102483120A
Authority: CN
Inventors: 李艳; 童永清; 顾剑; 郑红云
Original assignee: 李艳; 童永清; 顾剑; 郑红云
Current assignee: Guangzhou City, Panyu District Huaxin Technology Co. Ltd.
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: CN102286644B

Abstract

本发明涉及一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，包括HCVNS5B基因扩增引物、HCVNCR保守区域基因扩增引物、HCVRNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、cDNA合成试剂、PCR反应液和PCR测序试剂，其中，HCVNS5B基因上游引物序列为SEQIDNo.1所示，HCVNS5B基因下游引物序列为SEQIDNo.2所示，HCVNCR保守区域基因上游引物序列为SEQIDNo.3所示，HCVNCR保守区域基因上游引物序列为SEQIDNo.4所示。本发明的试剂盒检测灵敏度很高，特异性好，可以检测已报道的所有HCV基因型(亚型)，速度快，可在12~14小时完成。

Description

一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，用于快速检测患者血液样品中丙型肝炎病毒的型及亚型，属于医疗器械领域。

背景技术

丙型肝炎病毒（hepatitis C virμs, HCV）是一种单股线性正链RNA病毒，是重要的肝病致病因子之一，严重威胁人类健康。目前全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV感染患者发展为肝癌，继而引起消化道出血和腹水。肝病患者中由HCV感染导致的死亡正逐步增多。

丙型肝炎病毒包括9400左右个氨基酸，HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，编码一具有3010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV基因组中各种基因结构和功能不同，有些区域高度保守，如5’非编码区，非结构区。HCV具有高度的变异性，本身又具有负选择作用，导致了HCV基因分型众多，目前已知HCV至少可分为6型（HCV1-6型），各型又分为许多亚型（如1a, 1b, 2a, 2b, 3c等），共70多种亚型。各型核酸序列之间相差31-34%，氨基酸序列相差大约30%，而亚型序列之间相差20-23%。不同型别的HCV对治疗药物如干扰素、利巴韦林的敏感程度不同，区别患者的HCV基因型对临床治疗用药非常有帮助。

目前对HCV基因分型的方法主要有：ELISA法，荧光定量PCR法，限制性片段长度多态性，型特异性探针核酸杂交分析法等。这些方法敏感性、特异性低，只能区分出主要的几种基因型，对亚型分型能力不足，不能满足临床需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能快速、敏感地检测HCV基因型的试剂盒。

由于同一基因型、不同亚型HCV5’非编码区序列的差异度仅为1%-3.3%，而NS5B基因序列的差异度为16.5%-20.1% ，NS5B基因更适合用于HCV的基因分型。因此，根据HCV NS5B区基因序列而进行的基因分型被公认为HCV基因分型的“金标准”。

本发明为了提供对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，首先设计了HCV NS5B基因引物。HCV NS5B基因上游引物序列为：

5’ -TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3’（SEQ ID No.1）

HCV NS5B基因下游引物序列为：

5’-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3’ （SEQ ID No.2）

同时设计了HCV NCR保守区域基因引物：

HCV NCR保守区域基因上游引物序列为：

5’-GCGGAACCGGTGAGTACA-3’ （SEQ ID No.3）

HCV NCR保守区域基因下游引物序列为：

5’-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3’ （SEQ ID No.4）

本发明提供的对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，包括HCV NS5B基因扩增引物、HCV NCR保守区域基因扩增引物、HCV RNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、cDNA合成试剂、PCR反应液和PCR测序试剂，其中，

HCV NS5B基因上游引物序列为：5’ -TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3’

HCV NS5B基因下游引物序列为: 5’-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3’

HCV NCR保守区域基因上游引物序列为: 5’-GCGGAACCGGTGAGTACA-3’

HCV NCR保守区域基因下游引物序列为: 5’-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3’

其中HCV RNA提取采用酚氯仿提取法提取，提取试剂为：TRIzol，氯仿、异丙醇、无水乙醇和无RNase去离子水。

其中的阴性对照和阳性对照，以去离子水为阴性对照，以已知型别的含有HCV样品为阳性对照。

其中的cDNA合成反应液包括：200 U/μL 逆转录酶(M-MLV)、40 U/μL RNase抑制剂、50 μM Oligo(dT)₁₅、50 μM 随机引物(Random primer)、5×第一链合成缓冲液(first-strand buffer)、无RNase的去离子水(RNase-free ddH₂O)、10 mM dNTPs。

其中的PCR反应液包括：10×PCR混合液(premix)、0.25 pmol/μL的引物、2.5~4.0 mM的氯化镁、2U的Taq酶、0.2~0.4 mM的dNTPs。

其中PCR测序试剂为：4μL测序缓冲液，1μL DNA模板，1μL测序引物。

用本发明的试剂盒检测临床待检者外周血HCV基因型，检测方法如下：首先制备待检者血液样品中的丙型肝炎病毒RNA，使用RNA提取试剂盒得到丙型肝炎病毒RNA，以此提取到的RNA为模板，通过合成的寡核苷酸逆转录引物进行逆转录反应得到cDNA，然后用此cDNA作为模板及合成的PCR引物进行PCR扩增，扩增产物采用凝胶回收试剂盒进行快速胶回收，取回收DNA做测序反应，结束后采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，电泳前测序PCR产物在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，基因测序仪测序；将所测序列结果与NCBI核酸数据库进行序列比对，得出待检者HCV基因分型。

本发明采用基因序列分析法进行HCV基因分型，和其他技术相比，操作快速，结果准确，能一次性对7种HCV基因型进行分型鉴定，涵盖了目前所报道的所有亚型，是最直观、最准确的方法。本发明试剂盒的优点和有益效果如下：

(1)敏感：测序检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。

(2)特异：使用特异性标记的荧光素对定量分子进行识别，具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。

(3)简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。

(4)快速：速度快、高通量，可在12~14小时完成。

附图说明

图1丙型肝炎患者HCV靶基因片段测序结果；

图2为丙型肝炎患者HCV靶基因片段DNA序列；

图3为所测基因序列与NCBI核酸数据库比对结果，即检测患者HCV基因分型结果。

具体实施方式

现结合实施例对本发明进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1 本发明试剂盒的制备

本发明试剂盒的组成如下：

(1)丙型肝炎病毒RNA提取试剂：TRIzol裂解液，氯仿、异丙醇和无水乙醇

(2)引物：

HCV NS5B基因上游引物序列为：5’ -TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3’

HCV NS5B基因下游引物序列为: 5’-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3’

HCV NCR保守区域基因上游引物序列为: 5’-GCGGAACCGGTGAGTACA-3’

以上引物由上海Life Technology公司合成。

(3)阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有HCV RNA样品为阳性对照。

(4)逆转录PCR反应试剂: 200 U/μL M-MLV、40 U/μL RNase、50 μM Oligo(dT)₁₅、50 μM Random primer（随机引物）、5×first-strand buffer（第一链合成缓冲液）、 RNase-free ddH₂O、10 mM dNTPs

(5)PCR反应液: 10×PCR Premix、0.25 pmol/μL的引物、2.5~4.0 mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2~0.4 mM的dNTPs、0.3~0.6 mM dUTP、通常取1~2 μL的模板。

PCR扩增程序的设定：在ABI9700仪器上通常是先95℃ 5 min，然后95℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 1 min，循环40次，最后72℃ 10 min。

2%（g/ml）的DNA凝胶电泳后切取PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。

(6)测序反应液: 4 μL测序Buffer，1 μL DNA模板，1 μL测序引物。

测序反应程序的设定：在ABI9700仪器上通常先98℃变性2 min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

采用醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，上ABI3130测序仪进行测序。

实施例2 用实施例1制备的试剂盒检测HCV的基因型

以检测20例丙型肝炎患者外周血样品中HCV基因型结果为例。

检测流程：首先根据HCV核酸数据库提供的HCV核酸序列设计特异性引物。获得临床丙型肝炎患者外周血样品，快速提取HCV RNA，以此提取到的RNA为模板，通过合成的寡核苷酸逆转录引物进行逆转录反应得到cDNA，然后用此cDNA作为模板及合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用凝胶回收试剂盒进行快速胶回收，取回收DNA做测序反应，将测序反应产物纯化后进行测序，最后在NCBI核酸数据库中进行核酸序列比对，确定所测序列HCV基因型。

具体操作步骤如下：

(1)丙型肝炎病毒RNA提取：按照RNA提取纯化的方法提取丙型肝炎患者和正常人外周血HCV RNA。

(2)逆转录PCR：按照第一链合成方法将提取的RNA逆转录为cDNA。

(3) PCR扩增：PCR反应体系为20μl：含2X premix 10.0 μL，引物浓度0.2 μmol/L，超纯水补齐。在ABI9700PCR仪上反应：扩增条件95℃ 5 min，然后95℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 1 min，循环40次，最后72℃ 10 min。

(4) 2%（g/ml）的DNA凝胶电泳后切取PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。

(5)测序反应液：4 μL测序Buffer，1 μL DNA模板，1 μL 测序引物，在ABI9700仪器上先98℃变性2 min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

(6)采用醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，按照ABI3130测序仪操作说明进行测序。

(7)数据收集处理和分析：将所测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析，分析HCV亚型(图1、图2、图3)。

(8)结果：

样品	HCV NCR	HCV NS5B	基因型
				患者1	+	+	2a
患者2	+	+	6d、6k混合型
				患者3	+	+	6b
患者4	+	+	1b
				患者5	-	-	-
患者6	+	+	1b
				患者7	+	+	6a
患者8	+	+	1a
				患者9	+	+	2a
患者10	+	+	3b
				患者11	+	+	3a
患者12	+	+	6u
				患者13	+	+	6n
患者14	+	+	1b
				患者15	+	+	6a
患者16	+	+	1a
				患者17	-	-	-
患者18	+	+	3b
				患者19	+	+	3a
患者20	+	+	6u

实施例3本发明试剂盒检测能力评价

根据实例1，将45例经限制性片段长度多态性法进行HCV基因分型的HCV患者标本采用本发明试剂盒进行检测，将二者的检测能力进行了对比，本试剂盒敏感性、特异性及灵敏度与限制性片段长度多态性法进行分型比较，本试剂盒更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求：

其中：

① 特异性：100%；

② 灵敏度：97%；

③ 阳性预测值：阳性预测值达到100%；

④ 阴性预测值：阴性预测值达到94%；

⑤ 重复性：多次重复实验结果一致；

⑥ 耗时：一份临床标本的检测时间约为8-10h，耗时短。

上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的基因测序法对乙型肝炎病毒进行分析，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，该试剂盒为临床乙型肝炎患者的治疗及健康管理提供了一种全新的快速简便的基因检测方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 李, 艳

童, 永清

郑, 红云

顾, 剑

<120> 一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaaccacat cmrctccgtg tg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtacctggtc atagcytccg traa 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggaaccgg tgagtaca 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctatcaggc agtaccacaa gg 22

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> hcv

<400> 5

ggaccccacg aaggggggta aaaaagcagc tcgccttatc gtctaccctg acctcggcgt 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> hcv

<400> 6

cagggtctgc gagaaratgg ccctttatga trtcacacaa aagctccctc aggcggtgat 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> hcv

<400> 7

gggggcctct tatggattcc agtactcccc cgctcagcgg gtggagtttc tcttgaaggc 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> hcv

<400> 8

atgggcggac aaraaagacc ccatgggttt ttcgtatgat acccgatgct ttgactcaac 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> hcv

<400> 9

cgtcactgar agagatataa aaactgagga gtccatatac caggcttgct ccctgcccga 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> hcv

<400> 10

ggaggcycgc actgctatac actcgctgac tgaragactc tacgtaggag ggcccatgct 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> hcv

<400> 11

taacagcaag ggtcaracct gcggktacag gcgttgccgc gccagcgggg tgctcaccac 60

Claims

1.一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，其特征在于，包括HCV NS5B基因扩增引物、HCV NCR保守区域基因扩增引物、HCV RNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、cDNA合成试剂、PCR反应液和PCR测序试剂，其中，HCV NS5B基因上游引物序列为SEQ ID No.1所示，HCV NS5B基因下游引物序列为SEQ ID No.2所示，HCV NCR保守区域基因上游引物序列为SEQ ID No.3所示，HCV NCR保守区域基因上游引物序列为SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中HCV RNA提取试剂为：TRIzol，氯仿、异丙醇、无水乙醇和无RNase去离子水。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的阴性对照和阳性对照，以去离子水为阴性对照，以已知型别的含有HCV样品为阳性对照。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的cDNA合成反应液包括：200 U/μL 逆转录酶、40 U/μL RNase抑制剂、50 μM Oligo(dT)₁₅、50 μM 随机引物、5×第一链合成缓冲液、无RNase的去离子水、10 mM dNTPs。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的PCR反应液包括：10×PCR 混合液、0.25 pmol/μL的引物、2.5~4.0 mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2~0.4 mM的dNTPs、0.3~0.6 mM dUTP。

6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中PCR测序试剂由4 μL测序缓冲液，1 μL DNA模板，1 μL测序引物组成。