CN109777864A - 一种检测bcr-abl融合基因abl激酶区突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测BCR‑ABL融合基因ABL激酶区突变的方法。该方法采用COLD‑PCR结合二代测序的方法检测外周血或骨髓中BCR‑ABL融合基因两种剪切型M‑bcr和m‑bcr中的ABL激酶区耐药突变,即在同一体系内先扩增M‑bcr和m‑bcr的BCR‑ABL融合基因,再进行COLD‑PCR扩增ABL激酶区,并利用CLOD‑PCR的原理封闭野生型模板,利用Tc温度富集少量突变基因,同时通过二代测序的方法提高检测灵敏度。本发明方法具有操作简单、重复性好、高通量检测标本、报告时间短等特点,尤其适用于少量突变克隆株的检测。使用该方法将显著提高突变检测的敏感度及复合突变的检测能力。
Description
技术领域
本发明涉及基因组测序技术领域,具体地说,涉及一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法及试剂盒。
背景技术
慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病,骨髓以髓系增生,外周血白细胞增多及脾脏肿大为主要特征。对CML而言,突变克隆的扩增可能是一个渐进的过程,开始阶段突变克隆比例较低,但一旦出现会很快增高并导致疾病恶化。耐药性的突变往往出现于CML急变期前或伴随急变期出现,因此定期监测突变情况是必要的,可以及早发现突变并相应调整治疗方案。对于某些预后不良的突变来说,在低水平时就较早地检测出来是非常有意义的。CML患者的BCR-ABL融合基因M-bcr剪切型的ABL激酶区耐药突变检测结果和Ph+(费城染色体)阳性的ALL(急性淋巴细胞白血病)患者m-bcr剪切型的ABL激酶区耐药突变的检测结果,为临床医生用药提供参考,如果能够在低水平突变时检测到突变,临床医师可以尽早调整治疗方案。
目前对ABL激酶区突变的检测主要是Sanger测序法和HRM法。Sanger测序法是从外周血或骨髓中提取RNA,采用随机引物逆转录cDNA,以此为模板做半巢式PCR分别扩增M-bcr和m-bcr两种剪切体的BCR-ABL融合基因,得到扩增产物后以其为模板,扩增ABL激酶区,得到的产物,用一代测序的方法检测其中ABL激酶区片段的突变。该方法只能检测突变频率高于10%-20%的突变,低于此频率的突变则会被漏检。
HRM法是在一定的温度范围内将BCR-ABL融合基因中ABL基因PCR扩增的产物进行变性,期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化,可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列,因而也就有了独特的熔解曲线形状,如同DNA指纹图谱一样,具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型和突变型基因。上述Sanger测序法灵敏度低,HRM法只能检测样本中特定突变位点,如果要检测多个位点则成本较高,同时由于检测通量的局限性,不能批量检测而难以满足实际应用的需要。
二代测序技术已广泛应用于基础研究与临床基因检测,采用COLD-PCR结合二代测序的方法有望检测外周血或骨髓中BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变,尤其适用于少量突变克隆株的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法及试剂盒。
本发明提供了一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法,包括步骤:从外周血或骨髓样本中提取RNA,随机引物逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,在同一反应体系中扩增待测样品中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr,以扩增产物为模板,COLD-PCR扩增ABL激酶区,构建文库,文库混合制备模板后上机测序。
本发明的方法中,所述在同一反应体系中扩增待测样品中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr的方法为:以待测样品RNA逆转录而成的cDNA为模板,以SEQ ID NO.1-3所示序列为引物,进行PCR扩增。
SEQ ID NO.1、2、3所示序列的引物在PCR反应体系中初始物质的量比例为1:1:2。
在本发明的一个实施例中,三条引物的浓度均为10μM,按照体积比1:1:2混合,在20μL的总反应体系中,混合引物的体积为2μL。
本发明提供的一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法中,BCR-ABL融合基因扩增程序为:
95℃,10min;
95℃30s,退火温度65℃,30s,72℃75s,共20个循环,每个循环退火温度降低0.5℃;
95℃30s,55℃30s,72℃75s,共25个循环;
72℃8min。
本发明提供的一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法中,所述COLD-PCR扩增ABL激酶区的方法为:以BCR-ABL融合基因的扩增产物为模板,以SEQ ID NO.3-5所示的核苷酸序列为引物,进行COLD-PCR扩增。
优选地,COLD-PCR扩增程序为:
95℃,2min;
95℃10s,63℃30s,72℃10s,共5个循环;
95℃10s,69℃30s,73℃30s,63℃30s,72℃10s,共5个循环;其中73℃自首个循环起,每个循环升高0.2℃;
95℃10s,69℃30s,74℃30s,63℃30s,72℃10s,共45个循环;72℃5min。
在本发明的实施例中,采用Nextera XT方法构建文库,然后将文库混合制备模板,上机测序。
进一步地,本发明提供一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的试剂盒,该试剂盒含有SEQ ID NO.5所述的引物。
更进一步地,本发明的试剂盒还含有SEQ ID NO.1-4所述的引物,其工作程序为:以SEQ ID NO.1-3所述的引物扩增待测样品中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr,得到扩增产物后以其为模板,再以SEQ ID NO.3-5所述的引物COLD-PCR扩增ABL激酶区,构建文库,测序。
本发明提供一种上述方法进行工作的用于检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的试剂盒。
进一步地,上述试剂盒还含有SEQ ID NO.1-4所述的引物,其工作程序为:待测样品为外周血或骨髓样本提取的RNA,逆转录成cDNA,并以此作为模板,以SEQ ID NO.1-3所述的引物扩增模板中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr,得到扩增产物后以其为模板,再以SEQ ID NO.3-5所述的引物COLD-PCR扩增ABL激酶区,构建文库,测序。
另一方面,本发明还提供了一种适用于检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的引物组合,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示。
本发明提供了一种寡核苷酸,其如SEQ ID NO.5所示。该寡核苷酸用于封闭野生型ABL基因模板,降低野生型模板的检测背景,极大地提高了本发明方法的检测效率。
本发明的有益效果在于,本发明采用COLD-PCR结合二代测序的方法检测外周血或骨髓中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变,即在同一体系内先扩增M-bcr和m-bcr的BCR-ABL融合基因,再进行COLD-PCR扩增ABL激酶区,在PCR过程中设置特殊的复性温度,即Tc温度为69℃,在此温度下,可特异性扩增突变型模板,呈指数型扩增;而RS-Oligo(SEQ ID NO.5)可特异性结合野生型模板,使其线性扩增。从而达到封闭野生型模板,利用Tc温度富集少量突变基因的目的。
该方法中,在Tc温度下,RS-Oligo特异性结合野生型模板,在PCR程序完成以后,体系中的野生型DNA只有模板链发生了线性扩增,而突变型DNA两条链均参与了PCR反应,呈指数型扩增,从而反映出的结果是突变频率相对提高了。在血液肿瘤领域,目前还没有类似的技术用于检测ABL激酶区突变。利用Tc温度富集频率低的突变基因而便于检测,提高检测ABL激酶区突变灵敏度,辅助临床医生诊断CML及Ph+ALL,调整治疗方案;在治疗过程中定期监测,在疾病复发早期检测到低频突变可尽早调整用药方案。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所用的生化试剂均为市售。
实施例1COLD-PCR结合二代测序的方法检测外周血中BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变
COLD-PCR结合二代测序的方法检测外周血中BCR-ABL融合基因同时检测两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变检测试剂盒,包括:RNA提取液:红细胞裂解液、Trizol、氯仿、无水乙醇;逆转录试剂:SuperScript II Reverse Transcriptase(ThermoFisherScientific);检测体系PCR反应液;文库构建反应液;Miseq平台测序反应液;阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
检测体系PCR反应液包括:10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus);dNTP Mixture(10mMeach);LA Taq酶;扩增BCR/ABL融合基因M-bcr和m-bcr剪切型BCR-ABL融合基因的引物M-BCR-F(10μM):m-BCR-F(10μM):ABL-R:(10μM),按1:1:2的比例混合;COLD-PCR扩增ABL激酶区引物ABL-F(10μM)、ABL-R(10μM)、RS-Oligo(20μM);Nextera XT建库试剂包括:TD(Tagment DNA Buffer);ATM(Amplicon Tagment Mix);NT(Neutralize Tagment Buffer)。
1、BCR-ABL融合基因扩增引物:
M-BCR-F:TGACCAACTCGTGTGTGAAACTC SEQ ID NO.1
m-BCR-F:ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG SEQ ID NO.2
ABL-R:TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT SEQ ID NO.3
2、BCR-ABL融合基因扩增反应体系:
表1
成分 | 加入量(μl) |
LA Taq酶 | 0.2 |
10×LA PCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 2 |
dNTP Mixture | 0.8 |
引物混合物 | 2 |
cDNA | 5 |
ddH<sub>2</sub>O | 10 |
总体积 | 20 |
3、BCR-ABL融合基因扩增程序:
表2
4、COLD-PCR扩增ABL激酶区,所用引物对包含SEQ ID NO:3、SEQID NO:4,另含一条RS-Oligo(SEQ ID NO:5);
ABL-F:CGCAACAAGCCCACTGTCT SEQ ID NO:4
ABL-R:TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT SEQ ID NO:3
RS-Oligo:CAGCTCCTTTTCCACTTCGTCT SEQ ID NO:5
COLD-PCR扩增ABL激酶区反应体系:
表3
COLD-PCR扩增ABL激酶区程序:
表4
5、Nextera XT法构建文库操作参照illumina公司XT DNA LibraryPreparation Kit说明书。
5.1基因组DNA片段化
表5试剂
表6基因组DNA片段化程序
5.2片段化DNA并加接头(PCR)
表7
程序55℃5min,10℃保持。
5.3PCR扩增试剂见表8
表8
表9程序
5.4PCR产物纯化
表10试剂
5.5文库均一化
表11
6、Illumina Miseq测序仪上机测序构建好文库后,将文库混合制备模板,然后上机测序。检测结果列表:
表12 13例外周血标本检测结果
样本编号 | 剪切型 | 本发明的检测结果 | Sanger测序检测结果 |
1 | M-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
2 | M-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
3 | M-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
4 | M-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
5 | M-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
6 | M-bcr | T315I(9.45%) | 未见突变 |
7 | M-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
8 | m-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
9 | m-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
10 | m-bcr | 未见突变 | 未见突变 |
11 | m-bcr | T315I(99%) | T315I |
12 | m-bcr | Q252H(98.9%) | Q252H |
13 | m-bcr | Q252H(97.8%) | Q252H |
实施例2COLD-PCR结合二代测序的方法检测骨髓中BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变
COLD-PCR结合二代测序的方法检测骨髓中BCR-ABL融合基因同时检测两种剪切型M-bcr和m-bcr中的ABL激酶区耐药突变检测试剂盒,包括:RNA提取液:红细胞裂解液、Trizol、氯仿、无水乙醇;逆转录试剂:SuperScript II Reverse Transcriptase(ThermoFisher Scientific);检测体系PCR反应液;文库构建反应液;Miseq平台测序反应液;阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
检测体系PCR反应液包括:10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus);dNTP Mixture(10mMeach);LATaq酶;扩增BCR/ABL融合基因M-bcr和m-bcr剪切型BCR-ABL融合基因的引物M-BCR-F(10μM):m-BCR-F(10μM):ABL-R:(10μM),按1:1:2的比例混合;COLD-PCR扩增ABL激酶区引物ABL-F(10μM)、ABL-R(10μM)、RS-Oligo(20μM);Nextera XT建库试剂包括:TD(Tagment DNABuffer);ATM(Amplicon Tagment Mix);NT(Neutralize Tagment Buffer)。
第一步RNA逆转录、第二步同时扩增BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr、
1.BCR-ABL融合基因扩增引物:
M-BCR-F:TGACCAACTCGTGTGTGAAACTC SEQ ID NO.1
m-BCR-F:ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG SEQ ID NO:2
ABL-R:TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT SEQ ID No.3
2.BCR-ABL融合基因扩增反应体系:
表13
成分 | 加入量(μl) |
LATaq酶 | 0.2 |
10×LAPCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 2 |
dNTP Mixture | 0.8 |
引物混合物 | 2 |
cDNA | 5 |
ddH<sub>2</sub>O | 10 |
总体积 | 20 |
3.BCR-ABL融合基因扩增程序:
表14
第三步:COLD-PCR扩增ABL激酶区,所用引物对包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4,另含一条RS-Oligo(SEQ ID NO:5);
1.引物
ABL-F:CGCAACAAGCCCACTGTCT SEQ ID NO:4
ABL-R:TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT SEQ ID NO:3
RS-Oligo:CAGCTCCTTTTCCACTTCGTCT SEQ ID NO:5
2.COLD-PCR扩增ABL激酶区反应体系:
表15
成分 | 加入量(μl) |
LATaq酶 | 0.5 |
10×LAPCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 5 |
dNTP Mixture | 2 |
PCR/RS-Oligo引物混合物 | 2 |
第一轮PCR产物 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 39.5 |
总体积 | 50 |
3.COLD-PCR扩增ABL激酶区程序:
表16
第四步:Nextera XT法构建文库
1.基因组DNA片段化
表17
Component | Volume |
TD buffer | 10μl |
Input DNA | 5μl(0.2ng/μl,共1ng;要精准) |
ATM | 5μl |
Total | 20μl |
(2)基因组DNA片段化程序:55℃5min,10℃保持。
2.片段化DNA并加接头(PCR)
(1)试剂:TD buffer 10μl,Input DNA5μl(0.2ng/μl,共1ng;要精准),
ATM5μl,总体积20μl。
(2)程序:55℃5min,10℃保持。
PCR扩增
(1)试剂NPM(Nextera PCR Master Mix)15μl,Index 1primers(N7XX)5μl,Index2primers(S5XX)5μl。
(2)程序:
表18
3.PCR产物纯化
试剂:RSB(Resuspension Buffer)1ml,AMPure XP beads 90μl,80%Ethanol,freshly-prepared 200μl。
4.文库均一化
表19
Item | Volume |
LNA1(Library Normalization Additives 1) | 4.4ml |
LNB1(Library Normalization Beads 1) | 800μl |
LNW1(Library Normalization Wash 1) | 45μl |
LNS1(Library Normalization Storage Buffer 1) | 30μl |
0.1N NaOH(less than one week old) | 30μl |
第五步Illumina Miseq测序仪上机测序
构建好文库后,将文库混合制备模板,然后上机测序。检测结果见表20:
表20 13例骨髓标本检测结果
实施例3COLD-PCR结合二代测序的方法和传统PCR+二代测序的方法检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的比较
1、T-A克隆法构建T315I突变质粒,步骤如下:
1.1取存在T315I突变的CML患者骨髓样本,提取RNA,逆转录cDNA;
1.2以cDNA为模板,以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示序列为引物,扩增M-bcr型BCR-ABL融合基因;
1.2.1BCR-ABL融合基因扩增反应体系:
表21
成分 | 加入量(μl) |
LATaq酶 | 0.2 |
10×LAPCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 2 |
dNTP Mixture | 0.8 |
引物混合物 | 2 |
cDNA | 5 |
ddH<sub>2</sub>O | 10 |
总体积 | 20 |
1.2.2BCR-ABL融合基因扩增程序:
表22
1.3以步骤2中PCR产物为模板,以SEQ ID NO.3-4所示序列为引物,扩增ABL基因激酶区。
1.3.1ABL激酶区扩增反应体系:
表23
成分 | 加入量(μl) |
LA Taq酶 | 0.2 |
10×LA PCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 2 |
dNTP Mixture | 0.8 |
引物混合物 | 2 |
第一轮PCR产物 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 14 |
总体积 | 20 |
1.3.2ABL激酶区扩增程序:
表24
PCR产物凝胶电泳检测并切胶回收。所用试剂盒为购买的TakaraMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit;购买的pMD18-T载体试剂盒(Takara)进行连接反应;质粒载体转化感受态大肠杆菌,接种至LB培养液培养一段时间;涂布含氨苄青霉素、IPTG及X-gal的LB培养基上,倒置放在37℃恒温培养箱中过夜;挑取白色单克隆菌落于LB培养液中过夜培养,收集菌体提取质粒;质粒酶切后,测序验证T315I突变型和野生型的单克隆菌落。确定好T315I突变型和野生型单克隆菌落后,扩大培养,大量提取质粒DNA,用于后续实验。
2、COLD-PCR结合二代测序的方法和传统PCR+二代测序的方法检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变
(1)构建好的T315I突变质粒DNA,与野生型DNA按比例混合,将突变比例梯度稀释为5%、2%、1%、0.5%、0.2%。
(2)分别采用COLD-PCR和传统PCR扩增ABL激酶区片段。
COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR),即低温变性共扩增PCR技术,原理如下:双链DNA合成时,由于单个核苷酸的错配,使得这段序列的熔点温度(Tc)变化0.2~15℃甚至更高。
在PCR过程中设置特殊的复性温度可特异性扩增突变型模板,呈指数型扩增;而RS-Oligo可特异性结合野生型模板,使其线性扩增。从而达到封闭野生型模板,利用Tc温度富集少量突变基因的目的。
1)COLD-PCR引物序列为:
ABL-F:CGCAACAAGCCCACTGTCT SEQ ID NO:4
ABL-R:TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT SEQ ID NO:3
RS-Oligo:CAGCTCCTTTTCCACTTCGTCT SEQ ID NO:5
COLD-PCR扩增ABL激酶区反应体系参见表15。COLD-PCR扩增ABL激酶区程序参见表16。
2)传统PCR扩增引物序列为:
ABL-F:CGCAACAAGCCCACTGTCT SEQ ID NO:4
ABL-R:TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT SEQ ID NO:3
传统PCR扩增ABL激酶区反应体系见表25。
表25
成分 | 加入量(μl) |
LA Taq酶 | 0.5 |
10×LA PCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 5 |
dNTP Mixture | 2 |
ABL-F/R引物 | 1 |
第一轮PCR产物 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 40.5 |
总体积 | 50 |
传统PCR扩增ABL激酶区程序见表26:
表26
(3)Nextera XT法构建文库;步骤同实施例1所述。
(4)Illumina Miseq测序仪上机测序。
所用试剂包括:RNA提取液:红细胞裂解液、Trizol、氯仿、无水乙醇;逆转录试剂:SuperScript II Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific);检测体系PCR反应液;文库构建反应液;Miseq平台测序反应液;阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
构建好文库后,将文库混合制备模板,然后上机测序。
表27传统PCR结合二代测序检测结果
表28COLD-PCR结合二代测序检测结果
突变比例 | 5% | 2% | 1% | 0.50% | 0.20% |
检测到的频率 | 0.672 | 0.518 | 0.535 | 0.62 | 0.467 |
测序深度 | 7388 | 5099 | 3425 | 10026 | 26504 |
在该实施例中,两种方法相比较,COLD-PCR结合二代测序优势在于:
第一、可以检测到低至0.2%的突变比例的T315I突变,而传统PCR扩增产物用二代测序只检测到了突变率高于0.5%的突变;
第二、检测同样的突变比例的样本,COLD-PCR结合二代测序的方法能降低野生型DNA的背景,富集频率较低的突变型DNA,从而相对提高检测到的突变频率;
第三、检测同样的突变比例的样本,该方法所需的测序深度较传统PCR+二代测序的测序深度低,因此测序成本更低。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉康圣达医学检验所有限公司
<120> 一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法
<130> KHP181116080.6
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaccaactc gtgtgtgaaa ctc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgcatgtt ccgggacaaa ag 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccacttcgt ctgagatact ggatt 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcaacaagc ccactgtct 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagctccttt tccacttcgt ct 22
Claims (10)
1.一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法,其特征在于,从外周血或骨髓样本中提取RNA,随机引物逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,在同一反应体系中扩增待测样品中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr,以扩增产物为模板,COLD-PCR扩增ABL激酶区,构建文库,文库混合制备模板后上机测序。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述在同一反应体系中扩增待测样品中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr的方法为:以cDNA为模板,以SEQ ID NO.1-3所示序列为引物,进行PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,SEQ ID NO.1、2、3所示序列的引物在PCR反应体系中初始物质的量比例为1:1:2。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于,BCR-ABL融合基因扩增程序为:
95℃,10min;
95℃30s,退火温度65℃,30s,72℃75s,共20个循环,每个循环退火温度降低0.5℃;
95℃30s,55℃30s,72℃75s,共25个循环;
72℃8min。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于,所述COLD-PCR扩增ABL激酶区的方法为:以BCR-ABL融合基因的扩增产物为模板,以SEQ ID NO.3-5所示的核苷酸序列为引物,进行COLD-PCR扩增。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,COLD-PCR扩增程序为:
95℃,2min;
95℃10s,63℃30s,72℃10s,共5个循环;
95℃10s,69℃30s,73℃30s,63℃30s,72℃10s,共5个循环;其中73℃自首个循环起,每个循环升高0.2℃;
95℃10s,69℃30s,74℃30s,63℃30s,72℃10s,共45个循环;72℃5min。
7.一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的试剂盒,其特征在于,含有SEQ ID NO.5所述的引物。
8.一种利用权利要求1-6任一所述的方法进行工作的用于检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的试剂盒。
9.一种适用于检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的引物组合,其特征在于,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示。
10.一种寡核苷酸,其特征在于,其如SEQ ID NO.5所示。
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