JPH1057078A - トラコーマクラミジア核酸の増幅および検出 - Google Patents
トラコーマクラミジア核酸の増幅および検出Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 トラコーマクラミジア（C.trachomatis）核
酸を増幅し且つ検出すること。 【解決手段】 トラコーマクラミジアの潜在プラスミド
中の標的配列の種特異的検出のための検定において有用
な増幅プライマーを記載する。本発明のプライマーは、
潜在プラスミド配列のヌクレオチド２２１９−２３６６
の部分の標的を増幅し、そして開示された標的結合配列
は、種々の増幅反応の増幅プライマー中で用いるのに適
応しうる。
酸を増幅し且つ検出すること。 【解決手段】 トラコーマクラミジアの潜在プラスミド
中の標的配列の種特異的検出のための検定において有用
な増幅プライマーを記載する。本発明のプライマーは、
潜在プラスミド配列のヌクレオチド２２１９−２３６６
の部分の標的を増幅し、そして開示された標的結合配列
は、種々の増幅反応の増幅プライマー中で用いるのに適
応しうる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸増幅を用いる
微生物の検出および／または識別を含めた核酸増幅に関
する。
微生物の検出および／または識別を含めた核酸増幅に関
する。
【０００２】
【従来の技術】トラコーマクラミジア（Chlamydia trac
homatis）は、米国において男性および女性両方の尿生
殖器感染の主因である。クラミジア属の in vivo 診断
はマッコイ（McCoy）細胞単層上での培養を必要とし、
それは大変な作業であり且つ約４８〜７２時間を要す
る。いくつかのより迅速な試験は、直接蛍光抗体染色
（ＤＦＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）および酵素結合
イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）による抗原検出
に基いて開発されてきた。クラミジア属の直接検出のた
めのプローブハイブリダイゼーション検定法（ＰＡＣＥ
２，ジェンプローブ（GenProbe），ワレン（Warren）
ら，1993年，J.Clin.Microbiol.31:1663-1666 を参照さ
れたい）も開発されてきた。これらの現在利用可能な試
験の大部分は、女性の子宮頸管内スワブおよび男性の尿
道スワブを必要とする。しかしながら、ＰＣＲ、ＬＣＲ
およびＳＤＡなどのＤＮＡ増幅技術は、尿のようなあま
り煩わしくない臨床検体を用いてクラミジア属を検出す
る高感度の代替法を提供する可能性がある。ドメイカ
（Domeika）ら（1994年，J.Clin.Microbiol.32:2350-23
52）、ボーウェンズ（Bauwens）ら（1993年，J.Clin.Mi
crobiol.31:3013-3106）および米国特許第5,232,829号
明細書は、ＰＣＲに続いて微量滴定プレートハイブリダ
イゼーション検出を用いるトラコーマクラミジアＤＮＡ
の増幅を報告している。ＬＣＲに続いて微粒子サンドイ
ッチ免疫検定検出を用いる増幅試験も報告された（チェ
ルネスキ（Chernesky）ら，1994年，J.Clin.Microbiol.
32:2682-2685，リー（Lee）ら，1995年，Lancet 345:21
3-216，バシリ（Bassiri）ら，1995年，J.Clin.Microbi
ol.33:898-900）。現在、これらの試験は完了するのに
４〜６時間を要する。
homatis）は、米国において男性および女性両方の尿生
殖器感染の主因である。クラミジア属の in vivo 診断
はマッコイ（McCoy）細胞単層上での培養を必要とし、
それは大変な作業であり且つ約４８〜７２時間を要す
る。いくつかのより迅速な試験は、直接蛍光抗体染色
（ＤＦＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）および酵素結合
イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）による抗原検出
に基いて開発されてきた。クラミジア属の直接検出のた
めのプローブハイブリダイゼーション検定法（ＰＡＣＥ
２，ジェンプローブ（GenProbe），ワレン（Warren）
ら，1993年，J.Clin.Microbiol.31:1663-1666 を参照さ
れたい）も開発されてきた。これらの現在利用可能な試
験の大部分は、女性の子宮頸管内スワブおよび男性の尿
道スワブを必要とする。しかしながら、ＰＣＲ、ＬＣＲ
およびＳＤＡなどのＤＮＡ増幅技術は、尿のようなあま
り煩わしくない臨床検体を用いてクラミジア属を検出す
る高感度の代替法を提供する可能性がある。ドメイカ
（Domeika）ら（1994年，J.Clin.Microbiol.32:2350-23
52）、ボーウェンズ（Bauwens）ら（1993年，J.Clin.Mi
crobiol.31:3013-3106）および米国特許第5,232,829号
明細書は、ＰＣＲに続いて微量滴定プレートハイブリダ
イゼーション検出を用いるトラコーマクラミジアＤＮＡ
の増幅を報告している。ＬＣＲに続いて微粒子サンドイ
ッチ免疫検定検出を用いる増幅試験も報告された（チェ
ルネスキ（Chernesky）ら，1994年，J.Clin.Microbiol.
32:2682-2685，リー（Lee）ら，1995年，Lancet 345:21
3-216，バシリ（Bassiri）ら，1995年，J.Clin.Microbi
ol.33:898-900）。現在、これらの試験は完了するのに
４〜６時間を要する。
【０００３】トラコーマクラミジアの潜在プラスミド
は、この微生物に対して特異的である７．４ｋｂプラス
ミドである。それはゲノム当量につき約１０コピーで存
在し、そしてハイブリダイゼーションプローブとして用
いられた場合、トラコーマクラミジアの２００種類全部
の臨床的菌株を検出する（パルマー（Palmer）およびフ
ァルコウ（Falkow），1986年，Plasmid 16:52-62）。ハ
ット（Hatt）ら（1988年，Nucl.Acids Res.16:4053-406
7）は、Ｌ１血液型亜型の潜在プラスミドの配列を報告
しており、欧州特許第0499681号明細書には、血細型Ｄ
の潜在プラスミドの配列が記載されている。トラコーマ
クラミジアの潜在プラスミドの配列Ｌ２／４３４／Ｂｕ
は、欧州特許第0336412号明細書で示され、この潜在プ
ラスミド配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブも
記載されている。米国特許第5,232,829号明細書で記載
されたプレート捕捉検定の一つの実施態様は、潜在プラ
スミド標的配列の検出に関する。二つの増幅プライマー
セットが記載されており、１９５−２１９位および３７
７−４０２位でハイブリッド形成するプライマーを用い
て２０８塩基対アンプリコンを生じる一つと、６７８−
７００位および８２７−８５０位に対してハイブリッド
形成するプライマーを用いて１７３塩基対アンプリコン
を生じるもう一つである。一つの例において、ＷＯ93/0
0447号明細書は、クラミジア属標的配列の検出のための
ギャップフィリングＬＣＲを記載している。用いられる
オリゴヌクレオチドは、ハットら、上記の地図位置６６
９３．１、６６９３．２、６６９３．３および６６９
４．４に基づいている。
は、この微生物に対して特異的である７．４ｋｂプラス
ミドである。それはゲノム当量につき約１０コピーで存
在し、そしてハイブリダイゼーションプローブとして用
いられた場合、トラコーマクラミジアの２００種類全部
の臨床的菌株を検出する（パルマー（Palmer）およびフ
ァルコウ（Falkow），1986年，Plasmid 16:52-62）。ハ
ット（Hatt）ら（1988年，Nucl.Acids Res.16:4053-406
7）は、Ｌ１血液型亜型の潜在プラスミドの配列を報告
しており、欧州特許第0499681号明細書には、血細型Ｄ
の潜在プラスミドの配列が記載されている。トラコーマ
クラミジアの潜在プラスミドの配列Ｌ２／４３４／Ｂｕ
は、欧州特許第0336412号明細書で示され、この潜在プ
ラスミド配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブも
記載されている。米国特許第5,232,829号明細書で記載
されたプレート捕捉検定の一つの実施態様は、潜在プラ
スミド標的配列の検出に関する。二つの増幅プライマー
セットが記載されており、１９５−２１９位および３７
７−４０２位でハイブリッド形成するプライマーを用い
て２０８塩基対アンプリコンを生じる一つと、６７８−
７００位および８２７−８５０位に対してハイブリッド
形成するプライマーを用いて１７３塩基対アンプリコン
を生じるもう一つである。一つの例において、ＷＯ93/0
0447号明細書は、クラミジア属標的配列の検出のための
ギャップフィリングＬＣＲを記載している。用いられる
オリゴヌクレオチドは、ハットら、上記の地図位置６６
９３．１、６６９３．２、６６９３．３および６６９
４．４に基づいている。
【０００４】下記の用語を、本明細書中において次のよ
うに定義する。
うに定義する。
【０００５】増幅プライマーは、標的配列に対するハイ
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ増幅プライ
マーの３′末端（標的結合配列）は、標的配列の３′末
端でハイブリッド形成する。標的結合配列は約１０〜２
５ヌクレオチド長さであり且つ増幅プライマーに対して
ハイブリダイゼーション特異性を与える。ＳＤＡ増幅プ
ライマーは、更に、標的結合配列に対して５′に制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位を含む。その認識部位は、
Ｇ．ウォーカーら（1992年，PNAS 89:392-396 および 1
992年，Nucl.Acids Res.20:1691-1696）によって記載さ
れたように、認識部位が半修飾されている場合にＤＮＡ
二重らせんの一方の鎖にニックを入れるであろう制限エ
ンドヌクレアーゼに対する。制限エンドヌクレアーゼ認
識部位に対して５′の約１０〜２５ヌクレオチド（「尾
部」）は、増幅プライマーの残りの部分がＳＤＡの際に
ニックを入れられ且つ置換される場合、ポリメラーゼリ
プライミング部位として機能する。尾部ヌクレオチドの
リプライミング機能は、ＳＤＡ反応を持続し且つ一つの
標的分子からの多数のアンプリコンの合成を可能にす
る。尾部の配列は、概して臨界的ではなく、そして常套
手段によって選択され且つ修飾されて、ハイブリダイゼ
ーションに望ましいＴmを得ることができる。標的結合
配列は、その標的特異性を決定するプライマーの一部分
であるので、標的の末端に特殊な配列を必要としない増
幅法に対して、増幅プライマーは、概して、本質的に標
的結合配列だけから成る。標的に対して付加されるニッ
キング可能な制限部位およびＳＤＡのプライマー尾部以
外の特殊な配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転
写に基く増幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）を必要とする増幅法に対して、必要とされる特殊な
配列を、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を
変更することなく、オリゴヌクレオチドの製造のための
常套法を用いて標的結合配列に対して結合させることが
できる。
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ増幅プライ
マーの３′末端（標的結合配列）は、標的配列の３′末
端でハイブリッド形成する。標的結合配列は約１０〜２
５ヌクレオチド長さであり且つ増幅プライマーに対して
ハイブリダイゼーション特異性を与える。ＳＤＡ増幅プ
ライマーは、更に、標的結合配列に対して５′に制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位を含む。その認識部位は、
Ｇ．ウォーカーら（1992年，PNAS 89:392-396 および 1
992年，Nucl.Acids Res.20:1691-1696）によって記載さ
れたように、認識部位が半修飾されている場合にＤＮＡ
二重らせんの一方の鎖にニックを入れるであろう制限エ
ンドヌクレアーゼに対する。制限エンドヌクレアーゼ認
識部位に対して５′の約１０〜２５ヌクレオチド（「尾
部」）は、増幅プライマーの残りの部分がＳＤＡの際に
ニックを入れられ且つ置換される場合、ポリメラーゼリ
プライミング部位として機能する。尾部ヌクレオチドの
リプライミング機能は、ＳＤＡ反応を持続し且つ一つの
標的分子からの多数のアンプリコンの合成を可能にす
る。尾部の配列は、概して臨界的ではなく、そして常套
手段によって選択され且つ修飾されて、ハイブリダイゼ
ーションに望ましいＴmを得ることができる。標的結合
配列は、その標的特異性を決定するプライマーの一部分
であるので、標的の末端に特殊な配列を必要としない増
幅法に対して、増幅プライマーは、概して、本質的に標
的結合配列だけから成る。標的に対して付加されるニッ
キング可能な制限部位およびＳＤＡのプライマー尾部以
外の特殊な配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転
写に基く増幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）を必要とする増幅法に対して、必要とされる特殊な
配列を、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を
変更することなく、オリゴヌクレオチドの製造のための
常套法を用いて標的結合配列に対して結合させることが
できる。
【０００６】バンパープライマーすなわち外プライマー
は、等温増幅反応においてプライマー伸長生成物を置換
するのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。
は、等温増幅反応においてプライマー伸長生成物を置換
するのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。
【０００７】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れる核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核
酸配列およびその相補的第二鎖並びに増幅反応によって
生じる元の配列のコピーのどちらかの鎖を包含する。
れる核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核
酸配列およびその相補的第二鎖並びに増幅反応によって
生じる元の配列のコピーのどちらかの鎖を包含する。
【０００８】増幅反応中に生じる標的配列のコピーは、
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
【０００９】伸長生成物という用語は、プライマーのハ
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として用い
るポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生じた
標的配列のコピーを意味する。
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として用い
るポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生じた
標的配列のコピーを意味する。
【００１０】種特異的という用語は、同属の他の種また
は異なる属の種における実質的な検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含まない、微
生物の種または関連種の属における検出、増幅またはオ
リゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを意味する。
トラコーマクラミジア種特異的検出、増幅またはハイブ
リダイゼーションは、トラコーマクラミジアに対する種
特異性を意味する。
は異なる属の種における実質的な検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含まない、微
生物の種または関連種の属における検出、増幅またはオ
リゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを意味する。
トラコーマクラミジア種特異的検出、増幅またはハイブ
リダイゼーションは、トラコーマクラミジアに対する種
特異性を意味する。
【００１１】検定プローブという用語は、核酸の検出ま
たは識別を容易にするのに用いられる任意のオリゴヌク
レオチドを意味する。例えば、本発明において、検定プ
ローブは、トラコーマクラミジア核酸の検出または識別
のために、直接的にかまたは増幅後に用いられる。検出
用プローブ、捕捉プローブおよびシグナルプライマーは
検定プローブの例である。
たは識別を容易にするのに用いられる任意のオリゴヌク
レオチドを意味する。例えば、本発明において、検定プ
ローブは、トラコーマクラミジア核酸の検出または識別
のために、直接的にかまたは増幅後に用いられる。検出
用プローブ、捕捉プローブおよびシグナルプライマーは
検定プローブの例である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】トラコーマクラミジア
の潜在プラスミド中の標的配列の種特異的検出用のプラ
イマーを記載する。本発明の増幅プライマーは、潜在プ
ラスミド配列のヌクレオチド２２１９−２３６６の部分
の標的を増幅する。好ましい増幅プライマーは、ＳＤＡ
に必要な特殊な配列を含むが、しかしながら、同様の特
異性を有する増幅プライマーは、開示された標的結合配
列および、場合により、ある選択された反応に必要な他
の配列を用いて構築することができる。
の潜在プラスミド中の標的配列の種特異的検出用のプラ
イマーを記載する。本発明の増幅プライマーは、潜在プ
ラスミド配列のヌクレオチド２２１９−２３６６の部分
の標的を増幅する。好ましい増幅プライマーは、ＳＤＡ
に必要な特殊な配列を含むが、しかしながら、同様の特
異性を有する増幅プライマーは、開示された標的結合配
列および、場合により、ある選択された反応に必要な他
の配列を用いて構築することができる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】増幅プライマーにおいて
用いるのに可能な標的結合配列を識別するために、トラ
コーマクラミジア（ジェンバンク（GenBank）受託＃Ｘ
０６７０７）の潜在プラスミドのヌクレオチド配列を、
ＧＣ含量が低く且つ３個連続したＣまたはＧの列を含ま
ない読み取り枠について分析した。ヌクレオチド２２１
９−２３６６の部分の可能な標的（例示されたＳＤＡ反
応におけるバンパー−バンパー）は、これらの判定基準
（ＧＣ含量約３４％）によって識別された。３種類の上
流増幅プライマー（配列番号：１〜３）および２種類の
下流増幅プライマー（配列番号：４〜５）の標的結合配
列を選択し、そしてこれらの標的結合配列を含むＳＤＡ
用増幅プライマーを慣用法によって合成した。増幅プラ
イマーを以下に示すが、標的結合配列はイタリック体で
示され且つニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認
識部位は太字で示される。
用いるのに可能な標的結合配列を識別するために、トラ
コーマクラミジア（ジェンバンク（GenBank）受託＃Ｘ
０６７０７）の潜在プラスミドのヌクレオチド配列を、
ＧＣ含量が低く且つ３個連続したＣまたはＧの列を含ま
ない読み取り枠について分析した。ヌクレオチド２２１
９−２３６６の部分の可能な標的（例示されたＳＤＡ反
応におけるバンパー−バンパー）は、これらの判定基準
（ＧＣ含量約３４％）によって識別された。３種類の上
流増幅プライマー（配列番号：１〜３）および２種類の
下流増幅プライマー（配列番号：４〜５）の標的結合配
列を選択し、そしてこれらの標的結合配列を含むＳＤＡ
用増幅プライマーを慣用法によって合成した。増幅プラ
イマーを以下に示すが、標的結合配列はイタリック体で
示され且つニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認
識部位は太字で示される。
【００１４】
【化１】 ＳＤＡでの試験用に、上流および下流増幅プライマーの
全ての対ごとの組合わせに有用な１対のバンパープライ
マーを更に設計した。
全ての対ごとの組合わせに有用な１対のバンパープライ
マーを更に設計した。
【００１５】
【化２】 増幅生成物の検出用に、上流および下流増幅プライマー
の全ての対の組合わせの増幅生成物に対してハイブリッ
ド形成した検出用プローブを選択した。
の全ての対の組合わせの増幅生成物に対してハイブリッ
ド形成した検出用プローブを選択した。
【００１６】
【化３】 増幅プライマーの標的結合配列は、トラコーマクラミジ
アにハイブリダイゼーション特異性を与え、したがっ
て、検定の種特異性を提供する。例として、上記に挙げ
られた増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニックを入れ
られる制限エンドヌクレアーゼＢｏｓＢＩの認識部位を
含む。限定されるものではないが欧州特許第0684315号
明細書で開示された認識部位を含めた他のニッキング可
能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢＩ認
識部位の代わりに置換しうることは当業者に明らかであ
ろう。好ましくは、認識部位は好熱性制限エンドヌクレ
アーゼに対するので、増幅反応は最適温度条件下で行う
ことができる。同様に、増幅プライマーの尾部配列（制
限エンドヌクレアーゼ認識部位に対して５′）は、概し
て臨界的ではないが、ＳＤＡに用いられる制限部位の包
含を避けることおよびそれら自体の標的結合配列に対し
てかまたは他のプライマーに対してハイブリッド形成す
るであろう配列を避けることは重要である。したがっ
て、本発明によるＳＤＡのための増幅プライマーは、上
記で示された３′標的結合配列、該標的結合配列に対し
て５′のニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識
部位、および該制限エンドヌクレアーゼ認識部位に対し
て５′の約１０〜２５ヌクレオチド長さの尾部配列から
成る。尾部の長さは、選択された配列のＴm に依り、そ
して十分なハイブリダイゼーションを得るように当業者
によって容易に調整されうる。尾部配列および制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位は、ＳＤＡによる増幅に必要な
配列である。本発明による増幅プライマーの他の実施態
様は、（１）選択された増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に
よって更に別の特殊な配列が必要とされない場合の標的
結合配列単独、または（２）標的結合配列および増幅反
応に必要な更に別の配列（例えば、３ＳＲまたはＮＡＳ
ＢＡによる増幅に必要なＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）から成る。
アにハイブリダイゼーション特異性を与え、したがっ
て、検定の種特異性を提供する。例として、上記に挙げ
られた増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニックを入れ
られる制限エンドヌクレアーゼＢｏｓＢＩの認識部位を
含む。限定されるものではないが欧州特許第0684315号
明細書で開示された認識部位を含めた他のニッキング可
能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢＩ認
識部位の代わりに置換しうることは当業者に明らかであ
ろう。好ましくは、認識部位は好熱性制限エンドヌクレ
アーゼに対するので、増幅反応は最適温度条件下で行う
ことができる。同様に、増幅プライマーの尾部配列（制
限エンドヌクレアーゼ認識部位に対して５′）は、概し
て臨界的ではないが、ＳＤＡに用いられる制限部位の包
含を避けることおよびそれら自体の標的結合配列に対し
てかまたは他のプライマーに対してハイブリッド形成す
るであろう配列を避けることは重要である。したがっ
て、本発明によるＳＤＡのための増幅プライマーは、上
記で示された３′標的結合配列、該標的結合配列に対し
て５′のニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識
部位、および該制限エンドヌクレアーゼ認識部位に対し
て５′の約１０〜２５ヌクレオチド長さの尾部配列から
成る。尾部の長さは、選択された配列のＴm に依り、そ
して十分なハイブリダイゼーションを得るように当業者
によって容易に調整されうる。尾部配列および制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位は、ＳＤＡによる増幅に必要な
配列である。本発明による増幅プライマーの他の実施態
様は、（１）選択された増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に
よって更に別の特殊な配列が必要とされない場合の標的
結合配列単独、または（２）標的結合配列および増幅反
応に必要な更に別の配列（例えば、３ＳＲまたはＮＡＳ
ＢＡによる増幅に必要なＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）から成る。
【００１７】増幅生成物は、検定プローブに対するハイ
ブリダイゼーションによって検出されうる。検定プロー
ブは、増幅生成物に対してハイブリッド形成した場合に
その検出を容易にするように検出可能な標識によって標
識されうる。検出可能な標識は、それが合成された後に
プローブに対して結合することができるしまたはそれを
合成の際にプローブ中に、例えば、標識で誘導体化され
たヌクレオチドの形で包含させることができる。このよ
うな標識は当該技術分野において知られており、直接的
に且つ間接的に検出可能な標識が含まれる。直接的に検
出可能な標識は、更に化学反応を伴うことなくシグナル
を生じ、蛍光色素、放射性同位体および色素のような標
識が含まれる。間接的に検出可能な標識は、検出可能な
シグナルを生じる更に別の化学反応または試薬の添加を
必要とする。これらには、例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼなどの酵素、
標識に結合したアビジンに対して結合することによって
検出されるビオチンなどのリガンド、および化学発光分
子が含まれる。検定プローブは、それらのそれぞれの増
幅生成物に対して溶液中で、ゲル上でまたは固体支持体
上でハイブリッド形成することができる。ハイブリダイ
ゼーション後、結合した標識からシグナルを生じさせ、
検出し、そして場合により、選択された標識およびハイ
ブリダイゼーションプロトコルに適当な方法を用いて定
量する。それぞれの増幅生成物に対して検出されたシグ
ナルの量は、存在する増幅生成物の相対量を示すのに用
いることができる。リガンド標識もまた、固相（捕捉プ
ローブ）上のハイブリッドの捕捉を容易にするように検
定プローブ上で用いることができる。
ブリダイゼーションによって検出されうる。検定プロー
ブは、増幅生成物に対してハイブリッド形成した場合に
その検出を容易にするように検出可能な標識によって標
識されうる。検出可能な標識は、それが合成された後に
プローブに対して結合することができるしまたはそれを
合成の際にプローブ中に、例えば、標識で誘導体化され
たヌクレオチドの形で包含させることができる。このよ
うな標識は当該技術分野において知られており、直接的
に且つ間接的に検出可能な標識が含まれる。直接的に検
出可能な標識は、更に化学反応を伴うことなくシグナル
を生じ、蛍光色素、放射性同位体および色素のような標
識が含まれる。間接的に検出可能な標識は、検出可能な
シグナルを生じる更に別の化学反応または試薬の添加を
必要とする。これらには、例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼなどの酵素、
標識に結合したアビジンに対して結合することによって
検出されるビオチンなどのリガンド、および化学発光分
子が含まれる。検定プローブは、それらのそれぞれの増
幅生成物に対して溶液中で、ゲル上でまたは固体支持体
上でハイブリッド形成することができる。ハイブリダイ
ゼーション後、結合した標識からシグナルを生じさせ、
検出し、そして場合により、選択された標識およびハイ
ブリダイゼーションプロトコルに適当な方法を用いて定
量する。それぞれの増幅生成物に対して検出されたシグ
ナルの量は、存在する増幅生成物の相対量を示すのに用
いることができる。リガンド標識もまた、固相（捕捉プ
ローブ）上のハイブリッドの捕捉を容易にするように検
定プローブ上で用いることができる。
【００１８】増幅生成物を検出する別の方法は、標的配
列に対して特異的にハイブリッド形成したプライマーの
ポリメラーゼ伸長による。そのプライマーは、上記のよ
うに、例えば、放射性同位体によって標識され、その結
果、プライマーの標識は、伸長された反応生成物中に包
含される。この方法は、ウォーカーら（1992年）Nuc.Ac
ids Res.および PNAS、上記によって記載されている。
増幅した標的および対照配列を検出するもう一つの方法
は、米国特許第5,470,723号明細書で記載のように、ビ
オチニル化された捕捉プローブおよび酵素結合した検出
用プローブを用いて増幅生成物を検出する化学発光法で
ある。標的配列の検定範囲中の異なる部位に対するこれ
ら二つの検定プローブのハイブリダイゼーション後、複
合体を、ストレプトアビジンで被覆された微量滴定プレ
ート上に捕捉し、そして化学発光シグナルを生じさせ且
つルミノメーターで読み取る。増幅生成物の検出のため
のもう一つ代わるものとして、欧州特許第0678582号明
細書で記載のシグナルプライマー（本質的に、ポリメラ
ーゼによって伸長され、置換され、そして標的増幅依存
方式で二本鎖にされる検出用プローブ）をＳＤＡ反応中
に包含させることができる。この実施態様において、標
識された二次増幅生成物は、標的増幅依存方式でＳＤＡ
中に生じ、そして標的増幅を示すものとして検出されう
る。
列に対して特異的にハイブリッド形成したプライマーの
ポリメラーゼ伸長による。そのプライマーは、上記のよ
うに、例えば、放射性同位体によって標識され、その結
果、プライマーの標識は、伸長された反応生成物中に包
含される。この方法は、ウォーカーら（1992年）Nuc.Ac
ids Res.および PNAS、上記によって記載されている。
増幅した標的および対照配列を検出するもう一つの方法
は、米国特許第5,470,723号明細書で記載のように、ビ
オチニル化された捕捉プローブおよび酵素結合した検出
用プローブを用いて増幅生成物を検出する化学発光法で
ある。標的配列の検定範囲中の異なる部位に対するこれ
ら二つの検定プローブのハイブリダイゼーション後、複
合体を、ストレプトアビジンで被覆された微量滴定プレ
ート上に捕捉し、そして化学発光シグナルを生じさせ且
つルミノメーターで読み取る。増幅生成物の検出のため
のもう一つ代わるものとして、欧州特許第0678582号明
細書で記載のシグナルプライマー（本質的に、ポリメラ
ーゼによって伸長され、置換され、そして標的増幅依存
方式で二本鎖にされる検出用プローブ）をＳＤＡ反応中
に包含させることができる。この実施態様において、標
識された二次増幅生成物は、標的増幅依存方式でＳＤＡ
中に生じ、そして標的増幅を示すものとして検出されう
る。
【００１９】本発明のプライマーを用いるＳＤＡ反応
は、ウォーカーら、上記によって教示されたようにチミ
ンを包含することができるし、またはそれらは、欧州特
許第0624643号明細書で教示されたように、反応におい
てＴＴＰの代わりに２′−デオキシウリジン５′−三リ
ン酸を全体的に若しくは部分的に置換えて、引き続きの
ＳＤＡ反応の交差汚染を減少させることができる。ｄＵ
（ウリジン）は、標的および対照配列双方の増幅生成物
中に包含され、そしてウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
（ＵＤＧ）による処理によって切除されうる。これらの
非塩基部位は、引き続きのＳＤＡ反応において増幅生成
物を増幅不能にする。ＵＤＧは、引き続きの増幅を行う
前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）に
よって失活されて、新たに生成された増幅生成物中のｄ
Ｕの切除を妨げることができる。
は、ウォーカーら、上記によって教示されたようにチミ
ンを包含することができるし、またはそれらは、欧州特
許第0624643号明細書で教示されたように、反応におい
てＴＴＰの代わりに２′−デオキシウリジン５′−三リ
ン酸を全体的に若しくは部分的に置換えて、引き続きの
ＳＤＡ反応の交差汚染を減少させることができる。ｄＵ
（ウリジン）は、標的および対照配列双方の増幅生成物
中に包含され、そしてウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
（ＵＤＧ）による処理によって切除されうる。これらの
非塩基部位は、引き続きのＳＤＡ反応において増幅生成
物を増幅不能にする。ＵＤＧは、引き続きの増幅を行う
前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）に
よって失活されて、新たに生成された増幅生成物中のｄ
Ｕの切除を妨げることができる。
【００２０】本発明の検定法を行うためのプライマーお
よび／またはプローブは、トラコーマクラミジアＤＮＡ
の種特異的増幅または検出のための診断用キットの形で
包装されることができる。増幅用キットは、トラコーマ
クラミジア標的配列の増幅のための記載された標的結合
配列を含む増幅プライマーおよび、場合により、選択さ
れた増幅反応を行うのに必要な試薬（例えば、デオキシ
ヌクレオシド三リン酸、酵素、緩衝液、ポリメラーゼ、
追加のプライマー等）を含むことができる。標的配列増
幅用キットは、場合により、増幅されたトラコーマクラ
ミジア標的配列を検出するまたは識別するのに有用な検
定プローブ、および／または米国特許第5,457,027号明
細書で記載のように標的配列と一緒に同時増幅される内
部対照配列を更に含むことができる。増幅された標的の
検出用の検定プローブは、本明細書中に記載の検出可能
な標識を含むことができ、そして場合により、そのキッ
トは、検定プローブのハイブリダイゼーションおよび／
または検出のための試薬を含むことができる。
よび／またはプローブは、トラコーマクラミジアＤＮＡ
の種特異的増幅または検出のための診断用キットの形で
包装されることができる。増幅用キットは、トラコーマ
クラミジア標的配列の増幅のための記載された標的結合
配列を含む増幅プライマーおよび、場合により、選択さ
れた増幅反応を行うのに必要な試薬（例えば、デオキシ
ヌクレオシド三リン酸、酵素、緩衝液、ポリメラーゼ、
追加のプライマー等）を含むことができる。標的配列増
幅用キットは、場合により、増幅されたトラコーマクラ
ミジア標的配列を検出するまたは識別するのに有用な検
定プローブ、および／または米国特許第5,457,027号明
細書で記載のように標的配列と一緒に同時増幅される内
部対照配列を更に含むことができる。増幅された標的の
検出用の検定プローブは、本明細書中に記載の検出可能
な標識を含むことができ、そして場合により、そのキッ
トは、検定プローブのハイブリダイゼーションおよび／
または検出のための試薬を含むことができる。
【００２１】
実施例１ 上記の上流および下流増幅プライマーの６対の組合わせ
を、本質的には欧州特許第0684315号明細書で記載のよ
うに、ｔＳＤＡ反応で試験した。増幅反応５０μｌは、
５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴ
ＰおよびＴＴＰ、１．４ｍＭ α−チオ−ｄＣＴＰ、ヒ
ト胎盤ＤＮＡ １０ｎｇ／μｌ、３５ｍＭ ＫiＰＯ4
ｐＨ７．６、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５μ
Ｍの配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３、
０．５μＭの配列番号：４または配列番号：５、０．０
５μＭの配列番号：６および配列番号：７、３．２単位
／μｌ ＢｓｏＢＩ（ニューイングランド・バイオラブ
ズ（New England BioLabs））、０．１２５単位／μｌ
エキソヌクレアーゼ欠失Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ
（モレキュラー・バイオロジー・リソーシズ（Molecula
r Biology Resources））、およびトラコーマクラミジ
ア基本体（ＥＢ）１０5または１０3個を含んだ。Ｂｓｏ
ＢＩ、ＢｓｔポリメラーゼおよびＭｇＣｌ2を加える前
に、反応を９５℃で５分間加熱して標的ＤＮＡを変性さ
せた。標的を変性した後、試料を５３．５℃で５分間平
衡させた。増幅は、酵素配合物（５０ｍＭ ＭｇＣｌ2
５μｌ、２５単位／μｌ Ｂｓｔポリメラーゼ ０．
５μｌ、１６０単位／μｌ ＢｓｏＢＩ １μｌおよび
１Ｘ ＮＥＢ２緩衝液３．５μｌ）１０μｌの添加によ
って開始した。５３．５℃で３０分間増幅後、それぞれ
の反応５μｌの増幅生成物について、32Ｐ標識された配
列番号：８のハイブリダイゼーションおよびウォーカー
ら（1992年，Nuc.Acids Res.，上記）によって記載のプ
ライマー伸長によって検定した。生成物を８％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてオート
ラジオグラフィーによって分析した。
を、本質的には欧州特許第0684315号明細書で記載のよ
うに、ｔＳＤＡ反応で試験した。増幅反応５０μｌは、
５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴ
ＰおよびＴＴＰ、１．４ｍＭ α−チオ−ｄＣＴＰ、ヒ
ト胎盤ＤＮＡ １０ｎｇ／μｌ、３５ｍＭ ＫiＰＯ4
ｐＨ７．６、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５μ
Ｍの配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３、
０．５μＭの配列番号：４または配列番号：５、０．０
５μＭの配列番号：６および配列番号：７、３．２単位
／μｌ ＢｓｏＢＩ（ニューイングランド・バイオラブ
ズ（New England BioLabs））、０．１２５単位／μｌ
エキソヌクレアーゼ欠失Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ
（モレキュラー・バイオロジー・リソーシズ（Molecula
r Biology Resources））、およびトラコーマクラミジ
ア基本体（ＥＢ）１０5または１０3個を含んだ。Ｂｓｏ
ＢＩ、ＢｓｔポリメラーゼおよびＭｇＣｌ2を加える前
に、反応を９５℃で５分間加熱して標的ＤＮＡを変性さ
せた。標的を変性した後、試料を５３．５℃で５分間平
衡させた。増幅は、酵素配合物（５０ｍＭ ＭｇＣｌ2
５μｌ、２５単位／μｌ Ｂｓｔポリメラーゼ ０．
５μｌ、１６０単位／μｌ ＢｓｏＢＩ １μｌおよび
１Ｘ ＮＥＢ２緩衝液３．５μｌ）１０μｌの添加によ
って開始した。５３．５℃で３０分間増幅後、それぞれ
の反応５μｌの増幅生成物について、32Ｐ標識された配
列番号：８のハイブリダイゼーションおよびウォーカー
ら（1992年，Nuc.Acids Res.，上記）によって記載のプ
ライマー伸長によって検定した。生成物を８％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてオート
ラジオグラフィーによって分析した。
【００２２】上流プライマーとして配列番号：１または
配列番号：３を含有する増幅プライマー対は全て、容易
に検出可能な増幅生成物を生じた。対照的に、上流プラ
イマーとして配列番号：２を含有するプライマー対は充
分に働かなかった。オートラジオグラフのバンドの定量
は、配列番号：２／配列番号：４プライマー対を用いた
１０5標的の増幅が、配列番号２を含まないプライマー
対を用いた増幅と比較して１５９倍減少し、そして１０
3標的の増幅が３１倍減少したことを示した。配列番
号：２／配列番号：５を用いる増幅は、１０5標的につ
いて７５倍減少し且つ１０3標的について約１４倍減少
した。この結果は、配列番号：２の配列が、増幅反応に
おいていずれも充分に働いた他の上流増幅プライマーと
オーバーラップしているので意外であった。しかしなが
ら、これらの結果に基づいて、配列番号：２を用いる増
幅は、臨床診断に有用であるにはあまりに感度が悪いと
結論された。
配列番号：３を含有する増幅プライマー対は全て、容易
に検出可能な増幅生成物を生じた。対照的に、上流プラ
イマーとして配列番号：２を含有するプライマー対は充
分に働かなかった。オートラジオグラフのバンドの定量
は、配列番号：２／配列番号：４プライマー対を用いた
１０5標的の増幅が、配列番号２を含まないプライマー
対を用いた増幅と比較して１５９倍減少し、そして１０
3標的の増幅が３１倍減少したことを示した。配列番
号：２／配列番号：５を用いる増幅は、１０5標的につ
いて７５倍減少し且つ１０3標的について約１４倍減少
した。この結果は、配列番号：２の配列が、増幅反応に
おいていずれも充分に働いた他の上流増幅プライマーと
オーバーラップしているので意外であった。しかしなが
ら、これらの結果に基づいて、配列番号：２を用いる増
幅は、臨床診断に有用であるにはあまりに感度が悪いと
結論された。
【００２３】実施例２ 配列番号：１および配列番号：４を、欧州特許第067858
2号明細書で記載のように、同時増幅および検出を用い
てＳＤＡ反応において更に最適化するためのプライマー
対として選択した。ＳＤＡは、１０ｎＭの32Ｐ標識され
た配列番号：８を増幅前にシグナルプライマーとして加
えたこと以外は実施例１の場合と同様に行われた。二次
増幅生成物は、実施例１の場合と同様にポリアクリルア
ミドゲル上で検出された。増幅効率の比較のために、Ｓ
ＤＡは、更に、実施例１の場合と同様に増幅後検出を用
いて行われた。増幅水準は、同時増幅／検出および増幅
後検出についてほぼ同等であり、増幅因子は約１Ｘ１０
10であった。
2号明細書で記載のように、同時増幅および検出を用い
てＳＤＡ反応において更に最適化するためのプライマー
対として選択した。ＳＤＡは、１０ｎＭの32Ｐ標識され
た配列番号：８を増幅前にシグナルプライマーとして加
えたこと以外は実施例１の場合と同様に行われた。二次
増幅生成物は、実施例１の場合と同様にポリアクリルア
ミドゲル上で検出された。増幅効率の比較のために、Ｓ
ＤＡは、更に、実施例１の場合と同様に増幅後検出を用
いて行われた。増幅水準は、同時増幅／検出および増幅
後検出についてほぼ同等であり、増幅因子は約１Ｘ１０
10であった。
【００２４】次に、配列番号：１および配列番号：４の
特異性および交差反応性について、同時増幅／検出ＳＤ
Ａ反応で試験した。以下の種からの標的ＤＮＡを試験し
た。トラコーマクラミジア血液型亜型Ａ、Ｂ、Ｂａ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ３；オウム病
クラミジア（C.psittaci）、淋菌（N.gonorrhea）、髄
膜炎菌（N.meningititis）、カンジダアルビカンス（C.
albicans）および大腸菌（E.coli）。試験されたトラコ
ーマクラミジア血液型亜型はいずれも（ＥＢ １０4個
／反応）、検出可能な増幅生成物を生じた。非トラコー
マクラミジア細菌からのＤＮＡを含有する反応のいずれ
においても（ＥＢ １０6個／反応）、バックグラウン
ドより高いシグナルは検出されなかった。
特異性および交差反応性について、同時増幅／検出ＳＤ
Ａ反応で試験した。以下の種からの標的ＤＮＡを試験し
た。トラコーマクラミジア血液型亜型Ａ、Ｂ、Ｂａ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ３；オウム病
クラミジア（C.psittaci）、淋菌（N.gonorrhea）、髄
膜炎菌（N.meningititis）、カンジダアルビカンス（C.
albicans）および大腸菌（E.coli）。試験されたトラコ
ーマクラミジア血液型亜型はいずれも（ＥＢ １０4個
／反応）、検出可能な増幅生成物を生じた。非トラコー
マクラミジア細菌からのＤＮＡを含有する反応のいずれ
においても（ＥＢ １０6個／反応）、バックグラウン
ドより高いシグナルは検出されなかった。
【００２５】実施例３ トラコーマクラミジア標的配列の検出の感度は、ウォー
カーら（1996年，Clin.Chem.42,9-13）によって記載の
蛍光偏光による増幅後検出と共にシグナルプライマーを
用いる検定において、配列番号：１および配列番号：４
を用いて試験された。配列番号：８を、シグナルプライ
マーとして用いるために５−（４，６−ジクロロトリア
ジン−２−イル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡ
Ｆ）によって標識し、そして増幅の前にＳＤＡに対して
加えた。増幅反応５０μｌは、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各
０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびＴＴＰ、１．４
ｍＭα−チオ−ｄＣＴＰ、非アセチル化ウシ血清アルブ
ミン２０μｇ／ｍｌ、ヒト胎盤ＤＮＡ １ｎｇ／μｌ、
４０ｍＭ ＫiＰＯ4 ｐＨ７．６、５％（ｖ／ｖ）グリ
セロール、３％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．７５μＭの配
列番号：１、０．１８７５μＭの配列番号：４、１０ｎ
Ｍの５−ＤＴＡＦ標識された配列番号：８、０．０７５
μＭの配列番号：６および配列番号：７、３．２単位／
μｌ ＢｓｏＢＩ、０．２５単位／μｌエキソヌクレア
ーゼ欠失Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、および種々の量
のクラミジア属ＥＢ（０、５、１０、５０、５００）を
含んだ。ＥＤＴＡを含有する増幅反応を用いて増幅を阻
害し、アンプリコンが混入していない且つ標的ＤＮＡを
含まない試料とした。ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｔポリメラー
ゼ、ＢＳＡおよびＭｇＣｌ2を加える前に、反応（４０
μｌ）を９５℃で５分間加熱して標的ＤＮＡを変性させ
た。標的を変性した後、試料を５３．５℃で５分間平衡
させた。増幅は、酵素配合物（５０ｍＭ ＭｇＣｌ2
５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ １μｌ、２５単位／μ
ｌ Ｂｓｔポリメラーゼ １μｌ、１６０単位／μｌ
ＢｓｏＢＩ １μｌおよび１Ｘ ＮＥＢ２ ２μｌ）１
０μｌの添加によって開始した。３０分間増幅後、反応
４５μｌを、１２Ｘ７５ホウケイ酸ガラス管（フィッシ
ャー（Fisher））中の蛍光偏光緩衝液１ｍｌ中に３７℃
で希釈し、そして蛍光偏光（ＦＰ）を、ＦＰＭ−１フル
オロメーター（ジョリー・リサーチ・アンド・コンサル
タンツ（Jolley Research and Consultants））でＦＰ
緩衝液をブランクとして測定した。ＦＰＭ−１におい
て、ＦＰは、鉛直面の標識を４８８ｎｍで励起させ且つ
鉛直および水平面の発光強度を５２０ｎｍで測定するこ
とによって測定される。ＦＰはミリ偏光単位（ｍＰ）と
して表される。
カーら（1996年，Clin.Chem.42,9-13）によって記載の
蛍光偏光による増幅後検出と共にシグナルプライマーを
用いる検定において、配列番号：１および配列番号：４
を用いて試験された。配列番号：８を、シグナルプライ
マーとして用いるために５−（４，６−ジクロロトリア
ジン−２−イル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡ
Ｆ）によって標識し、そして増幅の前にＳＤＡに対して
加えた。増幅反応５０μｌは、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各
０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびＴＴＰ、１．４
ｍＭα−チオ−ｄＣＴＰ、非アセチル化ウシ血清アルブ
ミン２０μｇ／ｍｌ、ヒト胎盤ＤＮＡ １ｎｇ／μｌ、
４０ｍＭ ＫiＰＯ4 ｐＨ７．６、５％（ｖ／ｖ）グリ
セロール、３％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．７５μＭの配
列番号：１、０．１８７５μＭの配列番号：４、１０ｎ
Ｍの５−ＤＴＡＦ標識された配列番号：８、０．０７５
μＭの配列番号：６および配列番号：７、３．２単位／
μｌ ＢｓｏＢＩ、０．２５単位／μｌエキソヌクレア
ーゼ欠失Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、および種々の量
のクラミジア属ＥＢ（０、５、１０、５０、５００）を
含んだ。ＥＤＴＡを含有する増幅反応を用いて増幅を阻
害し、アンプリコンが混入していない且つ標的ＤＮＡを
含まない試料とした。ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｔポリメラー
ゼ、ＢＳＡおよびＭｇＣｌ2を加える前に、反応（４０
μｌ）を９５℃で５分間加熱して標的ＤＮＡを変性させ
た。標的を変性した後、試料を５３．５℃で５分間平衡
させた。増幅は、酵素配合物（５０ｍＭ ＭｇＣｌ2
５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ １μｌ、２５単位／μ
ｌ Ｂｓｔポリメラーゼ １μｌ、１６０単位／μｌ
ＢｓｏＢＩ １μｌおよび１Ｘ ＮＥＢ２ ２μｌ）１
０μｌの添加によって開始した。３０分間増幅後、反応
４５μｌを、１２Ｘ７５ホウケイ酸ガラス管（フィッシ
ャー（Fisher））中の蛍光偏光緩衝液１ｍｌ中に３７℃
で希釈し、そして蛍光偏光（ＦＰ）を、ＦＰＭ−１フル
オロメーター（ジョリー・リサーチ・アンド・コンサル
タンツ（Jolley Research and Consultants））でＦＰ
緩衝液をブランクとして測定した。ＦＰＭ−１におい
て、ＦＰは、鉛直面の標識を４８８ｎｍで励起させ且つ
鉛直および水平面の発光強度を５２０ｎｍで測定するこ
とによって測定される。ＦＰはミリ偏光単位（ｍＰ）と
して表される。
【００２６】ＦＰは、増幅反応中の標的（ＥＢ）の数が
増加するにつれて増加した（図１）。標的試料０とＥＤ
ＴＡ試料との比較は、約１０〜２０アンプリコンを含む
僅かな混入を示す。５個程度の僅かな初期ＥＢは、バッ
クグラウンドに対して検出されることができた。
増加するにつれて増加した（図１）。標的試料０とＥＤ
ＴＡ試料との比較は、約１０〜２０アンプリコンを含む
僅かな混入を示す。５個程度の僅かな初期ＥＢは、バッ
クグラウンドに対して検出されることができた。
【００２７】実施例４ 配列番号：１／配列番号：４増幅プライマー対を、ウォ
ーカーら（1996）によって記載のリアルタイムＳＤＡ／
蛍光偏光検出システムにおいてＳＬＭ ８１００フルオ
ロメーターを用いて試験した。この装置は、連続して読
み取ることができる４個のキュベット室を有する。ＳＤ
Ａ反応１ｍｌを、本質的には実施例３で記載のように、
種々の数のクラミジア属ＥＢ（１０6個、１０4個、１０
2個または０個）を用いて４回行った。反応０ ＥＢも
また、増幅を阻害する０．５ＭＥＤＴＡ １０μｌを含
み、クラミジア属ＥＢを欠いたおよびアンプリコンが混
入していない試料とされた。増幅は、リアルタイムに５
３．５℃で検出された。結果を図２で示す。１０6およ
び１０4ＥＢを含有する反応は、約２１５ｍＰの漸近的
ＦＰ値で１８分まで平坦であった。しかしながら、より
高い初期標的量を含有する反応は、より低い初期標的量
を含有する反応よりも速くＦＰの増加を示したので、試
料間には定量的に差が見られなかった。すなわち、１０
6ＥＢ含有試料は８分でＦＰの増加を示し始めたが、１
０4および１０2ＥＢ含有試料は、それぞれ１０分および
１６分までＦＰの増加を示し始めなかった。
ーカーら（1996）によって記載のリアルタイムＳＤＡ／
蛍光偏光検出システムにおいてＳＬＭ ８１００フルオ
ロメーターを用いて試験した。この装置は、連続して読
み取ることができる４個のキュベット室を有する。ＳＤ
Ａ反応１ｍｌを、本質的には実施例３で記載のように、
種々の数のクラミジア属ＥＢ（１０6個、１０4個、１０
2個または０個）を用いて４回行った。反応０ ＥＢも
また、増幅を阻害する０．５ＭＥＤＴＡ １０μｌを含
み、クラミジア属ＥＢを欠いたおよびアンプリコンが混
入していない試料とされた。増幅は、リアルタイムに５
３．５℃で検出された。結果を図２で示す。１０6およ
び１０4ＥＢを含有する反応は、約２１５ｍＰの漸近的
ＦＰ値で１８分まで平坦であった。しかしながら、より
高い初期標的量を含有する反応は、より低い初期標的量
を含有する反応よりも速くＦＰの増加を示したので、試
料間には定量的に差が見られなかった。すなわち、１０
6ＥＢ含有試料は８分でＦＰの増加を示し始めたが、１
０4および１０2ＥＢ含有試料は、それぞれ１０分および
１６分までＦＰの増加を示し始めなかった。
【００２８】
【００２９】(2) 配列情報 配列番号:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 45 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:1: ACCGCATCGA ATCGATGTCT CGGGTAGAAA ATCGCATGCA AGATA 45
【００３０】(2) 配列情報 配列番号:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 45 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:2: ACCGCATCGA ATCGATGTCT CGGGCGCATG CAAGATATCG AGTAT 45
【００３１】(2) 配列情報 配列番号:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 45 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:3: ACGCCATCGA ATCGATGTCT CGGGATGCAA GATATCGAGT ATGCG 45
【００３２】(2) 配列情報 配列番号:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 46 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:4: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGCTGC CTCAGAATAT ACTCAG 46
【００３３】(2) 配列情報 配列番号:5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 45 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:5: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGCAAGC TGCCTCAGAA TATAC 45
【００３４】(2) 配列情報 配列番号:6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:6: TAAACATGAA AACTCGTTCC G 21
【００３５】(2) 配列情報 配列番号:7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:7: TTTTATGATG AGAACACTTA AACTCA 26
【００３６】(2) 配列情報 配列番号:8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 34 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:8: TAGAGTCTTC AAATATCAGA GCTTTACCTA ACAA 34
【図１】図１は、実施例３の結果を図示するグラフであ
り、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる５個の基本体
の検出感度を示す。
り、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる５個の基本体
の検出感度を示す。
【図２】図２は、本発明のプライマーを用いる標的増幅
のリアルタイム検出を示すグラフである。
のリアルタイム検出を示すグラフである。
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：３、配列番
号：４および配列番号：５の標的結合配列から成る群よ
り選択される標的結合配列並びに、場合により増幅反応
に必要な配列から成るオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 トラコーマクラミジア潜在プラスミドの
標的配列を増幅する方法であって、 （ａ）該標的配列に対して、 （ｉ）配列番号：１および配列番号：３の標的結合配列
から成る群より選択される標的結合配列並びに、場合に
より増幅反応に必要な配列から成る第一増幅プライマ
ー、および （ｉｉ）配列番号：４および配列番号：５の標的結合配
列から成る群より選択される標的結合配列並びに、場合
により増幅反応に必要な配列から成る第二増幅プライマ
ーをハイブリッド形成させ、そして （ｂ）ハイブリッド形成した第一および第二増幅プライ
マーを該標的配列上で伸長することによって該標的配列
を増幅することを含む上記方法。 - 【請求項３】 増幅した標的配列を、検定プローブに対
するハイブリダイゼーションによって検出することを更
に含む請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 ハイブリッド形成した検定プローブを、
標識の検出の前にポリメラーゼによって伸長させる請求
項３に記載の方法。 - 【請求項５】 増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅中
に制限エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる
制限エンドヌクレアーゼの認識部位である請求項２に記
載の方法。 - 【請求項６】 標的配列をポリメラーゼ連鎖反応によっ
て増幅させる請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】 トラコーマクラミジア潜在プラスミドの
標的配列を増幅する方法であって、 （ａ）該標的配列に対して、 （ｉ）配列番号：１または配列番号：３から成る第一増
幅プライマー、および （ｉｉ）配列番号：４または配列番号：５から成る第二
増幅プライマーをハイブリッド形成させ、そして （ｂ）該標的配列を鎖置換増幅反応で増幅することを含
む上記方法。 - 【請求項８】 トラコーマクラミジア標的配列の種特異
的検出用キットであって、 （ａ）配列番号：１および配列番号：３の標的結合配列
から成る群より選択される標的結合配列並びに、場合に
より増幅反応に必要な配列を含む第一増幅プライマー； （ｂ）配列番号：４および配列番号：５の標的結合配列
から成る群より選択される標的結合配列並びに、場合に
より増幅反応に必要な配列から成る第二増幅プライマ
ー、および （ｃ）トラコーマクラミジア標的配列を検出するための
検定プローブを含む上記キット。 - 【請求項９】 標的配列の増幅用試薬を更に含む請求項
８に記載のキット。 - 【請求項１０】 検定プローブの検出用試薬を更に含む
請求項８に記載のキット。
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|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Cited By (1)
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- 1997-06-11 JP JP09153816A patent/JP3127135B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5814490A (en) | 1998-09-29 |
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