JP2002320488A - マイコプラズマ・ニューモニエの増幅および検出 - Google Patents
マイコプラズマ・ニューモニエの増幅および検出Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 呼吸器サンプルまたは他の患者検体または培
養サンプルから、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycop
lasma pneumoniae)の有無を判定する. 【解決手段】 Ｐ１標的を特異的に増幅および検出する
ための増幅プライマーおよび方法を開示する。多様な増
幅反応および検出反応において、プライマー標的結合性
配列は、マイコプラズマ・ニューモニエ標的の増幅およ
び検出に有用である。
養サンプルから、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycop
lasma pneumoniae)の有無を判定する. 【解決手段】 Ｐ１標的を特異的に増幅および検出する
ための増幅プライマーおよび方法を開示する。多様な増
幅反応および検出反応において、プライマー標的結合性
配列は、マイコプラズマ・ニューモニエ標的の増幅およ
び検出に有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】発明の分野 本発明は、呼吸器サンプルまたは他の患者検体または培
養サンプルから、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycop
lasma pneumoniae)の有無を判定する方法に関する。本
方法は、好ましくは、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、好熱性鎖
置換増幅（ｔＳＤＡ）または蛍光リアルタイムｔＳＤＡ
の技法の１つを使用して、Ｐ１遺伝子内の標的配列を特
異的に増幅するために、核酸プライマーを使用すること
を含む。
養サンプルから、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycop
lasma pneumoniae)の有無を判定する方法に関する。本
方法は、好ましくは、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、好熱性鎖
置換増幅（ｔＳＤＡ）または蛍光リアルタイムｔＳＤＡ
の技法の１つを使用して、Ｐ１遺伝子内の標的配列を特
異的に増幅するために、核酸プライマーを使用すること
を含む。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景 Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒトにおける非定型的肺
炎の原因である。Ｗｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９８
８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８３２３−
８３６６）により記載されているＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅの物理的マッピング、およびＨｉｍｍｅｌｒｅｉｃ
ｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９６．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２４：４４２０−４４４９）により記載されて
いるＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの全ゲノムの配列決定が
実施されている。この微生物が宿主細胞に付着するのに
関与していると考えられる幾つかのタンパク質が発見さ
れた。大きい表面膜タンパク質Ｐ１が、付着を仲介する
と考えられる。Ｐ１遺伝子の配列は、Ｓｕ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：３
０２３−３０２９）およびＩｎａｍｉｎｅ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８．Ｇｅｎｅ ６４：２１７−２２９）に
より決定されており、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが宿主
細胞に付着するためのＰ１遺伝子産物の必要条件、従っ
て、この微生物の病原性は、Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８２．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：８
０９−８１７）により証明されている。診断用試薬およ
びワクチンを製造するための、Ｐ１遺伝子のクローニン
グおよび使用、ならびにそのタンパク質生成物について
は、米国特許第５，０２６，６３６号、米国特許第５，
３６９，００５号および米国特許第５，２８２，６９４
号に記載されている。
炎の原因である。Ｗｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９８
８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８３２３−
８３６６）により記載されているＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅの物理的マッピング、およびＨｉｍｍｅｌｒｅｉｃ
ｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９６．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２４：４４２０−４４４９）により記載されて
いるＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの全ゲノムの配列決定が
実施されている。この微生物が宿主細胞に付着するのに
関与していると考えられる幾つかのタンパク質が発見さ
れた。大きい表面膜タンパク質Ｐ１が、付着を仲介する
と考えられる。Ｐ１遺伝子の配列は、Ｓｕ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：３
０２３−３０２９）およびＩｎａｍｉｎｅ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８．Ｇｅｎｅ ６４：２１７−２２９）に
より決定されており、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが宿主
細胞に付着するためのＰ１遺伝子産物の必要条件、従っ
て、この微生物の病原性は、Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８２．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：８
０９−８１７）により証明されている。診断用試薬およ
びワクチンを製造するための、Ｐ１遺伝子のクローニン
グおよび使用、ならびにそのタンパク質生成物について
は、米国特許第５，０２６，６３６号、米国特許第５，
３６９，００５号および米国特許第５，２８２，６９４
号に記載されている。
【０００３】核酸増幅は、特定の標的配列を速やかに検
出できる強力な技術である。従って、核酸増幅は、Ｍ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを速やかに検出し、同定するため
の有望な技術である。ＰＣＲを使用してＭ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅを検出するためのＰ１遺伝子の特異性が証明
されている（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，ｅｔａ
ｌ．１９９２．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１
０９：５１９−５３７；Ｃａｄｉｅｕｘ，ｅｔ ａｌ．
１９９３．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：
２４３１−２４３７；Ｂｕｃｋ，ｅｔ ａｌ．１９９
２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．３０：３２８０
−３２８３；Ｓｋａｋｎｉ，ｅｔ ａｌ．１９９２．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２６３８−
２６４３；およびＧｒａｔｔａｒｄ，ｅｔ ａｌ．１９
９８．Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６：４６４−４６
９）。
出できる強力な技術である。従って、核酸増幅は、Ｍ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを速やかに検出し、同定するため
の有望な技術である。ＰＣＲを使用してＭ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅを検出するためのＰ１遺伝子の特異性が証明
されている（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，ｅｔａ
ｌ．１９９２．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１
０９：５１９−５３７；Ｃａｄｉｅｕｘ，ｅｔ ａｌ．
１９９３．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：
２４３１−２４３７；Ｂｕｃｋ，ｅｔ ａｌ．１９９
２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．３０：３２８０
−３２８３；Ｓｋａｋｎｉ，ｅｔ ａｌ．１９９２．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２６３８−
２６４３；およびＧｒａｔｔａｒｄ，ｅｔ ａｌ．１９
９８．Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６：４６４−４６
９）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明のオリゴヌクレ
オチドは、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの核酸増幅および
検出に適用できる。
オチドは、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの核酸増幅および
検出に適用できる。
【０００５】以下の専門用語を、本明細書では下記の通
りに定義する。増幅プライマーは、標的配列にハイブリ
ダイズした後、プライマーの伸長によって標的配列を増
幅するためのプライマーである。増幅プライイマーは、
一般に１０〜７５ヌクレオチドの長さであり、好ましく
は１５〜５０ヌクレオチドの長さである。ＳＤＡ用増幅
プライマーの全長は約２５〜５０ヌクレオチドである。
ＳＤＡ増幅プライマーの３’末端（標的結合性配列）
は、標的配列の３’末端にてハイブリダイズする。標的
結合性配列は約１０〜２５ヌクレオチドの長さであり、
増幅プライマーにハイブリダーゼーション特性を与え
る。ＳＤＡ増幅プライマーは、５’から標的結合性配列
までの、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位をさ
らに含む。認識部位は、Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６および１９９２ Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９
６）に記載されている通り、認識部位を半修飾するとき
にＤＮＡ二重鎖の鎖１本を切断（ｎｉｃｋ）する、制限
エンドヌクレアーゼのためである。５’から制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド（「尾部」）
は、増幅プライマーの残りを切断し、ＳＤＡ中に置換す
るときにポリメラーゼリプライミング（ｒｅｐｒｉｍｉ
ｎｇ）部位として機能する。尾部ヌクレオチドのリプラ
イミング機能によって、ＳＤＡ反応が持続し、１つの標
的分子から多数のアンプリコンを合成することができ
る。この尾部は、一般に約１０〜２５ヌクレオチドの長
さである。その長さおよび配列は概して重要ではなく、
定型的に選択して修飾することができる。標的結合性配
列は、その標的特異性を決定するプライマーのタンパク
質であるため、標的の末端にて固有の配列を必要としな
い増幅方法の場合、増幅プライマーは概して、標的結合
性配列のみで本質的に構成される。たとえば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した本発明による標的配
列の増幅は、本明細書に記載の増幅プライマーの標的結
合性配列からなる増幅プライマーを使用する。ＳＤＡの
切断可能な（ｎｉｃｋａｂｌｅ）制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位および尾部以外の標的に付加した固有配列を
必要とする増幅方法（たとえば、自続的配列複製（Ｓｅ
ｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ：３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓ
ｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）また
は転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）用のＲＮＡポリ
メラーゼプロモーター）の場合、定型的なオリゴヌクレ
オチド調製法を使用して、プライマーのハイブリダイゼ
ーション特異性を変えることなく、必要な固有配列を標
的結合性配列に連結することが可能である。
りに定義する。増幅プライマーは、標的配列にハイブリ
ダイズした後、プライマーの伸長によって標的配列を増
幅するためのプライマーである。増幅プライイマーは、
一般に１０〜７５ヌクレオチドの長さであり、好ましく
は１５〜５０ヌクレオチドの長さである。ＳＤＡ用増幅
プライマーの全長は約２５〜５０ヌクレオチドである。
ＳＤＡ増幅プライマーの３’末端（標的結合性配列）
は、標的配列の３’末端にてハイブリダイズする。標的
結合性配列は約１０〜２５ヌクレオチドの長さであり、
増幅プライマーにハイブリダーゼーション特性を与え
る。ＳＤＡ増幅プライマーは、５’から標的結合性配列
までの、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位をさ
らに含む。認識部位は、Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６および１９９２ Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９
６）に記載されている通り、認識部位を半修飾するとき
にＤＮＡ二重鎖の鎖１本を切断（ｎｉｃｋ）する、制限
エンドヌクレアーゼのためである。５’から制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド（「尾部」）
は、増幅プライマーの残りを切断し、ＳＤＡ中に置換す
るときにポリメラーゼリプライミング（ｒｅｐｒｉｍｉ
ｎｇ）部位として機能する。尾部ヌクレオチドのリプラ
イミング機能によって、ＳＤＡ反応が持続し、１つの標
的分子から多数のアンプリコンを合成することができ
る。この尾部は、一般に約１０〜２５ヌクレオチドの長
さである。その長さおよび配列は概して重要ではなく、
定型的に選択して修飾することができる。標的結合性配
列は、その標的特異性を決定するプライマーのタンパク
質であるため、標的の末端にて固有の配列を必要としな
い増幅方法の場合、増幅プライマーは概して、標的結合
性配列のみで本質的に構成される。たとえば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した本発明による標的配
列の増幅は、本明細書に記載の増幅プライマーの標的結
合性配列からなる増幅プライマーを使用する。ＳＤＡの
切断可能な（ｎｉｃｋａｂｌｅ）制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位および尾部以外の標的に付加した固有配列を
必要とする増幅方法（たとえば、自続的配列複製（Ｓｅ
ｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ：３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓ
ｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）また
は転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）用のＲＮＡポリ
メラーゼプロモーター）の場合、定型的なオリゴヌクレ
オチド調製法を使用して、プライマーのハイブリダイゼ
ーション特異性を変えることなく、必要な固有配列を標
的結合性配列に連結することが可能である。
【０００６】バンパープライマーすなわち外部プライマ
ーは、等温増幅反応において、プライマー伸長生成物の
置換に使用されるプライマーである。バンパープライマ
ーは、バンパープライマーの伸長部が、下流の増幅プラ
イマーおよびその伸長生成物に取って替わるように、増
幅プライマーの上流の標的配列にアニールする。
ーは、等温増幅反応において、プライマー伸長生成物の
置換に使用されるプライマーである。バンパープライマ
ーは、バンパープライマーの伸長部が、下流の増幅プラ
イマーおよびその伸長生成物に取って替わるように、増
幅プライマーの上流の標的配列にアニールする。
【０００７】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れるべき核酸配列を指す。これらの中には、増幅される
べき本来の核酸配列、増幅されるべき本来の核酸配列の
相補的な第２鎖、および増幅反応により生成される本来
の配列のコピーのいずれかの鎖が含まれる。増幅可能な
標的は、増幅プライマーがハイブリダイズする対象であ
る配列のコピーを含むため、これらのコピーは増幅可能
な標的の役割を果たす。
れるべき核酸配列を指す。これらの中には、増幅される
べき本来の核酸配列、増幅されるべき本来の核酸配列の
相補的な第２鎖、および増幅反応により生成される本来
の配列のコピーのいずれかの鎖が含まれる。増幅可能な
標的は、増幅プライマーがハイブリダイズする対象であ
る配列のコピーを含むため、これらのコピーは増幅可能
な標的の役割を果たす。
【０００８】増幅反応中に生成され標的配列のコピー
は、増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと呼
ばれる。
は、増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと呼
ばれる。
【０００９】伸長生成物という用語は、プライマーのハ
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として使用
したポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生成
されるコピーを指す。
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として使用
したポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生成
されるコピーを指す。
【００１０】種特異的という用語は、実質的な検出、増
幅または同じ属の他種または異なる属の種へのオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションをしない、検出、増
幅または生物の種または一群の関連種へのオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションを指す。
幅または同じ属の他種または異なる属の種へのオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションをしない、検出、増
幅または生物の種または一群の関連種へのオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションを指す。
【００１１】アッセイプローブという用語は、核酸の検
出または同定を促進するのに使用されるオリゴヌクレオ
チドである。以下に記載の検出器プローブ、検出器プラ
イマー、捕捉プローブ、シグナルプライマーおよびレポ
ータープローブは、アッセイプローブの例である。
出または同定を促進するのに使用されるオリゴヌクレオ
チドである。以下に記載の検出器プローブ、検出器プラ
イマー、捕捉プローブ、シグナルプライマーおよびレポ
ータープローブは、アッセイプローブの例である。
【００１２】シグナルプライマーは、標的中の相補配列
にハイブリダイズする３’標的結合性配列を含み、標的
に相補的でない５’尾部配列（アダプター配列）を含
む。このアダプター配列は、その相補配列が、以下に記
載のレポータープローブの３’末端にハイブリダイズす
るように選択される、間接的に検出できるマーカーであ
る。シグナルプライマーは、増幅プライマーのハイブリ
ダイゼーション部位の少なくともある程度下流で、標的
配列にハイブリダイズする。このシグナルプライマー
は、増幅プライマーの伸長に似た様式で、ポリメラーゼ
により伸長される。増幅プライマーの伸長部は、標的増
幅依存にシグナルプライマーの伸長生成物に取って替わ
る。下流標的結合性配列およびフランキングＳＤＡ増幅
プライマーへのハイブリダイゼーション特異的３’結合
性配列を含む、５’アダプター配列、一本鎖生成物を生
成する。このフランキング増幅プライマーのハイブリダ
イゼーションおよび伸長、ならびに後続のニッキングお
よび伸長により、アダプター配列の補体を含む増幅生成
物が生じ、これを標的増幅の指標として検出することが
可能である。
にハイブリダイズする３’標的結合性配列を含み、標的
に相補的でない５’尾部配列（アダプター配列）を含
む。このアダプター配列は、その相補配列が、以下に記
載のレポータープローブの３’末端にハイブリダイズす
るように選択される、間接的に検出できるマーカーであ
る。シグナルプライマーは、増幅プライマーのハイブリ
ダイゼーション部位の少なくともある程度下流で、標的
配列にハイブリダイズする。このシグナルプライマー
は、増幅プライマーの伸長に似た様式で、ポリメラーゼ
により伸長される。増幅プライマーの伸長部は、標的増
幅依存にシグナルプライマーの伸長生成物に取って替わ
る。下流標的結合性配列およびフランキングＳＤＡ増幅
プライマーへのハイブリダイゼーション特異的３’結合
性配列を含む、５’アダプター配列、一本鎖生成物を生
成する。このフランキング増幅プライマーのハイブリダ
イゼーションおよび伸長、ならびに後続のニッキングお
よび伸長により、アダプター配列の補体を含む増幅生成
物が生じ、これを標的増幅の指標として検出することが
可能である。
【００１３】本発明によるレポータープローブは、検出
器オリゴヌクレオチドとして機能し、少なくとも１ドナ
ー／消去剤色素対（すなわち、ドナーフルオロフォア用
のドナー蛍光色素および消去剤）であることが好ましい
標識を含む。標識は、標的配列に直接ハイブリダイズし
ないレポータープローブ中の配列または構造（レポータ
ー部分）に連結される。レポートプローブ３’からレポ
ーター部分までの配列は、シグナルプライマーアダプタ
ー配列の補体にハイブリダイズするように選択される。
概して、レポータープローブの３’末端は、標的配列に
かなりの相補性を有する配列を含まない。上述のアダプ
ター配列の補体を含む増幅生成物が存在する場合、その
増幅生成物はレポータープローブの３’末端にハイブリ
ダイズすることができる。プライミングおよびアダプタ
ー補体配列の３’末端からの伸長により、レポーター部
分補体を形成することが可能である。この形成によって
レポーター部分は二本鎖になり、その結果、レポーター
プローブの標識を検出することができ、標的の存在また
は増幅を示すことができる。
器オリゴヌクレオチドとして機能し、少なくとも１ドナ
ー／消去剤色素対（すなわち、ドナーフルオロフォア用
のドナー蛍光色素および消去剤）であることが好ましい
標識を含む。標識は、標的配列に直接ハイブリダイズし
ないレポータープローブ中の配列または構造（レポータ
ー部分）に連結される。レポートプローブ３’からレポ
ーター部分までの配列は、シグナルプライマーアダプタ
ー配列の補体にハイブリダイズするように選択される。
概して、レポータープローブの３’末端は、標的配列に
かなりの相補性を有する配列を含まない。上述のアダプ
ター配列の補体を含む増幅生成物が存在する場合、その
増幅生成物はレポータープローブの３’末端にハイブリ
ダイズすることができる。プライミングおよびアダプタ
ー補体配列の３’末端からの伸長により、レポーター部
分補体を形成することが可能である。この形成によって
レポーター部分は二本鎖になり、その結果、レポーター
プローブの標識を検出することができ、標的の存在また
は増幅を示すことができる。
【００１４】アンプリコンという用語は、一対の増幅プ
ライマーのいずれか一方または両者の伸長により生じる
増幅反応の生成物を指す。使用する両プライマーが標的
配列にハイブリダイズする場合、アンプリコンは、指数
関数的に増幅した核酸を含んでもよい。あるいは、使用
したプライマーの１つが標的配列にハイブリダイズしな
い場合、アンプリコンは、直線的増幅により生じてもよ
い。従って、この用語は、本明細書で使用され、指数関
数的に増幅された核酸の存在を意味するものではない。
ライマーのいずれか一方または両者の伸長により生じる
増幅反応の生成物を指す。使用する両プライマーが標的
配列にハイブリダイズする場合、アンプリコンは、指数
関数的に増幅した核酸を含んでもよい。あるいは、使用
したプライマーの１つが標的配列にハイブリダイズしな
い場合、アンプリコンは、直線的増幅により生じてもよ
い。従って、この用語は、本明細書で使用され、指数関
数的に増幅された核酸の存在を意味するものではない。
【００１５】
【発明の実施の形態】発明の概要 本発明は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにある標的配列の
増幅に使用することができるオリゴヌクレオチドプライ
マーを提供する。さらに詳細には、この標的配列はＰ１
遺伝子のセグメントを含む。増幅プライマーは、高温に
て高能率高特異性の増幅（たとえばｔＳＤＡやＰＣＲ）
向けにデザインされてきたが、従来のＳＤＡ、３ＳＲ、
ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ等の低温増幅反応でも有用であ
る。標的特異的シグナルプライマーにハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅生成
物を間接的に検出するのに使用される。
増幅に使用することができるオリゴヌクレオチドプライ
マーを提供する。さらに詳細には、この標的配列はＰ１
遺伝子のセグメントを含む。増幅プライマーは、高温に
て高能率高特異性の増幅（たとえばｔＳＤＡやＰＣＲ）
向けにデザインされてきたが、従来のＳＤＡ、３ＳＲ、
ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ等の低温増幅反応でも有用であ
る。標的特異的シグナルプライマーにハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅生成
物を間接的に検出するのに使用される。
【００１６】本発明のオリゴヌクレオチドは、培養後
に、培養された微生物の同一性を確認するための手段と
して使用することが可能である。あるいは、既知の増幅
方法を使用して、ヒトまたは動物からの臨床サンプル中
のＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出および同定するのに
使用することができる。いずれの場合にも、本発明のオ
リゴヌクレオチドおよび分析方法を使用すると、Ｍ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅと他の微生物とを速やかに識別する
ための手段が得られ、専門家は、慣習的に信頼されてい
る旧式の手順を使用せずに、この微生物を速やかに同定
することできる。感染に関与する特定の病原体をこのよ
うに迅速に同定することにより、適切な処置を決定する
のに使用できる情報が短時間のうちに得られる。
に、培養された微生物の同一性を確認するための手段と
して使用することが可能である。あるいは、既知の増幅
方法を使用して、ヒトまたは動物からの臨床サンプル中
のＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出および同定するのに
使用することができる。いずれの場合にも、本発明のオ
リゴヌクレオチドおよび分析方法を使用すると、Ｍ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅと他の微生物とを速やかに識別する
ための手段が得られ、専門家は、慣習的に信頼されてい
る旧式の手順を使用せずに、この微生物を速やかに同定
することできる。感染に関与する特定の病原体をこのよ
うに迅速に同定することにより、適切な処置を決定する
のに使用できる情報が短時間のうちに得られる。
【００１７】配列の要約 配列番号１は、Ｐ１遺伝子内の配列を増幅するための上
流プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配
列である。配列番号２〜４は、Ｐ１遺伝子内の配列を増
幅するための下流プライマーとして使用されるオリゴヌ
クレオチドの配列である。配列番号５〜６は、ＳＤＡ増
幅用の上流バンパーとして使用されるオリゴヌクレオチ
ドの配列である。配列番号７〜８は、ＳＤＡ増幅用の下
流バンパーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列
である。配列番号９〜１０は、Ｐ１遺伝子内の配列を増
幅して検出するためのシグナルプライマーの配列であ
る。配列番号１１は、前述のシグナルプライマーと共に
使用したとき、Ｐ１遺伝子内の配列を検出するようにデ
ザインされたレポータープローブ用の配列である。
流プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配
列である。配列番号２〜４は、Ｐ１遺伝子内の配列を増
幅するための下流プライマーとして使用されるオリゴヌ
クレオチドの配列である。配列番号５〜６は、ＳＤＡ増
幅用の上流バンパーとして使用されるオリゴヌクレオチ
ドの配列である。配列番号７〜８は、ＳＤＡ増幅用の下
流バンパーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列
である。配列番号９〜１０は、Ｐ１遺伝子内の配列を増
幅して検出するためのシグナルプライマーの配列であ
る。配列番号１１は、前述のシグナルプライマーと共に
使用したとき、Ｐ１遺伝子内の配列を検出するようにデ
ザインされたレポータープローブ用の配列である。
【００１８】本発明の様々な目的、利点および新規な特
質は、添付の図面と関連して読んだ時、以下の詳細な説
明から容易に理解されるであろう。
質は、添付の図面と関連して読んだ時、以下の詳細な説
明から容易に理解されるであろう。
【００１９】発明の詳細な説明 本発明は、核酸増幅反応において、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅに対して特異性を示すオリゴヌクレオチド、増幅
プライマーおよびシグナルプライマーに関する。また、
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、Ｍ．ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ微生物の核酸を検出して同定するための方
法も提供する。好ましい方法は、ＳＤＡ、ｔＳＤＡまた
は同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡを使用することであ
る。以上の方法は、米国特許第５，５４７，８６１号、
米国特許第５，６４８，２１１号、米国特許第５，８４
６，７２６号、米国特許第５，９２８，８６９号、米国
特許第５，９５８，７００号、米国特許第５，９３５，
７９１号、米国特許第６，０５４，２７９号、２０００
年６月８日提出の米国特許出願番号第０９／５９０，０
６１号、および２０００年６月２３日提出の米国特許出
願番号第０９／６０２，９９６号（これらの開示内容
は、参照することにより特別に本明細書にくみこまれ
る）等の参考文献から、当業者に周知である。本発明の
プライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＴＣＣ＃ ＮＣ００
０９１２．に収載されているＭ１２９菌株からのＰ１遺
伝子配列データの分析に基づく。Ｐ１遺伝しないの幾つ
かの標的領域にわたるＰＣＲプライマーを、Ｍ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ特異性に関して評価した。標的領域にお
ける相同性を証明するために、８つのＭ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ参照菌株の標的領域を配列決定した。この標的
領域用のＳＤＡプライマーをデザインした。ｔＳＤＡで
使用するために開発されたプライマーを表１に示す。結
果として生じるアンプリコンを増幅して検出するための
シグナルプライーマーおよびレポータープローブも示
す。この増幅プライマーにおける代表的な制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位（ＢｓｏＢＩ）をボールド体で示
し、標的結合性配列をイタリック体で示す。増幅プライ
マーの標的結合性配列によって、その標的特異性が決定
される。
ｉａｅに対して特異性を示すオリゴヌクレオチド、増幅
プライマーおよびシグナルプライマーに関する。また、
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、Ｍ．ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ微生物の核酸を検出して同定するための方
法も提供する。好ましい方法は、ＳＤＡ、ｔＳＤＡまた
は同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡを使用することであ
る。以上の方法は、米国特許第５，５４７，８６１号、
米国特許第５，６４８，２１１号、米国特許第５，８４
６，７２６号、米国特許第５，９２８，８６９号、米国
特許第５，９５８，７００号、米国特許第５，９３５，
７９１号、米国特許第６，０５４，２７９号、２０００
年６月８日提出の米国特許出願番号第０９／５９０，０
６１号、および２０００年６月２３日提出の米国特許出
願番号第０９／６０２，９９６号（これらの開示内容
は、参照することにより特別に本明細書にくみこまれ
る）等の参考文献から、当業者に周知である。本発明の
プライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＴＣＣ＃ ＮＣ００
０９１２．に収載されているＭ１２９菌株からのＰ１遺
伝子配列データの分析に基づく。Ｐ１遺伝しないの幾つ
かの標的領域にわたるＰＣＲプライマーを、Ｍ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ特異性に関して評価した。標的領域にお
ける相同性を証明するために、８つのＭ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ参照菌株の標的領域を配列決定した。この標的
領域用のＳＤＡプライマーをデザインした。ｔＳＤＡで
使用するために開発されたプライマーを表１に示す。結
果として生じるアンプリコンを増幅して検出するための
シグナルプライーマーおよびレポータープローブも示
す。この増幅プライマーにおける代表的な制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位（ＢｓｏＢＩ）をボールド体で示
し、標的結合性配列をイタリック体で示す。増幅プライ
マーの標的結合性配列によって、その標的特異性が決定
される。
【００２０】
【表１】
【００２１】ハイブリダイズするために核酸は完全な相
補性を必要としないため、本明細書に開示されているプ
ローブ配列およびプライマー配列は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ特異的プローブおよびプライマーとしての有用
性を失うことなく、ある程度修飾することが可能であ
る。当技術分野で周知の通り、ストリンジェンシーを増
強または低減するようにハイブリダイゼーション条件
（すなわち、ハイブリダイゼーションｐＨ、温度または
緩衝液の塩含量）を調節するとにより、相補的な核酸配
列および部分的に相補的な核酸配列を得ることができ
る。開示した配列のこのように僅かな修飾およびＭ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異性を維持するために必要なハイ
ブリダイゼーション条件の調節は、定型的な実験のみを
必要とし、当分野で普通の技術の範囲内である。
補性を必要としないため、本明細書に開示されているプ
ローブ配列およびプライマー配列は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ特異的プローブおよびプライマーとしての有用
性を失うことなく、ある程度修飾することが可能であ
る。当技術分野で周知の通り、ストリンジェンシーを増
強または低減するようにハイブリダイゼーション条件
（すなわち、ハイブリダイゼーションｐＨ、温度または
緩衝液の塩含量）を調節するとにより、相補的な核酸配
列および部分的に相補的な核酸配列を得ることができ
る。開示した配列のこのように僅かな修飾およびＭ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異性を維持するために必要なハイ
ブリダイゼーション条件の調節は、定型的な実験のみを
必要とし、当分野で普通の技術の範囲内である。
【００２２】本明細書に記載のプライマーを使用して生
成した増幅生成物は、たとえば、臭化エチジウムで染色
されたポリアクリルアミドゲル上またはアガロースゲル
上の、特徴的なサイズによって検出することができる。
あるいは、アッセイプローブ（検出可能な標識で標識し
たオリゴヌクレオチドである）を使用して、増幅された
標的配列を検出することができる。１つの実施形態にお
いて、少なくとも１つの標識アッセイプローブを、ハイ
ブリダイゼーション（検出器プローブ）、Ｗａｌｋｅ
ｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）により記載されて
いるハイブリダイゼーションおよび伸長（検出器プライ
マー）またはＥＰ ０６７８５８２号に記載されている
通り、ハイブリダイゼーション、伸長および二本鎖型へ
の転換（シグナルプライマー）により増幅された標的配
列の検出に使用することができる。
成した増幅生成物は、たとえば、臭化エチジウムで染色
されたポリアクリルアミドゲル上またはアガロースゲル
上の、特徴的なサイズによって検出することができる。
あるいは、アッセイプローブ（検出可能な標識で標識し
たオリゴヌクレオチドである）を使用して、増幅された
標的配列を検出することができる。１つの実施形態にお
いて、少なくとも１つの標識アッセイプローブを、ハイ
ブリダイゼーション（検出器プローブ）、Ｗａｌｋｅ
ｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）により記載されて
いるハイブリダイゼーションおよび伸長（検出器プライ
マー）またはＥＰ ０６７８５８２号に記載されている
通り、ハイブリダイゼーション、伸長および二本鎖型へ
の転換（シグナルプライマー）により増幅された標的配
列の検出に使用することができる。
【００２３】増幅された標的の検出に好ましい実施形態
を、図１に図解する。この実施形態において、シグナル
プライマーの５’尾部配列は、標的にハイブリダイズし
ない配列（アダプター配列）を含む。このアダプター配
列は、異なる３’標的結合性配列を有する様々なシグナ
ルプライマーにおいてアダプター配列が同じであるよう
に選択することが可能な、間接的に検出できるマーカー
である（すなわち「普遍」５’尾部配列）。配列番号９
〜１０はシグナルプライマーとして、本発明の増幅プラ
イマーとともに、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ微生物の検
出に特に有用である。アッセイプローブは、本発明のシ
グナルプライマーのアダプター配列補体にハイブリダイ
ズする単一レポータープローブ配列であることが好まし
い。配列番号１１は、本発明のシグナルプライマーと一
緒に使用したとき、レポータープローブとして、Ｍ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出に特に有用である。あるい
は、増幅プライマー間にある、標的における配列にハイ
ブリダイズするように、アッセイプローブを選択するこ
とができる。さらなる実施形態では、増幅プライマーま
たはその標的結合性配列をアッセイプローブとして使用
することが可能である。
を、図１に図解する。この実施形態において、シグナル
プライマーの５’尾部配列は、標的にハイブリダイズし
ない配列（アダプター配列）を含む。このアダプター配
列は、異なる３’標的結合性配列を有する様々なシグナ
ルプライマーにおいてアダプター配列が同じであるよう
に選択することが可能な、間接的に検出できるマーカー
である（すなわち「普遍」５’尾部配列）。配列番号９
〜１０はシグナルプライマーとして、本発明の増幅プラ
イマーとともに、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ微生物の検
出に特に有用である。アッセイプローブは、本発明のシ
グナルプライマーのアダプター配列補体にハイブリダイ
ズする単一レポータープローブ配列であることが好まし
い。配列番号１１は、本発明のシグナルプライマーと一
緒に使用したとき、レポータープローブとして、Ｍ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出に特に有用である。あるい
は、増幅プライマー間にある、標的における配列にハイ
ブリダイズするように、アッセイプローブを選択するこ
とができる。さらなる実施形態では、増幅プライマーま
たはその標的結合性配列をアッセイプローブとして使用
することが可能である。
【００２４】アッセイプローブの検出可能な標識は、標
的核酸の存在の指標として、直接的または間接的のいず
れかで検出できる部分である。標識の直接検出の場合、
当技術分野で周知の通り、アッセイプローブを放射性同
位元素で標識してオートラジオグラフィーで検出しても
よく、蛍光部分で標識して蛍光で検出してもよい。ある
いは、検出できるようにするにはさらなる試薬を必要と
する標識で標識することにより、アッセイプローブを間
接的に検出することが可能である。間接的に検出できる
標識としては、たとえば、化学発光剤、目に見える反応
生成物を生成する酵素、および標識された結合パートナ
ーに結合させることにより検出できる（たとえば、抗体
または抗原／ハプテン）リガンド（たとえば、ハプテ
ン、抗体または抗原）などがある。リガンドは、その検
出を容易にするために、リガンド標識オリゴヌクレオチ
ド（捕捉プローブ）を固相に固定するのにも有用であ
る。特に有用な標識としては、ビオチン（標識されたア
ビジンまたはストレプトアビジンに結合させることによ
り検出できる）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ
またはアルカリホスファターゼ等の酵素（酵素基質を加
えて有色の反応性生物を生じさせることによって検出で
きる）などがある。このような標識をオリゴヌクレオチ
ドに加える方法、またはこのような標識をオリゴヌクレ
オチドに含める方法は、当技術分野で周知であり、これ
らの方法のいずれも本発明で使用するのに適している。
的核酸の存在の指標として、直接的または間接的のいず
れかで検出できる部分である。標識の直接検出の場合、
当技術分野で周知の通り、アッセイプローブを放射性同
位元素で標識してオートラジオグラフィーで検出しても
よく、蛍光部分で標識して蛍光で検出してもよい。ある
いは、検出できるようにするにはさらなる試薬を必要と
する標識で標識することにより、アッセイプローブを間
接的に検出することが可能である。間接的に検出できる
標識としては、たとえば、化学発光剤、目に見える反応
生成物を生成する酵素、および標識された結合パートナ
ーに結合させることにより検出できる（たとえば、抗体
または抗原／ハプテン）リガンド（たとえば、ハプテ
ン、抗体または抗原）などがある。リガンドは、その検
出を容易にするために、リガンド標識オリゴヌクレオチ
ド（捕捉プローブ）を固相に固定するのにも有用であ
る。特に有用な標識としては、ビオチン（標識されたア
ビジンまたはストレプトアビジンに結合させることによ
り検出できる）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ
またはアルカリホスファターゼ等の酵素（酵素基質を加
えて有色の反応性生物を生じさせることによって検出で
きる）などがある。このような標識をオリゴヌクレオチ
ドに加える方法、またはこのような標識をオリゴヌクレ
オチドに含める方法は、当技術分野で周知であり、これ
らの方法のいずれも本発明で使用するのに適している。
【００２５】使用することができる具体的な検出方法の
例としては、米国特許第５，４７０，７２３号に記載
の、ビオチニル化捕捉プローブおよび酵素複合検出器プ
ローブを使用して、増幅生成物を検出する化学発光法な
どがある。これらの２つのアッセイプローブを、標的配
列のアッセイ領域の異なる部位（２つの増幅プライマー
の結合部位の間）にハイブリダイズさせた後、捕捉プロ
ーブを用いて、この複合体をストレプトアビジン被覆微
量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを生じさ
せ、照度計で読み取る。増幅生成物を検出するための別
の代替法として、欧州特許ＥＰ ０ ６７８ ５８２号
に記載のシグナルプライマーを、ＳＤＡ反応に含めても
よい。増幅生成物を検出するためのさらに別の代替法で
は、シグナルプライマーは、標的配列にハイブリダイズ
しない配列、すなわちアダプター配列を含んでもよい。
この実施形態では、図１に示す通り、標識が結合したレ
ポータープローブは、アダプター配列の補体にハイブリ
ダイズすることができる。シグナルプライマーの両実施
形態において、ＳＤＡ中に、二次増幅生成物を標的増幅
依存的に生じさせ、これを標的増幅の指標として検出す
ることが可能である。
例としては、米国特許第５，４７０，７２３号に記載
の、ビオチニル化捕捉プローブおよび酵素複合検出器プ
ローブを使用して、増幅生成物を検出する化学発光法な
どがある。これらの２つのアッセイプローブを、標的配
列のアッセイ領域の異なる部位（２つの増幅プライマー
の結合部位の間）にハイブリダイズさせた後、捕捉プロ
ーブを用いて、この複合体をストレプトアビジン被覆微
量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを生じさ
せ、照度計で読み取る。増幅生成物を検出するための別
の代替法として、欧州特許ＥＰ ０ ６７８ ５８２号
に記載のシグナルプライマーを、ＳＤＡ反応に含めても
よい。増幅生成物を検出するためのさらに別の代替法で
は、シグナルプライマーは、標的配列にハイブリダイズ
しない配列、すなわちアダプター配列を含んでもよい。
この実施形態では、図１に示す通り、標識が結合したレ
ポータープローブは、アダプター配列の補体にハイブリ
ダイズすることができる。シグナルプライマーの両実施
形態において、ＳＤＡ中に、二次増幅生成物を標的増幅
依存的に生じさせ、これを標的増幅の指標として検出す
ることが可能である。
【００２６】商業上便利なように、核酸を特異的に検出
して同定するための増幅プライマーを、キットの形でパ
ッケージすることが可能である。一般に、このようなキ
ットは少なくとも一対の増幅プライマーを含む。標的特
異的増幅プライマーと共に、核酸増幅反応を実施するた
めの試薬、たとえば、緩衝液、さらなるプライマー、ヌ
クレオチド三リン酸、酵素等々も含まれてもよい。キッ
トの成分は、任意に本発明の具体的な実施形態を実施す
るための説明書が入っている、普通の容器に一緒にパッ
ケージされる。他の任意の成分、たとえば、アッセイプ
ローブとして使用するのに適した標識で標識されたオリ
ゴヌクレオチド、および／または標識を検出するための
試薬または手段もキットに含まれてもよい。
して同定するための増幅プライマーを、キットの形でパ
ッケージすることが可能である。一般に、このようなキ
ットは少なくとも一対の増幅プライマーを含む。標的特
異的増幅プライマーと共に、核酸増幅反応を実施するた
めの試薬、たとえば、緩衝液、さらなるプライマー、ヌ
クレオチド三リン酸、酵素等々も含まれてもよい。キッ
トの成分は、任意に本発明の具体的な実施形態を実施す
るための説明書が入っている、普通の容器に一緒にパッ
ケージされる。他の任意の成分、たとえば、アッセイプ
ローブとして使用するのに適した標識で標識されたオリ
ゴヌクレオチド、および／または標識を検出するための
試薬または手段もキットに含まれてもよい。
【００２７】本発明の場合、必要な成分を呼吸器微生物
パネルに提供するために、このようなキットを作ること
が可能である。このような呼吸器パネルは、Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
およびクラミジア微生物、ならびに呼吸器感染を引き起
こすことができる他の微生物を含んでもよい。従って、
このような呼吸器キットは、呼吸器パネルの各微生物に
特異的な核酸配列の増幅用プライマーを含むであろう。
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの増幅および検出に有用なプライマー、バンパー、
シグナルプライマーおよびレポータープローブは、それ
ぞれ、本明細書と同日付で提出された同時係属米国特許
出願番号第０９／６２６，８５５号（弁理士整理番号第
Ｐ−５１４３号）および本明細書と同日付で提出された
同時係属米国特許出願番号第０９／６２６，３５４号
（弁理士整理番号第Ｐ−５１４４号）（特に、その開示
内容は参照することにより本明細書に組み込まれるもの
とする）に記載されている。このような呼吸器パネルキ
ットは、使用する場合、パネルの各微生物の有無を示す
結果を提供するために、各微生物に対して別々の増幅反
応であってもよく、または１つ以上の複合的な増幅反応
であってもよい。
パネルに提供するために、このようなキットを作ること
が可能である。このような呼吸器パネルは、Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
およびクラミジア微生物、ならびに呼吸器感染を引き起
こすことができる他の微生物を含んでもよい。従って、
このような呼吸器キットは、呼吸器パネルの各微生物に
特異的な核酸配列の増幅用プライマーを含むであろう。
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの増幅および検出に有用なプライマー、バンパー、
シグナルプライマーおよびレポータープローブは、それ
ぞれ、本明細書と同日付で提出された同時係属米国特許
出願番号第０９／６２６，８５５号（弁理士整理番号第
Ｐ−５１４３号）および本明細書と同日付で提出された
同時係属米国特許出願番号第０９／６２６，３５４号
（弁理士整理番号第Ｐ−５１４４号）（特に、その開示
内容は参照することにより本明細書に組み込まれるもの
とする）に記載されている。このような呼吸器パネルキ
ットは、使用する場合、パネルの各微生物の有無を示す
結果を提供するために、各微生物に対して別々の増幅反
応であってもよく、または１つ以上の複合的な増幅反応
であってもよい。
【００２８】増幅プライマーの標的結合性配列は、オリ
ゴヌクレオチドに種ハイブリダイゼーション特異性を与
え、従って、増幅反応に種特異性を提供する。従って、
本発明の増幅プライマーの標的結合性配列は、ＰＣＲ、
従来のＳＤＡ（ｔＳＤＡと本質的に同じであるが、中温
性酵素を使用して、より低温で実施される反応体系）、
３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳ等の、他の核酸増幅プ
ロトコールにおいても有用である。具体的には、標的配
列への、プライマーの周期的な、特異的ハイブリダイゼ
ーションを使用するプロトコール、標的配列を鋳型とし
て使用するプライマーの伸長、および伸長生成物の標的
配列からの分離または置換は、本発明の標的結合性配列
を使用することが可能である。専門の非標的結合性配列
を必要としない増幅方法（たとえば、ＰＣＲ）の場合、
増幅プライマーは、表１に記載の増幅プライマーの標的
結合性配列のみで構成されてもよい。
ゴヌクレオチドに種ハイブリダイゼーション特異性を与
え、従って、増幅反応に種特異性を提供する。従って、
本発明の増幅プライマーの標的結合性配列は、ＰＣＲ、
従来のＳＤＡ（ｔＳＤＡと本質的に同じであるが、中温
性酵素を使用して、より低温で実施される反応体系）、
３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳ等の、他の核酸増幅プ
ロトコールにおいても有用である。具体的には、標的配
列への、プライマーの周期的な、特異的ハイブリダイゼ
ーションを使用するプロトコール、標的配列を鋳型とし
て使用するプライマーの伸長、および伸長生成物の標的
配列からの分離または置換は、本発明の標的結合性配列
を使用することが可能である。専門の非標的結合性配列
を必要としない増幅方法（たとえば、ＰＣＲ）の場合、
増幅プライマーは、表１に記載の増幅プライマーの標的
結合性配列のみで構成されてもよい。
【００２９】オリゴヌクレオチドの種特異性を変えるこ
となく、選択された増幅反応を実施するのに必要な他の
配列を、本明細書に開示されている標的結合性配列に、
任意に付加することが可能である。例として、特異的増
幅プライマーは、ＳＤＡ反応中に切断される制限エンド
ヌクレアーゼＢｓｏＢＩに対する認識部位を含んでもよ
い。ＥＰ ０ ６８４ ３１５号に開示の認識部位を含
むがその限りではない、他の切断可能な制限エンドヌク
レアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢＩ認識部位の代わりに使
用できることは、当業者に明らかになるであろう。好ま
しくは、この認識部位は、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼに対するものであり、従って、ｔＳＤＡの条件で増幅
反応を実施することが可能である。同様に、増幅プライ
マーの尾部配列（５’から制限エンドヌクレアーゼ認識
部位まで）は、一般に重要ではないが、ＳＤＡに使用さ
れる制限部位、およびそれ自身の標的結合性配列か他の
プライマーのいずれかにハイブリダイズする配列は避け
るべきである。従って幾つかのＳＤＡ用増幅プライマー
は、３’標的結合性配列、５’から標的結合性配列まで
の切断可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および
５’から制限ヌクレアーゼ認識部位の１０〜２５ヌクレ
オチドの長さの尾部配列からなる。切断可能な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位および尾部配列は、ＳＤＡ反応
に必要な配列である。２０００年５月１８日提出の米国
特許出願番号第０９／５７３，２４２号に記載の通り、
ＳＤＡ用の幾つかの増幅プライマーは、制限酵素認識部
位の５’および３’の両者の、標的特異的配列で構成さ
れてもよい。このデザインを用いて、標的特異的ハイブ
リダイゼーションの効率を高めることができる。他の増
幅反応（たとえば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳ）
の場合、増幅プライマーは、標的結合性配列および選択
された増幅反応に必要なさらなる配列（たとえば、上述
のＳＤＡに必要な配列、または３ＳＲではＲＮＡポリメ
ラーゼにより認識されるプロモーター）で構成されても
よい。本発明の標的結合性配列を、ＳＤＡ以外の増幅方
法に合わせて改変する場合、増幅プライマーを調製する
ためのルーチンの方法（たとえば化学合成）および選択
された増幅反応のプライマーに必要な周知の構造上の条
件を使用する。従って、本発明の標的結合性配列は、産
生、スクリーニングおよび最適化のためのルーチンの方
法のみを使用した様々な増幅反応における、Ｍ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ微生物特異的標的増幅ならびに検出に合
わせて容易に改変される。
となく、選択された増幅反応を実施するのに必要な他の
配列を、本明細書に開示されている標的結合性配列に、
任意に付加することが可能である。例として、特異的増
幅プライマーは、ＳＤＡ反応中に切断される制限エンド
ヌクレアーゼＢｓｏＢＩに対する認識部位を含んでもよ
い。ＥＰ ０ ６８４ ３１５号に開示の認識部位を含
むがその限りではない、他の切断可能な制限エンドヌク
レアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢＩ認識部位の代わりに使
用できることは、当業者に明らかになるであろう。好ま
しくは、この認識部位は、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼに対するものであり、従って、ｔＳＤＡの条件で増幅
反応を実施することが可能である。同様に、増幅プライ
マーの尾部配列（５’から制限エンドヌクレアーゼ認識
部位まで）は、一般に重要ではないが、ＳＤＡに使用さ
れる制限部位、およびそれ自身の標的結合性配列か他の
プライマーのいずれかにハイブリダイズする配列は避け
るべきである。従って幾つかのＳＤＡ用増幅プライマー
は、３’標的結合性配列、５’から標的結合性配列まで
の切断可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および
５’から制限ヌクレアーゼ認識部位の１０〜２５ヌクレ
オチドの長さの尾部配列からなる。切断可能な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位および尾部配列は、ＳＤＡ反応
に必要な配列である。２０００年５月１８日提出の米国
特許出願番号第０９／５７３，２４２号に記載の通り、
ＳＤＡ用の幾つかの増幅プライマーは、制限酵素認識部
位の５’および３’の両者の、標的特異的配列で構成さ
れてもよい。このデザインを用いて、標的特異的ハイブ
リダイゼーションの効率を高めることができる。他の増
幅反応（たとえば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳ）
の場合、増幅プライマーは、標的結合性配列および選択
された増幅反応に必要なさらなる配列（たとえば、上述
のＳＤＡに必要な配列、または３ＳＲではＲＮＡポリメ
ラーゼにより認識されるプロモーター）で構成されても
よい。本発明の標的結合性配列を、ＳＤＡ以外の増幅方
法に合わせて改変する場合、増幅プライマーを調製する
ためのルーチンの方法（たとえば化学合成）および選択
された増幅反応のプライマーに必要な周知の構造上の条
件を使用する。従って、本発明の標的結合性配列は、産
生、スクリーニングおよび最適化のためのルーチンの方
法のみを使用した様々な増幅反応における、Ｍ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ微生物特異的標的増幅ならびに検出に合
わせて容易に改変される。
【００３０】バンパープライマーは下流の種特異的増幅
プライマーを置換するように作用するため、ＳＤＡで
は、バンパープライマーは種特異性に不可欠ではない。
バンパープライマーが、増幅プライマーから上流の標的
にハイブリダイズすることだけが必要であり、従って、
バンパープライマーを伸長させると、バンパープライマ
ーは増幅プライマーおよびその伸長生成物を置換させ
る。従って、バンパープライマーの特定の配列は概して
重要ではなく、バンパープライマーが伸長したときに増
幅プライマー伸長生成物を置換できるように、増幅プラ
イマーの結合部位に十分近い上流の標的配列から誘導し
てもよい。バンパープライマー配列における標的と不一
致がたまにあっても、または非標的配列との交差ハイブ
リダイゼーションが多少あっても、バンパープライマー
が相変わらず特異的標的配列にハイブリダイズすること
ができる限り、概して、増幅効率にマイナスの影響はな
い。
プライマーを置換するように作用するため、ＳＤＡで
は、バンパープライマーは種特異性に不可欠ではない。
バンパープライマーが、増幅プライマーから上流の標的
にハイブリダイズすることだけが必要であり、従って、
バンパープライマーを伸長させると、バンパープライマ
ーは増幅プライマーおよびその伸長生成物を置換させ
る。従って、バンパープライマーの特定の配列は概して
重要ではなく、バンパープライマーが伸長したときに増
幅プライマー伸長生成物を置換できるように、増幅プラ
イマーの結合部位に十分近い上流の標的配列から誘導し
てもよい。バンパープライマー配列における標的と不一
致がたまにあっても、または非標的配列との交差ハイブ
リダイゼーションが多少あっても、バンパープライマー
が相変わらず特異的標的配列にハイブリダイズすること
ができる限り、概して、増幅効率にマイナスの影響はな
い。
【００３１】本発明のプライマーを使用する増幅反応
は、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）
による教示通り、チミンを組み込んでもよく、あるい
は、ＥＰ ０ ６２４ ６４３号に教示の通り、後続の
増幅反応の交差汚染を減少させるために、ＴＴＰの代わ
りに２’−デオキシウイリジン ５’三リン酸を全部ま
たは部分的に反応で使用してもよい。ｄＵ（ウリジン）
を増幅生成物に組み込み、ウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼ（ＵＤＧ）で処理することによって切除することがで
きる。これらの失歩部位は、後続の増幅反応において、
増幅生成物を増幅不能にする。新たに形成される増幅生
成物におけるｄＵの切除を防止するために、ＵＤＧをウ
ラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）で
不活化してから、後続の増幅を実施することが可能であ
る。
は、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）
による教示通り、チミンを組み込んでもよく、あるい
は、ＥＰ ０ ６２４ ６４３号に教示の通り、後続の
増幅反応の交差汚染を減少させるために、ＴＴＰの代わ
りに２’−デオキシウイリジン ５’三リン酸を全部ま
たは部分的に反応で使用してもよい。ｄＵ（ウリジン）
を増幅生成物に組み込み、ウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼ（ＵＤＧ）で処理することによって切除することがで
きる。これらの失歩部位は、後続の増幅反応において、
増幅生成物を増幅不能にする。新たに形成される増幅生
成物におけるｄＵの切除を防止するために、ＵＤＧをウ
ラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）で
不活化してから、後続の増幅を実施することが可能であ
る。
【００３２】ＳＤＡは、プライマーの切除、半修飾され
た制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位のニッキン
グ、一本鎖伸長生成物の置換、伸長生成物（または本来
の標的配列）へのプライマーのアニーリングおよびその
後のプライマーの伸長が、反応混合物中で同時に起こる
等熱方法である。これは、反応のステップが、反応の温
度循環特性の結果として非連続相または周期で行われる
ＰＣＲと対照的である。ＳＤＡは、１）制限エンドヌク
レアーゼが、そのヘミホスホロチオエート型二本鎖認識
／切断部位の未修飾の鎖を切断できることと、２）ある
特定のポリメラーゼがニックにて複製を開始し且つ下流
の非鋳型鎖を置換できることとに基づく。プライマーを
アニーリングするために、高温（約９５℃）にて最初に
インキュベートして二本鎖標的配列を変性させた後、続
いて、新たに合成された鎖の増幅および置換を定温で行
う。標的配列の新しい各コピーの作製は、１）増幅プラ
イマーを本来の標的配列または予め重合して置換した一
本鎖伸長生成物に結合するステップと、２）α−チオ
デオキシヌクレオシド三リン酸を取り込む５’−３’エ
クソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによりプライマーを
伸長するステップと、３）半修飾された二本鎖制限部位
を切断するステップと、４）制限酵素をニック部位から
分離するステップと、５）５’−３’エクソヌクレアー
ゼ欠損ポリメラーゼによってニックの３’末端から伸長
し、下流の新たに合成された鎖を置換するステップと
の、５ステップからなる。ニックからの伸長は別の切断
可能な制限部位を再生させるため、ニッキング（ｎｉｃ
ｋｉｎｇ）、重合および置換は、定温で同時に且つ連続
的に起こる。一対の増幅プライマーを使用し、それぞれ
が二本鎖標的配列の２本の鎖のうちの１本にハイブリダ
イズする場合、増殖は指数関数的である。これは、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖が、その後の循環の増幅にお
いて、反対側のプライマー用の鋳型の役割を果たすため
である。１つの増幅プライマーを使用するとき、ただ１
本の鎖がプライマー伸長用の鋳型の役割を果たすため、
増幅は直線的である。α−チオ ｄＮＴＰが組み込まれ
たとき、二本鎖認識／切断部位を切断する制限エンドヌ
クレアーゼの例は、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、Ａｖ
ａＩ、ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩである。これらの制
限エンドヌクレアーゼおよび必要なニッキング活性を示
す他の制限エンドヌクレアーゼは全て、従来のＳＤＡで
使用するのに適する。しかし、これらは比較的熱に不安
定であり、約４０℃以上で活性を失う。
た制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位のニッキン
グ、一本鎖伸長生成物の置換、伸長生成物（または本来
の標的配列）へのプライマーのアニーリングおよびその
後のプライマーの伸長が、反応混合物中で同時に起こる
等熱方法である。これは、反応のステップが、反応の温
度循環特性の結果として非連続相または周期で行われる
ＰＣＲと対照的である。ＳＤＡは、１）制限エンドヌク
レアーゼが、そのヘミホスホロチオエート型二本鎖認識
／切断部位の未修飾の鎖を切断できることと、２）ある
特定のポリメラーゼがニックにて複製を開始し且つ下流
の非鋳型鎖を置換できることとに基づく。プライマーを
アニーリングするために、高温（約９５℃）にて最初に
インキュベートして二本鎖標的配列を変性させた後、続
いて、新たに合成された鎖の増幅および置換を定温で行
う。標的配列の新しい各コピーの作製は、１）増幅プラ
イマーを本来の標的配列または予め重合して置換した一
本鎖伸長生成物に結合するステップと、２）α−チオ
デオキシヌクレオシド三リン酸を取り込む５’−３’エ
クソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによりプライマーを
伸長するステップと、３）半修飾された二本鎖制限部位
を切断するステップと、４）制限酵素をニック部位から
分離するステップと、５）５’−３’エクソヌクレアー
ゼ欠損ポリメラーゼによってニックの３’末端から伸長
し、下流の新たに合成された鎖を置換するステップと
の、５ステップからなる。ニックからの伸長は別の切断
可能な制限部位を再生させるため、ニッキング（ｎｉｃ
ｋｉｎｇ）、重合および置換は、定温で同時に且つ連続
的に起こる。一対の増幅プライマーを使用し、それぞれ
が二本鎖標的配列の２本の鎖のうちの１本にハイブリダ
イズする場合、増殖は指数関数的である。これは、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖が、その後の循環の増幅にお
いて、反対側のプライマー用の鋳型の役割を果たすため
である。１つの増幅プライマーを使用するとき、ただ１
本の鎖がプライマー伸長用の鋳型の役割を果たすため、
増幅は直線的である。α−チオ ｄＮＴＰが組み込まれ
たとき、二本鎖認識／切断部位を切断する制限エンドヌ
クレアーゼの例は、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、Ａｖ
ａＩ、ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩである。これらの制
限エンドヌクレアーゼおよび必要なニッキング活性を示
す他の制限エンドヌクレアーゼは全て、従来のＳＤＡで
使用するのに適する。しかし、これらは比較的熱に不安
定であり、約４０℃以上で活性を失う。
【００３３】ＳＤＡによる増幅の標的は、より大きい核
酸を断片化することによって調製することが可能であ
る。しかし、ＳＤＡ反応におけるニッキングのために選
択された制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有す
る標的核酸は、Ｗａｌｋｅｒｅｔ ａｌ．（１９９２
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６
９６）および米国特許第５，２７０，１８４号（特に、
参照することにより本明細書に組み込まれるものとす
る）に記載されている通りに生成することが一般に好ま
しい。簡単に記載すると、標的配列が２本鎖であれば、
４つのプライマーが標的配列にハイブリダイズされる。
このプライマーのうち２つ（Ｓ1およびＳ2）は、ＳＤＡ
増幅プライマーであり、２つ（Ｂ1およびＢ2）は、外
部、すなわちバンパープライマーである。Ｓ1およびＳ2
は、標的配列側方の、二本鎖核酸の反対側の鎖に結合す
る。Ｂ1およびＢ2は、それぞれ、Ｓ1およびＳ2の標的配
列５’（すなわち、上流）に結合する。次いで、３つの
デオキシヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの
修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸（たとえば、
２’−デオキシアデノシン ５’−Ｏ−（１−チオ三リ
ン酸）、「ｄＡＴＰαＳ」）の存在下で、エキソヌクレ
アーゼ欠損ポリメラーゼを使用して、４つのプライマー
全てを同時に伸長する。その結果、Ｓ1およびＳ2の伸長
生成物は、Ｂ1およびＢ2の伸長によって、本来の標的配
列鋳型から追い払われる。追い払われた、増幅プライマ
ーの一本鎖伸長生成物は、反対側の増幅およびバンパー
プライマーが結合する標的の役割を果たす（たとえば、
Ｓ1の伸長生成物はＳ2およびＢ2に結合する）。伸長の
次の反復および置換は、結果として、各末端に半修飾さ
れた制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有する２
つの二本鎖核酸断片を生じる。これらは、ＳＤＡによる
増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と同様、標的生
成反応の個々のステップは同時に且つ連続的に起こり、
ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な末端に認
識／切断配列を有する標的配列が生じる。ＳＤＡ反応の
全成分が既に標的生成反応に存在するため、自動的且つ
連続的に生成された標的配列はＳＤＡ反復に入り、増幅
される。
酸を断片化することによって調製することが可能であ
る。しかし、ＳＤＡ反応におけるニッキングのために選
択された制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有す
る標的核酸は、Ｗａｌｋｅｒｅｔ ａｌ．（１９９２
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６
９６）および米国特許第５，２７０，１８４号（特に、
参照することにより本明細書に組み込まれるものとす
る）に記載されている通りに生成することが一般に好ま
しい。簡単に記載すると、標的配列が２本鎖であれば、
４つのプライマーが標的配列にハイブリダイズされる。
このプライマーのうち２つ（Ｓ1およびＳ2）は、ＳＤＡ
増幅プライマーであり、２つ（Ｂ1およびＢ2）は、外
部、すなわちバンパープライマーである。Ｓ1およびＳ2
は、標的配列側方の、二本鎖核酸の反対側の鎖に結合す
る。Ｂ1およびＢ2は、それぞれ、Ｓ1およびＳ2の標的配
列５’（すなわち、上流）に結合する。次いで、３つの
デオキシヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの
修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸（たとえば、
２’−デオキシアデノシン ５’−Ｏ−（１−チオ三リ
ン酸）、「ｄＡＴＰαＳ」）の存在下で、エキソヌクレ
アーゼ欠損ポリメラーゼを使用して、４つのプライマー
全てを同時に伸長する。その結果、Ｓ1およびＳ2の伸長
生成物は、Ｂ1およびＢ2の伸長によって、本来の標的配
列鋳型から追い払われる。追い払われた、増幅プライマ
ーの一本鎖伸長生成物は、反対側の増幅およびバンパー
プライマーが結合する標的の役割を果たす（たとえば、
Ｓ1の伸長生成物はＳ2およびＢ2に結合する）。伸長の
次の反復および置換は、結果として、各末端に半修飾さ
れた制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有する２
つの二本鎖核酸断片を生じる。これらは、ＳＤＡによる
増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と同様、標的生
成反応の個々のステップは同時に且つ連続的に起こり、
ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な末端に認
識／切断配列を有する標的配列が生じる。ＳＤＡ反応の
全成分が既に標的生成反応に存在するため、自動的且つ
連続的に生成された標的配列はＳＤＡ反復に入り、増幅
される。
【００３４】別の増幅生成物による、１つのＳＤＡ反応
の交差汚染を防止するために、増幅反応を阻害せずに、
ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み
込むことができる。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼ（ＵＤＧ）で処理することにより、ウラシル修飾核
酸を特異的に認識して不活化することが可能である。従
って、事前の反応でｄＵＴＰがＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み
込まれるのであれば、二本鎖標的を増幅する前に、その
後のＳＤＡ反応をＵＤＧで処理することができ、先に増
幅された反応からのＤＮＡを含むｄＵを増幅不可能にす
る。その後の反応で増幅されるべき標的ｄＮＡはｄＵを
含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次いで、標
的の増幅前にＵＧＩで処理することにより、ＵＤＧを阻
害することができる。あるいは、ＵＤＧを熱不活化して
もよい。ｔＳＤＡの場合、反応の高温そのもの（≧５０
℃）を同時に使用して、ＵＤＧを不活化し、標的を増幅
することができる。
の交差汚染を防止するために、増幅反応を阻害せずに、
ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み
込むことができる。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼ（ＵＤＧ）で処理することにより、ウラシル修飾核
酸を特異的に認識して不活化することが可能である。従
って、事前の反応でｄＵＴＰがＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み
込まれるのであれば、二本鎖標的を増幅する前に、その
後のＳＤＡ反応をＵＤＧで処理することができ、先に増
幅された反応からのＤＮＡを含むｄＵを増幅不可能にす
る。その後の反応で増幅されるべき標的ｄＮＡはｄＵを
含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次いで、標
的の増幅前にＵＧＩで処理することにより、ＵＤＧを阻
害することができる。あるいは、ＵＤＧを熱不活化して
もよい。ｔＳＤＡの場合、反応の高温そのもの（≧５０
℃）を同時に使用して、ＵＤＧを不活化し、標的を増幅
することができる。
【００３５】ＳＤＡは、５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性が欠如したポリメラーゼを必要とし、二本鎖核酸の
一本鎖ニックにて重合を開始し、ニックの下流の鎖を置
換させる一方で、未切断鎖を鋳型として使用して新たな
相補鎖を生成する。ポリメラーゼは、ヌクレオチドを遊
離の３’−ＯＨに付加することによって伸長しなければ
ならない。ＳＤＡ反応を最適化するためには、ポリメラ
ーゼが、増幅できる標的配列の長さを最大化するのに極
めて前進的であることも望ましい。極めて前進的なポリ
メラーゼは、伸長生成物を分離して終結する前に、かな
りの長さの新しい鎖を重合することができる。置換活性
は、さらなるコピーの合成に利用できる標的を作り、且
つ指数関数的増幅反応で、第２の増幅プライマーがハイ
ブリダイズすることが可能な対象である一本鎖伸長生成
物を生成するため、増幅反応に不可欠である。制限酵素
のニッキング活性は、反応を永続させ、標的増幅のその
後の循環が開始するのを可能にするニッキングであるた
め、これも非常に重要である。
活性が欠如したポリメラーゼを必要とし、二本鎖核酸の
一本鎖ニックにて重合を開始し、ニックの下流の鎖を置
換させる一方で、未切断鎖を鋳型として使用して新たな
相補鎖を生成する。ポリメラーゼは、ヌクレオチドを遊
離の３’−ＯＨに付加することによって伸長しなければ
ならない。ＳＤＡ反応を最適化するためには、ポリメラ
ーゼが、増幅できる標的配列の長さを最大化するのに極
めて前進的であることも望ましい。極めて前進的なポリ
メラーゼは、伸長生成物を分離して終結する前に、かな
りの長さの新しい鎖を重合することができる。置換活性
は、さらなるコピーの合成に利用できる標的を作り、且
つ指数関数的増幅反応で、第２の増幅プライマーがハイ
ブリダイズすることが可能な対象である一本鎖伸長生成
物を生成するため、増幅反応に不可欠である。制限酵素
のニッキング活性は、反応を永続させ、標的増幅のその
後の循環が開始するのを可能にするニッキングであるた
め、これも非常に重要である。
【００３６】ｔＳＤＡは、適切な熱安定性ポリメラーゼ
および熱安定性制限エンドヌクレアーゼを取り替えて、
本質的に、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：
３９２−３９６および１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）に記載されてい
る従来のＳＤＡと同様に実施される。もちろん、反応温
度は、取り替えられた酵素に適した高温に調節し、Ｈｉ
ｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選
択された熱安定性エンドヌクレアーゼに適切な制限エン
ドヌクレアーゼ認識／切断部位と取り替える。また、Ｗ
ａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．と対照的に、酵素が変性温度
で十分に安定であれば、専門家は、最初の変性ステップ
の前に酵素を反応混合物に含める。ｔＳＤＡで使用する
のに好ましい制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、Ｂ
ｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩおよびＢｓｏＢＩ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、およびＢｓ
ｔＯＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。好ましい好熱性ポリ
メラーゼは、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＢｓｔ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）である。
および熱安定性制限エンドヌクレアーゼを取り替えて、
本質的に、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：
３９２−３９６および１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）に記載されてい
る従来のＳＤＡと同様に実施される。もちろん、反応温
度は、取り替えられた酵素に適した高温に調節し、Ｈｉ
ｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選
択された熱安定性エンドヌクレアーゼに適切な制限エン
ドヌクレアーゼ認識／切断部位と取り替える。また、Ｗ
ａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．と対照的に、酵素が変性温度
で十分に安定であれば、専門家は、最初の変性ステップ
の前に酵素を反応混合物に含める。ｔＳＤＡで使用する
のに好ましい制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、Ｂ
ｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩおよびＢｓｏＢＩ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、およびＢｓ
ｔＯＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。好ましい好熱性ポリ
メラーゼは、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＢｓｔ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）である。
【００３７】同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡは、ｔＳＤ
Ａの改良型である。これは、検出器オリゴヌクレオチド
を使用して、標的依存的様式で、低い蛍光消光をもたら
す。この検出器オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下
で蛍光消光が起こるように連結されたドナー／アクセプ
ター色素対を含む。標的の存在下で、検出器オリゴヌク
レオチドにおける分子内塩基対形成二次構造のアンフォ
ールディングおよび直線化は、色素間の距離を増大し、
蛍光消光を減少させる。塩基対形成二次構造のアンフォ
ールディングは、一般に、二次構造が少なくとも部分的
に乱されるように、二次構造の配列と相補鎖との間の分
子間塩基対形成を含む。十分な長さの相補鎖の存在下
で、二次構造を十分に直線化することが可能である。好
ましい実施形態では、二次構造と相補鎖との間の分子間
塩基対形成によって、ＲＥＲＳが二本鎖になり、制限エ
ンドヌクレアーゼで切断できるように、制限エンドヌク
レアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は、２つの色素の間に存
在する。制限エンドヌクレアーゼで切断することによ
り、ドナー色素とアクセプター色素を別個の核酸断片上
に分離し、さらに、消光低下の一助となる。いずれの実
施形態でも、付随する蛍光パラメーターの変化（たとえ
ば、ドナー蛍光強度の増強、アクセプター蛍光強度の低
下、またはウンフォールディング前後の蛍光の比率）
を、標的配列が存在する指標としてモニタリングする。
ドナー蛍光強度の変化は、一般にアクセプター蛍光強度
の変化より大きいため、ドナー蛍光強度の変化をモニタ
リングすることが好ましい。蛍光寿命等の他の蛍光パラ
メーターをモニタリングしてもよい。オリゴヌクレオチ
ドの切断は、ＤＮＡ重複部位の両鎖のホスホジエステル
結合を破壊すること、または一本鎖ＤＮＡのホスホジエ
ステル結合を破壊することを指す。これは、ＤＮＡ重複
部位における二本の鎖のうちの１本のみのホスホジエス
テル結合を破壊することを指すニッキングと対照的であ
る。
Ａの改良型である。これは、検出器オリゴヌクレオチド
を使用して、標的依存的様式で、低い蛍光消光をもたら
す。この検出器オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下
で蛍光消光が起こるように連結されたドナー／アクセプ
ター色素対を含む。標的の存在下で、検出器オリゴヌク
レオチドにおける分子内塩基対形成二次構造のアンフォ
ールディングおよび直線化は、色素間の距離を増大し、
蛍光消光を減少させる。塩基対形成二次構造のアンフォ
ールディングは、一般に、二次構造が少なくとも部分的
に乱されるように、二次構造の配列と相補鎖との間の分
子間塩基対形成を含む。十分な長さの相補鎖の存在下
で、二次構造を十分に直線化することが可能である。好
ましい実施形態では、二次構造と相補鎖との間の分子間
塩基対形成によって、ＲＥＲＳが二本鎖になり、制限エ
ンドヌクレアーゼで切断できるように、制限エンドヌク
レアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は、２つの色素の間に存
在する。制限エンドヌクレアーゼで切断することによ
り、ドナー色素とアクセプター色素を別個の核酸断片上
に分離し、さらに、消光低下の一助となる。いずれの実
施形態でも、付随する蛍光パラメーターの変化（たとえ
ば、ドナー蛍光強度の増強、アクセプター蛍光強度の低
下、またはウンフォールディング前後の蛍光の比率）
を、標的配列が存在する指標としてモニタリングする。
ドナー蛍光強度の変化は、一般にアクセプター蛍光強度
の変化より大きいため、ドナー蛍光強度の変化をモニタ
リングすることが好ましい。蛍光寿命等の他の蛍光パラ
メーターをモニタリングしてもよい。オリゴヌクレオチ
ドの切断は、ＤＮＡ重複部位の両鎖のホスホジエステル
結合を破壊すること、または一本鎖ＤＮＡのホスホジエ
ステル結合を破壊することを指す。これは、ＤＮＡ重複
部位における二本の鎖のうちの１本のみのホスホジエス
テル結合を破壊することを指すニッキングと対照的であ
る。
【００３８】同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の検出器
オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズする
一本鎖５’セクションまたは３’セクション（標的結合
性配列）、ならびに標的結合性配列に隣接する分子内塩
基対形成二次構造の両者を含むオリゴヌクレオチドであ
ってもよい。図１に示す好ましい実施形態では、検出器
オリゴヌクレオチドは、表テロ配列にハイブリダイズし
ない一本鎖５’セクションまたは３’セクションを含む
レポータープローブである。むしろ、一本鎖５’セクシ
ョンまたは３’セクションは、シグナルプライマーアダ
プター配列の補体（アダプター−補体結合性配列）にハ
イブリダイズする。レポータープローブのさらなる特徴
は、このハイブリダイズセクションが分子内塩基対形成
二次構造に隣接することである。本発明の検出器オリゴ
ヌクレオチドは、二次構造が分子内塩基対形成したと
き、ドナー蛍光が消光され、二次構造のアンフォールデ
ィングおよび直線化の結果として蛍光消光が減少するよ
うに検出器オリゴヌクレオチドに連結されたドナー／ア
クセプター色素対をさらに含む。
オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズする
一本鎖５’セクションまたは３’セクション（標的結合
性配列）、ならびに標的結合性配列に隣接する分子内塩
基対形成二次構造の両者を含むオリゴヌクレオチドであ
ってもよい。図１に示す好ましい実施形態では、検出器
オリゴヌクレオチドは、表テロ配列にハイブリダイズし
ない一本鎖５’セクションまたは３’セクションを含む
レポータープローブである。むしろ、一本鎖５’セクシ
ョンまたは３’セクションは、シグナルプライマーアダ
プター配列の補体（アダプター−補体結合性配列）にハ
イブリダイズする。レポータープローブのさらなる特徴
は、このハイブリダイズセクションが分子内塩基対形成
二次構造に隣接することである。本発明の検出器オリゴ
ヌクレオチドは、二次構造が分子内塩基対形成したと
き、ドナー蛍光が消光され、二次構造のアンフォールデ
ィングおよび直線化の結果として蛍光消光が減少するよ
うに検出器オリゴヌクレオチドに連結されたドナー／ア
クセプター色素対をさらに含む。
【００３９】同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の本発明
の検出器オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長または
ハイブリダイゼーションのために選択された反応条件で
分子内塩基対形成二次高構造を形成する配列を含む。１
つの実施形態では、標的結合性配列の少なくとも一部が
一本鎖３’尾部または５’尾部を形成するように、この
二次構造を検出器オリゴヌクレオチドの標的結合性配列
の近くに配置してもよい。図１に示す好ましい実施形態
では、アダプター−補体結合性配列の少なくとも一部が
一本鎖３’尾部または５’尾部を形成するように、この
二次構造は、レポータープローブ検出器オリゴヌクレオ
チドのアダプター−補体結合性配列の近くに配置され
る。本明細書で使用する用語「標的結合性配列の近く」
または「アダプター−補体結合性配列の近く」は、標的
／アダプター−補体結合性配列の全部または一部が、標
的／アダプター−補体へのハイブリダイゼーションに使
用できる５’尾部または３’尾部において一本鎖のまま
であることを意味する。すなわち、二次構造は標的／ア
ダプター−補体結合性配列全体を含まない。標的／アダ
プター−補体結合性配列は、その一部が二次構造におけ
る分子内塩基対形成に関与している可能性があり、二次
構造における分子内塩基対形成に関与する第１の配列の
一部または全部を含んでもよいが、その相補配列内に達
しないことが好ましい。たとえば、二次構造がステム・
ループ構造（たとえば、「ヘアピン」）であり、且つ検
出器オリゴヌクレオチドの標的／アダプター−補体結合
性配列が一本鎖３’尾部として存在するのであれば、標
的／アダプター−補体結合性配列は、ステムの第１アー
ムの全部または一部、および任意に、ループの全部また
は一部を通って伸びてもよい。しかし、標的／アダプタ
ー−補体結合性配列は、ステム分子内塩基対形成に関与
する配列の第２アーム内に達しないことが好ましい。す
なわち、標的／アダプター−補体にハイブリダイズする
ことができる二次構造において分子内塩基対形成に関与
する両配列を有することを回避することが望ましい。検
出器オリゴヌクレオチド二次構造の分子内塩基対形成部
分における不一致によって、標的の存在下で蛍光の変化
の大きさが減少する可能性があるが、分析感度が問題で
なければ許容できる。一本鎖尾部の標的／アダプター−
補体結合性配列における不一致も許容できるが、分析感
度および／または特異性が同様に低下する可能性があ
る。しかし、二次構造および標的／アダプター−補体結
合性配列の両者における完全な塩基対形成により反応が
損なわれないことが本発明の特質である。ハイブリダイ
ゼーションに関与する配列における完全一致は、反応動
力学に対してマイナスの影響を与えずに、分析特異性を
向上させる。
の検出器オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長または
ハイブリダイゼーションのために選択された反応条件で
分子内塩基対形成二次高構造を形成する配列を含む。１
つの実施形態では、標的結合性配列の少なくとも一部が
一本鎖３’尾部または５’尾部を形成するように、この
二次構造を検出器オリゴヌクレオチドの標的結合性配列
の近くに配置してもよい。図１に示す好ましい実施形態
では、アダプター−補体結合性配列の少なくとも一部が
一本鎖３’尾部または５’尾部を形成するように、この
二次構造は、レポータープローブ検出器オリゴヌクレオ
チドのアダプター−補体結合性配列の近くに配置され
る。本明細書で使用する用語「標的結合性配列の近く」
または「アダプター−補体結合性配列の近く」は、標的
／アダプター−補体結合性配列の全部または一部が、標
的／アダプター−補体へのハイブリダイゼーションに使
用できる５’尾部または３’尾部において一本鎖のまま
であることを意味する。すなわち、二次構造は標的／ア
ダプター−補体結合性配列全体を含まない。標的／アダ
プター−補体結合性配列は、その一部が二次構造におけ
る分子内塩基対形成に関与している可能性があり、二次
構造における分子内塩基対形成に関与する第１の配列の
一部または全部を含んでもよいが、その相補配列内に達
しないことが好ましい。たとえば、二次構造がステム・
ループ構造（たとえば、「ヘアピン」）であり、且つ検
出器オリゴヌクレオチドの標的／アダプター−補体結合
性配列が一本鎖３’尾部として存在するのであれば、標
的／アダプター−補体結合性配列は、ステムの第１アー
ムの全部または一部、および任意に、ループの全部また
は一部を通って伸びてもよい。しかし、標的／アダプタ
ー−補体結合性配列は、ステム分子内塩基対形成に関与
する配列の第２アーム内に達しないことが好ましい。す
なわち、標的／アダプター−補体にハイブリダイズする
ことができる二次構造において分子内塩基対形成に関与
する両配列を有することを回避することが望ましい。検
出器オリゴヌクレオチド二次構造の分子内塩基対形成部
分における不一致によって、標的の存在下で蛍光の変化
の大きさが減少する可能性があるが、分析感度が問題で
なければ許容できる。一本鎖尾部の標的／アダプター−
補体結合性配列における不一致も許容できるが、分析感
度および／または特異性が同様に低下する可能性があ
る。しかし、二次構造および標的／アダプター−補体結
合性配列の両者における完全な塩基対形成により反応が
損なわれないことが本発明の特質である。ハイブリダイ
ゼーションに関与する配列における完全一致は、反応動
力学に対してマイナスの影響を与えずに、分析特異性を
向上させる。
【００４０】本発明の検出器オリゴヌクレオチドレポー
タープローブは、増幅反応に加えられると、図１に示す
とおり、ハイブリダイゼーションおよび伸長によって二
本鎖型に転換される。ポリメラーゼによる鎖置換も二次
構造をほどくかまたは直線化し、これを相補鎖の合成に
よって二本鎖型に転換する。ＲＥＲＳも、存在する場合
には、二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼにより切
断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）になる。二次構造が、ポ
リメラーゼの鎖置換活性によってほどかれるかまたは直
線化されるため、ドナー色素とアクセプター色素との間
の距離が増加し、その結果、ドナー蛍光の消光が減少す
る。随伴する、ドナー色素またはアクセプター色素のい
ずれかの蛍光の変化は、標的配列の増幅の指標としてモ
ニタリングまたは検出することができる。一般に、ＲＥ
ＲＳが切断されると、それぞれ、２個の色素のうちの一
方を有する２個の別個の二本鎖二次増幅生成物断片が生
成することにより、蛍光の変化の大きさがさらに増大す
る。これらの断片は、反応溶液中で自由に拡散し、ドナ
ー／アクセプター対の色素間の距離がさらに増大する。
ドナー蛍光強度の上昇またはアクセプター蛍光強度の低
下は、標的増幅が起きているまたは起きた指標として、
検出および／またはモニタリングしてもよいが、ドナー
／アクセプター色素対の接近により影響を受ける他の蛍
光パラメーターをモニタリングしてもよい。ドナーまた
はアクセプターの蛍光強度の変化は、ドナーおよび／ま
たはアクセプター蛍光強度の比率の変化として検出する
こともできる。たとえば、蛍光強度の変化は、ａ）二次
構造の直線化またはアンフォールディング後のドナーフ
ルオロフォア蛍光と直線化またはアンフォールディング
前の検出器オリゴヌクレオチドにおけるフルオロフォア
蛍光との比率の上昇、またはｂ）二次構造の直線化また
はアンフォールディング後のアクセプター色素蛍光と直
線化またはアンフォールディング前の検出器オリゴヌク
レオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低下
として検出することが可能である。
タープローブは、増幅反応に加えられると、図１に示す
とおり、ハイブリダイゼーションおよび伸長によって二
本鎖型に転換される。ポリメラーゼによる鎖置換も二次
構造をほどくかまたは直線化し、これを相補鎖の合成に
よって二本鎖型に転換する。ＲＥＲＳも、存在する場合
には、二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼにより切
断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）になる。二次構造が、ポ
リメラーゼの鎖置換活性によってほどかれるかまたは直
線化されるため、ドナー色素とアクセプター色素との間
の距離が増加し、その結果、ドナー蛍光の消光が減少す
る。随伴する、ドナー色素またはアクセプター色素のい
ずれかの蛍光の変化は、標的配列の増幅の指標としてモ
ニタリングまたは検出することができる。一般に、ＲＥ
ＲＳが切断されると、それぞれ、２個の色素のうちの一
方を有する２個の別個の二本鎖二次増幅生成物断片が生
成することにより、蛍光の変化の大きさがさらに増大す
る。これらの断片は、反応溶液中で自由に拡散し、ドナ
ー／アクセプター対の色素間の距離がさらに増大する。
ドナー蛍光強度の上昇またはアクセプター蛍光強度の低
下は、標的増幅が起きているまたは起きた指標として、
検出および／またはモニタリングしてもよいが、ドナー
／アクセプター色素対の接近により影響を受ける他の蛍
光パラメーターをモニタリングしてもよい。ドナーまた
はアクセプターの蛍光強度の変化は、ドナーおよび／ま
たはアクセプター蛍光強度の比率の変化として検出する
こともできる。たとえば、蛍光強度の変化は、ａ）二次
構造の直線化またはアンフォールディング後のドナーフ
ルオロフォア蛍光と直線化またはアンフォールディング
前の検出器オリゴヌクレオチドにおけるフルオロフォア
蛍光との比率の上昇、またはｂ）二次構造の直線化また
はアンフォールディング後のアクセプター色素蛍光と直
線化またはアンフォールディング前の検出器オリゴヌク
レオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低下
として検出することが可能である。
【００４１】ＳＤＡのほかにも、本発明の検出器オリゴ
ヌクレオチドは、他のプライマー伸長増幅方法（たとえ
ば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ）のアン
プリコンの検出向けに改変することが可能なことが明白
になるであろう。たとえば、ＰＣＲでＰＣＲ増幅プライ
マーおよび５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如し
た標準置換ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｐｒｏｍｅ
ｇａのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｑまた
はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓのｅｘｏ-
Ｖｅｎｔまたはｅｘｏ- Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）を使
用することにより、ＰＣＲ向けに方法を改変してもよ
い。シグナルプライマーは、ＰＣＲ増幅プライマーから
下流の標的に少なくとも部分的にハイブリダイズし、検
出器オリゴヌクレオチドレポータープローブにハイブリ
ダイズし、続いて伸長した後、置換され、二本鎖にされ
る。ＰＣＲでは、ＲＥＲＳの切断よりむしろニッキング
を誘導しかねない、修飾されたデオキシヌクレオチド三
リン酸が一般に存在しないため、ＲＥＲＳを、検出器オ
リゴヌクレオチド向けに任意に選択することが可能であ
る。熱循環はＰＣＲによる増幅の特徴であるため、制限
エンドヌクレアーゼは、プライマーアニーリングの最終
周期および増幅のエンドポイント検出のための伸長の後
で、低温で加えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応
の高温相を通じて活性のままである好熱性制限エンドヌ
クレアーゼも、リアルタイムアッセイを提供するための
増幅中ずっと存在し得る。ＳＤＡシステムの場合と同
様、色素対の分離により蛍光消光が減少し、強度等の蛍
光パラメータの変化が標的増幅の指標の役割を果たす。
ヌクレオチドは、他のプライマー伸長増幅方法（たとえ
ば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ）のアン
プリコンの検出向けに改変することが可能なことが明白
になるであろう。たとえば、ＰＣＲでＰＣＲ増幅プライ
マーおよび５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如し
た標準置換ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｐｒｏｍｅ
ｇａのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｑまた
はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓのｅｘｏ-
Ｖｅｎｔまたはｅｘｏ- Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）を使
用することにより、ＰＣＲ向けに方法を改変してもよ
い。シグナルプライマーは、ＰＣＲ増幅プライマーから
下流の標的に少なくとも部分的にハイブリダイズし、検
出器オリゴヌクレオチドレポータープローブにハイブリ
ダイズし、続いて伸長した後、置換され、二本鎖にされ
る。ＰＣＲでは、ＲＥＲＳの切断よりむしろニッキング
を誘導しかねない、修飾されたデオキシヌクレオチド三
リン酸が一般に存在しないため、ＲＥＲＳを、検出器オ
リゴヌクレオチド向けに任意に選択することが可能であ
る。熱循環はＰＣＲによる増幅の特徴であるため、制限
エンドヌクレアーゼは、プライマーアニーリングの最終
周期および増幅のエンドポイント検出のための伸長の後
で、低温で加えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応
の高温相を通じて活性のままである好熱性制限エンドヌ
クレアーゼも、リアルタイムアッセイを提供するための
増幅中ずっと存在し得る。ＳＤＡシステムの場合と同
様、色素対の分離により蛍光消光が減少し、強度等の蛍
光パラメータの変化が標的増幅の指標の役割を果たす。
【００４２】検出器オリゴヌクレオチドのアンフォール
ディングまたは直線化による蛍光の変化を、反応の選択
されたエンドポイントで検出することができる。しか
し、直線化された二次構造はハイブリダイゼーションま
たはプライマー伸長と同時に生じるため、反応が起こる
につれて、すなわち、「リアルタイム」で、蛍光の変化
もモニタリングすることが可能である。この同種リアル
タイムアッセイ形式を使用して、存在する標的の初期量
に関する半定量的情報または定量的情報を提供すること
が可能である。たとえば、（標的増幅の一部としての、
または非増幅検出法における）アンフォールディング反
応または直線化反応中に蛍光強度が変化する速度は、初
期の標的レベルの指標である。結果として、標的配列の
最初のコピーがもっと多く存在するとき、ドナー蛍光は
選択された閾値にもっと急速に到達する（すなわち、短
時間で確実になる）。アクセプター蛍光強度の低下は、
同様に、より短時間で確実になり、選択された最小値に
達するまでに要する時間として検出される。さらに、反
応の経過中に蛍光パラメーターが変化する速度は、初期
標的含量の低いサンプルより初期標的含量の高いサンプ
ルで急速である（すなわち、蛍光曲線の傾斜が大き
い）。これらおよび当技術分野で周知の（たとえば、米
国特許第５，９２８，９０７号、１９９８年１１月２０
日提出の米国特許出願番号第０９／１９６，１２３号、
２０００年５月１９日出願の米国特許出願番号第０９／
５７４，０３１号（特に、その全ては参照することによ
り本明細書に組み込まれる））他の測定を、標的が存在
する指標として、または標的増幅の指標として実施する
ことが可能である。初期標的量は、実験結果と既知の標
的量に関する結果との比較によって決定される。
ディングまたは直線化による蛍光の変化を、反応の選択
されたエンドポイントで検出することができる。しか
し、直線化された二次構造はハイブリダイゼーションま
たはプライマー伸長と同時に生じるため、反応が起こる
につれて、すなわち、「リアルタイム」で、蛍光の変化
もモニタリングすることが可能である。この同種リアル
タイムアッセイ形式を使用して、存在する標的の初期量
に関する半定量的情報または定量的情報を提供すること
が可能である。たとえば、（標的増幅の一部としての、
または非増幅検出法における）アンフォールディング反
応または直線化反応中に蛍光強度が変化する速度は、初
期の標的レベルの指標である。結果として、標的配列の
最初のコピーがもっと多く存在するとき、ドナー蛍光は
選択された閾値にもっと急速に到達する（すなわち、短
時間で確実になる）。アクセプター蛍光強度の低下は、
同様に、より短時間で確実になり、選択された最小値に
達するまでに要する時間として検出される。さらに、反
応の経過中に蛍光パラメーターが変化する速度は、初期
標的含量の低いサンプルより初期標的含量の高いサンプ
ルで急速である（すなわち、蛍光曲線の傾斜が大き
い）。これらおよび当技術分野で周知の（たとえば、米
国特許第５，９２８，９０７号、１９９８年１１月２０
日提出の米国特許出願番号第０９／１９６，１２３号、
２０００年５月１９日出願の米国特許出願番号第０９／
５７４，０３１号（特に、その全ては参照することによ
り本明細書に組み込まれる））他の測定を、標的が存在
する指標として、または標的増幅の指標として実施する
ことが可能である。初期標的量は、実験結果と既知の標
的量に関する結果との比較によって決定される。
【００４３】本発明の方法に従って選択された標的配列
の存在に関するアッセイは、溶液または固相で実施する
ことが可能である。検出器オリゴヌクレオチドがプライ
マーとして機能するリアルタイムまたはエンドポイント
同種アッセイは、一般に溶液で実施される。本発明の検
出器オリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは溶液でも実施することが可能であるが
（たとえば、同種リアルタイムアッセイ）、標的のリア
ルタイム検出またはエンドポイント検出のための固相ア
ッセイに特に適している。固相アッセイでは、当技術分
野で周知の方法を使用した内部標識または末端標識によ
って、検出器オリゴヌクレオチドを固相（たとえば、ビ
ーズ、膜または反応容器）上に固定することが可能であ
る。たとえば、ビオチン標識検出器オリゴヌクレオチド
をアビジン修飾固相上に固定することが可能であり、そ
こで、適切なハイブリダイゼーション条件で標的に曝露
すると、蛍光の変化を生じる。この方式で標的を捕捉す
ることにより、サンプルからの標的の分離が容易にな
り、アッセイのシグナルまたは他の特徴の検出を妨害す
る恐れのあるサンプル中の物質を除去することができ
る。使用することができる固相系の一例は、当技術分野
で周知のもの等の、アレー形式である。
の存在に関するアッセイは、溶液または固相で実施する
ことが可能である。検出器オリゴヌクレオチドがプライ
マーとして機能するリアルタイムまたはエンドポイント
同種アッセイは、一般に溶液で実施される。本発明の検
出器オリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは溶液でも実施することが可能であるが
（たとえば、同種リアルタイムアッセイ）、標的のリア
ルタイム検出またはエンドポイント検出のための固相ア
ッセイに特に適している。固相アッセイでは、当技術分
野で周知の方法を使用した内部標識または末端標識によ
って、検出器オリゴヌクレオチドを固相（たとえば、ビ
ーズ、膜または反応容器）上に固定することが可能であ
る。たとえば、ビオチン標識検出器オリゴヌクレオチド
をアビジン修飾固相上に固定することが可能であり、そ
こで、適切なハイブリダイゼーション条件で標的に曝露
すると、蛍光の変化を生じる。この方式で標的を捕捉す
ることにより、サンプルからの標的の分離が容易にな
り、アッセイのシグナルまたは他の特徴の検出を妨害す
る恐れのあるサンプル中の物質を除去することができ
る。使用することができる固相系の一例は、当技術分野
で周知のもの等の、アレー形式である。
【００４４】
【実施例】以下の実施例は、本明細書に記載の本発明の
具体的な実施形態を、例を挙げて説明する。当業者に明
らかな通り、様々な変更および修飾は、可能であり且つ
記載の発明の範囲内と考えられる。
具体的な実施形態を、例を挙げて説明する。当業者に明
らかな通り、様々な変更および修飾は、可能であり且つ
記載の発明の範囲内と考えられる。
【００４５】実施例１分析感度 表１に示す増幅オリゴヌクレオチドを、Ｐ１標的配列の
検出について試験した。一部のＰ１遺伝子インサートを
含むクローン化プラスミド、反応当たり０、１０、２
０、３０、５０、および１００コピーで、増幅反応を実
施した。増幅反応は、以下の成分の最終濃度を含む緩衝
液中で、５２℃にて実施した：４５ｍＭのリン酸カリウ
ム、１０％グリセロール、１０％ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）、５ｍＭの酢酸マグネシウム、７００ｎｇ
のヒト胎盤ＤＮＡ、１０μｇのアセチル化ウシ血清アル
ブミン、１００ｍＭのビシン(Bicine)、３５ｍＭの水酸
化カリウム、５０ｎＭのバンパープライマー（配列番号
５、配列番号７）、２５０ｎＭのシグナルプライマー
（配列番号９）、５００ｎＭのレポータープローブ（配
列番号１１）、５００ｎＭの右ＳＤＡプライマー（配列
番号２）、１００ｎＭの左ＳＤＡプライマー（配列番号
１）、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、０．１ｍＭのｄＧＴＰ、
０．１ｍＭのｄＴＴＰ、０．５ｍＭの２’−デオキシシ
チジン ５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸） ｓ−異性
体、および約２４単位のＢｓｏＢ１および４単位のＢｓ
ｔポリメラーゼ。
検出について試験した。一部のＰ１遺伝子インサートを
含むクローン化プラスミド、反応当たり０、１０、２
０、３０、５０、および１００コピーで、増幅反応を実
施した。増幅反応は、以下の成分の最終濃度を含む緩衝
液中で、５２℃にて実施した：４５ｍＭのリン酸カリウ
ム、１０％グリセロール、１０％ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）、５ｍＭの酢酸マグネシウム、７００ｎｇ
のヒト胎盤ＤＮＡ、１０μｇのアセチル化ウシ血清アル
ブミン、１００ｍＭのビシン(Bicine)、３５ｍＭの水酸
化カリウム、５０ｎＭのバンパープライマー（配列番号
５、配列番号７）、２５０ｎＭのシグナルプライマー
（配列番号９）、５００ｎＭのレポータープローブ（配
列番号１１）、５００ｎＭの右ＳＤＡプライマー（配列
番号２）、１００ｎＭの左ＳＤＡプライマー（配列番号
１）、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、０．１ｍＭのｄＧＴＰ、
０．１ｍＭのｄＴＴＰ、０．５ｍＭの２’−デオキシシ
チジン ５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸） ｓ−異性
体、および約２４単位のＢｓｏＢ１および４単位のＢｓ
ｔポリメラーゼ。
【００４６】簡単に記載すると、ＤＮＡを、プライマー
およびバンパーを含む緩衝液に加える前に、９５℃にて
標的５分間変性させ、室温に冷却した。潜在的な間違っ
たプライミングを最小限に抑えるために、室温で２０分
間、続いて７０℃で１０分間、インキュベーションを続
けた。次いで、増幅酵素が入っている微量滴定ウェルに
一定量のプライミングミックを移すことにより、５２℃
で増幅を開始した。増幅およびリアルタイム検出を、５
２℃の定温で１時間実施した。配列番号１１の、シグナ
ルプライマー（配列番号９）の補体へのハイブリダイゼ
ーション、続いて起こるシグナルプライマー補体の伸長
および結果として得られる二本鎖生成物の切断と関連し
た蛍光強度の変化をモニタリングすることにより、特定
の増幅生成物を検出した。検出限界（９５％の確信率を
予測する目標レベルであると算定される）は、反応当た
り６〜２０コピーであった。
およびバンパーを含む緩衝液に加える前に、９５℃にて
標的５分間変性させ、室温に冷却した。潜在的な間違っ
たプライミングを最小限に抑えるために、室温で２０分
間、続いて７０℃で１０分間、インキュベーションを続
けた。次いで、増幅酵素が入っている微量滴定ウェルに
一定量のプライミングミックを移すことにより、５２℃
で増幅を開始した。増幅およびリアルタイム検出を、５
２℃の定温で１時間実施した。配列番号１１の、シグナ
ルプライマー（配列番号９）の補体へのハイブリダイゼ
ーション、続いて起こるシグナルプライマー補体の伸長
および結果として得られる二本鎖生成物の切断と関連し
た蛍光強度の変化をモニタリングすることにより、特定
の増幅生成物を検出した。検出限界（９５％の確信率を
予測する目標レベルであると算定される）は、反応当た
り６〜２０コピーであった。
【００４７】実施例２プライマー特異性の評価 実施例１に記載の通り、配列番号１、配列番号２、配列
番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１を
使用して、プライマー特異性を評価した。下表２に記載
のＡＴＣＣ Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ参照菌株を使用
して、プライマー特異性を評価した。反応条件は、実施
例１で述べたものと同じであった。反応当たり約１０5
ゲノム等価物を使用して、８つの参照菌株を試験した。
試験した菌株は全て、計算された特異性に関して１００
％陽性であった。
番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１を
使用して、プライマー特異性を評価した。下表２に記載
のＡＴＣＣ Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ参照菌株を使用
して、プライマー特異性を評価した。反応条件は、実施
例１で述べたものと同じであった。反応当たり約１０5
ゲノム等価物を使用して、８つの参照菌株を試験した。
試験した菌株は全て、計算された特異性に関して１００
％陽性であった。
【００４８】
【表２】
【００４９】実施例３交差反応性の評価 実施例１に記載のプライマーおよび反応条件を使用して
交差反応性を評価した。下表３に記載の５２の微生物か
らの細胞溶解物またはＡＴＣＣ参照ストックを使用し
て、交差反応性パネルを試験した。反応当たり１×１０
5ゲノム等価物にて微生物を試験した。試験した微生物
全てで陰性の結果が得られた。
交差反応性を評価した。下表３に記載の５２の微生物か
らの細胞溶解物またはＡＴＣＣ参照ストックを使用し
て、交差反応性パネルを試験した。反応当たり１×１０
5ゲノム等価物にて微生物を試験した。試験した微生物
全てで陰性の結果が得られた。
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表３（つづき）】
【００５２】本発明を多少具体的に説明してきたが、本
発明の範囲から逸脱せずに、当業者に明白な修飾を行う
ことができる。本発明の様々な特質を特許請求の範囲で
述べる。
発明の範囲から逸脱せずに、当業者に明白な修飾を行う
ことができる。本発明の様々な特質を特許請求の範囲で
述べる。
【００５３】
【配列表】 <110> Becton, Dickinson and Company <120> Amplification and Detection of Mycoplasma Pneumoniae <130> 13-398 <140> JP2001-227117 <141> 2001-07-27 <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Upstream primer for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 1 cgattccgct ccagacttct cgggcttaaa aacctgttgg a 41 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream primer for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 2 accgcatcga atgactgtct cggggtggaa tggtctgt 38 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream primer for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 3 accgcatcga atgactgtct cgggtggaat ggtctgt 37 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream primer for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 4 accgcatcga atgactgtct cggggtggaa tggtctgta 39 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Upstream bumper for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 5 gacaagttag acgac 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Upstream bumper for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 6 aagttagacg acgat 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream bumper for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 7 gtgtcgttgt tttga 15 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream bumper for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 8 gttgttttga gcgatt 16 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Signal primer for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 9 acgttagcca ccatacggat aaccaggttc gcaccaagct g 41 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Signal primer for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 10 acgttagcca ccatacggat caaccaggtt cgcaccaag 39 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1) <223> This base is modified by attachment of fluorescein. <220> <221> misc#feature <222> (15) <223> This base is modified by attachment of dabcyl. <220> <223> Description of Artificial Sequence:Reporter probe sequence for SDA for Mycoplasma pneumoniae. <400> 11 tagtgcccga gcactacgtt agccaccata cggat 35
【図１】本発明の方法による、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反
応におけるＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸Ｐ１遺伝子標
的配列の検出を示す図である。
応におけるＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸Ｐ１遺伝子標
的配列の検出を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 ジェイムズ・エイ・プライス，ジュニア アメリカ合衆国メリーランド州21903，ル ーサーヴィル，ウェンドスロウ・ロード 19 (72)発明者 トビン・ヘルヤー アメリカ合衆国メリーランド州21117，オ ーウィングズ・ミルズ，ローヤルティ・サ ークル 110 (72)発明者 ステファニー・エム・フィン アメリカ合衆国メリーランド州21117，オ ーウィングズ・ミルズ，サイレントウッ ド・コート 39 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB50 DA12 DA13 DA14 4B024 AA13 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA09 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ06 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR35 QR39 QR42 QR56 QR62 QS24 QS34 QX02
Claims (13)
- 【請求項１】 ＭＰ１Ｌｐｒｉｍ（配列番号１）、ＭＰ
１Ｒｐｒｉｍ１（配列番号２）、ＭＰ１Ｒｐｒｉｍ２
（配列番号３）およびＭＰ２Ｒｐｒｉｍｅｒ（配列番号
４）の標的結合性配列からなる群から選択される標的結
合性配列と、任意選択的に、増幅反応に必要な配列とか
らなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 前記増幅反応に必要な配列が、制限エン
ドヌクレアーゼでニックを入れることが可能な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位である請求項１に記載のオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項３】 ＭＰ１Ｌｐｒｉｍ（配列番号１）、ＭＰ
１Ｒｐｒｉｍ１（配列番号２）、ＭＰ１Ｒｐｒｉｍ２
（配列番号３）およびＭＰ２Ｒｐｒｉｍｅｒ（配列番号
４）からなる群から選択される請求項２に記載のオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項４】 ＭＰ１Ｂｕｍｐ（配列番号５）、ＭＰ２
ＬＢｕｍｐ（配列番号６）、ＭＰ１Ｒｂｕｍｐ（配列番
号７）およびＭＰ２ＲＢｕｍｐ（配列番号８）からなる
群から選択されるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 ＭＰ１Ａｄａｐ（配列番号９）、配列番
号９に相補的な核酸、ＭＰ２Ａｄａｐｔ（配列番号１
０）、および配列番号１０に相補的な核酸からなる群か
ら選択されるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 間接的に検出可能なマーカーを含む請求
項５に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 前記間接的に検出可能なマーカーがアダ
プター配列である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項８】 ａ）ＭＰ１Ｌｐｒｉｍ（配列番号１）か
らなる１個のプライマーと、 ｂ）ＭＰ１Ｒｐｒｉｍ１（配列番号２）、ＭＰ１Ｒｐｒ
ｉｍ２（配列番号３）およびＭＰ２Ｒｐｒｉｍｅｒ（配
列番号４）からなる群から選択される１個以上のプライ
マーと、 ｃ）ＭＰ１Ｂｕｍｐ（配列番号５）、ＭＰ２ＬＢｕｍｐ
（配列番号６）、ＭＰ１ＲＢｕｍｐ（配列番号７）また
はＭＰ２ＲＢｕｍｐ（配列番号８）からなる群から選択
される１個以上のバンパーと、 ｄ）ＭＰ１Ａｄａｐ（配列番号９）、配列番号９に相補
的な核酸、ＭＰ２Ａｄａｐｔ（配列番号１０）、および
配列番号１０に相補的な核酸からなる群から選択される
１個以上のシグナルプライマーとを含むキット。 - 【請求項９】 配列番号１１のレポータープローブをさ
らに含む請求項８に記載のキット。 - 【請求項１０】 ｅ）レジオネラ・ニューモフィラ(Leg
ionella pneumophila)に特異的な核酸配列の増幅に特異
的な一対のプライマーと、 ｆ）ボルデテラ・ペルタシス(Bordetella pertusis)に
特異的な核酸配列の増幅に特異的な一対のプライマー
と、 ｇ）クラミジア感染を示す核酸配列の増幅に特異的な一
対のプライマーとをさらに含む、請求項８に記載のキッ
ト。 - 【請求項１１】 ａ）核酸に、 ｉ）ＭＰ１Ｌｐｒｉｍ（配列番号１）の標的結合性配
列、および任意選択的にに増幅反応に必要な配列からな
る第１の増幅プライマーと、 ｉｉ）ＭＰ１Ｒｐｒｉｍ１（配列番号２）の標的結合性
配列、および任意選択的に増幅反応に必要な配列からな
る第２の増幅プライマーとをハイブリダイズさせるステ
ップと、 ｂ）ハイブリダイズした第１および第２の増幅プライマ
ーを標的核酸配列上で伸長し、それによって標的核酸配
列を増幅するステップとを含む、マイコプラズマ・ニュ
ーモニエ(Mycoplasma pneumoniae)微生物の標的核酸配
列を増幅する方法。 - 【請求項１２】 シグナルプライマーにハイブリダイズ
することによって、増幅された標的核酸を間接的に検出
するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記シグナルプライマーがＭＰ１Ａｄ
ａｐ（配列番号９）からなる請求項１２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/626355 | 2000-07-27 | ||
| US09/626,355 US6277582B1 (en) | 2000-07-27 | 2000-07-27 | Amplification and detection of mycoplasma pneumoniae targeting the P1 gene |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002320488A true JP2002320488A (ja) | 2002-11-05 |
Family
ID=24510051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001227117A Pending JP2002320488A (ja) | 2000-07-27 | 2001-07-27 | マイコプラズマ・ニューモニエの増幅および検出 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1176215B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002320488A (ja) |
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| US20020025519A1 (en) * | 1999-06-17 | 2002-02-28 | David J. Wright | Methods and oligonucleotides for detecting nucleic acid sequence variations |
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| EP1500710A4 (en) * | 2002-05-08 | 2006-10-04 | Arkray Inc | METHOD FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993009250A1 (en) * | 1991-11-01 | 1993-05-13 | Adelaide Children's Hospital | Solid phase amplification process |
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| WO2000037163A1 (en) * | 1998-12-23 | 2000-06-29 | Nanogen, Inc. | Integrated portable biological detection system |
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